CN101134774B - 组合化学修饰的内吗啡肽-1及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明通过液相合成法合成了内吗啡肽-1的四个新型类似物[GMLPC]-FM-1、[GMLDC]-EM-1、[GMDPC]-EM-1和[GMDDC]-EM-1，并提供了四个类似物的制备方法。本发明通过放射配体受体结合实验，离体器官生物检定，脂溶性测定，离体酶解稳定性，蛋白结合和温浴甩尾镇痛实验对四个类似物进行了一系列的药理学活性鉴定。结果显示四个类似物在小鼠脑质膜和血清中的酶解稳定性较母体显著提高，侧脑室注射后镇痛作用时间明显延长，特别是[GMDPC]-EM-1，其整体脂溶性显著提高，皮下注射时表现出明显的长时程镇痛活性，其作用通过μ阿片受体介导的中枢机制而产生。研究表明本发明中引入的化学改造设计将为发展内吗啡肽-1成为临床多肽镇痛药物提供重要依据。

Description

组合化学修饰的内吗啡肽-1及其制备方法

技术领域

本发明涉及内吗啡肽-1(Endomorphin-1，EM-1)的一类新的类似物[GMLPC]-EM-1、[GMLDC]-EM-1、[GMDPC]-EM-1和[GMDDC]-EM-1及其制备方法。

背景技术

内吗啡肽1(Tyr-Pro-Trp-Phe-NH₂，EM-1)和内吗啡肽2(Tyr-Pro-Phe-Phe-NH₂，EM-2)是两个高效选择性激动μ阿片受体的内源性阿片肽。研究发现，内吗啡肽通过与G蛋白偶联的μ阿片受体结合，可参与对痛觉、心血管、呼吸、胃肠、运动、行为、内分泌及免疫等诸多功能的调节，但其主要作用是强效的镇痛活性，可产生强度与吗啡相当而副作用较少的镇痛作用，特别是它们在神经痛动物模型中也表现出明显的镇痛活性。由于EM-1具有优于EM-2的治疗学特性，如奖赏行为与镇痛作用的分离，耐受的形成较EM-2发展更慢一些，镇痛剂量明显低于引起呼吸抑制及心血管作用的剂量等，因此推测EM-1比EM-2更适于作为新的安全镇痛药物进行开发研究。

研究表明阿片镇痛主要通过中枢机制介导。因此，口服或注射阿片镇痛剂首先必须穿透血脑屏障(BBB)，从循环血到达中枢神经系统(CNS)的细胞外液并达到有效浓度，经特异性和非特异性分布到达作用位点，与靶器官(或组织)的受体相互作用，从而产生药效。然而，EM-1也存在类似于其他内源性阿片肽的缺点，如镇痛持续时间短，缺乏口服活性，酶解稳定性差，在血液和脑中很快降解，半寿期较短，另外BBB的存在也阻碍了它们进入CNS发挥作用，从而限制了内吗啡肽作为治疗药物的使用。迄今为止尽管合成了许多内吗啡肽类似物，然而能够通过外周注射进入CNS而产生镇痛的类似物却鲜有所闻。

发明内容

本发明旨在通过引入当前阿片肽设计中的一些成功化学修饰对内吗啡肽的结构加以改造，以改进其理化结构，从而提高其代谢稳定性和BBB通透性，使之能够通过外周注射产生中枢介导的强效镇痛作用，为发展内吗啡肽作为镇痛效果强而副作用少的治疗药物提供依据。另外，通过观察特定化学修饰对各药理特性的影响对EM-1的构效关系研究还具有重要的参考意义。

BBB通透性和稳定性是发展天然活性肽成为临床药物所必须克服的两大主要问题。研究发现BBB上内吗啡肽的饱和脑-血外排系统的存在限制了其入脑。因此我们考虑通过提高内吗啡肽的不饱和运输途径增强其进入CNS的能力。由于脑毛细血管内壁带有负电荷，因此使肽类物质带上正电荷可提高其BBB通透性。研究发现，胍基化修饰可提高多肽的膜渗透性和酶解稳定性等药理活性。另外，由于肽类药物的BBB通透性与其脂溶性高低，分子大小特别是氢键键能有关，通过提高脂溶性或降低氢键键能也可增强其透过BBB的能力。因此选择C末端卤素化(提高脂溶性)和Tyr酚羟基甲醚化(通过掩盖极性功能团降低氢键键能，提高脂溶性)以期增强化合物的亲脂性，中和由N末端胍基化修饰引起的整体脂溶性的降低。同时，EM-1在体半衰期也极短，其2位L-Pro为二肽酶的天然识别位点，所以采用非天然氨基酸D-Pro替换L-Pro可显著增强代谢稳定性，延长药物作用时间。为保证类似物的活性构象为β-转角，于D-Pro后引入有转角趋势的Gly联合作为间隔子。

基于上述思路，本发明对EM-1做了适当的结构修饰，主要包括以下四点：(1)1位Tyr N^α胍基化修饰；(2)1位Tyr酚羟基甲醚化；(3)C末端Phe芳香环对位氯化修饰；(4)D-Pro替代2位L-Pro，同时，其后引入Gly联合作为间隔子，以确保类似物的β-转角构象。通过以上组合化学修饰，我们得到4种EM-1的新型类似物[GMLPC]-EM-1、[GMLDC]-EM-1、[GMDPC]-EM-1和[GMDDC]-EM-1，希望能够为寻找能有效控制疼痛并减少毒副作用的新型临床镇痛药物提供重要依据。

