CN102234315B - 一种修饰内吗啡肽-1化合物及其在镇痛方面的应用 - Google Patents

Abstract

Description

一种修饰内吗啡肽-1化合物及其在镇痛方面的应用

技术领域

本发明涉及一类新的内吗啡肽-1(Endomorphin-1，EM-1)类似物及其制备方法和在治疗疼痛方面的应用。

背景技术

疼痛是一种与实际上或潜在的组织损伤相关联的，或基于这种损伤的，可叙述的不愉快的感觉和情绪经验。然而，疼痛特别是长期疼痛给患者带来痛苦和不安，剧痛还可以引起失眠或其他生物功能紊乱，影响患者的生活质量。阿片类镇痛药是最古老的镇痛药，也是迄今为止最有效的镇痛药物，因其止痛作用强，在缓解重度疼痛具有无可取代的地位。但是，由于其诸如呼吸抑制、心搏过缓、耐受、成瘾等方面的副作用，对病人产生了很大的危害，很大程度上限制了其在镇痛方面的应用。从而，另辟蹊径，发现新型的低副作用的阿片类镇痛药物是目前科学研究的热点。

阿片类镇痛药物主要是通过μ阿片受体发挥镇痛作用，所以自从μ阿片受体的内源性配体内吗啡肽(见Zadina，J.E.；Hackler，L.；Ge，L.J.；Kastin，A.J.A potent and selective endogenous agonist for the μ-opiatereceptor.Nature.1997，386：499-502)被发现后，科学家们对其进行了广泛而深入的研究。研究表明：内吗啡肽通过与G蛋白偶联的μ阿片受体结合，可参与对痛觉、心血管、呼吸、胃肠、运动、行为、内分泌及免疫等诸多功能的调节，但其主要药用作用为镇痛功能。同时发现，在中枢给药情况下，内吗啡肽可产生强度与吗啡相当而副作用较少的镇痛作用。其中内吗啡肽-1(Tyr-Pro-Trp-Phe-NH₂)具有优于内吗啡肽-2(Tyr-Pro-Phe-Phe-NH₂)的治疗学特性，如奖赏行为与镇痛作用的分离，耐受的形成较内吗啡肽-2发展更慢一些，镇痛剂量明显低于引起呼吸抑制及心血管作用的剂量等，因此推测内吗啡肽-1比内吗啡肽-2更适于作为新的安全阿片类镇痛药物先导化合物。

内吗啡肽-1具有酶解稳定性差，血脑屏障通透能力弱的缺点，从而限制其在临床上的应用。因此，通过对内吗啡肽-1进行结构改造，在尽量不降低或提高其亲和活力的前提下，提高酶解稳定性和血脑屏障通透能力；从而得到外周给药产生高效镇痛活性的内吗啡肽-1类似物成为近年研究的方向。

发明内容

本发明以内吗啡肽-1为母体对其进行改造，旨在设计和合成一种修饰内吗啡肽-1化合物，具有亲和能力高、酶解稳定性好，血脑屏障通透能力强的低副作用的类似物，通过动物实验预示该类似物可成为外周给药具有强效镇痛活性低副作用的药物。

一种修饰内吗啡肽-1化合物，其结构式为：

其结构特征为：内吗啡肽-1类似物[GAGPC]-EM-1，[GAGFC]-EM-1，[GAGDC]-EM-1的1位Tyr进行N端胍基化，类似物[HAGPC]-EM-1的1位Tyr未改变；2位Pro被D-Ala-Gly替换；3位Trp保持不变；4位Phe分别为苯环对位氯化、氟化修饰或未修饰。

本发明的化合物的制备方法采用HOSu(N-羟基琥珀酰亚胺)/DCC(环己基羰二亚胺)活化酯法接肽，“2+3”法合成EM-1的新类似物。合成路线如下(见附图1)：采用苄氧羰酰氯(Cbz-Cl)于无水条件下分别保护脒基吡唑盐酸盐(GUPy·HCl)的氨基和亚氨基，合成化合物双苄氧羰酰脒基吡唑(Cbz₂GUPy)；Cbz₂GuPy与1.2倍过量的化合物g的脱Z产物在碱性条件(三乙胺调pH)、N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中反应生成化合物h；同时，化合物i经DCC/HOSu活化，与氨水缩合将其酰胺化得化合物j；化合物k经DCC/HOSu活化，与化合物j的脱Boc产物反应得化合物l；化合物m经DCC/HOSu活化，与化合物l的脱Boc产物反应得化合物n；化合物h经DCC/HOSu活化，与化合物n的脱Boc产物反应得化合物o；钯碳/氢气脱化合物o的N端保护基得终产物p。硅胶簿层层析分纯终产物，冷冻干燥机冻干，得到冻干粉。纯化后的最终产物经RP-HPLC，TLC，ESI-MS确定其结构及纯度，类似物纯度为95％-99％。

