CN104045706A - 一种利拉鲁肽的合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种利拉鲁肽的合成方法。该方法是通过将二肽片段、三肽片段或其组合与氨基酸、Gly-树脂偶联，得到肽树脂，经侧链修饰、裂解、纯化、冻干，即得。本发明提供的利拉鲁肽合成方法可提高粗肽的纯度和收率，有利于纯化，缩短了合成时间，适合工业化生产。

Description

一种利拉鲁肽的合成方法
技术领域
本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种利拉鲁肽的合成方法。
背景技术
随着生活水平的提高和生活方式的改变，近年来，我国糖尿病的发病率有逐年增加的趋势。糖尿病是由遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等各种致病因子作用于机体，导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗等问题，继而引发机体糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征，临床上以高血糖为主要特点，典型病例可出现多尿、多饮、多食、消瘦等表现，即“三多一少”症状，一旦控制不好会引发并发症，导致肾、眼、足等部位的衰竭病变，且无法治愈。糖尿病分为妊娠期糖尿病、特异性糖尿病、I型糖尿病和II型糖尿病。其中，II型糖尿病又名非胰岛素依赖型糖尿病，特点是人体自身能够产生胰岛素，但细胞无法对其作出反应，使胰岛素的效果大打折扣。
II型糖尿病主要通过口服或皮下注射降糖药治疗。针对II型糖尿病的降糖药种类很多，包括二甲双胍、磺脲类药物和胰高血糖样肽-1（GLP-1）的受体激动素等，GLP-1的受体激动素是近年来研究的热点。其中，利拉鲁肽（liraglutide）是GLP-1的受体激动素之一，2010年1月25日，美国FDA批准由丹麦诺和诺德公司研发的利拉鲁肽（商品名为Victoza）注射剂在美国上市，2011年3月4日，利拉鲁肽获得SFDA批准上市。利拉鲁肽的化学表述为Arg34Lys26-[N-ε-(γ-Glu-(N-hexadecanoyl))]-GLP-17-37，分子式为C172H265N43O51，相对分子质量3751.2，CAS登记号为204656-20-2，分子式如式I所示，与天然GLP-1相比，药效相当且作用时间更长。
式I
目前，利拉鲁肽主要采用基因重组技术和逐步偶联的固相合成方法进行制备。采用基因重组技术合成利拉鲁肽时，技术难度较大，成本相对较高，同时由于Arg34-GLP-1（7-37）-OH的侧链处于未保护状态，与Nα-hexadecanoyl-Glu(ONSu)-OtBu反应时会产生较多的杂质，不利于纯化；采用逐步偶联的固相合成方法进行利拉鲁肽制备时，由于利拉鲁肽的序列中有较多的疏水氨基酸，逐步偶联时树脂收缩严重，反应不完全，导致收率偏低，同时粗肽中与产品性质相近的杂质较多，纯化比较困难。因此，提供一种利拉鲁肽的合成方法具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种利拉鲁肽的合成方法。该方法通过将二肽片段、三肽片段或其组合与氨基酸、Gly-树脂偶联合成利拉鲁肽，提高了粗肽的纯度和收率，有利于纯化，缩短了合成时间，适合工业化生产。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种利拉鲁肽的合成方法，包括如下步骤：
获得二肽片段和/或三肽片段；
获得Gly-树脂；
取二肽片段、三肽片段或其组合与氨基酸、Gly-树脂偶联，得到肽树脂，经侧链修饰、裂解、纯化、冻干，即得；
二肽片段为Gly-Arg、Leu-Val、Trp-Leu、Ala-Trp、Ile-Ala、Phe-Ile或Ala-Ala；
三肽片段为Trp-Leu-Val、Ala-Trp-Leu、Ile-Ala-Trp或Phe-Ile-Ala；
肽的序列如SEQ ID NO.1所示。
作为优选，组合为Gly-Arg、Leu-Val、Ala-Trp、Phe-Ile或Ala-Ala中的任意两者或两者以上二肽片段的组合。
Gly-Arg、Leu-Val、Ala-Trp、Phe-Ile或Ala-Ala中的任意两者或两者以上二肽片段的组合具体为：
Gly-Arg和Leu-Val的组合；
Gly-Arg和Ala-Trp的组合；
Gly-Arg和Phe-Ile的组合；
Gly-Arg和Ala-Ala的组合；
Leu-Val和Ala-Trp的组合；
Leu-Val和Phe-Ile的组合；
Leu-Val和Ala-Ala的组合；
Ala-Trp和Phe-Ile的组合；
Ala-Trp和Ala-Ala的组合；
Phe-Ile和Ala-Ala的组合；
Gly-Arg、Leu-Val和Ala-Trp的组合；
Gly-Arg、Leu-Val和Phe-Ile的组合；
Gly-Arg、Leu-Val和Ala-Ala的组合；
Gly-Arg、Ala-Trp和Phe-Ile的组合；
Gly-Arg、Ala-Trp和Ala-Ala的组合；
Gly-Arg、Phe-Ile和Ala-Ala的组合；
Leu-Val、Ala-Trp和Phe-Ile的组合；
Leu-Val、Ala-Trp和Ala-Ala的组合；
Leu-Val、Phe-Ile和Ala-Ala的组合；
Ala-Trp、Phe-Ile和Ala-Ala的组合；
Gly-Arg、Ala-Trp、Phe-Ile和Ala-Ala的组合；
Gly-Arg、Leu-Val、Phe-Ile和Ala-Ala的组合；
Gly-Arg、Leu-Val、Ala-Trp和Ala-Ala的组合；
Gly-Arg、Leu-Val、Ala-Trp和Phe-Ile的组合；
Leu-Val、Ala-Trp、Phe-Ile和Ala-Ala的组合；
或Gly-Arg、Leu-Val、Ala-Trp、Phe-Ile和Ala-Ala的组合。
作为优选，组合为Gly-Arg、Trp-Leu、Ile-Ala或Ala-Ala中不少于三个二肽片段的组合。
Gly-Arg、Trp-Leu、Ile-Ala或Ala-Ala中不少于三个二肽片段的组合具体为：
Gly-Arg、Trp-Leu和Ala-Ala的组合；
Gly-Arg、Ile-Ala和Ala-Ala的组合；
Trp-Leu、Ile-Ala和Ala-Ala的组合；
Gly-Arg、Trp-Leu和Ile-Ala的组合；
或Gly-Arg、Trp-Leu、Ile-Ala和Ala-Ala的组合。
作为优选，组合为Gly-Arg、Trp-Leu-Val、Phe-Ile-Ala或Ala-Ala中至少包含一个三肽片段的组合。
Gly-Arg、Trp-Leu-Val、Phe-Ile-Ala或Ala-Ala中至少包含一个三肽片段的组合具体为：
Gly-Arg和Trp-Leu-Val的组合；
Gly-Arg和Phe-Ile-Ala的组合；
Trp-Leu-Val和Ala-Ala的组合；
Phe-Ile-Ala和Ala-Ala的组合；
Gly-Arg、Trp-Leu-Val和Ala-Ala的组合；
Gly-Arg、Phe-Ile-Ala和Ala-Ala的组合；
Gly-Arg、Trp-Leu-Val和Phe-Ile-Ala的组合；
Trp-Leu-Val、Phe-Ile-Ala和Ala-Ala的组合；
