CN1715294A - 内吗啡肽类似物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一类如下式的具有镇痛药效的内吗啡肽－2的类似物：化合物a、化合物b、化合物c及化合物d：其制备方法为：以Z－Tyr－Pro－OH或Z－Tyr－D－Pro－OH为第I片段，以Z－Phe－Ala－NHCH(CH3)Ph或Z－Phe－Gly－NHCH(CH3)Ph作为第II片段，采用片段缩合法，对其进行制备。其中，对氨基酸采用最小保护；原料Z－Ala－NHCH(CH3)Ph及Z－Gly－NHCH(CH3)Ph采用DCC/DMAP法合成；片段的合成采用DCC/HOSu法，片段之间采用DCC/HOBt为偶联试剂的合成技术方案进行制备；中间产物主要采用析晶法纯化，终产物采用普通硅胶柱层析法纯化。经离体器官生物检定、痛觉调节实验，或再通过大鼠整体平均动脉压试验等药理实验模型筛选，表明前述新化合物：内吗啡肽－2的类似物a～d为具有优良镇痛活性多肽前药分子，并可能进一步开发成镇痛多肽药物，以用于研究及临床。
Description
技术领域
本发明涉及一类新化合物及其制备法和药理功效，具体的讲是一类内吗啡肽-2类似物及其制备方法和镇痛相关活性，应用范围为医药工业及化学工业。
背景技术
内吗啡肽(endomorphins，EMs)分为内吗啡肽-1(endomorphin-1，EM-1，Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2)和内吗啡肽-2(endomorphin-2，EM-2，Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2)，是μ阿片受体(mu-opioid receptor，MOR)的内源性激动剂，对MOR具有极高的亲和力和选择性，并具有广泛的生理、药理效应特别是强效的镇痛作用。
内吗啡肽的氨基酸组成及结构如下式所示：
EM-1：Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2 EM-2：Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2
作为具有强效镇痛效应的生物活性肽，与非肽类镇痛药吗啡相比，内吗啡肽具有独特的优势。经大量的实验发现，脑室注射(icv.)、鞘内注射(it.)内吗啡肽时均可产生与吗啡等效的镇痛作用，但却不产生吗啡的某些副作用[Carrigan K A等，Psychopharmacology，2000，151：299-305；Czapla M A等，Am.J.Respir.Crit.CareMed，2000，162：994-999]，同时，EMs对吗啡依赖的大鼠亦有镇痛作用，更为特别的是内吗啡肽能剂量依赖性地对抗异常疼痛，特别是在对神经源性痛的调节中，内吗啡肽比吗啡有更强的抑制作用，因此，内吗啡肽可能用于治疗当前比较棘手的神经性疼痛[Przewlocka B等，Eur J Pharmacol，1999，367(2-3)：189-96]。
由于临床使用的强效镇痛药吗啡大多数的药理效应都是由MOR介导的，因而作为MOR天然配基的EMs就成为人们寻找镇痛活性多肽药物重要的模型分子。更由于内吗啡肽在痛觉感受和痛觉调节过程中的独特作用，丰富了人们对痛觉调节的认识，为多肽化学家及药学家研制开发强效、低毒的新型镇痛药提供了新思路，而且其构象的相对简单，更为阿片领域的研究、阿片肽的化学模拟及新型高效的镇痛药的开发提供了更加便捷的模式。
但是，由于内吗啡肽的柔性分子结构，可具有多种受体分子识别所需要的不同构象包括对受体不同亚型的结合作用，从而使它们的选择性低，在临床治疗中产生一些副反应，如内吗啡肽对兔、猫、小鼠、大鼠等实验动物都能剂量依赖地较为显著地降低实验动物系统动脉压和心率，从而限制了它作为镇痛剂的应用。同时作为阿片类物质，内吗啡肽亦具有阿片类药物的固有弱点，如具有一定的成瘾性，对于临床使用也增加了困难。而且，内吗啡肽也具有肽类药物分子本身的弱点，如易代谢、抗酶解能力差、作用半衰期短等，限制了它的应用。
因此，针对以上的不良特性，在结构为基础的合理药物设计基础上，对内吗啡肽进行结构修饰、结构改造以获得肽拟似物，以寻找出其特殊的拟似物，使其具有母体的某种特有活性，特别是其优良的镇痛活性，减少甚至消除其他的副作用，改变其不良特性，获得功能专一的多肽药物，已成为目前内吗啡肽及相关领域研究的热点。
发明内容
本发明在以结构为基础的合理药物设计的基础上，以内吗啡肽为模型分子，设计了一系列类似物，并获得了四个新的经改造的、具有优良镇痛效果的内吗啡肽-2的类似物a～d，该化合物均具有优良的镇痛活性，以作为多肽前药分子。
本发明的第二目的是提供一种前述具有优良镇痛效果的新化合物的制备方法。
