CN105907763A - 一种中国南海芋螺神经毒素编码序列以及应用 - Google Patents

一种中国南海芋螺神经毒素编码序列以及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种中国南海芋螺神经毒素编码序列以及应用，具体涉及一种新的中国南海蜡黄芋螺O‑超家族毒素基因Cq1.1及其编码的多肽序列Cq1.1，该种多肽的制备技术，以及该种多肽在神经生物学研究，离子通道研究和镇痛药物开发中的应用。通过构建cDNA文库的方法，从中国南海蜡黄芋螺的毒管中发现了一种新的O‑超家族毒素基因Cq1.1，利用高通量测序的办法，获得了Cq1.1。本发明制备的重组芋螺毒素Cq1.1通过小鼠热板实验和斑马鱼肌肉注射实验发现，重组芋螺毒素Cq1.1具有中枢镇痛和神经麻醉作用；因此，其可作为探针用于离子通道类型及亚型的分类鉴定或者用于工具药的研究开发和镇痛药物的制备。

Description

一种中国南海芋螺神经毒素编码序列以及应用
技术领域
本发明涉及一种中国南海芋螺神经毒素编码序列以及应用，尤其涉及一种中国南海蜡黄芋螺O-超家族毒素基因Cq1.1及其编码的多肽序列Cq1.1和该种多肽的制备技术，以及该种毒素在神经生物学研究，离子通道药物和镇痛药物开发中的应用。
背景技术
芋螺属于软体动物门腹足纲芋螺科(Conidae)，多数栖息在热带海洋的浅海水域，少数在水深几米至200余米的深水区，因外形呈圆锥形或芋头状而得名。
芋螺具有强大的自然进化能力，全球有注册有706种芋螺种芋螺，单一种属中就包括数百种物种，这使芋螺成为海洋无脊椎动物中进化最成功的生物。芋螺是食肉动物，靠毒液来捕食，根据其捕食习性可分为食鱼芋螺(piscivorous)、食螺芋螺(molluscivorous)、食虫芋螺(vermivorous)。食虫性芋螺种类最多，占全部芋螺种类的70％左右。食鱼性芋螺占芋螺总数最少，但毒性最强，报道的芋螺致死事件基本上是该类芋螺造成的，如织锦芋螺(C.textile)、地纹芋螺(C.geographus)等。
芋螺毒液是捕食与防御作用的主要武器，它是由许多单一毒肽组成的鸡尾酒样的混合毒素，称为芋螺毒素(Conotoxin)。芋螺毒素能特异地作用于神经系统的电压门控和配体门控离子通道的不用亚型和递质受体，因此被广泛用于神经生物学研究。芋螺毒素通常为由7～41个氨基酸残基组成的小分子多肽。大多富含半胱氨酸，具有高度保守的二硫键骨架，肽链短多，富含二硫键，分子结构更为紧密，生物活性更高。大多数芋螺毒素均由单一的mRNA编码，原始的翻译产物是一种特定的多肽前体，约为70-120个氨基酸残基，经复杂的翻译后修饰得到成熟肽。
芋螺毒素在目标猎物体内作用于不同的靶点，产生不同的生理学反应，共同作用使猎物失去活动能力。已有研究表明，芋螺多肽的作用位点主要有配体门控离子通道、G蛋白偶联受体和电压门控离子通道。并且根据作用靶点的不同可以对芋螺毒素进行分类，如α-芋螺毒素(抑制烟碱型乙酰胆碱受体)，ω-芋螺毒素(抑制钙离子通道受体)和κ-芋螺毒素(抑制钾离子通道受体)等。
由于它们作用靶点广泛,能高度特异地结合细胞膜上神经递质和激肽的受体和各种离子通道，一方面，可以被直接开发成药物或作为新药的先导化合物应用于临床；另一方面，可以成为神经生物学中发现鉴定新受体,研究受体构效关系及其调控细胞分子机理的重要探针,并推动了离子通道的进化研究。
目前正在进行临床或者临床前研究的芋螺毒素分别为：ω-MVIIA，ω-CVID，Contulakin-G，χ-MrIA，α-Vc1.1，Conantokin-G，κ-PVIIA，O-MrVIB。
