CN104418949A - 一种替度鲁肽的制备方法 - Google Patents

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CN104418949A CN201310369843.4A CN201310369843A CN104418949A CN 104418949 A CN104418949 A CN 104418949A CN 201310369843 A CN201310369843 A CN 201310369843A CN 104418949 A CN104418949 A CN 104418949A
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张文治
潘俊锋
马亚平
袁建成
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Abstract

本发明属于药物化学领域，尤其涉及一种替度鲁肽的制备方法。本发明所述制备方法分别固相合成替度鲁肽序列4-33位肽树脂片段和替度鲁肽序列1-3位肽树脂片段，然后以合适的树脂为载体，将替度鲁肽序列4-33位肽树脂片段与替度鲁肽序列1-3位肽树脂片段偶联，得到替度鲁肽树脂，最后裂解得到替度鲁肽粗肽，纯化得到替度鲁肽纯品。本发明所述制备方法，可以有效避免3-4位的Asp-Gly结构所带来的降解等副反应，同时也可以降低His1消旋，从而有效提高粗肽纯度，提高纯化收率。与现有技术相比，本发明所述制备方法最终制备得到替度鲁肽产品纯度高，副产物少，产品收率高，利于替度鲁肽的大规模生产。

Description

一种替度鲁肽的制备方法
技术领域
本发明属于药物化学领域，尤其涉及一种替度鲁肽的制备方法。
背景技术
短肠综合征（short bowel syndrome，SBS）是指由于严重小肠疾病或外科手术切除大部分小肠导致机体无法正常吸收营养而引发一系列综合征。SBS降低了患者摄取液体和营养物质的能力，由于残余肠管过短，营养物质吸收消化障碍，可表现为腹泻、脂肪泻、体重下降，导致脱水和营养不良，严重者甚至会危及生命。短肠综合征患者多不能正常饮食，有些通过积极恰当的肠康复治疗后可恢复经口饮食，但有些则需终生依赖肠外营养。而肠外营养支持治疗又将增加全身感染和其他长期并发症的风险。迄今为止尚无药物可以治疗短肠综合征。
替度鲁肽，英文名为telaprevir，是一种胰高血糖素样肽2（GLP-2）类似物，一种天然生成的激素，可减少胃排空和分泌，并调节小肠内膜细胞的生长、增殖和修复。替度鲁肽于2001年被定性为孤儿药。临床试验表明，该药能够降低短肠综合征患者对胃肠外营养的需求。2012年6月，欧洲药品管理局（EMA）批准替度鲁肽(teduglutide)用于治疗成人短肠综合征。替度鲁肽分子式为C164H252N44O55S，分子量为3752.13，氨基酸组成如下：His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-lle-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-lle-Asn-Trp-Leu-lle-Gln-Thr-Lys-lle-Thr-Asp-OH。
目前关于替度鲁肽的制备，公开号为CN101824087A的专利中采用了纯固相顺序偶联的方法进行替度鲁肽的合成，具体方法为以wang树脂为载体，采用常规顺序偶联，最终切割得到替度鲁肽。而公开号为WO2012028602A1专利中为了解决上述专利保护替度鲁肽的合成方法中存在的Asp-Gly片段产生的降解等一系列问题，采用片段偶联方法进行了替度鲁肽的合成，即先合成全保护片段1-4，然后采用纯化后的片段1-4与片段肽树脂5-33进行固相偶联，最终裂解得到替度鲁肽。
然而研究人员发现，不论是采用公开号为CN101824087A的专利中的常规的逐步偶联方法还是按照公开号为WO2012028602A1专利进行固相片段缩合方法制备替度鲁肽都存在His1容易消旋的问题。由于His的消旋，导致制得的替度鲁肽难以纯化，从而导致替度鲁肽收率降低。此外，公开号为WO2012028602A1专利采用片段1-4与片段肽树脂5-33进行固相偶联的方法制备替度鲁肽，仍然不能有效解决3-4位的Asp-Gly结构所带来的降解等副反应，同样会使制得的替度鲁肽难以纯化，进一步导致替度鲁肽收率降低。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，提供一种收率高的替度鲁肽的制备方法，所述制备方法可以有效避免3-4位的Asp-Gly结构所带来的降解等副反应，同时也可以降低His1消旋，从而有效提高粗肽纯度，提高纯化收率。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种替度鲁肽的制备方法，包括：
步骤1：将Fmoc-Asp(OtBu)-OH与固相载体偶联，得到Fmoc-Asp(OtBu)-Resin；
步骤2：Fmoc-Asp(OtBu)-Resin按照替度鲁肽顺序逐一偶联Fmoc保护的替度鲁肽的4-32位氨基酸得到替度鲁肽4-33片段肽树脂H-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Resin；
步骤3：固相合成替度鲁肽1-3片段肽树脂Boc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Resin，然后裂解得到替度鲁肽全保护1-3肽片段Boc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-OH；
步骤4：替度鲁肽4-33片段肽树脂在固相上偶联替度鲁肽全保护1-3肽片段，得到替度鲁肽树脂；
步骤5：替度鲁肽树脂裂解得到替度鲁肽粗肽；
步骤6：替度鲁肽粗肽纯化得到替度鲁肽纯品。
优选的，步骤1所述固相载体选自Wang Resin、PAM Resin、HMPA-AMResin、HMPA-MBHA Resin树脂。
优选的，步骤1所述固相载体的初始替代度为0.5mmol/g～1.0mmol/g。
优选的，步骤2所述Fmoc-Asp(OtBu)-Resin的替代度为0.2～0.5mmol/g。
优选的，步骤2所述偶联的偶联试剂为HOBt/DIC。
优选的，步骤3所述固相合成的载体为CTC树脂。
优选的，步骤3所述裂解的裂解剂为TFA与DCM的混合物或TFE与DCM的混合物。
优选的，步骤4所述偶联的偶联试剂为HATU/HOAt/DIPEA。
优选的，步骤5所述裂解的裂解剂为TFA、PhSMe、EDT、TIS与水的混合溶液。
优选的，步骤6所述纯化为反相高效液相色谱纯化。
