CN105131084B

CN105131084B - 基于内吗啡肽2或Biphalin的棕榈酰化修饰的阿片肽类似物及其合成和应用

Info

Publication number: CN105131084B
Application number: CN201510619850.4A
Authority: CN
Inventors: 王锐; 方泉; 王沛; 张婷; 王子龙; 李宁
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Shanghai Tianci Life Science Development Co., Ltd.
Priority date: 2015-09-25
Filing date: 2015-09-25
Publication date: 2018-05-01
Anticipated expiration: 2035-09-25
Also published as: CN105131084A

Abstract

本发明提供了一种基于阿片肽内吗啡肽2或Biphalin的棕榈酰化修饰的阿片肽类似物及其化学合成方法和应用，属于医药技术领域。本发明以具有高效镇痛活性的内吗啡肽2或Biphalin为模板，通过棕榈酰化修饰化学构建而成的一类全新的阿片肽类似物。通过一系列体内的临床前镇痛作用评价发现：侧脑室注射上述棕榈酰化修饰阿片肽在光热甩尾急性痛实验中能产生高效的镇痛活性，并在福尔马林痛、角叉菜胶引起的炎症痛及醋酸扭体内脏痛多种病理性疼痛模型中均能表现出显著的镇痛作用。因此，该类棕榈酰化修饰的阿片肽类似物在镇痛新药研发中具有潜在的应用价值。

Description

基于内吗啡肽2或Biphalin的棕榈酰化修饰的阿片肽类似物及其合成和应用

技术领域

本发明涉及一类阿片肽类似物的合成，尤其涉及一类基于阿片肽内吗啡肽2、Biphalin通过棕榈酰化修饰而构建的全新阿片肽类似物及其合成方法；本发明同时还涉及该类阿片肽类似物在镇痛药物制备中的应用，属于医药技术领域。

背景技术

疼痛是一种令人不快的感觉和情绪上的感受，伴随有现存的和潜在的组织损害，可导致整体生活质量下降（Pain 1986, 3:S1-226）。目前，包括吗啡、杜冷丁和芬太尼等在内的阿片类镇痛药物是临床应用最广泛的镇痛药物。并且，经过长期的临床实践和应用，阿片类镇痛药物已被证实在多种急性和慢性疼痛治疗中均具有高效的镇痛活性，已成为临床中、重度疼痛治疗的一线药物。阿片类镇痛药物主要是通过μ-阿片受体来介导其镇痛作用的（Nature 1997, 386:499-502）。因此，针对阿片受体类的新药研究和开发一直是镇痛药物研发中“热点”。大量的研究表明，阿片肽也能通过作用于阿片受体而介导高效的镇痛活性。而多肽药物普遍具有高效、低作用剂量、低副作用的优点，阿片肽在镇痛新药研发中具有广泛的应用前景。

已有的研究发现，内吗啡肽2 和Biphalin这两种阿片肽均具有高效的镇痛的作用。内吗啡肽2（EM-2, Tyr-Pro-Phe-Phe-NH₂）是1997年从哺乳动物牛脑组织中分离出来的μ-阿片受体的内源性配体，对μ-阿片受体具有很高的亲和力和特异选择性，并广泛分布于人中枢神经系统（CNS）中。相关药理学活性研究表明，在热板实验、甩尾实验、福尔马林痛实验模型及抗痛敏模型中，EM-2都能产生有效的中枢镇痛作用。而且，低剂量的EM-2在神经痛模型中就能产生镇痛作用。而Biphalin（[Tyr-(D)Ala-Gly-Phe-NH]₂）是Lipkowski 等人于1982年发现的一种高效镇痛的阿片肽，它是内源性阿片肽脑啡肽的类似物。进一步药理学活性研究表明，Biphalin可显著地增强其镇痛活性。其在体内和体外实验中作用的效价大于吗啡，中枢和腹腔注射时都能引起极其高效的镇痛作用。因此，以阿片肽内吗啡肽2 和Biphalin可作为化学模板，通过进一步的化学修饰来提高其生物利用度，以用于镇痛新药的研发。

目前，阿片肽可通过化学的修饰来提高其受体选择性，而获得具有优势构象的阿片肽类似物，这些化学修饰手段主要为非天然氨基酸的引入、环化、脂化、糖基化等（Med. Res. Rev. 2012, 32(3):536-80）。脂化修饰不仅可提高多肽分子的脂溶性，还能显著地增强其稳定性，有效防止多肽分子被体内水解酶所降解，同时，还影响了药物的吸收、分布、排泄和生物利用度，所以脂化修饰是多肽药物的化学修饰和结构优化中的有效策略之一。

