CN103242441A - 一种齐考诺肽的固相合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种齐考诺肽的固相合成方法，以Fmoc-氨基树脂为固相载体，缩合反应连接25个侧链保护的氨基酸，得到线性全保护肽树脂，其中，形成二硫键的三组Cys分别连接Trt、Acm或tBu保护基；将树脂进行线性切割，切割的同时脱去除Cys(Acm)和Cys(tBu)外的其它所有氨基酸的侧链保护基；氧化线性肽形成第一对二硫键，得到单二硫环肽；脱除单二硫环肽中Cys(Acm)的Acm保护基，同时环化形成第二对二硫键，得到双二硫环肽；脱除双二硫环肽中Cys(tBu)的tBu保护基，同时环化形成第三对二硫键，得到三二硫环肽；三二硫环肽经纯化、冻干得到齐考诺肽。
Description
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种齐考诺肽的固相合成方法。
背景技术
齐考诺肽(ziconotide)是ω-芋螺毒素MVIIA的合成形式，天然型存在于南太平洋海洋蜗牛(Conusmagus)体内，是由25个氨基酸组成的阳离子多肽，包括3对二硫键连接的6个半胱氨酸残基，分子量为2639.12。
它是强效的、特异性、选择性、可逆的的N型电压敏感性钙通道(N-type voltage-sensitive calcium channels,N-type VSCCs)阻滞剂，可阻止脊髓初级疼痛传入神经元上钙离子的涌入，抑制神经递质如P物质、降钙素基因相关肽以及谷氨酸等的释放，从而阻止或降低疼痛信号的传导，对其他离子通道没有明显的亲和力。鞘内注射齐考诺肽可以阻断初级伤害感受器的传入神经递质的释放，同时阻止疼痛信号从脊髓向脑部传导，从而产生镇痛作用。长期给药不会引起耐受性，优于鞘内注射吗啡，可用于治疗难治性、阿片类药物无效或已产生耐药性的病例。一系列的临床实验已经证明鞘内注射齐考诺肽可以治疗带状疱疹后遗神经痛，幻肢痛，HIV相关神经病理性疼痛，难治性癌痛，手术后疼痛。而且齐考诺肽不与阿片受体、胆碱能受体、单胺类受体或肽能受体结合。
此外，齐考诺肽仍存在部分副作用，表现为：头晕，恶心，眼球震颤，步态异常，便秘，尿潴留，嗜睡，体位性低血压，呕吐，思维混乱，视力异常。头晕，恶心，思维混乱，头痛最为常见。通过剂量调整和缓慢滴定，其副作用是可控，可逆的。有精神病史的病人不能用齐考诺肽治疗。对有精神缺陷、幻觉情绪改变的病人要严密监护。如果有精神问题发生，应当终止齐考诺肽治疗并改用精神药物治疗。
2004年美国食品及药物管理局批准其用于鞘内注射治疗，主要适用于其他治疗方法不能耐受或不能控制的严重慢性疼痛患者。在欧洲，齐考诺肽也被允许用于严重慢性疼痛患者的治疗。2007年，联合镇痛会议专门小组推荐齐考诺肽作为一线鞘内镇痛药物。
生物提取现受到现有有限生物资源的影响，提取过程较繁琐，效率低，且比较难得到高纯度的产物。低温自然成环反应属于热力学控制，环化过程慢，过程控制较复杂，反应收率低。
齐考诺肽的合成技术主要是液态合成法，很少有固相合成法的报道。其相关专利主要集中在药理和治疗方面，如US2007269528，US2006234936，LU91181。
2007年中国专利局公布一篇相关专利CN101412752A介绍了一种采用Fmoc策略固相合成齐考诺肽的方法[1]，合成路线如下：该方法以Fmoc-Rink Amide-MBHA树脂为固相载体，以HOBt和DIC为缩合剂，依次将侧链保护的氨基酸连到树脂上，得到含25个氨基酸的线性全保护肽树脂，其中形成二硫键的三组Cys分别由Trt、Acm、Mob保护，不同组Cys由不同的保护基保护，同组Cys由同一种保护基保护。将线性全保护肽树脂溶于1％的TFA/DCM溶液，室温反应20分钟脱去Trt保护基，过滤后加入水、乙腈、DMSO（体积比10:15:1），稀氨水调节pH至8，室温下搅拌反应4小时，得到齐考诺肽一环肽树脂。将得到的一环肽树脂中加入0.4mmol/ml的碘/甲醇溶液，室温反应2小时，洗涤过滤得到齐考诺肽二环肽树脂。将得到的二环肽树脂溶于三氟醋酸、三氟甲磺酸、硫代苯甲醚、乙二硫醇（体积比：80:8:8:4）混合溶液中，室温反应3小时，过滤沉淀后得到齐考诺肽二环肽粗品。将得到的二环肽粗品溶于水中，调pH至8，双氧水存在下室温反应一小时，得到齐考诺肽三环粗肽，HPLC制备纯化得到齐考诺肽。
