CN103965297B - 一种多肽、其制备方法和应用 - Google Patents
一种多肽、其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种多肽、其制备方法和应用。所述的多肽具有以下氨基酸序列：R1‑Arg‑Val‑Tyr‑Val‑His‑Pro‑Phe；其中，R1为Asp、isoAsp或Ac‑Asn。本发明的多肽是血管紧张素制备过程中的3个关键杂质，因此可作为血管紧张素检测过程的标准对照品，对血管紧张素以及杂质进行定性和定量分析，对于提高血管紧张素的质量标准，控制产品质量具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及制药领域，具体涉及一种多肽、其制备方法和应用。
背景技术
血管紧张素(Angiotensin)，是化学合成的8肽，氨基酸序列为Asn-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe，分子式为C49H70N14O11，临床上用于外伤或手术后休克和全身麻醉或腰麻时所致的低血压症等。其作用机制为：血管紧张素与血管平滑机、肾上腺皮质球状带细胞以及脑的一些部位、心脏和肾脏器官的细胞上血管紧张素受体结合，引起相应的生理效应。血管紧张素作用于血管平滑肌，可使全身微动脉收缩，动脉血压升高。作用于外周血管，使静脉收缩，回心血量增加。
就一个药品而言，其中所含的少量杂质是引发药品副作用最重要的原因，因此对其纯度的检查是保证药品安全有效性的重要基础之一，而纯度检查的内容，根据各个药物的性质和特点有些不同，但基本上均要涉及各自的“有关物质”检查研究。合成多肽的有关物质主要来自合成过程中的工艺杂质和由于多肽不稳定而产生的降解产物、聚合物等杂质，尽管目前合成多肽的纯化工艺已经有了很大进步，但工艺杂质仍是合成多肽有关物质的重要来源，这主要是由于合成多肽的一些工艺杂质(如缺失肽、断裂肽、氧化肽、二硫键交换的产物等)与药物本身的性质可能非常近似，从而给纯化造成了一定的难度。研究表明合成多肽中最常见的降解产物是脱酰胺产物、氧化产物、水解产物。在组成多肽的各种氨基酸中，天冬酰胺、谷胺酰胺易于发生脱酰胺反应(尤其是在pH值升高和高温条件下)。
由于合成多肽中有些杂质的性质与目标产品非常接近，因此建立适宜的方法充分检出这些杂质是合成多肽药物有关物质研究中面临的巨大困难。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供了一种多肽、其制备方法和应用。本发明的多肽是血管紧张素制备过程中的3个关键杂质，因此可作为血管紧张素检测过程的标准对照品，对血管紧张素以及杂质进行定性和定量分析，对于提高血管紧张素的质量标准，控制产品质量具有重要意义。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
本发明提供了一种多肽，其具有以下氨基酸序列：R1-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe；其中，R1为Asp、isoAsp或Ac-Asn。
对于上述多肽，当R1为Asp时，该多肽的结构如下式(1)所示：
当R1为isoAsp时，该多肽的结构如下式(2)所示：
当R1为Ac-Asn时，该多肽的结构如下式(3)所示：
上述多肽的制备方法可采用本领域常规使用的多肽固相合成方法，本发明优选包括下述步骤：
(1)在非质子极性溶剂中，将有机碱与肽树脂7进行脱除Fmoc氨基保护基的反应，得到肽树脂7’；所述的肽树脂7为Fmoc-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-wang树脂；所述的肽树脂7’为H-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-wang树脂；
(2)在DMF(N,N-二甲基甲酰胺)、HOBt(1-羟基苯并三唑)、HBTU(苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)和DIEA(N,N’-二异丙基乙胺)的溶液，或者DMF、HOBt和DIC(N,N’-二异丙基碳二亚胺)的溶液中，将肽树脂7’与Fmoc-氨基酸进行缩合反应，得到肽树脂8；
当Fmoc-氨基酸为Fmoc-Asp(OtBu)-OH时，所述的肽树脂8为Fmoc-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-wang树脂；再进行脱除Fmoc氨基保护基的反应，得到肽树脂8’；
当Fmoc-氨基酸为Fmoc-Asp-OtBu时，所述的肽树脂8为Fmoc-β-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-wang树脂；再进行脱除Fmoc氨基保护基的反应，得到肽树脂8’；
当Fmoc-氨基酸为Ac-Asn(Trt)-OH时，所述的肽树脂8为Ac-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-wang树脂；
(3)裂解除去保护基，即得多肽。
本发明中，Fmoc为9-芴甲氧羰基，是一种氨基保护基。Asp(OtBu)中的OtBu为叔丁氧基，是一种羧基保护基。Asn(Trt)中的Trt为三苯甲基，是一种氨基保护基。Tyr(tBu)中的tBu为叔丁基，是一种羟基保护基。Ac-是指乙酰基。Arg(Pbf)中的Pbf为2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基，是一种胍基保护基。Fmoc-Asp(OtBu)-OH是指Asp氨基酸的侧链羧基被OtBu保护，而Fmoc-Asp-OtBu是指Asp氨基酸的主链羧基被OtBu保护。