本发明进一步的目的是经药理实验模型筛选前述化合物，筛选出具有优良药理功效的新化合物，结果表明内吗啡肽-2的类似物a-d为具有优良镇痛活性多肽前药分子，可进一步开发成镇痛多肽药物，以用于研究及临床。同时，期望进一步研究EM-2类似物的其他生物效应及药理功效。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现。
在以结构为基础的合理药物设计的基础上，以内吗啡肽为模型分子，设计并获得如下所示的一类内吗啡肽-2的类似物a～d：
a Tyr-Pro-Phe-Gly-NHCH(CH3)Ph b Tyr-Pro-Phe-Ala-NHCH(CH3)Ph
c Tyr-D-Pro-Phe-Gly-NHCH(CH3)Ph d Tyr-D-Pro-Phe-Ala-NHCH(CH3)Ph
其结构特征为：内吗啡肽-2的4-位的-苯丙酰胺(-PheNH2)被-丙氨酰-L-G-甲基苄胺(-AlaNHCH(CH3)Ph)或-甘氨酰-L-α-甲基苄胺(-GlyNHCH(CH3)Ph)所取代；或内吗啡肽-2的2-位L-脯氨酸(L-Pro)被D-脯氨酸(D-Pro)所取代，而同时4-位的-PheNH2被-丙氨酰-L-α-甲基苄胺或-甘氨酰-L-α-甲基苄胺所取代。
本发明还可以通过以下技术方案来实现：
本发明提供了内吗啡肽-2类似物a～d的制备方法：以Z-Tyr-Pro-OH(苄氧羰基酪氨酰脯氨酸)或Z-Tyr-D-Pro-OH(苄氧羰基酪氨酰-D型-脯氨酸)为第I片段，以Z-Phe-Ala-NHCH(CH3)Ph(苄氧羰基苯丙氨酰丙氨酰-L-α-甲基苄胺)或Z-Phe-Gly-NHCH(CH3)Ph(苄氧羰基苯丙氨酰甘氨酰-L-α-甲基苄胺)作为第II片段，采用对氨基酸进行最小保护，以DCC-HOSu(二环己基碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺)或DCC-HOBt(二环己基碳二亚胺/1-羟基苯骈三氮唑)为偶联或缩合试剂，以片段缩合法进行肽链增长的合成技术方案进行制备。
1.片段I的合成：苄氧羰基酪氨酸(Z-Tyr-OH)与L-Pro-OH或D-Pro-OH采用DCC-HOSu法缩合，四氢呋喃(THF)或THF、NaHCO3/H2O混合溶液作为反应溶剂；接肽反应终止后，用盐酸酸化处理；常规后处理后采用低温石油醚结晶或硅胶柱层析纯化，得化合物X(Z-Tyr-Pro-OH)或化合物vii(Z-Tyr-D-Pro-OH)。
2.片段II的合成：化合物i(Z-Gly，N-苄氧羰基甘氨酸)或化合物化合物xiii(Z-Ala，N-苄氧羰基丙氨酸)与L-(-)α-甲基苄胺采用DCC/DMAP(二环己基碳二亚胺/4-二甲基氨基吡啶)法缩合，乙酸乙酯(EA)/石油醚(PE)重结晶得化合物ii(Z-Gly-NHCH(CH3)Ph，苄氧羰基甘氨酰-L-α-甲基苄胺)，乙酸乙酯重结晶得Z-Ala-NHCH(CH3)Ph(苄氧羰基丙氨酰-L-α-甲基苄胺)；进一步10％的钯碳(Pd/C)催化氢化脱Z保护，得化合物iii(H2N-Gly-NHCH(CH3)Ph，甘氨酰-L-α甲基苄胺)及H2N-Ala-NHCH(CH3)Ph(丙氨酰-L-α-甲基苄胺)。化合物iv(Z-Phe，N-苄氧羰基苯丙氨酸)与化合物iii或化合物H2N-Ala-NHCH(CH3)Ph采用DCC-HOBt法缩合，EA/PE重结晶，得化合物v(Z-Phe-Gly-NHCH(CH3)Ph，苄氧羰基苯丙氨酰甘氨酰-L-α-甲基苄胺)，EA析晶法得化合物Z-Phe-Ala-NHCH(CH3)Ph(苄氧羰基苯丙氨酰丙氨酰-L-α-甲基苄胺)；进一步10％的Pd/C催化氢化脱Z-保护，得化合物viii(Phe-Gly-NHCH(CH3)Ph，苯丙氨酰甘氨酰-L-α-甲基苄胺)或化合物xii(Phe-Ala-NHCH(CH3)Ph，苯丙氨酰丙氨酰-L-α-甲基苄胺)。
3.保护四肽的合成：化合物x(Z-Tyr-Pro-OH)或化合物vii(Z-Tyr-D-Pro)分别与化合物viii(Phe-Gly-NHCH(CH3)Ph)或化合物xii(Phe-Ala-NHCH(CH3)Ph)采用DCC-HOBt法缩合并采用结晶或硅胶柱层析法纯化粗产物，得化合物ix(Z-Tyr-D-Pro-Phe-Gly-NHCH(CH3)Ph，苄氧羰基酪氨酰-D型-脯氨酰苯丙氨酰甘氨酰-L-α-甲基苄胺)，或化合物xi(Z-Tyr-Pro-Phe-Gly-NHCH(CH3)Ph，苄氧羰基酪氨酰脯氨酰苯丙氨酰甘氨酰-L-α-甲基苄胺)，或化合物xiv(Z-Tyr-D-Pro-Phe-Ala-NHCH(CH3)Ph，苄氧羰基酪氨酰-D型-脯氨酰苯丙氨酰丙氨酰-L-α-甲基苄胺)，化合物xv(Z-Tyr-Pro-Phe-Ala-NHCH(CH3)Ph，苄氧羰基酪氨酰脯氨酰苯丙氨酰丙氨酰-L-α-甲基苄胺)。