发明内容

本发明的目的是针对内吗啡肽2、Biphalin两种阿片肽类在镇痛剂量范围内伴随一些副作用且稳定性差等弱点，提供了一种基于内吗啡肽2或Biphalin的棕榈酰化修饰的阿片肽类似物，以增强其镇痛活性。

本发明的另一目的是提供一种上述基于内吗啡肽2或Biphalin的棕榈酰化修饰的阿片肽类似物的化学合成方法。

本发明还有一个目的，就是提供上述阿片肽类似物的镇痛活性及在制备镇痛药物中的应用。

一、棕榈酰化阿片肽类似物

本发明棕榈酰化阿片肽类似物，是基于具有高效镇痛活性的阿片肽内吗啡肽2或Biphalin，通过棕榈酰化修饰化学构建而成的一类全新的阿片肽类似物。其结构式如下：

化合物

（二）棕榈酰化阿片肽类似物的合成

本发明阿片肽类似物的合成，是以高效阿片配体内吗啡肽2或Biphalin为化学模板，在保留其关键“药效团”的前提下，在其C末端连接3个Lys（多个Lys是为了提高溶解性），再通过C末端第一个Lys侧链氨基上化学连接一个γ-Glu，然后经棕榈酸酰化修饰而获得。其具体合成工艺如下：

（1）树脂的预处理：将Rink-Amide-MBHA树脂在二氯甲烷中搅拌，使树脂充分溶胀后减压抽干溶剂；

（2）脱除Fmoc保护基：在溶胀、抽干溶剂的树脂中，加入六氢吡啶（Piperidine）、1,8-二氮杂环十一碳-7-烯（DBU）及DMF的混合溶液，搅拌反应3~5min后抽干，重复3次，最后加DMF洗涤，茚检，得到脱除Fmoc基团保护的树脂；

混合溶液中，六氢吡啶、1,8-二氮杂环十一碳-7-烯、DMF的体积比为1:1:98；

（3）连接子Lys的缩合：将等摩尔比的N-(9-芴甲氧羰酰基)-N'-甲基三苯甲基-L-赖氨酸Fmoc-Lys(Mtt)-OH、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐完全溶解于DMF中混匀，再在混合溶液中加入二异丙基乙胺；混匀后加至步骤（2）所得脱除Fmoc基团保护的树脂中，在氩气保护下搅拌反应60 min，抽干溶剂；用DMF重复洗涤、抽干，茚检后按步骤（2）的工艺脱除Fmoc基团保护，得到脱除Fmoc保护基团的肽树脂。

Fmoc-Lys(Mtt)-OH的加量为脱除Fmoc基团保护的树脂摩尔量的2~4倍；

二异丙基乙胺的加入量为Fmoc-Lys(Mtt)-OH摩尔量的2倍；

（4）主链延长：将步骤（3）所得脱除Fmoc保护基团的肽树脂按步骤（2）、步骤（3）的工艺，依次完成Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Phe-OH或Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Pro-OH或Fmoc-(D)Ala-OH，Boc-Tyr(tBu)-OH的缩合和脱Fmoc基团保护，并保留Boc-Tyr(tBu)-OH的Boc保护基团，得到肽树脂Boc-Tyr(tBu)-Pro-Phe-Phe-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Mtt)-Resin或

Boc-Tyr(tBu)-(D)Ala-Gly-Phe-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Mtt)- Resin；

（5）Lys侧链Mtt保护基团的脱除：将步骤（4）得到的肽树脂抽干溶剂后，加入体积浓度1%~1.5%三氟乙酸的二氯甲烷溶液中，搅拌90~120 s后抽干，重复50次；最后加入DMF冲洗，得到脱除Lys侧链Mtt基团保护的肽树脂Boc-Tyr(tBu)-Pro-Phe-Phe-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys-Resin

或Boc-Tyr(tBu)-(D)Ala-Gly-Phe-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys-Resin；

（6）Lys侧链的棕榈酰化修饰：将步骤（5）所得肽树脂按步骤（2）、步骤（3）的工艺依次完成Fmoc-Glu-OtBu的缩合和脱Fmoc基团保护，茚检，得缩合和脱除Fmoc基团保护的树脂；再将等摩尔比的棕榈酸、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐完全溶解于DMF中，混匀后加入二异丙基乙胺，混匀后加入到上述缩合和脱除Fmoc基团保护的树脂，搅拌反应4~6小时，抽干，用DMF洗涤，得Lys侧链棕榈酰化的肽树脂；

