CN103554226A - 一种α-芋螺毒素MI的全固相合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种α-芋螺毒素MI的全固相合成方法，包括以下步骤：按照固相合成的方法，Fmoc氨基树脂在Fmoc脱保护试剂作用下反应脱去Fmoc后，在偶联体系作用下于偶联溶剂中从C端到N端依次依肽序依次连接Fmoc氨基酸，合成十四肽氨基树脂，在氧化体系的作用下，十四肽氨基树脂脱除保护基；产物在脱除N端保护基后，在裂解体系作用下裂解脱除侧链保护基，即得α-芋螺毒素MI。该方法以氨基树脂为原料，根据固相合成的方法依次偶联氨基酸合成保护的十四肽树脂，并根据不同保护基用碘脱除时间不一样，通过一步即可选择性生成两对二硫键；操作简单、耗时短、后处理简单、副产物少、产率高、污染小，适合大规模工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于多肽药物合成技术领域，特别涉及一种含多对二硫键的芋螺毒素MI的全固相合成方法。
背景技术
芋螺毒素是从热带海洋软体动物芋螺中得到的一类具有生物活性的多肽毒素，能特异性地作用于动物体内各种离子通道及受体，已在神经科学研究领域和新药研制方面受到了前所未有的广泛关注。芋螺毒素包括O-、M-、A-、S-、T-、P-、Y-等多个超家族，其中A超家族的α-芋螺毒素是芋螺毒素家族中的一类重要成员，能特异地作用于乙酰胆碱受体（nAChRs）各种亚型，对疼痛、成瘾、抑郁症、帕金森氏病、肌肉松弛等具有潜在的药用价值。α-芋螺毒素的作用靶点为神经肌肉接头的N乙酰胆碱受体（nAChRs），表现出对动物的麻痹和致死作用，乙酰胆碱受体（nAChRs）属于配门控通道，对诸如学习和记忆等神经生理过程起着至关重要的作用；对于阿尔茨海默病、帕金森症以及精神分裂、癫痫、肌无力等病症的病理生理研究和治疗，AChRs的意义则更为重要。通过对与nAChRs的不同亚型专一性结合的配体的研究，将为新药的研发提供十分有意义的线索。另外，α-芋螺毒素能结合并阻断小细胞肺癌细胞表面的nAChR，在小细胞肺癌的诊断和治疗中也有潜在的应用价值。
α-芋螺毒素结构中肽链（Cys残基排列方式-CC-C-C-）短小，半胱氨酸含量高，多数有两对二硫键，少数有三对二硫键，除SⅡ型α-芋螺毒素外，C端均是酰胺化的。二硫键的正确形成对α-芋螺毒素的毒性至关重要。
α-芋螺毒素MI是从幻芋螺毒液中提取出的一种小肽，长度为14个氨基酸，二硫键结构模式为C3-C8；C4-C14（氨基酸序列式如下所示），作为一种阻断剂，能特异性地与哺乳动物肌肉型nAChRs的α1δ亚基结合。α-芋螺毒素MI的结构如下：
专利CN102875653A报到了固相合成线性肽，然后再在液相中成环的方法。该方法先用固相合成仪合成了芋螺毒素的线性肽，切除固相上全保护的线性肽，再将得到的产物进行氧化折叠。并且该方法中，4个半胱氨酸的巯基全部都是用Trt保护，在氧化折叠过程中使该方法不具备选择性形成两对二硫键，难以合成正确结构的α-芋螺毒素。
专利CN102875654A报到了芋螺毒素多肽Eb1.6的制备方法。其方法同样也是先在固相上合成线性肽，再在缓冲液中氧化折叠形成芋螺毒素多肽Eb1.6。同样，该方法中的4个半胱氨酸的巯基也都是用Trt保护，在氧化折叠过程中使该方法不具备选择性形成两对二硫键，难以合成正确结构的芋螺毒素多肽Eb1.6。液相中成环需要高度稀释以防止分子间的二硫键的形成，因此增加后处理的难度，降低生产效率，无法满足大规模的工业化生产要求。
发明内容
发明目的：本发明的目的在于提供一种含多对二硫键的芋螺毒素MI的固相合成方法。
技术方案：本发明提供的一种α-芋螺毒素MI的全固相合成方法，包括以下步骤：（1）按照固相合成的方法，Fmoc氨基树脂在Fmoc脱保护试剂作用下反应脱去Fmoc后，在偶联体系作用下于偶联溶剂中从C端到N端依次依肽序依次连接Fmoc氨基酸，合成十四肽氨基树脂，所述十四肽树脂为PG-Gly-Arg-Cys(X2)-Cys(X1)-His-Pro-Ala-Cys(X2)-Gly-Lys-Asn-Tyr-Ser-Cys(X1)-氨基树脂，或为PG-Gly-Arg-Cys(X1)-Cys(X2)-His-Pro-Ala-Cys(X1)-Gly-Lys-Asn-Tyr-Ser-Cys(X2)-氨基树脂；其中，PG为Fmoc或Boc，X1为Trt或Mmt，X2为Acm；
