CN104045705A - 一种利拉鲁肽的合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种利拉鲁肽的合成方法。该方法通过依次将第三多肽片段、第二多肽片段、第一多肽片段与第四多肽片段-树脂偶联，得到肽树脂，经侧链修饰、裂解、纯化、冻干，即得。本发明提供的利拉鲁肽的合成方法可提高粗肽的纯度和收率，有利于纯化，同时提高了产品的收率，缩短了合成时间，适合工业化生产。

Description

一种利拉鲁肽的合成方法
技术领域
本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种利拉鲁肽的合成方法。
背景技术
随着生活水平的提高和生活方式的改变，近年来，我国糖尿病的发病率有逐年增加的趋势。糖尿病是由遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等各种致病因子作用于机体，导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗等，继而引发体内糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征，临床上以高血糖为主要特点，典型病例可出现多尿、多饮、多食、消瘦等表现，即“三多一少”症状，一旦控制不好会引发并发症，导致肾、眼、足等部位的衰竭病变，且无法治愈。糖尿病分为妊娠期糖尿病、特异性糖尿病、I型糖尿病和II型糖尿病。其中，II型糖尿病又名非胰岛素依赖型糖尿病，特点是人体自身能够产生胰岛素，但细胞无法对其作出反应，使胰岛素的效果大打折扣。
II型糖尿病主要通过口服或皮下注射降糖药治疗。针对II型糖尿病的降糖药种类很多，包括二甲双胍、磺脲类药物和胰高血糖样肽-1（GLP-1）的受体激动素等，GLP-1的受体激动素是近年来研究的热点。其中，利拉鲁肽（liraglutide）是GLP-1的受体激动素之一，2010年1月25日，美国FDA批准由丹麦诺和诺德公司研发的利拉鲁肽（商品名为Victoza）注射剂在美国上市，2011年3月4日，利拉鲁肽获得SFDA批准上市。利拉鲁肽的化学表述为Arg34Lys26-[N-ε-(γ-Glu-(N-hexadecanoyl))]-GLP-17-37，分子式为C172H265N43O51，相对分子质量3751.2，CAS登记号为204656-20-2，分子式如式I所示，与天然GLP-1相比，药效相当且作用时间更长。
式I
目前，利拉鲁肽主要采用基因重组技术和逐步偶联的固相合成方法进行制备。采用基因重组技术合成利拉鲁肽时，技术难度较大，成本相对较高，同时由于Arg34-GLP-1（7-37）-OH的侧链处于未保护状态，与Nα-hexadecanoyl-Glu(ONSu)-OtBu反应时会产生较多的杂质，不利于分离纯化；采用逐步偶联的固相合成方法进行利拉鲁肽制备时，由于利拉鲁肽的序列中有较多的疏水氨基酸，逐步偶联时树脂收缩严重，反应不完全，导致收率偏低，同时粗肽中与产品性质相近的杂质较多，纯化比较困难。因此，提供一种利拉鲁肽的合成方法具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种利拉鲁肽的合成方法。该方法通过依次将第三多肽片段、第二多肽片段、第一多肽片段与第四多肽片段-树脂偶联，得到肽树脂，经侧链修饰、裂解、纯化、冻干，获得利拉鲁肽，提高了粗肽的纯度和收率，有利于纯化，同时提高了产品的收率，缩短了合成时间，适合工业化生产。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种利拉鲁肽的合成方法，包括如下步骤：
获得第四多肽片段-树脂、如SEQ ID NO.1所示的第一多肽片段、如SEQID NO.2所示的第二多肽片段和如SEQ ID NO.3所示的第三多肽片段；
依次将第三多肽片段、第二多肽片段、第一多肽片段与第四多肽片段-树脂偶联，得到肽树脂，经侧链修饰、裂解、纯化、冻干，即得；
第四多肽片段的序列如SEQ ID NO.4所示；
肽的序列如SEQ ID NO.5所示。
作为优选，树脂为王树脂或2-CTC树脂。
作为优选，侧链修饰具体为：脱除肽树脂中Lys的侧链保护基团，与Glu、棕榈酰氯偶联。
作为优选，裂解的试剂为TFA、Anisole、Thioanisole和EDT的混合液。
作为优选，TFA、Anisole、Thioanisole与EDT的体积比为90︰5︰3︰2。
本发明提供了一种利拉鲁肽的合成方法。该方法通过依次将第三多肽片段、第二多肽片段、第一多肽片段与第四多肽片段-树脂偶联，得到肽树脂，经侧链修饰、裂解、纯化、冻干，即得。利用本发明提供的方法制备利拉鲁肽粗肽的收率可达88%，纯度可达76.45%，与现有技术相比，分别提高了8.37%、8.95%；利用本发明提供的方法制备利拉鲁肽总收率可达23.8%；由于在疏水氨基酸密集区域使用片段进行偶联，减少了与产品性质相近杂质的产生，从而有利于纯化操作；在利拉鲁肽合成过程中，第一多肽片段、第二多肽片段、第三多肽片段和第四多肽片段-树脂的合成可同时进行，大大缩短了合成时间。由此可见，本发明提供的利拉鲁肽的合成方法可提高粗肽的纯度和收率，有利于纯化，同时提高了产品的收率，缩短了合成时间，适合工业化生产。
附图说明
图1示实施例6提供的HPLC图谱；
图2示对比例1提供的HPLC图谱。