步骤(1)中，所述的有机碱可以为本领域中该类脱除Fmoc氨基保护基的反应的常规有机碱，优选六氢吡啶。
步骤(1)中，所述的非质子极性溶剂可以为本领域中该类脱除Fmoc氨基保护基的反应的常规非质子极性溶剂，优选DMF(N,N-二甲基甲酰胺)。
步骤(1)中，所述的有机碱与所述的非质子极性溶剂的体积比较佳地为(15～25)：100。
步骤(1)中，所述的脱除Fmoc氨基保护基的反应的温度较佳地为25～30℃，所述的脱除Fmoc氨基保护基的反应的时间较佳地为30～60min。
步骤(2)中，对于在DMF、HOBt、HBTU和DIEA的溶液的反应，肽树脂7’：Fmoc-氨基酸：DMF：HOBt：HBTU：DIEA较佳地为1：(1～3)：(5～10)：(1～3)：(1～3)：(1～5)，更佳地为1：2：5：2：2：3。
步骤(2)中，对于在DMF、HOBt和DIC的溶液的反应，肽树脂7’：Fmoc-氨基酸：DMF：HOBt：DIC较佳地为1：(1～5)：(5～20)：(1～5)：(1～5)，更佳地为1：4：5：4：4。
步骤(2)中，所述的缩合反应的温度较佳地为25～30℃，所述的缩合反应的时间较佳地为2～12h。
步骤(3)中，所述的裂解可为本领域该类除去保护基的常规裂解方法，优选包括下述步骤：加入酸性裂解液，反应，用0～10℃的甲基叔丁基醚沉淀，离心，洗涤，干燥，即可。所述的酸性裂解液较佳地为三氟乙酸、三异丙基硅烷和水的混合物，更佳地为三氟乙酸：三异丙基硅烷：水按体积比为95：2.5：2.5的混合物。
本发明中，在步骤(3)结束后还可包括进一步后处理纯化步骤，所述的后处理纯化步骤优选采用反相制备液相色谱法，色谱条件如下：流动相A：体积百分数为0.1％的三氟乙酸的水溶液，流动相B：体积百分数为0.1％三氟乙酸的乙腈溶液；流速：200mL/min；检测波长：220nm；以流动相A与流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱：0min:95％A+5％B→20min:95％A+5％B→80min:65％A+35％B。色谱柱的规格优选如下：美国Varian公司的Load&Lock4003色谱柱，75mm×265mm，PLRP-S，10μm，10nm。
本发明中，所述的肽树脂7可按本领域常规的多肽固相合成法来制备，其制备方法优选包括下述步骤：
(1)在非质子极性溶剂中，将有机碱与肽树脂6进行脱除Fmoc氨基保护基的反应，得到肽树脂6’；所述的肽树脂6为Fmoc-Val-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-wang树脂；所述的肽树脂6’为H-Val-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-wang树脂；
(2)在DMF(N,N-二甲基甲酰胺)、HOBt(1-羟基苯并三唑)、HBTU(苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)和DIEA(N,N’-二异丙基乙胺)的溶液，或者DMF、HOBt和DIC(N,N’-二异丙基碳二亚胺)的溶液中，将肽树脂6’与Fmoc-Arg(Pbf)-OH进行缩合反应，得到肽树脂7。
在肽树脂7的制备方法中，步骤(1)中，所述的有机碱可以为本领域中该类脱除Fmoc氨基保护基的反应的常规有机碱，优选六氢吡啶。
在肽树脂7的制备方法中，步骤(1)中，所述的非质子极性溶剂可以为本领域中该类脱除Fmoc氨基保护基的反应的常规非质子极性溶剂，优选DMF(N,N-二甲基甲酰胺)。
在肽树脂7的制备方法中，步骤(1)中，所述的有机碱与所述的非质子极性溶剂的体积比较佳地为(15～25)：100。
在肽树脂7的制备方法中，步骤(1)中，所述的脱除Fmoc氨基保护基的反应的温度较佳地为25～30℃，所述的脱除Fmoc氨基保护基的反应的时间较佳地为30～60min。
在肽树脂7的制备方法中，步骤(2)中，对于在DMF、HOBt、HBTU和DIEA的溶液的反应，肽树脂6’：Fmoc-Arg(Pbf)-OH：DMF：HOBt：HBTU：DIEA较佳地为1：(1～3)：(5～10)：(1～3)：(1～3)：(1～5)，更佳地为1：2：5：2：2：3。
在肽树脂7的制备方法中，步骤(2)中，对于在DMF、HOBt和DIC的溶液的反应，肽树脂6’：Fmoc-Arg(Pbf)-OH：DMF：HOBt：DIC较佳地为1：(1～5)：(5～20)：(1～5)：(1～5)，更佳地为1：4：5：4：4。
在肽树脂7的制备方法中，步骤(2)中，所述的缩合反应的温度较佳地为25～30℃，所述的缩合反应的时间较佳地为2～12h。
本发明中，所述的肽树脂6可按本领域常规的多肽固相合成法来制备，其制备方法优选包括下述步骤：
(1)在非质子极性溶剂中，将有机碱与肽树脂5进行脱除Fmoc氨基保护基的反应，得到肽树脂5’；所述的肽树脂5为Fmoc-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-wang树脂；所述的肽树脂5’为H-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-wang树脂；
(2)在DMF(N,N-二甲基甲酰胺)、HOBt(1-羟基苯并三唑)、HBTU(苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)和DIEA(N,N’-二异丙基乙胺)的溶液，或者DMF、HOBt和DIC(N,N’-二异丙基碳二亚胺)的溶液中，将肽树脂5’与Fmoc-Val-OH进行缩合反应，得到肽树脂6。
