CN100378126C

CN100378126C - C末端修饰的内吗啡肽1

Info

Publication number: CN100378126C
Application number: CNB2004100731592A
Authority: CN
Inventors: 王锐; 于烨; 刘红美
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Lanzhou University
Priority date: 2004-09-30
Filing date: 2004-09-30
Publication date: 2008-04-02
Anticipated expiration: 2024-09-30
Also published as: CN1754890A

Abstract

本发明提供结构式为内吗啡肽1(Endomorphin1，EM1)的新类似物以及该类似物的制备方法，并通过离体生物活性鉴定：GPI(μ受体亲和性鉴定)，MVD(δ受体亲和性鉴定)试验和在体生物活性鉴定方法中的SAP，HR实验，显示了C末端修饰的EM1类似物具备极强的受体结合能力，良好的镇痛效果，克服了吗啡在心搏过缓方面的副作用，为开发替代吗啡的深层次痛觉调节药物提供了非常广阔的前景。

Description

C末端修饰的内吗啡肽1

技术领域

本发明涉及一类新的化合物，具体讲是一类内吗啡肽1(Endomorphinl，EM1)的新类似物，以及这类化合物的制备方法与生理活性研究。

背景技术

阿片受体主要分为三类：μ，δ，κ，分布于哺乳动物的中枢神经系统和多种外周器官，对应的内源性配体分别为内吗啡肽〔见Zadina，J.E.；Hackler，L.；Ge，L.J.；Kastin，A.J.A potent and selective endogenous agonist for the μ-opiatereceptor.Noture.1997，386(6624)：499-502〕(Endomorphins，EMs)，脑啡肽(Enkephalin)〔见Hughes，J.，Smith，T.W.，Kosterlitz，H.W.，Forthergill，L.A.，Morgan，B.A.，and Morris，H.R.(1975)Identification oftwo related pentapeptidesfrom the brain with potent opiate agonist activity.Nature 258，577-580.〕和强啡肽(Dynorphins)〔见Goldstein，A.，Tachibana，S.，Lowney，L.H.，Hunkapiller，M.，and Hood，L.1979)Dynorphin-(1-13)，an extraordinarily potent opioid peptide.Proc.Natl.Acad.Sci. USA 76，6666-6670.〕，这些受体和配体都参与了痛觉调制及镇痛过程。相对其他哺乳动物内源性配体，内吗啡肽具备极高的μ阿片受体(MOR)亲和性和选择性，以MOR为介导，参与诸多的生理过程，特别是强效的镇痛作用，其作用与吗啡相当。吗啡作为高效的镇痛药物，广泛应用于临床，但由于诸如呼吸抑制、心搏过缓、成瘾等方面的副作用，对病人产生了很大的危害。EMs的发现为揭示阿片系统调节痛觉机理，开发替代吗啡的深层次痛觉调节药物提供了非常广阔的前景，四个氨基酸组分所蕴含的信息和作用之丰富引起了广泛的关注和研究热潮。

内吗啡肽的主要生物活性有：

1.镇痛作用：脑室注射、鞘内注射内吗啡肽均可产生强效的镇痛作用，其镇痛作用与吗啡相当，MOR阻断剂能阻断EMs的这种作用〔见Goldberg，I..E.；Rossi，GC.；Letchworth，S.R.；et al.Pharmacological characterization ofendomorphin-1and endomorphin-2in muse brain.J Pharmacol Exp Ther.1998，286(2)：1007-13〕、〔见Mizaoguchi，H.；Narita，M.；Oji，D.E.；et al.The mu-opioidreceptor gene-dose dependent reductions in G-protein activation in the pons/medullaand antinociception induced by endomorphins in μ-opioid receptor knockout mice.Neuroscience.1999，94(1)：203-7〕、〔Loh，H.H.；Liu，H.C.；Cavalli，A.et al.Muopioid receptor knockout in mice：effects on ligand-induced analgesia and morphinelethality.Brain Res MolBrain Res.1991，54(2)：321-6〕。

2.对心血管系统的作用：EMs能显著抑制小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猫等实验动物的心血管活动，并可以剂量依赖的降低兔、小鼠、大鼠等的整体动脉压，这种作用可被纳络酮(naloxone，Nx)阻断〔Champion，H.C.；Bivalacqua，T.J.；Lambert，D.G.；et al.Endomorphinl and 2，the endogenousmu-opioid agonists，produce biphasic changes in systemic arterial pressure in thecat.Life Sci.1991，63(9)：PL 131-6〕。

