CN109456404A - 一种替度鲁肽的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种替度鲁肽的合成方法,属于多肽药物合成领域。该方法以替度鲁肽序列的第2‑3位氨基酸作为伪脯二肽;或者以替度鲁肽序列的第5‑6位氨基酸作为伪脯二肽;或者以替度鲁肽序列的第22‑23位氨基酸作为伪脯二肽;或者以替度鲁肽序列的第27‑28位氨基酸作为伪脯二肽;或者以替度鲁肽序列的第29‑30位氨基酸作为伪脯二肽;再按顺序依次固相合成替度鲁肽序列的其他位点氨基酸,合成全保护替度鲁肽,经裂解沉淀,得到替度鲁肽。本发明方法提高了粗肽纯度,极大降低了物料成本和纯化成本,利于进行工业化放大生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种多肽药物合成领域,特别涉及GLP-2受体激动素一种替度鲁肽的合成方法。
背景技术
替度鲁肽,英文名:teduglutide。肽序列为:
His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-lle-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-lle-Asn-Trp-Leu-lle-Gln-Thr-Lys-lle-Thr-Asp-OH;是一种胰高血糖素样肽2(GLP-2)类似物,一种天然生成的激素,可减少胃排空和分泌,并调节小肠内膜细胞的生长、增殖和修复。替度鲁肽于2001年被定性为孤儿药。在临床上用于治疗成人短肠综合征,需求应用前景广泛。在替度鲁肽的现有合成方法中,主要是采用纯固相顺序偶联的方法。
如中国公开专利文献CN104072605A公开了一种替度鲁肽的制备方法,其同时包含了三种合成方式,一是先合成1-9位、10-18位、19-33位氨基酸片段,而后偶联各片段获得;二是先合成1-4位、5-12位、13-20位、21-33位氨基酸片段,而后偶联各片段获得;三是先合成1-4位、5-9位、10-18位、19-26位、27-33位氨基酸片段,而后偶联各片段获得。
而公开号为WO2012028602A1公开专利文献为了解决上述专利保护替度鲁肽的合成方法中存在的Asp-Gly片段产生的降解等一系列问题,采用片段偶联方法进行了替度鲁肽的合成,即先合成全保护片段1-4,然后采用纯化后的片段1-4与片段肽树脂5-33进行固相偶联,最终裂解得到替度鲁肽。
中国公开专利文献CN104418949A也公开了一种替度鲁肽的制备方法,其合成方式是先合成1-3位和4-33位氨基酸片段,而后再偶联而成。但是过多片段合成,会造成成本增加,操作步骤繁琐,废液过量的问题。本领域迫切需要提供一种利拉鲁肽的合成方法,以解决现有利拉鲁肽合成过程中存在的杂质多,纯度和收率低等问题。
发明内容
本发明所要解决的技术间题是针对现有合成过程中所存在的杂质多,纯度和收率低,成本昂贵,操作步骤繁琐,废液过量,不利于工业化生产的问题,提供一种优化的替度鲁肽的合成方法,该方法提高了粗肽纯度,极大降低了物料成本和纯化成本,利于进行工业化放大生产。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种替度鲁肽的合成方法,其特点是,该方法包括以下步骤:
(1)以替度鲁肽序列的第2-3位氨基酸作为伪脯二肽Fmoc-Ile-Thr(pro-me-me)-OH;或者以替度鲁肽序列的第5-6位氨基酸作为伪脯二肽Fmoc-Gln-Thr(pro-me-me)-OH;或者以替度鲁肽序列的第22-23位氨基酸作为伪脯二肽Fmoc-Asn-Thr(pro-me-me)-OH;或者以替度鲁肽序列的第27-28位氨基酸作为伪脯二肽Fmoc-Phe-Ser(pro-me-me)-OH;或者以替度鲁肽序列的第29-30位氨基酸作为伪脯二肽Fmoc-Gly-Ser(pro-me-me)-OH;
(2)按顺序依次固相合成替度鲁肽序列的其他位点氨基酸,合成全保护替度鲁肽,经裂解沉淀,得到替度鲁肽。
本发明所述的一种替度鲁肽的合成方法,其进一步优选的技术方案是,裂解采用的裂解试剂为:TFA∶PhSMe∶EDT∶TIS∶H2O∶Phenol=80∶5∶5∶5∶3∶2。
本发明所述的一种替度鲁肽的合成方法,其进一步优选的技术方案是,其具体步骤如下:
(1)Fmoc-Ile-Thr(pro-me-me)-OH替度鲁肽肽树脂的制备