本发明的另一目的是提供修饰内吗啡肽-1类似物在镇痛方面的应用。

本发明的优点和产生的有益效果：

内吗啡肽-1具有极高的μ阿片受体亲和力是其发展为阿片镇痛药物的基础；而极低的酶解稳定性和不能通过血脑屏障则是限制其成为镇痛药物的主要原因。在体内，降解内吗啡肽的主要酶是DPP IV，此酶的识别位点为Pro²，所以提高内吗啡肽的酶解稳定性最有效的改造就是替换或改造二位的Pro。同时，二位的Pro对内吗啡肽保持其活性构象起着非常重要的作用。我们采用D-Ala-Gly替换Pro提高酶解稳定性，同时保持或提高其μ阿片受体亲和力。由于提高药物的整体脂溶性可以提高药物的血脑屏障的通透能力，所以我们应用C末端的氯化或氟化修饰来提高类似物的整体脂溶性，从而提高血脑屏障的通透能力。除此，我们对类似物采用了N端胍基化修饰，脑毛细血管内壁带有负电荷，因此使肽类物质带上正电荷可提高其BBB通透性，胍基化修饰可提高多肽的膜渗透性和酶解稳定性等药理活性。

本发明采用HOSu/DCC活化酯法具有成本低，不易消旋，产率高，易纯化等特点，“2+3”法大大简化了合成线路，减少了工作时间。

附图说明

图1是本发明的合成路线图

图1说明：(I)三乙胺/二氯甲烷/N，N’-二甲基甲酰胺；(II)氢化钠/四氢呋喃；(III，V，VII，IX，XI)N，N’-二环己基碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺/四氢呋喃/碳酸氢钠/水；(IV)10％钯碳/氢气/无水甲醇/三乙胺/N，N’-二甲基甲酰胺；(VI，VIII，X)2.5mM盐酸/乙酸乙酯；(XII)10％钯碳/氢气/无水甲醇。

图2是侧脑室注射EM-1及其类似物镇痛效应-时间曲线

图3是皮下注射EM-1及其类似物镇痛效应-时间曲线

图4是纳洛酮和纳洛肼对皮下注射类似物[GAGPC]-EM-1镇痛活性的拮抗作用

图5是皮下注射[GAGPC]-EM-1与吗啡1-7天的耐药性柱图

具体实施方式

以下结合附图1对该发明的制备方案进一步阐述：

实施例1：类似物[GAGPC]-EM-1的合成

反应I：CbzGUPy(c)的合成

0.73g(5mmol)化合物a加入到等体积二氯甲烷(DCM)和二甲基甲酰氨(DMF)的混合液中，加入三乙胺(10mmol)，冰浴下缓慢滴加Cbz-Cl(6mmol)，冰浴反应30min，室温反应1.5h。反应完全后，减压浓缩DCM，加大量乙酸乙酯溶解残留物，依次用5％的柠檬酸水溶液和饱和NaCl水溶液萃取三次，无水硫酸钠干燥，浓缩。粗产物用乙酸乙酯/石油醚(1∶4，v/v)结晶得到白色晶体CbzGUPy1.127g。产率为92％。ESI-MS m/z＝245[M+H]⁺。

反应II：Cbz₂GUPy(d)的合成

0.61g(0.25mmol)化合物c和0.24g(1mmol)NaH溶解于THF中，氩气保护，冰浴搅拌下，反应30min后，缓慢滴加Cbz-Cl(0.5mmol)，冰浴下反应30min，室温反应6h。反应完全后，冰浴下冰水萃灭反应，减压浓缩THF，乙酸乙酯萃取水相三次，合并乙酸乙酯层，饱和NaCl洗涤三次，无水硫酸钠干燥，浓缩。粗产物用乙酸乙酯/乙醚/正己烷结晶，得白色晶体Cbz₂GUPy 0.616g。产率为65％。ESI-MS m/z＝379[M+H]⁺。