本发明所述制备方法分别固相合成替度鲁肽序列4-33位肽树脂片段和替度鲁肽序列1-3位肽树脂片段，然后以合适的树脂为载体，将替度鲁肽序列4-33位肽树脂片段与替度鲁肽序列1-3位肽树脂片段偶联，得到替度鲁肽树脂，最后裂解得到替度鲁肽粗肽，纯化得到替度鲁肽纯品。本发明所述将替度鲁肽序列4-33位肽树脂片段与替度鲁肽序列1-3位肽树脂片段固相缩合的方法，可以有效避免3-4位的Asp-Gly结构所带来的降解等副反应，同时也可以降低His1消旋，从而有效提高粗肽纯度，提高纯化收率。此外本发明所述替度鲁肽序列4-33位肽树脂片段与替度鲁肽序列1-3位肽树脂片段的合成可以同时进行，缩短合成周期。与现有技术相比，本发明所述制备方法最终制备得到替度鲁肽产品纯度高，副产物少，产品收率高，利于替度鲁肽的大规模生产。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种替度鲁肽的制备方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种替度鲁肽的制备方法，包括：
步骤1：将Fmoc-Asp(OtBu)-OH与固相载体偶联，得到Fmoc-Asp(OtBu)-Resin；
步骤2：Fmoc-Asp(OtBu)-Resin按照替度鲁肽顺序逐一偶联Fmoc保护的替度鲁肽的4-32位氨基酸得到替度鲁肽4-33片段肽树脂H-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Resin；
步骤3：Thr-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Resin；
步骤3：固相合成替度鲁肽1-3片段肽树脂Boc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Resin，然后裂解得到替度鲁肽全保护1-3肽片段Boc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-OH；
步骤4：替度鲁肽4-33片段肽树脂在固相上偶联替度鲁肽全保护1-3肽片段，得到替度鲁肽树脂；
步骤5：替度鲁肽树脂裂解得到替度鲁肽粗肽；
步骤6：替度鲁肽粗肽纯化得到替度鲁肽纯品。
本发明所述替度鲁肽的制备方法采用Fmoc/tBu合成策略，分别固相合成替度鲁肽序列4-33位肽树脂片段和替度鲁肽序列1-3位肽树脂片段，然后以合适的树脂为载体，将替度鲁肽序列4-33位肽树脂片段与替度鲁肽序列1-3位肽树脂片段偶联，得到替度鲁肽树脂，最后裂解得到替度鲁肽粗肽，纯化得到替度鲁肽。
本发明所述制备方法步骤1首先采用Fmoc/tBu合成策略，将Fmoc-Asp(OtBu)-OH与固相载体偶联得到Fmoc-Asp(OtBu)-Resin。
其中，优选的，步骤1所述固相载体选自Wang Resin、PAM Resin、HMPA-AM Resin、HMPA-MBHA Resin。更优选为Wang Resin。
进一步的，步骤1所述固相载体的初始替代度优选为0.5mmol/g～1.0mmol/g。更优选为1.0mmol/g
在一些具体实施方式中，本发明所述制备方法步骤1为固相载体与Fmoc-Asp(OtBu)-OH在偶联剂的作用下，反应得到Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂。其中，所述偶联剂优选为HOBt/DMAP/DIC。
具体的，所述Fmoc-Asp(OtBu)-OH先与HOBt/DMAP混合，溶解在有机溶剂中冰浴下加入DIC活化后加入到固相反应柱中，与事先用有机溶剂溶解的固相载体进行偶联反应。
作为优选，所述溶解Fmoc-Asp(OtBu)-OH的有机溶剂为体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液。所述溶解的固相载体的有机溶剂为DMF。
作为优选，偶联反应的条件为室温反应2小时。
上述步骤1所述偶联反应结束后需要对反应液进行纯化，分离得到Fmoc-Asp(OtBu)-Resin。所述纯化方法具体方法为用DMF洗涤，加入封闭液封闭，然后再依次用DMF和DCM洗涤，甲醇收缩抽干，即得Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂。其中，所述封闭液优选为摩尔比为1:1的吡啶与乙酸酐的混合溶液。进一步的，如果封闭后树脂若未完全扩散，需加DCM作为溶剂溶解。
本发明步骤2按照替度鲁肽顺序在Fmoc-Asp(OtBu)-Resin上逐一偶联Fmoc保护的替度鲁肽的4-32位氨基酸得到替度鲁肽4-33片段肽树脂H-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Resin。
其中，步骤2所述Fmoc-Asp(OtBu)-Resin的替代度为0.2mmol/g～0.5mmol/g。
进一步的，步骤2所述偶联的偶联试剂为HOBt/DIC。
在一些具体实施方式中，在Fmoc-Asp(OtBu)-Resin上逐一偶联Fmoc保护的替度鲁肽的4-32位氨基酸的方法具体为：Fmoc-Asp(OtBu)-Resin与Fmoc保护的氨基酸在偶联剂的作用下，逐一偶联最终反应得到替度鲁肽4-33片段肽树脂H-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Resin。其中，所述偶联剂优选为HOBt/DIC。
具体的，所述Fmoc保护的氨基酸Fmoc-Thr(tBu)-OH先与HOBt混合，溶解在有机溶剂中冰浴下加入DIC活化后加入到固相反应柱中，与事先用有机溶剂溶解的Fmoc-Asp(OtBu)-Resin进行偶联反应。Fmoc保护的替度鲁肽的4-31位氨基酸按此方法逐一偶联。
作为优选，所述溶解Fmoc保护的氨基酸的有机溶剂为体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液。所述溶解的Fmoc-Asp(OtBu)-Resin的有机溶剂为DMF。
作为优选，上述步骤2所述偶联反应的条件为室温反应2小时。
上述步骤2所述偶联反应以茚三酮法检测判断每次偶联反应终点。如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。
上述步骤2所述偶联反应结束后需要对反应液进行纯化，分离得到替度鲁肽4-33片段肽树脂。所述纯化方法具体方法为偶联反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，即得替度鲁肽4-33片段肽树脂。
本发明步骤3固相合成替度鲁肽1-3片段肽树脂Boc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Resin，然后裂解得到替度鲁肽全保护1-3肽片段Boc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-OH。
