CN104650182A - 偶联寡聚精氨酸及2位取代的内吗啡肽-1类似物及其合成方法和应用 - Google Patents

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Abstract

偶联寡聚精氨酸及2位取代的内吗啡肽-1类似物及其合成方法和应用，涉及一种内吗啡肽-1类似物及其合成方法和应用。要解决目前内吗啡肽-1的生物稳定性和外周给药的镇痛活性较低，对胃肠道副作用较大的问题。方法：一、“Fmoc”保护的Wang树脂预处理；二、脱除“Fmoc”保护基团；三、氨基酸缩合反应；四、肽链的延长；五、肽链从树脂上的切割；六、粗肽的脱盐与纯化。本发明内吗啡肽-1类似物保留阿片亲和性以及激动剂活性的同时，具有比母体内吗啡肽-1更高的生物稳定性和外周给药的镇痛活性，以及降低胃肠道副作用等优点。用于制备多肽镇痛药物。

Description

偶联寡聚精氨酸及2位取代的内吗啡肽-1类似物及其合成方法和应用
技术领域
本发明涉及一种内吗啡肽-1类似物及其合成方法和应用。
背景技术
神经肽在痛觉感受及痛觉调制方面的研究一直是神经科学研究的热点之一。目前已发现有多种神经肽在痛觉信息的传递和调制过程中起重要作用，其中最为人们熟悉的就是阿片肽。
1997年，Zadina等从牛脑中发现了两个对μ-阿片受体具有高亲和性和高选择性的内源性配体，即内吗啡肽-1(Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2,EM-1)和内吗啡肽-1(Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2,EM-2)，从而成为阿片肽研究的一个新突破。内吗啡肽(EMs)通过与G蛋白偶联的μ-阿片受体结合，参与对痛觉、心血管、呼吸、胃肠、运动、行为、内分泌及免疫等诸多功能的调节，但其主要作用是强效的镇痛活性，可产生活性强于吗啡而副作用较少的镇痛作用。特别是它们在神经性疼痛动物模型中也表现出明显的镇痛活性，比大多数阿片肽都更有效，使其具有潜在的开发前景。但是，内吗啡肽作为天然多肽类化合物，其酶解稳定性差，缺乏口服活性，不易透过血脑屏障和镇痛效果不能持久等，这些缺点极大限制了其作为临床镇痛药物的应用。近年来，对于神经肽治疗学的研究已经取得了很大的进展。然而，血脑屏障通透性和生物稳定性是发展天然活性肽成为临床药物所必须克服的两大主要问题，对于多肽药物向中枢系统的运输仍然是个很大的瓶颈。
已有报道主要有两种酶参与了内吗啡肽的酶解过程：一种是二肽基肽酶IV，可活泼地从内吗啡肽的N-末端释放二肽Tyr-Pro；另一种是氨肽酶，主要参与二级降解过程。2位Pro为二肽基肽酶IV的天然识别位点，因此对内吗啡肽的2位Pro通过非天然氨基酸取代对于提高生物稳定性非常重要。
细胞穿膜肽，也叫蛋白转导域，一般是由30个或者更少的氨基酸组成，能够穿越血脑屏障。最初，Green等首先发现并证实HIV-1病毒的反式激活蛋白TAT具有跨膜转移的功能，后经实验证明，真正起跨膜转运作用的其实是TAT的一段被称为蛋白转导域的特殊氨基酸序列(49-57位氨基酸)。之后，很多具有跨膜功能的多肽分子陆续被发现，并且这些细胞穿膜肽能够以非受体介导的方式增强被运载分子穿越血脑屏障。可以说，细胞穿膜肽的发现为生物活性分子在细胞生物学、基因治疗、药物体内转运、临床药效评价以及细胞免疫学等研究领域均具有良好的应用前景，利用细胞穿膜肽介导药物运输到中枢系统的应用提供了一个非常新颖有效的方法。各种小分子物质，多肽和蛋白已经被作为“货物体”运输到大脑中枢。
短序列的寡聚精氨酸是一种阳离子化的细胞穿膜肽。其精氨酸的主要结构特性提示胍基部分是内化作用的关键结构。胍基基团能够与细胞表面的阴离子基团形成二价的氢键，阳离子化的寡聚精氨酸能够通过与负价电荷的非特异静电相互作用而强烈吸附到细胞表面。
由于内吗啡肽-1具有优于内吗啡肽-2的治疗学特性，如奖赏行为与镇痛作用的分离，耐受的形成较内吗啡肽-2发展慢，镇痛剂量明显低于引起呼吸抑制及心血管作用的剂量等，推测内吗啡肽-1比内吗啡肽-2更适于作为新的安全镇痛药物进行研究。因此，对内吗啡肽-1的C-末端连接细胞穿膜肽，以及2位非天然氨基酸取代的组合修饰法对于提高药物的利用率和效能具有重要作用，有望为发展内吗啡肽-1成为新型的临床镇痛剂。
发明内容
本发明是要解决目前内吗啡肽-1的生物稳定性和外周给药的镇痛活性较低，对胃肠道副作用较大的问题，提供偶联寡聚精氨酸及2位取代的内吗啡肽-1类似物及其合成方法和应用。
本发明偶联寡聚精氨酸及2位取代的内吗啡肽-1类似物，是通过将内吗啡肽-1母体的第2位天然氨基酸Pro替换为非天然氨基酸β-Pro、D-Ala或Sar，并对C-末端连接具有连接子“-(Gly)2-”的二聚或五聚精氨酸，构建一系列新型高效的内吗啡肽-1类似物。
本发明偶联寡聚精氨酸及2位取代的内吗啡肽-1类似物的结构如下：
其中AA为β-Pro、D-Ala或Sar，n为2或5。
上述偶联寡聚精氨酸及2位取代的内吗啡肽-1类似物的合成方法，按以下步骤进行：
一、“Fmoc”保护的Wang树脂预处理：将1.2g带有一个氨基酸残基的Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂放入固相合成仪，加8～12mL二氯甲烷搅拌30min，减压抽滤至抽干溶剂；
二、脱除“Fmoc”保护基团：将抽干后的溶胀树脂用DMF洗涤3min，减压抽滤至抽干，重复3次；
在树脂中加入8～12mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌5min后抽干，重复2次；
再加入10～14mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌15min，之后抽干溶剂，最后用8～12mL DMF洗涤，得到脱除“Fmoc”保护基团的树脂；
三、氨基酸缩合反应：依次将“Fmoc”基团保护的氨基酸、N-羟基苯并三氮唑和O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐溶于6～10mL DMF中，再加入二异丙基乙胺，混匀后得混合溶液；然后将混合溶液加入到步骤二的脱除“Fmoc”保护基团的树脂中，在氩气保护下搅拌反应60min；通过茚检试剂检测缩合反应完成的程度，反应完全后用DMF重复洗涤以除去未反应的残留液体；
四、肽链的延长：重复步骤二和三，分别按照氨基酸序列的顺序，从多肽的C-端到N-端依次将“Fmoc”基团保护的氨基酸逐个缩合到树脂上，直至所有氨基酸残基缩合完成，得到肽树脂；
五、肽链从树脂上的切割：将肽树脂上最后连接的氨基酸的“Fmoc”基团完全脱除，然后用二氯甲烷和甲醇交替洗涤肽树脂，抽干溶剂后，向肽树脂中加入切割试剂，于室温下切割反应3h；收集切割试剂并减压旋干，用冰冷乙醚析出沉淀，静置片刻后去除乙醚上清，再用水及乙酸充分溶解沉淀，倒入分液漏斗，并加入乙酸乙酯萃取，收集水相，经冷冻干燥，得白色或淡黄色固体粉末粗肽；
