CN106928340A - 一种利西拉来的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及多肽药物合成技术领域，尤其涉及一种利西拉来的制备方法。本发明根据利西拉来肽的肽序结构，采用特定的保护的丝氨酸二肽作为原料偶联到肽序中，由于形成了类似脯氨酸的环状结构，能有效的防止肽键旋转，抑制肽链卷曲剂收缩，使活性官能团(伯胺)充分暴露，从而有利于氨基酸的偶联，减少缺损等副反应的发生。根据实验，本发明精肽收率可高达25.8％～28.8％，优于顺序逐个偶联方法(约15.4％)。同时，本发明精肽的纯度为99.3％。在保证了纯度的同时保证了收率。

Description

一种利西拉来的制备方法
技术领域
本发明涉及多肽药物合成技术领域，尤其涉及一种利西拉来的制备方法。
背景技术
利西拉来(Lixisenatide)是胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂，是基于具降糖活性的GLP-1类似物Exendin-4的C末端6个赖氨酸残基的修饰而合成的新型GLP-1类似物，能耐受体内二肽基肽酶Ⅳ(DPP4)的降解作用。利西拉来的结构如式I所示：
其肽序为：
H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2
作为GLP-1类似物的一种，利西拉来适用于服用二甲双胍、磺脲类、噻唑烷二酮类、二甲双胍和磺脲类联用、二甲双胍和噻唑烷二酮类联用的II型糖尿病患者中，不能有效控制血糖的患者的辅助治疗，以改善对血糖的控制。
目前一种常规合成利西拉来的方法是固相逐步合成(SPPS)法，该方法具有操作简单、设备要求低等特点。但是因为利西拉来由44个氨基酸组成，固相逐步合成法的产品收率低，肽在合成树脂上容易发生二级结构的弯曲，导致反应位点被包裹，得到的利西拉来粗肽纯度低，杂质繁杂，给产品纯化带来困难，不易得到较高纯度的利西拉来。
对于解决偶联困难的氨基酸问题，片段合成法是固相合成方法中一种常用的手段。片段合成法是先将偶联困难的序列制备成全保护肽片段，按照氨基酸序列将其作为整体直接偶联到指定肽树脂上，从而避开偶联困难的氨基酸位点，避免逐个氨基酸偶联产生的缺损等副反应，能够获得纯度相对高的粗肽，降低纯化难度。但片段合成法采用了常规的树脂外，还需使用大量价格较昂贵的2-CTC树脂制备片段肽树脂，且2-CTC树脂酸敏感性高，偶联时肽容易从树脂上脱落，从而导致制备的片段收率不高，操作步骤相对繁琐，生产成本也大幅度提高。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种利西拉来的制备方法，该方法操作简便，总收率高，所得产物纯度较高。
本发明提供了一种利西拉来的制备方法，包括：
步骤1：固相合成Fmoc-Lys-树脂；
步骤2：根据利西拉来的肽序在所述Fmoc-Lys-树脂上偶联氨基酸或二肽制得利西拉来肽树脂；所述二肽选自-Gly-Thr、-Phe-Thr、-Thr-Ser、-Leu-Ser、-Ser-Ser或-Pro-Ser；
步骤3：所述利西拉来肽树脂经裂解制得利西拉来。
本发明提供的方法将利西拉来肽序中第4～5位(-Gly-Thr，记为二肽A)、第6～7位(-Phe-Thr，记为二肽B)、第7～8位(-Thr-Ser，记为二肽C)、第10～11位(-Leu-Ser，记为二肽D)、第32～33位(-Ser-Ser，记为二肽E)或第31～32位、第37～37位(-Pro-Ser，记为二肽F)的氨基酸以二肽为原料进行偶联，选用的二肽原料为二肽A～F中任一种或多种，不采用二肽为原料的位点则采用单个氨基酸为原料进行偶联。该方法能够有效防止肽键旋转，抑制肽链卷曲剂收缩，使活性官能团(伯胺)充分暴露，从而有利于氨基酸的偶联，减少缺损等副反应的发生。
在本发明的实施例中，
偶联-Gly-Thr采用Fmoc-Gly-Thr(PSI ME,ME Pro)-OH；
偶联-Phe-Thr采用Fmoc-Phe-Thr(PSI ME,ME Pro)-OH；
偶联-Thr-Ser采用Fmoc-Thr(tBu)-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH；
偶联-Leu-Ser采用Fmoc-Leu-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH；
偶联-Ser-Ser采用Fmoc-Ser(tBu)-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH；
偶联-Pro-Ser采用Fmoc-Pro-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH。
其中，Fmoc-Gly-Thr(PSI ME,ME Pro)-OH的结构如式II-a；
Fmoc-Phe-Thr(PSI ME,ME Pro)-OH的结构如式II-b；
Fmoc-Thr(tBu)-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH的结构如式II-c；
Fmoc-Leu-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH的结构如式II-d；
Fmoc-Ser(tBu)-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH的结构如式II-e；
Fmoc-Pro-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH的结构如式II-f。
在本发明中，Fmoc-Lys-树脂的树脂为Rink Amide树脂、RinkAmide-MBHA树脂、Rink Amide-AM树脂或Siber树脂。
其中，Lys的保护基为Boc。
作为优选，Fmoc-Lys(Boc)-树脂的替代度为0.1mmol/g～0.6mmol/g。优选的，替代度范围为0.2mmol/g～0.4mmol/g。
在本发明的实施例中，偶联的偶联剂为HOBt与DIC的混合物；其中HOBt与DIC的摩尔比为1:1。
在本发明中，所述偶联的步骤包括：脱除Fmoc保护后，以DCM和DMF的混合液为溶剂，与偶联剂混合后进行偶联反应。
作为优选，脱除保护的树脂与待偶联氨基酸的摩尔比为1:3。
重复偶联的步骤直至合成整个肽链。
在本发明中，偶联反应的条件为室温反应2h。所述室温为10℃～30℃。
作为优选，如偶联反应不完全则继续偶联反应1h。
在本发明中，偶联反应结束后以甲醇收缩，树脂真空干燥过夜。
在本发明的实施例中，裂解的裂解剂为裂解的裂解剂包括TFA与B组分；所述B组分选自PhSMe、PhOMe、EDT、H2O、TIS或PhOH。
作为优选，裂解剂中TFA、PhSMe、PhOMe、EDT、H2O、TIS、PhOH的体积比为(80～90)：(0～5):(0～3):(0～5):(0～5)：(0～2)：(0～5)。