其中，步骤3所述固相合成替度鲁肽1-3片段肽树脂Boc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Resin具体为Fmoc-Asp(OtBu)-OH与载体偶联得到Fmoc-Asp(OtBu)-Resin，然后Fmoc-Asp(OtBu)-Resin逐一偶联Fmoc-Gly-OH和Boc-His(Trt)-OH得到Boc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Resin。
优选的，步骤3所述固相合成的载体为CTC树脂。所述CTC树脂的替代度优选为1.0mmol/g。
在一些具体实施方式中，固相合成替度鲁肽1-3片段肽树脂Boc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Resin的方法具体包括：
步骤a、固相载体CTC树脂与Fmoc-Asp(OtBu)-OH在偶联剂的作用下偶联反应得到Fmoc-Asp(OtBu)-CTC树脂；
步骤b、Fmoc-Asp(OtBu)-CTC树脂偶联剂的作用下依次与Fmoc-Gly-OH和Boc-His(Trt)-OH偶联反应得到替度鲁肽1-3片段肽树脂Boc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-CTC树脂。
其中，步骤a所述偶联剂优选为DMAP。步骤b所述偶联剂优选为HOBt/DIC。
具体的，步骤a所述偶联反应具体为Fmoc-Asp(OtBu)-OH溶解在有机溶剂中冰浴下加入DMAP活化后加入到固相反应柱中，与事先用有机溶剂溶解的CTC树脂进行偶联反应。
作为优选，步骤a所述有机溶剂为DMF。
作为优选，上述步骤a所述偶联反应的条件为室温反应5min后再次加入DIPEA室温反应2小时。分批次加入DIPEA可避免刚开始反应过于激烈，导致大量放热，保证反应温和。
上述步骤a所述偶联反应结束后需要对反应液进行纯化，分离得到Fmoc-Asp(OtBu)-CTC树脂。所述纯化方法具体方法为偶联反应结束后用DMF洗涤，加入封闭液封闭，然后用DMF洗涤，甲醇收缩抽干，即得Fmoc-Asp(OtBu)-CTC树脂。其中，所述封闭液优选为甲醇。进一步的，如果封闭后树脂若未完全扩散，需加DMF作为溶剂溶解。
进一步的，步骤b所述偶联反应具体为所述Fmoc-Gly-OH先与HOBt混合，溶解在有机溶剂中冰浴下加入DIC活化后加入到固相反应柱中，与事先用有机溶剂溶解的Fmoc-Asp(OtBu)-CTC树脂进行偶联反应得到Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-CTC树脂。Boc-His(Trt)-OH按此方法与Fmoc-Gly-Asp(OtBu)-CTC树脂偶联得到替度鲁肽1-3片段肽树脂Boc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-CTC树脂。
作为优选，步骤b所述有机溶剂为DMF。
作为优选，上述步骤b所述偶联反应的条件为室温反应2小时。
上述步骤b所述偶联反应以茚三酮法检测判断每次偶联反应终点。如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。
上述步骤b所述偶联反应结束后需要对反应液进行纯化，分离得到Boc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-CTC树脂。所述纯化方法具体方法为偶联反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，即得替度鲁肽1-3片段肽树脂Boc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-CTC树脂。
本发明所述步骤3固相合成的替度鲁肽1-3片段肽树脂Boc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Resin裂解得到替度鲁肽全保护1-3肽片段Boc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-OH。
其中，步骤3所述裂解的裂解剂优选为TFA与DCM的混合物。
进一步地，上述裂解剂中所述TFA与DCM的混合物中TFA与DCM的体积比优选为0.5：99.5～5：95。在一些具体实施方式中，TFA与DCM的体积比为1：99。
进一步地，步骤3所述裂解剂的加入量优选为按mL/g计算，裂解剂与肽树脂的比例为10:1。即每1g肽树脂加入10mL上述裂解剂。
进一步地，步骤3所述裂解反应条件优选为室温搅拌2.5h。
在一些具体实施方式中，上述步骤3所述裂解反应结束后需要对反应液进行纯化，分离得到替度鲁肽全保护1-3肽片段Boc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-OH。所述纯化方法具体方法为反应液用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量DCM洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入冰冻的无水乙醚沉淀，收集沉淀用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即粗肽Boc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-OH。其中DCM洗涤可以把残余的吸附在树脂上的产物尽可能洗出，以减少损失。
本发明所述制备方法步骤4替度鲁肽4-33片段肽树脂在固相上偶联替度鲁肽全保护1-3肽片段得到替度鲁肽树脂。
其中，步骤4所述偶联的偶联试剂优选为HATU/HOAt/DIPEA。
在具体实施方式中，步骤4所述替度鲁肽4-33片段肽树脂在固相上偶联替度鲁肽全保护1-3肽片段的方法具体为：替度鲁肽全保护1-3肽片段先与HATU和HOAt溶解在有机溶剂中冰浴下加入DIPEA活化后加入到固相反应柱中，与事先用有机溶剂溶解的替度鲁肽4-33片段肽树脂进行偶联反应得到替度鲁肽肽树脂。
作为优选，步骤4所述有机溶剂为DMF。
作为优选，步骤4所述偶联反应的条件为室温反应2小时。
上述步骤4所述偶联反应以茚三酮法检测判断偶联反应终点。如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。
上述步骤4所述偶联反应结束后需要对反应液进行纯化，分离得到替度鲁肽肽树脂。所述纯化方法具体方法为偶联反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，即得替度鲁肽肽树脂。
本发明所述制备方法步骤5将替度鲁肽树脂裂解得到替度鲁肽粗肽。
