CN103613656B - 一种艾塞那肽的固相片段合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种艾塞那肽的固相片段合成方法，将艾塞那肽的39个氨基酸分成6段全保护片段，先分别合成6段全保护片段，再将6段全保护片段依次进行固相片段组装连接，得到艾塞那肽树脂，然后切割，得到艾塞那肽粗品，粗品经纯化得到艾塞那肽产品。本发明克服了现有固相合成艾塞那肽过程复杂、效率低下、纯化困难、规模化困难的问题，提高了合成效率，大量简化了连接步骤，减少杂质累积，为有效解决艾塞那肽合成规模化，提高产品纯度，减小纯化难度提供了一种新方法。

Description

一种艾塞那肽的固相片段合成方法
技术领域
本发明属于固相多肽合成技术领域，具体涉及全固相片段组装合成艾塞那肽。
背景技术
艾塞那肽是一种含有39个氨基酸的活性多肽，氨基酸序列为：H2N-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-COOH，是GLP-1的类似物，能够刺激胰岛β细胞再生，促进胰岛素分泌，抑制胰高血糖素的释放，具有控制血糖功效，艾塞那肽注射液通过减少2型糖尿病患者空腹和餐后血糖浓度，从而改善血糖控制。
艾塞那肽的制备方法目前主要采用传统经典的固相多肽合成法，即将39个保护氨基酸从C端到N端依次逐个连接，最后切割得粗肽，纯化得纯品，此法合成效率低、产品含量低、纯化成本高；目前的片段缩合方法有固相液相混合使用，此法要求片段纯度较高，且液相反应过程中杂片段累积对产品含量影响大、过程较繁杂、纯化成本高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服传统经典的固相多肽合成法合成长肽效率低、产品含量低、纯化成本高的缺点，以及固相液相混合使用时过程较繁杂、纯化成本高的缺点，提供一种合成效率高、纯化成本低、易流程化、易规模化的全固相片段法合成艾塞那肽的方法。
解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成：
1、合成Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin
（1）合成Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin
将Fmoc-Rink Amide MBHA Resin用N,N-二甲基甲酰胺溶胀后，用哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液脱Fmoc-两次，加入N,N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Ser(tBu)-OH、1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺，在氮气保护下，常温搅拌1～3小时，得到Fmoc-Ser(tBu)-MBHAResin。
（2）合成Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin
将Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin用哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液脱Fmoc-两次，加入N,N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Pro-OH、1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺，在氮气保护下，常温搅拌1～3小时，得到Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin。
（3）合成Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin
按照步骤（2）的方法向Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin上依次连接Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH，得到Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin。
2、合成Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-COOH
（1）合成Fmoc-Gly-2-CTC resin
将2-chlorotrityl chloride resin用二氯甲烷溶胀后，加入二氯甲烷、Fmoc-Gly-OH、N,N′-二异丙基乙胺，在氮气保护下，常温搅拌1～3小时，得到Fmoc-Gly-2-CTCresin。
（2）合成Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-2-CTC resin
按照步骤1中（2）的方法，向Fmoc-Gly-2-CTC resin上依次连接Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH，得到Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-2-CTC resin。
（3）切割处理
向Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-2-CTC resin中加入切割液，常温搅拌1～3小时，过滤，将滤液加入冷乙醚中，析出沉淀，得到Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-COOH。
上述的切割液是三氟乙酸与二氯甲烷的体积比为1:99或2:98的混合液，或者是三氟乙醇与乙酸、二氯甲烷的体积比为2:1:7的混合液。
3、合成Fmoc-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-COOH
按照步骤2中（1）的方法，向2-chlorotrityl chloride resin上连接Fmoc-Leu-OH，得到Fmoc-Leu-2-CTC resin，再按照步骤2中（2）的方法向Fmoc-Leu-2-CTC resin上依次连接Fomc-Trp-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fomc-Val-OH，得到Fmoc-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-2-CTC Resin，Fmoc-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-2-CTC Resin按照步骤2中（3）的方法进行切割处理，得到Fmoc-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-COOH。
4、合成Fmoc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-COOH
按照步骤2中（1）的方法，向2-chlorotrityl chloride resin上连接Fomc-Ala-OH，得到Fmoc-Ala-2-CTC resin，再按照步骤2中（2）的方法向Fmoc-Ala-2-CTC resin上依次连接Fomc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fomc-Met-OH，得到Fmoc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-2-CTC Resin，Fmoc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-2-CTC Resin按照步骤2中（3）的方法进行切割处理，得到Fmoc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-COOH。