优选的，裂解液中TFA、PhSMe、EDT、TIS、H2O的体积比为84:5:5:5:1。
优选的，裂解剂中TFA、PhSMe、EDT、H2O的体积比为91:3:3:3。
优选的，裂解剂中TFA、PhSMe、EDT、PhOMe的体积比为90:5:3:2。
优选的，裂解剂中TFA、EDT、H2O的体积比为90:5:5。
优选的，裂解剂中TFA、PhSMe、PhOH、EDT、H2O的体积比为85:5:3:5:2。
在本发明中，裂解的步骤包括：将利西拉来肽树脂与裂解液混合，室温裂解2.5h～3h后，以TFA洗涤树脂、以无水乙醚沉淀，获得利西拉来线性粗肽。
作为优选，无水乙醚沉淀的温度为0～4℃。
作为优选，利西拉来肽树脂与裂解液的质量-体积比为1:8～15。
在本发明的实施例中，步骤3后还包括纯化、转盐的步骤。
具体的，纯化的色谱采用NOVASEP RP-HPLC系统，检测波长220nm，色谱柱为反相C18柱，流动相A相为体积分数为0.1％的TFA水溶液，流动相B相为乙腈。洗脱梯度为18％乙腈-48％乙腈45min，48％等度15min：纯化后经转盐色谱，转盐。
具体的转盐为转化为醋酸盐，盐酸盐，枸橼酸盐，磷酸盐，三氟乙酸盐，钠盐，钾盐或铵盐。
在一些实施例中，仅引入二肽A，二肽C、二肽D、二肽E、二肽F，制备利西拉来。
偶联具体为依次偶联：Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-Ser(PSI ME，ME Pro)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Ser(PSI ME，ME Pro)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-Ser(PSI ME，ME Pro)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-Ser(PSI ME，ME Pro)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-Thr(PSIME，ME Pro)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH和Boc-His(Trt)-OH。
在一些实施例中，仅引入二肽A，二肽B、二肽D、二肽F，制备利西拉来。
偶联具体为依次偶联：Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-Ser(PSIME,ME Pro)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-Ser(PSIME,ME Pro)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-Thr(PSIME,ME Pro)-OH、Fmoc-Gly-Thr(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH和Boc-His(Trt)-OH。
在一些实施例中，仅引入二肽A，二肽B、二肽D、二肽E，制备利西拉来。
偶联具体为依次偶联：Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-Thr(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Gly-Thr(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH和Boc-His(Trt)-OH。
在一些实施例中，仅引入二肽B、二肽D、二肽E，制备利西拉来。
偶联具体为依次偶联：Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-Thr(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH和Boc-His(Trt)-OH。
在一些实施例中，仅引入二肽C、二肽E，制备利西拉来。
偶联具体为依次偶联：Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH和Boc-His(Trt)-OH。
在一些实施例中，仅引入二肽E，制备利西拉来。
偶联具体为依次偶联：Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe--OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH和Boc-His(Trt)-OH。
在一些实施例中，仅引入二肽D，制备利西拉来。
偶联具体为依次偶联：Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe--OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH或Boc-His(Trt)-OH。
在一些实施例中，仅引入二肽A，二肽B，二肽D，二肽E，二肽F，制备利西拉来。
偶联具体为依次偶联：Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-Ser(PSIME,ME Pro)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-Ser(PSIME,ME Pro)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-Thr(PSIME,ME Pro)-OH、Fmoc-Gly-Thr(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH和Boc-His(Trt)-OH。
本发明根据利西拉来肽的肽序结构，采用特定的保护的丝氨酸二肽作为原料偶联到肽序中，由于形成了类似脯氨酸的环状结构，能有效的防止肽键旋转，抑制肽链卷曲剂收缩，使活性官能团(伯胺)充分暴露，从而有利于氨基酸的偶联，减少缺损等副反应的发生。根据实验，本发明精肽收率可高达25.8％～28.8％，优于顺序逐个偶联方法(约15.4％)。同时，本发明精肽的纯度为99.3％。在保证了纯度的同时保证了收率。
附图说明
图1示实施例1制得制得粗肽的质谱图；
图2示对比例1制得制得粗肽的质谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种利西拉来的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试剂或仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
其中，各材料的名称及缩写如表1：
表1 各材料的名称及缩写