上述棕榈酸的量为缩合和脱除Fmoc基团保护的树脂摩尔量的2~4倍；

二异丙基乙胺的加入量为棕榈酸摩尔量的2倍；

（7）肽链从树脂上的切割：将步骤（6）所得Lys侧链棕榈酰化的肽树脂用二氯甲烷、甲醇交替洗涤，充分抽干溶剂后，加入切割剂，于室温下切割反应2~3小时；过滤，滤液在不高于37℃的条件下充分减压旋干，然后用不高于-10℃的乙醚析出沉淀，加水充分溶解沉淀，分离除去水相中的乙醚；水相通过冷冻干燥得到白色的粗肽固体粉末；

（8）粗肽的脱盐和纯化：以体积浓度15~20%乙酸溶液为流动相，将粗肽固体粉末过Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱；利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥，得脱盐的肽化合物；再用反相高效液相色谱柱对脱盐的肽化合物进行分离纯化，经分离后收集样品主峰，即为目标产物。

上述方法制备的产物经质谱和色谱分析检测，与设计的化合物结构一致。表明成功合成了棕榈酰化修饰的阿片肽类似物化合物及化合物；纯化后样品纯度为98％以上。

三、棕榈酰化阿片肽类似物的镇痛实验

下面通过体内实验说明本发明设计合成的两种阿片肽类似物在痛觉调节方面的药理学功能。在多种痛模型中，检测化合物和化合物这两种药物在侧脑室注射水平的镇痛活性。实验过程中，环境温度控制在22 ± 1 ℃；实验动物可自由进食、饮水。为了确保药物注射位点的准确性，需要提前4天对实验所用小鼠进行侧脑室埋管手术。药物均用生理盐水溶解，-20℃保存，使用前解冻。小鼠侧脑室每次注射4 μl药物，然后用1 μl生理盐水冲洗管道。

1、化合物和化合物在光热甩尾急性痛中的镇痛活性研究

本发明的化合物、化合物和阴性对照生理盐水，通过侧脑室注射后，利用小鼠光热甩尾实验进行体内痛觉调节作用的活性检测。

（1）小鼠的侧脑室埋管手术

选取体重为20 ± 2 g的昆明系雄性小鼠，首先用戊巴比妥钠（80 mg/kg小鼠体重）将其麻醉，然后将小鼠头部固定在立体定位仪上，在小鼠侧脑室位置精准的植入自制的不锈钢管（直径为0.48 mm，上面接一小段PE-10管）。沿着矢状缝剪开小鼠头皮，露出颅骨。从前颅向后3 mm，向右1 mm，即为侧脑室的上方位置。将自制钢管向下插入3 mm，即为侧脑室。用医科牙托粉和胶水固定钢管，凝固后缝合伤口。小鼠需要恢复4天，第5天开始后续实验。实验中涉及到的手术器械、不锈钢管等均用新吉尔灭消毒。

（2）痛觉检测实验

使用光热甩尾仪对药物在急性痛中的镇痛活性进行检测。甩尾实验测定中，将光束集中在小鼠尾部靠近尾端的2-3 cm处，光强度调整至小鼠的甩尾阈值为3-5 s。测定3次基础值后，弃去反应过于敏感或迟钝的小鼠。小鼠给药后，记录给药之后第5, 10, 15, 20,30, 40, 50, 60 min的甩尾潜伏期。将10 s设为最长甩尾潜伏期以防止烫伤。

（3）计算药物镇痛作用的MPE和ED₅₀值

用最大可能效应MPE（maximum possible effect）值来评价药物的镇痛效果，MPE（%）= 100 × [(给药后的痛阈-基础痛阈)/(10秒-基础痛阈)]。相关的MPE值数据用平均值±标准误差（Means ± S.E.M.）表示，不同药物浓度处理的组间差异用单因素方差分析（one-way ANOVA的Bonferroni’s post-hoc检验）来进行数据统计和分析；^**P < 0.01，^***P< 0.001 表示药物处理组的曲线下面积AUC（0-60分钟）值与生理盐水组之间存在显著性差异。

实验结果如图1、2所示。图1表示，侧脑室注射1.25、2.5和5 nmol的化合物后可以产生剂量和时间依赖的镇痛作用（F_3,29=112.48，^***P< 0.001），注射药物后5 min镇痛效果达到最大，其中5 nmol 化合物的最大镇痛作用可达到100% MPE值，镇痛时间可持续60min左右。如图2所示，侧脑室注射化合物（0.25，0.5，1和1.5 nmol）可介导剂量和时间依赖的镇痛作用（F_4,39=110.26，^***P< 0.001），其镇痛效应最高点出现在药物注射后的5 min，其中1.5 nmol 化合物的最大镇痛作用为91%的MPE值，镇痛作用时间持续约60 min。

