CN111087474B - 一种基于大麻肽(r)VD-Hpα和神经肽FF的嵌合肽及其制备方法与应用 - Google Patents

一种基于大麻肽(r)VD-Hpα和神经肽FF的嵌合肽及其制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111087474B
CN111087474B CN201911323745.0A CN201911323745A CN111087474B CN 111087474 B CN111087474 B CN 111087474B CN 201911323745 A CN201911323745 A CN 201911323745A CN 111087474 B CN111087474 B CN 111087474B
Authority
CN
China
Prior art keywords
phe
resin
alpha
peptide
mixed solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201911323745.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111087474A (zh
Inventor
方泉
许彪
张梦娜
张润
李宁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lanzhou University
Original Assignee
Lanzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lanzhou University filed Critical Lanzhou University
Priority to CN201911323745.0A priority Critical patent/CN111087474B/zh
Publication of CN111087474A publication Critical patent/CN111087474A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111087474B publication Critical patent/CN111087474B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于大麻肽(r)VD‑Hpα和神经肽FF的嵌合肽及其制备方法与应用，即基于(r)VD‑Hpα的N末端序列与神经肽FF的C末端序列构建而成的全新嵌合肽VF‑11和VF‑13。与现有技术相比，本发明具有如下优势：(1)与已报道的(r)VD‑Hpα及(m)VD‑Hpα相比，VF‑11和VF‑13在体内的镇痛活性有所加强，产生了比母体分子更有效的镇痛效果。(2)VF‑11和VF‑13解决了经典大麻类激动剂以及母体分子存在的镇痛耐受的问题，产生了无耐受形式的镇痛效果，可用于急性痛和病理性疼痛的治疗。

Description

一种基于大麻肽(r)VD-Hpα和神经肽FF的嵌合肽及其制备方 法与应用
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种基于大麻肽(r)VD-Hpα和神经肽FF的嵌合肽及其制备方法与应用。
背景技术
疼痛是人类进化过程中为保护自身完整性而形成的一种感觉机制。然而，一些慢性、难治愈的疼痛严重影响人们的生活质量，在临床治疗中存在极大的挑战。大麻类物质被用于疼痛的治疗已有几千年的历史(J Psychoactive Drugs.1981,13(1):23；Pain ResManag.2001,6(2):80)。生物体内的大麻系统主要包括两种大麻受体(CB1受体和CB2受体)，内源性大麻配体以及相关的代谢酶类。CB1受体在全身的分布范围较广，尤其在中枢神经系统分布最多；CB2受体的分布区域相对比较保守，主要在免疫细胞和组织中表达(Adv ClinExp Med.2007,16(6):807)。经典的内源性大麻配体包括花生四烯乙醇胺(AEA)(Science.1992,258(5090):1946)和花生四烯酰甘油(2-AG)(Biochem Pharmacol.1995,50(1):83)。研究表明，大麻系统在疼痛调节过程中扮演重要的角色。
2003年，来源于血红蛋白α链的片段hemopressin(PVNFKFLSH-OH)被首次鉴定(JBiol Chem.2003,278:8547)。Hemopressin对于急性疼痛和病理性疼痛均可产生明显的镇痛效果(Proc Natl Acad Sci U S A.2007,104(51):20588；Peptides.2005,26(3):431)。VD-hemopressin(α)(VD-Hpα)是体内存在的hemopressin的N末端延伸片段，在体外功能实验中表现为CB1受体的激动剂(FASEB J.2009.23:3020)。不同种属哺乳动物体内VD-Hpα之间存在很高的氨基酸序列同源性(Neuropeptides.2017,63:83)。进一步的药理学研究表明，中枢注射VD-Hpα可以在小鼠不同临床前痛模型中产生明显的镇痛作用。此外，VD-Hpα参与到心血管调节、摄食、运动活性、胃肠运动和体温调节等生理过程。然而，与经典的大麻配体WIN55,212-2一样，侧脑室连续注射VD-Hpα产生明显的耐受现象(Neuropeptides.2017,63:83；J Pharmacol Exp Ther.2014,348:316)。