具体实施方式
本发明公开了一种利拉鲁肽的合成方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
说明书和权利要求书中所使用的缩写具体含义如下：
缩写及英文             含义
DIC                    N,N'-二异丙基碳二亚胺
DCM                    二氯甲烷
Et2O                   无水乙醚
MeOH                   甲醇
PyBOP                  苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基六氟磷酸盐
DIPEA                  N,N-二异丙基乙胺
HOBt                   1-羟基苯并三唑
TFA                    三氟乙酸
EDT                    乙二硫醇
DMF                    N,N-二甲基甲酰胺
20%DBLK                20%六氢吡啶（v）/N,N-二甲基甲酰胺（v）
Anisole                苯甲醚
Thioanisole            苯甲硫醚
TIS                    三异丙基硅烷
本发明提供的利拉鲁肽的合成方法中所用试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 第一多肽片段的制备
称取40g替代度为0.5mmol/g的2-CTC树脂加入到固相反应柱中，DMF洗涤2次，DMF溶胀30min，DMF洗涤2次，将Fmoc-Thr（tBu）-OH（31.80g，80mmol）和DIPEA（14ml，80mmol）溶解于DMF中，冰浴10min后加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应5分钟后再次加入14ml DIPEA，继续反应1h，加入12.8g MeOH封闭20分钟，抽干反应液，DMF洗涤6次，得到Fmoc-Thr（tBu）-2-CTC树脂。
在Fmoc-Thr（OtBu）-2-CTC树脂中加入20%DBLK脱保护（6+6min），DMF洗涤6次，将Fmoc-Phe-OH（30.99g，80mmol）、HOBt（11.35g，84mmol）和PyBOP（41.63g，80mmol）溶解于DMF中，冰浴10分钟，加入27.9ml DIPEA活化5分钟后加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤3次，20%DBLK脱保护（6+6）min，DMF洗涤6次，得到Fmoc-Phe-Thr（OtBu）-2-CTC树脂。
按照上述Fmoc-Phe-OH偶联的方法，在Fmoc-Phe-Thr（OtBu）-2-CTC树脂上依次偶联Fmoc-Thr（tBu）-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH和Fmoc-Ala-OH，并脱保护。
将Boc-His（trt）-OH（49.58g，80mmol）、HOBt（11.35g，84mmol）和PyBOP（41.63g，80mmol）溶解于DMF中，冰浴10分钟，加入27.9ml DIPEA活化5分钟后加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤4次，DCM洗2次，MeOH收缩（5+5+10min），真空干燥，得到35.9g第一多肽片段-2-CTC树脂。
将第一多肽片段-2-CTC树脂转移至500ml单口烧瓶中，加入350ml20%TFE/DCM（V︰V），机械搅拌反应2h，过滤，滤液真空浓缩，残留物用少量DCM溶解，PE沉降，过滤，滤渣真空干燥后得到16.6g序列如SEQ IDNo.1所示的第一多肽片段，收率为65.4%，纯度为90.1%。
实施例2 第二多肽片段的制备
称取40g替代度为0.5mmol/g的2-CTC树脂加入到固相反应柱中，DMF洗涤2次，DMF溶胀30min，DMF洗涤2次，将Fmoc-Glu（OtBu）-OH（35.04g，80mmol）和DIPEA（14ml，80mmol）溶解于DMF中，冰浴10min后加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应5分钟后再次加入14ml DIPEA，继续反应1h，加入12.8g MeOH封闭20分钟，抽干反应液，DMF洗涤6次，得到Fmoc-Glu（OtBu）-2-CTC树脂。
在Fmoc-Glu（OtBu）-2-CTC树脂中加入20%DBLK脱保护（6+6min），DMF洗涤6次，将Fmoc-Leu-OH（28.28g，80mmol）、HOBt（11.35g，84mmol）和PyBOP（41.63g，80mmol）溶解于DMF中，冰浴10分钟，加入27.9ml DIPEA活化5分钟后加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤3次，20%DBLK脱保护（6+6）min，DMF洗涤6次，得到Fmoc-Leu-Glu（OtBu）-2-CTC树脂。
