CN101745097A - 特异阻断乙酰胆碱受体的海南产α-芋螺毒素及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及特异阻断乙酰胆碱受体的海南产α-芋螺毒素及其用途。具体涉及α-芋螺毒素LtIA用于特异阻断α3β2 nAChRs的用途和α-芋螺毒素TxIB用于特异阻断α9α10 nAChRs的用途以及相关的药物组合物等。

Description

特异阻断乙酰胆碱受体的海南产α-芋螺毒素及其用途

技术领域

本发明涉及能特异阻断乙酰胆碱受体(nAChRs)的海南产α-芋螺毒素肽及其用途。nAChRs是具有重要生理作用和临床研究意义的关键受体，介导众多中枢和外周神经系统的生理功能，包括学习、记忆、应答、镇痛和运动控制等。

背景技术

具有重要生理作用和临床研究意义的烟碱乙酰胆碱受体(nAChRs)介导众多中枢和外周神经系统的生理功能，包括学习、记忆、应答、镇痛和运动控制等。nAChRs激活多巴胺、去甲肾上腺素、五羟色胺、γ-氨基丁酸等多种神经递质的释放。已证实nAChRs是筛选诊断和治疗一大类重要疾病药物的关键靶点，这些疾病包括智障、成瘾、疼痛、帕金森症、精神病、抑郁、重症肌无力等疑难杂症。至今对于上述疾病还没有对症治疗的药物。常用的非选择性的nAChR激动剂如烟碱，虽然可以缓解上述神经疾病的症状，但它们对心脏和胃肠道产生强烈的副作用，且有成瘾性。因此，开发针对nAChRs各种亚型具有高选择性的配体药物是治疗上述疾病的关键所在。然而，要开发这样的药物的前提是，要获得可以特异结合nAChRs各种亚型的选择性化合物，作为工具药来研究和鉴定各种亚型的精细组成和生理功能，或直接作为相关疾病的治疗药物。另外，在小细胞肺癌中，肿瘤细胞膜上烟碱乙酰胆碱受体的激活促进肿瘤细胞增殖，用药物阻断这些受体的激活，可有效地进行早期诊断，或治疗这种灾难性癌症。研究表明，阻断脊髓神经上的α3β2nAChRs，通过抑制C-纤维释放谷氨酸进行疼痛信号的传递，可产生镇痛效应。最近又发现，神经型α9α10nAChR是治疗神经痛的药物新靶点。因此，急需发现高特异性的nAChRs各种亚型的阻断剂。

对于严重危害人类健康的神经退行性疾病，如帕金森症、痴呆、以及神经痛等神经系统重大疾病，至今还没有对症治疗的药物。nAChRs及其突变体是诊断和治疗帕金森症和痴呆、以及镇痛的关键药靶。开发针对nAChRs各种亚型具有高选择性的配体药物是治疗上述疾病的关键所在。帕金森病(Parkinson disease，PD)即震颤麻痹，是中、老年人的慢性神经系统变性疾病，是一种缓慢发生的选择性的中脑黑质多巴胺能神经元丧失和纹状体多巴胺含量显著减少，导致锥体外系的一系列症状，以运动减少、肌强直、震颤和姿势调节障碍为主要临床表现的复杂性疾病。据统计帕金森病的发病率随年龄增高而增高，在欧美国家为65.6～187.0/10万人，例如美国至少有1百万PD患者，每年新增患者5万人以上；国内报道为15.0～119.0/10万人，60岁以上人群患病率为2.0％以上，我国现有PD患者已达数百万。老年人帕金森病的病程较短，3～5年以后症状逐渐加重。50％的PD患者精神抑郁、很多甚至发展为痴呆。新近研究表明，神经型α9α10nAChR是治疗神经痛的药物新靶点。据调查，疼痛影响1/6的人群，包括关节炎、神经痛、肿痛。其中神经痛影响4-8％的人群，包括酒精中毒、坐骨神经痛、癌症与癌症化疗、糖尿病、三叉神经痛、硬化症、带状疱疹、机械伤和手术伤等都会引起神经痛。α-芋螺毒素(α-CTXs)对nAChRs各种亚型具有空前的高选择性特异结合能力，是具有选择性阻断nAChRs的配体物质的重要来源。α-CTXs既可作为工具药来研究和鉴定各种亚型的精细组成和生理功能，亦可直接作为相关疾病的诊断与治疗药物。因此，急需发现高特异性的nAChRs各种亚型的阻断剂。

目前发现的最具有选择性阻断nAChRs的配体物质是，来自芋螺毒液中的α-芋螺毒素多肽(α-CTXs)。芋螺毒素(CTXs)是由生活在热带海洋中的肉食性软体动物芋螺，分泌出来的、用于麻醉猎物的一大类神经肽，它们具有特异结合各种离子通道的特殊功能，被誉为“海洋药物宝库”，是当今神经科学研究和新药开发的热点。芋螺毒素种类多、活性强、选择性高，已成为新药开发的新来源，在麻醉、镇痛，和治疗癫痫、精神病等多种疑难杂症方面具有极好的应用前景，其疗效确切、不成瘾，有的已进入临床试验或已被美国FDA批准为治疗新药。每种芋螺毒液中有约50-200种不同的动物神经肽毒素，且互不相同。全球至少有5万种芋螺毒肽具有调节各种离子通道的特殊功能。在我国，芋螺是海南特有的药用海洋生物资源，约有5000种海南产芋螺毒素药源。其中的α-芋螺毒素(α-CTXs)，对nAChRs各种亚型具有空前的高选择性特异结合能力。但至今已涉入研究的α-CTXs不到其总量的0.1％。尤其是海南产芋螺中的α-芋螺毒素的研发尚未开展。因而，大力发掘海南产α-芋螺毒素功能多肽，开发其医药用途，具有非常重要的意义。