取Wang树脂加入到固相反应器中,加入DCM溶胀树脂;抽干溶剂,加入Fmoc-Asp(Otbu)-OH,HOBT,DIC,DMF溶液,冰浴活化,活化温度不超过10摄氏度,活化液加入反应器后加入DMAP,搅拌反应4-6h;抽干,加入DMF洗涤,加入1∶1吡啶/乙酸酐溶液,封闭0.4-0.6h;加入DMF洗涤;加入哌啶/DMF溶液脱保护;抽干,加入DMF洗涤;茚检结果呈阳性;
取Fmoc-Ile-Thr(pro-me-me)-OH,HOBt,DIC,加入DMF溶解,冰浴活化;将活化后的溶液加入到反应器中,反应0.5-1.5h,茚检检测结果呈阴性后,抽干;加入DMF洗涤;
重复以上步骤,按照氨基酸序列Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Boc-His(Trt)-OH进行偶联反应;偶联结束后,DCM与甲醇交替洗涤,真空干燥,得到替度鲁肽肽树脂;
(2)裂解
配制裂解试剂为TFA∶PhSMe∶EDT∶TIS∶H2O∶Phenol=80∶5∶5∶5∶3∶2,冰浴条件下加入替度鲁肽肽树脂,0.4-0.6h后恢复至室温继续反应1.5-2.5h,反应结束后,加入无水乙醚沉淀;离心沉淀,干燥即得替度鲁肽粗肽。
本发明所述的一种替度鲁肽的合成方法,其进一步优选的技术方案是,其具体步骤如下:
(1)Fmoc-Gln(Trt)-Thr(pro-me-me)-OH替度鲁肽肽树脂的制备:
取Wang树脂加入到固相反应器中,加入DCM溶胀树脂;抽干溶剂,加入Fmoc-Asp(Otbu)-OH,HOBT,DIC,DMF溶液,冰浴活化,活化温度不超过10摄氏度,活化液加入反应器后加入DMAP,搅拌反应4-6h;抽干,加入DMF洗涤,加入1∶1吡啶/乙酸酐溶液,封闭0.4-0.6h;加入DMF洗涤;加入哌啶/DMF溶液脱保护;抽干,加入DMF洗涤;茚检结果呈阳性;
取Fmoc-Thr(tBu)-OH,HOBt,DIC,加入DMF溶解,冰浴活化;将活化后的溶液加入到反应器中,反应,茚检检测结果呈阴性后,抽干;加入DMF洗涤;
重复以上步骤,按照氨基酸序列Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gln-Thr(pro-me-me)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Boc-His(Trt)-OH进行偶联反应;偶联结束后,DCM与甲醇交替洗涤,真空干燥,得到替度鲁肽肽树脂;
(2)裂解
配制裂解试剂为TFA∶PhSMe∶EDT∶TIS∶H2O∶Phenol=80∶5∶5∶5∶3∶2,冰浴条件下加入替度鲁肽肽树脂,0.4-0.6h后恢复至室温继续反应1.5-2.5h,反应结束后,加入无水乙醚沉淀;离心沉淀;干燥即得替度鲁肽粗肽。
本发明所述的一种替度鲁肽的合成方法,其进一步优选的技术方案是,其具体步骤如下:
(1)Fmoc-Asn(Trt)-Thr(pro-me-me)-OH替度鲁肽肽树脂的制备
取Wang树脂加入到固相反应器中,加入DCM溶胀树脂0.4-0.6h;抽干溶剂,加入Fmoc-Asp(Otbu)-OH,HOBT,DIC,DMF溶液,冰浴活化,活化温度不超过10摄氏度,活化液加入反应器后加入的DMAP,搅拌反应4-6h;抽干,加入DMF洗涤,加入1∶1吡啶/乙酸酐溶液,封闭0.4-0.6h;加入DMF洗涤;加入哌啶/DMF溶液脱保护;抽干,加入DMF洗涤;茚检结果呈阳性;
取Fmoc-Thr(tBu)-OH,HOBt,DIC,加入DMF溶解,冰浴活化;将活化后的溶液加入到反应器中,反应,茚检检测结果呈阴性后,抽干;加入DMF洗涤;
重复以上步骤,按照氨基酸序列Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gln-Thr(pro-me-me)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-Thr(pro-me-me)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Set(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Boc-His(Trt)-OH进行偶联反应;偶联结束后,DCM与甲醇交替洗涤,真空干燥,得到替度鲁肽肽树脂;
