CN103304659B - 利拉鲁肽的固相制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及多肽合成领域，特别涉及利拉鲁肽的固相制备方法。本发明将困难序列或包含困难序列的单个片断连接到树脂上，其他区域仍采用逐步偶联的方法进行氨基酸连接,粗肽纯度和收率都显著提高，且成本相对较低。
Description
技术领域
本发明涉及多肽合成领域，特别涉及利拉鲁肽的固相制备方法。
背景技术
随着生活水平的提高和生活方式的改变，近年来，我国糖尿病的发病率有逐年增加的趋势。糖尿病是由遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等各种致病因子作用于机体，导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗等，继而引发体内糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征，临床上以高血糖为主要特点，典型病例可出现多尿、多饮、多食、消瘦等表现，即“三多一少”症状，一旦控制不好会引发严重的并发症，导致肾、眼、足等部位的衰竭病变，且无法治愈。糖尿病分为妊娠期糖尿病、特异性糖尿病、I型糖尿病和II型糖尿病。其中，II型糖尿病又名非胰岛素依赖型糖尿病，特点是人体自身能够产生胰岛素，但细胞无法对其作出反应，使胰岛素的效果大打折扣。
II型糖尿病主要通过口服或皮下注射降糖药治疗。针对II型糖尿病的降糖药种类很多，包括二甲双胍、磺脲类药物和胰高血糖样肽-1（GLP-1）的受体激动素等，GLP-1的受体激动素是近年来研究的热点。其中，利拉鲁肽（liraglutide）是GLP-1的受体激动素之一，2010年1月25日，美国FDA批准由丹麦诺和诺德公司研发的利拉鲁肽（商品名为Victoza）注射剂在美国上市，2011年3月4日，利拉鲁肽获得SFDA批准上市。利拉鲁肽的化学表述为Arg34Lys26-[N-ε-(γ-Glu-(N-hexadecanoyl))]-GLP-17-37，分子式为C172H265N43O51，相对分子质量3751.2，CAS登记号为204656-20-2，分子式如式I所示，与天然GLP-1相比，药效相当且作用时间更长。
目前，诺和诺德公司主要是通过基因重组技术，利用酵母生产利拉鲁肽；但由于需要采用基因重组技术，技术难度大，成本相对较高，同时由于Arg34-GLP-1（7-37）-OH的侧链处于未保护状态，和Nα-hexadecanoyl-Glu(ONSu)-OtBu反应时会产生较多杂质，损失较大。还有报道固相逐步偶联的方法进行制备，由于利拉鲁肽的序列中有很多的疏水氨基酸，逐步偶联时树脂收缩严重，反应不完全，导致粗肽中和产品性质相近杂质较多，HPLC制备比较困难，收率较低。因此，提供一种产品收率高、成本低廉的利拉鲁肽制备方法具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种利拉鲁肽的固相制备方法。该方法将困难序列或包含困难序列的单个片断连接到树脂上，其他区域仍采用逐步偶联的方法进行氨基酸连接,粗肽纯度和收率都显著提高，且成本相对较低。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种利拉鲁肽的固相制备方法，包括如下步骤：
步骤1：制备获得第一多肽片段-第一树脂，第一多肽片段-第一树脂中第一多肽片段的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示；
步骤2：制备获得第二多肽片段-第二树脂，第二多肽片段-第二树脂中第二多肽片段的氨基酸序列包含如SEQIDNo.13所示的氨基酸序列；
步骤3：取第二多肽片段-第二树脂，经第一裂解后获得第二多肽片段；
步骤4：取第二多肽片段与第一多肽片段-第一树脂偶联，获得第三多肽片段-第一树脂，再按照利拉鲁肽的氨基酸序列逐步偶联剩余氨基酸，经第二裂解、纯化，即得。
在本发明的一些实施例中，第二多肽片段具有如下氨基酸序列中的任意一个：
如SEQIDNo.2所示；
或如SEQIDNo.3所示；
或如SEQIDNo.4所示；
或如SEQIDNo.5所示；
或如SEQIDNo.6所示；
或如SEQIDNo.7所示；
或如SEQIDNo.8所示；
或如SEQIDNo.9所示；
或如SEQIDNo.10所示；
或如SEQIDNo.11所示；
或如SEQIDNo.12所示；
或如SEQIDNo.13所示。
在本发明的另一些实施例中，第三多肽片段-第一树脂中第三多肽片段具有如下氨基酸序列中的任意一个：
如SEQIDNo.14所示；
或如SEQIDNo.15所示；
或如SEQIDNo.16所示；
或如SEQIDNo.17所示；
或如SEQIDNo.18所示；
或如SEQIDNo.19所示；
或如SEQIDNo.20所示；
或如SEQIDNo.21所示；
或如SEQIDNo.22所示；
或如SEQIDNo.23所示；
或如SEQIDNo.24所示；
或如SEQIDNo.25所示。
在本发明的一些实施例中，按照利拉鲁肽的氨基酸序列逐步偶联剩余氨基酸时，最后偶联Fmoc-Glu-OtBu。
作为优选，第一多肽片段-第一树脂中第一树脂为王树脂。
作为优选，第二多肽片段-第二树脂中第二树脂为2-CTC树脂。
本发明提供的利拉鲁肽的制备方法包括如下步骤：制备获得第一多肽片段-第一树脂，第一多肽片段-第一树脂中第一多肽片段的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示；制备获得第二多肽片段-第二树脂，第二多肽片段-第二树脂中第二多肽片段的氨基酸序列包含如SEQIDNo.13所示的氨基酸序列；取第二多肽片段-第二树脂，经第一裂解后获得第二多肽片段；取第二多肽片段与第一多肽片段-第一树脂偶联，获得第三多肽片段-第一树脂，再按照利拉鲁肽的氨基酸序列逐步偶联剩余氨基酸，经第二裂解、纯化，即得。本发明将困难序列或包含困难序列的单个片断连接到树脂上，其他区域仍采用逐步偶联的方法进行氨基酸连接,粗肽纯度和收率都显著提高，且成本相对较低。
附图说明
图1示实施例15制得的利拉鲁肽粗肽的HPLC图谱。
具体实施方式
本发明公开了一种利拉鲁肽的固相制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换+和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的利拉鲁肽的固相制备方法中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1Fmoc-Gly-WangResin的制备
称取100g替代度为0.803mmol/g的WangResin加入到固相反应柱中，DMF洗涤2次，DMF溶胀30min，DMF洗涤2次，将Fmoc-Gly-OH(35.81g，120.5mmol)和HOBt(17.9g，132.5mmol)溶解于DMF中，冰浴10min后加入DIC(16.72g，132.5mmol)活化3～5min后加入反应柱，同时加入DMAP(1.47g，12.05mmol)，氮气搅拌反应2h，抽干反应液，DMF洗涤4次，DCM洗涤3次，加入乙酸酐（164g，160.6mmol）和吡啶（127g，160.6mmol）的DCM溶液封闭8h，抽掉封闭液，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次，MeOH收缩，干燥，得到Fmoc-Gly-WangResin，替代度0.36mmol/g。
实施例2第一多肽片段-第一树脂的制备
称取13.89g替代度为0.36mmol/g的Fmoc-Gly-WangResin加入到固相反应柱中，DMF洗涤2次，DMF溶胀30min，DMF洗涤2次，将Fmoc-Arg（pbf）-OH(9.73g，15mmol)和HOBt(2.13g，15.8mmol)溶解于DMF中，冰浴10min，加入DIC（1.98g，15.8mmol）活化3～5min后加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤3次，20%DBLK脱保护（6+6min），DMF洗涤6次；
将Fmoc-Gly-OH(4.46g，15mmol)和HOBt(2.13g，15.8mmol)溶解于DMF中，冰浴10min，加入DIC（1.98g，15.8mmol）活化3～5min后加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤3次，20%DBLK脱保护（6+6min），DMF洗涤6次；
按上述操作依次连接Fmoc-Arg（pbf）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp（Boc）-OH和Fmoc-Ala-OH得到第一多肽片段-WangResin，第一多肽片段的序列如SEQIDNo.1所示。
实施例3序列如SEQIDNo.2所示的第二多肽片段Fmoc-Thr（tBu）-Phe-Thr（tBu）-Ser（tBu）-Asp（OtBu）-Val-Ser（tBu）-Ser（tBu）-Tyr（tBu）-Leu-Glu（OtBu）-Gly-Gln（trt）-Ala-Ala-Lys（Alloc）-Glu（OtBu）-Phe-Ile-OH的制备