本发明在已授权的国家发明专利：“新的α-芋螺毒素肽，其编码多核苷酸及用途，授权专利号ZL200410103563”的基础上，鉴定出2个海南产α-芋螺毒素LeD2与TeA21前体基因所编码的多肽LtIA和TxIB所作用的分子药靶分别是α3β2与α9α10nAChRs，LtIA和TxIB在帕金森症、痴呆、以及神经痛等神经系统疾病的研究和诊断治疗方面、以及作为有用的分子探针用于研究脊椎动物nAChRs的种系发生，确定nAChR的不同亚型等方面具有极高的应用价值。

发明内容

本发明涉及从我国海南产的信号芋螺(Conus littertus Linnaeus)和织锦芋螺(C.textile Linnaeus)中，分别发现的能特异阻断乙酰胆碱受体α3β2与α9α10nAChRs的海南产α-芋螺毒素肽(α-Conotoxin，α-CTX)LtIA和TxIB及其用途。

本发明的另一个目的是提供了所述肽的人工合成制备方法。

本发明的又一目的是提供所述肽与所阻断乙酰胆碱受体(nAChRs)亚型之间的相互作用关系。本发明的芋螺毒素肽可通过结合乙酰胆碱受体(nAChR)的不同亚型发挥作用，具有镇痛活性，可应用于研究、诊断和治疗帕金森症、痴呆、以及神经痛等神经系统疾病、以及作为有用的分子探针用于研究脊椎动物nAChRs的种系发生，确定nAChR的不同亚型等方面。它们是新药开发的候选药物和先导药物。

因此，本发明还提供了包含本发明所述肽的药物组合物。本发明是已授权国家发明专利ZL200410103563.X(罗素兰等，新的α-芋螺毒素肽，其编码多核苷酸及用途，2008)的进一步扩展和补充。

附图说明

图1显示的是α-CTX LtIA对α3β2nAChR(图1A)，α3β4nAChR(图1B)，α4β2nAChR(图1C)的电流影响情况。图中“C”是指的对照电流，图1A中，箭头所指的是第一个Ach脉冲形成的电流轨迹(～0nA)。

图2显示的是α-CTX LtIA对各种nAChRs亚型的浓度剂量反应曲线。

图3显示的是α-CTX LtIA阻断α3β2nAChR后，可有效阻止α-CTX MII对α3β2nAChR的阻断作用。A.ND961min+10μM LtIA4min；B.ND961min+50nM MII4min；C.10μM LtIA 1min+50nM MII 4min。

图4显示的是α-CTX LtIA对α3β2nAChR及其3个β2突变型(α3β2T59K，α3β2V111I，α3β2F119Q)的浓度剂量反应曲线。

图5显示的是α-CTX TxIB对α9α10nAChR的电流影响情况。图中“C”是指的对照电流，第0分钟箭头所指的是第一个Ach脉冲形成的电流轨迹(～0nA)。

图6显示的是α-CTX TxIB对各种nAChRs亚型的浓度剂量反应曲线

图7显示的是LtIA的CD光谱。1.黑色是51.9uM LtIA球状异构体；2.红色是29.5uM LtIA球状异构体；3.蓝色是含10％TFE的51.9uM LtIA球状异构体；4.浅绿色是含30％TFE的51.9uM LtIA球状异构体。

图8显示的是LtIA的NMR光谱。显示了LtIA(a黄色)，Vc1.1(b蓝色)和MII(c红色)二级结构Hα化学位移。二级结构化学位移是通过Hα化学位移减去无规卷曲化学位移进行计算的。

具体实施方式

在一方面，本发明涉及特异阻断乙酰胆碱受体α3β2nAChRs的方法，包括将α3β2nAChRs和α-芋螺毒素LtIA接触。所述α-芋螺毒素LtIA包含选自下组的氨基酸序列或者其氨基酸序列选自：

(1)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列GCCARAACAGIHQELC#，其中#代表该毒素羧基端被酰胺化(酰胺化是指C末端的羧基-COOH变成了-CO-NH₂)；

(2)与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；或

(3)因1-5个、优选1-3个、更优选1-2个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加而与SEQ ID NO：1所示序列有所不同的氨基酸序列。优选所述不同是1-5个、优选1-3个、更优选1-2个、最优选1个氨基酸残基的保守取代。

本发明还涉及α-芋螺毒素LtIA用于特异阻断α3β2nAChRs的用途。

本发明还涉及α-芋螺毒素LtIA在制备用于特异阻断α3β2nAChRs的阻断剂中的用途。

本发明还涉及用于特异阻断α3β2nAChRs的组合物，其包含α-芋螺毒素LtIA。

本发明还涉及筛选药物的方法，该方法包括：在存在和不存在候选化合物存在的情况下将α3β2nAChRs和α-芋螺毒素LtIA接触，从而进行药物筛选。

本发明还涉及α-芋螺毒素LtIA在制备用于治疗神经系统疾病例如帕金森症、痴呆、或神经痛等的药物中的用途。本发明还涉及α-芋螺毒素TxIB在制备用于镇痛的药物中的用途。