按照上述Fmoc-Leu-OH偶联的方法，在Fmoc-Leu-Glu（OtBu）-2-CTC树脂上依次偶联Fmoc-Tyr（tBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Val-OH和Fmoc-Asp（OtBu）-OH，并脱保护。
将Fmoc-Ser（tBu）-OH（30.67g，80mmol）、HOBt（11.35g，84mmol）和PyBOP（41.63g，80mmol）溶解于DMF中，冰浴10分钟，加入27.9ml DIPEA活化5分钟后加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤4次，DCM洗2次，MeOH收缩（5+5+10min），真空干燥，得到36.8g第二多肽片段-2-CTC树脂。
将第二多肽片段-2-CTC树脂转移至500ml单口烧瓶中，加入370ml20%TFE/DCM（V︰V），机械搅拌反应2h，过滤，滤液真空浓缩，残留物用少量DCM溶解，PE沉降，过滤，滤渣真空干燥后得到16.9g序列如SEQ IDNo.2所示的第二多肽片段，收率为58.1%，纯度为88.7%。
实施例3 第三多肽片段的制备
称取40g替代度为0.5mmol/g的2-CTC树脂加入到固相反应柱中，DMF洗涤2次，DMF溶胀30min，DMF洗涤2次，将Fmoc-Glu（OtBu）-OH（35.04g，80mmol）和DIPEA（14ml，80mmol）溶解于DMF中，冰浴10min后加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应5分钟后再次加入14ml DIPEA，继续反应1h，加入12.8g MeOH封闭20分钟，抽干反应液，DMF洗涤6次，得到Fmoc-Glu（OtBu）-2-CTC树脂。
在Fmoc-Glu（OtBu）-2-CTC树脂中加入20%DBLK脱保护（6+6min），DMF洗涤6次，将Fmoc-Lys（Alloc）-OH（28.28g，80mmol）、HOBt（11.35g，84mmol）和PyBOP（41.63g，80mmol）溶解于DMF中，冰浴10分钟，加入27.9ml DIPEA活化5分钟后加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤3次，20%DBLK脱保护（6+6）min，DMF洗涤6次，得到Fmoc-Lys（Alloc）-Glu（OtBu）-2-CTC树脂。
按照上述Fmoc-Lys（Alloc）-OH偶联的方法，在Fmoc-Lys（Alloc）-Glu（OtBu）-2-CTC树脂上依次偶联Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH和Fmoc-Gln（trt）-OH，并脱保护。
将Fmoc-Gly-OH（23.79g，80mmol）、HOBt（11.35g，84mmol）和PyBOP（41.63g，80mmol）溶解于DMF中，冰浴10分钟，加入27.9ml DIPEA活化5分钟后加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤4次，DCM洗2次，MeOH收缩（5+5+10min），真空干燥，得到34.6g第三多肽片段-2-CTC树脂。
将第三多肽片段-2-CTC树脂转移至500ml单口烧瓶中，加入370ml20%TFE/DCM（V︰V），机械搅拌反应2h，过滤，滤液真空浓缩，残留物用少量DCM溶解，PE沉降，过滤，滤渣真空干燥后得到15.6g序列如SEQ IDNo.3所示的第三多肽片段，收率为67%，纯度为92.4%。
实施例4 第四多肽片段-王树脂的制备
称取替代度为0.75mmol/g的王树脂50g，加入固相反应柱中，DMF洗涤2次，DMF溶胀30分钟，抽干。将Fmoc-Gly-OH（16.724g，56.25mmol）和HOBt（8.36g，61.875mmol）溶解于300ml DMF中，冰浴条件下加入DIC（9.58ml，61.875mmol）活化5分钟，将上述溶液加入装有王树脂的固相反应柱中，同时加入DMAP（0.687g，6.188mmol），氮气搅拌反应2h，DMF洗涤4次，DCM洗涤2次，加入300ml Ac2O/吡啶=7︰6（V/V）封闭6小时，DCM洗涤6次，MeOH收缩，真空干燥得到Fmoc-Gly-王树脂，检测替代度为0.279mmol/g。
称取10g替代度为0.279mmol/g的Fmoc-Gly-王树脂，加入到固相反应柱中，DMF洗涤2次，DMF溶胀30分钟，DMF洗涤2次，加入20%DBLK脱保护（5+5min），DMF洗涤6次。
将称量好的Fmoc-Arg（pbf）-OH（7.24g，11.16mmol）和HOBt（1.58g，11.72mmol）溶解于DMF中，冰浴条件下加入DIC（1.83ml，11.72mmol）活化5min后加入上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤3次，加入20%DBLK脱保护（5+5min），DMF洗涤6次，得到Fmoc-Arg（pbf）-Gly-王树脂。