4.目标肽的获得：采用Pd/C或氢氧化钯/碳(Pd(OH)2/C)催化氢化脱去保护四肽的Z-保护基，再分别以乙酸乙酯、甲醇、浓氨水组成的混合溶剂为层析体系的硅胶柱层析纯化，得目标纯肽：化合物a(Tyr-Pro-Phe-Gly-NHCH(CH3)Ph，酪氨酰脯氨酰苯丙氨酰甘氨酰-L-α-甲基苄胺，化合物c(Tyr-D-Pro-Phe-Gly-NHCH(CH3)Ph，酪氨酰-D型-脯氨酰苯丙氨酰甘氨酰-L-α-甲基苄胺；化合物b(Tyr-Pro-Phe-Ala-NHCH(CH3)Ph，酪氨酰脯氨酰苯丙氨酰丙氨酰-L-α-甲基苄胺)；化合物d(Tyr-D-Pro-Phe-Ala-NHCH(CH3)Ph，酪氨酰-D型-脯氨酰苯丙氨酰丙氨酰-L-α-甲基苄胺)。
本发明还通过离体器官生物检定、痛觉调节实验，或再通过大鼠整体平均动脉压试验等药理实验模型，对前述化合物的药理功效进行了筛选与评价，发现化合物a、化合物b、化合物c、化合物d均为具有独特优势的强效镇痛剂。
镇痛效能大小通常用ED50值(nmol.kg-1)表示，化合物a～d的ED50值分别为：化合物a为109.21，化合物b为81.23；化合物c为91.40，化合物d为40.06；在相同条件下，母体内吗啡肽及阳性对照吗啡其ED50值大小分别为：EM-1为22.72，EM-2为36.02，吗啡为33.21(见表1，图1)。因此，上述化合物的ED50值均＜110nmol.kg-1，均为强效镇痛剂，其镇痛效能强度接近母体及吗啡；同时，其在较强镇痛效应水平持续时间均比EM-1长，具有优势(见图2，图3)。特别的是，化合物a及化合物b不具有母体内吗啡肽的外周降血压不良活性(见图5，图6)，其镇痛专一性相对较高，为具有一定优势的多肽镇痛潜药；化合物d具有的强效镇痛效应强度与其母体EM-2相同，并且同化合物c一样，其强效镇痛效应不能被经典阿片受体拮抗剂纳络酮(Nx)所拮抗(见图4)，因此可能为非经典阿片类镇痛药物而不具有经典阿片类镇痛药物如吗啡的不良作用，具有良好的应用前景。
本发明的优点和产生的有益效果是：
1、本发明以内吗啡肽-2为分子模型，新设计并获得的4个具有优良药理功效的多肽镇痛化合物a～d，可能为多肽前药分子，并可进一步开发成镇痛多肽药物，以用于研究及临床。
2、利用多肽液相合成法，提供了前述化合物的合理的制备方法，该合成路线及方法具有成本低廉、产率高、操作简便、纯化简单的特点，为该类似物的进一步研究提供了可靠的技术保障和产品支持，亦可为其他小肽的合成路线与制备方法的设计提供思路。
3、化合物a及化合物b不具有母体内吗啡肽的外周降血压不良活性，其镇痛专一性相对较高，为具有一定优势的多肽镇痛潜药。
4、化合物d具有的强效镇痛效应强度与其母体EM-2相同，并且同化合物c一样，其强效镇痛效应不能被经典阿片受体拮抗剂纳络酮(Nx)所拮抗，因此可能为非经典阿片类镇痛药物而不具有经典阿片类镇痛药物如吗啡的不良作用，具有良好的应用前景。
附图说明
图1，EM-2、吗啡及化合物a、b、c、d镇痛测试的剂量效应曲线；独立试验次数(n)：n＝8～12
图2，EM-2、吗啡及化合物a、c镇痛测试的时间效应曲线；n＝8～12；
图3，EM-2、吗啡及化合物b、d镇痛测试的时间效应曲线；n＝8～12；
图4，ip.(腹腔注射)纳洛酮(2mg.kg-1)对化合物a、b、c、d的镇痛效应的拮抗效应图；n＝8～12，数值用平均值±标准误表示(
x±SEM)，**p＜0.01vs药物
图5，EM-1、EM-2及化合物a、b静脉给药(iv.)对麻醉大鼠整体平均动脉压的影响的剂量效应曲线；化合物a、b，p＞0.05 vs control；EM-1，EM-2，**p＜0.01 vs control(对照)
图6，化合物a、b高剂量静脉给药(iv.)前后麻醉大鼠整体平均动脉压的变化图，n＝8～12，p＞0.05 vs control。
具体实施方式
下面以实施例的方式，结合附图对本发明技术方案再作进一步的说明：
实施例1：化合物c(Tyr-D-Pro-Phe-Gly-NHCH(CH3)Ph，酪氨酰-D型-脯氨酰苯丙氨酰甘氨酰-L-α-甲基苄胺)的合成
化合物i(Z-Gly，N-苄氧羰基甘氨酸)溶于无水DCM中(加无水DMF助溶)，冰浴，加入1.5倍量的L-(-)α-甲基苄胺，再冰浴10min，然后加入1.5倍量溶于预冷二氯甲烷(DCM)中的DCC，冰浴搅拌30min后，加入0.5倍量的DMAP，30min后，恢复至室温反应40h后，滤去DCU，滤液减压浓缩去溶剂，乙酸乙酯溶解，然后依次用稀盐酸、饱和NaHCO3、NaCl溶液洗涤，无水硫酸钠干燥。粗产物用EA/PE(1∶2，V/V)重结晶得化合物ii(Z-Gly-NHCH(CH3)Ph)：yield＝86.7％；质谱(EI-MS)：312，与计算值：312相一致。