在肽树脂6的制备方法中，步骤(1)中，所述的有机碱可以为本领域中该类脱除Fmoc氨基保护基的反应的常规有机碱，优选六氢吡啶。
在肽树脂6的制备方法中，步骤(1)中，所述的非质子极性溶剂可以为本领域中该类脱除Fmoc氨基保护基的反应的常规非质子极性溶剂，优选DMF(N,N-二甲基甲酰胺)。
在肽树脂6的制备方法中，步骤(1)中，所述的有机碱与所述的非质子极性溶剂的体积比较佳地为(15～25)：100。
在肽树脂6的制备方法中，步骤(1)中，所述的脱除Fmoc氨基保护基的反应的温度较佳地为25～30℃，所述的脱除Fmoc氨基保护基的反应的时间较佳地为30～60min。
在肽树脂6的制备方法中，步骤(2)中，对于在DMF、HOBt、HBTU和DIEA的溶液的反应，肽树脂5’：Fmoc-Val-OH：DMF：HOBt：HBTU：DIEA较佳地为1：(1～3)：(5～10)：(1～3)：(1～3)：(1～5)，更佳地为1：2：5：2：2：3。
在肽树脂6的制备方法中，步骤(2)中，对于在DMF、HOBt和DIC的溶液的反应，肽树脂5’：Fmoc-Val-OH：DMF：HOBt：DIC较佳地为1：(1～5)：(5～20)：(1～5)：(1～5)，更佳地为1：4：5：4：4。
在肽树脂6的制备方法中，步骤(2)中，所述的缩合反应的温度较佳地为25～30℃，所述的缩合反应的时间较佳地为2～12h。
本发明中，所述的肽树脂5可按本领域常规的多肽固相合成法来制备，其制备方法优选包括下述步骤：
(1)在非质子极性溶剂中，将有机碱与肽树脂4进行脱除Fmoc氨基保护基的反应，得到肽树脂4’；所述的肽树脂4为Fmoc-Val-His(Trt)-Pro-Phe-wang树脂；所述的肽树脂4’为H-Val-His(Trt)-Pro-Phe-wang树脂；
(2)在DMF(N,N-二甲基甲酰胺)、HOBt(1-羟基苯并三唑)、HBTU(苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)和DIEA(N,N’-二异丙基乙胺)的溶液，或者DMF、HOBt和DIC(N,N’-二异丙基碳二亚胺)的溶液中，将肽树脂4’与Fmoc-Tyr(tBu)-OH进行缩合反应，得到肽树脂5。
在肽树脂5的制备方法中，步骤(1)中，所述的有机碱可以为本领域中该类脱除Fmoc氨基保护基的反应的常规有机碱，优选六氢吡啶。
在肽树脂5的制备方法中，步骤(1)中，所述的非质子极性溶剂可以为本领域中该类脱除Fmoc氨基保护基的反应的常规非质子极性溶剂，优选DMF(N,N-二甲基甲酰胺)。
在肽树脂5的制备方法中，步骤(1)中，所述的有机碱与所述的非质子极性溶剂的体积比较佳地为(15～25)：100。
在肽树脂5的制备方法中，步骤(1)中，所述的脱除Fmoc氨基保护基的反应的温度较佳地为25～30℃，所述的脱除Fmoc氨基保护基的反应的时间较佳地为30～60min。
在肽树脂5的制备方法中，步骤(2)中，对于在DMF、HOBt、HBTU和DIEA的溶液的反应，肽树脂4’：Fmoc-Tyr(tBu)-OH：DMF：HOBt：HBTU：DIEA较佳地为1：(1～3)：(5～10)：(1～3)：(1～3)：(1～5)，更佳地为1：2：5：2：2：3。
在肽树脂5的制备方法中，步骤(2)中，对于在DMF、HOBt和DIC的溶液的反应，肽树脂4’：Fmoc-Tyr(tBu)-OH：DMF：HOBt：DIC较佳地为1：(1～5)：(5～20)：(1～5)：(1～5)，更佳地为1：4：5：4：4。
在肽树脂5的制备方法中，步骤(2)中，所述的缩合反应的温度较佳地为25～30℃，所述的缩合反应的时间较佳地为2～12h。
本发明中，所述的肽树脂4可按本领域常规的多肽固相合成法来制备，其制备方法优选包括下述步骤：
(1)在非质子极性溶剂中，将有机碱与肽树脂3进行脱除Fmoc氨基保护基的反应，得到肽树脂3’；所述的肽树脂3为Fmoc-His(Trt)-Pro-Phe-wang树脂；所述的肽树脂3’为H-His(Trt)-Pro-Phe-wang树脂；
(2)在DMF(N,N-二甲基甲酰胺)、HOBt(1-羟基苯并三唑)、HBTU(苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)和DIEA(N,N’-二异丙基乙胺)的溶液，或者DMF、HOBt和DIC(N,N’-二异丙基碳二亚胺)的溶液中，将肽树脂3’与Fmoc-Val-OH进行缩合反应，得到肽树脂4。
在肽树脂4的制备方法中，步骤(1)中，所述的有机碱可以为本领域中该类脱除Fmoc氨基保护基的反应的常规有机碱，优选六氢吡啶。
在肽树脂4的制备方法中，步骤(1)中，所述的非质子极性溶剂可以为本领域中该类脱除Fmoc氨基保护基的反应的常规非质子极性溶剂，优选DMF(N,N-二甲基甲酰胺)。
在肽树脂4的制备方法中，步骤(1)中，所述的有机碱与所述的非质子极性溶剂的体积比较佳地为(15～25)：100。
在肽树脂4的制备方法中，步骤(1)中，所述的脱除Fmoc氨基保护基的反应的温度较佳地为25～30℃，所述的脱除Fmoc氨基保护基的反应的时间较佳地为30～60min。
在肽树脂4的制备方法中，步骤(2)中，对于在DMF、HOBt、HBTU和DIEA的溶液的反应，肽树脂3’：Fmoc-Val-OH：DMF：HOBt：HBTU：DIEA较佳地为1：(1～3)：(5～10)：(1～3)：(1～3)：(1～5)，更佳地为1：2：5：2：2：3。