3.除镇痛作用和降血压的作用之外，还具有对运动、行为、呼吸、肠胃、内分泌和免疫等功能及细胞损伤的保护作用〔Lin，X.；Yang，D.J.；Cai，W.Q.；Zhao，Q.Y.；Gao，Y.F.；Chen，Q.；Wang，R.Endomorphins endogenous opioidpeptides，provide antioxidant defense in the brain agonist free radical-induceddanmage.Biochim Biophys-Acta.2003，Nov，20；1639(3)：195-202〕。

作为内源性阿片肽，内吗啡肽与其它体内的生物活性肽一样，表现出一些缺点，从而限制了其在临床上的应用，这些缺点主要表现在：其一，在体内容易受特异性和非特异性的肽酶作用，药物作用时间短。其二，结构上存在很大的柔性，体内构象多变，可与多种受体结合，从而降低其选择性，在临床治疗中产生一些副作用。其三，不易突破血脑屏障(Brainblood barrier，BBB)，不利于口服和注射。

因此，对EMs进行结构修饰，以增强对酶的稳定性，稳定其活性构象，提高生物利用度及生物活性，延长作用时间，突破血脑屏障已经成为EMs研究的重要难题。

发明内容

构效关系(Structure-activity relationship，SAR)研究表明，EMs与吗啡及其它的内源性阿片肽一样，具备相同的阿片药效团，空间上处于相同位置的阳离子酰氨、酚环及其另外一个疏水性基团，这可能是有效活性片段要求的共同特征。而且EM1(Tyr¹-Pro²-Trp³-Phe⁴-NH₂)、EM2(Tyr¹-Pro²-Phe³-Phe⁴-NH₂)、Morphiceptin(Tyr¹-Pro²-Phe³-Pro⁴-NH₂)〔Chang，K.J.，A.Killian，E.Hazum，and P.Cuatrecasas.1981.Morphiceptin(NH4-Tyr-Pro-Phe-Pro-CONH2)：a potent andspecific agonist for morphine(μ)receptors.Science.212：75-77.〕、PL017(Tyr¹-Pro²-MePhe³-D-Pro⁴-NH₂)〔Chang，K.J.，E.T.Wei，A.Killian，and J.-K.Chang.1983.Potent morphiceptin analogs：structure activity relationships andmorphine-like activities.J. Pharmacol. Exp.Ther.227：403-408.〕、Tyr-W-MIF-1(Tyr¹-Pro²-Trp³-Gly⁴-NH₂)属于同一级别，Pro处于第二的位置，具备很高的μ阿片受体的选择性。这些肽的亲和性很大程度上取决于第四位置氨基酸的性质，用疏水性基团替换Tyr-W-MIF-1四位的Gly活性可以提高5倍，Phe替换四位的Gly得到EM1活性可以提高50倍，这足以说明第四位氨基酸的侧链在EM1中的作用。Masakatsu Eguchi，Richard Y.W.Shen等在美国《医学化学》杂志〔Design，Synthesis，and Evaluation of Opioid Analogues withNon-Peptidic β-Turn Scaffold：Enkephalin and Endomorphin Mimetics.J. Med.Chem.2002，Vol.45，No.7，1397〕上运用β转角(β-turn)肽模拟物模型，证实了EMs的二级结构活性构象为(4-1)β-turn结构。Podlogar，B.L.；Paterlin M.G等人〔Conformational analysis of the endogenous mu-opioid agonist endomorphin-1using NMR spectroscopy and molecular modeling.FEBS Lett.1998，439，13-20〕披露，利用二维核磁和分子模拟技术在水和DMSO-D₆溶液中动态地研究了EMs的溶液构象，证实EM1存在顺势(cis)和反式(trans)构象，生物活性构象可能是反式的结构上表现为伸展的构象(extended conformation)，一定结构的疏水域(hydrophbolic pocket)决定了EM1的亲和性和选择性(见图1)。M.Germana Paterlini，Francesca Avitabile〔Stereochemical Requirements forReceptor Recognition of the m-Opioid Peptide Endomorphin-1.Biophys.J. 78(2)590-599〕等合成了一系列EM1的非对映异构体，通过二维核磁及分子模拟的方法证明了Podloger的想法。Csaba Tmbly等〔Csaba Tmbly，Katalin E.Kveretal Structure-Activity Study on the Phe Side Chain Arrangement of EndomorphinsUsing Conformationally Constrained Analogues.J.Med.Chem.2004，47，735-743〕认为Phe⁴的侧链x¹＝-60°是EM2的活性构象，这就说明Phe⁴侧链苄基朝向决定了EMs的生物活性。