(2)裂解
配制裂解试剂为TFA∶PhSMe∶EDT∶TIS∶H2O∶Phenol=80∶5∶5∶5∶3∶2,冰浴条件下加入替度鲁肽肽树脂,0.4-0.6h后恢复至室温继续反应1.5-2.5h,反应结束后,加入无水乙醚沉淀;离心沉淀;干燥后即得替度鲁肽粗肽。
本发明所述的一种替度鲁肽的合成方法,其进一步优选的技术方案是,其具体步骤如下:
(1)Fmoc-Phe-Ser(pro-me-me)-OH替度鲁肽肽树脂的制备
取Wang树脂加入到固相反应器中,加入DCM溶胀树脂0.4-6h;抽干溶剂,加入Fmoc-Asp(Otbu)-OH,HOBT,DIC,DMF溶液,冰浴活化,活化温度不超过10摄氏度,活化液加入反应器后加入DMAP,搅拌反应4-6h;抽干,加入DMF洗涤,加入1∶1吡啶/乙酸酐溶液,封闭0.4-0.6h;加入DMF洗涤;加入哌啶/DMF溶液脱保护,反应,抽干,加入DMF洗涤;茚检结果呈阳性;
称取Fmoc-Thr(tBu)-OH,HOBt,DIC,加入DMF溶解,冰浴活化;将活化后的溶液加入到反应器中,反应,茚检检测结果呈阴性后,抽干;加入DMF洗涤;
重复以上步骤,按照氨基酸序列Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gln-Thr(pro-me-me)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-Thr(pro-me-me)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Phe-Ser(pro-me-me)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Boc-His(Trt)-OH进行偶联反应;偶联结束后,DCM与甲醇交替洗涤,真空干燥,得到替度鲁肽肽树脂;
(2)裂解
配制裂解试剂为TFA∶PhSMe∶EDT∶TIS∶H2O∶Phenol=80∶5∶5∶5∶3∶2,冰浴条件下加入替度鲁肽肽树脂,0.5-0.6h后恢复至室温继续反应1.5-2.5h,反应结束后,加入无水乙醚沉淀;离心沉淀;干燥后即得替度鲁肽粗肽。
本发明所述的一种替度鲁肽的合成方法,其进一步优选的技术方案是,其具体步骤如下:
(1)Fmoc-Gly-Ser(pro-me-me)-OH替度鲁肽肽树脂的制备
取Wang树脂加入到固相反应器中,加入DCM溶胀树脂,抽干溶剂,加入Fmoc-Asp(Otbu)-OH,HOBT,DIC,DMF溶液,冰浴活化,活化温度不超过10摄氏度,活化液加入反应器后加入DMAP,搅拌反应4-6h;抽干,加入DMF洗涤,加入1∶1吡啶/乙酸酐溶液,封闭0.4-0.6h;加入DMF洗涤;加入哌啶/DMF溶液脱保护,抽干,加入DMF洗涤;茚检结果呈阳性;
取Fmoc-Thr(tBu)-OH,HOBt,DIC,加入DMF溶解,冰浴活化;将活化后的溶液加入到反应器中,反应,茚检检测结果呈阴性后,抽干;加入DMF洗涤;
重复以上步骤,按照氨基酸序列Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gln-Thr(pro-me-me)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-Thr(pro-me-me)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Phe-Ser(pro-me-me)-OH、Fmoc-Gly-Ser(pro-me-me)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Boc-His(Trt)-OH进行偶联反应;偶联结束后,DCM与甲醇交替洗涤,真空干燥,得到替度鲁肽肽树脂。
(2)裂解
配制裂解试剂为TFA∶PhSMe∶EDT∶TIS∶H2O∶Phenol=80∶5∶5∶5∶3∶2,冰浴条件下加入替度鲁肽肽树脂,0.4-0.6h恢复至室温继续反应1.5-2.5h,反应结束后,加入无水乙醚沉淀;离心沉淀;干燥即得替度鲁肽肽树脂粗肽。