5、合成Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH
按照步骤2中（1）的方法，向2-chlorotrityl chloride resin上连接Fomc-Gln(Trt)-OH，得到Fmoc-Gln(Trt)-2-CTC resin，再按照步骤2中（2）的方法向Fmoc-Gln(Trt)-2-CTC resin上依次连接Fomc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fomc-Thr(tBu)-OH，得到Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-2-CTC Resin，Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-2-CTC Resin按照步骤2中（3）的方法进行切割处理，得到Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH。
6、合成Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-COOH
按照步骤2中（1）的方法，向2-chlorotrityl chloride resin上连接Fomc-Phe-OH，得到Fmoc-Phe-2-CTC resin，再按照步骤2中（2）的方法向Fmoc-Phe-2-CTC resin上依次连接Fomc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fomc-His(Trt)-OH，得到Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-2-CTC Resin，Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-2-CTC Resin按照步骤2中（3）的方法进行切割处理，得到Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-COOH。
7、合成艾塞那肽
（1）组装连接Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin
将步骤1得到的Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin用哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液脱Fmoc-两次，加入N,N-二甲基甲酰胺与二甲亚砜、N-甲基吡咯烷酮的体积比为0.5～1:1～2:1的混合液以及Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-COOH、1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺，在氮气保护下，常温搅拌3～4小时，得到Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin。
（2）组装连接艾塞那肽
按照步骤（1）的组装连接方法，向Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin上依次组装连接Fmoc-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-COOH、Fmoc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-COOH、Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH、Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-COOH，用哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液脱Fmoc-两次，得到艾塞那肽树脂，用质量百分比组成为三氟乙酸83%、苯酚5%、苯甲硫醚4%、水3%、三异丙基硅烷5%的切割液按照步骤（2）中③的方法对艾塞那肽树脂进行切割处理，得到艾塞那肽粗品，艾塞那肽粗品经反相色谱纯化、冷冻干燥，得到艾塞那肽。
上述的步骤1中，Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH与Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩尔比均为2～4:1，Fmoc-Rink Amide MBHA Resin与1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺的摩尔比为1:2～4:2～4:2～4。
上述的步骤2的（1）中，2-chlorotrityl chloride resin与Fmoc-Gly-OH、N,N′-二异丙基乙胺的摩尔比为1:1:4，步骤2的（2）中，Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH与2-chlorotrityl chloride resin的摩尔比均为2～4:1，2-chlorotrityl chloride resin与1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺的摩尔比1:2～4:2～4:2～4。
上述的步骤7中，Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-COOH、Fmoc-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-COOH、Fmoc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-COOH、Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH、Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-COOH与Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin的摩尔比均为2:1，Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin与1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺的摩尔比1:4:4:4，N,N-二甲基甲酰胺与二甲亚砜、N-甲基吡咯烷酮的体积比最佳为1:1:1。
本发明的Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的取代度为0.34mmol/g，2-chlorotritylchloride resin的取代度为1.74mmol/g，均由天津南开和成科技有限公司。
本发明克服了现有固相合成艾塞那肽过程复杂、效率低下、纯化困难、规模化困难的问题，提高了合成效率，大量简化了连接步骤，减少杂质累积，为有效解决艾塞那肽合成规模化，提高产品纯度，减小纯化难度提供了一种新方法。
附图说明
图1是实施例1合成的艾塞那肽的质谱图。
图2是实施例1合成的艾塞那肽的液相色谱图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1
1、合成Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin
（1）合成Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin
将1.0g Fmoc-Rink Amide MBHA Resin加入反应器中，加入10mL N,N-二甲基甲酰胺浸泡树脂30分钟，使树脂充分溶胀，抽滤除去N,N-二甲基甲酰胺，向反应器中加入10mL哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液，反应5分钟，抽滤除去混合液，再加入10mL哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液，反应20分钟，抽滤，用异丙醇洗涤树脂2次、N,N-二甲基甲酰胺洗涤树脂3次，每次10mL，完成Fmoc-Rink Amide MBHA Resin脱Fmoc-两次，向反应合成器中加入10mL N,N-二甲基甲酰胺、0.53g Fmoc-Ser(tBu)-OH、0.19g1-羟基苯丙三唑、0.44g苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、0.24mL N,N′-二异丙基乙胺，在氮气保护下，常温搅拌1.5小时，抽滤，用异丙醇和N,N-二甲基甲酰胺各洗涤树脂2次，每次10mL，抽滤，得到Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin。
（2）合成Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin
按照步骤（1）的方法将得到的Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin用哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液脱Fmoc-两次，加入10mL N,N-二甲基甲酰胺、0.46g Fmoc-Pro-OH、0.19g1-羟基苯丙三唑、0.44g苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、0.24mL N,N′-二异丙基乙胺，在氮气保护下，常温搅拌1.5小时，用异丙醇和N,N-二甲基甲酰胺各洗涤树脂2次，每次10mL，得到Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin。
（3）合成Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin
按照步骤（2）的方法向Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin上依次连接0.46gFmoc-Pro-OH、0.46g Fmoc-Pro-OH、0.43g Fmoc-Ala-OH、0.41g Fmoc-Gly-OH、0.53g Fmoc-Ser(tBu)-OH、0.53g Fmoc-Ser(tBu)-OH、0.46g Fmoc-Pro-OH、0.41g Fmoc-Gly-OH，其他试剂的用量与步骤（2）相同，得到1.32g Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin。
上述的Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH与Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩尔比均为4:1，Fmoc-Rink AmideMBHA Resin与1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺的摩尔比为1:4:4:4。
2、合成Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-COOH
（1）合成Fmoc-Gly-2-CTC resin
将5.0g2-chlorotrityl chloride resin加入反应器中，加入50mL二氯甲烷浸泡树脂30分钟，使树脂充分溶胀，抽滤除去二氯甲烷，向反应器中加入50mL二氯甲烷、2.59g Fmoc-Gly-OH、6.10mL N,N′-二异丙基乙胺，2-chlorotrityl chloride resin与Fmoc-Gly-OH、N,N′-二异丙基乙胺的摩尔比为1:1:4，在氮气保护下，常温搅拌1.5小时，抽滤，用异丙醇和N,N-二甲基甲酰胺各洗涤树脂2次，每次50mL，得到Fmoc-Gly-2-CTC resin。
（2）合成Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-2-CTC resin
按照步骤1中（2）的方法，向Fmoc-Gly-2-CTC resin上依次连接20.77g Fmoc-Asn(Trt)-OH、16.31g Fmoc-Lys(Boc)-OH，其他试剂的用量为：1-羟基苯丙三唑4.71g、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸11.18g、N,N′-二异丙基乙胺6.10mL，用异丙醇和N,N-二甲基甲酰胺各洗涤树脂2次，每次50mL，得到Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-2-CTC resin。
上述的Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH与2-chlorotrityl chloride resin的摩尔比均为4:1，2-chlorotrityl chloride resin与1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺的摩尔比1:4:4:4。
（3）切割处理
向Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-2-CTC resin中加入50mL切割液，所用的切割液是三氟乙酸与二氯甲烷的体积比为1:99的混合液，常温搅拌1.5小时，过滤，将滤液加入500mL冷乙醚中，析出沉淀，抽滤，用冷乙醚洗涤2次，每次50mL，收集沉淀，常温真空干燥1小时，得到3.93g Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-COOH。
3、合成Fmoc-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-COOH
按照步骤2中（1）的方法，向2.8g2-chlorotrityl chloride resin上连接1.73gFmoc-Leu-OH，得到Fmoc-Leu-2-CTC resin，再按照步骤2中（2）的方法依次向Fmoc-Leu-2-CTC resin上连接8.32g Fomc-Trp-OH、8.30g Fmoc-Glu(otBu)-OH、6.89g Fmoc-Ile-OH、7.55g Fmoc-Phe-OH、6.89g Fmoc-Leu-OH、12.65g Fmoc-Arg(pbf)-OH、6.62g Fomc-Val-OH，得到Fmoc-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-2-CTC Resin，Fmoc-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-2-CTC Resin按照步骤2中（3）的方法进行切割处理，得到6.31g Fmoc-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-COOH。
4、合成Fmoc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-COOH