在肽树脂4的制备方法中，步骤(2)中，对于在DMF、HOBt和DIC的溶液的反应，肽树脂3’：Fmoc-Val-OH：DMF：HOBt：DIC较佳地为1：(1～5)：(5～20)：(1～5)：(1～5)，更佳地为1：4：5：4：4。
在肽树脂4的制备方法中，步骤(2)中，所述的缩合反应的温度较佳地为25～30℃，所述的缩合反应的时间较佳地为2～12h。
本发明中，所述的肽树脂3可按本领域常规的多肽固相合成法来制备，其制备方法优选包括下述步骤：
(1)在非质子极性溶剂中，将有机碱与肽树脂2进行脱除Fmoc氨基保护基的反应，得到肽树脂2’；所述的肽树脂2为Fmoc-Pro-Phe-wang树脂；所述的肽树脂2’为H-Pro-Phe-wang树脂；
(2)在DMF(N,N-二甲基甲酰胺)、HOBt(1-羟基苯并三唑)、HBTU(苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)和DIEA(N,N’-二异丙基乙胺)的溶液，或者DMF、HOBt和DIC(N,N’-二异丙基碳二亚胺)的溶液中，将肽树脂2’与Fmoc-His(Trt)-OH进行缩合反应，得到肽树脂3。
在肽树脂3的制备方法中，步骤(1)中，所述的有机碱可以为本领域中该类脱除Fmoc氨基保护基的反应的常规有机碱，优选六氢吡啶。
在肽树脂3的制备方法中，步骤(1)中，所述的非质子极性溶剂可以为本领域中该类脱除Fmoc氨基保护基的反应的常规非质子极性溶剂，优选DMF(N,N-二甲基甲酰胺)。
在肽树脂3的制备方法中，步骤(1)中，所述的有机碱与所述的非质子极性溶剂的体积比较佳地为(15～25)：100。
在肽树脂3的制备方法中，步骤(1)中，所述的脱除Fmoc氨基保护基的反应的温度较佳地为25～30℃，所述的脱除Fmoc氨基保护基的反应的时间较佳地为30～60min。
在肽树脂3的制备方法中，步骤(2)中，对于在DMF、HOBt、HBTU和DIEA的溶液的反应，肽树脂2’：Fmoc-His(Trt)-OH：DMF：HOBt：HBTU：DIEA较佳地为1：(1～3)：(5～10)：(1～3)：(1～3)：(1～5)，更佳地为1：2：5：2：2：3。
在肽树脂3的制备方法中，步骤(2)中，对于在DMF、HOBt和DIC的溶液的反应，肽树脂2’：Fmoc-His(Trt)-OH：DMF：HOBt：DIC较佳地为1：(1～5)：(5～20)：(1～5)：(1～5)，更佳地为1：4：5：4：4。
在肽树脂3的制备方法中，步骤(2)中，所述的缩合反应的温度较佳地为25～30℃，所述的缩合反应的时间较佳地为2～12h。
本发明中，所述的肽树脂2可按本领域常规的多肽固相合成法来制备，其制备方法优选包括下述步骤：
(1)在非质子极性溶剂中，将有机碱与肽树脂1进行脱除Fmoc氨基保护基的反应，得到肽树脂1’；所述的肽树脂1为Fmoc-Phe-wang树脂；所述的肽树脂1’为H-Phe-wang树脂；
(2)在DMF(N,N-二甲基甲酰胺)、HOBt(1-羟基苯并三唑)、HBTU(苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)和DIEA(N,N’-二异丙基乙胺)的溶液，或者DMF、HOBt和DIC(N,N’-二异丙基碳二亚胺)的溶液中，将肽树脂1’与Fmoc-Pro-OH进行缩合反应，得到肽树脂2。
在肽树脂2的制备方法中，步骤(1)中，所述的有机碱可以为本领域中该类脱除Fmoc氨基保护基的反应的常规有机碱，优选六氢吡啶。
在肽树脂2的制备方法中，步骤(1)中，所述的非质子极性溶剂可以为本领域中该类脱除Fmoc氨基保护基的反应的常规非质子极性溶剂，优选DMF(N,N-二甲基甲酰胺)。
在肽树脂2的制备方法中，步骤(1)中，所述的有机碱与所述的非质子极性溶剂的体积比较佳地为(15～25)：100。
在肽树脂2的制备方法中，步骤(1)中，所述的脱除Fmoc氨基保护基的反应的温度较佳地为25～30℃，所述的脱除Fmoc氨基保护基的反应的时间较佳地为30～60min。
在肽树脂2的制备方法中，步骤(2)中，对于在DMF、HOBt、HBTU和DIEA的溶液的反应，肽树脂1’：Fmoc-Pro-OH：DMF：HOBt：HBTU：DIEA较佳地为1：(1～3)：(5～10)：(1～3)：(1～3)：(1～5)，更佳地为1：2：5：2：2：3。
在肽树脂2的制备方法中，步骤(2)中，对于在DMF、HOBt和DIC的溶液的反应，肽树脂1’：Fmoc-Pro-OH：DMF：HOBt：DIC较佳地为1：(1～5)：(5～20)：(1～5)：(1～5)，更佳地为1：4：5：4：4。
在肽树脂2的制备方法中，步骤(2)中，所述的缩合反应的温度较佳地为25～30℃，所述的缩合反应的时间较佳地为2～12h。
本发明中，所述的肽树脂1可按本领域常规的多肽固相合成法来制备，其制备方法优选包括下述步骤：
在DMF(N,N-二甲基甲酰胺)、HOBt(1-羟基苯并三唑)、DIC(N,N’-二异丙基碳二亚胺)和DMAP(4-二甲基吡啶)的溶液中，将wang树脂与Fmoc-Phe-OH进行缩合反应，得到肽树脂1。
在肽树脂1的制备方法中，wang树脂：Fmoc-Phe-OH：DMF：HOBt：DIC：DMAP较佳地为1：(1～3)：(5～10)：(1～3)：(1～3)：0.2，更佳地为1：2：5：2：2：0.2。
在肽树脂1的制备方法中，所述的缩合反应的温度较佳地为15～30℃，所述的缩合反应的时间较佳地为2～24h。
本发明还提供了上述多肽作为标准品在检测药品中血管紧张素相关杂质的应用。
其中，所述的药品较佳地为血管紧张素原料药。
其中，所述的应用较佳地包括下述步骤：将多肽标准品溶液和药品溶液分别进行高效液相色谱检测，根据多肽标准品色谱图的保留时间确定药品色谱图中血管紧张素相关杂质的峰，并根据峰面积计算药品中血管紧张素相关杂质的含量。