本发明所述的一种替度鲁肽的合成方法中,在步骤(1)中,各个伪脯二肽均为定制,且符合质量标准。合成各个氨基酸所用的缩合剂可以为DIC/HOBt,HBTU/HOBT/DIEA,PyBop/HOBT/DIEA其中的一种或多种;所用的反应溶剂可以为DCM、DMF、NMP、DMSO中的一种或多种组合;所使用的Fmoc脱除试剂最好为v/v20%哌啶/DMF溶液。
与现有技术相比,本发明方法通过合成利替度肽序列的第2-3位氨基酸或者第5-6位氨基酸或者第22-23位氨基酸或者第27-28位氨基酸或乾第29-30位氨基酸作为伪脯二肽,从碳端到氮端依次按照顺序偶联剩余氨基酸,固相合成全保护替度鲁肽,经裂解沉淀,得到替度鲁肽。本发明方法提高了粗肽纯度,极大降低了物料成本和纯化成本,利于进行工业化放大生产。
具体实施方式
以下进一步对本发明的技术方案进行描述,以使本领域技术人员进一步地理解本发明,而不构成对其权利的限制。
实施例1,替度鲁肽的合成方法实验一:
(1)Fmoc-Ile-Thr(pro-me-me)-OH替度鲁肽肽树脂的制备
称取Wang树脂20.00g(Sub=0.50mmol/g)加入到固相反应器中,加入200mL DCM溶胀树脂0.5h。抽干溶剂,加入Fmoc-Asp(Otbu)-OH 12.35g,HOBT4.45g,DIC 5.1mL,50mLDMF溶液,冰浴活化10分钟,活化温度不超过10摄氏度,活化液加入反应器后加入0.366g的DMAP,搅拌反应5h。(取小样收样,经紫外分光光度法测定Fmoc-Asp(Otbu)-Wang树脂的Sub=0.418mmol/g。)抽干,加入DMF 250mL洗涤3次,加入吡啶/乙酸酐溶液(1∶1)300mL,封闭0.5h。加入DMF 250mL洗涤6次。加入200mLv/v 20%哌啶/DMF溶液脱保护,反应30min。抽干,加入DMF 250mL洗涤6次。茚检结果呈阳性。
称取Fmoc-Ile-Thr(pro-me-me)-OH 14.83g,HOBt 4.45g,DIC5.1mL,加入DMF80mL溶解,冰浴活化10min。将活化后的溶液加入到反应器中,反应1h,茚检检测结果呈阴性后,抽干。加入DMF洗涤3次,每次200mL。
重复以上步骤,按照氨基酸序列Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Boc-His(Trt)-OH进行偶联反应。偶联结束后,DCM与甲醇交替洗涤3次,每次400mL,真空干燥,得到替度鲁肽肽树脂。
(2)裂解
配制200mL裂解试剂为TFA∶PhSMe∶EDT∶TIS∶H2O∶Phenol=80∶5∶5∶5∶3∶2,冰浴条件下加入全保护肽,0.5h后恢复至室温继续反应2h,反应结束后,加入无水乙醚沉淀。离心沉淀4次,每次加入乙醚500mL。干燥后所得产品即为替度鲁肽粗肽,粗肽得到40.19g,粗肽经对照品定量为15.8g,总收率90%,纯度92.0%。
实施例2,替度鲁肽的合成方法实验二:
(1)Fmoc-Gln(Trt)-Thr(pro-me-me)-OH替度鲁肽肽树脂的制备
称取Wang树脂20.00g(Sub=0.50mmol/g)加入到固相反应器中,加入200mL DCM溶胀树脂0.5h。抽干溶剂,加入Fmoc-Asp(Otbu)-OH 12.35g,HOBT4.45g,DIC 5.1mL,50mLDMF溶液,冰浴活化10分钟,活化温度不超过10摄氏度,活化液加入反应器后加入0.366g的DMAP,搅拌反应5h。(取小样收样,经紫外分光光度法测定Fmoc-Asp(Otbu)-Wang树脂的Sub=0.418mmol/g。)抽干,加入DMF 250mL洗涤3次,加入吡啶/乙酸酐溶液(1∶1)300mL,封闭0.5h。加入DMF 250mL洗涤6次。加入200mL v/v 20%哌啶/DMF溶液脱保护,反应30min。抽干,加入DMF 250mL洗涤6次。茚检结果呈阳性。
称取Fmoc-Thr(tBu)-OH 11.93g,HOBt 4.45g,DIC5.1mL,加入DMF80mL溶解,冰浴活化10min。将活化后的溶液加入到反应器中,反应1h,茚检检测结果呈阴性后,抽干。加入DMF洗涤3次,每次200mL。
重复以上步骤,按照氨基酸序列Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gln-Thr(pro-me-me)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Boc-His(Trt)-OH进行偶联反应。偶联结束后,DCM与甲醇交替洗涤3次,每次400mL,真空干燥,得到替度鲁肽肽树脂。
