KR20190129868A - 조작된 트란스페린 수용체 결합 폴리펩티드 - Google Patents
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Abstract
본 명세서의 요약서
트란스페린 수용체에 결합하는 폴리펩티드, 이러한 폴리펩티드를 만드는 방법, 그리고 폴리펩티드를 트란스페린 수용체-발현시키는 세포에 조성물을 표적화시키는데 이용하는 방법이 본원에서 제공된다.
트란스페린 수용체에 결합하는 폴리펩티드, 이러한 폴리펩티드를 만드는 방법, 그리고 폴리펩티드를 트란스페린 수용체-발현시키는 세포에 조성물을 표적화시키는데 이용하는 방법이 본원에서 제공된다.
Description
발명의 배경
정상적으로는 결합하지 않는 표적에 결합하도록 단백질을 조작하는 다양한 기술이 개발되었다. 예를 들면, 원하는 결합 또는 효소 활성을 갖도록 조작된 단백질을 스크리닝하기 위해 라이브러리가 생성될 수 있다.
트란스페린 수용체는 다른 기능들 중에서도 철을 세포로 가져 오기 위해 필요하고, 세포 내 철 농도에 반응하여 조절되는 트랜스페린 담체 단백질이다. 트란스페린 수용체는 혈액-뇌 장벽의 내피를 비롯한 내피에서 발현되고, 다양한 암 세포 및 염증 세포에서 증가된 수준으로 발현된다. 혈액-뇌 장벽을 가로 지르는 동족(cognate) 리간드의 트랜스 사이토시스(transcytosis)를 매개하는 것은 수용체 중 하나이다. 트란스페린 수용체는 세포 내에서 엔도사이토시스를 위하여, 또는 세포를 가로 질러 트랜스사이토시스를 위해 제제를 세포 내로 도입하기 위한 바람직한 표적일 수 있다.
발명의 간단한 요약
트란스페린 (TfR) 수용체에 결합할 수 있는 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 개발하였다. 이들 폴리펩티드는 새로운 TfR 결합 부위를 생성하는 CH2 또는 CH3 도메인에서의 치환으로 조작되었다. TfR은 혈액-뇌 장벽 (BBB)에서 상당히 많이 발현되며, TfR은 자연적으로 혈액에서 뇌로 트랜스페린을 이동시킨다. 이들 폴리펩티드는 TfR에 결합하기 때문에, BBB를 가로 질러 운반될 수 있고, 또한 부착된 치료제 (가령, 치료 폴리펩티드, 항체 가변 영역 이를 테면 Fabs, 및 소분자)를 BBB를 가로질러 운반하는데 사용될 수 있다. 이러한 접근법은 치료제의 뇌 흡수를 실질적으로 개선시킬 수 있고, 따라서 뇌 전달이 유리한 장애 및 질병을 치료하는데 매우 유용하다.
한 측면에서, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 변형된 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드가 제공되며, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 157, 159, 160, 161, 162, 163, 186, 189, 및 194를 포함하는 아미노산 위치 세트에서 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개 치환을 포함하고, 이때 상기 치환 및 상기 위치는 서열 번호:1의 아미노산 114-220을 참고하여 결정된다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 153, 164, 165, 및 188을 포함하는 위치에서 1, 2, 3 또는 4개의 치환을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 트란스페린 수용체의 정점(apical) 도메인에 결합된다. 일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 트란스페린이 트란스페린 수용체에 결합하는 것을 방해하지 않고, 트란스페린 수용체에 결합한다. 일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 트란스페린 수용체 서열의 아미노산 208을 포함하는 에피토프에 결합한다.
일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 위치 161에서 Trp를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 위치 194에서 방향족 아미노산을 포함한다. 일부 구체예들에서, 위치 194에서 방향족 아미노산은 Trp 또는 Phe이다.
일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 다음에서 선택된 최소한 하나의 위치를 포함한다: 위치 157은 Leu, Tyr, Met, 또는 Val이고; 위치 159는 Leu, Thr, His, 또는 Pro이고; 위치 160은 Val, Pro, 또는 산성 아미노산이고; 위치 161은 Trp 또는 Gly이고; 위치 162는 Val, Ser, 또는 Ala이고; 위치 186은 Glu, Ala, Ser, Leu, Thr, 또는 Pro이고; 위치 189는 Thr 또는 산성 아미노산이고; 그리고 위치 194는 Trp, Tyr, His, 또는 Phe이다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 다음에서 선택된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 위치를 포함한다: 위치 157은 Leu, Tyr, Met, 또는 Val이고; 위치 159는 Leu, Thr, His, 또는 Pro이고; 위치 160은 Val, Pro, 또는 산성 아미노산이고; 위치 161은 Trp 또는 Gly이고; 위치 162는 Val, Ser, 또는 Ala이고; 위치 186은 Glu, Ala, Ser, Leu, Thr, 또는 Pro이고; 위치 189는 Thr 또는 산성 아미노산이고; 그리고 위치 194는 Trp, Tyr, His, 또는 Phe이다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 위치 157에 Leu 또는 Met를 포함하고; 위치 159에 Leu, His, 또는 Pro를 포함하고; 위치 160에 Val를 포함하고; 위치 161에 Trp 또는 Gly를 포함하고; 위치 162에 Val 또는 Ala를 포함하고; 위치 186에 Pro를 포함하고; 위치 189에 Thr를 포함하고; 및/또는 위치 194에 Trp를 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 다음에서 선택된 최소한 하나의 위치를 포함한다: 위치 157은 Leu, Tyr, Met, 또는 Val이고; 위치 159는 Leu, Thr, His, 또는 Pro이고; 위치 160은 Val, Pro, 또는 산성 아미노산이고; 위치 161은 Trp이고; 위치 162는 Val, Ser, 또는 Ala이고; 위치 186은 Glu, Ala, Ser, Leu, Thr, 또는 Pro (가령, Thr 또는 Pro)이고; 위치 189는 Thr 또는 산성 아미노산이고; 그리고 위치 194는 Trp, Tyr, His, 또는 Phe이다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 다음에서 선택된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 위치를 포함한다: 위치 157은 Leu, Tyr, Met, 또는 Val이고; 위치 159는 Leu, Thr, His, 또는 Pro이고; 위치 160은 Val, Pro, 또는 산성 아미노산이고; 위치 161은 Trp이고; 위치 162는 Val, Ser, 또는 Ala이고; 위치 186은 Glu, Ala, Ser, Leu, Thr, 또는 Pro (가령, Thr 또는 Pro)이고; 위치 189는 Thr 또는 산성 아미노산이고; 그리고 위치 194는 Trp, Tyr, His, 또는 Phe이다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 위치 157에 Leu 또는 Met를 포함하고; 위치 159에 Leu, His, 또는 Pro를 포함하고; 위치 160에 Val를 포함하고; 위치 161에 Trp를 포함하고; 위치 162에 Val 또는 Ala를 포함하고; 위치 186에 Pro를 포함하고; 위치 189에 Thr를 포함하고; 및/또는 위치 194에 Trp를 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 위치 164에서 Ser, Thr, Gln, 또는 Phe를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 위치 153에서 Trp, Tyr, Leu, 또는 Gln를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 위치 165에서 Gln, Phe, 또는 His를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 위치 153에서 Trp 및/또는 위치 165에서 Gln를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 위치 188에서 Glu를 더 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 위치 157에 Tyr를 포함하고; 위치 159에 Thr를 포함하고; 위치 160에 Glu 또는 Val를 포함하고; 위치 161에 Trp를 포함하고; 위치 162에 Ser를 포함하고; 위치 186에 Ser 또는 Thr를 포함하고; 위치 189에 Glu를 포함하고; 및/또는 위치 194에 Phe를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 위치 153에서 Trp, Tyr, Leu, 또는 Gln를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 위치 188에서 Glu를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 위치 153에서 Trp 및/또는 위치 188에서 Glu를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 위치 153에서 Leu 및/또는 위치 188에서 Glu를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 위치 163에서 Asn를 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 다음 치환중 하나 또는 그 이상을 포함한다: 위치 153에 Trp; 위치 159에 Thr; 위치 161에 Trp; 위치 162에 Val; 위치 186에 Ser 또는 Thr; 위치 188에 Glu; 및/또는 위치 194에 Phe.
일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 다음에서 선택된 1, 2 또는 3개 위치를 더 포함한다: 위치 187은 Lys, Arg, Gly, 또는 Pro이고; 위치 197은 Ser, Thr, Glu, 또는 Lys이고; 그리고 위치 199는 Ser, Trp, 또는 Gly이다.
일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 서열 번호:4-29, 236-299, 및 422-435중 임의의 하나의 아미노산 114-220에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 단서조항으로 동일성 백분율에 위치 157, 159, 160, 161, 162, 163, 186, 189, 및 194 세트를 포함하지 않는 조건하에, 서열 번호:1의 아미노산 114-220에 대하여 최소한 85% 동일성을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 서열 번호:4-29, 236-299, 및 422-435중 임의의 하나의 아미노산 157-163 및/또는 186-194를 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 다음에서 선택된 최소한 하나의 위치를 포함한다: 위치 153은 Trp, Leu, 또는 Glu이고; 위치 157은 Tyr 또는 Phe이고; 위치 159는 Thr이고; 위치 160은 Glu이고; 위치 161은 Trp이고; 위치 162는 Ser, Ala, Val, 또는 Asn이고; 위치 163은 Ser 또는 Asn이고; 위치 186은 Thr 또는 Ser이고; 위치 188은 Glu 또는 Ser이고; 위치 189는 Glu이고; 그리고 위치 194는 Phe이다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 다음에서 선택된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개의 위치 (가령, 11개 위치)를 포함한다: 위치 153은 Trp, Leu, 또는 Glu (가령, Trp 또는 Leu)이고; 위치 157은 Tyr 또는 Phe이고; 위치 159는 Thr이고; 위치 160은 Glu이고; 위치 161은 Trp이고; 위치 162는 Ser, Ala, Val, 또는 Asn이고; 위치 163은 Ser 또는 Asn이고; 위치 186은 Thr 또는 Ser이고; 위치 188은 Glu 또는 Ser이고; 위치 189는 Glu이고; 그리고 위치 194는 Phe이다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 서열 번호:236-299 및 422-435중 임의의 하나에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는다.
일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 다음 아미노산을 포함한다: 위치 153은 Trp, Leu, 또는 Glu (가령, Trp 또는 Leu)이고; 위치 157은 Tyr 또는 Phe이고; 위치 159는 Thr이고; 위치 160은 Glu이고; 위치 161은 Trp이고; 위치 162는 Ser, Ala, Val, 또는 Asn이고; 위치 163은 Ser 또는 Asn이고; 위치 186은 Thr 또는 Ser이고; 위치 188은 Glu 또는 Ser이고; 위치 189는 Glu이고; 그리고 위치 194는 Phe이다. 추가 구체예에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 서열 번호:236-299 및 422-435중 임의의 하나에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는다.
일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 서열 번호:236-299 및 422-435중 임의의 하나의 아미노산 153-163 및/또는 186-194를 포함한다.
일부 구체예들에서, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 변형된 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드가 본원에서 제공되는데, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 서열 번호:4-29, 236-299, 및 422-435중 임의의 하나의 아미노산 114-220에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는다. 특정 구체예에서, 서열 번호:1을 참고로 하여 결정되었을 때, 위치 153, 157, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 186, 187, 188, 189, 194, 197 및 199에 상응하는 위치에서 최소한 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16개 (가령, 11 내지 16개) 잔기는 서열 번호:4-29 또는 236-299에서 결손되거나, 또는 치환되지 않는다.
상기 구체예들중 임의의 것에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 (i) 위치 139에서 Trp (T139W) 또는 (ii) 위치 139에서 Ser (T139S), 위치 141에서 Ala (L141A), 및 위치 180에서 Val (Y180V)를 더 포함하고, 이때 상기 아미노산 위치는 서열 번호:1을 참고로 하여 결정된다. 상기 구체예중 임의의 것에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 (i) 위치 201에서 Leu (M201L) 및 위치 207에서 Ser (N207S), 또는 (ii) 위치 207에서 Ser 또는 Ala (N207S 또는 N207A)를 더 포함하고, 이때 상기 아미노산 위치는 서열 번호:1을 참고로 하여 결정된다.
또다른 측면에서, 본 명세서는 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 변형된 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 특징으로 하며, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 153, 157, 159, 160, 162, 163, 186, 188, 189, 194, 197, 및 199를 포함하는 아미노산 위치 세트에서 하나 또는 그 이상의 치환을 포함하고; 그리고 이때 상기 치환 및 상기 위치는 서열 번호:13을 참고로 하여 결정된다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 위치 153에서 Glu, Leu, Ser, Val, Trp, 또는 Tyr; 위치 157에서 방향족 아미노산, Met, Pro, 또는 Val; 위치 159에서 Thr, Asn, 또는 Val; 위치 160에서 Glu, Ile, Pro, 또는 Val; 위치 162에서 지방족 아미노산, Ser, 또는 Thr; 위치 163에서 Ser, Asn, Arg, 또는 Thr; 위치 186에서 Thr, His, 또는 Ser; 위치 188에서 Glu, Ser, Asp, Gly, Thr, Pro, Gln, 또는 Arg; 위치 189에서 Glu 또는 Arg; 위치 194에서 Phe, His, Lys, Tyr, 또는 Trp; 위치 197에서 Ser, Thr, 또는 Trp; 그리고 위치 199에서 Ser, Cys, Pro, Met, 또는 Trp를 포함한다. 특정 구체예들에서, 위치 157에서 방향족 아미노산은 Tyr, Phe, 또는 Trp이고, 위치 162에서 지방족 아미노산은 Ala, Ile, 또는 Val이다.
일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 위치 153에서 Glu, Leu, 또는 Trp; 위치 157에서 방향족 아미노산; 위치 159에서 Thr; 위치 160에서 Glu; 위치 162에서 지방족 아미노산 또는 Ser; 위치 163에서 Ser 또는 Asn; 위치 186에서 Thr 또는 Ser; 위치 188에서 Glu 또는 Ser; 위치 189에서 Glu; 위치 194에서 Phe, His, Tyr, 또는 Trp; 위치 197에서 Ser; 그리고 위치 199에서 Ser를 포함한다. 특정 구체예들에서, 위치 157에서 방향족 아미노산은 Tyr 또는 Phe이고, 위치 162에서 Ala 또는 Val이다.
일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 서열 번호:556 또는 559의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 153, 157, 159, 160, 162, 163, 186, 188, 189, 194, 197, 및 199를 포함하는 아미노산 위치 세트에서 하나의 치환을 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 서열 번호:563-574중 임의의 하나의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 위치 153에서 Glu, Leu, 또는 Trp; 위치 157에서 Tyr 또는 Phe; 위치 159에서 Thr; 위치 160에서 Glu; 위치 162에서 Ala, Val, 또는 Ser; 위치 163에서 Ser 또는 Asn; 위치 186에서 Thr 또는 Ser; 위치 188에서 Glu 또는 Ser; 위치 189에서 Glu; 위치 194에서 Phe; 위치 197에서 Ser; 그리고 위치 199에서 Ser를 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 서열 번호:562의 서열을 갖는다.
또다른 측면에서, 본 명세서는 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 변형된 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 특징으로 하며, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 153, 157, 159, 160, 162, 163, 164, 186, 189, 및 194를 포함하는 아미노산 위치 세트에서 하나 또는 그 이상의 치환을 포함하고; 그리고 이때 상기 치환 및 상기 위치는 서열 번호:9를 참고로 하여 결정된다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 위치 153에서 Glu 또는 Trp; 위치 157에서 Val, Trp, Leu, 또는 Tyr; 위치 159에서 Leu, Pro, Phe, Thr, 또는 His; 위치 160에서 Pro, Val, 또는 Glu; 위치 162에서 Ala, Ser, Val, 또는 Gly; 위치 163에서 Leu, His, Gln, Gly, Val, Ala, Asn, Asp, Thr, 또는 Glu; 위치 164에서 Thr, Phe, Gln, Val, 또는 Tyr; 위치 186에서 Leu, Ser, Glu, Ala, 또는 Pro; 위치 189에서 Glu, Asp, Thr, 또는 Asn; 그리고 위치 194에서 Trp, Tyr, Phe, 또는 His를 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 위치 153에서 Glu 또는 Trp; 위치 157에서 Trp, Leu, 또는 Tyr; 위치 159에서 Thr 또는 His; 위치 160에서 Val; 위치 162에서 Ala, Ser, 또는 Val; 위치 163에서 Val, Asn, 또는 Thr; 위치 164에서 Gln 또는 Tyr; 위치 186에서 Pro; 위치 189에서 Thr 또는 Asn; 그리고 위치 194에서 Trp, Tyr, Phe, 또는 His를 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 서열 번호:577 또는 580의 서열을 갖는다.
한 측면에서, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 변형된 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드가 제공되며, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 118, 119, 120, 122, 210, 211, 212, 및 213을 포함하는 아미노산 위치 세트에서 4, 5, 6, 7, 또는 8개 치환을 포함하고, 이때 상기 치환 및 상기 위치는 서열 번호:1의 아미노산 114-220을 참고하여 결정된다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 위치 210에서 Gly; 위치 211에서 Phe; 및/또는 위치 213에서 Asp를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 다음에서 선택된 최소한 하나의 위치를 포함한다: 위치 118은 Phe 또는 Ile이고; 위치 119는 Asp, Glu, Gly, Ala, 또는 Lys이고; 위치 120은 Tyr, Met, Leu, Ile, 또는 Asp이고; 위치 122는 Thr 또는 Ala이고; 위치 210은 Gly이고; 위치 211은 Phe이고; 위치 212는 His, Tyr, Ser, 또는 Phe이고; 그리고 위치 213은 Asp이다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 다음에서 선택된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 위치를 포함한다: 위치 118은 Phe 또는 Ile이고; 위치 119는 Asp, Glu, Gly, Ala, 또는 Lys이고; 위치 120은 Tyr, Met, Leu, Ile, 또는 Asp이고; 위치 122는 Thr 또는 Ala이고; 위치 210은 Gly이고; 위치 211은 Phe이고; 위치 212는 His, Tyr, Ser, 또는 Phe이고; 그리고 위치 213은 Asp이다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 서열 번호:30-46중 임의의 하나의 아미노산 114-220에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 단서조항으로 동일성 백분율에 위치 118, 119, 120, 122, 210, 211, 212, 및 213 세트를 포함하지 않는 조건하에, 서열 번호:1의 아미노산 114-220에 대하여 최소한 85% 동일성을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 서열 번호:30-46중 임의의 하나의 아미노산 118-122 및/또는 210-213을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 (i) 위치 139에서 Trp (T139W) 또는 (ii) 위치 139에서 Ser (T139S), 위치 141에서 Ala (L141A), 및 위치 180에서 Val (Y180V)를 더 포함하고, 이때 상기 아미노산 위치는 서열 번호:1을 참고로 하여 결정된다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 (i) 위치 201에서 Leu (M201L), 그리고 위치 207에서 Ser (N207S)를 갖고, 또는 (ii) 위치 207에서 Ser 또는 Ala (N207S 또는 N207A)를 더 포함하고, 이때 상기 아미노산 위치는 서열 번호:1을 참고로 하여 결정된다.
일부 구체예들에서, 대응하는 변형안된 CH3 도메인은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 CH3 도메인이다. 일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 CH2 도메인 (가령, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 CH2 도메인)에 연결된다. 일부 구체예들에서, 상기 CH2 도메인은 서열 번호:1의 아미노산 서열을 기준으로 다음의 변형 세트중 하나 또는 둘을 보유한다: (a) 위치 7 및 위치 8에서 Ala (L7A 및 L8A); 그리고 (b)위치 25에서 Tyr (M25Y), 위치 27에서 Thr (S27T), 및 위치 29에서 Glu (T29E). 일부 구체예들에서, 세트 (a)는 위치 102에서 Gly (P102G)를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 힌지 영역을 통하여 Fab에 연결된다. 일부 구체예들에서, 상기 Fab는 Tau 단백질 (가령, 인간 Tau 단백질) 또는 이의 단편에 결합한다. 상기 Tau 단백질은 인산화된 Tau 단백질, 인산화안된 Tau 단백질, Tau 단백질의 접합 동소체(splice isoform), N-말단 절두된 Tau 단백질, C-말단 절두된 Tau 단백질, 및/또는 이의 단편일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 Fab는 베타-세크레타제 1 (BACE1) 단백질 (가령, 인간 BACE1 단백질) 또는 이의 단편에 결합한다. 상기 BACE1 단백질은 BACE1 단백질의 접합 동소체 또는 이의 단편일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 Fab는 골수 세포 2 (TREM2) 단백질 (가령, 인간 TREM2 단백질) 또는 이의 단편에서 발현된 촉발(triggering) 수용체에 결합한다. 일부 구체예들에서, 상기 Fab는 알파-시누크레인(synuclein) 단백질 (가령, 인간 알파-시누크레인 단백질) 또는 이의 단편에 결합한다. 상기 알파-시누크레인 단백질은 단량체 알파-시누크레인, 올리고머 알파-시누크레인, 알파-시누크레인 원섬유(fibril), 가용성 알파-시누크레인, 및/또는 이의 단편일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 이량체의 제1 폴리펩티드이며, 상기 이량체는 트란스페린 수용체 결합에 대하여 단가(monovalent)이다. 일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 상기 트란스페린 수용체에 결합하고, 변형된 CH3 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드와 함께, 이량체를 형성하는 제1 폴리펩티드이다. 일부 구체예들에서, 상기 제2 폴리펩티드는 변형된 CH3 도메인은 상기 제1 폴리펩티드의 변형된 CH3 도메인과 동일하다.
또다른 측면에서, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 변형된 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드가 제공되며, 이때 상기 변형된 CH2 도메인은 47, 49, 56, 58, 59, 60, 61, 62, 및 63을 포함하는 아미노산 위치 세트에서 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개 치환을 포함하고, 이때 상기 치환 및 상기 위치는 서열 번호:1의 아미노산 4-113을 참고하여 결정된다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인은 위치 60에 Glu 및/또는 위치 61에 Trp를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인은 다음에서 선택된 최소한 하나의 위치를 포함한다: 위치 47은 Glu, Gly, Gln, Ser, Ala, Asn, Tyr, 또는 Trp이며; 위치 49는 Ile, Val, Asp, Glu, Thr, Ala, 또는 Tyr이며; 위치 56은 Asp, Pro, Met, Leu, Ala, Asn, 또는 Phe이며; 위치 58은 Arg, Ser, Ala, 또는 Gly이며; 위치 59는 Tyr, Trp, Arg, 또는 Val이며; 위치 60은 Glu이며; 위치 61은 Trp 또는 Tyr이며; 위치 62는 Gln, Tyr, His, Ile, Phe, Val, 또는 Asp이며; 그리고 위치 63은 Leu, Trp, Arg, Asn, Tyr, 또는 Val이다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인은 다음에서 선택된 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개 위치를 포함한다: 위치 47은 Glu, Gly, Gln, Ser, Ala, Asn, Tyr, 또는 Trp이며; 위치 49는 Ile, Val, Asp, Glu, Thr, Ala, 또는 Tyr이며; 위치 56은 Asp, Pro, Met, Leu, Ala, Asn, 또는 Phe이며; 위치 58은 Arg, Ser, Ala, 또는 Gly이며; 위치 59는 Tyr, Trp, Arg, 또는 Val이며; 위치 60은 Glu이며; 위치 61은 Trp 또는 Tyr이며; 위치 62는 Gln, Tyr, His, Ile, Phe, Val, 또는 Asp이며; 그리고 위치 63은 Leu, Trp, Arg, Asn, Tyr, 또는 Val이다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인은 위치 47에서 Glu, Gly, Gln, Ser, Ala, Asn, 또는 Tyr; 위치 49에서 Ile, Val, Asp, Glu, Thr, Ala, 또는 Tyr; 위치 56에서 Asp, Pro, Met, Leu, Ala, 또는 Asn; 위치 58에서 Arg, Ser, 또는 Ala; 위치 59에서 Tyr, Trp, Arg, 또는 Val; 위치 60에서 Glu; 위치 61에서 Trp; 위치 62에서 Gln, Tyr, His, Ile, Phe, 또는 Val; 및/또는 위치 63에서 Leu, Trp, Arg, Asn, 또는 Tyr을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인은 위치 58에서 Arg; 위치 59에서 Tyr 또는 Trp; 위치 60에서 Glu; 위치 61에서 Trp; 및/또는 위치 63에서 Arg 또는 Trp를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인은 서열 번호:47-62중 임의의 하나의 아미노산 4-113에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인은 단서조항으로 동일성 백분율에 위치 47, 49, 56, 58, 59, 60, 61, 62, 및 63 세트를 포함하지 않는 조건하에, 서열 번호:1의 아미노산 4-113에 대하여 최소한 85% 동일성을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인은 서열 번호:47-62중 임의의 하나의 아미노산 47-49 및/또는 56-63을 포함한다.
또다른 측면에서, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 변형된 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드가 제공되며, 이때 상기 변형된 CH2 도메인은 39, 40, 41, 42, 43, 44, 68, 70, 71, 및 72을 포함하는 아미노산 위치 세트에서 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 치환을 포함하고, 이때 상기 치환 및 상기 위치는 서열 번호:1의 아미노산 4-113을 참고하여 결정된다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인은 위치 43에 Pro, 위치 68에 Glu, 및/또는 위치 70에 Tyr를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인은 다음에서 선택된 최소한 하나의 위치를 포함한다: 위치 39는 Pro, Phe, Ala, Met, 또는 Asp이고; 위치 40은 Gln, Pro, Arg, Lys, Ala, Ile, Leu, Glu, Asp, 또는 Tyr이고; 위치 41은 Thr, Ser, Gly, Met, Val, Phe, Trp, 또는 Leu이고; 위치 42는 Pro, Val, Ala, Thr, 또는 Asp이고; 위치 43은 Pro, Val, 또는 Phe이고; 위치 44는 Trp, Gln, Thr, 또는 Glu이고; 위치 68은 Glu, Val, Thr, Leu, 또는 Trp이고; 위치 70은 Tyr, His, Val, 또는 Asp이고; 위치 71은 Thr, His, Gln, Arg, Asn, 또는 Val이고; 그리고 위치 72는 Tyr, Asn, Asp, Ser, 또는 Pro이다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인은 다음에서 선택된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 위치를 포함한다: 위치 39는 Pro, Phe, Ala, Met, 또는 Asp이고; 위치 40은 Gln, Pro, Arg, Lys, Ala, Ile, Leu, Glu, Asp, 또는 Tyr이고; 위치 41은 Thr, Ser, Gly, Met, Val, Phe, Trp, 또는 Leu이고; 위치 42는 Pro, Val, Ala, Thr, 또는 Asp이고; 위치 43은 Pro, Val, 또는 Phe이고; 위치 44는 Trp, Gln, Thr, 또는 Glu이고; 위치 68은 Glu, Val, Thr, Leu, 또는 Trp이고; 위치 70은 Tyr, His, Val, 또는 Asp이고; 위치 71은 Thr, His, Gln, Arg, Asn, 또는 Val이고; 그리고 위치 72는 Tyr, Asn, Asp, Ser, 또는 Pro이다.
일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인은 위치 39에 Pro, Phe, 또는 Ala; 위치 40에 Gln, Pro, Arg, Lys, Ala, 또는 Ile; 위치 41에 Thr, Ser, Gly, Met, Val, Phe, 또는 Trp; 위치 42에 Pro, Val, 또는 Ala; 위치 43에 Pro; 위치 44에 Trp 또는 Gln; 위치 68에 Glu; 위치 70에 Tyr; 위치 71에 Thr, His, 또는 Gln; 및/또는 위치 72에 Tyr, Asn, Asp, 또는 Ser를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인은 위치 39에 Met; 위치 40에 Leu 또는 Glu; 위치 41에 Trp; 위치 42에 Pro; 위치 43에 Val; 위치 44에 Thr; 위치 68에 Val 또는 Thr; 위치 70에 His; 위치 71에 His, Arg, 또는 Asn; 및/또는 위치 72에 Pro를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인은 위치 39에 Asp; 위치 40에 Asp; 위치 41에 Leu; 위치 42에 Thr; 위치 43에 Phe; 위치 44에 Gln; 위치 68에 Val 또는 Leu; 위치 70에 Val; 위치 71에 Thr; 및/또는 위치 72에 Pro를 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인은 서열 번호:63-85중 임의의 하나의 아미노산 4-113에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인은 단서조항으로 동일성 백분율에 위치 39, 40, 41, 42, 43, 44, 68, 70, 71, 및 72 세트를 포함하지 않는 조건하에, 서열 번호:1의 아미노산 4-113에 대하여 최소한 85% 동일성을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인은 서열 번호:63-85중 임의의 하나의 아미노산 39-44 및/또는 68-72을 포함한다.
또다른 측면에서, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 변형된 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드가 제공되며, 이때 상기 변형된 CH2 도메인은 41, 42, 43, 44, 45, 65, 66, 67, 69, 및 73을 포함하는 아미노산 위치 세트에서 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 치환을 포함하고, 이때 상기 치환 및 상기 위치는 서열 번호:1의 아미노산 4-113을 참고하여 결정된다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인은 다음에서 선택된 최소한 하나의 위치를 포함한다: 위치 41은 Val 또는 Asp이고; 위치 42는 Pro, Met, 또는 Asp이고; 위치 43은 Pro 또는 Trp이고; 위치 44는 Arg, Trp, Glu, 또는 Thr이고; 위치 45는 Met, Tyr, 또는 Trp이고; 위치 65는 Leu 또는 Trp이고; 위치 66은 Thr, Val, Ile, 또는 Lys이고; 위치 67은 Ser, Lys, Ala, 또는 Leu이고; 위치 69는 His, Leu, 또는 Pro이고; 그리고 위치 73은 Val 또는 Trp이다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인은 다음에서 선택된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 위치를 포함한다: 위치 41은 Val 또는 Asp이고; 위치 42는 Pro, Met, 또는 Asp이고; 위치 43은 Pro 또는 Trp이고; 위치 44는 Arg, Trp, Glu, 또는 Thr이고; 위치 45는 Met, Tyr, 또는 Trp이고; 위치 65는 Leu 또는 Trp이고; 위치 66은 Thr, Val, Ile, 또는 Lys이고; 위치 67은 Ser, Lys, Ala, 또는 Leu이고; 위치 69는 His, Leu, 또는 Pro이고; 그리고 위치 73은 Val 또는 Trp이다.
일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인은 위치 41에 Val; 위치 42에 Pro; 위치 43에 Pro; 위치 44에 Arg 또는 Trp; 위치 45에 Met; 위치 65에 Leu; 위치 66에 Thr; 위치 67에 Ser; 위치 69에 His; 및/또는 위치 73에 Val을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인은 위치 41에 Asp; 위치 42에 Met 또는 Asp; 위치 43에 Trp; 위치 44에 Glu 또는 Thr; 위치 45에 Tyr 또는 Trp; 위치 65에 Trp; 위치 66에 Val, Ile, 또는 Lys; 위치 67에 Lys, Ala, 또는 Leu; 위치 69에 Leu 또는 Pro; 및/또는 위치 73에 Trp을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인은 서열 번호:86-90중 임의의 하나의 아미노산 4-113에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인은 단서조항으로 동일성 백분율에 위치 41, 42, 43, 44, 45, 65, 66, 67, 69, 및 73 세트를 포함하지 않는 조건하에, 서열 번호:1의 아미노산 4-113에 대하여 최소한 85% 동일성을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인은 서열 번호:86-90중 임의의 하나의 아미노산 41-45 및/또는 65-73을 포함한다.
또다른 측면에서, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 변형된 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드가 제공되며, 이때 상기 변형된 CH2 도메인은 45, 47, 49, 95, 97, 99, 102, 103, 및 104 세트를 포함하는 아미노산 위치에서 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개 치환을 포함하고, 이때 상기 치환 및 상기 위치는 서열 번호:1의 아미노산 4-113을 참고하여 결정된다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인은 위치 103에서 Trp를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인은 다음에서 선택된 최소한 하나의 위치를 포함한다: 위치 45는 Trp, Val, Ile, 또는 Ala이고; 위치 47은 Trp 또는 Gly이고; 위치 49는 Tyr, Arg, 또는 Glu이고; 위치 95는 Ser, Arg, 또는 Gln이고; 위치 97은 Val, Ser, 또는 Phe이고; 위치 99는 Ile, Ser, 또는 Trp이고; 위치 102는 Trp, Thr, Ser, Arg, 또는 Asp이고; 위치 103은 Trp이고; 그리고 위치 104는 Ser, Lys, Arg, 또는 Val이다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인은 다음에서 선택된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개 위치를 포함한다: 위치 45는 Trp, Val, Ile, 또는 Ala이고; 위치 47은 Trp 또는 Gly이고; 위치 49는 Tyr, Arg, 또는 Glu이고; 위치 95는 Ser, Arg, 또는 Gln이고; 위치 97은 Val, Ser, 또는 Phe이고; 위치 99는 Ile, Ser, 또는 Trp이고; 위치 102는 Trp, Thr, Ser, Arg, 또는 Asp이고; 위치 103은 Trp이고; 그리고 위치 104는 Ser, Lys, Arg, 또는 Val이다.
일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인은 위치 45에 Val 또는 Ile; 위치 47에 Gly; 위치 49에 Arg; 위치95에 Arg; 위치 97에 Ser; 위치 99에 Ser; 위치 102에 Thr, Ser, 또는 Arg; 위치 103에 Trp; 및/또는 위치 104에 Lys 또는 Arg를 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인은 서열 번호:91-95중 임의의 하나의 아미노산 4-113에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인은 단서조항으로 동일성 백분율에 위치 45, 47, 49, 95, 97, 99, 102, 103, 및 104 세트를 포함하지 않는 조건하에, 서열 번호:1의 아미노산 4-113에 대하여 최소한 85% 동일성을 갖는다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인은 서열 번호:91-95중 임의의 하나의 아미노산 45-49 및/또는 95-104를 포함한다.
일부 구체예들에서, 대응하는 변형안된 CH2 도메인은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 CH2 도메인이다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인은 서열 번호:1의 아미노산 서열을 기준으로 다음의 변형 세트중 하나 또는 둘을 보유한다: (a) 위치 7 및 위치 8에서 Ala (L7A 및 L8A); 그리고 (b)위치 25에서 Tyr (M25Y), 위치 27에서 Thr (S27T), 및 위치 29에서 Glu (T29E). 일부 구체예들에서, 세트 (a)는 위치 102에서 Gly (P102G)를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 CH3 도메인에 연결된다. 일부 구체예들에서, CH3 도메인은 (i) 위치 139에서 Trp (T139W) 또는 (ii) 위치 139에서 Ser (T139S), 위치 141에서 Ala (L141A), 및 위치 180에서 Val (Y180V)를 포함하고, 이때 상기 아미노산 위치는 서열 번호:1의 아미노산 서열을 참고로 하여 결정된다. 일부 구체예들에서, 상기 CH3 도메인은 (i) 위치 201에서 Leu (M201L) 및 위치 207에서 Ser (N207S), 또는 (ii) 위치 207에서 Ser 또는 Ala (N207S 또는 N207A)를 포함하고, 이때 상기 아미노산 위치는 서열 번호:1을 참고로 하여 결정된다. 일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 Fab에 연결된다. 일부 구체예들에서, 상기 Fab는 Tau 단백질 (가령, 인간 Tau 단백질) 또는 이의 단편에 결합한다. 상기 Tau 단백질은 인산화된 Tau 단백질, 인산화안된 Tau 단백질, Tau 단백질의 접합 동소체(splice isoform), N-말단 절두된 Tau 단백질, C-말단 절두된 Tau 단백질, 및/또는 이의 단편일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 Fab는 베타-세크레타제 1 (BACE1) 단백질 (가령, 인간 BACE1 단백질) 또는 이의 단편에 결합한다. 상기 BACE1 단백질은 BACE1 단백질의 접합 동소체 또는 이의 단편일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 Fab는 골수 세포 2 (TREM2) 단백질 (가령, 인간 TREM2 단백질) 또는 이의 단편에서 발현된 촉발 수용체에 결합한다. 일부 구체예들에서, 상기 Fab는 알파-시누크레인 단백질 (가령, 인간 알파-시누크레인 단백질) 또는 이의 단편에 결합한다. 상기 알파-시누크레인 단백질은 단량체 알파-시누크레인, 올리고머 알파-시누크레인, 알파-시누크레인 원섬유, 가용성 알파-시누크레인, 및/또는 이의 단편일 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 본원에서 기술된 폴리펩티드, 가령, 서열 번호:4-95, 236-299, 302, 및 347-553중 임의의 하나와 트란스페린 수용체에 대한 결합을 경쟁하는 변형된 CH2 도메인 또는 변형된 CH3 도메인을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 본원에서 기술된 폴리펩티드, 가령, 서열 번호: 4-95, 236-299, 302, 및 347-553중 임의의 하나와 트란스페린 수용체상에 동일한 에피토프에 결합하는 변형된 CH2 도메인 또는 변형된 CH3 도메인을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 이량체의 제1 폴리펩티드이며, 상기 이량체는 트란스페린 수용체 결합에 대하여 단가(monovalent)이다. 일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 상기 트란스페린 수용체에 결합하고, 변형된 CH2 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드와 함께, 이량체를 형성하는 제1 폴리펩티드이다. 일부 구체예들에서, 상기 제2 폴리펩티드의 변형된 CH2 도메인은 상기 제1 폴리펩티드의 변형된 CH2와 동일하다.
또다른 측면에서, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하고, 그리고 서열 번호:4-29, 236-299, 및 422-435중 임의의 것의 아미노산 157-194, 또는 일부 구체예의 경우에는 아미노산 153-194 또는 아미노산 153-199, 서열 번호:30-46중 임의의 것의 아미노산 118-213, 서열 번호:47-62중 임의의 것의 아미노산 47-63, 서열 번호:63-85중 임의의 것의 아미노산 39-72, 서열 번호:86-90중 임의의 것의 아미노산 41-73, 또는 서열 번호:91-95중 임의의 것의 아미노산 45-104를 포함하는 폴리펩티드가 제공된다.
또다른 측면에서, 노브(knob) 돌연변이를 갖고, 그리고 서열 번호:4-95, 236-299, 및 422-435중 임의의 것의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 폴리펩티드가 본원에서 제공되며, 이때 상기 노브 돌연변이는 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W이다.
일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 노브 돌연변이, 그리고 서열 번호:349, 361, 373, 385, 397, 409, 436, 448, 460, 및 472중 임의의 것의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 이때 상기 노브 돌연변이는 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W이다. 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:349, 361, 373, 385, 397, 409, 436, 448, 460, 및 472중 임의의 하나의 서열을 포함한다.
또다른 측면에서, 노브 돌연변이, 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 그리고 서열 번호:4-95, 236-299, 및 422-435중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 폴리펩티드가 본원에서 제공되며, 이때 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 상기 노브 돌연변이는 T139W이며, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이는 L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)이다.
일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 노브 돌연변이, 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 그리고 서열 번호:350, 362, 374, 386, 398, 410, 437, 449, 461, 및 473중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 이때 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 상기 노브 돌연변이는 T139W이며, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이는 L7A 및 L8A이다. 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:350, 362, 374, 386, 398, 410, 437, 449, 461, 및 473중 임의의 하나의 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 노브 돌연변이, 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 그리고 서열 번호:351, 363, 375, 387, 399, 411, 438, 450, 462, 및 474중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 이때 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 상기 노브 돌연변이는 T139W이며, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이는 L7A, L8A, 및 P102G이다. 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:351, 363, 375, 387, 399, 411, 438, 450, 462, 및 474중 임의의 하나의 서열을 포함한다.
또다른 측면에서, 노브 돌연변이, 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이, 그리고 서열 번호:4-95, 236-299, 및 422-435중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 폴리펩티드가 본원에서 제공되며, 이때 상기 노브 돌연변이는 T139W이며, 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이는 (i) 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E, 또는 (ii) 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S이다.
일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 노브 돌연변이, 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이, 그리고 서열 번호:352, 364, 376, 388, 400, 412, 439, 451, 463 및 475중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 이때 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 상기 노브 돌연변이는 T139W이며, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이는 M25Y, S27T, 및 T29E이다. 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:352, 364, 376, 388, 400, 및 412중 임의의 하나의 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 노브 돌연변이, 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이, 그리고 서열 번호:485, 492, 499, 506, 513, 520, 527, 534, 541, 및 548중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 이때 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 상기 노브 돌연변이는 T139W이며, 및 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이는 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L과 함께, 또는 없이 N207S이다. 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호: 485, 492, 499, 506, 513, 520, 527, 534, 541, 및 548중 임의의 하나의 서열을 포함한다.
또다른 측면에서, 노브 돌연변이, 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖고, 그리고 서열 번호:4-95, 236-299, 및 422-435중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 본원에서 제공하며, 이때 상기 노브 돌연변이는 T139W, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이는 L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)이며, 그리고 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이는 (i) 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E이거나, 또는 (ii) 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S이다.
일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 노브 돌연변이, 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이, 그리고 서열 번호:353, 365, 377, 389, 401, 413, 440, 452, 464, 및 476중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 이때 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 상기 노브 돌연변이는 T139W이며, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이는 L7A 및 L8A이며, 그리고 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이는 M25Y, S27T, 및 T29E이다. 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:353, 365, 377, 389, 401, 413, 440, 452, 464, 및 476중 임의의 하나의 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 노브 돌연변이, 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이, 그리고 서열 번호:486, 493, 500, 507, 514, 521, 528, 535, 542, 및 549중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 이때 상기 노브 돌연변이는 T139W이며, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이는 L7A 및 L8A이고, 그리고 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이는 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때M201L와 함께, 또는 없이 N207S이다. 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:486, 493, 500, 507, 514, 521, 528, 535, 542, 및 549중 임의의 하나의 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 노브 돌연변이, 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이, 그리고 서열 번호:354, 366, 378, 390, 402, 414, 441, 453, 465, 및 477중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 이때 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 상기 노브 돌연변이는 T139W이며, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이는 L7A, L8A, 및 P102G이며, 그리고 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이는 M25Y, S27T, 및 T29E이다. 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:354, 366, 378, 390, 402, 414, 441, 453, 465, 및 477중 임의의 하나의 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 노브 돌연변이, 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이, 그리고 서열 번호:487, 494, 501, 508, 515, 522, 529, 536, 543, 및 550중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 이때 상기 노브 돌연변이는 T139W이며, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이는 L7A, L8A, 및 P102G이고, 그리고 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이는 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때M201L와 함께, 또는 없이 N207S이다. 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:487, 494, 501, 508, 515, 522, 529, 536, 543, 및 550중 임의의 하나의 서열을 포함한다.
또다른 측면에서, 홀(hole) 돌연변이를 갖고, 그리고 서열 번호:4-95, 236-299, 및 422-435중 임의의 것의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 폴리펩티드가 본원에서 제공되며, 이때 상기 홀 돌연변이는 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V이다.
일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 홀 돌연변이 및 서열 번호:355, 367, 379, 391, 403, 415, 442, 454, 466, 및 478중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 이때 상기 홀 돌연변이는 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V이다. 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:355, 367, 379, 391, 403, 415, 442, 454, 466, 및 478중 임의의 하나의 서열을 포함한다.
또다른 측면에서, 홀 돌연변이, 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 그리고 서열 번호:4-95, 236-299, 및 422-435중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 폴리펩티드가 본원에서 제공되며, 이때 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 상기 홀 돌연변이는 T139S, L141A, 및 Y180V이며, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이는 L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)이다.
일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 홀 돌연변이, 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 그리고 서열 번호:356, 368, 380, 392, 404, 416, 443, 455, 467, 및 479중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 이때 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 상기 홀 돌연변이는 T139S, L141A, 및 Y180V이며, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이는 L7A 및 L8A이다. 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:356, 368, 380, 392, 404, 416, 443, 455, 467 및 479중 임의의 하나의 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 홀 돌연변이, 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 그리고 서열 번호:357, 369, 381, 393, 405, 417, 444, 456, 468, 및 480중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 이때 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 상기 홀 돌연변이는 T139S, L141A, 및 Y180V이며, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이는 L7A, L8A, 및 P102G 이다. 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:357, 369, 381, 393, 405, 417, 444, 456, 468, 및 480중 임의의 하나의 서열을 포함한다.
또다른 측면에서, 홀 돌연변이, 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이, 그리고 서열 번호:4-95, 236-299, 및 422-435중 임의의 하나에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 폴리펩티드가 본원에서 제공되며, 이때 상기 홀 돌연변이는 T139S, L141A, 및 Y180V이고, 그리고 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이는 (i) 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E이며, 또는 (ii) 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S이다.
일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 홀 돌연변이, 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이, 그리고 서열 번호:358, 370, 382, 394, 406, 418, 445, 457, 469, 및 481중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 이때 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 상기 홀 돌연변이는 T139S, L141A, 및 Y180V이며, 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이는 M25Y, S27T, 및 T29E이다. 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:358, 370, 382, 394, 406, 418, 445, 457, 469, 및 481중 임의의 하나의 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 홀 돌연변이, 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이, 그리고 서열 번호:488, 495, 502, 509, 516, 523, 530, 537, 544, 및 551중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 이때 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 상기 홀 돌연변이는 T139S, L141A, 및 Y180V이고, 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이는 M201L와 함께, 또는 없이 N207S이다. 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:488, 495, 502, 509, 516, 523, 530, 537, 544, 및 551중 임의의 하나의 서열을 포함한다.
또다른 측면에서, 홀 돌연변이, 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이, 그리고 서열 번호:4-95, 236-299, 및 422-435중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 폴리펩티드가 본원에서 제공되며, 이때 상기 홀 돌연변이는 T139S, L141A, 및 Y180V이며, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이는 L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)이며, 그리고 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이는 (i) 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E 이며, 또는 (ii) 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S이다.
일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 홀 돌연변이, 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이, 그리고 서열 번호:359, 371, 383, 395, 407, 419, 446, 458, 470, 및 482중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 이때 번호:1의 303-345를 참고로 하여 번호매김될 때, 상기 홀 돌연변이는 T139S, L141A, 및 Y180V이며, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이는 L7A 및 L8A이고, 그리고 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이는 M25Y, S27T, 및 T29E이다. 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:359, 371, 383, 395, 407, 419, 446, 458, 470, 및 482중 임의의 하나의 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 홀 돌연변이, 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이, 그리고 서열 번호:489, 496, 503, 510, 517, 524, 531, 538, 545, 및 552중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 이때 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 상기 홀 돌연변이는 T139S, L141A, 및 Y180V이고, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이는 L7A 및 L8A이고, 그리고 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이는 M201L와 함께, 또는 없이 N207S이다. 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:489, 496, 503, 510, 517, 524, 531, 538, 545, 및 552중 임의의 하나의 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 홀 돌연변이, 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이, 그리고 서열 번호:360, 372, 384, 396, 408, 420, 447, 459, 471, 및 483중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 이때 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 상기 홀 돌연변이는 T139S, L141A, 및 Y180V이고, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이는 L7A, L8A, 및 P102G이고, 그리고 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이는 M25Y, S27T, 및 T29E이다. 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:360, 372, 384, 396, 408, 420, 447, 459, 471, 및 483중 임의의 하나의 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 홀 돌연변이, 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이, 그리고 서열 번호:490, 497, 504, 511, 518, 525, 532, 539, 546, 및 553중 임의의 하나의 서열에 대하여 소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 이때 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 상기 홀 돌연변이는 T139S, L141A, 및 Y180V이고, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이는 L7A, L8A, 및 P102G이고, 그리고 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이는 M201L와 함께, 또는 없이 N207S이다. 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:490, 497, 504, 511, 518, 525, 532, 539, 546, 및 553중 임의의 하나의 서열을 포함한다.
또다른 측면에서, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하고, 그리고 서열 번호:116-233, 303-345, 및 581-608중 임의의 하나의 서열을 포함하는 폴리펩티드가 제공된다.
일부 구체예들에서, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하고, 그리고 서열 번호:116-130중 임의의 하나의 제1 서열과 서열 번호:131-139로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 제 2 서열을 포함하는 폴리펩티드가 제공된다. 일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:121, 116, 122, 123, 또는 126-130중 임의의 하나의 제1 서열과 서열 번호:136, 137, 및 139로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 제 2 서열을 포함하는 폴리펩티드가 제공된다. 일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:120 또는 124-126중 임의의 하나의 제1 서열과 서열 번호:135, 138, 및 139로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 제 2 서열을 포함하는 폴리펩티드가 제공된다.
일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:116 및 서열 번호:131, 서열 번호:116 및 서열 번호:136, 서열 번호:117 및 서열 번호:132, 서열 번호:118 및 서열 번호:133, 서열 번호:119 및 서열 번호:134, 서열 번호:120 및 서열 번호:135, 서열 번호:121 및 서열 번호:136, 서열 번호:122 및 서열 번호:137, 서열 번호:123 및 서열 번호:136, 서열 번호:124 및 서열 번호:138, 서열 번호:125 및 서열 번호:135, 서열 번호:126 및 서열 번호:139, 서열 번호:127 및 서열 번호:136, 서열 번호:128 및 서열 번호:136, 서열 번호:129 및 서열 번호:136, 또는 서열 번호:130 및 서열 번호:136을 포함한다.
일부 구체예들에서, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하고, 그리고 서열 번호:303-339중 임의의 하나의 제1 서열과 서열 번호:136, 138, 및 340-345로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 제 2 서열을 포함하는 폴리펩티드가 제공된다. 일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:303 및 서열 번호:340, 서열 번호:304 및 서열 번호:340, 서열 번호:305 및 서열 번호:340, 서열 번호:306 및 서열 번호:341, 서열 번호:307 및 서열 번호:340, 서열 번호:308 및 서열 번호:340, 서열 번호:309 및 서열 번호:340, 서열 번호:310 및 서열 번호:340, 서열 번호:311 및 서열 번호:340, 서열 번호:312 및 서열 번호:341, 서열 번호:313 및 서열 번호:340, 서열 번호:314 및 서열 번호:340, 서열 번호:315 및 서열 번호:340, 서열 번호:316 및 서열 번호:340, 서열 번호:317 및 서열 번호:340, 서열 번호:318 및 서열 번호:341, 서열 번호:319 및 서열 번호:340, 서열 번호:320 및 서열 번호:340, 서열 번호:321 및 서열 번호:340, 서열 번호:322 및 서열 번호:340, 서열 번호:323 및 서열 번호:340, 서열 번호:324 및 서열 번호:341, 서열 번호:325 및 서열 번호:340, 서열 번호:326 및 서열 번호:340, 서열 번호:327 및 서열 번호:340, 서열 번호:328 및 서열 번호:340, 서열 번호:329 및 서열 번호:340, 서열 번호:330 및 서열 번호:341, 서열 번호:331 및 서열 번호:340, 서열 번호:332 및 서열 번호:340, 서열 번호:306 및 서열 번호:340, 서열 번호:312 및 서열 번호:340, 서열 번호:324 및 서열 번호:138, 서열 번호:318 및 서열 번호:340, 서열 번호:324 및 서열 번호:340, 서열 번호:330 및 서열 번호:340, 서열 번호:318 및 서열 번호:138, 서열 번호:333 및 서열 번호:136, 서열 번호:334 및 서열 번호:136, 서열 번호:312 및 서열 번호:138, 서열 번호:333 및 서열 번호:342, 서열 번호:335 및 서열 번호:342, 서열 번호:336 및 서열 번호:342, 서열 번호:334 및 서열 번호:342, 서열 번호:330 및 서열 번호:138, 서열 번호:330 및 서열 번호:343, 서열 번호:330 및 서열 번호:345, 서열 번호:337 및 서열 번호:136, 서열 번호:338 및 서열 번호:136, 서열 번호:339 및 서열 번호:136, 서열 번호:330 및 서열 번호:344, 서열 번호:312 및 서열 번호:343, 또는 서열 번호:312 및 서열 번호:345를 포함한다.
또다른 측면에서, 본 명세서는 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하고, 서열 번호:581, 583, 585, 587, 589, 591, 및 593중 임의의 하나의 제1서열, 그리고 서열 번호:582, 884, 586, 588, 590, 592, 및 594로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 제2 서열을 포함하는 폴리펩티드를 특징으로 한다. 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:581 및 서열 번호:582, 서열 번호:583 및 서열 번호:584, 서열 번호:585 및 서열 번호:586, 서열 번호:587 및 서열 번호:588, 서열 번호:589 및 서열 번호:590, 서열 번호:591 및 서열 번호:592, 또는 서열 번호:593 및 서열 번호:594를 포함한다.
또다른 측면에서, 본 명세서는 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하고, 서열 번호:554, 557, 및 560중 임의의 하나의 제1서열, 그리고 서열 번호:555, 558, 및 561로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 제2 서열을 포함하는 폴리펩티드를 특징으로 한다. 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:554 및 서열 번호:555, 서열 번호:557 및 서열 번호:558, 또는 서열 번호:560 및 서열 번호:561을 포함한다.
또다른 측면에서, 본 명세서는 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하고, 서열 번호:554, 557, 및 560 중 임의의 하나의 제1서열, 그리고 서열 번호:340-345, 582, 584, 586, 588, 590, 592, 및 594로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 제2 서열을 포함하는 폴리펩티드를 특징으로 한다. 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:554 및 서열 번호:340, 서열 번호:554 및 서열 번호:341, 서열 번호:554 및 서열 번호:342, 서열 번호:554 및 서열 번호:343, 서열 번호:554 및 서열 번호:344, 서열 번호:554 및 서열 번호:345, 서열 번호:554 및 서열 번호:582, 서열 번호:554 및 서열 번호:584, 서열 번호:554 및 서열 번호:586, 서열 번호:554 및 서열 번호:588, 서열 번호:554 및 서열 번호:590, 서열 번호:554 및 서열 번호:592, 서열 번호:554 및 서열 번호:594, 서열 번호:557 및 서열 번호:340, 서열 번호:557 및 서열 번호:341, 서열 번호:557 및 서열 번호:342, 서열 번호:557 및 서열 번호:343, 서열 번호:557 및 서열 번호:344, 서열 번호:557 및 서열 번호:345, 서열 번호:557 및 서열 번호:582, 서열 번호:557 및 서열 번호:584, 서열 번호:557 및 서열 번호:586, 서열 번호:557 및 서열 번호:588, 서열 번호:557 및 서열 번호:590, 서열 번호:557 및 서열 번호:592, 서열 번호:557 및 서열 번호:594, 서열 번호:560 및 서열 번호:340, 서열 번호:560 및 서열 번호:341, 서열 번호:560 및 서열 번호:342, 서열 번호:560 및 서열 번호:343, 서열 번호:560 및 서열 번호:344, 또는 서열 번호:560 및 서열 번호:345, 서열 번호:560 및 서열 번호:582, 서열 번호:560 및 서열 번호:584, 서열 번호:560 및 서열 번호:586, 서열 번호:560 및 서열 번호:588, 서열 번호:560 및 서열 번호:590, 서열 번호:560 및 서열 번호:592, 또는 서열 번호:560 및 서열 번호:594를 포함한다.
또다른 측면에서, 본 명세서는 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하고, 서열 번호:303-339, 581, 583, 585, 587, 589, 591, 및 593중 임의의 하나의 제1서열, 그리고 서열 번호:555, 558, 및 561로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 제2 서열을 포함하는 폴리펩티드를 특징으로 한다. 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:303 및 서열 번호:555, 서열 번호:303 및 서열 번호:558, 서열 번호:303 및 서열 번호:561, 서열 번호:304 및 서열 번호:555, 서열 번호:304 및 서열 번호:558, 서열 번호:304 및 서열 번호:561, 서열 번호:305 및 서열 번호:555, 서열 번호:305 및 서열 번호:558, 서열 번호:305 및 서열 번호:561, 서열 번호:306 및 서열 번호:555, 서열 번호:306 및 서열 번호:558, 서열 번호:306 및 서열 번호:561, 서열 번호:307 및 서열 번호:555, 서열 번호:307 및 서열 번호:558, 서열 번호:307 및 서열 번호:561, 서열 번호:308 및 서열 번호:555, 서열 번호:308 및 서열 번호:558, 서열 번호:308 및 서열 번호:561, 서열 번호:309 및 서열 번호:555, 서열 번호:309 및 서열 번호:558, 서열 번호:309 및 서열 번호:561, 서열 번호:310 및 서열 번호:555, 서열 번호:310 및 서열 번호:558, 서열 번호:310 및 서열 번호:561, 서열 번호:311 및 서열 번호:555, 서열 번호:311 및 서열 번호:558, 서열 번호:311 및 서열 번호:561, 서열 번호:312 및 서열 번호:555, 서열 번호:312 및 서열 번호:558, 서열 번호:312 및 서열 번호:561, 서열 번호:313 및 서열 번호:555, 서열 번호:313 및 서열 번호:558, 서열 번호:313 및 서열 번호:561, 서열 번호:314 및 서열 번호:555, 서열 번호:314 및 서열 번호:558, 서열 번호:314 및 서열 번호:561, 서열 번호:315 및 서열 번호:555, 서열 번호:315 및 서열 번호:558, 서열 번호:315 및 서열 번호:561, 서열 번호:316 및 서열 번호:555, 서열 번호:316 및 서열 번호:558, 서열 번호:316 및 서열 번호:561, 서열 번호:317 및 서열 번호:555, 서열 번호:317 및 서열 번호:558, 서열 번호:317 및 서열 번호:561, 서열 번호:318 및 서열 번호:555, 서열 번호:318 및 서열 번호:558, 서열 번호:318 및 서열 번호:561, 서열 번호:319 및 서열 번호:555, 서열 번호:319 및 서열 번호:558, 서열 번호:319 및 서열 번호:561, 서열 번호:320 및 서열 번호:555, 서열 번호:320 및 서열 번호:558, 서열 번호:320 및 서열 번호:561, 서열 번호:321 및 서열 번호:555, 서열 번호:321 및 서열 번호:558, 서열 번호:321 및 서열 번호:561, 서열 번호:322 및 서열 번호:555, 서열 번호:322 및 서열 번호:558, 서열 번호:322 및 서열 번호:561, 서열 번호:323 및 서열 번호:555, 서열 번호:323 및 서열 번호:558, 서열 번호:323 및 서열 번호:561, 서열 번호:324 및 서열 번호:555, 서열 번호:324 및 서열 번호:558, 서열 번호:324 및 서열 번호:561, 서열 번호:325 및 서열 번호:555, 서열 번호:325 및 서열 번호:558, 서열 번호:325 및 서열 번호:561, 서열 번호:326 및 서열 번호:555, 서열 번호:326 및 서열 번호:558, 서열 번호:326 및 서열 번호:561, 서열 번호:327 및 서열 번호:555, 서열 번호:327 및 서열 번호:558, 서열 번호:327 및 서열 번호:561, 서열 번호:328 및 서열 번호:555, 서열 번호:328 및 서열 번호:558, 서열 번호:328 및 서열 번호:561, 서열 번호:329 및 서열 번호:555, 서열 번호:329 및 서열 번호:558, 서열 번호:329 및 서열 번호:561, 서열 번호:330 및 서열 번호:555, 서열 번호:330 및 서열 번호:558, 서열 번호:330 및 서열 번호:561, 서열 번호:331 및 서열 번호:555, 서열 번호:331 및 서열 번호:558, 서열 번호:331 및 서열 번호:561, 서열 번호:332 및 서열 번호:555, 서열 번호:332 및 서열 번호:558, 서열 번호:332 및 서열 번호:561, 서열 번호:333 및 서열 번호:555, 서열 번호:333 및 서열 번호:558, 서열 번호:333 및 서열 번호:561, 서열 번호:334 및 서열 번호:555, 서열 번호:334 및 서열 번호:558, 서열 번호:334 및 서열 번호:561, 서열 번호:335 및 서열 번호:555, 서열 번호:335 및 서열 번호:558, 서열 번호:335 및 서열 번호:561, 서열 번호:336 및 서열 번호:555, 서열 번호:336 및 서열 번호:558, 서열 번호:336 및 서열 번호:561, 서열 번호:337 및 서열 번호:555, 서열 번호:337 및 서열 번호:558, 서열 번호:337 및 서열 번호:561, 서열 번호:338 및 서열 번호:555, 서열 번호:338 및 서열 번호:558, 서열 번호:338 및 서열 번호:561, 서열 번호:339 및 서열 번호:555, 서열 번호:339 및 서열 번호:558, 서열 번호:339 및 서열 번호:561, 서열 번호:581 및 서열 번호:555, 서열 번호:581 및 서열 번호:558, 서열 번호:581 및 서열 번호:561, 서열 번호:583 및 서열 번호:555, 서열 번호:583 및 서열 번호:558, 서열 번호:583 및 서열 번호:561, 서열 번호:585 및 서열 번호:555, 서열 번호:585 및 서열 번호:558, 서열 번호:585 및 서열 번호:561, 서열 번호:587 및 서열 번호:555, 서열 번호:587 및 서열 번호:558, 서열 번호:587 및 서열 번호:561, 서열 번호:589 및 서열 번호:555, 서열 번호:589 및 서열 번호:558, 서열 번호:589 및 서열 번호:561, 서열 번호:591 및 서열 번호:555, 서열 번호:591 및 서열 번호:558, 서열 번호:591 및 서열 번호:561, 서열 번호:593 및 서열 번호:555, 서열 번호:593 및 서열 번호:558, 또는 서열 번호:593 및 서열 번호:561을 포함한다.
또다른 측면에서, 본 명세서는 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하고, 서열 번호:609-614중 임의의 하나의 제1서열, 그리고 서열 번호:615-620으로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 제2 서열을 포함하는 폴리펩티드를 특징으로 한다.
또다른 측면에서, 본 명세서는 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하고, 서열 번호:303, 312, 315-318, 및 328중 임의의 하나의 제1서열, 그리고 서열 번호:135, 340, 및 341로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 제2 서열을 포함하는 폴리펩티드를 특징으로 한다. 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:303 및 서열 번호:340, 서열 번호:316 및 서열 번호:340, 서열 번호:317 및 서열 번호:340, 서열 번호:318 및 서열 번호:340, 서열 번호:328 및 서열 번호:341, 서열 번호:318 및 서열 번호:340, 서열 번호:312 및 서열 번호:340, 서열 번호:303 및 서열 번호:341, 서열 번호:316 및 서열 번호:135, 또는 서열 번호:315 및 서열 번호:341을 포함한다.
또다른 측면에서, 본 명세서는 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하고, 서열 번호:595, 597, 599, 601, 603, 605, 및 607중 임의의 하나의 제1서열, 그리고 서열 번호:596, 598, 600, 602, 604, 606, 및 608로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 제2 서열을 포함하는 폴리펩티드를 특징으로 한다. 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:595 및 서열 번호:596, 서열 번호:597 및 서열 번호:598, 서열 번호:599 및 서열 번호:600, 서열 번호:601 및 서열 번호:602, 서열 번호:603 및 서열 번호:604, 서열 번호:605 및 서열 번호:606, 또는 서열 번호:607 및 서열 번호:608을 포함한다.
또다른 측면에서, 본 명세서는 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하고, 서열 번호:575 및 578 중 임의의 하나의 제1서열, 그리고 서열 번호:576 및 579로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 제2 서열을 포함하는 폴리펩티드를 특징으로 한다. 특정 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:575 및 서열 번호:576 또는 서열 번호:578 및 서열 번호:579를 포함한다.
또다른 측면에서, 본 명세서는 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하고, 서열 번호:575 및 578 중 임의의 하나의 제1서열, 그리고 서열 번호:136, 138, 및 340-345로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 제2 서열을 포함하는 폴리펩티드를 특징으로 한다.
또다른 측면에서, 본 명세서는 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하고, 서열 번호:303-339중 임의의 하나의 제1서열, 그리고 서열 번호:576 및 579로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 제2 서열을 포함하는 폴리펩티드를 특징으로 한다.
일부 구체예들에서, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하고, 그리고 서열 번호:140-153중 임의의 하나의 제1 서열과 서열 번호:154-157로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 제 2 서열을 포함하는 폴리펩티드가 제공된다. 일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:140 및 서열 번호:154, 서열 번호:141 및 서열 번호:154, 서열 번호:142 및 서열 번호:154, 서열 번호:143 및 서열 번호:154, 서열 번호:144 및 서열 번호:154, 서열 번호:145 및 서열 번호:154, 서열 번호:146 및 서열 번호:154, 서열 번호:147 및 서열 번호:154, 서열 번호:148 및 서열 번호:155, 서열 번호:149 및 서열 번호:154, 서열 번호:140 및 서열 번호:156, 서열 번호:150 및 서열 번호:156, 서열 번호:151 및 서열 번호:157, 서열 번호:152 및 서열 번호:155, 또는 서열 번호:153 및 서열 번호:154를 포함한다.