整个合成过程反应流程如图1所示。
该方法的优势在于采用纯固相方法，操作比较简单。但是，在固相条件下完成前两个二硫键的氧化，重复难度很大；切割肽树脂时，容易导致两对二硫键的断裂和重排而使产物纯化复杂；最后一步双氧水作用的环化过程中肽浓度要求非常低，不适于商品化大规模生产，并且该过程很容易形成二聚物或多聚物。
2009年中国专利局公布一篇相关专利CN101709082A介绍了一种齐考诺肽的制备方法[2]，合成路线如下：该方法以氨基树脂为固相载体，在HATU/HOAt作用下首先与Fmoc-Cys(Acm)-OH缩合得到Fmoc-Cys(Acm)-氨基树脂。该树脂肽与Fmoc氨基酸在偶联剂作用下生成全保护的线性全保护肽，其中全部Cys侧链均用Acm保护。使用TFA、苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫醇(90:5:3:2)裂解肽树脂，得到Cys侧链含有Acm的齐考诺肽线性粗肽。将粗肽用TFA溶解，加入Tl(TFA)3反应脱除Acm保护基，然后DTT辅助自然氧化得到齐考诺肽，纯化，总收率在30％以上。
整个合成过程反应流程如图2所示。
该方法的优势在于合成步骤简便。但是，Cys的保护基全部选用Acm，同时脱除，同时形成三对二硫键，导致二硫键的连接准确率低，产率低，纯化困难。
2011年中国专利局公布一篇相关专利CN102268082A介绍了一种齐考诺肽的固相合成方法[3]，合成路线如下：该方法以Fmoc-氨基树脂为固相载体，以HOBt和HBTU为缩合剂，依次将侧链保护的氨基酸连到树脂上，得到含25个氨基酸的线性全保护肽树脂，其中形成二硫键的三组Cys分别由Trt、Acm、tBu保护，不同组Cys由不同的保护基保护，同组Cys由同一种保护基保护。将线性全保护肽树脂溶于三氟乙酸、苯甲硫醚、二巯基乙烷和苯甲醚（90:5:2.5:2.5），室温反应2小时脱去Trt保护基，得到Cys侧链含有Acm和tBu的线性粗肽。将该粗肽溶于乙酸溶液，加入10倍摩尔当量的I2，室温反应1小时，同时形成两对二硫键得到二环肽。将得到的二环肽溶于二甲基亚砜、苯甲醚和三氟乙酸(258:1.6:100000)混合溶液中，室温反应5小时，冻干得到齐考诺肽三环肽粗品，HPLC制备纯化得到齐考诺肽。
整个合成过程反应流程如图3所示。
该方法的优势在于简化了合成步骤。但是前两个二硫键同时形成，会形成三种二硫键连接方式不同的异构体，而这三种异构体因极性差异很小，导致很难在HPLC制备纯化中分开，导致最终得到的产物纯度低，杂质多。而且二甲基亚砜和苯甲醚氧化强度不大，形成三环肽的过程很难重复出来，且反应时间较长，易形成二聚体。
参考文献：
[1]路杨，李新宇。齐考诺肽的固相合成方法：中国，200710301598.8[P].2009-04-22。
[2]宓鹏程，李红玲，马亚平，袁建成。一种齐考诺肽的固相合成方法：中国，200910188686.0[P]。2010-05-19。
[3]董守良，李梅兴。一种齐考诺肽的固相合成方法：中国，201110139661.9[P]。2011-12-07。
发明内容
本发明提供了一种定向二硫键形成、高产率、纯化简便、反应条件温和、有利于实现工业化生产的固相齐考诺肽合成方法。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
一种齐考诺肽的固相合成方法，所述方法包括如下顺序步骤：
(1)以Fmoc-氨基树脂为固相载体，从C端到N端依次缩合反应连接25个侧链保护的氨基酸，得到25个氨基酸的线性全保护肽树脂，其中，形成二硫键的三组Cys(1-16,8-20,15-25)分别连接Trt、Acm或tBu保护基，同组的Cys连接相同保护基，不同组的Cys连接不同的保护基；
(2)将步骤(1)得到的线性全保护肽树脂进行线性切割，切割的同时脱去除Cys(Acm)和Cys(tBu)外的其它所有氨基酸的侧链保护基，得到含Cys(Acm)和Cys(tBu)的线性肽；