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
本实施例仅引入二肽A，二肽C、二肽D、二肽E、二肽F，制备利西拉来。
1.1Fmoc-Lys(Boc)-Rink Amide-MBHA Resin的制备
称取干燥Rink Amide-MBHA Resin 380g(替代度为0.45mmol/g)加入到固相反应柱中，首先DMF洗涤树脂2遍，再用2～3倍树脂床层体积DMF溶胀树脂30分钟，DMF洗涤3次，DCM洗涤2次，等待投料。
在冰浴冷却的条件下，将238.9g Fmoc-Lys(Boc)-OH(510mmol)、72.4gHOAt(536mmol)溶于DMF和DCM的混合溶剂中，待氨基酸溶解后，慢慢加入DIC 67.5g(535mmol)，活化3min后将反应液倒入反应柱中，鼓气搅拌反应；采用茚三酮检测树脂反应透明时停止反应，DMF洗涤3遍，甲醇收缩、减压干燥得Fmoc-Lys(Boc)-Rink Amide-MBHA Resin 421克，检测树脂替代度为0.406mmol/g。
1.2lixisenatide肽树脂的制备
取1.1方法制备的替代度为0.406mmol/g的Fmoc-Lys(Boc)-RinkAmide-MBHA Resin 421g(230mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，。将239.1g(510mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH，72.2g(536mmol)HOBt，67.7g(535mmol)DIC溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h至树脂检测透明)。
重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，采用一定的偶联方法，依次完成Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Ser(PSI ME,MEPro)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-Thr(PSIME,ME Pro)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Boc-His(Trt)-OH的偶联。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到2018克lixisenatide肽树脂。
1.3lixisenatide肽树脂的裂解和精肽制备
取1.2得到的lixisenatide肽树脂700g置于裂解反应器中，以8ml/g(裂解液/树脂)的裂解液用量入裂解试剂(TFA：PhSMe：EDT：TIS：H2O＝84:5:5:5:1，(V/V))，室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤2次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀、离心，无水乙醚洗涤粗肽滤饼3次，真空干燥得到白色粉末固体，lixisenatide粗肽341g，质谱(图1)MALDI-TOF：(M+H)+＝4859.216。粗肽重量收率为99.4％，HPLC纯度为69.1％。
取1.3中得到的lixisenatide粗肽44g进行精制，溶解后采用NOVASEPRP-HPLC系统，波长220nm，色谱柱为反相C18柱，常规0.1％TFA/水、乙腈流动相体系纯化后转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到lixisenatide精肽12.6g，HPLC纯度99.3％，精肽收率28.8％。
实施例2
本实施例仅引入二肽A，二肽B、二肽D、二肽F，制备利西拉来。
2.1Fmoc-Lys(Boc)-Rink Amide Resin的制备
称取干燥Rink Amide Resin356g(替代度为0.42mmol/g)加入到固相反应柱中，首先DMF洗涤树脂2遍，再用2～3倍树脂床层体积DMF溶胀树脂30分钟，DMF洗涤3次，DCM洗涤2次，等待投料。
在冰浴冷却的条件下，将210.9g Fmoc-Lys(Boc)-OH(450mmol)、63.8gHOBt(473mmol)、170.6g HBTU(450mmol)溶于DMF和DCM的混合溶剂中，待氨基酸溶解后，慢慢加入DIPEA 87.6g(675mmol)，活化3min后将反应液倒入反应柱中，鼓气搅拌反应；采用茚三酮检测树脂反应透明时停止反应，DMF洗涤3遍，甲醇收缩、减压干燥得Fmoc-Lys(Boc)-Rink Amide Resin 390克，检测树脂替代度为0.385mmol/g。
2.2lixisenatide肽树脂的制备
取2.1方法制备的替代度为0.385mmol/g的Fmoc-Lys(Boc)-Rink AmideResin 421g(150mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，。将211.3g(450mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH，64.8g(473mmol)HOBt，63.9g(473mmol)DIC溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h至树脂检测透明)。
重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，采用一定的偶联方法，依次完成Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-Thr(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Gly-Thr(PSIME,ME Pro)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Boc-His(Trt)-OH的偶联。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到1611克lixisenatide肽树脂。
2.3lixisenatide肽树脂的裂解和精肽制备
取2.2得到的lixisenatide肽树脂600g置于裂解反应器中，以10ml/g(裂解液/树脂)的裂解液用量入裂解试剂(TFA：PhSMe：EDT：H2O＝91:3:3:3，(V/V))，室温搅拌2.5h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤2次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀、离心，无水乙醚洗涤粗肽滤饼3次，真空干燥得到白色粉末固体，lixisenatide粗肽251g，质谱MALDI-TOF：(M+H)+＝4859.017。粗肽重量收率为101.2％，HPLC纯度为66.6％。