称取46.5g替代度为0.86mmol/g的2-CTCResin加入到固相反应柱中，DMF洗涤2次，DMF溶胀30min，DMF洗涤2次，将Fmoc-Ile-OH(42.4g，120mmol)和DIPEA(15.5g，120mmol)溶解于DMF中，冰浴10min后加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应5分钟后再次加入15.5gDIPEA,继续反应1h，加入25.6gMeOH封闭20分钟，抽干反应液，DMF洗涤6次，得到Fmoc-Ile-2-CTCResin；
在Fmoc-Ile-2-CTCResin中加入20%DBLK脱保护（6+6min），DMF洗涤6次，将Fmoc-Phe-OH（46.5g，120mmol）、HOBt（17.0g，126mmol）和PyBOP(62.5g，120mmol)溶解于DMF中，冰浴10分钟，加入DIPEA（31.0g，240mmol）活化5分钟后加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤3次，20%DBLK脱保护（6+6）min，DMF洗涤6次；
按上述操作依次连接Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Lys（Alloc）-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln（trt）-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr（tBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp（OtBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Thr（tBu）-OH和Fmoc-Phe-OH；
将Fmoc-Thr（tBu）-OH(47.7g，120mmol)、HOBt（17.0g，126mmol）和PyBOP(62.5g，120mmol)溶解于DMF中，冰浴10分钟，加入DIPEA（31.0g，240mmol）活化5分钟后加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤4次，DCM洗2次，MeOH收缩（5+5+10min），真空干燥，得到155g第二片段-2-CTCResin，其中第二多肽片段序列如SEQIDNo.2所示。
将第二多肽片段-2-CTCResin转移至2L单口烧瓶中，加入1550ml20%TFE/DCM(V:V)，机械搅拌反应2h，过滤，滤液加入到15.5L冰冻无水乙醚中沉降，离心收集固体，无水乙醚洗3次，真空干燥后得到白色粉末状固体90.6g，收率：72%，纯度：90.4%。
实施例4序列如SEQIDNo.3所示的第二多肽片段Fmoc-Phe-Thr（tBu）-Ser（tBu）-Asp（OtBu）-Val-Ser（tBu）-Ser（tBu）-Tyr（tBu）-Leu-Glu（OtBu）-Gly-Gln（trt）-Ala-Ala-Lys（Alloc）-Glu（OtBu）-Phe-Ile-OH的制备
称取46.5g替代度为0.86mmol/g的2-CTCResin加入到固相反应柱中，DMF洗涤2次，DMF溶胀30min，DMF洗涤2次，将Fmoc-Ile-OH(42.4g，120mmol)和DIPEA(15.5g，120mmol)溶解于DMF中，冰浴10min后加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应5分钟后再次加入15.5gDIPEA,继续反应1h，加入25.6gMeOH封闭20分钟，抽干反应液，DMF洗涤6次，得到Fmoc-Ile-2-CTCResin；
在Fmoc-Ile-2-CTCResin中加入20%DBLK脱保护（6+6min），DMF洗涤6次，将Fmoc-Phe-OH（46.5g，120mmol）、HOBt（17.0g，126mmol）和PyBOP(62.5g，120mmol)溶解于DMF中，冰浴10分钟，加入DIPEA（31.0g，240mmol）活化5分钟后加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤3次，20%DBLK脱保护（6+6）min，DMF洗涤6次；
按上述操作依次连接Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Lys（Alloc）-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln（trt）-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr（tBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp（OtBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH和Fmoc-Thr（tBu）-OH；
将Fmoc-Phe-OH(46.5g，120mmol)、HOBt（17.0g，126mmol）和PyBOP(62.5g，120mmol)溶解于DMF中，冰浴10分钟，加入DIPEA（31.0g，240mmol）活化5分钟后加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤4次，DCM洗2次，MeOH收缩（5+5+10min），真空干燥，得到139g第二多肽片段-2-CTCResin，其中第二多肽片段序列如SEQIDNo.3所示。
将第二多肽片段-2-CTCResin转移至2L单口烧瓶中，加入1390ml20%TFE/DCM(V:V)，机械搅拌反应2h，过滤，滤液加入到13.9L冰冻无水乙醚中沉降，离心收集固体，无水乙醚洗3次，真空干燥后得到白色粉末状固体89.2g，收率：75%，纯度：91.2%。
实施例5序列如SEQIDNo.4所示的第二多肽片段Fmoc-Thr（tBu）-Ser（tBu）-Asp（OtBu）-Val-Ser（tBu）-Ser（tBu）-Tyr（tBu）-Leu-Glu（OtBu）-Gly-Gln（trt）-Ala-Ala-Lys（Alloc）-Glu（OtBu）-Phe-Ile-OH的制备
称取46.5g替代度为0.86mmol/g的2-CTCResin加入到固相反应柱中，DMF洗涤2次，DMF溶胀30min，DMF洗涤2次，将Fmoc-Ile-OH(42.4g，120mmol)和DIPEA(15.5g，120mmol)溶解于DMF中，冰浴10min后加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应5分钟后再次加入15.5gDIPEA,继续反应1h，加入25.6gMeOH封闭20分钟，抽干反应液，DMF洗涤6次，得到Fmoc-Ile-2-CTCResin；
在Fmoc-Ile-2-CTCResin中加入20%DBLK脱保护（6+6min），DMF洗涤6次，将Fmoc-Phe-OH（46.5g，120mmol）、HOBt（17.0g，126mmol）和PyBOP(62.5g，120mmol)溶解于DMF中，冰浴10分钟，加入DIPEA（31.0g，240mmol）活化5分钟后加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤3次，20%DBLK脱保护（6+6）min，DMF洗涤6次；
按上述操作依次连接Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Lys（Alloc）-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln（trt）-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr（tBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp（OtBu）-OH和Fmoc-Ser（tBu）-OH；
将Fmoc-Thr（tBu）-OH(47.7g，120mmol)、HOBt（17.0g，126mmol）和PyBOP(62.5g，120mmol)溶解于DMF中，冰浴10分钟，加入DIPEA（31.0g，240mmol）活化5分钟后加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤4次，DCM洗2次，MeOH收缩（5+5+10min），真空干燥，得到133g第二多肽片段-2-CTCResin，其中第二多肽片段序列如SEQIDNo.4所示。
将第二多肽片段-2-CTCResin转移至2L单口烧瓶中，加入1330ml20%TFE/DCM(V:V)，机械搅拌反应2h，过滤，滤液加入到13.3L冰冻无水乙醚中沉降，离心收集固体，无水乙醚洗3次，真空干燥后得到白色粉末状固体88.6g，收率：78%，纯度：91.5%。
实施例6序列如SEQIDNo.5所示的第二多肽片段Fmoc-Ser（tBu）-Asp（OtBu）-Val-Ser（tBu）-Ser（tBu）-Tyr（tBu）-Leu-Glu（OtBu）-Gly-Gln（trt）-Ala-Ala-Lys（Alloc）-Glu（OtBu）-Phe-Ile-OH的制备