(3)氧化步骤(2)得到的线性肽形成第一对二硫键，得到单二硫环肽；
(4)脱除步骤(3)得到的单二硫环肽中Cys(Acm)的Acm保护基，同时环化形成第二对二硫键，得到双二硫环肽；
(5)脱除步骤(4)得到的双二硫环肽中Cys(tBu)的tBu保护基，同时环化形成第三对二硫键，得到三二硫环肽；
(6)步骤(5)得到的三二硫环肽经HPLC纯化、冻干得到齐考诺肽。
步骤(1)中，所述的氨基树脂为Rink Amide树脂、Rink Amide-MBHA树脂、RinkAmide-BHA树脂、Rink Amide-AM树脂、PAL树脂、Knorr树脂或Sieber树脂。
步骤(1)中，以Fmoc-氨基树脂为固相载体，从C端到N端依次缩合反应连接如下25个侧链保护的氨基酸：Fmoc-Cys(Acm)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Cys(tBu)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Thr-OH,Fmoc-Cys(Trt)-OH,Fmoc-Cys(Acm)-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Tyr(tBu)-OH,Fmoc-Met-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Arg(Pbf)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Cys(tBu)-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Cys(Trt)-OH，得到的25个氨基酸的线性全保护肽树脂如下：
NH2-Cys(Acm)-Lys(Boc)-Gly-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Cys(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Thr-Cys(Trt)-Cys(Acm)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Met-Leu-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Cys(tBu)-Lys(Boc)-Ala-Gly-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-NH-Rink Amide MBHA树脂。其中，Fmoc=芴甲氧羰基，Trt=三苯甲基，Acm=乙酰胺甲基，tBu=叔丁基，Pbf=2,2,4,6,7-五甲二氢苯并呋喃-5-磺酰基，Boc=叔丁基氧羰基。
步骤(1)中，从C端到N端依次缩合反应连接25个侧链保护的氨基酸，得到25个氨基酸的线性全保护肽树脂，方法为：按1:(4～8):(4～8)的摩尔比分别称取溶胀后的氨基树脂、Fmoc保护氨基酸、偶联剂，将Fmoc保护氨基酸和偶联剂溶于二甲基甲酰胺，预活化，然后加入溶胀后并已经脱除Fmoc保护基的氨基树脂，室温震荡反应0.5～3小时连接Fmoc保护氨基酸，连接下一个氨基酸前用哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱Fmoc保护基3次，时间分别为3～5分钟、3～5分钟、15～25分钟，每次连接一个氨基酸之后和脱除Fmoc保护基之后都需用二氯甲烷和二甲基甲酰胺交替洗涤3～10次，用量为5～10ml/g树脂；
其中，所述的偶联剂为DIC与组分A摩尔当量比为1：2的混合物，或组分A、组分B和组分C三者摩尔当量比为1:1:2的混合物，其中组分A为HOBt或HOAt，组分B为HBTU、HATU、TBTU或PyBOP，组分C为DIPEA或TMP。
步骤(2)中，将三氟乙酸、苯酚、水、TIS按照体积比88:5:5:2混合，或者，将三氟乙酸、茴香硫醚、乙二硫醇、苯甲醚按照体积比90:5:3:2混合，将上述两种混合液中的任意一种加入到步骤(1)得到的线性全保护肽树脂中，震荡反应1～2小时后，将反应液逐滴滴入冰乙醚中，沉淀，离心，倒掉上清，收集沉淀物，反复洗涤5～8次，得到含Cys(Acm)和Cys(tBu)的线性肽。
