CN103709243B - 一种制备利西拉来的方法 - Google Patents

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CN103709243B CN201310410018.4A CN201310410018A CN103709243B CN 103709243 B CN103709243 B CN 103709243B CN 201310410018 A CN201310410018 A CN 201310410018A CN 103709243 B CN103709243 B CN 103709243B
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Abstract

本发明涉及一种制备利西拉来的方法，其通过将片段1‑2与片段3‑44肽树脂，或者将片段1‑4与片段5‑44肽树脂进行固相缩合，然后将得到的利西拉来肽树脂裂解，得到利西拉来粗肽。

Description

一种制备利西拉来的方法
技术领域
本发明涉及一种新的制备利西拉来的方法。
背景技术
糖尿病(Diabetes Mellitus)是一种因胰岛素绝对或相对不足或靶细胞对胰岛素敏感性减低引起的以糖代谢紊乱为主的慢性综合性疾病，其严重影响患者的健康和生活质量。临床上将糖尿病分为胰岛素依赖型糖尿病(I型糖尿病)和非胰岛素依赖型糖尿病(Ⅱ型糖尿病)，其中Ⅱ型糖尿病患者占90％以上。利西拉来(lixisenatide)是全球第四个上市的的肠促胰岛素类似物，其给药频率为每日一次，联合口服降糖药或基础胰岛素一起治疗成人II型糖尿病。
临床研究表明，对于二甲双胍控制不佳的2型糖尿病患者，每日1次20μg(早上或晚上)利西拉来给药显著改善血糖控制，餐后给药效果明显，且药物耐受性良好。利西拉来的结构如下：
CN201210030151.2中采用了纯固相顺序偶联的方法进行肽的合成。所述方法以氨基树脂为载体，采用常规顺序偶联，最终切割得到利西拉来。
US6528486为化合物专利，它提到的合成方法为Fmoc/tBu策略的逐步缩合方法。
WO2005058954中的合成方法包括Fmoc/tBu策略的逐步缩合方法、Boc策略的逐步缩合方法及基因工程。
WO2001004156中的合成方法为Fmoc/tBu策略的逐步缩合方法。
发明内容
经研究发现，采用常规的Fmoc/tBu策略逐步偶联存在如下问题：
1.His1容易消旋。由于His的消旋，导致难以纯化，从而降低收率；
2.由于树脂收缩，Gly2在大量生产时容易产生缺损肽，导致难以纯化，从而降低收率。
为解决上述问题，本发明采用片段缩合方法合成利西拉来，具体地采用
片段1-2(即，Fmoc-His(Trt)-Gly-OH)与
片段3-44肽树脂(即，H-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-NH2Resin)缩合，或者
片段1-4(即，Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-OH)与
片段5-44肽树脂(即，H-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-NH2Resin)，
进行固相缩合的方法。
本发明提供一种制备利西拉来的方法，包括以下步骤：
1)以一种树脂P作为载体，将Fmoc-Lys(Boc)-OH与树脂偶联，得到Fmoc-Lys(Boc)-OH-NH2Resin；
2)按照Fmoc固相合成方法顺序地偶联得到片段3-44肽树脂或片段5-44肽树脂；
3)按照Fmoc固相合成方法合成片段1-2肽树脂(即，Fmoc-His(Trt)-Gly-P)或片段1-4肽树脂(即，Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-P)，然后裂解得到片段1-2或片段1-4；
4)将片段3-44肽树脂在固相上偶联片段1-2，或者
将片段5-44肽树脂在固相上偶联片段1-4，
得到利西拉来肽树脂；
5)裂解利西拉来肽树脂，得到利西拉来粗肽；
其中Fmoc为9-芴甲氧羰基，与氨基相连或与羧基所连的碳原子上的氮原子相连。
优选地，本发明方法还包括纯化利西拉来的步骤。
本发明的方法可以有效避免Gly2缺损带来副反应，可以降低His1消旋，从而有效提高粗肽纯度(从原有的50％提高至60％以上)，提高精肽纯化收率(从原有的不足3％提高至30％)。
具体实施方式
对本发明中所用缩写及其含义说明如下：
本文中，“替代度”指的是单位量的树脂负载的物质的数量，单位为“mmol/g”。
本文中，如无相反说明，则所述反应在常温常压下进行。
本发明中的宽泛的、优选的、更优选的、和最优选的定义和范围可以相互组合。
本发明中“肽”是指类似地通过多肽合成中的Fmoc固相合成方法得到的偶联产物。
对所述载体树脂P无特别限定，只要其具有可与物质中的羧基进行反应的活性位点且不与所述物质中的其他基团反应即可。所述载体树脂P优选为氨基树脂、2-CTC树脂或王树脂。氨基树脂的实例包括Rink Amide Resin、Rink Amide AM Resin、Rink Amide-MBHAResin树脂，优选Rink Amide-MBHA Resin。在一个具体实施方案中，氨基树脂的替代度为0.05-0.5mmol/g，优选为0.1-0.4mmol/g，更优选为0.2-0.3mmol/g。优选地，在本发明的步骤1)中所述的载体树脂P为氨基树脂。
本发明所用的王树脂类的结构如下：
本发明所用的2-CTC树脂类的结构如下：
其中代表树脂结构的其余部分且该部分不参与反应。
上述两种树脂均可商购得到(天津南开和成科技有限公司)或按文献已知的方法制备。在一个具体实施方案中，2-CTC树脂或王树脂的替代度为0.2-1.2mmol/g，优选为0.5-1.1mmol/g，更优选为0.6-1.0mmol/g。
