TWI797106B - 經工程改造之轉鐵蛋白受體結合多肽 - Google Patents
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Abstract
本文提供結合至轉鐵蛋白受體之多肽、產生此類多肽之方法及使用該等多肽以使組成物靶向轉鐵蛋白受體表現細胞之方法。
Description
已開發出將蛋白質工程改造成結合至其通常不結合之靶的各種技術。舉例而言，可以產生文庫以篩選工程改造成具有所需結合或酶活性的蛋白質。
轉鐵蛋白受體係轉鐵蛋白之載體蛋白，轉鐵蛋白係將鐵輸入細胞中及其他功能所需的且響應於細胞內鐵濃度進行調控。轉鐵蛋白受體在包括血腦屏障內皮在內之內皮上表現，且在各種癌症細胞及炎性細胞上之表現量較高。其係介導同源受體跨血腦屏障穿胞運輸的受體之一。因此，轉鐵蛋白受體可以作為將藥劑引入細胞中以內吞於細胞中或跨細胞穿胞運輸之理想靶。
已經開發出包括能夠結合轉鐵蛋白(TfR)受體之CH2及CH3結構域的多肽。該等多肽經工程改造成在CH2或CH3結構域中具有產生新穎TfR結合位點之取代。TfR在血腦屏障(BBB)上大量表現，且TfR天然地將轉鐵蛋白自血液移至腦中。由於該等多肽結合TfR，故其亦可跨BBB轉運且還可以用於跨BBB轉運所附接之治療劑(例如治療性多肽、抗體可變區諸如Fab，及小分子)。此方法可以大體上改良治療劑之腦吸收且因此特別適用於治療得益於腦遞送之病症及疾病。
在一個態樣中，提供包含特異性結合至轉鐵蛋白受體之經修飾CH3結構域的多肽，其中該經修飾CH3結構域在包含157、159、160、161、162、163、186、189及194之一組胺基酸位置處包含四個、五個、六個、七個、八個 或九個取代；且其中該等取代及該等位置係參照SEQ ID NO：1之胺基酸114-220確定。在一些實施例中，該經修飾CH3結構域進一步在包含153、164、165及188之位置處包含一個、兩個、三個或四個取代。在一些實施例中，該多肽結合至轉鐵蛋白受體之頂端結構域。在一些實施例中，該多肽結合至轉鐵蛋白受體，同時不抑制轉鐵蛋白與轉鐵蛋白受體之結合。在一些實施例中，該多肽結合至包含轉鐵蛋白受體序列之胺基酸208的抗原決定基。
在一些實施例中，經修飾CH3結構域包含在161位之Trp。在一些實施例中，經修飾CH3結構域包含在194位之芳族胺基酸。在一些實施例中，194位之芳族胺基酸係Trp或Phe。
在一些實施例中，該經修飾CH3結構域包含至少一個選自以下之位置：157位係Leu、Tyr、Met或Val；159位係Leu、Thr、His或Pro；160位係Val、Pro或酸性胺基酸；161位係Trp或Gly；162位係Val、Ser或Ala；186位係Glu、Ala、Ser、Leu、Thr或Pro；189位係Thr或酸性胺基酸；及194位係Trp、Tyr、His或Phe。在一些實施例中，經修飾CH3結構域包含選自以下之兩個、三個、四個、五個、六個、七個或八個位置：157位係Leu、Tyr、Met或Val；159位係Leu、Thr、His或Pro；160位係Val、Pro或酸性胺基酸；161位係Trp或Gly；162位係Val、Ser或Ala；186位係Glu、Ala、Ser、Leu、Thr或Pro；189位係Thr或酸性胺基酸；及194位係Trp、Tyr、His或Phe。在一些實施例中，經修飾CH3結構域包含在157位之Leu或Met；在159位之Leu、His或Pro；在160位之Val；在161位之Trp或Gly；在162位之Val或Ala；在186位之Pro；在189位之Thr；及/或在194位之Trp。
在一些實施例中，該經修飾CH3結構域包含至少一個選自以下之位置：157位係Leu、Tyr、Met或Val；159位係Leu、Thr、His或Pro；160位係Val、Pro或酸性胺基酸；161位係Trp；162位係Val、Ser或Ala；186位係Glu、 Ala、Ser、Leu、Thr或Pro(例如Thr或Pro)；189位係Thr或酸性胺基酸；及194位係Trp、Tyr、His或Phe。在一些實施例中，經修飾CH3結構域包含選自以下之兩個、三個、四個、五個、六個、七個或八個位置：157位係Leu、Tyr、Met或Val；159位係Leu、Thr、His或Pro；160位係Val、Pro或酸性胺基酸；161位係Trp；162位係Val、Ser或Ala；186位係Glu、Ala、Ser、Leu、Thr或Pro(例如Thr或Pro)；189位係Thr或酸性胺基酸；及194位係Trp、Tyr、His或Phe。在一些實施例中，經修飾CH3結構域包含在157位之Leu或Met；在159位之Leu、His或Pro；在160位之Val；在161位之Trp；在162位之Val或Ala；在186位之Pro；在189位之Thr；及/或在194位之Trp。
在一些實施例中，經修飾CH3結構域進一步包含在164位之Ser、Thr、Gln或Phe。在一些實施例中，經修飾CH3結構域進一步包含在153位之Trp、Tyr、Leu或Gln。在一些實施例中，經修飾CH3結構域進一步包含在165位之Gln、Phe或His。在一些實施例中，經修飾CH3結構域進一步包含在153位之Trp及/或在165位之Gln。在一些實施例中，經修飾CH3結構域進一步包含在188位之Glu。
在一些實施例中，經修飾CH3結構域包含在157位之Tyr；在159位之Thr；在160位之Glu或Val；在161位之Trp；在162位之Ser；在186位之Ser或Thr；在189位之Glu；及/或在194位之Phe。在一些實施例中，經修飾CH3結構域進一步包含在153位之Trp、Tyr、Leu或Gln。在一些實施例中，經修飾CH3結構域進一步包含在188位之Glu。在一些實施例中，經修飾CH3結構域進一步包含在153位之Trp及/或在188位之Glu。在一些實施例中，經修飾CH3結構域進一步包含在153位之Leu及/或在188位之Glu。在一些實施例中，經修飾CH3結構域包含在163位之Asn。
在一些實施例中，經修飾CH3結構域包含以下取代中之一或多個： 在153位之Trp；在159位之Thr；在161位之Trp；在162位之Val；在186位之Ser或Thr；在188位之Glu；及/或在194位之Phe。
在一些實施例中，該經修飾CH3結構域進一步包含選自以下之一個、兩個或三個位置：187位係Lys、Arg、Gly或Pro；197位係Ser、Thr、Glu或Lys；及199位係Ser、Trp或Gly。
在一些實施例中，該經修飾CH3結構域與SEQ ID NO：4-29、236-299及422-435中任一個之胺基酸114-220具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，該經修飾CH3結構域與SEQ ID NO：1之胺基酸114-220具有至少85%一致性，其限制條件為該一致性百分比不包括該組位置157、159、160、161、162、163、186、189及194。在一些實施例中，該經修飾CH3結構域包含SEQ ID NO：4-29、236-299及422-435中任一個之胺基酸157-163及/或186-194。
在一些實施例中，該經修飾CH3結構域包含至少一個選自以下之位置：153位係Trp、Leu或Glu；157位係Tyr或Phe；159位係Thr；160位係Glu；161位係Trp；162位係Ser、Ala、Val或Asn；163位係Ser或Asn；186位係Thr或Ser；188位係Glu或Ser；189位係Glu；及194位係Phe。在一些實施例中，該經修飾CH3結構域包含選自以下之2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個位置(例如11個位置)：153位係Trp、Leu或Glu(例如Trp或Leu)；157位係Tyr或Phe；159位係Thr；160位係Glu；161位係Trp；162位係Ser、Ala、Val或Asn；163位係Ser或Asn；186位係Thr或Ser；188位係Glu或Ser；189位係Glu；及194位係Phe。在一些實施例中，該經修飾CH3結構域與SEQ ID NO：236-299及422-435中之任一個具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。
在一些實施例中，該經修飾CH3結構域包含以下胺基酸：153位係 Trp、Leu或Glu(例如Trp或Leu)；157位係Tyr或Phe；159位係Thr；160位係Glu；161位係Trp；162位係Ser、Ala、Val或Asn；163位係Ser或Asn；186位係Thr或Ser；188位係Glu或Ser；189位係Glu；及194位係Phe。在另一實施例中，該經修飾CH3結構域與SEQ ID NO：236-299及422-435中之任一個具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。
在一些實施例中，該經修飾CH3結構域包含SEQ ID NO：236-299及422-435中任一個之胺基酸153-163及/或186-194。
在一些實施例中，本文提供一種包含特異性結合至轉鐵蛋白受體之經修飾CH3結構域的多肽，其中該經修飾CH3結構域與SEQ ID NO：4-29、236-299及422-435中任一個之胺基酸114-220具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在某些實施例中，在對應於參照SEQ ID NO：1確定的位置153、157、159、160、161、162、163、164、165、186、187、188、189、194、197及199的位置中之至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16個(例如11至16個)處的殘基在SEQ ID NO：4-29或236-299中未缺失或取代。
在以上實施例中之任一個中，該經修飾CH3結構域進一步包含(i)在139位之Trp(T139W)，或(ii)在139位之Ser(T139S)、在141位之Ala(L141A)及在180位之Val(Y180V)，其中該等胺基酸位置係參照SEQ ID NO：1確定。在以上實施例中之任一個中，該經修飾CH3結構域進一步包含(i)在201位之Leu(M201L)及在207位之Ser(N207S)，或(ii)在207位之Ser或Ala(N207S或N207A)，其中該等胺基酸位置係參照SEQ ID NO：1確定。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種包含特異性結合至轉鐵蛋白受體之經修飾CH3結構域的多肽，其中該經修飾CH3結構域在包含153、157、159、160、162、163、186、188、189、194、197及199之一組胺基酸位置處包含一或多個取代；且其中該等取代及該等位置係參照SEQ ID NO：13之序列確定。 在一些實施例中，該經修飾CH3結構域包含在153位之Glu、Leu、Ser、Val、Trp或Tyr；在157位之芳族胺基酸、Met、Pro或Val；在159位之Thr、Asn或Val；在160位之Glu、Ile、Pro或Val；在162位之脂族胺基酸、Ser或Thr；在163位之Ser、Asn、Arg或Thr；在186位之Thr、His或Ser；在188位之Glu、Ser、Asp、Gly、Thr、Pro、Gln或Arg；在189位之Glu或Arg；在194位之Phe、His、Lys、Tyr或Trp；在197位之Ser、Thr或Trp；及在199位之Ser、Cys、Pro、Met或Trp。在特定實施例中，該在157位之芳族胺基酸係Tyr、Phe或Trp且該在162位之脂族胺基酸係Ala、Ile或Val。
在一些實施例中，該經修飾CH3結構域包含在153位之Glu、Leu或Trp；在157位之芳族胺基酸；在159位之Thr；在160位之Glu；在162位之脂族胺基酸或Ser；在163位之Ser或Asn；在186位之Thr或Ser；在188位之Glu或Ser；在189位之Glu；在194位之Phe、His、Tyr或Trp；在197位之Ser；及在199位之Ser。在特定實施例中，該在157位之芳族胺基酸係Tyr或Phe且該在162位之脂族胺基酸係Ala或Val。
在一些實施例中，該經修飾CH3結構域具有SEQ ID NO：556或559之序列。
在一些實施例中，該經修飾CH3結構域在包含153、157、159、160、162、163、186、188、189、194、197及199之一組胺基酸位置處包含一個取代。在特定實施例中，該經修飾CH3結構域具有SEQ ID NO：563-574中任一個之序列。
在一些實施例中，該經修飾CH3結構域包含在153位之Glu、Leu或Trp；在157位之Tyr或Phe；在159位之Thr；在160位之Glu；在162位之Ala、Val或Ser；在163位之Ser或Asn；在186位之Thr或Ser；在188位之Glu或Ser；在189位之Glu；在194位之Phe；在197位之Ser；及在199位之 Ser。在特定實施例中，該經修飾CH3結構域具有SEQ ID NO：562之序列。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種包含特異性結合至轉鐵蛋白受體之經修飾CH3結構域的多肽，其中該經修飾CH3結構域在包含153、157、159、160、162、163、164、186、189及194之一組胺基酸位置處包含一或多個取代；且其中該等取代及該等位置係參照SEQ ID NO：9之序列確定。在一些實施例中，該經修飾CH3結構域包含在153位之Glu或Trp；在157位之Val、Trp、Leu或Tyr；在159位之Leu、Pro、Phe、Thr或His；在160位之Pro、Val或Glu；在162位之Ala、Ser、Val或Gly；在163位之Leu、His、Gln、Gly、Val、Ala、Asn、Asp、Thr或Glu；在164位之Thr、Phe、Gln、Val或Tyr；在186位之Leu、Ser、Glu、Ala或Pro；在189位之Glu、Asp、Thr或Asn；及在194位之Trp、Tyr、Phe或His。
在一些實施例中，該經修飾CH3結構域包含在153位之Glu或Trp；在157位之Trp、Leu或Tyr；在159位之Thr或His；在160位之Val；在162位之Ala、Ser或Val；在163位之Val、Asn或Thr；在164位之Gln或Tyr；在186位之Pro；在189位之Thr或Asn；及在194位之Trp、Tyr、Phe或His。在特定實施例中，該經修飾CH3結構域具有SEQ ID NO：577或580之序列。
在另一態樣中，提供一種包含特異性結合至轉鐵蛋白受體之經修飾CH3結構域的多肽，其中該經修飾CH3結構域在包含118、119、120、122、210、211、212及213之一組胺基酸位置處包含四個、五個、六個、七個或八個取代；且其中該等取代及該等位置係參照SEQ ID NO：1之胺基酸114-220確定。在一些實施例中，經修飾CH3結構域包含在210位之Gly；在211位之Phe；及/或在213位之Asp。在一些實施例中，該經修飾CH3結構域包含至少一個選自以下之位置：118位係Phe或Ile；119位係Asp、Glu、Gly、Ala或Lys；120位係Tyr、Met、Leu、Ile或Asp；122位係Thr或Ala；210位係Gly；211位係Phe；212 位係His、Tyr、Ser或Phe；及213位係Asp。在一些實施例中，經修飾CH3結構域包含選自以下之兩個、三個、四個、五個、六個、七個或八個位置：118位係Phe或Ile；119位係Asp、Glu、Gly、Ala或Lys；120位係Tyr、Met、Leu、Ile或Asp；122位係Thr或Ala；210位係Gly；211位係Phe；212位係His、Tyr、Ser或Phe；及213位係Asp。在一些實施例中，該經修飾CH3結構域與SEQ ID NO：30-46中任一個之胺基酸114-220具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，該經修飾CH3結構域與SEQ ID NO：1之胺基酸114-220具有至少85%一致性，其限制條件為該一致性百分比不包括該組位置118、119、120、122、210、211、212及213。在一些實施例中，該經修飾CH3結構域包含SEQ ID NO：30-46中任一個之胺基酸118-122及/或210-213。在一些實施例中，該經修飾CH3結構域進一步包含(i)在139位之Trp(T139W)，或(ii)在139位之Ser(T139S)、在141位之Ala(L141A)及在180位之Val(Y180V)，其中該等胺基酸位置係參照SEQ ID NO：1確定。在一些實施例中，該經修飾CH3結構域進一步包含(i)在201位之Leu(M201L)及在207位之Ser(N207S)，或(ii)在207位之Ser或Ala(N207S或N207A)，其中該等胺基酸位置係參照SEQ ID NO：1確定。
在一些實施例中，相應未修飾CH3結構域係人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH3結構域。在一些實施例中，該多肽接合至CH2結構域(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH2結構域)。在一些實施例中，該CH2結構域含有參照SEQ ID NO：1之胺基酸序列的以下各組修飾中之一個或兩個：(a)在7位及在8位之Ala(L7A及L8A)；及(b)在25位之Tyr(M25Y)、在27位之Thr(S27T)及在29位之Glu(T29E)。在一些實施例中，(a)組進一步包含在102位之Gly(P102G)。在一些實施例中，該多肽進一步經由鉸鏈區接合至Fab。在一些實施例中，Fab結合至τ蛋白(例如人類τ蛋白)或其片段。該τ蛋白可以為磷酸化τ蛋白、未磷 酸化之τ蛋白、τ蛋白之剪接同功型、N末端截短之τ蛋白、C末端截短之τ蛋白及/或其片段。在一些實施例中，Fab結合至β-分泌酶1(BACE1)蛋白(例如人類BACE1蛋白)或其片段。該BACE1蛋白可以為BACE1蛋白之剪接同功型或其片段。在一些實施例中，Fab結合至在骨髓細胞上表現之觸發性受體2(TREM2)蛋白(例如人類TREM2蛋白)或其片段。在一些實施例中，Fab結合至α-突觸核蛋白(例如人類α-突觸核蛋白)或其片段。該α-突觸核蛋白可以為單體α-突觸核蛋白、寡聚α-突觸核蛋白、α-突觸核蛋白原纖維、可溶性α-突觸核蛋白及/或其片段。在一些實施例中，該多肽係二聚體之第一多肽，由此使該二聚體關於轉鐵蛋白受體結合為單價的。在一些實施例中，該多肽係第一多肽，其與第二多肽形成二聚體，該第二多肽結合至轉鐵蛋白受體且包含經修飾CH3結構域。在一些實施例中，該第二多肽之經修飾CH3結構域與該第一多肽之經修飾CH3結構域相同。
在另一態樣中，提供包含特異性結合至轉鐵蛋白受體之經修飾CH2結構域的多肽，其中該經修飾CH2結構域在包含47、49、56、58、59、60、61、62及63之一組胺基酸位置處包含四個、五個、六個、七個、八個或九個取代；且其中該等取代及該等位置係參照SEQ ID NO：1之胺基酸4-113確定。在一些實施例中，該經修飾CH2結構域包含在60位之Glu及/或在61位之Trp。在一些實施例中，該經修飾CH2結構域包含至少一個選自以下之位置：47位係Glu、Gly、Gln、Ser、Ala、Asn、Tyr或Trp；49位係Ile、Val、Asp、Glu、Thr、Ala或Tyr；56位係Asp、Pro、Met、Leu、Ala、Asn或Phe；58位係Arg、Ser、Ala或Gly；59位係Tyr、Trp、Arg或Val；60位係Glu；6l位係Trp或Tyr；62位係Gln、Tyr、His、Ile、Phe、Val或Asp；及63位係Leu、Trp、Arg、Asn、Tyr或Val。在一些實施例中，該經修飾CH2結構域包含選自以下之至少兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個或九個位置：47位係Glu、Gly、Gln、Ser、 Ala、Asn、Tyr或Trp；49位係Ile、Val、Asp、Glu、Thr、Ala或Tyr；56位係Asp、Pro、Met、Leu、Ala、Asn或Phe；58位係Arg、Ser、Ala或Gly；59位係Tyr、Trp、Arg或Val；60位係Glu；61位係Trp或Tyr；62位係Gln、Tyr、His、Ile、Phe、Val或Asp；及63位係Leu、Trp、Arg、Asn、Tyr或Val。在一些實施例中，該經修飾CH2結構域包含在47位之Glu、Gly、Gln、Ser、Ala、Asn或Tyr；在49位之Ile、Val、Asp、Glu、Thr、Ala或Tyr；在56位之Asp、Pro、Met、Leu、Ala或Asn；在58位之Arg、Ser或Ala；在59位之Tyr、Trp、Arg或Val；在60位之Glu；在61位之Trp；在62位之Gln、Tyr、His、Ile、Phe或Val；及/或在63位之Leu、Trp、Arg、Asn或Tyr。
在一些實施例中，該經修飾CH2結構域包含在58位之Arg；在59位之Tyr或Trp；在60位之Glu；在61位之Trp；及/或在63位之Arg或Trp。在一些實施例中，該經修飾CH2結構域與SEQ ID NO：47-62中任一個之胺基酸4-113具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，該經修飾CH2結構域與SEQ ID NO：1之胺基酸4-113具有至少85%一致性，其限制條件為該一致性百分比不包括該組位置47、49、56、58、59、60、61、62及63。在一些實施例中，該經修飾CH2結構域包含SEQ ID NO：47-62中任一個之胺基酸47-49及/或56-63。
