CN110776555B - 一类双功能d-氨基酸修饰阿片肽类化合物及其合成方法与应用 - Google Patents
一类双功能d-氨基酸修饰阿片肽类化合物及其合成方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110776555B CN110776555B CN201911188458.3A CN201911188458A CN110776555B CN 110776555 B CN110776555 B CN 110776555B CN 201911188458 A CN201911188458 A CN 201911188458A CN 110776555 B CN110776555 B CN 110776555B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- resin
- fluorenylmethoxycarbonyl
- boc
- peptide
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 99
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 26
- 102000001490 Opioid Peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 11
- 108010093625 Opioid Peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 11
- 239000003399 opiate peptide Substances 0.000 title claims abstract description 11
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 title description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims abstract description 170
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims abstract description 170
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 92
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 91
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 48
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 36
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 31
- 229940035676 analgesics Drugs 0.000 claims abstract description 11
- 239000000730 antalgic agent Substances 0.000 claims abstract description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 7
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims abstract description 6
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 99
- -1 9-fluorenylmethoxycarbonyl Chemical group 0.000 claims description 90
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 50
- 125000002941 2-furyl group Chemical group O1C([*])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 claims description 42
- CNBUSIJNWNXLQQ-NSHDSACASA-N (2s)-3-(4-hydroxyphenyl)-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]propanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 CNBUSIJNWNXLQQ-NSHDSACASA-N 0.000 claims description 34
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 32
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N Furan Chemical compound C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 31
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N Propionic acid Substances CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 31
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 31
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 28
- ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 1-Hydroxybenzotriazole Chemical compound C1=CC=C2N(O)N=NC2=C1 ASOKPJOREAFHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 claims description 22
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 16
- SJVFAHZPLIXNDH-QFIPXVFZSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-phenylpropanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)C1=CC=CC=C1 SJVFAHZPLIXNDH-QFIPXVFZSA-N 0.000 claims description 12
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 11
- YBYIRNPNPLQARY-UHFFFAOYSA-N 1H-indene Chemical compound C1=CC=C2CC=CC2=C1 YBYIRNPNPLQARY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000005086 pumping Methods 0.000 claims description 9
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 7
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 claims description 5
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 claims description 5
- VSTXCZGEEVFJES-UHFFFAOYSA-N 1-cycloundecyl-1,5-diazacycloundec-5-ene Chemical compound C1CCCCCC(CCCC1)N1CCCCCC=NCCC1 VSTXCZGEEVFJES-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 4
- 230000008961 swelling Effects 0.000 claims description 4
- 238000007689 inspection Methods 0.000 claims description 3
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 2
- 230000007030 peptide scission Effects 0.000 claims description 2
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N benzene Substances C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 104
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 104
- 238000009833 condensation Methods 0.000 abstract description 102
- 230000005494 condensation Effects 0.000 abstract description 92
- 230000000202 analgesic effect Effects 0.000 abstract description 32
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 9
- 102000003840 Opioid Receptors Human genes 0.000 abstract description 6
- 108090000137 Opioid Receptors Proteins 0.000 abstract description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 5
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 2
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 abstract description 2
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 abstract 3
- 238000000119 electrospray ionisation mass spectrum Methods 0.000 description 30
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 23
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 230000008569 process Effects 0.000 description 20
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 18
- 102000051367 mu Opioid Receptors Human genes 0.000 description 18
- 108020001612 μ-opioid receptors Proteins 0.000 description 18
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 15
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 15
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 13
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 10
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 8
- BQJCRHHNABKAKU-KBQPJGBKSA-N morphine Chemical compound O([C@H]1[C@H](C=C[C@H]23)O)C4=C5[C@@]12CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C4O BQJCRHHNABKAKU-KBQPJGBKSA-N 0.000 description 8
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 6
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 101100244562 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) oprD gene Proteins 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 108700023159 delta Opioid Receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000048124 delta Opioid Receptors Human genes 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 5