일부 구체예들에서, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하고, 그리고 서열 번호:158-171중 임의의 하나의 제1 서열과 서열 번호:172-186으로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 제 2 서열을 포함하는 폴리펩티드가 제공된다. 일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:158 및 서열 번호:172, 서열 번호:158 및 서열 번호:179, 서열 번호:159 및 서열 번호:173, 서열 번호:159, 및 서열 번호:181, 서열 번호:160 및 서열 번호:174, 서열 번호:161 및 서열 번호:175, 서열 번호:162 및 서열 번호:176, 서열 번호:163 및 서열 번호:177, 서열 번호:164 및 서열 번호:178, 서열 번호:165 및 서열 번호:180, 서열 번호:166 및 서열 번호:182, 서열 번호:167 및 서열 번호:183, 서열 번호:168 및 서열 번호:184, 서열 번호:169 및 서열 번호:185, 서열 번호:170 및 서열 번호:174, 또는 서열 번호:171 및 서열 번호:186을 포함한다.
일부 구체예들에서, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하고, 그리고 서열 번호:187-204중 임의의 하나의 제1 서열과 서열 번호:205-215로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 제 2 서열을 포함하는 폴리펩티드가 제공된다. 일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:187 및 서열 번호:205, 서열 번호:187 및 서열 번호:206, 서열 번호:188 및 서열 번호:206, 서열 번호:189 및 서열 번호:207, 서열 번호:190 및 서열 번호:206, 서열 번호:191 및 서열 번호:205, 서열 번호:192 및 서열 번호:206, 서열 번호:193 및 서열 번호:208, 서열 번호:194 및 서열 번호:206, 서열 번호:195 및 서열 번호:209, 서열 번호:196 및 서열 번호:206, 서열 번호:197 및 서열 번호:205, 서열 번호:198 및 서열 번호:206, 서열 번호:199 및 서열 번호:208, 서열 번호:200 및 서열 번호:206, 서열 번호:201 및 서열 번호:210, 서열 번호:201 및 서열 번호:211, 서열 번호:201 및 서열 번호:212, 서열 번호:202 및 서열 번호:212, 서열 번호:203 및 서열 번호:213, 서열 번호:203 및 서열 번호:214, 또는 서열 번호:204 및 서열 번호:215를 포함한다.
일부 구체예들에서, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하고, 그리고 서열 번호:216-220중 임의의 하나의 제1 서열과 서열 번호:221-224로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 제 2 서열을 포함하는 폴리펩티드가 제공된다. 일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:216 및 서열 번호:221, 서열 번호:217 및 서열 번호:221, 서열 번호:218 및 서열 번호:222, 서열 번호:219 및 서열 번호:223, 또는 서열 번호:220 및 서열 번호:224를 포함한다.
일부 구체예들에서, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하고, 그리고 서열 번호:225-228중 임의의 하나의 제1 서열과 서열 번호:229-233으로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 제 2 서열을 포함하는 폴리펩티드가 제공된다. 일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:225 및 229, 서열 번호:226 및 서열 번호:230, 서열 번호:226 및 서열 번호:231, 서열 번호:227 및 서열 번호:232, 또는 서열 번호:228 및 서열 번호:233을 포함한다.
상기 구체예중 임의의 것에서, 상기 폴리펩티드는 또한 위치 7 및 8에 Leu-에서-Ala로의 치환 (L7A 및 L8A)을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 위치 7 및 8 에서의 Ala 치환 (L7A 및 L8A)은 위치 102에서 Pro-에서-Gly로의 치환(P102G)과 복합된다.
여전히 또다른 측면에서, 본원에서 기술된 바와 같은 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
또다른 측면에서, 본원에서 기술된 바와 같은 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터가 본원에서 제공된다.
여전히 또다른 측면에서, 본원에서 기술된 바와 같은 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 숙주 세포가 본원에서 제공된다
여전히 또다른 측면에서, 변형된 CH3 도메인 또는 변형된 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 만드는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 본원에서 기술된 폴리뉴클레오티드에 인코드된 폴리펩티드가 발현되는 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 것을 포함한다.
또다른 측면에서, 본원에서 기술된 바와 같은 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 및 약학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물이 제공된다.
여전히 또다른 측면에서, 조성물이 내피를 통과하는 트랜스사이토시스를 위한 방법이 제공되는데, 상기 방법은 상기 내피에 본원에서 기술된 바와 같은 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 내피는 혈액-뇌-장벽 (BBB)이다.
여전히 또다른 측면에서, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 CH3 도메인을 작제하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음을 포함한다:
(a) 다음을 포함하는 아미노산 위치 세트에서 최소한 5개 아미노산 치환을 갖도록 CH3 도메인을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 변형시키고:
(i) 157, 159, 160, 161, 162, 163, 186, 189, 및 194; 또는
(ii) 118, 119, 120, 122, 210, 211, 212, 및 213,
이때 상기 치환 및 위치는 서열 번호:1의 아미노산 114-220을 참고로 하여 결정된다;
(b) 상기 변형된 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 발현시키고; 그리고
(c) 상기 변형된 CH3 도메인은 트란스페린 수용체에 결합하는 지를 결정한다.
또다른 측면에서, 본원에서는 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 CH3 도메인을 작제하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 (a) CH3 도메인 치환을 기술하는 전술한 단락중 임의의 하나에서 제시된 바와 같이, CH3 도메인안에 최소한 5개 아미노산 치환을 갖도록 CH3 도메인을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 변형시키고; 그리고 (b) 상기 변형된 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 발현 및 회수하는 것을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 발현시키고, 상기 변형된 CH3 도메인이 트란스페린 수용체에 결합하는 지를 결정하는 단계들은 디스플레이 시스템을 이용하여 실행된다. 일부 구체예들에서, 상기 디스플레이 시스템은 세포 표면 디스플레이 시스템, 바이러스 디스플레이 시스템, mRNA 디스플레이 시스템, 폴리좀 디스플레이 시스템, 또는 리보좀 디스플레이 시스템이다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 가용성 단백질로 발현된다.
또다른 측면에서, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 CH2 도메인을 작제하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 다음을 포함한다:
(a) 다음을 포함하는 아미노산 위치 세트에서 최소한 5개 아미노산 치환을 갖도록 CH2 도메인을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 변형시키고:
(i) 47, 49, 56, 58, 59, 60, 61, 62, 및 63;
(ii) 39, 40, 41, 42, 43, 44, 68, 70, 71, 및 72;
(iii) 41, 42, 43, 44, 45, 65, 66, 67, 69, 및 73; 또는
(iv) 45, 47, 49, 95, 97, 99, 102, 103, 및 104;
이때 상기 치환 및 위치는 서열 번호:1의 아미노산 4-113을 참고로 하여 결정된다;
(b) 상기 변형된 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 발현시키고; 그리고
(c) 상기 변형된 CH2 도메인은 트란스페린 수용체에 결합하는 지를 결정한다.
또다른 측면에서, 본원에서는 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 CH2 도메인을 작제하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 (a) CH2 도메인 치환을 기술하는 전술한 단락중 임의의 하나에서 제시된 바와 같이, CH2 도메인안에 최소한 5개 아미노산 치환을 갖도록 CH2 도메인을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 변형시키고; 그리고 (b) 상기 변형된 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 발현 및 회수하는 것을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 발현시키고, 상기 변형된 CH2 도메인이 트란스페린 수용체에 결합하는 지를 결정하는 단계들은 디스플레이 시스템을 이용하여 실행된다. 일부 구체예들에서, 상기 디스플레이 시스템은 세포 표면 디스플레이 시스템, 바이러스 디스플레이 시스템, mRNA 디스플레이 시스템, 폴리좀 디스플레이 시스템, 또는 리보좀 디스플레이 시스템이다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 가용성 단백질로 발현된다.
또다른 측면에서, 본 명세서는 비-고유의 결합 부위를 포함하는 변형된 Fc 폴리펩티드가 표적 (가령, 트란스페린 수용체)에 결합하는 것을 강화시키는 방법을 특징으로 하는데, 상기 방법 다음을 포함한다: (a) 비-고유의 결합 부위의 10 Å이내 (가령, 9 Å, 8 Å, 7 Å, 6 Å, 5 Å, 4 Å, 3 Å, 2 Å, 또는 1 Å) 하나 또는 그 이상의 위치에 하나 또는 그 이상의 치환을 도입시키고; 그리고 (b) 상기 변형된 Fc 폴리펩티드가 상기 표적에 결합하는 지를 테스트한다.
일부 구체예들에서, 상기 비-고유의 결합 부위는 다음 위치중 하나 또는 그 이상에서 치환을 포함한다: 157, 159, 160, 161, 162, 163, 186, 189, 및 194.
일부 구체예들에서, 상기 비-고유의 결합 부위의 10 Å 이내 하나 또는 그 이상의 위치에서 하나 또는 그 이상의 치환은 서열 번호:1을 참고하여, K21, R28, Q115, R117, E118, Q120, T132, K133, N134, Q135, S137, K143, E153, E155, S156, G158, Y164, K165, T166, D172, S173, D174, S176, K182, L183, T184, V185, K187, S188, Q191, Q192, G193, V195, F196, S197, S199, Q211, S213, S215, L216, S217, P218, G219, 및 K220으로 구성된 군에서 선택된다.
도 1a-1d는 4개 CH2A2 클론의 파아지 ELISA 결과를 보여준다. 파아지의 표면 상에 CH2A2 Fc 변이체들이 발현되었고, 그리고 플레이트 상에 피복된 항-c-Myc 항체 9E10 (발현 대조군), 음성대조군, 인간 트란스페린 수용체 (TfR), 및 시노몰구스 (cyno) TfR에 결합에 대하여 테스트되었다. x-축은 파아지 용액의 OD268 를 나타내는데, 이는 파아지 농도의 척도다. 도 1a는 클론 CH2A2.5의 ELISA 결과를 보여준다. 도 1b는 클론 CH2A2.1의 ELISA 결과를 보여준다. 도 1c는 클론 CH2A2.4의 ELISA 결과를 보여준다. 도 1d는 CH2A2.16의 ELISA 결과를 보여준다.
도 2a 및 2b는 인간 TfR에 대한 CH2A2 클론 결합의 파아지 ELISA 결과를 보여준다. 파아지가 대략적인 결합 EC50에서 TfR-코팅된 ELISA 플레이트에 첨가되었고, 가용성 홀로(holo)-Tf 또는 가용성 TfR은 다양한 농도로 첨가되었다. CH2A2 클론이 플레이트-코팅된 TfR에 결합함에 있어서 가용성 TfR과 경쟁하지만, 홀로-Tf와는 경쟁하지 않았다는 것을 데이터에서 보여준다. 도 2a는 가용성 홀로-Tf가 첨가된 실험에 대한 결과를 보여준다. 도 2b는 가용성 TfR이 첨가된 실험에 대한 결과를 보여준다.
도 3a-3d는 홀로-Tf의 존재 또는 부재시, TfR에 CH2C 클론의 결합을 보여준다. 도 3a는 TfR을 ELISA 플레이트에 코팅하고, 파아지에 표시된 클론 CH2C.23을 다량의 홀로-Tf (5μM)의 존재 또는 부재 하에 첨가한 파지 ELISA의 결과를 보여준다. 도 3b는 인간 또는 cyno TfR-코팅된 ELISA 플레이트에 Fc-Fab 융합 형식(format)의 CH2C 클론의 결합을 보여준다. 도 3c는 인간 TfR, cyno TfR, 홀로-Tf, 항-Myc, 또는 스트렙타비딘이 ELISA 플레이트 상에 코딩되고, 파아지-디스플레이된 클론 CH2C.17 및 CH2C.22는 홀로-Tf의 존재 또는 부재 하에, 다양한 농도로 추가된 파아지 ELISAs 결과를 보여준다. 이들 클론이 TfR에 결합함에 있어서 홀로-Tf와는 경쟁하지 않았음을 이들 데이터에서 보여준다. 도 3d는 5 μM 홀로-Tf의 존재 하에 그리고 홀로-Tf의 결합에 대하여 차감된 배경에서, 항-스트렙타비딘 센서 상에 코팅된 TfR-바이오틴에 대한 클론 CH2C.7 결합을 Octet® (즉, 생물층 간섭계(biolayer interferometry)) 동역학 흔적을 보여준다.
도 4a 및 4b는 홀로-Tf의 존재 또는 부재시, TfR에 CH3B클론의 결합을 보여준다. 도 4a는 인간 TfR, cyno TfR, 홀로-Tf, 항-Myc, 또는 스트렙타비딘이 ELISA 플레이트 상에 코딩되고, 파아지-디스플레이된 클론 CH3B.11 및 CH3B.12는 홀로-Tf의 존재 또는 부재 하에 다양한 농도로 추가된, 파아지 ELISA 결과를 보여준다. 이들 클론이 TfR에 결합함에 있어서 홀로-Tf와는 경쟁하지 않았음을 이들 데이터에서 보여준다. 도 4b는 인간 또는 cyno TfR-코팅된 ELISA 플레이트에 CH3B클론의 결합을 보여준다. 상기 CH3B 클론 서열을 포함하는 Fc 영역은 Fab 단편에 융합되었고, 이량체 형식에 검증되었다.
도 5는 CH3B 클론의 성숙(maturation)에 대한 NNK 패치(patch) 라이브러리를 보여준다. 리본은 CH3 도메인의 백본(backbone)을 보여주는데, 여기서 어두운 표면은 원래 CH3B 레지스터를 나타내고, 밝은 표면 패치는 확장된 레퍼토리를 나타낸다.
도 6은 이스트(yeast)에서 CH3C 클론 선별을 위한 FACS 플롯을 보여주는데, 3회 소트 라운드(sort round) 후 결합 집단의 농축을 나타낸다. 소트 라운드 1 및 2에서, 바이오티닐화된 TfR은 스트렙타비딘-Alexa Fluor® 647 상에 사전-로딩된 후, 이스트와 함께 항온처리되었다. 소트 라운드 3에서, 바이오티닐화된 TfR은 이스트와 우선 항온처리되었고, 스트렙타비딘-Alexa Fluor® 647은 2차 탐지용으로 추가되었다. 모든 소트 라운드에서, 이스트 디스플레이 구조체 상에서 C-말단 Myc 테그에 대항한 닭 항-c-Myc 항체 (Thermo Fisher에서 구함)을 이용하여 발현을 모니터하였다.
도 7a-7c는 홀로-Tf의 존재 또는 부재 하에서, TfR에 대한 CH3C 클론의 결합을 보여준다. 클론은 Fc-Fab 융합 형식에서 분석되었다. TfR에 결합하는 가변 영역을 갖는 표준 항체인 Ab204는 이 분석에서 양성 대조군으로 이용되었다. 도 7a는 ELISA 플레이트에 코팅된 인간 TfR에 대한 CH3C 변이체의 결합을 보여준다. 도 7b는 5 μM 홀로-Tf 존재하에 ELISA 플레이트에 코팅된 인간 TfR에 대한 CH3C 변이체의 결합을 보여준다. 도 7c는 ELISA 플레이트에 코팅된 cyno TfR에 대한 CH3C 변이체의 결합을 보여준다.
도 8은 인간 TfR를 내생적으로 발현시키는 293F 세포에 대한 CH3C 클론의 결합을 보여준다. 세포를 96-웰 V자형 바닥 플레이트에 분포시키고, Fc-Fab 융합 결합 단백질로 포맷된 다양한 농도의 CH3C 클론을 첨가하였다. 4℃에서 1 시간 항온처리 후, 플레이트를 회전시키고, 세척한 다음, 염소-항-인간-IgG-Alexa Fluor® 647 2 차 항체와 함께 4℃에서 30 분 동안 항온처리했다. 세포를 추가로 세척시킨 후, 플레이트를 FACSCanto™II 유세포 분석기에서 판독하고, FlowJo® 소프트웨어를 사용하여 APC (647 nm) 채널의 정중(median) 형광 값을 결정하였다.
도 9a 및 9b는 인간 TfR를 내생적으로 발현시키는 HEK293 세포에서 CH3C.3의 내재화(internalization)를 보여준다. CH3C.3 또는 대조군은 1μM 농도로 37℃ 및 8% CO2 농도에서 30 분 동안 추가되었고, 그 다음 이들 세포는 세척되고, 침투화되고, 그리고 항-인간-IgG-Alexa Fluor® 488 2차 항체로 착색되었다. 추가 세척 후, 세포를 형광 현미경으로 이미지화하고 푼타(puncta)의 수를 정량화하였다. 도 9a는 현미경 데이터를 나타낸다. 도 9b는 웰당 푼타 수의 그래프를 보여준다.
도 10은 상기 CH3C 소프트 라이브러리의 선택 체계를 보여준다. 초기 라이브러리는 인간 (H) 또는 cyno (C) TfR에 대해 MACS에 의해 분류되었다. 이어서, 생성된 이스트 모둠(pool)을 분할하고, 각각 첫 번째 FACS 소트 라운드에서와 같이, 인간 또는 cyno TfR에 대해 분류 하였다. 생성된 모둠을 다른 FACS 소트 라운드에 대해 다시 분할했다. 마지막으로, HHH 및 CCC 모둠은 분리된 상태로 유지되었고, 두 표적 종을 모두 보여준 다른 모둠은 최종적으로 풀링되었다(pooled).
도 11a 및 11b는 제 1 소프트 랜덤 라이브러리로부터 확인된 CH3C 클론이 인간 및 cyno TfR에 결합하는 것을 보여준다. 양성 대조군은 고친화력 항-TfR 항체인 Ab204 및 저친화력 항-TfR 항체인 Ab084였다. 도 11a는 인간 TfR에 대한 결합을 보여준다. 도 11b는 cyno TfR에 대한 결합을 보여준다.
도 12a 및 12b는 홀로-Tf 존재 또는 부재하에서, 제 1 소프트 랜덤 라이브러리로부터 확인된 CH3C 클론이 인간 TfR에 결합하는 것을 보여준다. 클론은 Fc-Fab 융합 형식이다. 고친화력 항-TfR 항체인 Ab204는 이 분석에서 양성 대조군으로 이용되었다. 도 12a는 ELISA 플레이트에 코팅된 인간 TfR에 대한 CH3C 변이체의 결합을 보여준다. 도 12b는 5 μM 홀로-Tf 존재하에 ELISA 플레이트에 코팅된 인간 TfR에 대한 CH3C 변이체의 결합을 보여준다.
도 13은 제1 소프트 랜덤화 라이브러리로부터 확인된 CH3C 클론의 293F 세포에 대한 결합하는 것을 보여준다. 세포를 96-웰 V자형 바닥 플레이트에 분포시키고, Fc-Fab 융합 단백질로 포맷된 다양한 농도의 CH3C 클론을 첨가하였다. 4℃에서 1 시간 항온처리 후, 플레이트를 회전시키고, 세척한 다음, 염소-항-인간-IgG-Alexa Fluor® 647 2 차 항체와 함께 4℃에서 30 분 동안 항온처리했다. 세포를 추가로 세척시킨 후, 플레이트를 FACSCanto™II 유세포 분석기에서 판독하고, FlowJo® 소프트웨어를 사용하여 APC (647 nm) 채널의 정중 형광 값을 결정하였다.
도 14a-14c는 제1 소프트 랜덤화 라이브러리로부터 확인된 CH3C 클론의 CHO-K1 세포에 대한 결합하는 것을 보여준다. 세포를 96-웰 V자형 바닥 플레이트에 분포시키고, Fc-Fab 융합체로 포맷된 다양한 농도의 CH3C 클론을 첨가하였다. 4℃에서 1 시간 항온처리 후, 플레이트를 회전시키고, 세척한 다음, 염소-항-인간-IgG-Alexa Fluor® 647 2 차 항체와 함께 4℃에서 30 분 동안 항온처리했다. 세포를 추가로 세척시킨 후, 플레이트를 FACSCanto™II 유세포 분석기에서 판독하고, FlowJo® 소프트웨어를 사용하여 APC (647 nm) 채널의 정중 형광 값을 결정하였다. 도 14a는 인간 TfR을 과다발현시키는 CHO-K1 세포를 보여준다. 도 14b는 cyno TfR을 과다발현시키는 CHO-K1 세포를 보여준다. 도 14c는 인간 TfR을 발현시키지 않는 CHO-K1 부모(parental) 세포를 보여준다.
도 15a 및 15b는 TfR 정점 도메인을 보여준다. 도 15a는 인간 TfR 단백질 상에 정점 도메인의 위치를 보여준다. 삽입부는 인간과 cyno TfR 간에 상이한 7개 잔기의 근접 사진을 나타낸다. 도 15b는 인간 (서열 번호:107)과 cyno (서열 번호:108) TfR 상이에 상이한 7개 잔기를 담고 있는 서열 정렬을 나타낸다. 콘센수스(consensus) 서열은 서열 번호:622이다.
도 16a-16e는 파아지에 디스플레이된 정점 도메인에 대한 CH3C 클론의 결합을 나타낸다. 도 16a는 다양한 TfR 정점 도메인 돌연변이체(mutants)의 Myc 발현을 도시하며, 이는 돌연변이체의 발현 수준은 유사하고 표준화되었음을 나타낸다. 도 16b는 CH3C.18의 야생형 및 돌연변이체 인간 TfR 정점 도메인에 대한 결합을 보여주는데, R208G 돌연변이체에 대한 결합은 감소됨을 보여준다. 도 16c는 CH3C.35의 야생형 및 돌연변이체 인간 TfR 정점 도메인에 대한 결합을 보여주는데, R208G 돌연변이체에 대한 결합은 감소됨을 보여준다. 도 16d는 CH3C.18의 야생형 인간 및 cyno TfR 정점 도메인 및 G208R 돌연변이체 cyno 정점 도메인에 대한 결합을 보여주는데, 돌연변이체에 대한 결합이 회복됨을 보여준다. 도 16e는 CH3C.35의 야생형 인간 및 cyno TfR 정점 도메인 및 G208R 돌연변이체 cyno 정점 도메인에 대한 결합을 보여주는데, 돌연변이체에 대한 결합이 회복됨을 보여준다.
도 17a-17d는 돌연변이된 위치를 야생형 잔기로 되돌림으로써 CH3C 변이체의 파라토프 메핑(paratope mapping)을 나타낸다. 도 17a는 복귀(reversion) 돌연변이체의 경우 인간 TfR에 대한 ELISA 결합에 의해 CH3C.35의 파라토프 메핑을 보여준다. 도 17b는 복귀 돌연변이체의 경우 cyno TfR에 대한 ELISA 결합에 의해 CH3C.35의 파라토프 메핑을 보여준다. 도 17c는 복귀 돌연변이체의 경우 인간 TfR에 대한 ELISA 결합에 의해 CH3C.18의 파라토프 메핑을 보여준다. 도 17d는 복귀 돌연변이체의 경우 cyno TfR에 대한 ELISA 결합에 의해 CH3C.18의 파라토프 메핑을 보여준다.
도 18a-18d는 CH3C 콘센수스 성숙 라이브러리의 기획을 보여준다. 도 18a는 상기 CH3C.35-유사(like) 서열에 기초한 콘센수스 라이브러리를 나타낸다. 도 18b는 상기 CH3C.18-유사(like) 서열에 기초한 콘센수스 라이브러리를 나타낸다. 도 18c는 CH3C.18 및 CH3C.35에 기초한 갭(gap) 라이브러리를 나타낸다. 도 18d는 CH3C.18에 기초한 방향족(aromatics) 라이브러리를 나타낸다.
도 19a-19e는 콘센수스 성숙 라이브러리의 CH3C 변이체들의 인간 또는 cyno TfR에 대한 결합 ELISAs를 보여준다. 새로운 변이체 (가령, CH3C.3.2-1, CH3C.3.2-5, 및 CH3C.3.2-19)은 cyno 및 인간 TfR에 대한 유사한 결합 EC50 값을 갖지만, 반면 부모 클론 CH3C.18 및 CH3C.35는 cyno TfR에 비하여 인간의 경우 상당히 더 나은 EC50 값을 가졌다. 도 19a는 CH3C.3.2-1에 대한 데이터를 나타낸다. 도 19b는 CH3C.3.2-19에 대한 데이터를 나타낸다. 도 19c는 CH3C.3.2-5에 대한 데이터를 나타낸다. 도 19d는 CH3C.18에 대한 데이터를 나타낸다. 도 19e는 CH3C.35에 대한 데이터를 나타낸다.
도 20은 인간 (HEK293) 및 원숭이 (LLC-MK2) 세포에서 콘센수스 성숙 라이브러리로부터 CH3C 변이체의 내재화를 보여준다. 유사한 인간 및 cyno TfR 친화력을 갖는 클론 CH3C.3.2-5 및 CH3C3.2-19는 클론 CH3C.35와 비교하였을 때, 원숭이 세포에서 상당히 개선된 취입을 가졌고, 인간 TfR에 결합이 더 우수하였다. 항-BACE1 항체인 Ab107은 음성 대조군으로 이용되었다. (BACE1은 HEK293 또는 MK2 세포에서 발현되지 않는다). 항-TfR 항체인 Ab204는 양성 대조군으로 이용되었다.
도 21은 CH3 구조 (PDB 4W4O로부터 개작된)에서 나타낸 NNK 워크(walk) 잔기 지도를 보여준다. 검은 색 표면은 원래 CH3C 레지스터를 나타내고, 회색 표면은 NNK 워크 구조에 통합된 44 개의 잔기를 보여 주며, 리본은 야생형 백본을 나타낸다.
도 22는 NNK 워크 라이브러리를 3 회 라운드 분류한 후, 농축된 이스트 집단을 보여준다. 이스트를 항-c-Myc로 착색하여 발현 (x-축) 및 TfR 정점 도메인에 대한 결합을 모니터링하였다 (200 nM cyno 또는 200 nM 인간) (y-축). 여기에 제시된 데이터는 TfR 정점 도메인 오르소로그(orthologs)에 대한 향상된 결합을 명확하게 보여준다.
도 23a 및 23b는 CH3C.35.21 돌연변이체에 대한 FACS 데이터를 보여준다. 이스트를 항-c-Myc로 착색하여 발현 (x-축) 및 인간 TfR 정점 도메인에 대한 결합을 모니터링하였다(200 nM) (y-축). 도 23a는 클론 CH3C.35.21에 대한 FACS 데이터를 보여준다. 도 23b는 돌연변이체에 대한 FACS 데이터를 보여주는데, 이때 클론 CH3C.35.21의 11개 위치는 야생형 (FACS 플롯의 상단 열)으로 역 돌연변이되거나, 또는 총 20개 아미노산의 NNK 라이브러리로 발현되었다 (FACS 플롯의 하단 열, 임의의 소팅 전).
도 24a-24d는 이가(bivalent) 및 단가(monovalent) CH3C 폴리펩티드의 인간 및 cyno TfR에 대한 결합을 ELISA 비교한 것을 나타낸다. 도 24a는 이가 CH3C 폴리펩티드의 인간 TfR에 결합을 보여준다. 도 24b는 이가 CH3C 폴리펩티드의 cyno TfR에 결합을 보여준다. 도 24c는 단가 CH3C 폴리펩티드의 인간 TfR에 결합을 보여준다. 도 24d는 단가 CH3C 폴리펩티드의 cyno TfR에 결합을 보여준다.
도 25a-25e는 단가 CH3C 폴리펩티드의 세포 결합을 보여준다. 도 25a는 293F 세포를 보여준다. 도 25b는 도 25a에 나타낸 293F 세포에 대한 결합을 확대(zoom-in)한 것을 보여준다. 도 25c는 인간 TfR로 안정적으로 형질감염된 CHO-K1 세포를 나타낸다. 도 25d는 도 25c에 나타낸 인간 TfR로 안정적으로 형질감염된 CHO-K1 세포에 대한 결합을 확대한 것을 보여준다. 도 25e는 cyno TfR로 안정적으로 형질감염된 CHO-K1 세포를 나타낸다.
도 26은 HEK293 세포에서 단가 및 이가 CH3C 폴리펩티드의 내재화를 보여준다.
도 27a-27h는 CH3C 폴리펩티드의 결합 역학(kinetics)을 나타낸다. 도 27a는 CH3C.35.N163의 인간 TfR에 대한 결합을 보여준다. 도 27b는 CHC3.35의 인간 TfR에 대한 결합을 보여준다. 도 27c는 CHC3.35.N163의 인간 TfR에 대한 단가 결합을 보여준다. 도 27d는 CHC3.35의 인간 TfR에 대한 단가 결합을 보여준다. 도 27e는 CH3C.35.N163의 cyno TfR에 대한 단가 결합을 보여준다. 도 27f는 CHC3.35의 cyno TfR에 대한 결합을 보여준다. 도 27g는 CHC3.35.N163의 cyno TfR에 대한 단가 결합을 보여준다. 도 27h는 CHC3.35의 cyno TfR에 대한 단가 결합을 보여준다.
도 28a-28f는 CH3C 폴리펩티드의 결합 역학을 나타낸다. 도 28a는 CH3C.3.2-1의 인간 TfR에 대한 결합을 보여준다. 도 28b는 CH3C.3.2-5의 인간 TfR에 대한 결합을 보여준다. 도 28c는 CH3C.3.2-19의 인간 TfR에 대한 결합을 보여준다. 도 28d는 CH3C.3.2-1의 cyno TfR에 대한 결합을 보여준다. 도 28e는 CH3C.3.2-5의 cyno TfR에 대한 결합을 보여준다. 도 28f는 CH3C.3.2-19의 cyno TfR에 대한 결합을 보여준다.
도 29a-29e는 인간 TfR 세포외 도메인의 존재 (하부 자취) 또는 부재(상부 자취) 하에, pH 5.5에서 폴리펩티드-Fab 융합의 FcRn에 대한 결합을 보여준다. 도 29a는 클론 CH3C.35에 대한 데이터를 나타낸다. 도 29b는 클론 CH3C.35.19에 대한 데이터를 나타낸다. 도 29c는 클론 CH3C.35.20에 대한 데이터를 나타낸다. 도 29d는 클론 CH3C.35.21에 대한 데이터를 나타낸다. 도 29e는 클론 CH3C.35.24에 대한 데이터를 나타낸다.
도 30은 야생형 마우스에서 CH3C 폴리펩티드의 약력학 (PK) 분석을 나타낸다. 모든 폴리펩티드-Fab 융합은 CH3C.3.2-5(더 신속한 제거를 갖음)를 제외하고, 야생형 Fc-Fab 융합 (가령, Ab122, 항-RSV 항체, 및 Ab153, 항-BACE1 항체)에 필적하는 제거(clearance)를 갖는다.
도 31은 마우스 뇌 조직에서 뇌 약력학/약동학 (PK/PD) 데이터를 나타낸다. 키메라 huTfR 이형접합성(heterozygous) 마우스 (한 집단에서 n=4임)에게 42 mg/kg의 Ab153 또는 단가 CH3C.35.N163 (“CH3C.35.N163_mono”로 표지됨)를 정맥으로 투여하였고, 및 야생형 마우스 (n=3)에게 50 mg/kg의 대조군 인간 IgG1 (“huIgG1”로 표지됨)를 정맥으로 투여함. 막대 그래프는 평균 +/- SD을 나타낸다.
도 32a 및 32b는 50 mg/kg의 폴리펩티드로 처리하고, 24시간 후 hTfR정점+/+ 마우스에서 발견되는 IgG 농도를 나타낸다. 도 32a는 IgG의 혈장에서의 농도를 나타낸다. 도 32b는 IgG의 뇌 조직에서의 농도를 나타낸다.
도 33a 및 33b는 hTfR정점+/+ 마우스에서 아밀로이드 베타-단백질 40 (A베타 40)에서의 감소로 측정하였을 때, 24시간 후 투여된 폴리펩티드의 표적 참여(engagement)를 나타낸다. 도 33a는 A베타 40의 혈장내 농도를 나타낸다. 도 33b는 A베타 40의 뇌 조직내 농도를 나타낸다.
도 34는 CH3C.18 Fc 및 TfR 정점 도메인 (AD) 복합체의 크기 분획(sizing fraction)의 SDS-PAGE 겔을 보여준다. 라인 1: 분자량 마커. 라인 2: 크기-배제(size-exclusion) 크로마토그래피 후, 감소된 CH3C.18 Fc-AD 복합체.
도 35a 및 35b는 본 발명의 폴리펩티드와 트란스페린 수용체 간의 결합을 나타낸다. 도 35a는 클론 CH3C.18과 트란스페린 수용체의 정점 도메인 간의 결합 경계면(interface)을 나타낸다. 도 35b는 도 35a에 나타낸 결합 경계면의 확대도면을 보여준다.
도 36a 및 36b는 CH3C.18과 TfR 정점 도메인 사이의 상호작용을 나타낸다. 도 36a는 TfR 정점 도메인과 CH3C.18 Fc의 구조 양식(위), 그리고 TfR 정점 도메인과 CH3C.18 Fc의 결합 표면 (5 옹스트롬 이내) (아래)을 보여준다. 상기 공동-복합체 구조는 3.6Å 해상도에서 풀어내었다. 상기 구조는 CH3C.18에 결합된 TfR 정점 도메인상의 에피토프를 드러냈다. 구체적으로, 정점 도메인의 N-말단 영역은 CH3C Fc 결합에 관련되며, 이 구조는 CH3C.18 Fc 및 TfR 정점 도메인 돌연변이유발 데이터와 일치된다. 또한, 상기 CH3C.18 라이브러리 측쇄들은 모두 TfR (5Å이내)에 접촉한다. CH3C.18 라이브러리 잔기: L157, H159, V160, W161, A162, V163, P186, T189, 및 W194. 비-라이브러리 잔기: F196 및 S156. 도 36b는 CH3C.18 Fc 및 TfR 정점 도메인 주요 상호작용을 나타낸다. CH3C.18 Fc의 W161과 정점 도메인 상의 R208 사이에 양이온-pi 상호작용은 중추 결합 상호작용이다. CH3C.18 W388 또는 정점 도메인 R208의 돌연변이는 CH3C.18 Fc와 정점 도메인 결합을 파괴한다. 이와 일치하게, 인간에서 cyno까지의 R208G 돌연변이는 cyno 친화력 감소를 설명한다. 더욱이, 인간 정점 도메인에서 비-보존된 잔기 (N292 및 E294 (cyno에서 K292 및 D294))는 인접해있다. 따라서, 인간 결합에 대한 cyno 결합을 선택적으로 개선시키기 위하여, CH3C.18에서 Q192는 선택적으로 돌연변이될 수 있다.
도 37a 및 37b는 본 발명의 폴리펩티드와 트란스페린 수용체 간의 결합을 나타낸다. 도 37a는 클론 CH3C.18 (쇄 A) 및 트란스페린 수용체의 정점 도메인 (쇄 D)에서 잔기들 간에 수소 결합 및 비-결합된 접촉을 나타낸다. 도 37b는 클론 CH3C.18 (쇄 B) 및 트란스페린 수용체의 정점 도메인 (쇄 C)에서 잔기들 간에 수소 결합 및 비-결합된 접촉을 나타낸다.
도 38은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4 아미노산 서열 (서열 번호:623-626)의 정렬을 나타낸다.
도 39a-39c는 본 발명의 폴리펩티드와 트란스페린 수용체 간의 결합을 나타낸다. 도 39a는 TfR 정점 도메인과 CH3C.35 Fc의 구조 양식(위), 그리고 TfR 정점 도메인과 CH3C.35 Fc의 결합 표면 (5Å 이내) (아래)을 보여준다. 상기 공동-복합체 구조는 3.4Å 해상도에서 풀어내었다. 상기 구조는 CH3C.35에 결합된 TfR 정점 도메인상의 에피토프를 드러냈다. 상기 CH3C.35 라이브러리 측쇄들은 모두 TfR (5Å이내)에 접촉한다. CH3C.35 라이브러리 잔기: Y157, T159, E160, W161, S162, T186, E189, 및 W194. 비-라이브러리 잔기: F196, S156, Q192. 도 39b 및 39c는 도 39a에 나타낸 클론 CH3C.35와 트란스페린 수용체의 정점 도메인 간의 결합 경계면의 확대도면을 나타낸다.
도 40a는 상기 CH3C.35 Fc와 TfR-AD 복합체 사이, 그리고 상기 CH3C.18 Fc와 TfR-AD 복합체 사이의 덮어씌운 구조를 나타낸다.
도 40b는 도 40a에 나타낸 덮어씌운 구조의 확대도면을 보여준다.
도 41a 및 41b는 본 발명의 폴리펩티드와 트란스페린 수용체 간의 결합을 나타낸다. 도 41a는 클론 CH3C.35 (쇄 A) 및 트란스페린 수용체의 정점 도메인 (쇄 D)에서 잔기들 간에 수소 결합 및 비-결합된 접촉을 나타낸다. 도 41b는 클론 CH3C.35 (쇄 B) 및 트란스페린 수용체의 정점 도메인 (쇄 C)에서 잔기들 간에 수소 결합 및 비-결합된 접촉을 나타낸다.
도 42a 및 42b는 시노몰구스 원숭이에서 Ab153 Fab 도메인에 융합된 CH3C 변이체를 포함하는 Fc-Fab 융합 폴리펩티드에 대한 혈장 PK 및 Aβ40감소를 나타낸다. 도 42a는 대조군 IgG (Ab122) 및 Ab153와 비교하였을 때, TfR-매개된 제거로 인하여, Ab210 및 CH3C.35.9:Ab153은 더 신속한 제거를 나타내었다는 것을 보여준다 도 42b에서는 BACE1에 모두 결합하고, 이를 저해시키는 Ab153, Ab210, 및 CH3C.35.9:Ab153은 혈장에서 상당한 Aβ40감소를 나타내었다는 것을 보여준다.
도 43a 및 43b는 시노몰구스 원숭이에서 Ab153 Fab 도메인에 융합된 CH3C 변이체를 포함하는 Fc-Fab 융합 폴리펩티드에 의해 상당한 뇌척수액 (CSF) Aβ 및 sAPPβ/sAPPα 감소를 나타낸다. 도 43a에서는 Ab210 및 CH3C.35.9:Ab153를 투여받은 동물은 Ab153 및 대조군 IgG (Ab122)와 비교하였을 때, CSF Aβ40의 약 70% 감소를 보였다는 것을 나타낸다. 도 43b에서는 Ab210 및 CH3C.35.9:Ab153를 투여받은 동물은 Ab153 및 대조군 IgG (Ab122)와 비교하였을 때, sAPPβ/sAPPα 비율이 약 75% 감소되었다는 것을 보여준다. 한 집단마다 n = 4임. 선 그래프는 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 44a 및 44b는 50 mg/kg의 항-BACE1_Ab153, CH3C35.21:Ab153, CH3C35.20:Ab153, 또는 CH3C35:Ab153 폴리펩티드 융합을 전신으로 단일 주사 후, hTfR정점+/+ 녹-인 (KI) 마우스의 혈장 (도 44a) 및 뇌 용해질 (도 44b)에서의 huIgG1 농도를 나타낸다 (평균 ± SEM, 한 집단마다 n = 5임).
도 44c는 50 mg/kg의 항-BACE1_Ab153, CH3C35.21:Ab153, CH3C35.20:Ab153, 또는 CH3C35:Ab153 폴리펩티드 융합을 전신으로 단일 주사 후, hTfR정점+/+ KI 마우스 뇌 용해질에서 내생성 마우스 Aβ농도를 나타낸다 (평균 ± SEM, 한 집단마다 n = 5임).
도 44d는 50 mg/kg의 항-BACE1_Ab153, CH3C35.21:Ab153, CH3C35.20:Ab153, 또는 CH3C35:Ab153 폴리펩티드 융합을 전신으로 단일 주사 후, hTfR정점+/+ KI 마우스의 뇌 용해질에서 액틴에 대하여 표준화된 뇌 TfR 단백질의 웨스턴 블랏 정량화를 나타낸다 (평균 ± SEM, 한 집단마다 n = 5임).
도 45a 및 45b는 50 mg/kg의 항-BACE1_Ab153, CH3C.35.23:Ab153, 또는 CH3C.35.23.3:Ab153 폴리펩티드 융합을 전신으로 단일 주사 후, hTfR정점+/+ KI 마우스의 혈장 (도 45a) 및 뇌 용해질 (도 45b) 에서 huIgG1 농도를 나타낸다 (평균 ± SEM, 한 집단마다 n = 5임).
도 45c는 50 mg/kg의 항-BACE1_Ab153, CH3C.35.23:Ab153, 또는 CH3C.35.23.3:Ab153 폴리펩티드 융합을 전신으로 단일 주사 후, hTfR정점+/+ KI 마우스 뇌 용해질에서 내생성 마우스 Aβ농도를 나타낸다 (평균 ± SEM, 한 집단마다 n = 5임).
도 45d는 50 mg/kg의 항-BACE1_Ab153, CH3C.35.23:Ab153, 또는 CH3C.35.23.3:Ab153 폴리펩티드 융합을 전신으로 단일 주사 후, hTfR정점+/+ KI 마우스의 뇌 용해질에서 액틴에 대하여 표준화된 뇌 TfR 단백질의 웨스턴 블랏 정량화를 나타낸다 (평균 ± SEM, 한 집단마다 n = 4임).
도 46a-46d는 시노몰구스 원숭이에게 30 mg/kg 투여량의 표시 단백질을 단일 투여 후, 28-일 PKPD 연구를 나타낸다. 도 46a 및 46b는 혈청에서 혈청 huIgG1 및 혈장에서 혈장 Aβ 농도를 나타내는데, 투여된 화합물의 말초 노출 및 시간의 경과에 따른 혈장 Aβ 수준에 미치는 결과를 보여준다. 도 46c 및 46d는 투여 후, 시노몰구스 원숭이의 CDF에서 Aβ및 sAPPβ/sAPPα를 나타낸다(평균 ± SEM, 한 집단마다 n = 4-5임).
도 47a-47c는 30 mg/kg의 투여량으로 표시된 단백질들을 단일 투여 후, 시노몰구스 원숭이의 말초 혈액내 사전-투여 수준과 비교하여 혈액 망상적혈구(도 47a), 절대적 혈청 철 수준 (도 47b), 및 절대적 적혈구 세포 계수 (도 47c)를 나타낸다 (평균 ± SEM, 한 집단마다 n = 4-5임).
도 48a 및 48b는 14 일에 걸쳐 10 mg/kg을 단일 정맥 주사 후, hFcRn 녹-인 마우스에서 표시된 단백질들의 말초 PK 분석 (혈장 huIgG1 농도 (도 48a) 및 제거 값 (도 48b))을 나타낸다(평균 ± SEM, 한 집단마다 n = 3임).
도 49는 TfR-결합 CH3C.18 변이체의 정중 형광 강도를 나타낸다.
도 2a 및 2b는 인간 TfR에 대한 CH2A2 클론 결합의 파아지 ELISA 결과를 보여준다. 파아지가 대략적인 결합 EC50에서 TfR-코팅된 ELISA 플레이트에 첨가되었고, 가용성 홀로(holo)-Tf 또는 가용성 TfR은 다양한 농도로 첨가되었다. CH2A2 클론이 플레이트-코팅된 TfR에 결합함에 있어서 가용성 TfR과 경쟁하지만, 홀로-Tf와는 경쟁하지 않았다는 것을 데이터에서 보여준다. 도 2a는 가용성 홀로-Tf가 첨가된 실험에 대한 결과를 보여준다. 도 2b는 가용성 TfR이 첨가된 실험에 대한 결과를 보여준다.
도 3a-3d는 홀로-Tf의 존재 또는 부재시, TfR에 CH2C 클론의 결합을 보여준다. 도 3a는 TfR을 ELISA 플레이트에 코팅하고, 파아지에 표시된 클론 CH2C.23을 다량의 홀로-Tf (5μM)의 존재 또는 부재 하에 첨가한 파지 ELISA의 결과를 보여준다. 도 3b는 인간 또는 cyno TfR-코팅된 ELISA 플레이트에 Fc-Fab 융합 형식(format)의 CH2C 클론의 결합을 보여준다. 도 3c는 인간 TfR, cyno TfR, 홀로-Tf, 항-Myc, 또는 스트렙타비딘이 ELISA 플레이트 상에 코딩되고, 파아지-디스플레이된 클론 CH2C.17 및 CH2C.22는 홀로-Tf의 존재 또는 부재 하에, 다양한 농도로 추가된 파아지 ELISAs 결과를 보여준다. 이들 클론이 TfR에 결합함에 있어서 홀로-Tf와는 경쟁하지 않았음을 이들 데이터에서 보여준다. 도 3d는 5 μM 홀로-Tf의 존재 하에 그리고 홀로-Tf의 결합에 대하여 차감된 배경에서, 항-스트렙타비딘 센서 상에 코팅된 TfR-바이오틴에 대한 클론 CH2C.7 결합을 Octet® (즉, 생물층 간섭계(biolayer interferometry)) 동역학 흔적을 보여준다.
도 4a 및 4b는 홀로-Tf의 존재 또는 부재시, TfR에 CH3B클론의 결합을 보여준다. 도 4a는 인간 TfR, cyno TfR, 홀로-Tf, 항-Myc, 또는 스트렙타비딘이 ELISA 플레이트 상에 코딩되고, 파아지-디스플레이된 클론 CH3B.11 및 CH3B.12는 홀로-Tf의 존재 또는 부재 하에 다양한 농도로 추가된, 파아지 ELISA 결과를 보여준다. 이들 클론이 TfR에 결합함에 있어서 홀로-Tf와는 경쟁하지 않았음을 이들 데이터에서 보여준다. 도 4b는 인간 또는 cyno TfR-코팅된 ELISA 플레이트에 CH3B클론의 결합을 보여준다. 상기 CH3B 클론 서열을 포함하는 Fc 영역은 Fab 단편에 융합되었고, 이량체 형식에 검증되었다.
도 5는 CH3B 클론의 성숙(maturation)에 대한 NNK 패치(patch) 라이브러리를 보여준다. 리본은 CH3 도메인의 백본(backbone)을 보여주는데, 여기서 어두운 표면은 원래 CH3B 레지스터를 나타내고, 밝은 표면 패치는 확장된 레퍼토리를 나타낸다.
도 6은 이스트(yeast)에서 CH3C 클론 선별을 위한 FACS 플롯을 보여주는데, 3회 소트 라운드(sort round) 후 결합 집단의 농축을 나타낸다. 소트 라운드 1 및 2에서, 바이오티닐화된 TfR은 스트렙타비딘-Alexa Fluor® 647 상에 사전-로딩된 후, 이스트와 함께 항온처리되었다. 소트 라운드 3에서, 바이오티닐화된 TfR은 이스트와 우선 항온처리되었고, 스트렙타비딘-Alexa Fluor® 647은 2차 탐지용으로 추가되었다. 모든 소트 라운드에서, 이스트 디스플레이 구조체 상에서 C-말단 Myc 테그에 대항한 닭 항-c-Myc 항체 (Thermo Fisher에서 구함)을 이용하여 발현을 모니터하였다.
도 7a-7c는 홀로-Tf의 존재 또는 부재 하에서, TfR에 대한 CH3C 클론의 결합을 보여준다. 클론은 Fc-Fab 융합 형식에서 분석되었다. TfR에 결합하는 가변 영역을 갖는 표준 항체인 Ab204는 이 분석에서 양성 대조군으로 이용되었다. 도 7a는 ELISA 플레이트에 코팅된 인간 TfR에 대한 CH3C 변이체의 결합을 보여준다. 도 7b는 5 μM 홀로-Tf 존재하에 ELISA 플레이트에 코팅된 인간 TfR에 대한 CH3C 변이체의 결합을 보여준다. 도 7c는 ELISA 플레이트에 코팅된 cyno TfR에 대한 CH3C 변이체의 결합을 보여준다.
도 8은 인간 TfR를 내생적으로 발현시키는 293F 세포에 대한 CH3C 클론의 결합을 보여준다. 세포를 96-웰 V자형 바닥 플레이트에 분포시키고, Fc-Fab 융합 결합 단백질로 포맷된 다양한 농도의 CH3C 클론을 첨가하였다. 4℃에서 1 시간 항온처리 후, 플레이트를 회전시키고, 세척한 다음, 염소-항-인간-IgG-Alexa Fluor® 647 2 차 항체와 함께 4℃에서 30 분 동안 항온처리했다. 세포를 추가로 세척시킨 후, 플레이트를 FACSCanto™II 유세포 분석기에서 판독하고, FlowJo® 소프트웨어를 사용하여 APC (647 nm) 채널의 정중(median) 형광 값을 결정하였다.
도 9a 및 9b는 인간 TfR를 내생적으로 발현시키는 HEK293 세포에서 CH3C.3의 내재화(internalization)를 보여준다. CH3C.3 또는 대조군은 1μM 농도로 37℃ 및 8% CO2 농도에서 30 분 동안 추가되었고, 그 다음 이들 세포는 세척되고, 침투화되고, 그리고 항-인간-IgG-Alexa Fluor® 488 2차 항체로 착색되었다. 추가 세척 후, 세포를 형광 현미경으로 이미지화하고 푼타(puncta)의 수를 정량화하였다. 도 9a는 현미경 데이터를 나타낸다. 도 9b는 웰당 푼타 수의 그래프를 보여준다.
도 10은 상기 CH3C 소프트 라이브러리의 선택 체계를 보여준다. 초기 라이브러리는 인간 (H) 또는 cyno (C) TfR에 대해 MACS에 의해 분류되었다. 이어서, 생성된 이스트 모둠(pool)을 분할하고, 각각 첫 번째 FACS 소트 라운드에서와 같이, 인간 또는 cyno TfR에 대해 분류 하였다. 생성된 모둠을 다른 FACS 소트 라운드에 대해 다시 분할했다. 마지막으로, HHH 및 CCC 모둠은 분리된 상태로 유지되었고, 두 표적 종을 모두 보여준 다른 모둠은 최종적으로 풀링되었다(pooled).
도 11a 및 11b는 제 1 소프트 랜덤 라이브러리로부터 확인된 CH3C 클론이 인간 및 cyno TfR에 결합하는 것을 보여준다. 양성 대조군은 고친화력 항-TfR 항체인 Ab204 및 저친화력 항-TfR 항체인 Ab084였다. 도 11a는 인간 TfR에 대한 결합을 보여준다. 도 11b는 cyno TfR에 대한 결합을 보여준다.
도 12a 및 12b는 홀로-Tf 존재 또는 부재하에서, 제 1 소프트 랜덤 라이브러리로부터 확인된 CH3C 클론이 인간 TfR에 결합하는 것을 보여준다. 클론은 Fc-Fab 융합 형식이다. 고친화력 항-TfR 항체인 Ab204는 이 분석에서 양성 대조군으로 이용되었다. 도 12a는 ELISA 플레이트에 코팅된 인간 TfR에 대한 CH3C 변이체의 결합을 보여준다. 도 12b는 5 μM 홀로-Tf 존재하에 ELISA 플레이트에 코팅된 인간 TfR에 대한 CH3C 변이체의 결합을 보여준다.
도 13은 제1 소프트 랜덤화 라이브러리로부터 확인된 CH3C 클론의 293F 세포에 대한 결합하는 것을 보여준다. 세포를 96-웰 V자형 바닥 플레이트에 분포시키고, Fc-Fab 융합 단백질로 포맷된 다양한 농도의 CH3C 클론을 첨가하였다. 4℃에서 1 시간 항온처리 후, 플레이트를 회전시키고, 세척한 다음, 염소-항-인간-IgG-Alexa Fluor® 647 2 차 항체와 함께 4℃에서 30 분 동안 항온처리했다. 세포를 추가로 세척시킨 후, 플레이트를 FACSCanto™II 유세포 분석기에서 판독하고, FlowJo® 소프트웨어를 사용하여 APC (647 nm) 채널의 정중 형광 값을 결정하였다.
도 14a-14c는 제1 소프트 랜덤화 라이브러리로부터 확인된 CH3C 클론의 CHO-K1 세포에 대한 결합하는 것을 보여준다. 세포를 96-웰 V자형 바닥 플레이트에 분포시키고, Fc-Fab 융합체로 포맷된 다양한 농도의 CH3C 클론을 첨가하였다. 4℃에서 1 시간 항온처리 후, 플레이트를 회전시키고, 세척한 다음, 염소-항-인간-IgG-Alexa Fluor® 647 2 차 항체와 함께 4℃에서 30 분 동안 항온처리했다. 세포를 추가로 세척시킨 후, 플레이트를 FACSCanto™II 유세포 분석기에서 판독하고, FlowJo® 소프트웨어를 사용하여 APC (647 nm) 채널의 정중 형광 값을 결정하였다. 도 14a는 인간 TfR을 과다발현시키는 CHO-K1 세포를 보여준다. 도 14b는 cyno TfR을 과다발현시키는 CHO-K1 세포를 보여준다. 도 14c는 인간 TfR을 발현시키지 않는 CHO-K1 부모(parental) 세포를 보여준다.
도 15a 및 15b는 TfR 정점 도메인을 보여준다. 도 15a는 인간 TfR 단백질 상에 정점 도메인의 위치를 보여준다. 삽입부는 인간과 cyno TfR 간에 상이한 7개 잔기의 근접 사진을 나타낸다. 도 15b는 인간 (서열 번호:107)과 cyno (서열 번호:108) TfR 상이에 상이한 7개 잔기를 담고 있는 서열 정렬을 나타낸다. 콘센수스(consensus) 서열은 서열 번호:622이다.
도 16a-16e는 파아지에 디스플레이된 정점 도메인에 대한 CH3C 클론의 결합을 나타낸다. 도 16a는 다양한 TfR 정점 도메인 돌연변이체(mutants)의 Myc 발현을 도시하며, 이는 돌연변이체의 발현 수준은 유사하고 표준화되었음을 나타낸다. 도 16b는 CH3C.18의 야생형 및 돌연변이체 인간 TfR 정점 도메인에 대한 결합을 보여주는데, R208G 돌연변이체에 대한 결합은 감소됨을 보여준다. 도 16c는 CH3C.35의 야생형 및 돌연변이체 인간 TfR 정점 도메인에 대한 결합을 보여주는데, R208G 돌연변이체에 대한 결합은 감소됨을 보여준다. 도 16d는 CH3C.18의 야생형 인간 및 cyno TfR 정점 도메인 및 G208R 돌연변이체 cyno 정점 도메인에 대한 결합을 보여주는데, 돌연변이체에 대한 결합이 회복됨을 보여준다. 도 16e는 CH3C.35의 야생형 인간 및 cyno TfR 정점 도메인 및 G208R 돌연변이체 cyno 정점 도메인에 대한 결합을 보여주는데, 돌연변이체에 대한 결합이 회복됨을 보여준다.
도 17a-17d는 돌연변이된 위치를 야생형 잔기로 되돌림으로써 CH3C 변이체의 파라토프 메핑(paratope mapping)을 나타낸다. 도 17a는 복귀(reversion) 돌연변이체의 경우 인간 TfR에 대한 ELISA 결합에 의해 CH3C.35의 파라토프 메핑을 보여준다. 도 17b는 복귀 돌연변이체의 경우 cyno TfR에 대한 ELISA 결합에 의해 CH3C.35의 파라토프 메핑을 보여준다. 도 17c는 복귀 돌연변이체의 경우 인간 TfR에 대한 ELISA 결합에 의해 CH3C.18의 파라토프 메핑을 보여준다. 도 17d는 복귀 돌연변이체의 경우 cyno TfR에 대한 ELISA 결합에 의해 CH3C.18의 파라토프 메핑을 보여준다.
도 18a-18d는 CH3C 콘센수스 성숙 라이브러리의 기획을 보여준다. 도 18a는 상기 CH3C.35-유사(like) 서열에 기초한 콘센수스 라이브러리를 나타낸다. 도 18b는 상기 CH3C.18-유사(like) 서열에 기초한 콘센수스 라이브러리를 나타낸다. 도 18c는 CH3C.18 및 CH3C.35에 기초한 갭(gap) 라이브러리를 나타낸다. 도 18d는 CH3C.18에 기초한 방향족(aromatics) 라이브러리를 나타낸다.
도 19a-19e는 콘센수스 성숙 라이브러리의 CH3C 변이체들의 인간 또는 cyno TfR에 대한 결합 ELISAs를 보여준다. 새로운 변이체 (가령, CH3C.3.2-1, CH3C.3.2-5, 및 CH3C.3.2-19)은 cyno 및 인간 TfR에 대한 유사한 결합 EC50 값을 갖지만, 반면 부모 클론 CH3C.18 및 CH3C.35는 cyno TfR에 비하여 인간의 경우 상당히 더 나은 EC50 값을 가졌다. 도 19a는 CH3C.3.2-1에 대한 데이터를 나타낸다. 도 19b는 CH3C.3.2-19에 대한 데이터를 나타낸다. 도 19c는 CH3C.3.2-5에 대한 데이터를 나타낸다. 도 19d는 CH3C.18에 대한 데이터를 나타낸다. 도 19e는 CH3C.35에 대한 데이터를 나타낸다.
도 20은 인간 (HEK293) 및 원숭이 (LLC-MK2) 세포에서 콘센수스 성숙 라이브러리로부터 CH3C 변이체의 내재화를 보여준다. 유사한 인간 및 cyno TfR 친화력을 갖는 클론 CH3C.3.2-5 및 CH3C3.2-19는 클론 CH3C.35와 비교하였을 때, 원숭이 세포에서 상당히 개선된 취입을 가졌고, 인간 TfR에 결합이 더 우수하였다. 항-BACE1 항체인 Ab107은 음성 대조군으로 이용되었다. (BACE1은 HEK293 또는 MK2 세포에서 발현되지 않는다). 항-TfR 항체인 Ab204는 양성 대조군으로 이용되었다.
도 21은 CH3 구조 (PDB 4W4O로부터 개작된)에서 나타낸 NNK 워크(walk) 잔기 지도를 보여준다. 검은 색 표면은 원래 CH3C 레지스터를 나타내고, 회색 표면은 NNK 워크 구조에 통합된 44 개의 잔기를 보여 주며, 리본은 야생형 백본을 나타낸다.
도 22는 NNK 워크 라이브러리를 3 회 라운드 분류한 후, 농축된 이스트 집단을 보여준다. 이스트를 항-c-Myc로 착색하여 발현 (x-축) 및 TfR 정점 도메인에 대한 결합을 모니터링하였다 (200 nM cyno 또는 200 nM 인간) (y-축). 여기에 제시된 데이터는 TfR 정점 도메인 오르소로그(orthologs)에 대한 향상된 결합을 명확하게 보여준다.
도 23a 및 23b는 CH3C.35.21 돌연변이체에 대한 FACS 데이터를 보여준다. 이스트를 항-c-Myc로 착색하여 발현 (x-축) 및 인간 TfR 정점 도메인에 대한 결합을 모니터링하였다(200 nM) (y-축). 도 23a는 클론 CH3C.35.21에 대한 FACS 데이터를 보여준다. 도 23b는 돌연변이체에 대한 FACS 데이터를 보여주는데, 이때 클론 CH3C.35.21의 11개 위치는 야생형 (FACS 플롯의 상단 열)으로 역 돌연변이되거나, 또는 총 20개 아미노산의 NNK 라이브러리로 발현되었다 (FACS 플롯의 하단 열, 임의의 소팅 전).
도 24a-24d는 이가(bivalent) 및 단가(monovalent) CH3C 폴리펩티드의 인간 및 cyno TfR에 대한 결합을 ELISA 비교한 것을 나타낸다. 도 24a는 이가 CH3C 폴리펩티드의 인간 TfR에 결합을 보여준다. 도 24b는 이가 CH3C 폴리펩티드의 cyno TfR에 결합을 보여준다. 도 24c는 단가 CH3C 폴리펩티드의 인간 TfR에 결합을 보여준다. 도 24d는 단가 CH3C 폴리펩티드의 cyno TfR에 결합을 보여준다.
도 25a-25e는 단가 CH3C 폴리펩티드의 세포 결합을 보여준다. 도 25a는 293F 세포를 보여준다. 도 25b는 도 25a에 나타낸 293F 세포에 대한 결합을 확대(zoom-in)한 것을 보여준다. 도 25c는 인간 TfR로 안정적으로 형질감염된 CHO-K1 세포를 나타낸다. 도 25d는 도 25c에 나타낸 인간 TfR로 안정적으로 형질감염된 CHO-K1 세포에 대한 결합을 확대한 것을 보여준다. 도 25e는 cyno TfR로 안정적으로 형질감염된 CHO-K1 세포를 나타낸다.
도 26은 HEK293 세포에서 단가 및 이가 CH3C 폴리펩티드의 내재화를 보여준다.
도 27a-27h는 CH3C 폴리펩티드의 결합 역학(kinetics)을 나타낸다. 도 27a는 CH3C.35.N163의 인간 TfR에 대한 결합을 보여준다. 도 27b는 CHC3.35의 인간 TfR에 대한 결합을 보여준다. 도 27c는 CHC3.35.N163의 인간 TfR에 대한 단가 결합을 보여준다. 도 27d는 CHC3.35의 인간 TfR에 대한 단가 결합을 보여준다. 도 27e는 CH3C.35.N163의 cyno TfR에 대한 단가 결합을 보여준다. 도 27f는 CHC3.35의 cyno TfR에 대한 결합을 보여준다. 도 27g는 CHC3.35.N163의 cyno TfR에 대한 단가 결합을 보여준다. 도 27h는 CHC3.35의 cyno TfR에 대한 단가 결합을 보여준다.
도 28a-28f는 CH3C 폴리펩티드의 결합 역학을 나타낸다. 도 28a는 CH3C.3.2-1의 인간 TfR에 대한 결합을 보여준다. 도 28b는 CH3C.3.2-5의 인간 TfR에 대한 결합을 보여준다. 도 28c는 CH3C.3.2-19의 인간 TfR에 대한 결합을 보여준다. 도 28d는 CH3C.3.2-1의 cyno TfR에 대한 결합을 보여준다. 도 28e는 CH3C.3.2-5의 cyno TfR에 대한 결합을 보여준다. 도 28f는 CH3C.3.2-19의 cyno TfR에 대한 결합을 보여준다.
도 29a-29e는 인간 TfR 세포외 도메인의 존재 (하부 자취) 또는 부재(상부 자취) 하에, pH 5.5에서 폴리펩티드-Fab 융합의 FcRn에 대한 결합을 보여준다. 도 29a는 클론 CH3C.35에 대한 데이터를 나타낸다. 도 29b는 클론 CH3C.35.19에 대한 데이터를 나타낸다. 도 29c는 클론 CH3C.35.20에 대한 데이터를 나타낸다. 도 29d는 클론 CH3C.35.21에 대한 데이터를 나타낸다. 도 29e는 클론 CH3C.35.24에 대한 데이터를 나타낸다.
도 30은 야생형 마우스에서 CH3C 폴리펩티드의 약력학 (PK) 분석을 나타낸다. 모든 폴리펩티드-Fab 융합은 CH3C.3.2-5(더 신속한 제거를 갖음)를 제외하고, 야생형 Fc-Fab 융합 (가령, Ab122, 항-RSV 항체, 및 Ab153, 항-BACE1 항체)에 필적하는 제거(clearance)를 갖는다.
도 31은 마우스 뇌 조직에서 뇌 약력학/약동학 (PK/PD) 데이터를 나타낸다. 키메라 huTfR 이형접합성(heterozygous) 마우스 (한 집단에서 n=4임)에게 42 mg/kg의 Ab153 또는 단가 CH3C.35.N163 (“CH3C.35.N163_mono”로 표지됨)를 정맥으로 투여하였고, 및 야생형 마우스 (n=3)에게 50 mg/kg의 대조군 인간 IgG1 (“huIgG1”로 표지됨)를 정맥으로 투여함. 막대 그래프는 평균 +/- SD을 나타낸다.
도 32a 및 32b는 50 mg/kg의 폴리펩티드로 처리하고, 24시간 후 hTfR정점+/+ 마우스에서 발견되는 IgG 농도를 나타낸다. 도 32a는 IgG의 혈장에서의 농도를 나타낸다. 도 32b는 IgG의 뇌 조직에서의 농도를 나타낸다.