六、粗肽的脱盐与纯化：以体积浓度10％～20％的乙酸溶液为流动相，将粗肽通过Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱脱盐，利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥，得到脱盐的多肽化合物；再通过反相高效液相色谱柱进行分离纯化，收集主峰，冷冻干燥后得到白色或淡黄色的固体粉末纯肽；
其中步骤四所述氨基酸序列的顺序为Tyr-β-Pro-Trp-Phe-(Gly)2-(Arg)2、Tyr-D-Ala-Trp-Phe-(Gly)2-(Arg)2、Tyr-Sar-Trp-Phe-(Gly)2-(Arg)2、Tyr-β-Pro-Trp-Phe-(Gly)2-(Arg)5、Tyr-D-Ala-Trp-Phe-(Gly)2-(Arg)5或Tyr-Sar-Trp-Phe-(Gly)2-(Arg)5。
本发明合成的产物经过质谱和色谱分析检测，与设计的类似物结构一致，表明成功合成了偶联寡聚精氨酸及2位取代的内吗啡肽-1类似物。
本发明中利用寡聚精氨酸是一种阳离子化的细胞穿膜肽，将其连接在内吗啡肽-1的C-末端，能够通过与负电荷的非特异静电相互作用而吸附到细胞表面，进而增强内吗啡肽-1类似物的血脑屏障通透性。2位非天然氨基酸的引入则会增强内吗啡肽-1类似物的酶解稳定性。因此，通过外周给予内吗啡肽-1类似物，药物能够抵抗在体的酶解，具备良好的稳定性，进而通过寡聚精氨酸的作用使药物穿越血脑屏障，进入大脑中枢，与中枢阿片受体结合产生高效的镇痛作用。
附图说明
图1为侧脑室注射内吗啡肽-1类似物1的镇痛效应-时间曲线；
图2为侧脑室注射内吗啡肽-1类似物2的镇痛效应-时间曲线；
图3为侧脑室注射内吗啡肽-1类似物4的镇痛效应-时间曲线；
图4为侧脑室注射内吗啡肽-1类似物5的镇痛效应-时间曲线；
图5为皮下注射内吗啡肽-1类似物1,2的镇痛效应-时间曲线；
图6为皮下注射内吗啡肽-1类似物4,5的镇痛效应-时间曲线；
图7为中枢注射纳络酮对皮下注射类似物1,2,4和5镇痛活性的拮抗作用；
图8为中枢注射内吗啡肽-1类似物1,2,4和5的结肠排珠运动潜能性。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式偶联寡聚精氨酸及2位取代的内吗啡肽-1类似物的结构如下：
其中AA为β-Pro、D-Ala或Sar，n为2或5。
本实施方式的内吗啡肽-1类似物保留阿片亲和性以及激动剂活性的同时，具有比母体内吗啡肽-1更高的生物稳定性和外周给药的镇痛活性，以及降低胃肠道副作用等优点。实验证实寡聚精氨酸以及非天然氨基酸组合修饰法对于提高药物利用率和效能的重要性，为开发具有医用价值的新型神经肽类药物提供了广阔的前景。
具体实施方式二：本实施方式偶联寡聚精氨酸及2位取代的内吗啡肽-1类似物的合成方法，按以下步骤进行：
一、“Fmoc”保护的Wang树脂预处理：将1.2g带有一个氨基酸残基的Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂放入固相合成仪，加8～12mL二氯甲烷搅拌30min，减压抽滤至抽干溶剂；
二、脱除“Fmoc”保护基团：将抽干后的溶胀树脂用DMF洗涤3min，减压抽滤至抽干，重复3次；
在树脂中加入8～12mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌5min后抽干，重复2次；
再加入10～14mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌15min，之后抽干溶剂，最后用8～12mL DMF洗涤，得到脱除“Fmoc”保护基团的树脂；
三、氨基酸缩合反应：依次将“Fmoc”基团保护的氨基酸、N-羟基苯并三氮唑和O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐溶于6～10mL DMF中，再加入二异丙基乙胺，混匀后得混合溶液；然后将混合溶液加入到步骤二的脱除“Fmoc”保护基团的树脂中，在氩气保护下搅拌反应60min；通过茚检试剂检测缩合反应完成的程度，反应完全后用DMF重复洗涤以除去未反应的残留液体；
四、肽链的延长：重复步骤二和三，分别按照氨基酸序列的顺序，从多肽的C-端到N-端依次将“Fmoc”基团保护的氨基酸逐个缩合到树脂上，直至所有氨基酸残基缩合完成，得到肽树脂；
五、肽链从树脂上的切割：将肽树脂上最后连接的氨基酸的“Fmoc”基团完全脱除，然后用二氯甲烷和甲醇交替洗涤肽树脂，抽干溶剂后，向肽树脂中加入切割试剂，于室温下切割反应3h；收集切割试剂并减压旋干，用冰冷乙醚析出沉淀，静置片刻后去除乙醚上清，再用水及乙酸充分溶解沉淀，倒入分液漏斗，并加入乙酸乙酯萃取，收集水相，经冷冻干燥，得白色或淡黄色固体粉末粗肽；
六、粗肽的脱盐与纯化：以体积浓度10％～20％的乙酸溶液为流动相，将粗肽通过Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱脱盐，利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥，得到脱盐的多肽化合物；再通过反相高效液相色谱柱进行分离纯化，收集主峰，冷冻干燥后得到白色或淡黄色的固体粉末纯肽；
其中步骤四所述氨基酸序列的顺序为Tyr-β-Pro-Trp-Phe-(Gly)2-(Arg)2、Tyr-D-Ala-Trp-Phe-(Gly)2-(Arg)2、Tyr-Sar-Trp-Phe-(Gly)2-(Arg)2、Tyr-β-Pro-Trp-Phe-(Gly)2-(Arg)5、Tyr-D-Ala-Trp-Phe-(Gly)2-(Arg)5或Tyr-Sar-Trp-Phe-(Gly)2-(Arg)5。