在另一態樣中，提供包含特異性結合至轉鐵蛋白受體之經修飾CH2結構域的多肽，其中該經修飾CH2結構域在包含39、40、41、42、43、44、68、70、71及72之一組胺基酸位置處包含四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個取代；且其中該等取代及該等位置係參照SEQ ID NO：1之胺基酸4-113確定。在一些實施例中，該經修飾CH2結構域包含在43位之Pro、在68位之Glu及/或在70位之Tyr。在一些實施例中，該經修飾CH2結構域包含至少一個選自以下之位置：39位係Pro、Phe、Ala、Met或Asp；40位係Gln、Pro、Arg、Lys、 Ala、Ile、Leu、Glu、Asp或Tyr；4l位係Thr、Ser、Gly、Met、Val、Phe、Trp或Leu；42位係Pro、Val、Ala、Thr或Asp；43位係Pro、Val或Phe；44位係Trp、Gln、Thr或Glu；68位係Glu、Val、Thr、Leu或Trp；70位係Tyr、His、Val或Asp；71位係Thr、His、Gln、Arg、Asn或Val；及72位係Tyr、Asn、Asp、Ser或Pro。在一些實施例中，經修飾CH2結構域包含選自以下之兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個位置：39位係Pro、Phe、Ala、Met或Asp；40位係Gln、Pro、Arg、Lys、Ala、Ile、Leu、Glu、Asp或Tyr；41位係Thr、Ser、Gly、Met、Val、Phe、Trp或Leu；42位係Pro、Val、Ala、Thr或Asp；43位係Pro、Val或Phe；44位係Trp、Gln、Thr或Glu；68位係Glu、Val、Thr、Leu或Trp；70位係Tyr、His、Val或Asp；71位係Thr、His、Gln、Arg、Asn或Val；及72位係Tyr、Asn、Asp、Ser或Pro。
在一些實施例中，該經修飾CH2結構域包含在39位之Pro、Phe或Ala；在40位之Gln、Pro、Arg、Lys、Ala或Ile；在41位之Thr、Ser、Gly、Met、Val、Phe或Trp；在42位之Pro、Val或Ala；在43位之Pro；在44位之Trp或Gln；在68位之Glu；在70位之Tyr；在71位之Thr、His或Gln；及/或在72位之Tyr、Asn、Asp或Ser。在一些實施例中，該經修飾CH2結構域包含在39位之Met；在40位之Leu或Glu；在41位之Trp；在42位之Pro；在43位之Val；在44位之Thr；在68位之Val或Thr；在70位之His；在71位之His、Arg或Asn；及/或在72位之Pro。在一些實施例中，該經修飾CH2結構域包含在39位之Asp；在40位之Asp；在41位之Leu；在42位之Thr；在43位之Phe；在44位之Gln；在68位之Val或Leu；在70位之Val；在71位之Thr；及/或在72位之Pro。
在一些實施例中，該經修飾CH2結構域與SEQ ID NO：63-85中任一個之胺基酸4-113具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。 在一些實施例中，該經修飾CH2結構域與SEQ ID NO：1之胺基酸4-113具有至少85%一致性，其限制條件為該一致性百分比不包括該組位置39、40、41、42、43、44、68、70、71及72。在一些實施例中，該經修飾CH2結構域包含SEQ ID NO：63-85中任一個之胺基酸39-44及/或68-72。
在另一態樣中，提供包含特異性結合至轉鐵蛋白受體之經修飾CH2結構域的多肽，其中該經修飾CH2結構域在包含41、42、43、44、45、65、66、67、69及73之一組胺基酸位置處包含四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個取代；且其中該等取代及該等位置係參照SEQ ID NO：1之胺基酸4-113確定。在一些實施例中，該經修飾CH2結構域包含至少一個選自以下之位置：41位係Val或Asp；42位係Pro、Met或Asp；43位係Pro或Trp；44位係Arg、Trp、Glu或Thr；45位係Met、Tyr或Trp；65位係Leu或Trp；66位係Thr、Val、Ile或Lys；67位係Ser、Lys、Ala或Leu；69位係His、Leu或Pro；及73位係Val或Trp。在一些實施例中，經修飾CH2結構域包含選自以下之兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個位置：41位係Val或Asp；42位係Pro、Met或Asp；43位係Pro或Trp；44位係Arg、Trp、Glu或Thr；45位係Met、Tyr或Trp；65位係Leu或Trp；66位係Thr、Val、Ile或Lys；67位係Ser、Lys、Ala或Leu；69位係His、Leu或Pro；及73位係Val或Trp。
在一些實施例中，經修飾CH2結構域包含在41位之Val；在42位之Pro；在43位之Pro；在44位之Arg或Trp；在45位之Met；在65位之Leu；在66位之Thr；在67位之Ser；在69位之His；及/或在73位之Val。在一些實施例中，經修飾CH2結構域包含在41位之Asp；在42位之Met或Asp；在43位之Trp；在44位之Glu或Thr；在45位之Tyr或Trp；在65位之Trp；在66位之Val、Ile或Lys；在67位之Lys、Ala或Leu；在69位之Leu或Pro；及/或在73位之Trp。
在一些實施例中，該經修飾CH2結構域與SEQ ID NO：86-90中任一個之胺基酸4-113具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，該經修飾CH2結構域與SEQ ID NO：1之胺基酸4-113具有至少85%一致性，其限制條件為該一致性百分比不包括該組位置41、42、43、44、45、65、66、67、69及73。在一些實施例中，該經修飾CH2結構域包含SEQ ID NO：86-90中任一個之胺基酸41-45及/或65-73。
在另一態樣中，提供包含特異性結合至轉鐵蛋白受體之經修飾CH2結構域的多肽，其中該經修飾CH2結構域在包含45、47、49、95、97、99、102、103及104之一組胺基酸位置處包含四個、五個、六個、七個、八個或九個取代；且其中該等取代及該等位置係參照SEQ ID NO：1之胺基酸4-113確定。在一些實施例中，經修飾CH2結構域包含在103位之Trp。在一些實施例中，該經修飾CH2結構域包含至少一個選自以下之位置：45位係Trp、Val、Ile或Ala；47位係Trp或Gly；49位係Tyr、Arg或Glu；95位係Ser、Arg或Gln；97位係Val、Ser或Phe；99位係Ile、Ser或Trp；102位係Trp、Thr、Ser、Arg或Asp；103位係Trp；及104位係Ser、Lys、Arg或Val。在一些實施例中，經修飾CH2結構域包含選自以下之兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個或九個位置：45位係Trp、Val、Ile或Ala；47位係Trp或Gly；49位係Tyr、Arg或Glu；95位係Ser、Arg或Gln；97位係Val、Ser或Phe；99位係Ile、Ser或Trp；102位係Trp、Thr、Ser、Arg或Asp；103位係Trp；及104位係Ser、Lys、Arg或Val。
在一些實施例中，經修飾CH2結構域包含在45位之Val或Ile；在47位之Gly；在49位之Arg；在95位之Arg；在97位之Ser；在99位之Ser；在102位之Thr、Ser或Arg；在103位之Trp；及/或在104位之Lys或Arg。
在一些實施例中，該經修飾CH2結構域與SEQ ID NO：91-95中任一個之胺基酸4-113具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。 在一些實施例中，該經修飾CH2結構域與SEQ ID NO：1之胺基酸4-113具有至少85%一致性，其限制條件為該一致性百分比不包括該組位置45、47、49、95、97、99、102、103及104。在一些實施例中，該經修飾CH2結構域包含SEQ ID NO：91-95中任一個之胺基酸45-49及/或95-104。
在一些實施例中，相應未修飾CH2結構域係人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH2結構域。在一些實施例中，該經修飾CH2結構域含有參照SEQ ID NO：1之胺基酸序列的以下各組修飾中之一個或兩個：(a)在7位及在8位之Ala(L7A及L8A)；及(b)在25位之Tyr(M25Y)、在27位之Thr(S27T)及在29位之Glu(T29E)。在一些實施例中，(a)組進一步包含在102位之Gly(P102G)。在一些實施例中，該多肽接合至CH3結構域。在一些實施例中，該CH3結構域包含(i)在139位之Trp(T139W)，或(ii)在139位之Ser(T139S)、在141位之Ala(L141A)及在180位之Val(Y180V)，其中該等胺基酸位置係參照SEQ ID NO：1之胺基酸序列確定。在一些實施例中，該CH3結構域包含(i)在201位之Leu(M201L)及在207位之Ser(N207S)，或(ii)在207位之Ser或Ala(N207S或N207A)，其中該等胺基酸位置係參照SEQ ID NO：1確定。在一些實施例中，該多肽進一步接合至Fab。在一些實施例中，Fab結合至τ蛋白(例如人類τ蛋白)或其片段。該τ蛋白可以為磷酸化τ蛋白、未磷酸化之τ蛋白、τ蛋白之剪接同功型、N末端截短之τ蛋白、C末端截短之τ蛋白及/或其片段。在一些實施例中，Fab結合至β-分泌酶1(BACE1)蛋白(例如人類BACE1蛋白)或其片段。該BACE1蛋白可以為BACE1蛋白之剪接同功型或其片段。在一些實施例中，Fab結合至在骨髓細胞上表現之觸發性受體2(TREM2)蛋白(例如人類TREM2蛋白)或其片段。在一些實施例中，Fab結合至α-突觸核蛋白(例如人類α-突觸核蛋白)或其片段。該α-突觸核蛋白可以為單體α-突觸核蛋白、寡聚α-突觸核蛋白、α-突觸核蛋白原纖維、可溶性α-突觸核蛋白及/或其片段。
在一些實施例中，該多肽包含經修飾CH2結構域或經修飾CH3結構域，其與本文所述多肽中之任一個，例如SEQ ID NO：4-95、236-299、302及347-553中之任一個競爭結合至轉鐵蛋白受體。在一些實施例中，該多肽包含經修飾CH2結構域或經修飾CH3結構域，其與本文所述多肽中之任一個，例如SEQ ID NO：4-95、236-299、302及347-553中之任一個結合至轉鐵蛋白受體上之相同抗原決定基。
在一些實施例中，該多肽係二聚體之第一多肽，由此使該二聚體關於轉鐵蛋白受體結合為單價的。在一些實施例中，該多肽係第一多肽，其與第二多肽形成二聚體，該第二多肽結合至轉鐵蛋白受體且包含經修飾CH2結構域。在一些實施例中，該第二多肽之經修飾CH2結構域與該第一多肽之經修飾CH2相同。
在另一態樣中，提供特異性結合至轉鐵蛋白受體之多肽，其包含SEQ ID NO：4-29、236-299及422-435中任一個之胺基酸157-194，或在一些實施例中胺基酸153-194或胺基酸153-199；SEQ ID NO：30-46中任一個之胺基酸118-213；SEQ ID NO：47-62中任一個之胺基酸47-63；SEQ ID NO：63-85中任一個之胺基酸39-72；SEQ ID NO：86-90中任一個之胺基酸41-73；或SEQ ID NO：91-95中任一個之胺基酸45-104。
在另一態樣中，本文提供一種多肽，其包含節突變且與SEQ ID NO：4-95、236-299及422-435中任一個之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性，其中如參照SEQ ID NO：1所編號，該節突變係T139W。
在一些實施例中，該多肽包含節突變及與SEQ ID NO：349、361、373、385、397、409、436、448、460及472中任一個之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性的序列，其中如參照SEQ ID NO：1所編號， 該節突變係T139W。在特定實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：349、361、373、385、397、409、436、448、460及472中任一個之序列。
在另一態樣中，本文提供一種多肽，其包含節突變、調節效應子功能之突變且與SEQ ID NO：4-95、236-299及422-435中任一個之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性，其中如參照SEQ ID NO：1所編號，該節突變係T139W且該等調節效應子功能之突變係L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A)。
在一些實施例中，該多肽包含節突變、調節效應子功能之突變及與SEQ ID NO：350、362、374、386、398、410、437、449、461及473中任一個之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性的序列，其中如參照SEQ ID NO：1所編號，該節突變係T139W且該等調節效應子功能之突變係L7A及L8A。在特定實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：350、362、374、386、398、410、437、449、461及473中任一個之序列。
在一些實施例中，該多肽包含節突變、調節效應子功能之突變及與SEQ ID NO：351、363、375、387、399、411、438、450、462及474中任一個之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性的序列，其中如參照SEQ ID NO：1所編號，該節突變係T139W且該等調節效應子功能之突變係L7A、L8A及P102G。在特定實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：351、363、375、387、399、411、438、450、462及474中任一個之序列。
在另一態樣中，本文提供一種多肽，其具有節突變、增加血清穩定性之突變且與SEQ ID NO：4-95、236-299及422-435中任一個之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性，其中如參照SEQ ID NO：1所編號，該節突變係T139W且該等增加血清穩定性之突變係(i)如參照SEQ ID NO：1所編號的M25Y、S27T及T29E，或(ii)如參照SEQ ID NO：1所編號的N207S且 存在或不存在M201L。
在一些實施例中，該多肽包含節突變、增加血清穩定性之突變及與SEQ ID NO：352、364、376、388、400、412、439、451、463及475中任一個之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性的序列，其中如參照SEQ ID NO：1所編號，該節突變係T139W且該等增加血清穩定性之突變係M25Y、S27T及T29E。在特定實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：352、364、376、388、400及412中任一個之序列。
在一些實施例中，該多肽包含節突變、增加血清穩定性之突變及與SEQ ID NO：485、492、499、506、513、520、527、534、541及548中任一個之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性的序列，其中如參照SEQ ID NO：1所編號，該節突變係T139W且該等增加血清穩定性之突變係如參照SEQ ID NO：1所編號的N207S且存在或不存在M201L。在特定實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：485、492、499、506、513、520、527、534、541及548中任一個之序列。
在另一態樣中，本文提供一種多肽，其具有節突變、調節效應子功能之突變、增加血清穩定性之突變且與SEQ ID NO：4-95、236-299及422-435中任一個之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性，其中如參照SEQ ID NO：1所編號，該節突變係T139W，該等調節效應子功能之突變係L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A)，且該等增加血清穩定性之突變係(i)如參照SEQ ID NO：1所編號的M25Y、S27T及T29E，或(ii)如參照SEQ ID NO：1所編號的N207S且存在或不存在M201L。
在一些實施例中，該多肽包含節突變、調節效應子功能之突變、增加血清穩定性之突變及與SEQ ID NO：353、365、377、389、401、413、440、452、464及476中任一個之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95% 一致性的序列，其中如參照SEQ ID NO：1所編號，該節突變係T139W，該等調節效應子功能之突變係L7A及L8A且該等增加血清穩定性之突變係M25Y、S27T及T29E。在特定實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：353、365、377、389、401、413、440、452、464及476中任一個之序列。
在一些實施例中，該多肽包含節突變、調節效應子功能之突變、增加血清穩定性之突變及與SEQ ID NO：486、493、500、507、514、521、528、535、542及549中任一個之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性的序列，其中如參照SEQ ID NO：1所編號，該節突變係T139W，該等調節效應子功能之突變係L7A及L8A且該等增加血清穩定性之突變係如參照SEQ ID NO：1所編號的N207S且存在或不存在M201L。在特定實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：486、493、500、507、514、521、528、535、542及549中任一個之序列。
在一些實施例中，該多肽包含節突變、調節效應子功能之突變、增加血清穩定性之突變及與SEQ ID NO：354、366、378、390、402、414、441、453、465及477中任一個之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性的序列，其中如參照SEQ ID NO：1所編號，該節突變係T139W，該等調節效應子功能之突變係L7A、L8A及P102G且該等增加血清穩定性之突變係M25Y、S27T及T29E。在特定實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：354、366、378、390、402、414、441、453、465及477中任一個之序列。
在一些實施例中，該多肽包含節突變、調節效應子功能之突變、增加血清穩定性之突變及與SEQ ID NO：487、494、501、508、515、522、529、536、543及550中任一個之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性的序列，其中如參照SEQ ID NO：1所編號，該節突變係T139W，該等調節效應子功能之突變係L7A、L8A及P102G且該等增加血清穩定性之突變係如 參照SEQ ID NO：1所編號的N207S且存在或不存在M201L。在特定實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：487、494、501、508、515、522、529、536、543及550中任一個之序列。
在另一態樣中，本文提供一種多肽，其包含孔突變且與SEQ ID NO：4-95、236-299及422-435中任一個之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性，其中如參照SEQ ID NO：1所編號，該等孔突變係T139S、L141A及Y180V。
在一些實施例中，該多肽包含孔突變及與SEQ ID NO：355、367、379、391、403、415、442、454、466及478中任一個之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性的序列，其中如參照SEQ ID NO：1所編號，該等孔突變係T139S、L141A及Y180V。在特定實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：355、367、379、391、403、415、442、454、466及478中任一個之序列。
在另一態樣中，本文提供一種多肽，其包含孔突變、調節效應子功能之突變且與SEQ ID NO：4-95、236-299及422-435中任一個之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性，其中如參照SEQ ID NO：1所編號，該等孔突變係T139S、L141A及Y180V且該等調節效應子功能之突變係L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A)。
在一些實施例中，該多肽包含孔突變、調節效應子功能之突變及與SEQ ID NO：356、368、380、392、404、416、443、455、467及479中任一個之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性的序列，其中如參照SEQ ID NO：1所編號，該等孔突變係T139S、L141A及Y180V且該等調節效應子功能之突變係L7A及L8A。在特定實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：356、368、380、392、404、416、443、455、467及479中任一個之序列。