도 33a 및 33b는 hTfR정점+/+ 마우스에서 아밀로이드 베타-단백질 40 (A베타 40)에서의 감소로 측정하였을 때, 24시간 후 투여된 폴리펩티드의 표적 참여(engagement)를 나타낸다. 도 33a는 A베타 40의 혈장내 농도를 나타낸다. 도 33b는 A베타 40의 뇌 조직내 농도를 나타낸다.
도 34는 CH3C.18 Fc 및 TfR 정점 도메인 (AD) 복합체의 크기 분획(sizing fraction)의 SDS-PAGE 겔을 보여준다. 라인 1: 분자량 마커. 라인 2: 크기-배제(size-exclusion) 크로마토그래피 후, 감소된 CH3C.18 Fc-AD 복합체.
도 35a 및 35b는 본 발명의 폴리펩티드와 트란스페린 수용체 간의 결합을 나타낸다. 도 35a는 클론 CH3C.18과 트란스페린 수용체의 정점 도메인 간의 결합 경계면(interface)을 나타낸다. 도 35b는 도 35a에 나타낸 결합 경계면의 확대도면을 보여준다.
도 36a 및 36b는 CH3C.18과 TfR 정점 도메인 사이의 상호작용을 나타낸다. 도 36a는 TfR 정점 도메인과 CH3C.18 Fc의 구조 양식(위), 그리고 TfR 정점 도메인과 CH3C.18 Fc의 결합 표면 (5 옹스트롬 이내) (아래)을 보여준다. 상기 공동-복합체 구조는 3.6Å 해상도에서 풀어내었다. 상기 구조는 CH3C.18에 결합된 TfR 정점 도메인상의 에피토프를 드러냈다. 구체적으로, 정점 도메인의 N-말단 영역은 CH3C Fc 결합에 관련되며, 이 구조는 CH3C.18 Fc 및 TfR 정점 도메인 돌연변이유발 데이터와 일치된다. 또한, 상기 CH3C.18 라이브러리 측쇄들은 모두 TfR (5Å이내)에 접촉한다. CH3C.18 라이브러리 잔기: L157, H159, V160, W161, A162, V163, P186, T189, 및 W194. 비-라이브러리 잔기: F196 및 S156. 도 36b는 CH3C.18 Fc 및 TfR 정점 도메인 주요 상호작용을 나타낸다. CH3C.18 Fc의 W161과 정점 도메인 상의 R208 사이에 양이온-pi 상호작용은 중추 결합 상호작용이다. CH3C.18 W388 또는 정점 도메인 R208의 돌연변이는 CH3C.18 Fc와 정점 도메인 결합을 파괴한다. 이와 일치하게, 인간에서 cyno까지의 R208G 돌연변이는 cyno 친화력 감소를 설명한다. 더욱이, 인간 정점 도메인에서 비-보존된 잔기 (N292 및 E294 (cyno에서 K292 및 D294))는 인접해있다. 따라서, 인간 결합에 대한 cyno 결합을 선택적으로 개선시키기 위하여, CH3C.18에서 Q192는 선택적으로 돌연변이될 수 있다.
도 37a 및 37b는 본 발명의 폴리펩티드와 트란스페린 수용체 간의 결합을 나타낸다. 도 37a는 클론 CH3C.18 (쇄 A) 및 트란스페린 수용체의 정점 도메인 (쇄 D)에서 잔기들 간에 수소 결합 및 비-결합된 접촉을 나타낸다. 도 37b는 클론 CH3C.18 (쇄 B) 및 트란스페린 수용체의 정점 도메인 (쇄 C)에서 잔기들 간에 수소 결합 및 비-결합된 접촉을 나타낸다.
도 38은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4 아미노산 서열 (서열 번호:623-626)의 정렬을 나타낸다.
도 39a-39c는 본 발명의 폴리펩티드와 트란스페린 수용체 간의 결합을 나타낸다. 도 39a는 TfR 정점 도메인과 CH3C.35 Fc의 구조 양식(위), 그리고 TfR 정점 도메인과 CH3C.35 Fc의 결합 표면 (5Å 이내) (아래)을 보여준다. 상기 공동-복합체 구조는 3.4Å 해상도에서 풀어내었다. 상기 구조는 CH3C.35에 결합된 TfR 정점 도메인상의 에피토프를 드러냈다. 상기 CH3C.35 라이브러리 측쇄들은 모두 TfR (5Å이내)에 접촉한다. CH3C.35 라이브러리 잔기: Y157, T159, E160, W161, S162, T186, E189, 및 W194. 비-라이브러리 잔기: F196, S156, Q192. 도 39b 및 39c는 도 39a에 나타낸 클론 CH3C.35와 트란스페린 수용체의 정점 도메인 간의 결합 경계면의 확대도면을 나타낸다.
도 40a는 상기 CH3C.35 Fc와 TfR-AD 복합체 사이, 그리고 상기 CH3C.18 Fc와 TfR-AD 복합체 사이의 덮어씌운 구조를 나타낸다.
도 40b는 도 40a에 나타낸 덮어씌운 구조의 확대도면을 보여준다.
도 41a 및 41b는 본 발명의 폴리펩티드와 트란스페린 수용체 간의 결합을 나타낸다. 도 41a는 클론 CH3C.35 (쇄 A) 및 트란스페린 수용체의 정점 도메인 (쇄 D)에서 잔기들 간에 수소 결합 및 비-결합된 접촉을 나타낸다. 도 41b는 클론 CH3C.35 (쇄 B) 및 트란스페린 수용체의 정점 도메인 (쇄 C)에서 잔기들 간에 수소 결합 및 비-결합된 접촉을 나타낸다.
도 42a 및 42b는 시노몰구스 원숭이에서 Ab153 Fab 도메인에 융합된 CH3C 변이체를 포함하는 Fc-Fab 융합 폴리펩티드에 대한 혈장 PK 및 Aβ40감소를 나타낸다. 도 42a는 대조군 IgG (Ab122) 및 Ab153와 비교하였을 때, TfR-매개된 제거로 인하여, Ab210 및 CH3C.35.9:Ab153은 더 신속한 제거를 나타내었다는 것을 보여준다 도 42b에서는 BACE1에 모두 결합하고, 이를 저해시키는 Ab153, Ab210, 및 CH3C.35.9:Ab153은 혈장에서 상당한 Aβ40감소를 나타내었다는 것을 보여준다.
도 43a 및 43b는 시노몰구스 원숭이에서 Ab153 Fab 도메인에 융합된 CH3C 변이체를 포함하는 Fc-Fab 융합 폴리펩티드에 의해 상당한 뇌척수액 (CSF) Aβ 및 sAPPβ/sAPPα 감소를 나타낸다. 도 43a에서는 Ab210 및 CH3C.35.9:Ab153를 투여받은 동물은 Ab153 및 대조군 IgG (Ab122)와 비교하였을 때, CSF Aβ40의 약 70% 감소를 보였다는 것을 나타낸다. 도 43b에서는 Ab210 및 CH3C.35.9:Ab153를 투여받은 동물은 Ab153 및 대조군 IgG (Ab122)와 비교하였을 때, sAPPβ/sAPPα 비율이 약 75% 감소되었다는 것을 보여준다. 한 집단마다 n = 4임. 선 그래프는 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 44a 및 44b는 50 mg/kg의 항-BACE1_Ab153, CH3C35.21:Ab153, CH3C35.20:Ab153, 또는 CH3C35:Ab153 폴리펩티드 융합을 전신으로 단일 주사 후, hTfR정점+/+ 녹-인 (KI) 마우스의 혈장 (도 44a) 및 뇌 용해질 (도 44b)에서의 huIgG1 농도를 나타낸다 (평균 ± SEM, 한 집단마다 n = 5임).
도 44c는 50 mg/kg의 항-BACE1_Ab153, CH3C35.21:Ab153, CH3C35.20:Ab153, 또는 CH3C35:Ab153 폴리펩티드 융합을 전신으로 단일 주사 후, hTfR정점+/+ KI 마우스 뇌 용해질에서 내생성 마우스 Aβ농도를 나타낸다 (평균 ± SEM, 한 집단마다 n = 5임).
도 44d는 50 mg/kg의 항-BACE1_Ab153, CH3C35.21:Ab153, CH3C35.20:Ab153, 또는 CH3C35:Ab153 폴리펩티드 융합을 전신으로 단일 주사 후, hTfR정점+/+ KI 마우스의 뇌 용해질에서 액틴에 대하여 표준화된 뇌 TfR 단백질의 웨스턴 블랏 정량화를 나타낸다 (평균 ± SEM, 한 집단마다 n = 5임).
도 45a 및 45b는 50 mg/kg의 항-BACE1_Ab153, CH3C.35.23:Ab153, 또는 CH3C.35.23.3:Ab153 폴리펩티드 융합을 전신으로 단일 주사 후, hTfR정점+/+ KI 마우스의 혈장 (도 45a) 및 뇌 용해질 (도 45b) 에서 huIgG1 농도를 나타낸다 (평균 ± SEM, 한 집단마다 n = 5임).
도 45c는 50 mg/kg의 항-BACE1_Ab153, CH3C.35.23:Ab153, 또는 CH3C.35.23.3:Ab153 폴리펩티드 융합을 전신으로 단일 주사 후, hTfR정점+/+ KI 마우스 뇌 용해질에서 내생성 마우스 Aβ농도를 나타낸다 (평균 ± SEM, 한 집단마다 n = 5임).
도 45d는 50 mg/kg의 항-BACE1_Ab153, CH3C.35.23:Ab153, 또는 CH3C.35.23.3:Ab153 폴리펩티드 융합을 전신으로 단일 주사 후, hTfR정점+/+ KI 마우스의 뇌 용해질에서 액틴에 대하여 표준화된 뇌 TfR 단백질의 웨스턴 블랏 정량화를 나타낸다 (평균 ± SEM, 한 집단마다 n = 4임).
도 46a-46d는 시노몰구스 원숭이에게 30 mg/kg 투여량의 표시 단백질을 단일 투여 후, 28-일 PKPD 연구를 나타낸다. 도 46a 및 46b는 혈청에서 혈청 huIgG1 및 혈장에서 혈장 Aβ 농도를 나타내는데, 투여된 화합물의 말초 노출 및 시간의 경과에 따른 혈장 Aβ 수준에 미치는 결과를 보여준다. 도 46c 및 46d는 투여 후, 시노몰구스 원숭이의 CDF에서 Aβ및 sAPPβ/sAPPα를 나타낸다(평균 ± SEM, 한 집단마다 n = 4-5임).
도 47a-47c는 30 mg/kg의 투여량으로 표시된 단백질들을 단일 투여 후, 시노몰구스 원숭이의 말초 혈액내 사전-투여 수준과 비교하여 혈액 망상적혈구(도 47a), 절대적 혈청 철 수준 (도 47b), 및 절대적 적혈구 세포 계수 (도 47c)를 나타낸다 (평균 ± SEM, 한 집단마다 n = 4-5임).
도 48a 및 48b는 14 일에 걸쳐 10 mg/kg을 단일 정맥 주사 후, hFcRn 녹-인 마우스에서 표시된 단백질들의 말초 PK 분석 (혈장 huIgG1 농도 (도 48a) 및 제거 값 (도 48b))을 나타낸다(평균 ± SEM, 한 집단마다 n = 3임).
도 49는 TfR-결합 CH3C.18 변이체의 정중 형광 강도를 나타낸다.
발명의 상세한 설명
I.
개요
트란스페린 수용체 (TfR)에 결합하는 폴리펩티드가 본원에서 기술된다. 본 발명은 Fc 영역 안에 있는 특정 아미노산이 변형되어, 이 Fc 폴리펩티드에서 TfR에 특이적인 새로운 결합 부위를 만들 수 있다는 발견에 일부 기초한다. TfR은 혈액-뇌-장벽 (BBB)에서 상당한-수준으로 발현되며, 그리고 TfR은 트란스페린을 혈액으로부터 뇌 안으로 자연적으로 이동시킨다는 사실을 이용하여, 이들 폴리펩티드는 치료제 (가령, 치료 폴리펩티드, 항체 가변 영역 이를 테면 Fabs, 및 소분자)를 BBB를 통과하여 운반하는데 이용될 수 있다. 이러한 접근법은 치료제의 뇌 흡수를 실질적으로 개선시킬 수 있고, 따라서 뇌 전달이 유리한 장애 및 질병을 치료하는데 매우 유용하다.
한 측면에서, 본 발명은 CH3 또는 CH2 도메인 폴리펩티드에서 특정 아미노산 세트가 치환되어, 트란스페린 수용체에 결합하는 폴리펩티드를 만들 수 있다는 발견에 일부 기초한다. 따라서, 한 측면에서, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 아미노산 (i) 157, 159, 160, 161, 162, 163, 186, 189, 및 194; 또는 (ii) 118, 119, 120, 122, 210, 211, 212, 및 213 세트에서 다중 치환을 갖는 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드가 본원에서 제공된다. 일부 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 아미노산 (iii) 47, 49, 56, 58, 59, 60, 61, 62, 및 63; (iv) 39, 40, 41, 42, 43, 44, 68, 70, 71, 및 72; (v) 41, 42, 43, 44, 45, 65, 66, 67, 69, 및 73; 또는 (vi) 45, 47, 49, 95, 97, 99, 102, 103, 및 104 세트에서 다중 치환을 갖는다. 상기 아미노산 위치 세트중 4개 내지 모두의 어디에서건 치환될 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 치환은 서열 번호:1을 참고로 하여 결정된다. 따라서, 아미노산은 서열 번호:1의 위치에 대응하는 아미노산과 상이한 경우, 심지어 자연 발생적 CH3 또는 CH2 도메인 폴리펩티드에 있는 위치에 존재하는 경우에도 치환된 것으로 고려된다.
세트 (i), (ii), (iii), (iv), (v), 또는 (vi)의 다중 위치에 치환을 갖는 변이체 폴리펩티드를 만듦으로써, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드를 만드는 방법들이 또한 본원에서 제공된다. 이러한 변이체는 트란스페린 수용체 결합에 대하여 분석될 것이고, 본원에서 기술된 바와 같이, 결합을 강화시키기 위하여 추가 돌연변이될 수 있다.
추가 측면에서, 조성물을 트란스페린 수용체-발현시키는 세포로 표적화시키고, 가령, 상기 조성물을 이 세포로 운반하거나, 또는 조성물을 내피 이를 테면, 혈액-뇌-장벽을 통과하여 운반하기 위하여, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드를 이용하는 방법들 및 처리 방법들이 본원에서 제공된다.
II.
정의
본원에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 내용에서 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들면, “폴리펩티드”에 대한 언급은 2 개 또는 그 이상의 이러한 분자의 조합 등을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "약(about)" 및 "대략적으로(approximately)"은 숫자 값 또는 범위로 특정된 양을 변경하는데 사용될 때, 당업자에게 수치 값과 수치 뿐만 아니라 이 값으로부터 합리적으로 편차, 예를 들면, ± 20%, ± 10% 또는 ± 5%의 편차는 인용된 값의 의도된 의미 안에 있음을 나타낸다.
본 발명의 내용에서 이용된 것과 같이, 용어 “트란스페린 수용체” 또는 “TfR”이란 트란스페린 수용체 단백질 1을 지칭한다. 인간 트란스페린 수용체 1 폴리펩티드 서열은 서열 번호:235에서 제시된다. 다른 종의 트란스페린 수용체 단백질 1 서열 또한 공지되어 있다(가령, 침팬지, 수탁 번호 XP_003310238.1; 붉은털원숭이, NP_001244232.1; 개, NP_001003111.1; 소, NP_001193506.1; 마우스, NP_035768.1; 렛, NP_073203.1; 그리고 닭, NP_990587.1). 용어 “트란스페린 수용체”는 트란스페린 수용체 단백질 1 염색체 좌(locus)에서 유전자에 인코드된 예시적인 기준 서열, 가령, 인간 서열의 대립형질(allelic) 변이체를 포괄한다. 전장의 트란스페린 수용체 단백질은 짧은 N-말단 세포내 영역, 막경유 영역, 및 거대 세포외 도메인을 포함한다. 상기 세포외 도메인은 3개의 도메인: 프로테아제-유사(like) 도메인, 나선(helical) 도메인, 및 정점 도메인에 의해 특징화된다. 인간 트란스페린 수용체 1의 정점 도메인 서열은 서열 번호:107에서 제시된다.
용어 “CH3 도메인” 및 “CH2 도메인”이란 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 면역글로블린 불변 영역 도메인 폴리펩티드를 지칭한다. IgG 항체 내용에서, CH3 도메인 폴리펩티드는 EU 번호매김 체계에 따라 번호가 부여될 때, 대략적 위치 341 내지 대략적 위치 447의 아미노산 세그먼트를 지칭하며, CH2 도메인 폴리펩티드는 EU 번호매김 체계에 따라 번호가 부여될 때, 대략적 위치 231 내지 대략적 위치 340의 아미노산 세그먼트를 지칭한다. CH2 및 CH3 도메인 폴리펩티드는 IMGT (ImMunoGeneTics) 번호매김 체계에 의해 또한 번호부여될 수 있는데, 이때 IMGT 과학적 차트 번호매김(IMGT 웹사이트)에 따라 CH2 도메인 번호매김은 1-110이며, CH3 도메인 번호매김은 1-107이다. CH2 및 CH3 도메인은 면역글로블린의 Fc 영역의 일부분이다. IgG 항체의 내용에서, Fc 영역은 EU 번호매김 체계에 따라 번호부여될 때, 대략적 위치 231 내지 대략적 위치 447의 아미노산 세그먼트를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “Fc 영역”은 항체의 힌지 영역의 최소한 일부분을 포함할 수 있다. 예시적인 힌지 영역 서열은 서열 번호:234에서 제시된다.
CH3 또는 CH2 도메인에 있어서 용어 “야생형(wild-type)", “고유의(native)", 및 “자연 발생적(naturally occurring)”이란 자연계에서 발생되는 서열을 갖는 도메인을 본원 명세서에서 지칭되는데 이용된다.
본 발명의 내용에서, 돌연변이 폴리펩티드 또는 돌연변이 폴리뉴클레오티드에 있어서 용어 “돌연변이(mutant)”란 “변이체(variant)”와 호환적으로 이용된다. 주어진 야생형 CH3 또는 CH2 도메인 기준 서열에 있어서 변이체는 자연 발생적 대립형질 변이체를 포함할 수 있다. “비-자연적(non-naturally)”생성된 CH3 또는 CH2 도메인이란 자연계 세포에 존재하지 않고, 가령, 유전적 조작 기술 또는 돌연변이유발 기술을 이용하여, 고유의 CH3 도메인 또는 CH2 도메인 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 유전적변형에 의해 만들어진, 변이체 또는 돌연변이 도메인을 지칭한다. “변이체”란 야생형에 대하여 최소한 하나의 아미노산 돌연변이를 포함하는 임의의 도메인을 포함한다. 돌연변이는 치환, 삽입, 및 결손을 포함할 수 있다.
용어 “아미노산”이란 자연 발생적 아미노산 및 합성 아미노산, 뿐만아니라 이 자연 발생적 아미노산와 유사한 방식으로 기능을 하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체(mimetics)를 지칭한다.
자연 발생적 아미노산은 유전자 코드, 뿐만아니라 나중 변형된, 가령, 히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, 및 O-포스포세린과 같이 변형된 아미노산에 의해 인코드된 것들이다. “아미노산 유사체들"이란 자연적으로 생성되는 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 가령, 수소에 결합된 탄소, 카르복실기, 아미노기, 및 R 기를 갖는 화합물, 이를 테면, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포니움이다. 이러한 유사체들은 변형된 R 기들(예컨데, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 백본을 보유하지만, 자연적으로 생성되는 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 유지한다. “아미노산 모방체(mimetics)”란 아미노산의 일반적인 화학 구조와는 상이하지만, 자연 발생적 아미노산과 유사한 방식으로 기능을 하는 화학적인 화합물을 말한다.
자연 발생적 α-아미노산에는 다음을 포함하나, 이에 국한되지 않는다: 알라닌 (Ala), 시스테인 (Cys), 아스파르트산 (Asp), 글루타민산 (Glu), 페닐알라닌 (Phe), 글리신 (Gly), 히스티딘 (His), 이소류신 (Ile), 아르기닌 (Arg), 리신 (Lys), 류신 (Leu), 메티오닌 (Met), 아스파라긴 (Asn), 프롤린 (Pro), 글루타민 (Gln), 세린 (Ser), 트레오닌 (Thr), 발린(Val), 트립토판 (Trp), 티로신 (Tyr), 및 이의 조합. 자연 발생적 α-아미노산의 입체이성체로는 다음을 포함하나, 이에 국한되지 않는다: D-알라닌 (D-Ala), D-시스테인 (D-Cys), D-아스파르트산 (D-Asp), D-글루타민산 (D-Glu), D-페닐알라닌 (D-Phe), D-히스티딘 (D-His), D-이소류신 (D-Ile), D-아르기닌 (D-Arg), D-리신 (D-Lys), D-류신 (D-Leu), D-메티오닌 (D-Met), D-아스파라긴 (D-Asn), D-프롤린 (D-Pro), D-글루타민 (D-Gln), D-세린 (D-Ser), D-트레오닌 (D-Thr), D-발린(D-Val), D-트립토판 (D-Trp), D-티로신 (D-Tyr), 및 이의 조합.
아미노산은 IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission에서 권장하는 통상적으로 알려진 3문자 기호 또는 1-문자 기호에 의해 본 명세서에서 언급될 수 있다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기들의 중합체를 포함하는 것으로 본 명세서에서 호환된다. 이 용어는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기들이 대응하는 자연적으로 발생되는 아미노산의 유사체 또는 인공적인 모방체인 아미노산 중합체에 적용되고, 뿐만 아니라 자연적으로 발생되는 아미노산 중합체 및 비-자연적으로 발생되는 아미노산 중합체에도 적용된다. 아미노산 중합체는 전적으로 L-아미노산, 전적으로 D-아미노산, 또는 L 아미노산과 D 아미노산의 혼합물을 포함할 수 있다.
용어 “보존적 치환”, “보존적 돌연변이” 또는 “보존적으로 변형된 변이체”이란 유사한 특징을 갖는 것으로 분류될 수 있는 또다른 아미노산으로 아미노산을 치환시키는 변형을 지칭한다. 이러한 방식에서 특정된 보존적 아미노산 집단의 부유 예로는 다음을 포함할 수 있다: “하전된/극성 집단”은 Glu (글루타민산 또는 E), Asp (아스파르트산 또는 D), Asn (아스파라긴 또는 N), Gln (글루타민 또는 Q), Lys (리신 또는 K), Arg (아르기닌 또는 R), 및 His (히스티딘 또는 H)을 포함하고; “방향족 집단”은 Phe (페닐알라닌 또는 F), Tyr (티로신 또는 Y), Trp (트립토판 또는 W), 및 (히스티딘 또는 H)을 포함하고; 그리고 “지방족 집단”은 Gly (글리신 또는 G), Ala (알라닌 또는 A), Val (발린 또는 V), Leu (류신 또는 L), Ile (이소류신 또는 I), Met (메티오닌 또는 M), Ser (세린 또는 S), Thr (트레오닌 또는 T), 및 Cys (시스테인 또는 C)을 포함한다. 각 집단에서, 하위집단들 또한 식별될 수 있다. 예를 들면, 하전된 또는 극성 아미노산의 집단은 다음을 포함하는 하위-집단으로 더 분류될 수 있다: “양으로-하전된 하위-집단”은 Lys, Arg 및 His을 포함하고; “음으로-하전된 하위-집단”은 Glu 및 Asp을 포함하고; 그리고 “극성 하위-집단”은 Asn 및 Gln을 포함한다. 또다른 실시예에서, 방향족 또는 고리 집단은 다음을 포함하는 하위-집단으로 더 분류될 수 있다: “질소 고리 하위-집단”은 Pro, His 및 Trp을 포함하고; 그리고 “페닐 하위-집단”은 Phe 및 Tyr을 포함한다. 또다른 추가 실시예에서, 지방족 집단은 다음을 포함하는 하위-집단으로 더 분류될 수 있다: 가령, “지방족 비-극성 하위-집단”은 Val, Leu, Gly, 및 Ala을 포함하고; 그리고 “지방족 약간의-극성 하위-집단”은 Met, Ser, Thr, 및 Cys을 포함한다. 보존적 돌연변이의 범주의 예로는 상기 하위-집단 안의 아미노산의 아미노산 치환, 이를 테면, 다음을 포함하나, 이에 국한되지 않는다: Arg을 대신한 Lys 또는 이의 역, 이때 양전하는 유지될 수 있다; Asp을 대신한 Glu 또는 이의 역, 이때 음전하는 유지될 수 있다; Thr을 대신한 Ser 또는 이의 역, 유리(free)-OH는 유지될 수 있다; 그리고 Asn을 대신한 Gln 또는 이의 역, 유리-NH2는 유지될 수 있다. 일부 구체예들에서, 자연 발생적 소수성 아미노산을 대신하여 활성 부위에서 가령, 소수성을 보존하기 위하여 소수성 아미노산으로 대체된다.
2개 또는 그 이상 폴리펩티드 서열에서 용어 “동일한(identical)”또는 “동일성(identity)" 백분율이란 비교 창에서 최대 대응을 위하여 비교 및 정렬될 때, 또는 서열 비교 알고리즘을 이용하여 측정하였을 때, 또는 수작업 배열 및 시각적 관찰에 의해 측정하였을 때, 명시된 영역에서 동일한, 2개 또는 그 이상 폴리펩티드 서열에서 아미노산 잔기가 동일하거나, 또는 명시된 백분율, 가령, 최소한 60% 동일성, 최소한 65%, 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 또는 최소한 95% 또는 더 큰 백분율의 2개 또는 그 이상 서열 또는 하위 서열을 말한다.
폴리펩티드 서열 비교를 위하여, 일반적으로 하나의 서열이 참고 서열로 작용하여, 후보 서열들과 비교된다. 정렬은 당업자에게 이용가능한 다양한 방법, 예를 들어, 시각적 정렬, 또는 최대 정렬을 달성하기 위해 공지된 알고리즘을 사용하여 공개적으로 이용가능한 소프트웨어를 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 프로그램은 BLAST 프로그램, ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, Calif.) 또는 Megalign (DNASTAR)을 포함한다. 최대 정렬을 달성하기 위해, 정렬에 사용된 매개변수는 당업자에 의해 결정될 수 있다. 출원의 목적을 위한 폴리펩티드 서열의 서열 비교를 위해, 2 개의 단백질 서열을 디폴트 매개변수와 함께, 정렬시키기 위한 BLASTP 알고리즘 표준 단백질 BLAST가 사용된다.
폴리펩티드 서열에서 주어진 아미노산 잔기의 식별에 이용될 때, 용어 “~에 상응하는", “~를 참고하여 결정된", 또는 “~를 참고하여 번호매겨진”이란 해당 주어진 아미노산 서열을 기준 서열과 최대로 배열하고, 비교할 때, 명시된 기준 서열의 잔기 위치를 지칭한다. 따라서, 예를 들면, 서열 번호:1과 최적으로 배열될 때, 서열 번호:1의 아미노산과 해당 잔기가 정렬될 때, 폴리펩티드에서 아미노산 잔기는 서열 번호:1의 아미노산 114-220에 "대응한다". 기준 서열에 대하여 정렬된 폴리펩티드는 기준 서열과 동일한 길이어야 할 필요는 없다.
“결합 친화력”이란 본원에서 사용된 바와 같이 2개 분자, 가령, 폴리펩티드 상의 단일 결합 부위와 표적, 가령, 이것이 결합하는 트란스페린 수용체 사이에 비-공유 상호작용의 강도를 나타낸다. 따라서, 예를 들면, 이 용어는 다른 언급이 없거나, 문맥으로부터 명확하지 않는 경우, 폴리펩티드와 이의 표적 사이에 1:1 상호작용을 지칭한다. 결합 친화력이란 평형 해리 상수 (KD)를 측정함으로써 정량화될 수 있는데, 이는 연합 속도 상수 (ka, 시간-1 M-1)를 해리 속도 상수 (kd, 시간-1)로 나눈 것을 말한다. KD는 복합체 형성 및 해리의 역학을 가령, 표면 플라스몬 공명 (SPR) 방법, 가령, Biacore™ 시스템, 역학 배제 검증, 이를 테면, KinExA®; 그리고 BioLayer 간섭측정 (가령, ForteBio® Octet® 플렛폼)을 이용하여 결정될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, “결합 친화력(binding affinity)”은 폴리펩티드와 이의 표적 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 공식적인 결합 친화력(formal binding affinities)만을 포함하는 것이 아니라 결합능(avid) 결합을 또한 반영할 수 있는 산출된 KD의 표면 친화력(apparent affinities)을 포함한다.
본원에 기술된 변형된 CH3 및/또는 변형된 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 언급할 때, 표적, 예를 들어 트랜스페린 수용체에 "특이적으로 결합한다" 또는 "선택적으로 결합한다"란 이 폴리펩티드가 구조적으로 상이한 표적, 예를 들어 트랜스페린 수용체 패밀리에 없는 표적에 결합하는 것보다 더 큰 친화력, 더 큰 결합능 및/또는 더 오랜 지속 시간으로 표적에 결합하는 결합 반응을 지칭한다 전형적인 구체예에서, 동일한 친화력 검증 조건하에서 검사하였을 때, 무관한 표적과 비교하여, 상기 폴리펩티드는 트란스페린 수용체에 대하여 최소한 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배, 20-배, 25-배, 50-배, 또는 100-배, 또는 더 친화력을 갖는다. 일부 구체예들에서, 변형된 CH3 및/또는 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드는 종(species) 간에, 가령, 비-인간 영장류와 인간 종 간에 보존된 트란스페린 수용체 상의 보존된 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 구체예들에서, 폴리펩티드는 인간 트란스페린 수용체에 배타적으로 결합할 수 있다.
용어 “대상", “개체", 및 “환자"는 본원에서 호환되며, 인간, 비-인간 영장류, 설치류 (가령, 렛, 마우스, 및 기니아피그), 토끼, 소, 돼지, 말, 및 다른 포유류 종을 비롯하지만, 이에 국한되지 않는 포유류를 지칭한다. 한 구체예에서, 상기 환자는 인간이다.
용어 "치료", "치료하는", 및 이와 유사한 것은 바람직한 약리학적 및/또는 생리적 효과를 얻는 수단을 일반적으로 의미하는 것으로 이용된다. “치료하는” 또는 “치료”란 손상, 질환 또는 상태의 치료 또는 개선에서, 임의의 객관적 또는 주관적 매개변수 이를 테면, 환자 생존의 경감, 차도, 개선, 생존 시간 또는 생존율의 증가, 증상의 감소 또는 이 손상, 질환 또는 상태가 이 환자에 더 용인되도록 하거나, 환자의 신체적 또는 정신적 안녕을 퇴행, 또는 감소, 또는 개선시키는 속도를 느리게 하는 것들 포함한, 임의의 성공 지표를 지칭할 수 있다. 증상의 치료 또는 개선은 객관적 또는 주관적 매개변수에 기초될 수 있다. 치료 효과는 치료를 받지 않은 개인 또는 개인 모음과 비교하여, 또는 동일한 환자의 치료 전에 또는 치료 중 상이한 시간대와 비교할 수 있다.
용어 “약학적으로 수용가능한 부형제(excipient)”는 이를 테면, 완충제, 담체, 또는 보존제를 포함하나, 이에 국한되지 않는 인간 또는 동물에서 사용하는데 있어서 생물학적 또는 약학적으로 양립가능한 비-활성 약학 성분을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 작용제의 “치료요법적 양” 또는 “치료요법적으로 효과량”이란 대상의 질환의 증상을 치료, 경감, 완화, 약화, 또는 감소시키는 작용제의 양이다. 작용제의 “치료요법적 양” 또는 “치료요법적으로 효과량”은 환자 생존 개선, 생존 시간 또는 생존율의 증가, 증상의 감소, 손상, 질환, 또는 상태가 더욱 용인되도록 만들고, 퇴행 또는 감소 속도를 늦추고, 또는 환자의 신체적 또는 정신적 안녕을 개선시킬 수 있다.
용어 "투여하다"란 작용제, 화합물 또는 조성물을 원하는 생물학적 작용 부위로 전달하는 방법을 지칭한다. 이들 방법은 국소 전달, 비경구 전달, 정맥내 전달, 피내(intradermal) 전달, 근육내 전달, 척수강내(intrathecal) 전달, 결장 전달, 직장 전달 또는 복강 전달을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 한 구체예에서, 본원에서 기술된 폴리펩티드는 정맥으로 투여된다.
III.
트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드
이 섹션은 트랜스페린 수용체에 결합하고, 혈액-뇌 장벽 (BBB)을 가로 질러 수송될 수 있는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 생성을 설명한다.
한 측면에서, 상기 폴리펩티드가 트란스페린 수용체에 특이적 결합을 허용하는 변형을 갖는 CH3 또는 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드가 제공된다. 상기 변형(modifications)은 상기 CH3 또는 CH2 도메인의 표면에 존재하는 명시된 아미노산 세트 안으로 도입된다. 일부 구체예들에서, 변형된 CH3 또는 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 트란스페린 수용체의 정점 도메인의 에피토프에 특이적으로 결합한다.
다른 면역글로블린 동소체(isotypes), 가령, IgM, IgA, IgE, IgD, 등등의 CH2 및 CH3 도메인은 본원에서 기술된 세트 (i)-(vi)에 대응하는 아미노산 잔기를 식별함으로써 유사하게 변형될 수 있음을 당업자는 인지한다. 다른 종, 예를 들어 비-인간 영장류, 원숭이, 마우스, 렛, 토끼, 개, 돼지, 닭 등의 면역글로불린으로부터 상응하는 도메인에 변형이 또한 만들어질 수 있다.
CH3 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드
일부 구체예들에서, 변형된 도메인은 인간 Ig CH3 도메인, 이를 테면 IgG CH3 도메인이다. CH3 도메인은 임의의 IgG 하위유형, 가령, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 하위유형이다. IgG 항체의 내용에서, CH3 도메인은 EU 번호매김 체계에 따라 번호부여될 때, 대략적 위치 341 내지 대략적 위치 447의 아미노산 세그먼트를 지칭한다. 트란스페린 수용체 결합을 위한 아미노산 위치 세트의 대응하는 세트를 식별하기 위한 목적으로 CH3 도메인에서의 위치는 다른 언급이 없는 한, 서열 번호:3을 참고로 결정되거나, 또는 서열 번호:1의 아미노산 114-220을 참고로 결정된다. 치환 또한 서열 번호:1을 참고로 하여 결정되는데, 가령, 아미노산은 서열 번호:1에서 대응하는 위치에서 아미노산과 비교하여 치환인 것으로 간주된다. 서열 번호:1은 부분적 힌지 영역 서열, 아미노산 1-3, PCP를 포함한다. 서열 번호:1을 참고로 하여, CH3 도메인에서 위치의 번호매김은 처음 3개 아미노산을 포함한다.
상기에서 나타낸 것과 같이, 본 발명에 따라 변형될 수 있는 CH3 도메인의 잔기 세트는 본원에서 서열 번호:1을 참고로 하여 번호매김된다. 임의의 CH3 도메인, 가령, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 CH3 도메인은 서열 번호:1에서 기재된 위치의 잔기에 대응하는 하나 또는 그 이상의 잔기 세트에서 변형, 가령, 아미노산 치환을 보유할 수 있다. 서열 번호:1의 인간 IgG1 아미노산 서열과 인간 IgG2, IgG3, 및 IgG4의 정렬은 도 38에 나타낸다. 서열 번호:1의 임의의 주어진 위치에 대응하는 IgG2, IgG3, 및 IgG4 서열 각각에서의 위치는 바로 결정될 수 있다.
한 구체예에서, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 전장 인간 트란스페린 수용체 서열 (서열 번호:235)의 위치 208을 포함하는 에피토프에서 트란스페린 수용체의 정점 도메인에 결합하고, 이때 상기 위치는 서열 번호:107에서 제시된 인간 트란스페린 수용체 정점 도메인 서열의 위치 11에 대응한다. 서열 번호:107은 인간 트란스페린 수용체-1 유니프로테인(uniprotein) 서열 P02786 (서열 번호:235)의 아미노산 198-378에 대응한다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 전장 인간 트란스페린 수용체 서열 (서열 번호:235)의 위치 158, 188, 199, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 및/또는 294를 포함하는 에피토프에서 트란스페린 수용체의 정점 도메인에 결합한다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 트란스페린이 이 수용체에 결합하는 것을 차단, 또는 그렇지 않으면 억제하지 않고, 트란스페린 수용체에 결합할 수 있다. 일부 구체예들에서, 트란스페린이 TfR에 결합하는 것은실질적으로 억제되지 않는다. 일부 구체예들에서, 트란스페린이 TfR에 결합하는 것은 약 50% 미만으로 (가령, 약 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 미만으로) 억제된다. 일부 구체예들에서, 트란스페린이 TfR에 결합하는 것은 약 20% 미만으로 (가령, 약 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만으로) 억제된다. 이런 결합 특이성을 나타내는 예시적인 CH3 도메인 폴리펩티드는 서열 번호:1의 아미노산 114-220을 참고로 하여 결정하였을 때 위치 157, 159, 160, 161, 162, 163, 186, 189, 및 194에 아미노산 치환을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
CH3 트란스페린 수용체 결합 세트 (i): 157, 159, 160, 161, 162, 163, 186, 189, 및 194
일부 구체예들에서, 본 발명에 따른 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 157, 159, 160, 161, 162, 163, 186, 189, 및 194 (세트 i)을 포함하는 아미노산 위치 세트에서 최소한 3개 또는 최소한 4개, 그리고 전형적으로 5, 6, 7, 8, 또는 9개 치환을 포함한다. 이들 위치에 도입될 수 있는 예시적인 치환이 표 6에 제시되어 있다. 일부 구체예들에서, 위치 161 및/또는 194에서 아미노산은 방향족 아미노산, 가령, Trp, Phe, 또는 Tyr이다. 일부 구체예들에서, 위치 161에 아미노산은 Trp이다. 일부 구체예들에서, 위치 161의 아미노산은 Gly이다. 일부 구체예들에서, 위치 194에서 방향족 아미노산은 Trp 또는 Phe이다.
일부 구체예들에서, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 다음과 같이, 서열 번호:1에 대하여 치환을 갖는 최소한 1개 위치를 포함한다: 위치 157에 Leu, Tyr, Met, 또는 Val; 위치 159에 Leu, Thr, His, 또는 Pro; 위치 160에 Val, Pro, 또는 산성 아미노산; 위치 161에 방향족 아미노산, 가령, Trp 또는 Gly (가령, Trp); 위치 162에 Val, Ser, 또는 Ala; 위치 186에 산성 아미노산, Ala, Ser, Leu, Thr, 또는 Pro; 위치 189에 Thr 또는 산성 아미노산; 또는 위치 194에 Trp, Tyr, His, 또는 Phe. 일부 구체예들에서, 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 보존적 치환, 가령, 세트내 하나 또는 그 이상의 위치에서 명시된 아미노산의 동일한 하전 집단, 소수성 집단, 측쇄 고리 구조 집단 (가령, 방향족 아미노산), 또는 크기 집단, 및/또는 극성 또는 비-극성 집단의 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들면, Ile는 157, 159, 및/또는 위치 186에 존재할 수 있다. 일부 구체예들에서, 위치 160, 186, 및 189중 1, 2, 또는 각 위치에서 산성 아미노산은 Glu이다. 일부 구체예들에서, 위치 160, 186, 및 189중 1, 2, 또는 각 위치에서 산성 아미노산은 Asp이다. 일부 구체예들에서, 이 단락에서 명시된 바와 같이, 위치 157, 159, 160, 161, 162, 186, 189, 및 194중 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 모든 위치에서 아미노산 치환을 갖는다.
일부 구체예들에서, 세트 (i)의 변형을 갖는 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 163에 고유의 Asn을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 163에서 Gly, His, Gln, Leu, Lys, Val, Phe, Ser, Ala, 또는 Asp을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 153, 164, 165, 및 188을 포함하는 위치에서 1, 2, 3 또는 4개의 치환을 더 포함한다. 일부 구체예들에서, Trp, Tyr, Leu, 또는 Gln는 위치 153에 존재할 수 있다. 일부 구체예들에서, Ser, Thr, Gln, 또는 Phe는 위치 164에 존재할 수 있다. 일부 구체예들에서, Gln, Phe, 또는 His는 위치 165에 존재할 수 있다. 일부 구체예들에서, Glu는 위치 188에 존재할 수 있다.
특정 구체예에서, 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 다음에서 선택된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 위치를 포함한다: 위치 153에 Trp, Leu, 또는 Glu; 위치 157에 Tyr 또는 Phe; 위치 159에 Thr; 위치 160에 Glu; 위치 161에 Trp; 위치 162에 Ser, Ala, Val, 또는 Asn; 위치 163에 Ser 또는 Asn; 위치 186에 Thr 또는 Ser; 위치 188에 Glu 또는 Ser; 위치 189에 Glu; 및/또는 위치 194에 Phe. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 다음의 11개 모든 위치를 포함한다: 위치 153에 Trp, Leu, 또는 Glu; 위치 157에 Tyr 또는 Phe; 위치 159에 Thr; 위치 160에 Glu; 위치 161에 Trp; 위치 162에 Ser, Ala, Val, 또는 Asn; 위치 163에 Ser 또는 Asn; 위치 186에 Thr 또는 Ser; 위치 188에 Glu 또는 Ser; 위치 189에 Glu; 및/또는 위치 194에 Phe.
특정 구체예에서, 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 157에 Leu 또는 Met; 위치 159에 Leu, His, 또는 Pro; 위치 160에 Val; 위치 161에 Trp; 위치 162에 Val 또는 Ala; 위치 186에 Pro; 위치 189에 Thr; 및/또는 위치 194에 Trp를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 164에 Ser, Thr, Gln, 또는 Phe를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 153에 Trp, Tyr, Leu, 또는 Gln 및/또는 위치 165에 Gln, Phe, 또는 His를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, Trp은 위치 153에 존재하고 및/또는 Gln은 위치 165에 존재한다. 일부 구체예들에서, 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 153에 Trp을 보유하지 않는다.
다른 구체예들에서, 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 157에 Tyr; 위치 159에 Thr; 위치 160에 Glu 또는 Val 및; 위치 161에 Trp; 위치 162에 Ser; 위치 186에 Ser 또는 Thr; 위치 189에 Glu; 및/또는 위치 194에 Phe을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 163에서 고유의 Asn을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 153에 Trp, Tyr, Leu, 또는 Gln; 및/또는 위치 188에 Glu를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 153에서 Trp 및/또는 위치 188에서 Glu를 더 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 다음 치환중 하나 또는 그 이상을 포함한다: 위치 153에 Trp; 위치 159에 Thr; 위치 161에 Trp; 위치 162에 Val; 위치 186에 Ser 또는 Thr; 위치 188에 Glu; 및/또는 위치 194에 Phe.
추가 구체예에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 다음에서 선택된 1, 2 또는 3개 위치를 더 포함한다: 위치 187은 Lys, Arg, Gly, 또는 Pro이고; 위치 197은 Ser, Thr, Glu, 또는 Lys이고; 그리고 위치 199는 Ser, Trp, 또는 Gly이다.
일부 구체예들에서, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 서열 번호:4-29, 236-299, 및 422-435중 임의의 하나의 아미노산 114-220에 대하여 최소한 70% 동일성, 최소한 75% 동일성, 최소한 80% 동일성, 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는다. 일부 구체예들에서, 이러한 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 서열 번호:4-29, 236-299, 및 422-435중 임의의 하나의 아미노산 157-163 및/또는 186-194를 포함한다. 일부 구체예들에서, 이러한 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 서열 번호:4-29, 236-299, 및 422-435중 임의의 하나의 아미노산 153-163 및/또는 186-194를 포함한다. 일부 구체예들에서, 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 서열 번호:4-29, 236-299, 및 422-435중 임의의 하나의 아미노산 153-163 및/또는 186-199를 포함한다.
일부 구체예들에서, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 서열 번호:1의 아미노산 114-220에 대하여 최소한 70% 동일성, 최소한 75% 동일성, 최소한 80% 동일성, 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖고, 단서조항으로 상기 동일성 백분율에 위치 157, 159, 160, 161, 162, 163, 186, 189, 및 194의 세트는 포함하지 않는다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 서열 번호:4-29, 236-299, 및 422-435중 임의의 하나에서 제시된 바와 같이, 아미노산 157-163 및/또는 아미노산 186-194를 포함한다.
일부 구체예들에서, 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 서열 번호:4-29, 236-299 및 422-435중 임의의 하나에 대하여 최소한 70% 동일성, 최소한 75% 동일성, 최소한 80% 동일성, 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖고, 단서조항으로, 서열 번호:4-29, 236-299, 및 422-435중 임의의 하나의 위치 153, 157, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 186, 187, 188, 189, 194, 197, 및 199에 대응하는 위치의 최소한 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개는 결손되지 않거나, 또는 치환되지 않는다.
일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 서열 번호:4-29, 236-299, 및 422-435중 임의의 하나에 대하여 최소한 75% 동일성, 최소한 80% 동일성, 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖고, 다음과 같이, 상기 위치의 최소한 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개를 또한 포함한다: 위치 153에서 Trp, Tyr, Leu, Gln, 또는 Glu; 위치 157에서 Leu, Tyr, Met, 또는 Val; 위치 159에서 Leu, Thr, His, 또는 Pro; 위치 160에서 Val, Pro, 또는 산성 아미노산; 위치 161에서 방향족 아미노산, 가령, Trp; 위치 162에서 Val, Ser, 또는 Ala; 위치 163에서 Ser 또는 Asn; 위치 164에서 Ser, Thr, Gln, 또는 Phe; 위치 165에서 Gln, Phe, 또는 His; 위치 186에서 산성 아미노산, Ala, Ser, Leu, Thr, 또는 Pro; 위치 187에서 Lys, Arg, Gly 또는 Pro; 위치 188에서 Glu 또는 Ser; 위치 189에서 Thr 또는 산성 아미노산; 위치 194에서 Trp, Tyr, His 또는 Phe; 위치 197에서 Ser, Thr, Glu 또는 Lys; 그리고 위치 199에서 Ser, Trp, 또는 Gly.
일부 구체예들에서, 본 발명에 따른 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 153, 157, 159, 160, 162, 163, 186, 188, 189, 194, 197, 및 199를 포함하는 아미노산 위치 세트에서 하나 또는 그 이상의 치환을 포함하고; 그리고 이때 상기 치환 및 상기 위치는 서열 번호:13을 참고로 하여 결정된다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 위치 153에서 Glu, Leu, Ser, Val, Trp, 또는 Tyr; 위치 157에서 방향족 아미노산 (가령, Tyr, Phe, 또는 Trp), Met, Pro, 또는 Val; 위치 159에서 Thr, Asn, 또는 Val; 위치 160에서 Glu, Ile, Pro, 또는 Val; 위치 162에서 지방족 아미노산 (가령, Ala, Ile, 또는 Val), Ser, 또는 Thr; 위치 163에서 Ser, Asn, Arg, 또는 Thr; 위치 186에서 Thr, His, 또는 Ser; 위치 188에서 Glu, Ser, Asp, Gly, Thr, Pro, Gln, 또는 Arg; 위치 189에서 Glu 또는 Arg; 위치 194에서 Phe, His, Lys, Tyr, 또는 Trp; 위치 197에서 Ser, Thr, 또는 Trp; 그리고 위치 199에서 Ser, Cys, Pro, Met, 또는 Trp를 포함한다. 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 다음 서열을 가질 수 있다: GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVX1WESX2GX3X4WX5X6YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVX7KX8X9WQQGX10VFX11CX12VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열 번호:556), 이때 X1은 E, L, S, V, W, 또는 Y이고; X2는 방향족 아미노산 (가령, Y, F, 또는 W), M, P, 또는 V이고; X3은 T, N, 또는 V이고; X4는 E, I, P, 또는 V이고; X5는 지방족 아미노산 (가령, A, I, 또는 V), S, 또는 T이고; X6은 S, N, R, 또는 T이고; X7은 T, H, 또는 S이고; X8은 E, S, D, G, T, P, Q, 또는 R이고; X9는 E 또는 R이고; X10은 F, H, K, Y, 또는 W이고; X11은 S, T, 또는 W이고; 그리고 X12는 S, C, P, M, 또는 W이다. 특정 구체예에서, 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 다음 서열을 포함할 수 있다: X1WESX2GX3X4WX5X6 (서열 번호:554), 이때 X1은 E, L, S, V, W, 또는 Y이고; X2는 방향족 아미노산 (가령, Y, F, 또는 W), M, P, 또는 V이고; X3은 T, N, 또는 V이고; X4는 E, I, P, 또는 V이고; X5는 지방족 아미노산 (가령, A, I, 또는 V), S, 또는 T이고; 그리고 X6은 S, N, R, 또는 T이다. 특정 구체예에서, 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 다음 서열을 포함할 수 있다: X1KX2X3WQQGX4VFX5CX6 (서열 번호:555), 이때 X1은 T, H, 또는 S이고; X2는 E, S, D, G, T, P, Q, 또는 R이고; X3은 E 또는 R이고; X4는 F, H, K, Y, 또는 W이고; X5는 S, T, 또는 W이고; 그리고 X6은 S, C, P, M, 또는 W이다.
일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 153에서 Glu, Leu, 또는 Trp; 위치 157에서 방향족 아미노산; 위치 159에서 Thr; 위치 160에서 Glu; 위치 162에서 지방족 아미노산 또는 Ser; 위치 163에서 Ser 또는 Asn; 위치 186에서 Thr 또는 Ser; 위치 188에서 Glu 또는 Ser; 위치 189에서 Glu; 위치 194에서 Phe, His, Tyr, 또는 Trp; 위치 197에서 Ser; 그리고 위치 199에서 Ser를 포함하고, 이때 상기 치환 및 상기 위치는 서열 번호:13을 참고로 하여 결정된다. 특정 구체예들에서, 위치 157에서 방향족 아미노산은 Tyr 또는 Phe이고, 위치 162에서 Ala 또는 Val이다. 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 다음 서열을 가질 수 있다: GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVX1WESX2GX3X4WX5X6YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVX7KX8X9WQQGX10VFX11CX12VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열 번호:559), 이때 X1은 E, L, 또는 W이고; X2는 방향족 아미노산 (가령, Y 또는 F)이고; X3은 T이고; X4는 E이고; X5는 지방족 아미노산 (가령, A 또는 V) 또는 S이고; X6은 S 또는 N이고; X7은 T 또는 S이고; X8은 E 또는 S이고; X9는 E이고; X10은 F, H, Y, 또는 W이고; X11은 S이고; 그리고 X12는 S이다. 특정 구체예에서, 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 다음 서열을 포함할 수 있다: X1WESX2GX3X4WX5X6 (서열 번호:557), 이때 X1은 E, L, 또는 W이고; X2는 방향족 아미노산 (가령, Y 또는 F)이고; X3은 T이고; X4는 E이고; X5는 지방족 아미노산 (가령, A 또는 V) 또는 S이고; 그리고 X6은 S 또는 N이다. 특정 구체예에서, 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 다음 서열을 포함할 수 있다: X1KX2X3WQQGX4VFX5CX6 (서열 번호:558), 이때 X1은 T 또는 S이고; X2는 E 또는 S이고; X3은 E이고; X4는 F, H, Y, 또는 W이고; X5는 S이고; 그리고 X6은 S이다.
추가 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 153에서 Glu, Leu, 또는 Trp; 위치 157에서 Tyr 또는 Phe; 위치 159에서 Thr; 위치 160에서 Glu; 위치 162에서 Ala, Val, 또는 Ser; 위치 163에서 Ser 또는 Asn; 위치 186에서 Thr 또는 Ser; 위치 188에서 Glu 또는 Ser; 위치 189에서 Glu; 위치 194에서 Phe; 위치 197에서 Ser; 그리고 위치 199에서 Ser를 포함할 수 있고, 이때 상기 치환 및 상기 위치는 서열 번호:13을 참고로 하여 결정된다. 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 다음 서열을 가질 수 있다: GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVX1WESX2GX3X4WX5X6YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVX7KX8X9WQQGX10VFX11CX12VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열 번호:562), 이때 X1은 E, L, 또는 W이고; X2는 Y 또는 F이고; X3은 T이고; X4는 E이고; X5는 S, A 또는 V이고; X6은 S 또는 N이고; X7은 T 또는 S이고; X8은 E 또는 S이고; X9는 E이고; X10은 F이고; X11은 S이고; 그리고 X12는 S이다. 특정 구체예에서, 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 다음 서열을 포함할 수 있다: X1WESX2GX3X4WX5X6 (서열 번호:560), 이때 X1은 E, L, 또는 W이고; X2는 Y 또는 F이고; X3은 T이고; X4는 E이고; X5는 S, A 또는 V이고; 그리고 X6은 S 또는 N이다. 특정 구체예에서, 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 다음 서열을 포함할 수 있다: X1KX2X3WQQGX4VFX5CX6 (서열 번호:561), 이때 X1은 T 또는 S이고; X2는 E 또는 S이고; X3은 E이고; X4는 F이고; X5는 S이고; 그리고 X6은 S이다.
일부 구체예들에서, 본 발명에 따른 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 153, 157, 159, 160, 162, 163, 186, 188, 189, 194, 197, 및 199를 포함하는 아미노산 위치 세트에서 오직 한 개의 치환을 포함하고; 그리고 이때 상기 치환 및 상기 위치는 서열 번호:238을 참고로 하여 결정된다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 153에서 Glu, Leu, Ser, Val, Trp, 또는 Tyr을 포함한다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 153에서 Glu를 포함할 수 있다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 153에서 Leu를 포함할 수 있다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 153에서 Ser를 포함할 수 있다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 153에서 Val를 포함할 수 있다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 153에서 Trp를 포함할 수 있다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 153에서 Tyr를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 157에서 Tyr, Phe, Trp, Met, Pro, 또는 Val를 포함한다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 157에서 Tyr를 포함할 수 있다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 157에서 Phe를 포함할 수 있다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 157에서 Trp를 포함할 수 있다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 157에서 Met를 포함할 수 있다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 157에서 Pro를 포함할 수 있다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 157에서 Val를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 159에서 Thr, Asn, 또는 Val를 포함한다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 159에서 Thr를 포함할 수 있다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 159에서 Asn를 포함할 수 있다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 159에서 Val를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 160에서 Glu, Ile, Pro, 또는 Val을 포함한다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 160에서 Glu를 포함할 수 있다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 160에서 Ile를 포함할 수 있다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 160에서 Pro를 포함할 수 있다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 160에서 Val를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 162에서 Ala, Ile, Val, Ser, 또는 Thr를 포함한다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 162에서 Pro를 포함할 수 있다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 162에서 Ile를 포함할 수 있다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 162에서 Val를 포함할 수 있다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 162에서 Ser를 포함할 수 있다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 162에서 Thr를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 163에서 Ser, Asn, Arg, 또는 Thr를 포함한다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 163에서 Ser를 포함할 수 있다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 163에서 Asn를 포함할 수 있다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 163에서 Arg를 포함할 수 있다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 163에서 Thr를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 186에서 Thr, His, 또는 Ser를 포함한다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 186에서 Thr를 포함할 수 있다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 186에서 His를 포함할 수 있다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 186에서 Ser를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 188에서 Glu, Ser, Asp, Gly, Thr, Pro, Gln, 또는 Arg를 포함한다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 188에서 Glu를 포함할 수 있다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 188에서 Ser를 포함할 수 있다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 188에서 Asp를 포함할 수 있다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 188에서 Gly를 포함할 수 있다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 188에서 Thr를 포함할 수 있다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 188에서 Pro를 포함할 수 있다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 188에서 Gln를 포함할 수 있다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 188에서 Arg를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 189에서 Glu 또는 Arg를 포함한다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 189에서 Glu를 포함할 수 있다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 189에서 Arg를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 194에서 Phe, His, Lys, Tyr, 또는 Trp를 포함한다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 194에서 Phe를 포함할 수 있다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 194에서 His를 포함할 수 있다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 194에서 Lys를 포함할 수 있다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 194에서 Tyr를 포함할 수 있다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 194에서 Trp를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 197에서 Ser, Thr, 또는 Trp를 포함한다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 197에서 Ser를 포함할 수 있다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 197에서 Thr를 포함할 수 있다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 197에서 Trp를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 199에서 Ser, Cys, Pro, Met, 또는 Trp를 포함한다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 199에서 Ser를 포함할 수 있다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 199에서 Cys를 포함할 수 있다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 199에서 Pro를 포함할 수 있다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 199에서 Met를 포함할 수 있다. 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 199에서 Trp를 포함할 수 있다. 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 서열 번호:563-574중 임의의 하나의 서열을 가질 수 있다.
일부 구체예들에서, 본 발명에 따른 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 153, 157, 159, 160, 162, 163, 164, 186, 189, 및 194를 포함하는 아미노산 위치 세트에서 하나 또는 그 이상의 치환을 포함하고; 그리고 이때 상기 치환 및 상기 위치는 서열 번호:9를 참고로 하여 결정된다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인은 위치 153에서 Glu 또는 Trp; 위치 157에서 Val, Trp, Leu, 또는 Tyr; 위치 159에서 Leu, Pro, Phe, Thr, 또는 His; 위치 160에서 Pro, Val, 또는 Glu; 위치 162에서 Ala, Ser, Val, 또는 Gly; 위치 163에서 Leu, His, Gln, Gly, Val, Ala, Asn, Asp, Thr, 또는 Glu; 위치 164에서 Thr, Phe, Gln, Val, 또는 Tyr; 위치 186에서 Leu, Ser, Glu, Ala, 또는 Pro; 위치 189에서 Glu, Asp, Thr, 또는 Asn; 그리고 위치 194에서 Trp, Tyr, Phe, 또는 His를 포함한다. 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 다음 서열을 가질 수 있다: GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVX1WESX2GX3X4WX5X6X7KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVX8KSX9WQQGX10VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열 번호:577), 이때 X1은 E 또는 W이고; X2는 V, W, L, 또는 Y이고; X3은 L, P, F, T, 또는 H이고; X4는 P, V, 또는 E이고; X5는 A, S, V, 또는 G이고; X6은 L, H, Q, G, V, A N, D, T, 또는 E이고; X7은 T, F, Q, V, 또는 Y이고; X8은 L, S, E, A, 또는 P이고; X9는 E, D, T, 또는 N이고; 그리고 X10은 W, Y, H, 또는 F이다. 특정 구체예에서, 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 다음 서열을 포함할 수 있다: X1WESX2GX3X4WX5X6X7 (서열 번호:575), 이때 X1은 E 또는 W이고; X2는 V, W, L, 또는 Y이고; X3은 L, P, F, T, 또는 H이고; X4는 P, V, 또는 E이고; X5는 A, S, V, 또는 G이고; X6은 L, H, Q, G, V, A N, D, T, 또는 E이고; 그리고 X7은 T, F, Q, V, 또는 Y이다. 특정 구체예에서, 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 다음 서열을 포함할 수 있다: X1KSX2WQQGX3 (서열 번호:576), 이때 X8은 L, S, E, A, 또는 P이고; X9는 E, D, T, 또는 N이고; 그리고 X10은 W, Y, H, 또는 F이다.
일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 153에서 Glu 또는 Trp; 위치 157에서 Trp, Leu, 또는 Tyr; 위치 159에서 Thr 또는 His; 위치 160에서 Val; 위치 162에서 Ala, Ser, 또는 Val; 위치 163에서 Val, Asn, 또는 Thr; 위치 164에서 Gln 또는 Tyr; 위치 186에서 Pro; 위치 189에서 Thr 또는 Asn; 그리고 위치 194에서 Trp, Tyr, Phe, 또는 His를 포함하고, 이때 상기 치환 및 상기 위치는 서열 번호:9의 서열을 참고로 하여 결정된다. 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 다음 서열을 가질 수 있다: GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVX1WESX2GX3X4WX5X6X7KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVX8KSX9WQQGX10VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열 번호:580), 이때 X1은 E 또는 W이고; X2는 W, L, 또는 Y이고; X3은 T 또는 H이고; X4는 V이고; X5는 A, S, 또는 V이고; X6은 V, T, 또는 N이고; X7은 Y 또는 Q이고; X8은 P이고; X9는 T 또는 N이고; 그리고 X10은 W, Y, H, 또는 F이다. 특정 구체예에서, 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 다음 서열을 포함할 수 있다: X1WESX2GX3X4WX5X6X7 (서열 번호:578), 이때 X1은 E 또는 W이고; X2는 W, L, 또는 Y이고; X3은 T 또는 H이고; X4는 V이고; X5는 A, S, 또는 V이고; X6은 V, T, 또는 N이고; 그리고 X7은 Y 또는 Q이다. 특정 구체예에서, 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 다음 서열을 포함할 수 있다: X1KSX2WQQGX3 (서열 번호:579), 이때 X1은 P이고; X2는 T 또는 N이고; 그리고 X3은 W, Y, H, 또는 F이다.
일부 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 서열 번호:116-130중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 서열 번호:116-130중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하지만, 이때 1 또는 2개의 아미노산은 치환된다. 일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:116-130중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하지만, 이때 3개의 아미노산은 치환된다.
일부 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 서열 번호:131-139중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 서열 번호:131-139중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하지만, 이때 1 또는 2개의 아미노산은 치환된다. 일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:131-139중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하지만, 이때 3 또는 4개의 아미노산은 치환된다.
일부 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 서열 번호:303-339중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 서열 번호:303-339중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하지만, 이때 1 또는 2개의 아미노산은 치환된다. 일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:303-339중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하지만, 이때 3개의 아미노산은 치환된다.
일부 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 서열 번호:136, 138, 및 340-345중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 서열 번호:136, 138, 및 340-345중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하지만, 이때 1 또는 2개의 아미노산은 치환된다. 일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:136, 138, 및 340-345중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하지만, 이때 3 또는 4개의 아미노산은 치환된다.
추가 구체예에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 서열 번호:4-29, 236-299, 및 422-435중 임의의 하나의 아미노산 157-194, 아미노산 153-194, 또는 아미노산 153-199를 포함한다. 추가 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:4-29, 236-299 및 422-435중 임의의 하나의 아미노산 157-194에 대하여, 또는 서열 번호:4-29, 236-299, 및 422-435중 임의의 하나의 아미노산 153-194, 또는 아미노산 153-199에 대하여 최소한 75% 동일성, 최소한 80% 동일성, 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:4-29, 236-299, 및 422-435중 임의의 하나를 포함한다. 추가 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 아미노-말단 단부에서 첫 3개 아미노산 “PCP”없는, 서열 번호:4-29, 236-299, 및 422-435중 임의의 하나를 포함한다. 추가 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 아미노-말단 단부에서 첫 3개 아미노산 “PCP”없는 것으로 결정될 때, 서열 번호:4-29, 236-299, 및 422-435중 임의의 하나에 대하여 최소한 75% 동일성, 최소한 80% 동일성, 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다.
CH3 트란스페린 수용체 결합 세트 (ii): 118, 119, 120, 122, 210, 211, 212, 및 213
일부 구체예들에서, 본 발명에 따른 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 118, 119, 120, 122, 210, 211, 212, 및 213을 포함하는 아미노산 위치 세트(세트 ii)에서 최소한 3개 또는 최소한 4개, 그리고 전형적으로 5, 6, 7, 또는 8개 치환을 포함한다. 이들 위치에 도입될 수 있는 예시적인 치환이 표 5에 제시되어 있다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 위치 210에서 Gly; 위치 211에서 Phe; 및/또는 위치 213에서 Asp를 포함한다. 일부 구체예들에서, Glu는 위치 213에 존재한다. 특정 구체예에서, 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 다음의 위치에서 최소한 하나의 치환을 포함한다: 위치 118에서 Phe 또는 Ile; 위치 119에서 Asp, Glu, Gly, Ala, 또는 Lys; 위치 120에서 Tyr, Met, Leu, Ile, 또는 Asp; 위치 122에서 Thr 또는 Ala; 위치 210에서 Gly; 위치 211에서 Phe; 위치 212에서 His Tyr, Ser, 또는 Phe; 위치 213에서 또는 Asp. 일부 구체예들에서, 이 단락에서 명시된 바와 같이, 위치 118, 119, 120, 122, 210, 211, 212, 및 213중 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 모든 위치에서 치환을 갖는다. 일부 구체예들에서, 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 보존적 치환, 가령, 세트내 하나 또는 그 이상의 위치에서 명시된 아미노산의 동일한 하전 집단, 소수성 집단, 측쇄 고리 구조 집단 (가령, 방향족 아미노산), 또는 크기 집단, 및/또는 극성 또는 비-극성 집단의 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다.