其中，所述的高效液相色谱的条件优选如下：流动相A：0.02mol/L磷酸二氢钾-磷酸缓冲溶液，pH值为3.0；流动相B：体积百分数为50％的乙腈水溶液；柱温为25℃，检测波长为220nm，流速为1.0mL/min；以流动相A与流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱：0min:90％A+10％B→7min:60％A+40％B→13min:50％A+50％B→40min:0％A+100％B。
其中，所述的高效液相色谱的色谱柱的规格优选如下：美国Varian公司的Waters XBridge-C18色谱柱，4.6×150mm，5μm。
其中，所述的多肽标准品溶液较佳地为多肽溶于流动相A所形成的溶液。所述的多肽标准品溶液的浓度较佳地为1mg/mL。
其中，所述的药品溶液较佳地为药品溶于流动相A所形成的溶液。所述的药品溶液的浓度较佳地为1mg/mL。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明的多肽是血管紧张素制备过程中的3个关键杂质，因此可作为血管紧张素检测过程的标准对照品，对血管紧张素以及杂质进行定性和定量分析，对于提高血管紧张素的质量标准，控制产品质量具有重要意义。
附图说明
图1为式(1)所示的化合物的HPLC图谱。
图2为式(2)所示的化合物的HPLC图谱。
图3为式(3)所示的化合物的HPLC图谱。
图4为血管紧张素原料药的HPLC图谱。
图5为图4中A部的局部放大图。
图6为式(1)所示的化合物的质谱图谱。
图7为式(2)所示的化合物的质谱图谱。
图8为式(3)所示的化合物的质谱图谱。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例中，DMF是指N,N-二甲基甲酰胺，DCM是指二氯甲烷，HOBt是指1-羟基苯并三唑，DIC是指N,N’-二异丙基碳二亚胺，DMAP是指4-二甲基吡啶，DIEA是指N,N’-二异丙基乙胺，HBTU是指苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯。
实施例1
Fmoc-Phe-Wang树脂(肽树脂1)的制备
取50g Wang树脂(61.5mmol)置于1L双层反应器中，用DCM溶胀30分钟，N2吹拂混合，抽干，DMF洗涤3次，每次400mL。加入47.7gFmoc-Phe-OH、16.6g HOBt，用300mL DMF溶解，然后加入19.3mL DIC，最后加入1.5g DMAP在27℃条件下反应24小时。反应结束后用DMF洗涤3次，每次400mL。接着，加入封闭液(含56.5mL吡啶，58mL醋酸酐，350mL DMF)封闭3小时，用DMF、甲醇、甲醇、DMF、DMF、甲醇、甲醇、甲醇的顺序依次洗涤树脂，每次400mL。取样，测定替代度为0.83mmol/g。
实施例2
Fmoc-Pro-Phe-Wang树脂(肽树脂2)的制备
将实施例1制得的Fmoc-Phe-Wang树脂(肽树脂1)用DMF洗涤2次，每次400mL，抽干。加入400mL体积比为20％(v/v)的六氢吡啶/DMF，在25℃条件下脱保护2次，第一次10分钟，第二次20分钟。然后用DMF洗涤1次，甲醇洗涤2次，DMF洗涤2次，每次400mL，抽干。加入Fmoc-Pro-OH38.3g，1-羟基苯并三唑15.3g，400mL DMF，再加入HBTU43.0g和DIEA30.0mL，将混合物在27℃搅拌2.5小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，甲醇洗涤两次，真空抽干，即得。
实施例3
Fmoc-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂(肽树脂3)的制备
将实施例2制得的Fmoc-Pro-Phe-Wang树脂(肽树脂2)用DMF洗涤2次，每次400mL，抽干。加入400mL体积比浓度为20％(v/v)的六氢吡啶/DMF，在25℃条件下脱保护2次，第一次10分钟，第二次20分钟。然后用用DMF洗涤一次，甲醇洗涤两次，DMF洗涤两次，每次400mL，抽干。加入Fmoc-His(Trt)-OH70.3g，1-羟基苯并三唑15.3g，400mL DMF，再加入HBTU43.0g和DIEA30.0mL，将混合物在27℃搅拌2.5小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，甲醇洗涤两次，真空抽干，即得。Trt为三苯甲基。
实施例4
Fmoc-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂(肽树脂4)的制备
将实施例3制得的Fmoc-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂(肽树脂3)用DMF洗涤2次，每次400mL，抽干。加入400mL体积比浓度为20％(v/v)的六氢吡啶/DMF，在25℃条件下脱保护2次，第一次10分钟，第二次20分钟。然后用DMF洗涤一次，甲醇洗涤两次，DMF洗涤两次，每次400mL，抽干。加入Fmoc-Val-OH38.5g，1-羟基苯并三唑15.3g，400mL DMF，再加入HBTU43.0g和DIEA30.0mL，将混合物在27℃搅拌2.5小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，甲醇洗涤两次，真空抽干，即得。Trt为三苯甲基。
实施例5