反应III：Cbz-Tyr-D-Ala-OH(g)的合成

1.575g(5mmol)化合物e、0.633g(5.5mmol)HOSu溶于无水四氢呋喃(THF)中，冰浴搅拌10分钟后加入1.133g(5.5mmol)的DCC。冰浴下反应30分钟后撤掉冰浴，室温反应4～6小时，布氏漏斗过滤，除去反应生成的DCU(环二己基脲)得到化合物e的活化酯THF溶液。0.534g(6mmol)化合物f溶于饱和碳酸氢钠水溶液，调节PH值至9～10，冰浴搅拌10分钟后，加入化合物e的活化酯THF溶液。冰浴下反应30分钟后撤掉冰浴，室温反应过夜。抽干THF，溶于乙酸乙酯，依次用5％的柠檬酸，饱和氯化钠萃取三次，并用无水硫酸钠(Na₂SO₄)干燥。过滤，减压蒸发掉溶剂，硅胶柱层析分纯(乙酸乙酯∶石油醚＝2∶1，v/v)，油泵减压得无色油状产物g 1.255g，产率为65％。ESI-Ms m/z＝387[M+H]⁺。

反应IV：Cbz₂-Amidino-Tyr-D-Ala-OH(h)的合成

1.39g(3.6mmol)化合物g和0.28g的10％Pd/C在40ml无水甲醇中反应，通入氢气室温反应2小时后，抽虑除去Pd/C，浓缩后得到油状物；将油状物和1.134g(3mmol)化合物d溶解于3ml的DMF中，加入三乙胺(5mmol)，室温反应72小时。反应完全后，加大量乙酸乙酯，依次用5％柠檬酸和饱和NaCl水溶液萃取三次，无水硫酸钠干燥，浓缩。硅胶柱层析纯化(石油醚∶乙酸乙酯∶冰乙酸＝50∶85∶2，v/v)，得无色油状化合物h1.315g。产率为78％。ESI-MS m/z＝562[M+H]⁺。

反应V：Boc-p-Cl-Phe-NH₂(j)的合成

0.9g(3mmol)化合物i和0.39g(3.3mmol)HOSu溶于无水THF中，冰浴搅拌10min后，加入0.68g(3.3mmol)DCC，冰浴下反应30min后撤冰浴，室温反应6h。真空抽滤除DCU沉淀，得化合物g的活化酯溶液。冰浴搅拌下，缓慢滴加过量氨水(NH₃·H₂O)至滤液中，室温反应过夜。减压浓缩除去THF，95％乙醇/水(1∶10，v/v)结晶，得白色固体j0.88g。产率为98％。ESI-MS m/z＝300[M+H]⁺。

反应VI，VII：Boc-Trp-p-Cl-Phe-NH₂(l)的合成

0.68g(2mmol)化合物k和0.253g(2.2mmol)HOSu溶于无水THF中，冰浴搅拌10min后，加入0.453g(2.2mmol)DCC，冰浴下反应30min后撤冰浴，室温反应4-6h。真空抽滤除DCU沉淀，得化合物k的活化酯溶液。0.66g(2.2mmol)化合物j溶解于2ml乙酸乙酯溶液中，冰浴搅拌下，滴加入0.5ml浓盐酸，反应30min，室温再反应1.5h，减压浓缩乙酸乙酯，2N氢氧化钠调节残留物pH至8～9。冰浴搅拌下，滴加入化合物k的活化酯滤液于上述反应液，室温反应过夜。减压浓缩除THF，加大量乙酸乙酯溶解残留物，依次用5％柠檬酸、饱和碳酸氢钠和饱和NaCl萃取三次，无水硫酸钠干燥，浓缩。乙酸乙酯热结晶纯化，得白色粉末化合物l0.88g。产率为91％。ESI-MS m/z＝486[M+H]⁺。