图1表示EM1的cis构象(A)，Tyr，Pro，Trp形成“三明治”模型，结构上比较紧凑；trans构象(B)，结构上比较伸展，为生物活性构象(Podloger，FEBSletter，1998)。

结合以上EMs研究结果，为了固定EMs伸展的活性构象，减少Phe⁴的侧链苄基改变形成的空间位阻对其它侧链的影响，我们把Phe⁴的侧链苄基移到C-末端，四位用Gly/D-Ala/L-Ala/Sarcosine/D-Val替换Phe⁴，同时对苄基进行一定的结构限制，有效固定活性构象，以期能得到高效抗酶解的类似物。以非芳香环侧链氨基酸替换Phe⁴，以期得到一个能成功导入糖基，胍基的短肽序列，为解决EMs不易突破血脑屏障的问题提供了新的改造方法。

本发明提供一类新的经改造的内吗啡肽1，寻求比内吗啡肽具备更高的生物活性或者更低的毒副作用的一类类似物。

本发明的另一目的是提供一种内吗啡肽1的制备方法。

本发明的化合物是一类具有如下特征的EM1新类似物：

更具体描叙：1位是Tyr，2位是Pro，3位是Trp，原Phe⁴，被L-Ala或Gly或肌氨酸或β-Ala或D-Ala或D-Val，或D-Pro替换，同时C末端以苄胺结尾；或者用D-Ala替换Phe⁴，同时C末端以光活苯乙胺或苯丙酰胺结尾；或者用Gly替换Phe⁴，同时C末端以苯胺结尾。

本发明的化合物的制备方法采用Hosu(N-羟基琥珀酰亚胺)/Dcc(环己基羰二亚胺)活化酯法接肽，“2+2”法合成EM1的新类似物。Hosu/Dcc活化酯法合成具有成本低，不易消旋，产率高，易纯化，C-端不用保护等特点，“2+2”法合成大大简化了合成线路，减少了工作量。合成路线如下：

合成步骤简述如下(参见图2)：化合物a溶于无水处理的四氢呋喃中，加入Hosu/Dcc，形成活化酯以后，再加入氢氧化钠中和的化合物b，反应得到化合物c。化合物e溶于二氯甲烷，加入化合物f，Dcc/DMAP(二甲氨基吡啶)缩合反应生成化合物g；当化合物f为盐酸苯丙酰胺时，不用Dcc/DMAP法缩合，用Hosu/Dcc活化酯法缩合。化合物g用盐酸乙酸乙酯溶液脱掉Boc；若为Z保护，则溶于甲醇，用钯碳脱保护。以后同样以活化酯法与化合物d缩合得到化合物h。重复上一步，化合物h脱掉保护与化合物c活化酯法缩合得到化合物i；化合物i用钯碳脱保护得到终产物j。

本发明的化合物的离体生物活性鉴定主要包括豚鼠回肠纵型肌(guineapig ileal，GPI)结合实验和小鼠输精管(mouse vas deferens，MVD)结合实验。豚鼠回肠纵型肌上存在大量的μ阿片受体及少量κ受体，GPI实验是鉴定类似物μ受体亲和性的最经典的实验，类似物与受体结合能抑制肌条胆碱能的释放，减弱电刺激引起的收缩。小鼠输精管存在大量的δ受体，也存在部分μ受体和κ受体，是鉴定类似物和δ受体亲和性的最经典的实验。

本发明的化合物的在体生物活性鉴定主要包括整体血压(Systemic arterialpressure，SAP)实验、心率(Heart rate，HR)变化实验和热板镇痛实验。整体血压实验、心率变化实验的结果能直接说明阿片肽对心血管系统的影响，也能反映类似物与外周受体结合的能力的强弱。热刺激法系利用一定强度的温度刺激动物躯体的某一体表部位，使其产生疼痛反应，是目前国内外筛选镇痛药的常用致痛方法；本研究采用的小白鼠热板法试验镇痛药的作用强度与临床疗效大致平行。