在一些實施例中，該多肽包含孔突變、調節效應子功能之突變及與 SEQ ID NO：357、369、381、393、405、417、444、456、468及480中任一個之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性的序列，其中如參照SEQ ID NO：1所編號，該等孔突變係T139S、L141A及Y180V且該等調節效應子功能之突變係L7A、L8A及P102G。在特定實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：357、369、381、393、405、417、444、456、468及480中任一個之序列。
在另一態樣中，本文提供一種多肽，其具有孔突變、增加血清穩定性之突變且與SEQ ID NO：4-95、236-299及422-435中任一個之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性，其中如參照SEQ ID NO：1所編號，該等孔突變係T139S、L141A及Y180V且該等增加血清穩定性之突變係(i)如參照SEQ ID NO：1所編號的M25Y、S27T及T29E，或(ii)如參照SEQ ID NO：1所編號的N207S且存在或不存在M201L。
在一些實施例中，該多肽包含孔突變、增加血清穩定性之突變及與SEQ ID NO：358、370、382、394、406、418、445、457、469及481中任一個之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性的序列，其中如參照SEQ ID NO：1所編號，該等孔突變係T139S、L141A及Y180V且該等增加血清穩定性之突變係M25Y、S27T及T29E。在特定實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：358、370、382、394、406、418、445、457、469及481中任一個之序列。
在一些實施例中，該多肽包含孔突變、增加血清穩定性之突變及與SEQ ID NO：488、495、502、509、516、523、530、537、544及551中任一個之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性的序列，其中如參照SEQ ID NO：1所編號，該等孔突變係T139S、L141A及Y180V且該等增加血清穩定性之突變係如參照SEQ ID NO：1所編號的N207S且存在或不存在M201L。在特定實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：488、495、502、509、516、523、530、537、544及551中任一個之序列。
在另一態樣中，本文提供一種多肽，其具有孔突變、調節效應子功能之突變、增加血清穩定性之突變且與SEQ ID NO：4-95、236-299及422-435中任一個之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性，其中如參照SEQ ID NO：1所編號，該等孔突變係T139S、L141A及Y180V，該等調節效應子功能之突變係L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A)，且該等增加血清穩定性之突變係(i)如參照SEQ ID NO：1所編號的M25Y、S27T及T29E，或(ii)如參照SEQ ID NO：1所編號的N207S且存在或不存在M201L。
在一些實施例中，該多肽包含孔突變、調節效應子功能之突變、增加血清穩定性之突變及與SEQ ID NO：359、371、383、395、407、419、446、458、470及482中任一個之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性的序列，其中如參照SEQ ID NO：1所編號，該等孔突變係T139S、L141A及Y180V，該等調節效應子功能之突變係L7A及L8A且該等增加血清穩定性之突變係M25Y、S27T及T29E。在特定實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：359、371、383、395、407、419、446、458、470及482中任一個之序列。
在一些實施例中，該多肽包含孔突變、調節效應子功能之突變、增加血清穩定性之突變及與SEQ ID NO：489、496、503、510、517、524、531、538、545及552中任一個之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性的序列，其中如參照SEQ ID NO：1所編號，該等孔突變係T139S、L141A及Y180V，該等調節效應子功能之突變係L7A及L8A且該等增加血清穩定性之突變係如參照SEQ ID NO：1所編號的N207S且存在或不存在M201L。在特定實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：489、496、503、510、517、524、531、538、545及552中任一個之序列。
在一些實施例中，該多肽包含孔突變、調節效應子功能之突變、增加血清穩定性之突變及與SEQ ID NO：360、372、384、396、408、420、447、459、 471及483中任一個之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性的序列，其中如參照SEQ ID NO：1所編號，該等孔突變係T139S、L141A及Y180V，該等調節效應子功能之突變係L7A、L8A及P102G且該等增加血清穩定性之突變係M25Y、S27T及T29E。在特定實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：360、372、384、396、408、420、447、459、471及483中任一個之序列。
在一些實施例中，該多肽包含孔突變、調節效應子功能之突變、增加血清穩定性之突變及與SEQ ID NO：490、497、504、511、518、525、532、539、546及553中任一個之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性的序列，其中如參照SEQ ID NO：1所編號，該等孔突變係T139S、L141A及Y180V，該等調節效應子功能之突變係L7A、L8A及P102G且該等增加血清穩定性之突變係如參照SEQ ID NO：1所編號的N207S且存在或不存在M201L。在特定實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：490、497、504、511、518、525、532、539、546及553中任一個之序列。
在另一態樣中，提供特異性結合至轉鐵蛋白受體之多肽，其包含SEQ ID NO：116-233、303-345及581-608中任一個之序列。
在一些實施例中，提供特異性結合至轉鐵蛋白受體之多肽，其包含SEQ ID NO：116-130中任一個之第一序列及獨立地選自由SEQ ID NO：131-139組成之群的第二序列。在一些實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：121、116、122、123或126-130中任一個之第一序列及獨立地選自由SEQ ID NO：136、137及139組成之群的第二序列。在一些實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：120或124-126中任一個之第一序列及獨立地選自由SEQ ID NO：135、138及139組成之群的第二序列。
在一些實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：116及SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：116及SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：117及SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：118及SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：119及SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：120及SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：121及SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：122及SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：123及SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：124及SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：125及SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：126及SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：127及SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：128及SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：129及SEQ ID NO：136，或SEQ ID NO：130及SEQ ID NO：136。
在一些實施例中，提供特異性結合至轉鐵蛋白受體之多肽，其包含SEQ ID NO：303-339中任一個之第一序列及獨立地選自由SEQ ID NO：136、138及340-345組成之群的第二序列。在一些實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：303及SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：304及SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：305及SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：306及SEQ ID NO：341、SEQ ID NO：307及SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：308及SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：309及SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：310及SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：311及SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：312及SEQ ID NO：341、SEQ ID NO：313及SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：314及SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：315及SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：316及SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：317及SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：318及SEQ ID NO：341、SEQ ID NO：319及SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：320及SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：321及SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：322及SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：323及SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：324及SEQ ID NO：341、SEQ ID NO：325及SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：326及SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：327及SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：328及SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：329及SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：330及SEQ ID NO：341、SEQ ID NO：331及SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：332及SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：306及SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：312及SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：324及SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：318及SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：324及SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：330及SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：318及SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：333及SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：334及SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：312及SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：333及SEQ ID NO：342、SEQ ID NO：335及SEQ ID NO：342、SEQ ID NO：336及SEQ ID NO：342、SEQ ID NO：334及SEQ ID NO：342、SEQ ID NO：330及SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：330及SEQ ID NO：343、SEQ ID NO：330及SEQ ID NO：345、SEQ ID NO：337及SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：338及SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：339及SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：330及SEQ ID NO：344、SEQ ID NO：312及SEQ ID NO：343，或SEQ ID NO：312及SEQ ID NO：345。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種特異性結合至轉鐵蛋白受體之多肽，其包含SEQ ID NO：581、583、585、587、589、591及593中任一個之第一序列及獨立地選自由SEQ ID NO：582、884、586、588、590、592及594組成之群的第二序列。在特定實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：581及SEQ ID NO：582、SEQ ID NO：583及SEQ ID NO：584、SEQ ID NO：585及SEQ ID NO：586、SEQ ID NO：587及SEQ ID NO：588、SEQ ID NO：589及SEQ ID NO：590、SEQ ID NO：591及SEQ ID NO：592，或SEQ ID NO：593及SEQ ID NO：594。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種特異性結合至轉鐵蛋白受體之多肽，其包含SEQ ID NO：554、557及560中任一個之第一序列及獨立地選自由SEQ ID NO：555、558及561組成之群的第二序列。在特定實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：554及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：557及SEQ ID NO：558，或SEQ ID NO：560及SEQ ID NO：561。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種特異性結合至轉鐵蛋白受體之多肽，其包含SEQ ID NO：554、557及560中任一個之第一序列及獨立地選自由SEQ ID NO：340-345、582、584、586、588、590、592及594組成之群的第二 序列。在特定實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：554及SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：554及SEQ ID NO：341、SEQ ID NO：554及SEQ ID NO：342、SEQ ID NO：554及SEQ ID NO：343、SEQ ID NO：554及SEQ ID NO：344、SEQ ID NO：554及SEQ ID NO：345、SEQ ID NO：554及SEQ ID NO：582、SEQ ID NO：554及SEQ ID NO：584、SEQ ID NO：554及SEQ ID NO：586、SEQ ID NO：554及SEQ ID NO：588、SEQ ID NO：554及SEQ ID NO：590、SEQ ID NO：554及SEQ ID NO：592、SEQ ID NO：554及SEQ ID NO：594、SEQ ID NO：557及SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：557及SEQ ID NO：341、SEQ ID NO：557及SEQ ID NO：342、SEQ ID NO：557及SEQ ID NO：343、SEQ ID NO：557及SEQ ID NO：344、SEQ ID NO：557及SEQ ID NO：345、SEQ ID NO：557及SEQ ID NO：582、SEQ ID NO：557及SEQ ID NO：584、SEQ ID NO：557及SEQ ID NO：586、SEQ ID NO：557及SEQ ID NO：588、SEQ ID NO：557及SEQ ID NO：590、SEQ ID NO：557及SEQ ID NO：592、SEQ ID NO：557及SEQ ID NO：594、SEQ ID NO：560及SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：560及SEQ ID NO：341、SEQ ID NO：560及SEQ ID NO：342、SEQ ID NO：560及SEQ ID NO：343、SEQ ID NO：560及SEQ ID NO：344，或SEQ ID NO：560及SEQ ID NO：345、SEQ ID NO：560及SEQ ID NO：582、SEQ ID NO：560及SEQ ID NO：584、SEQ ID NO：560及SEQ ID NO：586、SEQ ID NO：560及SEQ ID NO：588、SEQ ID NO：560及SEQ ID NO：590、SEQ ID NO：560及SEQ ID NO：592，或SEQ ID NO：560及SEQ ID NO：594。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種特異性結合至轉鐵蛋白受體之多肽，其包含SEQ ID NO：303-339、581、583、585、587、589、591及593中任一個之第一序列及獨立地選自由SEQ ID NO：555、558及561組成之群的第二序列。