步骤(3)中，环化反应条件为：将步骤(2)得到的线性肽溶于乙酸水溶液，碳酸胺调节pH值至6，加入体积百分含量为20%的DMSO（即DMSO体积占整个反应体系的20%），室温下搅拌反应2小时，反应结束，加入两倍体积的三氟乙酸、乙腈与水的混合液终止反应，冻干溶液，得到单二硫环肽；其中，三氟乙酸、乙腈与水的混合液中，三氟乙酸的体积百分含量为0.05%，乙腈的体积百分含量为5%。
步骤(4)中，将步骤(3)得到单二硫环肽溶于乙酸水溶液中（乙酸与水的重量比为4：1）(c=0.5～1umol/ml)，加入10～15倍摩尔量的I2单质，室温搅拌反应1～2小时，反应完成后，加入2倍体积的四氯化碳和水按照体积比1:1的混合物终止反应，静置分层，收集水相，用四氯化碳反复洗涤5～6次，然后反萃取2～3次，收集水相，冻干溶液，得到双二硫环肽。
步骤(5)中，将步骤(4)得到的双二硫环肽溶于三氟乙酸中（约1umol/ml），依次加入10倍摩尔当量的二苯基亚砜，150倍摩尔当量的三氯甲基硅烷，100倍摩尔当量的苯甲醚，室温搅拌反应15分钟，将溶液逐滴滴入冰乙醚中，静置，离心，倒掉上清，收集沉淀物，乙醚重复洗涤2～3遍，风干，得到三二硫环肽。
步骤(6)中，得到的三二硫环肽粗品还要经C18反相高效液相色谱柱纯化，冻干得到齐考诺肽。
所合成的齐考诺肽具有如下结构：
其25个氨基酸的序列为：
Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys，肽链中二硫键的连接模式为Cys1-Cys16,Cys8-Cys20,Cys15-Cys25。分子式：C102H72N36O32S7，分子量：2639.13。
以下是本发明的固相合成法流程示意：
本发明针对含多对二硫键多肽的特点，结合半胱氨酸侧链巯基的化学反应特性，巧妙地选用了Trt、Acm、tBu三种不同保护强度的巯基保护基，实现依交脱除，依次成环，使二硫键能够准确定位，提高了环化速度，反应效率，产品纯度，得到较满意的收率。所接入的其他保护基氨基酸，也可根据具体实施过程尝试设计。本发明工艺具有反应操作简便、后处理容易、成本低、收率高等特点，具有可观的经济实用价值，同时在多肽药物设计合成领域具有广泛的应用前景。
相比专利CN101412752A，本发明二硫键的连接更加简单且定向，大大降低了形成二聚物或多聚物的可能性，产物较单一，易于纯化。相比专利CN101709082，本发明采用分步脱保护形成二硫键的方法，二硫键形成更有序，产品更易于制备纯化。
相比专利CN102268082A，本发明中双二硫环肽不需要纯化即可进行最后一步关环反应，简化了步骤，且本发明中合成双二硫环肽两步反应的总产率高于专利CN102268082A中一步反应的产率；最重要的是，本发明中HPLC纯化过程更加有效，使得到的产物纯度更高。
附图说明
图1为背景技术中专利CN101412752A的合成路线流程图。
图2为背景技术中专利CN101709082A的合成路线流程图。
图3为背景技术中专利CN102268082A的合成路线流程图。
图4为本发明的合成路线流程图。
具体实施方式
下面给出实施例以对本发明进行具体描述，以便更好理解。但实施例只是对本发明进行进一步描述，应当声明本发明的保护范围不仅限于此，该领域的技术熟练人员根据本发明内容对本发明做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
说明书或权利要求书中所使用的缩写含义列于下表：
| DMF | N,N-二甲基甲酰胺 |
| DCM | 二氯甲烷 |
| Piperidine | 哌啶 |
| HOBT | 1-羟基苯并三唑 |
| DMSO | 二甲基亚砜 |
| HBTU | 苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐 |
| DIEA | N,N-二异丙基乙胺 |
| Methanol | 甲醇 |
| Ether | 乙醚 |