(2)裂解
配制200mL裂解试剂为TFA∶PhSMe∶EDT∶TIS∶H2O∶Phenol=80∶5∶5∶5∶3∶2,冰浴条件下加入全保护肽,0.5h后恢复至室温继续反应2h,反应结束后,加入无水乙醚沉淀。离心沉淀4次,每次加入乙醚500mL。干燥后所得产品即为替度鲁肽粗肽,粗肽得到40.19g,粗肽经对照品定量为15.8g,总收率90%,纯度92.0%。
实施例3,替度鲁肽的合成方法实验三:
(1)Fmoc-Asn(Trt)-Thr(pro-me-me)-OH替度鲁肽肽树脂的制备
称取Wang树脂20.00g(Sub=0.50mmol/g)加入到固相反应器中,加入200mLDCM溶胀树脂0.5h。抽干溶剂,加入Fmoc-Asp(Otbu)-OH 12.35g,HOBT4.45g,DIC 5.1mL,50mLDMF溶液,冰浴活化10分钟,活化温度不超过10摄氏度,活化液加入反应器后加入0.366g的DMAP,搅拌反应5h。(取小样收样,经紫外分光光度法测定Fmoc-Asp(Otbu)-Wang树脂的Sub=0.418mmol/g。)抽干,加入DMF 250mL洗涤3次,加入吡啶/乙酸酐溶液(1∶1)300mL,封闭0.5h。加入DMF 250mL洗涤6次。加入200mL v/v 20%哌啶/DMF溶液脱保护,反应
30min。抽干,加入DMF 250mL洗涤6次。茚检结果呈阳性。
称取Fmoc-Thr(tBu)-OH 11.93g,HOBt 4.45g,DIC5.1mL,加入DMF80mL溶解,冰浴活化10min。将活化后的溶液加入到反应器中,反应1h,茚检检测结果呈阴性后,抽干。加入DMF洗涤3次,每次200mL。
重复以上步骤,按照氨基酸序列Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gln-Thr(pro-me-me)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-Thr(pro-me-me)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Boc-His(Trt)-OH进行偶联反应。偶联结束后,DCM与甲醇交替洗涤3次,每次400mL,真空干燥,得到替度鲁肽肽树脂。
(2)裂解
配制200mL裂解试剂为TFA∶PhSMe∶EDT∶TIS∶H2O∶Phenol=80∶5∶5∶5∶3∶2,冰浴条件下加入全保护肽,0.5h后恢复至室温继续反应2h,反应结束后,加入无水乙醚沉淀。离心沉淀4次,每次加入乙醚500mL。干燥后所得产品即为替度鲁肽粗肽,粗肽得到40.19g,粗肽经对照品定量为15.8g,总收率90%,纯度92.0%。
实施例4,替度鲁肽的合成方法实验四:
(1)Fmoc-Phe-Ser(pro-me-me)-OH替度鲁肽肽树脂的制备
称取Wang树脂20.00g(Sub=0.50mmol/g)加入到固相反应器中,加入200mLDCM溶胀树脂0.5h。抽干溶剂,加入Fmoc-Asp(Otbu)-OH 12.35g,HOBT4.45g,DIC 5.1mL,50mLDMF溶液,冰浴活化10分钟,活化温度不超过10摄氏度,活化液加入反应器后加入0.366g的DMAP,搅拌反应5h。(取小样收样,经紫外分光光度法测定Fmoc-Asp(Otbu)-Wang树脂的Sub=0.418mmol/g。)抽干,加入DMF 250mL洗涤3次,加入吡啶/乙酸酐溶液(1∶1)300mL,封闭0.5h。加入DMF 250mL洗涤6次。加入200mL v/v 20%哌啶/DMF溶液脱保护,反应30min。抽干,加入DMF 250mL洗涤6次。茚检结果呈阳性。
称取Fmoc-Thr(tBu)-OH 11.93g,HOBt 4.45g,DIC5.1mL,加入DMF80mL溶解,冰浴活化10min。将活化后的溶液加入到反应器中,反应1h,茚检检测结果呈阴性后,抽干。加入DMF洗涤3次,每次200mL。