称取46.5g替代度为0.86mmol/g的2-CTCResin加入到固相反应柱中，DMF洗涤2次，DMF溶胀30min，DMF洗涤2次，将Fmoc-Ile-OH(42.4g，120mmol)和DIPEA(15.5g，120mmol)溶解于DMF中，冰浴10min后加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应5分钟后再次加入15.5gDIPEA,继续反应1h，加入25.6gMeOH封闭20分钟，抽干反应液，DMF洗涤6次，得到Fmoc-Ile-2-CTCResin；
在Fmoc-Ile-2-CTCResin中加入20%DBLK脱保护（6+6min），DMF洗涤6次，将Fmoc-Phe-OH（46.5g，120mmol）、HOBt（17.0g，126mmol）和PyBOP(62.5g，120mmol)溶解于DMF中，冰浴10分钟，加入DIPEA（31.0g，240mmol）活化5分钟后加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤3次，20%DBLK脱保护（6+6）min，DMF洗涤6次；
按上述操作依次连接Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Lys（Alloc）-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln（trt）-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr（tBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Val-OH和Fmoc-Asp（OtBu）-OH；
将Fmoc-Ser（tBu）-OH(46.0g，120mmol)、HOBt（17.0g，126mmol）和PyBOP(62.5g，120mmol)溶解于DMF中，冰浴10分钟，加入DIPEA（31.0g，240mmol）活化5分钟后加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤4次，DCM洗2次，MeOH收缩（5+5+10min），真空干燥，得到126g第二多肽片段-2-CTCResin，其中第二多肽片段序列如SEQIDNo.5所示。
将第二多肽片段-2-CTCResin转移至2L单口烧瓶中，加入1260ml20%TFE/DCM(V:V)，机械搅拌反应2h，过滤，滤液加入到12.6L冰冻无水乙醚中沉降，离心收集固体，无水乙醚洗3次，真空干燥后得到白色粉末状固体83.4g，收率：78%，纯度：91.9%。
实施例7序列如SEQIDNo.6所示的第二多肽片段Fmoc-Asp（OtBu）-Val-Ser（tBu）-Ser（tBu）-Tyr（tBu）-Leu-Glu（OtBu）-Gly-Gln（trt）-Ala-Ala-Lys（Alloc）-Glu（OtBu）-Phe-Ile-OH的制备
称取46.5g替代度为0.86mmol/g的2-CTCResin加入到固相反应柱中，DMF洗涤2次，DMF溶胀30min，DMF洗涤2次，将Fmoc-Ile-OH(42.4g，120mmol)和DIPEA(15.5g，120mmol)溶解于DMF中，冰浴10min后加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应5分钟后再次加入15.5gDIPEA,继续反应1h，加入25.6gMeOH封闭20分钟，抽干反应液，DMF洗涤6次，得到Fmoc-Ile-2-CTCResin；
在Fmoc-Ile-2-CTCResin中加入20%DBLK脱保护（6+6min），DMF洗涤6次，将Fmoc-Phe-OH（46.5g，120mmol）、HOBt（17.0g，126mmol）和PyBOP(62.5g，120mmol)溶解于DMF中，冰浴10分钟，加入DIPEA（31.0g，240mmol）活化5分钟后加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤3次，20%DBLK脱保护（6+6）min，DMF洗涤6次；
按上述操作依次连接Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Lys（Alloc）-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln（trt）-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr（tBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH和Fmoc-Val-OH；
将Fmoc-Asp（OtBu）-OH(49.4g，120mmol)、HOBt（17.0g，126mmol）和PyBOP(62.5g，120mmol)溶解于DMF中，冰浴10分钟，加入DIPEA（31.0g，240mmol）活化5分钟后加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤4次，DCM洗2次，MeOH收缩（5+5+10min），真空干燥，得到122g第二多肽片段-2-CTCResin，其中第二多肽片段序列如SEQIDNo.6所示。
将第二多肽片段-2-CTCResin转移至2L单口烧瓶中，加入1220ml20%TFE/DCM(V:V)，机械搅拌反应2h，过滤，滤液加入到12.2L冰冻无水乙醚中沉降，离心收集固体，无水乙醚洗3次，真空干燥后得到白色粉末状固体82.8g，收率：81%，纯度：92.6%。
实施例8序列如SEQIDNo.7所示的第二多肽片段Fmoc-Val-Ser（tBu）-Ser（tBu）-Tyr（tBu）-Leu-Glu（OtBu）-Gly-Gln（trt）-Ala-Ala-Lys（Alloc）-Glu（OtBu）-Phe-Ile-OH的制备
称取46.5g替代度为0.86mmol/g的2-CTCResin加入到固相反应柱中，DMF洗涤2次，DMF溶胀30min，DMF洗涤2次，将Fmoc-Ile-OH(42.4g，120mmol)和DIPEA(15.5g，120mmol)溶解于DMF中，冰浴10min后加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应5分钟后再次加入15.5gDIPEA,继续反应1h，加入25.6gMeOH封闭20分钟，抽干反应液，DMF洗涤6次，得到Fmoc-Ile-2-CTCResin；
在Fmoc-Ile-2-CTCResin中加入20%DBLK脱保护（6+6min），DMF洗涤6次，将Fmoc-Phe-OH（46.5g，120mmol）、HOBt（17.0g，126mmol）和PyBOP(62.5g，120mmol)溶解于DMF中，冰浴10分钟，加入DIPEA（31.0g，240mmol）活化5分钟后加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤3次，20%DBLK脱保护（6+6）min，DMF洗涤6次；
按上述操作依次连接Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Lys（Alloc）-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln（trt）-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr（tBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH和Fmoc-Ser（tBu）-OH；
将Fmoc-Val-OH(40.7g，120mmol)、HOBt（17.0g，126mmol）和PyBOP(62.5g，120mmol)溶解于DMF中，冰浴10分钟，加入DIPEA（31.0g，240mmol）活化5分钟后加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤4次，DCM洗2次，MeOH收缩（5+5+10min），真空干燥，得到115g第二多肽片段-2-CTCResin，其中第二多肽片段序列如SEQIDNo.7所示。
将第二多肽片段-2-CTCResin转移至2L单口烧瓶中，加入1150ml20%TFE/DCM(V:V)，机械搅拌反应2h，过滤，滤液加入到11.5L冰冻无水乙醚中沉降，离心收集固体，无水乙醚洗3次，真空干燥后得到白色粉末状固体79.6g，收率：84%，纯度：93.8%。
实施例9序列如SEQIDNo.8所示的第二多肽片段Fmoc-Ser（tBu）-Ser（tBu）-Tyr（tBu）-Leu-Glu（OtBu）-Gly-Gln（trt）-Ala-Ala-Lys（Alloc）-Glu（OtBu）-Phe-Ile-OH的制备