其中，步骤5所述裂解剂优选为TFA、PhSMe、EDT、TIS与水的混合溶液。更优选为TFA、PhSMe、EDT、TIS与水体积比为86：5：5：3：1的混合溶液。
进一步地，步骤5所述裂解剂的加入量优选为按mL/g计算，裂解剂与肽树脂的比例为10:1。即每1g肽树脂加入10mL上述裂解剂。
进一步地，步骤5所述裂解反应条件优选为室温搅拌2.5h。
在一些具体实施方式中，上述步骤3所述裂解反应结束后需要对反应液进行纯化，分离得到替度鲁肽粗肽。所述纯化方法具体方法为反应液用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤，合并滤液后减压浓缩，加入冰冻的无水乙醚沉淀，收集沉淀用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到替度鲁肽粗肽。其中TFA洗涤可以把残余的吸附在树脂上的产物尽可能洗出，以减少损失。
本发明所述制备方法步骤6将裂解得到的替度鲁肽粗肽进一步纯化得到替度鲁肽纯品，其中所述纯化优选为反相高效液相色谱纯化。
反相高效液相色谱，英文名reversed phase high performance liquidchromatography，简称，RP-HPLC，是由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系。它正好与由极性固定相和弱极性流动相所组成的液相色谱体系（正相色谱）相反。RP-HPLC是当今液相色谱的最主要的分离模式，几乎可用于所有能溶于极性或弱极性溶剂中的有机物的分离纯化。本发明所述制备方法将步骤5裂解得到的替度鲁肽粗肽采用反相高效液相色谱法纯化得到替度鲁肽纯品。
优选的，所述反相高效液相色谱法具体为：以反相十八烷基硅烷或八烷基硅烷键合硅胶为固定相，裂解得到的帕西瑞肽粗品溶液上样后，用0.2%TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分；以反相十八烷基硅烷或八烷基硅烷键合硅胶为固定相，用0.1%醋酸溶液/乙腈流动相转盐，冻干即得替度鲁肽醋酸盐精肽即替度鲁肽纯品。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
说明书和权利要求书中所使用的缩写的含义列于下表中：
缩写及英文 含义
Wang Resin 王树脂
PAM Resin 4-羟甲基-苯乙酰胺甲基树脂
CTC Resin 2-氯三苯甲基氯树脂
HOAt 1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑
Fmoc 9-芴甲氧羰基
HOBt 1-羟基苯并三唑
HATU 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯
HOAt 1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑
DIPEA N,N-二异丙基乙胺
Hmb 2-羟基-4-甲氧基苄基
Dmb 2,4-二甲氧基苄基
DMF N,N-二甲基甲酰胺
DCM 二氯甲烷
TFE 三氟乙醇
TFA 三氟乙酸
PhSMe PhSMe
TIS 三异丙基硅烷
DIC N,N'-二异丙基碳二亚胺
EDT 乙二硫醇
实施例1：替代度为0.5mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的Wang树脂40g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取24.72g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（60mmol）、9.73g HOBt（72mmol）和0.73g DMAP（6mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入11.26mL DIC（72mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入70mL封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，400mmol：400mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂。检测替代度为0.503mmol/g。
实施例2：替代度为0.2mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的Wang树脂40g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取9.89g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（24mmol）、3.90g HOBt（28.8mmol）和0.29g DMAP（0.24mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入4.50mL DIC（28.8mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入70mL封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，400mmol：400mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂。检测替代度为0.198mmol/g。
实施例3：替代度为0.3mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的Wang树脂40g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取14.83g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（36mmol）、5.84g HOBt（43.2mmol）和1.44g DMAP（3.6mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入6.75mL DIC（43.2mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入70mL封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，400mmol：400mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂。检测替代度为0.302mmol/g。