일부 구체예들에서, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 서열 번호:30-46중 임의의 하나의 아미노산 114-220에 대하여 최소한 70% 동일성, 최소한 75% 동일성, 최소한 80% 동일성, 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는다. 일부 구체예들에서, 이러한 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 서열 번호:30-46중 임의의 하나의 아미노산 118-122 및/또는 아미노산 210-213을 포함한다.
일부 구체예들에서, 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 서열 번호:1의 아미노산 114-220에 대하여 최소한 70% 동일성, 최소한 75% 동일성, 최소한 80% 동일성, 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖고, 단서조항으로 상기 동일성 백분율에 위치 118, 119, 120, 122, 210, 211, 212, 및 213의 세트는 포함하지 않는다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 서열 번호:30-46중 임의의 하나에서 제시된 바와 같이, 아미노산 118-122 및/또는 아미노산 210-213을 포함한다.
일부 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 서열 번호:140-153중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 서열 번호:140-153중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하지만, 이때 1 또는 2개의 아미노산은 치환된다.
일부 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 서열 번호:154-157중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 서열 번호:154-157중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하지만, 이때 1개의 아미노산이 치환되거나, 또는 2개의 아미노산은 치환된다.
추가 구체예에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 서열 번호:30-46중 임의의 하나의 아미노산 118-213을 포함한다. 추가 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:30-46중 임의의 하나의 아미노산 118-213에 대하여 최소한 75% 동일성, 최소한 80% 동일성, 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:30-46중 임의의 하나를 포함한다. 추가 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 아미노-말단 단부에서 첫 3개 아미노산 “PCP”없는, 서열 번호:30-46중 임의의 하나를 포함한다. 추가 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:30-46중 임의의 하나에 대하여, 또는 아미노-말단 단부에서 첫 3개 아미노산 “PCP”없는 것으로 결정될 때, 서열 번호:30-46중 임의의 하나에 대하여 최소한 75% 동일성, 최소한 80% 동일성, 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다.
CH2 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드
일부 구체예들에서, 변형된 도메인은 인간 Ig CH2 도메인, 이를 테면 IgG CH2 도메인이다. CH3 도메인은 임의의 IgG 하위유형, 가령, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 하위유형이다. IgG 항체의 내용에서, CH2 도메인은 EU 번호매김 체계에 따라 번호부여될 때, 대략적 위치 231 내지 대략적 위치 340의 아미노산 세그먼트를 지칭한다. 트란스페린 수용체-결합을 위한 아미노산 위치의 대응하는 세트를 식별하기 위한 목적으로 CH2 도메인에서의 위치는 다른 언급이 없는 한, 서열 번호:2를 참고로 결정되거나, 또는 서열 번호:1의 아미노산 4-113을 참고로 결정된다. 치환 또한 서열 번호:1을 참고로 하여 결정되는데, 가령, 아미노산은 서열 번호:1에서 대응하는 위치에서 아미노산과 비교하여 치환인 것으로 간주된다. 서열 번호:1은 부분적 힌지 영역 서열, 아미노산 1-3, PCP를 포함한다. 이들 3개 잔기는 Fc 영역의 일부분은 아니지만; 그러나, 서열 번호:1의 서열을 참고로 하여, CH2 도메인에서 위치의 번호매김은 처음 3개 아미노산을 포함한다.
상기에서 나타낸 것과 같이, 본 발명에 따라 변형될 수 있는 CH2 도메인의 잔기 세트는 본원에서 서열 번호:1을 참고로 하여 번호매김된다. 임의의 CH2 도메인, 가령, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 CH2 도메인은 서열 번호:1에서 기재된 위치의 잔기에 대응하는 하나 또는 그 이상의 잔기 세트에서 변형, 가령, 아미노산 치환을 보유할 수 있다. 서열 번호:1의 인간 IgG1 아미노산 서열과 인간 IgG2, IgG3, 및 IgG4의 정렬은 도 38에 나타낸다. 서열 번호:1의 임의의 주어진 위치에 대응하는 IgG2, IgG3, 및 IgG4 서열 각각에서의 위치는 바로 결정될 수 있다.
한 구체예에서, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드는 트란스페린 수용체의 정점 도메인에 있는 에피토프에 결합한다. 인간 트란스페린 수용체 정점 도메인 서열은 서열 번호:107에서 제시되며, 인간 트란스페린 수용체-1 유니프로테인 서열 P02786의 아미노산 198-378에 대응한다. 상기 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드는 트란스페린이 이 수용체에 결합하는 것을 차단, 또는 그렇지 않으면 억제하지 않고, 트란스페린 수용체에 결합할 수 있다. 일부 구체예들에서, 트란스페린이 TfR에 결합하는 것은실질적으로 억제되지 않는다. 일부 구체예들에서, 트란스페린이 TfR에 결합하는 것은 약 50% 미만으로 (가령, 약 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 미만으로) 억제된다. 일부 구체예들에서, 트란스페린이 TfR에 결합하는 것은 약 20% 미만으로 (가령, 약 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1%미만으로) 억제된다.
CH2 트란스페린 수용체 결합 세트 (iii): 47, 49, 56, 58, 59, 60, 61, 62, 및 63
일부 구체예들에서, 본 발명에 따른 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드는 47, 49, 56, 58, 59, 60, 61, 62, 및 63을 포함하는 아미노산 위치 세트 (세트 iii)에서 최소한 3개 또는 최소한 4개, 그리고 전형적으로 5, 6, 7, 8, 또는 9개 치환을 포함한다. 이들 위치에 도입될 수 있는 예시적인 치환이 표 1에 제시되어 있다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드는 위치 60에 Glu 및/또는 위치 61에 Trp를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드는 다음의 위치에서 최소한 하나의 치환을 포함한다: 위치 47에서 Glu, Gly, Gln, Ser, Ala, Asn, Tyr, 또는 Trp; 위치 49에서 Ile, Val, Asp, Glu, Thr, Ala, 또는 Tyr; 위치 56에서 Asp, Pro, Met, Leu, Ala, Asn, 또는 Phe; 위치 58에서 Arg, Ser, Ala, 또는 Gly; 위치 59에서 Tyr, Trp, Arg, 또는 Val; 위치 60에서 Glu; 위치 61에서 Trp 또는 Tyr; 위치 62에서 Gln, Tyr, His, Ile, Phe, Val, 또는 Asp; 또는 위치 63에서 Leu, Trp, Arg, Asn, Tyr, 또는 Val. 일부 구체예들에서, 이 단락에서 명시된 바와 같이, 위치 47, 49, 56, 58, 59, 60, 61, 62, 및 63중 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개의 모든 위치에서 치환을 갖는다. 일부 구체예들에서, 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드는 보존적 치환, 가령, 세트내 하나 또는 그 이상의 위치에서 명시된 아미노산의 동일한 하전 집단, 소수성 집단, 측쇄 고리 구조 집단 (가령, 방향족 아미노산), 또는 크기 집단, 및/또는 극성 또는 비-극성 집단의 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드는 위치 47에서 Glu, Gly, Gln, Ser, Ala, Asn, 또는 Tyr; 위치 49에서 Ile, Val, Asp, Glu, Thr, Ala, 또는 Tyr; 위치 56에서 Asp, Pro, Met, Leu, Ala, 또는 Asn; 위치 58에서 Arg, Ser, 또는 Ala; 위치 59에서 Tyr, Trp, Arg, 또는 Val; 위치 60에서 Glu; 위치 61에서 Trp; 위치 62에서 Gln, Tyr, His, Ile, Phe, 또는 Val; 및/또는 위치 63에서 Leu, Trp, Arg, Asn, 또는 Tyr을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드는 위치 58에서 Arg; 위치 59에서 Tyr 또는 Trp; 위치 60에서 Glu; 위치 61에서 Trp; 및/또는 위치 63에서 Arg 또는 Trp를 포함한다.
일부 구체예들에서, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드는 서열 번호:47-62중 임의의 하나의 아미노산 4-113에 대하여 최소한 70% 동일성, 최소한 75% 동일성, 최소한 80% 동일성, 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는다. 일부 구체예들에서, 이러한 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드는 서열 번호:47-62중 임의의 하나의 아미노산 47-49 및/또는 아미노산 56-63을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본 발명의 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드는 서열 번호:1의 아미노산 4-113에 대하여 최소한 70% 동일성, 최소한 75% 동일성, 최소한 80% 동일성, 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖고, 단서조항으로 상기 동일성 백분율에 위치 47, 49, 56, 58, 59, 60, 61, 62, 및 63의 세트는 포함하지 않는다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드는 서열 번호:47-62중 임의의 하나에서 제시된 바와 같이, 아미노산 47-49 및/또는 아미노산 56-63을 포함한다.
일부 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 서열 번호:158-171중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 서열 번호:158-171중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하지만, 이때 1개의 아미노산이 치환된다.
일부 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 서열 번호:172-186중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 서열 번호:172-186중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하지만, 이때 1개의 아미노산이 치환되거나, 또는 2개의 아미노산은 치환된다. 다른 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 서열 번호:172-186중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하지만, 이때 3 또는 4개의 아미노산은 치환된다.
추가 구체예에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 서열 번호:47-62중 임의의 하나의 아미노산 47-63을 포함한다. 추가 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:47-62중 임의의 하나의 아미노산 47-63에 대하여 최소한 75% 동일성, 최소한 80% 동일성, 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:47-62중 임의의 하나를 포함한다. 추가 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 아미노-말단 단부에서 첫 3개 아미노산 “PCP”없는, 서열 번호:47-62중 임의의 하나를 포함한다. 추가 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:47-62중 임의의 하나에 대하여, 또는 아미노-말단 단부에서 첫 3개 아미노산 “PCP”없는 것으로 결정될 때, 서열 번호:47-62중 임의의 하나에 대하여 최소한 75% 동일성, 최소한 80% 동일성, 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다.
CH2 트란스페린 수용체 결합 세트 (iv): 39, 40, 41, 42, 43, 44, 68, 70, 71, 및 72
일부 구체예들에서, 본 발명에 따른 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드는 39, 40, 41, 42, 43, 44, 68, 70, 71, 및 72을 포함하는 아미노산 위치 세트(세트 iv)에서 최소한 3개 또는 최소한 4개, 그리고 전형적으로 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 치환을 포함한다. 이들 위치에 도입될 수 있는 예시적인 치환이 표 2에 제시되어 있다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드는 위치 43에 Pro, 위치 68에 Glu, 및/또는 위치 70에 Tyr를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드는 다음의 위치에서 최소한 하나의 치환을 포함한다: 위치 39에서 Pro, Phe, Ala, Met, 또는 Asp; 위치 40에서 Gln, Pro, Arg, Lys, Ala, Ile, Leu, Glu, Asp, 또는 Tyr; 위치 41에서 Thr, Ser, Gly, Met, Val, Phe, Trp, 또는 Leu; 위치 42에서 Pro, Val, Ala, Thr, 또는 Asp; 위치 43에서 Pro, Val, 또는 Phe; 위치 44에서 Trp, Gln, Thr, 또는 Glu; 위치 68에서 Glu, Val, Thr, Leu, 또는 Trp; 위치 70에서 Tyr, His, Val, 또는 Asp; 위치 71에서 Thr, His, Gln, Arg, Asn, 또는 Val; 또는 위치 72에서 Tyr, Asn, Asp, Ser, 또는 Pro. 일부 구체예들에서, 이 단락에서 명시된 바와 같이, 위치 39, 40, 41, 42, 43, 44, 68, 70, 71, 및 72중 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 모든 위치에서 치환을 갖는다. 일부 구체예들에서, 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드는 보존적 치환, 가령, 세트내 하나 또는 그 이상의 위치에서 명시된 아미노산의 동일한 하전 집단, 소수성 집단, 측쇄 고리 구조 집단 (가령, 방향족 아미노산), 또는 크기 집단, 및/또는 극성 또는 비-극성 집단의 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드는 위치 39에 Pro, Phe, 또는 Ala; 위치 40에 Gln, Pro, Arg, Lys, Ala, 또는 Ile; 위치 41에 Thr, Ser, Gly, Met, Val, Phe, 또는 Trp; 위치 42에 Pro, Val, 또는 Ala; 위치 43에 Pro; 위치 44에 Trp 또는 Gln; 위치 68에 Glu; 위치 70에 Tyr; 위치 71에 Thr, His, 또는 Gln; 및/또는 위치 72에 Tyr, Asn, Asp, 또는 Ser를 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드는 위치 39에 Met; 위치 40에 Leu 또는 Glu; 위치 41에 Trp; 위치 42에 Pro; 위치 43에 Val; 위치 44에 Thr; 위치 68에 Val 또는 Thr; 위치 70에 His; 위치 71에 His, Arg, 또는 Asn; 및/또는 위치 72에 Pro를 포함한다.
일부 구체예들에서, 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드는 위치 39에 Asp; 위치 40에 Asp; 위치 41에 Leu; 위치 42에 Thr; 위치 43에 Phe; 위치 44에 Gln; 위치 68에 Val 또는 Leu; 위치 70에 Val; 위치 71에 Thr; 및/또는 위치 72에 Pro를 포함한다.
일부 구체예들에서, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드는 서열 번호:63-85중 임의의 하나의 아미노산 4-113에 대하여 최소한 70% 동일성, 최소한 75% 동일성, 최소한 80% 동일성, 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는다. 일부 구체예들에서, 이러한 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드는 서열 번호:63-85중 임의의 하나의 아미노산 39-44 및/또는 아미노산 68-72를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본 발명의 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드는 서열 번호:1의 아미노산 4-113에 대하여 최소한 70% 동일성, 최소한 75% 동일성, 최소한 80% 동일성, 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖고, 단서조항으로 상기 동일성 백분율에 위치 39, 40, 41, 42, 43, 44, 68, 70, 71, 및 72의 세트는 포함하지 않는다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드는 서열 번호:63-85중 임의의 하나에서 제시된 바와 같이, 아미노산 39-44 및/또는 아미노산 68-72를 포함한다.
일부 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 서열 번호:187-204중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 서열 번호:187-204중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하지만, 이때 1 또는 2개의 아미노산은 치환된다. 다른 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 서열 번호:187-204중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하지만, 이때 3개의 아미노산은 치환된다.
일부 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 서열 번호:205-215중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 서열 번호:205-215중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하지만, 이때 1개의 아미노산이 치환되거나, 또는 2개의 아미노산은 치환된다.
추가 구체예에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 서열 번호:63-85중 임의의 하나의 아미노산 39-72를 포함한다. 추가 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:63-85중 임의의 하나의 아미노산 39-72에 대하여 최소한 75% 동일성, 최소한 80% 동일성, 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:63-85중 임의의 하나를 포함한다. 추가 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 아미노-말단 단부에서 첫 3개 아미노산 “PCP”없는, 서열 번호:63-85중 임의의 하나를 포함한다. 추가 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:63-85중 임의의 하나에 대하여, 또는 아미노-말단 단부에서 첫 3개 아미노산 “PCP” 없는 것으로 결정될 때, 서열 번호:63-85중 임의의 하나에 대하여 최소한 75% 동일성, 최소한 80% 동일성, 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다.
CH2 트란스페린 수용체 결합 세트 (v):41, 42, 43, 44, 45, 65, 66, 67, 69, 및 73
일부 구체예들에서, 본 발명에 따른 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드는 41, 42, 43, 44, 45, 65, 66, 67, 69, 및 73을 포함하는 아미노산 위치 세트 (세트 v)에서 최소한 3개 또는 최소한 4개, 그리고 전형적으로 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 치환을 포함한다. 이들 위치에 도입될 수 있는 예시적인 치환이 표 3에 제시되어 있다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드는 다음의 위치에서 최소한 하나의 치환을 포함한다: 위치 41에서 Val 또는 Asp; 위치 42에서 Pro, Met, 또는 Asp; 위치 43에서 Pro 또는 Trp; 위치 44에서 Arg, Trp, Glu, 또는 Thr; 위치 45에서 Met, Tyr, 또는 Trp; 위치 65에서 Leu 또는 Trp; 위치 66에서 Thr, Val, Ile, 또는 Lys; 위치 67에서 Ser, Lys, Ala, 또는 Leu; 위치 69에서 His, Leu, 또는 Pro; 또는 위치 73에서 Val 또는 Trp. 일부 구체예들에서, 이 단락에서 명시된 바와 같이, 위치 41, 42, 43, 44, 45, 65, 66, 67, 69, 및 73중 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 모든 위치에서 치환을 갖는다. 일부 구체예들에서, 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드는 보존적 치환, 가령, 세트내 하나 또는 그 이상의 위치에서 명시된 아미노산의 동일한 하전 집단, 소수성 집단, 측쇄 고리 구조 집단 (가령, 방향족 아미노산), 또는 크기 집단, 및/또는 극성 또는 비-극성 집단의 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드는 위치 41에 Val; 위치 42에 Pro; 위치 43에 Pro; 위치 44에 Arg 또는 Trp; 위치 45에 Met; 위치 65에 Leu; 위치 66에 Thr; 위치 67에 Ser; 위치 69에 His; 및/또는 위치 73에 Val을 포함한다.
일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드는 위치 41에 Asp; 위치 42에 Met 또는 Asp; 위치 43에 Trp; 위치 44에 Glu 또는 Thr; 위치 45에 Tyr 또는 Trp; 위치 65에 Trp; 위치 66에 Val, Ile, 또는 Lys; 위치 67에 Lys, Ala, 또는 Leu; 위치 69에 Leu 또는 Pro; 및/또는 위치 73에 Trp을 포함한다.
일부 구체예들에서, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드는 서열 번호:86-90중 임의의 하나의 아미노산 4-113에 대하여 최소한 70% 동일성, 최소한 75% 동일성, 최소한 80% 동일성, 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는다. 일부 구체예들에서, 이러한 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 서열 번호:86-90중 임의의 하나의 아미노산 41-45 및/또는 아미노산 65-73을 포함한다.
일부 구체예들에서, 본 발명의 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드는 서열 번호:1의 아미노산 4-113에 대하여 최소한 70% 동일성, 최소한 75% 동일성, 최소한 80% 동일성, 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖고, 단서조항으로 상기 동일성 백분율에 위치 41, 42, 43, 44, 45, 65, 66, 67, 69, 및 73의 세트는 포함하지 않는다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드는 서열 번호:86-90중 임의의 하나에서 제시된 바와 같이, 아미노산 41-45 및/또는 아미노산 65-73을 포함한다.
일부 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 서열 번호:216-220중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 서열 번호:216-220중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하지만, 이때 1 또는 2개의 아미노산은 치환된다.
일부 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 서열 번호:221-224중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 서열 번호:221-224중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하지만, 이때 1개의 아미노산이 치환되거나, 또는 2개의 아미노산은 치환된다. 다른 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 서열 번호:221-224중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하지만, 이때 3 또는 4개의 아미노산은 치환된다.
추가 구체예에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 서열 번호:86-90중 임의의 하나의 아미노산 41-73을 포함한다. 추가 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:86-90중 임의의 하나의 아미노산 41-73에 대하여 최소한 75% 동일성, 최소한 80% 동일성, 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:86-90중 임의의 하나를 포함한다. 추가 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 아미노-말단 단부에서 첫 3개 아미노산 “PCP”없는, 서열 번호:86-90중 임의의 하나를 포함한다. 추가 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:86-90중 임의의 하나에 대하여, 또는 아미노-말단 단부에서 첫 3개 아미노산 “PCP”없는 것으로 결정될 때, 서열 번호:86-90중 임의의 하나에 대하여 최소한 75% 동일성, 최소한 80% 동일성, 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다.
CH2 트란스페린 수용체 결합 세트 (vi):45, 47, 49, 95, 97, 99, 102, 103, 및 104
일부 구체예들에서, 본 발명에 따른 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드는 45, 47, 49, 95, 97, 99, 102, 103, 및 104를 포함하는 아미노산 위치 세트(세트 vi)에서 최소한 3개 또는 최소한 4개, 그리고 전형적으로 5, 6, 7, 8, 또는 9개 치환을 포함한다. 이들 위치에 도입될 수 있는 예시적인 치환이 표 4에 제시되어 있다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드는 위치 103에서 Trp를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드는 다음의 위치에서 최소한 하나의 치환을 포함한다: 위치 45에서 Trp, Val, Ile, 또는 Ala; 위치 47에서 Trp 또는 Gly; 위치 49에서 Tyr, Arg, 또는 Glu; 위치 95에서 Ser, Arg, 또는 Gln; 위치 97에서 Val, Ser, 또는 Phe; 위치 99에서 Ile, Ser, 또는 Trp; 위치 102에서 Trp, Thr, Ser, Arg, 또는 Asp; 위치 103에서 Trp; 또는 위치 104에서 Ser, Lys, Arg, 또는 Val. 일부 구체예들에서, 이 단락에서 명시된 바와 같이, 위치 45, 47, 49, 95, 97, 99, 102, 103, 및 104중 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개의 모든 위치에서 치환을 갖는다. 일부 구체예들에서, 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드는 보존적 치환, 가령, 세트내 하나 또는 그 이상의 위치에서 명시된 아미노산의 동일한 하전 집단, 소수성 집단, 측쇄 고리 구조 집단 (가령, 방향족 아미노산), 또는 크기 집단, 및/또는 극성 또는 비-극성 집단의 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드는 다음에서 선택된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개 위치를 포함한다: 위치 45는 Trp, Val, Ile, 또는 Ala이고; 위치 47은 Trp 또는 Gly이고; 위치 49는 Tyr, Arg, 또는 Glu이고; 위치 95는 Ser, Arg, 또는 Gln이고; 위치 97은 Val, Ser, 또는 Phe이고; 위치 99는 Ile, Ser, 또는 Trp이고; 위치 102는 Trp, Thr, Ser, Arg, 또는 Asp이고; 위치 103은 Trp이고; 그리고 위치 104는 Ser, Lys, Arg, 또는 Val이다.
일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드는 위치 45에 Val 또는 Ile; 위치 47에 Gly; 위치 49에 Arg; 위치95에 Arg; 위치 97에 Ser; 위치 99에 Ser; 위치 102에 Thr, Ser, 또는 Arg; 위치 103에 Trp; 및/또는 위치 104에 Lys 또는 Arg를 포함한다.
일부 구체예들에서, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드는 서열 번호:91-95중 임의의 하나의 아미노산 4-113에 대하여 최소한 70% 동일성, 최소한 75% 동일성, 최소한 80% 동일성, 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는다. 일부 구체예들에서, 이러한 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 서열 번호:91-95중 임의의 하나의 아미노산 45-49 및/또는 아미노산 95-104를 포함한다.
일부 구체예들에서, 본 발명의 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드는 서열 번호:1의 아미노산 4-113에 대하여 최소한 70% 동일성, 최소한 75% 동일성, 최소한 80% 동일성, 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖고, 단서조항으로 상기 동일성 백분율에 위치 45, 47, 49, 95, 97, 99, 102, 103, 및 104의 세트는 포함하지 않는다. 일부 구체예들에서, 상기 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드는 서열 번호:91-95중 임의의 하나에서 제시된 바와 같이, 아미노산 45-49 및/또는 아미노산 95-104를 포함한다.
일부 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 서열 번호:225-228중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 서열 번호:225-228중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하지만, 이때 1 또는 2개의 아미노산은 치환된다.
일부 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 서열 번호:229-233중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 서열 번호:229-233중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하지만, 이때 1개의 아미노산이 치환되거나, 또는 2개의 아미노산은 치환된다. 다른 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 서열 번호:229-233중 임의의 하나의 아미노산 서열을 포함하지만, 이때 3, 4 또는 5개의 아미노산은 치환된다.
추가 구체예에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 서열 번호:91-95중 임의의 하나의 아미노산 45-104를 포함한다. 추가 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:91-95중 임의의 하나의 아미노산 45-104에 대하여 최소한 75% 동일성, 최소한 80% 동일성, 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:91-95중 임의의 하나를 포함한다. 추가 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 아미노-말단 단부에서 첫 3개 아미노산 “PCP”없는, 서열 번호:91-95중 임의의 하나를 포함한다. 추가 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 서열 번호:91-95중 임의의 하나에 대하여, 또는 아미노-말단 단부에서 첫 3개 아미노산 “PCP”없는 것으로 결정될 때, 서열 번호:91-95중 임의의 하나에 대하여 최소한 75% 동일성, 최소한 80% 동일성, 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다.
예시적인 변형된 CH3 또는 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드
본 발명의 변형된 CH3 또는 CH2 도메인 폴리펩티드는 Fc 영역의 또다른 도메인에 연결될 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드는 전형적으로 CH2 도메인의 C-말단 단부에서 CH2 도메인에 연결되며, 이때 자연 발생적 CH2 도메인 또는 변이체 CH2 도메인일 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드는 전형적으로 CH3 도메인의 N-말단 단부에서 CH3 도메인에 연결되며, 이때 자연 발생적 CH3 도메인 또는 변이체 CH3 도메인일 수 있다. 일부 구체예들에서, CH3 도메인에 연결된 변형된 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드, 또는 CH2 도메인에 연결된 변형된 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 항체의 부분적 또는 전체 힌지 영역을 더 포함하고, 따라서 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드 또는 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드는 부분적 또는 전체 힌지 영역을 갖는 Fc 영역의 일부가 되는 형태로 된다. 상기 힌지 영역은 임의의 면역글로블린 하위부류 또는 동소체의 것일 수 있다. 예시적인 면역글로블린 힌지은 IgG 힌지 영역, 이를 테면 IgG1 힌지 영역, 가령, 인간 IgG1 힌지 아미노산 서열 EPKSCDKTHTCPPCP (서열 번호:234)이다. 추가 구체예들에서, 힌지 또는 부분적 힌지 영역을 보유하는 Fc 형식에 있을 수 있는 폴리펩티드는 또다른 모이어티, 예를 들면, Fab 단편에 더 연결되고, 따라서 트란스페린 수용체-결합 Fc-Fab 융합이 생성된다. 일부 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 Fc-Fab 융합은 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드 또는 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드, 힌지 영역, 및 Fab 단편을 포함한다. 상기 Fab 단편은 관심 표적, 가령, 치료 신경학적 표적으로 전달될 수 있으며, 이때 상기 Fab은 상기 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드 또는 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드가 트란스페린 수용체에 결합함으로써 매개되는 혈액-뇌-장벽을 가로지러는 트랜스사이토시스에 의해 이 표적으로 전달된다.
일부 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드에 연결된 Fab 단편은 Tau 단백질 (가령, 인간 Tau 단백질) 또는 이의 단편에 결합할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 Fab 단편은 인산화된 Tau 단백질, 인산화안된 Tau 단백질, Tau 단백질의 접합 동소체, N-말단 절두된 Tau 단백질, C-말단 절두된 Tau 단백질, 및/또는 이의 단편에 결합할 수 있다.
일부 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드에 연결된 Fab 단편은 베타-세크레타제 1 (BACE1) 단백질 (가령, 인간 BACE1 단백질) 또는 이의 단편에 결합할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 Fab 단편은 BACE1 단백질 또는 이의 단편의 하나 또는 그 이상의 접목(splice) 동소체에 결합할 수 있다.
일부 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드에 연결된 Fab 단편은 골수 세포 2 (TREM2) 단백질 (가령, 인간 TREM2 단백질) 상에서 발현되는 촉발 수용체 또는 이의 단편에 결합할 수 있다.
일부 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드에 연결된 Fab 단편은 알파-시누크레인 단백질 (가령, 인간 알파-시누크레인 단백질) 또는 이의 단편에 결합할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 Fab 단편은 단량체 알파-시누크레인, 올리고머 알파-시누크레인, 알파-시누크레인 원섬유, 가용성 알파-시누크레인, 및/또는 이의 단편에 결합할 수 있다.
일부 구체예들에서, 본 발명의 변형된 CH2 또는 CH3 도메인 폴리펩티드를 포함하는 Fc-Fab 융합은 이량체의 하위단위(subunit)다. 일부 구체예들에서, 상기 이량체는 이형이량체(heterodimer)이다. 일부 구체예들에서, 상기 이량체는 동형이량체(homodimer)이다. 일부 구체예들에서, 상기 이량체는 트란스페린 수용체에 결합하는 단일 폴리펩티드, 가령, 트란스페린 수용체 결합에 대하여 단가(monovalent)이다. 일부 구체예들에서, 상기 이량체는 트란스페린 수용체에 결합하는 제2 폴리펩티드를 포함한다. 상기 제2 폴리펩티드는 이가 결합 동형이량체를 제공하기 위하여 Fc-Fab 융합에 존재하는 동일한 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드 (또는 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드)를 포함할 수 있거나, 또는 본 발명의 제2 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드 (또는 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드)는 제2 트란스페린 수용체 결합 부위를 제공할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 이량체는 변형된 CH3 도메인 폴리펩티드 또는 변형된 CH2 도메인 폴리펩티드를 포함하는 제1 하위단위, 그리고 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 제2 하위단위를 포함하며, 이때 이것들중 어느 것도 트란스페린 수용체에 결합하지 않는다.
트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 Fab이외의 상이한 관심 폴리펩티드에 또한 융합될 수 있다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 상이한 폴리펩티드에 융합될 수 있는데, 이때 이 상이한 폴리펩티드는 트란스페린 수용체-발현시키는 세포로 표적화시키는 것이 바람직하거나, 또는 트란스사이토시스에 의해 내피, 가령, 혈액-뇌-장벽을 가로질러 운반되는 것이 바람직하다. 일부 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 가용성 단백질, 가령, 수용체 또는 성장 인자의 세포외 도메인 수용체, 사이토킨, 또는 효소에 융합된다.
여전히 또다른 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 단백질 정제에 이용되는 펩티드 또는 단백질, 가령, 폴리히스티딘, 에피토프 테그, 가령, FLAG, c-Myc, 헤마글루티닌 테그 및 이와 유사한 것들, 글루타티온 S 전이효소 (GST), 티오레독신, 단백질 A, 단백질 G, 또는 말토즈 결합 단백질 (MBP)에 융합될 수 있다. 일부 경우에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드에 융합된 펩티드 또는 단백질은 프로테아제 절단 부위, 이를 테면, 인자(Factor) Xa 또는 트롬빈에 대한 절단 부위를 포함할 수 있다.
본 발명의 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 가령, 상기 폴리펩티드의 형식에 기초하여, 광역의 결합 친화력을 보유할 수 있다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, 변형된 CH3 도메인 또는 변형된 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 트란스페린 수용체 결합에 대하여 1 pM 내지 10μM 중 임의의 범위의 친화력을 갖는다. 일부 구체예들에서, 친화력은 단가 형식(monovalent format)으로 측정될 수 있다. 다른 구체예들에서, 친화력은 이가 형식(bivalent format), 가령, 폴리펩티드-Fab 융합 단백질을 포함하는 이량체로써, 측정될 수 있다.
결합 친화력, 결합 역학, 및 교차-반응성을 분석하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 이들 방법은 다음을 포함하나, 이에 국한되지 않는다: 고형-상 결합 검증 (가령, ELISA 검증), 면역침전, 표면 플라스몬 공명 (가령, Biacore™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ)), 역학적 배제 검증 (가령, KinExA®), 유동세포분석, 형광-활성화된 세포 소팅 (FACS), BioLayer 간섭측정 (가령, Octet® (
, Inc., Menlo Park, CA)), 및 웨스턴 블랏 분석. 일부 구체예들에서, ELISA를 이용하여 결합 친화력 및/또는 교차-반응성이 결정된다. ELISA 검증을 수행하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 또한 하기 실시예 부분에 기재되어 있다. 일부 구체예들에서, 표면 플라스몬 공명 (SPR)을 이용하여 결합 친화력, 결합 역학, 및/또는 교차-반응성이 결정된다. 일부 구체예들에서, 역학적 배제 검증을 이용하여 결합 친화력, 결합 역학, 및/또는 교차-반응성이 결정된다. 일부 구체예들에서, BioLayer 간섭측정 검증을 이용하여 결합 친화력, 결합 역학, 및/또는 교차-반응성이 결정된다.
변형된 CH3 또는 CH2 도메인 폴리펩티드를 포함하는 Fc 영역에 추가 돌연변이
트란스페린 수용체에 결합하고, BBB를 가로질러 운반을 개시하도록 변형된 본원에서 제공되는 폴리펩티드는 가령, 혈청 안정성을 증가시키기 위하여, 작동체(effector) 기능을 조절하기 위하여, 당화에 영향을 주기 위하여, 인간에게서 면역원성을 감소시키기 위하여, 및/또는 상기 폴리펩티드의 노브 및 홀 이형이량체화를 제공하기 위한, 추가 돌연변이를 또한 포함할 수 있다.
일부 구체예들에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 대응하는 야생형 Fc 영역 (가령, 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 Fc 영역)에 대하여 최소한 약 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 아미노산 서열 동일성을 갖는다
본 발명에 따른 폴리펩티드는 가령, 당화에 영향을 주기 위하여, 혈청 반감기를 증가시키기 위하여, 또는 CH3 도메인의 경우, 이 변형된 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 노브 및 홀 이형이량체화를 제공하기 위하여, 특정 아미노산 세트 밖에 도입된 추가 돌연변이를 또한 가질 수 있다. 일반적으로, 상기 방법은 제1 폴리펩티드의 경계면에서 돌기("노브(knob)")와 제2 폴리펩티드의 경계면에서 상응하는 구멍("홀(hole)")을 도입시키고, 상기 돌기가 상기 구멍 안에 위치함으로써 이형이량체 형성을 촉진시키고, 동형이량체 형성을 방해한다. 돌기(Protuberances)는 제 1 폴리펩티드의 경계면의 작은 아미노산 측쇄를 더 큰 측쇄 (가령, 티로신 또는 트립토판)로 대체함으로써 구축된다. 상기 돌기에 동일한 또는 더 작은 크기의 상보적 구멍(cavities)은 제 2 폴리펩티드의 경계면에서 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 측쇄 (가령, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 만든다. 이러한 추가 돌연변이는 변형된 CH3 또는 CH2 도메인이 트란스페린 수용체에 결합함에 있어서 부정적인 영향을 주지 않는 이 폴리펩티드의 위치에 존재한다.
이량체화를 위한 노브 및 홀 접근법의 한 가지 예시적인 구체예에서, 이량체화되는 제1 Fc 폴리펩티드 하위단위의 서열 번호:1의 위치 139에 대응하는 위치는 고유의 트레오닌을 대신하여 트립토판을 보유하고, 상기 이량체의 Fc 폴리펩티드의 제2 하위단위는 서열 번호:1의 위치 180에 대응하는 위치에서 고유의 티로신을 대신하여 발린을 갖는다. Fc 폴리펩티드의 제2 하위단위는 치환을 더 포함할 수 있는데, 이때 서열 번호:1의 위치 139에 대응하는 위치의 고유의 트레오닌은 세린으로 치환되며, 서열 번호:1의 위치 141에 대응하는 위치에서 고유의 류신은 알라닌으로 치환된다.
본원에서 기술된 폴리펩티드는 이종이량체화를 위한 다른 변형, 예를 들어, 자연적으로 하전된 또는 소수성 패치 변형인 CH3-CH3 계면 내의 접촉 잔기의 정전기 공학을 포함하도록 조작될 수 있다.
일부 구체예들에서, 혈청 반감기를 강화시키기 위한 변형이 도입될 수 있다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, Fc 영역은 서열 번호:1의 위치 25에 대응하는 위치에 Tyr, 서열 번호:1의 27에 대응하는 위치에 Thr, 그리고 서열 번호:1의 위치 29에 대응하는 위치에 Glu을 포함하는 CH2 도메인을 포함한다.
일부 구체예들에서, 돌연변이, 가령, 치환은 서열 번호:1을 참고로 결정될 때, 위치 17-30, 52-57, 80-90, 156-163, 및 201-208 중 하나 또는 그 이상 위치에 도입된다. 일부 구체예들에서, 하나 또는 그 이상의 돌연변이는 서열 번호:1을 참고로 결정될 때, 위치 24, 25, 27, 28, 29, 80, 81, 82, 84, 85, 87, 158, 159, 160, 162, 201, 206, 207, 또는 209에 도입된다. 일부 구체예들에서, 돌연변이는 서열 번호:1을 참고로 결정될 때, 위치 25, 27, 및 29중 1, 2 또는 3개의 위치로 도입된다. 일부 구체예들에서, 상기 돌연변이는 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E이다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 폴리펩티드는 돌연변이 M25Y, S27T, 및 T29E를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 돌연변이는 서열 번호:1을 참고로 결정될 때, 위치 201 및 207중 1 또는 2개의 위치로 도입된다. 일부 구체예들에서, 상기 돌연변이는 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L 및 N207S이다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 폴리펩티드는 돌연변이 M201L와 함께, 또는 없이 N207S를 더 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 폴리펩티드는 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 위치 T80, E153, 및 N207중 1, 2 또는 3개 모든 위치에서 치환을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 돌연변이는 T80Q 및 N207A이다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 폴리펩티드는 돌연변이 T80A, E153A, 및 N207A를 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 폴리펩티드는 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 치환 위치 T23 및 M201을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 폴리펩티드는 돌연변이 T23Q 및 M201L을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 폴리펩티드는 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 위치 M201 및 N207에서 치환을 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 폴리펩티드는 치환 M201L 및 N207S를 포함한다. 일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 폴리펩티드는 N207S 또는 N207A 치환을 포함한다.
Fc 작동체 기능
일부 구체예들에서, 변형된 CH2 또는 CH3 도메인을 포함하는 Fc 영역은 작동체 기능을 갖는데, 가령, 작동체 기능을 중재하는 작동체 세포 상에서 발현되는 Fc 수용체에 결합시, 특정 생물학적 기능을 유도하는 능력이 감소될 수 있다. 작동체 세포는 단핵구, 대식세포, 호중구, 수지상 세포, 호산구, 비만 세포, 혈소판, B 세포, 거대 과립 림프구, 랑게르한스 세포, 자연 킬러 (NK) 세포 및 세포 독성 T 세포를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
항체 작동체 기능의 예로는 C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성 (CDC), Fc 수용체 결합, 항체-의존적 세포-매개된 세포독성 (ADCC), 항체-의존적 세포-매개된 식작용 (ADCP), 세포 표면 수용체 (가령, B 세포 수용체)의 하향-조절, 및 B-세포 활성화를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 작동체 기능은 상기 항체 부류에 따라 가변적일 수 있다. 예를 들면, 고유의 인간 IgG1 및 IgG3 항체는 면역 시스템 세포 상에 존재하는 적절한 Fc 수용체에 결합시 ADCC 및 CDC 활성을 유도할 수 있고; 그리고 고유의 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4는 면역 세포에 존재하는 적절한 Fc 수용체에 결합시 ADCP 기능을 유도할 수 있다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 폴리펩티드는 작동체 기능을 감소시키는 추가 변형을 포함할 수 있다. 대안으로, 일부 구체예들에서, 본 발명의 변형된 CH2 또는 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 작동체 기능을 강화시키는 추가 변형을 포함할 수 있다.
작동체 기능을 조절하는 예시적인 Fc 폴리펩티드 돌연변이는 CH2 도메인에서, 가령, 서열 번호:1의 위치 7과 8에 대응하는 위치에 치환을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 일부 구체예들에서, 변형된 CH2 도메인에서 치환은 서열 번호:1의 위치 7과 8에 Ala을 포함한다. 일부 구체예들에서, 변형된 CH2 도메인에서 치환은 서열 번호:1의 위치 7과 8에 Ala을, 그리고 위치 102에 Gly를 포함한다.
작동체 기능을 조절시키는 추가 Fc 폴리펩티드 돌연변이는 EU 번호매김 체계에 따라, 위치 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329에서 하나 또는 그 이상의 치환을 포함하나, 이에 국한되지 않는다(EU 번호매김 체계, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 위치 11, 38, 42, 43, 70, 100, 및 102에 대응함). 예시적인 치환 (EU 번호매김 체계에 따라 번호매김될 때)은 다음을 포함한다: 위치 329는 프롤린이 글리신 또는 아르기닌으로 치환되거나, 또는 상기 Fc의 프롤린 329와 Fcγ RIII의 트립토판 잔기 Trp 87와 Trp 110 사이에 형성되는 상기 Fc/Fcγ 수용체 경계면을 파괴시키는데 충분한 크기의 아미노산 잔기로 치환된 돌연변이를 보유할 수 있다. 추가 예시적인 치환은 S228P, E233P, L235E, N297A, N297D, 및 P331S를 포함한다. 다중 치환은 인간 IgG1 Fc 영역의 L234A 및 L235A; 인간 IgG1 Fc 영역의 L234A, L235A, 및 P329G; 인간 IgG4 Fc 영역의 S228P 및 L235E; 인간 IgG1 Fc 영역의 L234A 및 G237A; 인간 IgG1 Fc 영역의 L234A, L235A, 및 G237A; 인간 IgG2 Fc 영역의 V234A 및 G237A; 인간 IgG4 Fc 영역의 L235A, G237A, 및 E318A; 그리고 인간 IgG4 Fc 영역의 S228P 및 L236E에 또한 존재할 수도 있다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 폴리펩티드는 EU 번호매김 체계에 따라, 가령, Fc 영역의 위치 298, 333, 및/또는 334에서 ADCC를 조절하는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환을 보유할 수 있다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 폴리펩티드는 ADCC를 감소 또는 증가시키는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환을 갖거나, 또는 C1q 결합 및/또는 CDC를 변경시키는 돌연변이를 가질 수 있다.
추가 돌연변이를 포함하는 예시적인 폴리펩티드
본원에서 기술된 폴리펩티드 (가령, 클론 CH3C.35.20.1, CH3C.35.23.2, CH3C.35.23.3, CH3C.35.23.4, CH3C.35.21.17.2, CH3C.35.23, CH3C.35.21, CH3C.35.20.1.1, CH3C.23.2.1, 및 CH3C.35.23.1.1중 임의의 하나)는 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 및/또는 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, (i) 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E, 또는 (ii) 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S)를 포함하는 추가 돌연변이를 포함할 수 있다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 폴리펩티드 (가령, 클론 CH3C.35.20.1, CH3C.35.23.2, CH3C.35.23.3, CH3C.35.23.4, CH3C.35.21.17.2, CH3C.35.23, CH3C.35.21, CH3C.35.20.1.1, CH3C.23.2.1, 및 CH3C.35.23.1.1중 임의의 하나)는 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W)를 보유할 수 있고, 서열 번호:4-95, 236-299, 및 422-435중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 서열 번호:4-95, 236-299, 및 422-435 중 임의의 하나의 서열을 갖는 폴리펩티드는 노브 돌연변이를 보유하기 위하여 변형될 수 있다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 폴리펩티드 (가령, 클론 CH3C.35.20.1, CH3C.35.23.2, CH3C.35.23.3, CH3C.35.23.4, CH3C.35.21.17.2, CH3C.35.23, CH3C.35.21, CH3C.35.20.1.1, CH3C.23.2.1, 및 CH3C.35.23.1.1중 임의의 하나)는 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A))를 갖고, 그리고 서열 번호:4-95, 236-299, 및 422-435중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 서열 번호:4-95, 236-299, 및 422-435 중 임의의 하나의 서열을 갖는 폴리펩티드는 노브 돌연변이 및 작동체 기능을 조절하는 돌연변이를 보유하기 위하여 변형될 수 있다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 폴리펩티드 (가령, 클론 CH3C.35.20.1, CH3C.35.23.2, CH3C.35.23.3, CH3C.35.23.4, CH3C.35.21.17.2, CH3C.35.23, CH3C.35.21, CH3C.35.20.1.1, CH3C.23.2.1, 및 CH3C.35.23.1.1중 임의의 하나) 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, (i) 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E 또는 (ii) 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S)를 갖고, 그리고 서열 번호:4-95, 236-299, 및 422-435중 임의의 하나에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 서열 번호:4-95, 236-299, 및 422-435중 임의의 하나의 서열을 갖는 폴리펩티드는 노브 돌연변이 및 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖도록 변형될 수 있다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 폴리펩티드 (가령, 클론 CH3C.35.20.1, CH3C.35.23.2, CH3C.35.23.3, CH3C.35.23.4, CH3C.35.21.17.2, CH3C.35.23, CH3C.35.21, CH3C.35.20.1.1, CH3C.23.2.1, 및 CH3C.35.23.1.1중 임의의 하나)는 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, (i) 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E, 또는 (ii) 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S)를 가질 수 있고, 그리고 서열 번호:4-95, 236-299, 및 422-435중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 서열 번호:4-95, 236-299, 및 422-435중 임의의 하나의 서열을 갖는 폴리펩티드는 노브 돌연변이, 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 그리고 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖도록 변형될 수 있다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 폴리펩티드 (가령, 클론 CH3C.35.20.1, CH3C.35.23.2, CH3C.35.23.3, CH3C.35.23.4, CH3C.35.21.17.2, CH3C.35.23, CH3C.35.21, CH3C.35.20.1.1, CH3C.23.2.1, 및 CH3C.35.23.1.1중 임의의 하나)는 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V)를 가질 수 있고, 그리고 서열 번호:4-95, 236-299, 및 422-435중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 서열 번호:4-95, 236-299, 및 422-435 중임의의 하나의 서열을 갖는 폴리펩티드는 홀 돌연변이를 보유하기 위하여 변형될 수 있다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 폴리펩티드 (가령, 클론 CH3C.35.20.1, CH3C.35.23.2, CH3C.35.23.3, CH3C.35.23.4, CH3C.35.21.17.2, CH3C.35.23, CH3C.35.21, CH3C.35.20.1.1, CH3C.23.2.1, 및 CH3C.35.23.1.1중 임의의 하나)는 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A))를 가질 수 있고, 그리고 서열 번호:4-95, 236-299, 및 422-435중 임의의 하나에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 서열 번호:4-95, 236-299, 및 422-435 중임의의 하나의 서열을 갖는 폴리펩티드는 홀 돌연변이 및 작동체 기능을 조절하는 돌연변이를 보유하기 위하여 변형될 수 있다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 폴리펩티드 (가령, 클론 CH3C.35.20.1, CH3C.35.23.2, CH3C.35.23.3, CH3C.35.23.4, CH3C.35.21.17.2, CH3C.35.23, CH3C.35.21, CH3C.35.20.1.1, CH3C.23.2.1, 및 CH3C.35.23.1.1중 임의의 하나)는 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, (i) 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E, 또는 (ii) 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S)를 가질 수 있고, 그리고 서열 번호:4-95, 236-299, 및 422-435중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 서열 번호:4-95, 236-299, 및 422-435중 임의의 하나의 서열을 갖는 폴리펩티드는 홀 돌연변이 및 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖도록 변형될 수 있다.
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 폴리펩티드 (가령, 클론 CH3C.35.20.1, CH3C.35.23.2, CH3C.35.23.3, CH3C.35.23.4, CH3C.35.21.17.2, CH3C.35.23, CH3C.35.21, CH3C.35.20.1.1, CH3C.23.2.1, 및 CH3C.35.23.1.1중 임의의 하나)는 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, (i) 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E, 또는 (ii) 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S)를 가질 수 있고, 그리고 서열 번호:4-95, 236-299, 및 422-435중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 서열 번호:4-95, 236-299, 및 422-435중 임의의 하나의 서열을 갖는 폴리펩티드는 홀 돌연변이, 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 및 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖도록 변형될 수 있다.
클론 CH3C.35.20.1
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.20.1은 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W)와서열 번호:349의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.20.1은 서열 번호:349의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.20.1은 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 그리고 서열 번호:350 또는 351의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이 및 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.20.1은 서열 번호:350 또는 351의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.20.1은 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E), 그리고 서열 번호:352의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.20.1은 서열 번호:352의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.20.1은 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S), 그리고 서열 번호:485의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.20.1은 서열 번호:485의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.20.1은 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E), 그리고 서열 번호:353 또는 354의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.20.1은 서열 번호:353 또는 354의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.20.1은 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S), 그리고 서열 번호:486 또는 487의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.20.1은 서열 번호:486 또는 487의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.20.1은 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 그리고 서열 번호:355의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.20.1은 서열 번호:355의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.20.1은 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 그리고 서열 번호:356 또는 357의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이 및 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.20.1은 서열 번호:356 또는 357의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.20.1은 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E), 그리고 서열 번호:358의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.20.1은 서열 번호:358의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.20.1은 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S), 그리고 서열 번호: 488의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.20.1은 서열 번호:488의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.20.1은 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E), 그리고 서열 번호:359 또는 360의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.20.1은 서열 번호:359 또는 360의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.20.1은 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S), 그리고 서열 번호:489 또는 490의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.20.1은 서열 번호:489 또는 490의 서열을 갖는다.
클론 CH3C.35.23.2
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.2는 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W)와 서열 번호:361의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.2는 서열 번호:361의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.2는 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 그리고 서열 번호:362 또는 363의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이 및 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.2는 서열 번호:362 또는 363의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.2는 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E), 그리고 서열 번호:364의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.2는 서열 번호:364의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.2는 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S), 그리고 서열 번호:492의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.2는 서열 번호:492의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.2는 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E), 그리고 서열 번호:365 또는 366의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.2는 서열 번호:365 또는 366의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.2는 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S), 그리고 서열 번호:493 또는 494의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.2는 서열 번호:493 또는 494의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.2는 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 그리고 서열 번호:367의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.2는 서열 번호:367의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.2는 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 그리고 서열 번호:368 또는 369의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이 및 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.2는 서열 번호:368 또는 369의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.2는 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E), 그리고 서열 번호:370의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.2는 서열 번호:370의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.2는 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S), 그리고 서열 번호:495의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.2는 서열 번호:495의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.2는 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E), 그리고 서열 번호:371 또는 372의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.2는 서열 번호:371 또는 372의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.2는 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S), 그리고 서열 번호:496 또는 497의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.2는 서열 번호:496 또는 497의 서열을 갖는다.
클론 CH3C.35.23.3
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.3은 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W)와 서열 번호:373의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.3은 서열 번호:373의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.3은 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 그리고 서열 번호:374 또는 375의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이 및 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.3은 서열 번호:374 또는 375의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.3은 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E), 그리고 서열 번호:376의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.3은 서열 번호:376의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.3은 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S), 그리고 서열 번호:499의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.3은 서열 번호:499의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.3은 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E), 그리고 서열 번호:377 또는 378의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.3은 서열 번호:377 또는 378의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.3은 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S), 그리고 서열 번호:500 또는 501의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.3은 서열 번호:500 또는 501의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.3은 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 그리고 서열 번호:379의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.3은 서열 번호:379의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.3은 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 그리고 서열 번호:380 또는 381의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이 및 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.3은 서열 번호:380 또는 381의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.3은 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E), 그리고 서열 번호:382의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.3은 서열 번호:382의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.3은 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S), 그리고 서열 번호:502의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.3은 서열 번호:502의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.3은 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E), 그리고 서열 번호:383 또는 384의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.3은 서열 번호:383 또는 384의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.3은 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S), 그리고 서열 번호:503 또는 504의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.3은 서열 번호:503 또는 504의 서열을 갖는다.
클론 CH3C.35.23.4
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.4는 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W)와 서열 번호:385의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.4는 서열 번호:385의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.4는 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 그리고 서열 번호:386 또는 387의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이 및 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.4는 서열 번호:386 또는 387의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.4는 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E), 그리고 서열 번호:388의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.4는 서열 번호:388의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.4는 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S), 그리고 서열 번호:506의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.4는 서열 번호:506의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.4는 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E), 그리고 서열 번호:389 또는 390의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.4는 서열 번호:389 또는 390의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.4는 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S), 그리고 서열 번호:507 또는 508의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.4는 서열 번호:507 또는 508의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.4는 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 그리고 서열 번호:391의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.4는 서열 번호:391의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.4는 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 그리고 서열 번호:392 또는 393의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이 및 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.4는 서열 번호:392 또는 393의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.4는 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E), 그리고 서열 번호:394의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.4는 서열 번호:394의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.4는 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S), 그리고 서열 번호:509의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.4는 서열 번호:509의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.4는 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E), 그리고 서열 번호:395 또는 396의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.4는 서열 번호:395 또는 396의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.4는 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S), 그리고 서열 번호:510 또는 511의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.4는 서열 번호:510 또는 511의 서열을 갖는다.
클론 CH3C.35.21.17.2
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.21.17.2는 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W)와 서열 번호:397의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.21.17.2는 서열 번호:397의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.21.17.2는 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 그리고 서열 번호:398 또는 399의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이 및 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.21.17.2는 서열 번호:398 또는 399의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.21.17.2는 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E), 그리고 서열 번호:400의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.21.17.2는 서열 번호:400의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.21.17.2는 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S), 그리고 서열 번호:513의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.21.17.2는 서열 번호:513의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.21.17.2는 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E), 그리고 서열 번호:401 또는 402의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.21.17.2는 서열 번호:401 또는 402의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.21.17.2는 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S), 그리고 서열 번호:514 또는 515의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.21.17.2는 서열 번호:514 또는 515의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.21.17.2는 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 그리고 서열 번호:403의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.21.17.2는 서열 번호:403의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.21.17.2는 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 그리고 서열 번호:404 또는 405의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이 및 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.21.17.2는 서열 번호:404 또는 405의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.21.17.2는 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E), 그리고 서열 번호:406의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.21.17.2는 서열 번호:406의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.21.17.2는 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S), 그리고 서열 번호:516의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.21.17.2는 서열 번호:516의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.21.17.2는 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E), 그리고 서열 번호:407 또는 408의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.21.17.2는 서열 번호:407 또는 408의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.21.17.2는 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S), 그리고 서열 번호:517 또는 518의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.21.17.2는 서열 번호:517 또는 518의 서열을 갖는다.
클론 CH3C.35.23
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23은 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W)와 서열 번호:409의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23은 서열 번호:409의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23은 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 그리고 서열 번호:410 또는 411의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이 및 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23은 서열 번호:410 또는 411의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23은 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E), 그리고 서열 번호:412의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23은 서열 번호:412의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23은 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S), 그리고 서열 번호:520의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23은 서열 번호:520의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23은 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E), 그리고 서열 번호:413 또는 414의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23은 서열 번호:413 또는 414의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23은 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S), 그리고 서열 번호:521 또는 522의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23은 서열 번호:521 또는 522의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23은 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 그리고 서열 번호:415의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23은 서열 번호:415의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23은 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 그리고 서열 번호:416 또는 417의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이 및 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23은 서열 번호:416 또는 417의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23은 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E), 그리고 서열 번호:418의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23은 서열 번호:418의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23은 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S), 그리고 서열 번호:523의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23은 서열 번호:523의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23은 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E), 그리고 서열 번호:419 또는 420의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23은 서열 번호:419 또는 420의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23은 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S), 그리고 서열 번호:524 또는 525의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23은 서열 번호:524 또는 525의 서열을 갖는다.
클론 CH3C.35.21
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.21은 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W)와 서열 번호:436의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.21은 서열 번호:436의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.21은 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 그리고 서열 번호: 437 또는 438의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이 및 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.21은 서열 번호:437 또는 438의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.21은 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E), 그리고 서열 번호:439의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.21은 서열 번호:439의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.21은 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S), 그리고 서열 번호:527의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.21은 서열 번호:527의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.21은 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E), 그리고 서열 번호:440 또는 441의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.21은 서열 번호:440 또는 441의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.21은 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S), 그리고 서열 번호:528 또는 529의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.21은 서열 번호:528 또는 529의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.21은 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 그리고 서열 번호:442의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.21은 서열 번호:442의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.21은 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 그리고 서열 번호:443 또는 444의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이 및 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.21은 서열 번호:443 또는 444의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.21은 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E), 그리고 서열 번호:445의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.21은 서열 번호:445의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.21은 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S), 그리고 서열 번호:530의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.21은 서열 번호:530의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.21은 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E), 그리고 서열 번호:446 또는 447의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.21은 서열 번호:446 또는 447의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.21은 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S), 그리고 서열 번호:531 또는 532의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.21은 서열 번호:531 또는 532의 서열을 갖는다.
클론 CH3C.35.20.1.1
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.20.1.1은 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W)와 서열 번호:448의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.20.1.1은 서열 번호:448의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.20.1.1은 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 그리고 서열 번호:449 또는 450의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이 및 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.20.1.1은 서열 번호:449 또는 450의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.20.1.1은 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E), 그리고 서열 번호:451의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.20.1.1은 서열 번호:451의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.20.1.1은 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S), 그리고 서열 번호:534의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.20.1.1은 서열 번호:534의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.20.1.1은 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E), 그리고 서열 번호:452 또는 453의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.20.1.1는 서열 번호:452 또는 453의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.20.1.1은 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S), 그리고 서열 번호:535 또는 536의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.20.1.1는 서열 번호:535 또는 536의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.20.1.1은 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 그리고 서열 번호:454의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.20.1.1은 서열 번호: 454의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.20.1.1은 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 그리고 서열 번호:455 또는 456의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이 및 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.20.1.1은 서열 번호:455 또는 456의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.20.1.1은 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E), 그리고 서열 번호:457의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.20.1.1은 서열 번호:457의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.20.1.1은 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S), 그리고 서열 번호:537의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.20.1.1은 서열 번호:537의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.20.1.1은 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E), 그리고 서열 번호:458 또는 459의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.20.1.1는 서열 번호:458 또는 459의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.20.1.1은 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S), 그리고 서열 번호:538 또는 539의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.20.1.1은 서열 번호:538 또는 539의 서열을 갖는다.
클론 CH3C.35.23.2.1
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.2.1은 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W)와 서열 번호:460의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.2.1은 서열 번호:460의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.2.1은 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 그리고 서열 번호:461 또는 462의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이 및 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.2.1은 서열 번호:461 또는 462의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.2.1은 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E), 그리고 서열 번호:463의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.2.1은 서열 번호:463의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.2.1은 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S), 그리고 서열 번호:541의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.2.1은 서열 번호:541의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.2.1은 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E), 그리고 서열 번호:464 또는 465의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.2.1은 서열 번호:464 또는 465의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.2.1은 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S), 그리고 서열 번호:542 또는 543의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.2.1은 서열 번호:542 또는 543의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.2.1은 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 그리고 서열 번호:466의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.2.1은 서열 번호: 466의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.2.1은 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 그리고 서열 번호:467 또는 468의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이 및 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.2.1은 서열 번호:467 또는 468의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.2.1은 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E), 그리고 서열 번호:469의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.2.1은 서열 번호:469의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.2.1은 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S), 그리고 서열 번호:544의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.2.1은 서열 번호:544의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.2.1은 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E), 그리고 서열 번호:470 또는 471의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.2.1은 서열 번호:470 또는 471의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.2.1은 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S), 그리고 서열 번호:545 또는 546의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.2.1은 서열 번호:545 또는 546의 서열을 갖는다.
클론 CH3C.35.23.1.1
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.1.1은 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W)와 서열 번호:472의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.1.1은 서열 번호:472의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.1.1은 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 그리고 서열 번호:473 또는 474의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이 및 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.1.1은 서열 번호:473 또는 474의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.1.1은 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E), 그리고 서열 번호:475의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.1.1는 서열 번호:475의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.1.1은 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S), 그리고 서열 번호:548의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.1.1은 서열 번호:548의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.1.1은 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E), 그리고 서열 번호:476 또는 477의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.1.1은 서열 번호:476 또는 477의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.1.1은 노브 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139W), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S), 그리고 서열 번호:549 또는 550의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 노브 돌연변이, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.1.1은 서열 번호:549 또는 550의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.1.1은 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 그리고 서열 번호:478의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.1.1은 서열 번호:478의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.1.1은 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 그리고 서열 번호:479 또는 480의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이 및 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.1.1은 서열 번호:479 또는 480의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.1.1은 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E), 그리고 서열 번호:481의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.1.1은 서열 번호:481의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.1.1은 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S), 그리고 서열 번호:551의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.1.1은 서열 번호:551의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.1.1은 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M25Y, S27T, 및 T29E), 그리고 서열 번호:482 또는 483의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.1.1은 서열 번호:482 또는 483의 서열을 갖는다.
일부 구체예들에서, 클론 CH3C.35.23.1.1은 홀 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, T139S, L141A, 및 Y180V), 작동체 기능을 조절하는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, L7A, L8A, 및/또는 P102G (가령, L7A 및 L8A)), 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이 (가령, 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, M201L와 함께, 또는 없이 N207S), 그리고 서열 번호:552 또는 553의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 가질 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 홀 돌연변이, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이를 갖는 클론 CH3C.35.23.1.1은 서열 번호:552 또는 553의 서열을 갖는다.
VI.
접합체
일부 구체예들에서, 본 발명에 따른 변형된 CH2 또는 CH3 도메인을 포함하는 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 작용제(agent), 가령, 세포 안으로 내화되고, 및/또는 링커를 통하여 내피, 이를 테면 혈액-뇌-장벽을 가로질러 트랜스사이토시스를 위한 작용제에 연계(linked)된다. 상기 링커는 상기 폴리펩티드에 작용제을 연결시키는데 적합한 임의의 링커일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 연계(linkage)는 효소적으로 절단가능하다. 특정 구체예에서, 상기 연계는 중추신경계에 존재하는 효소에 의해 절단가능하다.
일부 구체예들에서, 상기 링커은 펩티드 링커이다. 펩티드 링커는 작용제 및 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드가 서로에 대해 회전을 허용하는 구성으로, 프로테아제에 의한 절단에 저항성이 있다. 일부 구체예들에서, 상기 링커는 유연성 링커, 가령, 아미노산, 이를 테면 Gly, Asn, Ser, Thr, Ala, 및 이와 유사한 것들을 포함하는 링커일 수 있다. 이러한 링커들은 공지의 매개변수를 이용하여 기획된다. 예를 들면, 상기 링커는 반복부, 이를 테면 Gly-Ser 반복부(repeats)를 가질 수 있다.
다양한 구체예들에서, 상기 접합체는 공지된 화학적 가교 시약 및 프로토콜을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들면, 당업자에게 공지되어 있고, 관심 작용제와 폴리펩티드를 가교하는데 유용한 다수의 화학적 가교제가 존재한다. 예를 들면, 가교제(cross-linking agents)는 이형이기능작용 가교제이며, 이는 단계적으로 분자를 연결하는 데 사용될 수 있다. 이형이기능적 가교 링커는 단백질을 접합하기시키기 위하여 보다 특정한 커플링 방법을 설계하는 능력을 제공하고, 이로써 동형-단백질 중합체와 같은 원하지 않는 부반응(side reaction)의 발생을 감소시킨다. 당분야에는 다양한 이형이기능적 가교 링커들이 공지되어 있는데, 다음을 포함한다: N-히드록시숙시니미드 (NHS) 또는 이의 수용성 유사체 N-히드록시술포숙시니미드 (술포-NHS), 숙시니미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙시니미드 에스테르 (MBS); N-숙시니미딜(4-이도아세틸) 아미노벤조에이트 (SIAB), 숙시니미딜 4-(p-말레이미도페닐)부티레이트 (SMPB), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC); 4-숙시니미딜옥시카르보닐-a-메틸-a-(2-피리딜디티오)-톨루엔 (SMPT), N-숙시니미딜3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP), 및 숙시니미딜 6-[3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트]헥사노에이트 (LC-SPDP). N-히드록시숙시니미드 모이어티를 갖는 가교제들은 N-히드록시술포숙시니미드 유사체로 수득될 수 있는데, 이는 수용성이 일반적으로 더 크다. 추가적으로, 연계쇄 내에 디설파이드 다리를 갖는 가교제는 생체 내에서 링커 절단양을 감소시키기 위해, 대신 알킬 유도체로 합성될 수 있다. 이형이기능적에 추가적으로, 동형이기능적 및 광반응성 가교제를 포함하는 다수의 다른 가교제가 존재한다. 디숙시니미딜 수브크레이트 (DSS), 비스말레이미도헥산 (BMH) 및 디메틸피멜리미데이트.2HCl (DMP)는 유용한 동형이기능적 가교제이며, 비스-[B-(4-아지도살리실아미도)에틸]디술피드 (BASED) 및 N-숙시니미딜-6(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노)헥사노에이트 (SANPAH)는 유용한 광반응성 가교제의 예가 된다.