将化合物ii溶于无水甲醇中，加入0.15倍量的Pd/C(10％)，搅拌，通入氢气氢化，5h后，终止反应，滤去催化剂，滤液减压浓缩至干(浴温不超过40℃)，得化合物iii(H2N-Gly-NHCH(CH3)Ph)。
将等摩尔量的化合物iv(Z-Phe，N-苄氧羰基苯丙氨酸)及HOBt溶于无水DCM/DMF混合溶剂中，冰盐浴冷却搅拌下，缓慢滴加入溶解了等摩尔量DCC的预冷DCM溶液，再室温反应12h后，滤去DCU，得Z-Phe-OBt溶液。冰盐浴，搅拌，加入1.2倍量已溶于预冷无水DCM的化合物iii(H2N-Gly-NHCH(CH3)Ph)溶液，冰盐浴反应1h，然后恢复至室温反应。约30-35h后，减压浓缩去DCM，残留物用乙酸乙酯溶解，然后按化合物ii的后处理方法进行后处理，粗产物用EA/PE(1∶1，V/V)重结晶，得化合物v(Z-Phe-Gly-NHCH(CH3)Ph)：针状白色晶体，yield＝84.6％，；质谱(ESI-MS)[M+H]+：460；与计算值：460相一致。
将等摩尔量的化合物vi(Z-Tyr，N-苄氧羰基酪氨酸)及HOSu溶于无水THF中，在0C冷却及充分搅拌下，缓慢滴加入溶解了等量DCC的预冷THF溶液，再室温反应，过夜。抽滤，得Z-Tyr-OSu溶液。搅拌，然后将0.77倍量的D-Pro用稍过量的NaHCO3溶液溶解后，滴加入Z-Tyr-OSu溶液中，室温反应约33h后，缓慢滴加6mol/L HCl至溶液pH为2。然后减压浓缩去THF，用乙酸乙酯萃取，酸洗，再用NaCl溶液洗至中性，加入无水硫酸钠干燥。滤掉无水硫酸钠，再减压浓缩去掉乙酸乙酯，得粗产物。粗品采用硅胶柱层析(EA∶MeOH∶冰HAc＝125∶25∶1，v/v)纯化，干燥，得化合物vii(Z-Tyr-D-Pro)：淡黄色固体，Yield＝79.1％，质谱(ESI-MS)[M+H]+：413；与计算值：413一致。
将化合物v溶于无水甲醇中，加入0.15倍量的10％的Pd/C，搅拌，通入氢气氢化3h，滤去催化剂，滤液减压浓缩至干(浴温不超过40℃)，得化合物viii(Phe-Gly-NHCH(CH3)Ph)。
将等摩尔量的化合物vii及HOBt溶于无水二氯甲烷/二甲基甲酰胺(DMF)混合溶剂中，冰盐浴冷却搅拌下，缓慢滴加入溶解了等摩尔量DCC的预冷DCM溶液，再室温反应12h后，滤去DCU，得Z-Tyr-D-Pro-OBt溶液。冰盐浴，搅拌，加入1.2倍量已溶于预冷无水DCM的化合物viii，冰盐浴反应1h，然后恢复至室温反应。约25h后，减压浓缩去DCM，残留物用乙酸乙酯溶解后，依次进行酸洗、饱和NaHCO3洗涤，最后再用NaCl溶液洗至中性，无水硫酸钠干燥，得粗产物。硅胶柱层析(PE∶EA∶EtOH＝2∶100∶l，v/v)纯化，干燥，得化合物ix(Z-Tyr-D-Pro-Phe-Gly-NHCH(CH3)Ph)：白色固体，yield＝72.2，质谱(FAB-MS)[M+H]+：m/z 720，与计算值：720相一致。
将化合物ix溶于无水甲醇中，加入0.15倍量10％的Pd/C，搅拌，通入氢气氢化，3h后，滤去催化剂，滤液减压浓缩至干(浴温不超过40℃)，得粗肽。采用普通硅胶柱层析(EA∶MeOH∶浓NH3.H2O＝125∶25∶1，v/v)纯化，干燥，得目标纯肽化合物c(Tyr-D-Pro-Phe-Gly-NHCH(CH3)Ph)，收率81.7％，Rf＝0.31；熔点：122-123℃；质谱(FAB-MS)[M+H]+：m/z 586，与计算值：586相一致。
实施例2：化合物a(Tyr-Pro-Phe-Gly-NHCH(CH3)Ph，酪氨酰脯氨酰苯丙氨酰甘氨酰-L-α-甲基苄胺)的合成
实施例2中化合物viii(Phe-Gly-NHCH(CH3)Ph)的结构和合成过程与实施例1中相同。
将等摩尔量的Z-Tyr与HOSu溶于无水THF中，在＜0℃冷却及充分搅拌下，缓慢滴加入溶解了等量DCC的预冷THF溶液，再室温反应，过夜。抽滤，得Z-Tyr-OSu溶液。搅拌，然后将1.5倍量的L-Pro用NaHCO3溶液溶解后，滴加入Z-Tyr-OSu溶液中，室温反应约2d。反应结束后，缓慢滴加6mol/L HCl，至溶液pH为2。然后减压浓缩去THF，用乙酸乙酯萃取，再酸洗，然后用NaCl溶液洗至中性，加入无水硫酸钠干燥。滤掉无水硫酸钠，再减压浓缩去掉乙酸乙酯，得糖浆状物。经冰冷的石油醚研磨过滤、洗涤，得到淡黄色固体化合物x(Z-Tyr-Pro-OH)，收率68.2％，Rf＝0.25(PE∶EA＝1∶3(添加少量冰HAc)，V/V)。质谱(ESI-MS)[M+H]+：413；与计算值：413一致。