所述Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂购于天津南开和成科技有限公司；“Fmoc”基团保护的氨基酸购于上海吉尔生化有限公司。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：步骤三中“Fmoc”基团保护的氨基酸的摩尔量为Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂摩尔量的2.5～3倍。其它与具体实施方式二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三不同的是：步骤三中N-羟基苯并三氮唑的摩尔量为Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂摩尔量的2.5～3倍。其它与具体实施方式二或三相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二至四之一不同的是：步骤三中O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐的摩尔量为Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂摩尔量的2.5～3倍。其它与具体实施方式二至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式二至五之一不同的是：步骤三中二异丙基乙胺的摩尔量为Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂摩尔量的5～6倍。其它与具体实施方式二至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式二至六之一不同的是：步骤五中每克肽树脂加入10～25mL的切割试剂。其它与具体实施方式二至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式二至七之一不同的是：步骤五所述切割试剂由三氟乙酸、苯酚、苯甲硫醚、1,2-乙二硫醇和水按照体积比82.5:5:5:2.5:5混合而成。其它与具体实施方式二至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式二至八之一不同的是：步骤五中将肽树脂上最后连接的氨基酸的“Fmoc”基团完全脱除的具体方法为：
A、将肽树脂用DMF洗涤3min，减压抽滤至抽干，重复3次；
B、在肽树脂中加入8～12mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌5min后抽干，重复2次；
C、再加入10～14mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌15min，之后抽干溶剂，最后用8～12mL DMF洗涤，得到脱除“Fmoc”保护基团的肽树脂。其它与具体实施方式二至八之一相同。
具体实施方式十：本实施方式偶联寡聚精氨酸及2位取代的内吗啡肽-1类似物在制备多肽镇痛药物中的应用。
为验证本发明的有益效果，进行以下实验：
实施例1：
本实施例偶联寡聚精氨酸及2位取代的内吗啡肽-1类似物的合成方法，按以下步骤进行：
一、“Fmoc”保护的Wang树脂预处理：检查固相合成仪的气密性，将1.2g带有一个氨基酸残基的Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂放入固相合成仪，加10mL二氯甲烷搅拌30min，使树脂充分浸泡溶胀后，减压抽滤至抽干溶剂；
二、脱除“Fmoc”保护基团：将抽干后的溶胀树脂用DMF洗涤3min，减压抽滤至抽干，重复3次；
在树脂中加入10mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌5min后抽干，重复2次；
再加入12mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌15min，使“Fmoc”保护基团充分脱除，之后抽干溶剂；最后用10mLDMF洗涤除净脱保护试剂，得到脱除“Fmoc”保护基团的树脂；
三、氨基酸缩合反应：依次将“Fmoc”基团保护的氨基酸、N-羟基苯并三氮唑和O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐溶于10mL DMF中，再加入二异丙基乙胺，混匀后得混合溶液；然后将混合溶液加入到步骤二的脱除“Fmoc”保护基团的树脂中，在氩气保护下搅拌反应60min；通过茚检试剂检测缩合反应完成的程度，反应完全后用DMF重复洗涤以除去未反应的残留液体；其中“Fmoc”基团保护的氨基酸的摩尔量为Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂摩尔量的3倍；N-羟基苯并三氮唑的摩尔量为Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂摩尔量的3倍；O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐的摩尔量为Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂摩尔量的3倍；二异丙基乙胺的摩尔量为Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂摩尔量的5.5倍；
四、肽链的延长：重复步骤二和三，按照氨基酸序列的顺序Tyr-β-Pro-Trp-Phe-(Gly)2-(Arg)2，从多肽的C-端到N-端依次将“Fmoc”基团保护的氨基酸逐个缩合到树脂上，直至所有氨基酸残基缩合完成，得到肽树脂；
五、肽链从树脂上的切割：将肽树脂上最后连接的氨基酸的“Fmoc”基团完全脱除，然后用二氯甲烷和甲醇交替洗涤树脂，抽干溶剂后，按每克肽树脂加入15mL的切割试剂，于室温下切割反应3h；收集切割试剂并减压旋干，用冰冷乙醚析出沉淀，静置片刻后去除乙醚上清，再用水及少量乙酸充分溶解沉淀，倒入分液漏斗，并加入乙酸乙酯萃取，收集水相，经冷冻干燥，得白色或淡黄色固体粉末粗肽；所述切割试剂由三氟乙酸、苯酚、苯甲硫醚、1,2-乙二硫醇和水按照体积比82.5:5:5:2.5:5混合而成；
六、粗肽的脱盐与纯化：以体积浓度15％的乙酸溶液为流动相，将粗肽通过SephadexG25交联葡聚糖凝胶柱脱盐，利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥，得到脱盐的多肽化合物；再通过反相高效液相色谱柱进行分离纯化，收集主峰，冷冻干燥后得到白色或淡黄色的固体粉末纯肽，即为内吗啡肽-1类似物1。
步骤五中将肽树脂上最后连接的氨基酸的“Fmoc”基团完全脱除的具体方法为：
A、将肽树脂用DMF洗涤3min，减压抽滤至抽干，重复3次；
B、在肽树脂中加入10mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌5min后抽干，重复2次；
C、再加入12mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌15min，之后抽干溶剂，最后用10mL DMF洗涤，得到脱除“Fmoc”保护基团的肽树脂。其它与具体实施方式一相同。
本实施例制备的内吗啡肽-1类似物1的结构如下：
其中AA为β-Pro，n为2。
实施例2：
本实施例偶联寡聚精氨酸及2位取代的内吗啡肽-1类似物的合成方法，按以下步骤进行：
一、“Fmoc”保护的Wang树脂预处理：检查固相合成仪的气密性，将1.2g带有一个氨基酸残基的Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂放入固相合成仪，加10mL二氯甲烷搅拌30min，使树脂充分浸泡溶胀后，减压抽滤至抽干溶剂；