관심있는 제제는 세포 독성제, DNA 또는 RNA 분자, 화학적 모이어티 등을 포함하는 치료제일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 제제는 펩티드 또는 소분자 치료제 또는 영상화제일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 소분자는 1000 Da 미만, 750 Da 미만, 또는 500 Da 미만이다.
트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드가 트란스페린 수용체에 결합하는 것을 이 제제가 간섭하지 않는 한, 관심대상 제제는 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단 영역에 연계되거나, 또는 상기 폴리펩티드의 임의 영역에 부착될 수 있다.
V.
트란스페린 수용체에 결합하는 FC 폴리펩티드를 공작하는 방법.
추가 측면에서, 트란스페린 수용체 결합 특이성을 갖는 CH2 또는 CH3 도메인 폴리펩티드를 공작하는 방법들이 제공된다. 일부 구체예들에서, CH3 도메인 폴리펩티드의 변형은 본원에서 기술된 바와 같이, 세트 (i) 및/또는 세트 (ii)의 다양한 아미노산을 치환시키는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 CH3 도메인 세트 (i)에 있는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개의 모든 위치에서 아미노산 변화를 포함하는 CH3 도메인 폴리펩티드를 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 CH3 도메인 세트 (ii)에 있는 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 모든 위치에서 아미노산 변화를 포함하는 CH3 도메인 폴리펩티드를 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 것을 포함한다. 세트의 다양한 위치에서 아미노산 치환을 갖는 CH3 도메인 폴리펩티드의 라이브러리를 생성하기 위해, 원하는 위치로 도입된 아미노산은 무작위화 또는 부분 무작위화에 의해 생성될 수 있다. 일부 구체예들에서, Fc 영역에서 상기 CH3 도메인 폴리펩티드는 돌연변이되는데, 이 영역은 전체 힌지 영역의 일부분 또는 모두를 함유하지 않을 수 있다.
한 측면에서, CH3 도메인은 (a) CH3 도메인을 인코드하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호:1의 아미노산 114-220을 참고하여 번호매김될 때, 위치 153, 157, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 186, 187, 188, 189, 194, 197, 또는 199중 최소한 5개 아미노산 치환을 갖도록 변형하고, 그리고 (b) 상기 변형된 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 발현시키고, 그리고 회수함으로써, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하도록 공작된다. 일부 구체예들에서, 상기 CH3 도메인은 위치 153, 157, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 186, 187, 188, 189, 194, 197, 또는 199에서 최소한 5개 치환을 갖도록 변형되며, 이때 상기 치환은 다음으로부터 선택된다: 위치 153에서 Trp, Tyr, Leu, 또는 Gln; 위치 157에서 Leu, Tyr, Met, 또는 Val; 위치 159에서 Leu, Thr, His, 또는 Pro; 위치 160에서 Val, 또는 산성 아미노산; 위치 161에서 방향족 아미노산, 가령, Trp; 위치 162에서 Val, Ser, 또는 Ala; 위치 163에서 Ser; 위치 164에서 Ser, Thr, Gln, 또는 Phe; 위치 165에서 Gln, Phe, 또는 His; 위치 186에서 Glu, Ala, Ser, Leu, Thr, 또는 Pro; 위치 187에서 Arg, Gly 또는 Pro; 위치 188에서 Glu; 위치 189에서 Thr 또는 산성 아미노산; 위치 194에서 Trp, Tyr, His 또는 Phe; 위치 197에서 Thr, Glu 또는 Lys; 그리고 위치 199에서 Trp, 또는 Gly.
한 측면에서, CH3 도메인은 (a) CH3 도메인을 인코드하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호:1의 아미노산 114-220을 참고하여 번호매김될 때, 위치 118, 119, 120, 122, 210, 211, 212, 및 213에서 최소한 5개 아미노산 치환을 갖도록 변형하고, 그리고 (b) 상기 변형된 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 발현시키고, 그리고 회수함으로써, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하도록 공작된다. 일부 구체예들에서, 상기 CH3 도메인은 위치 118, 119, 120, 122, 210, 211, 212, 및 213에서 최소한 5개 치환을 갖도록 변형되며, 이때 상기 치환은 다음으로부터 선택된다: 위치 118에서 Phe 또는 Ile; 위치 119에서 Asp, Glu, Gly, Ala, 또는 Lys; 위치 120에서 Tyr, Met, Leu, Ile, 또는 Asp; 위치 122에서 Thr 또는 Ala; 위치 210에서 Gly; 위치 211에서 Phe; 위치 212에서, 그리고 위치 213에서 또는 Asp.
CH2 도메인 폴리펩티드는 CH2 도메인 세트 (iii), 세트 (iv), 세트 (v), 또는 세트 (vi)의 상기 위치중 3개 내지 모든 위치 도처에 돌연변이를 도입시킴으로써, 트란스페린 수용체 결합에 대하여 유사하게 공작될 수 있다. 따라서, 일부 구체예들에서, CH2 도메인 폴리펩티드의 변형은 본원에서 기술된 바와 같이, 세트 (iii), 세트 (iv), 세트 (v), 및/또는 세트 (vi)에서 다양한 아미노산을 치환시키는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 CH2 도메인 세트 (iii)에 있는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개의 모든 위치에서 아미노산 변화를 포함하는 CH2 도메인 폴리펩티드를 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 CH2 도메인 세트 (iv)에 있는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 모든 위치에서 아미노산 변화를 포함하는 CH2 도메인 폴리펩티드를 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 CH2 도메인 세트 (v)에 있는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 모든 위치에서 아미노산 변화를 포함하는 CH2 도메인 폴리펩티드를 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 것을 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 CH2 도메인 세트 (vi)에 있는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개의 모든 위치에서 아미노산 변화를 포함하는 CH2 도메인 폴리펩티드를 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 것을 포함한다. 세트의 다양한 위치에서 아미노산 치환을 갖는 CH2 도메인 폴리펩티드의 라이브러리를 생성하기 위해, 원하는 위치로 도입된 아미노산은 무작위화 또는 부분 무작위화에 의해 생성될 수 있다. 일부 구체예들에서, Fc 영역에서 상기 CH2 도메인 폴리펩티드는 돌연변이되는데, 이 영역은 전체 힌지 영역의 일부분 또는 모두를 함유하지 않을 수 있다.
한 측면에서, CH2 도메인은 (a) CH2 도메인을 인코드하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호:1의 아미노산 4-113을 참고하여 번호매김될 때, 위치 47, 49, 56, 58, 59, 60, 61, 62, 및 63에서 최소한 5개 아미노산 치환을 갖도록 변형하고, 그리고 (b) 상기 변형된 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 발현시키고, 그리고 회수함으로써, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하도록 공작된다. 일부 구체예들에서, 상기 CH2 도메인은 위치 47, 49, 56, 58, 59, 60, 61, 62, 및 63에서 최소한 5개 치환을 갖도록 변형되며, 이때 상기 치환은 다음으로부터 선택된다: 위치 47에서 Glu, Gly, Gln, Ser, Ala, Asn, Tyr, 또는 Trp; 위치 49에서 Ile, Val, Asp, Glu, Thr, Ala, 또는 Tyr; 위치 56에서 Asp, Pro, Met, Leu, Ala, Asn, 또는 Phe; 위치 58에서 Arg, Ser, Ala, 또는 Gly; 위치 59에서 Tyr, Trp, Arg, 또는 Val; 위치 60에서 Glu; 위치 61에서 Trp 또는 Tyr; 위치 62에서 Gln, Tyr, His, Ile, Phe, Val, 또는 Asp; 그리고 위치 63에서 Leu, Trp, Arg, Asn, Tyr, 또는 Val.
또다른 측면에서, CH2 도메인은 (a) CH2 도메인을 인코드하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호:1의 아미노산 4-113을 참고하여 번호매김될 때, 위치 39, 40, 41, 42, 43, 44, 68, 70, 71, 및 72에서 최소한 5개 아미노산 치환을 갖도록 변형하고, 그리고 (b) 상기 변형된 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 발현시키고, 그리고 회수함으로써, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하도록 공작된다. 일부 구체예들에서, 상기 CH2 도메인은 위치 39, 40, 41, 42, 43, 44, 68, 70, 71, 및 72에서 최소한 5개 치환을 갖도록 변형되며, 이때 상기 치환은 다음으로부터 선택된다: 위치 39에서 Pro, Phe, Ala, Met, 또는 Asp; 위치 40에서 Gln, Pro, Arg, Lys, Ala, Ile, Leu, Glu, Asp, 또는 Tyr; 위치 41에서 Thr, Ser, Gly, Met, Val, Phe, Trp, 또는 Leu; 위치 42에서 Pro, Val, Ala, Thr, 또는 Asp; 위치 43에서 Pro, Val, 또는 Phe; 위치 44에서 Trp, Gln, Thr, 또는 Glu; 위치 68에서 Glu, Val, Thr, Leu, 또는 Trp; 위치 70에서 Tyr, His, Val, 또는 Asp; 위치 71은 위치 71에서 Thr, His, Gln, Arg, Asn, 또는 Val이고; 그리고 위치 72는 Tyr, Asn, Asp, Ser, 또는 Pro이다.
추가 측면에서, CH2 도메인은 (a) CH2 도메인을 인코드하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호:1의 아미노산 4-113을 참고하여 번호매김될 때, 위치 41, 42, 43, 44, 45, 65, 66, 67, 69, 및 73에서 최소한 5개 아미노산 치환을 갖도록 변형하고, 그리고 (b) 상기 변형된 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 발현시키고, 그리고 회수함으로써, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하도록 공작된다. 일부 구체예들에서, 상기 CH2 도메인은 위치 41, 42, 43, 44, 45, 65, 66, 67, 69, 및 73에서 최소한 5개 치환을 갖도록 변형되며, 이때 상기 치환은 다음으로부터 선택된다: 위치 41에서 Val 또는 Asp; 위치 42에서 Pro, Met, 또는 Asp; 위치 43에서 Pro 또는 Trp; 위치 44에서 Arg, Trp, Glu, 또는 Thr; 위치 45에서 Met, Tyr, 또는 Trp; 위치 65에서 Leu 또는 Trp; 위치 66에서 Thr, Val, Ile, 또는 Lys; 위치 67에서 Ser, Lys, Ala, 또는 Leu; 위치 69에서 His, Leu, 또는 Pro; 그리고 위치 73에서 Val 또는 Trp.
또다른 측면에서, CH2 도메인은 (a) CH2 도메인을 인코드하는 폴리뉴클레오티드는 서열 번호:1의 아미노산 4-113을 참고하여 번호매김될 때, 위치 45, 47, 49, 95, 97, 99, 102, 103, 및 104에서 최소한 5개 아미노산 치환을 갖도록 변형하고, 그리고 (b) 상기 변형된 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 발현시키고, 그리고 회수함으로써, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하도록 공작된다. 일부 구체예들에서, 상기 CH2 도메인은 위치 45, 47, 49, 95, 97, 99, 102, 103, 및 104에서 최소한 5개 치환을 갖도록 변형되며, 이때 상기 치환은 다음으로부터 선택된다: 위치 45에서 Trp, Val, Ile, 또는 Ala; 위치 47에서 Trp 또는 Gly; 위치 49에서 Tyr, Arg, 또는 Glu; 위치 95에서 Ser, Arg, 또는 Gln; 위치 97에서 Val, Ser, 또는 Phe; 위치 99에서 Ile, Ser, 또는 Trp; 위치 102에서 Trp, Thr, Ser, Arg, 또는 Asp; 위치 103에서 Trp; 그리고 위치 104에서 Ser, Lys, Arg, 또는 Val.
상기 돌연변이된 CH3 및/또는 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 임의의 수의 시스템을 이용하여 발현될 수 있다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, 돌연변이체 폴리펩티드는 디스플레이 시스템에서 발현된다. 다른 예시적인 구체예들에서, 돌연변이체 폴리펩티드는 숙주 세포로부터 분비되는 가용성 폴리펩티드로 발현된다. 일부 구체예들에서, 상기 발현 시스템은 디스플레이 시스템, 가령, 바이러스 디스플레이 시스템, 세포 표면 디스플레이 시스템, 이를 테면, 이스트 디스플레이 시스템, mRNA 디스플레이 시스템, 또는 폴리좀 디스플레이 시스템이다. 상기 라이브러리는 공지된 방법을 사용하여 트랜스페린 수용체 결합제를 확인하기 위하여 스크리닝되며, 이는 결합 역학을 결정하도록 추가로 특성화될 수 있다. 그 다음, 선택된 클론에서 아미노산의 초기 세트 (세트 (i) 또는 세트 (ii))에 임의 위치로; 또는 상기 선택된 클론의 결합 영역에 또한 존재하는 세트의 외부 다른 위치로 추가 돌연변이가 도입될 수 있다.
VI.
핵산, 벡터, 및 숙주 세포
본원에서 기술된 변형된 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 재조합 방법을 이용하여 준비된다. 따라서, 일부 측면에서, 본 발명은 본원에서 기술된 바와 같은 폴리펩티드를 포함하는 임의의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 및 이 핵산이 도입된 숙주 세포를 제공하는데, 이때 상기 숙주 세포는 상기 폴리펩티드-인코딩 핵산을 복제하거나 및/또는 상기 폴리펩티드를 발현시키는데 이용된다. 일부 구체예들에서, 상기 숙주 세포는 진핵, 가령, 인간 세포이다.
또다른 측면에서, 본원에서 기술된 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함한, 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 상기 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA이다. 특정 구체예들에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 cDNA이다. 일부 구체예들에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 RNA이다.
일부 구체예들에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 산 구조체 안에 포함된다. 일부 구체예들에서, 상기 구조체는 복제가능한 벡터이다. 일부 구체예들에서, 상기 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 파아지미드, 이스트 염색체 벡터, 및 비-에피좀 포유류 벡터이다.
일부 구체예들에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 발현 구조체 내에서 하나 또는 그 이상의 조절 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연계된다. 하나의 일련의 구체예들에서, 상기 핵산 발현 구조체들은 표면 발현 라이브러리로써 이용하기 위하여 개작된다. 일부 구체예들에서, 상기 라이브러리는 이스트에서 표면 발현을 위하여 개작된다. 일부 구체예들에서, 상기 라이브러리는 파아지에서 표면 발현을 위하여 개작된다. 또다른 일련의 구체예들에서, 상기 핵산 발현 구조체는 상기 폴리펩티드의 밀리그램 또는 그램 양으로 단리하는 것을 허용하는 시스템에서 상기 폴리펩티드를 발현시키기 위하여 개작된다. 일부 구체예들에서, 상기 시스템은 포유류 세포 발현 시스템이다. 일부 구체예들에서, 상기 시스템은 이스트 세포 발현 시스템이다.
폴리펩티드의 생산을 위한 발현 수송체(vehicles)는 플라스미드 및 다른 벡터를 포함한다. 예를 들면, 적합한 벡터는 다음의 유형의 플라스미드를 포함한다: 원핵 세포, 이를 테면 대장균(E. coli)에서 발현을 위한 pBR322-유도된 플라스미드, pEMBL-유도된 플라스미드, pEX-유도된 플라스미드, pBTac-유도된 플라스미드 및 pUC-유도된 플라스미드. pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo 및 pHyg-유도된 벡터는 진핵 세포의 형질감염에 적합한 포유류 발현 벡터의 예들이다. 대안으로, 바이러스, 이를 테면 소의 유두종 바이러스 (BPV-1), 또는 Epstein-Barr 바이러스 (pHEBo, pREP-유도된 그리고 p205)의 유도체들이 진핵 세포에서 폴리펩티드의 일시적 발현에 이용될 수 있다. 일부 구체예들에서, 베큘로바이러스 발현 시스템의 사용에 의해 재조합 폴리펩티드를 발현시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 베큘로바이러스 발현 시스템의 예로는 pVL-유도된 벡터 (이를 테면 pVL1392, pVL1393 및 pVL941), pAcUW-유도된 벡터 (이를 테면 pAcUW1), 및 pBlueBac-유도된 벡터를 포함한다. 추가 발현 시스템은 아데노바이러스, 아데노-연합된 바이러스, 및 다른 바이러스 발현 시스템을 포함한다.
벡터는 임의의 적합한 숙주 세포로 형질도입될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 숙주 세포, 가령, 박테리아 또는 이스트 세포는 표면 발현 라이브러리로써 사용하기 위하여 개작될 수 있다. 일부 세포에서, 상기 벡터는 상대적으로 다량의 상기 폴리펩티드를 발현시키기 위하여 숙주 세포에서 발현된다. 이러한 숙주 세포는 포유류 세포, 이스트 세포, 곤충 세포, 및 원핵 세포를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 세포는 포유류 세포, 이를 테면 중국 헴스터 난소 (CHO) 세포, 아기 헴스터 신장 (BHK) 세포, NS0 세포, Y0 세포, HEK293 세포, COS 세포, Vero 세포, 또는 HeLa 세포이다.
가령, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드를 인코딩하는 발현 벡터로 형질감염된 숙주 세포는 이 폴리펩티드의 발현이 발생하도록 허용하는 적절한 조건 하에 배양될 수 있다. 상기 폴리펩티드는 분비되고, 이 폴리펩티드를 함유하는 세포와 배지 혼합물로부터 단리될 수 있다. 대안으로, 상기 폴리펩티드는 세포질 내 또는 막 분획 내에 보유될 수 있고, 원하는 방법을 이용하여, 상기 세포는 수거되고, 용해되고, 상기 폴리펩티드는 단리될 수 있다.
VII.
치료 방법
본 발명에 따른 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 많은 적응증에서 치료적으로 사용될 수 있다. 일부 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 트란스페린 수용체를 발현하는 표적 세포 유형으로 치료제를 전달하는데 사용된다. 일부 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 내피, 예를 들어, 혈액-뇌 장벽을 가로 질러 뇌에 의해 흡수될 치료 모이어티를 운반하는데 사용될 수 있다.
일부 구체예들에서, 본 발명의 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 예를 들어, 치료제에 접합되어, 뇌 질환 또는 중추 신경계 (CNS)와 같은 신경계 장애를 치료하기 위해 치료제를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 질환은 알츠하이머 질환, 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증, 전두 측두 치매, 혈관성 치매, 루이소체(Lewy body) 치매, 픽병(Pick's disease), 일차 노화-관련 타우 병증 또는 진행성 핵상 마비를 포함한다. 일부 구체예들에서, 상기 질환은 타우병증, 프리온 질환 (이를 테면, 소 해면상 뇌병증, 스크래피, 크로이츠 펠트-야콥(Creutzfeldt-Jakob) 증후군, 쿠루(kuru), 게르스트만-스트라우 슬러-셰이커(Gerstmann-Straussler-Scheinker) 질환, 만성 소모성 질환 및 치명적 가족 불면증), 구근 마비(bulbar palsy), 운동 신경 질환, 또는 신경계 이질 퇴행성 장애 (이를 테면, 카나반 질환, 헌팅턴병, 뉴런 세로이드-지방갈색소증(lipofuscinosis), 알렉산더병, 투렛(Tourette's) 증후군, 멘케스 특이 털 증후군(Menkes kinky hair syndrome), 코카인 증후군(Cockayne syndrome), 할러보르덴-스파츠(Halervorden-Spatz) 증후군, 라 포라 질환(lafora disease), 레트 증후군(Rett syndrome), 간질 변성, 레쉬-니안(Lesch-Nyhan) 증후군, 프리드리히(Friedreich) 운동 실조증, 척추 근육 위축증 및 운베리취-룬드보르그(Unverricht-Lundborg) 증후군)일 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 질환은 뇌졸증 또는 다발 경화증이다. 일부 구체예들에서, 상기 환자는 무증상일 수 있지만, 뇌 또는 CNS의 질병과 관련된 마커를 갖는다. 일부 구체예들에서, 신경계 장애를 치료하기 위한 의약의 제조에서 본 발명의 트랜스페린 수용체-결합 폴리펩티드의 용도가 제공된다.
일부 구체예들에서, 본 발명의 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 암 치료에 이용된다. 특정 구체예에서, 상기 암은 신경교종, 다형성 교모세포종, 수막종, 성상 세포종, 음향 신경종, 연골종, 핍지교종, 수모세포종, 신경절교세포종, 슈반세포종(Schwannoma), 신경 섬유종, 신경아 세포종 또는 경막 외, 골수 내 또는 경 막내 종양과 같은 CNS의 일차 암이다 일부 구체예들에서, 상기 암은 고형(solid) 종양이거나, 또는 다른 구체예들에서, 상기 암은 비-고형 종양이다. 고형-종양 암은 중추신경계 종양, 유방암, 전립선암, 피부암 (기저 세포암종, 세포 암종, 편평 세포 암종 및 흑색종 포함), 자궁 경부암, 자궁암, 폐암, 난소암, 고환암, 갑상선암, 성상세포종, 신경교종, 췌장암, 중피종 , 위암, 간암, 대장암, 직장암, 신장 모세포종을 포함한 신장암, 방광암, 식도암, 후두암, 이하선암, 담관암, 내막암, 선암종, 소세포 암종, 신경 모세포종, 부신피질 암종, 상피 암종, 데스모이드성(desmoid) 종양, 결합조직형성 소원형세포종양, 내분비 종양, 유잉(Ewing) 육종 가족 종양, 생식 세포 종양, 간 모세포종, 간세포 암종, 비-횡문근 육종 연조직 육종, 골육종, 말초 원시 신경 외배엽 종양, 망막 모세포종 및 횡문근 육종을 포함한다. 일부 구체예들에서, 암을 치료하기 위한 의약의 제조에서 본 발명의 트랜스페린 수용체-결합 폴리펩티드의 용도가 제공된다.
일부 구체예들에서, 본 발명의 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 자가면역 또는 염증 질환의 치료에 이용될 수 있다. 이러한 질병의 예로는 강직성 척추염, 관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 천식, 경피증, 뇌졸중, 죽상동맥 경화증, 크론병, 대장염, 궤양성 대장염, 피부염, 게실염, 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 섬유 근육통, 간염, 과민성 대장 증후군 (IBS), 루푸스, 전신 홍반 루푸스 (SLE), 신장염, 다발성 경화증 및 궤양성 대장염을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 일부 구체예들에서, 자가면역 또는 염증 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에서 본 발명의 트랜스페린 수용체-결합 폴리펩티드의 용도가 제공된다.
일부 구체예들에서, 본 발명의 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 심혈관 질환, 이를 테면 관상 동맥 질환, 심장 마비, 비정상적인 심장 박동 또는 부정맥, 심부전, 심장 판막 질환, 선천성 심장 질환, 심장 근육 질환, 심근병증, 심낭 질환, 대동맥 질환, 마르판 증후군(marfan syndrome), 맥관 질환 및 혈관 질환의 치료에 이용될 수 있다. 일부 구체예들에서, 심혈관 질환의 치료하기 위한 의약의 제조에서 본 발명의 트랜스페린 수용체-결합 폴리펩티드의 용도가 제공된다.
일부 구체예들에서, 상기 방법은 상기 대상에게 하나 또는 그 이상의 추가적인 치료요법적 물질을 투여하는 것을 더 포함한다. 예를 들면, 뇌 또는 중추신경계를 치료하기 위한 일부 구체예들에서, 상기 방법은 신경보호 물질, 가령, 항콜린성 물질, 도파민성 물질, 글루탐산성 물질, 히스톤 데아세틸라제 (HDAC) 억제제, 카나비노이드, 카스파제 억제제, 멜라토닌, 항-염증성 물질, 호르몬 (가령, 에스트로겐 또는 프로게스테론), 또는 비타민을 상기 대상에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 신경성 장애의 인지적 또는 행동적 증상을 치료하는데 사용하기 위한 제제 (예를 들어, 항우울제, 도파민 작용제 또는 항-정신병약)을 대상에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 치료요법적으로 효과량 또는 용량(dose)으로 대상에게 투여된다. 예시적인 투여량(dosages)은 약 0.01 mg/kg 내지 약 500 mg/kg, 또는 약 0.1 mg/kg 내지 약 200 mg/kg, 또는 약 1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg, 또는 약 10 mg/kg 내지 약 50 mg/kg을 포함하고, 이용될 수 있다. 그러나, 투여량은 선택된 투여 경로, 조성물의 제형, 환자 반응, 상태의 중증도, 대상의 체중 및 처방 의사의 판단을 포함하여 여러 가지 요인에 따라 달라질 수 있다. 개별 환자에 의해 요구되는 바와 같이 투여량은 시간이 지남에 따라 증가 또는 감소될 수 있다. 일부 구체예들에서, 환자에게 초기에 저용량이 제공되고,이어서 환자에게 허용되는 효과적인 투여량으로 증가된다. 유효량의 결정은 당업자의 능력 내에 있다.
다양한 구체예들에서, 본 발명의 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 장관외로(parenterally)로 투여된다. 일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 정맥내로 투여된다. 정맥 투여는 가령, 약 10 내지 약 30 분의 기간, 또는 최소한 1 시간, 2 시간, 또는 3 시간의 기간에 걸쳐 주입될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 정맥 볼루스로 투여된다. 주입 및 볼루스 투여의 조합이 또한 이용될 수 있다.
일부 장관외 구체예에서, 트랜스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 인트라페이로테네알리(intraperiotneally), 피하, 피내(intradermally) 또는 근육 내 투여된다. 일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 피내 또는 근육내 투여된다. 일부 구체예들에서, 상기 폴리펩티드는 척추강내, 이를 테면 경막외 투여, 또는 뇌실안(intracerebroventricularly)으로 투여된다.
다른 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 구강으로, 폐 투여, 비강내 투여, 안구 투여, 또는 국소 투여에 의해 투여될 수 있다. 폐 투여는 예를 들면, 흡입기 또는 네불라이져(nebulizer), 그리고 에어로졸화 물질이 있는 제형을 이용함으로써 폐 투여가 또한 실시될 수 있다.
VIII.약학 조성물 및 키트
또다른 측면에서, 본 발명에 따른 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물 및 키트가 제공된다.
약학 조성물
본 발명에 사용을 위한 제제를 제조하기 위한 지침은 당업자에게 공지된 약학 제제 및 제제를 위한 임의의 수의 핸드북에서 찾을 수 있다.
일부 구체예들에서, 약학 조성물은 본 명세서에서 기술된 바와 같은 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드를 포함하고, 하나 또는 그 이상의 약학적으로 수용가능한 담체 및/또는 부형제를 더 포함한다. 약학적으로 수용가능한 담체는 생리학적으로 양립성이고, 바람직하게는 활성제의 활성을 방해하거나 달리 방해하지 않는 임의의 용매, 분산 매질 또는 코팅을 포함한다. 다양한 약학적으로 수용가능한 부형제는 공지되어 있다.
일부 구체예들에서, 상기 담체는 정맥, 척추강내(intrathecal), 뇌실내(intracerebroventricular), 근육내, 구강, 복강내, 경피, 국소 또는 피하 투여에 적합하다. 약학적으로 수용가능한 담체는 예를 들면, 상기 조성물의 안정성을 증가시키거나, 또는 상기 폴리펩티드의 흡수를 증가 또는 감소시키는 작용을 하는 하나 또는 그 이상의 생리적으로 수용가능한 화합물을 함유할 수 있다. 생리적으로 수용가능한 화합물은, 예를 들면, 탄수화물, 이를 테면, 포도당, 슈크로스, 또는 덱스트란, 항산화제, 이를 테면, 아스코르브산 또는 글루타티온, 킬레이트 물질, 저분자량 단백질들, 활성 물질의 제거 또는 가수분해를 감소시키는 조성물, 또는 부형제 또는 기타 안정화제 및/또는 완충액을 포함한다. 다른 약학적으로 수용가능한 담체 및 이들의 제형은 당분야에 이용가능하다.
본원에 기재된 약학 조성물은 당업자에게 공지된 방식으로, 예를 들어 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정제(dragee-making), 유화, 캡슐화, 포획화 또는 동결 건조 공정에 의해 제조될 수 있다. 하기 방법 및 부형제는 단지 예시적인 것이며, 이에 제한적인 것은 아니다.
구강 투여를 위하여, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 당업계에 공지된 약학적으로 허용되는 담체와 조합하여 제형화될 수 있다. 이러한 담체는 화합물을 치료될 환자에 의한 경구 섭취를 위해 정제, 환제, 당의정, 캡슐, 유제, 친유성 및 친수성 현탁액, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 제형화할 수 있게 한다. 경구용 약학 제제는 상기 폴리펩티드를 고체 부형제와 혼합하고, 임의선택적으로 생성된 혼합물을 분쇄하고, 필요한 경우 적합한 보조제를 첨가한 후, 과립의 혼합물을 가공하여, 정제 또는 당의정 코어를 수득함으로써 얻을 수 있다. 적합한 부형제는 예를 들어, 락토스, 슈크로스, 만니톨 또는 소르비톨을 포함하는 당과 같은 충전제; 셀룰로오스 제제, 예를 들어 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 검 트라카탄, 메틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸-셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스 및/또는 폴리비닐피롤리돈을 포함한다. 원하는 경우, 붕해제, 예컨대 가교-폴리비닐 피롤리돈, 한천 또는 알긴산 또는 이의 염, 예컨대 나트륨 알기네이트가 첨가될 수 있다.
상기에서 개시된 바와 같이, 본 발명의 기술된 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 주사에 의한 장관외 투여, 이를 테면 볼루스 주사 또는 연속 주입용으로 제형화될 수 있다. 주사를 위해, 상기 폴리펩티드는 수성 또는 비 수성 용매, 예컨대 식물성 또는 다른 유사한 오일, 합성 지방족 산 글리세리드, 고급 지방족 산 또는 프로필렌 글리콜의 에스테르에 용해, 현탁 또는 유화시키고; 그리고 필요하다면, 가용화제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제 및 보존제와 같은 통상적인 첨가제와 함께 사용하여 제제로 제형화될 수 있다. 일부 구체예들에서, 폴리펩티드는 수성 용액, 바람직하게는 생리학적으로 양립가능한 완충액, 이를 테면 Hank 용액, Ringer 용액, 또는 생리학적 염수 완충액에서 제형화될 수 있다. 주사용 제제는 보존제를 첨가한, 단위 투여 형태, 예를 들어 앰플 또는 다회 용량 용기로 제공될 수 있다. 상기 조성물은 현탁액, 용액 또는 유성 또는 수성 운반체내 에멀션의 형태를 취할 수 있고, 그리고 제형화 물질 이를 테면 현탁, 안정화 및/또는 분산 물질들을 포함할 수 있다.
일부 구체예들에서, 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드는 지속-방출, 제어-방출, 연장-방출, 정시-방출 또는 지연-방출 제제, 예를 들어 활성제를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반-투과성 매트릭스로 전달하기 위해 제조된다. 다양한 유형의 지속-방출 물질이 확립되었으며, 당업자에게 잘 알려져 있다. 연장-방출 제형은 필름-코팅 정제, 다중 미립자 또는 펠릿 시스템, 친수성 또는 친유성 물질을 사용한 매트릭스 기술 및 기공 형성 부형제가 있는 왁스-기반 정제를 포함한다. 지속-방출 전달 시스템은 디자인에 따라, 몇 시간 또는 며칠 동안, 예를 들면, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24 시간 또는 그 이상에 걸쳐 화합물을 방출할 수 있다. 일반적으로, 지속-방출 제형은 천연 또는 합성 중합체, 예를 들어 중합체 비닐 피롤리돈, 예컨대 폴리비닐 피롤리돈; 카르복시비닐 친수성 중합체; 소수성 및/또는 친수성 하이드로콜로이드, 예컨대 메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스 및 하이드록시프로필메틸셀룰로스; 및 카르복시폴리메틸렌을 이용하여 준비될 수 있다.
전형적으로, 생체 내 투여에 사용하기 위한 약학 조성물은 멸균성이다. 멸균은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 열 멸균, 증기 멸균, 멸균 여과 또는 조사(irradiation)에 따라 달성될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량 및 원하는 약물 농도는 계획된 특정 용도에 따라 달라질 수 있다. 적절한 투여량 또는 투여 경로의 결정은 당업자의 기술 범위 내에 있다. 적합한 투여량은 상기 섹션 VII에서 또한 기술된다.
키트
일부 구체예들에서, 본원에서 기술된 바와 같은 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드를 포함하는 키트가 제공된다. 일부 구체예들에서, 상기 키트는 신경성 장애, 이를 테면 뇌 또는 중추신경계 (CNS) 질환을 예방 또는 치료하는데 이용될 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 키트는 하나 또는 그 이상의 추가 치료제를 더 포함한다. 예를 들면, 일부 구체예들에서, 상기 키트는 본원에서 기술된 바의 트란스페린 수용체-결합 폴리펩티드 및 신경성 장애 치료에 사용을 위한 하나 또는 그 이상의 추가 치료제를 포함한다. 일부 구체예에서, 키트는 본원에 기술된 방법 (예를 들어, 혈액-뇌 장벽을 가로 질러 조성물을 투여하기 위해 키트를 사용하기위한 지침서)을 수행하기 위한 지침 (즉, 프로토콜)을 담은 지시 자료를 추가로 포함한다. 지침 자료는 일반적으로 문서 또는 인쇄 자료를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 지침을 보관할 수 있고, 최종 사용자에게 소통될 수 있는 임의의 매체도 본 발명에서 고려된다. 이러한 매체는 전자 보관 매체 (가령, 자석 디스크, 테이프, 카트릿지, 칩), 광학 매체 (가령, CD-ROM), 및 이와 유사한 것들을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 그러한 매체는 그러한 교육 자료를 제공하는 인터넷 주소를 포함할 수 있다.
IX.
실시예
본 발명은 특정 실시예들을 통해보다 상세하게 설명될 것이다. 이들 실시예는 단지 설명을 위한 것이며, 본 발명의 범위를 임의의 방식으로 제한시키는 것으로 간주되어서는 안된다. 당업자는 본질적으로 동일한 결과를 생성하도록 변경되거나 수정될 수있는 다양한 비임계 파라미터를 쉽게 인지할 것이다. 이용된 수치(가령, 양, 온도, 등)에 있어서 정확성을 보장하기 위한 노력이 있었지만, 일부 실험적 오차 및 편차들이 존재할 수 있다. 달리 지시되지 않는 한, 본 발명의 실시는 당업자에게 통상적 인 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기술 및 약리학적 방법을 이용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에서 충분히 설명되어 있다. 또한, 특정 라이브러리에 적용되는 엔지니어링 방법이 본 명세서에 기술된 다른 라이브러리에도 적용될 수 있다는 것이 당업자에게 명백하다.
실시예 1. TfR 표적 생성
트란스페린 수용체 (TfR) 엑토도메인 (ECD)을 인코딩하는 DNA(인간 (서열 번호:235) 또는 cyno (서열 번호:300) TfR의 잔기 121-760)는 C-말단 절단가능한 His- 및 Avi-테그와 함께 포유류 발현 벡터내로 클론되었다. 이 플라스미드는 HEK293 세포에 형질감염되고, 발현되었다. 상기 엑토도메인을 Ni-NTA 크로마토그래피에 이어서, 크기-배제 크로마토그래피를 사용하여, 수확된 상청액으로부터 정제하고, 임의의 응집된 단백질을 제거하였다. 수율은 배양 리터당 약 5 mg이었다. 상기 단백질은 10 mM K3PO4 (pH 6.7), 100 mM KCl, 100 mM NaCl, 및 20% 글리세롤에 보관하고, -20℃에서 냉동시켰다.
순열돌연변이된 TfR 정점 도메인 (서열 번호:301) (인간 또는 cyno TfR의 잔기 326-379 및 194-296)을 인코딩하는 DNA는 정제용 N-말단 His-테그 및 생체내 바이오티닐화를 위한 Avi-테그와 함께 pET28 벡터 안으로 클론되었다. 상기 플라스미드는 BirA 발현 벡터와 함께 BL21 (DE3) 세포로 공동-형질도입되었다. 세포는 LB 배지에서 37℃에서 로그 상까지 성장되었고, 그 다음 1 mM 이소프로필 1-티오-β-D-갈락토피라노시드 (IPTG)로 유도되고, 이어서 18℃에서 하룻밤 동안 배양되었다. 상기 세포는 용해되었고, 가용성 분획은 친화력 정제를 위하여 Ni-NTA 컬럼에 적용시키고, 이어서 크기-배제 크로마토그래피를 실시하여 임의의 응집된 단백질을 제거하였다. 수율은 배양 리터당 약 10 mg이었다. 상기 단백질은 50 mM HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 및 1 mM DTT에 보관하고, -20℃에서 냉동시켰다.
상기 정제된 TfR ECDs는 EZ-연계 술포-NHS-LC-Biotin 키트 (Thermo Scientific에서 구함)를 이용하여 바이오티닐화되었다. 5-배 몰 과량의 바이오틴을 반응에 사용하였다. 과량의 바이오틴은 PBS에 대해 광범위하게 투석함으로써 제거되었다.
Avi-테그된 TfR ECDs 및 정점 도메인은 BirA-500 (Avidity, LLC의 BirA 바이오틴-단백질 리가제 표준 반응 키트)를 이용하여 바이오티닐화되었다. 반응 후, 상기 라벨된 단백질은 크기-배제 크로마토그래피에 의해 추가 정제되어 과량의 BirA 효소를 제거하였다. 최종 물질은 10 mM K3PO4 (pH 6.7), 100 mM KCl, 100 mM NaCl, 및 20% 글리세롤에 보관하였고, -20℃에서 냉동시켰다.
실시예 2. 공작된 트란스페린 수용체 결합 폴리펩티드 기획 및 특징화
이 실시예는 본 발명의 폴리펩티드의 설계, 생성 및 특성 규명을 기술한다. 본 실시예의 목적을 위하여, 그리고 클론 서열에서 동일한 아미노산을 비교할 목적으로, “보존된” 돌연변이는 확인된 모든 클론에서 발생되는 것으로 간주되며 (보존적 아미노산 치환은 아님), 한편 “절반-보존된” 돌연변이는 클론중 >50%에서 발생되는 것이다.
다른 언급이 없는 한, 이 섹션에서 아미노산 잔기의 위치는 힌지에서 아미노-말단 단부에서 3개 잔기, PCP를 갖는 인간 IgG1 야생형 Fc 영역, 서열 번호:1에 기초하여 번호매김된다.
폴리펩티드 Fc 영역 도메인 라이브러리의 기획
폴리펩티드 Fc 영역 안에 새로운 분자 인지를 작제하는데, 변형을 위한 특정 용매 노출된 표면 패치를 선택하고, 표면 디스플레이 라이브러리를 구축하고, 이때 선택된 패치의 상기 아미노산 조성물은 랜덤화에 의해 변경되었고, 그 다음 표준 발현 디스플레이 기술을 이용하여 원하는 기능에 대하여 표면-디스플레이된 서열 변이체를 스크리닝함으로써 작제된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “랜덤화(randomization)”는 사전-특정된 뉴클레오티드 또는 아미노산 혼합 비율로 부분적 랜덤화 뿐만 아니라 서열 변화를 포함한다. 랜덤화를 위하여 선택된 전형적으로 표면-노출된 패치의 면적은 약 600 내지 1500 Å2, 약 7 내지 15개 아미노산으로 구성되었다.
클론 레지스터(registers)
다음 레지스터가 기획되었고, 본원에서 기술된 방법에 따라 만들어졌다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “리지스터(register)”란 변경될 수 있는(가령, 레지스터에 열거된 위치에서 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결손을 만들기 위하여 펩티드 코딩 유전자 서열 안으로 돌연변이를 도입시킴으로써) 인접(contiguous) 표면을 형성하는 일련의 표면-노출된 아미노산 잔기를 지칭한다.
CH2 리지스터 A2 - 세트 (iii)
상기 CH2A2 리지스터 (표 1)는 서열 번호:1에서 제시된 인간 IgG1 Fc 영역 아미노산 서열 세트를 기준으로 번호매김될 때, 위치 47, 49, 56, 58, 59, 60, 61, 62, 및 63의 아미노산을 포함한다. 상기 CH2A2 리지스터는 베타 쉬트, 이웃 턴(turn), 및 다음 루프(loop)를 따라 표현을 형성하도록 기획되었다. 이것은 FcγR 및 FcRn 결합 부위 둘 다에서 잘 제거된다.
CH2 리지스터 C - 세트 (iv)
상기 CH2C 리지스터 (표 2)는 서열 번호:1에서 제시된 인간 IgG1 Fc 영역 아미노산 서열 세트를 기준으로 번호매김될 때, 위치 39, 40, 41, 42, 43, 44, 68, 70, 71, 및 72의 아미노산을 포함한다. 상기 CH2C 리지스터는 힌지 부근의 일련의 루프를 따라 그리고 상기 CH2 영역의 FcγR 결합 부위에 매우 근접한 용매-노출된 잔기를 이용한다.
CH2 리지스터 D - 세트 (v)
상기 CH2D 리지스터 (표 3)는 서열 번호:1에서 제시된 인간 IgG1 Fc 영역 아미노산 서열 세트를 기준으로 번호매김될 때, 위치 41, 42, 43, 44, 45, 65, 66, 66, 69, 및 73의 아미노산을 포함한다. CH2C와 유사하게, 상기 CH2D 리지스터는 상기 CH2 영역의 상부 일련의 루프를 따라, FcγR 결합 부위에 매우 근접한 용매-노출된 잔기를 이용한다. 상기 CH2C 및 CH2D 레지스터는 대개 한개 루프를 공유하고, 결합에 이용되는 제 2루프에서 상이하다.
CH2 리지스터 E3 - 세트 (vi)
상기 CH2E3 리지스터 (표 4)는 서열 번호:1에서 제시된 인간 IgG1 Fc 영역 아미노산 서열 세트를 기준으로 번호매김될 때, 위치 45, 47, 49, 95, 97, 99, 102, 103, 및 104의 아미노산을 포함한다. 상기 CH2E3 리지스터 위치는 FcγR 결합 부위에 또한 매우 근접하지만, 그러나, 루프 잔기의 일부에 추가로, FcγR 결합 부위에 근접한 루프에 이웃한 베타 쉬트 상의 용매-노출된 잔기를 이용한다.
CH3 리지스터 B - 세트 (ii)
상기 CH3B 리지스터 (표 5)는 서열 번호:1에서 제시된 인간 IgG1 Fc 영역 아미노산 서열 세트를 기준으로 번호매김될 때, 위치 118, 119, 120, 122, 210, 211, 212, 및 213의 아미노산을 포함한다. 상기 CH3B 리지스터는 CH3 영역의 C-말단 근처에 몇몇 구조화가 덜된 잔기들을 따라 2 개의 평행한 베타 시트상의 용매-노출된 잔기들로 대개 구성된다. 이것은 FcγR 및 FcRn 결합 부위와는 거리가 멀다.
CH3 리지스터 C - 세트 (i)
상기 CH3C 리지스터 (표 6)는 서열 번호:1에서 제시된 인간 IgG1 Fc 영역 아미노산 서열 세트를 기준으로 번호매김될 때, 위치 157, 159, 160, 161, 162, 163, 186, 189, 및 194의 아미노산을 포함한다. 상기 CH3C 리지스터 위치는 FcγR 및 FcRn 결합 부위로부터 멀리 떨어진, 2 개의 루프로부터의 표면-노출된 잔기를 포함함으로써 연속 표면을 형성한다.
파아지-디스플레이 라이브러리의 생성
야생형 인간 Fc 서열 (서열 번호:1)을 인코딩하는 DNA 주형을 합성하여, 파지미드 벡터에 통합시켰다. 파지 미드 벡터는 ompA 또는 pelB 리더 서열, c-Myc 및 6xHis 에피토프 태그에 융합된 Fc 삽입물, 및 엠버 정지 코돈에 이어 M13 코트 단백질 pIII을 함유하였다.
랜덤화를 위해 대응하는 위치에 "NNK" 트리코돈을 함유하는 프라이머가 생성되었고, 이때 N은 임의의 DNA 염기 (가령, A, C, G, 또는 T)이며, K 는 G 또는 T이다. 대안으로, "소프트(soft)" 랜덤화를 위한 프라이머가 사용되었고, 여기서 70% 야생형 염기 및 다른 3 개의 염기 각각의 10%에 상응하는 염기의 혼합이 각 무작위 위치에 사용되었다. 랜덤화 영역에 해당하는 Fc 영역의 단편의 PCR 증폭을 수행하여 라이브러리를 생성하였고, SfiI 제한 부위를 함유하는 말단 프라이머를 이용하여 어셈블리되었고, 그 다음 SfiI로 절단되었고, 그리고 상기 파지미드 벡터 안으로 결찰되었다. 대안으로, 이 프라이머를 사용하여 Kunkel 돌연변이유발을 수행하였다. Kunkel 돌연변이유발을 실행하는 방법은 당업자에게 공지될 것이다. 상기 결찰된 생성물 또는 Kunkel 생성물을 전기적격성(electrocompetent) 대장균(E. coli) 균주 TG1의 세포 (Lucigen®에서 구함)로 형질변환시켰다. 상기 대장균 세포를 회수 및 밤새 성장시킨 후, M13K07 헬퍼 파아지로 감염시키고, 그 다음 라이브러리 파아지를 5% PEG/NaCl로 침전시키고, PBS에서 15% 글리세롤에 재현탁시키고, 사용 전까지 동결시켰다. 전형적인 라이브러리 크기는 약 109 내지 약 1011 개의 형질전환체의 범위였다. pIII-융합된 Fc와 pIII에 부착되지 않은 가용성 Fc(후자는 pIII 전 엠버(amber) 정지 코돈으로 인하여 생성된 것이다) 사이의 페어링을 통해, 파아지 상에 Fc-이량체가 표시되었다.
이스트-디스플레이 라이브러리 생성
야생형 인간 Fc 서열을 인코딩하는 DNA 주형을 합성하여, 이스트 디스플레이 벡터에 통합시켰다. CH2 및 CH3 라이브러리 경우, 상기 Fc 폴리펩티드는 Aga2p 세포 벽 단백질 상에 표시되었다. 두 벡터 모두 Kex2 절단 서열을 갖는 프리프로(prepro) 리더 펩티드 및 Fc의 말단에 융합된 c-Myc 에피토프 테그를 함유 하였다.
이스트 디스플레이 라이브러리는 단편의 증폭을 벡터에 대해 상동성 말단을 함유하는 프라이머로 수행되었다는 점을 제외하고, 파아지 라이브러리에 대해 기술된 것과 유사한 방법을 사용하여 조립되었다. 새로 제조된 전기적격 이스트 (즉, 균주 EBY100)를 선형화된 벡터 및 조립된 라이브러리 삽입물과 함께 전기천공시켰다. 전기 천공법은 당업자에게 공지될 것이다. 선택적 SD-CAA 배지에서 회수한 후, 이스트를 합류되도록 성장시키고, 2 회 분할한 후, 그 다음 SG-CAA 배지로 옮겨 단백질 발현을 유도하였다. 전형적인 라이브러리 크기는 약 107 내지 약 109 형질전환체의 범위였다. Fc-이량체는 인접하여 표시된 Fc 단량체의 쌍형성에 의해 형성되었다.
파아지 선택을 위한 일반적인 방법
파아지 디스플레이: A Laboratory Manual (Barbas, 2001)에 따라 파아지 방법이 채용되었다. 이 문헌으로부터 추가 프로토콜 정보를 얻을 수 있다.
플레이트 분류 방법
인간 TfR 표적은 MaxiSorp® 미량적정 플레이트 (PBS에서 1-10 μg/mL의 농도, 전형적으로 200 μL)상에서 하룻밤 동안 4℃에서 피복되었다. 다른 언급이 없는 한, 모든 결합은 실온에서 실행되었다. 상기 파아지 라이브러리를 각 웰에 첨가하고 밤새 항온처리하여 결합시켰다. 미량적정 웰은 0.05% Tween® 20 (PBST)을 함유하는 PBS로 강력히 세척되고, 결합된 파아지는 상기 웰을 산 (전형적으로 50 mM HCl+500 mM KCl, 또는 100 mM 글리신, pH 2.7)과 함께 30 분 동안 항온처리함으로써 용리되었다. 용리된 파아지를 1M Tris(pH 8)로 중화시키고, TG1 세포 및 M13/KO7 헬퍼 파아지를 사용하여 증폭시키고, 그리고 50 μg/mL 카르베나실린, 및 50 ug/mL 카나마이신을 함유하는 2YT 배지에서 하룻밤 동안 37℃에서 성장시켰다. 표적-함유 웰로부터 용출된 파아지의 역가를 비-표적-함유 웰로부터 회수된 파아지 역가와 비교하여, 농축을 평가하였다. 결합 동안 항온처리 시간을 후속적으로 감소시키고, 세척 시간 및 세척 횟수를 증가시킴으로써, 선별 엄격 성을 증가시켰다.
비드 분류 방법
인간 TfR 표적은 NHS-PEG4-바이오틴 (Pierce™로부터 구함)을 이융하여 유리 아민을 통하여 바이오티닐화되었다. 바이오티닐화 반응의 경우, 3- 내지 5-배 몰 과량의 바이오틴 시약을 PBS에 사용하였다. 반응은 Tris로 ?칭된 후, PBS에서 광범위한 투석이 이어졌다. 상기 바이오티닐화된 표적은 스트렙타비딘-피복된 자석 비드 (가령, Thermo Fisher에서 구한 M280-스트렙타비딘 비드)상에 고정되었다. 상기 파아지 디스플레이 라이브러리는 상기 표적-피복된 비드와 함께 실온에서 1 시간 동안 항온처리되었다. 그 다음 결합안된 파아지는 제거되었고, 비드는 PBST로 세척되었다. 상기 결합된 파아지는 500 mM KCl (또는 0.1 M 글리신, pH 2.7)를 함유하는 50 mM HCl과 함께 30 분 동안 항온처리되어 용리되었고, 그 다음 중화되고, 플레이트 분류에서 기술된 바와 같이 증식되었다.
3 내지 5 라운드의 패닝(panning) 후, 단일 클론을 파아지상에서 Fc를 발현하거나, 대장균 원형질에서 용해시켜 스크리닝 하였다. 이러한 발현 방법은 당업자에게 공지될 것이다. 개체 파아지 상청액 또는 세포형질 추출물은 표적 또는 음성 대조군으로 피복된 차단된 ELISA 플레이트에 노출되며, 후속적으로 세포형질 추출물의 경우 HRP-접합된 염소 항-Fc (Jackson Immunoresearch에서 구함) 또는 파아지의 경우 항-M13 (GE Healthcare)를 이용하여 탐지되며, 그 다음 TMB 시약 (Thermo Fisher에서 구함)으로 발달되었다. 배경에 비해 약 5-배 이상의 OD450 값을 갖는 웰은 양성 클론으로 간주되었고, 서열화되고, 그 후 일부 클론은 가용성 Fc 단편으로 발현되거나 또는 Fab 단편에 융합되었다.
이스트 선택을 위한 일반적인 방법
비드 분류 (자석-지원된 세포 분류(MACS)) 방법
MACS 및 FACS 선택은 Ackerman, 등 2009 Biotechnol. Prog. 25(3), 774에서 기술된 것과 유사하게 실행되었다. 스트렙타비딘 자석 비드 (가령, ThermoFisher의 M-280 스트렙타비딘 비드)는 바이오티닐화된 표적으로 라벨되고, 이스트 (전형적으로 5-10x 라이브러리 다양성)와 함께 항온처리되었다. 결합안된 이스트는 제거되었고, 이 비드는 세척되고, 결합된 이스트는 선택 배지에서 성장되고, 후속 선별 라운드를 위하여 유도되었다.
형광-활성화된 세포 분류 (FACS) 방법
이스트는 발현 및 바이오티닐화된 표적(분류 라운드에 따라 농도는 가변됨)을 모니터하기 위하여 항-c-Myc 항체로 라벨링되었다. 일부 실험에서, 상호 작용의 결합능을 향상시키기 위해, 표적을 스트렙타비딘-Alexa Fluor® 647과 미리 혼합하였다. 다른 실험에서, 스트렙타비딘-Alexa Fluor® 647과의 결합 및 세척 후, 비오티 닐화된 표적이 검출되었다. 결합을 갖는 싱글릿(singlet) 이스트를 FACS Aria III 세포 분류기를 사용하여 분류하였다. 선별된 이스트를 선택 배지에서 성장시킨 후, 후속 선택 라운드를 위해 유도하였다.
농축된 이스트 집단을 얻은 후, 이스트를 SD-CAA 한천 플레이트 상에 플레이팅하고, 단일 콜로니를 성장시키고 발현을 유도하였고, 그 다음 표적에 결합하는 경향을 결정하기 위해 상기 기술한 바와 같이 라벨된다. 이어서, 표적 결합을 위해 양성 단일 클론을 서열화한 후, 일부 클론은 가용성 Fc 단편 또는 Fab 단편에 융합된 것으로 발현 하였다.
스크리닝을 위한 일반적인 방법
ELISA에 의한 스크리닝
클론을 패닝 산출물로부터 선택하고, 96-웰 딥-웰 플레이트의 개별 웰에서 성장시켰다. 클론은 자가유도 배지 (EMD Millipore로부터 입수)를 사용하여 세포형질 발현을 위해 유도되거나, 또는 파아지상의 개별 Fc 변이체의 파아지-디스플레이를 위한 헬퍼 파아지로 감염되었다. 배양물을 밤새 성장시키고, 대장균을 펠렛화하기 위해 회전시켰다. 파아지 ELISA의 경우, 상청액을 함유하는 파아지를 직접 사용 하였다. 세포형질 발현을 위해, 펠렛을 20% 슈크로스에 재현탁시킨 후, 물로 4:1로 희석하고, 4℃에서 1 시간 동안 진탕시켰다. 플레이트를 회전시켜 고체를 펠렛화하고, 상청액을 ELISA에 사용하였다.
ELISA 플레이트를 표적으로, 전형적으로 0.5 mg/mL에서 밤새 피복한 다음, 파아지 또는 세포질 추출물을 첨가하기 전, 1% BSA로 차단하였다. 1 시간 항온처리 및 결합되지 않은 단백질의 세척 후, HRP-접합된 제2 항체를 첨가하고 (즉, 가용성 Fc 또는 파아지-표시 Fc의 경우, 차례로 각각 항-Fc 또는 항-M13) 30 분 동안 항온처리하였다. 이 플레이트를 다시 세척한 다음, TMB 시약으로 발달시키고, 2N 황산으로 ?칭했다. 플레이트 리더 (BioTek®)를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 정량하고, 이용가능한 경우 Prism 소프트웨어를 사용하여 결합 곡선을 폴로팅하였다. 시험된 클론에 대한 흡광도 신호는 음성 대조군 (Fc가 없는 파아지 또는 파라플라스마 추출물)과 비교되었다. 일부 분석에서, 가용성 트랜스페린 또는 다른 경쟁자는 결합 단계 동안 전형적으로 상당한 몰 과량(10-배 이상 과량)으로 첨가되었다.
유동세포분석에 의한 스크리닝
Fc 변이 폴리펩티드 (파아지에서 발현되거나, 세포질 추출물 안에 또는 Fab 단편에 대한 융합으로 발현됨)를 96-웰 V-바닥 플레이트 (PBS + 1% BSA (PBSA)에서 웰당 약 100,000 세포)에 첨가하고, 4℃에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 이어서 상기 플레이트를 회전시키고, 배지를 제거한 후, 세포를 PBSA로 1 회 세척 하였다. 세포를 2 차 항체 (염소 항-인간 -IgG-Alexa Fluor® 647 (Thermo Fisher로부터 입수))를 함유하는 PBSA에 재현탁시켰다. 30 분 후, 상기 플레이트를 회전시키고 배지를 제거하고, 세포를 PBSA로 1-2 회 세척 한 후, 플레이트를 유동세포 분석기 (가령, FACSCanto™ II 유동세포 분석기)에서 판독하였다. FlowJo 소프트웨어를 사용하여 각 조건에 대한 중앙값 형광 값을 계산하고, 결합 곡선을 Prism 소프트웨어로 플롯팅하였다.
CH2A2 클론 생성 및 특징화
트란스페린 수용체 (TfR)에 대항하는 CH2A2 라이브러리를 이용한 선별
CH2A2에 대한 파아지 및 이스트 라이브러리를 상기 기재된 바와 같이 TfR에 대해 패닝(panned) 및 분류하였다. 인간 및/또는 시노몰구스 (cyno) TfR에 결합하는 클론은 4회 라운드의 파아지 패닝 후, 상기 "ELISA에 의한 스크리닝" 섹션에 기술된 바와 같이, ELISA 분석에서 확인하였다. 대표적인 클론의 서열은 두 집단에 속한다: 집단 1은 15개의 독특한 서열 (가령, 서열 번호:47-61)을 포함하고, 집단 2는 하나의 독특한 서열 (가령, 서열 번호:62)을 포함한다. 집단 1 서열은 위치 60-61에서 보존된 Glu-Trp 모티프를 가졌다. 위치 58은 Arg, 위치 59는 Trp 또는 Tyr를 선호하였지만, 임의의 다른 위치에는 콘센수스가 나타나지 않았다.
CH2A2 클론 특징화
개별 CH2A2 변이체는 파아지의 표면에서 발현되었고, 인간 TfR, cyno TfR 또는 무관한 대조군과의 결합은 ELISA에 의해 분석되었다. C-말단 c-Myc 에피토프 테그에 결합된 항-Myc 항체 9E10에 대항하는 Fc 발현은 ELSA에 의해 확인되었다. 4 개의 대표적인 클론에 대한 데이터는 도 1a-1d에 도시되어있고, 이들 두는 잘 발현되었고, 인간 TfR에 결합된 반면, 관련없는 대조군에는 결합되지 않았다. 집단 1의 3개 클론은 cyno TfR에 또한 결합된 반면, 집단 2의 1개 클론 (가령, 클론 2A2.16)은 인간 TfR에 특이적이었다.
두 번째 분석에서, 파아지의 농도는 일정하게 유지되었고 (즉, 적합한 EC50에서), 가용성 경쟁자인 홀로-트란스페린 또는 인간 TfR은 농도를 변화시키면서 첨가되었다. 도 2a 및 2b는 최대 5 μM 농도까지 홀로-트랜스페린의 첨가에 의해 결합은 현저하게 영향을 받지 않았다는 것을 보여준다. 반대로, 가용성 인간 TfR은 표면-흡착된 인간 TfR에 결합하기 위해 경쟁할 수 있으며, 이는 특이적 상호작용을 나타낸다.
CH2A2 변이체는 항-BACE1 가변 영역 서열을 함유하는 발현 벡터 안으로 클로닝함으로써, 항-BACE1 Fab 단편에 대한 Fc 융합체로서 발현된다. 293 또는 CHO 세포에서 발현 후, 생성된 CH2A2-Fab 융합체는 단백질 A 및 크기-배제 크로마토그래피에 의해 정제되었고, 그 다음 ELISAs, 표면 플라스몬 공명 (SPR; 가령, Biacore™ 기구 이용), 바이오층 간섭(biolayer inferometry) (가령, Octet® RED 시스템을 이용), 세포 결합 (가령, 유세포 분석), 및 본원에서 기술된 다른 방법을 이용하여 결합에 대하여 분석되었다. 또한, 생성된 폴리펩티드-Fab 융합체는 열 용융, 동결-해동 및 열-가속 변성에 의해 안정성이 특징화된다.
CH2A2 클론의 추가 공작
인간 및 cyno TfR에 대항한 초기 히트(hits) 결합 친화력을 향상시키기 위해, 2 개의 2 차 라이브러리를 구축하였다. 첫 번째 라이브러리는 집단 1 클론을 기반으로 생성되었다. 변이체에서 위치 60 및 61에 보존된 EW 모티프는 유지되었고, 위치 58에서 절반-보존된 R은 소프트 랜덤화를 이용하여 돌연변이되었다. 다른 라이브러리 위치 (가령, 위치 47, 49, 56, 59, 62, 및 63)는 포화(saturation) 돌연변이유발에 의해 돌연변이되었다. 두 번째 2 라이브러리는 집단 2 클론을 기반으로 생성되었다. 이 라이브러리는 원래 CH2A2 라이브러리 위치의 소프트 랜덤화에 의해 생성되었지만, 그러나 주형으로 클론 2A2.16 (서열 번호:62) (야생형 Fc (서열 번호:1)보다는)을 이용하였다. 두 라이브러리는 상기 기술된 방법을 사용하여 파아지 및 이스트 디스플레이용으로 구축되었다.
상기 기술된 방법을 사용하여 라이브러리를 스크리닝하고, ELISA에 의해 인간 TfR에 결합된 몇몇 클론을 확인 하였다 (표 1).
CH2C 클론 생성 및 특징화
트란스페린 수용체 (TfR)에 대항하는 CH2C 라이브러리를 이용한 선별
CH2C 에 대한 파아지 및 이스트 라이브러리를 상기 기재된 바와 같이 TfR에 대해 패닝 및 분류하였다. 인간 및/또는 시노몰구스 (cyno) TfR에 결합하는 클론(가령, 집단 1 및 4 클론)은 4회 라운드의 파아지 패닝 후, 상기 "ELISA에 의한 스크리닝" 섹션에 기술된 바와 같이, ELISA 분석에서 확인하였고, 상기 “이스트 선별을 위한 일반적인 방법”이라는 표제가 붙은 섹션에서 기술된 바와 같은, 이스트 결합 분석을 통하여 추가 클론은 4회 또는 5회 이스트 소트 라운드를 통하여 확인되었다 (가령, 집단 2 및 3 클론). 대표적인 클론의 서열은 4개 집단에 속한다: 집단 1은 16개의 독특한 서열 (가령, 서열 번호:63-78)을 포함하고, 집단 2는 4개의 독특한 서열 (가령, 서열 번호:79-82)을 포함하고, 집단 3은 2개의 독특한 서열 (가령, 서열 번호:83-84)을 포함하고, 그리고 집단 4는 단일 서열 (가령, 서열 번호:85)을 포함한다. 상기 집단 1 서열은 위치 39에서 절반-보존된 Pro를 갖고, 위치 42에서 절반-보존된 Pro를 갖고, 위치 43에서 보존된 Pro를 갖고, 위치 44에서 절반-보존된 Trp를 갖고, 위치 68에서 절반-보존된 Glu를 갖고, 위치 70에서 보존된 Tyr를 갖고, 다른 라이브러리 위치들에서는 특이적인 선호는 거의 없었다. 상기 집단 2 서열은 위치 39에서 보존된 Met를 갖고, 위치 40에서 절반-보존된 L를 갖고, 위치 42에서 보존된 Pro를 갖고, 위치 43에서 보존된 Val를 갖고, 위치 44에서 절반-보존된 Pro를 갖고, 위치 68에서 절반-보존된 Thr를 갖고, 위치 70에서 보존된 His를 갖고, 그리고 위치 72에서 보존된 Pro를 가졌다. 2개 집단 3 서열은 오직 위치 68에서만 상이한데, 이 위치에는 Val 또는 Leu가 존재하였다. 집단 4는 서열 번호:85에 나타낸 서열을 갖는 단일 클론 (가령, CH2C.23)으로 구성되었다.
CH2C 클론의 특징화
상기 CH2C 변이체는 항-BACE1 벤치마크(benchmark) 가변 영역 서열을 함유하는 발현 벡터 안으로 클로닝함으로써, Fab 단편에 Fc 융합체로서 발현되었다. 293 또는 CHO 세포에서 발현 후, 생성된 폴리펩티드-Fab 융합체는 단백질 A 및 크기-배제 크로마토그래피에 의해 정제되었고, 그 다음 인간 또는 cyno TfR에 대한 결합에 대하여 분석하였다. 도 3a에서 나타낸 것과 같이, 집단 4 클론 CH2C.23은 홀로-트란스페린과 경쟁하였다. 서열 집단 1에 속하는 클론은 도 3b에서 인간 및 cyno TfR에 대항한 결합 역가로 나타낸다. 다른 서열 집단의 대표적인 클론들은 홀로-Tf의 존재 또는 부재시 결합에 대하여 파아지에서 테스트되었고 (도 3c 참고), 클론 CH2C.7은 홀로-트란스페린 존재하에 인간 TfR에 대한 결합에 대하여 생물층 간섭계를 이용하여 테스트되었다 (가령, Octet® RED 시스템이용; 도 3d 참고). 대부분의 클론은 cyno TfR에 대해 일부 교차 반응성을 보였으며, 클론 CH2C.23을 제외하고, 시험된 클론은 홀로-Tf와 경쟁하지 않았다.