或Gly-Arg、Trp-Leu-Val、Phe-Ile-Ala和Ala-Ala的组合。
作为优选，组合为Ala-Trp-Leu与Gly-Arg、Phe-Ile或Ala-Ala中的一者或两者以上的组合。
Ala-Trp-Leu与Gly-Arg、Phe-Ile或Ala-Ala中的一者或两者以上的组合具体为：
Gly-Arg和Ala-Trp-Leu的组合；
Ala-Trp-Leu和Phe-Ile的组合；
Ala-Trp-Leu和Ala-Ala的组合；
Gly-Arg、Ala-Trp-Leu和Phe-Ile的组合；
Gly-Arg、Ala-Trp-Leu和Ala-Ala的组合；
Ala-Trp-Leu、Phe-Ile和Ala-Ala的组合；
或Gly-Arg、Ala-Trp-Leu、Phe-Ile和Ala-Ala的组合。
作为优选，组合为Ile-Ala-Trp与Gly-Arg、Leu-Val或Ala-Ala中的一者或两者以上的组合。
Ile-Ala-Trp与Gly-Arg、Leu-Val或Ala-Ala中的一者或两者以上的组合具体为：
Gly-Arg和Ile-Ala-Trp的组合；
Leu-Val和Ile-Ala-Trp的组合；
Ile-Ala-Trp和Ala-Ala的组合；
Gly-Arg、Leu-Val和Ile-Ala-Trp的组合；
Gly-Arg、Ile-Ala-Trp和Ala-Ala的组合；
Leu-Val、Ile-Ala-Trp和Ala-Ala的组合；
或Gly-Arg、Leu-Val、Ile-Ala-Trp和Ala-Ala的组合。
作为优选，侧链修饰具体为：脱除肽树脂中Lys的侧链保护基团，与Glu、棕榈酰氯偶联。
作为优选，裂解的试剂为Anisole、Thioanisole、TIS、H2O或EDT中的一者或两者以上的混合物与TFA的混合物。
作为优选，裂解的试剂中TFA、Anisole、Thioanisole、TIS、H2O与EDT的体积比为（90～95）︰（0～5）︰（0～3）︰（0～3）︰（0～3）︰（0～3）。
本发明提供了一种利拉鲁肽的合成方法。该方法是通过将二肽片段、三肽片段或其组合与氨基酸、Gly-树脂偶联，得到肽树脂，经侧链修饰、裂解、纯化、冻干，即得。利用本发明提供的方法制备的利拉鲁肽粗肽，收率可达90.9%，纯度可达72.46%，与现有技术相比，利拉鲁肽粗肽的收率和纯度分别提高了11.95%、3.26%；由于在疏水氨基酸密集区域使用片段进行偶联，减少了与产品性质相近杂质的产生，从而有利于纯化操作；在利拉鲁肽合成过程中，二肽片段、三肽片段或其组合与Gly-树脂的合成可同时进行，大大缩短了合成时间。由此可见，本发明提供的利拉鲁肽的合成方法可提高粗肽的纯度和收率，有利于纯化，缩短了合成时间，适合工业化生产。
附图说明
图1示实施例20提供的HPLC图谱；
图2示对比例1提供的HPLC图谱。
具体实施方式
本发明公开了一种利拉鲁肽的合成方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
说明书和权利要求书中所使用的缩写具体含义如下：
本发明提供的利拉鲁肽的合成方法中所用试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1Fmoc-Gly-Arg（pbf）-OH的制备
将Fmoc-Gly-OH（29.7g，100mmol）和HONb（19.7g，110mmol）溶解在200ml THF中，冰浴条件下加入DCC（22.7g，110mmol），冰浴搅拌1h，撤掉冰浴，室温反应4h，滤掉不溶物，得到Fmoc-Gly-ONb溶液。
将L-Arg（pbf）-OH（42.7g，100mmol）和NaHCO3（16.8g，200mmol）溶解在THF/H2O（200ml︰200ml）中，冰浴条件下将上述Fmoc-Gly-ONb溶液滴加到上述THF/H2O中，滴加完毕后撤掉冰浴，室温搅拌反应2h。真空浓缩掉THF，水相中加入200ml H2O，EA洗涤3次，柠檬酸酸化水相pH至3，EA萃取（500ml*2），有机相用饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，得到油状物用DCM-Et2O重结晶，PE研磨后得到Fmoc-Gly-Arg（pbf）-OH白色粉末状固体55.6g，纯度98.54%，收率78.9%。
实施例2Fmoc-Leu-Val-OH的制备
将Fmoc-Leu-OH（35.3g，100mmol）和HONb（19.7g，110mmol）溶解在200ml THF中，冰浴条件下加入DCC（22.7g，110mmol），冰浴搅拌1h，撤掉冰浴，室温反应6h，滤掉不溶物，得到Fmoc-Leu-ONb溶液。
将L-Val-OH（11.7g，100mmol）和NaHCO3（16.8g，200mmol）溶解在THF/H2O（200ml︰200ml）中，冰浴条件下将上述Fmoc-Leu-ONb溶液滴加到上述THF/H2O中，滴加完毕后撤掉冰浴，室温搅拌反应2h。真空浓缩掉THF，水相中加入200ml H2O，Et2O洗涤3次，柠檬酸酸化水相pH至3，EA萃取（500ml*2），有机相用饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，得到油状物用MeOH-H2O重结晶，离心干燥后得到Fmoc-Leu-Val-OH白色粉末状固体23.1g，纯度99.4%，收率51.1%。
实施例3Fmoc-Trp（Boc）-Leu-OH的制备
将Fmoc-Trp（Boc）-OH（52.7g，100mmol）和HONb（19.7g，110mmol）溶解在200ml THF中，冰浴条件下加入DCC（22.7g，110mmol），冰浴搅拌1h，撤掉冰浴，室温反应2h，滤掉不溶物，得到Fmoc-Trp（Boc）-ONb溶液。
将L-Leu-OH（13.1g，100mmol）和NaHCO3（16.8g，200mmol）溶解在THF/H2O（200ml︰200ml）中，冰浴条件下将上述Fmoc-Trp（Boc）-ONb溶液滴加到上述THF/H2O中，滴加完毕后撤掉冰浴，室温搅拌反应2h。真空浓缩掉THF，水相中加入200ml H2O，EA洗涤3次，柠檬酸酸化水相pH至3，EA萃取（500ml*2），有机相用饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，得到蓬松固体用THF-PE重结晶，过滤收集，得到Fmoc-Trp（Boc）-Leu-OH白色粉末状固体40.9g，纯度98.1%，收率64.0%。
实施例4Fmoc-Ala-Trp（Boc）-OH的制备
将Fmoc-Ala-OH（31.1g，100mmol）和HONb（19.7g，110mmol）溶解在200ml THF中，冰浴条件下加入DCC（22.7g，110mmol），冰浴搅拌1h，撤掉冰浴，室温反应4h，滤掉不溶物，得到Fmoc-Ala-ONb溶液。
将H-Trp（Boc）-OH（30.4g，100mmol）和NaHCO3（16.8g，200mmol）溶解在THF/H2O（200ml︰200ml）中，冰浴条件下将上述Fmoc-Ala-ONb溶液滴加到上述THF/H2O中，滴加完毕后撤掉冰浴，室温搅拌反应2h。真空浓缩掉THF，水相中加入200ml H2O，EA洗涤3次，柠檬酸酸化水相pH至3，EA萃取（500ml*2），有机相用饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，得到油状物用MeOH-H2O重结晶，离心干燥后得到Fmoc-Ala-Trp（Boc）-OH白色粉末状固体31.2g，纯度98.6%，收率52.2%。