在特定實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：303及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：303及SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：303及SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：304及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：304及SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：304及SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：305及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：305及SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：305及SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：306及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：306及SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：306及SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：307及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：307及SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：307及SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：308及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：308及SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：308及SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：309及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：309及SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：309及SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：310及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：310及SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：310及SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：311及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：311及SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：311及SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：312及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：312及SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：312及SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：313及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：313及SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：313及SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：314及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：314及SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：314及SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：315及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：315及SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：315及SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：316及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：316及SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：316及SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：317及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：317及SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：317及SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：318及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：318及SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：318及SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：319及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：319及SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：319及SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：320及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：320及SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：320及SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：321及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：321及SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：321及SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：322及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：322及SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：322及SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：323及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：323及SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：323及SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：324及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：324及SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：324及SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：325及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：325及SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：325及SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：326及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：326及SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：326及SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：327及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：327及SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：327及SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：328及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：328及SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：328及SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：329及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：329及SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：329及SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：330及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：330及SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：330及SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：331及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：331及SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：331及SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：332及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：332及SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：332及SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：333及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：333及SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：333及SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：334及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：334及SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：334及SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：335及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：335及SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：335及SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：336及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：336及SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：336及SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：337及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：337及SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：337及SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：338及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：338及SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：338及SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：339及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：339及SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：339及SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：581及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：581及SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：581及SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：583及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：583及SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：583及SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：585及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：585及SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：585及SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：587及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：587及SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：587及SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：589及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：589及SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：589及SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：591及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：591及SEQ ID NO：558、SEQ ID NO：591及SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：593及SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：593及SEQ ID NO：558，或SEQ ID NO：593及SEQ ID NO：561。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種特異性結合至轉鐵蛋白受體之多肽，其包含SEQ ID NO：609-614中任一個之第一序列及獨立地選自由SEQ ID NO：615-620組成之群的第二序列。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種特異性結合至轉鐵蛋白受體之多肽，其包含SEQ ID NO：303、312、315-318及328中任一個之第一序列及獨立地選自由SEQ ID NO：135、340及341組成之群的第二序列。在特定實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：303及SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：316及SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：317及SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：318及SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：328及SEQ ID NO：341、SEQ ID NO：318及SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：312及SEQ ID NO：340、SEQ ID NO：303及SEQ ID NO：341、SEQ ID NO：316及SEQ ID NO：135，或SEQ ID NO：315及SEQ ID NO：341。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種特異性結合至轉鐵蛋白受體之多肽，其包含SEQ ID NO：595、597、599、601、603、605及607中任一個之第一序列及獨立地選自由SEQ ID NO：596、598、600、602、604、606及608組成之群的第二序列。在特定實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：595及SEQ ID NO：596、SEQ ID NO：597及SEQ ID NO：598、SEQ ID NO：599及SEQ ID NO：600、SEQ ID NO：601及SEQ ID NO：602、SEQ ID NO：603及SEQ ID NO：604、SEQ ID NO：605及SEQ ID NO：606，或SEQ ID NO：607及SEQ ID NO：608。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種特異性結合至轉鐵蛋白受體之多肽，其包含SEQ ID NO：575及578中任一個之第一序列及獨立地選自由SEQ ID NO：576及579組成之群的第二序列。在特定實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：575及SEQ ID NO：576，或SEQ ID NO：578及SEQ ID NO：579。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種特異性結合至轉鐵蛋白受體之多肽，其包含SEQ ID NO：575及578中任一個之第一序列及獨立地選自由SEQ ID NO：136、138及340-345組成之群的第二序列。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種特異性結合至轉鐵蛋白受體之多肽，其包含SEQ ID NO：303-339中任一個之第一序列及獨立地選自由SEQ ID NO：576及579組成之群的第二序列。
在一些實施例中，提供特異性結合至轉鐵蛋白受體之多肽，其包含SEQ ID NO：140-153中任一個之第一序列及獨立地選自由SEQ ID NO：154-157組成之群的第二序列。在一些實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：140及SEQ ID NO：154、SEQ ID NO：141及SEQ ID NO：154、SEQ ID NO：142及SEQ ID NO：154、SEQ ID NO：143及SEQ ID NO：154、SEQ ID NO：144及SEQ ID NO：154、SEQ ID NO：145及SEQ ID NO：154、SEQ ID NO：146及SEQ ID NO：154、SEQ ID NO：147及SEQ ID NO：154、SEQ ID NO：148及SEQ ID NO：155、SEQ ID NO：149及SEQ ID NO：154、SEQ ID NO：140及SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：150及SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：151及SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：152及SEQ ID NO：155，或SEQ ID NO：153及SEQ ID NO：154。