按照步骤2中（1）的方法，向3.0g2-chlorotrityl chloride resin上连接1.63gFomc-Ala-OH，得到Fmoc-Ala-2-CTC resin，再按照步骤2中（2）的方法依次向Fmoc-Ala-2-CTC resin上连接8.89g Fomc-Glu(otBu)-OH、8.89g Fmoc-Glu(otBu)-OH、8.89g Fmoc-Glu(otBu)-OH、7.76g Fomc-Met-OH，得到Fmoc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-2-CTC Resin，Fmoc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-2-CTCResin按照步骤2中（3）的方法进行切割处理，得到2.39g Fmoc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-COOH。
5、合成Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH
按照步骤2中（1）的方法，向2.8g2-chlorotrityl chloride resin上连接2.98gFomc-Gln(Trt)-OH，得到Fmoc-Gln(Trt)-2-CTC resin，再按照步骤2中（2）的方法依次向Fmoc-Gln(Trt)-2-CTC resin上连接9.13g Fomc-Lys(Boc)-OH、7.47g Fmoc-Ser(tBu)-OH、6.89g Fmoc-Leu-OH、8.02g Fmoc-Asp(otBu)-OH、7.47g Fmoc-Ser(tBu)-OH、7.75g Fomc-Thr(tBu)-OH，得到Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-2-CTC Resin，Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-2-CTC Resin按照步骤2中（3）的方法进行切割处理，得到5.09g Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH。
6、合成Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-COOH
按照步骤2中（1）的方法，向3.0g2-chlorotrityl chloride resin上连接2.03gFomc-Phe-OH，得到Fmoc-Phe-2-CTC resin，再按照步骤2中（2）的方法依次向Fmoc-Phe-2-CTC resin上连接8.30g Fomc-Thr(tBu)-OH、6.21g Fmoc-Gly-OH、8.89g Fmoc-Glu(otBu)-OH、6.21g Fmoc-Gly-OH、12.94g Fomc-His(Trt)-OH，得到Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-2-CTC Resin，Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-2-CTC Resin按照步骤2中（3）的方法进行切割处理，得到4.52gFmoc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-COOH。
7、组装连接合成艾塞那肽
按照步骤1中（1）的方法，将1.32g Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin用哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液脱Fmoc-两次，加入14mL N,N-二甲基甲酰胺与二甲亚砜、N-甲基吡咯烷酮的体积比为1:1:1的混合液以及0.80g Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-COOH、0.25g1-羟基苯丙三唑、0.58g苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、0.32mL N,N′-二异丙基乙胺，在氮气保护下，常温搅拌3小时，用异丙醇和N,N-二甲基甲酰胺各洗涤树脂2次，每次14mL，得到Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin。
按照上述方法向Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin上依次组装连接1.45g Fmoc-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-COOH、0.90g Fmoc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-COOH、1.41g Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH、1.10g Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-COOH，用哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液脱Fmoc-两次，得到艾塞那肽树脂，用14mL质量百分比组成为三氟乙酸83%、苯酚5%、苯甲硫醚4%、水3%、三异丙基硅烷5%的切割液按照步骤2中（3）的方法对艾塞那肽树脂进行切割处理，得到艾塞那肽粗品，艾塞那肽粗品经反相色谱纯化、冷冻干燥，得到0.89g艾塞那肽，收率47.6%。
上述的Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-COOH、Fmoc-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-COOH、Fmoc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-COOH、Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH、Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-COOH与Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin的摩尔比均为2:1，Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin与1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺的摩尔比1:4:4:4。
采用质谱仪对合成产物的结构进行表征，结果见图1，由图可见，所合成的产物的分子量及分子离子峰与艾塞那肽的分子量及分子离子峰一致，说明合成产物为艾塞那肽。采用液相色谱仪对合成的艾塞那肽进行纯度测定，液相色谱图见图2，由图2可见，艾塞那肽的纯度大于98%。
实施例2
本实施的步骤1中，Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH与Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩尔比均为2:1，Fmoc-Rink Amide MBHA Resin与1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺的摩尔比为1:2:2:2，该步骤的其他步骤与实施例1相同。本实施例的步骤2中，Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH与2-chlorotrityl chloride resin的摩尔比均为2:1，2-chlorotrityl chloride resin与1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺的摩尔比1:2:2:2，该步骤的其他步骤与实施例1相同。本实施例的步骤3～6中，2-chlorotritylchloride resin与Fmoc-氨基酸、1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺的摩尔比与本实施例的步骤2相同，其合成方法与实施例1相同。本实施的步骤7与实施例1相同，得到0.77g艾塞那肽，收率41.2%，纯度大于98%。