优选地，在步骤3)中的所述载体树脂P为2-CTC树脂。
在一个具体实施方案中，可根据树脂的用量、反应前的替代度以及所需的反应后的替代度来选择Fmoc-氨基酸-OH的用量，通常为树脂上可与氨基酸偶联的官能团的摩尔数的1-5当量，优选2-4当量，更优选2.5-3.5当量，其中树脂上可与氨基酸偶联的官能团摩尔数为树脂重量与替代度的乘积。
所述溶剂为常用于此目的的溶剂，例如，但不限于，DMF、DCM、DMSO、NMP、THF、乙酸乙酯、甲醇、乙醚等及其任意混合物，优选DMF、DCM，或DMF和DCM的混合液(例如，二者体积比为1：1)。
偶联制备肽树脂可采用多肽合成领域中技术人员已知的Fmoc固相合成方法来实现，例如可以参见文献Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis：A Practical Approach，W.C.Chan，Peter D.White著，March2，2000(ISBN-10：0199637245)，英国OxfordUniversity Press。
偶联中对树脂的洗涤和溶胀可采用实现该目的的任何试剂进行，优选DMF。
所述偶联在固相反应柱中进行。对固相反应柱无特别限制，可为可实现此目的的任意固相反应柱。
偶联优选在偶联剂的存在下进行，所述偶联剂优选为DIC、A或其结合，或者为DIPEA、A、B或其结合，其中A为HOBt或HOAt，B为PyBOP、PyAOP、HATU、HBTU和TBTU中的一种；例如，步骤1)-3)中的偶联剂为HOBt/DIC；步骤4)中的偶联剂为HATU/HOAt/DIPEA。
优选地，将步骤1)-4)中物质中的羧基进行活化，活化优选在冰水浴中进行。活化剂优选为DIPEA或DIC。
此外，每种物质进行偶联反应的时间通常为1-6小时，优选2-5小时；压力优选为常压，也可在适当提高或降低的压力(例如0.01-1.5大气压)下进行；温度优选为室温(指20±5℃)，也可在适当提高或降低的温度下(例如0-50℃)进行。
在偶联过程中，所用检测剂可为可判定所述反应终点的任何试剂，优选茚三酮。
脱除Fmoc的试剂可为可实现该目的的任何试剂，优选DBLK(即20％哌啶/DMF)。
脱保护反应时间通常为5-30分钟，优选10-20分钟；压力优选为常压，也可在适当提高或降低的压力(例如0.01-1.5大气压)下进行；温度优选为室温(指20±5℃)，也可在适当提高或降低的温度下(例如0-50℃)进行
所述裂解优选在室温和常压下进行，也可在适当提高或降低的温度和压力下进行。
步骤3)中的裂解试剂为弱酸，如TFA或TFE和DCM的混合物，其中TFA：DCM的体积比为1：99。
步骤5)中的裂解液为TFA、苯甲硫醚(PhSMe)、乙二硫醇(EDT)、三异丙基硅烷(TIS)和水的混合溶剂，其中混合溶剂的配比为：TFA体积比为80-86％，苯甲硫醚的体积比为1-5％、乙二硫醇的体积比为1-5％、三异丙基硅烷的体积比为1-3％，水的体积比为0.5-1％，四者之和为100％。
优选地，制备利西拉来化合物的方法还包括纯化利西拉来的步骤。纯化可采用快速薄层色谱法等常规用于纯化利西拉来的方法进行。
本发明中，优选地，纯化通过重结晶方法而进行，即通过用溶剂溶解利西拉来，然后析出利西拉来的晶体而实现。
在一个具体实施方案中，纯化利西拉来的步骤通过用良性溶剂溶解利西拉来，然后加入不良溶剂析出利西拉来的晶体而实现。此处“良性溶剂”是指在室温和常压下对利西拉来的溶解度大于90重量％、优选大于95重量％、更优选大于99重量％的溶剂；“不良溶剂”是指在室温和常压下对利西拉来的溶解度小于10重量％、优选小于5％，更优选小于1％的溶剂。
重结晶优选在室温和常压下进行，也可在适当提高或降低的压力下进行。重结晶可使用常规用于此目的所有设备而实现。
优选地，纯化通过反相高效液相纯化、冻干得到利西拉来，纯度大于98％。
以下参照实施例详细描述本发明，应理解，下述实施例意在说明，不对本发明构成限制。以下实施例中使用的化合物或试剂可通过商业途径购得，或者通过本领域技术人员已知的常规方法制备得到；所使用的实验仪器可通过商业途径购得。
实施例
实施例1：片段3-44肽树脂，即H-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide Resin的合成
称取替代度为0.1mmol/g的Rink Amide Resin100g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。加入20％哌啶/DMF，按10min+10min的方式脱除Fmoc。抽干反应液，并用DMF洗树脂6次。称取14.055g Fmoc-Lys(Boc)-OH(30mmol)、4.053g HOBt(30mmol)溶于体积比为1：1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入5.19ml DIC(33mmol)活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照利西拉来主链肽序，从C端到N端依次完成3-44片段的偶联，反应结束后用甲醇收集浓缩，树脂真空干燥过夜，称重得到利西拉来(3-44)-Rink Amide Resin树脂168.3g。
实施例2：片段3-44肽树脂，即H-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)--Rink Amide Resin的合成