二、脱除“Fmoc”保护基团：将抽干后的溶胀树脂用DMF洗涤3min，减压抽滤至抽干，重复3次；
在树脂中加入10mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌5min后抽干，重复2次；
再加入12mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌15min，使“Fmoc”保护基团充分脱除，之后抽干溶剂；最后用10mLDMF洗涤除净脱保护试剂，得到脱除“Fmoc”保护基团的树脂；
三、氨基酸缩合反应：依次将“Fmoc”基团保护的氨基酸、N-羟基苯并三氮唑和O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐溶于8mL DMF中，再加入二异丙基乙胺，混匀后得混合溶液；然后将混合溶液加入到步骤二的脱除“Fmoc”保护基团的树脂中，在氩气保护下搅拌反应60min；通过茚检试剂检测缩合反应完成的程度，反应完全后用DMF重复洗涤以除去未反应的残留液体；其中“Fmoc”基团保护的氨基酸的摩尔量为Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂摩尔量的3倍；N-羟基苯并三氮唑的摩尔量为Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂摩尔量的3倍；O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐的摩尔量为Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂摩尔量的3倍；二异丙基乙胺的摩尔量为Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂摩尔量的5.5倍；
四、肽链的延长：重复步骤二和三，按照氨基酸序列的顺序Tyr-D-Ala-Trp-Phe-(Gly)2-(Arg)2，从多肽的C-端到N-端依次将“Fmoc”基团保护的氨基酸逐个缩合到树脂上，直至所有氨基酸残基缩合完成，得到肽树脂；
五、肽链从树脂上的切割：将肽树脂上最后连接的氨基酸的“Fmoc”基团完全脱除，然后用二氯甲烷和甲醇交替洗涤树脂，抽干溶剂后，按每克肽树脂加入15mL的切割试剂，于室温下切割反应3h；收集切割试剂并减压旋干，用冰冷乙醚析出沉淀，静置片刻后去除乙醚上清，再用水及少量乙酸充分溶解沉淀，倒入分液漏斗，并加入乙酸乙酯萃取，收集水相，经冷冻干燥，得白色或淡黄色固体粉末粗肽；所述切割试剂由三氟乙酸、苯酚、苯甲硫醚、1,2-乙二硫醇和水按照体积比82.5:5:5:2.5:5混合而成；
六、粗肽的脱盐与纯化：以体积浓度15％的乙酸溶液为流动相，将粗肽通过SephadexG25交联葡聚糖凝胶柱脱盐，利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥，得到脱盐的多肽化合物；再通过反相高效液相色谱柱进行分离纯化，收集主峰，冷冻干燥后得到白色或淡黄色的固体粉末纯肽，即为内吗啡肽-1类似物2。
步骤五中将肽树脂上最后连接的氨基酸的“Fmoc”基团完全脱除的具体方法为：
A、将肽树脂用DMF洗涤3min，减压抽滤至抽干，重复3次；
B、在肽树脂中加入10mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌5min后抽干，重复2次；
C、再加入12mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌15min，之后抽干溶剂，最后用10mL DMF洗涤，得到脱除“Fmoc”保护基团的肽树脂。其它与具体实施方式一相同。
本实施例制备的内吗啡肽-1类似物2的结构如下：
其中AA为D-Ala，n为2。
实施例3：
本实施例偶联寡聚精氨酸及2位取代的内吗啡肽-1类似物的合成方法，按以下步骤进行：
一、“Fmoc”保护的Wang树脂预处理：检查固相合成仪的气密性，将1.2g带有一个氨基酸残基的Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂放入固相合成仪，加10mL二氯甲烷搅拌30min，使树脂充分浸泡溶胀后，减压抽滤至抽干溶剂；
二、脱除“Fmoc”保护基团：将抽干后的溶胀树脂用DMF洗涤3min，减压抽滤至抽干，重复3次；
在树脂中加入10mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌5min后抽干，重复2次；
再加入12mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌15min，使“Fmoc”保护基团充分脱除，之后抽干溶剂；最后用10mLDMF洗涤除净脱保护试剂，得到脱除“Fmoc”保护基团的树脂；
三、氨基酸缩合反应：依次将“Fmoc”基团保护的氨基酸、N-羟基苯并三氮唑和O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐溶于10mL DMF中，再加入二异丙基乙胺，混匀后得混合溶液；然后将混合溶液加入到步骤二的脱除“Fmoc”保护基团的树脂中，在氩气保护下搅拌反应60min；通过茚检试剂检测缩合反应完成的程度，反应完全后用DMF重复洗涤以除去未反应的残留液体；其中“Fmoc”基团保护的氨基酸的摩尔量为Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂摩尔量的3倍；N-羟基苯并三氮唑的摩尔量为Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂摩尔量的3倍；O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐的摩尔量为Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂摩尔量的3倍；二异丙基乙胺的摩尔量为Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂摩尔量的5.5倍；
四、肽链的延长：重复步骤二和三，按照氨基酸序列的顺序Tyr-Sar-Trp-Phe-(Gly)2-(Arg)2，从多肽的C-端到N-端依次将“Fmoc”基团保护的氨基酸逐个缩合到树脂上，直至所有氨基酸残基缩合完成，得到肽树脂；
五、肽链从树脂上的切割：将肽树脂上最后连接的氨基酸的“Fmoc”基团完全脱除，然后用二氯甲烷和甲醇交替洗涤树脂，抽干溶剂后，按每克肽树脂加入15mL的切割试剂，于室温下切割反应3h；收集切割试剂并减压旋干，用冰冷乙醚析出沉淀，静置片刻后去除乙醚上清，再用水及少量乙酸充分溶解沉淀，倒入分液漏斗，并加入乙酸乙酯萃取，收集水相，经冷冻干燥，得白色或淡黄色固体粉末粗肽；所述切割试剂由三氟乙酸、苯酚、苯甲硫醚、1,2-乙二硫醇和水按照体积比82.5:5:5:2.5:5混合而成；