Fmoc-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂(肽树脂5)的制备
将实施例4制得的Fmoc-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂(肽树脂4)用DMF洗涤2次，每次400mL，抽干。加入400mL体积比浓度为20％(v/v)的六氢吡啶/DMF，在25℃条件下脱保护2次，第一次10分钟，第二次20分钟。然后用DMF洗涤一次，甲醇洗涤两次，DMF洗涤两次，每次400mL，抽干。加入Fmoc-Tyr(tBu)-OH52.1g，1-羟基苯并三唑15.3g，400mL DMF，再加入HBTU43.0g和DIEA30.0mL，将混合物在27℃搅拌2.5小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，甲醇洗涤两次，真空抽干，即得。Trt为三苯甲基，tBu为叔丁基。
实施例6
Fmoc-Val-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂(肽树脂6)的制备
将实施例5制得的Fmoc-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂(肽树脂5)用DMF洗涤2次，每次400mL，抽干。加入400mL体积比为20％(v/v)的六氢吡啶/DMF，在25℃条件下脱保护2次，第一次10分钟，第二次20分钟。然后用DMF洗涤一次，甲醇洗涤两次，DMF洗涤两次，每次400mL，抽干。加入Fmoc-Val-OH38.5g，1-羟基苯并三唑15.3g，400mLDMF，再加入HBTU43.0g和DIEA30.0mL，将混合物在27℃搅拌2.5小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，甲醇洗涤两次，真空抽干，即得。Trt为三苯甲基，tBu为叔丁基。
实施例7
Fmoc-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂(肽树脂7)的制备
将实施例6制得的Fmoc-Val-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂(肽树脂6)用DMF洗涤2次，每次400mL，抽干。加入400mL体积比为20％(v/v)的六氢吡啶/DMF，在25℃条件下脱保护2次，第一次10分钟，第二次20分钟。然后用DMF洗涤一次，甲醇洗涤两次，DMF洗涤两次，每次400mL，抽干。加入Fmoc-Arg(Pbf)-OH73.6g，1-羟基苯并三唑15.3g，400mL DMF，再加入HBTU43.0g和DIEA30.0mL，将混合物在27℃搅拌2.5小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，甲醇洗涤两次，真空抽干，即得。Trt为三苯甲基，tBu为叔丁基，Pbf为2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基。
实施例8
Fmoc-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂(肽树脂8)的制备
将实施例7制得的Fmoc-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂(肽树脂7)用DMF洗涤2次，每次400mL，抽干。加入400mL体积比为20％(v/v)的六氢吡啶/DMF，在25℃条件下脱保护2次，第一次10分钟，第二次20分钟。然后用DMF洗涤一次，甲醇洗涤两次，DMF洗涤两次，每次400mL，抽干。加入Fmoc-Asp(OtBu)-OH46.7g，1-羟基苯并三唑15.3g，400mL DMF，再加入HBTU43.0g和DIEA30.0mL，将混合物在27℃搅拌2.5小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，甲醇洗涤两次，真空抽干，即得。Trt为三苯甲基，tBu为叔丁基，OtBu为叔丁氧基。
H-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂(肽树脂8’)的制备
将本实施例制得的Fmoc-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂(肽树脂8)用DMF洗涤2次，每次400mL，抽干。加入400mL体积比为20％(v/v)的六氢吡啶/DMF，在25℃条件下脱保护2次，第一次10分钟，第二次20分钟。DMF洗涤两次，甲醇洗涤三次，每次400mL，抽干，即得肽树脂8’。
实施例9
Fmoc-β-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂(肽树脂8)的制备
将实施例7制得的Fmoc-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂(肽树脂7)用DMF洗涤2次，每次400mL，抽干。加入400mL体积比为20％(v/v)的六氢吡啶/DMF，在25℃条件下脱保护2次，第一次10分钟，第二次20分钟。然后用DMF洗涤一次，甲醇洗涤两次，DMF洗涤两次，每次400mL，抽干。加入Fmoc-Asp-OtBu46.7g，1-羟基苯并三唑15.3g，400mL DMF，再加入HBTU43.0g和DIEA30.0mL，将混合物在27℃搅拌2.5小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，甲醇洗涤两次，DMF洗涤两次，真空抽干，即得。Trt为三苯甲基，tBu为叔丁基，OtBu为叔丁氧基。