称取替代度为0.4mmol/g的Rink Amide Resin25g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。加入20％哌啶/DMF，按10min+10min的方式脱除Fmoc。抽干反应液，并用DMF洗树脂6次。称取14.055g Fmoc-Lys(Boc)-OH(30mmol)、4.053g HOBt(30mmol)溶于体积比为1：1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入5.19ml DIC(33mmol)活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照利西拉来主链肽序，从C端到N端依次完成3-44片段的偶联，反应结束后用甲醇收集浓缩，树脂真空干燥过夜，称重得到利西拉来(3-44)-Rink Amide Resin树脂93.51g。
实施例3：片段3-44肽树脂，即H-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide Resin的合成
称取替代度为0.2mmol/g的Rink Amide Resin50g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。加入20％哌啶/DMF，按10min+10min的方式脱除Fmoc。抽干反应液，并用DMF洗树脂6次。称取14.055g Fmoc-Lys(Boc)-OH(30mmol)、4.053g HOBt(30mmol)溶于体积比为1：1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入5.19ml DIC(33mmol)活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照利西拉来主链肽序，从C端到N端依次完成3-44片段的偶联，反应结束后用甲醇收集浓缩，树脂真空干燥过夜，称重得到利西拉来(3-44)-Rink Amide Resin树脂118.70g。
实施例4：片段3-44肽树脂，即H-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide AM Resin的合成
称取替代度为0.1mmol/g的Rink Amide AM Resin100g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。加入20％哌啶/DMF，按10min+10min的方式脱除Fmoc。抽干反应液，并用DMF洗树脂6次。称取14.055g Fmoc-Lys(Boc)-OH(30mmol)、4.053g HOBt(30mmol)溶于体积比为1：1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入5.19ml DIC(33mmol)活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照利西拉来主链肽序，从C端到N端依次完成3-44片段的偶联，反应结束后用甲醇收集浓缩，树脂真空干燥过夜，称重得到利西拉来(3-44)-Rink Amide AM Resin树脂168.1g。
实施例5：片段3-44肽树脂，即H-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide AM Resin的合成
称取替代度为0.4mmol/g的Rink Amide AM Resin25g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。加入20％哌啶/DMF，按10min+10min的方式脱除Fmoc。抽干反应液，并用DMF洗树脂6次。称取14.055g Fmoc-Lys(Boc)-OH(30mmol)、4.053g HOBt(30mmol)溶于体积比为1：1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入5.19ml DIC(33mmol)活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照利西拉来主链肽序，从C端到N端依次完成3-44片段的偶联，反应结束后用甲醇收集浓缩，树脂真空干燥过夜，称重得到利西拉来(3-44)-Rink Amide AM Resin树脂93.49g。
实施例6：片段3-44肽树脂，即H-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide AM Resin的合成
称取替代度为0.2mmol/g的Rink Amide AM Resin50g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。加入20％哌啶/DMF，按10min+10min的方式脱除Fmoc。抽干反应液，并用DMF洗树脂6次。称取14.055g Fmoc-Lys(Boc)-OH(30mmol)、4.053g HOBt(30mmol)溶于体积比为1：1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入5.19ml DIC(33mmol)活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照利西拉来主链肽序，从C端到N端依次完成3-44片段的偶联，反应结束后用甲醇收集浓缩，树脂真空干燥过夜，称重得到利西拉来(3-44)-Rink Amide AM Resin树脂118.50g。
实施例7：片段3-44肽树脂，即H-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide MBHA Resin的合成