重复以上步骤,按照氨基酸序列Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gln-Thr(pro-me-me)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-Thr(pro-me-me)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Phe-Ser(pro-me-me)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Boc-His(Trt)-OH进行偶联反应。偶联结束后,DCM与甲醇交替洗涤3次,每次400mL,真空干燥,得到替度鲁肽肽树脂。
(2)裂解
配制200mL裂解试剂为TFA∶PhSMe∶EDT∶TIS∶H2O∶Phenol=80∶5∶5∶5∶3∶2,冰浴条件下加入全保护肽,0.5h后恢复至室温继续反应2h,反应结束后,加入无水乙醚沉淀。离心沉淀4次,每次加入乙醚500mL。干燥后所得产品即为替度鲁肽粗肽,粗肽得到40.19g,粗肽经对照品定量为15.8g,总收率90%,纯度92.0%。
实施例5,替度鲁肽的合成方法实验五:
(1)Fmoc-Gly-Ser(pro-me-me)-OH替度鲁肽肽树脂的制备
称取Wang树脂20.00g(Sub=0.50mmol/g)加入到固相反应器中,加入200mL DCM溶胀树脂0.5h。抽干溶剂,加入Fmoc-Asp(Otbu)-OH 12.35g,HOBT4.45g,DIC 5.1mL,50mLDMF溶液,冰浴活化10分钟,活化温度不超过10摄氏度,活化液加入反应器后加入0.366g的DMAP,搅拌反应5h。(取小样收样,经紫外分光光度法测定Fmoc-Asp(Otbu)-Wang树脂的Sub=0.418mmol/g。)抽干,加入DMF 250mL洗涤3次,加入吡啶/乙酸酐溶液(1∶1)300mL,封闭0.5h。加入DMF 250mL洗涤6次。加入200mLv/v 20%哌啶/DMF溶液脱保护,反应30min。抽干,加入DMF 250mL洗涤6次。茚检结果呈阳性。
称取Fmoc-Thr(tBu)-OH 11.93g,HOBt 4.45g,DIC5.1mL,加入DMF80mL溶解,冰浴活化10min。将活化后的溶液加入到反应器中,反应1h,茚检检测结果呈阴性后,抽干。加入DMF洗涤3次,每次200mL。
重复以上步骤,按照氨基酸序列Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gln-Thr(pro-me-me)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-Thr(pro-me-me)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Phe-Ser(pro-me-me)-OH、Fmoc-Gly-Ser(pro-me-me)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Boc-His(Trt)-OH进行偶联反应。偶联结束后,DCM与甲醇交替洗涤3次,每次400mL,真空干燥,得到替度鲁肽肽树脂。
(2)裂解
配制200mL裂解试剂为TFA∶PhSMe∶EDT∶TIS∶H2O∶Phenol=80∶5∶5∶5∶3∶2,冰浴条件下加入全保护肽,0.5h后恢复至室温继续反应2h,反应结束后,加入无水乙醚沉淀。离心沉淀4次,每次加入乙醚500mL。干燥后所得产品即为替度鲁肽粗肽,粗肽得到40.19g,粗肽经对照品定量为15.8g,总收率90%,纯度92.0%。通过图谱分析,最佳合成路线以伪脯二肽Fmoc-Asn(Trt)-Thr(pro-me-me)-OH为原料合成替度鲁肽肽树脂。
Claims (7)
1.一种替度鲁肽的合成方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:
(1)以替度鲁肽序列的第2-3位氨基酸作为伪脯二肽Fmoc-Ile-Thr(pro-me-me)-OH;或者以替度鲁肽序列的第5-6位氨基酸作为伪脯二肽Fmoc-Gln-Thr(pro-me-me)-OH;或者以替度鲁肽序列的第22-23位氨基酸作为伪脯二肽Fmoc-Asn-Thr(pro-me-me)-OH;或者以替度鲁肽序列的第27-28位氨基酸作为伪脯二肽Fmoc-Phe-Ser(pro-me-me)-OH;或者以替度鲁肽序列的第29-30位氨基酸作为伪脯二肽Fmoc-Gly-Ser(pro-me-me)-OH;