神经肽FF(NPFF)于1985年被首次在牛脑中分离。NPFF系统包括两种受体前体(Pro-NPFFA和NPFFB)和两种受体(NPFF1和NPFF2)(FEBS Lett.1997,409:426；MolPharmacol.1999,55:804)。研究表明，NPFF系统参与体内多种生理过程，例如摄食、体温和胃肠运动。此外，NPFF作为一种内源性肽类配体对阿片诱导的镇痛、耐受和成瘾产生显著的调节效果。近年来的药理学研究表明，NPFF不仅表现出抗阿片活性，而且其对大麻类物质的镇痛以及耐受和便秘副作用也有明显的调节作用(Eur J Pharmacol.2015,767:119；Anesth Analg.2015,121:1360)。因此，NPFF对大麻的调节作用使两者作为化学模板分子来发展全新嵌合肽。
本课题组在专利201310087565.3中公开了一种内源性大麻肽类激动剂(m)VD-Hpα(VDPVNFKLLSH-OH)在制备镇痛药物中的应用。药理学实验结果表明：该内源性大麻肽类配体在光热甩尾实验中表现出较强的中枢镇痛活性，并具有对体温、胃肠功能和运动活性影响小的优点。然而，(m)VD-Hpα的镇痛效果仍不理想，且长期给药过程中会出现明显的镇痛耐受现象。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种镇痛效果好、副作用低的基于大麻肽(r)VD-Hpα和神经肽FF的嵌合肽。
本发明还要解决的技术问题是提供上述嵌合肽的制备方法。
本发明最后要解决的技术问题是提供上述嵌合肽的应用。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种基于大麻肽(r)VD-Hpα和神经肽FF的嵌合肽，其是以大麻肽(r)VD-Hpα(VDPVNFKFLSH-OH)和NPFF(FLFQPQRF-NH2)的关键药效团为化学模板构建而成的，其N末端为大麻肽(r)VD-Hpα的“关键药效团”，C末端为NPFF的“关键药效团”，其具有式Ⅰ所示的氨基酸序列，
Val-Asp-Pro-Val-Asn-Phe-Lys-Phe-Leu-Xaa10-Xaa11-Arg-Phe-NH2(Ⅰ)；
其中，Xaa10和Xaa11同时缺失，或Xaa10被Pro取代的同时Xaa11被Gln取代。
优选地，当Xaa10和Xaa11同时缺失时，所述的嵌合肽具有式Ⅱ所示的氨基酸序列，嵌合肽标记为VF-11。
Val-Asp-Pro-Val-Asn-Phe-Lys-Phe-Leu-Arg-Phe-NH2 (Ⅱ)
Figure BDA0002327814630000031
优选地，当Xaa10被Pro取代的同时Xaa11被Gln取代时，所述的嵌合肽具有式Ⅲ所示的氨基酸序列，嵌合肽标记为VF-13。
Val-Asp-Pro-Val-Asn-Phe-Lys-Phe-Leu-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2 (Ⅲ)
Figure BDA0002327814630000032
上述嵌合肽的制备方法包括如下步骤：
(1)采用Fmoc固相合成法制备多肽：
(i)树脂预处理：先溶胀氨基树脂，减压抽干，洗涤；
(ii)脱除Fmoc基团保护，茚检；
(iii)氨基酸的缩合：脱保护后，将第一个N-α-Fmoc保护的氨基酸(Fmoc-Aa)与脱保护后的氨基树脂进行缩合反应，茚检确认缩合成功；再脱保护并洗涤，茚检确认脱保护完全；
(iv)肽链的延长：然后缩合第二个氨基酸，重复以上步骤，由C端向N端，直至多肽链合成完成；
(2)用切割剂将步骤(1)合成完成的多肽链进行切割，过滤，将滤液，即切割液减压旋干，加入冰乙醚析出沉淀，用20％的醋酸水溶液萃取乙醚中的粗肽，冷冻干燥得白色粗肽粉末；并通过反相高效液相色谱将粗肽进一步分离纯化，经分离后收集样品主峰，得到多靶点多肽产品。
步骤(1)中，所述的氨基树脂为Rink-Amide-MBHA或Rink-Amide树脂，优选Rink-Amide-MBHA树脂；所述的溶胀为将氨基树脂置于二氯甲烷中按照60～100rpm的速率搅拌10～40min，优选80rpm，搅拌30min，使树脂充分溶胀；二氯甲烷与氨基树脂的体积质量比为8～12mL/g，优选10mL/g；所述的洗涤为加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤3次，每次3min。
步骤(1)中，所述的脱保护为将处理后的氨基树脂置于混合溶液中，一次搅拌，重复1～4次，优选2次，抽干；再置于混合溶液中，二次搅拌，用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤4次，以清除残余的哌啶，得到脱除Fmoc保护基团的树脂。
其中，所述的混合溶液为哌啶、1,8-二氮杂环[5,4,0]十一碳-7-烯(DBU)与DMF的混合溶液，三者的体积比为1:1:98；混合溶液与脱保护的氨基树脂的体积质量比为8～12mL/g，优选10mL/g；一次搅拌的速率为60～100rpm，优选80rpm；一次搅拌的时间为2～6min，优选5min；二次搅拌的速率为60～100rpm，优选80rpm；二次搅拌的时间为8～12min，优选10min。