实施例3
本实施的步骤1中，Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH与Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩尔比均为3:1，Fmoc-Rink Amide MBHA Resin与1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺的摩尔比为1:3:3:3，该步骤的其他步骤与实施例1相同。本实施例的步骤2中，Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH与2-chlorotrityl chloride resin的摩尔比均为3:1，2-chlorotrityl chloride resin与1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺的摩尔比1:3:3:3，该步骤的其他步骤与实施例1相同。本实施例的步骤3～6中，2-chlorotritylchloride resin与Fmoc-氨基酸、1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺的摩尔比与本实施例的步骤2相同，其合成方法与实施例1相同。本实施的步骤7与实施例1相同，得到0.87g艾塞那肽，收率46.5%，纯度大于98%。
实施例4
在实施例1～3的步骤2～6中，所用的切割液用等体积的三氟乙酸与二氯甲烷的体积比为2:98的混合液替换，其他步骤与相应实施例相同，得到纯度大于98%的艾塞那肽。
实施例5
在实施例1～3的步骤2～6中，所用的切割液用等体积的三氟乙醇与乙酸、二氯甲烷的体积比为2:1:7的混合液替换，其他步骤与相应实施例相同，得到纯度大于98%的艾塞那肽。
实施例6
在实施例1～5的步骤7中，所用的N,N-二甲基甲酰胺与二甲亚砜、N-甲基吡咯烷酮的体积比为1:1:1的混合液用等体积N,N-二甲基甲酰胺与二甲亚砜、N-甲基吡咯烷酮的体积比为0.5:1:1的混合液替换，其他步骤与相应实施例相同，得到纯度大于98%的艾塞那肽。
实施例7
在实施例1～5的步骤7中，所用的N,N-二甲基甲酰胺与二甲亚砜、N-甲基吡咯烷酮的体积比为1:1:1的混合液用等体积N,N-二甲基甲酰胺与二甲亚砜、N-甲基吡咯烷酮的体积比为1:2:1的混合液替换，其他步骤与相应实施例相同，得到纯度大于98%的艾塞那肽。

Claims (5)

1.一种艾塞那肽的固相片段合成方法，其特征在于它由下述步骤组成：
(1)合成Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-MBHAResin
①合成Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin
将Fmoc-Rink Amide MBHA Resin用N,N-二甲基甲酰胺溶胀后，用哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液脱Fmoc-两次，加入N,N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Ser(tBu)-OH、1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺，在氮气保护下，常温搅拌1～3小时，得到Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin；
②合成Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin
将Fmoc-Ser(tBu)-MBHA Resin用哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液脱Fmoc-两次，加入N,N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Pro-OH、1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺，在氮气保护下，常温搅拌1～3小时，得到Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin；
③合成Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin
按照步骤②的方法向Fmoc-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin上依次连接Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH，得到Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin；
(2)合成Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-COOH
①合成Fmoc-Gly-2-CTC resin
将2-chlorotrityl chloride resin用二氯甲烷溶胀后，加入二氯甲烷、Fmoc-Gly-OH、N,N′-二异丙基乙胺，在氮气保护下，常温搅拌1～3小时，得到Fmoc-Gly-2-CTC resin；
②合成Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-2-CTC resin
按照步骤(1)中②的方法，向Fmoc-Gly-2-CTC resin上依次连接Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH，得到Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-2-CTC resin；
③切割处理
向Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-2-CTC resin中加入切割液，常温搅拌1～3小时，过滤，将滤液加入冷乙醚中，析出沉淀，得到Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-COOH；
上述的切割液是三氟乙酸与二氯甲烷的体积比为1:99混合液；
(3)合成Fmoc-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-COOH
按照步骤(2)中①的方法，向2-chlorotrityl chloride resin上连接Fmoc-Leu-OH，得到Fmoc-Leu-2-CTC resin，再按照步骤(2)中②的方法向Fmoc-Leu-2-CTCresin上依次连接Fomc-Trp-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fomc-Val-OH，得到Fmoc-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-2-CTC Resin，Fmoc-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-2-CTC Resin按照步骤(2)中③的方法进行切割处理，得到Fmoc-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-COOH；
(4)合成Fmoc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-COOH