（2）在氧化体系的作用下，十四肽氨基树脂反应脱除X1和X2；
（3）步骤（2）产物在脱除N端保护基后，在裂解体系作用下裂解脱除侧链保护基，即得α-芋螺毒素MI。
上述α-芋螺毒素MI的α-芋螺毒素MI的全固相合成方法流程如下：（其中，第3位和第8位Cys上的保护基为X2，第4位和第14位的Cys上的保护基X1，X1=Trt或Mmt，X2=Acm）：
值得说明的是，Cys保护基可以互换，如第4位和第14位Cys上的保护基为X2，第3位和第8位的Cys上的保护基X1，只要是第3位和第8位半胱氨酸上保护基相同、第4位和第14位半胱氨酸上保护基相同均可以实现本发明的目的。
步骤（2）产物脱除N端保护基方法为本领域公知常识。
步骤（1）中，所述Fmoc氨基树脂为Rink Amide树脂、Rink Amide AM树脂、RinkAmide MBHA树脂、Rink Amide PEGA树脂或PAL树脂。
步骤（1）中，Fmoc脱保护试剂为哌啶，脱保护反应温度为10-30℃，反应时间为5-60min。
步骤（1）中，偶联溶剂选自DCM、DMF和NMP中的任意一个或一个以上的组合；偶联体系选自HOBt、HOAt、HOOBt和Cl-HOBt中的任意一个或多个与DIC的组合，或选自HOBt、HOAt、HOOBt和Cl-HOBt中的任意一个或多个、DPIEA或NMM中的任意一个或两个以及HBTU、HATU、PyBOP和PyAOP中的任意一个或多个的组合；偶联溶剂与Fmoc脱保护试剂的体积比为（1-5）:1。
步骤（2）中，所述氧化体系为碘的混合溶剂溶液，其中混合溶剂为体积比为（1-8）:1的二氧六环和甲醇的混合溶液，或为体积比为（1-8）:1的二氯甲烷和甲醇的混合溶液，或为体积比为（1-8）:1的2,2,2-三氟乙醇和二氯甲烷的混合溶液，或为体积比为（1-8）:49的N-甲基吡咯烷酮和苯甲醚的混合溶液，或为体积比为（1-8）:1的2,2,2-三氟乙醇和氯仿的混合溶液，或为体积比为（1-8）:1的六氟异丙醇和氯仿的混合溶液；其中，碘和十四肽氨基树脂的摩尔比为（5-20）：1；反应温度为室温，反应时间为1-3h。
步骤（3）中，裂解体系为体积比为(80-96)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)的TFA、苯甲硫醚、三异丙基硅烷、苯甲醚和水；反应温度为室温，反应时间为1-4h。
有益效果：本发明提供的α-芋螺毒素MI的全固相合成方法以氨基树脂为原料，根据固相合成的方法依次偶联氨基酸合成保护的十四肽树脂，并根据不同保护基用碘脱除时间不一样，通过一步即可选择性生成两对二硫键；操作简单、耗时短、后处理简单、副产物少、产率高、污染小，适合大规模工业化生产。
附图说明
图1为本发明方法制得的α-芋螺毒素MI线性肽粗品HPLC图谱；
图2为本发明方法制得的α-芋螺毒素MI线性肽粗品MS图谱；
图3为本发明方法制得的α-芋螺毒素MI HPLC分析图谱；
图4为本发明方法制得的α-芋螺毒素MI MS图谱。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
试剂名称缩写
DMF：N，N’-二甲基甲酰胺
NMP：N-甲基吡咯烷酮
DIC：N，N’-二异丙基碳二亚胺
TFA：三氟乙酸
DCM：二氯甲烷
TIS：三异丙基硅烷
DIPEA：N，N’-二异丙基乙胺
HOBt：1-羟基苯并三唑
HOAt：N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑
Cl-HOBt：6-氯-1-羟基苯并三氮唑
HBTU：苯并三氮唑-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸盐
HATU：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯
PyBOP：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷
PyAOP：(3H-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基鏻六氟磷酸盐氨基酸缩写所代表的的基团如下：
实施例1
Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-Cys(Acm)-Cys(Trt)-His(Trt)-Pro-Ala-Cys(Acm)-Gly-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-氨基树脂的制备与分析
（1）氨基树脂脱保护
称取1g取代度为0.6mmol/g的Rink Amide树脂于固相反应器中，加入5mL DCM溶胀20min，随后加入5mL体积百分数为20%哌啶的DMF溶液，30℃反应5min，DMF洗涤一次，加入5mL体积百分数为20%的哌啶的DMF溶液，30℃反应15min；即得脱保护的氨基树脂；
（2）H-Cys(Trt)-氨基树脂的制备
步骤（1）反应后的固相反应器中加入Fmoc-Cys(Trt)-OH(1mmol)、HOBt(1.2mmol)、DIC(1.2mmol)、DMF（10mL），20℃反应1h，洗涤、抽干，即得Fmoc-Cys(Trt)-树脂；向Fmoc-Cys(Trt)-树脂中加入封闭试剂5mL（所述封闭试剂为醋酸酐：DIPEA：DMF=1mmol:1mmol:8ml）反应1h封闭剩余的氨基，分别用DCM、MeOH与DMF洗涤多次，抽干；加入20%PIP/DMF溶液反应20min脱除Fmoc保护基，分别用DCM、MeOH与DMF洗涤多次，抽干，即得H-Cys(Trt)-氨基树脂；
（3）Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-Cys(Acm)-Cys(Trt)-His(Trt)-Pro-Ala-Cys(Acm)-Gly-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-氨基树脂的制备
将步骤（2）制得的H-Cys(Trt)-氨基树脂置于固相反应器中，加入氨基酸Fmoc-Ser(tBu)-OH（1mmol）、HOBt（1.2mmol）、DPIEA（3.6mmol）、HBTU（1.2mmol）与DMF（10mL）20℃反应2h；偶联完成度可以使用Kaiser测试检测；检测通过后，加入10mL20%哌啶的DMF溶液，反应5min，DMF洗涤一次，加入10mL20%的哌啶的DMF溶液，反应15min，抽干；
以此步骤（3）方法依次偶联剩余的氨基酸，在偶联过程中，偶联溶剂选自DCM、DMF和NMP中的任意一个或一个以上的组合；偶联体系选自HOBt、HOAt、HOOBt和Cl-HOBt中的任意一个或多个与DIC的组合，或选自HOBt、HOAt、HOOBt和Cl-HOBt中的任意一个或多个、DPIEA或NMM中的任意一个或两个以及HBTU、HATU、PyBOP和PyAOP中的任意一个或多个的组合；即得十四肽氨基树脂2.95g。
氨基酸用量见表1。
表1氨基酸用量
| 序列 | 氨基酸名称 | 用量 |
| 1 | Fmoc-Gly-OH | 0.297g |
| 2 | Fmoc-Arg(Pbf)-OH | 0.648g |
| 3 | Fmoc-Cys(Acm)-OH | 0.414g |
| 4 | Fmoc-Cys(Trt)-OH | 0.585g |
| 5 | Fmoc-His(Trt)-OH | 0.619g |
| 6 | Fmoc-Pro-OH | 0.337g |
| 7 | Fmoc-Ala-OH | 0.311g |
| 8 | Fmoc-Cys(Acm)-OH | 0.414g |
| 9 | Fmoc-Gly-OH | 0.297g |