取2.3中得到的lixisenatide粗肽47g进行精制，溶解后采用NOVASEPRP-HPLC系统，波长220nm，色谱柱为反相C18柱，常规0.1％TFA/水、乙腈流动相体系纯化后转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到lixisenatide精肽12.4g，HPLC纯度99.1％，精肽收率26.4％。
实施例3
本实施例仅引入二肽A，二肽B、二肽D、二肽E，制备利西拉来。
3.1Fmoc-Lys(Boc)-Siber Resin的制备
称取干燥Siber Resin 155g(替代度为0.35mmol/g)加入到固相反应柱中，首先DMF洗涤树脂2遍，再用2～3倍树脂床层体积DMF溶胀树脂30分钟，DMF洗涤3次，DCM洗涤2次，等待投料。
在冰浴冷却的条件下，将77.6g Fmoc-Lys(Boc)-OH(165mmol)、23.5gHOBt(173mmol)溶于DMF和DCM的混合溶剂中，待氨基酸溶解后，慢慢加入DIC 22.1g(173mmol)，活化3min后将反应液倒入反应柱中，鼓气搅拌反应；采用茚三酮检测树脂反应透明时停止反应，DMF洗涤3遍，甲醇收缩、减压干燥得Fmoc-Lys(Boc)-Siber Resin 368克，检测树脂替代度为0.323mmol/g。
3.2lixisenatide肽树脂的制备
取3.1方法制备的替代度为0.323mmol/g的Fmoc-Lys(Boc)-Siber Resin368g(54mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，。将77.9g(165mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH，23.5g(173mmol)HOBt，22.4g(173mmol)DIC溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h至树脂检测透明)。
重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，采用一定的偶联方法，依次完成Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Ser(PSI ME,MEPro)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-Thr(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Gly-Thr(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Boc-His(Trt)-OH的偶联。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到831克lixisenatide肽树脂。
3.3lixisenatide肽树脂的裂解和精肽制备
取3.2得到的lixisenatide肽树脂800g置于裂解反应器中，以12ml/g(裂解液/树脂)的裂解液用量入裂解试剂(TFA：PhSMe：EDT：PhOMe＝90:5:3:2，(V/V))，室温搅拌3h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤2次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀、离心，无水乙醚洗涤粗肽滤饼3次，真空干燥得到白色粉末固体，lixisenatide粗肽241g，质谱MALDI-TOF：(M+H)+＝4859.512。粗肽重量收率为98.9％，HPLC纯度为68.4％。
取3.3中得到的lixisenatide粗肽50g进行精制，溶解后采用NOVASEPRP-HPLC系统，波长220nm，色谱柱为反相C18柱，常规0.1％TFA/水、乙腈流动相体系纯化后转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到lixisenatide精肽13.7g，HPLC纯度99.2％，精肽收率27.4％。
实施例4
本实施例仅引入二肽B、二肽D、二肽E，制备利西拉来。
4.1Fmoc-Lys(Boc)-Rink Amide-MBHA Resin的制备
称取干燥Rink Amide-MBHA Resin 135g(替代度为0.24mmol/g)加入到固相反应柱中，首先DMF洗涤树脂2遍，再用2～3倍树脂床层体积DMF溶胀树脂30分钟，DMF洗涤3次，DCM洗涤2次，等待投料。
在冰浴冷却的条件下，将46.8g Fmoc-Lys(Boc)-OH(100mmol)、14.2gHOBt(105mmol)溶于DMF和DCM的混合溶剂中，待氨基酸溶解后，慢慢加入DIC 13.5g(105mmol)，活化3min后将反应液倒入反应柱中，鼓气搅拌反应；采用茚三酮检测树脂反应透明时停止反应，DMF洗涤3遍，甲醇收缩、减压干燥得Fmoc-Lys(Boc)-Siber Resin 143克，检测树脂替代度为0.223mmol/g。
4.2lixisenatide肽树脂的制备
取4.1方法制备的替代度为0.223mmol/g的Fmoc-Lys(Boc)-RinkAmide-MBHA Resin 143g(32mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，将45.6g(96mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH，13.8g(101mmol)HOBt，12.7g(101mmol)DIC溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h至树脂检测透明)。
重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，采用一定的偶联方法，依次完成Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Ser(PSI ME,MEPro)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-Thr(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Boc-His(Trt)-OH的偶联。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到401克lixisenatide肽树脂。