ED₅₀值表示药物产生50%最大镇痛效应时的药物剂量。利用统计学软件GraphPadPrism 5.0版本，分别绘制了化合物和化合物在侧脑室给药时的最大镇痛效应时间点的MPE（％）值的量效曲线（见图3），并计算出化合物和化合物在侧脑室注射诱导镇痛的ED50值和95%的置信区间，相关数据如表1所示：

2、侧脑室注射化合物和化合物对福尔马林痛的调节

采用小鼠福尔马林致痛模型研究化合物和化合物对福尔马林引发的急性痛和炎症痛的调节作用。

（1）小鼠福尔马林致痛实验的检测方法

首先将小鼠放入有机玻璃盒中，使其适应环境15 min。侧脑室给药5 min后，在小鼠的右后脚掌注射20 μl 5%的福尔马林溶液，记录注射后30 min内小鼠足部的行为学反应。由于福尔马林会引起两个时相的反应，采用的行为学记录方法为：记录注射福尔马林后0-5 min（第一相）和15-30 min（第二相）内的舔、咬、抖被注射足时间。

（2）小鼠福尔马林致痛实验结果的统计

利用最大可能效应MPE（maximum possible effect）值来评价药物对福尔马林痛的痛觉调节作用，MPE（%）=100×[(空白溶剂对照组的舔、咬、抖被注射足时间-药物组的舔、咬、抖被注射足时间)/(空白溶剂对照组的舔、咬、抖被注射足时间)]。数据用平均值±标准误差（Means ± S.E.M.）表示，不同药物处理组各时间点所测定的MPE值与生理盐水对照组之间的差异用单因素方差（one-way ANOVA的Bonferroni检验）来进行分析和统计，^**P <0.01，^***P < 0.001 表示有显著性差异。实验结果如图4、5所示。

图4表明，侧脑室注射5、2.5和1.25 nmol的化合物后可以产生两相剂量依赖的镇痛作用（第一相：F_3,31= 42.42，^***P<0.001；第二相：F_3,31= 16.87，^***P<0.001）。5 nmol 化合物在第一相中产生的镇痛效果为84%MPE值；在第二相中的镇痛作用可达81%MPE值。图5显示，侧脑室注射化合物（3 nmol、2 nmol和1 nmol）后可以产生两相剂量依赖的镇痛作用（第一相：F_3,30= 39.05，^***P<0.001；第二相：F_3,30=22.78，^***P<0.001），其中3 nmol 化合物在第一相中的镇痛效果可达到为87%MPE值；在第二相中可产生约为84%MPE值的镇痛效果。

利用统计学软件GraphPad Prism 5.0版本，分别绘制了化合物和化合物通过侧脑室给药时在第一相和第二相中的最大镇痛效应时间点的MPE（%）值的量效曲线（见图6、7），并计算出化合物和化合物在侧脑室注射诱导镇痛的ED₅₀值和95%的置信区间，相关数据如表2所示：

3、侧脑室注射化合物和化合物对醋酸扭体内脏痛的调节

为了进一步评价化合物和化合物的镇痛作用，利用临床前镇痛药物评价方法来研究了化合物和化合物对内脏痛的调节作用。采用小鼠醋酸扭体内脏痛模型。

（1）小鼠醋酸扭体内脏痛实验的检测方法

将小鼠放入有机玻璃盒中适应环境15 min；给小鼠待检测药物，5 min后小鼠腹腔注射10 ml/kg 0.6%的醋酸溶液。5 min后开始记录小鼠的扭体反应，记录10 min。小鼠出现躯干伸长扭曲、腹部内凹、臀部抬高，后肢伸张等特征性反应，记为一次扭体反应。

（2）小鼠醋酸扭体内脏痛实验结果的统计

药物对醋酸扭体内脏痛的痛觉调节作用利用最大可能效应MPE（maximumpossible effect）值来评价，MPE（%）= 100×[(生理盐水组扭体数-药物组扭体数)／生理盐水组扭体数]。用单因素方差方法（ANOVA）进行分析，显著性差异用Bonferroni来检验，^**P <0.01，^***P < 0.001表示有显著性差异。实验结果如图8、9所示。

从图8、9可以看出，侧脑室注射不同浓度化合物（10 nmol、5 nmol和1 nmol）和化合物（3 nmol、2 nmol和1 nmol）在5-15 min可以产生剂量依赖的镇痛作用（化合物I：F_3,30=100.16，^***P<0.001；化合物II：F_3,32=98.05，^***P<0.001），其中10 nmol化合物的镇痛效果为86.63%MPE值；3 nmol化合物的镇痛作用可达到97.76%MPE值。