为此，本发明的目的旨在提供一类新的经组合化学改造的内吗啡肽-1的类似物[GMLPC]-EM-1、[GMLDC]-EM-1、[GMDPC]-EM-1和[GMDDC]-EM-1，这些类似物可克服现有内吗啡肽-1的一些不足，具备良好的药理学活性和治疗学潜力；

本发明的另一目的是提供内吗啡肽-1的类似物[GMLPC]-EM-1、[GMLDC]-EM-1、[GMDPC]-EM-1和[GMDDC]-EM-1的制备方法；

针对内吗啡肽-1的类似物的设计原理，对其进行了系统的药理学活性鉴定，包括受体结合活性(放射配体受体结合实验和离体器官生物检定)，脂溶性，离体酶解稳定性，蛋白结合活性和在体镇痛活性的测定。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：

一类内吗啡肽-1的类似物[GMLPC]-EM-1、[GMLDC]-EM-1、[GMDPC]-EM-1和[GMDDC]-EM-1，结构式为：

其结构特征为：内吗啡肽-1四个类似物的1位Tyr均进行N^α胍基化和酚羟基甲醚化修饰，3位Trp保持不变；类似物[GMLPC]-EM-1和[GMLDC]-EM-1的2位为L-Pro，类似物[GMDPC]-EM-1和[GMDDC]-EM-1的2位L-Pro用D-Pro-Gly二肽片段替换；类似物[GMLPC]-EM-1和[GMDPC]-EM-1的Phe⁴的芳香环的对位进行氯化修饰，类似物[GMLDC]-EM-1和[GMDDC]-EM-1的Phe⁴保持不变。

2.内吗啡肽-1的类似物[GMLPC]-EM-1、[GMLDC]-EM-1、[GMDPC]-EM-1和[GMDDC]-EM-1的制备方法：化合物a在冰盐浴氩气(Ar)保护下，以四氢呋喃(THF)为溶剂，用氢化钠(NaH)/碘甲烷(CH₃I)将其酚羟基甲醚化，得化合物b；N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)/N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)转化化合物b为活化脂，并与碳酸氢钠碱化(pH＝8-9)的化合物c缩合成化合物d；50％三氟乙酸(TFA)/二氯甲烷(DCM)混合溶液脱除化合物d的氨基保护基团叔丁氧羰基(Boc-)，得化合物e；先后采用苄氧羰酰氯(Cbz-Cl)和苄氧羰酰琥珀酰亚胺(Cbz-OSu)于无水条件下分别保护脒基吡唑盐酸盐(GUPy·HCl)的氨基和亚氨基，合成化合物双苄氧羰酰脒基吡唑(Cbz₂GUPy)；Cbz₂GuPy与1.2倍过量的化合物e在碱性条件(三乙胺调pH)、N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中反应生成化合物f；同时，化合物g经DCC/HOSu活化，与氨水缩合将其酰胺化得化合物h，盐酸/乙酸乙酯脱Boc保护基，得化合物j；DCC/HOSu法缩合化合物i和j，得化合物k，盐酸/乙酸乙酯脱Boc得化合物l；DCC/HOSu法缩合N-叔丁氧羰酰甘氨酸(Boc-Gly-OH)与化合物l生成化合物m，盐酸/乙酸乙酯脱Boc得化合物n；化合物f与化合物l或n分别缩合得到保护四肽或五肽片段o；钯碳/氢气脱化合物o的N端保护基得终产物p。硅胶簿层层析分纯终产物，冷冻干燥机冻干，或甲醇/乙酸乙酯结晶。纯化后的最终产物经RP-HPLC，TLC，ESI-MS确定其结构及纯度。

脒基吡唑上双苄氧羰基(Cbz-)保护反应于无水条件下分两步进行，首先将原料脒基吡唑盐酸盐用等体积的DCM/DMF溶解，冰盐浴下，同时缓慢滴加Cbz-Cl和二异丙基乙胺(DIEA)，确保反应在碱性条件下进行，室温下反应过夜，得到单苄氧羰酰脒基吡唑(CbzGUPy)经乙酸乙酯/石油醚结晶纯化。Ar保护，冰盐浴下，THF为反应溶剂，间隔30分钟依次将CbzGUPy和Cbz-OSu的THF溶液加入到NaH/THF溶液中，室温下反应48小时，经乙酸乙酯/乙醚/环己烷结晶纯化得到双苄氧羰酰脒基吡唑(Cbz₂GUPy)。

胍基化修饰发生于N端二肽片段，即Cbz₂GuPy和1.2倍过量的脱保护N端二肽化合物e分别溶解于1mlDMF中，Ar保护，冰浴搅拌下，于化合物e溶液中滴加适量三乙胺(Et₃N)。冰浴搅拌10分钟后，同时缓慢滴加预冷的Cbz₂GUPy/DMF溶液和Et₃N于化合物e中。室温反应72小时后，加大量乙酸乙酯，依次用5％柠檬酸和饱和NaCl洗涤三次，无水硫酸钠干燥，浓缩。硅胶柱层析纯化(石油醚∶乙酸乙酯∶冰乙酸＝50∶85∶2，v/v)，得胍基化修饰二肽化合物f。

3.本发明的化合物的生物活性鉴定试验

包括放射配体受体结合试验，离体生物活性功能检定，辛醇/缓冲液分配系数测定，离体代谢稳定性试验，蛋白结合率测定和温浴甩尾镇痛实验。其中，放射配体受体结合试验是通过受试药物竞争放射性同位素标记配基对受体组织的结合，从而测定该药物对特定受体的结合能力；分别选用[³H]DAMGO和[³H]DPDPE作为μ-阿片和δ-阿片受体选择性激动剂。离体器官生物活性功能检定包括豚鼠回肠纵行肌 