按照上述Fmoc-Arg（pbf）-OH偶联的方法，在Fmoc-Arg（pbf）-Gly-王树脂上依次偶联Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg（pbf）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp（Boc）-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH，得到序列如SEQ ID No.4所示的第四多肽片段-王树脂。
实施例5 第四多肽片段-2-CTC-树脂的制备
称取替代度为0.46mmol/g的2-CTC树脂6.07g，加入固相反应柱中，DMF洗涤2次，DMF溶胀30分钟，抽干。将Fmoc-Gly-OH（3.318g，11.16mmol）溶解于300ml DMF中，冰浴条件下加入DIPEA（3.9ml，22.32mmol）活化5分钟，将上述溶液加入装有2-CTC树脂的固相反应柱中，同氮气搅拌反应1h，加入1.79g MeOH封闭20min，抽干反应液，DMF洗涤3次20%DBLK脱保护（5+5min），DMF洗涤6次。
将称量好的Fmoc-Arg（pbf）-OH（7.24g，11.16mmol）和HOBt（1.58g，11.72mmol）溶解于DMF中，冰浴条件下加入DIC（1.83ml，11.72mmol）活化5min后加入上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤3次，加入20%DBLK脱保护（5+5min），DMF洗涤6次，得到Fmoc-Arg（pbf）-Gly-2-CTC树脂。
按照上述Fmoc-Arg（pbf）-OH偶联的方法，在Fmoc-Arg（pbf）-Gly-2-CTC树脂上依次偶联Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg（pbf）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp（Boc）-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH，得到序列如SEQ ID No.4所示的第四多肽片段-2-CTC树脂。
实施例6 利拉鲁肽粗肽的制备
取实施例3制得的第三多肽片段（6.49g，5.58mmol）和HOBt（0.79g，5.86mmol）溶解于DCM中，冰浴条件下加入DIC（0.92ml，5.86mmol）活化5分钟，加入到装有实施例4提供的第四多肽片段-王树脂的固相反应柱中，氮气搅拌反应4h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤3次，20%DBLK脱保护（5+5min），DMF洗涤6次。
取实施例2制得的第二多肽片段（8.13g，5.58mmol）和HOBt（0.79g，5.86mmol）溶解于DCM中，冰浴条件下加入DIC（0.92ml，5.86mmol）活化5分钟，加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应4h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤3次，20%DBLK脱保护（5+5min），DMF洗涤6次。
取实施例1制得的第一多肽片段（7.10g，5.58mmol）和HOBt（0.79g，5.86mmol）溶解于DCM中，冰浴条件下加入DIC（0.92ml，5.86mmol）活化5分钟，加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应4h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤4次，DCM洗涤2次。
向上述固相反应柱中加入35ml DCM和3.01g苯硅烷，氮气搅拌1分钟后加入0.806g四（三苯基膦）钯，反应0.5h，抽干，DCM洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
将Fmoc-Glu-OtBu（5.94g，13.95mmol）、HOBt（1.98g，14.65mmol）和PyBOP（7.26g，13.95mmol）溶解于50ml DMF中，冰浴条件下加入DIPEA（4.88ml，27.9mmol）活化3分钟，将活化好的溶液加入上述固相反应柱，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DMF洗涤4次，DCM洗涤2次。
向上述固相反应柱中加入20ml DCM和DIPEA（7.88ml，27.9mmol），氮气搅拌均匀后缓慢滴加棕榈酰氯（3.83g，13.95mmol），滴加完毕后继续反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DCM洗涤6次，MeOH收缩，真空干燥后得到23g肽树脂。
将上述肽树脂转移至500ml单口圆底烧瓶中，加入250ml冰冻2h的裂解液（TFA︰Anisole︰Thioanisole︰EDT=90︰5︰3︰2），室温搅拌反应2h，过滤，滤液加入到2.5L冰冻无水乙醚中，离心收集固体，干燥后得到9.21g序列如SEQ ID NO.5所示的利拉鲁肽粗肽，收率为88%，纯度为76.45%，HPLC图谱如图1所示，HPLC图谱数据如表1所示。
表1利用本发明提供的合成方法制备的利拉鲁肽粗肽HPLC图谱
