CN102477082A - 一种液相合成法合成卡贝缩宫素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种卡贝缩宫素的合成方法，该方法先分别合成中间体I：4-Bromobutyryl-Tyr(me)-Ile-OH、中间体II：H-Gln(trt)-Asn(trt)-Cys(trt)-ome和中间体III：H-Pro-Leu-Gly-NH2，中间体I、中间体II和中间体III在溶剂中，缩合剂存在下缩合成未成环产品IV，最后在碱性条件下加入催化剂环化，得到卡贝缩宫素。本发明液相合成缩宫素的方法得率85％以上，产品纯度80％以上，杂质易于去除，具有显著的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种多肽药物的合成方法，尤其涉及卡贝缩宫素的合成方法。
背景技术
产后出血是全球孕妇患病和死亡的最主要原因，每年导致125,000名孕妇死亡及2,000万名妇女患病，也是目前中国孕产妇死亡的首位原因，其发病率占分娩总数的2％～3％(徐玲等，《实用医学杂志》，2007年第23卷第18期，2940～2941)。近年来随着剖宫产率上升，手术并发症越来越被重视，剖宫产术产后出血率高达19.8％(高素云等，《世界中西医结合杂志》，2009年第4卷第9期，665～666)。
引起产后出血的主要原因为宫缩乏力，占70％～80％(徐玲等，《实用医学杂志》，2007年第23卷第18期，2940～2941)。降低发病率及病死率的关键在于及早预防产后子宫收缩乏力性出血。剖宫产手术中由于宫缩乏力、子宫切口撕裂损伤宫旁血管丛、胎盘粘连或植入、凝血功能异常等导致大出血，是剖宫产手术最危险的并发症，如何有效控制术中出血量是产科医生面临的问题(于爱芳，《实用临床医药杂志》，2009年第13卷第9期，82～83)。
目前产后出血的治疗方法有：按摩子宫，子宫收缩药物的应用，如缩宫素、麦角新碱、米索、卡孕栓，以及宫腔纱条填塞法，但有时效果不佳，需给予结扎或栓塞子宫动脉或髂内动脉，甚至子宫次全切或子宫切除术(徐玲等，《实用医学杂志》，2007年第23卷第18期，2940～2941)。缩宫素又名催产素，是最古老、临床使用最广泛的促宫缩剂，但其半衰期仅4～10min，体内作用时间短，需持续静滴或多次重复给药。当体内缩宫素受体位点饱和后，增加药量不再产生促宫缩作用，收缩子宫下段作用不明显，大量使用可致水中毒(于爱芳，《实用临床医药杂志》，2009年第13卷第9期，82～83)，部分患者对缩宫素不敏感，效果较差。
子宫肌瘤是女性生殖器官肿瘤中最常见的良性肿瘤，全子宫切除是传统的手术方式。腹腔镜技术是近年发展的微创治疗手段，可为女性保留子宫，但由于子宫的血流丰富，出血多仍是限制其应用的关键，甚至导致中转开腹。常用的促进子宫平滑肌收缩的方法是在子宫肌层注射催产素，有时术中需补充静脉滴注催产素，但收效甚微(沈怡等，《中国妇幼保健》，2010年第25卷，414～416)。
卡贝缩宫素(Carbetocin)，即[1-脱氨基-1-单羟基(2-氧-甲基酪氨酸)]催产素，是近年来新兴的长效催产素受体激动剂，是一种人工合成的缩宫素类似物，具有起效迅速、作用强效持久、使用便捷等特点，适合抢救用药。临床通常静脉给药，静脉注射后2分钟即产生促宫缩作用，对子宫体及子宫下段均有强烈收缩作用，半衰期40～50分钟，是缩宫素的10倍。静推后作用可持续60～120分钟(于爱芳，《实用临床医药杂志》，2009年第13卷第9期，82～83)。卡贝缩宫素可以在体内引起与天然激素相似的生理活性，使子宫收缩同步化、规律化和收缩增强并且延长收缩时间。在预防产后出血方面得到了一定范围的应用并收到了良好的效果(沈怡等，《中国妇幼保健》，2010年第25卷，414～416)。在高危病例预防性用药效果更好，明显降低产后出血，减少术后发病率，是更好的用药模式。产后静脉滴注缩宫素的同时静脉注射或子宫肌层、臀部肌内注射卡贝缩宫素可更有效预防产后出血，且无明显不良反应，值得基层医院推广(黄淑华等，《临床合理用药》，2010年5月第3卷第9期，83～84)。
无论是腹腔镜下子宫肌瘤剔除术还是开腹子宫肌瘤剔除术术中应用卡贝缩宫素均可有效促进子宫收缩，减少术中出血量(沈怡等，《中国妇幼保健》，2010年第25卷，414～416)。