反应VIII，IX：Boc-Gly-Trp-p-Cl-Phe-NH₂(n)的合成

0.35g(2mmol)化合物m和0.253g(2.2mmol)HOSu溶于无水THF中，冰浴搅拌10min后，加入0.453g(2.2mmol)DCC，冰浴下反应30min后撤冰浴，室温反应4-6h。真空抽滤除DCU沉淀，得化合物m的活化酯溶液。0.97g(2mmol)化合物l溶解于2ml乙酸乙酯溶液中，冰浴搅拌下，滴加入0.5ml浓盐酸，反应30min，室温再反应1.5h，减压浓缩乙酸乙酯，2N氢氧化钠调节残留物pH至8～9。冰浴搅拌下，滴加入化合物m的活化酯滤液于上述反应液，室温反应过夜。减压浓缩除THF，加大量乙酸乙酯溶解残留物，依次用5％柠檬酸、饱和碳酸氢钠和饱和NaCl萃取三次，无水硫酸钠干燥，浓缩。乙酸乙酯热结晶纯化，得白色粉末化合物n0.99g。产率为92％。ESI-MS m/z＝543[M+H]⁺。

反应X，XI：Cbz₂-Amidino-Tyr-D-Ala-Gly-Trp-p-Cl-Phe-NH₂(o)的合成

0.562g(1mmol)化合物h和0.126g(1.1mmol)HOSu溶于无水THF中，冰浴搅拌10min后，加入0.227g(1.1mmol)DCC，冰浴下反应30min后撤冰浴，室温反应4-6h。真空抽滤除DCU沉淀，得化合物h的活化酯溶液。化合物n0.597g(1.1mmol)溶解于2ml乙酸乙酯溶液中，冰浴搅拌下，滴加入0.5ml浓盐酸，反应30min，室温再反应1.5h，减压浓缩乙酸乙酯，2N氢氧化钠调节残留物pH至8～9。冰浴搅拌下，滴加入化合物h的活化酯滤液于上述反应液，室温反应过夜。减压浓缩除THF，加大量乙酸乙酯溶解残留物，依次用5％柠檬酸、饱和碳酸氢钠和饱和NaCl萃取三次，无水硫酸钠干燥，浓缩。硅胶柱层析分纯(乙酸乙酯∶石油醚∶甲醇＝2∶1∶0.2，v/v)，得白色粉末化合物o0.773g。产率为70％。ESI-MS m/z＝987[M+H]⁺。

反应XII：N^α-Amidino-Tyr-D-Ala-Gly-Trp-p-Cl-Phe-NH₂(p)的合成

0.10g化合物o溶于20ml无水甲醇溶液中，小心加入0.02g10％Pd/C，室温搅拌下，持续通氢气1h，真空抽滤除钯碳，减压浓缩滤液，簿层层析纯化粗产物(乙酸乙酯∶甲醇∶氨水＝45∶20∶8，v/v)，得白色固体化合物p 0.034g。产率为47％。ESI-MS m/z＝718[M+H]⁺。

实施例2：类似物[HAGPC]-EM-1的合成

反应III：Cbz-Tyr-D-Ala-OH(g)的合成：见实施例1。

反应V：Boc-p-Cl-Phe-NH₂(j)的合成：见实施例1。

反应VI，VII：Boc-Trp-p-Cl-Phe-NH₂(l)的合成：见实施例1。

反应VIII，IX：Boc-Gly-Trp-p-Cl-Phe-NH₂(n)的合成：见实施例1。

反应X，XI：Cbz-Tyr-D-Ala-Gly-Trp-p-Cl-Phe-NH₂的合成

0.386g(1mmol)化合物g和0.126g(1.1mmol)HOSu溶于无水THF中，冰浴搅拌10min后，加入0.227g(1.1mmol)DCC，冰浴下反应30min后撤冰浴，室温反应4-6h。真空抽滤除DCU沉淀，得化合物g的活化酯溶液。化合物n 0.597g(1.1mmol)溶解于2ml乙酸乙酯溶液中，冰浴搅拌下，滴加入0.5ml浓盐酸，反应30min，室温再反应1.5h，减压浓缩乙酸乙酯，2N氢氧化钠调节残留物pH至8～9。冰浴搅拌下，滴加入化合物g的活化酯滤液于上述反应液，室温反应过夜。减压浓缩除THF，加大量乙酸乙酯溶解残留物，依次用5％柠檬酸、饱和碳酸氢钠和饱和NaCl萃取三次，无水硫酸钠干燥，浓缩。硅胶柱层析分纯(乙酸乙酯∶石油醚∶甲醇＝2∶1∶0.2，v/v)，得白色粉末化合物0.561g。产率为70％。ESI-MS m/z＝801[M+H]⁺