六、粗肽的脱盐与纯化：以体积浓度15％的乙酸溶液为流动相，将粗肽通过SephadexG25交联葡聚糖凝胶柱脱盐，利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥，得到脱盐的多肽化合物；再通过反相高效液相色谱柱进行分离纯化，收集主峰，冷冻干燥后得到白色或淡黄色的固体粉末纯肽，即为内吗啡肽-1类似物3。
步骤五中将肽树脂上最后连接的氨基酸的“Fmoc”基团完全脱除的具体方法为：
A、将肽树脂用DMF洗涤3min，减压抽滤至抽干，重复3次；
B、在肽树脂中加入10mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌5min后抽干，重复2次；
C、再加入12mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌15min，之后抽干溶剂，最后用10mL DMF洗涤，得到脱除“Fmoc”保护基团的肽树脂。其它与具体实施方式一相同。
本实施例制备的内吗啡肽-1类似物3的结构如下：
其中AA为Sar，n为2。
实施例4：
本实施例偶联寡聚精氨酸及2位取代的内吗啡肽-1类似物的合成方法，按以下步骤进行：
一、“Fmoc”保护的Wang树脂预处理：检查固相合成仪的气密性，将1.2g带有一个氨基酸残基的Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂放入固相合成仪，加10mL二氯甲烷搅拌30min，使树脂充分浸泡溶胀后，减压抽滤至抽干溶剂；
二、脱除“Fmoc”保护基团：将抽干后的溶胀树脂用DMF洗涤3min，减压抽滤至抽干，重复3次；
在树脂中加入10mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌5min后抽干，重复2次；
再加入12mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌15min，使“Fmoc”保护基团充分脱除，之后抽干溶剂；最后用10mLDMF洗涤除净脱保护试剂，得到脱除“Fmoc”保护基团的树脂；
三、氨基酸缩合反应：依次将“Fmoc”基团保护的氨基酸、N-羟基苯并三氮唑和O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐溶于10mL DMF中，再加入二异丙基乙胺，混匀后得混合溶液；然后将混合溶液加入到步骤二的脱除“Fmoc”保护基团的树脂中，在氩气保护下搅拌反应60min；通过茚检试剂检测缩合反应完成的程度，反应完全后用DMF重复洗涤以除去未反应的残留液体；其中“Fmoc”基团保护的氨基酸的摩尔量为Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂摩尔量的3倍；N-羟基苯并三氮唑的摩尔量为Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂摩尔量的3倍；O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐的摩尔量为Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂摩尔量的3倍；二异丙基乙胺的摩尔量为Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂摩尔量的5.5倍；
四、肽链的延长：重复步骤二和三，按照氨基酸序列的顺序Tyr-β-Pro-Trp-Phe-(Gly)2-(Arg)5，从多肽的C-端到N-端依次将“Fmoc”基团保护的氨基酸逐个缩合到树脂上，直至所有氨基酸残基缩合完成，得到肽树脂；
五、肽链从树脂上的切割：将肽树脂上最后连接的氨基酸的“Fmoc”基团完全脱除，然后用二氯甲烷和甲醇交替洗涤树脂，抽干溶剂后，按每克肽树脂加入15mL的切割试剂，于室温下切割反应3h；收集切割试剂并减压旋干，用冰冷乙醚析出沉淀，静置片刻后去除乙醚上清，再用水及少量乙酸充分溶解沉淀，倒入分液漏斗，并加入乙酸乙酯萃取，收集水相，经冷冻干燥，得白色或淡黄色固体粉末粗肽；所述切割试剂由三氟乙酸、苯酚、苯甲硫醚、1,2-乙二硫醇和水按照体积比82.5:5:5:2.5:5混合而成；
六、粗肽的脱盐与纯化：以体积浓度15％的乙酸溶液为流动相，将粗肽通过SephadexG25交联葡聚糖凝胶柱脱盐，利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥，得到脱盐的多肽化合物；再通过反相高效液相色谱柱进行分离纯化，收集主峰，冷冻干燥后得到白色或淡黄色的固体粉末纯肽，即为内吗啡肽-1类似物4。
步骤五中将肽树脂上最后连接的氨基酸的“Fmoc”基团完全脱除的具体方法为：
A、将肽树脂用DMF洗涤3min，减压抽滤至抽干，重复3次；
B、在肽树脂中加入10mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌5min后抽干，重复2次；
C、再加入12mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌15min，之后抽干溶剂，最后用10mL DMF洗涤，得到脱除“Fmoc”保护基团的肽树脂。其它与具体实施方式一相同。
本实施例制备的内吗啡肽-1类似物4的结构如下：
其中AA为β-Pro，n为5。
实施例5：
本实施例偶联寡聚精氨酸及2位取代的内吗啡肽-1类似物的合成方法，按以下步骤进行：
一、“Fmoc”保护的Wang树脂预处理：检查固相合成仪的气密性，将1.2g带有一个氨基酸残基的Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂放入固相合成仪，加10mL二氯甲烷搅拌30min，使树脂充分浸泡溶胀后，减压抽滤至抽干溶剂；
二、脱除“Fmoc”保护基团：将抽干后的溶胀树脂用DMF洗涤3min，减压抽滤至抽干，重复3次；
在树脂中加入10mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌5min后抽干，重复2次；
再加入12mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌15min，使“Fmoc”保护基团充分脱除，之后抽干溶剂；最后用10mLDMF洗涤除净脱保护试剂，得到脱除“Fmoc”保护基团的树脂；