徐玲等的研究表明卡贝缩宫素用于预防及治疗产后出血具有显著疗效，产后出血的发生率及产后2、24小时平均出血量均明显少于对照组，治疗性用药组93％有效(徐玲等，《实用医学杂志》，2007年第23卷第18期，2940～2941)。高素云等进行了一项比较缩宫素和卡贝缩宫素治疗效果的临床研究，对照组16例有效，无效7例；治疗组20例有效，无效2例。观察组产后出血发生率、术中及产后24小时出血量均明显优于对照组。卡贝缩宫素用于预防及治疗产后出血有显著疗效(高素云等，《世界中西医结合杂志》，2009年第4卷第9期，665～666)。郑涛等进行了一项卡贝缩宫素预防妊娠合并子宫肌瘤剖宫产后出血的随机对照临床研究，结果显示卡贝缩宫素能加强和保持合并子宫肌瘤的妊娠子宫的收缩，减少产后出血，可选择做为预防产后出血的一种新的药物治疗措施(郑涛等，《中国新药与临床杂志》，2009年12月，第28卷第12期，925～928)。王静芳比较了卡贝缩宫素和缩宫素预防妇女剖宫产术后出血的效果，卡贝缩宫素组产妇术中、产后2小时、产后24小时出血量均显著小于缩宫素组；缩宫素组产后出血发生率为12％，卡贝缩宫素组产后出血发生率为4％，卡贝缩宫素组产后出血的发生率低于缩宫素组(王静芳，《实用医技杂志》，2010年1月第17卷第1期，52～53)。然而由于价格贵，卡贝缩宫素目前还没有常规用药(于爱芳，《实用临床医药杂志》，2009年第13卷第9期，82～83)。
临床试验中静脉注射卡贝缩宫素后常发生(10-40％)的是恶心、腹疼、瘙痒、面红、呕吐、热感、低血压、头痛和震颤，不常发生(1-5％)的不良事件包括背疼、头晕、金属味、贫血、出汗、胸痛、呼吸困难、寒战、心动过速和焦虑。这些不良事件发生的形式和频率都与硬膜外或腰麻下进行剖腹产术后给予催产素时观察到的相同。
另外卡贝缩宫素和催产素一样也可用于动、植物养殖，提高动物的受胎率和繁殖率，也可以作为促乳剂，提高动物的产奶量，用于果树起到催熟作用。
能够人工大量合成卡贝缩宫素，满足临床预防和治疗产后出血的需要具有重大意义，也利于拓展其在其他领域的用途。
专利ES2115543A1公开了一种卡贝缩宫素的制备方法(Process for obtaining carbetocinand its pharmaceutically acceptable addition salts or complexes)，包括：1)合成主肽链结构，N末端氨基与4-氯丁酸连接，2)半胱氨酸巯基脱保护基团，同时断开多肽链与树脂的连接，3)碱性条件下通过巯基的亲核进攻反应形成成硫醚键进行分子内的环化。利用多肽固相合成法的HOBt/DIC体系获得4-chlorobutyl-Tyr(OMe)-Ile-Gln-Asn-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-PAL-Nle-pMBHA，然后裂解得到线性肽，4-chlorobutyl-Tyr(OMe)-Ile-Gln-Asn-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-NH2，再采用NaOH、LiOH、NaHCO3、DIEA、DMAP等碱性试剂环化得到卡贝缩宫素。
专利CS8605461公开了一种卡贝缩宫素的合成方法，利用多肽固相合成法合成Z-Ile-Gln-Asn-Cys(Bzl)-Pro-Leu-Gly-NH2线性肽，氢化得到Ile-Gln-Asn-Cys(Bzl)-Pro-Leu-Gly-NH2，再和BrCH2CH2CH2COOH反应使半胱氨酸的巯基形成硫醚键，最后与X-Tyr(OMe)-OH反应、脱保护得到卡贝缩宫素。
中国专利(申请号：200910106889.0)公开了一种固相合成卡贝缩宫素的方法，包括以下步骤：由Fmoc-Gly-OH和替代度为0.2mmol/g～0.9mmol/g的氨基树脂反应得到Fmoc-Gly-氨基树脂；通过固相合成法依次连接具有Fmoc保护基团的氨基酸，得到卡贝缩宫素前体肽I-氨基树脂，脱掉半胱氨酸侧链保护基，得到卡贝缩宫素前体肽II-氨基树脂；在溶剂中，加入有机碱，氯化锂，环化，得到卡贝缩宫素-氨基树脂；裂解，得到卡贝缩宫素粗肽；纯化、冻干得到卡贝缩宫素。
以上专利公开的方法都使用多肽的固相合成技术，即将氨基酸逐一连接到树脂上。虽然多肽固相合成法经过不断改进和完善，已经能够合成很多具有生物活性的多肽，但是其本身还是存在着很多问题：
1、合成所需时间较长：多肽固相合成的速率虽有了很大的提高，但是相对其它合成方式(如生物合成法)来说，链的合成速率仍然很慢，每结合上一个氨基酸需要20～120分钟，平均一个九肽的合成需要5h以上。
2、合成的效率和纯度低、成本高：即使是30个氨基酸以内的小肽固相合成，富含二硫键和碱性氨基酸残基的多肽合成仍比较困难，相当一部分多肽还不能成功合成。随着氨基酸数量的增加，合成效率逐步下降，非目的肽含量逐步增长，目的肽的纯度逐步降低，后续的纯化愈加困难。合成多肽的树脂和保护氨基酸等原料昂贵，致使多肽合成的成本很高，还不能完全满足作为药物商业化生产的要求。
3、合成试剂的毒性大：进行多肽合成的试剂，其毒性很大，如DCM、DMF、哌啶等这些有机化学试剂，在成为废液后都需要报环保局进行处理。虽然有些仪器能提供合成过程全封闭进行，但其排出的废气废液等，还是对环境有污染，不能保证百分百安全。而那些不是全封闭进行的合成反应，有毒试剂对环境的危害则更大。