目前，由Elan公司进行开发的ω-CTX MⅦA(SNXⅢ，商品名：Ziconotide)，因其直接作用分布于神经组织的N-型钙离子通道，无需第二信使或蛋白，不成瘾，已成为治疗难治性神经疼痛的新一代药物，已通过了Ⅲ期临床试验，正式被FDA批准上市。而另一个衍生于ω-CTX CⅥD的化合物AM336作用类似于Ziconotide，因其对N-钙通道的选择性更强，副作用更低，已经批准作为对抗严重抗吗啡作用慢性疼痛的治疗药物进入临床试验阶段。此外，Conantokin-G作为NMDA受体高度选择性的拮抗剂，对难以治疗的癫痫有效，也已完成Ⅰ期临床试验。芋螺毒素药用研究的其他方向还有：具有去甲肾上腺素转运蛋白抑制作用的T-超家族芋螺毒素，可用于治疗抑郁症。以及抑制α1-肾上腺素受体的一些芋螺毒素，可用于治疗良性前列腺过度增生引起的尿失禁。与此同时，围绕着增强药物分子的稳定性，降低过敏反应以及增加溶解性以利于口服目的的分子改造研究工作也正在进行。
另一方面，芋螺毒素作为研究离子通道和膜受体的极好探针或工具，已经成为电压门控型钙离子通道(VSCCs)和N型乙酰胆碱受体(nAChRs)等通道、受体鉴定和诊断的标准工具，在神经药理学领域得到了广泛的应用。
芋螺在我国南海海域有广泛分布，已查明的芋螺约有80余种，主要分布在台湾、广东、广西、海南诸省以及西沙和南沙群岛等。
由于芋螺毒素在其基因序列和蛋白质结构及功能方面差异较大，具有种类繁多,结构复杂和高度遗传多样性特征。迄今为止，国外已构建了多种芋螺的cDNA文库，中国南海蜡黄芋螺是一种食虫性芋螺，世界上尚没有通过高通量测序的办法，挖掘它的基因和关于它的三对二硫键的毒素研究的报道。
另外，目前有关芋螺毒素的生化结构及其神经药理活性的研究都是基于天然提取毒素的分子结构,用人工合成的毒素来研究的，高效快速。
因此，开展我国南海蜡黄芋螺毒素的生物化学、药理学尤其是其分子生物学和基因工程技术领域的探索研究将有助于对新毒素分子相应受体及其作用机制的深入研究，为我国芋螺海洋资源的药用开发利用提供重要理论依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的中国南海蜡黄芋螺O-超家族毒素基因Cq1.1，其编码的多肽序列Cq1.1及其类似物和衍生物。
本发明的另一目的在于提供该种多肽的生产方法，按照以下步骤进行：
(1)称取氯树脂1.5g于150ml的反应器中，用50ml的DCM浸泡，其中，所述氯树脂的取代度为0.2mmol/g；
(2)经步骤(1)处理2h后，用DMF洗涤树脂，然后抽干，如此重复四次，将树脂抽干后待用；
(3)称取苏氨酸(Thr)192mg于10ml的离心管中，加入5ml的DCM将其溶解，然后加入1ml的DIEA振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应；
(4)经步骤(3)处理2h后，用一定量的甲醇封头半小时，然后用DMF洗涤四次，抽干待用，其中，甲醇封头采用甲醇：DIEA:DCM＝1：1：2；
(5)向反应器中加入一定量的20％哌啶)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干，其中，哌啶：DMF＝1:4；
(6)取少量树脂用茚三酮法检测，检A、检B各两滴，100℃反应1min，氯树脂有颜色，说明脱保护成功；
(7)称取281mg的半胱氨酸和HOBT 135mg于10ml的离心管中，加入5ml的DMF将其溶解，然后加入0.5ml的DIC振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应；其中，半胱氨酸的侧链特殊修饰C(a)；
(8)经步骤(7)处理1小时后，取少量树脂检测，用茚三酮法检测，检A、检B各两滴，100℃反应1min，若树脂为无色，说明反应完全；若树脂有颜色，说明缩合不完全，继续反应；待反应完全后，用DMF洗涤树脂四次，然后抽干，向反应器中加入一定量的20％哌啶，放在脱色摇床上摇晃20min,以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团；脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干检测保护是否脱去，其中，哌啶：DMF＝1:4；