步骤(1)中，所述的缩合反应为将N-α-Fmoc保护的氨基酸(Fmoc-Aa)、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)和N,N-二异丙基乙胺(DIEA)溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，得到混合溶液；将混合溶液加入脱保护后的氨基树脂中，于惰性环境，优选氩气环境下搅拌反应，抽干溶剂；用N,N-二甲基甲酰胺洗涤3次，抽干。
其中，Fmoc-Aa、HOBt、HBTU和DIEA的摩尔比为1：0.2～1.5：0.2～1.5：1.5～3，优选1：1：1：2；N,N-二甲基甲酰胺与N-α-Fmoc保护的氨基酸的体积质量比为20mL/g；其中，DIEA最后加入；所述混合溶液与脱保护后的氨基树脂的体积质量比为4～6mL/g，优选5mL/g；搅拌速率为60～100rpm，优选80rpm；所述的反应为在室温下反应40～100min，优选60min。
步骤(1)中，所述的茚检为挑取少量树脂于无色透明玻璃管中，加入茚检试剂，置于沸水中静置3min。如Fmoc基团脱除完全，则树脂和溶液均呈深蓝色。若缩合成功，则树脂无色，溶液淡黄色。茚检试剂：体积比为1：2：1的苯酚：吡啶：茚三酮溶液。其中苯酚溶液的配制为20g苯酚于5mL无水乙醇，吡啶溶液的配制为0.05mL KCN(0.001M)于2.5mL吡啶，茚三酮溶液的配制为0.5g茚三酮于10mL无水乙醇，其中苯酚、吡啶和无水乙醇均经重蒸处理。
步骤(1)中，所述的肽链延长，具体为根据多肽序列，从C端开始依次选择相应N-α-Fmoc保护的氨基酸，并将步骤(1.ii)所得脱除Fmoc保护基团的树脂按步骤(1.iii)的工艺完成肽链的缩合，得到侧链全保护的肽树脂。
步骤(2)中，所述的切割为将步骤(1)合成完成的多肽链置于切割剂中室温反应1.5～4h，优选3h；优选地，每15min于50rpm/min的搅拌速率下搅拌1min。
其中，所述的切割剂为三氟乙酸(TFA)：三异丙基硅烷(TIS)和水按照95：2.5：2.5的体积比混合而成的溶；切割剂与步骤(1)合成完成的多肽链与的体积质量比为10～20mL/g，优选15mL/g。
优选地，在切割前，将缩合后的树脂用二氯甲烷DCM(2×3min)、MeOH(1×3min)、DCM(1×3min)、MeOH(2×3min)交替洗涤，将合成仪密封后抽干4h。
上述嵌合肽在制备镇痛药中的应用也在本发明的保护范围之内，该类全新嵌合肽分子可以在急性痛和病理性痛中产生显著的镇痛效果，且降低了传统大麻类镇痛药物镇痛耐受的副作用。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：
(1)与已报道的(r)VD-Hpα及(m)VD-Hpα相比，VF-11和VF-13在体内的镇痛活性有所加强，产生了比母体分子更有效的镇痛效果。
(2)VF-11和VF-13解决了经典大麻类激动剂以及母体分子存在的镇痛耐受的问题，产生了无耐受形式的镇痛效果，可用于急性痛和病理性疼痛的治疗。
附图说明
图1为小鼠侧脑室注射VF-11在急性痛中所产生剂量依赖性镇痛作用的时效曲线。
图2为小鼠侧脑室注射VF-13在急性痛中所产生剂量依赖性镇痛作用的时效曲线。
图3为小鼠鞘内注射VF-11在急性痛中所产生剂量依赖性镇痛作用的时效曲线。
图4为小鼠鞘内注射VF-13在急性痛中所产生剂量依赖性镇痛作用的时效曲线。
图5为小鼠侧脑室注射VF-11和VF-13在炎症痛中所产生镇痛作用的时效曲线(机械刺激)。
图6为小鼠侧脑室注射VF-11和VF-13在炎症痛中所产生镇痛作用的时效曲线(光热刺激)。
图7为小鼠侧脑室中连续6天注射VF-11，VF-13和WIN 55,212-2所引起的镇痛作用的变化。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
仪器：高效液相色谱仪(HPLC)为Waters公司的Delta 600，其中分析柱(XBridgeTM BEH 130Prep C18，4.6mm×250mm)，制备柱(XBridge TM BEH 130Prep C18，19mm×250mm)。质谱仪为德国道尔顿公司的PE Biosystems，Mariner System 5074。固相多肽合成仪由本实验室自主设计。冷冻干燥机为美国VIRTIS公司的6KBTEL-85。旋转蒸发仪为中国上海亚荣公司的RE-5298A。
试剂：树脂为Rink-Amide-MBHA-Resin，购自天津南开和成公司。N-α-Fmoc保护的氨基酸(Fmoc-Aa)、N-羟基苯并三氮唑(HOBt)、O-苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲-六氟磷酸盐(HBTU)购自吉尔生化(上海)有限公司。二异丙基乙胺(DIEA)和1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)购置北京百灵威科技有限公司。二氯甲烷(DCM)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、六氢吡啶(哌啶)、甲醇(MeOH)和吡啶都购自天津第二试剂厂，三氟乙酸(TFA)和苯酚为天津试剂一厂产品；以上有机试剂使用前均经过重蒸处理。
实施例1VF-11的合成