V.Sanz-Nebot等采用液质联用技术分析了固相合成法合成的卡贝缩宫素粗品中杂质的情况(V.Sanz-Nebot，I.Toro，A.Garce′s and J.Barbosa，Separation and Identification of PeptideMixtures in a Synthesis Crude of Carbetocin by Liquid Chromatography/Electrospray IonizationMass Spectrometry，Rapid Commun.Mass Spectrom.1999，13：2341-2347)，分析使用KromasilC8柱(BC Aplicaciones Anali′ticas，S.A.，Barcelona，Spain)，乙腈浓度24％～30％，结果见表一，卡贝缩宫素含量4.64％～21.57％，其中24％乙腈浓度分析结果见附图一，目标产物卡贝缩宫素的纯度低。
表一、LC/ES-MS鉴别合成卡贝缩宫素中的杂质肽
可见固相合成法合成的卡贝缩宫素纯度低，时间长，后续纯化工艺难度大，收率低，成本高，本领域迫切需要开发一种简单易行，收率高，时间短的卡贝缩宫素合成方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种简单易行，收率高，时间短、易于大量合成的卡贝缩宫素的液相合成方法。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种卡贝缩宫素的合成方法，包括以下步骤：
(1)、合成中间体I：4-Bromobutyryl-Tyr(me)-Ile-OH；
(2)、合成中间体II：H-Gln(trt)-Asn(trt)-Cys(trt)-ome；
(3)、合成中间体III：H-Pro-Leu-Gly-NH2；
(4)、中间体I、中间体II和中间体III在溶剂中，缩合剂存在下缩合，合成中间体IV：Butyryl-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2；
(5)、中间体IV在碱性条件下加入催化剂环化，得到卡贝缩宫素。
采用以下方法合成中间体I：Boc-Tyr(me)-OH与H-Ile.ome.Hcl按0.5∶1～1∶0.5的比例混合于溶剂中，调节pH，加入偶联剂和缩合剂缩合，产物提纯后脱保护，再提纯后加入0.5～2倍摩尔量的4-溴丁酸，缩合，产物进一步在碱性条件下脱保护得到中间体I。
其中溶剂为DMF、THF或二氧六环，pH调节剂为NMM、DIEA或TMP，偶联剂为PyBOP/HOBT、HOBT/TBTU、HOAT/TATU或HATU/HOAT，活化剂为DIC、DCC、EDCI或CDI，脱保护剂为50％(V/V)TFA/DCM或HCl/MeOH；氢氧化锂或氢氧化钠。
采用以下方法合成中间体II：溶剂中Fmoc-Asn(trt)-OH脱保护剂脱保护，按0.5∶1～1∶0.5的摩尔比与Fmoc-Gln(trt)-OH混合，加入偶联剂，pH调节剂，在pH 7～8缩合剂存在下缩合，产物提纯后加入H-Cys(trt).ome.Hcl在溶剂中加入偶联剂，pH调节剂，缩合剂缩合，产物进一步提纯后脱保护得到中间体II。
其中溶剂为DMF、THF或二氧六环，pH调节剂为NMM、DIEA或TMP，偶联剂为PyBOP/HOBT、HOBT/TBTU、HOAT/TATU或HATU/HOAT，活化剂为DIC、DCC、EDCI或CDI，脱保护剂为二乙胺、三乙胺、吡啶或六氢吡啶。
采用以下方法合成中间体III：Boc-Pro-OH和H-Leu.ome.Hcl按0.5∶1～1∶0.5的比例混合于溶剂中，调节pH，加入偶联剂和缩合剂缩合，产物提纯后脱保护，再提纯后加入0.5～2倍摩尔量的入H-Gly-NH2.Hcl，缩合，产物进一步在碱性条件下脱保护得到中间体III。
其中溶剂为DMF、THF或二氧六环，pH调节剂为NMM、DIEA或TMP，偶联剂为PyBOP/HOBT、HOBT/TBTU、HOAT/TATU或HATU/HOAT，活化剂为DIC、DCC、EDCI或CDI，脱保护剂为50％(V/V)TFA/DCM或HCl/MeOH；二乙胺或三乙胺或吡啶或六氢吡啶。
采用以下方法合成中间体IV：中间体I和中间体II按0.5∶1～1∶0.5的比例混合于溶剂中，调节pH，加入偶联剂和缩合剂缩合，产物提纯后脱保护，再提纯后加入0.5～2倍摩尔量的合成中间体III，缩合，产物进一步在切割液中脱保护得到中间体IV。
其中溶剂为DMF、THF或二氧六环，pH调节剂为NMM、DIEA或TMP，偶联剂为PyBOP/HOBT、HOBT/TBTU、HOAT/TATU或HATU/HOAT，活化剂为DIC、DCC、EDCI或CDI，脱保护剂为氢氧化锂或氢氧化钠。切割液为TFA/三异丙基硅烷/H2O、TFA/三氟甲磺酸/苯甲硫醚或TFA/三氟甲磺酸硅烷脂/苯甲硫醚。