称取替代度为0.1mmol/g的Rink Amide MBHA Resin100g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。加入20％哌啶/DMF，按10min+10min的方式脱除Fmoc。抽干反应液，并用DMF洗树脂6次。称取14.055g Fmoc-Lys(Boc)-OH(30mmol)、4.053gHOBt(30mmol)溶于体积比为1：1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入5.19ml DIC(33mmol)活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照利西拉来主链肽序，从C端到N端依次完成3-44片段的偶联，反应结束后用甲醇收集浓缩，树脂真空干燥过夜，称重得到利西拉来(3-44)-Rink Amide MBHAResin树脂168.5g。
实施例8：片段3-44肽树脂，即H-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide MBHA Resin的合成
称取替代度为0.4mmol/g的Rink Amide MBHA Resin25g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。加入20％哌啶/DMF，按10min+10min的方式脱除Fmoc。抽干反应液，并用DMF洗树脂6次。称取14.055g Fmoc-Lys(Boc)-OH(30mmol)、4.053g HOBt(30mmol)溶于体积比为1：1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入5.19ml DIC(33mmol)活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照利西拉来主链肽序，从C端到N端依次完成3-44片段的偶联，反应结束后用甲醇收集浓缩，树脂真空干燥过夜，称重得到利西拉来(3-44)-Rink Amide MBHA Resin树脂93.70g。
实施例9：片段3-44肽树脂，即H-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide MBHA Resin的合成
称取替代度为0.2mmol/g的Rink Amide MBHA Resin50g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。加入20％哌啶/DMF，按10min+10min的方式脱除Fmoc。抽干反应液，并用DMF洗树脂6次。称取14.055g Fmoc-Lys(Boc)-OH(30mmol)、4.053g HOBt(30mmol)溶于体积比为1：1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入5.19ml DIC(33mmol)活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照利西拉来主链肽序，从C端到N端依次完成3-44片段的偶联，反应结束后用甲醇收集浓缩，树脂真空干燥过夜，称重得到利西拉来(3-44)-Rink Amide MBHA Resin树脂118.72g。
实施例10：片段5-44肽树脂，即H-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide Resin的合成
称取替代度为0.1mmol/g的Rink Amide Resin100g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。加入20％哌啶/DMF，按10min+10min的方式脱除Fmoc。抽干反应液，并用DMF洗树脂6次。称取14.055g Fmoc-Lys(Boc)-OH(30mmol)、4.053g HOBt(30mmol)溶于体积比为1：1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入5.19ml DIC(33mmol)活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照利西拉来主链肽序，从C端到N端依次完成5-44片段的偶联，反应结束后用甲醇收集浓缩，树脂真空干燥过夜，称重得到利西拉来(5-44)-Rink Amide Resin树脂165.3g。
实施例11：片段5-44肽树脂，即H-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide Resin的合成
称取替代度为0.4mmol/g的Rink Amide Resin25g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。加入20％哌啶/DMF，按10min+10min的方式脱除Fmoc。抽干反应液，并用DMF洗树脂6次。称取14.055g Fmoc-Lys(Boc)-OH(30mmol)、4.053g HOBt(30mmol)溶于体积比为1：1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入5.19ml DIC(33mmol)活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照利西拉来主链肽序，从C端到N端依次完成5-44片段的偶联，反应结束后用甲醇收集浓缩，树脂真空干燥过夜，称重得到利西拉来(5-44)-Rink Amide Resin树脂90.21g。
实施例12：片段5-44肽树脂，即H-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide Resin的合成