在一些實施例中，提供特異性結合至轉鐵蛋白受體之多肽，其包含 SEQ ID NO：158-171中任一個之第一序列及獨立地選自由SEQ ID NO：172-186組成之群的第二序列。在一些實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：158及SEQ ID NO：172、SEQ ID NO：158及SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：159及SEQ ID NO：173、SEQ ID NO：159、及SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：160及SEQ ID NO：174、SEQ ID NO：161及SEQ ID NO：175、SEQ ID NO：162及SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：163及SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：164及SEQ ID NO：178、SEQ ID NO：165及SEQ ID NO：180、SEQ ID NO：166及SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：167及SEQ ID NO：183、SEQ ID NO：168及SEQ ID NO：184、SEQ ID NO：169及SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：170及SEQ ID NO：174，或SEQ ID NO：171及SEQ ID NO：186。
在一些實施例中，提供特異性結合轉鐵蛋白受體之多肽，其包含SEQ ID NO：187-204中任一個之第一序列及獨立地選自由SEQ ID NO：205-215組成之群的第二序列。在一些實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：187及SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：187及SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：188及SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：189及SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：190及SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：191及SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：192及SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：193及SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：194及SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：195及SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：196及SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：197及SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：198及SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：199及SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：200及SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：201及SEQ ID NO：210、SEQ ID NO：201及SEQ ID NO：211、SEQ ID NO：201及SEQ ID NO：212、SEQ ID NO：202及SEQ ID NO：212、SEQ ID NO：203及SEQ ID NO：213、SEQ ID NO：203及SEQ ID NO：214，或SEQ ID NO：204及SEQ ID NO：215。
在一些實施例中，提供特異性結合至轉鐵蛋白受體之多肽，其包含SEQ ID NO：216-220中任一個之第一序列及獨立地選自由SEQ ID NO：221-224組 成之群的第二序列。在一些實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：216及SEQ ID NO：221、SEQ ID NO：217及SEQ ID NO：221、SEQ ID NO：218及SEQ ID NO：222、SEQ ID NO：219及SEQ ID NO：223，或SEQ ID NO：220及SEQ ID NO：224。
在一些實施例中，提供特異性結合至轉鐵蛋白受體之多肽，其包含SEQ ID NO：225-228中任一個之第一序列及獨立地選自由SEQ ID NO：229-233組成之群的第二序列。在一些實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：225及229、SEQ ID NO：226及SEQ ID NO：230、SEQ ID NO：226及SEQ ID NO：231、SEQ ID NO：227及SEQ ID NO：232，或SEQ ID NO：228及SEQ ID NO：233。
在以上實施例中之任一個中，該多肽亦可包含在7位及8位的Leu變為Ala之取代(L7A及L8A)。在一些實施例中，在7位及8位之Ala取代(L7A及L8A)係與在102位的Pro變為Gly之取代(P102G)組合。
在又另一態樣中，提供聚核苷酸，其包含編碼如本文所述的特異性結合至轉鐵蛋白受體之多肽的核酸序列。
在另一態樣中，提供載體，其包括含編碼如本文所述的特異性結合至轉鐵蛋白受體之多肽之核酸序列的聚核苷酸。
在又另一態樣中，提供宿主細胞，其包括含編碼如本文所述的特異性結合至轉鐵蛋白受體之多肽之核酸序列的聚核苷酸。
在又另一態樣中，提供用於產生包含經修飾CH3結構域或經修飾CH2結構域之多肽的方法，其包括在表現由本文所述之聚核苷酸編碼之多肽的條件下培養宿主細胞。
在另一態樣中，提供醫藥組成物，其包含如本文所述的特異性結合至轉鐵蛋白受體之多肽及醫藥學上可接受之載劑。
在又另一態樣中，提供用於跨內皮穿胞運輸組成物之方法，該等方法包括使內皮與包含如本文所述的特異性結合至轉鐵蛋白受體之多肽的組成物 接觸。在一些實施例中，該內皮係血腦屏障(BBB)。
在又另一態樣中，提供用於將CH3結構域工程改造成特異性結合至轉鐵蛋白受體的方法，該等方法包括：(a)將編碼該CH3結構域之聚核苷酸修飾成在包含以下之一組胺基酸位置處具有至少五個胺基酸取代：(i)157、159、160、161、162、163、186、189及194；或(ii)118、119、120、122、210、211、212及213，其中該等取代及位置係參照SEQ ID NO：1之胺基酸114-220確定；(b)表現包含該經修飾CH3結構域之多肽；及(c)確定該經修飾CH3結構域是否結合至該轉鐵蛋白受體。
在另一態樣中，本文提供一種用於將CH3結構域工程改造成特異性結合至轉鐵蛋白受體之方法，該方法包括(a)將編碼CH3結構域之聚核苷酸修飾成在該CH3結構域中具有至少五個如描述CH3結構域取代之先前段落中之任一個中所闡述之胺基酸取代；及(b)表現並回收包含該經修飾CH3結構域之多肽。
在一些實施例中，該表現包含該經修飾CH3結構域之多肽及確定該經修飾CH3結構域是否結合至該轉鐵蛋白受體的步驟係使用展示系統進行。在一些實施例中，該展示系統係細胞表面展示系統、病毒展示系統、mRNA展示系統、聚核糖體展示系統或核糖體展示系統。在一些實施例中，包含經修飾CH3結構域之多肽係表現為可溶性蛋白質之形式。
在另一態樣中，提供用於將CH2結構域工程改造成特異性結合至轉鐵蛋白受體的方法，該等方法包括：(a)將編碼該CH2結構域之聚核苷酸修飾成在包含以下之一組胺基酸位置處具有至少五個胺基酸取代：(i)47、49、56、58、59、60、61、62及63； (ii)39、40、41、42、43、44、68、70、71及72；(iii)41、42、43、44、45、65、66、67、69及73；或(iv)45、47、49、95、97、99、102、103及104；其中該等取代及該等位置係參照SEQ ID NO：1之胺基酸4-113確定；(b)表現包含該經修飾CH2結構域之多肽；及(c)確定該經修飾CH2結構域是否結合至該轉鐵蛋白受體。
在另一態樣中，本文提供一種用於將CH2結構域工程改造成特異性結合至轉鐵蛋白受體之方法，該方法包括(a)將編碼CH2結構域之聚核苷酸修飾成在該CH2結構域中具有至少五個如描述CH2結構域取代之先前段落中之任一個中所闡述之胺基酸取代；及(b)表現並回收包含該經修飾CH2結構域之多肽。
在一些實施例中，該表現包含該經修飾CH2結構域之多肽及確定該經修飾CH2結構域是否結合至該轉鐵蛋白受體的步驟係使用展示系統進行。在一些實施例中，該展示系統係細胞表面展示系統、病毒展示系統、mRNA展示系統、聚核糖體展示系統或核糖體展示系統。在一些實施例中，包含經修飾CH2結構域之多肽係表現為可溶性蛋白質之形式。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種用於增強包含非天然結合位點之經修飾Fc多肽與靶(例如轉鐵蛋白受體)之結合的方法，該方法包括：(a)在該非天然結合位點之10Å內(例如在9Å、8Å、7Å、6Å、5Å、4Å、3Å、2Å或1Å內)之一或多個位置處引入一或多個取代；及(b)測試該經修飾Fc多肽與該靶之結合。
在一些實施例中，該非天然結合位點在以下位置中之一或多個處包含取代：157、159、160、161、162、163、186、189及194。
在一些實施例中，參照SEQ ID NO：1，在該非天然結合位點之10Å內之一或多個位置處的該一或多個取代係選自由以下組成之群：K21、R28、Q115、 R117、E118、Q120、T132、K133、N134、Q135、S137、K143、E153、E155、S156、G158、Y164、K165、T166、D172、S173、D174、S176、K182、L183、T184、V185、K187、S188、Q191、Q192、G193、V195、F196、S197、S199、Q211、S213、S215、L216、S217、P218、G219及K220。
圖1A-1D顯示四個CH2A2純系之噬菌體ELISA結果。CH2A2 Fc變異體係在噬菌體表面上表現且測試其與板上塗佈的抗c-Myc抗體9E10(表現對照)、陰性對照、人類轉鐵蛋白受體(TfR)及食蟹獼猴(cyno)TfR的結合。x軸顯示噬菌體溶液之OD268，其為噬菌體濃度之量度。圖1A顯示純系CH2A2.5之ELISA結果。圖1B顯示純系CH2A2.1之ELISA結果。圖1C顯示純系CH2A2.4之ELISA結果。圖1D顯示純系CH2A2.16之ELISA結果。
圖2A及2B顯示結合至人類TfR之CH2A2純系的噬菌體ELISA結果。將噬菌體以近似結合EC50添加至塗有TfR之ELISA板上，並添加不同濃度之可溶性鐵飽和Tf或可溶性TfR。資料顯示CH2A2純系與可溶性TfR競爭結合至板上塗佈之TfR，但不與鐵飽和Tf競爭。圖2A顯示添加可溶性鐵飽和Tf之實驗的結果。圖2B顯示添加可溶性TfR之實驗的結果。
圖3A-3D顯示在存在或不存在鐵飽和Tf下CH2C純系與TfR之結合。圖3A顯示噬菌體ELISA之結果，其中將TfR塗佈於ELISA板上並在存在或不存在大量過量之鐵飽和Tf(5μM)下添加展示於噬菌體上之純系CH2C.23。圖3B顯示呈Fc-Fab融合物形式的CH2C純系與塗有人類或食蟹獼猴TfR之ELISA板的結合。圖3C顯示噬菌體ELISA之結果，其中將人類TfR、食蟹獼猴TfR、鐵飽和Tf、抗Myc或抗生蛋白鏈菌素塗佈於ELISA板上並在不存在或存在鐵飽和Tf下，添加各種稀釋度的噬菌體展示之純系CH2C.17及CH2C.22。該等資料顯示，該等純系不與鐵飽和Tf競爭結合至TfR。圖3D顯示在5μM鐵飽和Tf存 在下並減去單獨鐵飽和Tf結合背景的結合至抗-抗生蛋白鏈菌素感測器上之TfR-生物素的純系CH2C.7之Octet®(亦即，生物膜層干涉術)動力學跡線，表明不與Tf競爭結合。
圖4A及4B顯示在存在或不存在鐵飽和Tf下CH3B純系與TfR之結合。圖4A顯示噬菌體ELISA之結果，其中將人類TfR、食蟹獼猴TfR、鐵飽和Tf、抗Myc或抗生蛋白鏈菌素塗佈於ELISA板上並在不存在或存在鐵飽和Tf下，添加各種稀釋度的噬菌體展示之純系CH3B.11及CH3B.12。該等資料顯示，該等純系不與鐵飽和Tf競爭結合至TfR。圖4B顯示CH3B純系結合至人類或食蟹獼猴TfR塗佈之ELISA板。將包含CH3B純系序列之Fc區與Fab片段融合並以二聚體形式進行檢定。
圖5顯示有關CH3B純系成熟之NNK補丁文庫。各條帶顯示CH3結構域之主鏈，其中深色表面表示原始CH3B定位區(register)且淺色表面補丁表示擴展之譜系。
圖6顯示在酵母上CH3C純系選擇之FACS圖，顯示在3輪分選後結合群之富集。在第1輪及第2輪分選中，將生物素化TfR預先裝載於抗生蛋白鏈菌素-Alexa Fluor® 647上，隨後與酵母一起培育。在第3輪分選中，先將生物素化TfR與酵母一起培育，並添加抗生蛋白鏈菌素-Alexa Fluor® 647進行二次偵測。在所有數輪分選中，均使用針對酵母展示構築體上之C末端Myc標籤的雞抗c-Myc抗體(自Thermo Fisher獲得)監測表現。
圖7A-7C顯示在存在或不存在鐵飽和Tf下CH3C純系與TfR之結合。各純系係以Fc-Fab融合物形式檢定。在本檢定中使用Ab204作為陽性對照，其為具有結合至TfR之可變區的標準抗體。圖7A顯示CH3C變異體與塗佈於ELISA板上之人類TfR之結合。圖7B顯示在5μM鐵飽和Tf存在下，CH3C變異體與塗佈於ELISA板上之人類TfR之結合。圖7C顯示CH3C變異體與塗佈 於ELISA板上之食蟹獼猴TfR之結合。
圖8顯示CH3C純系與內源性表現人類TfR之293F細胞之結合。將細胞分配於96孔V形底培養板上，並添加不同濃度的呈Fc-Fab融合結合蛋白形式之CH3C純系。在4℃下培育1小時後，對各培養板離心並洗滌，且接著與山羊抗人類IgG-Alexa Fluor® 647二級抗體一起在4℃下培育30分鐘。再洗滌細胞後，在FACSCantoTM II流式細胞儀上讀取培養板，並使用FlowJo®軟體測定APC(647nm)通道中的中值螢光度值。
圖9A及9B顯示在內源性表現人類TfR之HEK293細胞中CH3C.3之內化情況。在37℃及8% CO2濃度下，添加1μM濃度之CH3C.3或對照物，保持30分鐘，接著洗滌細胞，使其透性化並用抗人類IgG-Alexa Fluor® 488二級抗體染色。再次洗滌後，利用螢光顯微鏡獲取細胞圖像並定量斑點之數量。圖9A顯示顯微鏡檢查資料。圖9B顯示每孔斑點之數量的圖。
圖10顯示CH3C軟文庫(soft library)之選擇方案。利用MACS針對人類(H)或食蟹獼猴(C)TfR分選初始文庫。接著將所得酵母匯集物分離並如第一輪FACS分選中一般針對人類或食蟹獼猴TfR分別進行分選。再次將所得匯集物分離以進行另一輪FACS分選。最後，將HHH及CCC匯集物保持分離並最終彙集同時具有兩個靶物種的其他匯集物。
圖11A及11B顯示自第一軟隨機突變文庫鑑別的CH3C純系與人類及食蟹獼猴TfR之結合。陽性對照係高親和力抗TfR抗體Ab204及低親和力抗TfR抗體Ab084。圖11A顯示與人類TfR之結合。圖11B顯示與食蟹獼猴TfR之結合。
圖12A及12B顯示在存在或不存在鐵飽和Tf下，自第一軟隨機突變文庫鑑別的CH3C純系與人類TfR之結合。各純系係呈Fc-Fab融合物形式。在本檢定中使用高親和力抗TfR抗體Ab204作為陽性對照。圖12A顯示CH3C變 異體與塗佈於ELISA板上之人類TfR之結合。圖12B顯示在5μM鐵飽和Tf存在下，CH3C變異體與塗佈於ELISA板上之人類TfR之結合。
圖13顯示自第一軟隨機突變文庫鑑別之CH3C純系與293F細胞之結合。將細胞分配於96孔V形底培養板上，並添加不同濃度的呈Fc-Fab融合蛋白形式之CH3C純系。在4℃下培育1小時後，對各培養板離心並洗滌，且接著與山羊抗人類IgG-Alexa Fluor® 647二級抗體一起在4℃下培育30分鐘。再洗滌細胞後，在FACSCantoTM II流式細胞儀上讀取培養板，並使用FlowJo®軟體測定APC(647nm)通道中的中值螢光度值。
圖14A-14C顯示自第一軟隨機突變文庫鑑別之CH3C純系與CHO-K1細胞之結合。將細胞分配於96孔V形底培養板上，並添加不同濃度的呈Fc-Fab融合物形式之CH3C純系。在4℃下培育1小時後，對各培養板離心並洗滌，且接著與山羊抗人類IgG-Alexa Fluor® 647二級抗體一起在4℃下培育30分鐘。再洗滌細胞後，在FACSCantoTM II流式細胞儀上讀取培養板，並使用FlowJo®軟體測定APC(647nm)通道中的中值螢光度值。圖14A顯示過度表現人類TfR之CHO-K1細胞。圖14B顯示過度表現食蟹獼猴TfR之CHO-K1細胞。圖14C顯示不表現人類TfR之CHO-K1親本細胞。
圖15A及15B顯示TfR頂端結構域。圖15A顯示頂端結構域在人類TfR蛋白質上的位置。插圖顯示人類與食蟹獼猴TfR之間不同的七個殘基之近視圖。圖15B顯示含有人類(SEQ ID NO：107)與食蟹獼猴(SEQ ID NO：108)TfR之間不同之七個殘基的序列比對。共同序列係SEQ ID NO：622。
圖16A-16E顯示CH3C純系與展示於噬菌體上之頂端結構域的結合。圖16A顯示各種TfR頂端結構域突變體之Myc表現，顯示該等突變體之表現量類似且經正規化。圖16B顯示CH3C.18與野生型及突變人類TfR頂端結構域之結合，顯示與R208G突變體之結合減少。圖16C顯示CH3C.35與野生型及突變 人類TfR頂端結構域之結合，顯示與R208G突變體之結合減少。圖16D顯示CH3C.18與野生型人類及食蟹獼猴TfR頂端結構域以及G208R突變食蟹獼猴頂端結構域之結合，顯示與該突變體之結合恢復。圖16E顯示CH3C.35與野生型人類及食蟹獼猴TfR頂端結構域以及G208R突變食蟹獼猴頂端結構域之結合，顯示與該突變體之結合恢復。
圖17A-17D顯示藉由將突變位置復原成野生型殘基進行的CH3C變異體之互補位定位。圖17A顯示利用ELISA進行的結合至人類TfR之CH3C.35之回復突變體的互補位定位。圖17B顯示利用ELISA進行的結合至食蟹獼猴TfR之CH3C.35之回復突變體的互補位定位。圖17C顯示利用ELISA進行的結合至人類TfR之CH3C.18之回復突變體的互補位定位。圖17D顯示利用ELISA進行的結合至食蟹獼猴TfR之CH3C.18之回復突變體的互補位定位。
圖18A-18D顯示CH3C共同成熟文庫之設計。圖18A顯示基於CH3C.35樣序列的共同文庫。圖18B顯示基於CH3C.18樣序列的共同文庫。圖18C顯示基於CH3C.18及CH3C.35之空位文庫。圖18D顯示基於CH3C.18芳族化合物文庫。
圖19A-19E顯示來自共同成熟文庫之CH3C變異體與人類或食蟹獼猴TfR之結合ELISA。新變異體(亦即，CH3C.3.2-1、CH3C.3.2-5及CH3C.3.2-19)對於食蟹獼猴及人類TfR具有類似結合EC50值，而親本純系CH3C.18及CH3C.35對人類TfR之EC50值明顯優於對食蟹獼猴TfR之EC50值。圖19A顯示CH3C.3.2-1之資料。圖19B顯示CH3C.3.2-19之資料。圖19C顯示CH3C.3.2-5之資料。圖19D顯示CH3C.18之資料。圖19E顯示CH3C.35之資料。
圖20顯示在人類(HEK293)及猴(LLC-MK2)細胞中來自共同成熟文庫之CH3C變異體之內化情況。相較於與人類TfR之結合較佳的純系CH3C.35，具有類似人類及食蟹獼猴TfR親和力的純系CH3C.3.2-5及CH3C3.2-19在猴細 胞中之吸收明顯改良。使用抗BACE1抗體Ab107作為陰性對照。(BACE1在HEK293或MK2細胞上不表現)。使用抗TfR抗體Ab204作為陽性對照。
圖21顯示描繪於CH3結構(改編自PDB 4W4O)上的NNK步行殘基之圖譜。黑色表面顯示原始CH3C定位區，灰色表面顯示併入NNK步行結構中的44個殘基，且條帶顯示野生型主鏈。
圖22顯示在三輪分選NNK步行文庫之後富集的酵母群。酵母用抗c-Myc染色以監測表現(x軸)及與TfR頂端結構域(200nM食蟹獼猴或200nM人類)之結合(y軸)。此處呈現之資料顯示與兩種TfR頂端結構域直系同源物之結合增強。
圖23A及23B顯示CH3C.35.21突變體之FACS資料。酵母用抗c-Myc染色以監測表現(x軸)及與人類TfR頂端結構域(200nM)之結合(y軸)。圖23A顯示純系CH3C.35.21之FACS資料。圖23B顯示突變體之FACS資料，其中純系CH3C.35.21中之11個位置回復突變成野生型(FACS圖之上面一列)或表現為全部20個胺基酸之NNK文庫(FACS圖之下面一列，在任何分選之前)。
圖24A-24D顯示二價及單價CH3C多肽與人類及食蟹獼猴TfR之結合的ELISA比較。圖24A顯示二價CH3C多肽與人類TfR之結合。圖24B顯示二價CH3C多肽與食蟹獼猴TfR之結合。圖24C顯示單價CH3C多肽與人類TfR之結合。圖24D顯示單價CH3C多肽與食蟹獼猴TfR之結合。
圖25A-25E顯示單價CH3C多肽之細胞結合。圖25A顯示293F細胞。圖25B顯示與圖25A中所描繪之293F細胞之結合的放大。圖25C顯示經人類TfR穩定轉染之CHO-K1細胞。圖25D顯示與圖25C中所描繪的經人類TfR穩定轉染之CHO-K1細胞之結合的放大。圖25E顯示經食蟹獼猴TfR穩定轉染之CHO-K1細胞。
圖26顯示在HEK293細胞中單價及二價CH3C多肽之內化情況。
圖27A-27H顯示CH3C多肽之結合動力學。圖27A顯示CH3C.35.N163與人類TfR之結合的資料。圖27B顯示CHC3.35與人類TfR之結合的資料。圖27C顯示CHC3.35.N163與人類TfR單價結合的資料。圖27D顯示CHC3.35與人類TfR單價結合的資料。圖27E顯示CH3C.35.N163與食蟹獼猴TfR之結合的資料。圖27F顯示CHC3.35與食蟹獼猴TfR之結合的資料。圖27G顯示CHC3.35.N163與食蟹獼猴TfR單價結合的資料。圖27H顯示CHC3.35與食蟹獼猴TfR單價結合的資料。