步骤(5)在溶剂中，加入有机碱，在催化剂存在下反应3-8小时，得到卡贝缩宫素，其中溶剂为DMF或N-甲基吡咯烷酮，有机碱为NMM、DIPEA或TMP，催化剂为氯化锂或二氮杂二环，优选的反应时间为4～5小时。
本发明液相合成缩宫素的得率85％以上，产品纯度80％以上，与固相合成法相比，优点主要有：
1、液相合成的理论和技术都已经很熟：
2、原料在合成过程中经历的步骤少，利用率高。固相合成法由于是氨基酸一个接一个连接到肽链上，每步反应的得率是有限的，到后面的氨基酸合成效率已经很低，对后面投入的原料的利用率也相应降低；
3、液相合成法可以在合成过程中检测产物的纯度，可以用重结晶和层析的方法得到纯度满足要求的多肤产品，固相合成法的杂质可能是比产物少1个、2个、3个或多个氨基酸的产物，其性质与产物非常接近，给后续的分离纯化带来很大的不便，而本法和成的产物杂质与产物相差氨基酸至少在3个以上，最主要的杂质也是3肽，后续提纯比较容易。
4、液相合成是大量多肽合成的优先选择，尤其是工业化生产所需要的千克级量时的选择。
本发明合成卡贝缩宫素的方法与固相合成法相比，与产品比较接近的少一个或者两个氨基酸的杂质少，产品纯度高。杂质和产品相比氨基酸差异大，因此后续分离纯化容易，适合产业化。
本发明的中间体是产品的部分片断，可以分别同时合成，与固相合成逐一增加氨基酸合成的产品相比，时间大大缩短，而且通过控制中间体保证了产品的收率和纯度。
附图说明
1、图1为固相合成法合成的卡贝缩宫素的RP-HPLC的分析流动相乙腈浓度24％。
2、图2为卡贝缩宫素工艺合成流程图。
3、图3为本发明合成的卡贝缩宫素的RP-HPLC分析。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步说明本发明，但实施例不能理解为是对本发明保护范围的限制，本领域技术人员根据本发明内容所做的非本质性的改变仍属于本发明的保护范围。
为了更好地理解本发明，申请文件中说使用的缩写的含义在此一并说明：
Boc-Tyr(me)-OH N-叔丁氧羰基-4-甲氧基-L-苯丙氨酸
H-Ile.ome.Hcl L-异亮氨酸甲酯盐酸盐
4-Bromobutyric acid 4-溴丁酸
Fmoc-Gln(trt)-OH N-(9-芴甲氧羰基)-N-三苯甲基-L-谷氨酰胺
Fmoc-Asn(trt)-OH N-(9-芴甲氧羰基)-N-甲苯磺酰基-L-天冬酰胺
H-Cys(trt).ome.Hcl L-半胱氨酸甲酯盐酸盐
Boc-Pro-OH N-叔丁氧基羰基-L-脯氨酸
H-Leu.ome.Hcl L-亮氨酸甲酯盐酸盐
H-Gly-NH2.Hcl 甘氨酰胺盐酸盐
DMF N，N-二甲基甲酰胺
HOBT N-羟基苯骈三氮唑
NMM N-甲基吗啡啉
DIEA 二异丙基乙胺
TMP 甲氧芐氨嘧啶
PyBOP N，N′-羰基二咪唑
TBTU O-(IH-苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基异脲四氟化硼
HOAT 1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑
TATU 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯
HATU 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟
DIC N，N′-二异丙基碳二酰亚胺
EDCI 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐
CDI N，N′-羰基二咪唑
DCC N，N’-2-二环己基碳二亚氨
BOP 苯并三唑-1-三(三甲氨基)-六氟磷酸酯
DCM 二氯甲烷
Boc- 叔丁氧羰基
Tos- 对甲基苯磺酰基
-Obzl 苄氧基
THF 四氢呋喃
TFA 三氟乙酸
合成工艺流程图见附图二。
实施例一4-Bromobutyryl-Tyr(me)-Ile-OH的合成
向250ml圆底烧瓶中依次加入1.48g Boc-Tyr(me)-OH(5mmol)和在磁力搅拌下能使基本溶解的适量DMF，另取0.91g H-Ile.ome.Hcl(5mmol)和0.68gHOBT(5mmol)加入少量DMF中，再加入2倍摩尔数NMM后一并加入烧瓶中，继续调pH到7至8，加入1.03g DCC(5mmol)搅拌反应，TLC跟踪监测反应完成情况。12h后停止搅拌，TLC检测，反应不完全加入BOP继续反应2小时，室温静置。抽滤(滤去不溶物DCU)，滤液用乙酸乙酯和水用分液漏斗萃取，上层为产品，下层用乙酸乙酯再萃取两遍，合并乙酸乙酯层，酸碱洗涤，无水Na2SO4干燥5h，减压浓缩至干得1.88g固体，收率89.0％。直接加入20ml50％(V/V)三氟乙酸的二氯甲烷溶液，TLC跟踪检测反应，室温下，磁力搅拌30min，减压蒸干，加入适量乙酸乙酯，旋摇，析出胶状白色沉淀。