(1)树脂预处理：称取500mg的Rink-Amide-MBHA树脂于5mL二氯甲烷中80rpm搅拌溶胀，反应时间为30min，反应结束后抽干30min。随后加入DMF洗涤3次，每次3min。
(2)脱除Fmoc基团保护：在溶胀后的树脂中加入体积分数比为1：1：98的哌啶：DBU：DMF的混合溶液，混合溶液与溶胀后的树脂的体积质量比为10mL/g；按照80rpm搅拌5min，重复2次。抽干后，再次加入上述混合溶液，按照80rpm搅拌10min。之后用DMF洗涤4次，每次3min，以清除残余的哌啶。得到脱除Fmoc保护基团的树脂；
(3)茚检：挑取少量树脂于无色透明玻璃管中，加入茚检试剂，置于沸水中静置3min。如Fmoc基团脱除完全，则树脂和溶液均呈深蓝色。茚检试剂：体积比为1：2：1的苯酚：吡啶：茚三酮溶液。其中苯酚溶液的配制为20g苯酚于5mL无水乙醇，吡啶溶液的配制为0.05mL KCN(0.001M)于2.5mL吡啶，茚三酮溶液的配制为0.5g茚三酮于10mL无水乙醇，其中苯酚、吡啶和无水乙醇均经重蒸处理。
(4)氨基酸的缩合：将N-α-Fmoc保护的苯丙氨酸Fmoc-Phe-OH、HOBt、HBTU及DIEA按1：1：1：2的摩尔比溶解于DMF中，DMF与Fmoc-Phe-OH的体积质量比为20mL/g，其中DIEA最后加入。将所得混合溶液加到步骤(2)所得脱除Fmoc基团保护的树脂中，混合溶液与脱保护后的树脂的体积质量比为5mL/g，在氩气保护下于合成仪中80rpm搅拌，室温反应60min，抽干溶剂；用DMF洗涤3次，抽干。按照步骤(3)进行茚检，若缩合成功，则树脂无色，溶液呈淡黄色。茚检后按步骤(2)脱除Fmoc基团保护，然后再按步骤(3)进行茚检；
(5)肽链的延长：将步骤(4)得到的肽树脂按照步骤(4)的方法依次将Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH和Fmoc-Val-OH缩合到肽树脂上。得到肽树脂Fmoc-Val-Asp(OtBu)-Pro-Val-Asn(Trt)-Phe-Lys(Boc)-Phe-Leu-Arg(pbf)-Phe-Resin。将得到的肽树脂按步骤(2)脱除Fmoc基团保护，DMF清洗4次，每次3min，然后再按照步骤(3)进行茚检，得到Val-Asp(OtBu)-Pro-Val-Asn(Trt)-Phe-Lys(Boc)-Phe-Leu-Arg(pbf)-Phe-Resin；
(6)肽链从树脂上的切割：将步骤(5)所得肽树脂用DCM(2×3min)、MeOH(1×3min)、DCM(1×3min)、MeOH(2×3min)交替洗涤，将合成仪密封后抽干4h。在抽干的肽树脂Val-Asp(OtBu)-Pro-Val-Asn(Trt)-Phe-Lys(Boc)-Phe-Leu-Arg(pbf)-Phe-Resin中加入切割剂(15mL/g肽树脂)。室温下反应3h，每15min于50rpm搅拌速率下搅拌1min。切割剂为TFA：TIS：水以95：2.5：2.5的体积比混合而成的溶液。反应完成后，将切割液减压旋干，加入预冷的乙醚析出沉淀，加人20％的醋酸水溶液萃取乙醚中的粗肽，通过冷冻干燥得到白色的粗肽固体粉末176.20mg，粗肽产率68.98％。
(7)多肽的纯化：利用反向高效液相色谱(RP-HPLC)C18柱(XBridge TM BEH130Prep C18，19mm×250mm)对上述粗肽进行分离纯化。流动相为乙腈(含0.1％的TFA)和水(含0.1％的TFA)，收集主峰产品。上样量48.14mg，冷冻干燥后得VF-11的纯肽固体粉末10.60mg。质谱和色谱分析检测结果如表1所示。
实施例2VF-13的合成
(1)树脂预处理：称取600mg的Rink-Amide-MBHA树脂于6mL二氯甲烷中80rpm搅拌溶胀，反应时间为30min，反应结束后抽干30min。随后加入DMF洗涤3次，每次3min。
(2)脱除Fmoc基团保护：在溶胀后的树脂中加入体积比为1：1：98的哌啶：DBU：DMF的混合溶液，混合溶液与溶胀后的树脂的体积质量为10mL/g；按照80rpm搅拌5min，重复2次。抽干后，再次加入上述混合溶液，按照80rpm搅拌10min。之后用DMF洗涤4次，每次3min，以清除残余的哌啶。得到脱除Fmoc保护基团的树脂；
(3)茚检：挑取少量树脂于无色透明试管中，加入茚检试剂，置于沸水中静置3min。如Fmoc基团脱除完全，则树脂和溶液均呈深蓝色。茚检试剂：体积比为1：2：1的苯酚：吡啶：茚三酮溶液。其中苯酚溶液的配制为20g苯酚于5ml无水乙醇，吡啶溶液的配制为0.05mlKCN(0.001M)于2.5ml吡啶，茚三酮溶液的配制为0.5g茚三酮于10ml无水乙醇，其中苯酚、吡啶和无水乙醇均经重蒸处理。
(4)氨基酸的缩合：将N-α-Fmoc保护苯丙氨酸Fmoc-Phe-OH、HOBt、HBTU及DIEA按1：1：1：2的摩尔比溶解于DMF中，DMF与Fmoc-Phe-OH的体积质量比为20mL/g，其中DIEA最后加入。将所得混合溶液加到步骤(2)所得脱除Fmoc基团保护的树脂中，混合溶液与脱保护后的树脂的体积质量比为5mL/g，在氩气保护下于合成仪中80rpm搅拌，室温反应60min，抽干溶剂；用DMF洗涤3次，抽干。按照步骤(3)进行茚检，若缩合成功，则树脂无色，溶液呈淡黄色。茚检后按步骤(2)脱除Fmoc基团保护，然后再按照步骤(3)进行茚检；