| TFA | 三氟乙酸 |
| Phenol | 苯酚 |
| TIS | 三异丙基硅烷 |
| Iodine | 碘 |
| Ph(SO)Ph | 二苯基亚砜 |
| CH3SiCl3 | 三氯甲基硅烷 |
| Anisole | 苯甲醚 |
| CCl4 | 四氯化碳 |
| AcOH | 乙酸 |
| HOAT | N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑 |
| TBTU | O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯 |
| HATU | 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯 |
| DIC | N,N′-二异丙基碳二亚胺 |
| TMP | 磷酸三甲酯 |
| PyBOP | 六氟磷酸苯并三唑–1-基-氧基三吡咯烷基 |
| Thioanisole | 苯甲硫醚 |
| EDT | 乙二硫醇 |
实施例1：齐考诺肽线性全保护肽树脂的制备。
(1)树脂溶胀：称取Fmoc-Rink Amide-MBHA树脂0.5g(SD=0.5mmol/g，0.25mmol)，加入到放有筛板的20ml BD注射器中，用二甲基甲酰氨和二氯甲烷交替洗涤各2次，5ml/次，3分钟/次，抽干。加入两倍树脂体积的二氯甲烷，640r/min振荡约2小时，抽滤除去二氯甲烷。然后加入二甲基甲酰氨清洗树脂3次，5ml/次，3分钟/次，抽干。
(2)脱除Fmoc保护基：向反应器中加入20%的哌啶/DMF(v/v)溶液5ml，室温搅拌反应5分钟，抽干。重复两次，分别为5分钟、15分钟。茚三酮法检测Fmoc脱除结果。然后用二甲基甲酰氨和二氯甲烷交替洗涤各3次，5ml/次，3分钟/次，抽干。
(3)氨基酸预活化：在圆底烧瓶(10ml)中加入将1mmol的Fmoc保护基氨基酸、1mmol HOBT、1mmol HBTU，用最少量的DMF超声溶解，预活化5分钟。
(4)氨基酸连接：树脂用二甲基甲酰氨洗涤3次，5ml/次，3分钟/次，抽干。然后将已活化的保护氨基酸溶液倒入反应器中，快速逐滴加入2mmol DIPEA，补加适量的二甲基甲酰氨溶液，以保证树脂在反应器中充分悬浮。640r/min室温震荡反应1～3小时，抽干。每一种氨基酸、缩合剂的用量及具体反应时间见表1。树脂用二甲基甲酰氨和二氯甲烷交替洗涤各3次，5ml/次，3分钟/次，抽干。茚三酮法检测氨基酸连接是否完全。
(5)第一个氨基酸缩合完成后，重复步骤(2)～(4)，按照氨基酸顺序延长肽链至25个氨基酸偶联完毕。
(6)树脂肽用甲醇和二氯甲烷交替洗涤各3次，5ml/次，3分钟/次，抽干。干燥后得齐考诺肽线性全保护肽树脂1.2g，粗产率98%。
表1氨基酸、缩合剂的用量及反应时间
实施例2：齐考诺肽线性全保护肽树脂的切割。
(1)将实施例1得到的线性全保护肽树脂加入到50ml圆底烧瓶中，配置切割剂1（将三氟乙酸、苯酚、水、TIS按照体积比88:5:5:2混合）或切割剂2（将三氟乙酸、茴香硫醚、乙二硫醇、苯甲醚按照体积比90:5:3:2混合），将12ml(10ml/g)切割剂加入到圆底烧瓶中，720r/min震荡反应2小时。
(2)切割反应完成以后，将切割液滴入10倍体积的冰乙醚(-20℃)中，再向反应器中补加2～3ml切割剂1或2清洗树脂，滴入冰乙醚，出现大量的肽沉淀，静置沉降半小时。4℃8000r/min离心15min。弃上清，重新加入冰乙醚，震荡超声溶解，配平，低温离心，重复以上操作三次。最终将所得粗肽产品置于通风橱中，使溶剂挥发至粗肽呈粉末状。得到Cys侧链含有Acm和tBu的线性粗肽1.1g，粗产率92%。
实施例3：齐考诺肽单二硫环粗肽的制备。
(1)将实施例2得到的线性肽30mg加入到100ml圆底烧瓶中，加入60ml5%的乙酸水溶液中溶解至浓度0.5mg/ml，用碳酸胺饱和水溶液调节pH至6，加入15mlDMSO，640r/min室温震荡反应2小时。
(2)反应结束，加入150ml0.05%三氟乙酸-5%乙腈溶液终止反应。冻干溶液，得到齐考诺肽单二硫环粗肽28.5mg，粗产率95%。