和小鼠输精管(mouse vas deferens，MVD)试验：GPI上含有大量的μ-阿片受体和少量κ-阿片受体，MVD主要含δ-阿片受体，也有部分μ和κ-阿片受体；GPI和MVD是研究药物和受体作用机制的经典模型。辛醇/缓冲液分配系数D是模拟生物体内药物亲脂性或疏水性的物理参数。选用小鼠脑质膜和血清作为离体酶解媒介，研究类似物[GMLPC]-EM-1、[GMLDC]-EM-1、[GMDPC]-EM-1和GMDDC]-EM-1的离体稳定性；该媒介制备方法简便，含大量游离的细胞内的或膜结合肽酶，是评估离体药物酶解稳定性的常用材料。血清蛋白结合率是决定CNS吸收的重要参数之一，影响药物在体内的分布、排泄和代谢速率以及药理作用强度等，本试验选用哺乳动物Ringer’s溶液为介质，并采用超滤法结合高效液相色谱法测定蛋白结合率。此外，选用小鼠温浴甩尾实验测定各类似物的镇痛活性；温浴甩尾实验是在室温下，以50℃的热水为致痛源，将小鼠尾部浸入热水使其产生甩尾反应，为一种脊髓反射；实验操作简单，反应恒定，重复性好，是目前国内外筛选镇痛药物常用的致痛方法。

本发明的优点和产生的有益效果是：

1.本发明设计并合成了4个经化学改造的新型内吗啡肽-1类似物GMLPC]-EM-1、[GMLDC]-EM-1、[GMDPC]-EM-1和[GMDDC]-EM-1，所有类似物在小鼠脑质膜和血清中的酶解稳定性较母体显著提高，侧脑室注射镇痛作用时间明显延长，特别是类似物[GMDPC]-EM-1，其整体脂溶性显著提高，皮下注射时表现出明显的长时程镇痛活性，且研究发现此作用通过阿片受体介导的中枢机制产生，表明本发明中引入的化学改造显著改善了EM-1的理化性质和CNS的生物利用度，将为发展内吗啡肽-1成为临床多肽镇痛药物提供重要依据。

2.采用液相法合成各类似物。DCC/HOSu活化酯法具有成本低，不易消旋，产率高，易纯化，C端不用保护等优点，并且是有水反应，合成条件不苛刻。此外，“2+2/3”片段偶连法大大简化合成线路，减少工作量，可大量合成。

3.类似物N端酪氨酸残基(Tyr¹)胍基化修饰发生于N端二肽片段，而并非单个酪氨酸残基或四肽/五肽片段。该方案简化合成步骤，提高产率。

4.本发明中采用的一系列药理学活性检测方法具系统性，逻辑性，更有利于最佳临床镇痛药物候选的鉴别和筛选。

附图说明

图1是本发明合成路线流程图

图1说明：(Ⅰ)氢化钠/碘甲烷/四氢呋喃；(Ⅱ)N，N’-二环己基碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺/四氢呋喃/碳酸氢钠/水；(Ⅲ)50％三氟乙酸/二氯甲烷；(Ⅳ)N，N’-二甲基甲酰胺/三乙胺；(Ⅴ，Ⅶ，Ⅸ，Ⅺ)N，N’-二环己基碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺/四氢呋喃/氢氧化钠/水；(Ⅵ，Ⅷ，Ⅹ)2.5mM盐酸/乙酸乙酯；(Ⅻ)(20％)钯碳/氢气/无水甲醇。

图2是侧脑室注射EM-1及其类似物[GMLPC]-EM-1和[GMDPC]-EM-1的镇痛效应-时间曲线

图3是侧脑室注射类似物[GMLDC]-EM-1和[GMDDC]-EM-1的镇痛效应-时间曲线

图4是皮下注射EM-1和类似物[GMDPC]-EM-1的镇痛效应-时间曲线

图5是纳络酮、甲碘化纳络酮对皮下注射类似物[GMDPC]-EM-1镇痛活性的拮抗作用

图6是母体EM-1的ESI-MS谱图

图7是类似物[GMLPC]-EM-1的ESI-MS谱图

图8是类似物[GMLDC]-EM-1的ESI-MS谱图

图9是类似物[GMDPC]-EM-1的ESI-MS谱图

图10是类似物[GMDDC]-EM-1的ESI-MS谱图

具体实施方式

以下结合附图对该发明的制备方案作进一步阐述：

实施例1：类似物[GMLPC]-EM-1的合成

反应Ⅰ：Boc-Tyr(Me)-OH(b)的合成

化合物a(Boc-Tyr-OH)和4倍量的NaH分别溶于无水THF中，Ar保护，冰盐浴搅拌下，缓慢滴加化合物a溶液至NaH/THF中。-15℃反应30min后，将过量的CH₃I缓慢滴加入反应体系，室温搅拌过夜。反应完全后，0℃下冰水萃灭反应，减压浓缩THF，留水相于瓶底，加乙醚/水(1∶3)的混合液，产物留于水相，饱和NaHCO₃洗涤乙醚层两次，与前水相合并，20％柠檬酸调水相pH值至3-4，乙酸乙酯萃取水相三次，合并乙酸乙酯层，依次用5％Na₂S₂O₃和饱和NaCl洗涤三次，无水硫酸钠干燥，浓缩，得无色油状产物b。产率Y％＝98％。ESI-MSm/z＝296[M+H]⁺。

