CN105713082B - 一种制备利西拉来的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备利西拉来的方法，采用片段缩合方法合成利西拉来，具体采用片段20‑44肽树脂与片段15‑19进行固相缩合，然后逐步偶联剩余氨基酸至固相合成结束。与常规的逐步偶联相比，提高了粗肽纯度和纯化收率。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种制备利西拉来的方法。
背景技术
糖尿病(Diabetes Mellitus)是一种因胰岛素绝对或相对不足或靶细胞对胰岛素敏感性减低引起的以糖代谢紊乱为主的慢性综合性疾病，其严重影响患者的健康和生活质量。临床上将糖尿病分为胰岛素依赖型糖尿病(Ⅰ型糖尿病)和非胰岛素依赖型糖尿病(Ⅱ型糖尿病)，其中Ⅱ型糖尿病患者占90％以上。利西拉来(lixisenatide)是全球第四个上市的的肠促胰岛素类似物，其适应症为每日一次，联合口服降糖药或基础胰岛素一起治疗成人Ⅱ型糖尿病。
临床研究表明，对于二甲双胍控制不佳的II型糖尿病患者，每日1次20μg(早上或晚上)利西拉来给药显著改善血糖控制，餐后给药效果明显，且药物耐受性良好。利西拉来结构如下：
专利CN201210030151.2公开了纯固相顺序偶联的方法进行肽的合成。以氨基树脂为载体，采用常规顺序偶联，最终切割得到利西拉来。US6528486公开的合成方法为Fmoc/tBu策略的逐步缩合方法，WO2005058954公开的合成方法则包括Fmoc/tBu策略的逐步缩合方法，Boc策略的逐步缩合方法及基因工程，WO2001004156公开的合成方法为Fmoc/tBu策略的逐步缩合方法。
然而，现有技术中，粗肽纯度及纯化后收率均相对较低。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺点，提供一种制备利西拉来的新方法。
发明人发现，采用常规的Fmoc/tBu策略逐步偶联存在如下问题：由于树脂固相偶联时存在着明显收缩情况，在偶联至片段15-19中的五个氨基酸(Glu15、Glu16、Glu17、Ala18、Vla19)时，这五个氨基酸容易产生偶联不完全的缺损肽，从而降低粗肽纯度，增加纯化难度并进一步降低产品收率。
为解决上述问题，本发明采用片段缩合方法合成利西拉来，具体采用片段20-44肽树脂(即H-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Resin)与片段15-19(即Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-OH)进行固相缩合，然后逐步偶联剩余氨基酸至固相合成结束。
基于此，本发明提供一种制备利西拉来的方法，包括以下步骤：
(1)将Fmoc-Lys(Boc)-OH与树脂偶联，得到Fmoc-Lys(Boc)-Resin；
(2)采用Fmoc保护氨基酸，按照固相合成操作，依利西拉来氨基酸顺序进行依次偶联，得到利西拉来全保护20-44片段肽树脂(即H-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Resin)；
(3)采用固相合成方法合成全保护片段15-19肽树脂(即Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Resin)，然后裂解得到全保护肽片段15-19(即Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-OH)；
(4)将所得全保护片段15-19(即Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-OH)与全保护片段20-44肽树脂(即H-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Resin)偶联得到全保护片段15-44肽树脂(即Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Resin)；
(5)依利西拉来肽序逐步偶联其余氨基酸至固相合成结束；
(6)裂解利西拉来肽树脂，得到粗肽；
(7)采用反向高效液相色谱(RP-HPLC)纯化，最终得到利西拉来纯品。
其中Fmoc为9-芴甲氧羰基，与氨基相连或与羧基所连的碳原子上的氮原子相连。
使用本方法制备利息拉来具有如下优势：采用片段替代逐步偶联，可以有效避免逐步偶联片段15-19中五个氨基酸时容易产生由于偶联不完全的缺损肽；与常规的逐步偶联相比，提高了粗肽纯度(从原有的42％提高至70％以上)和纯化收率(从原有的10％提高至45％)。
附图说明
图1利西拉来的HPLC纯度分析图
图2利西拉来的质谱图
具体实施方式
本发明提供一种制备利西拉来的新方法，提高了产品的收率和纯度。所述方法包括以下步骤：
(1)将Fmoc-Lys(Boc)-OH与树脂偶联，得到Fmoc-Lys(Boc)-Resin；
(2)采用Fmoc保护氨基酸，按照固相合成操作，依利西拉来氨基酸顺序进行依次偶联，得到利西拉来全保护20-44片段肽树脂(即H-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Resin)；