将等摩尔量的化合物x(Z-Tyr-Pro-OH)及HOBt溶于无水DCM/DMF混合溶剂中，冰盐浴冷却搅拌下，缓慢滴加入溶解了等摩尔量DCC的预冷DCM溶液，再室温反应12h后，滤去DCU，得Z-Tyr-Pro-OBt溶液。冰盐浴，搅拌，加入1.2倍量已溶于预冷无水DCM的化合物viii(Phe-Gly-NHCH(CH3)Ph)，冰盐浴反应1h，然后恢复至室温反应。约30h后，减压浓缩去DCM，残留物用乙酸乙酯溶解后，依次进行酸洗、饱和NaHCO3洗涤，最后再用NaCl溶液洗至中性，无水硫酸钠干燥，得粗产物，采用柱层析(PE∶EA∶EtOH＝6∶70∶1，v/v)纯化，干燥，得化合物xi(Z-Tyr-Pro-Phe-Gly-NHCH(CH3)Ph)：白色固体，质谱(FAB-MS)[M+H]+：m/z 720，与计算值：720相一致。
将化合物xi溶于无水甲醇中，加入0.15倍量Pd(OH)2/C(75％)，搅拌，通入氢气氢化，1.5-2.5h后，滤去催化剂，滤液减压浓缩至干(浴温不超过40℃)，得粗肽。采用普通硅胶柱层析(EA∶MeOH∶浓NH3.H2O＝150∶30∶1，v/v)纯化，干燥，得目标纯肽化合物a(Tyr-Pro-Phe-Gly-NHCH(CH3)Ph)：yield＝80.0％，Rf＝0.29；熔点：120.5-122℃；反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析(体系：35％乙腈/水(含0.1％ TFA))：tR＝8.9min；质谱(FAB-MS)[M+H]+：m/z 586，与计算值：586相一致。
实施例3：化合物d(Tyr-D-Pro-Phe-Ala-NHCH(CH3)Ph，酪氨酰-D型-脯氨酰苯丙氨酰丙氨酰-L-α-甲基苄胺)的合成
实施例3中化合物vii(Z-Tyr-D-Pro)的合成见实施例1；实施例3中化合物xii(Phe-Ala-NHCH(CH3)Ph)的合成过程及具体操作与实施例1中化合物viii(Phe-Gly-NHCH(CH3)Ph)类似，只是将实施例1中的原料化合物i(Z-Gly)改为化合物xiii(Z-Ala，N-苄氧羰基丙氨酸)进行反应，得到xii(Phe-Ala-NHCH(CH3)Ph)。
将等摩尔量的化合物vii(Z-Tyr-D-Pro)及HOBt溶于无水DCM/DMF混合溶剂中，冰盐浴冷却搅拌下，缓慢滴加入溶解了等摩尔量DCC的预冷DCM溶液，再室温反应12h后，滤去DCU，得Z-Tyr-D-Pro-OBt溶液。冰盐浴，搅拌，加入1.2倍量已溶于预冷无水DCM的化合物xii(Phe-Ala-NHCH(CH3)Ph)，冰盐浴反应1h，然后恢复至室温反应。约32h后，减压浓缩去DCM，残留物用乙酸乙酯溶解后，依次进行酸洗、饱和NaHCO3洗涤，最后再用NaCl溶液洗至中性，无水硫酸钠干燥，得粗产物。乙酸乙酯重结晶纯化，干燥，得化合物xiv(Z-Tyr-D-Pro-Phe-Ala-NHCH(CH3)Ph)：白色固体，yield＝77.8％，[M+H]+：m/z734，与计算值：734相一致。
将化合物xiv溶于无水甲醇中，加入0.15倍量10％的Pd/C，搅拌，通入氢气氢化，3h后，滤去催化剂，滤液减压浓缩至干(浴温不超过40℃)，得粗肽。采用普通硅胶柱层析(EA∶MeOH∶浓NH3.H2O＝325∶50∶1，v/v)纯化，干燥，得目标纯肽：化合物d(Tyr-D-Pro-Phe-Ala-NHCH(CH3)Ph)，yield＝72.6％；熔点：118-120℃；质谱(FAB-MS)[M+H]+：m/z 600，与计算值：600相一致。
实施例4：化合物b(Tyr-Pro-Phe-Ala-NHCH(CH3)Ph，酪氨酰脯氨酰苯丙氨酰丙氨酰-L-α-甲基苄胺)的合成
实施例4中化合物x(Z-Tyr-Pro-OH)的见实施例2；实施例4中化合物xii(Phe-Ala-NHCH(CH3)Ph)的合成见实施例3。
将等摩尔量的化合物x及HOBt溶于无水DCM/DMF混合溶剂中，冰盐浴冷却搅拌下，缓慢滴加入溶解了等摩尔量DCC的预冷DCM溶液，再室温反应12h后，滤去DCU，得Z-Tyr-Pro-OBt溶液。冰盐浴，搅拌，加入1.2倍量已溶于预冷无水DCM的化合物xii，冰盐浴反应1h，然后恢复至室温反应。约25h后，减压浓缩去DCM，残留物用乙酸乙酯溶解后，依次进行酸洗、饱和NaHCO3洗涤，最后再用NaCl溶液洗至中性，无水硫酸钠干燥，得粗产物，采用硅胶柱层析(PE∶EA∶EtOH＝3∶1∶0.4，v/v)纯化，干燥，得化合物xv(Z-Tyr-Pro-Phe-Ala-NHCH(CH3)Ph)：白色固体，[M+H]+：m/z 734，与计算值：734相一致。
将化合物xv溶于无水甲醇中，加入0.15倍量Pd(OH)2/C(75％)，搅拌，通入氢气氢化，1.5-2.5h后，滤去催化剂，滤液减压浓缩至干(浴温不超过40℃)，得粗肽。采用普通硅胶柱层析(EA∶MeOH∶浓NH3.H2O＝225∶50∶1，v/v)纯化，干燥，得目标纯肽Tyr-Pro-Phe-Ala-NHCH(CH3)Ph：收率79.5％，Rf＝0.39；熔点：133-135℃；RP-HPLC分析(体系：35％乙腈/水(含0.1％ TFA))：tR＝11.5min；质谱(FAB-MS)[M+H]+：m/z 600，与计算值：600相一致。