本发明还涉及确定nAChRs的亚型的方法，包括将待测nAChRs和α-芋螺毒素LtIA接触。该方法任选地还可以包含如下步骤：当α-芋螺毒素LtIA能够特异阻断nAChRs时，则推断该nAChRs是α3β2nAChRs亚型。

本发明还涉及α-芋螺毒素LtIA，其中所述LtIA按照N端到C端的顺序在第1个和第3个半胱氨酸形成二硫键，并且在第2个和第4个半胱氨酸之间形成二硫键。优选地，α-芋螺毒素LtIA具有SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列。

另一方面，本发明还涉及特异阻断α9α10nAChRs的方法，包括将α9α10nAChRs和α-芋螺毒素TxIB接触，所述α-芋螺毒素TxIB包含选自下组的氨基酸序列或者其氨基酸序列选自：

(1)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列PECCSDPRCNSSHPELC#，其中#代表该毒素羧基端被酰胺化；

(2)与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；或

(3)因1-5个、优选1-3个、更优选1-2个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加而与SEQ ID NO：2所示序列有所不同的氨基酸序列。优选所述不同是1-5个、优选1-3个、更优选1-2个、最优选1个氨基酸残基的保守取代。

本发明还涉及α-芋螺毒素TxIB用于特异阻断α9α10nAChRs的用途。

本发明还涉及α-芋螺毒素TxI B在制备用于特异阻断α9α10nAChRs的阻断剂中的用途。

本发明还涉及用于特异阻断α9α10nAChRs的组合物，其包含α-芋螺毒素TxIB。

本发明还涉及筛选药物的方法，该方法包括：在存在和不存在候选化合物存在的情况下将α9α10nAChRs和α-芋螺毒素TxIB接触，从而进行药物筛选。

本发明还涉及α-芋螺毒素TxIB在制备用于治疗神经系统疾病例如帕金森症、痴呆、或神经痛等的药物中的用途。本发明还涉及α-芋螺毒素TxIB在制备用于镇痛的药物中的用途。

本发明还涉及确定nAChRs的亚型的方法，包括将待测nAChRs和α-芋螺毒素TxIB接触。该方法任选地还可以包含如下步骤：当α-芋螺毒素TxIB能够特异阻断nAChRs时，则推断该nAChRs是α9α10nAChRs亚型。

本发明还涉及α-芋螺毒素TxIB，其中所述TxIB按照N端到C端的顺序在第1个和第3个半胱氨酸形成二硫键，并且在第2个和第4个半胱氨酸之间形成二硫键。优选地，α-芋螺毒素TxIB具有SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列。

本发明还涉及LtIA和TxIB作为工具药应用于研究、诊断和治疗帕金森症、痴呆、以及神经痛等神经系统疾病、以及作为有用的分子探针用于研究脊椎动物nAChRs的种系发生，确定nAChR的不同亚型等方面。

本发明的方法和用途可以在体内或体外进行。

“特异阻断”是指阻断nAChRs某种亚型，而不阻断其他亚型。

在一个实施方案中，本发明提供了α-芋螺毒素肽，其包含选自下组的氨基酸序列：

(1)SEQ ID NO：1；GCCARAACAGIHQELC#(#代表该毒素羧基端被酰胺化。该肽及其同源肽、变体肽统称为LtIA。SEQ ID NO：1所示的LtIA是由来自信号芋螺(Conus litteratus Linnaeus，LetteredCone)的前肽基因LeD2P经加工产生的成熟肽LeD2M，由16个氨基酸组成，其基因与编码产物详细情况见国家发明专利：罗素兰等，新的α-芋螺毒素肽，其编码多核苷酸及用途。2008，专利号：ZL200410103563.X，授权公告号CN 100430416C)

(2)SEQ ID NO：2；PECCSDPRCNSSHPELC#(#代表该毒素羧基端被酰胺化。该肽及其同源肽、变体肽统称为TxIB。SEQ ID NO：2所示的TxIB是由来自织锦芋螺(C.textile Linnaeus，Textile Cone)的前肽基因TeA21P经加工产生的成熟肽TeA21M，由17个氨基酸组成，其基因与编码产物详细情况见国家发明专利：罗素兰等，新的α-芋螺毒素肽，其编码多核苷酸及用途。2008，专利号：ZL200410103563.X，授权公告号CN 100430416C)

(4)与上述SEQ ID NO：1或2所示氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；或

(5)因1-5个、优选1-3个、更优选1-2个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加而与SEQ ID NO：1或2所示序列有所不同的氨基酸序列。

优选地，所述芋螺毒素肽具有的氨基酸序列与SEQ ID NO：1或2至少大约90％相同，更优选至少大约95％相同，最优选至少大约97％相同(在本文中称作“同源肽”)。

为了本发明的目的，两个或更多个氨基酸序列之间的相同程度是通过BLAST2.0蛋白质数据库查询程序(Aaltschul等，1997，核酸研究25：3389-3402)并采用下列参数确定的：blastall pblastp-a4-e10-E0-v500-b250-I[查询文档]-d prot_all，其中-p指程序名称，-a指将要用到的服务器数，-e指期望值，-E指延伸缺口的代价，-v指单线描述(one-line description)数，-b指将要显示的比对数，-I指查询文档，-d指用于查询的数据库。