用少量乙酸乙酯洗涤沉淀两次，浓缩干后得到白色固体1.35g，收率95.0％。再加入0.84g4-溴丁酸(5mmol)，0.68g HOBT(5mmol)，1.03g DCC(5mmol)，适量DMF完全溶解，NMM调碱，TLC跟踪监测反应完成情况。12h后停止搅拌，TLC检测，室温静置。抽滤(滤去不溶物DCU)，滤液用乙酸乙酯和水用分液漏斗萃取，上层为产品，下层用乙酸乙酯再萃取两遍，合并乙酸乙酯层，酸碱洗涤，无水Na2SO4干燥5h，减压浓缩至干得固体1.8g，收率91.0％。用甲醇溶解加入少量四氢呋喃，滴加饱和的氢氧化锂水溶液到pH＝13，当pH恒定在13后再反应2小时，反应完全后将反应液倒入分液漏斗内加石油醚洗涤2次，下层液体为产品。在产品内加入柠檬酸固体，加入的柠檬酸量为加到产品的pH值到3-4。再将加过柠檬酸的产品倒入分液漏斗内用乙酸乙酯萃取产物，乙酸乙酯用饱和的NaCl溶液洗涤3次，上层液体为产品，将产品倒入干燥的烧杯用Na2SO4干燥2小时，干燥后将液体浓缩得到固体产品中间体I 1.65g，收率95％。
实施例二H-Gln(trt)-Asn(trt)-Cys(trt)-ome的合成
将3g Fmoc-Asn(trt)-OH(5mmol)用10ml二氯甲烷溶解，加入7ml二乙胺反应2小时，2小时后点板，反应完全后直接浓缩得到固体1.8g，收率98％。在磁力搅拌下能使基本溶解的适量DMF，另取3g Fmoc-Gln(trt)-OH(5mmol)和0.68g HOBT(5mmol)加入少量DMF中再加入N-甲基吗啡啉(NMM)调pH到7至8，加入1.03g DCC(5mmol)搅拌反应，TLC跟踪监测反应完成情况。12h后停止搅拌，TLC检测，反应不完全加入BOP继续反应2小时，室温静置。抽滤(滤去不溶物DCU)，滤液用乙酸乙酯和水用分液漏斗萃取，上层为产品，下层用乙酸乙酯再萃取两遍，合并乙酸乙酯层，酸碱洗涤，无水Na2SO4干燥5h，减压浓缩至干得固体4.1g，收率87.0％。加入0.86g H-Cys.ome.Hcl(5mmol)，0.68g HOBT(5mmol)，1.03gDCC(5mmol)，适量DMF完全溶解，NMM调碱，TLC跟踪监测反应完成情况。12h后停止搅拌，TLC检测，室温静置。抽滤(滤去不溶物DCU)，滤液用乙酸乙酯和水用分液漏斗萃取，上层为产品，下层用乙酸乙酯再萃取两遍，合并乙酸乙酯层，酸碱洗涤，无水Na2SO4干燥5h，减压浓缩至干得固体4.1g，收率88.0％。再用15ml二氯甲烷溶解，加入10ml二乙胺反应2小时，2小时后点板，反应完全后直接浓缩得到固体产品中间体II 3.1g，收率96.0％。
实施例三H-Pro-Leu-Gly-NH2的合成
向250ml圆底烧瓶中依次加入1.1g Boc-Pro-OH(5mmol)和在磁力搅拌下能使基本溶解的适量DMF，另取等摩尔0.91g H-Leu.ome.Hcl(5mmol)和0.68g HOBT(5mmol)加入少量DMF中再加入2倍摩尔数N-甲基吗啡啉(NMM)后一并加入烧瓶中，继续调pH到7至8，加入1.03gDCC(5mmol)搅拌反应，TLC跟踪监测反应完成情况。12h后停止搅拌，TLC检测，反应不完全加入BOP继续反应2小时，室温静置。抽滤(滤去不溶物DCU)，滤液用乙酸乙酯和水用分液漏斗萃取，上层为产品，下层用乙酸乙酯再萃取两遍，合并乙酸乙酯层，酸碱洗涤，无水Na2SO4干燥5h，减压浓缩至干得固体1.52g，收率89.0％。将所得产品用甲醇溶解加入少量四氢呋喃，滴加饱和的氢氧化锂水溶液到pH＝13，当pH恒定在13后再反应2小时，反应完全后将反应液倒入分液漏斗内加石油醚洗涤2次，下层液体为产品。在产品内加入柠檬酸固体，加入的柠檬酸量为加到产品的pH值到3-4。再将加过柠檬酸的产品倒入分液漏斗内用乙酸乙酯萃取产物，乙酸乙酯用饱和的NaCl溶液洗涤3次，上层液体为产品，将产品倒入干燥的烧杯用Na2SO4干燥2小时，干燥后将液体浓缩得到固体1.39g，收率95.0％。加入0.55gH-Gly-NH2.Hcl(5mmol)，0.68g HOBT(5mmol)，1.03gDCC(5mmol)，适量DMF完全溶解，NMM调碱，TLC跟踪监测反应完成情况。12h后停止搅拌，TLC检测，室温静置。抽滤(滤去不溶物DCU)，滤液用乙酸乙酯和水用分液漏斗萃取，上层为产品，下层用乙酸乙酯再萃取两遍，合并乙酸乙酯层，酸碱洗涤，无水Na2SO4干燥5h，减压浓缩至干得固体1.42g，收率87.5％。直接加入10ml50％(V/V)三氟乙酸的二氯甲烷溶液，TLC跟踪检测反应，室温下，磁力搅拌30min，减压蒸干，加入适量乙酸乙酯，旋摇，析出胶状白色沉淀。用少量乙酸乙酯洗涤沉淀两次，浓缩干后得到白色固体中间体III1.03g，收率98.0％。
实施例四三个片段缩合及保护基团的切除