4.3lixisenatide肽树脂的裂解和精肽制备
取4.2得到的lixisenatide肽树脂400g置于裂解反应器中，以15ml/g(裂解液/树脂)的裂解液用量入裂解试剂(TFA：PhSMe：EDT：PhOH：H2O＝85:5:3:5:2，(V/V))，室温搅拌3h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤2次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀、离心，无水乙醚洗涤粗肽滤饼3次，真空干燥得到白色粉末固体，lixisenatide粗肽156g，质谱MALDI-TOF：(M+H)+＝4859.347。粗肽重量收率为102.6％，HPLC纯度为67.9％。
取4.3中得到的lixisenatide粗肽46g进行精制，溶解后采用NOVASEPRP-HPLC系统，波长220nm，色谱柱为反相C18柱，常规0.1％TFA/水、乙腈流动相体系纯化后转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到lixisenatide精肽11.6g，HPLC纯度99.3％，精肽收率27.1％。
实施例5
本实施例仅引入二肽C、二肽E，制备利西拉来。
5.1Fmoc-Lys(Boc)-Rink Amide-AM Resin的制备
称取干燥Rink Amide-AM Resin 547g(替代度为0.56mmol/g)加入到固相反应柱中，首先DMF洗涤树脂2遍，再用2～3倍树脂床层体积DMF溶胀树脂30分钟，DMF洗涤3次，DCM洗涤2次，等待投料。
在冰浴冷却的条件下，将431.2g Fmoc-Lys(Boc)-OH(918mmol)、130.5gHOBt(964mmol)溶于DMF和DCM的混合溶剂中，待氨基酸溶解后，慢慢加入DIC 121.5g(964mmol)，活化3min后将反应液倒入反应柱中，鼓气搅拌反应；采用茚三酮检测树脂反应透明时停止反应，DMF洗涤3遍，甲醇收缩、减压干燥得Fmoc-Lys(Boc)-Rink Amide-AM Resin 621克，检测树脂替代度为0.508mmol/g。
5.2lixisenatide肽树脂的制备
取5.1方法制备的替代度为0.508mmol/g的Fmoc-Lys(Boc)-RinkAmide-AM Resin 207g(105mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，。将147.6g(315mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH，44.8g(330mmol)HOBt，41.6g(330mmol)DIC溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h至树脂检测透明)。
重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，采用一定的偶联方法，依次完成Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Ser(PSI ME,MEPro)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Phe--OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Boc-His(Trt)-OH的偶联。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到1046克lixisenatide肽树脂。
5.3lixisenatide肽树脂的裂解和精肽制备
取5.2得到的lixisenatide肽树脂1000g置于裂解反应器中，以10ml/g(裂解液/树脂)的裂解液用量入裂解试剂(TFA：EDT：H2O＝90:5:5，(V/V))，室温搅拌3h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤2次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀、离心，无水乙醚洗涤粗肽滤饼3次，真空干燥得到白色粉末固体，lixisenatide粗肽487g，质谱MALDI-TOF：(M+H)+＝4859.109。粗肽重量收率为100.6％，HPLC纯度为67.1％。
取5.3中得到的lixisenatide粗肽43g进行精制，溶解后采用NOVASEPRP-HPLC系统，波长220nm，色谱柱为反相C18柱，常规0.1％TFA/水、乙腈流动相体系纯化后转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到lixisenatide精肽11.9g，HPLC纯度99.3％，精肽收率28.1％。
实施例6
本实施例仅引入二肽E，制备利西拉来。
6.1Fmoc-Lys(Boc)-Rink Amide-AM Resin的制备
称取干燥Rink Amide-AM Resin 547g(替代度为0.56mmol/g)加入到固相反应柱中，首先DMF洗涤树脂2遍，再用2～3倍树脂床层体积DMF溶胀树脂30分钟，DMF洗涤3次，DCM洗涤2次，等待投料。
在冰浴冷却的条件下，将431.2g Fmoc-Lys(Boc)-OH(918mmol)、130.5gHOBt(964mmol)溶于DMF和DCM的混合溶剂中，待氨基酸溶解后，慢慢加入DIC 121.5g(964mmol)，活化3min后将反应液倒入反应柱中，鼓气搅拌反应；采用茚三酮检测树脂反应透明时停止反应，DMF洗涤3遍，甲醇收缩、减压干燥得Fmoc-Lys(Boc)-Rink Amide-AM Resin 621克，检测树脂替代度为0.508mmol/g。
6.2lixisenatide肽树脂的制备
取6.1方法制备的替代度为0.508mmol/g的Fmoc-Lys(Boc)-RinkAmide-AM Resin 137g(70mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次。将98.5g(210mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH，30.6g(220mmol)HOBt，27.9g(220mmol)DIC溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h至树脂检测透明)。