同源多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：1或2的氨基酸序列不同之处可能在于取代、插入、添加和/或缺失了1或多个、优选1-5个、更优选1-3个、尤其优选1-2个、最优选1个氨基酸残基。优选地，氨基酸改变是性质改变较小的变化，即是不会显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守性氨基酸取代；小片段缺失，通常是1到大约5个、优选1-3个、更优选1个氨基酸的缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基端添加的甲硫氨酸残基；有多达大约20-25个残基的小连接肽；或可通过改变净电荷或者其它功能而有助于纯化的小延伸如多聚组氨酸片段、抗原表位或结合区。优选所述不同是1-5个、优选1-3个、更优选1-2个、最优选1个氨基酸残基的保守取代。

保守性取代的例子是在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)内进行的取代。通常不会改变特异活性的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H.Neurath和R.L.Hill，1979，在《蛋白质》一书，Academic Press，New York中描述过。最常见的替换是Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu和Asp/Gly以及反向进行的替换。

合成与本发明所述多肽基本相似的多肽时，可能有必要对本发明多肽的氨基酸序列进行修饰。术语与所述多肽“基本相似”是指非天然形式的多肽。这些多肽可能与从天然来源分离到的多肽在某些加工方式上不同。

药物组合物

本发明还涉及含有本发明肽和药学可接受载体和/或赋形剂的药物组合物。所述药物组合物可用于诊断、缓解或治疗与智障、成瘾、疼痛、帕金森症、精神病、抑郁、重症肌无力等有关的疾病或病症。在一个实施方案中，含有治疗有效量的本发明肽的药物组合物以利于药用的方式配制和给药，并需考虑到个体病人的临床状况、运送位点、给药方法、给药日程安排和医生已知的其它因素。因此用于本文目的的“有效量”由这些方面的考虑决定。

含治疗有效量的本发明多肽的药物组合物可口服、非肠道给药、脑池内给药、鞘内给药等。“药学可接受载体”指无毒的固体、半固体或液体填充物、稀释液、胶囊材料或任何类型的配方辅助物。本文所用术语“非肠道的”表示的给药方式包括静脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、皮下、鞘内和关节内注射和输注。本发明多肽还可通过缓释系统恰当地给药。

本发明还涉及特异阻断nAChRs的药物组合物。

可应用本发明的芋螺毒素肽作为有用的探针来用于研究动物nAChR的种系发生；作为分子探针来确定nAChR的不同亚型；作为分子模型，设计新药；作为研究、诊断神经性疾病如帕金森氏病、行动障碍、精神分裂症等的工具药和治疗药物；治疗小细胞肺癌的侯选药物等。

下面参考实施例对本发明作进一步说明。给出这些实施例只是为了举例说明，它们不以任何方式限制本发明的范围。

实施例

在以下实施例中，α-芋螺毒素LtIA是指如下氨基酸序列所示的肽：

SEQ ID NO：1：GCCARAACAGIHQBLC#，其中#代表该毒素羧基端被酰胺化。

在以下实施例中，α-芋螺毒素TxIB是指如下氨基酸序列所示的肽：

SEQ ID NO：2：PECCSDPRCNSSHPBLC#，其中#代表该毒素羧基端被酰胺化。

实施例1α-芋螺毒素LtIA、TxIB的一步法氧化合成

根据α-芋螺毒素LtIA与TxIB的氨基酸序列，采用Fmoc与FastMoc化学方法人工合成了这两种多肽的线性肽，并进行氧化折叠。具体方法如下。

采用固相合成法中的Fmoc与FastMoc方法，在ABI Prism 433a多肽合成仪上合成了LtIA、TxIB两条芋螺毒素线性肽。Fmoc氨基酸的侧链保护基为：Pmc(Arg)、Trt(Cys)、But(Thr、Ser、Tyr)，OBut(Asp)，Boc(Lys).采用Fmoc HOBT DCC方法，Rink酰胺化树脂及Fmoc氨基酸，所有半胱氨酸(Cys)都用Trt保护基团，合成步骤参考仪器合成手册进行。为反应完全，在哌啶脱保护及偶合时间上分别适当延长，对难接氨基酸采用双偶合，获得树脂肽。用reagent K(trifluoroacetic acid/water/ethanedithiol/phenol/thioanisole；90∶5∶2.5∶7.5∶5，v/v/v/v/v)将线性肽从树脂上切割下来，并用冰乙醚沉淀和洗涤回收线性肽粗品，用制备型反向HPLC C18柱(Vydac)纯化，洗脱线性梯度为0 50min0 50％buffer B，50-55min 50100％buffer B(Buffer Bis 0.05％TFA(Trifluoroacetic acid，为美国Tedia(Fairfield，Ohio，USA)公司产品)in 90％ACN(Acetonitrile，购自美国Fisher(University of Miami，Miami，FL，USA)公司).；Buffer A is 0.1％TFA(trifluoroacetic acid，v/v)in water，下同)，流速为15mL/min，在UV 215nm的波长下监测洗脱情况。纯化后的线性肽用分析型的HPLC C18柱(Vydac)进行纯度检测，洗脱梯度为0 50min0 50％buffer B，50-55min 50100％buffer B，流速为1mL/min。其纯度达95％以上，并冻干保存，用于氧化折叠，并通过质谱(MS)鉴定。LtIA线性肽的分子量为1604.0，TxIB线性肽的分子量为1875.5。