称取46.5g替代度为0.86mmol/g的2-CTCResin加入到固相反应柱中，DMF洗涤2次，DMF溶胀30min，DMF洗涤2次，将Fmoc-Ile-OH(42.4g，120mmol)和DIPEA(15.5g，120mmol)溶解于DMF中，冰浴10min后加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应5分钟后再次加入15.5gDIPEA,继续反应1h，加入25.6gMeOH封闭20分钟，抽干反应液，DMF洗涤6次，得到Fmoc-Ile-2-CTCResin；
在Fmoc-Ile-2-CTCResin中加入20%DBLK脱保护（6+6min），DMF洗涤6次，将Fmoc-Phe-OH（46.5g，120mmol）、HOBt（17.0g，126mmol）和PyBOP(62.5g，120mmol)溶解于DMF中，冰浴10分钟，加入DIPEA（31.0g，240mmol）活化5分钟后加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤3次，20%DBLK脱保护（6+6）min，DMF洗涤6次；
按上述操作依次连接Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Lys（Alloc）-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln（trt）-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr（tBu）-OH和Fmoc-Ser（tBu）-OH；
将Fmoc-Ser（tBu）-OH(46.0g，120mmol)、HOBt（17.0g，126mmol）和PyBOP(62.5g，120mmol)溶解于DMF中，冰浴10分钟，加入DIPEA（31.0g，240mmol）活化5分钟后加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤4次，DCM洗2次，MeOH收缩（5+5+10min），真空干燥，得到108g第二多肽片段-2-CTCResin，其中第二多肽片段序列如SEQIDNo.8所示。
将第二多肽片段-2-CTCResin转移至2L单口烧瓶中，加入1080ml20%TFE/DCM(V:V)，机械搅拌反应2h，过滤，滤液加入到10.8L冰冻无水乙醚中沉降，离心收集固体，无水乙醚洗3次，真空干燥后得到白色粉末状固体76.8g，收率：86%，纯度：94.6%。
实施例10序列如SEQIDNo.9所示的第二多肽片段Fmoc-Ser（tBu）-Tyr（tBu）-Leu-Glu（OtBu）-Gly-Gln（trt）-Ala-Ala-Lys（Alloc）-Glu（OtBu）-Phe-Ile-OH的制备
称取46.5g替代度为0.86mmol/g的2-CTCResin加入到固相反应柱中，DMF洗涤2次，DMF溶胀30min，DMF洗涤2次，将Fmoc-Ile-OH(42.4g，120mmol)和DIPEA(15.5g，120mmol)溶解于DMF中，冰浴10min后加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应5分钟后再次加入15.5gDIPEA,继续反应1h，加入25.6gMeOH封闭20分钟，抽干反应液，DMF洗涤6次，得到Fmoc-Ile-2-CTCResin；
在Fmoc-Ile-2-CTCResin中加入20%DBLK脱保护（6+6min），DMF洗涤6次，将Fmoc-Phe-OH（46.5g，120mmol）、HOBt（17.0g，126mmol）和PyBOP(62.5g，120mmol)溶解于DMF中，冰浴10分钟，加入DIPEA（31.0g，240mmol）活化5分钟后加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤3次，20%DBLK脱保护（6+6）min，DMF洗涤6次；
按上述操作依次连接Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Lys（Alloc）-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln（trt）-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Leu-OH和Fmoc-Tyr（tBu）-OH；
将Fmoc-Ser（tBu）-OH(46.0g，120mmol)、HOBt（17.0g，126mmol）和PyBOP(62.5g，120mmol)溶解于DMF中，冰浴10分钟，加入DIPEA（31.0g，240mmol）活化5分钟后加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤4次，DCM洗2次，MeOH收缩（5+5+10min），真空干燥，得到100g第二多肽片段-2-CTCResin，其中第二多肽片段序列如SEQIDNo.9所示。
将第二多肽片段-2-CTCResin转移至2L单口烧瓶中，加入1000ml20%TFE/DCM(V:V)，机械搅拌反应2h，过滤，滤液加入到10L冰冻无水乙醚中沉降，离心收集固体，无水乙醚洗3次，真空干燥后得到白色粉末状固体68.6g，收率：82%，纯度：94.8%。
实施例11序列如SEQIDNo.10所示的第二多肽片段Fmoc-Tyr（tBu）-Leu-Glu（OtBu）-Gly-Gln（trt）-Ala-Ala-Lys（Alloc）-Glu（OtBu）-Phe-Ile-OH的制备
称取46.5g替代度为0.86mmol/g的2-CTCResin加入到固相反应柱中，DMF洗涤2次，DMF溶胀30min，DMF洗涤2次，将Fmoc-Ile-OH(42.4g，120mmol)和DIPEA(15.5g，120mmol)溶解于DMF中，冰浴10min后加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应5分钟后再次加入15.5gDIPEA,继续反应1h，加入25.6gMeOH封闭20分钟，抽干反应液，DMF洗涤6次，得到Fmoc-Ile-2-CTCResin；
在Fmoc-Ile-2-CTCResin中加入20%DBLK脱保护（6+6min），DMF洗涤6次，将Fmoc-Phe-OH（46.5g，120mmol）、HOBt（17.0g，126mmol）和PyBOP(62.5g，120mmol)溶解于DMF中，冰浴10分钟，加入DIPEA（31.0g，240mmol）活化5分钟后加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤3次，20%DBLK脱保护（6+6）min，DMF洗涤6次；
按上述操作依次连接Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Lys（Alloc）-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln（trt）-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH和Fmoc-Leu-OH；
将Fmoc-Tyr（tBu）-OH(55.2g，120mmol)、HOBt（17.0g，126mmol）和PyBOP(62.5g，120mmol)溶解于DMF中，冰浴10分钟，加入DIPEA（31.0g，240mmol）活化5分钟后加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤4次，DCM洗2次，MeOH收缩（5+5+10min），真空干燥，得到95g第二多肽片段-2-CTCResin，其中第二多肽片段序列如SEQIDNo.10所示。
将第二多肽片段-2-CTCResin转移至2L单口烧瓶中，加入950ml20%TFE/DCM(V:V)，机械搅拌反应2h，过滤，滤液加入到9.5L冰冻无水乙醚中沉降，离心收集固体，无水乙醚洗3次，真空干燥后得到白色粉末状固体67.6g，收率：87%，纯度：94.6%。
实施例12序列如SEQIDNo.11所示的第二多肽片段Fmoc-Leu-Glu（OtBu）-Gly-Gln（trt）-Ala-Ala-Lys（Alloc）-Glu（OtBu）-Phe-Ile-OH的制备
称取46.5g替代度为0.86mmol/g的2-CTCResin加入到固相反应柱中，DMF洗涤2次，DMF溶胀30min，DMF洗涤2次，将Fmoc-Ile-OH(42.4g，120mmol)和DIPEA(15.5g，120mmol)溶解于DMF中，冰浴10min后加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应5分钟后再次加入15.5gDIPEA,继续反应1h，加入25.6gMeOH封闭20分钟，抽干反应液，DMF洗涤6次，得到Fmoc-Ile-2-CTCResin；
在Fmoc-Ile-2-CTCResin中加入20%DBLK脱保护（6+6min），DMF洗涤6次，将Fmoc-Phe-OH（46.5g，120mmol）、HOBt（17.0g，126mmol）和PyBOP(62.5g，120mmol)溶解于DMF中，冰浴10分钟，加入DIPEA（31.0g，240mmol）活化5分钟后加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤3次，20%DBLK脱保护（6+6）min，DMF洗涤6次；