CH3B 클론 생성 및 특징화
트란스페린 수용체 (TfR)에 대항하는 CH3B 라이브러리를 이용한 선별
CH3B에 대한 파아지 및 이스트 라이브러리를 상기 기재된 바와 같이 TfR에 대해 패닝 및 분류하였다. 인간 및/또는 cyno TfR에 결합하는 클론은 4회 라운드의 파아지 패닝 후, 상기 "ELISA에 의한 스크리닝" 섹션에 기술된 바와 같이, ELISA 분석에서 확인하였고, 상기 “이스트 선별을 위한 일반적인 방법”이라는 표제가 붙은 섹션에서 기술된 바와 같은, 이스트 결합 분석을 통하여 추가 클론은 4회 또는 5회 이스트 소트 라운드를 통하여 확인되었다. 파아지 및 이스트 모두로부터 확인된 17개 모든 클론 (가령, 서열 번호:30-46)은 관련된 서열을 보유하였고; 상기 서열은 위치 118에서 절반-보존된 Phe를 갖고, 위치 119에서 절반-보존된 음으로 하전된 Asp 또는 Glu를 갖고, 위치 122에서 절반-보존된 Thr를 갖고, 위치 210에서 보존된 G를 갖고, 위치 211에서 보존된 Phe를 갖고, 위치 212에서 절반-보존된 His를 갖고, 그리고 위치 213에서 보존된 Asp를 가졌다. 몇 개의 클론은 T123I 돌연변이를 보유하였는데, 이는 상기 라이브러리 디자인에서 의도적으로 돌연변이된 위치가 아닌지만, 그러나 추측컨데 재조합 또는 PCR 오류에 의해 도입된 것이다.
CH3B 클론의 특징화
2개의 대표 클론, CH3B.11 (서열 번호:40) 및 CH3B.12 (서열 번호:41)은 파아지의 표면 상에 발현되었고, 그리고 홀로-Tf의 존재 또는 부재하에, 인간 및 cyno TfR에 결합하는 것에 대하여 테스트되었다. 클론은 홀로-Tf의 첨가에 의해 영향을 받지 않았다 (도 4a). 추가적으로, 상기 CH3B 변이체는 항-BACE1 가변 영역 서열을 함유하는 발현 벡터 안으로 클로닝함으로써, Fab 단편에 융합체로서 발현되었다. 293 또는 CHO 세포에서 발현 후, 생성된 폴리펩티드-Fab 융합체는 단백질 A 및 크기-배제 크로마토그래피에 의해 정제되었고, 그 다음 인간 또는 cyno TfR에 대한 결합에 대하여 분석하였다(도 4b). 모두다 두 오르소로그(orthologs)에 특이적 결합을 나타내었다.
CH3B 클론의 추가 공작
추가 라이브러리의 설계 및 스크리닝을 위해, CH2A2에 대해 전술 한 것과 유사한 추가 엔지니어링 방법을 사용하여 CH3B 클론의 친화력을 개선하였다. 특히, 도 5에 도시된 바와 같이, 추가 다양화(diversification)를 위해 파라토프 근처의 몇몇 일련의 4 내지 7 개의 잔기 패치가 선택되었다 (어두운 표면은 원래 라이브러리 레지스터를 나타내고; 밝은 패치는 새로 돌연변이된 위치를 나타낸다). 클론 CH3B.12 (서열 번호:41)은 출발점으로 이용되었고; 포화 (가령, NNK) 돌연변이유발을 위하여 선택된 잔기들은 다음과 같다:
CH3B-패치1 (서열 번호:101): 아미노산 위치 127, 128, 129, 131, 132, 133, 및 134;
CH3B-패치2 (서열 번호:102): 아미노산 위치 121, 206, 207, 및 209;
CH3B-패치3 (서열 번호:103): 아미노산 위치 125, 214, 217, 218, 219, 및 220;
CH3B-패치4 (서열 번호:104): 아미노산 위치 115, 117, 143, 174, 및 176; 그리고
CH3B-패치5 (서열 번호:105): 아미노산 위치 155, 157, 158, 193, 194, 및 195.
상기 라이브러리는 PCR 돌연변이유발을 사용하여 생성하였고, 상기 “파아지-디스플레이 라이브러리의 생성” 및 “이스트-디스플레이 라이브러리의 생성” 이란 제목의 섹션에서 기술된 바와 같이, 효모 및 파지에 넣었다. 상기 기술된 방법을 사용하여 라이브러리를 스크리닝하고, ELISA에 의해 인간 TfR에 결합된 몇몇 클론을 확인 하였다 (표 5).
CH2D 클론 생성 및 특징화
트란스페린 수용체 (TfR)에 대항하는 CH2D 라이브러리를 이용한 선별
CH2D에 대한 파아지 라이브러리를 상기 기재된 바와 같이 TfR에 대해 패닝하였다. 인간 및/또는 cyno TfR에 결합하는 클론은 상기 "ELISA에 의한 스크리닝" 섹션에 기술된 바와 같이, ELISA 분석에서 확인하였다. 5 개의 독특한 클론들이 확인되었고, 이들은 차례로 2개 및 3개 서열의 2개 서열 패밀리로 집단화되었다(표 3). 서열 집단 1 (가령, 클론 CH2D.1 (서열 번호:86) 및 CH2D.2 (서열 번호:87))은 위치 40-45에서 보존된 VPPXM (서열 번호:111) 모티프, 위치 64-67에서 SLTS (서열 번호:112) 모티프, 그리고 위치 73에서 V를 보유하였다. 위치 40에서 돌연변이는 이 기획에는 포함되지 않았었고, 이것은 아마도 PCR 오류 또는 재조합으로 인한 것이었다. 서열 집단 2 (가령, 클론 CH2D.3 (서열 번호:88), CH2D.4 (서열 번호:89), 및 CH2D.5 (서열 번호:90))는 위치 41에서 보존된 D를 갖고, 위치 42에서 절반-보존된 D를 갖고, 위치 43에서 보존된 W를 갖고, 위치 44에서 절반-보존된 E를 갖고, 위치 45에서 보존된 방향족 (W 또는 Y)를 갖고, 위치 64-65에서 보존된 PW 모티프를 갖고, 그리고 위치 73에서 보존된 W를 가졌다.
CH2D 클론의 특징화 및 추가 공작
CH2D 변이체는 항-BACE1 가변 영역 서열을 함유하는 발현 벡터 안으로 클로닝함으로써, Fab 단편에 융합체로서 발현되었다. 293 또는 CHO 세포에서 발현 후, 생성된 폴리펩티드-Fab 융합체는 단백질 A 및 크기-배제 크로마토그래피에 의해 정제되었고, 기존에 설명된 방법을 이용하여, 홀로-Tf의 존재 또는 부재시 cyno 및 인간 TfR에 대한 결합에 대하여 분석하였다.
CH2E3 클론 생성 및 특징화
트란스페린 수용체 (TfR)에 대항하는 CH2E3 라이브러리를 이용한 선별
CH2E3에 대한 파아지 라이브러리를 상기 기재된 바와 같이 TfR에 대해 패닝하였다. 인간 및/또는 cyno TfR에 결합하는 클론은 상기 "ELISA에 의한 스크리닝" 섹션에 기술된 바와 같이, ELISA 분석에서 확인하였다. 3 개의 서열 집단은 5 개의 서열로부터 확인되었지만, 이들 집단중 2 개는 각각 하나의 독특한 서열로만 구성되었다 (표 4). 서열 집단 2는 3개 독특한 서열 (가령, 클론 CH2E3.2 (서열 번호:92), CH2E3.3 (서열 번호:93), 및 CH2E3.4 (서열 번호:94))을 보유하였고, 위치 45에서 절반-보존된 Val를 갖고, 위치 47에서 보존된 Gly를 갖고, 위치 49에서 보존된 Arg를 갖고, 위치 95에서 보존된 Arg를 갖고, 위치 97 및 99에서 보존된 Ser를 갖고, 위치 103에서 보존된 Trp를 갖고, 그리고 위치 104에서 Arg 또는 Lys를 가졌다.
CH2E3 클론의 특징화 및 추가 공작
CH2E3 변이체는 항-BACE1 벤치마크 가변 영역 서열을 함유하는 발현 벡터 안으로 클로닝함으로써, Fab 단편에 융합체로서 발현되었다. 293 또는 CHO 세포에서 발현 후, 생성된 폴리펩티드-Fab 융합체는 단백질 A 및 크기-배제 크로마토그래피에 의해 정제되었고, 기존에 설명된 결합 방법을 이용하여, 홀로-Tf의 존재 또는 부재시 cyno 및 인간 TfR에 대한 결합에 대하여 분석하였다.
CH3C 클론 생성 및 특징화
트란스페린 수용체 (TfR)에 대항하는 CH3C 라이브러리를 이용한 선별
CH3C에 대한 이스트 라이브러리를 상기 기재된 바와 같이 TfR에 대해 패닝 및 분류하였다. 첫 3회 소트 라운드를 위한 집단 농축(enrichment) FACS 플롯은 도 6에 나타낸다. 추가로 2 라운드의 분류 후, 단일 클론을 서열화하고, 4개 독특한 서열 (가령, 클론 CH3C.1 (서열 번호:4), CH3C.2 (서열 번호:5), CH3C.3 (서열 번호:6), 및 CH3C.4 (서열 번호:7))을 확인하였다. 이들 서열은 위치 161에 보존된 Trp을 갖고, 이들 모두는 위치 194에서 방향족 잔기 (가령, Trp, Tyr, 또는 His)를 보유하였다. 다른 위치에는 많은 다양성이 있었다.
1세대 CH3C 클론의 특징화
CH3C 라이브러리로부터 선택된 4 개의 클론은 CHO 또는 293 세포에서 Fab 단편에 대한 Fc 융합으로서 발현되었고, 단백질 A 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제된 후, ELISA에 의한 홀로-Tf의 존재 또는 부재하에, cyno 및 인간 TfR에 결합하는 것을 스크리닝하였다. 도 7에서 나타낸 것과 같이, 이 클론은 모두 인간 TfR에 결합하였고, 과량 (5 μM)의 홀로-Tf를 첨가해도 결합은 영향을 받지 않았다. 그러나, 이들 클론은 cyno TfR에 눈에 띄게 결합하지 않았다. 클론은 또한 인간 TfR을 내생적으로 발현하는 293F 세포에 대한 결합에 대해 시험되었다. 도 8은 이들 클론은 293F 세포에 결합하였고, 전체 결합이 고친화력 양성 대조군보다 실질적으로 약하였다.
다음으로, 클론 CH3C.3이 TfR-발현 세포에서 내재화될 수 있는지 시험하였다. 흡착 HEK293 세포는 96-웰 플레이트에서 약 80% 합류되도록 성장되었고, 배지는 제거되었고, 그리고 시료는 1 μM 농도로 추가되었다: CH3C.3, 항-TfR 기준 양성 대조군 항체 (Ab204), 항-BACE1 기준 음성 대조군 항체 (Ab107), 및 인간 IgG 동소체 대조군 (Jackson Immunoresearch에서 구함). 이들 세포는 37℃ 및 8% CO2 농도에서 30 분간 항온처리되었고, 그 다음 세척되고, 0.1% Triton™ X-100으로 투과화되고, 항-인간-IgG-Alexa Fluor® 488 제2 항체로 착색되었다. 추가 세척 후, 세포를 고함량 형광 현미경 (즉, Opera Phenix™ 시스템) 하에서 이미지화하고, 도 9에 나타낸 것과 같이, 세포당 푼타(puncta)의 수를 정량화하였다. 1 μM에서 클론 CH3C.3은 양성 항-TfR 대조군과 유사한 내재화 경향을 보였으며, 한편 음성 대조군은 내재화를 나타내지 않았다.
CH3C 클론의 2차 공작
인간 TfR에 대한 초기 CH3C 히트의 친화력을 개선하기 위해, 그리고 cyno TfR에 대한 결합을 유도하는 것을 시도하기 위하여, 추가 라이브러리가 생성되었다. 소프트 랜덤화 접근법을 사용하였고, 이때 DNA 올리고는 원래의 4 개의 히트 각각에 기초하여 소프트 돌연변이 유발을 도입하기 위해 생성되었다. 리지스터의 제1 부분 (WESXGXXXXXYK; 서열 번호:113) 및 리지스터의 제2 부분 (TVXKSXWQQGXV; 서열 번호:114)은 별도의 단편을 통하여 구축되어, 상기 소프트 무작위화된 레지스터는 PCR 증폭하는 동안 셔플되었다 (가령, 클론 CH3C.1로부터 리지스터의 제1 부분은 클론 CH3C.1, CH3C.2, CH3C.3, 및 CH3C.4, 및 등등으로부터 리지스터의 제2 부분과 혼합되었다). 단편을 모두 혼합한 후 표면 발현 및 선별을 위해 이스트에 도입하였다.
선별 체계는 도 10에 나타낸다. 1 라운드의 MACS 및 3 라운드의 FACS 후, 개별 클론들이 서열화되었다 (클론 CH3C.17 (서열 번호:8), CH3C.18 (서열 번호:9), CH3C.21 (서열 번호:10), CH3C.25 (서열 번호:11), CH3C.34 (서열 번호:12), CH3C.35 (서열 번호:13), CH3C.44 (서열 번호:14), 및 CH3C.51 (서열 번호:15)). 선택된 클론은 2 개의 일반적인 서열 집단으로 분류되었다. 집단 1 클론 (가령, 클론 CH3C.18, CH3C.21, CH3C.25, 및 CH3C.34)은 위치 157에서 절반-보존된 Leu를 갖고, 위치 159에서 Leu 또는 His를 갖고, 위치 160 및 162에서 차례로 보존된 및 절반-보존된 Val를 갖고, 그리고 위치 186, 189, 및 194에서 차례로 절반-보존된 P-T-W 모티프를 가졌다. 집단 2 클론은 위치 157에서 보존된 Tyr를 갖고, 위치 159-163에서 모티프 TXWSX (서열 번호:602)를 갖고, 그리고 위치 186, 189, 및 194에서 차례로 보존된 모티프 S/T-E-F를 가졌다. 클론 CH3C.18 및 CH3.35는 추가 연구에서 각 서열 군의 대표 구성원으로 사용되었다. 클론 CH3C.51은 집단 1의 리지스터의 제 1 부분을 가지고, 집단 2의 리지스터의 제 2 부분을 가졌다는 것을 주목하였다.
소프트 돌연변이유발 라이브러리로부터 CH3C 클론의 결합 특징화
소프트 돌연변이유발 라이브러리의 클론들은 Fc-Fab 융합 폴리펩티드로 재구성되었고, 상기에서 기술된 바와 같이 발현 및 정제되었다. 도 12에 도시된 바와 같이, 이들 변이체는 초기 라이브러리 선별에서의 최고 클론 (CH3C.3)과 비교하여, 인간 TfR에 대한 ELISA 결합이 개선되었으며, 또한 홀로-Tf와 경쟁하지 않았다. 하기 표 7에 나타낸 EC50 값은 홀로-Tf의 존재 또는 부재에 의한 실험의 오차 한계를 넘어서 현저한 영향을 미치지 않았다.
눈에 띄는 것으로, 클론 CH3C.35는 인간 TfR, 뿐만 아니라 고친화력 항-Tfr 대조군 항체 Ab204에 결합하였다. 소프트 랜덤화 라이브러리로부터 선택된 클론은 또한 도 13에서 나타난 바와 같이, 293F 세포에 대한 세포 결합이 개선되었다. 유사한 세포 결합 분석에서, 이들 클론은 높은 수준의 인간 또는 cyno TfR을 안정적으로 발현시키는 CHO-K1 세포 표면에서 이들 세포에 대한 결합을 시험하였다. 소프트 랜덤화 라이브러리로부터 선택된, 인간 TfR (도 14a) 뿐만 아니라 cyno TfR (도 14b)를 발현시키는 세포에 결합된 클론은 부모 CHO-K1 세포 (도 14c)에 결합하지 않았다. 인간 TfR과 비교하여, cyno TfR에 대한 크기 및 결합 EC50 값이 실질적으로 더 낮았다. 데이터는 하기 표 8에 요약된다.
에피토프 메핑
조작된 CH3C Fc 영역이 TfR의 정점 도메인 (인간 및 cyno의 경우 차례로 서열 번호:107 및 108) 에 결합되는지 여부를 결정하기 위해, TfR 정점 도메인을 파아지의 표면에 발현시켰다. 정점 도메인을 올바르게 폴딩하고 표시하려면, 루프 중 하나를 잘라내고 서열을 순환 재배치해야 했다; 파아지 상에 발현된 서열은 인간 및 cyno의 경우 차례로 서열 번호:109 및 110으로 확인되었다. 클론 CH3C.18 및 CH3C.35는 ELISA 플레이트상에 피복시키고, 기존 기술된 파아지 ELISA 프로토콜을 따랐다. 간략하게 설명하자면, 1% PBSA로 세척 및 차단한 후, 파아지 디스플레이의 희석액을 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 상기 플레이트는 후속적으로 세척되었고, 항-M13-HRP가 추가되었고, 추가 세척후 상기 플레이트는 TMB 기질로 발달시키고, 2N H2SO4로 ?칭하였다. 이 분석에서 CH3C.18 및 CH3C.35는 모두 정점 도메인에 결합되었다.
cyno TfR에의 결합은 인간 TfR에의 결합보다 훨씬 약한 것으로 알려져 있기 때문에, cyno와 인간의 정점 도메인 사이의 하나 또는 그 이상의 아미노산 차이가 결합 차이에 원인이될 수 있다고 가정되었다. 따라서, 인간 잔기가 상응하는 cyno 잔기로 대체된 인간 TfR 정점 도메인에서 일련의 6개 점 돌연변이가 이루어졌다. 이들 돌연변이체는 파아지 상에 디스플레이되었고, 파아지 농도는 OD268에 의해 표준화되었고, CH3C.18 및 CH3C.35에 대한 결합은 파아지 ELISA 적정에 의해 테스트되었다(도 16b 및 16c). 항-Myc 항체 9E10에서의 포획은 모든 돌연변이체에 대한 디스플레이 수준이 유사하다는 것을 보여주었다(도 16a). 인간 TfR 돌연변이에 대한 결합은 R208G 돌연변이의 강력한 효과를 분명히 보여주었고, 이는 이 잔기가 에피토프의 핵심 부분이며, 이 위치에서 cyno 잔기에 의해 부정적인 영향을 받는다는 것을 시사한다. G208R 돌연변이는 파아지-디스플레이된 cyno 정점 도메인상에서 이루어졌으며, 이 돌연변이는 cyno 정점 도메인에 대한 결합을 극적으로 개선시키는 것으로 나타났다(도 16d 및 16e). 이러한 결과는 CH3C 클론이 TfR의 정점 도메인에 결합하고, 위치 208이 결합에 중요하고, 한편 위치 247, 292, 364, 370 및 372는 중요성이 상당히 떨어지는 것으로 나타났다.
파라토프 메핑
Fc 도메인의 어떤 잔기가 TfR 결합에 가장 중요한지를 이해하기 위해, 일련의 돌연변이체 CH3C.18 및 CH3C.35 클론을 만들었고, 이때 각 돌연변이체는 TfR-결합 리지스터에서 야생형으로 다시 돌아간 하나의 위치를 가졌다. 생성된 변이체를 CH3C Fc-Fab 융합으로서 재조합적으로 발현시키고, 인간 또는 cyno TfR 에의 결합에 대해 시험하였다.(도 17). CH3C.35의 경우, 위치 161 및 194는 결합에 절대적이며; 이들 중 하나의 야생형으로의 복귀는 인간 TfR에 대한 결합을 완전히 없애버렸다. 놀랍게도, 위치 163의 야생형으로 복귀는 인간 결합에 거의 영향을 미치지 않으면서 cyno TfR 결합에 대한 극적인 증가를 제공하였다. 반대로, 잔기 163의 야생형으로의 복귀는 CH3C.18에서 거의 영향을 미치지 않았지만, 이 변이체에서 위치 189 및 194의 복귀는 인간 TfR에 대한 결합을 완전히 없애버렸다. 두 변이체에서, 다른 단일 복귀는 인간 TfR 결합에 대해 중간 정도의 (유해한) 영향을 미쳤지 만, 많은 경우에 cyno TfR에 대한 결합은 없어졌다.
cyno TfR에 개선된 결합을 제공하기 위한 추가 공작
cyno TfR에 대한 CH3C 변이체의 친화력을 추가로 증가시키기 위해 추가 라이브러리를 제조 하였다. 이들 라이브러리는 이론적 다양성 측면에서 약 107개 미만의 클론으로 설계되어, 이스트 표면 디스플레이를 사용하여 전체 다양성 공간을 탐색할 수 있다. 이들 라이브러리의 설계는 도 18에 나타낸다. 4개 라이브러리 설계를 이용하였고; 모든 라이브러리는 NNK 또는 기타 축퇴 코돈 위치를 갖는 축퇴(degenerate) 올리고를 이용하여 만들었고, 상기에서 기술된 바와 같이, 중첩(overlap) PCR을 이용하여 증폭시켰다.
제1 라이브러리는 CH3C.35-유사(like) 서열의 콘센수스에 기초하였다(도 18a). 여기에서, 위치 157-161는 YGTEW (서열 번호:115)를 항상 유지한 반면, 위치 162, 163, 186, 189, 및 194는 포화 돌연변이유발을 이용하여 돌연변이되었다.
제2 라이브러리는 CH3C.18-유사(like) 서열의 콘센수스에 기초하였다 (도 18b). 여기에서, 위치 157은 Leu 및 Met로 제한되었고, 위치 159는 Leu 및 His로 제한되었고, 위치 160은 Val로 일정하게 유지되었고, 위치 161은 Trp 및 Gly로 제한되었고, 위치 162는 Val 및 Ala로 제한되었고, 위치 163은 완전히 무작위화되었고, 위치 164는 이 리지스터에 추가되었고, 그리고 완전히 무작위화되었고, 위치 186은 소프트 무작위화되었고, 위치 189는 완전히 무작위화되었고, 그리고 위치 194는 방향족 아미노산 및 Leu로 제한되었다.
제 3 라이브러리는 새롭게 무작위화된 위치들을 상기 라이브러리에 추가하였다 (도 18c). 각각 CH3C.18과 CH3C.35를 시작 레지스터로 사용하는 두 가지 버전이 생성되었고, 그 다음 추가 위치는 포화 돌연변이유발에 의해 무작위화되었다: E153, E155, Y164, S188, 및 Q192.
제 4 라이브러리는 CH3C.18의 경우 일정한 특정 위치를 유지하였지만, 다른 위치들에서 변이를 허용하였고, 콘센수스 라이브러리보다는 편향이 적었다 (도 18d). 위치 160, 161, 및 186은 고정되었고, 위치 157, 159, 162, 163, 및 189는 포화(saturating) 돌연변이유발에 의해 무작위화되었고; 위치 194는 돌연변이되었지만, 방향족 잔기 및 Leu로 제한되었다.
상기 라이브러리는 cynoTfR에 대해 4 내지 5회 라운드 동안 이스트에서 선택되었고, 단일 클론은 서열화되었고, 상기 기재된 바와 같이 폴리펩티드-Fab 융합체로 전환되었다. 제2 라이브러리로부터 cynoTfR 결합에서 최대 농축이 관찰되었지만 (가령, 상기 CH3.18 부모계의 유도체), huTfR 결합에서는 약간의 손실이 또한 있었다.
CH3C 성숙 클론의 결합 특징화
상기 기재된 바와 같이 플레이트 상에 코팅된 인간 또는 cyno TfR을 갖는 정제된 CH3C Fc-Fab 융합 변이체와 함께 결합 ELISAs를 수행하였다. CH3C.18 성숙 라이브러리의 변이체들, CH3C3.2-1, CH3C.3.2-5, 및 CH3C.3.2-19는 인간 및 cyno TfR에 대략적으로 등가의 EC50 값으로 결합하였지만, 반면 부모 클론 CH3C.18, 및 CH3C.35는 cyno TfR에 비교하여 인간에 10-배 이상 더 잘 결합되었다(도 19).
다음으로, 새로운 폴리펩티드가 인간 및 원숭이 세포에 내재화되어 있는지 여부를 시험하였다. 상기 “제1 생성 CH3C 클론의 특징화" 제목의 섹션 기술된 프로토콜을 사용하여, 인간 HEK293 세포 및 붉은털원숭이(rhesus) LLC-MK2 세포에서의 내재화를 시험하였다. 도 20에 나타낸 바와 같이, 인간 및 cyno TfR, CH3C.3.2-5 및 CH3C.3.2-19 클론과 유사하게 결합하는 변이체는 CH3C.35와 비교하여, LLC-MK2 세포에서 내재화가 상당히 개선되었다.
CH3C 클론의 추가 공작
추가 친화력 성숙 클론 CH3C.18 및 CH3C.35에 대한 추가 공학은 직접적인 상호 작용, 2 차-쉘 상호 작용 또는 구조 안정화를 통해 결합을 향상시키는 백본 (가령, 비-리지스터)위치에 추가 돌연변이를 추가하는 것과 관련되었다. 이것은 "NNK 워크(walk)"또는 "NNK 패치(patch)"라이브러리에서 생성 및 선택을 통해 달성되었다. NNK 워크 라이브러리는 파라토프에 가까운 잔기의 NNK 돌연변이를 하나-하나-씩 생성하는 것을 포함하였다. FcgRI에 결합된 Fc 구조(PDB ID: 4W4O)를 살펴보면, 도 21에 나타낸 것과 같이, 원래 라이브러리 리지스터 근처의 44개 잔기는 심문(interrogation) 후보로 확인되었다. 구체적으로, 다음 잔기가 NNK 돌연변이유발 표적이 되었다: K21, R28, Q115, R117, E118, Q120, T132, K133, N134, Q135, S137, K143, E153, E155, S156, G158, Y164, K165, T166, D172, S173, D174, S176, K182, L183, T184, V185, K187, S188, Q191, Q192, G193, V195, F196, S197, S199, Q211, S213, S215, L216, S217, P218, G219, 및 K220. Kunkel 돌연변이유발을 이용하여, 44 개의 단일 점 NNK 라이브러리를 생성하고, 다른 이스트 라이브러리에 대해 상기 기재된 바와 같이, 생성물을 모아서 전기천공을 통해 이스트로 도입하였다.
이들 미니-라이브러리의 조합(각각 하나의 위치가 돌연변이되어 20개의 변이체가 생성됨)은 더 큰 친화력 결합을 유도하는 임의의 위치에 대해 이스트 표면 디스플레이를 사용하여 선택된 작은 라이브러리를 생성하였다. TfR 정점 도메인 단백질을 사용하여 상기 기재된 바와 같이 선별을 수행하였다(도 22). 3 라운드의 분류(sorting) 후, 농축 이스트 라이브러리로부터의 클론을 서열화하고, 특정 점 돌연변이가 정점 도메인 단백질에 대한 결합을 유의하게 개선시키는 몇몇 "핫-스팟(hot-spot)"위치가 확인되었다. 클론 CH3C.35의 경우, 이들 돌연변이는 E153 (Trp, Tyr, Leu, 또는 Gln로 돌연변이됨) 및 S188 (Glu로 돌연변이됨)를 포함하였다. 상기 CH3C.35 단일 및 복합 돌연변이체의 서열은 서열 번호:21-23, 236-241, 및 297-299에서 제시된다. CH3C.18의 경우, 이들 돌연변이는 E153 (Trp, Tyr, 또는 Leu로 돌연변이됨) 및 K165(Gln, Phe, 또는 His로 돌연변이됨)를 포함하였다. CH3C.18 단일 돌연변이의 서열은 서열 번호:242-247에 제시된다.
“NNK 패치” 접근법은 상기 CH3B 라이브러리에서 기술된 것과 유사하지만, 그러나 패치들은 상기 CH3C 리지스터에 바로 이웃한다. 클론 CH3C.35는 시작점으로 이용되었고, 다음 라이브러리들이 생성되었다:
CH3C-패치1: 아미노산 위치: K21, R28, Y164, K165, 및 T166;
CH3C-패치2: 아미노산 위치: Q115, R117, E118, Q120, 및 K143;
CH3C-패치3: 아미노산 위치: T132, K133, N134, Q135, 및 S137;
CH3C-패치4: 아미노산 위치: E153, E155, S156, 및 G158;
CH3C-패치5: 아미노산 위치: D172, S173, D174, S176, 및 K182;
CH3C-패치6: 아미노산 위치: L183, T184, V185, K187, 및 S188;
CH3C-패치7: 아미노산 위치: Q191, Q192, G193, V195, 및 F196;
CH3C-패치8: 아미노산 위치: S197, S199, Q211, S213, 및 S215; 그리고
CH3C-패치9: 아미노산 위치: L216, S217, P218, G219, 및 K220.
TfR 정점 도메인 단백질을 사용하여 상기 기재된 바와 같이 선별을 수행하였다. 그러나, 결합이 강화된 클론은 확인되지 않았다.
또다른 측면에서, 본 명세서는 비-고유의 결합 부위를 포함하는 변형된 Fc 폴리펩티드가 표적 (가령, 트란스페린 수용체)에 결합하는 것을 강화시키는 방법을 특징으로 하는데, 상기 방법 다음을 포함한다: (a) 비-고유의 결합 부위의 10 Å이내 (가령, 9 Å, 8 Å, 7 Å, 6 Å, 5 Å, 4 Å, 3 Å, 2 Å, 또는 1 Å) 하나 또는 그 이상의 위치에 하나 또는 그 이상의 치환을 도입시키고; 그리고 (b) 상기 변형된 Fc 폴리펩티드가 상기 표적에 결합하는 지를 테스트한다. 상기 변형된 Fc 폴리펩티드가 이 표적 (가령, 트란스페린 수용체)에 결합 성질은 당분야에 이용가능한 방법들, 가령, 파아지 및 이스트 선별 방법, ELISA, 표면 플라스몬 공명 (SPR; 가령, Biacore™ 기구를 이용), 및 FACS를 이용하여 결정될 수 있다.
일부 구체예들에서, 상기 비-고유의 결합 부위는 다음 위치중 하나 또는 그 이상에서 치환을 포함한다: 157, 159, 160, 161, 162, 163, 186, 189, 및 194.
일부 구체예들에서, 상기 비-고유의 결합 부위의 10 Å 이내 하나 또는 그 이상의 위치에서 하나 또는 그 이상의 치환은 서열 번호:1을 참고하여, K21, R28, Q115, R117, E118, Q120, T132, K133, N134, Q135, S137, K143, E153, E155, S156, G158, Y164, K165, T166, D172, S173, D174, S176, K182, L183, T184, V185, K187, S188, Q191, Q192, G193, V195, F196, S197, S199, Q211, S213, S215, L216, S217, P218, G219, 및 K220으로 구성된 군에서 선택된다.
CH3C.35 친화력을 개선시키기 위한 추가 성숙 라이브러리
NNK 워크 라이브러리로부터 돌연변이의 조합을 확인하기 위한 추가 라이브러리는 이들의 주변에 몇 가지 추가 위치를 추가하면서, 이전 이스트 라이브러리에 대해 기술된 바와 같이 생성되었다. 이 라이브러리에서, YxTEWSS 및 TxxExxxxF 모티프는 일정하게 유지되었고, 6개 위치는 완전히 무작위화되었다: E153, K165, K187, S188, S197, 및 S199. 위치 E153 및 S188은 NNK 워크 라이브러리의 "핫 스팟"이기 때문에 포함되었다. 위치 K165, S197, 및 S199는 결합 영역을 위치시킬 수 있는 코어의 일부를 구성하기 때문에 포함되었으며, K187은 위치 188에 대한 인접성으로 인해 선택되었다.
이 라이브러리는 앞에서 설명한대로 cyno TfR 정점 도메인으로 만 정렬되었다. 농축된 모둠(pool)은 5 라운드 후에 서열화되었고, 확인된 고유 클론의 CH3 영역의 서열은 서열 번호:248-265에 제시되어 있다.
CH3C.35.21의 경우 원래 리지스터내 그리고 핫 스팟안에서 수용가능한 다양성의 탐색
다음 라이브러리는 주요 결합 파라토프에서 허용가능한 전체 다양성을 탐색하도록 설계되었다. 취한 접근법은 NNK 워크 라이브러리와 유사하였다. 각 원래 리지스터 위치 (157, 159, 160, 161, 162, 163, 186, 189, 및 194)에 추가로 2개의 핫 스팟 (153 및 188)을 NNK 코돈으로 개별적으로 무작위화하여, 이스트에서 일련의 단일 위치 포화 돌연변이유발 라이브러리를 생성하였다. 추가적으로, 각각의 위치를 개별적으로 야생형 잔기로 되돌리고, 이들 개별 클론을 이스트에 표시하였다. 도 23은 야생형 복귀 및 단일-위치 NNK 라이브러리와 비교하였을 때, 부모 클론 CH3C.35.21의 결합을 보여준다. 위치 153, 162, 163, 및 188은 야생형 잔기로의 복귀시 TfR에 실질적으로 결합을 유지한 유일한 위치였다 (186의 야생형으로의 복귀되는 경우 결합은 일부 잔류하지만 그러나 상당히 감소됨이 관찰됨).
단일 위치 NNK 라이브러리를 인간 TfR 정점 도메인에 대해 3 라운드 동안 분류하여, 최고 ~5%의 결합제를 수집한 다음, 각각의 라이브러리로부터 최소 16 개 이상의 클론을 서열 분석하였다. 결과는 CH3C.35 클론과 관련하여, 인간 TfR에 대한 결합을 유의하게 감소시키지 않으면서, 각 위치에서 어떤 아미노산이 견딜 수 있는지를 나타낸다. 다음에 요약을 나타낸다:
위치 153: Trp, Leu, 또는 Glu;
위치 157: Tyr 또는 Phe;
위치 159: 오직 Thr 만;
위치 160: 오직 Glu 만;
위치 161: 오직 Trp 만;
위치 162: Ser, Ala, 또는 Val (비록 야생형 Asn 잔기는 일부 결합을 유지하는 것으로 보이지만, 라이브러리 분류 후에 나타나지 않았음을 주목할 것);
위치 163: Ser 또는 Asn;
위치 186: Thr 또는 Ser;
위치 188: Glu 또는 Ser;
위치 189: 오직 Glu 만; 그리고
위치 194: 오직 Phe 만.
상기 잔기들은 단일 변화로, 또는 조합으로, 클론 CH3C.35로 치환될 때, TfR 정점 도메인에 대한 결합을 유지하는 파라토프 다양성을 나타낸다. 이들 위치에서 돌연변이를 갖는 클론은 표 9에 나타내고, 이들 클론의 CH3 도메인의 서열은 서열 번호 : 237-241, 264, 및 266-296에 기재되어 있다.
단가 폴리펩티드-Fab 융합
단가 TfR-결합 폴리펩티드-Fab 융합의 생성
비록 Fc 도메인은 자연적으로 동형이량체를 형성하지만, “노브-인-홀(knobs-in-holes)로 알려진 일련의 비대칭 돌연변이”는 2개 Fc 단편의 선호되는 이형이량체화를 유도할 수 있고, 여기에서 한 개의 Fc 단위는 T139W 노브 돌연변이 (EU 번호매김 체계를 이용하면 위치 366에 대응함)를 갖고, 다른 Fc 단위는 T139S, L141A, 및 Y180V 홀 돌연변이 (EU 번호매김 체계를 이용하면 차례로 위치 366, 368, 및 407)를 갖는다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 변형된 CH3 도메인은 위치 139에 Trp를 포함한다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 변형된 CH3 도메인은 위치 139에 Ser, 위치 141에 Ala 그리고 위치 180에 Val을 포함한다. 이형이량체 TfR-결합 폴리펩티드는 293 또는 CHO 세포에서 2개 플라스미드(가령, 노브-Fc 및 홀-Fc)의 일시적 공동-형질감염에 의해 발현되며, 한편 폴리펩티드-Fab 융합은 3개의 플라스미드 (가령, 노브-Fc-Fab 중쇄, 홀-Fc-Fab 중쇄, 및 공통 경쇄)의 일시적 공동-형질감염에 의해 발현된다. 분비된 이형이량체 폴리펩티드 또는 폴리펩티드-Fab 융합의 정제는 동형이량체의 경우와 동일하게 실행되었다 (가령, 단백질 A를 이용한 2-컬럼 정제에 이어서 크기-배제, 및 그 다음 필요에 따라 농축 및 완충액 교환). 질량 분석법 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피를 사용하여, 형성된 이형이량체 대 동형이량체의 양 (예를 들어 노브-노브 또는 홀-홀 짝지어진 Fc's)을 결정하였다. 전형적인 제조로부터, 폴리펩티드의 95% 이상, 및 종종 98% 이상은 이형이량체였다. 명확성을 위해, 이러한 방식으로 생성된 모든 단가 TfR 결합제 (Fc 동형이량체)는 "ZZ.mono"로 명명되었고, 여기서 ZZ는 폴리펩티드의 이름이고. “.mono”는 1가 TfR 결합을 나타냈다. 이형이량체 폴리펩티드 및 폴리펩티드-Fab 융합의 경우, TfR 결합을 부여하는 돌연변이는 “노브” 돌연변이를 포함하며, 다른 언급이 없는 한, 반면 비-TfR-결합 Fc 영역은 “홀(hole)” 영역과 함께 이용되었다. 일부 경우에서, Fc 성질을 변경시키는 추가 돌연변이가 이들 구조체에 또한 포함되는데, 이를 테면 변형된 FcγR 또는 FcRn 결합의 경우 차례로 L7A/L8A, M25Y/S27T/T29E, N207S, 또는 N207S/M201L을 포함한다.
CH3C.mono Fc 폴리펩티드의 결합 특징화
단가 CH3C 폴리펩티드의 결합은 상기에서 기술된 과정의 변형을 이용하여 ELISA에서 측정되었다. 스트렙타비딘은 96-웰 ELISA 플레이트 상에서 PBS에서 1 μg/mL으로 피복되었다. 세척 후, 상기 플레이트는 1% BSA/PBS로 차단시키고, 그 다음 바이오티닐화된 인간 또는 cyno TfR은 1 μg/mL로 추가되었으며, 30 분 동안 항온처리되었다. 추가 세척 후, 폴리펩티드는 일련의 희석으로 이 플레이트에 추가되었고, 1 시간 동안 항온처리되었다. 상기 플레이트들은 세척되었으며, 2차 항체 (가령, 항-카파-HRP, 1:5,000)가 30 분 동안 추가되었고, 이들 플레이트는 다시 세척되었다. 이들 플레이트는 TMB 기질로 발달시키고, 2N H2SO4 로 ?칭되었고, 그 다음 450 nm에서 BioTek® 플레이트 판독기 상에서 흡수도를 판독하였다. 결과는 도 24에 나타내며, 이는 표준 (가령, 이가 TfR-결합) 및 단가 TfR-결합 폴리펩티드를 직접적으로 비교한다. Ab204는 고친화력 항-TfR 대조군 항체다.
내생적으로 인간 TfR를 발현시키는 293F 세포에 대한 결합, 뿐만 아니라 인간 TfR 또는 cyno TfR이 안정적으로 형질감염된 CHO-K1 세포에서의 결합도 추가 테스트가 실시되었다 (도 25).
일반적으로, 이가 폴리펩티드와 비교하였을 때, 인간 TfR에 대한 단가 폴리펩티드의 결합이 실질적으로 감소되었음이 관찰되었고, 이들 단가 폴리펩티드의 cyno 결합은 이들 분석에서 검출되기에는 너무 약했다.
이어서, 단가 버전의 CH3C 폴리펩티드가 인간-TfR를 발현시키는 HEK293 세포에서 내재화될 수 있는지를 시험 하였다. 내재화 분석을 위해 전술한 방법이 사용되었다. 도 26에 도시된 바와 같이, 이가 및 단가 폴리펩티드를 비교하면, 단가 펩티드는 또한 내재화될 수 있지만, 전체 신호는 아마도 결합친화력/결합능(avidity)의 상실로 인해 각각의 이가 버전에 비해 약했다.
바이오층 간섭에 의해 측정된 CH3C 폴리펩티드의 결합 역학
결합 역학은 항-BACE1 Fabs에 융합된 몇개의 단가 및 이가 CH3C 폴리펩티드 변이체에 대하여 측정되었고, 바이오층 간섭 (가령, Octet® RED 시스템 이용)을 이용하여 이들 이가 등가체와 비교하였다. 스트렙타비딘 센서에서 TfR을 포획한 다음, CH3C 폴리펩티드를 결합시키고, 씻어내었다. 센소그램을 1:1 결합 모델에 맞추었고; 이가 폴리펩티드에 대한 KD (app) 값은 TfR 이량체에 대한 열렬한(avid) 결합을 나타냈다. 상기 결과는 표 10 및 도 27 및 28에 나타낸다.
단가 형식으로 전환된 폴리펩티드는 결합능의 상실로 인하여 상당히 약간 KD (app) 값을 가졌다. ELISA에 의해 유사한 인간 및 cyno TfR 결합을 갖는 것으로 이미 보여준 클론 CH3C.3.2-1, CH3C.3.2-5, 및 CH3C.3.2-19는 또한 인간과 cyno의 TfR 간에 매우 유사한 KD (app) 값을 가졌다. 이들 폴리펩티드의 단가 형태를 시험하려는 시도가 있었지만,이 분석에서의 결합은 운동 파라미터를 계산하기에는 너무 약했다.
실시예 3. Biacore
™
를 이용한 추가 CH3C 변이체의 결합 특징화
재조합 TfR 정점 도메인에 대한 클론 변이체의 친화력은 Biacore™ T200 기구를 이용한 표면 플라스몬 공명에 의해 결정되었다. Biacore™ Series S CM5 센서 칩은 항-인간 Fab 항체 (인간 Fab 포획 키트, GE Healthcare)와 함께 고정되었다. 5 μg/mL의 폴리펩티드-Fab 융합은 각 유동 쎌(flow cell) 상에서 1 분 동안 포집되었고, 인간 또는 cyno 정점 도메인의 일련의 3-배 희석물은 실온에서 30 μL/분의 유속으로 주사되었다. 각 샘플은 45-초 연합 및 3-분 해리의 프로토콜로 분석되었다. 각 주입 후, 상기 칩은 10mM 글리신-HCl (pH 2.1)를 사용하여 재생되었다. 결합 반응은 유사한 밀도에서 무관한 IgG를 포획하는 유동 쎌로부터 RU를 차감함으로써, 교정되었다. Biacore™ T200 평가 소프트웨어 v3.1을 사용하여, 농도에 대한 평형에서 반응을 피팅함으로써 정상-상태(Steady-state) 친화력을 수득하였다.
재조합 TfR 엑토도메인 (ECD)에 대한 클론 변이체의 친 화력을 결정하기 위해, Biacore™ Series S CM5 센서 칩은 스트렙타비딘과 함께 고정되었다. 바이오티닐화된 인간 또는 cyno TfR ECD는 각 유동 쎌(flow cell) 상에서 1 분 동안 포집되었고, 클론 변이체의 일련의 3-배 희석물은 실온에서 30 μL/분의 유속으로 주사되었다. 각 샘플은 45-초 연합 및 3-분 해리의 프로토콜로 분석되었다. 결합 반응은 유사한 밀도에서 TfR ECD가 없는 유동 쎌에서 RU를 차감함으로써 수정되었다. Biacore™ T200 평가 소프트웨어 v3.1을 사용하여, 농도에 대한 평형에서 반응을 피팅함으로써 정상-상태(Steady-state) 친화력을 수득하였다.
결합 친화력은 표 11에 요약되었다. 친화력은 정상-상태 피팅에 의해 수득되었다.
추가 CH3C 변이체 CH3C.35.20.1.1, CH3C.35.23.2.1, CH3C.35.23.1.1, CH3C.35.S413, CH3C.35.23.3.1, CH3C.35.N390.1, 및 CH3C.35.23.6.1을 만들었고, 앞에서 설명한 것과 동일한 프로토콜에 따라 인간 TfR에 대한 이들의 결합 친화력이 측정되었다. CH3C.35.20.1.1, CH3C.35.23.2.1, CH3C.35.23.1.1, CH3C.35.S413, CH3C.35.23.3.1, CH3C.35.N390.1, 및 CH3C.35.23.6.1의 결합 친화력은 차례로 620 nM, 690 nM, 750 nM, 1700 nM, 1900 nM, 2000 nM, 및 2100 nM이었다.
실시예 4. FcRn에 대한 CH3C 변이체의 결합 특징화
FcRn 결합 검증은 
스트렙타비딘 바이오센서를 이용하여 
Octet® RED384 기구에서 실행되었다. 바이오티닐화된 재조합 BACE1을 운동 완충액 (
에서 입수)에서 10 μg/mL의 농도로 희석하고, 1 분 동안 개별 바이오 센서에 포획하였다. 이어서, 기선은 운동 완충제에서 1 분 동안 확립하였다. 10 μg/mL의 폴리펩티드-Fab 융합 (항-BACE1 Fab 아암을 포함 함)을 1 uM 인간 TfR ECD의 존재 또는 부재 하에 센서 팁에 결합시켰다. 고정화된 폴리펩티드-Fab 융합에 대한 재조합 인간 FcRn (pH5.5) 결합을 3-분 연합 및 3-분 해리로 분석하였다.
이들 실험으로부터 얻은 센소그램 (도 29)은 산성 pH (pH 5.5)에서 FcRn에 결합된 폴리펩티드-Fab 융합 변이체 및 TfR 결합이 FcRn 결합을 현저하게 방해하지 않았음을 나타낸다.
실시예 5. CH3C 변이체의 약력학/약동학 특징화
본 실시예는 마우스 혈장 및 뇌 조직에서 본 발명의 CH3C 변이체 폴리펩티드의 약력학/약동학 (PK/PD) 특징화를 기술한다.
야생형 마우스 혈장에서 CH3C 변이체의 약력학
폴리펩티드-Fab 융합은 뮤린 TfR이 아닌 인간 TfR에만 결합하기 때문에, 야생형 마우스에서 여러 CH3C 변이체에 대한 약력학 (PK)을 시험하여 TfR-매개된 제거가 결여된 모델에서 생체내 안정성을 입증하였다. 이 연구 안은 하기 표 12에 나타낸다. 6-8 주령의 C57B16 마우스에 정맥 내 투여하고, 표 12에 지시된 시점에서 턱밑 하 출혈을 통해 채혈하였다(in-life bleeds). 혈액을 EDTA 혈장 튜브에 수집하고, 5 분 동안 14,000 rpm으로 회전시키고, 이어서 혈장을 후속 분석을 위해 단리하였다.
Ab122는 마우스에서 정상 PK를 갖는 항-RSV 대조군으로 삼았다. Ab153은 마우스에서 정상 PK를 갖는 항-BACE1 대조군으로 삼았다. 이 연구에서 Ab153의 Fab 아암은 폴리펩티드에 융합되었다.
마우스 혈장의 폴리펩티드 농도를 제조자의 지시에 따라, 일반적인 인간 IgG 분석 (MSD® 인간 IgG 키트 #K150JLD-4)을 사용하여 정량화하였다. 간략하게 설명하자면, 사전피복된 플레이트를 MSD® 차단제 A로 30 분 동안 차단시켰다. Hamilton® NIMBUS 액체 처리기를 사용하여 1:2,500으로 희석시키고, 차단된 플레이트에 이중으로 첨가하였다. 투여 용액을 동일한 플레이트에서 분석하여, 정확한 투여량을 확인하였다. 표준 곡선인 0.78-200 ng/mL IgG는 4-매개변수 로지스틱 복귀를 사용하여 피팅하였다. 도 30 및 표 13은 이들 데이터 분석을 보여준다. CH3C 폴리펩티드 변이체는 모두다 실질적으로 더 빠른 제거 및 더 짧은 반감기를 갖는 CH3C.3.2-5를 제외하고, 표준 Ab122와 필적되는 제거 및 반감기 값을 가졌다. 흥미롭게도, 이 변이체는 CH3C.3.2-19 (N163D)의 점 돌연변이 체였으며, 후자는 정상적인 PK 프로파일을 가졌다.
야생형 마우스에서 추가 PK 연구
제2 PK연구는 하기 표 14의 기획에 따라 야생형 마우스에서 실시되었다 (Ab153 Fab에 대한 모든 폴리펩티드-Fab 융합):
마우스 및 샘플은 이전 연구에서 기술된 바와 같이 처리되었다. 데이터는 표 15에서 제공된다.
상기 제거 값으로부터 명백한 바와 같이, 이들 폴리펩티드 -Fab 융합은 표준 대조군 항체와 비교하여 야생형 마우스에서 유사한 제거를 나타냈다.
야생형 마우스 뇌 조직에서 단가 CH3C.35.N163의 PK/PD 평가
뮤린 Tfrc 유전자 내에서 인간 Tfrc 정점 도메인을 발현하는 유전자이식 마우스를 CRISPR/Cas9 기술을 사용하여 생성하였다. 생성된 키메라 TfR은 내생성 프로모터의 관리하에 생체내에서 발현되었다.
키메라 huTfR정점 이형접합성 마우스 (한 집단에서 n=4임)에게 42 mg/kg의 Ab153 또는 단가 CH3C.35.N163을 정맥으로 투여하였고, 및 야생형 마우스 (n=3)에게 50 mg/kg의 대조군 인간 IgG1을 정맥으로 투여하였다. Ab153은 마우스에서 정상 PK를 갖는 대조군으로 삼았다. 모든 마우스는 투여-후 24시간에 PBS로 관주시켰다. 관주 후, 혈액을 심장 천자를 통하여 EDTA 혈장 튜브에 수집하고, 14,000 rpm에서 5 분 회전시켰다. 혈장은 그 다음 후속 PK 및 PD 분석을 위하여 단리되었다. 관류 후 뇌를 추출하고, PBS (PK의 경우) 또는 5M GuHCl (PD의 경우)에서 조직 중량의 1% NP-40으로 10x 배의 균질화를 위해 절반-뇌를 단리하였다.
도 31은 뇌 PK 연구 결과를 나타낸다. Ab153 및 대조군 인간 IgG1 집단보다는 단가 CH3C.35.N163 집단에서 취입이 더 컸다.
hTfR
정점+/+
마우스에서 폴리펩티드-Fab 융합의 뇌 및 혈장 PKPD: CH3C.35.21 및 CH3C.35.N153
표 16의 연구 기획에서 나타낸 것과 같이, 동형접합체 hTfR정점+/+ 마우스에게 50 mg/kg의 항-BACE1 항체 Ab153, 항-TfR/BACE1 이중특이적 항체 Ab116, Ab153 Fab에 융합된 CH3C.35.21.mono, 또는 Ab153 Fab에 융합된 CH3C.35.N153.mono를 정맥으로 주사하였다. 이 연구에서, 모든 Fc는 작동체 기능을 제거하기 위하여 LALAPG 돌연변이를 보유하였다.
24 시간 후, 혈액은 심장천자를 통하여 수거하고, 마우스는 PBS로 관주시켰다. 뇌 조직을 PBS 중 1% NP-40을 함유하는 용해 완충액의 10x 조직 중량에서 균질화시켰다. 혈액을 EDTA 튜브에 수집하여 응고를 방지하고, 혈장을 분리하기 위해 14,000 rpm에서 7 분 동안 회전시켰다. 마우스 혈장 및 뇌 용해물 중의 폴리펩티드 농도를 제조자의 지시에 따라, 일반적인 인간 IgG 분석 (MSD 인간 IgG 키트 # K150JLD)을 사용하여 정량화하였다. 간략하게 설명하자면, 사전-피복된 플레이트를 MSD 차단제 A로 30 분 동안 차단시켰다. Hamilton Nimbus 액체 처리기를 사용하여 1:10,000으로 희석시키고, 차단된 플레이트에 이중으로 첨가하였다. 뇌 샘플을 1% NP40 용해 완충액에서 균질화하고, PK 분석을 위해 1:10으로 희석된 용해물을 사용하였다. 투여 용액을 동일한 플레이트에서 분석하여, 정확한 투여량을 확인하였다. 표준 곡선인 0.78-200 ng/mL IgG는 4-매개변수 로지스틱 복귀를 사용하여 피팅하였다.
24 시간 후, TfR-결합 폴리펩티드의 혈장 수준은 주변으로-발현된 huTfR정점 에 결합을 통하여 이 항체가 제거로 인하여 항-BACE1의 수준보다 더 낮았다(도 32a). 뇌에서, 항-BACE1과 비교하여, 항-TfR/BACE1의 농도가 유의하게 증가하였다(도 32b). CH3C.35.21.mono에서 가장 큰 증가가 관찰되었지만, CH3C35.N153.bi를 갖는 항-BACE와 비교하여 뇌 취입도 상당히 개선되었다. 공작된 TfR-결합 폴리펩티드의 상당한 축적은 혈액-뇌-장벽에서 TfR-매개된 트랜스사이토시스로 인한 것이었으며, 따라서 Fc 영역으로의 TfR 결합 엔지니어링 유틸리티의 유효성을 입증한다.
아밀로이드 전구체 단백질 APP 절단의 BACE1 억제는 혈장 및 뇌에서 항체 활성의 약물력학 판독으로서 사용되었다. 뇌 조직을 5M 구아니딘-HCl의 10x 조직 중량에서 균질화한 다음, PBS에서 0.25% 카제인 완충액에서 1:10으로 희석 하였다. 혈장 및 뇌 용해물에서 마우스 Aβ40 수준을 샌드위치 ELISA를 사용하여 측정하였다. 384-웰 MaxiSorp 플레이트를 밤새 Aβ40 펩티드(Millipore #ABN240)의 C-말단에 특이적인 다중클론 포획 항체로 코팅 하였다. 카제인-희석된 구아니딘 뇌 용해물을 ELISA 플레이트에서 1:2로 추가로 희석하고, 검출 항체인 바이오티닐화된 M3.2와 동시에 첨가하였다. 1:5 희석에서 혈장을 분석하였다. 스트렙트아비딘-HRP를 첨가하기 전, 시료를 하룻밤동안 4℃에서 항온처리하고, 그 다음 TMB 기질을 첨가하였다. 표준 곡선인 0.78-50 pg/mL msAβ40은 4-매개변수 로지스틱 복귀를 사용하여 피팅하였다.
모든 폴리펩티드 상에 항-BACE1 Fab 아암의 존재로 인하여, 처리되지 않은 야생형 마우스와 비교하여, 혈장 아밀로이드 베타-단백질(A베타)은 모든 폴리펩티드에 대하여 유사한 정도로 감소되었다(도 33a). 항-BACE1와 비교하였을 때, TfR-결합 폴리펩티드로 처리하면 hTfR정점+/+ 마우스에서 A베타의 감소가 증가되었고, 이것은 뇌에서 BACE1 표적 관여는 이루어졌다는 것을 나타낸다(도 33b). 뇌에서의 표적 관여 수준은 공학적 폴리펩티드 융합 및 항-TfR/BACE1 이중특이적 항체에 대해 유사하였다.
hTfR
정점+/+
마우스에서 폴리펩티드-Fab 융합의 뇌 및 혈장 PKPD: CH3C.35.21, CH3C.35.20, CH3C.35, CH3C.35.23, CH3C.35.23.3
PK 및 뇌 취입에 대한 TfR 결합 친화력의 영향을 평가하기 위하여, Biacore에 의해 측정하였을 때, 정점 인간 TfR에 대한 결합 친화력이 상이한 항-BACE1 Ab153 및 TfR-결합 폴리펩티드 융합 (CH3C.35.21:Ab153, CH3C.35.20:Ab153, CH3C.35:Ab153 융합)을 만들었다. 인간 TfR에 대한 CH3C.35.21:Ab153, CH3C.35.20:Ab153, CH3C.35:Ab153 융합의 결합 친화력은 차례로 100 nM, 170 nM 및 620 nM이었다. hTfR정점+/+ 녹-인 마우스의 전신으로 Ab153 또는 상기 폴리펩티드-Fab 융합을 50 mg/kg으로 투여하였고, 그리고 혈장 PK 및 뇌 PKPD는 투여-후 1, 3, 및 7 일에 평가되었다. 뇌 및 혈장 PKPD 분석은 이전 섹션에서 기술된 바와 같이 수행되었다. 말초 조직에서 TfR의 발현으로 인하여, CH3C.35.21:Ab153, CH3C.35.20:Ab153, 및 CH3C.35:Ab153 융합은 Ab153 단독과 비교하였을 때, 혈장에서 더 신속하게 제거되었고, 표적-매개된 제거 및 생체내 TfR 결합의 지표와 일치된다 (도 44a). 인상적인 것은, CH3C.35.21:Ab153, CH3C.35.20:Ab153, 및 CH3C.35:Ab153 융합의 뇌 농도는 Ab153과 비교하여 상당히 증가되었고, 이는 투여-후 1일차에 Ab153의 경우 단지 약 3 nM인 것과 비교하였을 때, 동일시점에서 30 nM이상의 최대 뇌 농도를 얻을 수 있었다(도 44b). CH3C.35.21:Ab153, CH3C.35.20:Ab153, 및 CH3C.35:Ab153 융합의 뇌 노출 증가로 인하여 Ab153이 투여된 마우스에서 Aβ수준과 비교하였을 때, 마우스의 뇌에서 내생성 마우스 Aβ수준이 약 55-60% 더 낮아지게 되었다 (도 44c). 더 낮아진 뇌 Aβ 수준은 지속되면서, CH3C.35.21:Ab153, CH3C.35.20:Ab153, 및 CH3C.35:Ab153 융합은 뇌에서 상승된 상태로 유지되었고, 노출 후 7일차 까지 감소되었을 때 Ab153 처리된 마우스와 유사한 수준으로 회복되었다. 시간에 따른 뇌 노출의 감소는 CH3C.35.21:Ab153, CH3C.35.20:Ab153, 및 CH3C.35:Ab153 융합의 말초 노출의 감소와 관련있었고, 이는 생체내에서 명백한 PK/PD 상관관계를 제공한다(도 44a 및 44c 비교). 추가적으로, 뇌 TfR 전체 수준은 단일 고투여령의 투여 후 Ab153-처리된, 그리고 폴리펩티드-Fab 융합-처리된 마우스에 필적하며, 이것은 뇌에서 TfR 발현에 대한 상기 폴리펩티드-Fab 융합의 증가된 뇌 노출의 영향은 크지 않음을 나타낸다 (도 44d).
TfR-결합 폴리펩티드-Fab 융합의 더 광범위한 친화력으로 PK와 뇌 취입 간의 상관관계를 더 평가하기 위하여, hTfR 결합에 대한 더 광범위한 범위의 추가 융합을 만들었다. 인간 TfR에 대한 CH3C.35.23:Ab153 및 CH3C.35.23.3:Ab153융합의 결합 친화력은 차례로 420 nM 및 1440 nM이었다. hTfR정점+/+ 녹-인 마우스에게 상기에서 기술된 바와 같이 투여되었다. 혈장 PK 및 뇌 PKPD는 투여-후 1, 4, 7, 및 10 일 시점에 평가되었다. 상기 폴리펩티드-Fab 융합의 말초 PK는 hTfR 친화력-의존적이며, 이때 더 큰 친화력 CH3C.35.23:Ab153 융합은 더 낮은 친화력 CH3C.35.23.3:Ab153 융합과 비교하여 더 신속한 제거를 보였다 (도 45a). CH3C.35.23:Ab153 및 CH3C.35.23.3:Ab153 융합은 모두다 Ab153 단독과 비교하여 상당히 더 큰 뇌 노출을 가졌고, CH3C.35.23:Ab153은 투여후 1-일 시점에 약 36 nM을 획득하였다 (도 45b). 유사한 혈장 농도에도 불구하고, CH3C.35.23.3:Ab153 융합의 최대 뇌 취입은 CH3.35.23:Ab153 융합보다는 더 낮았고, 이것은 hTfR에 대하여 후자 융합이 약 3.5-배 더 낮은 친화력 때문인 것 같다. 흥미로운 것은, 더 낮은 친화력 융합은 10일 시점까지 더 지속된 말초 노출을 제공하였기 때문에, 이의 뇌 노출은 또한 더 높은 친화력 CH3C.35.23:Ab153 융합의 것보다 더 높았다. 이것은 더 낮은 친화력 TfR-결합 폴리펩티드-Fab 융합에 대한 시간이 지남에 따라 더 낮은 뇌 Cmax 그러나 더 지속된 PK의 교환(trade-off)을 예시한다. 항-BACE1 단독과 비교하였을 때, 항-BACE1 폴리펩티드 융합이 투여된 마우스의 뇌에서 상당한 더 낮은 농도의 Aβ40이 관찰되었다 (도 45c). Aβ40 감소 기간은 시간의 경과에 따라 뇌에서 huIgG1 노출 수준과 일치하였다 (도 45b). 인상깊은 것은, CH3C.35:Ab153 융합이 투여된 마우스는 단일 투여-후 7-10일 까지 연장된 뇌 Aβ40 감소를 나타내었다. 뇌 TfR 전체 수준은 투여-후 1일 시점에서 Ab153 대 CH3C.35:Ab153 융합을 투여한 마우스간에 필적하였다(도 45d). 이들 데이터과 함께, TfR-결합 폴리펩티드 융합이 단일 투여-후 뇌 Aβ40을 상당히 감소시키기 위해, 항-BACE1의 뇌 노출을 증가시킬 수 있음을 입증한다.
실시예 6. CH3C.18 Fc 및 트란스페린 수용체 정점 도메인 결정화
본 실시예는 CH3C.18과 트란스페린 수용체의 정점 도메인 (TfR-AD) 사이의 결합 경계면의 결정화 및 분석을 설명한다.
발현
인간 트란스페린 수용체의 정점 도메인 (TfR-AD)과 공작된 인간 Fc (CH3C.18 Fc)는 2.5 x 106 세포/mL의 최초 세포 밀도에서 Expi293 세포에서 발현되었다(차례로 서열 번호:301 및 302). 필요에 따라, 200mL 이상의 부피로 발현시켰다. 글리코실화억제제인 키푸넨신(Kifunensine)을 형질 감염 후 20 시간에 최종 농도 25μM로 첨가하였다. 세포 생존력이 현저하게 감소될 때인, 형질감염 후 3 내지 4 일 후에 발현 배양물을 수집 하였다.
정제
발현된 TfR-AD 및 CH3C.18 Fc는 차례로 단백질 A 및 Ni-NTA 수지로 정제되었고, Superdex200 26/60 겔 여과 컬럼 상에서 크기-배제 크로마토그래피되었다. 다음 완충액이 이용되었다:
단백질 A 세척 완충액: 20 mM Hepes pH 7.4, 100 mM NaCl;
단백질 A 용리 완충액: 30mM 글리신 pH 2.5 (용출액을 1M Tris, pH 9.0을 함유하는 튜브에 수집하여 용출액을 즉시 중화시켰다);
Ni-NTA 세척 완충액: 30 mM Tris pH, 10 mM 이미다졸, 및 200 mM NaCl;
Ni-NTA 용리 완충액: 30mM Tris pH 8.0, 200 mM NaCl, 및 250mM 이미다졸; 그리고
크기-배제 완충액 (SEC): 30 mM HEPES pH 7.5, 200 mM NaCl, 및 3% 글리세롤.
복합체 형성 및 정제
정제된 TfR-AD 및 CH3C.18 Fc는 과량의 정점 도메인과 혼합하고, 실온에서 1 시간 동안 항온처리하고, 그리고 이 복합체는 기존에 언급된 SEC 완충액을 이용하여 Superdex200 26/60 겔-여과 컬럼 상에서 크기-배제 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 상기 사이징으로 예상된 바와 같이, 두 가지 주요 피크를 제공했다; 하나는 복합체에 해당함 (유지 용적 = 180 ml), 그리고 다른 하나는 과량의 정점 도메인에 해당됨 (유지 용적 = 240 ml). 피크 분획은 Coomassie 착색된 SDS-PAGE 겔에 의해 분석되었다(도 34).
결정화
복합체의 초기 결정화 스크리닝은 8.5 mg/mlL 단백질 농도에서 15℃에서 그리고 실온 (RT)에 시팅 드롭(sitting drop) 증기 확산법에 의해 수행되었다. 25% PEG 3350, 0.1M Tris pH 8.5 및 0.2M MgCl2를 함유한 조건에서 얇은 결정의 바늘 샤워(Showers of thin needles of crystals)가 관찰되었다. 이러한 결정을 동일한 조건에서 20% PEG 3350으로 씨딩하여(seed) 장착가능한 크기의 단일 얇은 바늘을 제조하는데 사용하였다.