本发明的优点和产生的有益效果：

化合物1e和1f的trans构象伸展，苄胺末端与Tyr侧链之间的空间位阻小，形成有利于与阿片受体结合的区域。尤其是化合物1f，无论是trans，cis构象都能保持伸展的生物活性构象(经2DNMR研究证实)(见图7)。由此可见，Tyr¹-Pro²-Trp³-D-Val⁴-NH-Bn这一序列能有效的固定EM-1的生物活性构象，为研究EM-1构效，合成更高效的阿片受体激动剂，研究开发代替吗啡的高效镇痛药物提供了一个非常具有参考价值的序列模式。

本发明的化合物的制备方法采用Hosu/Dcc活化酯法接肽，“2+2”法合成EM1的新类似物。Hosu/Dcc活化酯法合成具有成本低，光学纯度高，产率高，易纯化，C-端不用保护等特点，“2+2”法合成大大简化了合成线路，减少了工作量。

附图说明

图1为EM1的cis构象(A)与trans构象(B)

图2为内吗啡肽1类似物的的合成路线

图3为静脉注射内吗啡肽1，吗啡和化合物1e对wistar大鼠整体血压影响

图4为静脉注射内吗啡肽1，吗啡和化合物1e对wistar大鼠整体血压影响的时效曲线

图5为静脉注射内吗啡肽1，吗啡和化合物1e(1-30nmol/kg)血压下降百分率和心率下降百分率柱状图。

图6为内吗啡肽1和吗啡热板镇痛的剂量效应曲线。

图7化合物1f顺反式低能量构象比较

具体实施方式

合成的实施实例：化合物1e(Tyr-Pro-Trp-D-Ala-NH-Bn)的合成

反应i：苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸(c)的合成：化合物a 0.946g(3mmol)、Hosu 0.346g(3.3mmol)溶于无水四氢呋喃(THF)中，冰浴搅拌10分钟后加入0.619g(3.6mmol)的DCC。冰浴下反应30分钟后撤掉冰浴，室温反应3～5小时，布氏漏斗过滤，除去反应生成的DCU(环二己基脲)得到化合物a的活化酯THF溶液。0.414g(3.6mmol)化合物b溶于等摩尔的氢氧化钠水溶液，调节PH值至9～10，冰浴搅拌10分钟后，加入化合物的a的活化酯THF溶液。冰浴下反应30分钟后撤掉冰浴，室温反应过夜。抽干THF，溶于乙酸乙酯，依次用5％的柠檬酸，饱和氯化钠洗涤，并用无水硫酸钠(Na₂SO₄)干燥。过滤，减压蒸发掉溶剂，硅胶柱层析分纯(乙酸乙酯∶石油醚∶甲醇＝3∶1∶0.1)，油泵减压得白色粉末0.887g，产率72.1％。[α]_D ²⁰＝-19(c＝1，MeOH)。ESI-Ms m/z＝446.0285(M+H)，Mp＝102～103℃

反应ii：叔丁氧羰基-D-丙氨酸-苄胺(g)的合成：化合物e 0.1892g(1mmol)、化合物f0.165ml(1.5mmol)溶于无水二氯甲烷(DCM)中，冰浴搅拌10分钟后加入0.247g(3.6mmol)的DCC。冰浴下反应30分钟后撒掉冰浴，加入DMAP，室温反应过夜，布氏漏斗过滤，除去反应生成的DCU。抽干DCM，溶于乙酸乙酯，依次用饱和碳酸氢钠溶液，5％的柠檬酸，饱和氯化钠洗涤，并用无水硫酸钠(Na₂SO₄)干燥。过滤，减压蒸发掉溶剂。硅胶柱层析分纯(乙酸乙酯∶石油醚∶＝1∶1)得到0.2244g白色固体，产率80.6％。[α]_D ²⁰＝5(c＝1，MeOH)。ESI-Ms m/z＝279.0834(M+H)，Mp＝103～105℃