圖28A-28F顯示CH3C多肽之結合動力學。圖28A顯示CH3C.3.2-1與人類TfR之結合的資料。圖28B顯示CH3C.3.2-5與人類TfR之結合的資料。圖28C顯示CH3C.3.2-19與人類TfR之結合的資料。圖28D顯示CH3C.3.2-1與食蟹獼猴TfR之結合的資料。圖28E顯示CH3C.3.2-5與食蟹獼猴TfR之結合的資料。圖28F顯示CH3C.3.2-19與食蟹獼猴TfR之結合的資料。
圖29A-29E顯示在存在(下部跡線)或不存在(上部跡線)人類TfR細胞外結構域下，在pH 5.5下多肽-Fab融合物與FcRn之結合。圖29A顯示CH3C.35之資料。圖29B顯示CH3C.35.19之資料。圖29C顯示CH3C.35.20之資料。圖29D顯示CH3C.35.21之資料。圖29E顯示CH3C.35.24之資料。
圖30顯示在野生型小鼠中CH3C多肽之藥物動力學(PK)分析。除CH3C.3.2-5具有較快清除率外，所有多肽-Fab融合物均具有與野生型Fc-Fab融合物(亦即，抗RSV抗體Ab122及抗BACE1抗體Ab153)相當之清除率。
圖31顯示在小鼠腦組織中之腦藥物動力學/藥效學(PK/PD)資料。對嵌合huTfR雜合小鼠(n=4隻/組)靜脈內給與42mg/kg Ab153或單價CH3C.35.N163(標為「CH3C.35.N163_mono」)，且野生型小鼠(n=3)靜脈內給與50mg/kg對照人類IgG1(標為「huIgG1」)。條形圖表示平均值+/- SD。
圖32A及32B顯示在用50mg/kg多肽治療之後24小時，hTfR頂端結構 域+/+小鼠中所發現之IgG的濃度。圖32A顯示血漿中之IgG濃度。圖32B顯示腦組織中之IgG濃度。
圖33A及33B顯示如藉由澱粉樣β-蛋白40(Aβ 40)減少所量測，在24小時後hTfR頂端結構域+/+小鼠中給與之多肽的靶接合。圖33A顯示血漿中之Aβ 40濃度。圖33B顯示腦組織中之Aβ 40濃度。
圖34顯示CH3C.18 Fc及TfR頂端結構域(AD)複合物之不同大小部分的SDS-PAGE凝膠。泳道1：分子量標記物。泳道2：在尺寸排阻層析法後減少的CH3C.18 Fc-AD複合物。
圖35A及35B描繪本發明多肽與轉鐵蛋白受體之間的結合。圖35A描繪純系CH3C.18與轉鐵蛋白受體頂端結構域之間的結合界面。圖35B顯示圖35A中所描繪之結合界面的放大圖。
圖36A及36B描繪CH3C.18與TfR頂端結構域之間的相互作用。圖36A描繪TfR頂端結構域及CH3C.18 Fc之結構架構(頂圖)以及TfR頂端結構域與CH3C.18 Fc之結合表面(在5埃內)(底圖)。共複合物結構以3.6Å解析度解析。該結構披露在TfR頂端結構域上結合至CH3C.18之抗原決定基。詳言之，該頂端結構域之N末端區參與CH3C Fc結合，且該結構與CH3C.18 Fc及TfR頂端結構域誘變資料相符。另外，CH3C.18文庫側鏈亦均接觸TfR(在5Å內)。CH3C.18文庫殘基：L157、H159、V160、W161、A162、V163、P186、T189及W194。非文庫殘基：F196及S156。圖36B描繪CH3C.18 Fc與TfR頂端結構域之關鍵相互作用。CH3C.18 Fc上之W161與頂端結構域上之R208之間的陽離子-π相互作用係重要的結合相互作用。CH3C.18 W388或頂端結構域R208突變會破壞CH3C.18 Fc與頂端結構域之結合。與此相符，自人類到食蟹獼猴之R208G突變解釋了食蟹獼猴親和力減小的原因。此外，人類頂端結構域中之非保守殘基(N292及E294(食蟹獼猴中之K292及D294))係鄰近的。因此，CH3C.18中之Q192 可以經突變以相對於人類結合選擇性改善食蟹獼猴結合。
圖37A及37B描繪本發明多肽與轉鐵蛋白受體之間的結合。圖37A描繪純系CH3C.18(A鏈)中之殘基與轉鐵蛋白受體(D鏈)頂端結構域之間的氫鍵及非鍵結接觸。圖37B描繪純系CH3C.18(B鏈)中之殘基與轉鐵蛋白受體(C鏈)頂端結構域之間的氫鍵及非鍵結接觸。
圖38顯示人類IgG1、IgG2、IgG3及IgG4胺基酸序列(SEQ ID NO：623-626)之比對。
圖39A-39C描繪本發明多肽與轉鐵蛋白受體之間的結合。圖39A描繪TfR頂端結構域及CH3C.35 Fc之結構架構(頂圖)以及TfR頂端結構域與CH3C.35 Fc之結合表面(在5Å內)(底圖)。共複合物結構以3.4Å解析度解析。該結構披露在TfR頂端結構域上結合至CH3C.35之抗原決定基。CH3C.35文庫側鏈均接觸TfR(在5Å內)。CH3C.35文庫殘基：Y157、T159、E160、W161、S162、T186、E189及W194。非文庫殘基：F196、S156、Q192。圖39B及39C顯示圖39A中所描繪的純系CH3C.35與轉鐵蛋白受體頂端結構域之間之結合界面的放大圖。
圖40A描繪CH3C.35 Fc與TfR-AD複合物以及CH3C.18 Fc與TfR-AD複合物之間的覆蓋結構。
圖40B描繪圖40A中之覆蓋結構的放大圖。
圖41A及41B描繪本發明多肽與轉鐵蛋白受體之間的結合。圖41A描繪純系CH3C.35(A鏈)中之殘基與轉鐵蛋白受體(D鏈)頂端結構域之間的氫鍵及非鍵結接觸。圖41B描繪純系CH3C.35(B鏈)中之殘基與轉鐵蛋白受體(C鏈)頂端結構域之間的氫鍵及非鍵結接觸。
圖42A及42B描繪食蟹獼猴中包含CH3C變異體融合至Ab153 Fab結構域之Fc-Fab融合多肽的血漿PK及Aβ40減少。圖42A顯示，Ab210及 CH3C.35.9：Ab153由於TfR介導之清除而展現比對照IgG(Ab122)及Ab153快的清除率。圖42B顯示，各自結合並抑制BACE1的Ab153、Ab210及CH3C.35.9：Ab153展現血漿中之顯著Aβ40減少。
圖43A及43B描繪在食蟹獼猴中利用包含CH3C變異體融合至Ab153 Fab結構域之Fc-Fab融合多肽使腦脊髓液(CSF)Aβ及sAPPβ/sAPPα顯著減少。圖43A顯示，給與Ab210及CH3C.35.9：Ab153之動物顯示CSF Aβ40相較於Ab153及對照IgG(Ab122)減少約70%。圖43B顯示，給與Ab210及CH3C.35.9：Ab153之動物顯示sAPPβ/sAPPα比率相較於Ab153及對照IgG(Ab122)減少約75%。n=4隻/組。線圖表示平均值± SEM。
圖44A及44B描繪在單次全身注射50mg/kg抗BACE1_Ab153、CH3C35.21：Ab153、CH3C35.20：Ab153或CH3C35：Ab153多肽融合物之後hTfR頂端結構域+/+基因敲入(KI)小鼠之血漿(圖44A)及腦溶解產物(圖44B)中的huIgG1濃度(平均值± SEM，n=5隻/組)。
圖44C描繪在單次全身注射50mg/kg抗BACE1_Ab153、CH3C35.21：Ab153、CH3C35.20：Ab153或CH3C35：Ab153多肽融合物之後hTfR頂端結構域+/+ KI小鼠之腦溶解產物中的內源性小鼠Aβ濃度(平均值± SEM，n=5隻/組)。
圖44D描繪在單次全身注射50mg/kg抗BACE1_Ab153、CH3C35.21：Ab153、CH3C35.20：Ab153或CH3C35：Ab153多肽融合物之後hTfR頂端結構域+/+ KI小鼠之腦溶解產物中針對肌動蛋白正規化之腦TfR蛋白質的西方墨點法(Western blot)定量(平均值± SEM，n=5隻/組)。
圖45A及45B描繪在單次全身注射50mg/kg抗BACE1_Ab153、CH3C.35.23：Ab153或CH3C.35.23.3：Ab153多肽融合物之後hTfR頂端結構域+/+ KI小鼠之血漿(圖45A)及腦溶解產物(圖45B)中的huIgG1濃度(平均值± SEM，n=5隻 /組)。
圖45C描繪在單次全身注射50mg/kg抗BACE1_Ab153、CH3C.35.23：Ab153或CH3C.35.23.3：Ab153多肽融合物之後hTfR頂端結構域+/+ KI小鼠之腦溶解產物中的內源性小鼠Aβ濃度(平均值± SEM，n=5隻/組)。
圖45D描繪在單次全身注射50mg/kg抗BACE1_Ab153、CH3C.35.23：Ab153或CH3C.35.23.3：Ab153多肽融合物之後hTfR頂端結構域+/+ KI小鼠之腦溶解產物中針對肌動蛋白正規化之腦TfR蛋白質的西方墨點法定量(平均值± SEM，n=4隻/組)。
圖46A-46D描繪在給與單劑30mg/kg之指定蛋白質之後在食蟹獼猴中進行的28天PKPD研究。圖46A及46B描繪血清中之血清huIgG1及血漿中之血漿Aβ濃度，顯示所給與之化合物的周圍暴露及由此引起的隨時間對血漿Aβ含量之影響。圖46C及46D描繪在給藥後食蟹獼猴之CSF中的Aβ及sAPPβ/sAPPα(平均值± SEM，n=4-5隻/組)。
圖47A-47C描繪在單劑30mg/kg指定蛋白質之後食蟹獼猴之末梢血液中的血液網狀紅血球相對於給藥前的量(圖47A)、絕對血清鐵含量(圖47B)及絕對紅血球計數(圖47C)(平均值± SEM，n=4-5隻/組)。
圖48A及48B描繪在14天的單劑10mg/kg靜脈內注射之後hFcRn基因敲入小鼠中指定蛋白質之周圍PK分析(血漿huIgG1濃度(圖48A)及清除率值(圖48B))(平均值± SEM，n=3隻/組)。
圖49描繪TfR結合CH3C.18變異體之中值螢光強度。
本文描述結合轉鐵蛋白受體(TfR)之多肽。本發明係部分基於發現Fc區中之某些胺基酸可以經修飾以在Fc多肽中產生對TfR具有特異性之新穎結合 位點。利用TfR在血腦屏障(BBB)上大量表現及TfR天然地將轉鐵蛋白自血液移動至腦中的事實，該等多肽可以用於跨BBB轉運治療劑(例如治療性多肽、抗體可變區諸如Fab，及小分子)。此方法可以大體上改良治療劑之腦吸收且因此特別適用於治療得益於腦遞送之病症及疾病。
在一個態樣中，本發明係部分基於發現CH3或CH2結構域多肽中之幾組胺基酸可以經取代以產生結合轉鐵蛋白受體之多肽。因此，在一個態樣中，本文提供轉鐵蛋白受體結合多肽，其在如參照SEQ ID NO：1編號的一組胺基酸(i)157、159、160、161、162、163、186、189及194；或(ii)118、119、120、122、210、211、212及213處具有多個取代。在一些實施例中，本發明之轉鐵蛋白受體結合多肽在如參照SEQ ID NO：1編號的一組胺基酸(iii)47、49、56、58、59、60、61、62及63；(iv)39、40、41、42、43、44、68、70、71及72；(v)41、42、43、44、45、65、66、67、69及73；或(vi)45、47、49、95、97、99、102、103及104處具有多個取代。一組中約四個至全部胺基酸位置可以經取代。出於本發明之目的，取代係參照SEQ ID NO：1確定。因此，若一個胺基酸不同於SEQ ID NO：1位置中之相應胺基酸，則認為該胺基酸為取代，即使該胺基酸係存在於天然存在之CH3或CH2結構域多肽中該位置處。
本文亦提供產生轉鐵蛋白受體結合多肽的方法，該等方法係藉由產生在(i)組、(ii)組、(iii)組、(iv)組、(v)組或(vi)組之多個位置處具有取代的變異體多肽實現。可以分析該等變異體之轉鐵蛋白受體結合且如本文所描述，使其進一步突變以增強結合。
在另一態樣中，本文提供治療方法及使用轉鐵蛋白受體結合多肽使組成物靶向轉鐵蛋白受體表現細胞，例如將該組成物遞送至該細胞，或跨內皮，諸如跨血腦屏障遞送組成物的方法。
除非上下文另作清楚規定，否則如本文所使用，單數形式「一個(種)」及「該」包括複數個(種)指示物。因此，例如，提及「一多肽」可以包括兩個或兩個以上此類分子，及類似表述。
如本文所使用，術語「約」及「大約」當用於修飾以數字值或範圍指定之量時指示，該數字值以及熟習此項技術者已知的與該值之合理偏差，例如± 20%、± 10%或±5%係在所述值之預定含義內。
如本發明上下文中所使用，術語「轉鐵蛋白受體」或「TfR」係指轉鐵蛋白受體蛋白質1。人類轉鐵蛋白受體1多肽序列陳述於SEQ ID NO：235中。亦已知來自其他物種之轉鐵蛋白受體蛋白質1(例如，黑猩猩，寄存編號XP_003310238.1；獼猴，NP_001244232.1；狗，NP_001003111.1；牛，NP_001193506.1；小鼠，NP_035768.1；大鼠，NP_073203.1；及雞，NP_990587.1)。術語「轉鐵蛋白受體」亦涵蓋由位於轉鐵蛋白受體蛋白質1染色體基因座處之基因編碼的例示性參考序列，例如人類序列的等位基因變異體。全長轉鐵蛋白受體蛋白質包括短N末端細胞內區域、跨膜區及大細胞外結構域。該細胞外結構域係以三個結構域表徵：蛋白酶樣結構域、螺旋結構域及頂端結構域。人類轉鐵蛋白受體1之頂端結構域序列陳述於SEQ ID NO：107中。
如本文所使用，術語「CH3結構域」及「CH2結構域」係指免疫球蛋白恆定區結構域多肽。在IgG抗體之情況下，CH3結構域多肽係指如根據EU編號方案編號由自約341位至約447位之胺基酸構成的區段，且CH2結構域多肽係指如根據EU編號方案編號由自約231位至約340位之胺基酸構成的區段。CH2及CH3結構域多肽亦可利用IMGT(ImMunoGeneTics)編號方案編號，其中根據IMGT Scientific圖表編號(IMGT網站)，CH2結構域編號係1-110且CH3結構域編號係1-107。CH2及CH3結構域係免疫球蛋白Fc區之一部分。在IgG抗體之情況下，Fc區係指如根據EU編號方案編號，由自約231位至約447位之胺 基酸構成的區段。如本文所使用，術語「Fc區」亦可包括抗體鉸鏈區之至少一部分。示例性鉸鏈區序列陳述於SEQ ID NO：234中。
關於CH3或CH2結構域之術語「野生型」、「天然」及「天然存在」在本文中用於指具有自然界中存在之序列的結構域。
在本發明之上下文中，關於突變多肽或突變聚核苷酸之術語「突變體」與「變異體」可互換使用。關於給定野生型CH3或CH2結構域參考序列之變異體可以包括天然存在之等位基因變異體。「非天然」存在之CH3或CH2結構域係指在自然界中不存在於細胞中且由例如使用基因工程技術或誘變技術基因修飾天然CH3結構域或CH2結構域聚核苷酸或多肽產生的變異或突變結構域。「變異體」包括相對於野生型含有至少一個胺基酸突變的任何結構域。突變可以包括取代、插入及缺失。
術語「胺基酸」係指天然存在及合成之胺基酸以及以類似於天然存在胺基酸的方式起作用的胺基酸類似物及胺基酸模擬物。
天然存在之胺基酸係由遺傳密碼編碼之胺基酸，以及隨後經修飾之胺基酸，例如羥脯胺酸、γ-羧基麩胺酸及O-磷酸絲胺酸。「胺基酸類似物」係指具有與天然存在之胺基酸相同的基本化學結構(亦即，α碳結合至氫、羧基、胺基及R基團)的化合物，例如高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶。該等類似物具有經修飾之R基團(例如正白胺酸)或經修飾之肽骨架，但保留與天然存在之胺基酸相同之基本化學結構。「胺基酸模擬物」係指具有不同於胺基酸之一般化學結構之結構但以類似於天然存在胺基酸之方式作用的化合物。
天然存在之α-胺基酸包括但不限於，丙胺酸(Ala)、半胱胺酸(Cys)、天冬胺酸(Asp)、麩胺酸(Glu)、苯丙胺酸(Phe)、甘胺酸(Gly)、組胺酸(His)、異白胺酸(Ile)、精胺酸(Arg)、離胺酸(Lys)、白胺酸(Leu)、甲硫胺酸(Met)、天冬醯胺 (Asn)、脯胺酸(Pro)、麩醯胺酸(Gln)、絲胺酸(Ser)、蘇胺酸(Thr)、纈胺酸(Val)、色胺酸(Trp)、酪胺酸(Tyr)及其組合。天然存在之α-胺基酸的立體異構體包括但不限於，D-丙胺酸(D-Ala)、D-半胱胺酸(D-Cys)、D-天冬胺酸(D-Asp)、D-麩胺酸(D-Glu)、D-苯丙胺酸(D-Phe)、D-組胺酸(D-His)、D-異白胺酸(D-Ile)、D-精胺酸(D-Arg)、D-離胺酸(D-Lys)、D-白胺酸(D-Leu)、D-甲硫胺酸(D-Met)、D-天冬醯胺(D-Asn)、D-脯胺酸(D-Pro)、D-麩醯胺酸(D-Gln)、D-絲胺酸(D-Ser)、D-蘇胺酸(D-Thr)、D-纈胺酸(D-Val)、D-色胺酸(D-Trp)、D-酪胺酸(D-Tyr)及其組合。
胺基酸在本文中可以其通常已知之三字母符號或由IUPAC-IUB生物化學命名委員會(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)所推薦的單字母符號提及。
術語「多肽」、「肽」與「蛋白質」在本文中可互換使用，指胺基酸殘基之聚合物。該等術語適用於一或多個胺基酸殘基為相應天然存在胺基酸之人造化學模擬物的胺基酸聚合物，且亦適用於天然存在之胺基酸聚合物及非天然存在之胺基酸聚合物。胺基酸聚合物可以僅包含L-胺基酸、僅包含D-胺基酸，或包含L及D胺基酸之混合物。
術語「保守取代」、「保守突變」或「保守修飾之變異體」係指用可以歸類為具有類似特徵的一個胺基酸取代另一胺基酸的改變。以此方式界定之保守胺基酸群組之類別的實例可以包括：「帶電/極性組」，包括Glu(麩胺酸或E)、Asp(天冬胺酸或D)、Asn(天冬醯胺或N)、Gln(麩醯胺酸或Q)、Lys(離胺酸或K)、Arg(精胺酸或R)及His(組胺酸或H)；「芳族胺基酸組」，包括Phe(苯丙胺酸或F)、Tyr(酪胺酸或Y)、Trp(色胺酸或W)及(組胺酸或H)；及「脂族胺基酸組」，包括Gly(甘胺酸或G)、Ala(丙胺酸或A)、Val(纈胺酸或V)、Leu(白胺酸或L)、Ile(異白胺酸或I)、Met(甲硫胺酸或M)、Ser(絲胺酸或S)、Thr(蘇胺酸或T)及Cys(半胱胺酸或C)。在各組內，亦可鑑別出亞組。舉例而言， 帶電或極性胺基酸組可以細分成數個亞組，包括：「帶正電亞組」，包含Lys、Arg及His；「帶負電亞組」，包含Glu及Asp；及「極性亞組」，包含Asn及Gln。在另一實例中，芳族或環狀胺基酸組可以細分成包括以下亞組：「氮環亞組」，包含Pro、His及Trp；及「苯基亞組」，包含Phe及Tyr。在又另一實例中，脂族胺基酸組可以細分成數個亞組，例如「脂族非極性亞組」，包含Val、Leu、Gly及Ala；及「脂族低極性亞組」，包含Met、Ser、Thr及Cys。保守突變之類別的實例包括在以上亞組內之胺基酸的胺基酸取代，諸如但不限於：Lys取代Arg或反之亦然，由此可以維持正電荷；Glu取代Asp或反之亦然，由此可以維持負電荷；Ser取代Thr或反之亦然，由此可以維持游離-OH；及Gln取代Asn或反之亦然，由此可以維持游離-NH2。在一些實施例中，用疏水性胺基酸取代例如活性位點中的天然存在之疏水性胺基酸，以保持疏水性。
在兩個或兩個以上多肽序列之情形中，術語「一致」或「一致性」百分比係指當比較及在比較窗或指定區域內對準以達到最大對應性時，如使用序列比較演算法或藉由手動比對及目測檢查所量測的相同或在指定區域內具有指定百分比之胺基酸殘基一致，例如至少60%一致性、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%或更高百分比一致性的兩個或兩個以上序列或子序列。
對於多肽之序列比較，典型地一個序列充當參考序列，用以與候選序列相比較。對準可以使用熟習此項技術者可用之各種方法，例如目測對準或使用公開可用之軟體，使用已知演算法進行，以實現最大對準性。此類程式包括BLAST程式、ALIGN、ALIGN-2(Genentech,South San Francisco,Calif.)或Megalign(DNASTAR)。用於對準達到最大對準性的參數可以由熟習此項技術者決定。出於本申請案之目的，對於多肽序列之序列比較，使用以預設參數比對兩個蛋白質序列的BLASTP演算法標準蛋白質BLAST。
當用於標識多肽序列中之給定胺基酸殘基時，術語「對應於」、「參照......確定」或「參照......編號」係指當將給定胺基酸序列與指定參考序列最大程度地對準並進行比較時，該參考序列中殘基之位置。因此，例如，當與SEQ ID NO：1最佳地對準時，在多肽中之胺基酸殘基與SEQ ID NO：1中之胺基酸對準的情況下，該殘基「對應於」SEQ ID NO：1中胺基酸114-220之區域中的胺基酸。與參考序列對準之多肽的長度無需與參考序列相同。
如本文所使用，「結合親和力」係指兩個分子，例如一個多肽上之單一結合位點與其所結合之靶，例如轉鐵蛋白受體之間的非共價相互作用之強度。因此，除非另外指示或自上下文清楚可見，否則例如，該術語可以指多肽與其靶之間之1：1相互作用。結合親和力可以藉由量測平衡解離常數(KD)定量，該平衡解離常數係指解離速率常數(kd，時間-1)除以締合速率常數(ka，時間-1 M-1)。KD可以藉由例如使用表面電漿共振(SPR)法，例如BiacoreTM系統；動力學排除檢定，諸如KinExA®；及生物膜層干涉法(例如使用ForteBio® Octet®平台)量測複合物形成及解離的動力學確定。如本文所使用，「結合親和力」不僅包括形式上的結合親和力，諸如反映多肽與其靶之間之1：1相互作用的結合親和力，而且亦包括表觀親和力，對於表觀親和力，計算的KD可以反映所希望之結合。
當提及如本文所描述的包含經修飾CH3及/或經修飾CH2結構域之多肽時，片語「特異性結合」或「選擇性結合」至靶，例如轉鐵蛋白受體係指使該多肽以比其結合至結構不同之靶，例如不存在於轉鐵蛋白受體家族中之靶更高的親和力、更高的親合力及/或更長的持續時間結合至該靶的結合反應。在典型實施例中，當在相同親和力檢定條件下檢定時，該多肽對轉鐵蛋白受體之親和力係對不相關靶之親和力的至少5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、25倍、50倍或100倍，或更高倍數。在一些實施例中，經修飾CH3及/或經修飾CH2結構域多肽特異性結合至轉鐵蛋白受體上各物種間保守，例如在非 人類靈長類動物與人類物種之間保守的抗原決定基。在一些實施例中，多肽只能結合至人類轉鐵蛋白受體。
術語「受試者」、「個體」及「患者」在本文中可互換使用，意思指哺乳動物，包括但不限於人類、非人類靈長類動物、囓齒動物(例如大鼠、小鼠及天竺鼠)、兔、牛、豬、馬及其他哺乳動物物種。在一個實施例中，患者係人類。
術語「治療(treatment)、「治療(treating)」及類似表述在本文中一般用於指獲得所需藥理學及/或生理學作用。「治療」可以指在治療或改善損傷、疾病或病症方面的任何成功指標，包括任何客觀或主觀參數，諸如消除、緩解、患者存活期之改善、存活時間或存活率增加、減輕症狀或使患者更易忍受該損傷、疾病或病症、減慢退化或減退之速率，或改善患者之身體或精神健康。症狀之治療或改善可以基於客觀或主觀參數。治療效果可以與未接受該治療之一位個體或一組個體，或與同一患者在治療前或在治療期間之不同時間的狀況相比較。
術語「醫藥學上可接受之賦形劑」係指在生物學上或藥理學上適合用於人類或動物的非活性醫藥成分，諸如但不限於緩衝劑、載劑或防腐劑。
如本文所使用，一種藥劑之「治療量」或「治療有效量」係治療、減輕、消除受試者疾病，或降低疾病症狀之嚴重程度的藥劑量。「治療量」或「治療有效量」之藥劑可以改善患者存活狀況；增加存活時間或存活率；減輕症狀；使損傷、疾病或病症更易忍受；減慢退化或減退之速率；或改善患者之身體或精神健康。