(9)按照步骤7-9依次接上Asp-Pro-Cys-Cys-Ser-Asn-Pro-Ser-Cys-Ala-Gln-Thr-His-Pro-Glu-Ile-Cys脱去D的保护后,用切割试剂切割下肽链冻干；
(10)粗样品的氧化折叠---碘氧化法：将合成完裂解下来的安诺吉斯肽冻干后，用适量水进行溶解；将新鲜配制的碘液逐滴加入到安诺吉斯肽溶液中，边加边搅拌，直至多肽溶液呈 现淡黄色；反应几分钟后，加入几滴新鲜配制的抗坏血酸溶液，淡黄色褪去，终止氧化。
本发明的第三个目的在于提供了用斑马鱼肌肉注射考察了该种多肽对小鼠药学作用，从而为制备神经生物学研究的工具药和治疗心律失常、顽痛、癫痫以及中风等疾病药物筛选提供数据。
本发明的第四个目的在于提供了用小鼠热板实验来考察该种多肽是否具有中枢镇痛作用，从而为制备镇痛药物提供数据。
本发明的第五个目的在于提供了通过高通量测序挖掘毒素基因的的方法，从中国南海蜡黄芋螺毒管中分离得到O-超家族芋螺毒素Cq1.1基因，其cDNA序列如序列表中<400>1序列所示。
上述本发明基因所编码的多肽，其前体肽氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示；其成熟肽的氨基酸序列如序列表中<400>3序列所示；其成熟肽的分子量为1801.00道尔顿。
本发明所选择的蜡黄芋螺采自海南省三亚市。
蜡黄芋螺毒管cDNA文库的构建：取活螺体，使用喉闸破碎螺壳，暴露出螺肉，冰上小心并快速分离毒管组织，提取总RNA；采用illunina测序平台测序。
本发明通过高通量测序，从中得到了1个新的编码芋螺毒素的克隆，命名为Cq1.1，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示；新基因编码83个氨基酸残基，成熟肽编码29个氨基酸残基，成熟肽段分子量为1801.00道尔顿。
小鼠热板试验结果证实，重组蜡黄芋螺毒素Cq1.1的试验组与空白对照组相比，具有显著性差异(P<0.05)；由此可初步认为Cq1.1具有一定的镇痛和麻醉作用，从而为制备镇痛药物提供数据。
本发明的有益效果：
本发明通过构建cDNA文库的方法，从中国南海蜡黄芋螺的毒管中发现了一种新的O-超家族毒素基因Cq1.1；利用高通量测序的办法，获得了Cq1.1。本发明制备的重组芋螺毒素Cq1.1通过小鼠热板实验和斑马鱼肌肉注射实验发现，本发明制备的重组芋螺毒素Cq1.1具有中枢镇痛和神经麻醉作用。因此，本发明制备的重组芋螺毒素Cq1.1可作为探针用于离子通道类型及亚型的分类鉴定或者用于工具药的研究开发和镇痛药物的制备。
附图说明
利用附图对发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制，对于本领域的普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据以下附图获得其它 的附图。
图1为多肽Cq1.1的高效液相色谱分析图。
图2为多肽Cq1.1的飞行时间质谱分析图。
图3为多肽Cq1.1生理模型上的镇痛药效。
图4为多肽Cq1.1斑马鱼肌肉注射麻醉毒性试验。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明作进一步描述。
一种中国南海芋螺毒素编码序列，从中国南海蜡黄芋螺毒管中分离得到，其核苷酸序列如序列表<400>1所示。
由上述的芋螺毒素编码的多肽，含有权利要求1所述基因编码的氨基酸序列或其保守性变异多肽序列或其活性衍生物。
上述多肽，氨基酸序列如序列表<400>2所示。
上述多肽，成熟肽片段的氨基酸序列如序列表<400>3所示。
本发明还提供一种多肽的生产方法，按照以下步骤进行：