重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，采用一定的偶联方法，依次完成Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Ser(PSI ME,MEPro)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe--OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Boc-His(Trt)-OH的偶联。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到728克lixisenatide肽树脂。
6.3lixisenatide肽树脂的裂解和精肽制备
取6.2得到的lixisenatide肽树脂728g置于裂解反应器中，以10ml/g(裂解液/树脂)的裂解液用量入裂解试剂(TFA：EDT：H2O＝90:5:5，(V/V))，室温搅拌3h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤2次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀、离心，无水乙醚洗涤粗肽滤饼3次，真空干燥得到白色粉末固体，lixisenatide粗肽338.9g，质谱MALDI-TOF：(M+H)+＝4859.205。粗肽重量收率为99.6％，HPLC纯度为61.8％。
取6.3中得到的lixisenatide粗肽58g进行精制，溶解后采用NOVASEPRP-HPLC系统，波长220nm，色谱柱为反相C18柱，常规0.1％TFA/水、乙腈流动相体系纯化后转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到lixisenatide精肽14.9g，HPLC纯度99.2％，精肽收率25.8％。
实施例7
本实施例仅引入二肽D，制备利西拉来。
7.1Fmoc-Lys(Boc)-Rink Amide-AM Resin的制备
称取干燥Rink Amide-AM Resin 547g(替代度为0.56mmol/g)加入到固相反应柱中，首先DMF洗涤树脂2遍，再用2～3倍树脂床层体积DMF溶胀树脂30分钟，DMF洗涤3次，DCM洗涤2次，等待投料。
在冰浴冷却的条件下，将431.2g Fmoc-Lys(Boc)-OH(918mmol)、130.5gHOBt(964mmol)溶于DMF和DCM的混合溶剂中，待氨基酸溶解后，慢慢加入DIC 121.5g(964mmol)，活化3min后将反应液倒入反应柱中，鼓气搅拌反应；采用茚三酮检测树脂反应透明时停止反应，DMF洗涤3遍，甲醇收缩、减压干燥得Fmoc-Lys(Boc)-Rink Amide-AM Resin 621克，检测树脂替代度为0.508mmol/g。
7.2lixisenatide肽树脂的制备
取7.1方法制备的替代度为0.508mmol/g的Fmoc-Lys(Boc)-RinkAmide-AM Resin 137g(70mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次。将98.5g(210mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH，31.6g(220mmol)HOAt，27.9g(220mmol)DIC溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h至树脂检测透明)。
重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，采用一定的偶联方法，依次完成Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe--OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Boc-His(Trt)-OH的偶联。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到742克lixisenatide肽树脂。
7.3lixisenatide肽树脂的裂解和精肽制备
取7.2得到的lixisenatide肽树脂742g置于裂解反应器中，以10ml/g(裂解液/树脂)的裂解液用量入裂解试剂(TFA：PhSMe：PhOH：EDT：H2O＝85:5:3:5:2，(V/V))，室温搅拌3h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤2次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀、离心，无水乙醚洗涤粗肽滤饼3次，真空干燥得到白色粉末固体，lixisenatide粗肽341.3g，质谱MALDI-TOF：(M+H)+＝4859.318。粗肽重量收率为100.8％，HPLC纯度为59.6％。
取7.3中得到的lixisenatide粗肽48g进行精制，溶解后采用NOVASEPRP-HPLC系统，波长220nm，色谱柱为反相C18柱，常规0.1％TFA/水、乙腈流动相体系纯化后转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到lixisenatide精肽12.8g，HPLC纯度99.1％，精肽收率26.6％。
实施例8
本实施例仅引入二肽A，二肽B，二肽D，二肽E，二肽F，制备利西拉来。
8.1Fmoc-Lys(Boc)-Rink Amide-AM Resin的制备
称取干燥Rink Amide-AM Resin 547g(替代度为0.56mmol/g)加入到固相反应柱中，首先DMF洗涤树脂2遍，再用2～3倍树脂床层体积DMF溶胀树脂30分钟，DMF洗涤3次，DCM洗涤2次，等待投料。
在冰浴冷却的条件下，将431.2g Fmoc-Lys(Boc)-OH(918mmol)、130.5gHOBt(964mmol)溶于DMF和DCM的混合溶剂中，待氨基酸溶解后，慢慢加入DIC 121.5g(964mmol)，活化3min后将反应液倒入反应柱中，鼓气搅拌反应；采用茚三酮检测树脂反应透明时停止反应，DMF洗涤3遍，甲醇收缩、减压干燥得Fmoc-Lys(Boc)-Rink Amide-AM Resin 621克，检测树脂替代度为0.508mmol/g。
8.2lixisenatide肽树脂的制备
取8.1方法制备的替代度为0.508mmol/g的Fmoc-Lys(Boc)-RinkAmide-AM Resin 136g(70mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次。将98.5g(210mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH，31.6g(220mmol)HOAt，109.5g(210mmol)PyAOP，54.3g(420mmol)DIPEA溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h至树脂检测透明)。