实施例4：齐考诺肽双二硫环粗肽的制备。
(1)将实施例3得到的单二硫环肽26mg加入到50ml圆底烧瓶中，加入13ml醋酸：水=4：1的溶液溶解至浓度2mg/ml，加入12.5倍摩尔当量的I2单质（约29mg，用醋酸溶液溶解），640r/min室温震荡反应1小时。
(2)反应结束，加入26ml水终止反应，随后加入26ml四氯化碳萃取碘单质。静置待溶液分层，弃掉四氯化碳相，水相用四氯化碳重复洗涤5次。收集水相，冻干得到齐考诺肽双二硫环粗肽25.5mg，粗产率98%。
实施例5：齐考诺肽三二硫环粗肽的制备。
(1)将实施例4得到的双二硫环肽21mg加入到50ml圆底烧瓶中，加入7ml TFA溶解至浓度3mg/ml，依次加入10倍摩尔当量的二苯基亚砜(15.5mg)、150倍摩尔当量的三氯甲基硅烷(126ml)、100倍摩尔当量的苯甲醚(83ml)，640r/min室温震荡反应15分钟。
(2)反应结束，将反应滴入10倍体积的冰乙醚(-20℃)中，静置沉降半小时，配平，4℃8000r/min离心15min。弃上清，重新加入冰乙醚，震荡超声溶解，配平，低温离心，重复以上操作三次。最终将所得粗肽产品置于通风橱中，使溶剂挥发至粗肽呈粉末状。得到齐考诺肽三二硫环粗肽20.5mg，粗产率98%。
实施例6：齐考诺肽粗制品的HPLC制备纯化。
装置：C18反相高效液相色谱制备柱，20×250mm；
洗脱液A：0.1%(v/v)TFA/H2O；
洗脱液D：0.1%(v/v)TFA/乙腈
流速：8ml/min
紫外检测波长：220nm和254nm
洗脱梯度：
| 时间 | 洗脱液A/% | 洗脱液D/% |
| 0 | 5 | 95 |
| 5 | 5 | 95 |
| 10 | 40 | 60 |
| 80 | 75 | 25 |
| 90 | 95 | 5 |
操作：
(1)齐考诺肽三二硫环粗肽的水溶液超声溶解，离心，取上清。
(2)上清液直接上样。
(3)乙腈-水流动相梯度洗脱
(4)收集目的肽洗脱液。
(5)冷冻干燥。
得齐考诺肽白色固体纯肽32.5mg。
产物经ESI-MS质谱确认，总收率44%。
Claims (8)
1.一种齐考诺肽的固相合成方法，其特征在于，所述方法包括如下顺序步骤：
(1)以Fmoc-氨基树脂为固相载体，从C端到N端依次缩合反应连接25个侧链保护的氨基酸，得到25个氨基酸的线性全保护肽树脂，其中，形成二硫键的三组Cys分别连接Trt、Acm或tBu保护基，同组的Cys连接相同保护基，不同组的Cys连接不同的保护基；
(2)将步骤(1)得到的线性全保护肽树脂进行线性切割，切割的同时脱去除Cys(Acm)和Cys(tBu)外的其它所有氨基酸的侧链保护基，得到含Cys(Acm)和Cys(tBu)的线性肽；
(3)氧化步骤(2)得到的线性肽形成第一对二硫键，得到单二硫环肽；
(4)脱除步骤(3)得到的单二硫环肽中Cys(Acm)的Acm保护基，同时环化形成第二对二硫键，得到双二硫环肽；
(5)脱除步骤(4)得到的双二硫环肽中Cys(tBu)的tBu保护基，同时环化形成第三对二硫键，得到三二硫环肽；
(6)步骤(5)得到的三二硫环肽经HPLC纯化、冻干得到齐考诺肽。
2.根据权利要求1所述的齐考诺肽的固相合成方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的氨基树脂为Rink Amide树脂、Rink Amide-MBHA树脂、Rink Amide-BHA树脂、RinkAmide-AM树脂、PAL树脂、Knorr树脂或Sieber树脂。
3.根据权利要求1所述的齐考诺肽的固相合成方法，其特征在于，步骤(1)中，以Fmoc-氨基树脂为固相载体，从C端到N端依次缩合反应连接如下25个侧链保护的氨基酸：Fmoc-Cys(Acm)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Cys(tBu)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Thr-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Cys(Acm)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Met-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Cys(tBu)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，得到的25个氨基酸的线性全保护肽树脂如下：