向250ml圆底烧瓶中依次加入1.65g中间体I(3.6mmol)和在磁力搅拌下能使基本溶解的适量DMF，另取3.1g中间体II(3.6mmol)和0.49g HOBT(3.6mmol)加入少量DMF中再加入NMM，调pH到7至8，加入0.74g DCC(3.6mmol)搅拌反应，TLC跟踪监测反应完成情况。12h后停止搅拌，TLC检测，反应不完全加入BOP继续反应2小时，室温静置。抽滤(滤去不溶物DCU)，滤液用乙酸乙酯和水用分液漏斗萃取，上层为产品，下层用乙酸乙酯再萃取两遍，合并乙酸乙酯层，酸碱洗涤，无水Na2SO4干燥5h，减压浓缩至干得固体4.07g，收率87.0％。用甲醇溶解加入少量四氢呋喃，滴加饱和的氢氧化锂水溶液到pH＝13，当pH恒定在13后再反应2小时，反应完全后将反应液倒入分液漏斗内加石油醚洗涤2次，下层液体为产品。在产品内加入柠檬酸固体，加入的柠檬酸量为加到产品的pH值到3-4。再将加过柠檬酸的产品倒入分液漏斗内用乙酸乙酯萃取产物，乙酸乙酯用饱和的NaCl溶液洗涤3次，上层液体为产品，将产品倒入干燥的烧杯用Na2SO4干燥2小时，干燥后将液体浓缩得到固体产品3.82g，收率95.0％。加入1.08g中间体III(3.6mmol)，0.74g HOBT(3.6mmol)，0.74g DCC(3.6mmol)，适量DMF完全溶解，NMM调碱，TLC跟踪监测反应完成情况。12h后停止搅拌，TLC检测，室温静置。抽滤(滤去不溶物DCU)，滤液用乙酸乙酯和水用分液漏斗萃取，上层为产品，下层用乙酸乙酯再萃取两遍，合并乙酸乙酯层，酸碱洗涤，无水Na2SO4干燥5h，减压浓缩至干得固体4.05g，收率86.0％。加入适量切割液(比例为TFA95％，三异丙基硅烷2.5％ 水2.5％)，搅拌溶解，间断震荡两小时，氮气鼓吹至少量体积，乙醚沉淀，所得沉淀再用乙醚洗涤数次，吹干得未成环产品中间体IV2.2g，收率96.0％。
实施例五成环合成卡贝缩宫素
将上述未成环产品中间体IV用适量DMF溶解，NMM作为有机碱，加入氯化锂环化，反应5小时，Ellman反应检测巯基反应完全与否。反应完全后直接减压浓缩得粗肽卡贝缩宫素1.94g，收率97.0％。
实施例六4-Bromobutyryl-Tyr(me)-Ile-OH的合成
在250ml圆底烧瓶中加入2.95g Boc-Tyr(me)-OH(10mmol)，适量DMF溶解，另取等摩尔1.82gH-Ile.ome.Hcl(10mmol)和1.35gHOBt(10mmol)加入少量DMF溶解，再加入2倍摩尔数NMM后一并加入烧瓶中，继续调pH到7至8，加入1.92EDCI(10mmol)搅拌反应，TLC跟踪监测反应完成情况。12h后停止搅拌，室温静置。抽滤，滤液用乙酸乙酯和水用分液漏斗萃取，上层为产品，下层用乙酸乙酯再萃取两遍，合并乙酸乙酯层，酸碱洗涤，无水Na2SO4干燥5h，减压浓缩至干得固体3.84g，收率91.0％。直接加入30ml50％(V/V)三氟乙酸的二氯甲烷溶液，室温下磁力搅拌30min，减压蒸干，加入适量乙酸乙酯，旋摇，析出胶状白色沉淀。用少量乙酸乙酯洗涤沉淀两次，浓缩干后得到白色固体2.82g，收率96.0％。再加入1.67g的4-溴丁酸(10mmol)，1.35g HOBt(10mmol)，1.92g EDCI(10mmol)，适量DMF完全溶解，NMM调碱，TLC跟踪监测反应完成情况。12h后停止搅拌，室温静置。抽滤，滤液用乙酸乙酯和水萃取，上层为产品，下层用乙酸乙酯再萃取两遍，合并乙酸乙酯层，酸碱洗涤，无水Na2SO4干燥5h，减压浓缩至干得固体3.95g，收率96.0％。用甲醇溶解加入少量四氢呋喃，滴加饱和的氢氧化锂水溶液到pH＝13，当pH恒定在13后再反应2小时，反应完全后将反应液倒入分液漏斗内加石油醚洗涤2次，下层液体为产品。在产品内加入柠檬酸固体，加入的柠檬酸量为加到产品的pH值到3-4。再将加过柠檬酸的产品倒入分液漏斗内用乙酸乙酯萃取产物，乙酸乙酯用饱和的NaCl溶液洗涤3次，上层液体为产品，将产品倒入干燥的烧杯用Na2SO4干燥5小时，干燥后将液体浓缩得到固体产品中间体I 3.5g，收率91.5％。
实施例七H-Gln(trt)-Asn(trt)-Cys(trt)-ome的合成
将5.9g Fmoc-Asn(trt)-OH(10mmol)用二氯甲烷溶解，加入二乙胺反应2小时，TLC跟踪监测，反应完全后直接浓缩得到固体3.67g，收率98.0％。适量DMF溶解，另取6.1gFmoc-Gln(trt)-OH(10mmol)和1.35g HOBt(10mmol)加入少量DMF中再加入N-甲基吗啡啉(NMM)调pH到7至8，加入1.92g EDCI(10mmol)搅拌反应，TLC跟踪监测反应完成情况。12h后停止搅拌，室温静置。抽滤，滤液用乙酸乙酯和水用分液漏斗萃取，上层为产品，下层用乙酸乙酯再萃取两遍，合并乙酸乙酯层，酸碱洗涤，无水Na2SO4干燥5h，减压浓缩至干得固体8.72g，收率92.0％。加入1.72g H-Cys.ome.Hcl(10mmol)，1.35g HOBt(10mmol)，1.92gEDCI(10mmol)，适量DMF完全溶解，NMM调碱，TLC跟踪监测反应完成情况。12h后停止搅拌，室温静置。抽滤，滤液用乙酸乙酯和水用分液漏斗萃取，上层为产品，下层用乙酸乙酯再萃取两遍，合并乙酸乙酯层，酸碱洗涤，无水Na2SO4干燥5h，减压浓缩至干得固体8.92g，收率87.5％。再用二氯甲烷溶解，加入二乙胺反应2小时，2小时后点板看有无反应完全，反应完全后直接浓缩得到固体产品中间体II 6.73g，收率94.8％。