实施例5Fmoc-Ile-Ala-OH的制备
将Fmoc-Ile-OH（35.3g，100mmol）和HONb（19.7g，110mmol）溶解在200ml THF中，冰浴条件下加入DCC（22.7g，110mmol），冰浴搅拌1h，撤掉冰浴，室温反应4h，滤掉不溶物，得到Fmoc-Ile-ONb溶液。
将L-Ala-OH（8.9g，100mmol）和NaHCO3（16.8g，200mmol）溶解在THF/H2O（200ml︰200ml）中，冰浴条件下将上述Fmoc-Ala-ONb溶液滴加到上述THF/H2O中，滴加完毕后撤掉冰浴，室温搅拌反应2h。真空浓缩掉THF，水相中加入200ml H2O，EA洗涤3次，柠檬酸酸化水相pH至3，EA萃取（500ml*2），有机相用饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，得到蓬松固体用MeOH-H2O重结晶，过滤收集，得到Fmoc-Ile-Ala-OH白色粉末状固体24.6g，纯度98.0%，收率57.9%。
实施例6Fmoc-Phe-Ile-OH的制备
将Fmoc-Phe-OH（38.7g，100mmol）和HONb（19.7g，110mmol）溶解在200ml THF中，冰浴条件下加入DCC（22.7g，110mmol），冰浴搅拌1h，撤掉冰浴，室温反应4h，滤掉不溶物，得到Fmoc-Phe-ONb溶液。
将L-Ile-OH（13.1g，100mmol）和NaHCO3（16.8g，200mmol）溶解在THF/H2O（200ml︰200ml）中，冰浴条件下将上述Fmoc-Phe-ONb溶液滴加到上述THF/H2O中，滴加完毕后撤掉冰浴，室温搅拌反应4h。真空浓缩掉THF，水相中加入200ml H2O，EA洗涤3次，柠檬酸酸化水相pH至3，EA萃取（500ml*2），有机相用饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，得到油状物用THF-PE重结晶，过滤收集，得到Fmoc-Phe-Ile-OH白色粉末状固体30.5g，纯度99.6%，收率60.9%。
实施例7Fmoc-Ala-Ala-OH的制备
将Fmoc-Ala-OH（31.1g，100mmol）和HONb（19.7g，110mmol）溶解在200ml THF中，冰浴条件下加入DCC（22.7g，110mmol），冰浴搅拌1h，撤掉冰浴，室温反应4h，滤掉不溶物，得到Fmoc-Ala-ONb溶液。
将H-Ala-OH（8.9g，100mmol）和NaHCO3（16.8g，200mmol）溶解在THF/H2O（200ml︰200ml）中，冰浴条件下将上述Fmoc-Ala-ONb溶液滴加到上述THF/H2O中，滴加完毕后撤掉冰浴，室温搅拌反应2h。真空浓缩掉THF，水相中加入200ml H2O，EA洗涤3次，柠檬酸酸化水相pH至3，EA萃取（500ml*2），有机相用饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，THF-EA-PE重结晶，过滤收集，得到Fmoc-Ala-Ala-OH白色粉末状固体20.6g，纯度98.9%，收率53.9%。
实施例8Fmoc-Trp（Boc）-Leu-Val-OH的制备
取实施例3制得的Fmoc-Trp（Boc）-Leu-OH（64.0g，100mmol）和HONb（19.7g，110mmol）溶解在200ml THF中，冰浴条件下加入DCC（22.7g，110mmol），冰浴搅拌1h，撤掉冰浴，室温反应4h，滤掉不溶物，得到Fmoc-Trp（Boc）-Leu-ONb溶液。
将H-Val-OH（11.7g，100mmol）和NaHCO3（16.8g，200mmol）溶解在THF/H2O（200ml︰200ml）中，冰浴条件下将上述Fmoc-Trp（Boc）-Leu-ONb溶液滴加到上述THF/H2O中，滴加完毕后撤掉冰浴，室温搅拌反应2h。真空浓缩掉THF，水相中加入200ml H2O，EA洗涤3次，柠檬酸酸化水相pH至3，EA萃取（500ml*2），有机相用饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，乙腈-H2O重结晶，过滤收集，得到Fmoc-Trp（Boc）-Leu-Val-OH白色粉末状固体32.4g，纯度97.6%，收率43.8%。
实施例9Fmoc-Ala-Trp（Boc）-Leu-OH的制备
取实施例4制得的Fmoc-Ala-Trp（Boc）-OH（59.8g，100mmol）和HONb（19.7g，110mmol）溶解在200ml THF中，冰浴条件下加入DCC（22.7g，110mmol），冰浴搅拌1h，撤掉冰浴，室温反应4h，滤掉不溶物，得到Fmoc-Ala-Trp（Boc）-ONb溶液。
将H-Leu-OH（13.1g，100mmol）和NaHCO3（16.8g，200mmol）溶解在THF/H2O（200ml︰200ml）中，冰浴条件下将上述Fmoc-Ala-Trp（Boc）-ONb溶液滴加到上述THF/H2O中，滴加完毕后撤掉冰浴，室温搅拌反应2h。真空浓缩掉THF，水相中加入200ml H2O，EA洗涤3次，柠檬酸酸化水相pH至3，EA萃取（500ml*2），有机相用饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，MeOH-H2O重结晶，过滤收集，得到Fmoc-Ala-Trp（Boc）-Leu-OH白色粉末状固体29.5g，纯度98.2%，收率41.5%。
实施例10Fmoc-Ile-Ala-Trp（Boc）-OH的制备
取实施例5制得的Fmoc-Ile-Ala-OH（42.5g，100mmol）和HONb（19.7g，110mmol）溶解在200ml THF中，冰浴条件下加入DCC（22.7g，110mmol），冰浴搅拌1h，撤掉冰浴，室温反应4h，滤掉不溶物，得到Fmoc-Ile-Ala-ONb溶液。
将H-Trp（Boc）-OH（30.4g，100mmol）和NaHCO3（16.8g，200mmol）溶解在THF/H2O（200ml︰200ml）中，冰浴条件下将上述Fmoc-Ile-Ala-ONb溶液滴加到上述THF/H2O中，滴加完毕后撤掉冰浴，室温搅拌反应2h。真空浓缩掉THF，水相中加入200ml H2O，EA洗涤3次，柠檬酸酸化水相pH至3，EA萃取（500ml*2），有机相用饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，MeOH-H2O重结晶，过滤收集，得到Fmoc-Ile-Ala-Trp（Boc）-OH白色粉末状固体33.4g，纯度98.9%，收率47.0%。
实施例11Fmoc-Phe-Ile-Ala-OH的制备
取实施例6制得的Fmoc-Phe-Ile-OH（50.1g，100mmol）和HONb（19.7g，110mmol）溶解在200ml THF中，冰浴条件下加入DCC（22.7g，110mmol），冰浴搅拌1h，撤掉冰浴，室温反应4h，滤掉不溶物，得到Fmoc-Phe-Ile-ONb溶液。