按上述操作依次连接Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Lys（Alloc）-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln（trt）-OH、Fmoc-Gly-OH和Fmoc-Glu（OtBu）-OH；
将Fmoc-Leu-OH(42.4g，120mmol)、HOBt（17.0g，126mmol）和PyBOP(62.5g，120mmol)溶解于DMF中，冰浴10分钟，加入DIPEA（31.0g，240mmol）活化5分钟后加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤4次，DCM洗2次，MeOH收缩（5+5+10min），真空干燥，得到90g第二多肽片段-2-CTCResin，其中第二多肽片段序列如SEQIDNo.11所示。
将第二多肽片段-2-CTCResin转移至2L单口烧瓶中，加入950ml20%TFE/DCM(V:V)，机械搅拌反应2h，过滤，滤液加入到9.5L冰冻无水乙醚中沉降，离心收集固体，无水乙醚洗3次，真空干燥后得到白色粉末状固体60.6g，收率：88%，纯度：94.5%。
实施例13序列如SEQIDNo.12所示的第二多肽片段Fmoc-Glu（OtBu）-Gly-Gln（trt）-Ala-Ala-Lys（Alloc）-Glu（OtBu）-Phe-Ile-OH的制备
称取46.5g替代度为0.86mmol/g的2-CTCResin加入到固相反应柱中，DMF洗涤2次，DMF溶胀30min，DMF洗涤2次，将Fmoc-Ile-OH(42.4g，120mmol)和DIPEA(15.5g，120mmol)溶解于DMF中，冰浴10min后加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应5分钟后再次加入15.5gDIPEA,继续反应1h，加入25.6gMeOH封闭20分钟，抽干反应液，DMF洗涤6次，得到Fmoc-Ile-2-CTCResin；
在Fmoc-Ile-2-CTCResin中加入20%DBLK脱保护（6+6min），DMF洗涤6次，将Fmoc-Phe-OH（46.5g，120mmol）、HOBt（17.0g，126mmol）和PyBOP(62.5g，120mmol)溶解于DMF中，冰浴10分钟，加入DIPEA（31.0g，240mmol）活化5分钟后加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤3次，20%DBLK脱保护（6+6）min，DMF洗涤6次；
按上述操作依次连接Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Lys（Alloc）-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln（trt）-OH和Fmoc-Gly-OH；
将Fmoc-Glu（OtBu）-OH(51.1g，120mmol)、HOBt（17.0g，126mmol）和PyBOP(62.5g，120mmol)溶解于DMF中，冰浴10分钟，加入DIPEA（31.0g，240mmol）活化5分钟后加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤4次，DCM洗2次，MeOH收缩（5+5+10min），真空干燥，得到82g第二多肽片段-2-CTCResin，其中第二多肽片段序列如SEQIDNo.12所示。
将第二多肽片段-2-CTCResin转移至1L单口烧瓶中，加入820ml20%TFE/DCM(V:V)，机械搅拌反应2h，过滤，滤液加入到8.2L冰冻无水乙醚中沉降，离心收集固体，无水乙醚洗3次，真空干燥后得到白色粉末状固体57.3g，收率：89%，纯度：94.8%。
实施例14序列如SEQIDNo.13所示的第二多肽片段Fmoc-Gly-Gln（trt）-Ala-Ala-Lys（Alloc）-Glu（OtBu）-Phe-Ile-OH的制备
称取46.5g替代度为0.86mmol/g的2-CTCResin加入到固相反应柱中，DMF洗涤2次，DMF溶胀30min，DMF洗涤2次，将Fmoc-Ile-OH(42.4g，120mmol)和DIPEA(15.5g，120mmol)溶解于DMF中，冰浴10min后加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应5分钟后再次加入15.5gDIPEA,继续反应1h，加入25.6gMeOH封闭20分钟，抽干反应液，DMF洗涤6次，得到Fmoc-Ile-2-CTCResin；
在Fmoc-Ile-2-CTCResin中加入20%DBLK脱保护（6+6min），DMF洗涤6次，将Fmoc-Phe-OH（46.5g，120mmol）、HOBt（17.0g，126mmol）和PyBOP(62.5g，120mmol)溶解于DMF中，冰浴10分钟，加入DIPEA（31.0g，240mmol）活化5分钟后加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤3次，20%DBLK脱保护（6+6）min，DMF洗涤6次；
按上述操作依次连接Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Lys（Alloc）-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH和Fmoc-Gln（trt）-OH；
将Fmoc-Gly-OH(35.7g，120mmol)、HOBt（17.0g，126mmol）和PyBOP(62.5g，120mmol)溶解于DMF中，冰浴10分钟，加入DIPEA（31.0g，240mmol）活化5分钟后加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤4次，DCM洗2次，MeOH收缩（5+5+10min），真空干燥，得到79g第二多肽片段-2-CTCResin，其中第二多肽片段序列如SEQIDNo.13所示。
将第二多肽片段-2-CTCResin转移至1L单口烧瓶中，加入790ml20%TFE/DCM(V:V)，机械搅拌反应2h，过滤，滤液加入到7.9L冰冻无水乙醚中沉降，离心收集固体，无水乙醚洗3次，真空干燥后得到白色粉末状固体51.3g，收率：90%，纯度：95.1%。
实施例15合成利拉鲁肽粗品
将实施例3制备的第二多肽片段（10mmol）、HATU(3.81g，10mmol)和HOAt（1.32g，10.5mmol）溶解于DCM中，冰浴条件下加入DIPEA（2.58g，20mmol）活化5分钟，加入到实施例2的第一多肽片段-第一树脂的固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤3次，20%DBLK脱保护（5+5min），DMF洗涤6次得到第三多肽片段-WangResin，其中第三多肽片段序列如SEQIDNo.14所示。
按利拉鲁肽序列，Fmoc固相方法在第三多肽片段-WangResin依次连接剩余氨基酸，连接完成后，向固相反应柱中加入150mlDCM和5.4g苯硅烷，氮气搅拌1分钟后加入1.46g四（三苯基膦）钯，反应0.5h，抽干，DCM洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
将Fmoc-Glu-OtBu（6.38g，15mmol）、HOBt（2.13g，15.75mmol）和PyBOP(7.81g，15mmol)溶解在50mlDMF中，冰浴条件下加入DIPEA(3.88g，30mmol)活化3分钟，将活化好的溶液加入固相反应柱，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DMF洗涤4次，DCM洗涤2次。
向固相反应中加入150mlDCM和DIPEA(3.88g，30mmol)，氮气搅拌均匀后缓慢滴加棕榈酰氯（4.12g，15mmol），滴加完毕后继续反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DCM洗涤6次，MeOH收缩，真空干燥后得到42.7g利拉鲁肽肽树脂。
将利拉鲁肽肽树脂转移至1000ml单口圆底烧瓶中，加入430ml冰冻2h的裂解液（TFA:Anisole：Thioanisole：EDT=90：5：3：2），室温搅拌反应2h，过滤，滤液加入到4.3L冰冻无水乙醚中，离心收集固体，干燥后得到16.9g粗肽，收率：90%，纯度：67.6%，HPLC图谱如图1所示。
实施例16合成利拉鲁肽粗品
将实施例4制备的第二多肽片段（10mmol）、HATU(3.81g，10mmol)和HOAt（1.32g，10.5mmol）溶解于DCM中，冰浴条件下加入DIPEA（2.58g，20mmol）活化5分钟，加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤3次，20%DBLK脱保护（5+5min），DMF洗涤6次得到第三多肽片段-WangResin，其中第三多肽片段序列如SEQIDNo.15所示。