NH2-Cys(Acm)-Lys(Boc)-Gly-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Cys(tBu)-Ser(tBu)-Gly–Thr-Cys(Trt)-Cys(Acm)-Asp(OtBu)-Tyr(tBu)-Met-Leu-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Cys(tBu)-Lys(Boc)-Ala-Gly-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-NH-Rink Amide MBHA树脂。
4.根据权利要求1或2或3所述的齐考诺肽的固相合成方法，其特征在于，步骤(1)中，从C端到N端依次缩合反应连接25个侧链保护的氨基酸，得到25个氨基酸的线性全保护肽树脂，方法为：按1∶(4～8)∶(4～8)的摩尔比分别称取溶胀后的氨基树脂、Fmoc保护氨基酸、偶联剂，将Fmoc保护氨基酸和偶联剂溶于二甲基甲酰胺，预活化，然后加入溶胀后并已经脱除Fmoc保护基的氨基树脂，室温震荡反应0.5～3小时连接Fmoc保护氨基酸，连接下一个氨基酸前用哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱Fmoc保护基3次，时间分别为3～5分钟、3～5分钟、15～25分钟，每次连接一个氨基酸之后和脱除Fmoc保护基之后都需用二氯甲烷和二甲基甲酰胺交替洗涤3～10次，用量为5～10ml/g树脂；
其中，所述的偶联剂为DIC与组分A摩尔当量比为1：2的混合物，或组分A、组分B和组分C三者摩尔当量比为1:1:2的混合物，其中组分A为HOBt或HOAt，组分B为HBTU、HATU、TBTU或PyBOP，组分C为DIPEA或TMP。
5.根据权利要求1所述的齐考诺肽的固相合成方法，其特征在于，步骤(2)中，将三氟乙酸、苯酚、水、TIS按照体积比88:5:5:2混合，或者，将三氟乙酸、茴香硫醚、乙二硫醇、苯甲醚按照体积比90:5:3:2混合，将上述两种混合液中的任意一种加入到步骤(1)得到的线性全保护肽树脂中，震荡反应1～2小时后，将反应液逐滴滴入冰乙醚中，沉淀，离心，倒掉上清，收集沉淀物，反复洗涤5～8次，得到含Cys(Acm)和Cys(tBu)的线性肽。
6.根据权利要求1所述的齐考诺肽的固相合成方法，其特征在于，步骤(3)中，将步骤(2)得到的线性肽溶于乙酸水溶液，碳酸胺调节pH值至6，加入体积百分含量为20%的DMSO，室温下搅拌反应2小时，反应结束，加入两倍体积的三氟乙酸、乙腈与水的混合液终止反应，冻干溶液，得到单二硫环肽；其中，三氟乙酸、乙腈与水的混合液中，三氟乙酸的体积百分含量为0.05%，乙腈的体积百分含量为5%。
7.根据权利要求1所述的齐考诺肽的固相合成方法，其特征在于，步骤(4)中，将步骤(3)得到单二硫环肽溶于乙酸水溶液中，加入10～15倍摩尔当量的I2单质，室温搅拌反应1～2小时，反应完全后，加入2倍体积的四氯化碳和水按照体积比1:1的混合物终止反应，静置分层，收集水相，用四氯化碳反复洗涤5～6次，然后反萃取2～3次，收集水相，冻干溶液，得到双二硫环肽。
8.根据权利要求1所述的齐考诺肽的固相合成方法，其特征在于，步骤(5)中，将步骤(4)得到的双二硫环肽溶于三氟乙酸中，依次加入10倍摩尔当量的二苯基亚砜，150倍摩尔当量的三氯甲基硅烷，100倍摩尔当量的苯甲醚，室温搅拌反应15分钟，将溶液逐滴滴入冰乙醚中，静置，离心，倒掉上清，收集沉淀物，乙醚重复洗涤2～3遍，风干，得到三二硫环肽。
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