術語「投予」係指將藥劑、化合物或組成物遞送至所希望之生物作用部位的方法。該等方法包括但不限於，表面遞送、非經腸遞送、靜脈內遞送、皮內遞送、肌肉內遞送、鞘內遞送、結腸遞送、直腸遞送或腹膜內遞送。在一 個實施例中，本文所描述之多肽係經靜脈內投予。
本節描述結合至轉鐵蛋白受體且能夠跨血腦屏障(BBB)轉運的根據本發明之多肽之產生。
在一個態樣中，提供包含CH3或CH2結構域之多肽，該等CH3或CH2結構域具有允許該等多肽特異性結合至轉鐵蛋白受體之修飾。該等修飾係引入在CH3或CH2結構域之表面處存在的指定組之胺基酸。在一些實施例中，包含經修飾CH3或CH2結構域之多肽特異性結合至轉鐵蛋白受體之頂端結構域中的抗原決定基。
熟習此項技術者應理解，可以藉由鑑別其他免疫球蛋白同型，例如IgM、IgA、IgE、IgD等之CH2及CH3結構域中對應於本文所述(i)-(vi)組之胺基酸，以類似方式修飾該等結構域。亦可對來自其他物種，例如非人類靈長類動物、猴、小鼠、大鼠、兔、狗、豬、雞及類似物種之免疫球蛋白中的相應結構域進行修飾。
在一些實施例中，經修飾之結構域係人類IgCH3結構域，諸如IgGCH3結構域。該CH3結構域可以屬於任何IgG亞型，亦即，來自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在IgG抗體之情況下，CH3結構域係指如根據EU編號方案編號，由自約341位至約447位之胺基酸構成的區段。除非另作說明，否則出於鑑別用於轉鐵蛋白受體結合之相應胺基酸位置組的目的，CH3結構域中之位置係參照SEQ ID NO：3確定或參照SEQ ID NO：1之胺基酸114-220確定。取代亦係參照SEQ ID NO：1確定，亦即，相對於在SEQ ID NO：1中相應位置處之胺基酸，考慮擬取代之胺基酸。SEQ ID NO：1包括部分鉸鏈區序列，即PCP，作為胺基酸1-3。參照SEQ ID NO：1進行的CH3結構域中各位置之編號包括前三個胺基酸。
如以上所指示，CH3結構域中可以根據本發明修飾的殘基組在本文中係參照SEQ ID NO：1編號。任何CH3結構域，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4CH3結構域可以在對應於SEQ ID NO：1中所述位置處之殘基的一或多組殘基中具有修飾，例如胺基酸取代。SEQ ID NO：1之人類IgG1胺基酸序列與人類IgG2、IgG3及IgG4的比對顯示於圖38中。該等IgG2、IgG3及IgG4序列中之每一序列中對應於SEQ ID NO：1之任何給定位置的位置可以容易地確定。
在一個實施例中，特異性結合轉鐵蛋白受體之經修飾CH3結構域多肽結合至該轉鐵蛋白受體之頂端結構域中包含全長人類轉鐵蛋白受體序列(SEQ ID NO：235)之208位的抗原決定基，該位置對應於SEQ ID NO：107中所陳述之人類轉鐵蛋白受體頂端結構域序列之11位。SEQ ID NO：107對應於人類轉鐵蛋白受體-1 uniprotein序列P02786(SEQ ID NO：235)的胺基酸198-378。在一些實施例中，經修飾CH3結構域多肽結合至轉鐵蛋白受體之頂端結構域中包含全長人類轉鐵蛋白受體序列(SEQ ID NO：235)之位置158、188、199、207、208、209、210、211、212、213、214、215及/或294的抗原決定基。該經修飾CH3結構域多肽可以結合至轉鐵蛋白受體，同時不阻斷或以其他方式抑制轉鐵蛋白與該受體之結合。在一些實施例中，轉鐵蛋白與TfR之結合大體上不受抑制。在一些實施例中，對於轉鐵蛋白與TfR之結合的抑制作用低於約50%(例如低於約45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%或5%)。在一些實施例中，對於轉鐵蛋白與TfR之結合的抑制作用低於約20%(例如低於約19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%)。展現此結合特異性的示例性CH3結構域多肽包括在如參照SEQ ID NO：1之胺基酸114-220所確定的位置157、159、160、161、162、163、186、189及194處具有胺基酸取代的多肽。
在一些實施例中，根據本發明之經修飾CH3結構域多肽在包含157、159、160、161、162、163、186、189及194的一組胺基酸位置(i組)中包含至少三個或至少四個，且典型地五個、六個、七個、八個或九個取代。可以在該等位置處引入之示例性取代顯示於表6中。在一些實施例中，161位及/或194位之胺基酸係芳族胺基酸，例如Trp、Phe或Tyr。在一些實施例中，161位之胺基酸係Trp。在一些實施例中，161位之胺基酸係Gly。在一些實施例中，194位之芳族胺基酸係Trp或Phe。
在一些實施例中，特異性結合轉鐵蛋白受體之經修飾CH3結構域多肽相對於SEQ ID NO：1，包含如下所示的至少一個具有取代的位置：在157位之Leu、Tyr、Met或Val；在159位之Leu、Thr、His或Pro；在160位之Val、Pro或酸性胺基酸；在161位之芳族胺基酸，例如Trp或Gly(例如Trp)；在162位之Val、Ser或Ala；在186位之酸性胺基酸、Ala、Ser、Leu、Thr或Pro；在189位之Thr或酸性胺基酸；或在194位之Trp、Tyr、His或Phe。在一些實施例中，經修飾CH3結構域多肽可以在該組之一或多個位置處包含特定胺基酸之保守取代，例如在同一帶電分組、疏水性分組、側鏈環結構分組(例如芳族胺基酸)或大小分組，及/或極性或非極性分組中之胺基酸。因此，例如，Ile可以存在於157位、159位及/或186位。在一些實施例中，在位置160、186及189中之一個、兩個或所有位置處的酸性胺基酸係Glu。在其他實施例中，在位置160、186及189中之一個、兩個或所有位置處的酸性胺基酸係Asp。在一些實施例中，在位置157、159、160、161、162、186、189及194中之兩個、三個、四個、五個、六個、七個或全部八個位置具有如本段中所說明之胺基酸取代。
在一些實施例中，在(i)組中具有修飾之CH3結構域多肽包含163位之天然Asn。在一些實施例中，經修飾CH3結構域多肽在163位包含Gly、His、Gln、Leu、Lys、Val、Phe、Ser、Ala或Asp。在一些實施例中，該經修飾CH3 結構域多肽進一步在包含153、164、165及188之位置處包含一個、兩個、三個或四個取代。在一些實施例中，Trp、Tyr、Leu或Gln可以存在於153位。在一些實施例中，Ser、Thr、Gln或Phe可以存在於164位。在一些實施例中，Gln、Phe或His可以存在於165位。在一些實施例中，Glu可以存在於188位。
在一些實施例中，經修飾CH3結構域多肽包含選自以下之兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個位置：在153位之Trp、Leu或Glu；在157位之Tyr或Phe；在159位之Thr；在160位之Glu；在161位之Trp；在162位之Ser、Ala、Val或Asn；在163位之Ser或Asn；在186位之Thr或Ser；在188位之Glu或Ser；在189位之Glu；及/或在194位之Phe。在一些實施例中，經修飾CH3結構域多肽包含如下全部十一個位置：在153位之Trp、Leu或Glu；在157位之Tyr或Phe；在159位之Thr；在160位之Glu；在161位之Trp；在162位之Ser、Ala、Val或Asn；在163位之Ser或Asn；在186位之Thr或Ser；在188位之Glu或Ser；在189位之Glu；及/或在194位之Phe。
在一些實施例中，經修飾CH3結構域多肽包含在157位之Leu或Met；在159位之Leu、His或Pro；在160位之Val；在161位之Trp；在162位之Val或Ala；在186位之Pro；在189位之Thr；及/或在194位之Trp。在一些實施例中，經修飾CH3結構域多肽進一步包含在164位之Ser、Thr、Gln或Phe。在一些實施例中，經修飾CH3結構域多肽進一步包含在153位之Trp、Tyr、Leu或Gln及/或在165位之Gln、Phe或His。在一些實施例中，Trp存在於153位及/或Gln存在於165位。在一些實施例中，經修飾CH3結構域多肽在153位不具有Trp。
在其他實施例中，經修飾CH3結構域多肽包含在157位之Tyr；在159位之Thr；在160位之Glu或Val；在161位之Trp；在162位之Ser；在186位之Ser或Thr；在189位之Glu；及/或在194位之Phe。在一些實施例中，經 修飾CH3結構域多肽包含在163位之天然Asn。在一些實施例中，經修飾CH3結構域多肽進一步包含在153位之Trp、Tyr、Leu或Gln；及/或在188位之Glu。在一些實施例中，經修飾CH3結構域多肽進一步包含在153位之Trp及/或在188位之Glu。
在一些實施例中，經修飾CH3結構域包含以下取代中之一或多個：在153位之Trp；在159位之Thr；在161位之Trp；在162位之Val；在186位之Ser或Thr；在188位之Glu；及/或在194位之Phe。
在另外的實施例中，該經修飾CH3結構域進一步包含選自以下之一個、兩個或三個位置：187位係Lys、Arg、Gly或Pro；197位係Ser、Thr、Glu或Lys；及199位係Ser、Trp或Gly。
在一些實施例中，特異性結合轉鐵蛋白受體之經修飾CH3結構域多肽與SEQ ID NO：4-29、236-299及422-435中任一個之胺基酸114-220具有至少70%一致性、至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，此類經修飾CH3結構域多肽包含SEQ ID NO：4-29、236-299及422-435中任一個之胺基酸157-163及/或186-194。在一些實施例中，此類經修飾CH3結構域多肽包含SEQ ID NO：4-29、236-299及422-435中任一個之胺基酸153-163及/或186-194。在一些實施例中，經修飾CH3結構域多肽包含SEQ ID NO：4-29、236-299及422-435中任一個之胺基酸153-163及/或186-199。
在一些實施例中，特異性結合轉鐵蛋白受體之經修飾CH3結構域多肽與SEQ ID NO：1之胺基酸114-220具有至少70%一致性、至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性，其限制條件為一致性百分比不包括該組位置157、159、160、161、162、163、186、189及194。在一些實施例中，該經修飾CH3結構域多肽包含如SEQ ID NO：4-29、 236-299及422-435中任一個所陳述之胺基酸157-163及/或胺基酸186-194。
在一些實施例中，經修飾CH3結構域多肽與SEQ ID NO：4-29、236-299及422-435中之任一個具有至少70%一致性、至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性，其限制條件為對應於SEQ ID NO：4-29、236-299及422-435中之任一個之位置153、157、159、160、161、162、163、164、165、186、187、188、189、194、197及199的位置中有至少五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、十三個、十四個、十五個或十六個未缺失或未經取代。
在一些實施例中，經修飾CH3結構域多肽與SEQ ID NO：4-29、236-299及422-435中之任一個具有至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性，且亦包含如下位置中之至少五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、十三個、十四個、十五個或十六個：在153位之Trp、Tyr、Leu、Gln或Glu；在157位之Leu、Tyr、Met或Val；在159位之Leu、Thr、His或Pro；在160位之Val、Pro或酸性胺基酸；在161位之芳族胺基酸，例如Trp；在162位之Val、Ser或Ala；在163位之Ser或Asn；在164位之Ser、Thr、Gln或Phe；在165位之Gln、Phe或His；在186位之酸性胺基酸、Ala、Ser、Leu、Thr或Pro；在187位之Lys、Arg、Gly或Pro；在188位之Glu或Ser；在189位之Thr或酸性胺基酸；在194位之Trp、Tyr、His或Phe；在197位之Ser、Thr、Glu或Lys；及在199位之Ser、Trp或Gly。
在一些實施例中，根據本發明之經修飾CH3結構域多肽在包含153、157、159、160、162、163、186、188、189、194、197及199之一組胺基酸位置處包含一或多個取代；且其中該等取代及該等位置係參照SEQ ID NO：13之序列確定。在一些實施例中，該經修飾CH3結構域包含在153位之Glu、Leu、Ser、Val、Trp或Tyr；在157位之芳族胺基酸(例如Tyr、Phe或Trp)、Met、Pro或 Val；在159位之Thr、Asn或Val；在160位之Glu、Ile、Pro或Val；在162位之脂族胺基酸(例如Ala、Ile或Val)、Ser或Thr；在163位之Ser、Asn、Arg或Thr；在186位之Thr、His或Ser；在188位之Glu、Ser、Asp、Gly、Thr、Pro、Gln或Arg；在189位之Glu或Arg；在194位之Phe、His、Lys、Tyr或Trp；在197位之Ser、Thr或Trp；及在199位之Ser、Cys、Pro、Met或Trp。經修飾CH3結構域多肽可以具有序列：GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVX1WESX2GX3X4WX5X6YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVX7KX8X9WQQGX10VFX11CX12VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：556)，其中X1係E、L、S、V、W或Y；X2係芳族胺基酸(例如Y、F或W)、M、P或V；X3係T、N或V；X4係E、I、P或V；X5係脂族胺基酸(例如A、I或V)、S或T；X6係S、N、R或T；X7係T、H或S；X8係E、S、D、G、T、P、Q或R；X9係E或R；X10係F、H、K、Y或W；X11係S、T或W；且X12係S、C、P、M或W。在某些實施例中，經修飾CH3結構域多肽可以包含序列：X1WESX2GX3X4WX5X6(SEQ ID NO：554)，其中X1係E、L、S、V、W或Y；X2係芳族胺基酸(例如Y、F或W)、M、P或V；X3係T、N或V；X4係E、I、P或V；X5係脂族胺基酸(例如A、I或V)、S或T；且X6係S、N、R或T。在某些實施例中，經修飾CH3結構域多肽可以包含序列：X1KX2X3WQQGX4VFX5CX6(SEQ ID NO：555)，其中X1係T、H或S；X2係E、S、D、G、T、P、Q或R；X3係E或R；X4係F、H、K、Y或W；X5係S、T或W；且X6係S、C、P、M或W。
在一些實施例中，該經修飾CH3結構域多肽包含在153位之Glu、Leu或Trp；在157位之芳族胺基酸；在159位之Thr；在160位之Glu；在162位之脂族胺基酸或Ser；在163位之Ser或Asn；在186位之Thr或Ser；在188位之Glu或Ser；在189位之Glu；在194位之Phe、His、Tyr或Trp；在197位 之Ser；及在199位之Ser，其中該等取代及該等位置係參照SEQ ID NO：13之序列確定。在特定實施例中，該在157位之芳族胺基酸係Tyr或Phe且該在162位之脂族胺基酸係Ala或Val。經修飾CH3結構域多肽可以具有序列：GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVX1WESX2GX3X4WX5X6YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVX7KX8X9WQQGX10VFX11CX12VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：559)，其中X1係E、L或W；X2係芳族胺基酸(例如Y或F)；X3係T；X4係E；X5係脂族胺基酸(例如A或V)或S；X6係S或N；X7係T或S；X8係E或S；X9係E；X10係F、H、Y或W；X11係S；且X12係S。在某些實施例中，經修飾CH3結構域多肽可以包含序列：X1WESX2GX3X4WX5X6(SEQ ID NO：557)，其中X1係E、L或W；X2係芳族胺基酸(例如Y或F)；X3係T；X4係E；X5係脂族胺基酸(例如A或V)或S；且X6係S或N。在某些實施例中，經修飾CH3結構域多肽可以包含序列：X1KX2X3WQQGX4VFX5CX6(SEQ ID NO：558)，其中X1係T或S；X2係E或S；X3係E；X4係F、H、Y或W；X5係S；且X6係S。
在另外的實施例中，該經修飾CH3結構域多肽可以包含在153位之Glu、Leu或Trp；在157位之Tyr或Phe；在159位之Thr；在160位之Glu；在162位之Ala、Val或Ser；在163位之Ser或Asn；在186位之Thr或Ser；在188位之Glu或Ser；在189位之Glu；在194位之Phe；在197位之Ser；及在199位之Ser，其中該等取代及該等位置係參照SEQ ID NO：13之序列確定。經修飾CH3結構域多肽可以具有序列：GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVX1WESX2GX3X4WX5X6YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVX7KX8X9WQQGX10VFX11CX12VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：562)，其中X1係E、L或W；X2係Y或F；X3係T；X4係E；X5係S、A或V；X6係S或N；X7係T或S；X8係E或S；X9 係E；X10係F；X11係S；且X12係S。在某些實施例中，經修飾CH3結構域多肽可以包含序列：X1WESX2GX3X4WX5X6(SEQ ID NO：560)，其中X1係E、L或W；X2係Y或F；X3係T；X4係E；X5係S、A或V；且X6係S或N。在某些實施例中，經修飾CH3結構域多肽可以包含序列：X1KX2X3WQQGX4VFX5CX6(SEQ ID NO：561)，其中X1係T或S；X2係E或S；X3係E；X4係F；X5係S；且X6係S。
在一些實施例中，根據本發明之經修飾CH3結構域多肽在包含153、157、159、160、162、163、186、188、189、194、197及199之一組胺基酸位置中僅包含一個取代；且其中該等取代及該等位置係參照SEQ ID NO：238之序列確定。在一些實施例中，經修飾CH3結構域多肽包含在153位之Glu、Leu、Ser、Val、Trp或Tyr。經修飾CH3結構域多肽可以包含在153位之Glu。經修飾CH3結構域多肽可以包含在153位之Leu。經修飾CH3結構域多肽可以包含在153位之Ser。經修飾CH3結構域多肽可以包含在153位之Val。經修飾CH3結構域多肽可以包含在153位之Trp。經修飾CH3結構域多肽可以包含在153位之Tyr。在一些實施例中，經修飾CH3結構域多肽包含在157位之Tyr、Phe、Trp、Met、Pro或Val。經修飾CH3結構域多肽可以包含在157位之Tyr。經修飾CH3結構域多肽可以包含在157位之Phe。經修飾CH3結構域多肽可以包含在157位之Trp。經修飾CH3結構域多肽可以包含在157位之Met。經修飾CH3結構域多肽可以包含在157位之Pro。經修飾CH3結構域多肽可以包含在157位之Val。在一些實施例中，經修飾CH3結構域多肽包含在159位之Thr、Asn或Val。經修飾CH3結構域多肽可以包含在159位之Thr。經修飾CH3結構域多肽可以包含在159位之Asn。經修飾CH3結構域多肽可以包含在159位之Val。在一些實施例中，經修飾CH3結構域多肽包含在160位之Glu、Ile、Pro或Val。經修飾CH3結構域多肽可以包含在160位之Glu。經修飾CH3結構域多肽可以 包含在160位之Ile。經修飾CH3結構域多肽可以包含在160位之Pro。經修飾CH3結構域多肽可以包含在160位之Val。在一些實施例中，經修飾CH3結構域多肽包含在162位之Ala、Ile、Val、Ser或Thr。經修飾CH3結構域多肽可以包含在162位之Ala。經修飾CH3結構域多肽可以包含在162位之Ile。經修飾CH3結構域多肽可以包含在162位之Val。經修飾CH3結構域多肽可以包含在162位之Ser。經修飾CH3結構域多肽可以包含在162位之Thr。在一些實施例中，經修飾CH3結構域多肽包含在163位之Ser、Asn、Arg或Thr。經修飾CH3結構域多肽可以包含在163位之Ser。經修飾CH3結構域多肽可以包含在163位之Asn。經修飾CH3結構域多肽可以包含在163位之Arg。經修飾CH3結構域多肽可以包含在163位之Thr。在一些實施例中，經修飾CH3結構域多肽包含在186位之Thr、His或Ser。經修飾CH3結構域多肽可以包含在186位之Thr。經修飾CH3結構域多肽可以包含在186位之His。經修飾CH3結構域多肽可以包含在186位之Ser。在一些實施例中，經修飾CH3結構域多肽包含在188位之Glu、Ser、Asp、Gly、Thr、Pro、Gln或Arg。經修飾CH3結構域多肽可以包含在188位之Glu。經修飾CH3結構域多肽可以包含在188位之Ser。經修飾CH3結構域多肽可以包含在188位之Asp。經修飾CH3結構域多肽可以包含在188位之Gly。經修飾CH3結構域多肽可以包含在188位之Thr。經修飾CH3結構域多肽可以包含在188位之Pro。經修飾CH3結構域多肽可以包含在188位之Gln。經修飾CH3結構域多肽可以包含在188位之Arg。在一些實施例中，經修飾CH3結構域多肽包含在189位之Glu或Arg。經修飾CH3結構域多肽可以包含在189位之Glu。經修飾CH3結構域多肽可以包含在189位之Arg。在一些實施例中，經修飾CH3結構域多肽包含在194位之Phe、His、Lys、Tyr或Trp。經修飾CH3結構域多肽可以包含在194位之Phe。經修飾CH3結構域多肽可以包含在194位之His。經修飾CH3結構域多肽可以包含在194位之Lys。經修飾 CH3結構域多肽可以包含在194位之Tyr。經修飾CH3結構域多肽可以包含在194位之Trp。在一些實施例中，經修飾CH3結構域多肽包含在197位之Ser、Thr或Trp。經修飾CH3結構域多肽可以包含在197位之Ser。經修飾CH3結構域多肽可以包含在197位之Thr。經修飾CH3結構域多肽可以包含在197位之Trp。在一些實施例中，經修飾CH3結構域多肽包含在199位之Ser、Cys、Pro、Met或Trp。經修飾CH3結構域多肽可以包含在199位之Ser。經修飾CH3結構域多肽可以包含在199位之Cys。經修飾CH3結構域多肽可以包含在199位之Pro。經修飾CH3結構域多肽可以包含在199位之Met。經修飾CH3結構域多肽可以包含在199位之Trp。經修飾CH3結構域多肽可以具有SEQ ID NO：563-574中任一個之序列。