按利拉鲁肽序列，Fmoc固相方法在第三多肽片段-WangResin依次连接剩余氨基酸，连接完成后，向固相反应柱中加入150mlDCM和5.4g苯硅烷，氮气搅拌1分钟后加入1.46g四（三苯基膦）钯，反应0.5h，抽干，DCM洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
将Fmoc-Glu-OtBu（6.38g，15mmol）、HOBt（2.13g，15.75mmol）和PyBOP(7.81g，15mmol)溶解在50mlDMF中，冰浴条件下加入DIPEA(3.88g，30mmol)活化3分钟，将活化好的溶液加入固相反应柱，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DMF洗涤4次，DCM洗涤2次。
向固相反应中加入150mlDCM和DIPEA(3.88g，30mmol)，氮气搅拌均匀后缓慢滴加棕榈酰氯（4.12g，15mmol），滴加完毕后继续反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DCM洗涤6次，MeOH收缩，真空干燥后得到42.9g利拉鲁肽肽树脂。
将利拉鲁肽肽树脂转移至1000ml单口圆底烧瓶中，加入430ml冰冻2h的裂解液（TFA:Anisole：Thioanisole：EDT=90：5：3：2），室温搅拌反应2h，过滤，滤液加入到4.3L冰冻无水乙醚中，离心收集固体，干燥后得到17.2g粗肽，收率：91.4%，纯度：64.8%。
实施例17合成利拉鲁肽粗品
将实施例5制备的第二多肽片段（10mmol）、HATU(3.81g，10mmol)和HOAt（1.32g，10.5mmol）溶解于DCM中，冰浴条件下加入DIPEA（2.58g，20mmol）活化5分钟，加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤3次，20%DBLK脱保护（5+5min），DMF洗涤6次得到第三多肽片段-WangResin，其中第三多肽片段序列如SEQIDNo.16所示。
按利拉鲁肽序列，Fmoc固相方法在第三多肽片段-WangResin依次连接剩余氨基酸，连接完成后，向固相反应柱中加入150mlDCM和5.4g苯硅烷，氮气搅拌1分钟后加入1.46g四（三苯基膦）钯，反应0.5h，抽干，DCM洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
将Fmoc-Glu-OtBu（6.38g，15mmol）、HOBt（2.13g，15.75mmol）和PyBOP(7.81g，15mmol)溶解在50mlDMF中，冰浴条件下加入DIPEA(3.88g，30mmol)活化3分钟，将活化好的溶液加入固相反应柱，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DMF洗涤4次，DCM洗涤2次。
向固相反应中加入150mlDCM和DIPEA(3.88g，30mmol)，氮气搅拌均匀后缓慢滴加棕榈酰氯（4.12g，15mmol），滴加完毕后继续反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DCM洗涤6次，MeOH收缩，真空干燥后得到42.0g利拉鲁肽肽树脂。
将利拉鲁肽肽树脂转移至1000ml单口圆底烧瓶中，加入430ml冰冻2h的裂解液（TFA:Anisole：Thioanisole：EDT=90：5：3：2），室温搅拌反应2h，过滤，滤液加入到4.3L冰冻无水乙醚中，离心收集固体，干燥后得到16.63g粗肽，收率：88.6%，纯度：60.86%。
实施例18合成利拉鲁肽粗品
将实施例6制备的第二多肽片段（10mmol）、HATU(3.81g，10mmol)和HOAt（1.32g，10.5mmol）溶解于DCM中，冰浴条件下加入DIPEA（2.58g，20mmol）活化5分钟，加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤3次，20%DBLK脱保护（5+5min），DMF洗涤6次得到第三多肽片段-WangResin，其中第三多肽片段序列如SEQIDNo.17所示。
按利拉鲁肽序列，Fmoc固相方法在第三多肽片段-WangResin依次连接剩余氨基酸，连接完成后，向固相反应柱中加入150mlDCM和5.4g苯硅烷，氮气搅拌1分钟后加入1.46g四（三苯基膦）钯，反应0.5h，抽干，DCM洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
将Fmoc-Glu-OtBu（6.38g，15mmol）、HOBt（2.13g，15.75mmol）和PyBOP(7.81g，15mmol)溶解在50mlDMF中，冰浴条件下加入DIPEA(3.88g，30mmol)活化3分钟，将活化好的溶液加入固相反应柱，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DMF洗涤4次，DCM洗涤2次。
向固相反应中加入150mlDCM和DIPEA(3.88g，30mmol)，氮气搅拌均匀后缓慢滴加棕榈酰氯（4.12g，15mmol），滴加完毕后继续反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DCM洗涤6次，MeOH收缩，真空干燥后得到42.3g利拉鲁肽肽树脂。
将利拉鲁肽肽树脂转移至1000ml单口圆底烧瓶中，加入430ml冰冻2h的裂解液（TFA:Anisole：Thioanisole：EDT=90：5：3：2），室温搅拌反应2h，过滤，滤液加入到4.3L冰冻无水乙醚中，离心收集固体，干燥后得到17.45g粗肽，收率：92.9%，纯度：60.8%。
实施例19合成利拉鲁肽粗品
将实施例7制备的第二多肽片段（10mmol）、HATU(3.81g，10mmol)和HOAt（1.32g，10.5mmol）溶解于DCM中，冰浴条件下加入DIPEA（2.58g，20mmol）活化5分钟，加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤3次，20%DBLK脱保护（5+5min），DMF洗涤6次得到第三多肽片段-WangResin，其中第三多肽片段序列如SEQIDNo.18所示。
按利拉鲁肽序列，Fmoc固相方法在第三多肽片段-WangResin依次连接剩余氨基酸，连接完成后，向固相反应柱中加入150mlDCM和5.4g苯硅烷，氮气搅拌1分钟后加入1.46g四（三苯基膦）钯，反应0.5h，抽干，DCM洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
将Fmoc-Glu-OtBu（6.38g，15mmol）、HOBt（2.13g，15.75mmol）和PyBOP(7.81g，15mmol)溶解在50mlDMF中，冰浴条件下加入DIPEA(3.88g，30mmol)活化3分钟，将活化好的溶液加入固相反应柱，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DMF洗涤4次，DCM洗涤2次。
向固相反应中加入150mlDCM和DIPEA(3.88g，30mmol)，氮气搅拌均匀后缓慢滴加棕榈酰氯（4.12g，15mmol），滴加完毕后继续反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DCM洗涤6次，MeOH收缩，真空干燥后得到41.6g利拉鲁肽肽树脂。
将利拉鲁肽肽树脂转移至1000ml单口圆底烧瓶中，加入430ml冰冻2h的裂解液（TFA:Anisole：Thioanisole：EDT=90：5：3：2），室温搅拌反应2h，过滤，滤液加入到4.3L冰冻无水乙醚中，离心收集固体，干燥后得到16.85g粗肽，收率：89.7%，纯度：59.86%。
实施例20合成利拉鲁肽粗品
将实施例8制备的第二多肽片段（10mmol）、HATU(3.81g，10mmol)和HOAt（1.32g，10.5mmol）溶解于DCM中，冰浴条件下加入DIPEA（2.58g，20mmol）活化5分钟，加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤3次，20%DBLK脱保护（5+5min），DMF洗涤6次得到第三多肽片段-WangResin，其中第三多肽片段序列如SEQIDNo.19所示。
按利拉鲁肽序列，Fmoc固相方法在第三多肽片段-WangResin依次连接剩余氨基酸，连接完成后，向固相反应柱中加入150mlDCM和5.4g苯硅烷，氮气搅拌1分钟后加入1.46g四（三苯基膦）钯，反应0.5h，抽干，DCM洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
将Fmoc-Glu-OtBu（6.38g，15mmol）、HOBt（2.13g，15.75mmol）和PyBOP(7.81g，15mmol)溶解在50mlDMF中，冰浴条件下加入DIPEA(3.88g，30mmol)活化3分钟，将活化好的溶液加入固相反应柱，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DMF洗涤4次，DCM洗涤2次。