按照步骤(2)中①的方法，向2-chlorotrityl chloride resin上连接Fomc-Ala-OH，得到Fmoc-Ala-2-CTC resin，再按照步骤(2)中②的方法向Fmoc-Ala-2-CTCresin上依次连接Fomc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fomc-Met-OH，得到Fmoc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-2-CTC Resin，Fmoc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-2-CTC Resin按照步骤(2)中③的方法进行切割处理，得到Fmoc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-COOH；
(5)合成Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH
按照步骤(2)中①的方法，向2-chlorotrityl chloride resin上连接Fomc-Gln(Trt)-OH，得到Fmoc-Gln(Trt)-2-CTC resin，再按照步骤(2)中②的方法向Fmoc-Gln(Trt)-2-CTC resin上依次连接Fomc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fomc-Thr(tBu)-OH，得到Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-2-CTC Resin，Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-2-CTC Resin按照步骤(2)中③的方法进行切割处理，得到Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH；
(6)合成Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-COOH
按照步骤(2)中①的方法，向2-chlorotrityl chloride resin上连接Fomc-Phe-OH，得到Fmoc-Phe-2-CTC resin，再按照步骤(2)中②的方法向Fmoc-Phe-2-CTCresin上依次连接Fomc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fomc-His(Trt)-OH，得到Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-2-CTC Resin，Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-2-CTC Resin按照步骤(2)中①的方法进行切割处理，得到Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-COOH；
(7)合成艾塞那肽
①组装连接Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin
将步骤(1)得到的Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin用哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液脱Fmoc-两次，加入N,N-二甲基甲酰胺与二甲亚砜、N-甲基吡咯烷酮的体积比为1:1:1的混合液以及Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-COOH、1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺，在氮气保护下，常温搅拌3～4小时，得到Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin；
②组装连接艾塞那肽
按照步骤①的组装连接方法，向Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin上依次组装连接Fmoc-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-COOH、Fmoc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-COOH、Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH、Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-COOH，用哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1:4的混合液脱Fmoc-两次，得到艾塞那肽树脂，用质量百分比组成为三氟乙酸83％、苯酚5％、苯甲硫醚4％、水3％、三异丙基硅烷5％的切割液按照步骤(2)中③的方法对艾塞那肽树脂进行切割处理，得到艾塞那肽粗品，艾塞那肽粗品经反相色谱纯化、冷冻干燥，得到艾塞那肽。
2.根据权利要求1所述的艾塞那肽的固相片段合成方法，其特征在于：所述的步骤(1)中，Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH与Fmoc-Rink Amide MBHA Resin的摩尔比均为2～4:1，Fmoc-Rink Amide MBHA Resin与1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺的摩尔比为1:(2～4):(2～4):(2～4)。
3.根据权利要求1所述的艾塞那肽的固相片段合成方法，其特征在于：所述的步骤(2)的①中，2-chlorotrityl chloride resin与Fmoc-Gly-OH、N,N′-二异丙基乙胺的摩尔比为1:1:4。
4.根据权利要求1所述的艾塞那肽的固相片段合成方法，其特征在于：所述的步骤(2)的②中，Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH与2-chlorotrityl chloride resin的摩尔比均为2～4:1，2-chlorotrityl chloride resin与1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺的摩尔比1:(2～4):(2～4):(2～4)。
5.根据权利要求1所述的艾塞那肽的固相片段合成方法，其特征在于：所述的步骤(7)中，Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-COOH、Fmoc-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-COOH、Fmoc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-COOH、Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH、Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-COOH与Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin的摩尔比均为2:1，Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-MBHA Resin与1-羟基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二异丙基乙胺的摩尔比1:4:4:4。
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