利用统计学软件GraphPad Prism 5.0版本，分别绘制了化合物和化合物在侧脑室给药时的最大镇痛效应时间点的MPE（%）值的量效曲线（见图10），并计算出化合物和化合物在侧脑室注射诱导镇痛的ED₅₀值和95%的置信区间，相关数据如表3所示。

4、侧脑室注射化合物I对角叉菜胶诱导炎症痛的调节

（1）小鼠角叉菜胶诱导炎症痛实验的检测方法

将小鼠置于透明地板的小隔间中适应30 min。首先测定基础痛阈值。然后建立炎症模型，在小鼠足跖皮下注射20 μl 2 %的角叉菜胶溶液。最后，测定药物的镇痛作用。先测定痛敏值，测定方法如同基础值的测定。然后小鼠侧脑室注射4 μl药物。测定给药后不同时间点的痛阈值。

（2）小鼠角叉菜胶诱导炎症痛实验结果的统计

药物对角叉菜胶诱导的炎症痛的痛觉调节作用利用最大可能效应MPE（maximumpossible effect）值来评价，MPE（%）＝100×[(给药后的痛阈值-痛敏值)/(基础值-痛敏值)]。数据用平均值±标准误差（Means ± S.E.M.）表示，不同药物处理组各时间点所测定的MPE值与生理盐水对照组之间的差异用单因素方差（one-way ANOVA的Bonferroni检验）来进行分析和统计，^**P < 0.01，^***P < 0.001 表示药物处理组的最大MPE值与生理盐水组相同时间点的MPE值相比差异显著。实验结果如图11所示。

从图11可以看出，侧脑室注射5、2.5和1.25 nmol的化合物后可以产生剂量依赖的镇痛作用（F_3,31=58.65，^***P<0.001），化合物在10 min达到最大镇痛作用，其中5 nmol化合物的最大镇痛作用可达82%MPE值。

利用统计学软件GraphPad Prism 5.0版本，绘制了化合物在侧脑室给药时的最大镇痛效应时间点的MPE（％）值的量效曲线（见图12），并计算出化合物在侧脑室注射诱导镇痛的ED50值和95%的置信区间，其ED₅₀（nmol）为1.92（1.47, 2.50）nmol。

综上所述，本发明以高效阿片配体内吗啡肽2、Biphalin作为化学模板进行棕榈酰化修饰获得了两种阿片肽类似物化合物和化合物，侧脑室注射在光热甩尾急性痛实验中的镇痛作用强度分别为吗啡作用的0.6和2.03倍（CN201210098832.2）。另外其在福尔马林诱导的急性痛和炎症痛以及角叉菜胶诱导的炎症痛、醋酸扭体内脏痛等多种病理性痛模型中均能产生很好的镇痛作用。因此，该类全新的棕榈酰化修饰阿片肽类似物在治疗临床疼痛中具有潜在的应用前景。

附图说明

图1为小鼠侧脑室注射化合物在光热甩尾模型中所产生的镇痛作用。

图2为小鼠侧脑室注射化合物在光热甩尾模型中所产生的镇痛作用。

图3为小鼠侧脑室注射化合物和化合物在光热甩尾模型所产生的镇痛作用的量效曲线。

图4为小鼠侧脑室注射化合物在福尔马林痛中所产生的镇痛作用。

图5为小鼠侧脑室注射化合物在福尔马林痛中所产生的镇痛作用。

图6为小鼠侧脑室注射化合物和化合物在福尔马林痛第一相中所产生的镇痛作用的量效曲线。

图7为小鼠侧脑室注射化合物和化合物在福尔马林痛第二相中所产生的镇痛作用的量效曲线。

图8为小鼠侧脑室注射化合物在醋酸扭体中所产生的镇痛作用。

图9为小鼠侧脑室注射化合物在醋酸扭体中所产生的镇痛作用。

图10为小鼠侧脑室注射化合物和化合物在醋酸扭体中所产生的镇痛作用的量效曲线。

图11为小鼠侧脑室注射化合物在角叉菜胶诱导炎症痛中所产生的镇痛作用。

图12为小鼠侧脑室注射化合物在角叉菜胶诱导炎症痛中所产生的量效曲线。

图13为化合物的合成路线图。

图14为化合物的合成路线图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明阿片肽类似物化合物和化合物的合成方法作进一步说明。本实施例所涉及的仪器材料及试剂如下：