反应XII：N^α-Amidino-Tyr-D-Ala-Gly-Trp-p-Cl-Phe-NH₂的合成

0.10g化合物Cbz-Tyr-D-Ala-Gly-Trp-p-Cl-Phe-NH₂溶于20ml无水甲醇溶液中，小心加入0.02g10％Pd/C，室温搅拌下，持续通氢气1h，真空抽滤除钯碳，减压浓缩滤液，簿层层析纯化粗产物(乙酸乙酯∶甲醇∶氨水＝45∶20∶8，v/v)，得白色固体化合物0.034g。产率为53％。ESI-MS m/z＝676[M+H]⁺。

内吗啡肽-1的其它类似物[GAGDC]-EM-1和[GAGFC]-EM-1的全合成方案与实施例1类似，并得到相似的实验结果。四个类似物都为白色固体粉末，表1列出四个类似物的理化特征。

表1.EM-1类似物的理化特征

a.HPLC测定的保留时间：分析柱：Waters Delta-Pak C18 column(3.9mm×150mm)；流动相流速0.6ml/min，流动相＝水/0.1％TFA(A)+乙腈/0.1％TFA(B)。

流动相A∶B＝80；20→20∶80；洗脱梯度：0-25min；A∶B＝20∶80→80；20，

洗脱梯度：25-28min。

b.高效硅胶板上的Rf值；展开体系为：乙酸乙酯/甲醇/氨水＝20∶10∶1

本发明的类似物在镇痛方面的应用以生物活性鉴定实验说明。生物活性鉴定实验包括放射配体受体结合实验，离体生物活性功能鉴定实验，离体代谢稳定性实验，温浴甩尾镇痛实验和药物耐受实验。实验过程中类似物都被溶解于生理盐水中，加入适量的二甲基亚砜助溶。

本发明的化合物的药理学活性鉴定实验详述如下：

实施例3

1.放射配体受体结合试验

1.1大鼠脑膜蛋白的制备

成年Wistar大鼠(250-300g)断头取出大脑，用冰冷的50mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)冲洗大脑三次，除去溢血后，用滤纸擦干，称重。加20倍体积的(v/w)Tris-HCl缓冲液，冰浴下，匀浆器匀浆。匀浆液在4℃下1000g离心10min后，上清液在4℃下20000g离心25min，除去上清液，加入原体积的Tris-HCl缓冲液，吹打使重新悬浮，再次在冰浴下匀浆。匀浆液先在37℃水浴孵育30min后，在4℃下20000g离心25min后，除去上清液，再加入原体积的Tris-HCl缓冲液混匀。使用考马斯亮蓝G-250法测定提取的脑膜蛋白含量。将匀浆液分批放在细胞冻存管里，-80℃下保存待用。

1.2受体结合试验

取-80℃保存脑膜蛋白，37℃水浴1min快速解冻。实验分为总结合管，竞争结合管和非特异性结合管。每个反应管中依次加入放射配体，纳洛酮(Naloxone，Nx)/非放射性药物，Tris-HCl(含PMSF和Captoril)和膜蛋白(300-500μg/ml)。其中，在总结合管中，只加入[³H]DAMGO(0.5nM)和固定的膜蛋白(300-500μg/ml)，在非特异性结合管和竞争结合管中，分别另加入10μM Nx和不同浓度的类似物，最后补充Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)至总体积0.5ml。振荡器混匀反应液。37℃摇床反应时间为1h，取出离心管，反应液经ZT-II型细胞收集器收集，GF/C型玻璃纤维素膜过滤。80℃油浴下烘烤玻璃纤维素膜30min后，取出滤膜，放入24孔板中，每孔加入0.7ml闪烁液，封盖膜封盖。隔夜用β液体闪烁计数仪记录放射性强度(CPM)。计算类似物对特异性结合的抑制率，以浓度的负对数为横坐标，抑制率为纵坐标，线性回归求得IC₅₀值，根据公式K_i＝IC₅₀/(1+[L]/K_D)计算K_i值。每个实验数据为分别平行做3组实验求平均值。

1.3实验结果

表2表示EM-1及其类似物的μ阿片受体解离常数K_i值，实验数据如下：

表2.EM-1及其类似物的μ阿片受体解离常数K_i值

化合物                  K_i(μ)(nM)