称取替代度为0.2mmol/g的Rink Amide Resin50g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。加入20％哌啶/DMF，按10min+10min的方式脱除Fmoc。抽干反应液，并用DMF洗树脂6次。称取14.055g Fmoc-Lys(Boc)-OH(30mmol)、4.053g HOBt(30mmol)溶于体积比为1：1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入5.19ml DIC(33mmol)活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照利西拉来主链肽序，从C端到N端依次完成5-44片段的偶联，反应结束后用甲醇收集浓缩，树脂真空干燥过夜，称重得到利西拉来(5-44)-Rink Amide Resin树脂114.2g。
实施例13：片段5-44肽树脂，即H-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide AM Resin的合成
称取替代度为0.1mmol/g的Rink Amide AM Resin100g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。加入20％哌啶/DMF，按10min+10min的方式脱除Fmoc。抽干反应液，并用DMF洗树脂6次。称取14.055g Fmoc-Lys(Boc)-OH(30mmol)、4.053g HOBt(30mmol)溶于体积比为1：1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入5.19ml DIC(33mmol)活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照利西拉来主链肽序，从C端到N端依次完成5-44片段的偶联，反应结束后用甲醇收集浓缩，树脂真空干燥过夜，称重得到利西拉来(5-44)-Rink Amide AM Resin树脂165.8g。
实施例14：片段5-44肽树脂，即H-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide AM Resin的合成
称取替代度为0.4mmol/g的Rink Amide AM Resin25g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。加入20％哌啶/DMF，按10min+10min的方式脱除Fmoc。抽干反应液，并用DMF洗树脂6次。称取14.055g Fmoc-Lys(Boc)-OH(30mmol)、4.053g HOBt(30mmol)溶于体积比为1：1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入5.19ml DIC(33mmol)活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照利西拉来主链肽序，从C端到N端依次完成5-44片段的偶联，反应结束后用甲醇收集浓缩，树脂真空干燥过夜，称重得到利西拉来(5-44)-Rink Amide AM Resin树脂90.74g。
实施例15：片段5-44肽树脂，即H-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide AM Resin的合成
称取替代度为0.2mmol/g的Rink Amide AM Resin50g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。加入20％哌啶/DMF，按10min+10min的方式脱除Fmoc。抽干反应液，并用DMF洗树脂6次。称取14.055g Fmoc-Lys(Boc)-OH(30mmol)、4.053g HOBt(30mmol)溶于体积比为1：1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入5.19ml DIC(33mmol)活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照利西拉来主链肽序，从C端到N端依次完成5-44片段的偶联，反应结束后用甲醇收集浓缩，树脂真空干燥过夜，称重得到利西拉来(5-44)-Rink Amide AM Resin树脂114.8g。
实施例16：片段5-44肽树脂，即H-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide MBHA Resin的合成
称取替代度为0.1mmol/g的Rink Amide MBHA Resin100g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。加入20％哌啶/DMF，按10min+10min的方式脱除Fmoc。抽干反应液，并用DMF洗树脂6次。称取14.055g Fmoc-Lys(Boc)-OH(30mmol)、4.053gHOBt(30mmol)溶于体积比为1：1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入5.19ml DIC(33mmol)活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照利西拉来主链肽序，从C端到N端依次完成5-44片段的偶联，反应结束后用甲醇收集浓缩，树脂真空干燥过夜，称重得到利西拉来(5-44)-Rink AmideMBHA Resin树脂166.1g。