(3)采用固相合成方法合成全保护片段15-19肽树脂(即Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Resin)，然后裂解得到全保护肽片段15-19(即Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-OH)；
(4)将所得全保护片段15-19(即Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-OH)与全保护片段20-44肽树脂(即H-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Resin)偶联得到全保护片段15-44肽树脂(即Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Il e-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Resin)；
(5)依利西拉来肽序逐步偶联其余氨基酸至固相合成结束；
(6)裂解利西拉来肽树脂，得到粗肽；
(7)采用RP-HPLC方法纯化，最终得到利西拉来纯品。
其中Fmoc为9-芴甲氧羰基，与氨基相连或与羧基所连的碳原子上的氮原子相连。
另外，
本发明中，“替代度”指的是单位量的树脂负载的物质的数量，单位为“mmol/g”。
本发明中，如无相反说明，则所述反应在常温常压下进行。
本发明中“肽”是指类似地通过多肽合成中的Fmoc固相合成方法得到的偶联产物。
本发明中，偶联制备肽树脂可采用多肽合成领域中技术人员已知的Fmoc固相合成方法来实现。
本发明中，偶联中对树脂的洗涤和溶胀可采用实现该目的的任何试剂进行，优选DMF。
本发明中，所述偶联在固相反应柱中进行。对固相反应柱无特别限制，可为可实现此目的的任意固相反应柱。
偶联优选在偶联剂的存在下进行，所述偶联剂优选为HOBt、A或其结合，或者为HATU、A、B或其结合，其中A为DIPEA或HOAt，B为PyBOP、PyAOP、HBTU、TMP和TBTU中的一种。
在偶联过程中，所用检测剂可为可判定所述反应终点的任何试剂，优选茚三酮。
优选地，将步骤(1)-(5)中物质中的羧基进行活化，活化优选在冰水浴中进行。活化剂优选为DIPEA或DIC。
对于在固相柱中反应的时间依检测剂检测结果而定，在未显示终点前可继续反应直至反应结束。
脱保护反应时间通常为5-30分钟，优选10-20分钟；压力优选为常压，也可在适当提高或降低的压力(例如0.01-1.5大气压)下进行；温度优选为室温(指20±5℃)，也可在适当提高或降低的温度下(例如0-50℃)进行。
所述裂解优选在室温和常压下进行，也可在适当提高或降低的温度和压力下进行。
在步骤(1)中，所述的树脂为氨基树脂，优选选自Rink Amide Resin、Rink AmideAM Resin、Rink Amide-MBHA Resin树脂，更优选选自Rink Amide-MBHA Resin。
在上述步骤(2)中，所述的树脂初始替代度范围为0.1～0.4mmol/g，优选范围为0.2～0.3mmol/g，
对于所用树脂的Fmoc脱除，用一种碱的稀释液脱除，稀释剂为洗涤和溶胀所用的溶剂，优选DMF，所述碱为有机碱，优选为哌啶，所述碱占混合物的体积比范围为0.1-0.3，优选为0.2，
所述的片段依次偶联时使用的偶联试剂为HOBt/DIC，
所用底物与缩合剂的摩尔比范围为0.7：1-0.4：1，优选0.5:1，稀释剂为DCM、DMF或其混合物，优选DCM和DMF的混合物。
在上述步骤(3)中，所用树脂为CTC树脂，
裂解液与肽树脂的比例范围为5ml/g至15ml/g，优选10ml/g，
所述的裂解液为弱酸，如TFA或TFE和DCM的混合物，优选0.5％～5％TFA或20％TFE的二氯甲烷溶液。
在上述步骤(4)中，所述的片段依次偶联时使用的偶联试剂为HATU/HOAt/TMP或HATU/HOAt/DIPEA，优选HATU/HOAt/TMP。
在上述步骤(6)中，所述裂解液为TFA、苯甲硫醚(PhSMe)、乙二硫醇(EDT)、三异丙基硅烷(TIS)和水的混合溶剂，其中混合溶剂的配比为：TFA体积比为80-86％，苯甲硫醚的体积比为1-5％、乙二硫醇的体积比为1-5％、三异丙基硅烷的体积比为1-3％，水的体积比为0.5-1％，四者之和为100％。
本发明中所使用的名称缩写的全称如下：
CTC Resin 2-氯三苯甲基氯树脂
HOAt 1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑
Fmoc 9-芴甲氧羰基
DIC N,N-二异丙基碳二亚胺
HOBt 1-羟基苯并三唑
HATU 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯
HBTU 苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐
DIPEA N,N-二异丙基乙胺
TMP 2,4,6-三甲基吡啶
DMF N,N-二甲基甲酰胺
DCM 二氯甲烷
TFA 三氟乙酸
PhSMe 苯甲硫醚
TIS 三异丙基硅烷
EDT 乙二硫醇
RP-HPLC 反相高效液相色谱
Gly 甘氨酸
Ala 丙氨酸
Val 缬氨酸
Leu 亮氨酸
Ile 异亮氨酸
Pro 脯氨酸
Phe 苯丙氨酸
Ser 丝氨酸
Thr 苏氨酸
Met 蛋氨酸
Asn 天冬酰胺
Gln 谷氨酰胺
Asp 天冬氨酸
Glu 谷氨酸
Lys 赖氨酸
Arg 精氨酸
His 组氨酸