| 10 | Fmoc-Lys(Boc)-OH | 0.353g |
| 11 | Fmoc-Asn(Trt)-OH | 0.596g |
| 12 | Fmoc-Tyr(tBu)-OH | 0.459g |
| 13 | Fmoc-Ser(tBu)-OH | 0.383g |
| 14 | Fmoc-Cys(Trt)-OH | 0.585g |
（4）α-芋螺毒素MI线性粗肽的分析
称取0.5g实施例1步骤（2）制得的十四肽氨基树脂于固相反应器中，加入5mL DCM溶胀10min，抽干。随后加入20%PIP/DMF溶液反应20min脱除Fmoc保护基，分别用DCM、MeOH与DMF洗涤多次，抽干。配置裂解液5mL，裂解液各组分体积比为TFA：苯甲硫醚：TIS：苯甲醚：水=90：2.5：2.5：2.5：2.5。冰浴冷却，向其中加入侧链全保护的α-芋螺毒素MI线性肽树脂，15℃震荡反应3h；滤除树脂，将所得滤液缓慢滴加至50mL冰乙醚中，沉淀，离心后收集白色沉淀，真空干燥，得0.256gα-芋螺毒素MI线性肽粗品。
HPLC图谱见图1，MS图谱见图2。
实施例2
称取2g实施例1步骤（3）制得的十四肽氨基树脂置于固相反应器中，加入10mLDCM溶胀10min，抽干；将2.6g碘溶于20mL Dioxane/MeOH（Dioxane和MeOH体积比为8:1）混合溶液中后，加入固相反应器中；室温震荡反应1h后，用DMF、无水甲醇各洗涤3次，抽干，得产物1.72g。
（2）α-芋螺毒素MI粗肽的制备
将步骤（2）中得到的产物加入10mL20%哌啶的DMF溶液，反应5min，DMF洗涤一次，加入10mL20%的哌啶的DMF溶液，反应15min，抽干；分别用DMF洗涤2次，无水甲醇洗涤3次，抽干；配置裂解液15mL，其各组分体积比为TFA：苯甲硫醚：TIS：苯甲醚：水=90：2.5：2.5：2.5：2.5；将裂解液加入固相反应器中，与脱除了N端保护基的步骤（2）产物在室温震荡反应3h后，将反应液注入乙醚中，沉淀，离心后收集白色沉淀，放入真空干燥器中干燥，即得0.67gα-芋螺毒素MI粗品。
（3）α-芋螺毒素MI粗品纯化
具体方法为：装置：C18制备柱（20×250mm）
洗脱液A：0.1%（v/v）TFA/H2O
洗脱液B：乙腈
流速：12mL/min
紫外检测波长：215nm
操作：（1）将α-芋螺毒素MI粗品的水溶液用0.45μm微孔滤膜过滤；
（2）滤液直接进样；
（3）13-23%（v/v）乙腈-水流动相梯度洗脱；
（4）收集目的肽；
（5）浓缩，冷冻干燥；
（6）得α-芋螺毒素MI白色固体0.59g。
产物经HPLC分析（图3）和MS确认（图4）。
实施例3
Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-Cys(Acm)-Cys(Mmt)-His(Trt)-Pro-Ala-Cys(Acm)-Gly-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Mmt)-氨基树脂的制备与分析
（1）氨基树脂脱保护
称取1g取代度为0.6mmol/g的Rink Amide AM树脂于固相反应器中，加入5mL DCM溶胀20min，随后加入5mL体积百分数为20%哌啶的DMF溶液，10℃反应40min，DMF洗涤一次，加入5mL体积百分数为20%的哌啶的DMF溶液，10℃反应20min；即得脱保护的氨基树脂；
（2）H-Cys(Mmt)-氨基树脂的制备
步骤（1）反应后的固相反应器中加入Fmoc-Cys(Mmt)-OH(1mmol)、HOBt(1.2mmol)、DIC(1.2mmol)、DMF（10mL），20℃反应1h，洗涤、抽干，即得Fmoc-Cys(Mmt)-树脂；向Fmoc-Cys(Mmt)-树脂中加入封闭试剂5mL（所述封闭试剂为醋酸酐：DIPEA：DMF=1mmol:1mmol:8ml）反应1h封闭剩余的氨基，分别用DCM、MeOH与DMF洗涤多次，抽干；加入20%PIP/DMF溶液反应20min脱除Fmoc保护基，分别用DCM、MeOH与DMF洗涤多次，抽干，即得H-Cys(Mmt)-氨基树脂。