实施例5 内吗啡肽-2类似物a～d的镇痛效应测试
1>实验方法与条件：
按Vida(1974)等的方法进行。采用小白鼠热板法。雄性昆明系小鼠，体重20±2g，随机分组进行试验。试验环境温度20±0.5℃，热板温度恒温在53±0.5℃，小鼠舔后跖为镇痛潜伏期终点，截止时间(cut-off value，T2)为45秒，以避免烫伤。加药前小鼠舔后跖的潜伏期(基础痛阈)为10～18S(T0)，过于敏感和过于迟钝的小鼠弃之不用。侧脑室注射给药(i.c.v)，注射方法：在两耳连线和两眼连线之间，正中线右偏2mm，针头成45度角刺入。一般选用4号钢针，在针上套有一段塑料管，使针头刚好露出1～2mm，这样不至于使针插入脑室过深，以防破坏脑组织。每次注射体积4.0μl；Nx拮抗组先注射Nx(2mg.kg-1，i.p)，注射体积100μl，10min后再注射药物。给药后测定舔后跖的潜伏期(T1)：前30min内每5min测一次，30-60min内每10min测一次。结果以MPE％(Maximal possible effect，最大可能效应)表示：
MPE/％＝[(T1-T0)/(T2-T0)]×100
2>实验结果：
本发明的化合物a～d在中枢系统均产生强效的镇痛效应，其ED50＜110nmol·kg-1，为强效的镇痛剂；化合物a、b的镇痛作用是由阿片受体介导的，化合物c、d的镇痛作用不是由经典的阿片受体介导的；从时间效应曲线可以看出(图2，图3)，EMs及其类似物出现最大镇痛效应的时间并无明显差异(P＞0.05)，但在较高镇痛效应水平上的保持时间有明显差异。C-末端为-GlyNGCH(CH3)Ph4的EM-2类似物其在较高镇痛效应水平保持时间均大于EMs及其他类似物，特别是化合物C，显著大于EMs及其他类似物，表明其镇痛效应具有独到的优势。(见表1，图1，图2，图3，图4)
表1，EM-1、EM-2、吗啡及化合物a、b、c、d的镇痛效应；n＝8～12
| 药物 | ED50/nmol·kg-1 | 纳络酮(2mg.kg-1)拮抗否 | 持续时间/分 |
| 吗啡EM-1EM-2化合物a化合物b化合物c化合物d | 33.2122.7236.02109.9181.2391.4040.06 | 是是是是是否否 | 50203030303030 |
实施例6 内吗啡肽-2类似物a～d的阿片受体结合性质研究—离体器官生物检定实验
1>实验方法与条件
i>MVD(小鼠输精管)离体器官生物检定实验：
按文献[徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学.第三版.北京：人民卫生出版社，2002.]方法进行。昆明系小鼠，雄性，体重30-35g雄性昆明系小白鼠，颈椎脱臼处死，剖腹取出两侧输精管，浸入持续通入95％ O2和5％ CO2混合气的Krebs液I中，将附着在其上的脂肪及血管剥离干净。剪去输精管的一端，用小棉花球轻轻地从末端向开口端压出管内的精液，变成一条空心管，然后用零号丝线将其一端缚在玻璃电极的小钩上，另一端缚在JZ-100型肌肉张力传感器上，制备好后立即放入盛有持续通入95％ O2和5％ CO2混合气的Krebs液I(g·L-1，NaCl 6.9，CaCl20.28，KCl 0.35，KH2PO4 0.16，NaHCO3 2.1，葡萄糖1.98)、恒温37.0±0.5℃的麦氏玻璃浴管中，预负荷250mg。前30min每5min换一次营养液，以后每15min换液一次，平衡2h后开始实验。对样本给予电刺激(刺激参数：电压50V，频率6次/min，波宽2-3ms。实验前先给予一定量的吗啡检测样品的敏感度，对吗啡过于敏感或过于迟钝的样品舍去)，记录基础收缩强度，平行记录两次；然后分别给予不同剂量的待试药物，孵育6分钟后，再给予同样强度的电刺激，记录收缩强度，计算抑制百分率；Nx拮抗实验组：需提前10分钟加入一定浓度的Nx，再加入待试药物，其余步骤相同。每次药物作用后，用营养液冲洗5次，平衡15min，再次给药品。最后再给予吗啡鉴定活性。
ii>GPI(豚鼠回肠)离体器官生物检定实验