本发明公开了一种制备利西拉来的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通优选实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的一种合成利西拉来的方法中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：
H-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide Resin的合成
称取100g替代度为0.1mmol/g的Rink Amide Resin(购自天津南开和成)加入到固相反应柱中，用一倍量树脂床层体积DMF洗涤2次，用一倍量树脂床层体积DMF溶胀树脂30分钟。加入一倍量树脂床层体积20％哌啶/DMF，按10min+10min的方式脱除Fmoc。抽干反应液，并用一倍量树脂床层体积DMF洗树脂6次。称取14.055g Fmoc-Lys(Boc)-OH(30mmol)、4.053g HOBt(30mmol)溶于体积比为1:1的DCM和DMF最小体积混合溶液，冰水浴下加入5.19ml DIC(33mmol)活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照利西拉来主链肽序，从C端到N端依次完成20-44片段的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到利西拉来(20-44)-RinkAmide Resin全保护肽树脂141.3g。
实施例2：
H-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)--Rink Amide Resin的合成
称取25g替代度为0.4mmol/g的Rink Amide Resin(购自天津南开和成)，加入到固相反应柱中，用一倍量树脂床层体积DMF洗涤2次，用一倍量树脂床层体积DMF溶胀树脂30分钟。加入20％一倍量树脂床层体积哌啶/DMF，按10min+10min的方式脱除Fmoc。抽干反应液，并用一倍量树脂床层体积DMF洗树脂6次。称取14.055g Fmoc-Lys(Boc)-OH(30mmol)、4.053g HOBt(30mmol)溶于体积比为1:1的DCM和DMF最小体积混合溶液，冰水浴下加入5.19ml DIC(33mmol)活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照利西拉来主链肽序，从C端到N端依次完成20-44片段的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到利西拉来(20-44)-RinkAmide Resin全保护肽树脂65.9g。
实施例3：
H-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide Resin的合成
称取50g替代度为0.2mmol/g的Rink Amide Resin(天津南开和成)，加入到固相反应柱中，用一倍量树脂床层体积DMF洗涤2次，用一倍量树脂床层体积DMF溶胀树脂30分钟。加入一倍量树脂床层体积20％哌啶/DMF，按10min+10min的方式脱除Fmoc。抽干反应液，并用DMF洗树脂6次。称取14.055g Fmoc-Lys(Boc)-OH(30mmol)、4.053g HOBt(30mmol)溶于体积比为1:1的DCM和DMF最小体积混合溶液，冰水浴下加入5.19ml DIC(33mmol)活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照利西拉来主链肽序，从C端到N端依次完成20-44片段的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到利西拉来(20-44)-Rink Amide Resin全保护肽树脂91.2g。
实施例4：
H-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide AM Resin的合成
称取100g替代度为0.1mmol/g的Rink Amide AM Resin(天津南开和成)，加入到固相反应柱中，用一倍量树脂床层体积DMF洗涤2次，用一倍量树脂床层体积DMF溶胀树脂30分钟。加入一倍量树脂床层体积20％哌啶/DMF，按10min+10min的方式脱除Fmoc。抽干反应液，并用一倍量树脂床层体积DMF洗树脂6次。称取14.055g Fmoc-Lys(Boc)-OH(30mmol)、4.053g HOBt(30mmol)溶于体积比为1:1的DCM和DMF最小体积混合溶液，冰水浴下加入5.19ml DIC(33mmol)活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照利西拉来主链肽序，从C端到N端依次完成20-44片段的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到利西拉来(20-44)-RinkAmide AM Resin树脂141.2g。
实施例5：
H-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide AM Resin的合成