(5)肽链的延长：将步骤(4)得到的肽树脂按照步骤(4)的方法依次将Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH和Fmoc-Val-OH缩合到肽树脂上。得到肽树脂Fmoc-Val-Asp(OtBu)-Pro-Val-Asn(Trt)-Phe-Lys(Boc)-Phe-Leu-Pro-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Phe-Resin。将得到的肽树脂按步骤(2)脱除Fmoc基团保护，DMF清洗4次，每次3min，然后再按照步骤(3)进行茚检，得到Val-Asp(OtBu)-Pro-Val-Asn(Trt)-Phe-Lys(Boc)-Phe-Leu-Pro-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Phe-Resin；
(6)肽链从树脂上的切割：将步骤(5)所得肽树脂用DCM(2×3min)、MeOH(1×3min)、DCM(1×3min)、MeOH(2×3min)交替洗涤，将合成仪密封后抽干4h。在抽干的肽树脂Val-Asp(OtBu)-Pro-Val-Asn(Trt)-Phe-Lys(Boc)-Phe-Leu-Pro-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Phe-Resin中加入切割剂(15ml/g肽树脂)。室温下反应3h，每15min于50rpm搅拌速率下搅拌1min。切割剂为TFA：TIS：EDT：水以95：2.5:2.5的体积比混合而成的溶液。反应完成后，将切割液减压旋干，加入预冷的乙醚析出沉淀，加人20％的醋酸水溶液萃取乙醚中的粗肽，通过冷冻干燥得到白色的粗肽固体粉末286.2mg，粗肽产率67.5％。
(7)多肽的纯化：利用反向高效液相色谱(RP-HPLC)C18柱(XBridge TM BEH130Prep C18，19mm×250mm)对上述粗肽进行分离纯化。流动相为乙腈(含0.1％的TFA)和水(含0.1％的TFA)，收集主峰产品。上样量60.14mg，冷冻干燥后得VF-11的纯肽固体粉末21.3mg。
质谱和色谱分析检测结果如表1所示。
表1 VF-11和VF-13的质谱和色谱检测结果
Figure BDA0002327814630000091
注：体系1：梯度洗脱体系1为：10-80％乙腈/水(0.1％TFA)(30min完成)，流速为：1mL/min，检测波长为220nm，分析色谱柱为：XBridge TM BEH 130Prep C18，4.6mm×250mm；体系2：梯度洗脱体系2为：10-100％乙腈/水(0.1％TFA)(30min完成)，流速为：1mL/min，检测波长为220nm，分析色谱柱为：XBridge TM BEH 130Prep C18，4.6mm×250mm；其中，体系1中的乙腈浓度在30min时间内从10％升至80％；体系2中乙腈的浓度在30min时间内从10％升至100％。
上述方法制备的产物经质谱和色谱分析检测，与设计的化合物结构一致。表明成功合成了基于大麻肽(r)VD-Hpα和NPFF的嵌合肽，纯化后样品纯度为98％以上。
实施例3：基于大麻肽(r)VD-Hpα和NPFF的嵌合肽的镇痛实验
本发明基于大麻肽(r)VD-Hpα和NPFF的嵌合肽，是基于大麻肽(r)VD-Hpα和NPFF构建的全新嵌合肽，其在发挥高效镇痛作用的同时，有效地降低了镇痛耐受的副作用。下面通过药理学实验说明本发明的嵌合肽VF-11和VF-13的镇痛及耐受作用。
1、镇痛实验
将实施例1和实施例2制备的化合物VF-11和VF-13通过侧脑室和鞘内注射后，在光热诱导的急性痛和角叉菜胶诱导的炎症痛模型中进行了体内痛觉调节作用的活性检测和比较。
(1)小鼠侧脑室埋管
脑立体定位仪为瑞沃德68001型。昆明系雄性小鼠，体重18-22g。用戊巴比妥钠(i.p.，80mg/kg小鼠体重)麻醉后，置于脑立体定位仪上。手术中用到的器械需进行消毒。将小鼠头部手术区的毛发剃掉，置于脑立体定位仪进行固定，手术区用碘伏消毒。沿矢状缝切开头皮，露出颅骨，找到前囟位置。从前囟向后3mm，向左/右1mm，即为侧脑室的上方位置，用针在此打孔标记。将自制不锈钢管(外径0.5mm，内径0.25mm，上面接一段PE-10管)向下插入3mm，即为侧脑室。用医科牙托粉固定钢管，凝固后，插入一段不锈钢琴弦(28-gauge)于上述钢管中，以防止脑脊液外溢或感染，缝合伤口。手术完成后小鼠恢复4天，第5天用于后续实验。小鼠侧脑室每次注射4μL药物，然后用1μL生理盐水冲洗钢管，给药总体积为5μL。
(2)小鼠鞘内注射
药物的鞘内注射在清醒小鼠上进行，每只小鼠注射药物的体积为5μL。用手固定住小鼠的髂骨，将吸有药物的微量注射器(25μL)通过L5-L6的间隙进入蛛网膜下腔。针尖进入蛛网膜下腔后，小鼠的尾巴会有一个快速甩动且呈现“S”形。药物以5μL/10s的速度缓慢注入蛛网膜下腔。
(3)痛觉检测实验
光热甩尾实验用来检测药物对急性痛觉反应的影响。动物为上述侧脑室埋管小鼠。环境温度控制在22±1℃，实验动物可自由进食、饮水。实验开始前，将小鼠放置在实验台适应30min，以消除其紧张状态。给药前先测定小鼠的基础甩尾潜伏期(3-5s)，过于敏感或迟钝的小鼠弃之不用。记录给药后第5,10,15,20,30,40,50,60min小鼠的甩尾潜伏期。为防止辐射热烫伤，甩尾时间超过10s都以10s来计算。