反应iii，iv：叔丁氧羰基-L-色氨酸-D-丙氨酸-苄胺(h)的合成：化合物d0.263g(0.72mmol)、Hosu 0.1g(0.84mmol)溶于无水THF中，冰浴搅拌10分钟后加入0.178g(0.84mmol)的DCC。冰浴下反应30分钟后撤掉冰浴，室温反应3～5小时，布氏漏斗过滤，除去反应生成的DCU得到化合物d的活化酯THF溶液。化合物g溶于2ml的乙酸乙酯，小心滴加12.5mol/L盐酸0.5ml于乙酸乙酯溶液中，室温反应2～3小时，减压抽去乙酸乙酯，加水调节到一定体积，2mol/L氢氧化钠水溶液调节PH值至9～10，冰浴搅拌10分钟后，加入化合物的d的活化酯THF溶液。冰浴下反应30分钟后撤掉冰浴，室温反应过夜。抽干THF，溶于乙酸乙酯，依次用饱和碳酸氢钠溶液，5％的柠檬酸，饱和氯化钠洗涤，并用无水硫酸钠(Na₂SO₄)干燥。过滤，减压蒸发掉溶剂，硅胶柱层析分纯(乙酸乙酯∶石油醚＝3∶1)，减压得白色粉末0.887g，产率87.48％。Mp＝82～84℃

反应v，vi：苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-L-色氨酸-D-丙氨酸-苄胺(i)的合成：化合物c 100mg(0.24mmol)、Hosu 26mg(0.22mmol)溶于无水四氢呋喃(THF)中，冰浴搅拌10分钟后加入45.4mg(0.24mmol)的DCC。冰浴下反应30分钟后撤掉冰浴，室温反应3～5小时，布氏漏斗过滤，除去反应生成的DCU得到化合物c的活化酯THF溶液。化合物h溶于2ml的乙酸乙酯，小心滴加12.5mol/L盐酸0.5ml于乙酸乙酯溶液中，室温反应2～3小时，减压抽去乙酸乙酯，加水调节到一定体积，2mol/L氢氧化钠水溶液调节PH值至9～10，冰浴搅拌10分钟后，加入化合物的c的活化酯THF溶液。冰浴下反应30分钟后撤掉冰浴，室温反应过夜。抽干THF，溶于乙酸乙酯，依次用饱和碳酸氢钠溶液，5％的柠檬酸，饱和氯化钠洗涤，并用无水硫酸钠(Na₂SO₄)干燥。过滤，减压蒸发掉溶剂，硅胶柱层析分纯(乙酸乙酯∶石油醚∶甲醇＝5∶1∶0.2)，减压得无色透明油状物123.43mg，产率81.42％。

反应vii：酪氨酸-脯氨酸-L-色氨酸-D-丙氨酸-苄胺(j)的合成：化合物i123.43mg溶于8～10ml无水甲醇中，加入钯碳60mg，通氢气反应3～4小时，布氏漏斗过滤，除去钯碳。减压抽去甲醇，得到透明无色固体。硅胶柱层析分纯(乙酸乙酯∶甲醇＝5∶1，滴加几滴氨水)，得到白色终产物62.02mg，产率61％，ESI-Ms＝625.6(M+H)。

内吗啡肽1其他类似物的全合成过程与以上类似并且得到类似的结果。

所有的中间产物经过高分辨质谱确定。终产物经过[α]_D、高分辨质谱分析确定，熔点测定确定结构，数据如Tab 1。

Tab 1终产物鉴定数据

Compounds	ESI-MS(or FAB)：m/z	[α]<sub>D</sub><sup>20</sup>(c＝0.3，MeOH)	MP(℃)
Compounds	ESI-MS(or FAB)：m/z	[α]<sub>D</sub><sup>20</sup>(c＝0.3，MeOH)	MP(℃)	1a1b1c1d1e	625.0617612.1827625.5625.2625.6	-20°-11°-2°-28°-19°	141～143128～131124～125118～120121～124