实施例4：H-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Wang Resin肽树脂的制备
称取实施例3中替代度为0.302mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂33.1g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取11.93g Fmoc-Thr(tBu)-OH（30mmol），4.86g HOBt（36mmol），溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入5.63mL DIC（36mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序，从C端到N端依次完成4-33片段的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到替度鲁肽（4-33）-Wang树脂76.0g。
实施例5：替代度为0.5mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-PAM树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的PAM树脂40g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取24.72g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（60mmol）、9.73g HOBt（72mmol）和0.73g DMAP（6mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入11.26mL DIC（72mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入70mL封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，400mmol：400mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-PAM树脂。检测替代度为0.516mmol/g。
实施例6：替代度为0.2mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-PAM树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的PAM树脂40g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取9.89g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（24mmol）、3.90g HOBt（28.8mmol）和0.29g DMAP（0.24mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入4.50mL DIC（28.8mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入70mL封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，400mmol：400mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-PAM树脂。检测替代度为0.189mmol/g。
实施例7：替代度为0.3mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-PAM树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的PAM树脂40g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取14.83g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（36mmol）、5.84g HOBt（43.2mmol）和1.44g DMAP（3.6mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入6.75mL DIC（43.2mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入70mL封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，400mmol：400mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-PAM树脂。检测替代度为0.298mmol/g。
实施例8：替代度为0.5mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-HMPA-AM树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的HMPA-AM树脂40g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取24.72g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（60mmol）、9.73g HOBt（72mmol）和0.73g DMAP（6mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入11.26mL DIC（72mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入70mL封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，400mmol：400mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-HMPA-AM树脂。检测替代度为0.503mmol/g。