反应Ⅱ：Boc-Tyr(Me)-L-Pro-OH(d)的合成

化合物b和1.1倍过量的HOSu溶于无水THF中，冰浴搅拌10min后，缓慢滴加入预冷的1.1倍过量的DCC/THF溶液，冰浴下反应30min后撤冰浴，室温反应6h。真空抽滤除DCU沉淀，得化合物b的活化酯[Boc-Tyr(Me)-OSu]溶液。冰浴搅拌下，滴加滤液至等摩尔量的化合物c(L-Pro)的NaHCO₃溶液中(pH＝8-9)，室温反应过夜。反应完全后，减压浓缩除THF，加大量乙酸乙酯溶解残留物，依次用5％柠檬酸和饱和NaCl洗涤三次，无水硫酸钠干燥，浓缩。硅胶柱层析纯化(石油醚∶乙酸乙酯∶冰乙酸＝50∶80∶1，v/v)，得无色油状产物d。产率Y％＝89％。ESI-MS m/z＝393[M+H]⁺。

反应Ⅲ：H-Tyr(Me)-L-Pro-OH(e)的合成

化合物d溶于1ml无水DCM中，冰浴搅拌下，滴加相同体积(1ml)的TFA至反应体系中，得50％TFA/DCM混合反应溶液。冰浴下继续搅拌2h后，减压浓缩除去TFA/DCM溶液，得无色油状化合物e。产率Y％＝98％。ESI-MS m/z＝293[M+H]⁺。

反应Ⅳ：Cbz2GU-Tyr(Me)-L-Pro-OH(f)的合成

①Cbz₂GUPy的合成

ACbzGUPy的合成

用等体积的DCM/DMF混合液溶解脒基吡唑盐酸盐(GUPy·HCl)，冰盐浴搅拌下，同时缓慢滴加1.2倍过量的Cbz-Cl和过量的DIEA(确保反应在碱性条件下进行)，室温下反应过夜。反应完全后，减压浓缩DCM，加大量乙酸乙酯溶解残留物，依次用水和饱和NaCl洗涤三次，无水硫酸钠干燥，浓缩。粗产物用乙酸乙酯/石油醚(1∶4，v/v)结晶得白色晶体CbzGUPy。Y％＝94％。ESI-MS m/z＝245[M+H]⁺。

B.Cbz₂GUPy的合成

CbzGUPy、4倍过量的NaH、和2倍过量的Cbz-OSu分别用THF溶解，Ar保护，冰盐浴搅拌下，缓慢滴加CbzGUPy溶液至NaH/THF中。-15℃反应30min后，再缓慢滴加Cbz-OSu/THF溶液至反应体系，室温下继续搅拌反应48h。反应完全后，0℃下冰水萃灭反应，减压浓缩THF，乙酸乙酯萃取水相三次，合并乙酸乙酯层，饱和NaCl洗涤三次，无水硫酸钠干燥，浓缩。粗产物用乙酸乙酯/乙醚/正己烷结晶，得白色晶体Cbz₂GUPy。Y％＝65％。ESI-MS m/z＝379[M+H]⁺。

②胍基化反应

Cbz₂GUPy和1.2倍过量的化合物e分别溶解于1ml DMF中，Ar保护，冰浴搅拌下，于化合物e溶液中滴加适量三乙胺(Et₃N)。冰浴搅拌10min后，同时缓慢滴加预冷的Cbz₂GUPy/DMF溶液和Et₃N于化合物e中，室温反应72h。反应完全后，加大量乙酸乙酯，依次用5％柠檬酸和饱和NaCl洗涤三次，无水硫酸钠干燥，浓缩。硅胶柱层析纯化(石油醚∶乙酸乙酯∶冰乙酸＝50∶85∶2，v/v)，得无色油状化合物f。产率Y％＝69.65％。ESI-MS m/z＝603[M+H]⁺。

反应Ⅴ：Boc-p-Cl-Phe-NH₂(h)的合成

化合物g和1.1倍过量的HOSu溶于无水THF中，冰浴搅拌10min后，缓慢滴加入预冷的1.1倍过量的DCC/THF溶液，冰浴下反应30min后撤冰浴，室温反应6h。真空抽滤除DCU沉淀，得化合物g的活化酯溶液。冰浴搅拌下，缓慢滴加过量氨水(NH₃·H₂O)至滤液中，室温反应过夜。减压浓缩除去THF，95％乙醇/水(1∶10，v/v)结晶，得白色固体h，自然晾干。Y％＝98％。ESI-MS m/z＝300[M+H]⁺。

反应Ⅵ，Ⅶ：Boc-Trp-p-Cl-Phe-NH₂(k)的合成

化合物i和1.1倍过量的HOSu溶于无水THF中，冰浴搅拌10min后，缓慢滴加入预冷的1.1倍过量的DCC/THF溶液，冰浴下反应30min后撤冰浴，室温反应6h。真空抽滤除DCU沉淀，得化合物i的活化酯溶液。1.1倍过量的化合物h溶解于2ml乙酸乙酯溶液中，冰浴搅拌下，滴加入0.5ml 12.5N浓盐酸，继续反应2h，减压浓缩乙酸乙酯，2N氢氧化钠调节残留物(化合物j)pH至8-9。冰浴搅拌下，滴加入化合物i的活化酯滤液于上述反应液，室温反应过夜。减压浓缩除THF，加大量乙酸乙酯溶解残留物，依次用5％柠檬酸、饱和碳酸氢钠和饱和NaCl洗涤三次，无水硫酸钠干燥，浓缩。乙酸乙酯热结晶纯化，得白色粉末化合物k。产率Y％＝92.93％。ESI-MS m/z＝486[M+H]⁺。