将H-Ala-OH（8.9g，100mmol）和NaHCO3（16.8g，200mmol）溶解在THF/H2O（200ml︰200ml）中，冰浴条件下将上述Fmoc-Phe-Ile-ONb溶液滴加到上述THF/H2O中，滴加完毕后撤掉冰浴，室温搅拌反应2h。真空浓缩掉THF，水相中加入200ml H2O，EA洗涤3次，柠檬酸酸化水相pH至3，EA萃取（500ml*2），有机相用饱和食盐水洗涤3次，无水硫酸钠干燥，真空浓缩，THF-PE重结晶，过滤收集，得到Fmoc-Phe-Ile-Ala-OH白色粉末状固体24.7g，纯度98.5%，收率43.2%。
实施例12Fmoc-Gly-王树脂的制备
称取替代度为0.75mmol/g的王树脂50g，加入固相反应柱中，DMF洗涤2次，DMF溶胀30分钟，抽干。将Fmoc-Gly-OH（5.575g，18.75mmol）和HOBt（2.787g，20.625mmol）溶解于200ml DMF中，冰浴条件下加入DIC（3.17ml，20.625mmol）活化5分钟，将上述溶液加入装有王树脂的固相反应柱中，同时加入DMAP（0.206g，1.875mmol），氮气搅拌反应2h，DMF洗涤4次，DCM洗涤2次，加入300ml Ac2O/吡啶=7︰6（V/V）封闭6小时，DCM洗涤6次，MeOH收缩，真空干燥得到Fmoc-Gly-王树脂，检测替代度为0.108mmol/g。
实施例13Fmoc-Gly-王树脂的制备
称取替代度为0.75mmol/g的王树脂50g，加入固相反应柱中，DMF洗涤2次，DMF溶胀30分钟，抽干。将Fmoc-Gly-OH（16.724g，56.25mmol）和HOBt（8.36g，61.875mmol）溶解于300ml DMF中，冰浴条件下加入DIC（9.58ml，61.875mmol）活化5分钟，将上述溶液加入装有王树脂的固相反应柱中，同时加入DMAP（0.687g，6.188mmol），氮气搅拌反应2h，DMF洗涤4次，DCM洗涤2次，加入300ml Ac2O/吡啶=7︰6（V/V）封闭6小时，DCM洗涤6次，MeOH收缩，真空干燥得到Fmoc-Gly-王树脂，检测替代度为0.279mmol/g。
实施例14Fmoc-Gly-王树脂的制备
称取替代度为0.75mmol/g的王树脂50g，加入固相反应柱中，DMF洗涤2次，DMF溶胀30分钟，抽干。将Fmoc-Gly-OH（33.448g，112.5mmol）和HOBt（16.72g，123.75mmol）溶解于400ml DMF中，冰浴条件下加入DIC（19.16ml，123.75mmol）活化5分钟，将上述溶液加入装有王树脂的固相反应柱中，同时加入DMAP（1.374g，12.376mmol），氮气搅拌反应2h，DMF洗涤4次，DCM洗涤2次，加入400ml Ac2O/吡啶=7︰6（V/V）封闭6小时，DCM洗涤6次，MeOH收缩，真空干燥得到Fmoc-Gly-王树脂，检测替代度为0.498mmol/g。
实施例15肽树脂的制备
取实施例13制得的3.58g Fmoc-Gly-王树脂（0.279mmol/g）装入固相反应柱中，DMF洗两次，DMF溶胀30分钟，DBLK脱保护（5+7min），DMF洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
将实施例1提供的Fmoc-Gly-Arg（pbf）-OH（2.117g，3mmol）和HOBt（0.426g，3.15mmol）溶解在15ml DMF中，冰浴条件下加入DIC（0.49ml，3.15mmol）活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性，得到Fmoc-Gly-Arg（pbf）-Gly-王树脂。抽干反应液，DMF洗涤3次，DBLK脱保护（5+7min），DMF洗涤6次，茚三酮检测呈阴性，得到H-Gly-Arg（pbf）-Gly-王树脂。
按照上述Fmoc-Gly-Arg（pbf）-OH偶联的方法，在H-Gly-Arg（pbf）-Gly-王树脂上依次偶联Fmoc-Arg（Pbf）-OH、实施例2提供的Fmoc-Leu-Val-OH、实施例4提供的Fmoc-Ala-Trp（Boc）-OH、实施例6提供的Fmoc-Phe-Ile-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Lys（Alloc）-OH、实施例7提供的Fmoc-Ala-Ala-OH、Fmoc-Gln（Trt）-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr（tBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp（OtBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Thr（tBu）-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr（tBu）-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Ala-OH。
将Boc-His（trt）-OH（1.858g，3mmol）和HOBt（0.426g，3.15mmol）溶解于15ml DMF中，冰浴条件下加入DIC（0.49ml，3.15mmol）活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌2h，茚三酮检测呈阴性，DMF洗涤4次，DCM洗涤2次。
向上述固相反应柱中加入15ml DCM和1.08g苯硅烷，氮气搅拌1分钟后加入0.289g四（三苯基膦）钯，反应0.5h，抽干，DCM洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
将Fmoc-Glu-OtBu（2.128g，5mmol）、HOBt（0.709g，5.25mmol）和PyBOP（2.602g，5mmol）溶解在25ml DMF中，冰浴条件下加入DIPEA（1.75ml，10mmol）活化3分钟，将活化好的溶液加入上述固相反应柱，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DMF洗涤4次，DCM洗涤2次。
向上述固相反应柱中加入20ml DCM和DIPEA（1.75ml，10mmol），氮气搅拌均匀后缓慢滴加棕榈酰氯（1.374g，5mmol），滴加完毕后继续反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DCM洗涤6次，MeOH收缩，真空干燥后得到肽树脂7.94g。
实施例16肽树脂的制备
取实施例12制得的3.58g Fmoc-Gly-王树脂（0.108mmol/g）装入固相反应柱中，DMF洗两次，DMF溶胀30分钟，DBLK脱保护（5+7min），DMF洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
将实施例1提供的Fmoc-Gly-Arg（pbf）-OH（2.117g，3mmol）和HOBt（0.426g，3.15mmol）溶解在15ml DMF中，冰浴条件下加入DIC（0.49ml，3.15mmol）活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性，得到Fmoc-Gly-Arg（pbf）-Gly-王树脂。抽干反应液，DMF洗涤3次，DBLK脱保护（5+7min），DMF洗涤6次，茚三酮检测呈阴性，得到H-Gly-Arg（pbf）-Gly-王树脂。