仪器：高效液相色谱仪（HPLC）为Waters公司的Delta 600；分析柱：XBridge TMBEH 130 Prep C18（4.6 mm×250 mm）；制备柱：XBridge TM BEH 130 Prep C18（19 mm×250mm）。质谱仪型号为德国道尔顿公司Mariner ESI-TOF MS, Applied Biosystems, CA。旋转蒸发仪为上海亚荣RE-5298A。质谱仪为Mariner ESI-TOF MS, Applied Biosystems,CA。冷冻干燥机购于美国VIRTIS公司。手动固相多肽合成仪，由本实验室设计后由玻璃工制作（合成仪的设计原理具体参考Chen WC和White PD所编的《Fmoc solid phase peptidesynthesis》中第14页图4，并在其基础上作了部分改进。）。

试剂：树脂为Rink-Amide-MBHA-Resin （0.37 mmol/g），天津南开和成公司。Fmoc保护氨基酸、Boc保护氨基酸、N,N-二异丙基乙胺（DIEA）、1,8-二氮杂环[5,4,0]十一碳-7-烯（DBU）、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐（HBTU）、1-羟基苯并三唑（HOBT）、苯甲硫醚和三异丙基硅烷（TIS）均购自吉尔生化（上海）有限公司。 N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、二氯甲烷（DCM）、六氢吡啶和甲醇购于天津第二试剂厂。三氟乙酸（TFA）、苯酚、茚三酮和吡啶均为天津试剂一厂产品。乙腈购于美国天地Tedia公司。以上所有试剂都经过重蒸处理。

实施例1：化合物的合成

（1）树脂的预处理：将0.5 g Rink-Amide-MBHA树脂在二氯甲烷中搅拌，使树脂充分溶胀后减压抽干溶剂；

（2）脱除Fmoc保护基：在溶胀、抽干溶剂的树脂中，加入六氢吡啶（Piperidine）、1,8-二氮杂环十一碳-7-烯（DBU）、DMF的混合溶液（体积比为1:1:98），搅拌反应5 min后抽干，重复3次，最后加DMF洗涤，茚检，得到脱除Fmoc基团保护的树脂；

（3）连接子Lys的缩合：将等摩尔比的N-(9-芴甲氧羰酰基)-N'-甲基三苯甲基-L-赖氨酸Fmoc-Lys(Mtt)-OH、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐完全溶解于DMF中，混匀后在混合溶液中加入二异丙基乙胺；然后混匀加至步骤（2）所得脱除Fmoc基团保护的树脂中，在氩气保护下搅拌反应60 min，抽干溶剂；用DMF重复洗涤、抽干，茚检后按步骤.的工艺脱除Fmoc基团保护，得到脱除Fmoc保护基团的肽树脂。上述的Fmoc-Lys(Mtt)-OH的量为脱除Fmoc基团保护的树脂摩尔量的3倍；二异丙基乙胺的加入量为Fmoc-Lys(Mtt)-OH摩尔量的2倍。

（4）主链延长：将步骤（3）所得脱除Fmoc保护基团的肽树脂按步骤（2）、步骤（3）的工艺依次完成Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、和Boc-Tyr(tBu)-OH的缩合和脱Fmoc基团保护，并保留Boc-Tyr(tBu)-OH的Boc保护基团，得到肽树脂Boc-Tyr(tBu)-Pro-Phe-Phe-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Mtt)-Resin。

（5）Lys侧链Mtt保护基团的脱除：将步骤（4）得到的肽树脂Boc-Tyr(tBu)-Pro-Phe-Phe-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Mtt)-Resin抽干溶剂后，加入体积浓度1%~1.5%的TFA/DCM溶液，搅拌90~120 s后抽干，重复50次；最后加入DMF冲洗，得到脱除Lys侧链Mtt基团保护的肽树脂Boc-Tyr(tBu)-Pro-Phe-Phe-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys-Resin。

（6） Lys侧链的棕榈酰化修饰：将步骤（5）所得肽树脂Boc-Tyr(tBu)-Pro-Phe-Phe-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys-Resin按步骤（2）、步骤（3）的工艺依次完成Fmoc-Glu-OtBu的缩合和脱Fmoc基团保护，茚检；得到缩合和脱Fmoc基团保护的树脂；

（7）将等摩尔比的棕榈酸、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐完全溶解于DMF中混匀，再在混合溶液中加入二异丙基乙胺，混匀后加至步骤（6）所得缩合和脱除Fmoc基团保护的肽树脂中，搅拌反应4小时。抽干，用DMF洗涤，得肽树脂。上述的棕榈酸加入摩尔量为缩合和脱除Fmoc基团保护的树脂摩尔量的3倍，二异丙基乙胺的加入量为棕榈酸摩尔量的2倍；