（3）Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-Cys(Acm)-Cys(Mmt)-His(Trt)-Pro-Ala-Cys(Acm)-Gly-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Mmt)-氨基树脂的制备
将步骤（2）制得的H-Cys(Mmt)-树脂于固相反应器中，加入氨基酸Fmoc-Ser(tBu)-OH（1mmol）、HOBt（1.2mmol）、DPIEA（3.6mmol）、HBTU（1.2mmol）与DMF（5mL）20℃反应2h；偶联完成度可以使用Kaiser测试检测；检测通过后，加入5mL20%哌啶的DMF溶液，反应5min，DMF洗涤一次，加入5mL20%的哌啶的DMF溶液，反应15min。抽干。
以此步骤（3）方法依次偶联剩余的氨基酸，在偶联过程中，偶联溶剂选自DCM、DMF和NMP中的任意一个或一个以上的组合；偶联体系选自HOBt、HOAt、HOOBt和Cl-HOBt中的任意一个或多个与DIC的组合，或选自HOBt、HOAt、HOOBt和Cl-HOBt中的任意一个或多个、DPIEA或NMM中的任意一个或两个以及HBTU、HATU、PyBOP和PyAOP中的任意一个或多个的组合；即得十四肽氨基树脂3.05g。
氨基酸用量见表2。
表2氨基酸用量
| 序列 | 氨基酸名称 | 用量 |
| 1 | Fmoc-Gly-OH | 0.297g |
| 2 | Fmoc-Arg(Pbf)-OH | 0.648g |
| 3 | Fmoc-Cys(Acm)-OH | 0.414g |
| 4 | Fmoc-Cys(Mmt)-OH | 0.615g |
| 5 | Fmoc-His(Trt)-OH | 0.619g |
| 6 | Fmoc-Pro-OH | 0.337g |
| 7 | Fmoc-Ala-OH | 0.311g |
| 8 | Fmoc-Cys(Acm)-OH | 0.414g |
| 9 | Fmoc-Gly-OH | 0.297g |
| 10 | Fmoc-Lys(Boc)-OH | 0.353g |
| 11 | Fmoc-Asn(Trt)-OH | 0.596g |
| 12 | Fmoc-Tyr(tBu)-OH | 0.459g |
| 13 | Fmoc-Ser(tBu)-OH | 0.383g |
| 14 | Fmoc-Cys(Mmt)-OH | 0.615g |
（4）α-芋螺毒素MI线性粗肽的分析
称取0.5g实施例3步骤（2）制得的十四肽氨基树脂于固相反应器中，加入5mL DCM溶胀10min，抽干。随后加入20%PIP/DMF溶液反应20min脱除Fmoc保护基，分别用DCM、MeOH与DMF洗涤多次，抽干。配置裂解液5mL，其各组分体积比为TFA：苯甲硫醚：TIS：苯甲醚：水=90：2.5：2.5：2.5：2.5。冰浴冷却，向其中加入侧链全保护的α-芋螺毒素MI线性肽树脂，15℃震荡反应3h；滤除树脂，将所得滤液缓慢滴加至50mL冰乙醚中，沉淀，离心后收集白色沉淀，真空干燥，得0.256gα-芋螺毒素MI线性肽粗品。产物经HPLC分析和MS确认。
实施例4
氨基树脂的制备
称取2g实施例3步骤（1）制得的十四肽氨基树脂置于固相反应器中，加入10mLDCM溶胀10min，抽干；将2.6g碘溶于20mL Dioxane/MeOH（Dioxane和MeOH体积比为1:1）混合溶液中，加入固相反应器中；室温震荡反应3h后，用DMF、无水甲醇各洗涤3次，抽干，得产物1.65g。
（2）α-芋螺毒素MI粗肽的制备
将步骤（2）中得到的产物加入10mL20%哌啶的DMF溶液，反应5min，DMF洗涤一次，加入10mL20%的哌啶的DMF溶液，反应15min，抽干；分别用DMF洗涤2次，无水甲醇洗涤3次，抽干；配置裂解液15mL，其各组分体积比为TFA：苯甲硫醚：TIS：苯甲醚：水=80：5：1：1：5；将裂解液加入固相反应器中，与脱除了N端保护基的步骤（2）产物在室温震荡反应2h后，将反应液注入乙醚中，沉淀，离心后收集白色沉淀，放入真空干燥器中干燥，即得0.52gα-芋螺毒素MI粗品。