按照上述Fmoc-Gly-Arg（pbf）-OH偶联的方法，在H-Gly-Arg（pbf）-Gly-王树脂上依次偶联Fmoc-Arg（Pbf）-OH、Fmoc-Val-OH、实施例3提供的Fmoc-Trp（Boc）-Leu-OH、实施例5提供的Fmoc-Ile-Ala-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Lys（Alloc）-OH、实施例7提供的Fmoc-Ala-Ala-OH、Fmoc-Gln（Trt）-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr（tBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp（OtBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Thr（tBu）-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr（tBu）-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Ala-OH。
将Boc-His（trt）-OH（1.858g，3mmol）和HOBt（0.426g，3.15mmol）溶解于15ml DMF中，冰浴条件下加入DIC（0.49ml，3.15mmol）活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌2h，茚三酮检测呈阴性，DMF洗涤4次，DCM洗涤2次。
向上述固相反应柱中加入15ml DCM和1.08g苯硅烷，氮气搅拌1分钟后加入0.289g四（三苯基膦）钯，反应0.5h，抽干，DCM洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
将Fmoc-Glu-OtBu（2.128g，5mmol）、HOBt（0.709g，5.25mmol）和PyBOP（2.602g，5mmol）溶解在25ml DMF中，冰浴条件下加入DIPEA（1.75ml，10mmol）活化3分钟，将活化好的溶液加入上述固相反应柱，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DMF洗涤4次，DCM洗涤2次。
向上述固相反应柱中加入20ml DCM和DIPEA（1.75ml，10mmol），氮气搅拌均匀后缓慢滴加棕榈酰氯（1.374g，5mmol），滴加完毕后继续反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DCM洗涤6次，MeOH收缩，真空干燥后得到肽树脂7.98g。
实施例17肽树脂的制备
取实施例14制得的3.58g Fmoc-Gly-王树脂（0.498mmol/g）装入固相反应柱中，DMF洗两次，DMF溶胀30分钟，DBLK脱保护（5+7min），DMF洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
将实施例1提供的Fmoc-Gly-Arg（pbf）-OH（2.117g，3mmol）和HOBt（0.426g，3.15mmol）溶解在15ml DMF中，冰浴条件下加入DIC（0.49ml，3.15mmol）活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性，Fmoc-Gly-Arg（pbf）-Gly-王树脂。抽干反应液，DMF洗涤3次，DBLK脱保护（5+7min），DMF洗涤6次，茚三酮检测呈阴性，得到H-Gly-Arg（pbf）-Gly-王树脂。
按照上述Fmoc-Gly-Arg（pbf）-OH偶联的方法，在H-Gly-Arg（pbf）-Gly-王树脂上依次偶联Fmoc-Arg（Pbf）-OH、实施例8提供的Fmoc-Trp（Boc）-Leu-Val-OH、实施例11提供的Fmoc-Phe-Ile-Ala-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Lys（Alloc）-OH、实施例7提供的Fmoc-Ala-Ala-OH、Fmoc-Gln（Trt）-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr（tBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp（OtBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Thr（tBu）-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr（tBu）-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Ala-OH。
将Boc-His（trt）-OH（1.858g，3mmol）和HOBt（0.426g，3.15mmol）溶解于15ml DMF中，冰浴条件下加入DIC（0.49ml，3.15mmol）活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌2h，茚三酮检测呈阴性，DMF洗涤4次，DCM洗涤2次。
向上述固相反应柱中加入15ml DCM和1.08g苯硅烷，氮气搅拌1分钟后加入0.289g四（三苯基膦）钯，反应0.5h，抽干，DCM洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
将Fmoc-Glu-OtBu（2.128g，5mmol）、HOBt（0.709g，5.25mmol）和PyBOP（2.602g，5mmol）溶解在25ml DMF中，冰浴条件下加入DIPEA（1.75ml，10mmol）活化3分钟，将活化好的溶液加入上述固相反应柱，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DMF洗涤4次，DCM洗涤2次。
向上述固相反应柱中加入20ml DCM和DIPEA（1.75ml，10mmol），氮气搅拌均匀后缓慢滴加棕榈酰氯（1.374g，5mmol），滴加完毕后继续反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DCM洗涤6次，MeOH收缩，真空干燥后得到肽树脂7.87g。
实施例18肽树脂的制备
取实施例13制得的3.58g Fmoc-Gly-王树脂（0.279mmol/g）装入固相反应柱中，DMF洗两次，DMF溶胀30分钟，DBLK脱保护（5+7min），DMF洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