20μM充分还原的LtIA、TxIB线性肽，在NH₄HCO₃折叠缓冲液(100mMNH₄HCO₃(pH 8.0)，23-25℃)中搅拌折叠24-48h；或在含GSSG-GSH的Tris-HCl折叠缓冲液(0.1M Tris-HCl，pH 7.5，1mM EDTA；1mM GSSG和2mM GSH，4℃)中进行氧化折叠，经氧化折叠的肽再用半制备型或制备型反向HPLC C18柱(Vydac)纯化出主产物，分别为α-芋螺毒素LtIA和TxIB，其纯度达98％以上，并通过质谱(MS)鉴定，LtIA的分子量为1600.0，TxIB的分子量为1871.5。α-芋螺毒素LtIA和TxIB，按照从N端至C端的顺序在第1、3个半胱氨酸之间，第2、4个半胱氨酸之间形成二硫键，这已通过与下面的两步氧化法折叠产物进行共洗脱进行确证。

实施例2α-芋螺毒素LtIA、TxIB的两步氧化法合成

LtIA与TxIB的树脂肽采用Fmoc化学方法进行人工合成，除了半胱氨酸外，其余氨基酸用标准的侧链保护基团，其合成步骤与一步法氧化合成相同。其中第1和第3个半胱氨酸的-SH用Trt(S-trityl)保护，第2和第4个半胱氨酸的-SH用Acm(S-acetamidomethyl)成对交叉保护，树脂肽用与一步氧化法相同的方法进行切割和回收获得带有Acm的线性肽。参照文献McIntosh，J.M.，Azam，L.，Staheli，S.，Dowell，C.，Lindstrom，J.M.，Kuryatov，A.，Garrett，J.E.，Marks，M.J.，and Whiteaker，P.(2004)Analogs of α-ConotoxinMII Are Selective for α6-Containing Nicotinic AcetylcholineReceptors.MolPharmacol 65，944-952的两步氧化法，对α-CTX LtIA和TxIB的线性肽进行选择性氧化折叠。过程简述如下。首先通过铁氰化钾氧化法(20mM potassium ferricyanide，0.1M Tris，pH 7.5，30min)在第1和第3个半胱氨酸之间形成第一对二硫键。单环肽经反相HPLC C18柱(Vydac)纯化后，进行碘氧化(10mM iodine inH2O∶trifluoroacetic acid∶acetonitrile(78∶2∶20by volume，10min)，移去第2和第4个半胱氨酸上的Acm，同时在第2和第4个半胱氨酸之间形成第二对二硫键。二环肽再经反相HPLC C18柱(Vydac)纯化，即获得按照从N端至C端的顺序在第1、3个半胱氨酸之间，第2、4个半胱氨酸之间形成二硫键的α-芋螺毒素LtIA和TxIB，并通过质谱(MS)鉴定，LtIA的分子量为1600.0，TxIB的分子量为1871.5。将一步与两步氧化法折叠产物进行HPLC共洗脱，产生单一峰，二者具有相同的保留时间，说明一步氧化法与两步氧化法所获得的毒素肽是同一物质，二者具有相同的二硫键连接方式。

实施例3α-芋螺毒素LtIA是α3β2nAChRs的特异阻断剂

参照Azam L，Yoshikami D，McIntosh JM.Amino acid residuesthat confer high selectivity of the alpha6 nicotinicacetylcholine receptor subunit to alpha-conotoxinMII[S4A，E11A，L15A].J Biol Chem.2008Apr 25；283(17)：11625-32.Epub 2008Feb 25中的方法，以及体外转录试剂盒(mMessage mMachinein vitro transcription kit(Ambion，Austin，TX))说明书，制备各种大鼠神经型nAChRs亚型(α3β2，α6/α3β2β3，α6/α3β4，α9α10，α4β2，α4β4，α3β4，α2β2，α2β4，α7)、α3β2nAChRs突变型(α3β2T59K，α3β2V111I，α3β2F119Q)、以及小鼠肌肉型nAChRs(α1β1δε)的cRNA，其浓度用UV 260nm下的OD值进行测算。解剖收集非洲爪蟾(Xenopus laveis)卵母细胞(蛙卵)，将cRNA注射入蛙卵中，每个亚基的注射量为5ng cRNA。肌肉nAChR每个亚基注射0.5 2.5ng DNA。蛙卵在ND-96中培养。蛙卵收集后的1-2天内注射cRNA，注射后1-7天内用于nAChRs的电压钳记录。

将1个注射过cRNA的蛙卵置于30uL的Sylgard记录槽中(直径4mm×深度2mm)，重力灌注ND96或含有1mM atropine的ND96(ND96A)，流速为1ml/min。所有的芋螺毒素溶液也含有0.1mg/ml BSA(bovine serum albumin)以减少毒素的非特异性吸附，用转换阀(Smart Valve，Cavro Scientific Instruments，Sunnyvale，CA)可以在灌注毒素或乙酰胆碱(ACh)之间进行自由切换，以及一系列三通螺线阀(solenoid valves，model 161TO 31，Neptune Research，Northboro，MA)使灌注ND96与ACh等之间进行自由切换。Ach门控的电流由双电极电压箝放大器(model OC-725B，Warner InstrumentCorp.，Hamden，CT)设置在“慢”箝，以及clamp gain在最大值(×2000)位置时进行在线记录。用1mm外径×0.75内径mm的玻璃毛细管(fiber-filled borosili catecapillaries，WPI Inc.，Sarasota，FL)拉制玻璃电极，并充满3M KCl作为电压和电流电极。膜电压箝制在-70mV.整个系统均由电脑控制和记录数据。ACh脉冲为每隔5min自动灌注1s的ACh。ACh的浓度分别为，表达肌肉型的nAChR s和神经型α9α10nAChRs卵为10μM；表达神经型的nAChRs之α7为200μM，其他的亚型都为100μM。至少记录4个卵表达某个亚型对不同毒素浓度的电流反应情况，以及电流轨迹。