（3）α-芋螺毒素MI粗品纯化
具体方法为：装置：C18制备柱（20×250mm）
洗脱液A：0.1%（v/v）TFA/H2O
洗脱液B：乙腈
流速：12mL/min
紫外检测波长：215nm
操作：（1）将α-芋螺毒素MI粗品的的水溶液用0.45μm微孔滤膜过滤；
（2）滤液直接进样；
（3）13-23%（v/v）乙腈-水流动相梯度洗脱；
（4）收集目的肽；
（5）浓缩，冷冻干燥；
（6）得α-芋螺毒素MI白色固体0.46g。
产物经HPLC分析和MS确认。
实施例5
Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-Cys(Acm)-Cys(Mmt)-His(Trt)-Pro-Ala-Cys(Acm)-Gly-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Mmt)-氨基树脂的制备与分析
（1）氨基树脂脱保护
称取1g取代度为0.6mmol/g的Rink Amide MBHA树脂于固相反应器中，加入5mLDCM溶胀20min，随后加入10mL体积百分数为50%哌啶的DMF溶液，20℃反应2min，DMF洗涤一次，加入10mL体积百分数为50%的哌啶的DMF溶液，20℃反应3min；即得脱保护的氨基树脂；
（2）H-Cys(Mmt)-氨基树脂的制备
步骤（1）反应后的固相反应器中加入Fmoc-Cys(Mmt)-OH(1mmol)、HOBt(1.2mmol)、DIC(1.2mmol)、DMF（10mL），20℃反应1h，洗涤、抽干，即得Fmoc-Cys(Mmt)-树脂；向Fmoc-Cys(Mmt)-树脂中加入封闭试剂5mL（所述封闭试剂为醋酸酐：DIPEA：DMF=1mmol:1mmol:8ml）反应1h封闭剩余的氨基，分别用DCM、MeOH与DMF洗涤多次，抽干；加入20%PIP/DMF溶液反应20min脱除Fmoc保护基，分别用DCM、MeOH与DMF洗涤多次，抽干，即得H-Cys(Mmt)-氨基树脂。
（3）Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-Cys(Acm)-Cys(Mmt)-His(Trt)-Pro-Ala-Cys(Acm)-Gly-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Mmt)-氨基树脂的制备
将步骤（2）制得的H-Cys(Mmt)-树脂于固相反应器中，加入氨基酸Fmoc-Ser(tBu)-OH（1mmol）、HOBt（1.2mmol）、DPIEA（3.6mmol）、HBTU（1.2mmol）与DMF（5mL）20℃反应2h；偶联完成度可以使用Kaiser测试检测；检测通过后，加入5mL20%哌啶的DMF溶液，反应5min，DMF洗涤一次，加入5mL20%的哌啶的DMF溶液，反应15min。抽干。
以此步骤（3）方法依次偶联剩余的氨基酸，在偶联过程中，偶联溶剂选自DCM、DMF和NMP中的任意一个或一个以上的组合；偶联体系选自HOBt、HOAt、HOOBt和Cl-HOBt中的任意一个或多个与DIC的组合，或选自HOBt、HOAt、HOOBt和Cl-HOBt中的任意一个或多个、DPIEA或NMM中的任意一个或两个以及HBTU、HATU、PyBOP和PyAOP中的任意一个或多个的组合；即得十四肽氨基树脂3.15g。
氨基酸用量见表3。
表3氨基酸用量
| 序列 | 氨基酸名称 | 用量 |
| 1 | Fmoc-Gly-OH | 0.296g |
| 2 | Fmoc-Arg(Pbf)-OH | 0.653g |
| 3 | Fmoc-Cys(Acm)-OH | 0.467g |
| 4 | Fmoc-Cys(Mmt)-OH | 0.625g |
| 5 | Fmoc-His(Trt)-OH | 0.625g |