重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，采用一定的偶联方法，依次完成Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Ser(PSI ME,MEPro)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-Thr(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Gly-Thr(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Boc-His(Trt)-OH的偶联。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到751克lixisenatide肽树脂。
8.3lixisenatide肽树脂的裂解和精肽制备
取8.2得到的lixisenatide肽树脂742g置于裂解反应器中，以10ml/g(裂解液/树脂)的裂解液用量入裂解试剂(TFA：PhSMe：PhOH：EDT：H2O＝85:5:3:5:2，(V/V))，室温搅拌3h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤2次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀、离心，无水乙醚洗涤粗肽滤饼3次，真空干燥得到白色粉末固体，lixisenatide粗肽335.6g，质谱MALDI-TOF：(M+H)+＝4859.478。粗肽重量收率为97.6％，HPLC纯度为68.9％。
取8.3中得到的lixisenatide粗肽52g进行精制，溶解后采用NOVASEPRP-HPLC系统，波长220nm，色谱柱为反相C18柱，常规0.1％TFA/水、乙腈流动相体系纯化后转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到lixisenatide精肽14.5g，HPLC纯度99.2％，精肽收率27.9％。
对比例1
D1.1Fmoc-Lys(Boc)-Rink Amide-AM Resin的制备
称取干燥Rink Amide-AM Resin 410g(替代度为0.56mmol/g)加入到固相反应柱中，首先DMF洗涤树脂2遍，再用2～3倍树脂床层体积DMF溶胀树脂30分钟，DMF洗涤3次，DCM洗涤2次，等待投料。
在冰浴冷却的条件下，将323.5g Fmoc-Lys(Boc)-OH(690mmol)、97.9gHOBt(725mmol)溶于DMF和DCM的混合溶剂中，待氨基酸溶解后，慢慢加入DIC 92.4g(725mmol)，活化3min后将反应液倒入反应柱中，鼓气搅拌反应；采用茚三酮检测树脂反应透明时停止反应，DMF洗涤3遍，甲醇收缩、减压干燥得Fmoc-Lys(Boc)-Rink Amide-AM Resin 462克，检测树脂替代度为0.51mmol/g。
D1.2顺序偶联制备lixisenatide肽树脂
取D1.1方法制备的替代度为0.51mmol/g的Fmoc-Lys(Boc)-RinkAmide-AM Resin 462g(230mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，。将323.6g(690mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH，98.1g(725mmol)HOBt，92.4g(724mmol)DIC溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h至树脂检测透明)。
重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照片段的顺序，采用一定的偶联方法，依次完成Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Boc-His(Trt)-OH的偶联。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到2350克lixisenatide肽树脂。
D1.3lixisenatide肽树脂的裂解和精肽制备
称取D1.2得到的lixisenatide肽树脂800克置于裂解反应器中，以12ml/g(裂解液/树脂)的裂解液用量入裂解试剂(TFA：PhSMe：PhOH：EDT：H2O＝85:5:3:5:2，(V/V))，室温搅拌3h。反应物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤2次，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀、离心，无水乙醚洗涤粗肽滤饼3次，真空干燥得到白色粉末固体，lixisenatide粗肽370.6g，质谱(图2)MALDI-TOF：(M+H)+＝4859.288。粗肽重量收率为96.8％，HPLC纯度为44.5％。
取D1.3中得到的lixisenatide粗肽49g进行精制，溶解后采用NOVASEPRP-HPLC系统，波长220nm，色谱柱为反相C18柱，常规0.1％TFA/水、乙腈流动相体系纯化后转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到lixisenatide精肽7.5g，HPLC纯度98.6％，精肽收率15.4％。
实施例9
检测实施例1～8和对比例1制得的精肽。其中，对实施例1制得粗肽的质谱图如图1，对对比例1制得粗肽的质谱图如图2。其他各实施例制得产品的质谱图与此相似。各实施例获得多肽纯度和收率如表2：
表2 多肽纯度和收率
结果显示，引入二肽片段的技术方案无论从粗肽纯度、精肽纯度还是精肽收率上都高于对比例方案。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (13)

1.一种利西拉来的制备方法，其特征在于，包括：
步骤1：固相合成Fmoc-Lys-树脂；
步骤2：根据利西拉来的肽序在所述Fmoc-Lys-树脂上偶联氨基酸或二肽制得利西拉来肽树脂；所述二肽选自-Gly-Thr、-Phe-Thr、-Thr-Ser、-Leu-Ser、-Ser-Ser或-Pro-Ser；
步骤3：所述利西拉来肽树脂经裂解制得利西拉来。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
偶联-Gly-Thr采用Fmoc-Gly-Thr(PSI ME,ME Pro)-OH；
偶联-Phe-Thr采用Fmoc-Phe-Thr(PSI ME,ME Pro)-OH；
偶联-Thr-Ser采用Fmoc-Thr(tBu)-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH；