称取25g替代度为0.4mmol/g的Rink Amide AM Resin(天津南开和成)，加入到固相反应柱中，用一倍量树脂床层体积DMF洗涤2次，用一倍量树脂床层体积DMF溶胀树脂30分钟。加入一倍量树脂床层体积20％哌啶/DMF，按10min+10min的方式脱除Fmoc。抽干反应液，并用DMF洗树脂6次。称取14.055g Fmoc-Lys(Boc)-OH(30mmol)、4.053g HOBt(30mmol)溶于体积比为1:1的DCM和DMF最小体积混合溶液，冰水浴下加入5.19ml DIC(33mmol)活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照利西拉来主链肽序，从C端到N端依次完成20-44片段的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到利西拉来(20-44-Rink)-Amide AM Resin树脂65.8g。
实施例6：
H-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide AM Resin的合成
称取50g替代度为0.2mmol/g的Rink AmideAM Resin(天津南开和成)，加入到固相反应柱中，用一倍量树脂床层体积DMF洗涤2次，用一倍量树脂床层体积DMF溶胀树脂30分钟。加入一倍量树脂床层体积20％哌啶/DMF，按10min+10min的方式脱除Fmoc。抽干反应液，并用一倍量树脂床层体积DMF洗树脂6次。称取14.055g Fmoc-Lys(Boc)-OH(30mmol)、4.053g HOBt(30mmol)溶于体积比为1:1的DCM和DMF最小体积混合溶液，冰水浴下加入5.19ml DIC(33mmol)活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照利西拉来主链肽序，从C端到N端依次完成20-44片段的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到利西拉来(20-44)-RinkAmideAM Resin树脂91.1g。
实施例7：
H-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide MBHA Resin的合成
称取100g替代度为0.1mmol/g的Rink Amide MBHA Resin(天津南开和成)，加入到固相反应柱中，用一倍量树脂床层体积DMF洗涤2次，用一倍量树脂床层体积DMF溶胀树脂30分钟。加入一倍量树脂床层体积20％哌啶/DMF，按10min+10min的方式脱除Fmoc。抽干反应液，并用DMF洗树脂6次。称取14.055g Fmoc-Lys(Boc)-OH(30mmol)、4.053g HOBt(30mmol)溶于体积比为1:1的DCM和DMF最小体积混合溶液，冰水浴下加入5.19ml DIC(33mmol)活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照利西拉来主链肽序，从C端到N端依次完成20-44片段的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到利西拉来(20-44)-Rink AmideMBHA Resin树脂141.3g。
实施例8：
H-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide MBHA Resin的合成
称取25g替代度为0.4mmol/g的Rink AmideMBHA Resin(天津南开和成)，加入到固相反应柱中，用一倍量树脂床层体积DMF洗涤2次，用一倍量树脂床层体积DMF溶胀树脂30分钟。加入一倍量树脂床层体积20％哌啶/DMF，按10min+10min的方式脱除Fmoc。抽干反应液，并用一倍量树脂床层体积DMF洗树脂6次。称取14.055g Fmoc-Lys(Boc)-OH(30mmol)、4.053g HOBt(30mmol)溶于体积比为1:1的DCM和DMF最小体积混合溶液，冰水浴下加入5.19ml DIC(33mmol)活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照利西拉来主链肽序，从C端到N端依次完成20-44片段的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到利西拉来(20-44)-RinkAmideMBHA Resin树脂66.1g。
实施例9：
H-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide MBHA Resin的合成
称取50g替代度为0.2mmol/g的Rink AmideMBHA Resin(天津南开和成)，加入到固相反应柱中，用一倍量树脂床层体积DMF洗涤2次，用一倍量树脂床层体积DMF溶胀树脂30分钟。加入一倍量树脂床层体积20％哌啶/DMF，按10min+10min的方式脱除Fmoc。抽干反应液，并用一倍量树脂床层体积DMF洗树脂6次。称取14.055g Fmoc-Lys(Boc)-OH(30mmol)、4.053g HOBt(30mmol)溶于体积比为1:1的DCM和DMF最小体积混合溶液，冰水浴下加入5.19ml DIC(33mmol)活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照利西拉来主链肽序，从C端到N端依次完成20-44片段的偶联，反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到利西拉来(20-44)-RinkAmideMBHA Resin树脂90.9g。