按文献[徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学.第三版.北京：人民卫生出版社，2002.]进行。体重为300-400g豚鼠，雌雄不限，禁食12小时后进行实验，饮水不限。棒击枕部处死，剖腹取出近盲肠端的回肠6cm两段，浸入持续通入95％ O2和5％ CO2混合气的Krebs液II中，湿润后套在一根玻璃棒上，沿回肠壁的一根纵形血管，将纵行肌与环形肌分离，然后用零号丝线将纵行肌的一端缚在玻璃电极的小钩上，另一端缚在JZ-100型肌肉张力传感器上，制备好后立即放入盛有持续通入95％ O2和5％ CO2混合气的Krebs液II(g.L-1，NaCl6.9，CaCl2 0.28，KCl 0.35，KH2PO4 0.16，MgSO4·7H2O 0.30，NaHCO3 2.1，六烃季铵25×10-3，苯海拉明50×10-6，氯化胆碱2.8×10-3，葡萄糖1.98)、恒温37.0±0.5℃的麦氏玻璃浴管中，预负荷1g。前30min每5min换一次营养液，以后每15min换液一次，平衡2h后开始实验。对样本给予电刺激(刺激参数：电压50V，频率6次/min，波宽2-3ms。实验前先给予一定量的吗啡检测样品的敏感度，对吗啡过于敏感或过于迟钝的样品舍去)，记录基础收缩强度，平行记录两次；然后分别给予不同剂量的待试药物，孵育6分钟后，再给予同样强度的电刺激，记录收缩强度，计算抑制百分率；Nx拮抗实验组：需提前10分钟加入一定浓度的Nx，再加入待试药物，其余步骤相同。每次药物作用后，用营养液冲洗5次，平衡15min，再次给药品。最后再给予吗啡鉴定活性。
MVD和GPI结果用抑制率表示：抑制率＝(基础收缩值-给药后的收缩值)/基础收缩值×100％。也可用IC50值表示。
2>实验结果：
结果表明：化合物c、d几乎无μ/δ阿片受体的激动活性；化合物a、b仅具有较弱的μ/δ阿片受体的激动活性，其在GPI/MVD中的激动活性大小均为EMs＞morphine＞a＞b，且可分别被50nmol·L-1和10nmol·L-1的Nx完全逆转，这表明化合物a、b具阿片样作用。(见表2)。
表2，EM-1、EM-2、吗啡及化合物a、b、c、d的阿片活性*
| 药物 | GPI | MVD | 效能比(potency ratio)GPI/MVD | ||
| IC50(nM) | **Nx(10nM)拮抗否 | IC50(nM) | **Nx(50nM)拮抗否 | ||
| EM-1EM-2化合物a化合物b化合物c化合物d吗啡 | 8.85±0.454.23±0.231087±863157±279＞1000000＞1000000141.4±24.3 | 是是是是//是 | 20.42±1.9024.55±1.651637±1303388±478＞10000＞1000000190.5±27.3 | 是是是是//是 | 0.430.170.660.93//0.74 |
*n＝8～12；
x±SEM，**P＜0.01
实施例7 内吗啡肽-2类似物a～d对心血管系统的影响—大鼠平均动脉压实验
按文献[徐叔云等.药理实验方法学.第三版.北京：人民卫生出版社，2002；Thorat s等，J.Pharmac.Exp.Ther.1997，283，1185-1192.]进行。采用插管法，静脉给药。雄性Wistar大鼠，体重250-300g，用20％氨基甲酸乙酯(1.0-1.2g.kg-1，ip)麻醉。背位固定于手术台上，少量生理盐水湿润颈部的毛并剪去，以便手术操作。割开颈部皮肤，分离气管，作气管插管，自主呼吸；分离左侧颈外静脉，插入充满1000u.L-1肝素钠生理盐水的导管供给药用；分离右侧颈总动脉，在远心端结扎动脉，在近心端夹上动脉夹，用眼科镊子轻轻地挑起动脉，沿动脉壁用眼科剪刀剪一三角口，插入动脉插管。动脉插管经YP-1型压力换能器与RM6240B生理实验系统相连。结扎好后，打开动脉夹，记录平均动脉压。手术结束后待动物平均动脉压稳定30～60min，再开始实验。整个实验过程肛温稳定在37.0±0.5℃。注射体积100μl，注射时间10-15s。Nx拮抗组提前10min注射Nx(2mg.kg-1，iv)。每次给药后，动物血压恢复稳定30min后再行下次给药。
结果表明：通过EMs及各类似物的剂量效应曲线及高剂量时对麻醉大鼠平均动脉压的影响比较，表明：化合物a对麻醉大鼠平均动脉压变化不产生影响(P＞0.05 vs control)，化合物b在高剂量时仅有微弱的降血压作用(见图5，图6)。
Claims (5)
1、如下式的一类内吗啡肽-2的类似物：化合物a、化合物b、化合物c及化合物d：
a Tyr-Pro-Phe-Gly-NHCH(CH3)Ph b Tyr-Pro-Phe-Ala-NHCH(CH3)Ph
c Tyr-D-Pro-Phe-Gly-NHCH(CH3)Ph d Tyr-D-Pro-Phe-Ala-NHCH(CH3)Ph
其结构特征为：内吗啡肽-2的4-位的-苯丙酰胺(-PheNH2)被-丙氨酰-L-α-甲基苄胺(-AlaNHCH(CH3)Ph)或-甘氨酰-L-α-甲基苄胺(-GlyNHCH(CH3)Ph)所取代；或内吗啡肽-2的2-位L-脯氨酸(L-Pro)被D-脯氨酸(D-Pro)所取代，而同时4-位的-PheNH2被-丙氨酰-L-α-甲基苄胺或-甘氨酰-L-α-甲基苄胺所取代。