特征峰相对保留时间与峰面积检测结果
序号 相对保留时间RT（min） 峰面积（AU*min） 峰面积比（%）
1 22.540 146619 1.58
2 22.338 103375 1.11
3 24.680 146199 1.58
4 25.395 146308 1.58
5 26.209 7092834 76.45
6 28.353 238347 2.57
7 28.849 199244 2.15
8 29.747 145068 1.56
9 31.369 30029 0.32
10 10.404 94942 1.02
11 11.499 39467 0.43
12 13.285 40922 0.44
13 13.927 122334 1.32
14 14.689 167981 1.81
实施例7 利拉鲁肽粗肽的制备
取实施例3制得的第三多肽片段（6.49g，5.58mmol）和HOBt（0.79g，5.86mmol）溶解于DCM中，冰浴条件下加入DIC（0.92ml，5.86mmol）活化5分钟，加入到装有实施例5提供的第四多肽片段-2-CTC树脂的固相反应柱中，氮气搅拌反应4h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤3次，20%DBLK脱保护（5+5min），DMF洗涤6次。
取实施例2制得的第二多肽片段（8.13g，5.58mmol）和HOBt（0.79g，5.86mmol）溶解于DCM中，冰浴条件下加入DIC（0.92ml，5.86mmol）活化5分钟，加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应4h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤3次，20%DBLK脱保护（5+5min），DMF洗涤6次。
取实施例1制得的第一多肽片段（7.10g，5.58mmol）和HOBt（0.79g，5.86mmol）溶解于DCM中，冰浴条件下加入DIC（0.92ml，5.86mmol）活化5分钟，加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应4h，茚三酮检测反应完全，抽掉反应液，DMF洗涤4次，DCM洗涤2次。
向上述固相反应柱中加入35ml DCM和3.01g苯硅烷，氮气搅拌1分钟后加入0.806g四（三苯基膦）钯，反应0.5h，抽干，DCM洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
将Fmoc-Glu-OtBu（5.94g，13.95mmol）、HOBt（1.98g，14.65mmol）和PyBOP（7.26g，13.95mmol）溶解于50ml DMF中，冰浴条件下加入DIPEA（4.88ml，27.9mmol）活化3分钟，将活化好的溶液加入上述固相反应柱，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DMF洗涤4次，DCM洗涤2次。
向上述固相反应柱中加入20ml DCM和DIPEA（7.88ml，27.9mmol），氮气搅拌均匀后缓慢滴加棕榈酰氯（3.83g，13.95mmol），滴加完毕后继续反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DCM洗涤6次，MeOH收缩，真空干燥后得到23g肽树脂。
将上述肽树脂转移至500ml单口圆底烧瓶中，加入250ml冰冻2h的裂解液（TFA︰Anisole︰Thioanisole︰EDT=90︰5︰3︰2），室温搅拌反应2h，过滤，滤液加入到2.5L冰冻无水乙醚中，离心收集固体，干燥后得到8.16g序列如SEQ ID NO.5所示的利拉鲁肽粗肽，收率为82.7%，纯度为75.9%，HPLC图谱与实施例6提供的图谱相似。
实施例8 利拉鲁肽精肽的制备
取实施例6制得的利拉鲁肽粗肽用10%乙腈/90%水（V/V），超声使样品完全溶解后用滤膜过滤，收集滤液备用。
取滤液进行第一步HPLC纯化。纯化条件：以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为50mm×250mm；流动相中，A相为0.1%三氟乙酸/85%水/15%甲醇溶液水溶液，B相为0.1%三氟醋酸的乙腈，流速为50～80ml/min，梯度为40%B～60%B，检测波长为275nm；进样量为3g。纯化过程：将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为1.5～3g。线性梯度洗脱40min，收集目的峰，得到纯度大于95%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超过35℃的条件下减压旋蒸浓缩至约10～30mg/ml，得到第一步纯化馏分。
取第一步纯化馏分进行第二步HPLC纯化。纯化条件：以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为50mm×250mm；流动相中，A相为20mM碳酸氢铵的水溶液，B相为色谱纯乙腈，梯度为40%B～60%B，检测波长为275nm；进样量为1.9g。纯化过程：将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净平衡后将第一步纯化馏分上样，上样量为1.9g。线性梯度洗脱40min，收集目的峰，得到纯度大于98%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超过35℃的条件下减压旋蒸浓缩至约15-25mg/ml，得到第二步纯化馏分。