反应Ⅷ，Ⅺ：Cbz₂GU-Tyr(Me)-L-Pro-Trp-p-Cl-Phe-NH₂(o)的合成

化合物f和1.1倍过量的HOSu溶于无水THF中，冰浴搅拌10min后，缓慢滴加入预冷的1.1倍过量的DCC/THF溶液，冰浴下反应30min后撤冰浴，室温反应6h。真空抽滤除DCU沉淀，得化合物f的活化酯溶液。1.1倍过量的化合物k溶解于2ml乙酸乙酯溶液中，冰浴搅拌下，滴加入0.5ml 12.5N浓盐酸，室温反应2h，减压浓缩乙酸乙酯，2N氢氧化钠调节残留物(化合物l)pH至8-9。冰浴搅拌下，滴加入化合物f的活化酯溶液于上述反应液，室温反应过夜。减压浓缩除THF，加大量乙酸乙酯溶解残留物，依次用5％柠檬酸、饱和碳酸氢钠和饱和NaCl洗涤三次，无水硫酸钠干燥，浓缩。硅胶柱层析纯化(石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶冰乙酸＝20∶80∶3∶1，v/v)，得无色油状化合物o。产率Y％＝68.48％。ESI-MS m/z＝969[M+H]⁺。

反应Ⅻ：GU-Tyr(Me)-L-Pro-Trp-p-Cl-Phe-NH₂(p)的合成

化合物o溶于无水甲醇(6mg/ml)溶液中，小心加入20％钯碳，室温搅拌下，持续通氢气2h，真空抽滤除钯碳，减压浓缩滤液，簿层层析纯化粗产物(乙酸乙酯∶甲醇∶氨水＝60∶20∶5，v/v)，得无色油状终产物p。甲醇/乙酸乙酯结晶得白色固体。产率Y％＝58％。ESI-MS m/z＝701[M+H]⁺。

实施例2：类似物[GMDPC]-EM-1的合成

反应Ⅰ：见实施例1。

反应Ⅱ：Boc-Tyr(Me)-D-Pro-OH(d)的合成

化合物b和1.1倍过量的HOSu溶于无水THF中，冰浴搅拌10min后，缓慢滴加入预冷的1.1倍过量的DCC/THF溶液，冰浴下反应30min后撤冰浴，室温反应6h。真空抽滤除DCU沉淀，得化合物b的活化酯[Boc-Tyr(Me)-OSu]溶液。冰浴搅拌下，滴加滤液至等摩尔量的化合物c(D-Pro)的NaHCO₃溶液中(pH＝8-9)，反应过夜。反应完全后，减压浓缩除THF，加大量乙酸乙酯溶解残留物，依次用5％柠檬酸和饱和NaCl洗涤三次，无水硫酸钠干燥，浓缩。硅胶柱层析纯化(石油醚∶乙酸乙酯∶冰乙酸＝50∶80∶1，v/v)，得无色油状产物d。产率Y％＝78％。ESI-MS m/z＝393[M+H]⁺。

反应Ⅲ：H-Tyr(Me)-D-Pro-OH(e)的合成

化合物d溶于1ml无水DCM溶液中，冰浴搅拌下，滴加相同体积(1ml)的TFA至反应体系中，得50％TFA/DCM混合反应溶液。冰浴继续搅拌2h后，减压浓缩除去TFA/DCM溶液，得化合物e。产率Y％＝98％。ESI-MS m/z＝293[M+H]⁺。

反应Ⅳ：Cbz₂GU-Tyr(Me)-D-Pro-OH(f)的合成

Cbz₂GUPy的合成见实施例1。

Cbz₂GUPy和1.2倍过量的化合物e分别溶解于1ml DMF中，Ar保护，冰浴搅拌下，于化合物e溶液中滴加适量Et₃N。冰浴搅拌10min后，同时缓慢滴加预冷的Cbz₂GUPy/DMF溶液和Et₃N于化合物e中，室温反应72h。反应完全后，加大量乙酸乙酯，依次用5％柠檬酸和饱和NaCl洗涤三次，无水硫酸钠干燥，浓缩。硅胶柱层析纯化(石油醚∶乙酸乙酯∶冰乙酸＝50∶85∶2，v/v)，得无色油状化合物f。产率Y％＝76.7％。ESI-MS m/z＝603[M+H]⁺。

反应Ⅴ，Ⅵ，Ⅶ，Ⅷ：见实施例1。

反应Ⅸ：Boc-Gly-Trp-p-Cl-Phe-NH₂(m)的合成

N-叔丁氧羰酰甘氨酸(Boc-Gly-OH)和1.1倍过量的HOSu溶于无水THF中，冰浴搅拌10min后，缓慢滴加入预冷的1.1倍过量的DCC/THF溶液，冰浴下反应30min后撤冰浴，室温反应6h。真空抽滤除DCU沉淀，得Boc-Gly-OSu滤液。冰浴搅拌下，滴加滤液至等摩尔量化合物l的2N氢氧化钠溶液中(pH 8-9)，室温反应过夜。减压浓缩除THF，加大量乙酸乙酯溶解残留物，依次用5％柠檬酸、饱和碳酸氢钠和饱和NaCl洗涤三次，无水硫酸钠干燥，浓缩。乙酸乙酯热结晶，得白色固体化合物m。产率Y％＝90％。ESI-MS m/z＝543[M+H]⁺。