2、一种根据权利要求1所述的内吗啡肽-2类似物a～d的制备方法，其特征是：以Z-Tyr-Pro-OH(苄氧羰基酪氨酰脯氨酸)或Z-Tyr-D-Pro-OH(苄氧羰基酪氨酰-D型-脯氨酸)为第I片段，以Z-Phe-Ala-NHCH(CH3)Ph(苄氧羰基苯丙氨酰丙氨酰-L-α-甲基苄胺)或Z-Phe-Gly-NHCH(CH3)Ph(苄氧羰基苯丙氨酰甘氨酰-L-α-甲基苄胺)作为第II片段；在采用最小保护的策略下，对氨基酸的N-端采用Z-保护，而C-端则采用简单Na+盐保护或不保护的策略；保护基的脱除分别采用钯碳(Pd/C)或氢氧化钯(Pd(OH)2/C)催化氢化，或者盐酸酸解进行；片段I、II的合成采用DCC-HOSu(二环己基碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺)或DCC-HOBt(二环己基碳二亚胺/1-羟基苯骈三氮唑)法进行，而片段之间的偶联则采用DCC-HOBt法进行。
3、根据权利要求2所述的内吗啡肽-2类似物a～d的制备方法，其特征是：由N-苄氧羰基酪氨酸(Z-Tyr)与D-Pro-OH或L-Pro-OH采用DCC-HOSu法缩合得片段I，即化合物x(Z-Tyr-Pro-OH)或化合物vii(Z-Tyr-D-Pro)；由化合物i(Z-Gly，N-苄氧羰基甘氨酸)或化合物xiii(Z-Ala，N-苄氧羰基丙氨酸)与L-(-)α-甲基苄胺采用DCC-DMAP(二环己基碳二亚胺/4-二甲基氨基吡啶)法缩合得到化合物ii(Z-Gly-NHCH(CH3)Ph，苄氧羰基甘氨酰-L-α-甲基苄胺)或化合物Z-Ala-NHCH(CH3)Ph(苄氧羰基丙氨酰-L-α-甲基苄胺)，再经Pd/C催化氢化脱保护得化合物iii(H2N-Gly-NHCH(CH3)Ph，甘氨酰-L-α-甲基苄胺)及H2N-Ala-NHCH(CH3)Ph(丙氨酰-L-α-甲基苄胺)；化合物iv(Z-Phe，N-苄氧羰基苯丙氨酸)与化合物iii(H2N-Gly-NHCH(CH3)Ph)或化合物H2N-Ala-NHCH(CH3)Ph采用DCC-HOBt法缩合，得化合物V(Z-Phe-Gly-NHCH(CH3)Ph，苄氧羰基苯丙氨酰甘氨酰-L-α-甲基苄胺)，或化合物Z-Phe-Ala-NHCH(CH3)Ph(苄氧羰基苯丙氨酰甘氨酰-L-α-甲基苄胺)；进一步Pd/C催化氢化脱Z-保护，得化合物viii(Phe-Gly-NHCH(CH3)Ph，苯丙氨酰甘氨酰-L-α-甲基苄胺)或化合物xii(Phe-Ala-NHCH(CH3)Ph，苯丙氨酰丙氨酰-L-α-甲基苄胺)；化合物x(Z-Tyr-Pro-OH)或化合物vii(Z-Tyr-D-Pro)与化合物viii(Phe-Gly-NHCH(CH3)Ph)或化合物xii(Phe-Ala-NHCH(CH3)Ph)采用DCC-HOBt法缩合，得化合物ix(Z-Tyr-D-Pro-Phe-Gly-NHCH(CH3)Ph，苄氧羰基酪氨酰-D型-脯氨酰苯丙氨酰甘氨酰-L-α-甲基苄胺)，或化合物xi(Z-Tyr-Pro-Phe-Gly-NHCH(CH3)Ph，苄氧羰基酪氨酰脯氨酰苯丙氨酰甘氨酰-L-α-甲基苄胺)，或化合物xiv(Z-Tyr-D-Pro-Phe-Ala-NHCH(CH3)Ph，苄氧羰基酪氨酰-D型-脯氨酰苯丙氨酰丙氨酰-L-α-甲基苄胺)，化合物xv(Z-Tyr-Pro-Phe-Ala-NHCH(CH3)Ph，苄氧羰基酪氨酰脯氨酰苯丙氨酰丙氨酰-L-α-甲基苄胺)；进一步，化合物ix、化合物xiv采用Pd/C催化氢化脱Z-保护，化合物xi、化合物xv采用Pd(OH)2/C催化氢化脱Z-保护，分别获得目标肽内吗啡肽-2类似物a～d。
4、据权利要求2、3任一项所述内吗啡肽-2类似物a～d的制备方法，其特征是：化合物ii(Z-Gly-NHCH(CH3)Ph)采用乙酸乙酯(EA)/石油醚(PE)重结晶纯化，化合物Z-Ala-NHCH(CH3)Ph采用EA重结晶纯化；化合物v(Z-Phe-Gly-NHCH(CH3)Ph)采用EA/PE重结晶纯化，化合物Z-Phe-Ala-NHCH(CH3)Ph采用EA析晶法纯化；化合物x采用低温石油醚结晶纯化，化合物vii(Z-Tyr-D-Pro)采用以乙酸乙酯、甲醇、冰醋酸混合溶剂为层析体系的硅胶柱层析纯化；化合物ix、化合物xi、化合物xv采用以石油醚、乙酸乙酯、乙醇混合溶剂为层析体系的硅胶柱层析纯化，化合物xiv采用乙酸乙酯重结晶纯化；各终产物目标肽采用硅胶柱层析(层析体系：EA∶MeOH∶浓NH3.H2O)纯化，干燥，得目标纯肽：化合物a～d。
5、一种根据权利要求1所述的内吗啡肽-2类似物a～d的镇痛药理功效及其他药理活性。
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