三、氨基酸缩合反应：依次将“Fmoc”基团保护的氨基酸、N-羟基苯并三氮唑和O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐溶于6mL DMF中，再加入二异丙基乙胺，混匀后得混合溶液；然后将混合溶液加入到步骤二的脱除“Fmoc”保护基团的树脂中，在氩气保护下搅拌反应60min；通过茚检试剂检测缩合反应完成的程度，反应完全后用DMF重复洗涤以除去未反应的残留液体；其中“Fmoc”基团保护的氨基酸的摩尔量为Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂摩尔量的3倍；N-羟基苯并三氮唑的摩尔量为Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂摩尔量的3倍；O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐的摩尔量为Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂摩尔量的3倍；二异丙基乙胺的摩尔量为Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂摩尔量的5.5倍；
四、肽链的延长：重复步骤二和三，按照氨基酸序列的顺序Tyr-D-Ala-Trp-Phe-(Gly)2-(Arg)5，从多肽的C-端到N-端依次将“Fmoc”基团保护的氨基酸逐个缩合到树脂上，直至所有氨基酸残基缩合完成，得到肽树脂；
五、肽链从树脂上的切割：将肽树脂上最后连接的氨基酸的“Fmoc”基团完全脱除，然后用二氯甲烷和甲醇交替洗涤树脂，抽干溶剂后，按每克肽树脂加入15mL的切割试剂，于室温下切割反应3h；收集切割试剂并减压旋干，用冰冷乙醚析出沉淀，静置片刻后去除乙醚上清，再用水及少量乙酸充分溶解沉淀，倒入分液漏斗，并加入乙酸乙酯萃取，收集水相，经冷冻干燥，得白色或淡黄色固体粉末粗肽；所述切割试剂由三氟乙酸、苯酚、苯甲硫醚、1,2-乙二硫醇和水按照体积比82.5:5:5:2.5:5混合而成；
六、粗肽的脱盐与纯化：以体积浓度15％的乙酸溶液为流动相，将粗肽通过SephadexG25交联葡聚糖凝胶柱脱盐，利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥，得到脱盐的多肽化合物；再通过反相高效液相色谱柱进行分离纯化，收集主峰，冷冻干燥后得到白色或淡黄色的固体粉末纯肽，即为内吗啡肽-1类似物5。
步骤五中将肽树脂上最后连接的氨基酸的“Fmoc”基团完全脱除的具体方法为：
A、将肽树脂用DMF洗涤3min，减压抽滤至抽干，重复3次；
B、在肽树脂中加入10mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌5min后抽干，重复2次；
C、再加入12mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌15min，之后抽干溶剂，最后用10mL DMF洗涤，得到脱除“Fmoc”保护基团的肽树脂。其它与具体实施方式一相同。
本实施例制备的内吗啡肽-1类似物5的结构如下：
其中AA为D-Ala，n为5。
实施例6：
本实施例偶联寡聚精氨酸及2位取代的内吗啡肽-1类似物的合成方法，按以下步骤进行：
一、“Fmoc”保护的Wang树脂预处理：检查固相合成仪的气密性，将1.2g带有一个氨基酸残基的Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂放入固相合成仪，加10mL二氯甲烷搅拌30min，使树脂充分浸泡溶胀后，减压抽滤至抽干溶剂；
二、脱除“Fmoc”保护基团：将抽干后的溶胀树脂用DMF洗涤3min，减压抽滤至抽干，重复3次；
在树脂中加入10mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌5min后抽干，重复2次；
再加入12mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌15min，使“Fmoc”保护基团充分脱除，之后抽干溶剂；最后用10mLDMF洗涤除净脱保护试剂，得到脱除“Fmoc”保护基团的树脂；
三、氨基酸缩合反应：依次将“Fmoc”基团保护的氨基酸、N-羟基苯并三氮唑和O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐溶于6mL DMF中，再加入二异丙基乙胺，混匀后得混合溶液；然后将混合溶液加入到步骤二的脱除“Fmoc”保护基团的树脂中，在氩气保护下搅拌反应60min；通过茚检试剂检测缩合反应完成的程度，反应完全后用DMF重复洗涤以除去未反应的残留液体；其中“Fmoc”基团保护的氨基酸的摩尔量为Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂摩尔量的3倍；N-羟基苯并三氮唑的摩尔量为Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂摩尔量的3倍；O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐的摩尔量为Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂摩尔量的3倍；二异丙基乙胺的摩尔量为Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂摩尔量的5.5倍；
四、肽链的延长：重复步骤二和三，按照氨基酸序列的顺序Tyr-Sar-Trp-Phe-(Gly)2-(Arg)5，从多肽的C-端到N-端依次将“Fmoc”基团保护的氨基酸逐个缩合到树脂上，直至所有氨基酸残基缩合完成，得到肽树脂；
五、肽链从树脂上的切割：将肽树脂上最后连接的氨基酸的“Fmoc”基团完全脱除，然后用二氯甲烷和甲醇交替洗涤树脂，抽干溶剂后，按每克肽树脂加入15mL的切割试剂，于室温下切割反应3h；收集切割试剂并减压旋干，用冰冷乙醚析出沉淀，静置片刻后去除乙醚上清，再用水及少量乙酸充分溶解沉淀，倒入分液漏斗，并加入乙酸乙酯萃取，收集水相，经冷冻干燥，得白色或淡黄色固体粉末粗肽；所述切割试剂由三氟乙酸、苯酚、苯甲硫醚、1,2-乙二硫醇和水按照体积比82.5:5:5:2.5:5混合而成；
六、粗肽的脱盐与纯化：以体积浓度15％的乙酸溶液为流动相，将粗肽通过SephadexG25交联葡聚糖凝胶柱脱盐，利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥，得到脱盐的多肽化合物；再通过反相高效液相色谱柱进行分离纯化，收集主峰，冷冻干燥后得到白色或淡黄色的固体粉末纯肽，即为内吗啡肽-1类似物6。
步骤五中将肽树脂上最后连接的氨基酸的“Fmoc”基团完全脱除的具体方法为：
A、将肽树脂用DMF洗涤3min，减压抽滤至抽干，重复3次；
B、在肽树脂中加入10mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌5min后抽干，重复2次；