X-선 데이터 수집
20% (v/v) 에틸렌 글리콜이 보충된 결정화 모액(mother liquor)을 사용하여 액체 질소에 직접 침지시켜 결정을 플래시-냉각시켰다. X-선 강도 데이터는 Rayonix 300 고속 검출기를 사용하여 APS (Advanced Photon Source)의 SER-CAT 빔 라인에서 수집되었다. 결정을 3.6 Å으로 회절시키고, 비대칭 단위에서 2 개의 복합체 분자를 갖는 6 각형 공간 집단군 P6 4에 속하였다 (표 17). 프로그램 HKL2000을 사용하여 데이터를 색인, 통합 및 확장했다. 2 개의 결정으로부터 수집된 데이터를 합쳐 3.6Å 데이터를 생성하였다.
구조 결정 및 개선(refinement)
CH3C.18 Fc 이량체 및 TFR-AD 단량체를 초기 탐색 모델로 사용하여 PHASER로 분자를 대체함으로써 복합체의 결정 구조를 결정하였다. 이 모델은 REFMAC를 사용하여 강체(rigid-body) 개선에 이어 제한 개선(restrained refinement)에 의해 정제되었다. 모든 결정학적 계산은 CCP4 제품군으로 수행되었다. (www.ccp4.ac.uk/). 전자 밀도로의 복합체의 모델 구축은 그래픽 프로그램 COOT를 사용하여 수행되었다. 복합체 분자의 전자 밀도는 CH3C.18 Fc-TfF-AD 경계면에서 특히 양호했다 (2Fo-Fc 맵은 1.2 시그마 수준으로 윤곽이 드러났다). 반복 모델 구축 및 개선 후, 데이터의 해상도가 낮고, CH2 도메인의 장애로 인해 높은 R 및 freeR (R/freeR = 0.30/0.39)이 나타났다. 다른 이용가능한 Fc 구조에서 발견되는 바와 같이, CH2의 장애는 CH2와 CH3 도메인 사이의 유연한 엘보 각으로 인한 것이었다.
결합 경계면 상호작용
CH3C.18 Fc와 TfR-AD 사이의 결합 경계면은 도 35a-35b 및 도 36a-36b에 도시된다. 도 37a-37b에서 나타낸 것과 같이, 상호작용은 다음의 것들 사이에서 관찰되었다:
CH3C.18의 Trp154와 TfR-AD의 Arg208;
CH3C.18의 Glu155와 TfR-AD의 Arg208;
CH3C.18의 Ser156과 TfR-AD의 Arg208 및 Leu212;
CH3C.18의 Leu157과 TfR-AD의 Ser 199 및 Asn215;
CH3C.18의 His159와 TfR-AD의 Lys188, Ser199, 및 Arg208;
CH3C.18의 Val160과 TfR-AD의 Gly207 및 Arg208;
CH3C.18의 Trp161 Arg208, Val210과 TfR-AD의 Leu212;
CH3C.18의 Ala162와 TfR-AD의 Arg208;
CH3C.18의 Val163과 TfR-AD의 Leu209;
CH3C.18의 Ser188과 TfR-AD의 Tyr211;
CH3C.18의 Thr189와 TfR-AD의 Tyr211 및 Leu212;
CH3C.18의 Gln192와 TfR-AD의 Lys158 및 Glu294;
CH3C.18의 Trp194와 TfR-AD의 Leu212, Val213, Glu214, 및 Asn215; 그리고
CH3C.18의 Phe196과 TfR-AD의 Arg208.
더욱이, 실시예 2의 “파라토프 메핑”이라는 제목의 섹션 및 도 37a-37b에서 기술된 바와 같이, 상기 CH3C 리지스터 밖의 몇 개 위치는 또한 TfR에 결합에 참여한다.
실시예 7. CH3C.35 Fc 및 트란스페린 수용체 정점 도메인 결정화
본 실시예는 CH3C.35와 트란스페린 수용체의 정점 도메인 (TfR-AD) 사이의 결합 경계면의 결정화 및 분석을 설명한다.
발현
인간 트란스페린 수용체의 정점 도메인 (TfR-AD)과 공작된 인간 Fc (CH3C.35 Fc)는 2.5 x 106 세포/mL의 최초 세포 밀도에서 CHO 세포에서 발현되었다(차례로 서열 번호:301 및 421). 필요에 따라, 500mL 이상의 부피로 발현시켰다. 세포 생존력이 현저하게 감소될 때인, 형질감염 후 3 내지 4 일 후에 발현 배양물을 수집하였다.
정제
발현된 TfR-AD 및 CH3C.35 Fc는 차례로 단백질 A (Genescript) 및 Ni-NTA (Sigma)수지로 정제되었고, Superdex200 26/60 겔 여과 컬럼 상에서 크기-배제 크로마토그래피되었다. 다음 완충액이 이용되었다:
단백질 A 용리 완충액: 30mM 글리신 pH 2.5 (용출액을 1M Tris, pH 9.0을 함유하는 튜브에 수집하여 용출액을 즉시 중화시켰다);
Ni-NTA 용리 완충액: 30 mM Tris pH 8.0, 200 mM NaCl, 및 250 mM 이미다졸; 그리고
크기-배제 완충액 (SEC): 30 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 50 mM KCl, 3% 글리세롤, 및 0.01% 아지드 나트륨.
복합체 형성 및 정제
정제된 TfR-AD 및 CH3C.35 Fc는 과량의 정점 도메인과 혼합하고, 실온에서 1 시간 동안 항온처리하고, 그리고 이 복합체는 기존에 언급된 SEC 완충액을 이용하여 Superdex200 26/60 겔 여과 컬럼 상에서 크기-배제 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.
결정화
복합체의 초기 결정화 스크리닝은 4℃, 15℃에서 그리고 실온 (RT)에 시팅 드롭 증기 확산법에 의해 수행되었다. 25% PEG 3350, 0.1 M Bis-Tris pH 6.5, 및 0.2 M LiSO4를 함유한 조건에서 얇은 결정의 바늘 샤워가 관찰되었다. 이러한 결정을 동일한 조건에서 20% PEG 3350으로 씨딩하여 장착가능한 크기의 단일 얇은 바늘을 제조하는데 사용하였고, 그리고 장착 가능한 크기의 결정을 생성하기 위해 시딩을 순차적으로 4 회 반복 하였다.
X-선 데이터 수집
20% (v/v) 에틸렌 글리콜이 보충된 결정화 모액을 사용하여 액체 질소에 직접 침지시켜 결정을 플래시-냉각시켰다. X-선 강도 데이터는 PILATUS 검출기를 사용하여 DLS (Diamond Light Source)의 IO4 빔 라인에서 수집되었다. 크기 5 미크론의 마이크로 포커스 빔이 데이터 수집에 사용되었다. 결정을 3.38 Å으로 회절시키고, 비대칭 단위에서 2 개의 복합체 분자를 갖는 6 각형 공간 집단군 P6 4 에 속하였다 (표 18). CCP4 스위트(suite) 프로그램(Xia2- XDS 및 XSCALE)을 사용하여 데이터를 색인, 통합 및 확장했다.
구조 결정 및 개선(refinement)
CH3C.35 Fc-AD TfR 복합체를 탐색 모델로 사용하여 PHASER로 분자를 대체함으로써 복합체의 결정 구조를 결정하였다. 이 모델은 REFMAC를 사용하여 강체 개선에 이어 제한 개선에 의해 정제되었다. 모든 결정학적 계산은 CCP4 제품군으로 수행되었다. 전자 밀도로의 복합체의 모델 구축은 그래픽 프로그램 COOT를 사용하여 수행되었다. 복합체 분자의 전자 밀도는 CH3C.35 Fc-TfF-AD 경계면에서 특히 양호했다.
결합 경계면 상호작용
CH3C.35 Fc와 TfR-AD 사이의 결합 경계면은 도 39a-39c에 도시된다. 도 39a는 3.4 Å에서 CH3C.35 Fc와 TfR-AD의 복합체를 보여준다. 도 39b는 CH3C.35 Fc의 잔기 W161이 TfR-AD에서 잔기 L209, L212, 및 Y211에 의해 안정화됨을 보여준다. 도 39c는 CH3C.35 Fc에서 잔기 E160과 TfR-AD에서 잔기 R208 사이에 중앙 결합 상호작용으로써 염 다리를 보여주는데, 이는 인간 TfR (위치 208의 Arg) 및 시노몰구스 TfR (위치 208의 Gly)에 대한 Fc 폴리펩티드의 결합 친화력의 차이를 부분적으로 설명할 수 있다. 도 40a는 상기 CH3C.35 Fc와 TfR-AD 복합체 및 상기 CH3C.18 Fc와 TfR-AD 복합체 (실시예 6에서 설명됨) 사이에 오버레이트 구조를 나타내는데, CH3C.35와 CH3C.18 사이에는 유의적인 Fc 골격 입체 구조 변화가 없음을 설명한다. 도 40b는 도 40a에 나타낸 덮어씌운 구조의 확대도면을 보여준다. 상기 CH3C.35 Fc/TfR-AD 복합체의 TfR-AD에서 잔기 206-212는 CH3C.18 Fc/TfR-AD 복합체의 TfR-AD에서 잔기와 다른 형태를 채택하였다. TfR-AD에서 잔기 R208은 CH3C.18 Fc/TfR-AD 복합체의 표면에 묻힌 것으로 나타났지만, CH3C.35 Fc/TfR-AD 복합체에서는 용매 노출된 것으로 나타났다. 더욱이, 상기 CH3C.35 Fc/TfR-AD 복합체의 TfR-AD에서 잔기 L209는 180˚회전하여, 이 표면에 결합되었지만, 그러나 CH3C.18 Fc/TfR-AD 복합체에서는 표면으로부터 떨어져 있는 것으로 나타났다.
도 41a 및 41b에서 나타낸 것과 같이, 상호작용은 다음의 것들 사이에서 관찰되었다:
CH3C.35의 Thr159와 TfR-AD의 Gly207, Arg208, Lys188, 및 Leu209;
CH3C.35의 Glu160과 TfR-AD의 Arg208 및 Leu209;
CH3C.35의 Ser162와 TfR-AD의 Arg208 및 Leu209;
CH3C.35의 Ser156과 TfR-AD의 Leu209;
CH3C.35의 Trp161과 TfR-AD의 Leu209, Tyr211, 및 Leu212;
CH3C.35의 Glu189와 TfR-AD의 Tyr211 및 Leu212;
CH3C.35의 Phe194와 TfR-AD의 Leu212, Asn215, 및 Val213;
CH3C.35의 Tyr157과 TfR-AD의 Leu212, Asn215, 및 Ser199;
CH3C.35의 Gln192와 TfR-AD의 Val213 및 Lys158; 그리고
CH3C.35의 Phe196과 TfR-AD의 Val213 및 Leu212.
더욱이, 실시예 2의 “파라토프 메핑”이라는 제목의 섹션 및 도 41a 및 41b에서 기술된 바와 같이, 상기 CH3C 리지스터 밖의 몇 개 위치는 또한 TfR에 결합에 참여한다.
실시예 8. 시노몰구스 원숭이에서 CH3C 변이체를 포함하는 Fc-Fab 융합 폴리펩티드의 약력학/약동학 연구
본 실시예는 시노몰구스 원숭이에서 본 발명의 CH3C 변이체 폴리펩티드를 포함하는 Fc-Fab 융합의 약력학/약동학 (PK/PD) 특징화를 기술한다.
연구 기획
단일 30 mg/kg 투여량의 Ab122 (항-RSV 항체, 대조군 IgG), Ab153 (항-BACE1 항체), Ab210 (항-TfR/BACE1 이중특이적 항체), 또는 Ab153의 Fab 도메인에 융합된 CH3C 변이체 폴리펩티드를 포함하는 Fc-Fab 융합 폴리펩티드를 2-4 연령의 수컷 시노몰구스 원숭이 정맥으로 주사하고, 29일간의 일정에 걸쳐 혈장 PK, 혈장 PD (Aβ40), 및 뇌척수액 (CSF) PD (Aβ40)를 평가하였다 (n=4/집단). 기준선을 확립하기 위해, 투여-전 7 일에 각 동물로부터 투여 전 CSF 및 혈액 샘플을 채취하였다. 투여 후, PD 분석을 위하여 투여-후 CSF는 12, 24, 48, 72, 및 96 시간 그리고 연구일 8, 11, 15, 18, 22, 25, 및 29일에 IT-L 카테테르를 통하여 수거하였다. 혈액 시료는 투여-후 0.25, 1, 6, 12, 24, 72 시간, 및 연구일 8, 11, 15, 18, 22, 25, 및 29일에 혈장 및 혈청 PK를 위하여 수집되었다.
표 19는 연구 기획의 개요를 보여준다. “CH3C.35.21.16:Ab153”은 Ab153 Fab 도메인에 융합된 클론 CH3C.35.21.16을 포함하는 단가 Fc-Fab 융합 폴리펩티드이다. “CH3C.35.21:Ab153”은 Ab153 Fab 도메인에 융합된 클론 CH3C.35.21을 포함하는 단가 Fc-Fab 융합 폴리펩티드이다. “CH3C.35.9:Ab153”은 Ab153 Fab 도메인에 융합된 클론 CH3C.35.21을 포함하는 이가 Fc-Fab 융합 폴리펩티드이다. “CH3C.35.8:Ab153”은 Ab153 Fab 도메인에 융합된 클론 CH3C.35.20을 포함하는 이가 Fc-Fab 융합 폴리펩티드이다. “LALAPG”는 이 항체 또는 Fc-Fab 융합 폴리펩티드가 Fc 서열 (서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때)에서 돌연변이 L7A, L8A, 및 P102G를 함유함을 나타낸다. “LALAPG.YTE”는 Fc-Fab 융합 폴리펩티드가 Fc 서열에서 (서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때) 돌연변이 L7A, L8A, P102G, M25Y, S27T, 및 T29E를 함유함을 나타낸다
방법
인간 IgG PK 분석
cyno 혈청에서 항체 또는 Fc-Fab 융합 폴리펩티드 농도는 인간 IgG-특이적 샌드위치 ELISA를 이용하여 정량화되었다. 384-웰 MaxiSorp 플레이트는 인간 IgG의 Fc에 특이적인 항체로 코팅되었다. 혈청 시료는 1:100, 1:1,000, 1:10,000, 및 1:100,000으로 희석되었고, 차단된 플레이트에 추가되었다. 탐지 항체는 다중클론성 항-인간 IgG 원숭이-흡착된 항체이다. 표준 곡선은 각각의 항체 또는 Fc-Fab 융합 폴리펩티드에 대해 개별적으로 제조되었고(48-200,000 pg/mL IgG) 및 분석법은 20ng/mL의 혈청에서 정량의 하한치 (LLOQ)를 갖는다.
PD 분석
cyno CSF에서 가용성 APPα/β수준은 MesoScale Discovery (MSD) 멀티플렉스 키트(MSD #K15120E)를 이용하여 측정되었다. 상이한 2개의 항체는 특이적으로 sAPPα 또는 sAPPβ를 포획하였고, 그 다음 이들 두 피분석물은 술포-tag 라벨된 항-APP 마우스 단일클론 항체로 탐지되었다. Cyno Aβ40 수준은 MSD 매우-민감한 키트 (MSD #K151FTE)을 이용하여 측정되었다. 이 분석은 huAβ특이적 6E10 항체를 포획으로 이용하였고, 이 펩티드의 C-말단에 특이적인 항-Aβ40 항체는 탐지 분자로 이용하였다. 제조업체의 지침에 따라 두 가지 분석을 모두 수행했다. 간략하게 설명하자면, 사전피복된 플레이트를 MSD 차단제 A로 1시간 동안 차단시켰다. CSF 시료는 1:5로 희석되었고, 상기 차단된 플레이트에 이중으로 추가된 후, 4℃에서 하룻밤 동안 항온처리되었다. 다음으로, 각각의 검출 항체를 첨가하고, 플레이트를 섹터 S600 기기에서 판독하였다. sAPPα/β둘 모두에 대한 표준 곡선, 0.92-3750 pg/mL huAβ40 및 0.1-100 ng/mL를 4-파라미터 로지스틱 복귀를 사용하여 맞추었다. 이 분석에서 Aβ40의 경우 73 pg/mL의 LLOQ, 그리고 sAPPα/β의 경우 0.5 ng/mL이었다.
결과
투여 후 처음 7 일로부터의 중간 혈청 PK는 말초에서 TfR 에의 결합으로 인해, Ab210 및 CH3C.35.9:Ab153에 대해 예상되는 표적-매개된 제거를 보여주었다 (도 42a). Ab153 및 Ab210 두 항체, 뿐만 아니라 CH3C.35.9:Ab153은 대조군 IgG과 비교하여, 혈장에서 Aβ40의 상당한, 그리고 지속적인 감소를 초래하였고 (도 42b), 이들 세 분자는 모두 생체 내에서 BACE1 활성을 유사한 정도로 억제할 수 있다는 것을 확인하였다. CSF 경우, Ab210 및 CH3C.35.9:Ab153은 모두 대조군 IgG와 비교하였을 때, CSF Aβ40 및 sAPPβ/sAPPα의 비율을 차례로 대략 70% 및 대략 75% 감소시킬 수 있었다 (도 43a 및 43b). TfR에 결합하지 않는 항-BACE1 항체인 Ab153은 대조군 IgG와 비교하여, CSF Aβ40 및 sAPPβ/sAPPα 비율에 최소의 영향을 나타냈다. 이들 결과에서 CH3C 변이체 폴리펩티드 (가령, 클론 CH3C.35.9)로 TfR에 결합은 항-BACE1 항체의 Fab 도메인에 융합된 CH3C 변이체 폴리펩티드를 포함하는 Fc-Fab 융합 (가령, CH3C.35.9:Ab153)의 CNS 침투를 강화시켜, CSF Aβ40 및 sAPPβ/sAPPα 생산을 억제한다는 것을 증명한다.
혈청 PK, 혈장 Aβ, 및 CSF Aβ 수준은 또한 단일 투여 후 4주 동안 평가되었다. 마우스에서 관찰된 것과 유사하게, TfR-결합 Fc-Fab 융합 (CH3C.35.21.16:Ab153 LALAPG, CH3C.35.21.16:Ab153 LALAPGYTE, 및 CH3C.35.21:Ab153 LALAPGYTE)의 말초 혈청 PK는 말초 조직에서 TfR에 결합으로 인하여, Ab122 및 Ab153과 비교하였을 때, 더 빠른 제거를 나타내었다 (도 46a). Ab153 및 CH3C:Ab153 융합은 모두 대조군 IgG_Ab122와 비교하였을 때, 혈장 Aβ수준을 약 50% 이상으로 감소시켰다 (도 46b). 최대 Aβ는 Ab153과 CH3C:Ab153 융합 사이에서 유사하였으며, 이는 Fc 변형이 생체 내 APP 절단을 억제하는 항-BACE1 Fab의 능력에 영향을 미치지 않음을 나타낸다(도 46b). 혈장 Aβ의 지속 기간은 시간에 따른 Ab153 및 CH3C:Ab153의 노출과 상관 관계가 있었다. CSF에서, 3개의 모든 Fc-Fab 융합은 대조군 IgG_Ab122와 비교하여 Aβ40 및 sAPPβ/sAPPα 비율을 모두 대략 70%까지 상당히 감소시킬 수 있었던 반면, Ab153을 투여한 동물에서는 유의미한 감소가 관찰되지 않았다(도 46c 및 46d). 이들 결과에서 CH3C 변이체 폴리펩티드 (가령, 클론 CH3C.35.21.16 및 CH3C.35.21)의 TfR에로의 결합은 항-BACE1 항체의 Fab 도메인에 융합된 CH3C 변이체 폴리펩티드를 포함하는 Fc-Fab 융합 (가령, CH3C.35.21.16:Ab153 및 CH3C.35.21:Ab153)의 CNS 침투를 강화시켜, CSF Aβ40 및 sAPPβ/sAPPα 생산을 억제한다는 것을 증명한다.
미성숙 적혈구에서 높은 수준의 TfR 발현으로 인해, 말초 혈액 임상 병리를 연구 과정 전반에 걸쳐 평가하여, 망상 적혈구 수, 혈청 철 및 적혈구 수를 평가하였다. 혈청 철 수준의 평가는 발색체(chromogen)로서 TPTZ [2,4,6-트리-(2-피리딜)-5-트리아진]를 사용하는 방법의 변형을 이용했다. 산성 매질에서, 트랜스페린-결합 철은 유리(free) 제 2 철 이온 및 아포 트랜스페린으로 분리되었다. 염산 및 아스코르브 산 나트륨은 제 2 철 이온을 제 1 철 상태로 환원시켰다. 그 후, 철 이온은 TPTZ와 반응하여 청색 착물을 형성하였고, 이는 600/800 nm에서 이중-염색성으로(bichromatically) 측정되었다. 흡광도의 증가는 존재하는 트랜스페린 결합된 철의 양에 정비례한다. 이것은 Beckman/Olympus AU640e 화학 분석기에서 수행된다. 절대 망상 적혈구 및 RBC 형태는 Siemens Advia 120 자동 혈액학 시스템에 의해 분석되었다. Fc-Fab 융합은 투여 전 값과 비교하여 망상 적혈구 수에 영향을 미치지 않았다 (도 47a). 추가적으로, 혈청 철 뿐만 아니라 적혈구 세포 수 또한 영향을 받지 않았다 (도 47b 및 47c). 함께 이들 데이터는 변형된 TfR-결합 Fc 폴리펩티드-Fab 융합이 비-인간 영장류에서 항체의 뇌 노출을 안전하고, 효과적으로 증가시켜, 강력한 약력학적 반응(가령, CSF Aβ 감소)을 생성할 수 있음을 나타낸다.
실시예 9. M201L 및 N207S 돌연변이를 함유하는 CH3C.35의 약력학 분석
본 실시예는 돌연변이 M201L 및 N207S는 CH3C.35와 양립가능함을 설명한다.
서열 번호: 1을 참고로 하여 번호매김된 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이, M201L 및 N207S (EU 번호매김에 따른 경우 M428L/N434S; “LS”돌연변이로 또한 지칭됨)가 TfR-결합 Fc 변형에 필적하는 지를 평가하기 위하여, 인간 FcRn 녹-인 마우스에게 Ab153_LALAPG, Ab153_LALA.LS, CH3C.35.21:Ab153_LALA.LS, 또는 Ab153_LALAPG.YTE를 10 mg/kg로 투여하였다. 14 일에 걸친 혈장 PK 평가에서 임의의 혈청 안정성 돌연변이가 없는 Ab153_LALAPG와 비교하였을 때, Ab153_LALA.LS, CH3C.35.21:Ab153_LALA.LS, 및 Ab153_LALAPG.YTE의 경우 유사하게 약 2-배 개선을 나타내었다 (도 48a 및 48b). 이는 TfR 결합에 대한 추가 Fc 돌연변이가 생체 내에서 huIgG1 반감기를 개선시키는 LS 돌연변이의 능력에 영향을 미치지 않음을 나타낸다.
실시예 10. CH3C.35.21의 단일 아미노산 치환
본 실시예는 CH3C.35.21 단일 아미노산 돌연변이체의 라이브러리의 구축을 기술한다.
방법
각각 CH3C.35.21의 단일 아미노산 치환을 함유하는 CH3C.35.21 돌연변이체의 라이브러리는 Kunkel 돌연변이유발을 이용하여 구축되었다 (Kunkel, Proc Natl Acad Sci U S A. 82(2):488-92, 1985). CH3C.35.21의 각 위치에서, 서열 번호:1에 따라 번호매김된 W153, Y157, T159, E160, W161, S162, S163, K165, T186, K187, E188, E189, F194, S197, 및 S199(EU 번호매김 체계에 따라 번호매김될 때, W380, Y384, T386, E387, W388, S389, S390, K392, T413, K414, E415, E416, F421, S424, 및 S426)는 축퇴 돌연변이성 올리고를 이용하여 코돈 NNK로 개별적으로 돌연변이되었다. 상기 라이브러리에서 원래 CH3C.35.21 클론이 획득되는 것을 회피하기 위하여, 야생형 IgG1 Fc를 인코드하는 단일-가닥으로된 DNA (ssDNA) Kunkel 주형이 이용되었다. 2개의 돌연변이성 올리고 (하나는 NNK를 갖고, 그리고 다른 하나는 CH3C.35.21 영역을 인코딩함)를 복합 이용하여, 두 올리고가 통합될 때, CH3C.35.21 아미노산 서열이 생성되지만, 원하는 라이브러리 위치에 NNK 코돈을 갖는다. 상기 주형은 야생형 Fc이기 때문에, 단일 올리고 삽입, 또는 올리고 삽입이 없는 경우 TfR에 결합하지 않을 것이고, 따라서, 이들 구조체들은 임의의 분석에서 용이하게 제거되었다. 유사하게, NNK 위치에서 발생되는 중지 코돈은 배제되었다. 라이브러리는 EBY100 이스트로 형질감염되었다. 나이브(
) 라이브러리가 원하는 위치 랜덤화를 가지고 있는 지를 확인하기 위하여, 각 라이브러리로부터 8개 콜로니가 서열화되었다.
이스트 디스플레이 및 유세포 분석에 의해 측정된 원형으로 순열배치된 TfR 정점 도메인 결합 집단의 상위 대략 10%를 친화력을 구별하기 위한 최상의 범위를 제공하는 TfR 농도에서 수집하였다. 각 위치에 대해 12 개의 클론에 대해 서열을 수득하였다. 뚜렷한 집단을 갖는 라이브러리의 경우, 더 나은 개선된 고위(high) 게이트, 중간(medium) 게이트, 하위(low) 게이트(gates)로 수행했다. 각각의 수집된 집단에 대해 36 개의 클론이 서열화되었다. 더욱이, 대응하는 아미노산 위치에 야생형 잔기를 갖는 대응하는 돌연변이체의 결합에 대하여 돌연변이체의 결합을 비교하기 위하여, 동일한 위치의 아미노산은 유사한 방법으로 돌연변이 올리고를 이용하여 야생형 IgG1 잔기로 역전시켰다.
표 20은 CH3C.35.21 돌연변이체의 라이브러리를 나타낸다. 각 돌연변이체는 CH3C.35.21의 단일 아미노산 치환을 보유하였다. 예를 들면, 하나의 돌연변이체는 W380E를 보유하고, 상기 위치들중 나머지 위치에서 아미노산은 CH3C.35.21의 것과 동일하다. 표 20에 나타낸 위치는 EU 번호매김 체계에 따라 번호매김된다.
실시예 11. CH3C.18 변이체의 구축
본 실시예는 CH3C.18 변이체의 라이브러리의 구축을 기술한다.
단일 클론을 단리하고, CH3C.18 변이체의 표면 발현을 유도하기 위해0.2% 글루코스가 보충된 SG-CAA 배지에서 하롯밤 동안 성장시켰다. 각각의 클론에 대해, 2 백만 개의 세포를 pH 7.4에서 PBS+0.5% BSA에서 3 회 세척하였다. 세포는 바이오티닐화된 표적, 250 nM 인간 TfR, 250 nM cyno TfR, 또는 250 nM의 무관한 바이오티닐화된 단백질로 1 시간 동안 4℃에서 교반과 함께 착색되었고, 그 다음 동일 완충액으로 2회 세척되었다. 세포를 4℃에서 30 분 동안 뉴트라비딘-Alexafluor647 (AF647)로 염색한 후, 다시 2 회 세척하였다. 항-닭-Alexfluor488 (AF488) 이차 항체와 함께, 항-c-myc 항체를 사용하여 발현을 측정하였다. 세포를 재현탁시키고, AF647 및 AF488의 중앙 형광 강도 (MFI)를 BD FACS CantoII에서 측정하였다. MFI는 각각의 집단에 대한 TfR-결합 집단에 대해 계산되었고, 인간 TfR, cyno TfR 또는 대조군 결합으로 플롯팅되었다(도 49).
표 21은 CH3C.18 변이체의 라이브러리를 나타낸다. 각 열은 각 위치에서 표시된 아미노산 치환을 포함하는 변이체를 나타내고, 나머지 위치의 아미노산은 야생형 Fc의 아미노산과 동일하다. 표 21에 나타낸 위치는 EU 번호매김 체계에 따라 번호매김된다.
표 (예를 들어, 표 9)에 기재된 각각의 클론에 대한 아미노산 치환은 불일치의 경우, 서열 목록에 제시된 서열에서 발견된 아미노산에 대한 클론의 레지스터 위치에서의 아미노산 치환을 지시한다.
본 명세서에 기술된 실시예 및 구체예는 단지 설명을 위한 것이며, 이에 대한 다양한 변형 또는 변경이 당업자에게 제안될 것이며, 본 출원의 사상 및 첨부된 청구 범위 및 본 발명의 범위 내에 포함되어야 하는 것으로 이해된다. 본원에 인용된 서열 수탁 번호의 서열은 본원에 참고로 포함된다.
SEQUENCE LISTING
<110> Denali Therapeutics Inc.
<120> ENGINEERED TRANSFERRIN RECEPTOR BINDING POLYPEPTIDES
<130> 102342-000130PC-1073688
<150> US 62/460,692
<151> 2017-02-17
<150> US 62/543,658
<151> 2017-08-10
<150> US 62/583,314
<151> 2017-11-08
<160> 626
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 220
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
115 120 125
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
130 135 140
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
145 150 155 160
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
165 170 175
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
180 185 190
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
195 200 205
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 2
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 2
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys
<210> 3
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 3
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 4
<211> 220
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 4
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
115 120 125
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
130 135 140
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Leu Gly Leu Val
145 150 155 160
Trp Val Gly Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
165 170 175
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Ala Lys Ser Thr Trp Gln Gln
180 185 190
Gly Trp Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
195 200 205
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 5
<211> 220
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 5
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
115 120 125
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
130 135 140
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Tyr Gly Thr Val
145 150 155 160
Trp Ser His Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
165 170 175
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Ser Lys Ser Glu Trp Gln Gln
180 185 190
Gly Tyr Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
195 200 205
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 6
<211> 220
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 6
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1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
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Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
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Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
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Trp Ser Gln Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
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<211> 220
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
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Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
1 5 10 15
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 102
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
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Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
180 185 190
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu Xaa Xaa His
195 200 205
Xaa Gly Phe Ser Asp Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 103
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
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<222> (125)..(125)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
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<222> (214)..(214)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (217)..(220)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 103
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys Gly Gln Pro Arg Phe Asp Tyr Val Thr Thr Leu Xaa Pro Ser Arg
115 120 125
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
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Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
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Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
165 170 175
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
180 185 190
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
195 200 205
Tyr Gly Phe Ser Asp Xaa Ser Leu Xaa Xaa Xaa Xaa
210 215 220
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Synthetic construct
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
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Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
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130 135 140
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
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Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Xaa Gly Xaa
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Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
180 185 190
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
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Tyr Gly Phe Ser Asp Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 105
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
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Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
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Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
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Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
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Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
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Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
165 170 175
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
180 185 190
Xaa Xaa Xaa Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
195 200 205
Tyr Gly Phe Ser Asp Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
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<220>
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
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Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
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Xaa Xaa Xaa Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
165 170 175
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Xaa Lys Ser Xaa Trp Gln Gln
180 185 190
Gly Xaa Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
195 200 205
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<213> Homo sapiens
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Asn Ser Val Ile Ile Val Asp Lys Asn Gly Arg Leu Val Tyr Leu Val
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Gly Lys Leu Val His Ala Asn Phe Gly Thr Lys Lys Asp Phe Glu Asp
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<213> Macaca fascicularis
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Gly Lys Leu Val His Ala Asn Phe Gly Thr Lys Lys Asp Phe Glu Asp
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Lys Thr Asp Ser Thr Cys Lys Met Val Thr Ser Glu Asn Lys Ser Val
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Lys Thr Asp Ser Thr Cys Arg Met Val Thr Ser Glu Ser Lys Asn Val
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65 70 75 80
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Lys Leu Thr Val Ser Asn Asp Ser Ala Gln Asn Ser Val Ile Ile Val
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Val Ala Asn Ala Glu Ser Leu Asn Ala Ile Gly Val Leu Ile Tyr Met
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<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
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Thr Val Xaa Lys Ser Xaa Trp Gln Gln Gly Xaa Val
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<220>
<223> Synthetic construct
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Val Gly Thr Pro Trp Ala Leu
1 5
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<220>
<223> Synthetic construct
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Tyr Gly Thr Val Trp Ser Lys
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Leu Gly His Val Trp Val Gly
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<211> 7
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 127
Leu Gly His Val Trp Val Ala
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<211> 7
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Leu Gly Pro Val Trp Val His
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Leu Gly His Val Trp Val Asp
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<220>
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Ser Lys Ser Glu Trp Gln Gln Gly Trp
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<223> Synthetic construct
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<220>
<223> Synthetic construct
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Phe Gly Met Val Thr
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<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
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Phe Gly Leu Val Thr
1 5
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
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Ile Asp Tyr Val Thr
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<220>
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<220>
<223> Synthetic construct
<400> 152
Phe Asp Leu Val Thr
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<400> 153
Phe Glu Leu Val Ala
1 5
<210> 154
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 154
Gly His Phe Asp
1
<210> 155
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 155
Gly Phe Tyr Asp
1
<210> 156
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 156
Gly Phe Ser Asp
1
<210> 157
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 157
Gly Phe Phe Asp
1
<210> 158
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 158
Glu Phe Ile
1
<210> 159
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 159
Gly Phe Val
1
<210> 160
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 160
Gln Phe Asp
1
<210> 161
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 161
Ser Phe Glu
1
<210> 162
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 162
Ala Phe Thr
1
<210> 163
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 163
Asn Phe Asp
1
<210> 164
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 164
Gln Phe Val
1
<210> 165
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 165
Gly Phe Ala
1
<210> 166
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 166
Ser Phe Asp
1
<210> 167
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 167
Glu Phe Thr
1
<210> 168
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 168
Gln Phe Thr
1
<210> 169
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 169
Gln Phe Tyr
1
<210> 170
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 170
Tyr Phe Asp
1
<210> 171
<211> 3
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 171
Trp Phe Glu
1
<210> 172
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 172
Asp Val Arg Tyr Glu Trp Gln Leu
1 5
<210> 173
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 173
Pro Val Ser Trp Glu Trp Tyr Trp
1 5
<210> 174
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 174
Met Val Arg Arg Glu Trp His Arg
1 5
<210> 175
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 175
Pro Val Arg Trp Glu Trp Gln Trp
1 5
<210> 176
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 176
Pro Val Arg Trp Glu Trp Gln Asn
1 5
<210> 177
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 177
Leu Val Arg Arg Glu Trp His Arg
1 5
<210> 178
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 178
Ala Val Arg Trp Glu Trp Ile Arg
1 5
<210> 179
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 179
Glu Val Ala Trp Glu Trp Phe Trp
1 5
<210> 180
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 180
Asn Val Arg Val Glu Trp Gln Tyr
1 5
<210> 181
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 181
Glu Val Arg Arg Glu Trp Val Arg
1 5
<210> 182
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 182
Leu Val Arg Arg Glu Trp Gln Arg
1 5
<210> 183
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 183
Asp Val Arg Tyr Glu Trp Tyr Tyr
1 5
<210> 184
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 184
Asp Val Arg Tyr Glu Trp Val Arg
1 5
<210> 185
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 185
Asn Val Arg Arg Glu Trp His Arg
1 5
<210> 186
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 186
Phe Val Gly Val Ala Tyr Asp Val
1 5
<210> 187
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 187
Pro Gln Thr Pro Pro Trp
1 5
<210> 188
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 188
Pro Pro Ser Pro Pro Trp
1 5
<210> 189
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 189
Phe Arg Gly Pro Pro Trp
1 5
<210> 190
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 190
Pro Gln Thr Val Pro Trp
1 5
<210> 191
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 191
Pro Lys Met Pro Pro Trp
1 5
<210> 192
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 192
Pro Pro Val Pro Pro Trp
1 5
<210> 193
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 193
Pro Ala Phe Pro Pro Trp
1 5
<210> 194
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 194
Ala Ile Trp Pro Pro Trp
1 5
<210> 195
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 195
Pro Pro Val Ala Pro Trp
1 5
<210> 196
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 196
Pro Gln Met Pro Pro Gln
1 5
<210> 197
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 197
Pro Gln Thr Ala Pro Trp
1 5
<210> 198
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 198
Pro Gln Thr Pro Pro Gln
1 5
<210> 199
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 199
Pro Arg Val Pro Pro Trp
1 5
<210> 200
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 200
Pro Ser Val Pro Pro Trp
1 5
<210> 201
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 201
Met Leu Trp Pro Val Pro
1 5
<210> 202
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 202
Met Glu Trp Pro Val Thr
1 5
<210> 203
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 203
Asp Asp Leu Thr Phe Gln
1 5
<210> 204
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 204
Ala Tyr Gly Asp Pro Glu
1 5
<210> 205
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 205
Glu Tyr Tyr Thr Tyr
1 5
<210> 206
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 206
Glu Tyr Tyr Ser Asn
1 5
<210> 207
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 207
Glu Tyr Tyr His Asp
1 5
<210> 208
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 208
Glu Tyr Tyr Gln Asn
1 5
<210> 209
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 209
Glu Tyr Tyr Ser Ser
1 5
<210> 210
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 210
Val Tyr His Arg Pro
1 5
<210> 211
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 211
Thr Tyr His Asn Pro
1 5
<210> 212
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 212
Thr Tyr His His Pro
1 5
<210> 213
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 213
Val Tyr Val Thr Pro
1 5
<210> 214
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 214
Leu Tyr Val Thr Pro
1 5
<210> 215
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 215
Trp Tyr Asp Val Pro
1 5
<210> 216
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 216
Val Pro Pro Arg Met
1 5
<210> 217
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 217
Val Pro Pro Trp Met
1 5
<210> 218
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 218
Asp Met Trp Glu Tyr
1 5
<210> 219
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 219
Asp Asp Trp Thr Trp
1 5
<210> 220
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 220
Asp Asp Trp Glu Trp
1 5
<210> 221
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 221
Leu Thr Ser Gln His Asn Ser Thr Val
1 5
<210> 222
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 222
Trp Val Lys Gln Leu Asn Ser Thr Trp
1 5
<210> 223
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 223
Trp Ile Ala Gln Pro Asn Ser Thr Trp
1 5
<210> 224
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 224
Trp Lys Leu Gln Leu Asn Ser Thr Trp
1 5
<210> 225
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 225
Trp Val Trp Phe Tyr
1 5
<210> 226
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 226
Val Val Gly Phe Arg
1 5
<210> 227
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 227
Ile Val Gly Phe Arg
1 5
<210> 228
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 228
Ala Val Gly Phe Glu
1 5
<210> 229
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 229
Ser Val Val Asn Ile Ala Leu Trp Trp Ser
1 5 10
<210> 230
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 230
Arg Val Ser Asn Ser Ala Leu Thr Trp Lys
1 5 10
<210> 231
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 231
Arg Val Ser Asn Ser Ala Leu Ser Trp Arg
1 5 10
<210> 232
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 232
Arg Val Ser Asn Ser Ala Leu Arg Trp Arg
1 5 10
<210> 233
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 233
Gln Val Phe Asn Trp Ala Leu Asp Trp Val
1 5 10
<210> 234
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 234
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 235
<211> 760
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 235
Met Met Asp Gln Ala Arg Ser Ala Phe Ser Asn Leu Phe Gly Gly Glu
1 5 10 15
Pro Leu Ser Tyr Thr Arg Phe Ser Leu Ala Arg Gln Val Asp Gly Asp
20 25 30
Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Val Asp Glu Glu Glu Asn Ala
35 40 45
Asp Asn Asn Thr Lys Ala Asn Val Thr Lys Pro Lys Arg Cys Ser Gly
50 55 60
Ser Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val Ile Val Phe Phe Leu Ile Gly
65 70 75 80
Phe Met Ile Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys Gly Val Glu Pro Lys Thr
85 90 95
Glu Cys Glu Arg Leu Ala Gly Thr Glu Ser Pro Val Arg Glu Glu Pro
100 105 110
Gly Glu Asp Phe Pro Ala Ala Arg Arg Leu Tyr Trp Asp Asp Leu Lys
115 120 125
Arg Lys Leu Ser Glu Lys Leu Asp Ser Thr Asp Phe Thr Gly Thr Ile
130 135 140
Lys Leu Leu Asn Glu Asn Ser Tyr Val Pro Arg Glu Ala Gly Ser Gln
145 150 155 160
Lys Asp Glu Asn Leu Ala Leu Tyr Val Glu Asn Gln Phe Arg Glu Phe
165 170 175
Lys Leu Ser Lys Val Trp Arg Asp Gln His Phe Val Lys Ile Gln Val
180 185 190
Lys Asp Ser Ala Gln Asn Ser Val Ile Ile Val Asp Lys Asn Gly Arg
195 200 205
Leu Val Tyr Leu Val Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Val Ala Tyr Ser Lys
210 215 220
Ala Ala Thr Val Thr Gly Lys Leu Val His Ala Asn Phe Gly Thr Lys
225 230 235 240
Lys Asp Phe Glu Asp Leu Tyr Thr Pro Val Asn Gly Ser Ile Val Ile
245 250 255
Val Arg Ala Gly Lys Ile Thr Phe Ala Glu Lys Val Ala Asn Ala Glu
260 265 270
Ser Leu Asn Ala Ile Gly Val Leu Ile Tyr Met Asp Gln Thr Lys Phe
275 280 285
Pro Ile Val Asn Ala Glu Leu Ser Phe Phe Gly His Ala His Leu Gly
290 295 300
Thr Gly Asp Pro Tyr Thr Pro Gly Phe Pro Ser Phe Asn His Thr Gln
305 310 315 320
Phe Pro Pro Ser Arg Ser Ser Gly Leu Pro Asn Ile Pro Val Gln Thr
325 330 335
Ile Ser Arg Ala Ala Ala Glu Lys Leu Phe Gly Asn Met Glu Gly Asp
340 345 350
Cys Pro Ser Asp Trp Lys Thr Asp Ser Thr Cys Arg Met Val Thr Ser
355 360 365
Glu Ser Lys Asn Val Lys Leu Thr Val Ser Asn Val Leu Lys Glu Ile
370 375 380
Lys Ile Leu Asn Ile Phe Gly Val Ile Lys Gly Phe Val Glu Pro Asp
385 390 395 400
His Tyr Val Val Val Gly Ala Gln Arg Asp Ala Trp Gly Pro Gly Ala
405 410 415
Ala Lys Ser Gly Val Gly Thr Ala Leu Leu Leu Lys Leu Ala Gln Met
420 425 430
Phe Ser Asp Met Val Leu Lys Asp Gly Phe Gln Pro Ser Arg Ser Ile
435 440 445
Ile Phe Ala Ser Trp Ser Ala Gly Asp Phe Gly Ser Val Gly Ala Thr
450 455 460
Glu Trp Leu Glu Gly Tyr Leu Ser Ser Leu His Leu Lys Ala Phe Thr
465 470 475 480
Tyr Ile Asn Leu Asp Lys Ala Val Leu Gly Thr Ser Asn Phe Lys Val
485 490 495
Ser Ala Ser Pro Leu Leu Tyr Thr Leu Ile Glu Lys Thr Met Gln Asn
500 505 510
Val Lys His Pro Val Thr Gly Gln Phe Leu Tyr Gln Asp Ser Asn Trp
515 520 525
Ala Ser Lys Val Glu Lys Leu Thr Leu Asp Asn Ala Ala Phe Pro Phe
530 535 540
Leu Ala Tyr Ser Gly Ile Pro Ala Val Ser Phe Cys Phe Cys Glu Asp
545 550 555 560
Thr Asp Tyr Pro Tyr Leu Gly Thr Thr Met Asp Thr Tyr Lys Glu Leu
565 570 575
Ile Glu Arg Ile Pro Glu Leu Asn Lys Val Ala Arg Ala Ala Ala Glu
580 585 590
Val Ala Gly Gln Phe Val Ile Lys Leu Thr His Asp Val Glu Leu Asn
595 600 605
Leu Asp Tyr Glu Arg Tyr Asn Ser Gln Leu Leu Ser Phe Val Arg Asp
610 615 620
Leu Asn Gln Tyr Arg Ala Asp Ile Lys Glu Met Gly Leu Ser Leu Gln
625 630 635 640
Trp Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Asp Phe Phe Arg Ala Thr Ser Arg Leu
645 650 655
Thr Thr Asp Phe Gly Asn Ala Glu Lys Thr Asp Arg Phe Val Met Lys
660 665 670
Lys Leu Asn Asp Arg Val Met Arg Val Glu Tyr His Phe Leu Ser Pro
675 680 685
Tyr Val Ser Pro Lys Glu Ser Pro Phe Arg His Val Phe Trp Gly Ser
690 695 700
Gly Ser His Thr Leu Pro Ala Leu Leu Glu Asn Leu Lys Leu Arg Lys
705 710 715 720
Gln Asn Asn Gly Ala Phe Asn Glu Thr Leu Phe Arg Asn Gln Leu Ala
725 730 735
Leu Ala Thr Trp Thr Ile Gln Gly Ala Ala Asn Ala Leu Ser Gly Asp
740 745 750
Val Trp Asp Ile Asp Asn Glu Phe
755 760
<210> 236
<211> 220
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 236
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
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100 105 110
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<213> Macaca fascicularis
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420 425 430
Phe Ser Asp Met Val Leu Lys Asp Gly Phe Gln Pro Ser Arg Ser Ile
435 440 445
Ile Phe Ala Ser Trp Ser Ala Gly Asp Phe Gly Ser Val Gly Ala Thr
450 455 460
Glu Trp Leu Glu Gly Tyr Leu Ser Ser Leu His Leu Lys Ala Phe Thr
465 470 475 480
Tyr Ile Asn Leu Asp Lys Ala Val Leu Gly Thr Ser Asn Phe Lys Val
485 490 495
Ser Ala Ser Pro Leu Leu Tyr Thr Leu Ile Glu Lys Thr Met Gln Asp
500 505 510
Val Lys His Pro Val Thr Gly Arg Ser Leu Tyr Gln Asp Ser Asn Trp
515 520 525
Ala Ser Lys Val Glu Lys Leu Thr Leu Asp Asn Ala Ala Phe Pro Phe
530 535 540
Leu Ala Tyr Ser Gly Ile Pro Ala Val Ser Phe Cys Phe Cys Glu Asp
545 550 555 560
Thr Asp Tyr Pro Tyr Leu Gly Thr Thr Met Asp Thr Tyr Lys Glu Leu
565 570 575
Val Glu Arg Ile Pro Glu Leu Asn Lys Val Ala Arg Ala Ala Ala Glu
580 585 590
Val Ala Gly Gln Phe Val Ile Lys Leu Thr His Asp Thr Glu Leu Asn
595 600 605
Leu Asp Tyr Glu Arg Tyr Asn Ser Gln Leu Leu Leu Phe Leu Arg Asp
610 615 620
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625 630 635 640
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660 665 670
Lys Leu Asn Asp Arg Val Met Arg Val Glu Tyr Tyr Phe Leu Ser Pro
675 680 685
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690 695 700
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Ser Val Ile Ile Val Asp Lys Asn Gly Arg Leu Val Tyr Leu Val Glu
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130 135 140
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145 150 155 160
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<223> Synthetic construct
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20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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<223> Synthetic construct
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<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(6)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 346
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<210> 347
<211> 220
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 347
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50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
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50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 351
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
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50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
115 120 125
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130 135 140
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Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 352
<211> 220
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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130 135 140
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Phe Gly Thr Glu
145 150 155 160
Trp Ser Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
165 170 175
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Ser Lys Glu Glu Trp Gln Gln
180 185 190
Gly Phe Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His
195 200 205
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 548
<211> 220
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 548
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
115 120 125
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly
130 135 140
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Phe Gly Thr Glu
145 150 155 160
Trp Ser Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
165 170 175
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Ser Lys Glu Glu Trp Gln Gln
180 185 190
Gly Phe Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His
195 200 205
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 549
<211> 220
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 549
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
115 120 125
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly
130 135 140
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Phe Gly Thr Glu
145 150 155 160
Trp Ser Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
165 170 175
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Ser Lys Glu Glu Trp Gln Gln
180 185 190
Gly Phe Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His
195 200 205
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 550
<211> 220
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 550
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
115 120 125
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly
130 135 140
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Phe Gly Thr Glu
145 150 155 160
Trp Ser Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
165 170 175
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Ser Lys Glu Glu Trp Gln Gln
180 185 190
Gly Phe Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His
195 200 205
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
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<211> 220
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 551
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
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65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
115 120 125
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly
130 135 140
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Phe Gly Thr Glu
145 150 155 160
Trp Ser Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
165 170 175
Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Ser Lys Glu Glu Trp Gln Gln
180 185 190
Gly Phe Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His
195 200 205
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
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<211> 220
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 552
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
115 120 125
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly
130 135 140
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Phe Gly Thr Glu
145 150 155 160
Trp Ser Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
165 170 175
Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Ser Lys Glu Glu Trp Gln Gln
180 185 190
Gly Phe Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His
195 200 205
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 553
<211> 220
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 553
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
85 90 95
Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
115 120 125
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly
130 135 140
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Phe Gly Thr Glu
145 150 155 160
Trp Ser Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
165 170 175
Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Ser Lys Glu Glu Trp Gln Gln
180 185 190
Gly Phe Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His
195 200 205
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
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<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = Glu, Leu, Ser, Val, Trp, or Tyr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa = an aromatic amino acid (e.g., Tyr, Phe, or Trp), Met, Pro,
or Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa = Thr, Asn, or Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = Glu, Ile, Pro, or Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa = an aliphatic amino acid (e.g., Ala, Ile, or Val), Ser, or
Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> Xaa = Ser, Asn, Arg, or Thr
<400> 554
Xaa Trp Glu Ser Xaa Gly Xaa Xaa Trp Xaa Xaa
1 5 10
<210> 555
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = Thr, His, or Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa = Glu, Ser, Asp, Gly, Thr, Pro, Gln, or Arg
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Xaa = Phe, His, Lys, Tyr, or Trp
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> Xaa = Ser, Thr, or Trp
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> Xaa = Ser, Cys, Pro, Met, or Trp
<400> 555
Xaa Lys Xaa Xaa Trp Gln Gln Gly Xaa Val Phe Xaa Cys Xaa
1 5 10
<210> 556
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> Xaa = Glu, Leu, Ser, Val, Trp, or Tyr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (44)..(44)
<223> Xaa = an aromatic amino acid (e.g., Tyr, Phe, or Trp), Met, Pro,
or Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (46)..(46)
<223> Xaa = Thr, Asn, or Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (47)..(47)
<223> Xaa = Glu, Ile, Pro, or Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (49)..(49)
<223> Xaa = an aliphatic amino acid (e.g., Ala, Ile, or Val), Ser, or
Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50)..(50)
<223> Xaa = Ser, Asn, Arg, or Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (73)..(73)
<223> Xaa = Thr, His, or Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (75)..(75)
<223> Xaa = Glu, Ser, Asp, Gly, Thr, Pro, Gln, or Arg
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (76)..(76)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (81)..(81)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (84)..(84)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (86)..(86)
<223> Xaa = Ser, Cys, Pro, Met, or Trp
<400> 556
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Xaa Trp Glu Ser Xaa Gly Xaa Xaa Trp
35 40 45
Xaa Xaa Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Xaa Lys Xaa Xaa Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Xaa Val Phe Xaa Cys Xaa Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 557
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = Glu, Leu, or Trp
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa = an aromatic amino acid (e.g., Tyr or Phe)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa = an aliphatic amino acid (e.g., Ala or Val) or Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> Xaa = Ser or Asn
<400> 557
Xaa Trp Glu Ser Xaa Gly Thr Glu Trp Xaa Xaa
1 5 10
<210> 558
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = Thr or Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa = Glu or Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Xaa = Phe, His, Tyr, or Trp
<400> 558
Xaa Lys Xaa Glu Trp Gln Gln Gly Xaa Val Phe Ser Cys Ser
1 5 10
<210> 559
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> Xaa = Glu, Leu, or Trp
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (44)..(44)
<223> Xaa = an aromatic amino acid (e.g., Tyr or Phe)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (49)..(49)
<223> Xaa = an aliphatic amino acid (e.g., Ala or Val) or Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50)..(50)
<223> Xaa = Ser or Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (73)..(73)
<223> Xaa = Thr or Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (75)..(75)
<223> Xaa = Glu or Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (81)..(81)
<223> Xaa = Phe, His, Tyr, or Trp
<400> 559
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Xaa Trp Glu Ser Xaa Gly Thr Glu Trp
35 40 45
Xaa Xaa Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Xaa Lys Xaa Glu Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Xaa Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 560
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = Glu, Leu, or Trp
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa = Tyr or Phe
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa = Ser, Ala or Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> Xaa = Ser or Asn
<400> 560
Xaa Trp Glu Ser Xaa Gly Thr Glu Trp Xaa Xaa
1 5 10
<210> 561
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = Thr or Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa = Glu or Ser
<400> 561
Xaa Lys Xaa Glu Trp Gln Gln Gly Phe Val Phe Ser Cys Ser
1 5 10
<210> 562
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> Xaa = Glu, Leu, or Trp
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (44)..(44)
<223> Xaa = Tyr or Phe
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (49)..(49)
<223> Xaa = Ser, Ala or Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50)..(50)
<223> Xaa = Ser or Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (73)..(73)
<223> Xaa = Thr or Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (75)..(75)
<223> Xaa = Glu or Ser
<400> 562
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Xaa Trp Glu Ser Xaa Gly Thr Glu Trp
35 40 45
Xaa Xaa Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Xaa Lys Xaa Glu Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Phe Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 563
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> Xaa = Glu, Leu, Ser, Val, Trp, or Tyr
<400> 563
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Xaa Trp Glu Ser Tyr Gly Thr Glu Trp
35 40 45
Ser Ser Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Thr Lys Glu Glu Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Phe Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 564
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (44)..(44)
<223> Xaa = Tyr, Phe, Met, Pro, Val, or Trp
<400> 564
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Trp Trp Glu Ser Xaa Gly Thr Glu Trp
35 40 45
Ser Ser Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Thr Lys Glu Glu Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Phe Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 565
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (46)..(46)
<223> Xaa = Thr, Asn, or Val
<400> 565
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Trp Trp Glu Ser Tyr Gly Xaa Glu Trp
35 40 45
Ser Ser Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Thr Lys Glu Glu Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Phe Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 566
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (47)..(47)
<223> Xaa = Glu, Ile, Pro, or Val
<400> 566
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Trp Trp Glu Ser Tyr Gly Thr Xaa Trp
35 40 45
Ser Ser Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Thr Lys Glu Glu Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Phe Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 567
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (49)..(49)
<223> Xaa = Ser, Ala, Ile, Thr, or Val
<400> 567
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Trp Trp Glu Ser Tyr Gly Thr Glu Trp
35 40 45
Xaa Ser Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Thr Lys Glu Glu Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Phe Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 568
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50)..(50)
<223> Xaa = Ser, Asn, Arg, or Thr
<400> 568
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Trp Trp Glu Ser Tyr Gly Thr Glu Trp
35 40 45
Ser Xaa Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Thr Lys Glu Glu Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Phe Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 569
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (73)..(73)
<223> Xaa = Thr, His, or Ser
<400> 569
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Trp Trp Glu Ser Tyr Gly Thr Glu Trp
35 40 45
Ser Ser Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Xaa Lys Glu Glu Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Phe Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 570
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (75)..(75)
<223> Xaa = Glu, Ser, Asp, Gly, Thr, Pro, Gln, or Arg
<400> 570
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Trp Trp Glu Ser Tyr Gly Thr Glu Trp
35 40 45
Ser Ser Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Thr Lys Xaa Glu Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Phe Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 571
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (76)..(76)
<223> Xaa = Glu or Arg
<400> 571
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Trp Trp Glu Ser Tyr Gly Thr Glu Trp
35 40 45
Ser Ser Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Thr Lys Glu Xaa Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Phe Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 572
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (81)..(81)
<223> Xaa = Phe, His, Lys, or Tyr
<400> 572
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Trp Trp Glu Ser Tyr Gly Thr Glu Trp
35 40 45
Ser Ser Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Thr Lys Glu Glu Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Xaa Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 573
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (84)..(84)
<223> Xaa = Ser, Thr, or Trp
<400> 573
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Trp Trp Glu Ser Tyr Gly Thr Glu Trp
35 40 45
Ser Ser Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Thr Lys Glu Glu Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Phe Val Phe Xaa Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 574
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (86)..(86)
<223> Xaa = Ser, Cys, Pro, Met, or Trp
<400> 574
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Trp Trp Glu Ser Tyr Gly Thr Glu Trp
35 40 45
Ser Ser Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Thr Lys Glu Glu Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Phe Val Phe Ser Cys Xaa Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
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<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa = Pro, Val, or Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa = Ala, Ser, Val, or Gly
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> Xaa = Leu, His, Gln, Gly, Val, Ala, Asn, Asp, Thr, or Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> Xaa = Thr, Phe, Gln, Val, or Tyr
<400> 575
Xaa Trp Glu Ser Xaa Gly Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Xaa
1 5 10
<210> 576
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = Leu, Ser, Glu, Ala, or Pro
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa = Glu, Asp, Thr, or Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Xaa = Trp, Tyr, His, or Phe
<400> 576
Xaa Lys Ser Xaa Trp Gln Gln Gly Xaa
1 5
<210> 577
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> Xaa = Glu or Trp
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (46)..(46)
<223> Xaa = Leu, Pro, Phe, Thr, or His
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (47)..(47)
<223> Xaa = Pro, Val, or Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (49)..(49)
<223> Xaa = Ala, Ser, Val, or Gly
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50)..(50)
<223> Xaa = Leu, His, Gln, Gly, Val, Ala, Asn, Asp, Thr, or Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (51)..(51)
<223> Xaa = Thr, Phe, Gln, Val, or Tyr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (73)..(73)
<223> Xaa = Leu, Ser, Glu, Ala, or Pro
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (76)..(76)
<223> Xaa = Glu, Asp, Thr, or Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (81)..(81)
<223> Xaa = Trp, Tyr, His, or Phe
<400> 577
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Xaa Trp Glu Ser Xaa Gly Xaa Xaa Trp
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Xaa Lys Ser Xaa Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Xaa Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 578
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = Glu or Trp
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa = Trp, Leu, or Tyr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa = Thr or His
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa = Ala, Ser, or Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> Xaa = Val, Thr, or Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> Xaa = Tyr or Gln
<400> 578
Xaa Trp Glu Ser Xaa Gly Xaa Val Trp Xaa Xaa Xaa
1 5 10
<210> 579
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa = Thr or Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Xaa = Trp, Tyr, His, or Phe
<400> 579
Pro Lys Ser Xaa Trp Gln Gln Gly Xaa
1 5
<210> 580
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> Xaa = Glu or Trp
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (44)..(44)
<223> Xaa = Trp, Leu, or Tyr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (46)..(46)
<223> Xaa = Thr or His
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (49)..(49)
<223> Xaa = Ala, Ser, or Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50)..(50)
<223> Xaa = Val, Thr, or Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (51)..(51)
<223> Xaa = Tyr or Gln
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (76)..(76)
<223> Xaa = Thr or Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (81)..(81)
<223> Xaa = Trp, Tyr, His, or Phe
<400> 580
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Xaa Trp Glu Ser Xaa Gly Xaa Val Trp
35 40 45
Xaa Xaa Xaa Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Pro Lys Ser Xaa Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Xaa Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 581
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 581
Glu Trp Glu Ser Phe Gly Thr Glu Trp Ser Ser
1 5 10
<210> 582
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 582
Ser Lys Glu Glu Trp Gln Gln Gly Phe
1 5
<210> 583
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 583
Glu Trp Glu Ser Tyr Gly Thr Glu Trp Ala Asn
1 5 10
<210> 584
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 584
Ser Lys Ser Glu Trp Gln Gln Gly Phe
1 5
<210> 585
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 585
Glu Trp Glu Ser Phe Gly Thr Glu Trp Ser Asn
1 5 10
<210> 586
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 586
Ser Lys Glu Glu Trp Gln Gln Gly Phe
1 5
<210> 587
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 587
Glu Trp Glu Ser Tyr Gly Thr Glu Trp Ser Ser
1 5 10
<210> 588
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 588
Ser Lys Ser Glu Trp Gln Gln Gly Phe
1 5
<210> 589
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 589
Glu Trp Glu Ser Tyr Gly Thr Glu Trp Val Asn
1 5 10
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 590
Ser Lys Glu Glu Trp Gln Gln Gly Phe
1 5
<210> 591
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 591
Glu Trp Glu Ser Tyr Gly Thr Glu Trp Ser Asn
1 5 10
<210> 592
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 592
Ser Lys Ser Glu Trp Gln Gln Gly Phe
1 5
<210> 593
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 593
Glu Trp Glu Ser Phe Gly Thr Glu Trp Val Asn
1 5 10
<210> 594
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 594
Ser Lys Glu Glu Trp Gln Gln Gly Phe
1 5
<210> 595
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 595
Trp Gly Phe Val Trp Ser Thr Tyr
1 5
<210> 596
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 596
Pro Lys Ser Asn Trp Gln Gln Gly Phe
1 5
<210> 597
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 597
Trp Gly His Val Trp Ser Thr Tyr
1 5
<210> 598
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 598
Pro Lys Ser Asn Trp Gln Gln Gly Tyr
1 5
<210> 599
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 599
Leu Gly His Val Trp Val Glu Gln
1 5
<210> 600
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 600
Pro Lys Ser Thr Trp Gln Gln Gly Trp
1 5
<210> 601
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 601
Leu Gly His Val Trp Val Gly Val
1 5
<210> 602
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 602
Pro Lys Ser Thr Trp Gln Gln Gly Trp
1 5
<210> 603
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 603
Leu Gly His Val Trp Val His Thr
1 5
<210> 604
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 604
Pro Lys Ser Thr Trp Gln Gln Gly Trp
1 5
<210> 605
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 605
Trp Gly Thr Val Trp Gly Thr Tyr
1 5
<210> 606
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 606
Pro Lys Ser Asn Trp Gln Gln Gly Tyr
1 5
<210> 607
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 607
Leu Gly His Val Trp Val Gly Thr
1 5
<210> 608
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<400> 608
Pro Lys Ser Thr Trp Gln Gln Gly Trp
1 5
<210> 609
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = Glu, Leu, Ser, Val, Trp, or Tyr
<400> 609
Xaa Trp Glu Ser Tyr Gly Thr Glu Trp Ser Ser
1 5 10
<210> 610
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa = Tyr, Phe, Met, Pro, Val, or Trp
<400> 610
Trp Trp Glu Ser Xaa Gly Thr Glu Trp Ser Ser
1 5 10
<210> 611
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa = Thr, Asn, or Val
<400> 611
Trp Trp Glu Ser Tyr Gly Xaa Glu Trp Ser Ser
1 5 10
<210> 612
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa = Glu, Ile, Pro, or Val
<400> 612
Trp Trp Glu Ser Tyr Gly Thr Xaa Trp Ser Ser
1 5 10
<210> 613
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa = Ser, Ala, Ile, Thr, or Val
<400> 613
Trp Trp Glu Ser Tyr Gly Thr Glu Trp Xaa Ser
1 5 10
<210> 614
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> Xaa = Ser, Asn, Arg, or Thr
<400> 614
Trp Trp Glu Ser Tyr Gly Thr Glu Trp Ser Xaa
1 5 10
<210> 615
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa = Thr, His, or Ser
<400> 615
Xaa Lys Glu Glu Trp Gln Gln Gly Phe Val Phe Ser Cys Ser
1 5 10
<210> 616
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa = Glu, Ser, Asp, Gly, Thr, Pro, Gln, or Arg
<400> 616
Thr Lys Xaa Glu Trp Gln Gln Gly Phe Val Phe Ser Cys Ser
1 5 10
<210> 617
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa = Glu or Arg
<400> 617
Thr Lys Glu Xaa Trp Gln Gln Gly Phe Val Phe Ser Cys Ser
1 5 10
<210> 618
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Xaa = Phe, His, Lys, or Tyr
<400> 618
Thr Lys Glu Glu Trp Gln Gln Gly Xaa Val Phe Ser Cys Ser
1 5 10
<210> 619
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> Xaa = Ser, Thr, or Trp
<400> 619
Thr Lys Glu Glu Trp Gln Gln Gly Phe Val Phe Xaa Cys Ser
1 5 10
<210> 620
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> Xaa = Ser, Cys, Pro, Met, or Trp
<400> 620
Thr Lys Glu Glu Trp Gln Gln Gly Phe Val Phe Ser Cys Xaa
1 5 10
<210> 621
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 621
Thr Xaa Trp Ser Xaa
1 5
<210> 622
<211> 181
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (97)..(97)
<223> Xaa = Asp or Glu
<400> 622
Asn Ser Val Ile Ile Val Asp Lys Asn Gly Arg Leu Val Tyr Leu Val
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Val Ala Tyr Ser Lys Ala Ala Thr Val Thr
20 25 30
Gly Lys Leu Val His Ala Asn Phe Gly Thr Lys Lys Asp Phe Glu Asp
35 40 45
Leu Asp Ser Pro Val Asn Gly Ser Ile Val Ile Val Arg Ala Gly Lys
50 55 60
Ile Thr Phe Ala Glu Lys Val Ala Asn Ala Glu Ser Leu Asn Ala Ile
65 70 75 80
Gly Val Leu Ile Tyr Met Asp Gln Thr Lys Phe Pro Ile Val Asn Ala
85 90 95
Xaa Leu Ser Phe Phe Gly His Ala His Leu Gly Thr Gly Asp Pro Tyr
100 105 110
Thr Pro Gly Phe Pro Ser Phe Asn His Thr Gln Phe Pro Pro Ser Arg
115 120 125
Ser Ser Gly Leu Pro Asn Ile Pro Val Gln Thr Ile Ser Arg Ala Ala
130 135 140
Ala Glu Lys Leu Phe Gly Asn Met Glu Gly Asp Cys Pro Ser Asp Trp
145 150 155 160
Lys Thr Asp Ser Thr Cys Arg Met Val Thr Ser Glu Asn Lys Asn Val
165 170 175
Lys Leu Thr Val Ser
180
<210> 623
<211> 330
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 623
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 624
<211> 326
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 624
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 625
<211> 377
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 625
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro
100 105 110
Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
115 120 125
Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys
130 135 140
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
145 150 155 160
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
165 170 175
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
180 185 190
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
195 200 205
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
210 215 220
Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
225 230 235 240
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
245 250 255
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
260 265 270
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
275 280 285
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
290 295 300
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn
305 310 315 320
Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
325 330 335
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile
340 345 350
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
355 360 365
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375
<210> 626
<211> 327
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 626
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
Claims (182)
- 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 변형된 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 157, 159, 160, 161, 162, 163, 186, 189, 및 194를 포함하는 아미노산 위치 세트에서 5, 6, 7, 8, 또는 9개 치환을 포함하고; 이때 상기 치환 및 상기 위치는 서열 번호:1의 아미노산 114-220을 참고하여 결정되는, 폴리펩티드.