（8）肽链从树脂上的切割：将上步所得肽树脂用二氯甲烷、甲醇交替洗涤充分抽干溶剂后，加入切割剂，于室温下切割反应2~3小时；过滤，滤液在不高于37 ℃的条件下充分减压旋干，然后用不高于-10 ℃的乙醚析出沉淀；吸出上清液弃之，加水充分溶解沉淀后将乙醚从水相中分离除去，水相通过冷冻干燥得到白色的粗肽固体粉末151.71 mg，产率为62%。

（9）粗肽的脱盐和纯化：以体积浓度15~20%乙酸溶液为流动相，过Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱；利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥，得脱盐的肽化合物；再用反相高效液相色谱柱对脱盐的肽化合物进行分离纯化，经分离后收集样品主峰。化合物Ⅰ和化合物Ⅱ分别在约45 min和40 min时出现最高峰。其合成的总产率分别为31.6%和28.7%。纯化后的化合物纯度均为98％以上。分析色谱柱为：Delta Pak C₁₈, 5 μm, 150×3.9 mm。

实施例2、肽化合物的合成

步骤（1）、（2）、（3）同实施例1。

（4）主链延长：将步骤（3）所得脱除Fmoc保护基团的肽树脂按步骤（2）、步骤（3）的工艺依次完成Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-(D)Ala-OH、和Boc-Tyr(tBu)-OH的缩合和脱Fmoc基团保护，并保留Boc-Tyr(tBu)-OH的Boc保护基团，得到肽树脂Boc-Tyr(tBu)-(D)Ala-Gly-Phe-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Mtt)-Resin。

（5） Lys侧链Mtt保护基团的脱除：将步骤（4）得到的肽树脂Boc-Tyr(tBu)-(D)Ala-Gly-Phe-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Mtt)-Resin抽干溶剂后，加入体积浓度1%~1.5%的TFA/DCM溶液，搅拌90~120 s后抽干，重复50次；最后加入DMF冲洗，得到脱除Lys侧链Mtt基团保护的肽树脂。

（6）Lys侧链的棕榈酰化修饰：将步骤（5）所得肽树脂Boc-Tyr(tBu)-Pro-Phe-Phe-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys-Resin按步骤（2）、步骤（3）的工艺依次完成Fmoc-Glu-OtBu的缩合和脱Fmoc基团保护，茚检，茚检；得到缩合和脱Fmoc基团保护的树脂；

（7）将等摩尔比的棕榈酸、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐完全溶解于DMF中混匀，再在混合溶液中加入二异丙基乙胺，混匀后加至步骤（6）所得缩合和脱除Fmoc基团保护的肽树脂中，搅拌反应4小时。抽干，用DMF洗涤，得肽树脂。上述的棕榈酸摩尔量为脱除Fmoc基团保护的树脂摩尔量的3倍，二异丙基乙胺的加入量为棕榈酸摩尔量的2倍；

（8）肽链从树脂上的切割：将上步所得肽树脂用二氯甲烷、甲醇交替洗涤充分抽干溶剂后，加入切割剂，于室温下切割反应2~3小时；过滤，滤液在不高于37 ℃的条件下充分减压旋干，然后用不高于-10 ℃的乙醚析出沉淀；吸出上清液弃之，加水充分溶解沉淀后将乙醚从水相中分离除去，水相通过冷冻干燥得到白色的粗肽固体粉末150.34 mg，产率为67.3%。

（9）粗肽的脱盐和纯化：以体积浓度15~20%乙酸溶液为流动相，过Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱；利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥，得脱盐的肽化合物；再用反相高效液相色谱柱对脱盐的肽化合物进行分离纯化，经分离后收集样品主峰。化合物I和化合物II分别在约45 min和40 min时出现最高峰。其合成的总产率分别为31.6%和28.7%。纯化后的化合物样品纯度均为98％以上。分析色谱柱为：Delta Pak C₁₈, 5 μm, 150×3.9 mm。采用两个洗脱梯度（梯度条件同实施例1）。化合物的质谱和色谱分析检测结果见表4：

注：体系1：梯度洗脱体系1为：10–100% 乙腈/水(0.1% TFA) (30 分钟完成)，流速为：1 mL/min，检测波长为220 nm，分析色谱柱为：XBridge ^TM BEH 130 Prep C₁₈，4.6 mm×250mm；