实施例17：片段5-44肽树脂，即H-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide MBHA Resin的合成
称取替代度为0.4mmol/g的Rink Amide MBHA Resin25g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。加入20％哌啶/DMF，按10min+10min的方式脱除Fmoc。抽干反应液，并用DMF洗树脂6次。称取14.055g Fmoc-Lys(Boc)-OH(30mmol)、4.053g HOBt(30mmol)溶于体积比为1：1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入5.19ml DIC(33mmol)活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照利西拉来主链肽序，从C端到N端依次完成5-44片段的偶联，反应结束后用甲醇收集浓缩，树脂真空干燥过夜，称重得到利西拉来(5-44)-Rink Amide MBHA Resin树脂90.53g。
实施例18：片段5-44肽树脂，即H-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide MBHA Resin的合成
称取替代度为0.2mmol/g的Rink Amide MBHA Resin50g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。加入20％哌啶/DMF，按10min+10min的方式脱除Fmoc。抽干反应液，并用DMF洗树脂6次。称取14.055g Fmoc-Lys(Boc)-OH(30mmol)、4.053g HOBt(30mmol)溶于体积比为1：1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入5.19ml DIC(33mmol)活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照利西拉来主链肽序，从C端到N端依次完成5-44片段的偶联，反应结束后用甲醇收集浓缩，树脂真空干燥过夜，称重得到利西拉来(5-44)-Rink Amide MBHA Resin树脂114.5g。
实施例19：Fmoc-Gly-CTC Resin树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的CTC树脂100g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取59.46g Fmoc-Gly-OH(200mmol)溶于DMF溶液，冰水浴下加入69.5ml DIPEA(400mmol)活化3min后加入固相反应柱中，室温反应5min后再次加入34.8mlDIPEA(200mmol)。室温反应60min。用DMF洗涤3次，加入81ml封闭液(甲醇：2000mmol)封闭8小时(树脂若未完全扩散加DMF作为溶剂)。用DMF洗涤6次，甲醇收集浓缩抽干，得到Fmoc-Gly-CTCResin。检测替代度为0.916mmol/g。
实施例20：片段1-2肽树脂，即Fmoc-His(Trt)-Gly-CTC Resin肽树脂的合成
称取实施例19中替代度为0.916mmol/g的Fmoc-Gly-CTC树脂98.3g(90mmol)，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。用20％哌啶/DMF10min+10min脱Fmoc。取167.3gFmoc-His(Trt)-OH(270mmol)，43.8HOBt(324mmol)，溶于DMF溶液，冰水浴下加入50.7ml DIC(324mmol)活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。反应结束后用甲醇收集浓缩，树脂真空干燥过夜，称重得到Fmoc-His(Trt)-Gly-CTC Resin130.2g。
实施例21：片段1-4肽树脂，即Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-C TC Resin肽树脂的合成
称取实施例19中替代度为0.916mmol/g的Fmoc-Gly-CTC树脂98.3g(90mmol)，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。用20％哌啶/DMF10min+10min脱Fmoc。取114.9gFmoc-Glu(OtBu)-OH(270mmol)，43.8g HOBt(324mmol)，溶于DMF溶液，冰水浴下加入50.7ml DIC(324mmol)活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，依次逐步偶联Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH。反应结束后用甲醇收集浓缩，树脂真空干燥过夜，称重得到Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-CTC Resin154.2g。
实施例22：片段1-2，即Fmoc-His(Trt)-Gly-OH的合成