| 6 | Fmoc-Pro-OH | 0.373g |
| 7 | Fmoc-Ala-OH | 0.352g |
| 8 | Fmoc-Cys(Acm)-OH | 0.446g |
| 9 | Fmoc-Gly-OH | 0.273g |
| 10 | Fmoc-Lys(Boc)-OH | 0.365g |
| 11 | Fmoc-Asn(Trt)-OH | 0.581g |
| 12 | Fmoc-Tyr(tBu)-OH | 0.464g |
| 13 | Fmoc-Ser(tBu)-OH | 0.391g |
| 14 | Fmoc-Cys(Mmt)-OH | 0.626g |
（4）α-芋螺毒素MI线性粗肽的分析
称取0.5g实施例3步骤（2）制得的十四肽氨基树脂于固相反应器中，加入5mL DCM溶胀10min，抽干。随后加入20%PIP/DMF溶液反应20min脱除Fmoc保护基，分别用DCM、MeOH与DMF洗涤多次，抽干。配置裂解液5mL，其各组分体积比为TFA：苯甲硫醚：TIS：苯甲醚：水=90：2.5：2.5：2.5：2.5。冰浴冷却，向其中加入侧链全保护的α-芋螺毒素MI线性肽树脂，15℃震荡反应3h；滤除树脂，将所得滤液缓慢滴加至50mL冰乙醚中，沉淀，离心后收集白色沉淀，真空干燥，得0.276gα-芋螺毒素MI线性肽粗品。产物经HPLC分析和MS确认。
实施例6
氨基树脂的制备
称取2g实施例3步骤（1）制得的十四肽氨基树脂置于固相反应器中，加入10mLDCM溶胀10min，抽干；将2.6g碘溶于20mL2,2,2-三氟乙醇和二氯甲烷（2,2,2-三氟乙醇和二氯甲烷体积比为8:1）混合溶液中，加入固相反应器中；室温震荡反应2h后，用DMF、无水甲醇各洗涤3次，抽干，得产物1.67g。
（2）α-芋螺毒素MI粗肽的制备
将步骤（2）中得到的产物加入10mL20%哌啶的DMF溶液，反应5min，DMF洗涤一次，加入10mL20%的哌啶的DMF溶液，反应15min，抽干；分别用DMF洗涤2次，无水甲醇洗涤3次，抽干；配置裂解液15mL，其各组分体积比为TFA：苯甲硫醚：TIS：苯甲醚：水=96：1：5：5：1；将裂解液加入固相反应器中，与脱除了N端保护基的步骤（2）产物在室温震荡反应4h后，将反应液注入乙醚中，沉淀，离心后收集白色沉淀，放入真空干燥器中干燥，即得0.64gα-芋螺毒素MI粗品。
（3）α-芋螺毒素MI粗品纯化
具体方法为：装置：C18制备柱（20×250mm）
洗脱液A：0.1%（v/v）TFA/H2O
洗脱液B：乙腈
流速：12mL/min
紫外检测波长：215nm
操作：（1）将α-芋螺毒素MI粗品的的水溶液用0.45μm微孔滤膜过滤；
（2）滤液直接进样；
（3）13-23%（v/v）乙腈-水流动相梯度洗脱；
（4）收集目的肽；
（5）浓缩，冷冻干燥；
（6）得α-芋螺毒素MI白色固体0.52g。
产物经HPLC分析和MS确认。
实施例7
与实施例1基本相同，不同之处仅在于：采用Rink Amide PEGA树脂替代Rink Amide树脂；氧化体系为碘的混合溶剂溶液，其中溶剂为体积比为1:1的2,2,2-三氟乙醇和二氯甲烷的混合溶液。制得的产物经HPLC分析和MS确认。
实施例8
与实施例1基本相同，不同之处仅在于：采用PAL树脂替代Rink Amide树脂；氧化体系为碘的混合溶剂溶液，其中溶剂为体积比为体积比为1:49的N-甲基吡咯烷酮和苯甲醚的混合溶液。制得的产物经HPLC分析和MS确认。
实施例9
与实施例1基本相同，不同之处仅在于：采用PAL树脂替代Rink Amide树脂；氧化体系为碘的混合溶剂溶液，其中溶剂为体积比为体积比为8:49的N-甲基吡咯烷酮和苯甲醚的混合溶液。制得的产物经HPLC分析和MS确认。
实施例10
与实施例1基本相同，不同之处仅在于：氧化体系为碘的混合溶剂溶液，其中溶剂为体积比为体积比为1:8的2,2,2-三氟乙醇和氯仿的混合溶液。制得的产物经HPLC分析和MS确认。
实施例11
与实施例1基本相同，不同之处仅在于：氧化体系为碘的混合溶剂溶液，其中溶剂为体积比为体积比为1:1的2,2,2-三氟乙醇和氯仿的混合溶液。制得的产物经HPLC分析和MS确认。