反应Ⅹ，Ⅺ：Cbz₂GU-Tyr(Me)-D-Pro-Gly-Trp-p-Cl-Phe-NH₂(o)的合成

化合物f和1.1倍过量的HOSu溶于无水THF中，冰浴搅拌10min后，缓慢滴加入预冷的1.1倍过量的DCC/THF溶液，冰浴下反应30min后撤冰浴，室温反应6h。真空抽滤除DCU沉淀，得化合物f的活化酯滤液。1.1倍过量的化合物m溶解于2ml乙酸乙酯溶液中，冰浴搅拌下，滴加入0.5ml 12.5N浓盐酸，室温反应2h，减压浓缩乙酸乙酯，2N氢氧化钠调节残留物(化合物n)pH至8-9。冰浴搅拌下，滴加入化合物f的活化酯溶液于上述反应液，室温反应过夜。减压浓缩除THF，加大量乙酸乙酯溶解残留物，依次用5％柠檬酸、饱和碳酸氢钠和饱和NaCl洗涤三次，无水硫酸钠干燥，浓缩。硅胶柱层析纯化(石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇∶冰乙酸＝20∶80∶4∶1，v/v)，得无色油状化合物o。产率Y％＝68.10％。ESI-MS m/z＝1027[M+H]⁺。

反应Ⅻ：GU-Tyr(Me)-D-Pro-Gly-Trp-Phe(p-Cl)-NH₂(p)的合成

化合物o溶于无水甲醇(6mg/ml)溶液中，小心加入20％钯碳，室温搅拌下，持续通氢气2h，真空抽滤除钯碳，减压浓缩滤液，簿层层析纯化粗产物(乙酸乙酯∶甲醇∶氨水＝45∶20∶8，v/v)，得无色透明油状化合物p。甲醇/乙酸乙酯结晶得白色固体。产率Y％＝50.9％。ESI-MS m/z＝758[M+H]⁺。

内吗啡肽-1的其它类似物[GMLDC]-EM-1和[GMDDC]-EM-1的全合成方案与实施例1、2类似，并得到相似的实验结果。表1列出EM-1及其类似物的理化特征。

表1.EM-1及其类似物的理化特征

本发明的化合物的药理学活性鉴定试验详述如下：

1.放射配体受体结合试验(Radioligand binding assay)

1.1大鼠脑膜蛋白的制备

成年Wistar大鼠(250-300g)断头取脑，去除小脑及脑桥部分，称重。冰冷的50mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)冲洗大脑几次，除去溢血。加20倍体积的(v/w)Tris-HCl缓冲液，匀浆器匀浆。4℃，40,000×g离心25min，弃上清，加Tris-HCl缓冲液至原体积，吹打使重新悬浮，再次研磨。37℃水浴孵育30min。4℃，40,000×g再次离心25min，弃上清，加入20倍体积的Tris-HCl缓冲液混匀。考马斯亮蓝G-250法测定蛋白含量。细胞冻存管分批在-80℃下保存待用。

1.2受体结合试验

取-80℃保存脑膜蛋白，37℃水浴1min快速解冻。实验分为总结合管，竞争结合管和非特异性结合管。每个反应管中依次加入放射配体，纳洛酮(Naloxone，Nx)/非放射性药物，Tris-HCl(含PMSF和Captoril)和膜蛋白(300-500μg/ml)。其中，在总结合管中，只加入[³H]DAMGO(0.5nM)或[³H]DPDPE(1nM)和固定的膜蛋白(300-500μg/ml)，在非特异性结合管和竞争结合管中，分别另加入10μM Nx和不同浓度的类似物，最后补充Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)至总体积0.5ml。振荡器混匀结合体系。37℃摇床反应一定时间([³H]DAMGO为1h，[³H]DPDPE为3h)后，取出离心管，反应液经ZT-II型细胞收集器收集，GF/C型玻璃纤维素膜过滤。80℃油浴下烘烤玻璃纤维素膜30min后，取出滤膜，放入24孔板中，每孔加入0.7ml闪烁液，封盖膜封盖。隔夜用β液体闪烁计数仪记录放射性强度(CPM)。计算类似物对特异性结合的抑制率，以浓度的负对数为横坐标，抑制率为纵坐标，线性回归求得IC₅₀值，根据公式K_i＝IC₅₀/(1+[L]/KD)计算K_i值。

1.3实验结果

实验数据见表2。结果表明，所有类似物的μ阿片受体亲和性都低于母体。其中，类似物[GMLPC]-EM-1和[GMLDC]-EM-1具有中等强度的MOR亲和性，而类似物[GMDPC]-EM-1和[GMDDC]-EM-1的MOR亲和性则相对较弱。另外，所有类似物的δ/μ选择性都显著低于母体。

2.离体生物活性功能检定(In vitro bioactivity assays)

2.1GPI试验

豚鼠250-300g，雌雄不限，实验前禁食12h，饮水不限。棒击枕部处死，剖腹取出近盲肠端的回肠6cm两段，浸入持续通入95％O₂和5％CO₂混合气的Krebs液(g/L：NaCl 6.9，CaCl₂0.28，KCl 0.35，KH₂PO₄0.16，MgSO₄·7H₂O 0.30，NaHCO₃ 2.1，苯海拉明50×10^-6，氯化胆碱2.8×10^-3，葡萄糖1.98)中，湿润后套在一根玻璃棒上，沿回肠壁的一根纵形血管将纵行肌与环形肌分离，然后用零号丝线将纵行肌的一端缚在玻璃电极的小钩上，另一端缚在JZ-1型肌肉张力传感器上，制备好后立即放入盛有持续通入气体(95％O₂和5％CO₂)的Krebs液、恒温37±0.2℃的玻璃浴管中，预负荷500mg。前30min每5min换一次营养液，以后每15min换液一次，平衡2h后开始实验。给予电刺激，刺激参数：波宽0.3-0.5ms，频率6次·min^-1，负载电压50V。记录基础收缩强度，再给予适量吗啡鉴定其活性；然后分别给予不同剂量的待试药物，记录收缩强度，计算抑制百分率。每次药物作用后，用营养液冲洗5次，平衡15min。