实施例9：替代度为0.2mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-HMPA-AM树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的HMPA-AM树脂40g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取9.89g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（24mmol）、3.90g HOBt（28.8mmol）和0.29g DMAP（0.24mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入4.50mL DIC（28.8mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入70mL封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，400mmol：400mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-HMPA-AM树脂。检测替代度为0.214mmol/g。
实施例10：替代度为0.3mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-HMPA-AM树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的HMPA-AM树脂40g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取14.83g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（36mmol）、5.84g HOBt（43.2mmol）和1.44g DMAP（3.6mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入6.75mL DIC（43.2mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入70mL封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，400mmol：400mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-HMPA-AM树脂。检测替代度为0.309mmol/g。
实施例11：替代度为0.5mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-HMPA-MBHA树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的HMPA-AM树脂40g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取24.72g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（60mmol）、9.73g HOBt（72mmol）和0.73g DMAP（6mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入11.26mL DIC（72mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入70mL封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，400mmol：400mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-HMPA-MBHA树脂。检测替代度为0.503mmol/g。
实施例12：替代度为0.2mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-HMPA-MBHA树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的HMPA-MBHA树脂40g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取9.89g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（24mmol）、3.90g HOBt（28.8mmol）和0.29g DMAP（0.24mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入4.50mL DIC（28.8mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入70mL封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，400mmol：400mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-HMPA-MBHA树脂。检测替代度为0.203mmol/g。
实施例13：替代度为0.3mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-HMPA-MBHA树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的HMPA-MBHA树脂40g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取14.83g Fmoc-Asp(OtBu)-OH（36mmol）、5.84g HOBt（43.2mmol）和1.44g DMAP（3.6mmol）溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入6.75mL DIC（43.2mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入70mL封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，400mmol：400mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-HMPA-MBHA树脂。检测替代度为0.310mmol/g。
实施例14：H-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Pam Resin肽树脂的制备
称取实施例7中替代度为0.298mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-PAM树脂33.6g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取11.93g Fmoc-Thr(tBu)-OH（30mmol），4.86g HOBt（36mmol），溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入5.63mL DIC（36mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序，从C端到N端依次完成4-33片段的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到替度鲁肽（4-33）-PAM树脂74.3g。