实施例12
与实施例1基本相同，不同之处仅在于：氧化体系为碘的混合溶剂溶液，其中溶剂为体积比为体积比为1:4的2,2,2-三氟乙醇和氯仿的混合溶液。制得的产物经HPLC分析和MS确认。
实施例13
与实施例1基本相同，不同之处仅在于：氧化体系为碘的混合溶剂溶液，其中溶剂为体积比为体积比为1:8的六氟异丙醇和氯仿的混合溶液。制得的产物经HPLC分析和MS确认。
实施例14
与实施例1基本相同，不同之处仅在于：氧化体系为碘的混合溶剂溶液，其中溶剂为体积比为体积比为1:1的六氟异丙醇和氯仿的混合溶液。制得的产物经HPLC分析和MS确认。
实施例15
与实施例1基本相同，不同之处仅在于：氧化体系为碘的混合溶剂溶液，其中溶剂为体积比为体积比为1:4的六氟异丙醇和氯仿的混合溶液。制得的产物经HPLC分析和MS确认。
Claims (6)
1.一种α-芋螺毒素MI的全固相合成方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）按照固相合成的方法，Fmoc氨基树脂在Fmoc脱保护试剂作用下反应脱去Fmoc后，在偶联体系作用下于偶联溶剂中从C端到N端依次依肽序依次连接Fmoc氨基酸，合成十四肽氨基树脂，所述十四肽树脂为PG-Gly-Arg-Cys(X2)-Cys(X1)-His-Pro-Ala-Cys(X2)-Gly-Lys-Asn-Tyr-Ser-Cys(X1)-氨基树脂，或为PG-Gly-Arg-Cys(X1)-Cys(X2)-His-Pro-Ala-Cys(X1)-Gly-Lys-Asn-Tyr-Ser-Cys(X2)-氨基树脂；其中，PG为Fmoc或Boc，X1为Trt或Mmt，X2为Acm；
（2）在氧化体系的作用下，十四肽氨基树脂反应脱除X1和X2；
（3）步骤（2）产物在脱除N端保护基后，在裂解体系作用下裂解脱除侧链保护基，即得α-芋螺毒素MI。
2.权利要求1所述的一种α-芋螺毒素MI的全固相合成方法，其特征在于：步骤（1）中，所述Fmoc氨基树脂为Rink Amide树脂、Rink Amide AM树脂、Rink Amide MBHA树脂、Rink Amide PEGA树脂或PAL树脂。
3.权利要求1所述的一种α-芋螺毒素MI的全固相合成方法，其特征在于：步骤（1）中，Fmoc脱保护试剂为哌啶，脱保护反应温度为10-30℃，反应时间为5-60min。
4.权利要求1所述的一种α-芋螺毒素MI的全固相合成方法，其特征在于：步骤（1）中，偶联溶剂选自DCM、DMF和NMP中的任意一个或一个以上的组合；偶联体系选自HOBt、HOAt、HOOBt和Cl-HOBt中的任意一个或多个与DIC的组合，或选自HOBt、HOAt、HOOBt和Cl-HOBt中的任意一个或多个、DPIEA或NMM中的任意一个或两个以及HBTU、HATU、PyBOP和PyAOP中的任意一个或多个的组合；偶联溶剂与Fmoc脱保护试剂的体积比为（1-5）:1。
5.权利要求1所述的一种α-芋螺毒素MI的全固相合成方法，其特征在于：步骤（2）中，所述氧化体系为碘的混合溶剂溶液，其中混合溶剂为体积比为（1-8）:1的二氧六环和甲醇的混合溶液，或为体积比为（1-8）:1的二氯甲烷和甲醇的混合溶液，或为体积比为（1-8）:1的2,2,2-三氟乙醇和二氯甲烷的混合溶液，或为体积比为（1-8）:49的N-甲基吡咯烷酮和苯甲醚的混合溶液，或为体积比为（1-8）:1的2,2,2-三氟乙醇和氯仿的混合溶液，或为体积比为（1-8）:1的六氟异丙醇和氯仿的混合溶液；其中，碘和十四肽氨基树脂的摩尔比为（5-20）：1；反应温度为室温，反应时间为1-3h。
6.权利要求1所述的一种α-芋螺毒素MI的全固相合成方法，其特征在于：步骤（3）中，裂解体系为体积比为(80-96)：(1-5)：(1-5)：(1-5)：(1-5)的TFA、苯甲硫醚、三异丙基硅烷、苯甲醚和水；反应温度为室温，反应时间为1-4h。
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