2.2MVD试验

体重30-35g雄性昆明系小白鼠，颈椎脱臼处死，剖腹取出两侧输精管，浸入持续通入95％O₂和5％CO₂混合气的Krebs液(g/L：NaCl6.9，CaCl₂ 0.28，KCl O.35，KH₂PO₄ 0.16，NaHCO₃ 2.1，葡萄糖198)中，剥离附着于其上的脂肪及血管。剪去输精管的一端，用小棉花球轻轻地从末端向开口端压出管内的精液，变成一条空心管，然后用零号丝线将其一端缚在玻璃电极的小钩上，另一端缚在JZ-1型肌肉张力传感器上，制备好后立即放入盛有持续通入气体(95％O₂和5％CO₂)的Krebs液、恒温36.5±0.5℃的玻璃浴管中，预负荷100mg。前30min每5min换一次营养液，以后每10min换液一次，平衡2h后开始实验。给予电刺激，刺激参数：波宽2ms，频率6次·min^-1，负载电压50V。记录基础收缩强度，再给予适量吗啡鉴定其活性；然后分别给予不同剂量的待试药物，记录收缩强度，计算抑制百分率。每次药物作用后，用营养液冲洗5次，平衡15min。

表2.EM-1及其类似物的阿片受体亲和性和离体生物活性功能试验结果

2.3实验结果

表2列出GPI/MVD实验数据，与放射配体结合实验结果一致。所有类似物的μ阿片受体激动活性均显著低于母体。在GPI试验中，类似物[GMLPC]-EM-1和[GMLDC]-EM-1的IC₅₀值无显著差异，μ阿片受体激动活性稍高于类似物[GMDPC]-EM-1和[GMDDC]-EM-1。MVD结果显示所有类似物的IC₅₀值都显著高于母体，表明对δ阿片受体的弱的激动活性。

3.辛醇/缓冲液分配系数(D)测定(Octanol/bufferdistribution)

3.1实验方法

将等体积的辛醇与0.05M HEPES/0.1M NaCl缓冲液(pH＝7.4)混合，室温下平衡12h，待混合液分层后，分离两相，4℃保存。试验时，将50μg多肽药物加入到500μl辛醇饱和的缓冲液中，并与500μl水饱和的辛醇溶液振荡涡旋2min。4,000rpm离心1min，分离水层和辛醇层。水层直接用于RP-HPLC分析。辛醇层冻干，加等量甲醇溶解，RP-HPLC分析。药物在辛醇层与缓冲液层的含量比值被定义为辛醇/缓冲液分配系数(D)。

3.2实验结果

实验结果见表3。类似物[GMLDC]-EM-1和[GMDDC]-EM-1的辛醇/缓冲液分配系数D值分别比母体降低约7.7倍和2.1倍，而类似物[GMLPC]-EM-1和[GMDPC]-EM-1的D值则显著高于母体，分别提高约1.7倍和3.5倍。提示，Phe⁴芳香环对位氯化修饰可明显增强药物的脂溶性。此外，类似物[GMDPC]-EM-1和[GMDDC]-EM-1的D值也分别高于对应的类似物[GMLPC]-EM-1和[GMLDC]-EM-1。表明D-Pro-Gly二肽片段的引入也增强了药物的脂溶性。

4.离体酶解稳定性试验(in vitro metabolic stability)

4.1.血清/脑质膜标本制备

4.1.1100％血清标本制备

肝素化注射器/离心管：取2mg/ml肝素钠溶液0.1ml均匀浸湿注射器/离心管管壁后晾干，每管可使10ml血液不凝。

30-35g成年雄性小鼠，i.p.注射25％的乌拉坦0.3-0.4ml/每只小鼠，使其麻醉。背位固定，颈部去毛，切开皮肤，用镊子挑起颈动脉并剪断，注射器取血，将取出的血液转移到肝素化的冰冷的离心管中，4℃放置过夜。4℃，20,000g离心20min。取上清液，-80℃冻存。

4.1.2 15％小鼠脑质膜标本制备

取30-35g成年雄性小鼠，颈椎脱臼处死，取大脑(去除小脑及脑桥)，滤纸吸干，称重。用冰冷的1mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)冲洗几次，除去溢血。加入50倍体积(v/w)的冰冷1mM Tris-HCl(pH＝7.4)缓冲液，0℃下，用匀浆器使之成胞浆匀浆。匀浆液置于冰浴中放置30分钟以促进细胞溶解。然后按每1ml匀浆液补加0.5ml 50mM冰冷的Tris-HCl，再次匀浆，吹打悬浮。49,000g离心45min，弃上清，沉淀重新悬浮于50倍体积的冰冷50mM Tris-HCl中，吹打悬浮。49,000g再次离心45min，弃上清，沉淀悬浮于适当体积的50mM Tris-HCl中，使脑膜蛋白浓度约为2mg/ml。振荡器震荡涡旋混匀，分装，-80℃冻存。

4.2血清/脑质膜孵育试验

取10μ1多肽母液(10^-2M)，加入到190μl血清或脑质膜中，立即振荡混匀，然后迅速取出20μl混合液，加入离心管中计时为0min，余者于37℃下继续孵育，并分别在5min，10min，15min，30min，60min，120min，240min取出20μl。酶解过程的终止：于取出的样品中加入90μl乙腈振荡混匀，样品置于冰上放置5分钟，再用90μl 0.5％的冰冷乙酸稀释以确保酶解过程停止。13,000g离心15min，收集上清，-80℃冻存，直至RP-HPLC分析。