偶联-Leu-Ser采用Fmoc-Leu-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH；
偶联-Ser-Ser采用Fmoc-Ser(tBu)-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH；
偶联-Pro-Ser采用Fmoc-Pro-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述偶联的偶联剂为HOBt与DIC的混合物；其中HOBt与DIC的摩尔比为1:1。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述裂解的裂解剂包括TFA与B组分；所述B组分选自PhSMe、PhOMe、EDT、H2O、TIS或PhOH。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3后还包括纯化、转盐的步骤。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述偶联具体为依次偶联：Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-Ser(PSI ME，ME Pro)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Ser(PSI ME，ME Pro)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-Ser(PSI ME，ME Pro)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-Ser(PSI ME，ME Pro)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-Thr(PSIME，ME Pro)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH和Boc-His(Trt)-OH。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述偶联具体为依次偶联：Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-Thr(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Gly-Thr(PSIME,ME Pro)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH和Boc-His(Trt)-OH。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述偶联具体为依次偶联：Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Ser(PSI ME,MEPro)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-Thr(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Gly-Thr(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH和Boc-His(Trt)-OH。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述偶联具体为依次偶联：Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Ser(PSI ME,MEPro)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-Thr(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH和Boc-His(Trt)-OH。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述偶联具体为依次偶联：Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Ser(PSI ME,MEPro)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Phe--OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH和Boc-His(Trt)-OH。
11.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述偶联具体为依次偶联：Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Ser(PSI ME,MEPro)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe--OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH和Boc-His(Trt)-OH。
12.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述偶联具体为依次偶联：Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe--OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH或Boc-His(Trt)-OH。
13.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述偶联具体为依次偶联：Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-Ser(PSI ME,MEPro)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-Ser(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Phe-Thr(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Gly-Thr(PSI ME,ME Pro)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH和Boc-His(Trt)-OH。
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