将实施例20制备的Fmoc-His(Trt)-Gly-CTC Resin130.2g置于裂解反应瓶中，以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂(TFA：DCM＝1：99(V/V))，室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量DCM洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即粗肽Fmoc-His(Trt)-Gly-OH。重量58.74g，收率96.5％，HPLC纯度为96.3％。
实施例23：片段1-4，即Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-OH的合成
将实施例21制备的Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-CTC Resin154.2g置于裂解反应瓶中，以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂(TFA：DCM＝1：99(V/V))，室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量DCM洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即粗肽Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-OH。重量78.43g，收率94.8％，HPLC纯度为95.2％。
实施例24：利西拉来肽树脂的合成
称取由实施例9的方法制备的118.7g(10mmol)的H-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide MBHA Resin，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。将20.3g实施例22制备的Fmoc-His(Trt)-Gly-OH粗品(30mmol)，11.41g HATU(30mmol)，4.90g HOAt(36mmol)溶于DMF中，冰浴中滴加10.43ml DIPEA，活化5min后加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h。反应结束后用甲醇收集浓缩，肽树脂真空干燥过夜，称重利西拉来肽树脂为125.4g。
实施例25：利西拉来肽树脂的合成
称取由实施例18的方法制备的114.5g(10mmol)的H-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(t Bu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide MBHA Resin，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。将27.56g实施例23制备的Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-OH粗品(30mmol)，11.41g HATU(30mmol)，4.90g HOAt(36mmol)溶于DMF中，冰浴中滴加10.43ml DIPEA，活化5min后加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h。反应结束后用甲醇收集浓缩，肽树脂真空干燥过夜，称重利西拉来肽树脂为123.7g。
实施例26：利西拉来粗肽的制备
将实施例24制备的利西拉来肽树脂125.4g置于裂解反应中，以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂(TFA：苯甲硫醚：EDT：TIS：水＝86：5：5：3：1(V/V))，室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即利西拉来粗肽47.1g，粗肽重量收率为97.2％，HPLC纯度为63.8％。
实施例27：利西拉来粗肽的制备
将实施例25制备的利西拉来肽树脂123.7g置于裂解反应中，以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂(TFA：苯甲硫醚：EDT：TIS：水＝86：5：5：3：1(V/V))，室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即利西拉来粗肽46.9g，粗肽重量收率为96.5％，HPLC纯度为64.2％。
实施例28：利西拉来精肽醋酸盐的制备
称取实施例26～27中任意30.0g利西拉来粗肽用3000ml水溶解后，采用Waters2545RP-HPLC系统，波长230nm，色谱柱为50×250mm反相C18柱，常规0.2％TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分，得到纯度大于98.5％精肽。将精肽溶液采用Waters2545RP-HPLC系统，色谱柱为50×250mm反相C18柱，0.1％醋酸溶液/乙腈流动相转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到利西拉来醋酸盐精肽≥9.0g，RP-HPLC纯度≥98.5％。纯化收率≥30％，总收率≥29.0％。
虽然已参照特定实施方案对本发明进行了说明，但本领域技术人员应认识到的是，在不偏离本发明主旨和范围的情况下，可对所述实施方案进行改变或改进，本发明范围通过所附权利要求书限定。

Claims (22)

1.一种制备利西拉来的方法，包括以下步骤：
1)以一种树脂P作为载体，将Fmoc-Lys(Boc)-OH与树脂偶联，得到Fmoc-Lys(Boc)-OH-NH2Resin；