将实施例1提供的Fmoc-Gly-Arg（pbf）-OH（2.117g，3mmol）和HOBt（0.426g，3.15mmol）溶解在15ml DMF中，冰浴条件下加入DIC（0.49ml，3.15mmol）活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性，Fmoc-Gly-Arg（pbf）-Gly-王树脂。抽干反应液，DMF洗涤3次，DBLK脱保护（5+7min），DMF洗涤6次，茚三酮检测呈阴性，得到H-Gly-Arg（pbf）-Gly-王树脂。
按照上述Fmoc-Gly-Arg（pbf）-OH偶联的方法，在H-Gly-Arg（pbf）-Gly-王树脂上依次偶联Fmoc-Arg（Pbf）-OH、Fmoc-Val-OH、实施例9提供的Fmoc-Ala-Trp（Boc）-Leu-OH、实施例6提供的Fmoc-Phe-Ile-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Lys（Alloc）-OH、实施例7提供的Fmoc-Ala-Ala-OH、Fmoc-Gln（Trt）-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr（tBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp（OtBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Thr（tBu）-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr（tBu）-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Ala-OH。
将Boc-His（trt）-OH（1.858g，3mmol）和HOBt（0.426g，3.15mmol）溶解于15ml DMF中，冰浴条件下加入DIC（0.49ml，3.15mmol）活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌2h，茚三酮检测呈阴性，DMF洗涤4次，DCM洗涤2次。
向上述固相反应柱中加入15ml DCM和1.08g苯硅烷，氮气搅拌1分钟后加入0.289g四（三苯基膦）钯，反应0.5h，抽干，DCM洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
将Fmoc-Glu-OtBu（2.128g，5mmol）、HOBt（0.709g，5.25mmol）和PyBOP（2.602g，5mmol）溶解在25ml DMF中，冰浴条件下加入DIPEA（1.75ml，10mmol）活化3分钟，将活化好的溶液加入上述固相反应柱，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DMF洗涤4次，DCM洗涤2次。
向上述固相反应柱中加入20ml DCM和DIPEA（1.75ml，10mmol），氮气搅拌均匀后缓慢滴加棕榈酰氯（1.374g，5mmol），滴加完毕后继续反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DCM洗涤6次，MeOH收缩，真空干燥后得到肽树脂8.0g。
实施例19肽树脂的制备
取实施例12制得的3.58g Fmoc-Gly-王树脂（0.108mmol/g）装入固相反应柱中，DMF洗两次，DMF溶胀30分钟，DBLK脱保护（5+7min），DMF洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
将实施例1提供的Fmoc-Gly-Arg（pbf）-OH（2.117g，3mmol）和HOBt（0.426g，3.15mmol）溶解在15ml DMF中，冰浴条件下加入DIC（0.49ml，3.15mmol）活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性，Fmoc-Gly-Arg（pbf）-Gly-王树脂。抽干反应液，DMF洗涤3次，DBLK脱保护（5+7min），DMF洗涤6次，茚三酮检测呈阴性，得到H-Gly-Arg（pbf）-Gly-王树脂。
按照Fmoc-Gly-Arg（pbf）-OH偶联的方法，在H-Gly-Arg（pbf）-Gly-王树脂上依次偶联Fmoc-Arg（Pbf）-OH、实施例2提供的Fmoc-Leu-Val-OH、实施例10提供的Fmoc-Ile-Ala-Trp（Boc）-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Lys（Alloc）-OH、实施例7提供的Fmoc-Ala-Ala-OH、Fmoc-Gln（Trt）-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr（tBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp（OtBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Thr（tBu）-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr（tBu）-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Ala-OH。
将Boc-His（trt）-OH（1.858g，3mmol）和HOBt（0.426g，3.15mmol）溶解于15ml DMF中，冰浴条件下加入DIC（0.49ml，3.15mmol）活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌2h，茚三酮检测呈阴性，DMF洗涤4次，DCM洗涤2次。
向上述固相反应柱中加入15ml DCM和1.08g苯硅烷，氮气搅拌1分钟后加入0.289g四（三苯基膦）钯，反应0.5h，抽干，DCM洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
将Fmoc-Glu-OtBu（2.128g，5mmol）、HOBt（0.709g，5.25mmol）和PyBOP（2.602g，5mmol）溶解在25ml DMF中，冰浴条件下加入DIPEA（1.75ml，10mmol）活化3分钟，将活化好的溶液加入上述固相反应柱，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DMF洗涤4次，DCM洗涤2次。
向上述固相反应柱中加入20ml DCM和DIPEA（1.75ml，10mmol），氮气搅拌均匀后缓慢滴加棕榈酰氯（1.374g，5mmol），滴加完毕后继续反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DCM洗涤6次，MeOH收缩，真空干燥后得到肽树脂7.8g。
实施例20利拉鲁肽粗肽的制备
取实施例15制得的肽树脂7.94g加入到圆底烧瓶中，加入80ml冰冻2h的裂解液（TFA︰Anisole︰Thioanisole︰TIS︰H2O︰EDT=90︰5︰3︰3︰3︰3），室温搅拌反应2h，过滤，滤液加入到800ml冰冻无水乙醚中，离心收集固体，干燥后得到3.38g如SEQ ID NO.1所示的利拉鲁肽粗肽，收率为90.1%，纯度为72.46%，HPLC图谱如图1所示，HPLC图谱数据如表1所示。
表1利用本发明提供的方法制备的利拉鲁肽的HPLC图谱