测试的电流数据用GraphPad Prism软件(San Diego，CA)进行统计分析，绘制剂量反应曲线，计算芋螺毒素的半阻滞浓度IC50等多种有关毒素阻断nAChRs的各种参数。

结果表明，1μMα-CTX LtIA完全阻断了由Ach门控的α3β2nAChRs开放产生的电流(图1A)，而高浓度的10μM α-CTX LtIA对α4β2(Fig.1B)和α3β4(Fig.1C)nAChRs完全没有阻断作用。LtIA阻断α3β2nAChRs的IC50为9.8nM，且是快速可逆的，也就是当毒素LtIA被洗脱后，α3β2nAChR可快速回复至ACh正常门控开放状态(图1A)。当一个β4或β2nAChR亚基与α3亚基共同表达时，α-CTX LtIA阻断α3β4nAChR的IC50比阻断α3β2nAChR的IC50大1000倍以上，表明在同源的βnAChR亚基之间，氨基酸残基的差异显著影响毒素的生物活性。高浓度的10μM α-CTXLtIA对其他的nAChR亚型，没有阻断作用，其IC50大于1000nM，这些nAChR亚型包括α1β1δε，α2β2，α2β4，α4β2，α4β4，α7，α9α10(表1)。α-CTX LtIA对各种nAChRs亚型的浓度剂量反应曲线如图2所示。

表1.α-CTX LtIA对各种nAChRs亚型的半阻断剂量与斜率

Table1 IC50 & Hillslop of different subtypes

α-CTX LtIA阻断α3β2nAChR后，可有效阻止α-CTX MII对α3β2nAChR的阻断作用。α-CTX MII也是α3β2nAChR的特异阻断剂，但洗脱恢复非常慢(McIntosh，J.M.，Azam，L.，Staheli，S.，Dowell，C.，Lindstrom，J.M.，Kuryatov，A.，Garrett，J.E.，Marks，M.J.，and Whiteaker，P.(2004)Analogs of α-ConotoxinMII Are Selective for α6-Containing Nicotinic AcetylcholineReceptors.Mol Pharmacol 65，944-952)，也就是当毒素MII被洗脱后，α3β2nAChR回复至ACh正常门控开放状态非常慢(图3)。预先用10μM α-CTX LtIA阻断α3β2nAChR 1min，再加入50nM的MII至同一蛙卵的细胞槽中4min，进行电流记录，同时设置ND96分别替换α-CTX LtIA与MII，作为正负对照。结果表明，α-CTX LtIA阻断α3β2nAChR后，再用MII去阻断，其洗脱恢复非常快，与单独用LtIA的效果一样，说明LtIA可有效阻止α-CTX MII对α3β2nAChR的阻断作用，α-CTX LtIA与MII对α3β2nAChR的阻断结合位点有重叠。

α-CTX LtIA对α3β2nAChR的3个β2突变型(α3β2 T59K，α3β2 V111I，α3β2 F119Q)的阻断作用有较大差异(表2和图4)，这3种突变型是将nAChR的β2亚基中与配体结合部位的关键氨基酸残基突变为β4亚基中相应的氨基酸残基(包括α-CTX MII在内)。关于这3个α3β2nAChRs突变型的详细情况可参考文献Shiembob DL，Roberts RL，Luetje CW，McIntosh JM.Determinants ofalpha-conotoxin BuIA selectivity on the nicotinicacetylcholine receptor beta subunit.Biochemistry.2006Sep19；45(37)：11200-7和Dutertre S，Nicke A，Lewis RJ.β2 subunitcontribution to 4/7 α-conotoxin binding to the nicotinicacetylcholine receptor.J Biol Chem 2005；280：304608.α-CTXLtIA对突变型α3β2F119Q的阻断活性很小，其IC50为高达9190nM；对突变型α3β2 T59K，α3β2 V111I的阻断活性很强，其IC50分别为7.2和28.2nM，与对野生型的α3β2 nAChR的阻断活性差异不大。α-CTX LtIA对3种突变型的半阻断剂量IC50与对野生型的α3β2的IC50之间的比例分别为0.7(T59K)，2.9(V111I)和938(F119Q)。这意味着β2亚基上的第119位的苯丙氨酸对于LtIA与α3β2的结合起关键作用，与MII结合α3β2nAChR的部位有所不同。