(1)称取氯树脂1.5g于150ml的反应器中，用50ml的DCM浸泡，其中，所述氯树脂的取代度为0.2mmol/g；(2)经步骤(1)处理2h后，用DMF洗涤树脂，然后抽干，如此重复四次，将树脂抽干后待用；(3)称取苏氨酸(Thr)192mg于10ml的离心管中，加入5ml的DCM将其溶解，然后加入1ml的DIEA振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应；(4)经步骤(3)处理2h后，用一定量的甲醇封头半小时，然后用DMF洗涤四次，抽干待用，其中，甲醇封头采用甲醇：DIEA:DCM＝1：1：2；(5)向反应器中加入一定量的20％哌啶)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干，其中，哌啶：DMF＝1:4；(6)取少量树脂用茚三酮法检测，检A、检B各两滴，100℃反应1min，氯树脂有颜色，说明脱保护成功；(7)称取281mg的半胱氨酸和HOBT135mg于10ml的离心管中，加入5ml的DMF将其溶解，然后加入0.5ml的DIC振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应；其中，半胱氨酸的侧链特殊修饰C(a)；(8)经步骤(7)处理1小时后，取少量树脂检测，用茚三酮法检测，检A、检B各两滴，100℃反应1min，若树脂为无色，说明反应完全；若树脂有颜色，说明缩合不完全，继续反应；待反应完全后，用DMF洗涤树脂四次，然后抽干，向反应器中加入一定量的20％哌啶，放在脱 色摇床上摇晃20min,以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团；脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干检测保护是否脱去，其中，哌啶：DMF＝1:4；(9)按照步骤7-9依次接上Asp-Pro-Cys-Cys-Ser-Asn-Pro-Ser-Cys-Ala-Gln-Thr-His-Pro-Glu-Ile-Cys脱去D的保护后,用切割试剂切割下肽链冻干；(10)粗样品的氧化折叠---碘氧化法：将合成完裂解下来的安诺吉斯肽冻干后，用适量水进行溶解。将新鲜配制的碘液逐滴加入到安诺吉斯肽溶液中，边加边搅拌，直至多肽溶液呈现淡黄色；反应几分钟后，加入几滴新鲜配制的抗坏血酸溶液，淡黄色褪去，终止氧化。
此外，上述多肽可以用于离子通道类型的检测以及神经生物学工具药物和镇痛药物的应用。
实施例1：蜡黄芋螺毒管高通量测序
总RNA的提取和cDNA合成：分离中国南海蜡黄芋螺毒管，参照Gibco BRL公司的TRIZOL LS试剂说明书进行毒管总RNA提取。
实施例2：芋螺毒素基因Cq1.1的序列分析
南海蜡黄芋螺神经毒素基因Cq1.1的质粒和序列来自中国南海蜡黄芋螺毒管c序列。南海蜡黄芋螺神经毒素基因Cq1.1的前体肽编码83个氨基酸残基，成熟肽编码29个氨基酸残基。
利用BLAST N和BLAST X(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)算法在现有GenBank等公共数据库中对所测核苷酸和衍生蛋白质序列进行同源检索。潜在的读码框(ORFs)利用SEQTOOLS 8.0来定位。序列的同源性比较采用CLUSTAL X软件进行。蛋白蜡黄肽序列预测是通过网站http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP进行的。蛋白质的分子量、理论等电点、电荷分布和稳定性参数等通过ProtParam tool(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)软件来完成。三级结构的预测是通过SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org//SWISS-MODEL.html)同源模建程序完成，生成的PDB文件由Swiss-PdbViewer软件进行分析。
南海条纹芋螺神经毒素基因Bt-S14二硫键连接方式为Cys3-Cys9,Cys4-Cys17。