- PKAUMAVONPSDRW-LJQANCHMSA-N (2r)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]propanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@H](CNC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 PKAUMAVONPSDRW-LJQANCHMSA-N 0.000 description 4
- ZEXLJFNSKAHNFH-SYKYGTKKSA-N L-Phenylalaninamide, L-tyrosyl-L-prolyl-L-tryptophyl- Chemical group C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZEXLJFNSKAHNFH-SYKYGTKKSA-N 0.000 description 4
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 4
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 229940040102 levulinic acid Drugs 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 229960005181 morphine Drugs 0.000 description 4
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 4
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 4
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 125000000472 sulfonyl group Chemical group *S(*)(=O)=O 0.000 description 4
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical group CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical class C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 3
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 3
- 230000001593 cAMP accumulation Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 108010015205 endomorphin 1 Proteins 0.000 description 3
- XIJHWXXXIMEHKW-LJWNLINESA-N endomorphin-2 Chemical group C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)C1=CC=C(O)C=C1 XIJHWXXXIMEHKW-LJWNLINESA-N 0.000 description 3
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 3
- 210000003140 lateral ventricle Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 3
- 239000002287 radioligand Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- 238000005556 structure-activity relationship Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 3
- LIWKOFAHRLBNMG-HXUWFJFHSA-N (2r)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-4-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]butanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@H](CCNC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 LIWKOFAHRLBNMG-HXUWFJFHSA-N 0.000 description 2
- VCFCFPNRQDANPN-LJQANCHMSA-N (2r)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)hexanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@H](CCCC)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 VCFCFPNRQDANPN-LJQANCHMSA-N 0.000 description 2
- GDFAOVXKHJXLEI-GSVOUGTGSA-N (2r)-2-(methylamino)propanoic acid Chemical compound CN[C@H](C)C(O)=O GDFAOVXKHJXLEI-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 2
- VEYYWZRYIYDQJM-SSDOTTSWSA-N (2r)-2-acetamido-6-azaniumylhexanoate Chemical compound CC(=O)N[C@@H](C(O)=O)CCCCN VEYYWZRYIYDQJM-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ASLIYYCUXZFNGB-OAQYLSRUSA-N C1(=CC=CC=2C3=CC=CC=C3CC12)COC(=O)N[C@H](CCCNC(=O)OC(C)(C)C)C(=O)O Chemical compound C1(=CC=CC=2C3=CC=CC=C3CC12)COC(=O)N[C@H](CCCNC(=O)OC(C)(C)C)C(=O)O ASLIYYCUXZFNGB-OAQYLSRUSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010010774 Constipation Diseases 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-SCSAIBSYSA-N D-Proline Chemical compound OC(=O)[C@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N D-alanine Chemical compound C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N FORSKOLIN Chemical compound O=C([C@@]12O)C[C@](C)(C=C)O[C@]1(C)[C@@H](OC(=O)C)[C@@H](O)[C@@H]1[C@]2(C)[C@@H](O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 208000004756 Respiratory Insufficiency Diseases 0.000 description 2
- 206010038678 Respiratory depression Diseases 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 2
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- OROGSEYTTFOCAN-DNJOTXNNSA-N codeine Chemical compound C([C@H]1[C@H](N(CC[C@@]112)C)C3)=C[C@H](O)[C@@H]1OC1=C2C3=CC=C1OC OROGSEYTTFOCAN-DNJOTXNNSA-N 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 2
- 108010015198 endomorphin 2 Chemical group 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 229940124636 opioid drug Drugs 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- JDDWRLPTKIOUOF-UHFFFAOYSA-N 9h-fluoren-9-ylmethyl n-[[4-[2-[bis(4-methylphenyl)methylamino]-2-oxoethoxy]phenyl]-(2,4-dimethoxyphenyl)methyl]carbamate Chemical compound COC1=CC(OC)=CC=C1C(C=1C=CC(OCC(=O)NC(C=2C=CC(C)=CC=2)C=2C=CC(C)=CC=2)=CC=1)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 JDDWRLPTKIOUOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100022749 Aminopeptidase N Human genes 0.000 description 1
- 102000001921 Aminopeptidase P Human genes 0.000 description 1
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010049990 CD13 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 206010058019 Cancer Pain Diseases 0.000 description 1
- 102000005572 Cathepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108010059081 Cathepsin A Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N D-arginine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N D-lysine Chemical compound NCCCC[C@@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-MRVPVSSYSA-N D-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-MRVPVSSYSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-SECBINFHSA-N D-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-SECBINFHSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-MRVPVSSYSA-N D-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-MRVPVSSYSA-N 0.000 description 1
- SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N Deoxycoleonol Natural products C12C(=O)CC(C)(C=C)OC2(C)C(OC(=O)C)C(O)C2C1(C)C(O)CCC2(C)C SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016622 Dipeptidyl Peptidase 4 Human genes 0.000 description 1
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 1
- 101000930822 Giardia intestinalis Dipeptidyl-peptidase 4 Proteins 0.000 description 1
- 238000012449 Kunming mouse Methods 0.000 description 1
- 125000003412 L-alanyl group Chemical group [H]N([H])[C@@](C([H])([H])[H])(C(=O)[*])[H] 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- NFVNYBJCJGKVQK-ZDUSSCGKSA-N N-[(Tert-butoxy)carbonyl]-L-tryptophan Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 NFVNYBJCJGKVQK-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- GDFAOVXKHJXLEI-VKHMYHEASA-N N-methyl-L-alanine Chemical compound C[NH2+][C@@H](C)C([O-])=O GDFAOVXKHJXLEI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 208000004550 Postoperative Pain Diseases 0.000 description 1
- 101710180012 Protease 7 Proteins 0.000 description 1
- 206010039897 Sedation Diseases 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 108010038900 X-Pro aminopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 description 1
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 230000036592 analgesia Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 125000001951 carbamoylamino group Chemical group C(N)(=O)N* 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229960004126 codeine Drugs 0.000 description 1
- OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N colforsin Natural products OC12C(=O)CC(C)(C=C)OC1(C)C(OC(=O)C)C(O)C1C2(C)C(O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 229940126513 cyclase activator Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- DQYBDCGIPTYXML-UHFFFAOYSA-N ethoxyethane;hydrate Chemical compound O.CCOCC DQYBDCGIPTYXML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- OROGSEYTTFOCAN-UHFFFAOYSA-N hydrocodone Natural products C1C(N(CCC234)C)C2C=CC(O)C3OC2=C4C1=CC=C2OC OROGSEYTTFOCAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 102000048260 kappa Opioid Receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 210000001767 medulla oblongata Anatomy 0.000 description 1
- 238000003801 milling Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000002756 mu opiate receptor agonist Substances 0.000 description 1
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 229940005483 opioid analgesics Drugs 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 239000000018 receptor agonist Substances 0.000 description 1
- 229940044601 receptor agonist Drugs 0.000 description 1
- 238000001525 receptor binding assay Methods 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036280 sedation Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 108020001588 κ-opioid receptors Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
- C07K5/0202—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing the structure -NH-X-X-C(=0)-, X being an optionally substituted carbon atom or a heteroatom, e.g. beta-amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明公开了一类双功能D‑氨基酸修饰阿片肽类化合物、合成方法以及该系列类似物在制备镇痛药物方面的应用。其合成方法包括合成固相载体肽树脂；在固相载体上，按照多肽序列C端至N端的顺序，依次接入相应氨基酸；肽树脂后处理、切肽和萃肽和制备纯化，合成方法简单便捷、容易操作、缩合时间短、可作大量合成、易纯化。本发明通过有选择性替代修饰序列中容易被酶识别和酶切的位点，能够在保持其高的μ‑阿片受体亲和能力的同时，能够显著其抗生物体内酶水解的能力，镇痛活性与镇痛效果的持续时间也得到了提高，有效的提高其生物利用度，具备良好的药理学活性和潜在的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一类双功能D-氨基酸修饰阿片肽类化合物及其合成方法与应用。
背景技术
阿片类药物(如吗啡，可待因等)，具有对阿片受体很高的结合能力与激动活性，表现出强效的镇痛活性，是临床上用来缓解重度痛(如癌症痛或术后痛)最有效的止痛药物(J.Pain Res.2014 7 589)。然而，在这类阿片类药物产生强效镇痛作用的同时，往往伴随着许多令人不愉快的副作用，如镇定，身体依赖性，耐受，呼吸抑制，便秘，以及寻求-奖赏的行为。
阿片类药物通过与阿片受体系统的相互作用，产生临床镇痛效果。经典阿片受体有三种类型，分别为μ-阿片受体，δ-阿片受体和κ-阿片受体，它们都属于七次跨膜的G蛋白偶联受体家族。在这三种经典阿片受体中，μ-阿片受体的激活被认为是能够产生最强的镇痛作用，但同时伴随着呼吸抑制，镇定，兴奋，恶心和便秘这些副作用的风险。
内吗啡肽是一类新型的内源性的阿片肽，在1997年，由Zadina课题组报道，首次在哺乳动物的大脑中被发现。它是一类C-末端酰胺化的简短四肽，分为内吗啡肽-1与内吗啡肽-2，肽序列分别为H-Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2和H-Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2。内吗啡肽表现出对μ-阿片受体很高的亲和能力和选择性，在同等剂量下表现出与吗啡相当甚至优于吗啡的镇痛活性，而且不伴随吗啡类药物所固有的副作用。因而，关于内吗啡肽的相关研究是当前镇痛类候选药物研究中的一大热点。尽管内吗啡肽具有作为镇痛药物的巨大潜力，但其，抵抗酶水解的能力差，不能够有效的通过血脑屏障到达中枢神经系统，且缺乏口服活性，使得在临床上的应用一直未能实现。
为了提高①内吗啡肽的抗酶水解的能力，进而提高药物在生物体内的半衰期；②提高其镇痛活性与药物在生物体内的利用度；大量的化学修饰策略被用来优化内吗啡肽的结构。根据内吗啡肽“信息域-地址域”的概念，其N-端三肽序列Tyr1-Pro2-Trp3/Phe3被称为“信息域”，C-末端的Phe4-NH2被称为“地址域”。通过内吗啡肽的酶促降解相关的研究报道，发现“信息域”中Tyr1-Pro2间的酰胺键很容易被生物体内的二肽基肽酶IV和脯氨酸-特定的氨肽酶(氨肽酶P和氨肽酶M)识别并降解；此外，内吗啡肽的C-末端的“地址域”Phe4-NH2能够被羧肽酶Y和蛋白酶A移除酰胺，水解为肽酸，进一步移除C-末端的苯丙氨酸残基。
D-氨基酸被广泛应用于各类天然多肽的结构修饰，因为其能够很好的解决天然多肽易被生物体内的代谢酶识别与降解的问题。内吗啡肽的构-效关系研究发现，使用D-氨基酸(D-Tyr，D-Pro，D-Trp和D-Phe)修饰内吗啡肽-1或内吗啡肽-2的不同位点，对内吗啡肽类似物与阿片受体的结合产生很大程度的负面影响，尤其当D-Pro2替代内吗啡肽-1的L-Pro2后，所得新的化合物基本丧失与μ-阿片受体的结合能力(Biophys J,2000,78,590–599；Biochem Biophys Res Commun,2000,276,7–11)。但Perlikowsta课题组在研究不同构型的线性氨基酸(L/D-丙氨酸，β-丙氨酸，L/D-N-甲基-丙氨酸或苏氨酸)替代修饰内吗啡肽的Pro2时发现，最高活性的类似物[D-Ala2]-EM-2和[N-Me-D-Ala2]-EM-2表现出略高于母肽EM-2的μ-阿片受体的结合能力，以及改善的酶解稳定性和比EM-2高的镇痛活性(BasicClin Pharmacol Toxicol,2009,106,106–113)。我们已报道的多位点修饰内吗啡肽的构-效关系研究中，在多个位点同时修饰下，其中2位采用R-β-脯氨酸，N-甲基-D-丙氨酸替代修饰，均获得了一系列高亲和能力和具有强效镇痛作用的μ-阿片受体的全激动剂(专利CN103214552 A，ACS Chem.Neurosci.2017,8,2180-2193)。
因此，有针性的通过合适的D-氨基酸来修饰Pro2-Trp3/Phe3这个关键酶切位点，能够起到延长内吗啡肽类似物抵抗代谢酶水解的能力，增强镇痛作用持续时间以及提高多肽药物在生物体内的利用度。因而，双功能D-氨基酸修饰内吗啡肽，在目前镇痛类多肽药物研发中具有潜在的应用前景。
发明内容
本发明的目的之一是提供一类双功能D-氨基酸修饰[(2-furyl)Map4]EMs的DM24系列类似物；
本发明的目的之二是提供一类双功能D-氨基酸修饰[(2-furyl)Map4]EMs的DM24系列类似物的合成方法；
本发明的目的之三是提供一类双功能D-氨基酸修饰[(2-furyl)Map4]EMs的DM24系列类似物在制备镇痛药物方面的应用。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一、一类双功能D-氨基酸修饰[(2-furyl)Map4]EMs的类似物，其结构通式为：
具体化合物编号、氨基酸序列和其结构式如下：
二、一类双功能D-氨基酸修饰[(2-furyl)Map4]EMs的类似物的合成方法，将一类更具成药性的μ-阿片受体的激动剂[(2-furyl)Map4]EMs的2位脯氨酸被双功能D-氨基酸替代修饰的DM24系列内吗啡肽类似物，包括如下步骤：
(1)合成固相载体肽树脂：
采用经典的固相合成方法，在MBHA树脂上依次接入N-(9-芴甲氧羰基)-3-氨基-2-甲烯基-3-(2-呋喃)-丙酸，Nα-芴甲氧羰基-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸或N-(9-芴甲氧羰基)-L-苯丙氨酸，得到N-末端9-芴甲氧羰基保护的二肽树脂Fmoc-Trp3(Boc)/Phe3-(2-furyl)Map4-Resin，在该二肽树脂中，加入9-芴甲氧羰基的脱除试剂，反应5-15min，得到H-Trp3(Boc)/Phe3-(2-furyl)Map4-Resin；
(2)在固相载体上，按照多肽序列C端至N端的顺序，依次接入相应氨基酸：
将N-(9-芴甲氧羰基)-D-Xaa(None/Boc/Pbf)氨基酸、1-羟基苯并三唑、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐和N,N-二异丙基乙胺依次溶于N,N-二甲基甲酰胺中，将此混合液加入到步骤(1)得到的肽树脂中，在氩气保护下，室温反应1-3h，抽干，用N,N-二甲基甲酰胺洗涤，茚检，得到三肽树脂Fmoc-D-Xaa2(None/Boc/Pbf)-Trp3(Boc)/Phe3-(2-furyl)Map4-Resin；
向得到的三肽树脂中加入9-芴甲氧羰基的脱除试剂，反应5-15min，得到H-D-Xaa2(None/Boc/Pbf)-Trp3(Boc)-(2-furyl)Map4-Resin；
向得到的树脂中加入由N-叔丁氧羰基-酪氨酸、1-羟基苯并三唑、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐和N,N-二异丙基乙胺溶于N,N-二甲基甲酰胺中的到的混合液，在氩气保护下，室温反应1-3h，得到四肽树脂Boc-Tyr1-D-Xaa2(None/Boc/Pbf)-Trp3(Boc)/Phe3-(2-furyl)Map4-Resin；
(3)肽树脂后处理、切肽和萃肽：
将步骤(2)得到的肽树脂依次经过溶胀，压缩，抽干后，加入切割试剂，反应2-4h，浓缩，萃取，冷冻干燥，得到粗肽H-Tyr1-D-Xaa2-Trp3/Phe3-(2-furyl)Map4-NH2；
(4)制备纯化：
将步骤(3)得到的粗肽进行纯化，得到纯化后的双功能D-氨基酸修饰[(2-furyl)Map4]EMs的类似物。
优选的，步骤(1)和(2)中所述各氨基酸的用量为所用MBHA树脂物质的量的1.5-3倍。
优选的，步骤(2)中所述1-羟基苯并三唑、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐和N,N-二异丙基乙胺的用量均为所用MBHA树脂物质的量的3-6倍。
优选的，步骤(2)中所述9-芴甲氧羰基的脱除试剂为六氢吡啶、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯和N,N-二甲基甲酰胺的混合液，六氢吡啶、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯和N,N-二甲基甲酰胺之间的体积比为1:1:98-3:3:94。
本发明合成的双功能D-氨基酸2修饰[(2-furyl)Map4]EMs的DM24系列内吗啡肽类似物，由于有针对性的关键代谢酶识别和水解位点的双功能D-氨基酸替代修饰，能够显著提高其抗酶解能力，增强其镇痛能力，从而有效的提高其生物利用度，具备良好的药理学活性和潜在的临床应用价值。此外，本发明中DM24-01、DM24-02、DM24-03、DM24-04和DM24-15，由于2位D-氨基酸残基侧链上的自由氨基，可以为内吗啡肽进一步阳离子化、酯化或环化修饰提供可供选择的氨基反应位点，具有潜在化学修饰的应用价值；其次，也可以与荧光素标分子(如异硫氰酸荧光素酯FITC，Cy7等)通过附加氨基耦合，形成特定荧光素标记的内吗啡肽类似物，应用于血脑屏障相关分子机制或内吗啡肽在生物体内的药代动力学相关的研究领域。
三、一类双功能D-氨基酸修饰[(2-furyl)Map4]EMs的DM24系列类似物在制备镇痛药物方面的应用，即该类类似物的药理活性实验：
已合成的双功能D-氨基酸修饰[(2-furyl)Map4]EMs的类似物(即DM24系列内吗啡肽类似物)，通过放射配体-受体结合实验，cAMP累积实验，离体酶解稳定性和温浴甩尾镇痛实验，对其药理学活性进行评估。
1、放射配体-受体结合实验
1.1大鼠脑质膜匀浆液的制备
本实验采用体重在250-300克间的Wista大鼠来制备脑质膜匀浆，断头取脑，用提前预冷的浓度为50mM，pH＝7.4的Tri-HCl清洗大脑上的残血，用滤纸擦拭干，称重。加入10倍体积(v/w)Tris-HCl(50mM，pH＝7.4)，在匀浆器中反复研磨后，取出匀浆液在-4℃，40,000g，离心25min。弃上清液，加入10倍体积悬浮在匀浆器中再次研磨，37℃水浴中孵育30min，以除去内源性的阿片物质。在相同离心条件下，再次离心，弃上清，加入10mL的Tri-HCl(50mM，pH＝7.4)悬浮研磨，分装后，-80℃保存，用BSA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度。
1.2受体结合实验
本实验分为总结合，特异性结合，非特异性结合三个组。其中总结合组中，依次加入190μL Tri-HCl(50mM，pH＝7.4)，10μL的放射性配体(3H-DAMGO或3H-DPDPE)，200μL的脑膜蛋白匀浆液；特异性结合组中，依次加入180μL Tri-HCl(50mM，pH＝7.4)，10μL的药物，10μL的放射性配体，以及200μL的脑膜蛋白匀浆液；非特异性结合组，依次加入180μL Tri-HCl(50mM，pH＝7.4)，10μL的拮抗剂，10μL的放射性配体，以及200μL的脑膜蛋白匀浆液；25℃下孵育1-3h,通过装有GF/C玻纤膜的细胞收集器过滤，玻纤膜在80℃烘干。放置于24孔板对应孔中，每孔加入闪烁液700uL,避光搁置4h以上，通过β液体闪烁计数仪记录放射性强度(CPM)。计算化合物对特异性结合的抑制率，以浓度的负对数为横坐标，抑制率为纵坐标，通过GraphPad Prism 5.0software计算出药物的IC50，根据公式Ki＝IC50/(1+[L]/KD)计算Ki值。每组实验均重复3次。
1.3实验结果
表1内吗啡肽及其类似物对μ/δ阿片受体亲和能力
实验结果见表1。实验数据显示，DM24系列类似物中，第三位氨基酸是色氨酸的EM-1类似物DM24-01、DM24-02、DM24-05和DM24-07对μ-阿片受体的结合能力弱于母体约2-30倍，对δ-阿片受体的亲和性普遍高于母体(DM24-01除外)；第三位氨基酸是色氨酸的EM-1类似物DM24-03、DM24-04、DM24-06和DM24-08至DM24-10，对μ-阿片受体的结合能力强于母体约1.5-7倍，其中类似物DM24-06和DM24-09的δ-阿片受体亲和能力明显高于母体。但第三位氨基酸是苯丙氨酸的EM-2类似物，μ-阿片受体的结合能力基本与母体保持一致，其中，类似物DM24-11、DM24-13和DM24-14的δ-阿片受体亲和能力明显高于母体。
2、cAMP累积实验
2.1细胞准备实验
本实验采用稳定表达特定μ-阿片受体的HEK-293细胞株进行实验。在使用前，提前复苏细胞，在经过传代后，待细胞贴壁，生长至80-90％左右，即可处理种板子。先弃掉过夜的旧培养基，随后PBS洗1-3次，用胰酶消化细胞1min，用含有10％血清和双抗的DMEM培养基终止消化，离心(800r，5min)；弃掉上清液，加入含有血清和双抗的DMEM培养基，吹打均匀后，在显微镜下计数，计算24孔板每孔须加的细胞悬浮液体积，加入细胞悬浮液后，晃动24孔板，使细胞在板中分布均匀，放置于孵育箱中孵育，第二天即可用于cAMP累积实验。
2.2cAMP累计实验
取出24孔板，弃掉隔夜培养基，PBS洗1-3次，每孔加入500uL的含有IBMX的DMEM培养基，37℃下孵育10min，实验组每孔加入10μL类似物(终浓度为5×10-10-5×10-4mol/L)，5μL的腺苷酸环化酶激活剂；对照组Blank孔，forskolin和PKA孔均加入5μL/孔的DMSO；37℃孵育0.5h后，取出24孔板，弃掉培养基，每孔加入500μL的HCl溶液(0.2N)，静置半小时裂解细胞，吹打均匀后，转至相应的EP管，1,2000r离心2min，取50μL的上清液至新的对应EP管。除Blank组外，每管加入100μL的PKA溶液，Blank组加入100μL的TE buffer溶液。随后，所有组每管加入50μL的3H-cAMP配体，震荡均匀，4℃下孵育2.5-3h。待孵育结束后，每管加入100μL的活性炭，静置1min，5000r，离心4min。取200μL上清液于特定24孔板中，每孔加入700μL的闪烁液，贴膜后，避光静置4h以上，通过β液体闪烁计数仪记录放射性强度(CPM)。通过，GraphPad Prism软件分析处理数据，计算EC50(nM)与Emax(％)值。
2.3实验结果
实验结果见表2。实验数据显示，所有DM24系列内吗啡肽类似物都是μ-阿片受体的半激动剂。这些多位点修饰的DM24系列内吗啡肽类似物对μ-阿片受体的激动活性均略微弱于于母体，但仍然在纳摩尔水平下。其中，DM24-02表现出最高的μ-阿片受体激动活性，几乎与母体相当。在这些DM24系列内吗啡肽类似物中DM24-01、DM24-09、DM24-14和DM24-15表现出最低的μ-阿片受体激动活性。
表2内吗啡肽及其类似物的μ阿片类激动剂活性
3、离体酶解稳定性实验
3.1 15％小鼠脑质膜标本制备
本实验采用颈椎脱臼法，处死体重在30-35g的昆明小鼠，取出大脑(弃掉小脑，脑桥和延髓)，滤纸吸干，称重。用提前预冷的Tris-HCl缓冲液(1mM，pH＝7.4)清洗干净余血后，将小鼠大脑放入匀浆器中，加入50倍体积的(v/w)预冷的Tris-HCl缓冲液(1mM，pH＝7.4)，充分研磨后，静置冰浴30min。随后按照匀浆液的体积，每毫升匀浆液补加0.5mL的50mM的预冷的Tris-HCl缓冲液。再次充分研磨，在4℃，49,000g，离心45min，弃掉上清液，加入50倍体积的预冷的Tris-HCl缓冲液(50mM，pH＝7.4)，重新吹打悬浮，在匀浆器中充分研磨后，在相同的条件下，再次离心45min。弃掉上清液，加入Tris-HCl缓冲液(50mM，pH＝7.4)重新悬浮，充分研磨分装，脑膜匀浆蛋白浓度通过BSA蛋白检测试剂盒检测，使蛋白浓度为2mg/mL左右。-80℃冰箱中，冷冻保存。
3.2脑质膜孵育试验
将10μL的浓度为10-2mol/L内吗啡肽或DM24系列内吗啡肽类似物的水溶液，加入到190μL的15％的小鼠脑膜蛋白匀浆液中，震荡均匀，立即取出20μL，标记为0min，加入90μL乙腈终止酶解，5min后加入90μl 5％的冰乙酸，以确保酶解反应完全被终止；剩余混合液在37℃水浴中孵育，在5min、10min、15min、30min、60min、120min、180min、240min以及480min时间点时，分别震荡均匀后，取出20μL，终止酶解操作与0min时间点的样处理方法相同。进行酶解终止操作的混合液，在4℃，2,000g，离心10min，取上清液，置于新标记的EP管中，通过反向-高效液相色谱测定。
3.3反相-高效液相色谱分析
本实验运用反向-高效液相色谱，通过对上述各个时间点的样品进行分析，评估其在脑质膜中的稳定性。RP-HPLC系统使用Waters Delta 600控制器、紫外监测器和WatersDelta Pak C18柱(3.9mm×150mm)。我们的样品，在上样前，首先通过滤膜过滤，进样时体积为20μL，在进样后，选择280nm波长下的吸光度进行检测。洗脱剂为乙腈(含0.1％的三氟乙酸)/和双蒸水(含0.1％的三氟乙酸)，洗脱剂流速为1mL/min，洗脱剂的梯度设置为乙腈：水＝10:90-90:10，整个洗脱过程检测时间为30min。在监测结束后，分析样品出峰时间，以及相应峰的峰面积。通过类似物的峰面积比的对数[(ln(At/A0)]和时间的最小二乘线性回归分析求得降解速率常数(κ)，半衰期(t1/2)＝ln2/κ。
3.4实验结果
实验结果见表3。实验数据显示，四个体外活性最好的DM24类似物DM24-06、DM24-08、DM24-11和DM24-12在小鼠脑质膜匀浆中的半衰期得到很大提高，均显著长于母体。实验结果表明这四个DM24系列内吗啡肽类似物，在离体的脑膜匀浆中具有很好的抗水解酶降解的能力，因此，可以延长其在体内中枢神经中的生物半衰期，进而提高其调节镇痛作用的持续时间。
表3内吗啡肽及其类似物的离体大脑半衰期
4、镇痛实验
4.1实验方法
本实验通过中枢给药和外周给药两种给药方式下的温浴甩尾实验，来检测四种体外活性最佳的DM24系列内吗啡肽类似物在制备镇痛药物中的应用。我们选择体重范围为18-20g之间的小鼠，在实验环境中，放置5-10min，使其适应实验环境。通过小鼠在50±0.2℃水浴中的甩尾反应时间测定小鼠的基础痛域，我们记为T0,选用T0在2.5s-5s内的小鼠进行实验。通过侧脑室给药(4μL/只)或尾静脉给药(100μL/只)后，测定5min、10min、15min、20min、30min、40min、50min和60min时间点时，小鼠在50±0.2℃水浴中的甩尾反应时间，称为甩尾潜伏期，记作T1。本实验选用0.9％的生理盐水作为阴性对照组。我们以MPE％来评估化合物的镇痛作用强度。其计算公式为：％MPE＝100×(T1-T0)/(10-T0)。在此公式中，10s是为了防止小鼠被烫伤所选择的截止时间。
4.2实验结果
实验结果见表4和图1。侧脑室和尾静脉两种给药方式下，在小鼠甩尾实验中，DM24-06、DM24-08、DM24-11和DM24-12四种类似物的ED50如表4所示。如图1-A所示为侧脑室注射DM24-06、DM24-08、DM24-11和DM24-12四种内吗啡肽类似物，在20nmol/kg剂量下所产生的镇痛时效曲线。侧脑室给药时，这四种DM24系列内吗啡肽类似物均能够产生强效的镇痛作用，相比于内吗啡肽，类似物镇痛效力和镇痛持续时间都明显增加，其最高镇痛能力达到84-100％，且如图1-A所示，镇痛能力有明显延长。如图1-B所示，为尾静脉注射这四个DM24系列的内吗啡肽类似物，在10mg/kg剂量下产生的镇痛时效曲线，这四种化合物均能够产生强效的镇痛作用，镇痛效力和镇痛持续时间都明显增加，其最高镇痛能力达到80-90％，且如图1-B所示，除DM24-11外，其他三个化合物的镇痛能力有明显延长。实验结果表明这四种DM24-06、DM24-08、DM24-11和DM24-12化合物在体内能够发挥有效的镇痛作用。
表4侧脑室和尾静脉注射体外活性最佳的DM24系列类似物产生镇痛活性
综上所述，本发明双功能D-氨基酸2(D-Arg和D-Cit)替代修饰[(2-furyl)Map4]EMs的类似物DM24-06、DM24-08、DM24-11和DM24-12较母体具有高的μ-阿片受体亲和能力，高酶解稳定性和高镇痛活性等优点，因此这些化合物在制备镇痛药物方面具有很好的临床应用价值。
本发明相较于现有技术的有益效果为：
本专利中新的DM24系列化合物，是基于本课题组早期的α-烯基-β-氨基酸替代修饰内吗啡肽-1的构-效关系研究成果(CN 102558297A)基础上进行的D-氨基酸修饰，即保留内吗啡肽的关键残基(N-端的酪氨酸及其游离的-NH2，芳香基团侧链的Trp3/Phe3)，在[(2-furyl)Map4]EMs模板的基础上，将2位刚性骨架结构Pro2残基替换为侧链含有功能基团的(氨基，呱基，烷基，脲基以及氨基乙酰化)具有不同程度结构上限制性的D-氨基酸，获得一系列酶解稳定性高，镇痛强效和持久的新的化合物。
本发明公开的DM24系列内吗啡肽类似物，通过有选择性替代修饰[(2-furyl)Map4]EMs序列中容易被酶识别和酶切的位点，能够在保持其高的μ-阿片受体亲和能力的同时，明显提高了其抗生物体内酶水解的能力，而且在体的镇痛活性与镇痛效果的持续时间也得到了提高；
本发明公开的DM24系列内吗啡肽类似物的合成采用固相合成方法，合成简单便捷、容易操作、缩合时间短、可作大量合成、易纯化等特点；此外在内吗啡肽对应位点氨基酸替代的选择上，我们选用商业或市场上容易购得的，价格低廉的氨基酸，从合成方面降低了其在制备镇痛药物中的成本。
本发明公开的DM24系列内吗啡肽类似物，除了作为镇痛药物的临床应用价值外，还可以通过D-氨基酸侧链上的自由氨基与荧光素标分子(如异硫氰酸荧光素酯FITC，Cy7等)反应，形成特定荧光素标记的内吗啡肽类似物，可应用于血脑屏障相关分子机制和内吗啡肽在生物体内的药代动力学相关的研究领域。
附图说明
图1是注射DM24系列内吗啡肽类似物的镇痛效应-时间曲线：A为侧脑室注射、B为尾静脉注射；
图2是内吗啡肽类似物DM24-01的ESI-MS谱图；
图3是内吗啡肽类似物DM24-02的ESI-MS谱图；
图4是内吗啡肽类似物DM24-03的ESI-MS谱图；
图5是内吗啡肽类似物DM24-04的ESI-MS谱图；
图6是内吗啡肽类似物DM24-05的ESI-MS谱图；
图7是内吗啡肽类似物DM24-06的ESI-MS谱图；
图8是内吗啡肽类似物DM24-07的ESI-MS谱图；
图9是内吗啡肽类似物DM24-08的ESI-MS谱图；
图10是内吗啡肽类似物DM24-09的ESI-MS谱图；
图11是内吗啡肽类似物DM24-10的ESI-MS谱图；
图12是内吗啡肽类似物DM24-11的ESI-MS谱图；
图13是内吗啡肽类似物DM24-12的ESI-MS谱图；
图14是内吗啡肽类似物DM24-13的ESI-MS谱图；
图15是内吗啡肽类似物DM24-14的ESI-MS谱图；
图16是内吗啡肽类似物DM24-15的ESI-MS谱图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的DM24系列内吗啡肽类似物的结构、合成及理化特征做进一步说明。
实施例1、DM24-01的合成
(1)树脂处理
称取0.6mmol的Rink Amide-MBHA树脂(取代值为0.44mmol/g)，加入二氯甲烷，溶胀30min，抽干，N,N-二甲基甲酰胺洗涤3次；加入9-芴甲氧羰基脱除试剂，室温反应5-15min，抽干，N,N-二甲基甲酰胺洗涤3次，茚检，得到脱除9-芴甲氧羰基保护基的树脂。
(2)N-(9-芴甲氧羰基)-3-氨基-2-甲烯基-3-(2-呋喃)-丙酸缩合
称取树脂摩尔量1.5-3倍的N-(9-芴甲氧羰基)-3-氨基-2-甲烯基-3-(2-呋喃)-丙酸，以及树脂摩尔量3-6倍的1-羟基苯并三唑和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐，溶于N,N-二甲基甲酰胺中；随后，加入树脂摩尔量3-6倍的N,N-二异丙基乙胺；将混合液加入步骤(1)所得树脂中，在氩气保护下，室温反应1-3h，抽干，N,N-二甲基甲酰胺洗涤3次，茚检，得到肽树脂Fmoc-(2-furyl)Map-Resin。加入9-芴甲氧羰基脱除试剂，室温反应5-15min，抽干，N,N-二甲基甲酰胺洗涤3次，茚检，得到H-(2-furyl)Map-Resin。
(3)Nα-芴甲氧羰基-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸缩合
称取树脂摩尔量1.5-3倍的Nα-芴甲氧羰基-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸，以及树脂摩尔量3-6倍的1-羟基苯并三唑，和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐，溶于N,N-二甲基甲酰胺中；随后，加入树脂摩尔量3-6倍量的N,N-二异丙基乙胺；将混合液加入步骤(2)所得树脂中，按照步骤(2)的工艺缩合氨基酸和脱除9-芴甲氧羰基，得到H-Trp(Boc)-(2-furyl)Map-Resin。
(4)N-alpha-芴甲氧羰基-N-epsilon-叔丁氧羰基-D-赖氨酸的缩合
称取树脂摩尔量1.5-3倍的N-alpha-芴甲氧羰基-N-epsilon-叔丁氧羰基-D-赖氨酸，以及树脂摩尔量3-6倍的1-羟基苯并三唑，和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐，溶于N,N-二甲基甲酰胺中；随后，加入树脂摩尔量3-6倍的N,N-二异丙基乙胺；将混合液加入步骤(3)所得肽树脂中，按照步骤(2)的工艺缩合氨基酸和脱除9-芴甲氧羰基，得到H-D-Lys(Boc)-Trp(Boc)-(2-furyl)Map-Resin。
(5)N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸的缩合
称取树脂摩尔量1.5-3倍的N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸，以及树脂摩尔量3-6倍的1-羟基苯并三唑，和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐，溶于N,N-二甲基甲酰胺中；随后，加入树脂摩尔量3-6倍的N,N-二异丙基乙胺；将混合液加入步骤(4)所得三肽树脂中，并按照步骤(2)的工艺缩合氨基酸，得到序列为Boc-Tyr-D-Lys(Boc)-Trp(Boc)-(2-furyl)Map-Resin的四肽树脂。
(6)切肽与萃肽
上述肽树脂经溶胀，压缩和抽干后，加入现配的切割试剂，室温下反应2-4h；收集切割溶液，旋干三氟乙酸，置于冰箱的冷冻层15min；加入水和乙醚萃取，收集水相，冷冻干燥，得到粗产物H-Tyr-D-Lys-Trp-(2-furyl)Map-NH2。
(7)制备纯化及鉴定
经过反向-高效液相色谱制备柱(Sun Fire TM,Prep C18 OBD TM；5μm,19×250mmColumn)，对粗肽进行纯化，每次上样量控制在50mg/5mL，起始洗脱剂梯度为乙腈:水＝10:90，1个梯度/min。检测器通过220nm,280nm的吸光度值，同时进行检测，收集主峰，纯化后得到白色固体DM24-01，纯肽产率42％。DM24-01的理化特征见表5，DM24-01的ESI-MS谱图见图2。
实施例2、DM24-02的合成
(1)树脂处理
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的树脂处理的操作。
(2)N-(9-芴甲氧羰基)-3-氨基-2-甲烯基-3-(2-呋喃)-丙酸缩合
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的N-(9-芴甲氧羰基)-3-氨基-2-甲烯基-3-(2-呋喃)-丙酸的缩合操作。
(3)Nα-芴甲氧羰基-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸的缩合
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的Nα-芴甲氧羰基-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸的缩合操作。
(4)N-芴甲氧羰基-N'-叔丁氧羰基-D-鸟氨酸的缩合
称取树脂摩尔量1.5-3倍的N-芴甲氧羰基-N'-叔丁氧羰基-D-鸟氨酸，以及树脂摩尔量3-6倍的1-羟基苯并三唑，和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐，溶于N,N-二甲基甲酰胺中；随后，加入树脂摩尔量3-6倍的N,N-二异丙基乙胺；将混合液加入步骤(3)所得肽树脂中，按照实施案例一中步骤(2)的工艺缩合氨基酸和脱除9-芴甲氧羰基方法，得到三肽树脂H-D-Orn(Boc)-Trp-(Boc)-(2-furyl)Map-Resin。
(5)N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸的缩合
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸的缩合操作，得到四肽树脂Boc-Tyr-D-Orn(Boc)-Trp(Boc)-(2-furyl)Map-Resin。
(6)切肽与萃肽
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的切肽和萃肽的操作，得到粗产物H-Tyr-D-Orn-Trp-(2-furyl)Map-NH2。
(7)制备纯化及鉴定
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的制备纯化及鉴定的操作。纯化后得到白色固体DM24-02，纯肽产率38％。DM24-02的理化特征见表5，DM24-02的ESI-MS谱图见图3。
实施例3、DM24-03的合成
(1)树脂处理
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的树脂处理的操作。
(2)N-(9-芴甲氧羰基)-3-氨基-2-甲烯基-3-(2-呋喃)-丙酸缩合
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的N-(9-芴甲氧羰基)-3-氨基-2-甲烯基-3-(2-呋喃)-丙酸的缩合操作。
(3)Nα-芴甲氧羰基-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸的缩合
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的Nα-芴甲氧羰基-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸的缩合操作。
(4)(R)-2-[(9-芴甲氧羰基)氨基]-4-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸的缩合
称取树脂摩尔量1.5-3倍的(R)-2-[(9-芴甲氧羰基)氨基]-4-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸，以及树脂摩尔量3-6倍的1-羟基苯并三唑，和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐，溶于N,N-二甲基甲酰胺中；随后，加入树脂摩尔量3-6倍的N,N-二异丙基乙胺；将混合液加入步骤(3)所得肽树脂中，按照实施案例一中步骤(2)的工艺缩合氨基酸和脱除9-芴甲氧羰基方法，得到三肽树脂H-D-Dab(Boc)-Trp(Boc)-(2-furyl)Map-Resin。
(5)N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸的缩合
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸的缩合操作，得到四肽树脂Boc-Tyr-D-Dab(Boc)-Trp(Boc)-(2-furyl)Map-Resin。
(6)切肽与萃肽
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的切肽和萃肽的操作，得到粗产物H-Tyr-D-Dab-Trp-(2-furyl)Map-NH2。
(7)制备纯化及鉴定
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的制备纯化及鉴定的操作。纯化后得到白色固体DM24-03,纯肽产率39％。DM24-03的理化特征见表5，DM24-03的ESI-MS谱图见图4。
实施例4、DM24-04的合成
(1)树脂处理
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的树脂处理的操作。
(2)N-(9-芴甲氧羰基)-3-氨基-2-甲烯基-3-(2-呋喃)-丙酸缩合
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的N-(9-芴甲氧羰基)-3-氨基-2-甲烯基-3-(2-呋喃)-丙酸的缩合操作。
(3)Nα-芴甲氧羰基-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸的缩合
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的Nα-芴甲氧羰基-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸的缩合操作。
(4)(R)-2-[(9-芴甲氧羰基)氨基]-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]丙酸的缩合
称取树脂摩尔量1.5-3倍的(R)-2-[(9-芴甲氧羰基)氨基]-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]丙酸，以及树脂摩尔量3-6倍的1-羟基苯并三唑，和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐，溶于N,N-二甲基甲酰胺中；随后，加入树脂摩尔量3-6倍的N,N-二异丙基乙胺；将混合液加入步骤(3)所得肽树脂中，按照实施案例一中步骤(2)的工艺缩合氨基酸和脱除9-芴甲氧羰基方法，得到三肽树脂H-D-Dap(Boc)-Trp(Boc)-(2-furyl)Map-Resin。
(5)N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸的缩合
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸的缩合操作，得到四肽树脂Boc-Tyr-D-Dap(Boc)-Trp(Boc)-(2-furyl)Map-Resin。
(6)切肽与萃肽
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的切肽和萃肽的操作，得到粗产物H-Tyr-D-Dap-Trp-(2-furyl)Map-NH2。
(7)制备纯化及鉴定
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的制备纯化及鉴定的操作。纯化后得到白色固体DM24-04，纯肽产率21％。DM24-04的理化特征见表5，DM24-04的ESI-MS谱图见图5。
实施例5、DM24-05的合成
(1)树脂处理
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的树脂处理的操作。
(2)N-(9-芴甲氧羰基)-3-氨基-2-甲烯基-3-(2-呋喃)-丙酸缩合
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的N-(9-芴甲氧羰基)-3-氨基-2-甲烯基-3-(2-呋喃)-丙酸的缩合操作。
(3)Nα-芴甲氧羰基-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸的缩合
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的Nα-芴甲氧羰基-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸的缩合操作。
(4)N2–(9-芴甲氧羰基)-N6-[N-(叔丁氧羰基)甲脒基]-D-赖氨酸的缩合
称取树脂摩尔量1.5-3倍的N2–(9-芴甲氧羰基)-N6-[N-(叔丁氧羰基)甲脒基]-D-赖氨酸，以及树脂摩尔量3-6倍的1-羟基苯并三唑，和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐，溶于N,N-二甲基甲酰胺中；随后，加入树脂摩尔量3-6倍的N,N-二异丙基乙胺；将混合液加入步骤(3)所得肽树脂中，按照实施案例一中步骤(2)的工艺缩合氨基酸和脱除9-芴甲氧羰基方法，得到三肽树脂H-D-Lys[Gu(Boc)]-Trp(Boc)-(2-furyl)Map-Resin。
(5)N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸的缩合
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸的缩合操作，得到四肽树脂Boc-Tyr-D-Lys[Gu(Boc)]-Trp(Boc)-(2-furyl)Map-Resin。
(6)切肽与萃肽
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的切肽和萃肽的操作，得到粗产物H-Tyr-D-Lys(Gu)-Trp-(2-furyl)Map-NH2。
(7)制备纯化及鉴定
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的制备纯化及鉴定的操作。纯化后得到白色固体DM24-05，纯肽产率22％。DM24-05的理化特征见表5，DM24-05的ESI-MS谱图见图6。
实施例6、DM24-06的合成
(1)树脂处理
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的树脂处理的操作。
(2)N-(9-芴甲氧羰基)-3-氨基-2-甲烯基-3-(2-呋喃)-丙酸缩合
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的N-(9-芴甲氧羰基)-3-氨基-2-甲烯基-3-(2-呋喃)-丙酸的缩合操作。
(3)Nα-芴甲氧羰基-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸的缩合
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的Nα-芴甲氧羰基-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸的缩合操作。
(4)N'-[(2,3-二氢-2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-基)磺酰基]-N-芴甲氧羰基-D-精氨酸的缩合
称取树脂摩尔量1.5-3倍的N'-[(2,3-二氢-2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-基)磺酰基]-N-芴甲氧羰基-D-精氨酸，以及树脂摩尔量3-6倍的1-羟基苯并三唑，和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐，溶于N,N-二甲基甲酰胺中；随后，加入树脂摩尔量3-6倍的N,N-二异丙基乙胺；将混合液加入步骤(3)所得肽树脂中，按照实施案例一中步骤(2)的工艺缩合氨基酸和脱除9-芴甲氧羰基方法，得到三肽树脂H-D-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-(2-furyl)Map-Resin。
(5)N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸的缩合
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸的缩合操作，得到四肽树脂Boc-Tyr-D-Arg(Pbf)-Trp(Boc)-(2-furyl)Map-Resin。
(6)切肽与萃肽
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的切肽和萃肽的操作，得到粗产物H-Tyr-D-Arg-Trp-(2-furyl)Map-NH2。
(7)制备纯化及鉴定
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的制备纯化及鉴定的操作。纯化后得到白色固体DM24-06，纯肽产率24％。DM24-06的理化特征见表5，DM24-06的ESI-MS谱图见图7。
实施例7、DM24-07的合成
(1)树脂处理
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的树脂处理的操作。
(2)N-(9-芴甲氧羰基)-3-氨基-2-甲烯基-3-(2-呋喃)-丙酸缩合
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的N-(9-芴甲氧羰基)-3-氨基-2-甲烯基-3-(2-呋喃)-丙酸的缩合操作。
(3)Nα-芴甲氧羰基-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸的缩合
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的Nα-芴甲氧羰基-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸的缩合操作。
(4)N-(9-芴甲氧羰基)-D-正亮氨酸的缩合
称取树脂摩尔量1.5-3倍的N-(9-芴甲氧羰基)-D-正亮氨酸，以及树脂摩尔量3-6倍的1-羟基苯并三唑，和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐，溶于N,N-二甲基甲酰胺中；随后，加入树脂摩尔量3-6倍的N,N-二异丙基乙胺；将混合液加入步骤(3)所得肽树脂中，按照实施案例一中步骤(2)的工艺缩合氨基酸和脱除9-芴甲氧羰基方法，得到三肽树脂H-D-Nle-Trp(Boc)-(2-furyl)Map-Resin。
(5)N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸的缩合
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸的缩合操作，得到四肽树脂Boc-Tyr-D-Nle-Trp(Boc)-(2-furyl)Map-Resin。
(6)切肽与萃肽
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的切肽和萃肽的操作，得到粗产物H-Tyr-D-Nle-Trp-(2-furyl)Map-NH2。
(7)制备纯化及鉴定
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的制备纯化及鉴定的操作。纯化后得到白色固体DM24-07，纯肽产率43％。DM24-07的理化特征见表5，DM24-07的ESI-MS谱图见图8。
实施例8、DM24-08的合成
(1)树脂处理
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的树脂处理的操作。
(2)N-(9-芴甲氧羰基)-3-氨基-2-甲烯基-3-(2-呋喃)-丙酸缩合
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的N-(9-芴甲氧羰基)-3-氨基-2-甲烯基-3-(2-呋喃)-丙酸的缩合操作。
(3)Nα-芴甲氧羰基-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸的缩合
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的Nα-芴甲氧羰基-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸的缩合操作。
(4)N-(9-芴甲氧羰基)-D-瓜氨酸的缩合
称取树脂摩尔量1.5-3倍的N-(9-芴甲氧羰基)-D-瓜氨酸，以及树脂摩尔量3-6倍的1-羟基苯并三唑，和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐，溶于N,N-二甲基甲酰胺中；随后，加入树脂摩尔量3-6倍的N,N-二异丙基乙胺；将混合液加入步骤(3)所得肽树脂中，按照实施案例一中步骤(2)的工艺缩合氨基酸和脱除9-芴甲氧羰基方法，得到三肽树脂H-D-Cit-Trp(Boc)-(2-furyl)Map-Resin。
(5)N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸的缩合
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸的缩合操作，得到四肽树脂Boc-Tyr-D-Cit-Trp(Boc)-(2-furyl)Map-Resin。
(6)切肽与萃肽
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的切肽和萃肽的操作，得到粗产物H-Tyr-D-Cit-Trp-(2-furyl)Map-NH2。
(7)制备纯化及鉴定
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的制备纯化及鉴定的操作。纯化后得到白色固体DM24-08，纯肽产率37％。DM24-08的理化特征见表5，DM24-08的ESI-MS谱图见图9。
实施例9、DM24-09的合成
(1)树脂处理
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的树脂处理的操作。
(2)N-(9-芴甲氧羰基)-3-氨基-2-甲烯基-3-(2-呋喃)-丙酸缩合
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的N-(9-芴甲氧羰基)-3-氨基-2-甲烯基-3-(2-呋喃)-丙酸的缩合操作。
(3)Nα-芴甲氧羰基-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸的缩合
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的Nα-芴甲氧羰基-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸的缩合操作。
(4)N2-(9-芴甲氧羰基)-N6-乙酰基-D-赖氨酸的缩合
称取树脂摩尔量1.5-3倍的N2-(9-芴甲氧羰基)-N6-乙酰基-D-赖氨酸，以及树脂摩尔量3-6倍的1-羟基苯并三唑，和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐，溶于N,N-二甲基甲酰胺中；随后，加入树脂摩尔量3-6倍的N,N-二异丙基乙胺；将混合液加入步骤(3)所得肽树脂中，按照实施案例一中步骤(2)的工艺缩合氨基酸和脱除9-芴甲氧羰基方法，得到三肽树脂H-D-Lys(Ac)-Trp(Boc)-(2-furyl)Map-Resin。
(5)N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸的缩合
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸的缩合操作，得到四肽树脂Boc-Tyr-D-Lys(Ac)-Trp(Boc)-(2-furyl)Map-Resin。
(6)切肽与萃肽
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的切肽和萃肽的操作，得到粗产物H-Tyr-D-Lys(Ac)-Trp-(2-furyl)Map-NH2。
(7)制备纯化及鉴定
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的制备纯化及鉴定的操作。纯化后得到白色固体DM24-09，纯肽产率33％。DM24-09的理化特征见表5，DM24-09的ESI-MS谱图见图10。
实施例10、DM24-10的合成
(1)树脂处理
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的树脂处理的操作。
(2)N-(9-芴甲氧羰基)-3-氨基-2-甲烯基-3-(2-呋喃)-丙酸缩合
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的N-(9-芴甲氧羰基)-3-氨基-2-甲烯基-3-(2-呋喃)-丙酸的缩合操作。
(3)Nα-芴甲氧羰基-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸的缩合
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的Nα-芴甲氧羰基-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸的缩合操作。
(4)(R)-2-[(9-芴甲氧羰基)氨基]-3-乙酰氨基丙酸的缩合
称取树脂摩尔量1.5-3倍的(R)-2-[(9-芴甲氧羰基)氨基]-3-乙酰氨基丙酸，以及树脂摩尔量3-6倍的1-羟基苯并三唑，和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐，溶于N,N-二甲基甲酰胺中；随后，加入树脂摩尔量3-6倍的N,N-二异丙基乙胺；将混合液加入步骤(3)所得肽树脂中，按照实施案例一中步骤(2)的工艺缩合氨基酸和脱除9-芴甲氧羰基方法，得到三肽树脂H-D-Dap(Ac)-Trp(Boc)-(2-furyl)Map-Resin。
(5)N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸的缩合
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸的缩合操作，得到四肽树脂Boc-Tyr-D-Dap(Ac)-Trp(Boc)-(2-furyl)Map-Resin。
(6)切肽与萃肽
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的切肽和萃肽的操作，得到粗产物H-Tyr-D-Dap(Ac)-Trp-(2-furyl)Map-NH2。
(7)制备纯化及鉴定
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的制备纯化及鉴定的操作。纯化后得到白色固体DM24-10，纯肽产率27％。DM24-10的理化特征见表5，DM24-10的ESI-MS谱图见图11。
实施例11、DM24-11的合成
(1)树脂处理
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的树脂处理的操作。
(2)N-(9-芴甲氧羰基)-3-氨基-2-甲烯基-3-(2-呋喃)-丙酸缩合
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的N-(9-芴甲氧羰基)-3-氨基-2-甲烯基-3-(2-呋喃)-丙酸的缩合操作。
(3)N-(9-芴甲氧羰基)-L-苯丙氨酸的缩合
称取树脂摩尔量1.5-3倍的N-(9-芴甲氧羰基)-L-苯丙氨酸，以及树脂摩尔量3-6倍的1-羟基苯并三唑，和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐，溶于N,N-二甲基甲酰胺中；随后，加入树脂摩尔量3-6倍的N,N-二异丙基乙胺；将混合液加入步骤(2)所得树脂中，按照实施案例一中步骤(2)的工艺缩合氨基酸和脱除9-芴甲氧羰基方法，得到二肽树脂H-Phe-(2-furyl)Map-Resin。
(4)N'-[(2,3-二氢-2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-基)磺酰基]-N-芴甲氧羰基-D-精氨酸的缩合
称取树脂摩尔量1.5-3倍的N'-[(2,3-二氢-2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-基)磺酰基]-N-芴甲氧羰基-D-精氨酸，以及树脂摩尔量3-6倍的1-羟基苯并三唑，和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐，溶于N,N-二甲基甲酰胺中；随后，加入树脂摩尔量3-6倍的N,N-二异丙基乙胺；将混合液加入步骤(3)所得肽树脂中，按照实施案例一中步骤(2)的工艺缩合氨基酸和脱除9-芴甲氧羰基方法，得到三肽树脂H-D-Arg(Pbf)-Phe-(2-furyl)Map-Resin。
(5)N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸的缩合
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸的缩合操作，得到四肽树脂Boc-Tyr-D-Arg(Pbf)-Phe-(2-furyl)Map-Resin。
(6)切肽与萃肽
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的切肽和萃肽的操作，得到粗产物H-Tyr-D-Arg-Phe-(2-furyl)Map-NH2。
(7)制备纯化及鉴定
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的制备纯化及鉴定的操作。纯化后得到白色固体DM24-11，纯肽产率27％。DM24-11的理化特征见表5，DM24-11的ESI-MS谱图见图12。
实施例12、DM24-12的合成
(1)树脂处理
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的树脂处理的操作。
(2)N-(9-芴甲氧羰基)-3-氨基-2-甲烯基-3-(2-呋喃)-丙酸缩合
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的N-(9-芴甲氧羰基)-3-氨基-2-甲烯基-3-(2-呋喃)-丙酸的缩合操作。
(3)N-(9-芴甲氧羰基)-L-苯丙氨酸的缩合
同实施例十一中化合物DM24-11合成过程中的N-(9-芴甲氧羰基)-L-苯丙氨酸的缩合操作。
(4)N-(9-芴甲氧羰基)-D-瓜氨酸的缩合
称取树脂摩尔量1.5-3倍的N-(9-芴甲氧羰基)-D-瓜氨酸，以及树脂摩尔量3-6倍的1-羟基苯并三唑，和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐，溶于N,N-二甲基甲酰胺中；随后，加入树脂摩尔量3-6倍的N,N-二异丙基乙胺；将混合液加入步骤(3)所得肽树脂中，按照实施案例一中步骤(2)的工艺缩合氨基酸和脱除9-芴甲氧羰基方法，得到三肽树脂H-D-Cit-Phe-(2-furyl)Map-Resin。
(5)N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸的缩合
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸的缩合操作，得到四肽树脂Boc-Tyr-D-Cit-Phe-(2-furyl)Map-Resin。
(6)切肽与萃肽
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的切肽和萃肽的操作，得到粗产物H-Tyr-D-Cit-Phe-(2-furyl)Map-NH2。
(7)制备纯化及鉴定
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的制备纯化及鉴定的操作。纯化后得到白色固体DM24-12，纯肽产率30％。DM24-12的理化特征见表5，DM24-12的ESI-MS谱图见图13。
实施例13、DM24-13的合成
(1)树脂处理
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的树脂处理的操作。
(2)N-(9-芴甲氧羰基)-3-氨基-2-甲烯基-3-(2-呋喃)-丙酸缩合同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的N-(9-芴甲氧羰基)-3-氨基-2-甲烯基-3-(2-呋喃)-丙酸的缩合操作。
(3)N-(9-芴甲氧羰基)-L-苯丙氨酸的缩合
同实施例十一中化合物DM24-11合成过程中的N-(9-芴甲氧羰基)-L-苯丙氨酸的缩合操作。
(4)N2-(9-芴甲氧羰基)-N6-乙酰基-D-赖氨酸的缩合
称取树脂摩尔量1.5-3倍的N2-(9-芴甲氧羰基)-N6-乙酰基-D-赖氨酸，以及树脂摩尔量3-6倍的1-羟基苯并三唑，和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐，溶于N,N-二甲基甲酰胺中；随后，加入树脂摩尔量3-6倍的N,N-二异丙基乙胺；将混合液加入步骤(3)所得肽树脂中，按照实施案例一中步骤(2)的工艺缩合氨基酸和脱除9-芴甲氧羰基，得到肽树脂H-D-Lys(Ac)-Phe-(2-furyl)Map-Resin。
(5)N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸的缩合
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸的缩合操作，得到四肽树脂Boc-Tyr-D-Lys(Ac)-Phe-(2-furyl)Map-Resin。
(6)切肽与萃肽
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的切肽和萃肽的操作，得到粗产物H-Tyr-D-Lys(Ac)-Phe-(2-furyl)Map-NH2。
(7)制备纯化及鉴定
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的制备纯化及鉴定的操作。纯化后得到白色固体DM24-13，纯肽产率24％。DM24-13的理化特征见表5，DM24-13的ESI-MS谱图见图14。
实施例14、DM24-14的合成
(1)树脂处理
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的树脂处理的操作。
(2)N-(9-芴甲氧羰基)-3-氨基-2-甲烯基-3-(2-呋喃)-丙酸缩合
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的N-(9-芴甲氧羰基)-3-氨基-2-甲烯基-3-(2-呋喃)-丙酸的缩合操作。
(3)N-(9-芴甲氧羰基)-L-苯丙氨酸的缩合
同实施例十一中化合物DM24-11合成过程中的N-(9-芴甲氧羰基)-L-苯丙氨酸的缩合操作。
(4)(R)-2-[(9-芴甲氧羰基)氨基]-3-乙酰氨基丙酸的缩合
称取树脂摩尔量1.5-3倍的(R)-2-[(9-芴甲氧羰基)氨基]-3-乙酰氨基丙酸，以及树脂摩尔量3-6倍的1-羟基苯并三唑，和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐，溶于N,N-二甲基甲酰胺中；随后，加入树脂摩尔量3-6倍的N,N-二异丙基乙胺；将混合液加入步骤(3)所得肽树脂中，按照实施案例一中步骤(2)的工艺缩合氨基酸和脱除9-芴甲氧羰基，得到肽树脂H-D-Dap(Ac)-Phe-(2-furyl)Map-Resin。
(5)N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸的缩合
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸的缩合操作，得到四肽树脂Boc-Tyr-D-Dap(Ac)-Phe-(2-furyl)Map-Resin。
(6)切肽与萃肽
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的切肽和萃肽的操作，得到粗产物H-Tyr-D-Dap(Ac)-Phe-(2-furyl)Map-NH2。
(7)制备纯化及鉴定
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的制备纯化及鉴定的操作。纯化后得到白色固体DM24-14，纯肽产率27％。DM24-14的理化特征见表5，DM24-14的ESI-MS谱图见图15。
实施例15、DM24-15的合成
(1)树脂处理
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的树脂处理的操作。
(2)N-(9-芴甲氧羰基)-3-氨基-2-甲烯基-3-(2-呋喃)-丙酸缩合
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的N-(9-芴甲氧羰基)-3-氨基-2-甲烯基-3-(2-呋喃)-丙酸的缩合操作。
(3)N-(9-芴甲氧羰基)-L-苯丙氨酸的缩合
同实施例十一中化合物DM24-11合成过程中的N-(9-芴甲氧羰基)-L-苯丙氨酸的缩合操作。
(4)(R)-2-[(9-芴甲氧羰基)氨基]-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]丙酸的缩合
称取树脂摩尔量1.5-3倍的(R)-2-[(9-芴甲氧羰基)氨基]-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]丙酸，以及树脂摩尔量3-6倍的1-羟基苯并三唑，和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐，溶于N,N-二甲基甲酰胺中；随后，加入树脂摩尔量3-6倍的N,N-二异丙基乙胺；将混合液加入步骤(3)所得肽树脂中，按照实施案例一中步骤(2)的工艺缩合氨基酸和脱除9-芴甲氧羰基方法，得到三肽树脂H-D-Dap(Boc)-Phe-(2-furyl)Map-Resin。
(5)N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸的缩合
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的N-叔丁氧羰基-L-酪氨酸的缩合操作，得到四肽树脂Boc-Tyr-D-Dap(Boc)-Phe-(2-furyl)Map-Resin。
(6)切肽与萃肽
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的切肽和萃肽的操作，得到粗产物H-Tyr-D-Dap-Phe-(2-furyl)Map-NH2。
(7)制备纯化及鉴定
同实施例1中化合物DM24-01合成过程中的制备纯化及鉴定的操作。纯化后得到白色固体DM24-15，纯肽产率18％。DM24-15的理化特征见表5，DM24-15的ESI-MS谱图见图16。
表5内吗啡肽类似物理化特征
a.反向-HPLC分析测定的保留时间：分析柱：WateRs Delta-Pak C18 column(3.9mm×150mm)，洗脱剂的流速1mL/min，洗脱剂为乙腈(0.1％的三氟乙酸)和双蒸水(0.1％三氟乙酸)，乙腈：水＝5：95→95:5，洗脱时间为：0-30min，乙腈：水＝95:5→5:95，洗脱时间为：30-35min。
b.高效硅胶板上的Rf值：展开剂体系为乙酸乙酯:甲醇:氨水＝30:10:1。
Claims (6)
1.一类双功能D-氨基酸修饰阿片肽类化合物，其特征在于其结构通式为：
其中，
当时：
其中n＝3，
或
当时：
或
2.如权利要求1所述的双功能D-氨基酸修饰阿片肽类化合物的合成方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)合成固相载体肽树脂：
采用经典的固相合成方法，在MBHA树脂上依次接入N-(9-芴甲氧羰基)-3-氨基-2-甲烯基-3-(2-呋喃)-丙酸，Nα-芴甲氧羰基-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸或N-(9-芴甲氧羰基)-L-苯丙氨酸，得到N-末端9-芴甲氧羰基保护的二肽树脂Fmoc-Trp3(Boc)/Phe3-(2-furyl)Map4-Resin，在该二肽树脂中，加入9-芴甲氧羰基的脱除试剂，反应5-15min，得到H-Trp3(Boc)/Phe3-(2-furyl)Map4-Resin；
(2)在固相载体上，按照多肽序列C端至N端的顺序，依次接入相应氨基酸：将N-(9-芴甲氧羰基)-D-Xaa(None/Boc/Pbf)氨基酸、1-羟基苯并三唑、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐和N,N-二异丙基乙胺依次溶于N,N-二甲基甲酰胺中，将此混合液加入到步骤(1)得到的肽树脂中，在氩气保护下，室温反应1-3h，抽干，用N,N-二甲基甲酰胺洗涤，茚检，得到三肽树脂Fmoc-D-Xaa2(None/Boc/Pbf)-Trp3(Boc)/Phe3-(2-furyl)Map4-Resin；
向得到的三肽树脂中加入9-芴甲氧羰基的脱除试剂，反应5-15min，得到H-D-Xaa2(None/Boc/Pbf)-Trp3(Boc)-(2-furyl)Map4-Resin；
向得到的树脂中加入由N-叔丁氧羰基-酪氨酸、1-羟基苯并三唑、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐和N,N-二异丙基乙胺溶于N,N-二甲基甲酰胺中的到的混合液，在氩气保护下，室温反应1-3h，得到四肽树脂Boc-Tyr1-D-Xaa2(None/Boc/Pbf)-Trp3(Boc)/Phe3-(2-furyl)Map4-Resin；
(3)肽树脂后处理、切肽和萃肽：
将步骤(2)得到的肽树脂依次经过溶胀，压缩，抽干后，加入切割试剂，反应2-4h，浓缩，萃取，冷冻干燥，得到粗肽H-Tyr1-D-Xaa2-Trp3/Phe3-(2-furyl)Map4-NH2；
(4)制备纯化：
将步骤(3)得到的粗肽进行纯化，得到纯化后的双功能D-氨基酸修饰[(2-furyl)Map4]EMs的类似物。
3.如权利要求2所述的双功能D-氨基酸修饰阿片肽类化合物的合成方法，其特征在于：步骤(1)和(2)中各氨基酸的用量为所用MBHA树脂物质的量的1.5-3倍。
4.如权利要求3所述的双功能D-氨基酸修饰阿片肽类化合物的合成方法，其特征在于：步骤(2)中所述1-羟基苯并三唑、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐和N,N-二异丙基乙胺的用量均为所用MBHA树脂物质的量的3-6倍。
5.如权利要求4所述的双功能D-氨基酸修饰阿片肽类化合物的合成方法，其特征在于：步骤(2)中所述9-芴甲氧羰基的脱除试剂为六氢吡啶、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯和N,N-二甲基甲酰胺的混合液，六氢吡啶、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯和N,N-二甲基甲酰胺之间的体积比为1:1:98-3:3:94。
6.如权利要求1所述的双功能D-氨基酸修饰阿片肽类化合物在制备镇痛药物方面的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911188458.3A CN110776555B (zh) | 2019-11-28 | 2019-11-28 | 一类双功能d-氨基酸修饰阿片肽类化合物及其合成方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911188458.3A CN110776555B (zh) | 2019-11-28 | 2019-11-28 | 一类双功能d-氨基酸修饰阿片肽类化合物及其合成方法与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110776555A CN110776555A (zh) | 2020-02-11 |
| CN110776555B true CN110776555B (zh) | 2023-10-13 |
Family
ID=69393003
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201911188458.3A Active CN110776555B (zh) | 2019-11-28 | 2019-11-28 | 一类双功能d-氨基酸修饰阿片肽类化合物及其合成方法与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110776555B (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102241737A (zh) * | 2011-04-06 | 2011-11-16 | 兰州大学 | 内吗啡肽-1类似物及其合成和在制备镇痛药物中的应用 |
| CN103214552A (zh) * | 2012-10-31 | 2013-07-24 | 兰州大学 | 多位点修饰的内吗啡肽-1类似物的合成和应用 |
| CN104877005A (zh) * | 2015-04-16 | 2015-09-02 | 兰州大学 | 非天然氨基酸修饰的内吗啡肽-1类似物及其合成和应用 |
| CN105131084A (zh) * | 2015-09-25 | 2015-12-09 | 兰州大学 | 基于内吗啡肽2或Biphalin的棕榈酰化修饰的阿片肽类似物及其合成和应用 |
| CN106967151A (zh) * | 2017-02-07 | 2017-07-21 | 兰州大学 | 多位点组合修饰的内吗啡肽类似物及其合成和应用 |
-
2019
- 2019-11-28 CN CN201911188458.3A patent/CN110776555B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102241737A (zh) * | 2011-04-06 | 2011-11-16 | 兰州大学 | 内吗啡肽-1类似物及其合成和在制备镇痛药物中的应用 |
| CN103214552A (zh) * | 2012-10-31 | 2013-07-24 | 兰州大学 | 多位点修饰的内吗啡肽-1类似物的合成和应用 |
| CN104877005A (zh) * | 2015-04-16 | 2015-09-02 | 兰州大学 | 非天然氨基酸修饰的内吗啡肽-1类似物及其合成和应用 |
| CN105131084A (zh) * | 2015-09-25 | 2015-12-09 | 兰州大学 | 基于内吗啡肽2或Biphalin的棕榈酰化修饰的阿片肽类似物及其合成和应用 |
| CN106967151A (zh) * | 2017-02-07 | 2017-07-21 | 兰州大学 | 多位点组合修饰的内吗啡肽类似物及其合成和应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Design, Synthesis and Pharmacological Characterization of Endomorphin Analogues with Non-Cyclic Amino Acid Residues in Position 2;Perlikowska R等;《Basic & clinical pharmacology & toxicology》;第106卷(第2期);摘要、第111页左栏最后一段，第112页右栏第1段 * |
| MEL-N16: A Series of Novel Endomorphin Analogs with Good Analgesic Activity and a Favorable Side Effect Profile;Liu Xin等;《ACS chemical neuroscience》;第8卷(第10期);图1，表1-6，第2184页左栏第2段-第2-86页左栏第2段 * |
| 多靶点肽类镇痛药物的研究进展;方泉等;《药学进展》(第10期);第10-21页 * |
| 非天然氨基酸修饰的内吗啡肽类似物构效关系及药理活性研究;王媛;《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》(第1期);第E079-70页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110776555A (zh) | 2020-02-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Coy et al. | Synthesis and opioid activities of stereoisomers and other D-amino acid analogs of methionine-enkephalin | |
| US6472505B1 (en) | Peptide parathyroid hormone analogs | |
| JP5358564B2 (ja) | 環状ペプチドｃｘｃｒ４アンタゴニスト | |
| Toth et al. | Ring substituted and other conformationally constrained tyrosine analogs of [cyclic][D-Pen2, D-Pen5] enkephalin with. delta.-opioid receptor selectivity | |
| JPH10504802A (ja) | コンホメーション的に固定された主鎖環化ペプチド類似体 | |
| JPH08225595A (ja) | 環状ペプチドおよびその用途 | |
| CZ168893A3 (en) | Novel amylin-antagonizing peptides and their use | |
| CZ61893A3 (en) | Cyclopeptides, process of their preparation and their use as medicaments | |
| EP1831244A2 (en) | Dermorphin analogs with analgesic activity | |
| Sato et al. | Synthesis and invitro bioactivity of human growth hormone-releasing factor analogs substituted with a single D-amino acid | |
| EP1422240A2 (en) | Analogs of nociceptin | |
| CN110776555B (zh) | 一类双功能d-氨基酸修饰阿片肽类化合物及其合成方法与应用 | |
| US4213968A (en) | Enkephalin derivatives | |
| EP1189941B1 (en) | Neuromedin b and somatostatin receptor agonists | |
| Haskell-Luevano et al. | Design, Synthesis, Biology, and Conformations of Bicyclic. alpha.-Melanotropin Analogs | |
| WO2022188628A1 (zh) | 一类阿片/神经肽ff受体多靶点环肽分子及其制备和应用 | |
| US4139504A (en) | Novel nonapeptides, intermediates therefor, and compositions and methods employing said nonapeptides | |
| EP0606881B1 (en) | Cyclic pentapeptides having a beta-turn and a gamma-turn | |
| STORY et al. | Synthesis and opioid activity of 2–substituted dynorphin A‐(1‐13) amide analogues 1 | |
| US4127532A (en) | Novel heptapeptides, intermediates therefor, and compositions and methods employing said heptapeptides | |
| CN108976287B (zh) | 一类阿片和神经肽ff受体多靶点分子bn-9的二硫键环化类似物及其制备方法与应用 | |
| US6346604B1 (en) | Method for controlling conformation of cyclopentapeptide | |
| US4127527A (en) | Novel pentadecapeptides, intermediates therefor, and compositions and methods employing said pentadecapeptides | |
| Biondi et al. | Opioid peptides: synthesis and biological activity of new endomorphin analogues | |
| US4127531A (en) | Novel hexapeptides, intermediates therefor, and compositions and methods employing said hexapeptides |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20231009 Address after: 730000 No. 222 Tianshui South Road, Chengguan District, Gansu, Lanzhou Applicant after: LANZHOU University Address before: 730000 No. 222 Tianshui South Road, Chengguan District, Gansu, Lanzhou Applicant before: Wang Rui |
|
| TA01 | Transfer of patent application right |