表2.α-CTX LtIA对α3β2nAChR突变型的半阻断剂量与斜率

Table 2 IC50 & Hillslop of different α3β2 nAChRs mutants

通过仔细观察发现，α-CTX LtIA的结构很独特，第1个环内的序列是丙氨酸-精氨酸-丙氨酸-丙氨酸(ARAA)，不含有以往发现的α4/7型芋螺毒素(α4/7-CTXs)在第1个环内具有的保守性的丝氨酸-可变氨基酸-脯氨酸(Ser-X-Pro motif)基序。对于α-CTX MII，用丙氨酸取代其第4位的丝氨酸，相对于α6/α3β2β3和α3β2nAChRs，MII的选择性发生了改变，MII更趋向于结合α6/α3β2β3，对α3β2nAChRs的活性还保持较低的nM浓度(McIntosh，J.M.，Azam，L.，Staheli，S.，Dowell，C.，Lindstrom，J.M.，Kuryatov，A.，Garrett，J.E.，Marks，M.J.，and Whiteaker，P.(2004)Analogs of α-Conotoxin MII Are Selective for α6-Containing NicotinicAcetylcholine Receptors.Mol Pharmacol 65，944-952.Azam L，Yoshikami D，McIntosh JM.Amino acid residues that confer highselectivity of the alpha6 nicotinic acetylcholine receptorsubunit to alpha-conotoxin MII[S4A，E11A，L15A].J Biol Chem.2008 Apr 25；283(17)：11625-32.Epub 2008 Feb 25)；用丙氨酸取代其第6位的脯氨酸，MII对α3β2 nAChR的活性降低了2000倍。然而，本发明的α-CTX LtIA的第4位与第6位均为丙氨酸，对α3β2的活性比对α6/α3β2β3的活性更高(表1)，α-CTX LtIA对α3β2nAChR的亲和活性比MII[P6A]要高450倍。因此，α-CTX LtIA的结构与功能为研究洞察α-CTXs与nAChRs之间相互作用的机制奠定了重要的基础，提供了很好的工具与模型。

实施例4α-芋螺毒素TxIB是α9α10nAChRs的特异阻断剂

利用与实施例3相同的方法检测α-芋螺毒素TxIB与各种nAChRs之间的结合情况。α-CTX TxIB含有以往发现的α4/7型芋螺毒素(α4/7-CTXs)在第1个环内具有的保守性的丝氨酸-可变氨基酸-脯氨酸(Ser-X-Pro motif)基序。

结果表明，10μM α-CTX TxIB完全阻断了由Ach门控的α9α10nAChR开放产生的电流(图5)。α-CTX TxIB对各种nAChRs亚型的浓度剂量反应曲线如图6所示。TxIB阻断α3β2nAChRs的IC50为117nM(表3)，且是快速可逆的，也就是当毒素TxIB被洗脱后，α9α10nAChR可快速回复至ACh正常门控开放状态(图5)。而高浓度的10μM α-CTX TxIB对其他nAChRs完全没有阻断作用(图5和表3)，其IC50大于1000nM，这些nAChR亚型包括α3β2，α6/α3β2β3，α6/α3β4，α1β1δε，α2β2，α2β4，α4β2，α4β4，α7，α9α10(表3)。

表3.α-CTX TxIB对各种nAChRs亚型的半阻断剂量与斜率

Table 3 IC50 & Hillslop of different subtypes

实施例5α-CTX LtIA的结构分析

利用圆二色光谱(CD)法对LtIA的结构分析

用Jasco J-810圆二色光谱仪测定α-CTX LtIA的CD光谱，所有实验都在室温25℃有氮气保护(流量为15L/min)的情况下进行。测量参数为：波长扫描范围在远紫外190～260nm，扫描速率50nm/min，分辨率0.01nm，响应时间1s，累积次数4次.均采用1mm光径样品池。LtIA多肽分别溶于20mM碳酸氢铵缓冲液(pH 7.0)、含10％和30％(v/v)的TFE(trifluoroethanol)的20mM磷酸钠缓冲液中，分别测定其CD光谱。光谱扫描时均扣除溶液空白的干扰。摩尔椭圆率[θ]用方程[θ]＝θ/(10xCxNpx1)计算，其中的θ是毫度椭圆率，C是多肽的摩尔浓度，Np是多肽单位数(对于Lt1A Np＝15)，l是样品池的光径。用摩尔椭圆率对波长(nm)作图，并分析α-螺旋结构的含量。球状LtIA的CD光谱如图7所示。51.9μM和29.5μM Lt1A的CD光谱有较好的重叠，表明LtIA没有浓度依赖性的聚集。LtIA在187nm和205nm处分别出现最大正峰和负峰，CD光谱表明LtIA并不富含在以前发现的α-CTXs中常见的α-螺旋结构。LtIA在10％和30％TFE的CD光谱几乎重叠，说明LtIA并不受促α-螺旋结构形成剂TFE浓度的显著影响。[Sonnichsen F.D.，Van Eyk J.E.，Hodges R.S.and Sykes B.D.Effect oftrifluoroethanol on protein secondary structure：an NMR and CDstudy using a synthetic actin peptide.Biochemistry.1992，31(37)：8790-8].

利用核磁共振法对LtIA的结构分析

LtIA球状异构体用10％D2O/90％H2O(～pH 3)配成1mM溶液，在Bruker Avance 600MHz核磁共振仪上测定其一维(1H NMR)和二维(2D NMR)核磁共振谱。2D NMR实验包括测定全相关谱(TOCSY，totalcorrelation spectroscopy)和二维NOE谱(NOESY，NuclearOverhauser Effect)。用相敏感模式的TPPI(time proportionalphase incriminations)法记录光谱。改进的WATERGATE序列用来消除水分子信号。光谱加工数据处理软件为Topspin(Bruker)，共振分析软件为SPARKY程序。获得了NH-NHi+1，Hα-NHi+1和Hβ-NHi+1相关谱。观察到LtIA的Hα化学位移和无规则卷曲位移之间的差异计算结果作为二级位移，如图8中的第1位黄色峰图所示。同时还测定了α-CTXVc1.1和MII的核磁共振谱进行比较(图8中的第2位蓝色和第1位红色峰图)。化学位移数据分析显示LtIA的第6至第9个氨基酸残基α-螺旋结构处(-0.1ppm附近)，出现了负向二级结构延伸位移。然而，由于缺乏NOEs而无法计算LtIA的精细结构。与Vc1.1和MII的二级位移比较，Lt1A与它们相似，但明显低于Vc1.1和MII，表明Lt1A的结构不如Vc1.1和MII的结构明晰，这与上述CD谱的结果一致。虽然Lt1A没有以前发现的α-CTXs中一致存在的两个α-螺旋结构，但却是α3β2nAChR的强阻断剂。之前发现的α-CTX MII，GIC，PIA和BuIA都有α-螺旋结构域，且对与nAChR结合活性起关键作用，因此，本发明中的新α-CTX Lt1A的新颖结构对于研究配体与nAChR受体之间的结构与功能具有重要的价值。