实施例八H-Pro-Leu-Gly-NH2的合成
在250ml圆底烧瓶中加入2.15g Boc-Pro-OH(10mmol)，适量DMF溶解，另取1.82gH-Leu.ome.Hcl(10mmol)和1.35g HOBt(10mmol)加入少量DMF中再加入2倍摩尔数N-甲基吗啡啉(NMM)后一并加入烧瓶中，继续调pH到7至8，加入1.92EDCI(10mmol)搅拌反应，TLC跟踪监测反应完成情况。12h后停止搅拌，室温静置。抽滤，滤液用乙酸乙酯和水用分液漏斗萃取，上层为产品，下层用乙酸乙酯再萃取两遍，合并乙酸乙酯层，酸碱洗涤，无水Na2SO4干燥5h，减压浓缩至干得固体3.05g，收率89.0％，将所得产品用甲醇溶解加入少量四氢呋喃，滴加饱和的氢氧化锂水溶液到pH＝13，当pH恒定在13后再反应2小时，TLC跟踪监测，反应完全则将反应液倒入分液漏斗内加石油醚洗涤2次，下层液体为产品。在产品内加入柠檬酸固体，加入的柠檬酸量为加到产品的pH值到3-4。再将加过柠檬酸的产品倒入分液漏斗内用乙酸乙酯萃取产物，乙酸乙酯层用饱和的NaCl溶液洗涤3次，上层液体为产品，将产品倒入干燥的烧杯用Na2SO4干燥2小时，干燥后将液体浓缩至干得固体2.76g，收率，94.5％。加入1.1gH-Gly-NH2.Hcl，1.35g HOBt(10mmol)，1.92g EDCI(10mmol)，适量DMF完全溶解，NMM调碱，TLC跟踪监测反应完成情况。12h后停止搅拌，室温静置。抽滤，滤液用乙酸乙酯和水用分液漏斗萃取，上层为产品，下层用乙酸乙酯再萃取两遍，合并乙酸乙酯层，酸碱洗涤，无水Na2SO4干燥5h，减压浓缩至干得固体2.94g，收率91.0％。直接加入30ml50％(V/V)三氟乙酸的二氯甲烷溶液，TLC跟踪检测反应，室温下，磁力搅拌30min，减压蒸干，加入适量乙酸乙酯，旋摇，析出胶状白色沉淀。用少量乙酸乙酯洗涤沉淀两次，浓缩干后得到白色固体中间体III2.13g，收率98.0％。
实施例九三个片段缩合及保护基团的切除
向250ml圆底烧瓶中依次加入3.43g中间体I(7.5mmol)和适量DMF，另取6.46g中间体II(7.5mmol)和1.01g HOBT(7.5mmol)加入少量DMF溶解，再加入NMM，调pH到7至8，加入1.44g EDCI(7.5mmol)搅拌反应，TLC跟踪监测反应完成情况。12h后停止搅拌，室温静置。抽滤，滤液用乙酸乙酯和水用分液漏斗萃取，上层为产品，下层用乙酸乙酯再萃取两遍，合并乙酸乙酯层，酸碱洗涤，无水Na2SO4干燥5h，减压浓缩至干得固体产品8.78g，收率90.0％。用甲醇溶解加入少量四氢呋喃，滴加饱和的氢氧化锂水溶液到pH＝13，当pH恒定在13后再反应2小时，TLC跟踪检测，反应完全则将反应液倒入分液漏斗内加石油醚洗涤2次，下层液体为产品。在产品内加入柠檬酸固体，加入的柠檬酸量为加到产品的pH值到3-4。再将加过柠檬酸的产品倒入分液漏斗内用乙酸乙酯萃取产物，乙酸乙酯用饱和的NaCl溶液洗涤3次，上层液体为产品，将产品倒入干燥的烧杯用Na2SO4干燥2小时，干燥后将液体浓缩得到固体产品8.51g，收率98.0％。加入2.13g(7.5mmol)中间体III，1.01g HOBT(7.5mmol)，，1.44gEDCI(7.5mmol)，适量DMF完全溶解，NMM调碱，TLC跟踪监测反应完成情况。12h后停止搅拌，室温静置。抽滤，滤液用乙酸乙酯和水用分液漏斗萃取，上层为产品，下层用乙酸乙酯再萃取两遍，合并乙酸乙酯层，酸碱洗涤，无水Na2SO4干燥5h，减压浓缩至干得固体9.36g，收率90.3％。加入适量TFMSA/TFA、苯甲硫醚，于冰浴中，搅拌，间断震荡两小时，氮气鼓吹至少量体积，反应液用预冷乙醚沉淀，所得沉淀再用乙醚洗涤数次，吹干得未成环产品中间体IV5.16g，收率98.1％。
实施例十.成环合成卡贝缩宫素
将上述未成环产品中间体IV用适量N-甲基吡咯烷酮溶解，DIPEA作为有机碱，加入LiCl环化，反应5小时，Ellman反应检测巯基反应完全与否。反应完全后直接减压浓缩得粗肽卡贝缩宫素4.59g，收率89.8％。