1f1g1h1i1j

653.4651.6639.4682.3597.4

-21°+2°-49°-9°-16°

142～146148～151132～135136～140129～133

本发明的化合物离体生物活性鉴定GPI(μ受体亲和性鉴定)试验方法如下：体重250-300g豚鼠，雌雄不限，实验前禁食12h。处死，剖腹取出取出近盲肠端的回肠6cm两段，浸入持续通入混合气(95％O₂，5％CO₂)的Krebs液II中，剥离纵行肌，然后用零号丝线将纵行肌的一端缚在玻璃电极的小钩上，另一端缚在JZ-1型肌肉张力传感器上，Krebs液II、恒温37.5±0.5℃的玻璃浴管中抚育，预负荷1g。平衡2h后开始实验。给予电刺激，刺激参数：波宽0.5-1ms，频率6次·min^-1，负载电压40V。记录基础收缩强度，再给予适量吗啡鉴定其活性；然后分别给予不同剂量的待试药物，记录收缩强度，计算抑制百分率。MVD实验(δ受体亲和性鉴定)方法如下：30-35g雄性昆明系小白鼠，处死，剖腹取出两侧输精管，浸入持续通入混合气(95％O₂和5％CO₂)的Krebs液I中，将附着在其上的脂肪及血管剥离干净。剪去输精管的一端，轻轻地压出管内的精液，变成一条空心管，然后用零号丝线将其一端缚在玻璃电极的小钩上，另一端缚在JZ-1型肌肉张力传感器上，Krebs液I、恒温36±0.5℃的玻璃浴管中，预负荷250mg。平衡2h后开始实验。给予电刺激，刺激参数：频率6次·min^-1，波宽2-3ms，负载电压50V。记录基础收缩强度，再给予适量吗啡鉴定其活性；然后分别给予不同剂量的待试药物，记录收缩强度，计算抑制百分率。

在MVD/GPI检定中(Tab 2)，所有化合物基本上都能100％地抑制电刺激标本引起的收缩反应，并且可分别被50nmol·L^-1和10nmol·L^-1的纳络酮完全逆转，这表明了它们的阿片样作用。MVD/GPI实验表明化合物1e有很高的μ受体结合活性及选择活性(μIC₅₀＝5.2±1.03nM，比母体EM1高2.13倍，对δ受体的选择性比母体高1.72倍)，其非对映异构体化合物1a的μ受体激动活性则基本上完全消失(μ_IC50＞10000nM)，这就说明四位D型为受体的立体选择性构象。在保证第四位氨基酸为D型构象的前提下，四位上的Cα位引入-CH(CH₃)₂，调整苄胺的角度，改变由Tyr侧链与苄胺末端形成结构域的性状，化合物1f阿片受体激动活性相比母体EM1提高了3.67倍(μ_IC50＝3.06±0.51nM)，δ阿片受体激动活性相比母体提高了18.15倍。此外化合物1g也具备了很高的μ阿片受体结合活性，其结构特征为四位为D型非芳香侧链氨基酸。

Tab1.GPI/MVD鉴定结果

Peptides	IC<sub>50</sub>(nM)		GPI/MVDPotency ratio<sup>△</sup>
	IC<sub>50</sub>(nM)			GPI(n<sup>#</sup>＝6-13)	MVD(n<sup>#</sup>＝10-15)
	EM 11c1b1j1a1d1e1f1h1iMorphine	11.1±0.68369.76±127.081209.4±175.125005.6±630.5449.8％±20.57％243.96±91.565.2±1.033.06±0.31378.71±80.23270.6±62.32125.9±16.3		GPI(n<sup>#</sup>＝6-13)	MVD(n<sup>#</sup>＝10-15)	42.84±9.07195.78±7.8668.27±25.620.96％±14.54％3764.76±270.748.34％±16.11％34.48±6.632.36±0.553167.2±26.53162.57±17.1304.5±16.8	0.261.8917.7＜0.502.66＜0.0240.15081.302.271.660.413

^*1μM剂量肽类药物的最大抑制率；^#重复的动物标本数；^△比值反映了药物对μ受体的选择性。

本发明化合物的在体生物活性鉴定方法中的SAP，HR实验其方法如下：体重200-250g雄性Wistar大鼠，用20％氨基甲酸乙酯(1.0-1.2g·kg^-1，ip)麻醉，作气管插管，自主呼吸；分离右侧颈外静脉，插入充满1000u·L^-1肝素钠生理盐水的导管供给药用；分离左侧颈总动脉插管，经YP-1型压力换能器与泰盟301相连接，记录平均动脉压和心率变化。手术30min后进行实验，整个实验过程肛温稳定在37.5±0.5℃。注射体积100μl，注射时间10-15s。纳络酮拮抗组提前10min注射Nx(2mg·kg^-1，iv)。