取第二步纯化馏分进行第三步HPLC脱盐纯化。纯化条件：以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为50mm×250mm；流动相中，A相为0.01%氨水的水溶液，B相为色谱纯乙腈，梯度为30%B～60%B，检测波长为275nm；进样量为1.3g。纯化过程：将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净平衡后将第二步纯化馏分上样，上样量为1.3g。线性梯度洗脱30min，收集目的峰，得到纯度大于98%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超过35℃的条件下减压旋蒸浓缩至约65mg/ml后进行冷冻干燥，即可得到序列如SEQ ID NO.5所示的利拉鲁肽精肽，重量为2.41g，纯度大于99%，纯化收率为81%，总收率达23.8%。
实施例9 利拉鲁肽精肽的制备
取实施例7制得的利拉鲁肽粗肽用10%乙腈/90%水（V/V），超声使样品完全溶解后用滤膜过滤，收集滤液备用。
取滤液进行第一步HPLC纯化。纯化条件：以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为50mm×250mm；流动相中，A相为0.1%三氟乙酸/85%水/15%甲醇溶液水溶液，B相为0.1%三氟醋酸的乙腈，流速为50～80ml/min，梯度为40%B～60%B，检测波长为275nm；进样量为3g。纯化过程：将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为1.5～3g。线性梯度洗脱40min，收集目的峰，得到纯度大于95%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超过35℃的条件下减压旋蒸浓缩至约10～30mg/ml，得到第一步纯化馏分。
取第一步纯化馏分进行第二步HPLC纯化。纯化条件：以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为50mm×250mm；流动相中，A相为20mM碳酸氢铵的水溶液，B相为色谱纯乙腈，梯度为40%B～60%B，检测波长为275nm；进样量为1.9g。纯化过程：将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净平衡后将第一步纯化馏分上样，上样量为1.9g。线性梯度洗脱40min，收集目的峰，得到纯度大于98%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超过35℃的条件下减压旋蒸浓缩至约15-25mg/ml，得到第二步纯化馏分。
取第二步纯化馏分进行第三步HPLC脱盐纯化。纯化条件：以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为50mm×250mm；流动相中，A相为0.01%氨水的水溶液，B相为色谱纯乙腈，梯度为30%B～60%B，检测波长为275nm；进样量为1.3g。纯化过程：将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净平衡后将第二步纯化馏分上样，上样量为1.3g。线性梯度洗脱30min，收集目的峰，得到纯度大于98%以上馏分，将收集的目的峰馏分于水温不超过35℃的条件下减压旋蒸浓缩至约65mg/ml后进行冷冻干燥，即可得到序列如SEQ ID NO.5所示的利拉鲁肽精肽，重量为2.28g，纯度大于99%，纯化收率为79%，总收率达21.8%。
对比例1 利拉鲁肽粗肽的制备
将3.58g Fmoc-Gly-王树脂（0.279mmol/g）装入固相反应柱中，DMF洗两次，DMF溶胀30分钟，DBLK脱保护（5+7min），DMF洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
将Fmoc-Arg（Pbf）-OH（1.85g，3mmol）和HOBt（0.426g，3.15mmol）溶解在15ml DMF中，冰浴条件下加入DIC（0.49ml，3.15mmol）活化5分钟，将活化好的溶液加入到上述固相反应柱中，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性。抽干反应液，DMF洗涤3次，DBLK脱保护（5+7min），DMF洗涤6次，茚三酮检测呈阴性，得到Fmoc-Arg（Pbf）-Gly-王树脂。