实施例3：蜡黄芋螺O-超家族毒素成熟肽Cq1.1的合成
(1)称取氯树脂1.5g(取代度0.2mmol/g)于150ml的反应器中，用50ml的DCM浸泡。
(2)2小时后，用DMF洗涤树脂，然后抽干，如此重复四次，将树脂抽干后待用。
(3)称取苏氨酸(Thr)192mg于10ml的离心管中，加入5ml的DCM将其溶解，然后加入1ml的DIEA振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。
(4)2小时后，用一定量的甲醇封头(甲醇：DIEA:DCM＝1：1：2)半小时，然后用DMF洗涤四次，抽干待用。
(5)向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干。
(6)取少量树脂用茚三酮法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。
(7)称取281(mg)的半胱氨酸(侧链特殊修饰C(a))和HOBT(135mg)于10ml的离心管中，加入5ml的DMF将其溶解，然后加入0.5ml的DIC振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。
(8)1小时后，取少量树脂检测，用茚三酮法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，若树脂为无色，说明反应完全；若树脂有颜色，说明缩合不完全，继续反应。待反应完全后，用DMF洗涤树脂四次，然后抽干，向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4)，放在脱色摇床上摇晃20min,以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干检测保护是否脱去。
(9)按照步骤7-9依次接上L,H,A,W,T,N,C(b),V,N,S,C(c),C(a),H,S,H,H,N,C(b),A,G,N,H,S,T,C(c),D,脱去D的保护后,用切割试剂切割下肽链冻干。
(10)待多肽冻干后一步步氧化，形成三对二硫键。纯化制备后送QC检测合格后发货。
(11)待多肽冻干后一步步氧化，形成三对二硫键。
实施例4：电喷雾和飞行时间质谱鉴定合成芋螺毒素Cq1.1的分子量和纯度
取高效液相色谱分离后的目的蛋白峰进行电喷雾和飞行时间质谱鉴定其分子量。结果显示，芋螺毒素Cq1.1的分子量(预测MW＝1801.00)和纯度以及氧化成环相吻合(见图1和图2)。
实施例5：生理模型上的中枢镇痛药效实验法
基本方案：小鼠热板法
选取NIH系小鼠100只，体重20±2g,全为雌性。实验前先对小鼠进行筛选，将小鼠放于事先加热到55℃的热板测痛仪上，用秒表记录小鼠自投入热板至出现舔后足的时间为该鼠的痛阈值，测定2次，挑选出痛阈值不超过20s的小鼠为合格者进行正式实验。将筛选后的小鼠随机分成4组，即空白对照组、cq1.0样品低、中、高剂量组，每组10只。实验开始时进行腹腔注射给药，其中cq1.0样品低、中、高剂量组给予剂量分别为0.07mg/kg，0.14mg/kg，0.28mg/kg，空白对照组给予等体积的生理盐水。于注射给药后0.25h、0.5h、1h、1.5h测定一次，如痛阈值超过60s则按60s计算(注意时间不宜太久以免烫伤小鼠足部)。实验结束后，进行统计学处理并计算痛阈提高百分率。痛阈提高百分率＝(用药后平均痛阈值-用药前平均痛阈值)÷用药前平均痛阈值×100％。
由图3所示的实验结果可得，空白对照组小鼠给药前后的痛阈值基本稳定，提示经过筛选后的小鼠对热刺激反应的耐受性较好。受试样品cq1.1组小鼠给药后的痛阈值均不同程度的提高，其中给药0.5h时，受试样品达到最大；由此可初步认为cq1.1组具有一定的镇痛作用。
基本方案：斑马鱼肌肉注射