产品的RP-HPLC分析，流动相A为pH＝6.8磷酸盐缓冲液，流动相B为乙腈，C18柱，梯度为B相起始浓度为20％，60min后提高至35％，结果见附图三，其中卡贝缩宫素粗品纯度达到80％以上。
以上内容是结合具体实施例对本发明技术方案的详细说明，这些具体实施例不是对发明技术方案的限定。对于本领域技术人员所做的任何简单的非实质性改变，都应当视为属于本发明权利要求书技术方案要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种卡贝缩宫素的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、合成中间体I：4-Bromobutyryl-Tyr(me)-Ile-OH；
(2)、合成中间体II：H-Gln(trt)-Asn(trt)-Cys(trt)-ome；
(3)、合成中间体III：H-Pro-Leu-Gly-NH2；
(4)、中间体I、中间体II和中间体III在溶剂中，缩合剂存在下缩合，合成中间体IV：Butyryl-Tyr(Me)-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2；
(5)、中间体IV在碱性条件下加入催化剂环化，得到卡贝缩宫素。
2.如权利要求1所述的合成卡贝缩宫素的方法，其特征在于，采用以下方法合成中间体I：：Boc-Tyr(me)-OH与H-Ile.ome.Hcl按0.5∶1～1∶0.5的比例混合于溶剂中，调节pH，加入偶联剂和缩合剂缩合，产物提纯后脱保护，再提纯后加入0.5～2倍摩尔量的4-溴丁酸，缩合，产物进一步在碱性条件下脱保护得到中间体I。
3.如权利要求2所述的合成卡贝缩宫素的方法，其特征在于，溶剂为溶剂为DMF、THF或二氧六环，pH调节剂为NMM、DIEA或TMP，偶联剂为PyBOP/HOBT、HOBT/TBTU、HOAT/TATU或HATU/HOAT，活化剂为DIC、DCC、EDCI或CDI，脱保护剂为50％(V/V)TFA/DCM或HCl/MeOH；氢氧化锂或氢氧化钠。
4.如权利要求1所述的合成卡贝缩宫素的方法，其特征在于，采用以下方法合成中间体II：溶剂中Fmoc-Asn(trt)-OH脱保护剂脱保护，按0.5∶1～1∶0.5的摩尔比与Fmoc-Gln(trt)-OH混合，加入偶联剂，pH调节剂，在pH 7～8缩合剂存在下缩合，产物提纯后加入H-Cys(trt).ome.Hcl在溶剂中加入偶联剂，pH调节剂，缩合剂缩合，产物进一步提纯后脱保护得到中间体II。
5.如权利要求4所述的合成卡贝缩宫素的方法，其特征在于，溶剂为DMF、THF或二氧六环，pH调节剂为NMM、DIEA或TMP，偶联剂为PyBOP/HOBT、HOBT/TBTU、HOAT/TATU或HATU/HOAT，活化剂为DIC、DCC、EDCI或CDI，脱保护剂为二乙胺、三乙胺、吡啶或六氢吡啶。
6.如权利要求1所述的合成卡贝缩宫素的方法，其特征在于，采用以下方法合成中间体III：Boc-Pro-OH和H-Leu.ome.Hcl按0.5∶1～1∶0.5的比例混合于溶剂中，调节pH，加入偶联剂和缩合剂缩合，产物提纯后脱保护，再提纯后加入0.5～2倍摩尔量的入H-Gly-NH2.Hcl，缩合，产物进一步在碱性条件下脱保护得到中间体III。
7.如权利要求6所述的合成卡贝缩宫素的方法，其特征在于，溶剂为DMF、THF或二氧六环，pH调节剂为NMM、DIEA或TMP，偶联剂为PyBOP/HOBT、HOBT/TBTU、HOAT/TATU或HATU/HOAT，活化剂为DIC、DCC、EDCI或CDI，脱保护剂为50％(V/V)TFA/DCM或HCl/MeOH；二乙胺、三乙胺、吡啶或六氢吡啶。
8.如权利要求1所述的合成卡贝缩宫素的方法，其特征在于，采用以下方法合成中间体IV：中间体I和合成中间体II按0.5∶1～1∶0.5的比例混合于溶剂中，调节pH，加入偶联剂和缩合剂缩合，产物提纯后脱保护，再提纯后加入0.5～2倍摩尔量的合成中间体III，缩合，产物进一步在切割液中脱保护得到中间体IV。
9.如权利要求8所述的合成卡贝缩宫素的方法，其特征在于，溶剂为DMF、THF或二氧六环，pH调节剂为NMM、DIEA或TMP，偶联剂为PyBOP/HOBT、HOBT/TBTU、HOAT/TATU或HATU/HOAT，活化剂为DIC、DCC、EDCI或CDI，脱保护剂为氢氧化锂或氢氧化钠。切割液为TFA/三异丙基硅烷/H2O、TFA/三氟甲磺酸/苯甲硫醚或TFA/三氟甲磺酸硅烷脂/苯甲硫醚。
10.如权利要求1所述的合成卡贝缩宫素的方法，其特征在于，步骤(5)在溶剂中，加入有机碱，在催化剂存在下反应3-8小时，得到卡贝缩宫素，溶剂为DMF或N-甲基吡咯烷酮，有机碱为NMM、DIPEA或TMP，催化剂为氯化锂或二氮杂二环，优选的反应时间为4～5小时。
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