体系2：梯度洗脱体系2为：10–80%乙腈/水(0.1% TFA) (30 分钟完成)，流速为：1mL/min，检测波长为220 nm，分析色谱柱为：XBridge ^TM BEH 130 Prep C₁₈，4.6 mm×250mm。

Claims

1.基于内吗啡肽2或Biphalin的棕榈酰化修饰的阿片肽类似物，其化学结构式如下：

化合物

化合物。

2.如权利要求1所述基于内吗啡肽2或Biphalin的棕榈酰化修饰的阿片肽类似物的合成方法，包括以下工艺步骤：

（2）脱除Fmoc保护基：在溶胀、抽干溶剂的树脂中，加入六氢吡啶、1,8-二氮杂环十一碳-7-烯及DMF的混合溶液，搅拌反应3~5min后抽干，重复3次，最后加DMF洗涤，茚检，得到脱除Fmoc基团保护的树脂；

（3）连接子Lys的缩合：将等摩尔比的N-(9-芴甲氧羰酰基)-N'-甲基三苯甲基-L-赖氨酸Fmoc-Lys(Mtt)-OH、N-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐完全溶解于DMF中，混匀后在混合溶液中加入二异丙基乙胺，混匀后加至步骤（2）所得脱除Fmoc基团保护的树脂中，在氩气保护下搅拌反应60 min，抽干溶剂；用DMF重复洗涤、抽干，茚检后按步骤（2）的工艺脱除Fmoc基团保护，得到脱除Fmoc保护基团的肽树脂；

（4）主链延长：将步骤（3）所得脱除Fmoc保护基团的肽树脂按步骤（2）、步骤（3）的工艺，依次完成Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Phe-OH或Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Pro-OH或Fmoc-(D)Ala-OH，Boc-Tyr(tBu)-OH的缩合和脱Fmoc基团保护，并保留Boc-Tyr(tBu)-OH的Boc保护基团，得到肽树脂Boc-Tyr(tBu)-Pro-Phe-Phe-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Mtt)-Resin或Boc-Tyr(tBu)-(D)Ala-Gly-Phe-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Mtt)-Resin；

（5）Lys侧链Mtt保护基团的脱除：将步骤（4）得到的肽树脂抽干溶剂后，加入体积浓度1%~1.5% 三氟乙酸的二氯甲烷溶液中，搅拌90~120 s后抽干，重复50次；最后加入DMF冲洗，得到脱除Lys侧链Mtt基团保护的肽树脂Boc-Tyr(tBu)-Pro-Phe-Phe-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys-Resin或Boc-Tyr(tBu)-(D)Ala-Gly-Phe-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys-Resin；

3.如权利要求2所述基于内吗啡肽2或Biphalin的棕榈酰化修饰的阿片肽类似物的合成方法，其特征在于：步骤（2）的混合溶液中，六氢吡啶、1,8-二氮杂环十一碳-7-烯、DMF的体积比为1:1:98。

4.如权利要求2所述基于内吗啡肽2或Biphalin的棕榈酰化修饰的阿片肽类似物的合成方法，其特征在于：步骤（3）中，Fmoc-Lys(Mtt)-OH的量为脱除Fmoc基团保护的树脂摩尔量的2~4倍。

5.如权利要求2所述基于内吗啡肽2或Biphalin的棕榈酰化修饰的阿片肽类似物的合成方法，其特征在于：步骤（3）中，二异丙基乙胺的加入量为Fmoc-Lys(Mtt)-OH摩尔量的2倍。

6.如权利要求2所述基于内吗啡肽2或Biphalin的棕榈酰化修饰的阿片肽类似物的合成方法，其特征在于：步骤（6）中，棕榈酸的量为缩合和脱除Fmoc基团保护的树脂摩尔量的2~4倍。

7.如权利要求2所述基于内吗啡肽2或Biphalin的棕榈酰化修饰的阿片肽类似物的合成方法，其特征在于：步骤（6）中，二异丙基乙胺的加入量为棕榈酸摩尔量的2倍。

8.如权利要求2所述基于内吗啡肽2或Biphalin的棕榈酰化修饰的阿片肽类似物的合成方法，其特征在于：步骤（7）中采用的切割剂是由三氟乙酸、三异丙基硅烷、水以95:2.5:2.5的体积比混合形成的溶液。

9.如权利要求3所述基于内吗啡肽2或Biphalin棕榈酰化修饰的阿片肽类似物的合成方法，其特征在于：所述切割剂的加入量为每克肽树脂加入10~25 mL的切割剂。

10.如权利要求1所述基于内吗啡肽2 或Biphalin的棕榈酰化修饰的阿片肽类似物在制备镇痛药物方面的应用。