选取大小一致的成年斑马鱼。实验前先对斑马鱼进行停止喂食一天。随机选取36只，分成6组即空白对照组、cq1.1样品组，每组6只。实验开始时进行背部肌肉注射给药，其中cq1.1样品高剂量组给予剂量为0.28mg/kg，空白对照组给予等体积的生理盐水。于注射给药后观察24h、48h、72h，统计斑马鱼的死亡率。
由图4所示的实验结果可得，试验结束后，部分斑马鱼开始失去平衡，翻白，不能自由灵活游走，1个小时后，斑马鱼逐渐恢复平衡。其中，空白对照组基本稳定，受试样品cq1.1组给斑马鱼药后明显出现较高的死亡率；由此可初步认为cq1.1组具有一定的神经麻醉毒性。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (6)

1.一种中国南海芋螺毒素编码序列，从中国南海蜡黄芋螺毒管中分离得到的基因，其特征在于：其核苷酸序列如序列表<400>1所示。
2.由权利要求1所述的芋螺毒素编码的多肽，其特征在于：含有权利要求1所述基因编码的氨基酸序列或其保守性变异多肽序列或其活性衍生物。
3.根据权利要求2所述的多肽，其特征在于：氨基酸序列如序列表<400>2所示。
4.根据权利要求3所述的多肽，其特征在于：成熟肽片段的氨基酸序列如序列表<400>3所示。
5.权利要求2～4任一所述的多肽的生产方法，按照以下步骤进行：
(1)称取氯树脂1.5g于150ml的反应器中，用50ml的DCM浸泡，其中，所述氯树脂的取代度为0.2mmol/g；
(2)经步骤(1)处理2h后，用DMF洗涤树脂，然后抽干，如此重复四次，将树脂抽干后待用；
(3)称取苏氨酸(Thr)192mg于10ml的离心管中，加入5ml的DCM将其溶解，然后加入1ml的DIEA振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应；
(4)经步骤(3)处理2h后，用一定量的甲醇封头半小时，然后用DMF洗涤四次，抽干待用，其中，甲醇封头采用甲醇：DIEA:DCM＝1：1：2；
(5)向反应器中加入一定量的20％哌啶)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干，其中，哌啶：DMF＝1:4；
(6)取少量树脂用茚三酮法检测，检A、检B各两滴，100℃反应1min，氯树脂有颜色，说明脱保护成功；
(7)称取281mg的半胱氨酸和HOBT 135mg于10ml的离心管中，加入5ml的DMF将其溶解，然后加入0.5ml的DIC振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应；其中，半胱氨酸的侧链特殊修饰C(a)；
(8)经步骤(7)处理1小时后，取少量树脂检测，用茚三酮法检测，检A、检B各两滴，100℃反应1min，若树脂为无色，说明反应完全；若树脂有颜色，说明缩合不完全，继续反应；待反应完全后，用DMF洗涤树脂四次，然后抽干，向反应器中加入一定量的20％哌啶，放在脱色摇床上摇晃20min,以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团；脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干检测保护是否脱去，其中，哌啶：DMF＝1:4；
(9)按照步骤7-9依次接上Asp-Pro-Cys-Cys-Ser-Asn-Pro-Ser-Cys-Ala-Gln-Thr-His-Pro-Glu-Ile-Cys脱去D的保护后，用切割试剂切割下肽链冻干；
(10)粗样品的氧化折叠，采用碘氧化法：将合成完裂解下来的安诺吉斯肽冻干后，用适量水进行溶解；将新鲜配制的碘液逐滴加入到安诺吉斯肽溶液中，边加边搅拌，直至多肽溶液呈现淡黄色；反应几分钟后，加入几滴新鲜配制的抗坏血酸溶液，淡黄色褪去，终止氧化。
6.权利要求2、3、4所述多肽用于离子通道类型的检测以及神经生物学工具药物和镇痛药物的应用。
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