特征峰相对保留时间与峰面积检测结果
序号 相对保留时间RT（min） 峰面积（AU*min） 峰面积比（%）
1 17.002 106868 0.88
2 16.167 12078 0.10
3 20.633 133933 1.11
4 21.615 160303 1.32
5 22.245 259681 2.14
6 22.754 136484 1.13
7 23.787 789228 6.52
8 24.805 292603 2.42
9 25.915 8774675 72.46
10 28.164 443824 3.67
11 28.675 98251 0.81
12 29.816 224918 1.86
13 32.474 29061 0.24
14 33.648 35525 0.29
实施例21利拉鲁肽粗肽的制备
取实施例16制得的肽树脂7.98g加入到圆底烧瓶中，加入80ml冰冻2h的裂解液（TFA︰TIS︰H2O︰EDT=90︰4︰3︰3），室温搅拌反应2h，过滤，滤液加入到800ml冰冻无水乙醚中，离心收集固体，干燥后得到3.34g如SEQID NO.1所示的利拉鲁肽粗肽，收率为89.1%，纯度为71.8%，HPLC图谱与实施例20提供的图谱相似。
实施例22利拉鲁肽粗肽的制备
取实施例17制得的肽树脂7.87g加入到圆底烧瓶中，加入80ml冰冻2h的裂解液（TFA︰Anisole︰Thioanisole︰TIS︰H2O︰EDT=92︰3︰2︰1︰1︰1），室温搅拌反应2h，过滤，滤液加入到800ml冰冻无水乙醚中，离心收集固体，干燥后得到3.41g如SEQ ID NO.1所示的利拉鲁肽粗肽，收率为90.9%，纯度为72.1%，HPLC图谱与实施例20提供的图谱相似。
实施例23利拉鲁肽粗肽的制备
取实施例18制得的肽树脂8.0g加入到圆底烧瓶中，加入80ml冰冻2h的裂解液（TFA︰Anisole︰Thioanisole︰EDT=93︰3︰2︰2），室温搅拌反应2h，过滤，滤液加入到800ml冰冻无水乙醚中，离心收集固体，干燥后得到3.27g如SEQ ID NO.1所示的利拉鲁肽粗肽，收率为87.2%，纯度为70.9%，HPLC图谱与实施例20提供的图谱相似。
实施例24利拉鲁肽粗肽的制备
取实施例19制得的肽树脂7.8g加入到圆底烧瓶中，加入80ml冰冻2h的裂解液（TFA︰Anisole︰EDT=95︰3︰2），室温搅拌反应2h，过滤，滤液加入到800ml冰冻无水乙醚中，离心收集固体，干燥后得到3.36g如SEQ IDNO.1所示的利拉鲁肽粗肽，收率为89.6%，纯度为72.1%，HPLC图谱与实施例20提供的图谱相似。
实施例25利拉鲁肽精肽的制备
将实施例20制得的利拉鲁肽粗肽加入10%乙腈/90%水（V/V），超声使其完全溶解，用滤膜过滤，收集滤液备用。
取滤液进行第一步HPLC纯化。纯化条件：以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为50mm×250mm；流动相中，A相为0.1%三氟乙酸/85%水/15%甲醇溶液水溶液，B相为0.1%三氟醋酸的乙腈，流速为50～80ml/min，梯度为40%B～60%B，检测波长为275nm；进样量为3g。纯化过程：将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为1.5～3g。线性梯度洗脱40min，收集目的峰，得到纯度大于95%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超过35℃的条件下减压旋蒸浓缩至约10～30mg/ml，得到第一步纯化馏分。
取第一步纯化馏分进行第二步HPLC纯化。纯化条件：以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为50mm×250mm；流动相中，A相为20mM碳酸氢铵的水溶液，B相为色谱纯乙腈，梯度为40%B～60%B，检测波长为275nm；进样量为1.5g。纯化过程：将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净平衡后将第一步纯化馏分上样，上样量为1.5g。线性梯度洗脱40min，收集目的峰，得到纯度大于97%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超过35℃的条件下减压旋蒸浓缩至约15-25mg/ml，得到第二步纯化馏分。
取第二步纯化馏分进行第三步HPLC脱盐纯化。纯化条件：以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为50mm×250mm；流动相中，A相为0.01%氨水的水溶液，B相为色谱纯乙腈，梯度为30%B～60%B，检测波长为275nm；进样量为1.0g。纯化过程：将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净平衡后将第二步纯化馏分上样，上样量为1.0g。线性梯度洗脱30min，收集目的峰，得到纯度大于98%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超过35℃的条件下减压旋蒸浓缩至约65mg/ml后进行冷冻干燥，即可得到如SEQ ID NO.1所示的利拉鲁肽精肽，重量为0.69g，纯度大于99%，纯化收率为75%，总收率达18.5%。
实施例26利拉鲁肽精肽的制备
取实施例21制备的利拉鲁肽粗肽，按照实施例25提供的纯化方法，对其进行纯化，得到0.69g如SEQ ID NO.1所示的利拉鲁肽精肽，纯度为99.5%，纯化收率为75%，总收率达18.5%。
实施例27利拉鲁肽精肽的制备
取实施例22制备的利拉鲁肽粗肽，按照实施例25提供的纯化方法，对其进行纯化，得到0.68g如SEQ ID NO.1所示的利拉鲁肽精肽，纯度为99.6%，纯化收率为73%，总收率达18.1%。
实施例28利拉鲁肽精肽的制备
取实施例23制备的利拉鲁肽粗肽，按照实施例25提供的纯化方法，对其进行纯化，得到0.64g如SEQ ID NO.1所示的利拉鲁肽精肽，纯度为99.8%，纯化收率为72%，总收率达17.1%。
实施例29利拉鲁肽精肽的制备
取实施例24制备的利拉鲁肽粗肽，按照实施例25提供的纯化方法，对其进行纯化，得到0.66g如SEQ ID NO.1所示的利拉鲁肽精肽，纯度为99.6%，纯化收率为74%，总收率达17.6%。
对比例1利拉鲁肽粗肽的制备
取实施例13制得的3.58g Fmoc-Gly-王树脂（0.279mmol/g）装入固相反应柱中，DMF洗两次，DMF溶胀30分钟，DBLK脱保护（5+7min），DMF洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
将Fmoc-Arg（Pbf）-OH（1.85g，3mmol）和HOBt（0.426g，3.15mmol）溶解在15ml DMF中，冰浴条件下加入DIC（0.49ml，3.15mmol）活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性。抽干反应液，DMF洗涤3次，DBLK脱保护（5+7min），DMF洗涤6次，茚三酮检测呈阴性，得到Fmoc-Arg（Pbf）-Gly-王树脂。