2)按照Fmoc固相合成方法顺序地偶联得到片段3-44肽树脂或片段5-44肽树脂；其中所述片段3-44的氨基酸序列为H-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH，
并且其中所述片段5-44的氨基酸序列为H-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OH；
3)按照Fmoc固相合成方法合成片段1-2肽树脂或片段1-4肽树脂，然后裂解得到片段1-2或片段1-4；其中所述片段1-2的氨基酸序列为Fmoc-His(Trt)-Gly-OH，并且其中所述片段1-4的氨基酸序列为Fmoc-His(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Gly-OH；
4)将片段3-44肽树脂在固相上偶联片段1-2，或者
将片段5-44肽树脂在固相上偶联片段1-4，
得到利西拉来肽树脂；
5)裂解利西拉来肽树脂，得到利西拉来粗肽；
其中Fmoc为9-芴甲氧羰基，与氨基相连或与羧基所连的碳原子上的氮原子相连；
其中步骤1)中所述树脂P为氨基树脂，其选自Rink Amide Resin、Rink Amide AMResin、Rink Amide-MBHA Resin树脂；以及其中步骤3)中所述树脂为2-CTC树脂或王树脂。
2.权利要求1的方法，还包括纯化利西拉来的步骤。
3.权利要求2的方法，其中纯化通过重结晶方法或HPLC而进行。
4.权利要求3的方法，其中HPLC为反相HPLC。
5.权利要求1的方法，其中步骤1)-4)的偶联反应在固相反应柱中进行；步骤1)-5)均在室温和常压下进行。
6.权利要求1的方法，其中步骤1)中所述的氨基树脂的替代度为0.05-0.5mmol/g；
步骤3)中所述树脂的替代度为0.2-1.2mmol/g。
7.权利要求1的方法，其中步骤1)中所述的树脂P为氨基树脂，其选自Rink Amide-MBHAResin。
8.权利要求1的方法，其中步骤1)中所述氨基树脂的替代度为0.1-0.4mmol/g。
9.权利要求8的方法，其中步骤1)中所述氨基树脂的替代度为0.2-0.3mmol/g。
10.权利要求1的方法，其中步骤3)中所述树脂为2-CTC树脂。
11.权利要求1的方法，其中步骤3)中所述树脂的替代度为0.5-1.1mmol/g。
12.权利要求11的方法，其中步骤3)中所述树脂的替代度为0.6-1.0mmol/g。
13.权利要求1的方法，其中步骤1)-3)中的偶联剂为HOBt/DIC；步骤4)中的偶联剂为HATU/HOAt/DIPEA。
14.权利要求1的方法，其中偶联反应或裂解反应的时间为1-6小时。
15.权利要求14的方法，其中偶联反应或裂解反应的时间为2-5小时。
16.权利要求1的方法，其中偶联反应中对树脂的洗涤和溶胀采用DMF进行。
17.权利要求1的方法，其中步骤1)-5)还包括脱除Fmoc保护的步骤，并且其中脱除Fmoc的试剂为DBLK；脱保护反应时间为5-30分钟。
18.权利要求17的方法，其中其中步骤1)-5)中脱保护反应时间为10-20分钟。
19.权利要求1的方法，其中将步骤1)-4)中的肽树脂中的羧基进行活化，活化在冰水浴中进行。
20.权利要求19的方法，其中步骤1)-4)中的活化剂为DIPEA或DIC。
21.权利要求1的方法，其中步骤3)中的裂解试剂为弱酸；
步骤5)中的裂解液为TFA、苯甲硫醚、乙二硫醇、三异丙基硅烷和水的混合溶剂，其中混合溶剂的配比为：TFA体积比为80-86％，苯甲硫醚的体积比为1-5％、乙二硫醇的体积比为1-5％、三异丙基硅烷的体积比为1-3％，水的体积比为0.5-1％，四者之和为100％。
22.权利要求21的方法，其中步骤3)中的裂解试剂为TFA或TFE和DCM的混合物，其中TFA:DCM的体积比为1:99。
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CN104817638B (zh) * 2015-05-26 2018-08-03 成都圣诺生物科技股份有限公司 一种合成替度鲁肽的方法
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CN112812172B (zh) * 2021-02-05 2022-12-23 杭州固拓生物科技有限公司 一种利西拉来的制备工艺

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1918177A (zh) * 2003-12-18 2007-02-21 诺和诺德公司 新型glp－1化合物
CN102558338A (zh) * 2012-02-10 2012-07-11 深圳翰宇药业股份有限公司 一种合成利西拉来的方法
CN103159850A (zh) * 2013-03-26 2013-06-19 深圳翰宇药业股份有限公司 替可克肽的制备方法
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Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1918177A (zh) * 2003-12-18 2007-02-21 诺和诺德公司 新型glp－1化合物
CN102558338A (zh) * 2012-02-10 2012-07-11 深圳翰宇药业股份有限公司 一种合成利西拉来的方法
CN103159850A (zh) * 2013-03-26 2013-06-19 深圳翰宇药业股份有限公司 替可克肽的制备方法
CN103242431A (zh) * 2013-05-20 2013-08-14 齐鲁制药有限公司 一种比伐卢定的制备方法

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