向固相反应中加入150mlDCM和DIPEA(3.88g，30mmol)，氮气搅拌均匀后缓慢滴加棕榈酰氯（4.12g，15mmol），滴加完毕后继续反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DCM洗涤6次，MeOH收缩，真空干燥后得到41.6g利拉鲁肽肽树脂。
将利拉鲁肽肽树脂转移至1000ml单口圆底烧瓶中，加入430ml冰冻2h的裂解液（TFA:Anisole：Thioanisole：EDT=90：5：3：2），室温搅拌反应2h，过滤，滤液加入到4.3L冰冻无水乙醚中，离心收集固体，干燥后得到16.4g粗肽，收率：87.3%，纯度：65.3%。
实施例21合成利拉鲁肽粗品
将实施例9制备的第二多肽片段（10mmol）、HATU(3.81g，10mmol)和HOAt（1.32g，10.5mmol）溶解于DCM中，冰浴条件下加入DIPEA（2.58g，20mmol）活化5分钟，加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤3次，20%DBLK脱保护（5+5min），DMF洗涤6次得到第三多肽片段-WangResin，其中第三多肽片段序列如SEQIDNo.20所示。
按利拉鲁肽序列，Fmoc固相方法在第三多肽片段-WangResin依次连接剩余氨基酸，连接完成后，向固相反应柱中加入150mlDCM和5.4g苯硅烷，氮气搅拌1分钟后加入1.46g四（三苯基膦）钯，反应0.5h，抽干，DCM洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
将Fmoc-Glu-OtBu（6.38g，15mmol）、HOBt（2.13g，15.75mmol）和PyBOP(7.81g，15mmol)溶解在50mlDMF中，冰浴条件下加入DIPEA(3.88g，30mmol)活化3分钟，将活化好的溶液加入固相反应柱，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DMF洗涤4次，DCM洗涤2次。
向固相反应中加入150mlDCM和DIPEA(3.88g，30mmol)，氮气搅拌均匀后缓慢滴加棕榈酰氯（4.12g，15mmol），滴加完毕后继续反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DCM洗涤6次，MeOH收缩，真空干燥后得到42.9g利拉鲁肽肽树脂。
将利拉鲁肽肽树脂转移至1000ml单口圆底烧瓶中，加入430ml冰冻2h的裂解液（TFA:Anisole：Thioanisole：EDT=90：5：3：2），室温搅拌反应2h，过滤，滤液加入到4.3L冰冻无水乙醚中，离心收集固体，干燥后得到16.7g粗肽，收率：89%，纯度：59.9%。
实施例22合成利拉鲁肽粗品
将实施例10制备的第二多肽片段（10mmol）、HATU(3.81g，10mmol)和HOAt（1.32g，10.5mmol）溶解于DCM中，冰浴条件下加入DIPEA（2.58g，20mmol）活化5分钟，加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤3次，20%DBLK脱保护（5+5min），DMF洗涤6次得到第三多肽片段-WangResin，其中第三多肽片段序列如SEQIDNo.21所示。
按利拉鲁肽序列，Fmoc固相方法在第三多肽片段-WangResin依次连接剩余氨基酸，连接完成后，向固相反应柱中加入150mlDCM和5.4g苯硅烷，氮气搅拌1分钟后加入1.46g四（三苯基膦）钯，反应0.5h，抽干，DCM洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
将Fmoc-Glu-OtBu（6.38g，15mmol）、HOBt（2.13g，15.75mmol）和PyBOP(7.81g，15mmol)溶解在50mlDMF中，冰浴条件下加入DIPEA(3.88g，30mmol)活化3分钟，将活化好的溶液加入固相反应柱，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DMF洗涤4次，DCM洗涤2次。
向固相反应中加入150mlDCM和DIPEA(3.88g，30mmol)，氮气搅拌均匀后缓慢滴加棕榈酰氯（4.12g，15mmol），滴加完毕后继续反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DCM洗涤6次，MeOH收缩，真空干燥后得到42.3g利拉鲁肽肽树脂。
将利拉鲁肽肽树脂转移至1000ml单口圆底烧瓶中，加入430ml冰冻2h的裂解液（TFA:Anisole：Thioanisole：EDT=90：5：3：2），室温搅拌反应2h，过滤，滤液加入到4.3L冰冻无水乙醚中，离心收集固体，干燥后得到17.0g粗肽，收率：90.5%，纯度：63.4%。
实施例23合成利拉鲁肽粗品
将实施例11制备的第二多肽片段（10mmol）、HATU(3.81g，10mmol)和HOAt（1.32g，10.5mmol）溶解于DCM中，冰浴条件下加入DIPEA（2.58g，20mmol）活化5分钟，加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤3次，20%DBLK脱保护（5+5min），DMF洗涤6次得到第三多肽片段-WangResin，其中第三多肽片段序列如SEQIDNo.22所示。
按利拉鲁肽序列，Fmoc固相方法在第三多肽片段-WangResin依次连接剩余氨基酸，连接完成后，向固相反应柱中加入150mlDCM和5.4g苯硅烷，氮气搅拌1分钟后加入1.46g四（三苯基膦）钯，反应0.5h，抽干，DCM洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
将Fmoc-Glu-OtBu（6.38g，15mmol）、HOBt（2.13g，15.75mmol）和PyBOP(7.81g，15mmol)溶解在50mlDMF中，冰浴条件下加入DIPEA(3.88g，30mmol)活化3分钟，将活化好的溶液加入固相反应柱，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DMF洗涤4次，DCM洗涤2次。
向固相反应中加入150mlDCM和DIPEA(3.88g，30mmol)，氮气搅拌均匀后缓慢滴加棕榈酰氯（4.12g，15mmol），滴加完毕后继续反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DCM洗涤6次，MeOH收缩，真空干燥后得到41.3g利拉鲁肽肽树脂。
将利拉鲁肽肽树脂转移至1000ml单口圆底烧瓶中，加入430ml冰冻2h的裂解液（TFA:Anisole：Thioanisole：EDT=90：5：3：2），室温搅拌反应2h，过滤，滤液加入到4.3L冰冻无水乙醚中，离心收集固体，干燥后得到16.2g粗肽，收率：86.3%，纯度：66.7%。
实施例24合成利拉鲁肽粗品
将实施例12制备的第二多肽片段（10mmol）、HATU(3.81g，10mmol)和HOAt（1.32g，10.5mmol）溶解于DCM中，冰浴条件下加入DIPEA（2.58g，20mmol）活化5分钟，加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤3次，20%DBLK脱保护（5+5min），DMF洗涤6次得到第三多肽片段-WangResin，其中第三多肽片段序列如SEQIDNo.23所示。
按利拉鲁肽序列，Fmoc固相方法在第三多肽片段-WangResin依次连接剩余氨基酸，连接完成后，向固相反应柱中加入150mlDCM和5.4g苯硅烷，氮气搅拌1分钟后加入1.46g四（三苯基膦）钯，反应0.5h，抽干，DCM洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
将Fmoc-Glu-OtBu（6.38g，15mmol）、HOBt（2.13g，15.75mmol）和PyBOP(7.81g，15mmol)溶解在50mlDMF中，冰浴条件下加入DIPEA(3.88g，30mmol)活化3分钟，将活化好的溶液加入固相反应柱，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DMF洗涤4次，DCM洗涤2次。
向固相反应中加入150mlDCM和DIPEA(3.88g，30mmol)，氮气搅拌均匀后缓慢滴加棕榈酰氯（4.12g，15mmol），滴加完毕后继续反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DCM洗涤6次，MeOH收缩，真空干燥后得到42.4g利拉鲁肽肽树脂。
将利拉鲁肽肽树脂转移至1000ml单口圆底烧瓶中，加入430ml冰冻2h的裂解液（TFA:Anisole：Thioanisole：EDT=90：5：3：2），室温搅拌反应2h，过滤，滤液加入到4.3L冰冻无水乙醚中，离心收集固体，干燥后得到16.86g粗肽，收率：89.78%，纯度：62.1%。
实施例25合成利拉鲁肽粗品