EM-1                    4.55±0.16

[GAGDC]-EM-1            1.81±0.29

[GAGPC]-EM-1            3.2±0.31

[GAGFC]-EM-1            1.40±0.21

[HAGPC]-EM-1            7.7±0.40

结果表明，类似物[GAGDC]-EM-1，[GAGPC]-EM-1，[GAGFC]-EM-1的μ阿片受体亲和解离常数为母体EM-1的40％，70％和31％，可见其亲和活性都比母体EM-1有所提高。类似物[HAGPC]-EM-1比母体的EM-1的亲和活性低。可见N端胍基化和二位D-Ala-Gly替换使类似物的结构更易于与μ阿片受体结合。

2.离体生物活性功能鉴定

2.1 GPI试验

豚鼠250-300g，雌雄不限，实验前禁食12h，饮水不限。棒击枕部处死，剖腹取出近盲肠端的回肠6cm两段，浸入持续通入95％O₂和5％CO₂混合气的Krebs液(g/L：NaCl 6.9，CaCl₂ 0.28，KCl 0.35，KH₂PO₄ 0.16，MgSO₄·7H₂O 0.30，NaHCO₃ 2.1，苯海拉明50×10^-6，氯化胆碱2.8×10^-3，葡萄糖1.98)中，湿润后套在一根玻璃棒上，沿回肠壁的一根纵形血管将纵行肌与环形肌分离，然后用零号丝线将纵行肌的一端缚在玻璃电极的小钩上，另一端缚在JZ-1型肌肉张力传感器上，制备好后立即放入盛有持续通入气体(95％O₂和5％CO₂)的Krebs液、恒温37±0.2℃的玻璃浴管中，预负荷500mg。前30min每5min换一次营养液，以后每15min换液一次，平衡2h后开始实验。给予电刺激，刺激参数：波宽0.3-0.5ms，频率6次·min^-1，负载电压50V。记录基础收缩强度，再给予适量吗啡鉴定其活性；然后分别给予不同剂量的待试药物，记录收缩强度，计算抑制百分率。每次药物作用后，用营养液冲洗5次，平衡15min。每个实验数据为分别平行做6-8组实验求平均值。

2.2实验结果

表3 EM-1及其类似物GPI实验的IC₅₀值，实验数据如下：

表3.EM-1及其类似物GPI实验的IC₅₀值

化合物                  GPI IC₅₀(nM)

EM-1                    12.4±0.6

[GAGDC]-EM-1            4.18±0.7

[GAGPC]-EM-1            19.8±4.8

[GAGFC]-EM-1            10.7±2.3

[HAGPC]-EM-1            65.3±4.7

与放射配体结合实验结果相差不多，类似物[GAGDC]-EM-1，[GAGFC]-EM-1的IC₅₀值为母体EM-1的34％，86％，可见类似物[GAGDC]-EM-1，[GAGFC]-EM-1的离体激活活性高于母体；而类似物[GAGPC]-EM-1的比母体略低。

3.离体酶解稳定性实验

3.1.血浆/脑质膜标本制备

3.1.1 100％血浆标本制备

向离心管加入2mg/ml的浓度的肝素钠溶液，烘干待用；30-35g成年雄性小白鼠，用乙醚麻醉，取眼球取血到处理的离心管中，轻微振荡，4℃2000g离心20min。收集上清液，-80℃冻存待用。

3.1.2 15％小鼠脑质膜标本制备

取30-35g成年雄性小鼠，颈椎脱臼处死，取大脑(去除小脑及脑桥)，滤纸吸干，称重。用冰冷的1mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)冲洗几次，除去溢血。加入50倍体积(v/w)的冰冷1mM Tris-HCl(pH＝7.4)缓冲液，0℃下，用匀浆器使之成胞浆匀浆。匀浆液置于冰浴中放置30分钟以促进细胞溶解。然后按每1ml匀浆液补加0.5ml 50mM冰冷的Tris-HCl，再次匀浆，吹打悬浮。49000g离心45min，弃上清，沉淀重新悬浮于50倍体积的冰冷50mM Tris-HCl中，吹打悬浮。49000g再次离心45min，弃上清，沉淀悬浮于适当体积的50mM Tris-HCl中，使脑膜蛋白浓度约为2mg/ml。振荡器震荡涡旋混匀，分装，-80℃冻存。