角叉菜胶诱导的炎症痛模型用来检测药物对炎性痛觉反应的影响。动物为上述侧脑室埋管小鼠。环境温度控制在22±1℃，实验动物可自由进食、饮水。实验开始前，将小鼠单独放置在实验台适应30min，然后分别测定小鼠右脚对于机械刺激和光热刺激的基础缩爪阈值。基础缩爪阈值测定完成后，通过脚掌皮下注射20μL2％的角叉菜胶溶液来构建炎症痛模型。小鼠注射角叉菜胶24h后用于实验。在注射角叉菜胶后的第2天，分别记录小鼠给药前和给药后第15,30,45,60min的缩爪阈值。为防止辐射热烫伤，光热刺激的最大切断时间设置为25s。
(4)计算药物的MPE值
用最大镇痛效应MPE(％)来评价药物的镇痛效果；光热甩尾实验中，MPE(％)的计算方法为：MPE(％)＝100×[(给药后的痛阈-基础痛阈)/(10s-基础痛阈)]。角叉菜胶诱导的炎症痛中，MPE(％)的计算方法为：MPE(％)＝100×[(给药后的痛阈-给药前的痛阈)/(基础痛阈-给药前的痛阈)]。由于药物镇痛作用时间可持续60min，所以药物在每只小鼠上的镇痛效果被转化为曲线下面积AUC(area under the curve)(0-60min)来评价药物的镇痛效果。不同药物浓度处理之间的组间差异用单因素方差分析(one-way ANOVA的Dunnett检验)来进行统计。**P<0.01,***P<0.001表示MPE(％)值与空白对照生理盐水组镇痛作用相比有显著性差异，实验结果如图1-6所示。ED50半数有效量(50％effectivedose,ED50)在量效反应中指引起50％最大反应强度对应的药量。通过统计学软件GraphPad Prism 5.0利用MPE(％)，以及对应药物的用量计算出相关的统计学数据ED50以及95％的置信区间。
相关的镇痛数据如表2所示。在小鼠光热甩尾模型中，侧脑室注射VF-11和VF-13均能产生显著的镇痛效果。其镇痛活性相比于(m)VD-Hpα(6.69nmol,201310087565.3)提高了5.2和3.5倍，比(r)VD-Hpα(6.85nmol,Neuropeptides.2017,63:83)提高了5.3和3.6倍。鞘内注射VF-11和VF-13同样可以在光热甩尾实验中产生剂量依赖的镇痛效果，其镇痛活性相比于(m)VD-Hpα(2.89nmol,201310087565.3)提高了20.6和22.2倍，比(r)VD-Hpα(2.50nmol,Neuropeptides.2017,63:83)提高了17.9和19.2倍。单独注射神经肽FF在光热甩尾实验中无明显镇痛作用(Eur J Pharmacol.2015,767:119；Peptides.1995,16:973)。此外，侧脑室注射这两个嵌合肽可以在炎症痛模型中产生明显的镇痛作用(图5和6)。
表2侧脑室和鞘内水平注射VF-11和VF-13的镇痛作用比较
Figure BDA0002327814630000121
2、镇痛耐受实验
进一步比较了本发明中的嵌合肽与WIN 55,212-2在镇痛耐受方面的药理活性。通过小鼠侧脑室连续6天注射药物，在光热甩尾实验中检测它们镇痛作用的耐受现象。
(1)小鼠的痛觉耐受实验方法
昆明系雄性小鼠，侧脑室埋管后恢复4天，连续注射高剂量药物6天，每天注射一次。环境温度控制在22±1℃，实验动物可自由进食、饮水。实验在每天9点到11点之间进行。第一天药物注射前测定小鼠的基础甩尾潜伏期。实验中记录给药后药物达到最大镇痛效果时间点对应的甩尾潜伏期。
(2)耐受实验数据统计
实验数据用最大镇痛效应MPE(％)来表示，光热甩尾实验中，MPE(％)的计算方法为：MPE(％)＝100×[(给药后的痛阈-基础痛阈)/(10s-基础痛阈)]。小鼠6天镇痛作用的差异用单因素方差分析(one-way ANOVA的Tukey HSD检验)来进行统计，***P<0.001表示MPE(％)值与第一天对应药物的镇痛作用相比有显著性差异。实验结果如图7所示。
生理盐水组为空白溶剂对照组，VF-11和VF-13的药物浓度为15nmol，WIN 55,212-2的药物浓度为9nmol。每组动物为6-8只。实验数据表明小鼠的侧脑室连续6天注射空白溶剂对照生理盐水后，其甩尾潜伏期均未发生显著的变化。与对照组相比，侧脑室注射3种化合物在第1天均显著地增加了小鼠的甩尾潜伏期。但WIN 55,212-2在连续注射4天后开始，其MPE(％)值显著地降低，即镇痛作用出现了耐受现象。此外，已有研究表明中枢注射(m)VD-Hpα和(r)VD-Hpα会出现明显的镇痛耐受现象(201310087565.3和Neuropeptides.2017,63:83)。而15nmol的VF-11和VF-13侧脑室连续注射6天期间，其镇痛活性的MPE(％)值无明显变化(P>0.05)，在连续注射的6天内一直保持较好的无耐受的镇痛活性。
本发明提供了一种基于大麻肽(r)VD-Hp和神经肽FF的嵌合肽及其制备方法与应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims (10)

1.一种基于大麻肽(r)VD-Hpα和神经肽FF的嵌合肽，其特征在于，其具有式Ⅰ所示的氨基酸序列，
Val-Asp-Pro-Val-Asn-Phe-Lys-Phe-Leu-Xaa10-Xaa11-Arg-Phe-NH2 （Ⅰ）；
其中，Xaa10和Xaa11同时缺失，或Xaa10被Pro取代的同时Xaa11被Gln取代。