实施例6

α-CTX TxIB镇痛活性的测试

利用小鼠热板试验测定α-CTX TxIB的镇痛活性。

测试用昆明小鼠体重为(20g±3g)。小鼠采用侧脑室给药，每只注射20μL含不同毒素浓度的TxIB盐溶液(150mM NaCl)，用热板法测量小鼠脚部受热镇痛后舔后足或抬后足并回头时间为痛阈时间，60s为100％镇痛。设5个剂量浓度：0、4、8、12、16ng/只，每剂量5只小鼠。结果表明TxIB剂量大于12ng/只，镇痛活性(热板法)大于60s，且作用4h以上。表明镇痛活性强大。

上述实施例只是为了阐明、而不是限制本发明。相关领域的技术人员清楚地知道，可对本文所述的内容作其它适当的修饰和变化，并可在本发明或其任何实施方案的范围内进行这种修饰和变化。这样的修饰和变化都落入本发明的保护范围。

序列表

<110>海南大学

<120>特异阻断乙酰胆碱受体的海南产α-芋螺毒素及其用途

<130>IDC080116

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>16

<212>PRT

<213>α-芋螺毒素LtIA

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>该毒素的羧基端被酰胺化

<400>1

Gly Cys Cys Ala Arg Ala Ala Cys Ala Gly Ile His Gln Glu Leu Cys

1               5                   10                  15

<210>2

<211>17

<212>PRT

<213>α-芋螺毒素TxIB

<220>

<221>MISC_FEATURE

<223>该毒素羧基端被酰胺化

<400>2

Pro Glu Cys Cys Ser Asp Pro Arg Cys Asn Ser Ser His Pro Glu Leu

1               5                   10                  15

Cys

Claims (10)

1.特异阻断α3β2 nAChRs的方法，包括将α3β2 nAChRs和α-芋螺毒素LtIA接触，所述α-芋螺毒素LtIA包含选自下组的氨基酸序列：

(1)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列GCCARAACAGIHQELC #，其中#代表该毒素羧基端被酰胺化；

(2)与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；或

(3)因1-5个、优选1-3个、更优选1-2个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加而与SEQ ID NO：1所示序列有所不同的氨基酸序列。

2.权利要求1中定义的α-芋螺毒素LtIA用于特异阻断α3β2nAChRs的用途，或者权利要求1中定义的α-芋螺毒素LtIA在制备用于特异阻断α3β2 nAChRs的阻断剂中的用途。

3.用于特异阻断α3β2 nAChRs的组合物，其包含权利要求1中定义的α-芋螺毒素LtIA。

4.特异阻断α9α10 nAChRs的方法，包括将α9α10 nAChRs和α-芋螺毒素TxIB接触，所述α-芋螺毒素TxIB包含选自下组的氨基酸序列：

(10SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列PECCSDPRCNSSHPELC #，其中#代表该毒素羧基端被酰胺化；

(2)与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；或

(3)因1-5个、优选1-3个、更优选1-2个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加而与SEQ ID NO：2所示序列有所不同的氨基酸序列。

5.权利要求4中定义的α-芋螺毒素TxIB用于特异阻断α9α10nAChRs的用途，或者权利要求4中定义的α-芋螺毒素TxIB在制备用于特异阻断α9α10 nAChRs的阻断剂中的用途。

6.用于特异阻断α9α10 nAChRs的组合物，其包含权利要求4中定义的α-芋螺毒素TxIB。

7.筛选药物的方法，该方法包括：通过在存在和不存在候选化合物存在的情况下将α3β2 nAChRs和权利要求1中定义的α-芋螺毒素LtIA接触，或者在存在和不存在候选化合物存在的情况下将α9α10nAChRs和权利要求4中定义的α-芋螺毒素TxIB接触，进行筛选。

8.权利要求1中定义的α-芋螺毒素LtIA或者权利要求4中定义的α-芋螺毒素TxIB在制备用于治疗神经系统疾病例如帕金森症、痴呆、或神经痛等或者用于镇痛的药物中的用途。

9.确定nAChRs的亚型的方法，包括将待测nAChRs和权利要求1中定义的α-芋螺毒素LtIA或者权利要求4中定义的α-芋螺毒素TxIB接触。

10.权利要求1中定义的α-芋螺毒素LtIA或者权利要求4中定义的α-芋螺毒素TxIB，其中所述LtIA或者TxIB按照N端到C端的顺序在第1个和第3个半胱氨酸形成二硫键，并且在第2个和第4个半胱氨酸之间形成二硫键。

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