H-β-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂(肽树脂8’)的制备
将本实施例制得的Fmoc-β-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂(肽树脂8)用DMF洗涤2次，每次400mL，抽干。加入400mL体积比为20％(v/v)的六氢吡啶/DMF，在25℃条件下脱保护2次，第一次10分钟，第二次20分钟。然后用DMF洗涤两次，甲醇洗涤三次，每次400mL，抽干，即得肽树脂8’。
实施例10
Ac-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂(肽树脂8)的制备
将实施例7制得的Fmoc-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂(肽树脂7)用DMF洗涤2次，每次400mL，抽干。加入400mL体积比为20％(v/v)的六氢吡啶/DMF，在25℃条件下脱保护2次，第一次10分钟，第二次20分钟。然后用DMF洗涤一次，甲醇洗涤两次，DMF洗涤两次，每次400mL，抽干。加入Ac-Asn(Trt)-OH47.2g，1-羟基苯并三唑15.3g，400mL DMF，再加入HBTU43.0g和DIEA30.0mL，将混合物在27℃搅拌2.5小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，甲醇洗涤两次，DMF洗涤两次，甲醇洗涤三次，真空抽干，即得。Trt为三苯甲基，tBu为叔丁基，OtBu为叔丁氧基。
实施例11
Ac-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂(肽树脂8)的制备
将实施例7制得的Fmoc-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Val-His(Trt)-Pro-Phe-Wang树脂(肽树脂7)用DMF洗涤2次，每次400mL，抽干。加入400mL体积比为20％(v/v)的六氢吡啶/DMF，在25℃条件下脱保护2次，第一次10分钟，第二次20分钟。然后用DMF洗涤一次，甲醇洗涤两次，DMF洗涤两次，每次400mL，抽干。加入Ac-Asn(Trt)-OH47.2g，1-羟基苯并三唑15.3g，400mL DMF，再加入DIC35.5mL，将混合物在27℃搅拌2.5小时，茚三酮检测呈阴性，真空抽干，甲醇洗涤两次，DMF洗涤两次，甲醇洗涤三次，真空抽干，即得。Trt为三苯甲基，tBu为叔丁基，OtBu为叔丁氧基。
实施例12
将实施例8制得的肽树脂8’进行裂解，加入酸性裂解液(三氟乙酸：三异丙基硅烷：水＝95：2.5：2.5，v/v)，所用酸性裂解液的体积(mL)为肽树脂8’质量(g)的10倍，于28℃条件下振荡裂解3小时。将酸解液滤出，树脂用三氟乙酸洗涤3次，合并滤液，于28℃使用旋转蒸发仪除溶剂后浓缩。在浓缩液中加入冷的甲基叔丁基醚沉淀，离心，再用冷(5℃)的甲基叔丁基醚沉淀洗涤3次，真空干燥恒重，即得式(1)所示的多肽粗品。
反相制备液相色谱法纯化：粗品50g用体积比为5％乙腈水溶液溶解至浓度为10g/L，进行上样，所用色谱柱为美国Varian公司的Load&Lock4003色谱柱，75mm×265mm，PLRP-S，10μm，10nm，具体色谱条件如下：流动相A：体积百分数为0.1％的三氟乙酸的水溶液，流动相B：体积百分数为0.1％的三氟乙酸的乙腈溶液；流速：200mL/min；检测波长：220nm；按照下述体积比进行线性梯度洗脱：0min:95％A+5％B→20min:95％A+5％B→80min:65％A+35％B。收集峰高10,000mAU以上的样品，真空冷冻干燥后得到式(1)所示的多肽纯品，进行HPLC分析，其HPLC图谱如图1所示，式(1)所示的多肽的保留时间为10.891分钟。
实施例13
将实施例9制得的肽树脂8’进行裂解，加入酸性裂解液(三氟乙酸：三异丙基硅烷：水＝95：2.5：2.5，v/v)，所用酸性裂解液的体积(mL)为肽树脂8’质量(g)的10倍，于28℃条件下振荡裂解3小时。将酸解液滤出，树脂用三氟乙酸洗涤3次，合并滤液，于28℃使用旋转蒸发仪除溶剂后浓缩。在浓缩液中加入冷的甲基叔丁基醚沉淀，离心，再用冷的(5℃)甲基叔丁基醚沉淀洗涤3次，真空干燥恒重，即得式(2)所示的多肽粗品。
反相制备液相色谱法纯化：粗品50g用体积比为5％乙腈水溶液溶解至浓度为10g/L，进行上样，所用色谱柱为美国Varian公司的Load&Lock4003色谱柱，75mm×265mm，PLRP-S，10μm，10nm，具体色谱条件如下：流动相A：体积百分数为0.1％的三氟乙酸的水溶液，流动相B：体积百分数为0.1％的三氟乙酸的乙腈溶液；流速：200mL/min；检测波长：220nm；按照下述体积比进行线性梯度洗脱：0min:95％A+5％B→20min:95％A+5％B→80min:65％A+35％B。收集峰高10,000mAU以上的样品，真空冷冻干燥后得到式(2)所示的多肽纯品，进行HPLC分析，其HPLC图谱如图2所示，式(2)所示的多肽的保留时间为11.306分钟。
实施例14
将实施例10制得的肽树脂8进行裂解，加入酸性裂解液(三氟乙酸：三异丙基硅烷：水＝95：2.5：2.5，v/v)，所用酸性裂解液的体积(mL)为肽树脂8’质量(g)的10倍，于28℃条件下振荡裂解3小时。将酸解液滤出，树脂用三氟乙酸洗涤3次，合并滤液，于28℃使用旋转蒸发仪除溶剂后浓缩。在浓缩液中加入冷的甲基叔丁基醚沉淀，离心，再用冷的(5℃)甲基叔丁基醚沉淀洗涤3次，真空干燥恒重，即得式(3)所示的多肽粗品。