2.根据权利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，其具有式Ⅱ所示的氨基酸序列；
Val-Asp-Pro-Val-Asn-Phe-Lys-Phe-Leu-Arg-Phe-NH2 （Ⅱ）。
3.根据权利要求1所述的嵌合肽，其特征在于，其具有式Ⅲ所示的氨基酸序列；
Val-Asp-Pro-Val-Asn-Phe-Lys-Phe-Leu-Pro-Gln-Arg-Phe-NH2 （Ⅲ）。
4.权利要求1所述嵌合肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）采用Fmoc固相合成法制备多肽：先溶胀氨基树脂，抽干，洗涤并脱保护后，将第一个N-α-Fmoc保护的氨基酸与脱保护后的氨基树脂进行缩合反应，茚检确认缩合成功，再脱保护并洗涤，茚检确认脱保护完全；然后缩合第二个氨基酸，重复以上步骤，由C端向N端，直至多肽链合成完成；
（2）用切割剂将步骤（1）合成完成的多肽链进行切割，过滤，将滤液旋干，加入冰乙醚析出沉淀，萃取获得粗肽，并通过液相色谱进一步纯化，得到多肽产品。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的氨基树脂为Rink-Amide-MBHA或Rink-Amide树脂；所述的溶胀为将氨基树脂置于二氯甲烷中，使树脂充分溶胀；二氯甲烷与氨基树脂的体积质量比为8~12 mL：1 g。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的脱保护为将处理后的氨基树脂置于混合溶液中，一次搅拌，重复1~4次，抽干；再置于混合溶液中，二次搅拌，洗涤；
其中，所述的混合溶液为哌啶、1,8-二氮杂环[5,4,0]十一碳-7-烯与N,N-二甲基甲酰胺的混合溶液，三者的体积比为1：1：98；混合溶液与脱保护的氨基树脂的体积质量比为8~12 mL：1 g；一次搅拌的速率为60~100 rpm，一次搅拌的时间为2~6 min；二次搅拌的速率为60~100 rpm，二次搅拌的时间为8~12 min。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的缩合反应为将N-α-Fmoc保护的氨基酸、1-羟基苯并三氮唑、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐和N,N-二异丙基乙胺溶于N,N-二甲基甲酰胺中，得到混合溶液；将混合溶液加入脱保护后的氨基树脂中，于惰性环境下搅拌反应，抽干；用N,N-二甲基甲酰胺洗涤，抽干。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，N-α-Fmoc保护的氨基酸、1-羟基苯并三氮唑、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐和N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为1：0.2~1.5：0.2~1.5：1.5~3；N,N-二甲基甲酰胺与N-α-Fmoc保护的氨基酸的体积质量比为20mL：1 g；所述混合溶液与脱保护后的氨基树脂的体积质量比为4~6 mL：1 g；搅拌速率为60~100 rpm；所述的反应为在室温下反应40~100 min。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的切割为将步骤（1）合成完成的多肽链置于切割剂中室温反应1.5~4 h；其中，所述的切割剂为三氟乙酸：三异丙基硅烷和水按照95：2.5：2.5的体积比混合而成的溶液；切割剂与步骤（1）合成完成的多肽链与的体积质量比为10~20 mL：1 g。
10.权利要求1所述的嵌合肽在制备镇痛药中的应用。
CN201911323745.0A 2019-12-20 2019-12-20 一种基于大麻肽(r)VD-Hpα和神经肽FF的嵌合肽及其制备方法与应用 Active CN111087474B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911323745.0A CN111087474B (zh) 2019-12-20 2019-12-20 一种基于大麻肽(r)VD-Hpα和神经肽FF的嵌合肽及其制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911323745.0A CN111087474B (zh) 2019-12-20 2019-12-20 一种基于大麻肽(r)VD-Hpα和神经肽FF的嵌合肽及其制备方法与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111087474A CN111087474A (zh) 2020-05-01
CN111087474B true CN111087474B (zh) 2021-07-27

Family

ID=70395992