3.2血浆/脑质膜孵育试验

取10μl多肽母液(10^-2M)，加入到190μl血浆或脑质膜中，立即振荡混匀，然后迅速取出20μl混合液，加入离心管中计时为0min，余者于37℃下继续孵育，并分别在5min，10min，15min，30min，60min，120min，240min，300min，360min，420min取出20μl。酶解过程的终止：于取出的样品中加入90μl乙腈振荡混匀，样品置于冰上放置5分钟，再用90μl0.5％的冰冷乙酸稀释以确保酶解过程停止。13000g离心15min，收集上清，-80℃冻存，直至RP-HPLC分析。

3.3反相-高效液相色谱(reversed-phase high performance liquidchromatography，RP-HPLC)分析

运用RP-HPLC分析各个时间点的离体稳定性样品。RP-HPLC系统由Waters Delta 600控制器，紫外监测器和Waters Delta Pak C18柱(3.9mm×150mm)组成。检测波长280nm，流动相流速0.6ml/min，流动相＝水/0.1％TFA(A)+乙腈/0.1％TFA(B)。流动相A∶B＝75∶25→25∶75；洗脱梯度：0-30min，A∶B＝25∶75→75∶25；30-55min。分别测定每个时间点样品药物浓度，并根据药物代谢公式以各个时间点的药物浓度和时间绘制药物变化曲线计算求得药物得半衰期。每个实验数据为分别平行做3组实验求平均值。

3.4实验结果

表4.EM-1及其类似物的生物半衰期。实验数据如下：

表4.EM-1及其类似物的生物半衰期

所有类似物在小鼠脑质膜和血浆半衰期都显著高于母体EM-1。其中，类似物[GAGDC]-EM-1，[GAGPC]-EM-1在两种介质中都显示出极高的酶解稳定性；其中[GAGDC]-EM-1，[GAGPC]-EM-1的稳定性最高，在脑匀浆中约是母体的30倍，在血浆中约是母体的45倍，而类似物[HAGPC]-EM-1的酶解稳定性在脑匀浆中约是母体的18倍，在血浆中约是母体的31倍。可见，二位D-Ala-Gly替换和N端胍基化都显著增强了类似物的抗酶解能力。

4.镇痛实验

4.1实验方法

采用小鼠温浴甩尾法。昆明系雄性小鼠，18-20g，环境温度：20℃，水浴温度：50±0.5℃。给药前先测定小鼠的基础痛阈(control latency，CL)，将小鼠鼠尾的1/3浸入水浴，记录鼠尾从刚浸入水浴至发生收缩的时间。过于敏感(＜3s)或迟钝的(＞5s)小鼠弃去不用，截止时间10s，以防止小鼠烫伤。侧脑室(i.c.v.)分别注射类似物[GAGDC]-EM-1，[GAGPC]-EM-1，[GAGFC]-EM-1，EM-1和吗啡，注射体积4μl，类似物[GAGDC]-EM-1，[GAGPC]-EM-1，[GAGFC]-EM-1，EM-1和吗啡分别用于8-10只小鼠测定数据。给药后第5，10，15，20，25，30，45，60min各测一次甩尾潜伏期(test latency，TL)；药物浓度为20nmol/kg。结果以最大可能效应百分比(maximum possible effect，％MPE)。皮下(s.c.)分别注射类似物[GAGDC]-EM-1，[GAGPC]-EM-1，[GAGFC]-EM-1，EM-1和吗啡，注射剂量为10mg/kg，注射体积100μl，类似物[GAGDC]-EM-1，[GAGPC]-EM-1，[GAGFC]-EM-1，EM-1和吗啡分别用于8-10只小鼠测定数据。给药后测定5，10，15，20，30min的甩尾潜伏期。结果以最大镇痛效应百分率(maximum possible effect，％MPE)表示：％MPE＝100×(TL-CL)/(10-CL)，分别注射等体积的生理盐水都无活性数据未显示。

4.2实验结果

图2显示侧脑室注射20nmol/kg的类似物及母体EM-1和吗啡产生的镇痛时效曲线图。类似物[GAGDC]-EM-1，[GAGPC]-EM-1，[GAGFC]-EM-1均产生强效的镇痛作用，镇痛效力和镇痛持续时间都明显高于母体EM-1和吗啡。