按照上述Fmoc-Arg（Pbf）-OH偶联的方法，在Fmoc-Arg（Pbf）-Gly-王树脂上依次偶联Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg（Pbf）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp（Boc）-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Lys（Alloc）-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln（Trt）-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr（tBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp（OtBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Thr（tBu）-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr（tBu）-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Ala-OH、Boc-His（trt）-OH。
向上述固相反应柱中加入15ml DCM和1.08g苯硅烷，氮气搅拌1分钟后加入0.289g四（三苯基膦）钯，反应0.5h，抽干，DCM洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
将Fmoc-Glu-OtBu（2.128g，5mmol）、HOBt（0.709g，5.25mmol）和PyBOP（2.602g，5mmol）溶解在25ml DMF中，冰浴条件下加入DIPEA（1.75ml，10mmol）活化3分钟，将活化好的溶液加入上述固相反应柱，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DMF洗涤4次，DCM洗涤2次。
向上述固相反应柱中加入20ml DCM和DIPEA（1.75ml，10mmol），氮气搅拌均匀后缓慢滴加棕榈酰氯（1.374g，5mmol），滴加完毕后继续反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DCM洗涤6次，MeOH收缩，真空干燥后得到利拉鲁肽肽树脂6.9g。
向装有利拉鲁肽肽树脂6.9g的圆底烧瓶中加入70ml冰冻2h的裂解液（TFA︰Anisole︰Thioanisole︰EDT=90︰5︰3︰2），室温搅拌反应2h，过滤，滤液加入到700ml冰冻无水乙醚中，离心收集固体，干燥后得到3.05g如SEQID NO.1所示的利拉鲁肽粗肽，收率81.2%，纯度70.17%，HPLC图谱如图2所示，HPLC图谱数据如表2所示。
表2利用现有技术制备的利拉鲁肽的HPLC图谱
特征峰相对保留时间与峰面积检测结果
序号 相对保留时间RT（min） 峰面积（AU*min） 峰面积比（%）
1 10.133 50806 0.36
2 34.142 502811 3.59
3 13.139 41601 0.30
4 13.565 153858 1.10
5 14.509 121073 0.86
6 16.273 126221 0.90
7 18.162 24750 0.18
8 19.957 65873 0.47
9 20.669 206585 1.48
10 21.546 194930 1.39
11 22.920 1129859 8.07
12 23.350 526927 3.76
13 24.153 170893 1.22
14 24.915 9822736 70.17
实施例20中制备的利拉鲁肽粗肽收率达90.1%，纯度为72.46%，与对比例1提供的方法相比，利拉鲁肽粗肽的收率和纯度分别提高了10.96%、3.26%。实施例21中获得的利拉鲁肽粗肽的收率和纯度与对比例1相比分别提高了9.73%、2.32%，实施例22中获得的利拉鲁肽粗肽的收率和纯度与对比例1相比分别提高了11.95%、2.75%，实施例23中获得的利拉鲁肽粗肽的收率和纯度与对比例1相比分别提高了7.39%、1.04%，实施例24中获得的利拉鲁肽粗肽的收率和纯度与对比例1相比分别提高了10.34%、2.75%。由此可知，本发明提供的利拉鲁肽的合成方法可提高利拉鲁肽粗肽的纯度和收率，有利于纯化。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种利拉鲁肽的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
获得二肽片段和/或三肽片段；
获得Gly-树脂；
取所述二肽片段、所述三肽片段或其组合与氨基酸、所述Gly-树脂偶联，得到肽树脂，经侧链修饰、裂解、纯化、冻干，即得；
所述二肽片段为Gly-Arg、Leu-Val、Trp-Leu、Ala-Trp、Ile-Ala、Phe-Ile或Ala-Ala；
所述三肽片段为Trp-Leu-Val、Ala-Trp-Leu、Ile-Ala-Trp或Phe-Ile-Ala；
所述肽的序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述组合为Gly-Arg、Leu-Val、Ala-Trp、Phe-Ile或Ala-Ala中的任意两者或两者以上二肽片段的组合。
3.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述组合为Gly-Arg、Trp-Leu、Ile-Ala或Ala-Ala中不少于三个二肽片段的组合。
4.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述组合为Gly-Arg、Trp-Leu-Val、Phe-Ile-Ala或Ala-Ala中至少包含一个三肽片段的组合。
5.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述组合为Ala-Trp-Leu与Gly-Arg、Phe-Ile或Ala-Ala中的一者或两者以上的组合。
6.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述组合为Ile-Ala-Trp与Gly-Arg、Leu-Val或Ala-Ala中的一者或两者以上的组合。
7.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述侧链修饰具体为：脱除所述肽树脂中Lys的侧链保护基团，与Glu、棕榈酰氯偶联。
8.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述裂解的试剂为Anisole、Thioanisole、TIS、H2O或EDT中的一者或两者以上的混合物与TFA的混合物。
9.根据权利要求8所述的合成方法，其特征在于，所述裂解的试剂中所述TFA、所述Anisole、所述Thioanisole、所述TIS、所述H2O与所述EDT的体积比为（90～95）︰（0～5）︰（0～3）︰（0～3）︰（0～3）︰（0～3）。
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