麻醉大鼠给药前平均动脉压为12.37±0.67kPa；给予纳络酮后对平均动脉压无影响(P＞0.05)。EMs及其类似物均剂量依赖地降低麻醉大鼠平均动脉压，并都可被Nx (2mg·kg^-1，iv)阻断。各化合物降血压效应的效果(30nmol/kg，iv)的顺序为化合物1e＞EM-1＞morphine(见图3)。与其他化合物相比，化合物1e有较强的降血压作用(P＜0.05)。iv EM-1与化合物1e，时效曲线无显著性差异(P＞0.05)，注射后30s内血压开始下降，1-2min内达最低值，作用持续时间为4.0-6.0min(见图4)。所有化合物静脉给药引起的血压降低都能被纳络酮(2mg/kg)所拮抗。

图3表示静脉注射EM1，Morphine，化合物1e(30nmolKg^-1)对wistar大鼠整体血压影响。剂量以纳摩尔每千克体重表示。各浓度数据均重复6～8次，取平均值。

图4表示静脉注射EM1，Morphine，化合物1e对wistar大鼠整体血压影响的时效曲线。剂量以纳摩尔每千克体重表示。各浓度数据均重复6～8次，取平均值。

麻醉大鼠给药前平均心率为372±20.67次/分；给予纳络酮后对平均动脉压无影响(P＞0.05)。EMs及其类似物均剂量依赖地降低麻醉大鼠HR，并都可被纳络酮(2mg·kg^-1，iv)阻断。与其他化合物相比，Morphine的降心率作用最为明显，血压下降更依赖于心率降低，心输出量减少，这就说明EM-1及类似物在心博过缓方面的副作用相比吗啡要小(见图5)。

图5柱型图比较了Morphine(100nmol/kg，300nmol/kg)，endomorphinl(30nmol/kg)，化合物1e(1-30nmol/kg)静脉给药时血压下降百分率和心率下降百分率。

本发明化合物的在体生物活性鉴定方法中的热板镇痛实验方法如下：恒温水浴维持在55±0.5℃，小鼠舔后跖为镇痛潜伏期终点，截止时间(cut-offvalue，T₂)为45s，以避免烫伤，加药前小鼠的舔后跖的潜伏期(基础痛阈)为9～30s(T₀)，过于敏感和迟钝的小鼠弃去不用。给药后每10min测一次，记录60min内小鼠舔后跖的潜伏期(T₁)，结果以％MPE(最大可能的生物学效应)表示：％MPE＝[(T₁-T₀)/(T₂-T₀)]×100。icv EMs及其类似物均可产生较强的镇痛作用，且可被纳络酮完全逆转(1mg·kg^-1，ip)，说明此效应是由阿片受体介导的；它们镇痛效应的强弱顺序为EM-1＞morphine(见图6)。

Claims

1.一类具有如下结构特征的内吗啡肽1的类似物：

结构特征是：1位是Tyr，2位是Pro，3位是Trp，原Phe⁴，被L-Ala或Gly或肌氨酸或β-Ala或D-Ala或D-Val，或D-Pro替换，同时C末端以苄胺结尾；或者用D-Ala替换Phe⁴，同时C末端以光活苯乙胺或苯丙酰胺结尾；或者用Gly替换Phe⁴，同时C末端以苯胺结尾。

2.一种制备如权利要求1所述内吗啡肽1类似物的方法，其特征是化合物a溶于无水处理的四氢呋喃中，加入N-羟基琥珀酰亚胺/环己基羰二亚胺，形成活化酯以后，再加入氢氧化钠中和的化合物b，反应得到化合物c；化合物e溶与二氯甲烷，加入化合物f，环己基羰二亚胺/二甲氨基吡啶缩合反应生成化合物g；当化合物f为盐酸苯丙酰胺时，不用环己基羰二亚胺/二甲氨基吡啶法缩合，用N-羟基琥珀酰亚胺/环己基羰二亚胺活化酯法缩合；化合物g用盐酸乙酸乙酯溶液脱掉Boc；若为Z保护，则溶于甲醇，用钯碳脱保护，以后同样以活化酯法与化合物d缩合得到化合物h；重复上一步，化合物h脱掉保护与化合物c活化酯法缩合得到化合物i；化合物i用钯碳脱保护得到终产物j。