实施例15：H-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)--HMPA-AM Resin肽树脂的制备
称取实施例10中替代度为0.309mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-HMPA-AM树脂32.4g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取11.93g Fmoc-Thr(tBu)-OH（30mmol），4.86g HOBt（36mmol），溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入5.63mLDIC（36mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序，从C端到N端依次完成4-33片段的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到替度鲁肽（4-33）-HMPA-AM树脂75.2g。
实施例16：H-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)--HMPA-MBHA Resin肽树脂的制备
称取实施例13中替代度为0.310mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-HMPA-MBHA树脂32.3g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取11.93g Fmoc-Thr(tBu)-OH（30mmol），4.86g HOBt（36mmol），溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入5.63mL DIC（36mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序，从C端到N端依次完成4-33片段的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到替度鲁肽（4-33）-HMPA-MBHA树脂75.5g。
实施例17：Fmoc-Asp(OtBu)-CTC树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的CTC树脂100g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取82.3gFmoc-Asp(OtBu)-OH（200mmol）溶于DMF溶液，冰水浴下加入69.5mLDIPEA（400mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应5min后再次加入34.8mLDIPEA（200mmol）。室温反应60min。用DMF洗涤3次，加入81mL封闭液（甲醇：2000mmol）封闭8小时（树脂若未完全扩散加DMF作为溶剂）。用DMF洗涤6次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Asp(OtBu)-CTC树脂。检测替代度为0.916mmol/g。
实施例18：Boc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-CTC肽树脂的制备
称取实施例17中替代度为0.916mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-CTC树脂98.3g（90mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。取80.271gFmoc-Gly-OH（270mmol），43.8g HOBt（324mmol），溶于DMF溶液，冰水浴下加入50.7mL DIC（324mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照替度鲁肽主链肽序，再完成Boc-His(Trt)-OH的固相偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到Boc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-CTC126.1g。
实施例19:Boc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-OH的制备
将实施例18制备的Boc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-CTC肽树脂置于裂解反应瓶中，以10mL/g树脂的比例加入裂解试剂（TFA：DCM=1：99（V/V）），室温搅拌2.5h。反应液用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量DCM洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，收集沉淀用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即粗肽Boc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-OH。重量63.2g，HPLC纯度为96.1%。
实施例20：替度鲁肽肽树脂的合成
称取由实施例4的方法制备的76.0g（10mmol）的H-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Wang Resin肽树脂的制备，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。将21.7g实施例19制备的Boc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-OH粗品（30mmol），11.41g HATU（30mmol），4.90g HOAt（36mmol）溶于DMF中，冰浴中滴加10.43mL DIPEA，活化5min后加入固相反应柱中，室温反应2h。反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h。反应结束后用甲醇收缩，肽树脂真空干燥过夜，称重Boc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Wang Resin肽树脂为83.2g。