按照上述Fmoc-Arg（Pbf）-OH偶联的方法，在Fmoc-Arg（Pbf）-Gly-王树脂上偶联Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg（Pbf）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp（Boc）-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Lys（Alloc）-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln（Trt）-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr（tBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp（OtBu）-OH、Fmoc-Ser（tBu）-OH、Fmoc-Thr（tBu）-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr（tBu）-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu（OtBu）-OH、Fmoc-Ala-OH、Boc-His（trt）-OH。
向上述固相反应柱中加入15ml DCM和1.08g苯硅烷，氮气搅拌1分钟后加入0.289g四（三苯基膦）钯，反应0.5h，抽干，DCM洗涤6次，茚三酮检测呈阳性。
将Fmoc-Glu-OtBu（2.128g，5mmol）、HOBt（0.709g，5.25mmol）和PyBOP（2.602g，5mmol）溶解在25ml DMF中，冰浴条件下加入DIPEA（1.75ml，10mmol）活化3分钟，将活化好的溶液加入上述固相反应柱，氮气搅拌反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DMF洗涤4次，DCM洗涤2次。
向上述固相反应柱中加入20ml DCM和DIPEA（1.75ml，10mmol），氮气搅拌均匀后缓慢滴加棕榈酰氯（1.374g，5mmol），滴加完毕后继续反应2h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DCM洗涤6次，MeOH收缩，真空干燥后得到肽树脂6.9g。
向装有6.9g上述肽树脂的圆底烧瓶中加入70ml冰冻2h的裂解液（TFA︰Anisole︰Thioanisole︰EDT=90︰5︰3︰2），室温搅拌反应2h，过滤，滤液加入到700ml冰冻无水乙醚中，离心收集固体，干燥后得到3.94g序列如SEQ ID NO.5所示的利拉鲁肽粗肽，收率为81.2%，纯度为70.17%，HPLC图谱如图2所示，HPLC图谱数据如表2所示。
表2利用现有技术制得的利拉鲁肽粗肽HPLC图谱特征峰
相对保留时间与峰面积检测结果
序号 相对保留时间RT（min） 峰面积（AU*min） 峰面积比（%）
1 10.133 50806 0.36
2 34.142 502811 3.59
3 13.139 41601 0.30
4 13.565 153858 1.10
5 14.509 121073 0.86
6 16.273 126221 0.90
7 18.162 24750 0.18
8 19.957 65873 0.47
9 20.669 206585 1.48
10 21.546 194930 1.39
11 22.920 1129859 8.07
12 23.350 526927 3.76
13 24.153 170893 1.22
14 24.915 9822736 70.17
实施例6中制备的利拉鲁肽粗肽收率达88%，纯度为76.45%，与对比例1提供的方法相比，利拉鲁肽粗肽的收率和纯度分别提高了8.37%、8.95%；实施例7中制备的利拉鲁肽粗肽纯度为75.9%，与对比例1提供的方法相比，利拉鲁肽粗肽的纯度提高了8.17%。由此可知，本发明提供的利拉鲁肽的合成方法可提高粗肽的纯度和收率，有利于纯化。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种利拉鲁肽的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
获得第四多肽片段-树脂、如SEQ ID NO.1所示的第一多肽片段、如SEQID NO.2所示的第二多肽片段和如SEQ ID NO.3所示的第三多肽片段；
依次将所述第三多肽片段、所述第二多肽片段、所述第一多肽片段与所述第四多肽片段-树脂偶联，得到肽树脂，经侧链修饰、裂解、纯化、冻干，即得；
所述第四多肽片段的序列如SEQ ID NO.4所示；
所述肽的序列如SEQ ID NO.5所示。
2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述树脂为王树脂或2-CTC树脂。
3.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述侧链修饰具体为：脱除所述肽树脂中Lys的侧链保护基团，与Glu、棕榈酰氯偶联。
4.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述裂解的试剂为TFA、Anisole、Thioanisole和EDT的混合液。
5.根据权利要求4所述的合成方法，其特征在于，所述TFA、所述Anisole、所述Thioanisole与所述EDT的体积比为90︰5︰3︰2。
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