(2)按顺序依次固相合成替度鲁肽序列的其他位点氨基酸,合成全保护替度鲁肽,经裂解沉淀,得到替度鲁肽。
2.根据权利要求1所述的一种替度鲁肽的合成方法,其特征在于,裂解采用的裂解试剂为:TFA∶PhSMe∶EDT∶TIS∶H2O∶Phenol=80∶5∶5∶5∶3∶2。
3.根据权利要求1所述的一种替度鲁肽的合成方法,其特征在于,其具体步骤如下:
(1)Fmoc-Ile-Thr(pro-me-me)-OH替度鲁肽肽树脂的制备
取Wang树脂加入到固相反应器中,加入DCM溶胀树脂;抽干溶剂,加入Fmoc-Asp(Otbu)-OH,HOBT,DIC,DMF溶液,冰浴活化,活化温度不超过10摄氏度,活化液加入反应器后加入DMAP,搅拌反应4-6h;抽干,加入DMF洗涤,加入1∶1吡啶/乙酸酐溶液,封闭0.4-0.6h;加入DMF洗涤;加入哌啶/DMF溶液脱保护;抽干,加入DMF洗涤;茚检结果呈阳性;
取Fmoc-Ile-Thr(pro-me-me)-OH,HOBt,DIC,加入DMF溶解,冰浴活化;将活化后的溶液加入到反应器中,反应0.5-1.5h,茚检检测结果呈阴性后,抽干;加入DMF洗涤;
重复以上步骤,按照氨基酸序列Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Boc-His(Trt)-OH进行偶联反应;偶联结束后,DCM与甲醇交替洗涤,真空干燥,得到替度鲁肽肽树脂;
(2)裂解
配制裂解试剂为TFA∶PhSMe∶EDT∶TIS∶H2O∶Phenol=80∶5∶5∶5∶3∶2,冰浴条件下加入替度鲁肽肽树脂,0.4-0.6h后恢复至室温继续反应1.5-2.5h,反应结束后,加入无水乙醚沉淀;离心沉淀,干燥即得替度鲁肽粗肽。
4.根据权利要求1所述的一种替度鲁肽的合成方法,其特征在于,其具体步骤如下:
(1)Fmoc-Gln(Trt)-Thr(pro-me-me)-OH替度鲁肽肽树脂的制备:
取Wang树脂加入到固相反应器中,加入DCM溶胀树脂;抽干溶剂,加入Fmoc-Asp(Otbu)-OH,HOBT,DIC,DMF溶液,冰浴活化,活化温度不超过10摄氏度,活化液加入反应器后加入DMAP,搅拌反应4-6h;抽干,加入DMF洗涤,加入1∶1吡啶/乙酸酐溶液,封闭0.4-0.6h;加入DMF洗涤;加入哌啶/DMF溶液脱保护;灿干,加入DMF洗涤;茚检结果呈阳性;
取Fmoc-Thr(tBu)-OH,HOBt,DIC,加入DMF溶解,冰浴活化;将活化后的溶液加入到反应器中,反应,茚检检测结果呈阴性后,抽干;加入DMF洗涤;
重复以上步骤,按照氨基酸序列Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gln-Thr(pro-me-me)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Boc-His(Trt)-OH进行偶联反应;偶联结束后,DCM与甲醇交替洗涤,真空干燥,得到替度鲁肽肽树脂;
(2)裂解
配制裂解试剂为TFA∶PhSMe∶EDT∶TIS∶H2O∶Phenol=80∶5∶5∶5∶3∶2,冰浴条件下加入替度鲁肽肽树脂,0.4-0.6h后恢复至室温继续反应1.5-2.5h,反应结束后,加入无水乙醚沉淀;离心沉淀;干燥即得替度鲁肽粗肽。
5.根据权利要求1所述的一种替度鲁肽的合成方法,其特征在于,其具体步骤如下:
(1)Fmoc-Asn(Trt)-Thr(pro-me-me)-OH替度鲁肽肽树脂的制备
取Wang树脂加入到固相反应器中,加入DCM溶胀树脂0.4-0.6h;抽干溶剂,加入Fmoc-Asp(Otbu)-OH,HOBT,DIC,DMF溶液,冰浴活化,活化温度不超过10摄氏度,活化液加入反应器后加入的DMAP,搅拌反应4-6h;抽干,加入DMF洗涤,加入1∶1吡啶/乙酸酐溶液,封闭0.4-0.6h;加入DMF洗涤;加入哌啶/DMF溶液脱保护;抽干,加入DMF洗涤;茚检结果呈阳性;
取Fmoc-Thr(tBu)-OH,HOBt,DIC,加入DMF溶解,冰浴活化;将活化后的溶液加入到反应器中,反应,茚检检测结果呈阴性后,抽干;加入DMF洗涤;