实施例21：替度鲁肽肽树脂的合成
称取由实施例14的方法制备的74.3g（10mmol）的H-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Pam Resin肽树脂的制备，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。将21.7g实施例19制备的Boc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-OH粗品（30mmol），11.41g HATU（30mmol），4.90g HOAt（36mmol）溶于DMF中，冰浴中滴加10.43mL DIPEA，活化5min后加入固相反应柱中，室温反应2h。反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h。反应结束后用甲醇收缩，肽树脂真空干燥过夜，称重Boc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Wang Resin肽树脂为81.5g。
实施例22：替度鲁肽粗肽的制备
将实施例20制备的83.2g Boc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-(Hmb)Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Wang Resin肽树脂置于裂解反应其中，以10mL/g树脂的比例加入裂解试剂（TFA：苯甲硫醚：EDT：TIS：水=86：5：5：3：1（V/V）），室温搅拌2.5h。反应液用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，收集沉淀用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即替度鲁肽粗肽36.52g，HPLC纯度为63.8%。
实施例23：替度鲁肽粗肽的制备
将实施例21制备的105.7g Boc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-PAM肽树脂置于裂解反应其中，以10mL/g树脂的比例加入裂解试剂（TFA：苯甲硫醚：EDT：TIS：水=86：5：5：3：1（V/V）），室温搅拌2.5h。反应液用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，收集沉淀用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即替度鲁肽粗肽34.21g，HPLC纯度为59.78%。
实施例24：替度鲁肽精肽醋酸盐的制备
称取实施例22～23中任意30.0g替度鲁肽粗肽用3000mL水溶解后，采用Waters2545RP-HPLC系统，波长230nm，色谱柱为50×250mm反相C18柱，常规0.2%TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分，得到纯度大于98.5%精肽。将精肽溶液采用Waters2545RP-HPLC系统，色谱柱为50×250mm反相C18柱，0.1%醋酸溶液/乙腈流动相转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到替度鲁肽醋酸盐精肽≥9.0g，RP-HPLC纯度≥98.5%，Asp降解杂质<0.2%。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种替度鲁肽的制备方法，其特征在于，包括：
步骤1：将Fmoc-Asp(OtBu)-OH与固相载体偶联，得到Fmoc-Asp(OtBu)-Resin；
步骤2：Fmoc-Asp(OtBu)-Resin按照替度鲁肽顺序逐一偶联Fmoc保护的替度鲁肽的4-32位氨基酸得到替度鲁肽4-33片段肽树脂H-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Resin；
步骤3：固相合成替度鲁肽1-3片段肽树脂Boc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Resin，然后裂解得到替度鲁肽全保护1-3肽片段Boc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-OH；
步骤4：替度鲁肽4-33片段肽树脂在固相上偶联替度鲁肽全保护1-3肽片段，得到替度鲁肽树脂；
步骤5：替度鲁肽树脂裂解得到替度鲁肽粗肽；
步骤6：替度鲁肽粗肽纯化得到替度鲁肽纯品。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤1）所述固相载体选自Wang Resin、PAM Resin、HMPA-AM Resin、HMPA-MBHA Resin树脂。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤1）所述固相载体的初始替代度为0.5mmol/g～1.0mmol/g。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤2）所述Fmoc-Asp(OtBu)-Resin的替代度为0.2mmol/g～0.5mmol/g。
5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤2）所述偶联的偶联试剂为HOBt/DIC。
6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤3）所述固相合成的载体为CTC树脂。
7.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤3）所述裂解的裂解剂为TFA与DCM的混合物或TFE与DCM的混合物。
8.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤4）所述偶联的偶联试剂为HATU/HOAt/DIPEA。
9.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤5）所述裂解的裂解剂为TFA、PhSMe、EDT、TIS与水的混合溶液。
10.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤6)所述纯化为反相高效液相色谱纯化。
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