C、再加入12mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌15min，之后抽干溶剂，最后用10mL DMF洗涤，得到脱除“Fmoc”保护基团的肽树脂。其它与具体实施方式一相同。
本实施例制备的内吗啡肽-1类似物6的结构如下：
其中AA为Sar，n为5。
以上实施例制备的内吗啡肽-1类似物的产率均达到50％以上，质谱和色谱分析检测结果如表1所示。
表1.内吗啡肽-1类似物1-6的质谱和色谱分析检测结果
表1的结果表明，本发明得到的类似物的检测值与理论值相符。
实施例1-6制备的偶联寡聚精氨酸及2位取代的内吗啡肽-1类似物的药理活性实验如下：
1、同位素配体受体亲和实验
采用HEK293细胞株稳定表达阿片受体，实验分为总结合管、竞争结合管和非特异性结合管，每个反应管中依次加入放射配体，纳洛酮(Naloxone，Nx)/非放射性药物，Tris-HCl(pH＝7.4)和细胞悬液(200μL)。其中，在总结合管中只加入[3H]DAMGO(0.5nM)或[3H]DPDPE(1nM)和细胞悬液(200μL)，在非特异性结合管和竞争结合管中，分别另加入10μM Nx/不同浓度的类似物和细胞悬液，最后补充Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)至总体积0.4mL。振荡器混匀反应液，37℃摇床反应1h，取出离心管，反应液经ZT-II型细胞收集器收集，GF/C型玻璃纤维素膜过滤。80℃油浴下烘烤玻璃纤维素膜30min后取出滤膜，放入24孔板中，每孔加入0.7mL闪烁液，封盖膜封盖。隔夜用β液体闪烁计数仪记录放射性强度(CPM)。利用成都泰盟BL-420F生物系统计算类似物对特异性结合的抑制率，以浓度的负对数为横坐标，抑制率为纵坐标，线性回归求得IC50值，根据公式Ki＝IC50/(1+[L]/KD)计算Ki值。每个实验数据分别平行做3组实验求平均值。
实验结果见表2。表2的数据显示，类似物1-6的μ-阿片受体和δ-阿片受体的亲和性都略低于母体内吗啡肽-1，但是类似物1,2,4和5的μ-阿片受体亲和性较高，仍然保留较好的阿片活性。
表2.内吗啡肽-1及其类似物1-6的μ/δ阿片受体亲和能力
2、离体酶解稳定性实验
取10μL多肽母液(10-2M)，加入到190μL的100％小鼠血清或15％脑质膜中，立即振荡混匀，然后迅速取出20μL混合液，加入离心管中计时为0min，余者于37℃下继续孵育，并分别在5min，10min，15min，30min，60min，120min，240min取出20μL。酶解过程的终止：于取出的样品中加入90μL乙腈振荡混匀，样品置于冰上放置5分钟，再用90μL 0.5％的冰冷乙酸稀释以确保酶解过程停止。13000g离心15min，收集上清，-80℃冻存，直至RP-HPLC分析。
实验结果见表3。表3的结果显示，内吗啡肽-1的小鼠脑质膜和血清半衰期较短，而所有类似物1-6的半衰期都显著长于母体内吗啡肽-1。其中，类似物3和6在两种介质中的酶解稳定性更高。该结果表明3位非天然氨基酸的引入显著增强了内吗啡肽-1类似物的抗酶解能力。
表3.内吗啡肽-1及其类似物1-6的脑膜和血清半衰期
多肽 酶解稳定性(半衰期min)
脑膜 血清
内吗啡肽-1 18.3±1.2 9.0±1.1
类似物1 61.5±3.8 34.4±1.8
类似物2 62.6±7.9 30.0±3.6
类似物3 89.2±7.4 46.0±3.0
类似物4 62.3±2.6 32.5±1.5
类似物5 59.5±1.7 39.2±5.1
类似物6 85.9±10.1 45.7±3.3
3、温水浴甩尾镇痛实验
采用昆明系雄性小鼠，18-20g，环境温度：20℃，水浴温度：50±0.5℃。给药前先测定小鼠的基础痛阈(control latency，CL)，将小鼠鼠尾的1/3-1/2浸入水浴，记录鼠尾从刚浸入水浴至发生收缩的时间。过于敏感(<3s)或迟钝的(>5s)小鼠弃去不用，截止时间10s，以防止小鼠烫伤。侧脑室给药后第5,10,15,20,25,30,40and 50min各测一次甩尾潜伏期(test latency，TL)，皮下给药后第5,10,15,20,25,30,45,60and 90min各测一次TL，0.9％生理盐水作为空白对照。结果以最大可能效应百分比(maximum possible effect，％MPE)表示：％MPE＝100×(TL-CL)/(10-CL)。
实验结果如图1、2、3、4、5、6和7所示，图1为侧脑室注射内吗啡肽-1类似物1的镇痛效应-时间曲线，图1中—■—表示注射100nmol剂量，—●—表示注射33nmol剂量，—▲—表示注射10nmol剂量，—▼—表示注射3.3nmol剂量，—◆—表示注射生理盐水；图2为侧脑室注射内吗啡肽-1类似物2的镇痛效应-时间曲线，图2中—■—表示注射100nmol剂量，—●—表示注射33nmol剂量，—▲—表示注射10nmol剂量，—▼—表示注射3.3nmol剂量，—◆—表示注射生理盐水；图3为侧脑室注射内吗啡肽-1类似物4的镇痛效应-时间曲线，图3中—■—表示注射100nmol剂量，—●—表示注射33nmol剂量，—▲—表示注射10nmol剂量，—▼—表示注射3.3nmol剂量，—◆—表示注射生理盐水；图4为侧脑室注射内吗啡肽-1类似物5的镇痛效应-时间曲线，图4中—■—表示注射100nmol剂量，—●—表示注射33nmol剂量，—▲—表示注射10nmol剂量，—▼—表示注射3.3nmol剂量，—◆—表示注射生理盐水；图5为皮下注射内吗啡肽-1类似物1,2的镇痛效应-时间曲线，图5中—■—表示类似物1，—●—表示类似物2，—▲—表示生理盐水；图6为皮下注射内吗啡肽-1类似物4,5的镇痛效应-时间曲线，图6中—■—表示类似物4，—●—表示类似物5，—▲—表示生理盐水；图7是中枢注射纳洛酮对皮下注射类似物1,2,4和5镇痛活性的拮抗作用，图7中——表示类似物，——表示类似物+纳洛酮。
侧脑室注射3.3～100nmol剂量的类似物1、2、4和5产生浓度依赖型的显著镇痛效果，在注射药物5min后产生最大的镇痛作用，且镇痛持续时间较长，这表明这些类似物具有高效的中枢镇痛效果。此外，皮下注射50μmol/kg的类似物1、2、4和5，结果发现类似物都具有一定的镇痛活性，并且是通过阿片受体介导了该镇痛作用，这表明内吗啡肽-1的C-末端连接寡聚精氨酸以及2位非天然氨基酸的引入改进了药物向中枢神经系统的转运能力，进而引起外周给药产生的中枢阿片受体介导的镇痛作用。
4、结肠转运实验
雄性昆明系小鼠(体重25-30g)，实验开始前禁食1h，乙醚轻微麻醉，将d＝3mm的玻璃珠塞到末端结肠(距肛门2cm)处，小鼠自由活动，测定基础排珠时间，排珠时间大于30min的小鼠剔除。相同条件下，侧脑室注射不同浓度药物，注射体积5μl。5min后开始测定排珠时间，转运计算公式：％MPE＝(给药后排珠时间-基础排珠时间)/基础排珠时间×100。