实施例10：Fmoc-Val-CTC Resin树脂的合成
称取100g替代度为1.0mmol/g的CTC树脂(天津南开和成)，加入到固相反应柱中，用一倍量树脂床层体积DMF洗涤2次，用一倍量树脂床层体积DMF溶胀树脂30分钟。称取68.0gFmoc-Val-OH(200mmol)溶于最小体积DMF溶液，冰水浴下加入69.5ml DIPEA(400mmol)活化3min后加入固相反应柱中，室温反应5min后再次加入34.8ml DIPEA(200mmol)。室温反应60min。用一倍量树脂床层体积DMF洗涤3次，加入81ml封闭液(甲醇：2000mmol)封闭8小时(树脂若未完全扩散加DMF作为溶剂)。用一倍量树脂床层体积DMF洗涤6次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Val-CTC Resin。检测替代度为0.916mmol/g。
实施例11：Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-CTC Resin肽树脂的制备
称取98.3g(90mmol)实施例10中替代度为0.916mmol/g的Fmoc-Val-CTC树脂，加入到固相反应柱中，用一倍量树脂床层体积DMF洗涤2次，用一倍量树脂床层体积DMF溶胀树脂30分钟。用一倍量树脂床层体积20％哌啶/DMF10min+10min脱Fmoc。取167.3gFmoc-His(Trt)-OH(270mmol)，43.8g HOBt(324mmol)，溶于最小体积DMF溶液，冰水浴下加入50.7mlDIC(324mmol)活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，依次逐步固相偶联Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，称重得到Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-CTCResin156.1g。
实施例12:Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-OH的制备
将实施例11制备的156.1g
Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-CTC Resin置于裂解反应瓶中，以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂(TFA：DCM＝1：99(V/V))，室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量DCM洗涤3次，合并滤液后减压浓缩至析出白色固体。在80℃回流下用最少量的四氢呋喃将白色固体溶解完全，缓慢滴加正己烷至溶液刚刚变浑浊，静置、停止加热回流，溶液逐渐冷却至室温，析出大量的白色固体。减压过滤，收集白色固体，此即粗肽Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-OH。重量82.56，收率95.1％，HPLC纯度为96.5％。
实施例13：
H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-G lu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Bo c)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-RinkAmide MBHA Resin的合成
称取由实施例9的方法制备的90.9g(10mmol)(20-44)-Rink AmideMBHA Resin树脂，加入固相反应柱中，用一倍量树脂床层体积DMF洗涤2次，用一倍量树脂床层体积DMF溶胀树脂30分钟。
将29.0g实施例12制备的
Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-OH粗品(30mmol)，11.41g HATU(30mmol)，4.90g HOAt(36mmol)溶于最小体积DMF中，冰浴中滴加10.43ml DIPEA，活化5min后加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，则抽干反应液完全按照上面的操作重复偶联至反应完全。
实施例14：
H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-G lu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Bo c)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-RinkAmide MBHA Resin的合成
称取由实施例9的方法制备的90.9g(10mmol)(20-44)-Rink AmideMBHA Resin树脂，加入固相反应柱中，用一倍量树脂床层体积DMF洗涤2次，用一倍量树脂床层体积DMF溶胀树脂30分钟。