- 청구항 1에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 153, 164, 165, 및 188을 포함하는 위치에서 1, 2, 3 또는 4개의 치환을 더 포함하는, 폴리펩티드.
- 청구항 1 또는 2에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 187, 197, 및 199를 포함하는 위치에 1, 2 또는 3개 치환을 더 포함하는, 폴리펩티드.
- 청구항 1 내지 3중 임의의 한 항에 있어서, 이때 폴리펩티드는 트란스페린 수용체의 정점 도메인에 결합하는, 폴리펩티드.
- 청구항 4에 있어서, 이때 상기 폴리펩티드는 트란스페린이 트란스페린 수용체에 결합하는 것을 방해하지 않고, 트란스페린 수용체에 결합하는, 폴리펩티드.
- 청구항 4 또는 5에 있어서, 이때 상기 폴리펩티드는 트란스페린 수용체 서열의 아미노산 208을 포함하는 에피토프에 결합하는, 폴리펩티드.
- 청구항 1 내지 6중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 위치 161에 Trp를 포함하는, 폴리펩티드.
- 청구항 1 내지 7중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 위치 194에서 방향족 아미노산을 포함하는, 폴리펩티드.
- 청구항 8에 있어서, 이때 위치 194의 방향족 아미노산은 Trp 또는 Phe인, 폴리펩티드.
- 청구항 1 내지 6중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 다음에서 선택된 최소한 하나의 위치를 포함하는 폴리펩티드: 위치 157은 Leu, Tyr, Met, 또는 Val이고; 위치 159는 Leu, Thr, His, 또는 Pro이고; 위치 160은 Val, Pro, 또는 산성 아미노산이고; 위치 161은 Trp이고; 위치 162는 Val, Ser, 또는 Ala이고; 위치 186은 Glu, Ala, Ser, Leu, Thr, 또는 Pro이고; 위치 189는 Thr 또는 산성 아미노산이고; 그리고 위치 194는 Trp, Tyr, His, 또는 Phe이다.
- 청구항 10에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 다음에서 선택된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 위치를 포함하는, 폴리펩티드: 위치 157은 Leu, Tyr, Met, 또는 Val이고; 위치 159는 Leu, Thr, His, 또는 Pro이고; 위치 160은 Val, Pro, 또는 산성 아미노산이고; 위치 161은 Trp이고; 위치 162는 Val, Ser, 또는 Ala이고; 위치 186은 Glu, Ala, Ser, Leu, Thr, 또는 Pro이고; 위치 189는 Thr 또는 산성 아미노산이고; 그리고 위치 194는 Trp, Tyr, His, 또는 Phe이다.
- 청구항 1 내지 11중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 위치 157에 Leu 또는 Met를 포함하고; 위치 159에 Leu, His, 또는 Pro를 포함하고; 위치 160에 Val를 포함하고; 위치 161에 Trp를 포함하고; 위치 162에 Val 또는 Ala를 포함하고; 위치 186에 Pro를 포함하고; 위치 189에 Thr를 포함하고; 및/또는 위치 194에 Trp를 포함하는, 폴리펩티드.
- 청구항 12에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 위치 164에서 Ser, Thr, Gln, 또는 Phe를 더 포함하는, 폴리펩티드.
- 청구항 12 또는 13에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 위치 153에서 Trp, Tyr, Leu, 또는 Gln를 더 포함하는, 폴리펩티드.
- 청구항 12 내지 14중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 위치 165에서 Gln, Phe, 또는 His를 더 포함하는, 폴리펩티드.
- 청구항 12 또는 13에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 위치 153 에 Trp 및/또는 위치 165에 Gln를 더 포함하는, 폴리펩티드.
- 청구항 10 내지 16중 임의의 한 항에 있어서, 이때 변형된 CH3 도메인은 다음에서 선택된 1, 2 또는 3개 위치를 더 포함하는, 폴리펩티드: 위치 187은 Lys, Arg, Gly, 또는 Pro이고; 위치 197은 Ser, Thr, Glu, 또는 Lys이고; 그리고 위치 199는 Ser, Trp, 또는 Gly이다.
- 청구항 1 내지 11중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 위치 157에 Tyr를 포함하고, 위치 159에 Thr를 포함하고, 위치 160에 Glu 또는 Val를 포함하고, 위치 161에 Trp를 포함하고, 위치 162에 Ser를 포함하고, 위치 186에 Ser 또는 Thr를 포함하고, 위치 189에 Glu를 포함하고, 및/또는 위치 194에 Phe를 포함하는, 폴리펩티드.
- 청구항 18에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 위치 153에서 Trp, Tyr, Leu, 또는 Gln를 더 포함하는, 폴리펩티드.
- 청구항 18 또는 19에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 위치 188에서 Glu를 더 포함하는, 폴리펩티드.
- 청구항 18에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 위치 153에서 Trp 및/또는 위치 188에서 Glu를 더 포함하는, 폴리펩티드.
- 청구항 18 내지 21중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 위치 163에서 Asn를 포함하는, 폴리펩티드.
- 청구항 2 내지 6중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 하나 또는 그 이상의 다음 치환을 포함하는, 폴리펩티드: 위치 153에 Trp; 위치 159에 Thr; 위치 161에 Trp; 위치 162에 Val; 위치 186에 Ser 또는 Thr; 위치 188에 Glu; 및/또는 위치 194에 Phe.
- 청구항 1 내지 23중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 서열 번호:4-29, 236-299, 및 422-435중 임의의 하나의 아미노산 114-220에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는, 폴리펩티드.
- 청구항 1 내지 23중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 단서조항으로 동일성 백분율에 위치 157, 159, 160, 161, 162, 163, 186, 189, 및 194 세트를 포함하지 않는 조건하에, 서열 번호:1의 아미노산 114-220에 대하여 최소한 85% 동일성을 갖는, 폴리펩티드.
- 청구항 1 내지 25중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 서열 번호:4-29, 236-299, 및 422-435중 임의의 하나의 아미노산 157-163 및/또는 186-194를 포함하는, 폴리펩티드.
- 청구항 2 내지 6중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 다음에서 선택된 최소한 하나의 위치를 포함하는 폴리펩티드: 위치 153은 Trp, Leu, 또는 Glu이고; 위치 157은 Tyr 또는 Phe이고; 위치 159는 Thr이고; 위치 160은 Glu이고; 위치 161은 Trp이고; 위치 162는 Ser, Ala, Val, 또는 Asn이고; 위치 163은 Ser 또는 Asn이고; 위치 186은 Thr 또는 Ser이고; 위치 188은 Glu 또는 Ser이고; 위치 189는 Glu이고; 그리고 위치 194는 Phe이다.
- 청구항 27에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 다음에서 선택된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11개 위치를 포함하는 폴리펩티드: 위치 153은 Trp, Leu, 또는 Glu이고; 위치 157은 Tyr 또는 Phe이고; 위치 159는 Thr이고; 위치 160은 Glu이고; 위치 161은 Trp이고; 위치 162는 Ser, Ala, Val, 또는 Asn이고; 위치 163은 Ser 또는 Asn이고; 위치 186은 Thr 또는 Ser이고; 위치 188은 Glu 또는 Ser이고; 위치 189는 Glu이고; 그리고 위치 194는 Phe이다.
- 청구항 28에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 다음과 같이 11개 위치를 포함하는, 폴리펩티드: 위치 153은 Trp, Leu, 또는 Glu이고; 위치 157은 Tyr 또는 Phe이고; 위치 159는 Thr이고; 위치 160은 Glu이고; 위치 161은 Trp이고; 위치 162는 Ser, Ala, Val, 또는 Asn이고; 위치 163은 Ser 또는 Asn이고; 위치 186은 Thr 또는 Ser이고; 위치 188은 Glu 또는 Ser이고; 위치 189는 Glu이고; 그리고 위치 194는 Phe이다.
- 청구항 28 또는 29에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 서열 번호:4-29, 236-299, 및 422-435중 임의의 하나의 아미노산 114-220에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는, 폴리펩티드.
- 청구항 30에 있어서, 이때 서열 번호:4-29, 236-299, 및 422-435중 임의의 하나의 위치 153, 157, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 186, 187, 188, 189, 194, 197 및 199에 대응하는 위치에서 최소한 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16개의 위치에서 잔기가 결손되거나 또는 치환되지 않는, 폴리펩티드.
- 청구항 1 내지 31중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 (i) 위치 139에서 Trp 또는 (ii) 위치 139에서 Ser, 위치 141에서 Ala, 그리고 위치 180에서 Val를 더 포함하고, 이때 상기 아미노산 위치는 서열 번호:1을 참고로 하여 결정되는, 폴리펩티드.
- 청구항 1 내지 32중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 (i) 위치 201에서 Leu 및 위치 207에서 Ser, 또는 (ii) 위치 207에서 Ser 또는 Ala를 더 포함하고, 이때 상기 아미노산 위치는 서열 번호:1을 참고로 하여 결정되는, 폴리펩티드.
- 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 변형된 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 153, 157, 159, 160, 162, 163, 186, 188, 189, 194, 197, 및 199를 포함하는 아미노산 위치 세트에서 하나 또는 그 이상의 치환을 포함하며; 그리고 이때 상기 치환 및 상기 위치는 서열 번호:13을 참고로 하여 결정되는, 폴리펩티드.
- 청구항 34에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 위치 153에서 Glu, Leu, Ser, Val, Trp, 또는 Tyr; 위치 157에서 방향족 아미노산, Met, Pro, 또는 Val; 위치 159에서 Thr, Asn, 또는 Val; 위치 160에서 Glu, Ile, Pro, 또는 Val; 위치 162에서 지방족 아미노산, Ser, 또는 Thr; 위치 163에서 Ser, Asn, Arg, 또는 Thr; 위치 186에서 Thr, His, 또는 Ser; 위치 188에서 Glu, Ser, Asp, Gly, Thr, Pro, Gln, 또는 Arg; 위치 189에서 Glu 또는 Arg; 위치 194에서 Phe, His, Lys, Tyr, 또는 Trp; 위치 197에서 Ser, Thr, 또는 Trp; 그리고 위치 199에서 Ser, Cys, Pro, Met, 또는 Trp를 포함하는, 폴리펩티드.
- 청구항 35에 있어서, 이때 위치 157의 방향족 아미노산은 Tyr, Phe, 또는 Trp이고, 위치 162의 지방족 아미노산은 Ala, Ile, 또는 Val인, 폴리펩티드.
- 청구항 34 또는 35에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 위치 153에서 Glu, Leu, 또는 Trp; 위치 157에서 방향족 아미노산; 위치 159에서 Thr; 위치 160에서 Glu; 위치 162에서 지방족 아미노산 또는 Ser; 위치 163에서 Ser 또는 Asn; 위치 186에서 Thr 또는 Ser; 위치 188에서 Glu 또는 Ser; 위치 189에서 Glu; 위치 194에서 Phe, His, Tyr, 또는 Trp; 위치 197에서 Ser; 그리고 위치 199에서 Ser를 포함하는, 폴리펩티드.
- 청구항 37에 있어서, 이때 위치 157의 방향족 아미노산은 Tyr 또는 Phe이고, 위치 162의 지방족 아미노산은 Ala 또는 Val인, 폴리펩티드.
- 청구항 34 내지 38중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 서열 번호:556 또는 559의 서열을 갖는, 폴리펩티드.
- 청구항 34 내지 38중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 153, 157, 159, 160, 162, 163, 186, 188, 189, 194, 197, 및 199를 포함하는 아미노산 위치 세트에서 하나의 치환을 포함하는, 폴리펩티드.
- 청구항 40에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 서열 번호:563-574중 임의의 하나의 서열을 갖는, 폴리펩티드.
- 청구항 34 또는 35중 임의의 하나에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 위치 153에 Glu, Leu, 또는 Trp; 위치 157에 Tyr 또는 Phe; 위치 159에 Thr; 위치 160에 Glu; 위치 162에 Ala, Val, 또는 Ser; 위치 163에 Ser 또는 Asn; 위치 186에 Thr 또는 Ser; 위치 188에 Glu 또는 Ser; 위치 189에 Glu; 위치 194에 Phe; 위치 197에 Ser; 그리고 위치 199에 Ser를 포함하는, 폴리펩티드.
- 청구항 42에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 서열 번호:562의 서열을 갖는, 폴리펩티드.
- 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 변형된 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 153, 157, 159, 160, 162, 163, 164, 186, 189, 및 194를 포함하는 아미노산 위치 세트에서 하나 또는 그 이상의 치환을 포함하고; 그리고 이때 상기 치환 및 상기 위치는 서열 번호:9를 참고로 하여 결정되는, 폴리펩티드.
- 청구항 44에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 위치 153에서 Glu 또는 Trp; 위치 157에서 Val, Trp, Leu, 또는 Tyr; 위치 159에서 Leu, Pro, Phe, Thr, 또는 His; 위치 160에서 Pro, Val, 또는 Glu; 위치 162에서 Ala, Ser, Val, 또는 Gly; 위치 163에서 Leu, His, Gln, Gly, Val, Ala, Asn, Asp, Thr, 또는 Glu; 위치 164에서 Thr, Phe, Gln, Val, 또는 Tyr; 위치 186에서 Leu, Ser, Glu, Ala, 또는 Pro; 위치 189에서 Glu, Asp, Thr, 또는 Asn; 그리고 위치 194에서 Trp, Tyr, Phe, 또는 His를 포함하는, 폴리펩티드.
- 청구항 45에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 위치 153에서 Glu 또는 Trp; 위치 157에서 Trp, Leu, 또는 Tyr; 위치 159에서 Thr 또는 His; 위치 160에서 Val; 위치 162에서 Ala, Ser, 또는 Val; 위치 163에서 Val, Asn, 또는 Thr; 위치 164에서 Gln 또는 Tyr; 위치 186에서 Pro; 위치 189에서 Thr 또는 Asn; 그리고 위치 194에서 Trp, Tyr, Phe, 또는 His를 포함하는, 폴리펩티드.
- 청구항 44 내지 46중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 서열 번호:577 또는 580의 서열을 갖는, 폴리펩티드.
- 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 변형된 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 118, 119, 120, 122, 210, 211, 212, 및 213을 포함하는 아미노산 위치 세트에서 5, 6, 7, 또는 8개 치환을 포함하고; 그리고 이때 상기 치환 및 상기 위치는 서열 번호:1의 아미노산 114-220을 참고로 하여 결정되는, 폴리펩티드.
- 청구항 48에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 위치 210에서 Gly; 위치 211에서 Phe; 및/또는 위치 213에서 Asp를 포함하는, 폴리펩티드.
- 청구항 48에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 다음에서 선택된 최소한 하나의 위치를 포함하는 폴리펩티드: 위치 118은 Phe 또는 Ile이고; 위치 119는 Asp, Glu, Gly, Ala, 또는 Lys이고; 위치 120은 Tyr, Met, Leu, Ile, 또는 Asp이고; 위치 122는 Thr 또는 Ala이고; 위치 210은 Gly이고; 위치 211은 Phe이고; 위치 212는 His, Tyr, Ser, 또는 Phe이고; 그리고 위치 213은 Asp이다.
- 청구항 50에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 다음에서 선택된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 위치를 포함하는 폴리펩티드: 위치 118은 Phe 또는 Ile이고; 위치 119는 Asp, Glu, Gly, Ala, 또는 Lys이고; 위치 120은 Tyr, Met, Leu, Ile, 또는 Asp이고; 위치 122는 Thr 또는 Ala이고; 위치 210은 Gly이고; 위치 211은 Phe이고; 위치 212는 His, Tyr, Ser, 또는 Phe이고; 그리고 위치 213은 Asp이다.
- 청구항 48 내지 51중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 서열 번호:30-46중 임의의 하나의 아미노산 114-220에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는, 폴리펩티드.
- 청구항 48 내지 51중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 단서조항으로 동일성 백분율에 위치 118, 119, 120, 122, 210, 211, 212, 및 213을 포함하지 않는 조건하에, 서열 번호:1의 아미노산 114-220에 대하여 최소한 85% 동일성을 갖는, 폴리펩티드.
- 청구항 48 내지 53중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 서열 번호:30-46중 임의의 하나의 아미노산 118-122 및/또는 210-213을 포함하는, 폴리펩티드.
- 청구항 34 내지 54중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 (i) 위치 139에서 Trp 또는 (ii) 위치 139에서 Ser, 위치 141에서 Ala, 그리고 위치 180에서 Val를 더 포함하고, 이때 상기 아미노산 위치는 서열 번호:1을 참고로 하여 결정되는, 폴리펩티드.
- 청구항 34 내지 55중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인은 (i) 위치 201에서 Leu 및 위치 207에서 Ser, 또는 (ii) 위치 207에서 Ser 또는 Ala를 더 포함하고, 이때 상기 아미노산 위치는 서열 번호:1을 참고로 하여 결정되는, 폴리펩티드.
- 청구항 1 내지 56중 임의의 한 항에 있어서, 이때 대응하는 변형안된 CH3 도메인은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 CH3 도메인인, 폴리펩티드.
- 청구항 1 내지 57중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 폴리펩티드는 CH2 도메인에 연결된, 폴리펩티드.
- 청구항 58에 있어서, 이때 상기 CH2 도메인은 서열 번호:1의 아미노산 서열을 기준으로 다음의 변형 세트중 하나 또는 둘 모두를 보유하는, 폴리펩티드:
(a) 위치 7 및 위치 8에서 Ala; 그리고
(b) 위치 25에서 Tyr, 위치 27에서 Thr, 그리고 위치 29에서 Glu. - 청구항 59에 있어서, 이때 세트 (a)는 위치 102에 Gly를 더 포함하는, 폴리펩티드.
- 청구항 58 내지 60중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 CH2 도메인은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 CH2 도메인인, 폴리펩티드.
- 청구항 58 내지 61중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 폴리펩티드는 Fab에 더 연결된, 폴리펩티드.
- 청구항 58 내지 62중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 폴리펩티드는 이량체의 제1 폴리펩티드이며, 상기 이량체는 트란스페린 수용체 결합에 대하여 단가인, 폴리펩티드.
- 청구항 58 내지 62중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 폴리펩티드는 상기 트란스페린 수용체에 결합하고, 변형된 CH3 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드와 함께, 이량체를 형성하는 제1 폴리펩티드인, 폴리펩티드.
- 청구항 64에 있어서, 이때 상기 제2 폴리펩티드의 변형된 CH3 도메인은 상기 제1 폴리펩티드의 변형된 CH3 도메인과 동일한, 폴리펩티드.
- 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 변형된 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 있어서, 이때 상기 변형된 CH2 도메인은 47, 49, 56, 58, 59, 60, 61, 62, 및 63을 포함하는 아미노산 위치 세트에서 5, 6, 7, 8, 또는 9개 치환을 포함하고; 이때 상기 치환 및 상기 위치는 서열 번호:1의 아미노산 4-113을 참고하여 결정되는, 폴리펩티드.
- 청구항 66에 있어서, 이때 상기 변형된 CH2 도메인은 위치 60에 Glu 및/또는 위치 61에 Trp를 포함하는, 폴리펩티드.
- 청구항 66에 있어서, 이때 상기 변형된 CH2 도메인은 다음에서 선택된 최소한 하나의 위치를 포함하는, 폴리펩티드: 위치 47은 Glu, Gly, Gln, Ser, Ala, Asn, Tyr, 또는 Trp이고; 위치 49는 Ile, Val, Asp, Glu, Thr, Ala, 또는 Tyr이고; 위치 56은 Asp, Pro, Met, Leu, Ala, Asn, 또는 Phe이고; 위치 58은 Arg, Ser, Ala, 또는 Gly이고; 위치 59는 Tyr, Trp, Arg, 또는 Val이고; 위치 60은 Glu이고; 위치 61은 Trp 또는 Tyr이고; 위치 62는 Gln, Tyr, His, Ile, Phe, Val, 또는 Asp이고; 그리고 위치 63은 Leu, Trp, Arg, Asn, Tyr, 또는 Val이다.
- 청구항 68에 있어서, 이때 상기 변형된 CH2 도메인은 다음에서 선택된 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개 위치를 포함하는 폴리펩티드: 위치 47은 Glu, Gly, Gln, Ser, Ala, Asn, Tyr, 또는 Trp이고; 위치 49는 Ile, Val, Asp, Glu, Thr, Ala, 또는 Tyr이고; 위치 56은 Asp, Pro, Met, Leu, Ala, Asn, 또는 Phe이고; 위치 58은 Arg, Ser, Ala, 또는 Gly이고; 위치 59는 Tyr, Trp, Arg, 또는 Val이고; 위치 60은 Glu이고; 위치 61은 Trp 또는 Tyr이고; 위치 62는 Gln, Tyr, His, Ile, Phe, Val, 또는 Asp이고; 그리고 위치 63은 Leu, Trp, Arg, Asn, Tyr, 또는 Val이다.
- 청구항 68 또는 69에 있어서, 이때 상기 변형된 CH2 도메인은 위치 47에서 Glu, Gly, Gln, Ser, Ala, Asn, 또는 Tyr; 위치 49에서 Ile, Val, Asp, Glu, Thr, Ala, 또는 Tyr; 위치 56에서 Asp, Pro, Met, Leu, Ala, 또는 Asn; 위치 58에서 Arg, Ser, 또는 Ala; 위치 59에서 Tyr, Trp, Arg, 또는 Val; 위치 60에서 Glu; 위치 61에서 Trp; 위치 62에서 Gln, Tyr, His, Ile, Phe, 또는 Val; 및/또는 위치 63에서 Leu, Trp, Arg, Asn, 또는 Tyr을 포함하는, 폴리펩티드.
- 청구항 68 내지 70중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 변형된 CH2 도메인은 위치 58에서 Arg; 위치 59에서 Tyr 또는 Trp; 위치 60에서 Glu; 위치 61에서 Trp; 및/또는 위치 63에서 Arg 또는 Trp를 포함하는, 폴리펩티드.
- 청구항 66 내지 71중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 변형된 CH2 도메인은 서열 번호:47-62중 임의의 하나의 아미노산 4-113에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는, 폴리펩티드.
- 청구항 66 내지 71중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 변형된 CH2 도메인은 단서조항으로 동일성 백분율에 위치 47, 49, 56, 58, 59, 60, 61, 62, 및 63 세트를 포함하지 않는 조건하에, 서열 번호:1의 아미노산 4-113에 대하여 최소한 85% 동일성을 갖는, 폴리펩티드.
- 청구항 66 내지 73중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 변형된 CH2 도메인은 서열 번호:47-62중 임의의 하나의 아미노산 47-49 및/또는 56-63을 포함하는, 폴리펩티드.
- 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 변형된 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 있어서, 이때 상기 변형된 CH2 도메인은 39, 40, 41, 42, 43, 44, 68, 70, 71, 및 72을 포함하는 아미노산 위치 세트에서 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 치환을 포함하고; 이때 상기 치환 및 상기 위치는 서열 번호:1의 아미노산 4-113을 참고하여 결정되는, 폴리펩티드.
- 청구항 75에 있어서, 이때 상기 변형된 CH2 도메인은 위치 43에 Pro, 위치 68에 Glu, 및/또는 위치 70에 Tyr를 포함하는, 폴리펩티드.
- 청구항 75에 있어서, 이때 상기 변형된 CH2 도메인은 다음에서 선택된 최소한 하나의 위치를 포함하는, 폴리펩티드: 위치 39는 Pro, Phe, Ala, Met, 또는 Asp이고; 위치 40은 Gln, Pro, Arg, Lys, Ala, Ile, Leu, Glu, Asp, 또는 Tyr이고; 위치 41은 Thr, Ser, Gly, Met, Val, Phe, Trp, 또는 Leu이고; 위치 42는 Pro, Val, Ala, Thr, 또는 Asp이고; 위치 43은 Pro, Val, 또는 Phe이고; 위치 44는 Trp, Gln, Thr, 또는 Glu이고; 위치 68은 Glu, Val, Thr, Leu, 또는 Trp이고; 위치 70은 Tyr, His, Val, 또는 Asp이고; 위치 71은 Thr, His, Gln, Arg, Asn, 또는 Val이고; 그리고 위치 72는 Tyr, Asn, Asp, Ser, 또는 Pro이다.
- 청구항 77에 있어서, 이때 상기 변형된 CH2 도메인은 다음에서 선택된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 위치를 포함하는, 폴리펩티드: 위치 39는 Pro, Phe, Ala, Met, 또는 Asp이고; 위치 40은 Gln, Pro, Arg, Lys, Ala, Ile, Leu, Glu, Asp, 또는 Tyr이고; 위치 41은 Thr, Ser, Gly, Met, Val, Phe, Trp, 또는 Leu이고; 위치 42는 Pro, Val, Ala, Thr, 또는 Asp이고; 위치 43은 Pro, Val, 또는 Phe이고; 위치 44는 Trp, Gln, Thr, 또는 Glu이고; 위치 68은 Glu, Val, Thr, Leu, 또는 Trp이고; 위치 70은 Tyr, His, Val, 또는 Asp이고; 위치 71은 Thr, His, Gln, Arg, Asn, 또는 Val이고; 그리고 위치 72는 Tyr, Asn, Asp, Ser, 또는 Pro이다.
- 청구항 77 또는 78에 있어서, 이때 상기 변형된 CH2 도메인은 위치 39에 Pro, Phe, 또는 Ala; 위치 40에 Gln, Pro, Arg, Lys, Ala, 또는 Ile; 위치 41에 Thr, Ser, Gly, Met, Val, Phe, 또는 Trp; 위치 42에 Pro, Val, 또는 Ala; 위치 43에 Pro; 위치 44에 Trp 또는 Gln; 위치 68에 Glu; 위치 70에 Tyr; 위치 71에 Thr, His, 또는 Gln; 및/또는 위치 72에 Tyr, Asn, Asp, 또는 Ser를 포함하는, 폴리펩티드.
- 청구항 77 또는 78에 있어서, 이때 상기 변형된 CH2 도메인은 위치 39에 Met; 위치 40에 Leu 또는 Glu; 위치 41에 Trp; 위치 42에 Pro; 위치 43에 Val; 위치 44에 Thr; 위치 68에 Val 또는 Thr; 위치 70에 His; 위치 71에 His, Arg, 또는 Asn; 및/또는 위치 72에 Pro를 포함하는, 폴리펩티드.
- 청구항 77 또는 78에 있어서, 이때 상기 변형된 CH2 도메인은 위치 39에 Asp; 위치 40에 Asp; 위치 41에 Leu; 위치 42에 Thr; 위치 43에 Phe; 위치 44에 Gln; 위치 68에 Val 또는 Leu; 위치 70에 Val; 위치 71에 Thr; 및/또는 위치 72에 Pro를 포함하는, 폴리펩티드.
- 청구항 75 내지 81중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 변형된 CH2 도메인은 서열 번호:63-85중 임의의 하나의 아미노산 4-113에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는, 폴리펩티드.
- 청구항 75 내지 81중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 변형된 CH2 도메인은 단서조항으로 동일성 백분율에 위치 39, 40, 41, 42, 43, 44, 68, 70, 71, 및 72 세트를 포함하지 않는 조건하에, 서열 번호:1의 아미노산 4-113에 대하여 최소한 85% 동일성을 갖는, 폴리펩티드.
- 청구항 75 내지 83중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 변형된 CH2 도메인은 서열 번호:63-85중 임의의 하나의 아미노산 39-44 및/또는 68-72를 포함하는, 폴리펩티드.
- 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 변형된 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 있어서, 이때 상기 변형된 CH2 도메인은 41, 42, 43, 44, 45, 65, 66, 67, 69, 및 73을 포함하는 아미노산 위치 세트에서 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 치환을 포함하고; 이때 상기 치환 및 상기 위치는 서열 번호:1의 아미노산 4-113을 참고하여 결정되는, 폴리펩티드.
- 청구항 85에 있어서, 이때 상기 변형된 CH2 도메인은 다음에서 선택된 최소한 하나의 위치를 포함하는, 폴리펩티드: 위치 41은 Val 또는 Asp이고; 위치 42는 Pro, Met, 또는 Asp이고; 위치 43은 Pro 또는 Trp이고; 위치 44는 Arg, Trp, Glu, 또는 Thr이고; 위치 45는 Met, Tyr, 또는 Trp이고; 위치 65는 Leu 또는 Trp이고; 위치 66은 Thr, Val, Ile, 또는 Lys이고; 위치 67은 Ser, Lys, Ala, 또는 Leu이고; 위치 69는 His, Leu, 또는 Pro이고; 그리고 위치 73은 Val 또는 Trp이다.
- 청구항 86에 있어서, 이때 상기 변형된 CH2 도메인은 다음에서 선택된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 위치를 포함하는, 폴리펩티드: 위치 41은 Val 또는 Asp이고; 위치 42는 Pro, Met, 또는 Asp이고; 위치 43은 Pro 또는 Trp이고; 위치 44는 Arg, Trp, Glu, 또는 Thr이고; 위치 45는 Met, Tyr, 또는 Trp이고; 위치 65는 Leu 또는 Trp이고; 위치 66은 Thr, Val, Ile, 또는 Lys이고; 위치 67은 Ser, Lys, Ala, 또는 Leu이고; 위치 69는 His, Leu, 또는 Pro이고; 그리고 위치 73은 Val 또는 Trp이다.
- 청구항 86 또는 87에 있어서, 이때 상기 변형된 CH2 도메인은 위치 41에 Val; 위치 42에 Pro; 위치 43에 Pro; 위치 44에 Arg 또는 Trp; 위치 45에 Met; 위치 65에 Leu; 위치 66에 Thr; 위치 67에 Ser; 위치 69에 His; 및/또는 위치 73에 Val을 포함하는, 폴리펩티드.
- 청구항 86 또는 87에 있어서, 이때 상기 변형된 CH2 도메인은 위치 41에 Asp; 위치 42에 Met 또는 Asp; 위치 43에 Trp; 위치 44에 Glu 또는 Thr; 위치 45에 Tyr 또는 Trp; 위치 65에 Trp; 위치 66에 Val, Ile, 또는 Lys; 위치 67에 Lys, Ala, 또는 Leu; 위치 69에 Leu 또는 Pro; 및/또는 위치 73에 Trp을 포함하는, 폴리펩티드.
- 청구항 85 내지 89중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 변형된 CH2 도메인은 서열 번호:86-90중 임의의 하나의 아미노산 4-113에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는, 폴리펩티드.
- 청구항 85 내지 89중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 변형된 CH2 도메인은 단서조항으로 동일성 백분율에 위치 41, 42, 43, 44, 45, 65, 66, 67, 69, 및 73 세트를 포함하지 않는 조건하에, 서열 번호:1의 아미노산 4-113에 대하여 최소한 85% 동일성을 갖는, 폴리펩티드.
- 청구항 85 내지 91중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 변형된 CH2 도메인은 서열 번호:86-90중 임의의 하나의 아미노산 41-45 및/또는 65-73을 포함하는, 폴리펩티드.
- 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 변형된 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 있어서, 이때 상기 변형된 CH2 도메인은 45, 47, 49, 95, 97, 99, 102, 103, 및 104를 포함하는 아미노산 위치 세트에서 5, 6, 7, 8, 또는 9개 치환을 포함하고; 이때 상기 치환 및 상기 위치는 서열 번호:1의 아미노산 4-113을 참고하여 결정되는, 폴리펩티드.
- 청구항 93에 있어서, 이때 상기 변형된 CH2 도메인은 위치 103에서 Trp를 포함하는, 폴리펩티드.
- 청구항 93 또는 94에 있어서, 이때 상기 변형된 CH2 도메인은 다음에서 선택된 최소한 하나의 위치를 포함하는, 폴리펩티드: 위치 45는 Trp, Val, Ile, 또는 Ala이고; 위치 47은 Trp 또는 Gly이고; 위치 49는 Tyr, Arg, 또는 Glu이고; 위치 95는 Ser, Arg, 또는 Gln이고; 위치 97은 Val, Ser, 또는 Phe이고; 위치 99는 Ile, Ser, 또는 Trp이고; 위치 102는 Trp, Thr, Ser, Arg, 또는 Asp이고; 위치 103은 Trp이고; 그리고 위치 104는 Ser, Lys, Arg, 또는 Val이다.
- 청구항 95에 있어서, 이때 상기 변형된 CH2 도메인은 다음에서 선택된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개 위치를 포함하는, 폴리펩티드: 위치 45는 Trp, Val, Ile, 또는 Ala이고; 위치 47은 Trp 또는 Gly이고; 위치 49는 Tyr, Arg, 또는 Glu이고; 위치 95는 Ser, Arg, 또는 Gln이고; 위치 97은 Val, Ser, 또는 Phe이고; 위치 99는 Ile, Ser, 또는 Trp이고; 위치 102는 Trp, Thr, Ser, Arg, 또는 Asp이고; 위치 103은 Trp이고; 그리고 위치 104는 Ser, Lys, Arg, 또는 Val이다.
- 청구항 93 또는 94에 있어서, 이때 상기 변형된 CH2 도메인은 위치 45에 Val 또는 Ile; 위치 47에 Gly; 위치 49에 Arg; 위치95에 Arg; 위치 97에 Ser; 위치 99에 Ser; 위치 102에 Thr, Ser, 또는 Arg; 위치 103에 Trp; 및/또는 위치 104에 Lys 또는 Arg를 포함하는, 폴리펩티드.
- 청구항 93 내지 97중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 변형된 CH2 도메인은 서열 번호:91-95중 임의의 하나의 아미노산 4-113에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는, 폴리펩티드.
- 청구항 93 내지 97중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 변형된 CH2 도메인은 단서조항으로 동일성 백분율에 위치 45, 47, 49, 95, 97, 99, 102, 103, 및 104 세트를 포함하지 않는 조건하에, 서열 번호:1의 아미노산 4-113에 대하여 최소한 85% 동일성을 갖는, 폴리펩티드.
- 청구항 93 내지 99중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 변형된 CH2 도메인은 서열 번호:91-95중 임의의 하나의 아미노산 45-49 및/또는 95-104를 포함하는, 폴리펩티드.
- 청구항 66 내지 100중 임의의 한 항에 있어서, 이때 대응하는 변형안된 CH2 도메인은 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 CH2 도메인인, 폴리펩티드.
- 청구항 66 내지 101중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 변형된 CH2 도메인은 서열 번호:1의 아미노산 서열을 기준으로 다음의 변형 세트중 하나 또는 둘 모두를 보유하는, 폴리펩티드:
(a) 위치 7 및 위치 8에서 Ala; 그리고
(b) 위치 25에서 Tyr, 위치 27에서 Thr, 그리고 위치 29에서 Glu. - 청구항 102에 있어서, 이때 세트 (a)는 위치 102에 Gly를 더 포함하는, 폴리펩티드.
- 청구항 66 내지 103중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 폴리펩티드는 CH3 도메인에 연결된, 폴리펩티드.
- 청구항 104에 있어서, 이때 상기 CH3 도메인은 (i) 위치 139에서 Trp 또는 (ii) 위치 139에서 Ser, 위치 141에서 Ala, 그리고 위치 180에서 Val 를 포함하고, 이때 상기 아미노산 위치는 서열 번호:1을 참고로 하여 결정되는, 폴리펩티드.
- 청구항 104 또는 105에 있어서, 이때 상기 CH3 도메인은 (i) 위치 201에 Leu 및 위치 207에 Ser, 또는 (ii) 위치 207에 Ser 또는 Ala를 포함하고, 이때 상기 아미노산 위치는 서열 번호:1을 참고로 하여 결정되는, 폴리펩티드.
- 청구항 104 내지 106중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 폴리펩티드는 Fab에 더 연결된, 폴리펩티드.
- 청구항 104 내지 107중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 폴리펩티드는 이량체의 제1 폴리펩티드이며, 상기 이량체는 트란스페린 수용체 결합에 대하여 단가인, 폴리펩티드.
- 청구항 104 내지 107중 임의의 한 항에 있어서, 이때 상기 폴리펩티드는 상기 트란스페린 수용체에 결합하고, 변형된 CH2 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드와 함께, 이량체를 형성하는 제1 폴리펩티드인, 폴리펩티드.
- 청구항 109에 있어서, 이때 상기 제2 폴리펩티드의 변형된 CH2 도메인은 상기 제1 폴리펩티드의 변형된 CH2 도메인과 동일한, 폴리펩티드.
- 다음을 포함한, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드:
서열 번호:4-29, 236-299, 및 422-435중 임의의 하나의 아미노산 157-194
서열 번호:30-46중 임의의 하나의 아미노산 118-213,
서열 번호:47-62중 임의의 하나의 아미노산 47-63,
서열 번호:63-85중 임의의 하나의 아미노산 39-72,
서열 번호:86-90중 임의의 하나의 아미노산 41-73, 또는
서열 번호:91-95중 임의의 하나의 아미노산 45-104, 이때 상기 아미노산 위치는 서열 번호:1을 참고로 하여 결정된다. - 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드에 있어서, 서열 번호:349, 361, 373, 385, 397, 409, 436, 448, 460, 및 472중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 이때 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 상기 노브 돌연변이는 T139W인, 폴리펩티드.
- 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드에 있어서, 노브 돌연변이, 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 그리고 서열 번호:350, 362, 374, 386, 398, 410, 437, 449, 461, 및 473중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 이때 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 상기 노브 돌연변이는 T139W이고, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이는 L7A 및 L8A인, 폴리펩티드.
- 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드에 있어서, 노브 돌연변이, 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 그리고 서열 번호:351, 363, 375, 387, 399, 411, 438, 450, 462, 및 474중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 이때 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 상기 노브 돌연변이는 T139W이고, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이는 L7A, L8A, 및 P102G인, 폴리펩티드.
- 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드에 있어서, 노브 돌연변이, 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이, 그리고 서열 번호:352, 364, 376, 388, 400, 412, 439, 451, 463, 및 475중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 이때 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 상기 노브 돌연변이는 T139W이며, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이는 M25Y, S27T, 및 T29E인, 폴리펩티드.
- 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드에 있어서, 노브 돌연변이, 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이, 그리고 서열 번호:485, 492, 499, 506, 513, 520, 527, 534, 541, 및 548중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 이때 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 상기 노브 돌연변이는 T139W이며, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이는 M201L 및 N207S인, 폴리펩티드.
- 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드에 있어서, 노브 돌연변이, 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이, 그리고 서열 번호:353, 365, 377, 389, 401, 413, 440, 452, 464, 및 476중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 이때 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 상기 노브 돌연변이는 T139W이고, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이는 L7A 및 L8A이며, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이는 M25Y, S27T, 및 T29E인, 폴리펩티드.
- 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드에 있어서, 노브 돌연변이, 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이, 그리고 서열 번호:486, 493, 500, 507, 514, 521, 528, 535, 542, 및 549중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 이때 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 상기 노브 돌연변이는 T139W이고, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이는 L7A 및 L8A이며, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이는 M201L 및 N207S인, 폴리펩티드.
- 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드에 있어서, 노브 돌연변이, 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이, 그리고 서열 번호:354, 366, 378, 390, 402, 414, 441, 453, 465, 및 477중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 이때 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 상기 노브 돌연변이는 T139W이고, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이는 L7A, L8A, 및 P102G이며, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이는 M25Y, S27T, 및 T29E인, 폴리펩티드.
- 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드에 있어서, 노브 돌연변이, 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이, 그리고 서열 번호:487, 494, 501, 508, 515, 522, 529, 536, 543, 및 550중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 이때 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 상기 노브 돌연변이는 T139W이고, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이는 L7A, L8A, 및 P102G이며, 및 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이는 M201L 및 N207S인, 폴리펩티드.
- 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드에 있어서, 홀 돌연변이와 서열 번호:355, 367, 379, 391, 403, 415, 442, 454, 466, 및 478중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 이때 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 상기 홀 돌연변이는 T139S, L141A, 및 Y180V인, 폴리펩티드.
- 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드에 있어서, 홀 돌연변이, 작동체 기능을 조절하는 돌연변이와 서열 번호:356, 368, 380, 392, 404, 416, 443, 455, 467, 및 479중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 이때 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 상기 홀 돌연변이는 T139S, L141A, 및 Y180V이며, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이는 L7A 및 L8A인, 폴리펩티드.
- 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드에 있어서, 홀 돌연변이, 작동체 기능을 조절하는 돌연변이와 서열 번호:357, 369, 381, 393, 405, 417, 444, 456, 468, 및 480중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 이때 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 상기 홀 돌연변이는 T139S, L141A, 및 Y180V이며, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이는 L7A, L8A, 및 P102G 인, 폴리펩티드.
- 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드에 있어서, 홀 돌연변이, 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이, 그리고 서열 번호:358, 370, 382, 394, 406, 418, 445, 457, 469, 및 481중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 이때 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 상기 홀 돌연변이는 T139S, L141A, 및 Y180V이고, 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이는 M25Y, S27T, 및 T29E인, 폴리펩티드.
- 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드에 있어서, 홀 돌연변이, 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이, 그리고 서열 번호:3488, 495, 502, 509, 516, 523, 530, 537, 544, 및 551중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 이때 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 상기 홀 돌연변이는 T139S, L141A, 및 Y180V이고, 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이는 M201L 및 N207S인, 폴리펩티드.
- 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드에 있어서, 홀 돌연변이, 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이, 그리고 서열 번호:359, 371, 383, 395, 407, 419, 446, 458, 470, 및 482중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 이때 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 상기 홀 돌연변이는 T139S, L141A, 및 Y180V이고, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이는 L7A 및 L8A이고, 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이는 M25Y, S27T, 및 T29E인, 폴리펩티드.
- 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드에 있어서, 홀 돌연변이, 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이, 그리고 서열 번호:489, 496, 503, 510, 517, 524, 531, 538, 545, 및 552중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 이때 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 상기 홀 돌연변이는 T139S, L141A, 및 Y180V이고, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이는 L7A 및 L8A이고, 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이는 M201L 및 N207S인, 폴리펩티드.
- 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드에 있어서, 홀 돌연변이, 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이, 그리고 서열 번호:360, 372, 384, 396, 408, 420, 447, 459, 471, 및 483중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 이때 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 상기 홀 돌연변이는 T139S, L141A, 및 Y180V이고, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이는 L7A, L8A, 및 P102G이고, 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이는 M25Y, S27T, 및 T29E인, 폴리펩티드.
- 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드에 있어서, 홀 돌연변이, 작동체 기능을 조절하는 돌연변이, 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이, 그리고 서열 번호:490, 497, 504, 511, 518, 525, 532, 539, 546, 및 553중 임의의 하나의 서열에 대하여 최소한 85% 동일성, 최소한 90% 동일성, 또는 최소한 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 이때 서열 번호:1을 참고하여 번호매김될 때, 상기 홀 돌연변이는 T139S, L141A, 및 Y180V이고, 상기 작동체 기능을 조절하는 돌연변이는 L7A, L8A, 및 P102G이고, 상기 혈청 안정성을 증가시키는 돌연변이는 M201L 및 N207S인, 폴리펩티드.
- 서열 번호:116-233, 303-345, 및 581-608중 임의의 하나의 서열을 포함하고, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드.
- 서열 번호:116-130중 임의의 하나의 제1 서열과 서열 번호:131-139로 구성된 집단에서 독립적으로 선택된 제 2 서열을 포함하고, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드.
- 청구항 131에 있어서, 서열 번호:121, 116, 122, 123, 또는 126-130중 임의의 하나의 제1 서열과 서열 번호:136, 137, 및 139로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 제 2 서열을 포함하는 폴리펩티드.
- 청구항 131에 있어서, 서열 번호:120 또는 124-126중 임의의 하나의 제1 서열과 서열 번호:135, 138, 및 139로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 제 2 서열을 포함하는 폴리펩티드.
- 청구항 131에 있어서, 다음을 포함하는 폴리펩티드:
a)서열 번호:116 및 서열 번호:131,
b)서열 번호:116 및 서열 번호:136,
c)서열 번호:117 및 서열 번호:132,
d)서열 번호:118 및 서열 번호:133,
e)서열 번호:119 및 서열 번호:134,
f)서열 번호:120 및 서열 번호:135,
g)서열 번호:121 및 서열 번호:136,
h)서열 번호:122 및 서열 번호:137,
i)서열 번호:123 및 서열 번호:136,
j)서열 번호:124 및 서열 번호:138,
k)서열 번호:125 및 서열 번호:135,
l)서열 번호:126 및 서열 번호:139,
m)서열 번호:127 및 서열 번호:136,
n)서열 번호:128 및 서열 번호:136,
o)서열 번호:129 및 서열 번호:136, 또는
p)서열 번호:130 및 서열 번호:136. - 서열 번호:303-339중 임의의 하나의 제1 서열과 서열 번호:136, 138, 및 340-345로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 제 2 서열을 포함하고, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드.
- 청구항 135에 있어서, 다음을 포함하는 폴리펩티드:
a)서열 번호:303 및 서열 번호:340,
b)서열 번호:304 및 서열 번호:340,
c)서열 번호:305 및 서열 번호:340,
d)서열 번호:306 및 서열 번호:341,
e)서열 번호:307 및 서열 번호:340,
f)서열 번호:308 및 서열 번호:340,
g)서열 번호:309 및 서열 번호:340,
h)서열 번호:310 및 서열 번호:340,
i)서열 번호:311 및 서열 번호:340,
j)서열 번호:312 및 서열 번호:341,
k)서열 번호:313 및 서열 번호:340,
l)서열 번호:314 및 서열 번호:340,
m)서열 번호:315 및 서열 번호:340,
n)서열 번호:316 및 서열 번호:340,
o)서열 번호:317 및 서열 번호:340,
p)서열 번호:318 및 서열 번호:341,
q)서열 번호:319 및 서열 번호:340,
r)서열 번호:320 및 서열 번호:340,
s)서열 번호:321 및 서열 번호:340,
t)서열 번호:322 및 서열 번호:340,
u)서열 번호:323 및 서열 번호:340,
v)서열 번호:324 및 서열 번호:341,
w)서열 번호:325 및 서열 번호:340,
x)서열 번호:326 및 서열 번호:340,
y)서열 번호:327 및 서열 번호:340,
z)서열 번호:328 및 서열 번호:340,
aa)서열 번호:329 및 서열 번호:340,
ab)서열 번호:330 및 서열 번호:341,
ac)서열 번호:331 및 서열 번호:340,
ad)서열 번호:332 및 서열 번호:340,
ae)서열 번호:306 및 서열 번호:340,
af)서열 번호:312 및 서열 번호:340,
ag)서열 번호:324 및 서열 번호:138,
ah)서열 번호:318 및 서열 번호:340,
ai)서열 번호:324 및 서열 번호:340,
aj)서열 번호:330 및 서열 번호:340,
ak)서열 번호:318 및 서열 번호:138,
al)서열 번호:333 및 서열 번호:136,
am)서열 번호:334 및 서열 번호:136,
an)서열 번호:312 및 서열 번호:138,
ao)서열 번호:333 및 서열 번호:342,
ap)서열 번호:335 및 서열 번호:342,
aq)서열 번호:336 및 서열 번호:342,
ar)서열 번호:334 및 서열 번호:342,
as)서열 번호:330 및 서열 번호:138,
at)서열 번호:330 및 서열 번호:343,
au)서열 번호:330 및 서열 번호:345,
av)서열 번호:337 및 서열 번호:136,
aw)서열 번호:338 및 서열 번호:136,
ax)서열 번호:339 및 서열 번호:136,
ay)서열 번호:330 및 서열 번호:344,
az)서열 번호:312 및 서열 번호:343, 또는
ba)서열 번호:312 및 서열 번호:345. - 서열 번호:581, 583, 585, 587, 589, 591, 및 593중 임의의 하나의 제1서열, 그리고 서열 번호:582, 884, 586, 588, 590, 592, 및 594로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 제2 서열을 포함하고, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드.
- 청구항 137에 있어서, 다음을 포함하는 폴리펩티드:
a)서열 번호:581 및 서열 번호:582,
b)서열 번호:583 및 서열 번호:584,
c)서열 번호:585 및 서열 번호:586,
d)서열 번호:587 및 서열 번호:588,
e)서열 번호:589 및 서열 번호:590,
f)서열 번호:591 및 서열 번호:592, 또는
g)서열 번호:593 및 서열 번호:594. - 서열 번호:554, 557, 및 560중 임의의 하나의 제1서열, 그리고 서열 번호:555, 558, 및 561로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 제2 서열을 포함하고, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드.
- 청구항 139에 있어서, 다음을 포함하는 폴리펩티드:
a)서열 번호:554 및 서열 번호:555,
b)서열 번호:557 및 서열 번호:558, 또는
c)서열 번호:560 및 서열 번호:561. - 서열 번호:554, 557, 및 560 중 임의의 하나의 제1서열, 그리고 서열 번호:340-345, 582, 584, 586, 588, 590, 592, 및 594로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 제2 서열을 포함하고, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드.
- 서열 번호:303-339, 581, 583, 585, 587, 589, 591, 및 593중 임의의 하나의 제1서열, 그리고 서열 번호:555, 558, 및 561로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 제2 서열을 포함하고, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드.
- 서열 번호:609-614중 임의의 하나의 제1 서열과 서열 번호:615-620으로 구성된 집단에서 독립적으로 선택된 제 2 서열을 포함하고, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드.
- 서열 번호:303, 312, 315-318, 및 328중 임의의 하나의 제1서열, 그리고 서열 번호:135, 340, 및 341로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 제2 서열을 포함하고, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드.
- 청구항 144에 있어서, 다음을 포함하는 폴리펩티드:
a)서열 번호:303 및 서열 번호:340,
b)서열 번호:316 및 서열 번호:340,
c)서열 번호:317 및 서열 번호:340,
d)서열 번호:318 및 서열 번호:340,
e)서열 번호:328 및 서열 번호:341,
f)서열 번호:318 및 서열 번호:340,
g)서열 번호:312 및 서열 번호:340,
h)서열 번호:303 및 서열 번호:341,
i)서열 번호:316 및 서열 번호:135, 또는
j)서열 번호:315 및 서열 번호:341. - 서열 번호:595, 597, 599, 601, 603, 605, 및 607중 임의의 하나의 제1서열, 그리고 서열 번호:596, 598, 600, 602, 604, 606, 및 608로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 제2 서열을 포함하고, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드.
- 청구항 146에 있어서, 다음을 포함하는 폴리펩티드:
a)서열 번호:595 및 서열 번호:596,
b)서열 번호:597 및 서열 번호:598,
c)서열 번호:599 및 서열 번호:600,
d)서열 번호:601 및 서열 번호:602,
e)서열 번호:603 및 서열 번호:604,
f)서열 번호:605 및 서열 번호:606, 또는
g)서열 번호:607 및 서열 번호:608. - 서열 번호:575 및 578 중 임의의 하나의 제1서열, 그리고 서열 번호:576 및 579로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 제2 서열을 포함하고, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드.
- 청구항 148에 있어서, 다음을 포함하는 폴리펩티드:
a)서열 번호:575 및 서열 번호:576, 또는
b)서열 번호:578 및 서열 번호:579. - 서열 번호:575 및 578중 임의의 하나의 제1 서열과 서열 번호:136, 138, 및 340-345로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 제 2 서열을 포함하고, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드.
- 서열 번호:303-339 중 임의의 하나의 제1서열, 그리고 서열 번호:576 및 579로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 제2 서열을 포함하고, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드.
- 서열 번호:140-153중 임의의 하나의 제1 서열과 서열 번호:154-157로 구성된 집단에서 독립적으로 선택된 제 2 서열을 포함하고, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드.
- 청구항 152에 있어서, 다음을 포함하는 폴리펩티드:
a)서열 번호:140 및 서열 번호:154,
b)서열 번호:141 및 서열 번호:154,
c)서열 번호:142 및 서열 번호:154,
d)서열 번호:143 및 서열 번호:154,
e)서열 번호:144 및 서열 번호:154,
f)서열 번호:145 및 서열 번호:154,
g)서열 번호:146 및 서열 번호:154,
h)서열 번호:147 및 서열 번호:154,
i)서열 번호:148 및 서열 번호:155,
j)서열 번호:149 및 서열 번호:154,
k)서열 번호:140 및 서열 번호:156,
l)서열 번호:150 및 서열 번호:156,
m)서열 번호:151 및 서열 번호:157,
n)서열 번호:152 및 서열 번호:155, 또는
o)서열 번호:153 및 서열 번호:154. - 서열 번호:158-171중 임의의 하나의 제1 서열과 서열 번호:172-186으로 구성된 집단에서 독립적으로 선택된 제 2 서열을 포함하고, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드.
- 청구항 154에 있어서, 다음을 포함하는 폴리펩티드:
a)서열 번호:158 및 서열 번호:172,
b)서열 번호:158 및 서열 번호:179,
c)서열 번호:159 및 서열 번호:173,
d)서열 번호:159, 및 서열 번호:181,
e)서열 번호:160 및 서열 번호:174,
f)서열 번호:161 및 서열 번호:175,
g)서열 번호:162 및 서열 번호:176,
h)서열 번호:163 및 서열 번호:177,
i)서열 번호:164 및 서열 번호:178,
j)서열 번호:165 및 서열 번호:180,
k)서열 번호:166 및 서열 번호:182,
l)서열 번호:167 및 서열 번호:183,
m)서열 번호:168 및 서열 번호:184,
n)서열 번호:169 및 서열 번호:185,
o)서열 번호:170 및 서열 번호:174, 또는
p)서열 번호:171 및 서열 번호:186. - 서열 번호:187-204중 임의의 하나의 제1 서열과 서열 번호:205-215로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 제 2 서열을 포함하고, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드.
- 청구항 156에 있어서, 다음을 포함하는 폴리펩티드:
a)서열 번호:187 및 서열 번호:205,
b)서열 번호:187 및 서열 번호:206,
c)서열 번호:188 및 서열 번호:206,
d)서열 번호:189 및 서열 번호:207,
e)서열 번호:190 및 서열 번호:206,
f)서열 번호:191 및 서열 번호:205,
g)서열 번호:192 및 서열 번호:206,
h)서열 번호:193 및 서열 번호:208,
i)서열 번호:194 및 서열 번호:206,
j)서열 번호:195 및 서열 번호:209,
k)서열 번호:196 및 서열 번호:206,
l)서열 번호:197 및 서열 번호:205,
m)서열 번호:198 및 서열 번호:206,
n)서열 번호:199 및 서열 번호:208,
o)서열 번호:200 및 서열 번호:206,
p)서열 번호:201 및 서열 번호:210,
q)서열 번호:201 및 서열 번호:211,
r)서열 번호:201 및 서열 번호:212,
s)서열 번호:202 및 서열 번호:212,
t)서열 번호:203 및 서열 번호:213,
u)서열 번호:203 및 서열 번호:214, 또는
v)서열 번호:204 및 서열 번호:215. - 서열 번호:216-220 중 임의의 하나의 제1 서열과 서열 번호:221-224로 구성된 집단에서 독립적으로 선택된 제 2 서열을 포함하고, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드.
- 청구항 158에 있어서, 다음을 포함하는 폴리펩티드:
a)서열 번호:216 및 서열 번호:221,
b)서열 번호:217 및 서열 번호:221,
c)서열 번호:218 및 서열 번호:222,
d)서열 번호:219 및 서열 번호:223, 또는
e)서열 번호:220 및 서열 번호:224. - 서열 번호:225-228 중 임의의 하나의 제1 서열과 서열 번호:229-233으로 구성된 집단에서 독립적으로 선택된 제 2 서열을 포함하고, 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드.
- 청구항 160에 있어서, 다음을 포함하는 폴리펩티드:
a)서열 번호:225 및 서열 번호:229,
b)서열 번호:226 및 서열 번호:230,
c)서열 번호:226 및 서열 번호:231,
d)서열 번호:227 및 서열 번호:232, 또는
e)서열 번호:228 및 서열 번호:233. - 청구항 1 내지 161중 임의의 한 항에 따른 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
- 청구항 162의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 벡터.
- 청구항 162의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 숙주 세포.
- 변형된 CH3 도메인 또는 변형된 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 만드는 방법에 있어서, 이때 상기 방법은 청구항 162의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드된 폴리펩티드가 발현되는 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 방법.
- 청구항 1 내지 161항중 임의의 한 항에 따른 폴리펩티드 및 약학적으로 수용가능한 운반체를 포함하는 약학 조성물.
- 조성물이 내피를 통과하는 트랜스사이토시스(transcytosis)를 위한 방법에 있어서, 상기 방법은 청구항 1 내지 161중 임의의 한 항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 상기 내피에 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
- 청구항 167에 있어서, 이때 상기 내피는 혈액-뇌-장벽 (BBB)인, 방법.
- 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 CH3 도메인을 작제하는 방법에 있어서, 상기 방법은 다음을 포함하는, 방법:
(a) 다음을 포함하는 아미노산 위치 세트에서 최소한 5개 아미노산 치환을 갖도록 CH3 도메인을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 변형시키고:
(i) 157, 159, 160, 161, 162, 163, 186, 189, 및 194; 또는
(ii) 118, 119, 120, 122, 210, 211, 212, 및 213,
이때 상기 치환 및 위치는 서열 번호:1의 아미노산 114-220을 참고로 하여 결정된다;
(b) 상기 변형된 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 발현시키고; 그리고
(c) 상기 변형된 CH3 도메인이 트란스페린 수용체에 결합하는 지를 결정한다. - 청구항 169에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 발현시키는 단계, 그리고 상기 변형된 CH3 도메인이 트란스페린 수용체에 결합하는 지를 결정하는 단계는 디스플레이 시스템을 이용하여 실행되는, 방법.
- 청구항 170에 있어서, 이때 상기 디스플레이 시스템은 세포 표면 디스플레이 시스템, 바이러스 디스플레이 시스템, mRNA 디스플레이 시스템, 폴리좀 디스플레이 시스템, 또는 리보좀 디스플레이 시스템인, 방법.
- 청구항 169에 있어서, 이때 상기 변형된 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 가용성 단백질로 발현되는, 방법.
- 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 CH2 도메인을 작제하는 방법에 있어서, 상기 방법은 다음을 포함하는, 방법:
(a) 다음을 포함하는 아미노산 위치 세트에서 최소한 5개 아미노산 치환을 갖도록 CH2 도메인을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 변형시키고:
(i) 47, 49, 56, 58, 59, 60, 61, 62, 및 63;
(ii) 39, 40, 41, 42, 43, 44, 68, 70, 71, 및 72;
(iii) 41, 42, 43, 44, 45, 65, 66, 67, 69, 및 73; 또는
(iv) 45, 47, 49, 95, 97, 99, 102, 103, 및 104;
이때 상기 치환 및 위치는 서열 번호:1의 아미노산 4-113을 참고로 하여 결정된다;
(b) 상기 변형된 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 발현시키고; 그리고
(c) 상기 변형된 CH2 도메인이 트란스페린 수용체에 결합하는 지를 결정한다. - 청구항 173에 있어서, 이때 상기 변형된 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 발현시키는 단계, 그리고 상기 변형된 CH2 도메인이 트란스페린 수용체에 결합하는 지를 결정하는 단계는 디스플레이 시스템을 이용하여 실행되는, 방법.
- 청구항 174에 있어서, 이때 상기 디스플레이 시스템은 세포 표면 디스플레이 시스템, 바이러스 디스플레이 시스템, mRNA 디스플레이 시스템, 폴리좀 디스플레이 시스템, 또는 리보좀 디스플레이 시스템인, 방법.
- 청구항 173에 있어서, 이때 상기 변형된 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 가용성 단백질로 발현되는, 방법.
- 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 CH3 도메인을 작제하는 방법에 있어서, 상기 방법은 다음을 포함하는, 방법:
(a) 청구항 1 내지 23, 27 내지 29, 32 내지 33, 48 내지 51, 그리고 55 내지 56중 임의의 한 항에서 기술된 최소한 5개 아미노산 치환을 갖도록 CH3 도메인을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 변형시키고; 그리고
(b) 상기 변형된 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 발현시키고, 회수한다. - 트란스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 CH2 도메인을 작제하는 방법에 있어서, 상기 방법은 다음을 포함하는, 방법:
(a) 청구항 66 내지 71, 75 내지 81, 85 내지 89, 그리고 93 내지 97중 임의의 한 항에서 기술된 최소한 5개 아미노산 치환을 갖도록 CH2 도메인을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 변형시키고; 그리고
(b) 상기 변형된 CH2 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 발현시키고, 회수한다. - 비-고유의 결합 부위를 포함하는 변형된 Fc 폴리펩티드가 표적에 결합하는 것을 강화시키는 방법에 있어서, 다음을 포함하는 방법:
(a) 상기 비-고유의 결합 부위의 10 Å안에 하나 또는 그 이상의 위치에 하나 또는 그 이상의 치환을 도입시키고; 그리고
(b) 상기 표적에 결합하는지에 대하여 변형된 Fc 폴리펩티드를 테스트한다. - 청구항 179에 있어서, 이때 상기 비-고유의 결합 부위는 다음 위치들중 하나 또는 그 이상의 위치에서 치환을 포함하는, 방법: 157, 159, 160, 161, 162, 163, 186, 189, 및 194.
- 청구항 179 또는 180에 있어서, 이때 상기 비-고유의 결합 부위의 10 Å 이내 하나 또는 그 이상의 위치에 하나 또는 그 이상의 치환은 서열 번호:1을 참고하여 다음 K21, R28, Q115, R117, E118, Q120, T132, K133, N134, Q135, S137, K143, E153, E155, S156, G158, Y164, K165, T166, D172, S173, D174, S176, K182, L183, T184, V185, K187, S188, Q191, Q192, G193, V195, F196, S197, S199, Q211, S213, S215, L216, S217, P218, G219, 및 K220에서 선택되는, 방법.
- 청구항 179 내지 181중 임의의 하나에 있어서, 이때 상기 표적은 트란스페린 수용체인, 방법.
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