将实施例13制备的第二多肽片段（10mmol）、HATU(3.81g，10mmol)和HOAt（1.32g，10.5mmol）溶解于DCM中，冰浴条件下加入DIPEA（2.58g，20mmol）活化5分钟，加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤3次，20%DBLK脱保护（5+5min），DMF洗涤6次得到第三多肽片段-WangResin，其中第三多肽片段序列如SEQIDNo.24所示。
按利拉鲁肽序列，Fmoc固相方法在第三多肽片段-WangResin依次连接剩余氨基酸，连接完成后，向固相反应柱中加入150mlDCM和5.4g苯硅烷，氮气搅拌1分钟后加入1.46g四（三苯基膦）钯，反应0.5h，抽干，DCM洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
将Fmoc-Glu-OtBu（6.38g，15mmol）、HOBt（2.13g，15.75mmol）和PyBOP(7.81g，15mmol)溶解在50mlDMF中，冰浴条件下加入DIPEA(3.88g，30mmol)活化3分钟，将活化好的溶液加入固相反应柱，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DMF洗涤4次，DCM洗涤2次。
向固相反应中加入150mlDCM和DIPEA(3.88g，30mmol)，氮气搅拌均匀后缓慢滴加棕榈酰氯（4.12g，15mmol），滴加完毕后继续反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DCM洗涤6次，MeOH收缩，真空干燥后得到42.8g利拉鲁肽肽树脂。
将利拉鲁肽肽树脂转移至1000ml单口圆底烧瓶中，加入430ml冰冻2h的裂解液（TFA:Anisole：Thioanisole：EDT=90：5：3：2），室温搅拌反应2h，过滤，滤液加入到4.3L冰冻无水乙醚中，离心收集固体，干燥后得到16.65g粗肽，收率：88.66%，纯度：63.6%。
实施例26合成利拉鲁肽粗品
将实施例14制备的第二多肽片段（10mmol）、HATU(3.81g，10mmol)和HOAt（1.32g，10.5mmol）溶解于DCM中，冰浴条件下加入DIPEA（2.58g，20mmol）活化5分钟，加入到固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤3次，20%DBLK脱保护（5+5min），DMF洗涤6次得到第三多肽片段-WangResin，其中第三多肽片段序列如SEQIDNo.25所示。
按利拉鲁肽序列，Fmoc固相方法在第三多肽片段-WangResin依次连接剩余氨基酸，连接完成后，向固相反应柱中加入150mlDCM和5.4g苯硅烷，氮气搅拌1分钟后加入1.46g四（三苯基膦）钯，反应0.5h，抽干，DCM洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
将Fmoc-Glu-OtBu（6.38g，15mmol）、HOBt（2.13g，15.75mmol）和PyBOP(7.81g，15mmol)溶解在50mlDMF中，冰浴条件下加入DIPEA(3.88g，30mmol)活化3分钟，将活化好的溶液加入固相反应柱，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DMF洗涤4次，DCM洗涤2次。
向固相反应中加入150mlDCM和DIPEA(3.88g，30mmol)，氮气搅拌均匀后缓慢滴加棕榈酰氯（4.12g，15mmol），滴加完毕后继续反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DCM洗涤6次，MeOH收缩，真空干燥后得到42.5g利拉鲁肽肽树脂。
将利拉鲁肽肽树脂转移至1000ml单口圆底烧瓶中，加入430ml冰冻2h的裂解液（TFA:Anisole：Thioanisole：EDT=90：5：3：2），室温搅拌反应2h，过滤，滤液加入到4.3L冰冻无水乙醚中，离心收集固体，干燥后得到16.98g粗肽，收率：90.4%，纯度：59.95%。
实施例27利拉鲁肽精肽的制备
1.样品处理：将实施例15制备获得的粗肽用10%乙腈/90%水（V/V），超声使样品完全溶解后用滤膜过滤，收集滤液备用。
2.HPLC纯化：
纯化条件：色谱柱：以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：50mm×250mm。流动相：A相：0.1%三氟乙酸85%水/15%甲醇溶液水溶液；B相：0.1%三氟醋酸的乙腈，流速：50-80ml/min，梯度：40%B—60%B,检测波长：275nm。进样量为3g。
纯化过程：将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为1.5-3g。线性梯度洗脱40min，收集目的峰，得到纯度大于95%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超过35℃的条件下减压旋蒸浓缩至约10-30mg/ml后作第二步纯化样品。
3.第二步HPLC纯化：
纯化条件：色谱柱：以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：50mm×250mm。流动相：A相：20mM碳酸氢铵的水溶液为A相，色谱纯乙腈为B相，梯度：40%B—60%B，检测波长：275nm。进样量为1.9g。
纯化过程：将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净平衡后将第一步纯化馏分上样，上样量为1.9g。线性梯度洗脱40min，收集目的峰，得到纯度大于98%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超过35℃的条件下减压旋蒸浓缩至约15-25mg/ml后作第三步脱盐纯化样品。
4.第三步HPLC脱盐纯化：色谱柱：以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：50mm×250mm。0.01%氨水的水溶液为A相，色谱纯乙腈为B相，梯度：30%B—60%B，检测波长：275nm。进样量为1.3g。
纯化过程：将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净平衡后将第二步纯化馏分上样，上样量为1.3g。线性梯度洗脱30min，收集目的峰，得到纯度大于98%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超过35℃的条件下减压旋蒸浓缩至约65mg/ml后进行冷冻干燥，得到0.81g精肽，纯化收率为82%，总收率为25.6%。
按照上述方法对实施例16至26制备获得的粗肽进行纯化，获得利拉鲁肽精肽，结果同实施例15制备的粗肽纯化结果相近。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.利拉鲁肽的固相制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：制备获得第一多肽片段-第一树脂，所述第一多肽片段-第一树脂中第一多肽片段的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示；
步骤2：制备获得第二多肽片段-第二树脂，所述第二多肽片段-第二树脂中第二多肽片段的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示，或如SEQIDNo.3所示，或如SEQIDNo.4所示，或如SEQIDNo.5所示，或如SEQIDNo.6所示，或如SEQIDNo.7所示，或如SEQIDNo.8所示，或如SEQIDNo.9所示，或如SEQIDNo.10所示，或如SEQIDNo.11所示，或如SEQIDNo.12所示，或如SEQIDNo.13所示；
步骤3：取所述第二多肽片段-第二树脂，经第一裂解后获得第二多肽片段；
步骤4：取所述第二多肽片段与所述第一多肽片段-第一树脂偶联，获得第三多肽片段-第一树脂，再按照利拉鲁肽的氨基酸序列逐步偶联剩余氨基酸，经第二裂解、纯化，即得。
2.根据权利要求1所述的固相制备方法，其特征在于，所述第三多肽片段-第一树脂中第三多肽片段具有如下氨基酸序列中的任意一个：
如SEQIDNo.14所示；
或如SEQIDNo.15所示；
或如SEQIDNo.16所示；
或如SEQIDNo.17所示；
或如SEQIDNo.18所示；
或如SEQIDNo.19所示；
或如SEQIDNo.20所示；
或如SEQIDNo.21所示；
或如SEQIDNo.22所示；
或如SEQIDNo.23所示；
或如SEQIDNo.24所示；
或如SEQIDNo.25所示。
3.根据权利要求1所述的固相制备方法，其特征在于，所述第一多肽片段-第一树脂中第一树脂为王树脂。
4.根据权利要求1所述的固相制备方法，其特征在于，所述第二多肽片段-第二树脂中第二树脂为2-CTC树脂。
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