将29.0g实施例12制备的
Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-OH粗品(30mmol)，11.41g HATU(30mmol)，4.90g HOAt(36mmol)溶于最小体积DMF中，冰浴中滴加7.92ml TMP，活化5min后加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，则抽干反应液完全按照上面的操作重复偶联至反应完全。
实施例15：利西拉来肽树脂的合成
按照逐步固相偶联操作，将实施例14所得的全部肽树脂依照利西拉来的肽序偶联至结束。反应结束后用甲醇收缩三次，肽树脂真空干燥过夜，称重得利西拉来肽树脂123.7g。
实施例16：利西拉来粗肽的制备
将实施例15制备的利西拉来肽树脂123.7g置于裂解反应器中，以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂(TFA：苯甲硫醚：EDT：TIS：水＝86：5：5：3：1(V/V))，室温搅拌3.5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即利西拉来粗肽47.3g，粗肽重量收率97.2％，利西拉来含量为60.5％，HPLC纯度为71.8％。
实施例17：利西拉来醋酸盐精肽的制备
称取实施例16中30.0g利西拉来粗肽用3000ml水溶解后，采用Waters 2545RP-HPLC系统，波长230nm，色谱柱为50×250mm反相C18柱，常规0.2％TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分，得到纯度大于98.5％精肽。将精肽溶液采用Waters 2545RP-HPLC系统，色谱柱为50×250mm反相C18柱，0.1％醋酸溶液/乙腈流动相转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到利西拉来醋酸盐精肽9.1g，纯度为98.61％。
MS(MALDI-TOF):m/z＝4858.64(M+)。
Claims (8)
1.一种制备利西拉来的方法，包括以下步骤：
(1)将Fmoc-Lys(Boc)-OH与树脂偶联，得到Fmoc-Lys(Boc)-Resin；
(2)采用Fmoc保护氨基酸，按照固相合成操作，依利西拉来氨基酸顺序进行依次偶联，得到利西拉来全保护20-44片段肽树脂；
(3)采用固相合成方法合成全保护片段15-19肽树脂，即Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Resin，然后裂解得到全保护肽片段15-19，即
Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-OH；
(4)将所得全保护片段15-19，即
Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-OH，与全保护片段20-44肽树脂，即
H-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Resin，偶联得到全保护片段15-44肽树脂，即
Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Resin；
(5)依利西拉来肽序逐步偶联其余氨基酸至固相合成结束；
(6)裂解利西拉来肽树脂，得到粗肽；
(7)采用RP-HPLC方法纯化，最终得到利西拉来纯品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述的树脂为氨基树脂，其选自Rink Amide Resin、Rink Amide AM Resin、Rink Amide-MBHA Resin树脂。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，其中使用的树脂为氨基树脂，氨基树脂初始替代度范围为0.1-0.4mmol/g。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，偶联反应中对树脂的洗涤和溶胀采用DMF进行。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所用树脂为CTC树脂；其中所述树脂的替代度为0.2-1.2mmol/g；所用的裂解液与肽树脂的比例范围为5ml/g-15ml/g。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述的片段偶联时使用的偶联试剂为HATU/HOAt/TMP或HATU/HOAt/DIPEA。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(6)中，所用的裂解液为TFA、苯甲硫醚(PhSMe)、乙二硫醇(EDT)、三异丙基硅烷(TIS)和水的混合溶剂，其中混合溶剂的配比为，TFA:苯甲硫醚:乙二硫醇:三异丙基硅烷:水的体积比为86:5:5:3:1。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对在步骤(1)-(4)中的肽树脂的羧基进行活化，活化在冰水浴中进行。
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