反相制备液相色谱法纯化：粗品50g用体积比为5％乙腈水溶液溶解至浓度为10g/L，进行上样，所用色谱柱为美国Varian公司的Load&Lock4003色谱柱，75mm×265mm，PLRP-S，10μm，10nm，具体色谱条件如下：流动相A：体积百分数为0.1％的三氟乙酸的水溶液，流动相B：体积百分数为0.1％的三氟乙酸的乙腈溶液；流速：200mL/min；检测波长：220nm；按照下述体积比进行线性梯度洗脱：0min:95％A+5％B→20min:95％A+5％B→80min:65％A+35％B。收集峰高10,000mAU以上的样品，真空冷冻干燥后得到式(3)所示的多肽纯品，进行HPLC分析，其HPLC图谱如图3所示，式(3)所示的多肽的保留时间为11.893分钟。
实施例15
式(1)、式(2)、式(3)所示的多肽作为标准品在检测药品中血管紧张素相关杂质含量的应用。
(1)标准品溶液的配制：分别精密称取式(1)、式(2)、式(3)纯品5mg，用5mL0.02M KH2PO4-H3PO4(pH为3.0)溶解，混匀；
(2)供试品溶液的配制：精密称取血管紧张素样品5mg，用5mL0.02M KH2PO4-H3PO4(pH为3.0)溶解，混匀；
(3)含量测定。取以上标准品溶液和供试品溶液各5μL注入液相色谱仪，得到色谱图。以峰面积为指标，通过面积归一化法计算供试品中式(1)、式(2)、式(3)和血管紧张素的百分含量。
色谱条件：色谱柱：Waters XBridge-C18，4.6×150mm，5μm；流动相A：0.02M KH2PO4-H3PO4(pH为3.0)，流动相B：体积百分数为50％的乙腈水溶液；流速：1.0mL/min；检测波长：220nm；检测温度：25℃；以流动相A与流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱：0min:90％A+10％B→7min:60％A+40％B→13min:50％A+50％B→40min:0％A+100％B。
其HPLC图谱如图4所示。血管紧张素主峰的保留时间为10.579分钟，此外，在11.236分钟、11.481分钟和12.395分钟处还有3个杂质峰，其中保留时间为11.236分钟的峰与标准品式(1)所示的多肽的保留时间10.891分钟基本一致，保留时间为11.481分钟的峰与标准品式(2)所示的多肽的保留时间11.306分钟基本一致，保留时间为12.395分钟的峰与标准品式(3)所示的多肽的保留时间11.893分钟基本一致，说明本实施例的血管紧张素样品中11.236分钟、11.481分钟和12.395分钟的3个杂质峰分别为式(1)、式(2)、式(3)所示的多肽的峰。
根据峰面积计算血管紧张素样品中血管紧张素以及相关杂质的含量，如下表所示。
| 名称 | 血管紧张素 | 式(1) | 式(2) | 式(3) |
| 面积百分比 | 99.06％ | 0.15％ | 0.41％ | 0.17％ |
实施例16
将式(1)、式(2)、式(3)所示的多肽做质谱鉴定，结构正确，图谱分别如图6、7、8所示。由此可知，图6表明主要离子碎片峰[M+2H]2+测定值516.76，符合式(1)所示的多肽理论相对分子量1031；图7表明主要离子碎片峰[M+2H]2+测定值516.76，符合式(2)所示的多肽理论相对分子量1031；图8表明主要离子碎片峰[M+2H]2+测定值537.27，符合式(3)所示的多肽理论相对分子量1072。仪器：美国Waters公司QTOF Premier质谱仪，极性：正，毛细管电压：3.0kV，采样锥：45V，碰撞能量：4EV，离子源温度：100℃，去溶剂化温度：350℃，脱溶剂气体：600l/hr，扫描范围：M/z为100～2000，扫描时间：0.3秒，扫描间的时间：0.02秒。
Claims (2)
1.一种多肽作为标准品在检测药品中血管紧张素相关杂质的应用；
所述的多肽具有以下氨基酸序列：R1-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe；其中，R1为Asp、isoAsp或Ac-Asn；
所述的相关杂质具有以下氨基酸序列：R1-Arg-Val-Tyr-Val-His-Pro-Phe；其中，R1为Asp、isoAsp或Ac-Asn；
所述的药品为血管紧张素原料药；
所述的应用包括下述步骤：将多肽标准品溶液和药品溶液分别进行高效液相色谱检测，根据多肽标准品色谱图的保留时间确定药品色谱图中血管紧张素相关杂质的峰，并根据峰面积计算药品中血管紧张素相关杂质的含量；
所述的高效液相色谱的条件如下：流动相A：0.02mol/L磷酸二氢钾-磷酸缓冲溶液，pH值为3.0；流动相B：体积百分数为50％的乙腈水溶液；柱温为25℃，检测波长为220nm，流速为1.0mL/min；以流动相A与流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱：0min:90％A+10％B→7min:60％A+40％B→13min:50％A+50％B→40min:0％A+100％B。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的多肽标准品溶液为多肽溶于流动相A所形成的溶液，所述的多肽标准品溶液的浓度为1mg/mL；
和/或，所述的药品溶液为药品溶于流动相A所形成的溶液，所述的药品溶液的浓度为1mg/mL。
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