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911323745.0A Active CN111087474B (zh) 2019-12-20 2019-12-20 一种基于大麻肽(r)VD-Hpα和神经肽FF的嵌合肽及其制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111087474B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112961249B (zh) * 2021-02-25 2023-08-04 兰州大学 一类基于阿片肽和大麻肽的双功能肽及其制备方法与应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102850431A (zh) * 2012-04-06 2013-01-02 兰州大学 基于阿片肽Biphalin和神经肽FF的嵌合肽及其合成和应用
CN104710508A (zh) * 2015-03-20 2015-06-17 兰州大学 基于内吗啡肽2和npff受体拮抗剂rf9的分叉型杂交肽及其合成方法和应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102850431A (zh) * 2012-04-06 2013-01-02 兰州大学 基于阿片肽Biphalin和神经肽FF的嵌合肽及其合成和应用
CN104710508A (zh) * 2015-03-20 2015-06-17 兰州大学 基于内吗啡肽2和npff受体拮抗剂rf9的分叉型杂交肽及其合成方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Effects of neuropeptide FF and related peptides on the antinociceptive activities of VD-hemopressin(α) in naive and cannabinoid-tolerant mice;Jia-XinPan 等;《European Journal of Pharmacology》;20151115;第767卷;第119-125页 *
Investigation of receptor binding and functional characteristics of hemopressin(1–7);SzabolcsDvorácskó 等;《Neuropeptides》;20160831;第15-22页 *
大麻肽类配体Hemopressin及其相关肽的发现和生物活性的研究进展;李升;《临床合理用药杂志》;20181210;第11卷(第34期);第177-179页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111087474A (zh) 2020-05-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6849720B2 (ja) グルカゴン類似体
CN110194785B (zh) 一种阿片和神经肽ff受体的多靶点肽类分子及其制备和应用
CN104662038B (zh) 胰高血糖素类似物
CN111777671B (zh) 一种长效的psd-95抑制剂
CN111253475B (zh) Glp-1激动多肽化合物及其盐与合成方法及用途
CN110590934B (zh) 一种glp-1化合物
CN110551203B (zh) 一种艾塞那肽类似物
CN111410686A (zh) Glp-1r激活剂的分子改构及其二聚体在治疗代谢病中的应用
WO2013149506A1 (zh) 基于阿片肽Biphalin和神经肽FF的嵌合肽及其合成和应用
CN105131084B (zh) 基于内吗啡肽2或Biphalin的棕榈酰化修饰的阿片肽类似物及其合成和应用
CN111087474B (zh) 一种基于大麻肽(r)VD-Hpα和神经肽FF的嵌合肽及其制备方法与应用
CN104710508B (zh) 基于内吗啡肽2和npff受体拮抗剂rf9的分叉型杂交肽及其合成方法和应用
CN113429471A (zh) 长效glp-1多肽类似物及其制备方法和应用
CN109232743A (zh) 一类长效化降糖减重肽、其制备方法及其作为药物的用途
CN110128526A (zh) 长效化艾塞那肽衍生物及其盐与制备方法和用途
CN108822222A (zh) 一种长效化降糖减重肽，及其制备方法与应用
CN108948213A (zh) 长效化胃泌酸调节素（oxm）杂合肽、其制备方法及其作为药物的用途
CN112961249B (zh) 一类基于阿片肽和大麻肽的双功能肽及其制备方法与应用
CN108976287B (zh) 一类阿片和神经肽ff受体多靶点分子bn-9的二硫键环化类似物及其制备方法与应用
CN112457369B (zh) 一类作用于多靶点的长效镇痛肽类化合物的制备及应用
CN113416232B (zh) 一类以pd-1受体为靶点的多肽化合物、其制备方法及应用
CN115073556A (zh) 一类阿片/神经肽ff受体多靶点环肽分子及其制备和应用
CN111298106B (zh) 缀合物及其在降解β-catenin蛋白中的应用
CN114874292A (zh) 一类多靶点嵌合肽化合物、其制备方法和应用
CN109021117B (zh) 一类阿片和神经肽ff受体多靶点分子bn-9的类似物及其制备方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant