CN104877005A - 非天然氨基酸修饰的内吗啡肽-1类似物及其合成和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一类非天然氨基酸修饰的内吗啡肽-1类似物，是将母体内吗啡肽-1从N端至C端的第4位的氨基酸苯丙氨酸分别由2-噻吩基取代的α-烯基-β-氨基酸，3-噻吩基取代的α-烯基-β-氨基酸替换，有效提高其μ阿片受体亲和能力及酶解稳定性，从而进一步提高并延长其在体镇痛效果。通过放射配体受体结合实验，离体器官生物检定，离体酶解稳定性和温浴甩尾镇痛实验对其进行了药理学的活性鉴定，结果显示，本发明合成的非天然氨基酸修饰的内吗啡肽类似物较母体内吗啡肽-1具有更高的亲和能力、更高的酶解稳定性和更高的镇痛活性等，具有成为临床多肽镇痛药物的潜在应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一类内吗啡肽-1类似物，尤其涉及一类非天然氨基酸修饰的内吗啡肽-1类似物及其合成方法，本发明同时涉及该内吗啡肽-1类似物在镇痛调节方面的应用。
背景技术
疼痛是患者寻求医护治疗的最常见的原因之一，它对患者个人、家庭、社会、政府及工业领域都造成了极大的经济负担。目前全世界约有20%的人遭受疼痛的折磨，而阿片类药物则是治疗严重急性痛、术后痛和癌痛的首选药，目前尚无其他的镇痛药可以替代阿片类药物在严重疼痛中的治疗地位。阿片肽是一种通过阿片受体起到镇痛作用的内源性神经递质，阿片肽一经发现就引起了科学界的广泛关注。1997年，μ阿片受体的内源性阿片肽：内吗啡肽-1和内吗啡肽-2被首次发现，这是一类在所有已知的内源性阿片肽中对μ阿片受体的亲和性和选择性最高的多肽，并且在起到理想镇痛作用的同时不会带来类似于吗啡的副作用。然而，内吗啡肽的临床应用仍然受到了很多限制，例如其较短的作用时间、在体内容易被酶解、难以穿透血脑屏障到达中枢神经系统等。
因此，通过化学改造修饰内吗啡肽-1提高其亲和能力和酶解稳定性，以获得一系列神经肽受体的高效配体成为近年来研究的方向。非天然氨基酸在研究多肽结构和功能应用方面有非常重要的作用，通过基团替换模拟原有的天然结构，能够进一步探讨天然配体的构效关系。最近研究显示，使用非天然β-氨基酸取代对应的α-氨基酸修饰生物活性肽能够对其结构和活性产生明显影响（Med.Res.Rev.2012,32,536；J Med Chem.,2012,55,6224）。使用非天然氨基酸修饰内吗啡肽的特点位点，对其进行有针对性的化学改造，已经成为发展内吗啡肽-1成为临床多肽镇痛药物的研究方向。
发明内容
本发明目的是提供一类非天然氨基酸修饰的内吗啡肽-1类似物。
本发明的另一目的是提供该非天然氨基酸修饰的内吗啡肽-1类似物的合成方法。
本发明还有一个目的，就是提供该非天然氨基酸修饰的内吗啡肽-1类似物作为活性物质在制备镇痛药物中的应用。
一、非天然氨基酸修饰的内吗啡肽-1类似物
本发明非天然氨基酸修饰的内吗啡肽-1类似物的结构特点是：将母体内吗啡肽-1从N端至C端的第4位的氨基酸苯丙氨酸分别由2-噻吩基取代的α-烯基-β-氨基酸、3-噻吩基取代的α-烯基-β-氨基酸替换而得。其命名分别为酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3（2-噻吩）丙酸酰胺（[(2-thienyl)Map4]EM-1），酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺（[(3-thienyl)Map4]EM-1）。其具体结构式：
二、非天然氨基酸修饰的内吗啡肽-1类似物的合成
本发明内吗啡肽-1类似物的合成，包括以下工艺步骤：
（1）化合物N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（2-噻吩）丙酸酰胺或N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺合成：将N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（2-噻吩）丙酸或N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸溶于无水二氯甲烷，于 0~5℃下依次加入N,N-二异丙基乙基胺，1-羟基苯并三唑，1-乙基-3-（3-二甲胺丙基）碳二亚胺，搅拌充分溶解后加入氨水，室温反应10~12小时；反应结束后洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，得白色固体即为N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（2-噻吩）丙酸或N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸的酰胺。
N,N-二异丙基乙基胺的加入量为N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（2-噻吩）丙酸或N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸摩尔量的4~5倍；
1-羟基苯并三唑的加入量为N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（2-噻吩）丙酸或N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸摩尔量的1.45~1.5倍；
1-乙基-3-（3-二甲胺丙基）碳二亚胺的加入量为N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（2-噻吩）丙酸或N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸摩尔量的1.5~1.6倍；
氨水的加入量为N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（2-噻吩）丙酸或N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸摩尔量的1.2~1.5倍。
（2）3-氨基-2-甲烯基-3-（2-噻吩）丙酸酰胺或3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺合成：将化合物N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（2-噻吩）丙酸酰胺或N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺溶于乙酸乙酯和盐酸的混合溶液中，室温反应2~2.5小时后，调节pH=9~10，用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，得白色固体，即为3-氨基-2-甲烯基-3-（2-噻吩）丙酸酰胺或3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺。
乙酸乙酯和盐酸的混合溶液中，乙酸乙酯和盐酸的体积比为4:1~4.5:1。
（3）N-叔丁氧羰基-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3（2-噻吩）丙酸酰胺或N-叔丁氧羰基-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺的合成：将N-叔丁氧羰基-色氨酸溶于无水二氯甲烷，于0~5℃下依次加入N,N-二异丙基乙基胺，1-羟基苯并三唑，1-乙基-3-（3-二甲胺丙基）碳二亚胺，搅拌充分溶解后加入3-氨基-2-甲烯基-3-（2-噻吩）丙酸酰胺或3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺的二氯甲烷溶液，室温反应10~12小时，反应结束后洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，得白色固体产物即为N-叔丁氧羰基-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3（2-噻吩）丙酸酰胺或N-叔丁氧羰基-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺。
N,N-二异丙基乙基胺的加入量为N-叔丁氧羰基-色氨酸摩尔量的4~5倍量；
1-羟基苯并三唑的加入量为N-叔丁氧羰基-色氨酸摩尔量的1.45~1.5倍；
1-乙基-3-（3-二甲胺丙基）碳二亚胺的加入量为N-叔丁氧羰基-色氨酸摩尔量的1.5~1.6倍；
3-氨基-2-甲烯基-3-（2-噻吩）丙酸酰胺或3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺的加入量为N-叔丁氧羰基-色氨酸的摩尔量的1.2-1.5倍。
（4）N-叔丁氧羰基-酪氨酸-脯氨酸的合成：将N-叔丁氧羰基-酪氨酸溶于无水二氯甲烷，0~5℃搅拌下依次加入N,N-二异丙基乙基胺，1-羟基苯并三唑，1-乙基-3-（3-二甲胺丙基）碳二亚胺，搅拌充分溶解后加入脯氨酸的饱和碳酸氢钠溶液，室温反应10~12小时，反应结束后洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，得油状液体产物N-叔丁氧羰基-酪氨酸-脯氨酸。
N,N-二异丙基乙基胺的加入量为N-叔丁氧羰基-酪氨酸摩尔量的4~5倍；
1-羟基苯并三唑的加入量为N-叔丁氧羰基-酪氨酸摩尔量的1.45~1.5倍；
1-乙基-3-（3-二甲胺丙基）碳二亚胺的加入量为N-叔丁氧羰基-酪氨酸摩尔量的1.5~1.6倍；
脯氨酸的摩尔量为N-叔丁氧羰基-酪氨酸的1.2~1.5倍。
（5）色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3（2-噻吩）丙酸酰胺或色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺的合成：将N-叔丁氧羰基-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3（2-噻吩）丙酸酰胺或N-叔丁氧羰基-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺溶于乙酸乙酯和盐酸的混合溶液中，室温反应2~2.5小时后，调节pH=9~10，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，得白色固体色，即为氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3（2-噻吩）丙酸酰胺或色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺。
乙酸乙酯和盐酸的混合溶液中，乙酸乙酯和盐酸的体积比为4:1~4.5:1。
（6）N-叔丁氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3（2-噻吩）丙酸酰胺或N-叔丁氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺的合成：将N-叔丁氧羰基-酪氨酸-脯氨酸溶于无水二氯甲烷，于0~5℃下依次加入N,N-二异丙基乙基胺，1-羟基苯并三唑，1-乙基-3-（3-二甲胺丙基）碳二亚胺，搅拌充分溶解后加入色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3（2-噻吩）丙酸酰胺或色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺的二氯甲烷溶液，室温反应12~16小时，反应结束后洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，得白色固体产物即为N-叔丁氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3（2-噻吩）丙酸酰胺或N-叔丁氧羰基-2,6-二甲基酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺。
N,N-二异丙基乙基胺的加入量为N-叔丁氧羰基-酪氨酸-脯氨酸摩尔量的4~5倍；
1-羟基苯并三唑的加入量为N-叔丁氧羰基-酪氨酸-脯氨酸摩尔量的1.45~1.5倍；
1-乙基-3-（3-二甲胺丙基）碳二亚胺的加入量为N-叔丁氧羰基-酪氨酸-脯氨酸摩尔量的1.5~1.6倍；
色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3（2-噻吩）丙酸酰胺或色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺的加入量为N-叔丁氧羰基-酪氨酸-脯氨酸摩尔量的1.2~1.5倍。
（7）酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3（2-噻吩）丙酸酰胺或酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺的合成：将N-叔丁氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3（2-噻吩）丙酸酰胺或N-叔丁氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺溶于乙酸乙酯和盐酸的混合溶液中，室温反应2~2.5小时后，调节pH=9~10，用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，得白色固体即为非天然氨基酸修饰的内吗啡肽-1类似物——酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3（2-噻吩）丙酸酰胺（[(2-thienyl)Map4]EM-1）或酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺（[(3-thienyl)Map4]EM-1）。
上述乙酸乙酯和盐酸的混合溶液中，乙酸乙酯和盐酸的体积比为4:1~4.5:1。
上述合成产物经过RP-HPLC制备纯化，冷冻干燥机冻干的最终产物经RP-HPLC，TLC，ESI-MS确定其分子量及纯度，类似物纯度为95%~99%。
综上所述，本发明采用HOBt/EDC活化酯法，对内吗啡肽-1通过合理有效的化学修饰改造，使母体内吗啡肽-1 从N端至C端的第4位的氨基酸苯丙氨酸由2-噻吩基取代α-烯基-β-氨基酸或3-噻吩基取代的α-烯基-β-氨基酸替换，有效提高其μ阿片受体亲和能力及酶解稳定性，从而进一步提高并延长其在体镇痛效果。
三、内吗啡肽-1类似物的镇痛活性
下面放射配体受体结合实验，离体器官生物检定，离体酶解稳定性和温浴甩尾镇痛实验对本发明合成的非天然氨基酸修饰的内吗啡肽-1类似物的药理学活性进行鉴定。
1. 结合试验（Radioligand binding assay）
本实验细胞采用稳定表达μ/δ阿片受体的HEK293（人胚胎肾细胞）细胞。实验分为总结合管、竞争结合管和非特异性结合管，每个反应管中依次加入放射配体，纳洛酮（Naloxone，Nx）/非放射性药物，TRis-HCl（pH=7.4）和细胞悬液（200ul）。其中，在总结合管中只加入[3H]DAMGO（0.5nM）和细胞悬液（200ul），在非特异性结合管和竞争结合管中，分别另加入10μM Nx/不同浓度的类似物和细胞悬液，最后补充TRis-HCl缓冲液（pH=7.4）至总体积0.4ml。振荡器混匀反应液，37℃摇床反应1h，取出离心管，反应液经ZT-II型细胞收集器收集，GF/C型玻璃纤维素膜过滤。80℃油浴下烘烤玻璃纤维素膜30min后取出滤膜，放入24孔板中，每孔加入0.7 ml 闪烁液，封盖膜封盖。隔夜用β液体闪烁计数仪记录放射性强度（CPM）。计算类似物对特异性结合的抑制率，以浓度的负对数为横坐标，抑制率为纵坐标，线性回归求得IC50值，根据公式Ki=IC50/(1+[L]/KD)计算Ki值。每个实验数据分别平行做3组实验求平均值。
实验结果见表1。实验数据显示，本发明合成的非天然氨基酸修饰的内吗啡肽-1类似物[(2-thienyl)Map4]EM-1，[(3-thienyl)Map4]EM-1的亲和能力μ阿片受体有一定提高，δ阿片受体的亲和性与母体基本一致。所有类似物的受体选择性都明显提高。
2. 离体生物活性功能检定（In vitRobioactivity assays）
2.1豚鼠离体回肠纵行肌实验（GPI实验）
体重250~300g豚鼠，雌雄不限，实验前禁食12h，饮水不限。棒击枕部处死，剖腹取出近盲肠端的回肠6cm两段，浸入持续通入95%O2和5%CO2混合气的KReb’s液（g\L: 氯化钠 6.9，CaC12 0.28，KCl 0.35，KH2PO4 0.16，MgSO4·7H2O 0.30，碳酸氢钠2.1，葡萄糖1.98，苯海拉明50×10-6，氯化胆碱2.8×10-3）中，湿润后套在一根玻璃棒上，沿回肠壁的一根纵形血管将纵行肌与环形肌分离，然后用零号丝线将纵行肌的一端缚在玻璃电极的小钩上，另一端缚在JZ-1型肌肉张力传感器上，制备好后立即放入盛有持续通入气体(95%O2和5%CO2)的KReb’s液、恒温37±0.5℃的玻璃浴管中，预负荷500mg。前30min每5min换一次营养液，以后每10min换液一次，平衡2h后开始实验。给予电刺激，刺激参数:波宽0.3-0.1ms单方波，频率6次/min，负载电压80V。记录基础收缩强度，再给予适量内吗啡肽-1鉴定其活性，然后分别给予不同剂量的待试药物，记录收缩强度，计算抑制百分率。每次药物作用后，用营养液冲洗3次，平衡15min。
抑制百分率=（反应前收缩高度-反应后收缩高度）/反应前收缩高度×100%。
用剂量-效应半对数作图法，以抑制百分率为纵坐标，以待测药物浓度的对数为横坐标作图，求得抑制50%收缩高度的药物浓度（IC50）。
2.2小鼠输精管实验（MVD实验）
体重30-35g雄性昆明系小白鼠，颈椎脱臼处死，剖腹取出两侧输精管，浸入持续通入95%O2和5%CO2混合气的KReb’s液（g\L:氯化钠 6.9，CaC12 0.28，KCl 0.35，KH2PO4 0.16，MgSO4·7H2O 0.30，碳酸氢钠2.1，葡萄糖1.98），剥离附着于其上的脂肪及血管。剪去输精管的一端，用小棉花球轻轻地从末端向开口端压出管内的精液，变成一条空心管，然后用零号丝线将其一端缚在玻璃电极的小钩上，另一端缚在JZ-1型肌肉张力传感器上，制备好后立即放入盛有持续通入气体（95%O2和5%CO2）的KReb’s液，恒温36.5±0.5℃的玻璃浴管中，预负荷l00mg。前30min每5min换一次营养液，以后每10min换液一次，平衡2h后开始实验。给予电刺激，刺激参数：波宽2ms，频率6次/min，负载电压80V。记录基础收缩强度，再给予适量内吗啡肽-1鉴定其活性，然后分别给予不同剂量的待试药物，记录收缩强度。每次药物作用后，用营养液冲洗5次，平衡15min。IC50测定方法同GPI实验。
实验结果见表2。表2实验数据显示，GPI/MVD实验与放射配体结合实验结果的趋势是一致的。内吗啡肽-1类似物[(2-thienyl)Map4]EM-1和[(3-thienyl)Map4]EM-1表现出的GPI/MVD的IC50值都高于母体，GPI的IC50值分别达到母体的5.5和4.2倍；使用δ阿片受体特异性拮抗剂naltrindole能部分拮抗这些类似物的MVD激动效应，说明这些多肽的高DOR激动效应可能主要或部分地由共存于MVD上的MOR介导。实验结果表明这些类似物在离体生物标本中对μ/δ阿片受体有强的激动活性。
3. 离体酶解稳定性试验（In vitRometabolic stability）
体重30~35g成年雄性小鼠，颈椎脱臼处死，取大脑（去除小脑及脑桥）滤纸吸干，称重。用冰冷的1mM的Tris-HCl缓冲液（pH=7.4）冲洗除去溢血后，加入50倍体积（v/w）冰冷1mM TRis-HCl（pH=7.4）缓冲液，0℃下用匀浆器使之成胞浆匀浆，匀浆液置于冰浴中放置30分钟以促进细胞溶解。然后按每1ml匀浆液补加0.5ml 50mM冰冷的Tris-HCl，再次匀浆，吹打悬浮。49,000 g离心45min，弃上清，将沉淀重新悬浮于50倍体积的冰冷50mM Tris-HCl中，吹打悬浮。49,000 g再次离心45min，弃上清，沉淀悬浮于适当体积的50mM Tris-HCl中，使脑膜蛋白浓度约为2mg/ml。振荡器震荡涡旋混匀，分装，-80℃冻存。
取10μl多肽母液（10-2M），加入到190μl脑质膜中，立即振荡混匀，然后迅速取出20μl混合液，加入离心管中计时为0min，余者于37℃下继续孵育，并分别在5min，10min，15min，30min，60min，120min，240min，480min取出20μl。酶解过程的终止：取出的样品中加入90μl乙腈振荡混匀，样品置于冰上放置5分钟，再用90μl 0.5%的冰冷乙酸稀释以确保酶解过程停止。4℃下13,000g离心15min，收集上清，-80℃冻存，直至RP-HPLC分析。
RP-HPLC系统使用WateRs Delta 600控制器、紫外监测器和WateRs Delta Pak C18柱（3.9 mm × 150 mm）。脑膜样品在波长280nm下检测，流动相流速0.8ml/min，流动相=乙腈含0.05% TFA (A) +水含0.05% TFA (B)。流动相的体积比为A:B = 10:90~90:10，洗脱时间：0~30 min。实验分别测定每个时间点样品药物浓度，并根据药物代谢公式以每个时间点的药物浓度和时间绘制药物变化曲线计算求得药物得半衰期。每个实验数据平行3组求平均值。
实验结果见表3。表3的实验数据显示，所得类似物的小鼠脑质膜半衰期都显著长于母体，结果表明类似物在离体生物组织中具有好的酶解稳定性，因此可以延长其对镇痛的调节作用。
4. 镇痛实验（Assessment of antinociception）
采用小鼠温浴甩尾法。体重18-20g昆明系雄性小鼠，环境温度20℃，水浴温度50 ± 0.5℃。给药前先测定小鼠的基础痛阈（contRol latency，CL)，将小鼠鼠尾的1/3-1/2浸入水浴，记录鼠尾从刚浸入水浴至发生收缩的时间。过于敏感（<2.5s）或迟钝的(>5s)小鼠弃去不用，截止时间10s以防小鼠烫伤。药物注射剂量:侧脑室（i.c.v.）注射20nmol/kg。每只小鼠侧脑室分别注射EM-1及类似物4μl，给药后90分钟内，前30min每5分钟测一次，后每10分钟测一次甩尾潜伏期（test latency，TL），0.9%生理盐水作为空白对照。结果以最大可能效应百分比（maximum possible effect, % MPE）表示：%MPE=100×(TL-CL)/(10-CL) 。
实验结果见图1。图1所示为内吗啡肽类似物侧脑室注射20 nmol/kg的类似物产生的镇痛时效曲线，两种类似物均产生明显的镇痛作用，镇痛效力和镇痛持续时间都明显增加，其最高镇痛能力分别达到88%和82%，且如图所示镇痛能力有所延长。镇痛效力和镇痛持续时间都明显增加，实验结果表明类似物在体内能够发挥有效的镇痛作用。
综上所述，本发明化学修饰的内吗啡肽-1类似物较母体内吗啡肽-1具有更高的亲和能力、更高的酶解稳定性和更高的镇痛活性，因此，在制备镇痛药物方面具有很好的临床应用价值。
附图说明
图1是本发明内吗啡肽-1类似物合成路线流程图；
图2是侧脑室注射内吗啡肽-1类似物镇痛效应-时间曲线；
图3是类似物[(2-thienyl)Map4]EM-1的ESI-MS谱图；
图4是类似物[(3-thienyl)Map4]EM-1的ESI-MS谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明内吗啡肽-1类似物的合成及其产物的表征进行详述。
实施例1：[(2-thienyl)Map4]EM-1的合成：
（1）N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（2-噻吩）丙酸的酰胺合成
将N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（2-噻吩）丙酸溶于无水处理的二氯甲烷，于 0~5℃下依次加入N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（2-噻吩）丙酸摩尔量4~5倍量的N,N-二异丙基乙基胺，1.45~1.5倍量的1-羟基苯并三唑，1.5~1.6倍量的1-乙基-3-（3-二甲胺丙基）碳二亚胺，搅拌充分溶解后加入N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（2-噻吩）丙酸摩尔量1.2~1.5倍的氨水，室温反应10~12小时；反应结束后洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，得白色固体N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（2-噻吩）丙酸的酰胺。
（2）3-氨基-2-甲烯基-3-（2-噻吩）丙酸酰胺合成
将化合物N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（2-噻吩）丙酸的酰胺溶于乙酸乙酯和盐酸的混合溶液中（乙酸乙酯和盐酸的体积比为4:1~4.5:1），室温反应2~2.5小时后，调节pH=9~10，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，得白色固体3-氨基-2-甲烯基-3-（2-噻吩）丙酸酰胺；
（3）N-叔丁氧羰基-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3（2-噻吩）丙酸酰胺的合成
将N-叔丁氧羰基-色氨酸溶于无水处理的二氯甲烷，于0~5℃下依次加入N-叔丁氧羰基-色氨酸摩尔量4-5倍量的N,N-二异丙基乙基胺，1.45~1.5倍量的1-羟基苯并三唑，1.5~1.6倍量的1-乙基-3-（3-二甲胺丙基）碳二亚胺，搅拌充分溶解后加入3-氨基-2-甲烯基-3-（2-噻吩）丙酸酰胺的二氯甲烷溶液，室温反应10~12小时，反应结束后洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，得白色固体产物N-叔丁氧羰基-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3（2-噻吩）丙酸酰胺；其中，3-氨基-2-甲烯基-3-（2-噻吩）丙酸酰胺的摩尔量为N-叔丁氧羰基-色氨酸的1.2~1.5倍；
（4）N-叔丁氧羰基-酪氨酸-脯氨酸的合成
将N-叔丁氧羰基-酪氨酸溶于无水二氯甲烷，0~5℃搅拌下依次加入N-叔丁氧羰基-酪氨酸摩尔量4~5倍量的N,N-二异丙基乙基胺，1.45~1.5倍量的1-羟基苯并三唑，1.5~1.6倍量的1-乙基-3-（3-二甲胺丙基）碳二亚胺，搅拌充分溶解后加入脯氨酸的饱和碳酸氢钠溶液，室温反应10~12小时，反应结束后洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，得油状液体产物N-叔丁氧羰基-酪氨酸-脯氨酸；所述脯氨酸的摩尔量为N-叔丁氧羰基-酪氨酸的1.2~1.5倍；
（5）色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3（2-噻吩）丙酸酰胺的合成
将N-叔丁氧羰基-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3（2-噻吩）丙酸酰胺溶于乙酸乙酯和盐酸的混合溶液中（乙酸乙酯和盐酸的体积比为4:1~4.5:1），室温反应2~2.5小时后，调节pH=9~10，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，得白色固体色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3（2-噻吩）丙酸酰胺；
（6）N-叔丁氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3（2-噻吩）丙酸酰胺的合成
将N-叔丁氧羰基-酪氨酸-脯氨酸溶于无水二氯甲烷，于0~5℃下依次加入N-叔丁氧羰基-酪氨酸-脯氨酸摩尔量4~5倍量的N,N-二异丙基乙基胺，1.45~1.5倍量的1-羟基苯并三唑，1.5~1.6倍量的1-乙基-3-（3-二甲胺丙基）碳二亚胺，搅拌充分溶解后加入色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3（2-噻吩）丙酸酰胺的二氯甲烷溶液，室温反应12~16小时，反应结束后洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，得白色固体产物N-叔丁氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3（2-噻吩）丙酸酰胺；其中，色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3（2-噻吩）丙酸酰胺的摩尔量为N-叔丁氧羰基-酪氨酸-脯氨酸的1.2~1.5倍；
（7）酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3（2-噻吩）丙酸酰胺的合成
将N-叔丁氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3（2-噻吩）丙酸酰胺溶于乙酸乙酯和盐酸的混合溶液中（乙酸乙酯和盐酸的体积比为4:1~4.5:1），室温反应2~2.5小时后，调节pH=9~10，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，得白色固体酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3（2-噻吩）丙酸酰胺——[(2-thienyl)Map4]EM-1，产率91%。其结构式为：
[(2-thienyl)Map4]EM-1的理化特征见表4，其ESI-MS谱图见图3。
实施例2：[(3-thienyl)Map4]EM-1的合成：
（1）N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸的酰胺合成
将N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸溶于无水处理的二氯甲烷，于 0~5℃下依次加入N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸摩尔量4~5倍量的N,N-二异丙基乙基胺，1.45~1.5倍量的1-羟基苯并三唑，1.5~1.6倍量的1-乙基-3-（3-二甲胺丙基）碳二亚胺，搅拌充分溶解后加入N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸摩尔量1.2~1.5倍的氨水，室温反应10~12小时；反应结束后洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，得白色固体N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸的酰胺；
（2）3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺合成
将化合物N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸的酰胺溶于乙酸乙酯和盐酸的混合溶液中（乙酸乙酯和盐酸的体积比为4:1~4.5:1），室温反应2~2.5小时后，调节pH=9~10，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，得白色固体3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺；
（3）N-叔丁氧羰基-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺的合成
将N-叔丁氧羰基-色氨酸溶于无水处理的二氯甲烷，于0~5℃下依次加入N-叔丁氧羰基-色氨酸摩尔量4~5倍量的N,N-二异丙基乙基胺，1.45~1.5倍量的1-羟基苯并三唑，1.5~1.6倍量的1-乙基-3-（3-二甲胺丙基）碳二亚胺，搅拌充分溶解后加入3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺的二氯甲烷溶液，室温反应10~12小时，反应结束后洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，得白色固体产物N-叔丁氧羰基-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺。其中，3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺的摩尔量为N-叔丁氧羰基-色氨酸的1.2~1.5倍；
（4）N-叔丁氧羰基-酪氨酸-脯氨酸的合成
将N-叔丁氧羰基-酪氨酸溶于无水二氯甲烷，0~5℃搅拌下依次加入N-叔丁氧羰基-酪氨酸摩尔量4~5倍量的N,N-二异丙基乙基胺，1.45~1.5倍量的1-羟基苯并三唑，1.5~1.6倍量的1-乙基-3-（3-二甲胺丙基）碳二亚胺，搅拌充分溶解后加入脯氨酸的饱和碳酸氢钠溶液，室温反应10~12小时，反应结束后洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，得油状液体产物N-叔丁氧羰基-酪氨酸-脯氨酸；所述脯氨酸的摩尔量为N-叔丁氧羰基-酪氨酸的1.2~1.5倍；
（5）色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺的合成
将N-叔丁氧羰基-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺溶于乙酸乙酯和盐酸的混合溶液中（乙酸乙酯和盐酸的体积比为4:1~4.5:1），室温反应2~2.5小时后，调节pH=9~10，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，得白色固体色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺；
（6）N-叔丁氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺的合成
将N-叔丁氧羰基-酪氨酸-脯氨酸溶于无水二氯甲烷，于0~5℃下依次加入N-叔丁氧羰基-酪氨酸-脯氨酸摩尔量4~5倍量的N,N-二异丙基乙基胺，1.45~1.5倍量的1-羟基苯并三唑，1.5~1.6倍量的1-乙基-3-（3-二甲胺丙基）碳二亚胺，搅拌充分溶解后加入色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺的二氯甲烷溶液，室温反应12~16小时，反应结束后洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，得白色固体产物N-叔丁氧羰基-2,6-二甲基酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺。其中色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺的摩尔量为N-叔丁氧羰基-酪氨酸-脯氨酸的1.2~1.5倍；
（7）酪氨酸-脯氨酸- 色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺的合成
将N-叔丁氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺溶于乙酸乙酯和盐酸的混合溶液中（乙酸乙酯和盐酸的体积比为4:1~4.5:1），室温反应2~2.5小时后，调节pH=9~10，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，得白色固体酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺——[(3-thienyl)Map4]EM-1，产率89%。其结构式为：
[(3-thienyl)Map4]EM-1的理化特征见表4，其ESI-MS谱图见图4。
Claims (8)
1. 一类非天然氨基酸修饰的内吗啡肽-1类似物，是将母体内吗啡肽-1从N端至C端的第4位的氨基酸苯丙氨酸分别由2-噻吩基取代的α-烯基-β-氨基酸、3-噻吩基取代的α-烯基-β-氨基酸替换而得；其具体结构式和命名分别如下：
。
2.如权利要求1所述非天然氨基酸修饰的内吗啡肽-1类似物的合成方法，包括以下工艺步骤：
（1）化合物N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（2-噻吩）丙酸酰胺或N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺合成：将N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（2-噻吩）丙酸或N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸溶于无水二氯甲烷，于 0~5℃下依次加入N,N-二异丙基乙基胺，1-羟基苯并三唑，1-乙基-3-（3-二甲胺丙基）碳二亚胺，搅拌充分溶解后加入氨水，室温反应10~12小时；反应结束后洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，得白色固体即为N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（2-噻吩）丙酸或N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸的酰胺；
（2）3-氨基-2-甲烯基-3-（2-噻吩）丙酸酰胺或3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺合成：将化合物N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（2-噻吩）丙酸酰胺或N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺溶于乙酸乙酯和盐酸的混合溶液中，室温反应2~2.5小时后，调节pH=9~10，用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，得白色固体，即为3-氨基-2-甲烯基-3-（2-噻吩）丙酸酰胺或3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺；
（3）N-叔丁氧羰基-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3（2-噻吩）丙酸酰胺或N-叔丁氧羰基-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺的合成：将N-叔丁氧羰基-色氨酸溶于无水二氯甲烷，于0~5℃下依次加入N,N-二异丙基乙基胺，1-羟基苯并三唑，1-乙基-3-（3-二甲胺丙基）碳二亚胺，搅拌充分溶解后加入3-氨基-2-甲烯基-3-（2-噻吩）丙酸酰胺或3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺的二氯甲烷溶液，室温反应10~12小时，反应结束后洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，得白色固体产物即为N-叔丁氧羰基-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3（2-噻吩）丙酸酰胺或N-叔丁氧羰基-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺；
（4）N-叔丁氧羰基-酪氨酸-脯氨酸的合成：将N-叔丁氧羰基-酪氨酸溶于无水二氯甲烷，0~5℃搅拌下依次加入N,N-二异丙基乙基胺，1-羟基苯并三唑，1-乙基-3-（3-二甲胺丙基）碳二亚胺，搅拌充分溶解后加入脯氨酸的饱和碳酸氢钠溶液，室温反应10~12小时，反应结束后洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，得油状液体产物N-叔丁氧羰基-酪氨酸-脯氨酸；
（5）色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3（2-噻吩）丙酸酰胺或色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺的合成：将N-叔丁氧羰基-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3（2-噻吩）丙酸酰胺或N-叔丁氧羰基-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺溶于乙酸乙酯和盐酸的混合溶液中，室温反应2~2.5小时后，调节pH=9~10，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，得白色固体色，即为氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3（2-噻吩）丙酸酰胺或色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺；
（6）N-叔丁氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3（2-噻吩）丙酸酰胺或N-叔丁氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺的合成：将N-叔丁氧羰基-酪氨酸-脯氨酸溶于无水二氯甲烷，于0~5℃下依次加入N,N-二异丙基乙基胺，1-羟基苯并三唑，1-乙基-3-（3-二甲胺丙基）碳二亚胺，搅拌充分溶解后加入色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3（2-噻吩）丙酸酰胺或色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺的二氯甲烷溶液，室温反应12~16小时，反应结束后洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，得白色固体产物即为N-叔丁氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3（2-噻吩）丙酸酰胺或N-叔丁氧羰基-2,6-二甲基酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺；
（7）酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3（2-噻吩）丙酸酰胺或酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺的合成：将N-叔丁氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3（2-噻吩）丙酸酰胺或N-叔丁氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺溶于乙酸乙酯和盐酸的混合溶液中，室温反应2~2.5小时后，调节pH=9~10，用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，得白色固体即为非天然氨基酸修饰的内吗啡肽-1类似物。
3.如权利要求2所述非天然氨基酸修饰的内吗啡肽-1类似物的合成方法，其特征在于：步骤（1）中，N,N-二异丙基乙基胺的加入量为N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（2-噻吩）丙酸或N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸摩尔量的4~5倍；1-羟基苯并三唑的加入量为N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（2-噻吩）丙酸或N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸摩尔量的1.45~1.5倍；1-乙基-3-（3-二甲胺丙基）碳二亚胺的加入量为N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（2-噻吩）丙酸或N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸摩尔量的1.5~1.6倍；氨水的加入量为N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（2-噻吩）丙酸或N-叔丁氧羰基-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸摩尔量的1.2~1.5倍。
4.如权利要求2所述非天然氨基酸修饰的内吗啡肽-1类似物的合成方法，其特征在于：步骤（3）中，N,N-二异丙基乙基胺的加入量为N-叔丁氧羰基-色氨酸摩尔量的4~5倍量；1-羟基苯并三唑的加入量为N-叔丁氧羰基-色氨酸摩尔量的1.45~1.5倍；1-乙基-3-（3-二甲胺丙基）碳二亚胺的加入量为N-叔丁氧羰基-色氨酸摩尔量的1.5~1.6倍；3-氨基-2-甲烯基-3-（2-噻吩）丙酸酰胺或3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺的加入量为N-叔丁氧羰基-色氨酸的摩尔量的1.2-1.5倍。
5.如权利要求2所述非天然氨基酸修饰的内吗啡肽-1类似物的合成方法，其特征在于：步骤（4）中，N,N-二异丙基乙基胺的加入量为N-叔丁氧羰基-酪氨酸摩尔量的4~5倍；1-羟基苯并三唑的加入量为N-叔丁氧羰基-酪氨酸摩尔量的1.45~1.5倍；1-乙基-3-（3-二甲胺丙基）碳二亚胺的加入量为N-叔丁氧羰基-酪氨酸摩尔量的1.5~1.6倍；脯氨酸的摩尔量为N-叔丁氧羰基-酪氨酸的1.2~1.5倍。
6.如权利要求2所述非天然氨基酸修饰的内吗啡肽-1类似物的合成方法，其特征在于：步骤（6）中，N,N-二异丙基乙基胺的加入量为N-叔丁氧羰基-酪氨酸-脯氨酸摩尔量的4~5倍；1-羟基苯并三唑的加入量为N-叔丁氧羰基-酪氨酸-脯氨酸摩尔量的1.45~1.5倍；1-乙基-3-（3-二甲胺丙基）碳二亚胺的加入量为N-叔丁氧羰基-酪氨酸-脯氨酸摩尔量的1.5~1.6倍；色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3（2-噻吩）丙酸酰胺或色氨酸-3-氨基-2-甲烯基-3-（3-噻吩）丙酸酰胺的加入量为N-叔丁氧羰基-酪氨酸-脯氨酸摩尔量的1.2~1.5倍。
7.如权利要求2所述非天然氨基酸修饰的内吗啡肽-1类似物的合成方法，其特征在于：步骤（2）、（5）、（7）中，所述乙酸乙酯和盐酸的混合溶液中，乙酸乙酯和盐酸的体积比为4:1~4.5:1。
8.如权利要求1所述非天然氨基酸修饰的内吗啡肽-1类似物作为活性成分在制备镇痛药物中的应用。
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