表5.EM-1及其类似物分别在侧脑室注射和皮下注射后最大的镇痛活性。实验数据如下：

表5.EM-1及其类似物分别在侧脑室注射和皮下注射后最大的镇痛活性

表5显示侧脑室注射类似物[GAGDC]-EM-1，[GAGFC]-EM-1最大镇痛活力分别达到89.3％和72.8％，母体EM-151.1％，吗啡44.3％，可见类似物[GAGDC]-EM-1，[GAGFC]-EM-1最大镇痛活力明显高于母体EM-1和吗啡。同时，表4也显示皮下注射类似物[GAGPC]-EM-1最大镇痛效应达到53％，略低于吗啡的最大镇痛效应为65.5％。

图3显示皮下注射10mg/Kg的类似物和母体EM-1及吗啡产生的镇痛时效曲线图。其中母体EM-1基本无镇痛活性，类似物[GAGDC]-EM-1，[GAGPC]-EM-1，[GAGFC]-EM-1都表现出了显著的镇痛活性，但都比吗啡镇痛活性低。

图4表示皮下注射类似物[GAGPC]-EM-1产生的镇痛效应在纳洛酮和纳洛肼的拮抗情况，其中1表示皮下注射10mg/Kg[GAGPC]-EM-1产生的最大镇痛效应；2表示提前5分钟注射2mg/Kg纳洛酮后再皮下注射10mg/Kg[GAGPC]-EM-1产生的最大镇痛效应；3表示提前24小时注射35mg的纳洛肼后再皮下注射10mg/Kg[GAGPC]-EM-1产生的最大镇痛效应。可见皮下注射2mg/Kg的纳洛酮或35mg/Kg的纳洛肼都能完全拮抗皮下注射[GAGPC]-EM-1镇痛活性，可见其是通过阿片受体起镇痛作用，而且主要是通过μ₁阿片受体起作用，这说明[GAGPC]-EM-1产生镇痛活性时，可能产生较少的副作用。

5.药物耐受实验

5.1实验方法

选取18-20g的雄性昆明系小鼠20只，类似物[GAGPC]-EM-和吗啡各10只，连续7天每天皮下注射一次20mg/Kg[GAGPC]-EM-1或4mg/Kg吗啡，分别在给药后的1，3，5，7天测定吗啡和[GAGPC]-EM-1镇痛活性，对比判断其镇痛活性降低情况。

5.2实验结果

图5为皮下注射[GAGPC]-EM-1与吗啡1-7天的耐药性柱图。从图5可以看出类似物[GAGPC]-EM-1的镇痛活性降低程度明显小于吗啡。

表6.表示1-7天皮下注射[GAGPC]-EM-1和吗啡的镇痛时效曲线下面积值，数据如下：

表6.1-7天皮下注射[GAGPC]-EM-1和吗啡的镇痛时效曲线下面积值

显示从第一天皮下注射[GAGPC]-EM-1的镇痛时效曲线下面积值1777到第7天的时效曲线下面积值1214，为第一天的68.3％；而从第一天注射吗啡的镇痛时效曲线下面积值1471到第7天的时效曲线下面积值489，为第一天的33.2％。可见皮下注射和吗啡产生相似镇痛活性的[GAGPC]-EM-1，比吗啡产生更低程度的耐药性。

实验结果表明：本发明的四个内吗啡肽-1类似物，在离体酶解稳定性上都明显高于母体EM-1；类似物[GAGDC]-EM-1，[GAGPC]-EM-1，[GAGFC]-EM-1的亲和活性也高于母体；在侧脑室给药的情况下，类似物[GAGDC]-EM-1，[GAGPC]-EM-1，[GAGFC]-EM-1的镇痛效力高于母体EM-1和吗啡；特别是在皮下给药的情况下，类似物[GAGPC]-EM-1表现出了略低于吗啡的镇痛活性但其耐药性却明显低于吗啡。

Claims (1)

1.一类内吗啡肽-1类似物[GAGPC]-EM-1、[GAGFC]-EM-1、[GAGDC]-EM-1和[HAGPC]-EM-1，结构式为： 

其结构特征为：内吗啡肽-1类似物[GAGPC]-EM-1、[GAGFC]-EM-1和[GAGDC]-EM-1是在内吗啡肽-1的基础上将1位Tyr进行N端胍基化，2位Pro被D-Ala-Gly替换,3位Trp保持不变,4位Phe分别为苯环对位氯化、氟化修饰以及未修饰；类似物[HAGPC]-EM-1是在内吗啡肽-1的基础上2位Pro被D-Ala-Gly替换,3位Trp保持不变，4位Phe的苯环对位氯化。 

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