实验结果如图8所示，图8中—■—表示内吗啡肽-1，——表示类似物1，——表示类似物2，——表示类似物4，——表示类似物5。侧脑室注射0.5-5nmol的内吗啡肽-1和类似物1,2,4,和5产生浓度依赖型的增强结肠排珠潜能性，但是类似物的作用明显弱于母体内吗啡肽-1，这表明本发明的类似物降低了胃肠道副作用等优点，具有较高的医学应用价值。
综上所述，本发明偶联寡聚精氨酸及2位取代的内吗啡肽-1类似物利用寡聚精氨酸是一种阳离子化的细胞穿膜肽，将其连接在内吗啡肽-1的C-末端，能够通过与负电荷的非特异静电相互作用而吸附到细胞表面，进而增强内吗啡肽-1类似物的中枢运输。2位非天然氨基酸的引入则会增强内吗啡肽-1类似物的酶解稳定性。通过同位素配体受体亲和实验，酶解稳定性，温水浴甩尾镇痛实验和结肠转运实验，对本发明合成的高效类似物进行药理学活性鉴定。结果表明，这类新型类似物具备较高的阿片亲和性和激动剂活性，具有比母体内吗啡肽-1更高的生物稳定性。此外，类似物1,2,4和5具有较高的外周给药的镇痛活性，以及降低胃肠道副作用等优点。因此，本发明的内吗啡肽-1类似物极大提高了药物的利用率和效能，具有较高的临床止痛应用价值。

Claims (10)

1.偶联寡聚精氨酸及2位取代的内吗啡肽-1类似物，其特征在于类似物的结构如下：
其中AA为β-Pro、D-Ala或Sar，n为2或5。
2.权利要求1所述偶联寡聚精氨酸及2位取代的内吗啡肽-1类似物的合成方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：
一、“Fmoc”保护的Wang树脂预处理：将1.2g带有一个氨基酸残基的Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂放入固相合成仪，加8～12mL二氯甲烷搅拌30min，减压抽滤至抽干溶剂；
二、脱除“Fmoc”保护基团：将抽干后的溶胀树脂用DMF洗涤3min，减压抽滤至抽干，重复3次；
在树脂中加入8～12mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌5min后抽干，重复2次；
再加入10～14mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌15min，之后抽干溶剂，最后用8～12mLDMF洗涤，得到脱除“Fmoc”保护基团的树脂；
三、氨基酸缩合反应：依次将“Fmoc”基团保护的氨基酸、N-羟基苯并三氮唑和O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐溶于6～10mL DMF中，再加入二异丙基乙胺，混匀后得混合溶液；然后将混合溶液加入到步骤二的脱除“Fmoc”保护基团的树脂中，在氩气保护下搅拌反应60min；通过茚检试剂检测缩合反应完成的程度，反应完全后用DMF重复洗涤以除去未反应的残留液体；
四、肽链的延长：重复步骤二和三，分别按照氨基酸序列的顺序，从多肽的C-端到N-端依次将“Fmoc”基团保护的氨基酸逐个缩合到树脂上，直至所有氨基酸残基缩合完成，得到肽树脂；
五、肽链从树脂上的切割：将肽树脂上最后连接的氨基酸的“Fmoc”基团完全脱除，然后用二氯甲烷和甲醇交替洗涤肽树脂，抽干溶剂后，向肽树脂中加入切割试剂，于室温下切割反应3h；收集切割试剂并减压旋干，用冰冷乙醚析出沉淀，静置片刻后去除乙醚上清，再用水及乙酸充分溶解沉淀，倒入分液漏斗，并加入乙酸乙酯萃取，收集水相，经冷冻干燥，得白色或淡黄色固体粉末粗肽；
六、粗肽的脱盐与纯化：以体积浓度10％～20％的乙酸溶液为流动相，将粗肽通过Sephadex G25交联葡聚糖凝胶柱脱盐，利用紫外检测仪收集主峰后冷冻干燥，得到脱盐的多肽化合物；再通过反相高效液相色谱柱进行分离纯化，收集主峰，冷冻干燥后得到白色或淡黄色的固体粉末纯肽；
其中步骤四所述氨基酸序列的顺序为Tyr-β-Pro-Trp-Phe-(Gly)2-(Arg)2、Tyr-D-Ala-Trp-Phe-(Gly)2-(Arg)2、Tyr-Sar-Trp-Phe-(Gly)2-(Arg)2、Tyr-β-Pro-Trp-Phe-(Gly)2-(Arg)5、Tyr-D-Ala-Trp-Phe-(Gly)2-(Arg)5或Tyr-Sar-Trp-Phe-(Gly)2-(Arg)5。
3.根据权利要求2所述的偶联寡聚精氨酸及2位取代的内吗啡肽-1类似物的合成方法，其特征在于步骤三中“Fmoc”基团保护的氨基酸的摩尔量为Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂摩尔量的2.5～3倍。
4.根据权利要求2或3所述的偶联寡聚精氨酸及2位取代的内吗啡肽-1类似物的合成方法，其特征在于步骤三中N-羟基苯并三氮唑的摩尔量为Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂摩尔量的2.5～3倍。
5.根据权利要求4所述的偶联寡聚精氨酸及2位取代的内吗啡肽-1类似物的合成方法，其特征在于步骤三中O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲-六氟磷酸盐的摩尔量为Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂摩尔量的2.5～3倍。
6.根据权利要求5所述的偶联寡聚精氨酸及2位取代的内吗啡肽-1类似物的合成方法，其特征在于步骤三中二异丙基乙胺的摩尔量为Fmoc-Arg(pbf)-Wang树脂摩尔量的5～6倍。
7.根据权利要求6所述的偶联寡聚精氨酸及2位取代的内吗啡肽-1类似物的合成方法，其特征在于步骤五中每克肽树脂加入10～25mL的切割试剂。
8.根据权利要求7所述的偶联寡聚精氨酸及2位取代的内吗啡肽-1类似物的合成方法，其特征在于步骤五所述切割试剂由三氟乙酸、苯酚、苯甲硫醚、1,2-乙二硫醇和水按照体积比82.5:5:5:2.5:5混合而成。
9.根据权利要求8所述的偶联寡聚精氨酸及2位取代的内吗啡肽-1类似物的合成方法，其特征在于步骤五中将肽树脂上最后连接的氨基酸的“Fmoc”基团完全脱除的具体方法为：
A、将肽树脂用DMF洗涤3min，减压抽滤至抽干，重复3次；
B、在肽树脂中加入8～12mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌5min后抽干，重复2次；
C、再加入10～14mL体积百分浓度为20％的哌啶/DMF脱保护溶液，搅拌15min，之后抽干溶剂，最后用8～12mL DMF洗涤，得到脱除“Fmoc”保护基团的肽树脂。
10.权利要求1所述的偶联寡聚精氨酸及2位取代的内吗啡肽-1类似物在制备多肽镇痛药物中的应用。
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