重复以上步骤,按照氨基酸序列Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gln-Thr(pro-me-me)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-Thr(pro-me-me)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Boc-His(Trt)-OH进行偶联反应;偶联结束后,DCM与甲醇交替洗涤,真空干燥,得到替度鲁肽肽树脂;
(2)裂解
配制裂解试剂为TFA∶PhSMe∶EDT∶TIS∶H2O∶Phenol=80∶5∶5∶5∶3∶2,冰浴条件下加入替度鲁肽肽树脂,0.4-0.6h后恢复至室温继续反应1.5-2.5h,反应结束后,加入无水乙醚沉淀;离心沉淀;干燥后即得替度鲁肽粗肽。
6.根据权利要求1所述的一种替度鲁肽的合成方法,其特征在于,其具体步骤如下:
(1)Fmoc-Phe-Ser(pro-me-me)-OH替度鲁肽肽树脂的制备
取Wang树脂加入到固相反应器中,加入DCM溶胀树脂0.4-6h;抽干溶剂,加入Fmoc-Asp(Otbu)-OH,HOBT,DIC,DMF溶液,冰浴活化,活化温度不超过10摄氏度,活化液加入反应器后加入DMAP,搅拌反应4-6h;抽干,加入DMF洗涤,加入1∶1吡啶/乙酸酐溶液,封闭0.4-0.6h;加入DMF洗涤;加入哌啶/DMF溶液脱保护,反应,抽干,加入DMF洗涤;茚检结果呈阳性;
称取Fmoc-Thr(tBu)-OH,HOBt,DIC,加入DMF溶解,冰浴活化;将活化后的溶液加入到反应器中,反应,茚检检测结果呈阴性后,抽干;加入DMF洗涤;
重复以上步骤,按照氨基酸序列Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gln-Thr(pro-me-me)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-Thr(pro-me-me)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Phe-Ser(pro-me-me)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Boc-His(Trt)-OH进行偶联反应;偶联结束后,DCM与甲醇交替洗涤,真空干燥,得到替度鲁肽肽树脂;
(2)裂解
配制裂解试剂为TFA∶PhSMe∶EDT∶TIS∶H2O∶Phenol=80∶5∶5∶5∶3∶2,冰浴条件下加入替度鲁肽肽树脂,0.5-0.6h后恢复至室温继续反应1.5-2.5h,反应结束后,加入无水乙醚沉淀;离心沉淀;干燥后即得替度鲁肽粗肽。
7.根据权利要求1所述的一种替度鲁肽的合成方法,其特征在于,其具体步骤如下:
(1)Fmoc-Gly-Ser(pro-me-me)-OH替度鲁肽肽树脂的制备
取Wang树脂加入到固相反应器中,加入DCM溶胀树脂,抽干溶剂,加入Fmoc-Asp(Otbu)-OH,HOBT,DIC,DMF溶液,冰浴活化,活化温度不超过10摄氏度,活化液加入反应器后加入DMAP,搅拌反应4-6h;抽干,加入DMF洗涤,加入1∶1吡啶/乙酸酐溶液,封闭0.4-0.6h;加入DMF洗涤;加入哌啶/DMF溶液脱保护,抽干,加入DMF洗涤;茚检结果呈阳性;
取Fmoc-Thr(tBu)-OH,HOBt,DIC,加入DMF溶解,冰浴活化;将活化后的溶液加入到反应器中,反应,茚检检测结果呈阴性后,抽干;加入DMF洗涤;
重复以上步骤,按照氨基酸序列Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gln-Thr(pro-me-me)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asn(Trt)-Thr(pro-me-me)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Phe-Ser(pro-me-me)-OH、Fmoc-Gly-Ser(pro-me-me)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Boc-His(Trt)-OH进行偶联反应;偶联结束后,DCM与甲醇交替洗涤,真空干燥,得到替度鲁肽肽树脂。
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