4.3试验结果

如表3所示，所有类似物[GMLPC]-EM-1、[GMLDC]-EM-1、[GMDPC]-EM-1和[GMDDC]-EM-1的小鼠脑质膜和血清半衰期都显著长于母体EM-1。其中，类似物[GMDPC]-EM-1和[GMDDC]-EM-1在两种介质中的酶解稳定性都明显高于类似物[GMLPC]-EM-1和[GMLDC]-EM-1，提示，2位非天然氨基酸的引入显著增强了药物的抗酶解能力。

5.蛋白结合率测定(Protein Binding)

5.1游离样品制备(T)

将500μl预热至37℃的哺乳动物Ringer’s溶液[117.0mMNaCl，4.7mM KCl，0.8mM MgSO₄，24.8mM NaHCO₃，1.2mM KH₂PO₄，2.5mMCaCl₂，10mM D-葡萄糖，3.9％右旋糖苷(dextran，wt＝70,000)，和1％牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)，pH＝7.4]，加入含10μl多肽母液(10^-2M)的离心管中，立即振荡混匀，迅速转移至超滤离心管内。2,000g离心10min，取出50μl超滤液，加入50μl乙腈振荡混匀，冰浴下放置5min，再加入50μl 0.5％冰乙酸，振荡混匀。13,000g离心15min，收集上清，-80℃保存，直至HPLC分析。

5.2总样品制备(T)

取50μl预热至37℃的超滤Ringer’s溶液，加入含1μl多肽母液(10^-2M)的离心管中，立即振荡混匀。室温放置10min后，加入50μl乙腈振荡混匀，冰浴下放置5min，再加入50μl 0.5％冰乙酸，振荡混匀。13,000g离心15min，收集上清，-80℃保存，直至HPLC分析。蛋白结合率B％＝(T-F)/T×100。

5.3实验结果

类似物[GMLDC]-EM-1的蛋白结合率与母体无显著差异，而类似物[GMLPC]-EM-1，[GMDPC]-EM-1和[GMDDC]-EM-1的结合率则明显高于母体(见表3)。类似物[GMLPC]-EM-1和[GMDPC]-EM-1的蛋白结合率显著高于对应的C末端没有修饰的类似物[GMLDC]-EM-1和[GMDDC]-EM-1，表明氯化修饰显著提高了药物与蛋白的结合能力。

表3.EM-1及其类似物的离体大脑/血清半衰期，辛醇/缓冲液分配系数(D)和BSA蛋白结合率

6.镇痛实验(Assessment of antinociception)

6.1实验方法

采用小鼠温浴甩尾法。昆明系雄性小鼠，18-20g，环境温度：20℃，水浴温度：50±0.5℃。给药前先测定小鼠的基础痛阈(control latency，CL)，将小鼠鼠尾的1/3-1/2浸入水浴，记录鼠尾从刚浸入水浴至发生收缩的时间。过于敏感(＜3s)或迟钝的(＞5s)小鼠弃去不用，截止时间10s，以防止小鼠烫伤。药物注射剂量：侧脑室注射(EM-1及其四个类似物)，20nmol/kg；皮下注射(类似物[GMDPC]-EM-1)，30mg/kg。给药后90分钟内，前30min每5分钟测一次，后每15分钟测一次甩尾潜伏期(test latency，TL)。0.9％生理盐水作为空白对照。

结果以最大可能效应百分比(maximum possible effect，％MPE)表示：％MPE＝100×(TL-CL)/(10-CL)。

6.2实验结果

侧脑室注射20nmol/kg的类似物[GMLPC]-EM-1、[GMLDC]-EM-1、[GMDPC]-EM-1和[GMDDC]-EM-1均产生镇痛作用，尽管其效力都低于母体(强度约为EM-1的50％)，但镇痛持续时间(30-45min)均显著长于EM-1(约20min)(见图2和图3)。皮下注射EM-1(30mg/kg)基本无镇痛活性，而注射等剂量的类似物[GMDPC]-EM-1则产生明显的长时程(＞1h)的镇痛作用(见图4)。另外，侧脑室注射(10nmol/小鼠)μ阿片受体拮抗剂纳络酮可显著的逆转此作用，而皮下注射10mg/kg的甲碘化纳络酮(不能穿透血脑屏障)则对此没有影响(见图5)。提示，皮下注射类似物[GMDPC]-EM-1产生的镇痛作用是一种通过MOR介导的中枢机制。

7.反相-高效液相色谱(reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC)分析

采用RP-HPLC分析辛醇/缓冲液分配样品，离体稳定性样品及蛋白结合样品。RP-HPLC系统由Waters Delta 600控制器，紫外监测器和Warers Delta Pak C18柱(3.9×150mm)组成。检测波长280nm，流速0.6ml/min，流动相＝水/0.1％TFA(A)+乙腈/0.1％TFA(B)。洗脱梯度：0-12min，流动相A∶B＝20∶80→80∶20；12-15min，流动相A∶B＝80∶20→20∶80。

Claims (1)

1.一类内吗啡肽-1类似物[GMLPC]-EM-1、[GMLDC]-EM-1、[GMDPC]-EM-1和[GMDDC]-EM-1，结构式为：

其结构特征为：内吗啡肽-1四个类似物的1位Tyr均进行N^α胍基化和酚羟基甲醚化修饰，3位Trp保持不变；类似物[GMLPC]-EM-1和[GMLDC]-EM-1的2位为L-Pro，类似物[GMDPC]-EM-1和[GMDDC]-EM-1的2位L-Pro用D-Pro-Gly二肽片段替换；类似物[GMLPC]-EM-1和[GMDPC]-EM-1的Phe⁴的芳香环的对位进行氯化修饰，类似物[GMLDC]-EM-1和[GMDDC]-EM-1的Phe⁴保持不变。

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