在一些實施例中，根據本發明之經修飾CH3結構域多肽在包含153、157、159、160、162、163、164、186、189及194之一組胺基酸位置處包含一或多個取代；且其中該等取代及該等位置係參照SEQ ID NO：9之序列確定。在一些實施例中，該經修飾CH3結構域包含在153位之Glu或Trp；在157位之Val、Trp、Leu或Tyr；在159位之Leu、Pro、Phe、Thr或His；在160位之Pro、Val或Glu；在162位之Ala、Ser、Val或Gly；在163位之Leu、His、Gln、Gly、Val、Ala、Asn、Asp、Thr或Glu；在164位之Thr、Phe、Gln、Val或Tyr；在186位之Leu、Ser、Glu、Ala或Pro；在189位之Glu、Asp、Thr或Asn；及在194位之Trp、Tyr、Phe或His。經修飾CH3結構域多肽可以具有序列：GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVX1WESX2GX3X4WX5X6X7KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVX8KSX9WQQGX10VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：577)，其中X1係E或W；X2係V、W、L或Y；X3係L、P、F、T或H；X4係P、V或E；X5係A、S、V或G；X6係L、H、Q、G、V、AN、D、T或E；X7係T、F、Q、V或Y；X8係L、S、E、A或P；X9 係E、D、T或N；且X10係W、Y、H或F。在某些實施例中，經修飾CH3結構域多肽可以包含序列：X1WESX2GX3X4WX5X6X7(SEQ ID NO：575)，其中X1係E或W；X2係V、W、L或Y；X3係L、P、F、T或H；X4係P、V或E；X5係A、S、V或G；X6係L、H、Q、G、V、A、N、D、T或E；且X7係T、F、Q、V或Y。在某些實施例中，經修飾CH3結構域多肽可以包含序列：X1KSX2WQQGX3(SEQ ID NO：576)，其中X8係L、S、E、A或P；X9係E、D、T或N；且X10係W、Y、H或F。
在一些實施例中，該經修飾CH3結構域多肽包含在153位之Glu或Trp；在157位之Trp、Leu或Tyr；在159位之Thr或His；在160位之Val；在162位之Ala、Ser或Val；在163位之Val、Asn或Thr；在164位之Gln或Tyr；在186位之Pro；在189位之Thr或Asn；及在194位之Trp、Tyr、Phe或His，其中該等取代及該等位置係參照SEQ ID NO：9之序列確定。經修飾CH3結構域多肽可以具有序列：GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVX1WESX2GX3X4WX5X6X7KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVX8KSX9WQQGX10VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：580)，其中X1係E或W；X2係W、L或Y；X3係T或H；X4係V；X5係A、S或V；X6係V、T或N；X7係Y或Q；X8係P；X9係T或N；且X10係W、Y、H或F。在某些實施例中，經修飾CH3結構域多肽可以包含序列：X1WESX2GX3X4WX5X6X7(SEQ ID NO：578)，其中X1係E或W；X2係W、L或Y；X3係T或H；X4係V；X5係A、S或V；X6係V、T或N；且X7係Y或Q。在某些實施例中，經修飾CH3結構域多肽可以包含序列：X1KSX2WQQGX3(SEQ ID NO：579)，其中X1係P；X2係T或N；且X3係W、Y、H或F。
在一些實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽包含SEQ ID NO：116-130中任一個之胺基酸序列。在其他實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽包含SEQ ID NO：116-130中任一個之胺基酸序列，但其中有一個或兩個胺基酸經取代。在一些實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：116-130中任一個之胺基酸序列，但其中有三個胺基酸經取代。
在一些實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽包含SEQ ID NO：131-139中任一個之胺基酸序列。在其他實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽包含SEQ ID NO：131-139中任一個之胺基酸序列，但其中有一個或兩個胺基酸經取代。在一些實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：131-139中任一個之胺基酸序列，但其中有三個或四個胺基酸經取代。
在一些實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽包含SEQ ID NO：303-339中任一個之胺基酸序列。在其他實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽包含SEQ ID NO：303-339中任一個之胺基酸序列，但其中有一個或兩個胺基酸經取代。在一些實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：303-339中任一個之胺基酸序列，但其中有三個胺基酸經取代。
在一些實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽包含SEQ ID NO：136、138及340-345中任一個之胺基酸序列。在其他實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽包含SEQ ID NO：136、138及340-345中任一個之胺基酸序列，但其中有一個或兩個胺基酸經取代。在一些實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：136、138及340-345中任一個之胺基酸序列，但其中有三個或四個胺基酸經取代。
在另外的實施例中，轉鐵蛋白結合多肽包含SEQ ID NO：4-29、236-299及422-435中任一個之胺基酸157-194、胺基酸153-194或胺基酸153-199。在另外的實施例中，該多肽包含與SEQ ID NO：4-29、236-299及422-435中任一個之胺基酸157-194，或與SEQ ID NO：4-29、236-299及422-435中任一個之胺基酸153-194或胺基酸153-199具有至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：4-29、236-299及422-435中之任一個。在另外的實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：4-29、236-299及422-435中之任一個，但無胺基末端處之前三個胺基酸「PCP」。在另外的實施例中，該多肽可以與如在無胺基末端處之前三個胺基酸「PCP」情況下所測定的SEQ ID NO：4-29、236-299及422-435中之任一個具有至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。
在一些實施例中，根據本發明之經修飾CH3結構域多肽在包含118、119、120、122、210、211、212及213的一組胺基酸位置(ii組)中包含至少三個或至少四個，且典型地五個、六個、七個或八個取代。可以在該等位置處引入之示例性取代顯示於表5中。在一些實施例中，經修飾CH3結構域多肽包含在210位之Gly；在211位之Phe；及/或在213位之Asp。在一些實施例中，Glu係存在於213位。在某些實施例中，經修飾CH3結構域多肽包含在如下位置處之至少一個取代：在118位之Phe或Ile；在119位之Asp、Glu、Gly、Ala或Lys；在120位之Tyr、Met、Leu、Ile或Asp；在122位之Thr或Ala；在210位之Gly；在211位之Phe；在212位之His、Tyr、Ser或Phe；或在213位之Asp。在一些實施例中，在位置118、119、120、122、210、211、212及213中之兩個、三個、四個、五個、六個、七個或全部八個位置具有如本段中所說明之取代。在一些實施例中，經修飾CH3結構域多肽可以在該組之一或多個位置處包含特定胺基酸之保守取代，例如在同一帶電分組、疏水性分組、側鏈環結構分組(例如芳族胺基酸)或大小分組，及/或極性或非極性分組中之胺基酸。
在一些實施例中，特異性結合轉鐵蛋白受體之經修飾CH3結構域多肽與SEQ ID NO：30-46中任一個之胺基酸114-220具有至少70%一致性、至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95% 一致性。在一些實施例中，此類經修飾CH3結構域多肽包含SEQ ID NO：30-46中任一個之胺基酸118-122及/或胺基酸210-213。
在一些實施例中，經修飾CH3結構域多肽與SEQ ID NO：1之胺基酸114-220具有至少70%一致性、至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性，其限制條件為一致性百分比不包括該組位置118、119、120、122、210、211、212及213。在一些實施例中，該經修飾CH3結構域多肽包含如SEQ ID NO：30-46中任一個中所陳述的胺基酸118-122及/或胺基酸210-213。
在一些實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽包含SEQ ID NO：140-153中任一個之胺基酸序列。在其他實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽包含SEQ ID NO：140-153中任一個之胺基酸序列，但其中有一個或兩個胺基酸經取代。
在一些實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽包含SEQ ID NO：154-157中任一個之胺基酸序列。在其他實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽包含SEQ ID NO：154-157中任一個之胺基酸序列，但其中有一個胺基酸經取代或其中有兩個胺基酸經取代。
在另外的實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽包含SEQ ID NO：30-46中任一個之胺基酸118-213。在一些實施例中，該多肽可以包含與SEQ ID NO：30-46中任一個之胺基酸118-213具有至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：30-46中之任一個。在另外的實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：30-46中之任一個，但無胺基末端處之前三個胺基酸「PCP」。在另外的實施例中，該多肽可以與SEQ ID NO：30-46中之任一個或與如在無胺基末端處之前三個胺基酸「PCP」情況下所測定的SEQ ID NO：30-46中之任一個具有至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一 致性、至少90%一致性或至少95%一致性。
在一些實施例中，經修飾之結構域係人類IgCH2結構域，諸如IgGCH2結構域。該CH2結構域可以屬於任何IgG亞型，亦即，來自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在IgG抗體之情況下，CH2結構域係指如根據EU編號方案編號，由自約231位至約340位之胺基酸構成的區段。出於鑑別用於轉鐵蛋白受體結合之相應胺基酸位置組的目的，CH2結構域中之位置係參照SEQ ID NO：2確定或參照SEQ ID NO：1之胺基酸4-113確定。取代亦係參照SEQ ID NO：1確定，亦即，相對於在SEQ ID NO：1中相應位置處之胺基酸，考慮擬取代之胺基酸。SEQ ID NO：1包括部分鉸鏈區序列，即PCP，作為胺基酸1-3。該三個殘基並非Fc區之一部分；然而，參照SEQ ID NO：1進行的CH2結構域中各位置之編號包括該前三個胺基酸。
如以上所指示，CH2結構域中可以根據本發明修飾的殘基組在本文中係參照SEQ ID NO：l編號。任何CH2結構域，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4CH2結構域可以在對應於SEQ ID NO：1中所述位置處之殘基的一或多組殘基中具有修飾，例如胺基酸取代。SEQ ID NO：1之人類IgG1胺基酸序列與人類IgG2、IgG3及IgG4的比對顯示於圖38中。該等IgG2、IgG3及IgG4序列中之每一序列中對應於SEQ ID NO：1之任何給定位置的位置可以容易地確定。
在一個實施例中，特異性結合轉鐵蛋白受體之經修飾CH2結構域結合至轉鐵蛋白受體頂端結構域中之抗原決定基。人類轉鐵蛋白受體頂端結構域陳述於SEQ ID NO：107中，其對應於人類轉鐵蛋白受體-1 uniprotein序列P02786之胺基酸198-378。該經修飾CH2結構域多肽可以結合至轉鐵蛋白受體，同時不阻斷或以其他方式抑制轉鐵蛋白與該受體之結合。在一些實施例中，轉鐵蛋白與TfR之結合大體上不受抑制。在一些實施例中，對於轉鐵蛋白與TfR之結 合的抑制作用低於約50%(例如低於約45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%或5%)。在一些實施例中，對於轉鐵蛋白與TfR之結合的抑制作用低於約20%(例如低於約19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%)。
在一些實施例中，根據本發明之經修飾CH2結構域多肽在包含47、49、56、58、59、60、61、62及63的一組胺基酸位置(iii組)中包含至少三個或至少四個，且典型地五個、六個、七個、八個或九個取代。可以在該等位置處引入之示例性取代顯示於表1中。在一些實施例中，該經修飾CH2結構域多肽包含在60位之Glu及/或在61位之Trp。在一些實施例中，經修飾CH2結構域多肽包含在如下位置處之至少一個取代：在47位之Glu、Gly、Gln、Ser、Ala、Asn、Tyr或Trp；在49位之Ile、Val、Asp、Glu、Thr、Ala或Tyr；在56位之Asp、Pro、Met、Leu、Ala、Asn或Phe；在58位之Arg、Ser、Ala或Gly；在59位之Tyr、Trp、Arg或Val；在60位之Glu；在61位之Trp或Tyr；在62位之Gln、Tyr、His、Ile、Phe、Val或Asp；或在63位之Leu、Trp、Arg、Asn、Tyr或Val。在一些實施例中，在位置47、49、56、58、59、60、61、62及63中之兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個或全部九個位置具有如本段中所說明之取代。在一些實施例中，經修飾CH2結構域多肽可以在該組之一或多個位置處包含特定胺基酸之保守取代，例如在同一帶電分組、疏水性分組、側鏈環結構分組(例如芳族胺基酸)或大小分組，及/或極性或非極性分組中之胺基酸。
在一些實施例中，該經修飾CH2結構域多肽包含在47位之Glu、Gly、Gln、Ser、Ala、Asn或Tyr；在49位之Ile、Val、Asp、Glu、Thr、Ala或Tyr；在56位之Asp、Pro、Met、Leu、Ala或Asn；在58位之Arg、Ser或Ala；在 59位之Tyr、Trp、Arg或Val；在60位之Glu；在61位之Trp；在62位之Gln、Tyr、His、Ile、Phe或Val；及/或在63位之Leu、Trp、Arg、Asn或Tyr。在一些實施例中，該經修飾CH2結構域多肽包含在58位之Arg；在59位之Tyr或Trp；在60位之Glu；在61位之Trp；及/或在63位之Arg或Trp。
在一些實施例中，特異性結合轉鐵蛋白受體之經修飾CH2結構域多肽與SEQ ID NO：47-62中任一個之胺基酸4-113具有至少70%一致性、至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，此類經修飾CH2結構域多肽包含SEQ ID NO：47-62中任一個之胺基酸47-49及/或胺基酸56-63。
在一些實施例中，本發明之經修飾CH2結構域多肽與SEQ ID NO：1之胺基酸4-113具有至少70%一致性、至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性，其限制條件為一致性百分比不包括該組位置47、49、56、58、59、60、61、62及63。在一些實施例中，該經修飾CH2結構域多肽包含如SEQ ID NO：47-62中任一個中所陳述的胺基酸47-49及/或胺基酸56-63。
在一些實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽包含SEQ ID NO：158-171中任一個之胺基酸序列。在其他實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽包含SEQ ID NO：158-171中任一個之胺基酸序列，但其中有一個胺基酸經取代。
在一些實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽包含SEQ ID NO：172-186中任一個之胺基酸序列。在其他實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽包含SEQ ID NO：172-186中任一個之胺基酸序列，但其中有一個胺基酸經取代或其中有兩個胺基酸經取代。在其他實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽包含SEQ ID NO：172-186中任一個之胺基酸序列，但其中有三個或四個胺基酸經取代。
在另外的實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽包含SEQ ID NO：47-62 中任一個之胺基酸47-63。在一些實施例中，該多肽可以包含與SEQ ID NO：47-62中任一個之胺基酸47-63具有至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：47-62中之任一個。在另外的實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：47-62中之任一個，但無胺基末端處之前三個胺基酸「PCP」。在另外的實施例中，該多肽可以與SEQ ID NO：47-62中之任一個或與如在無胺基末端處之前三個胺基酸「PCP」情況下所測定的SEQ ID NO：47-62中之任一個具有至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。
在一些實施例中，根據本發明之經修飾CH2結構域多肽在包含39、40、41、42、43、44、68、70、71及72的一組胺基酸位置(iv組)中包含至少三個或至少四個，且典型地五個、六個、七個、八個、九個或十個取代。可以在該等位置處引入之示例性取代顯示於表2中。在一些實施例中，該經修飾CH2結構域多肽包含在43位之Pro、在68位之Glu及/或在70位之Tyr。在一些實施例中，經修飾CH2結構域多肽包含在如下位置處之至少一個取代：在39位之Pro、Phe、Ala、Met或Asp；在40位之Gln、Pro、Arg、Lys、Ala、Ile、Leu、Glu、Asp或Tyr；在41位之Thr、Ser、Gly、Met、Val、Phe、Trp或Leu；在42位之Pro、Val、Ala、Thr或Asp；在43位之Pro、Val或Phe；在44位之Trp、Gln、Thr或Glu；在68位之Glu、Val、Thr、Leu或Trp；在70位之Tyr、His、Val或Asp；在71位之Thr、His、Gln、Arg、Asn或Val；或在72位之Tyr、Asn、Asp、Ser或Pro。在一些實施例中，在位置39、40、41、42、43、44、68、70、71及72中之兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或全部十個位置具有如本段中所說明之取代。在一些實施例中，經修飾CH2結構域多肽 可以在該組之一或多個位置處包含特定胺基酸之保守取代，例如在同一帶電分組、疏水性分組、側鏈環結構分組(例如芳族胺基酸)或大小分組，及/或極性或非極性分組中之胺基酸。
在一些實施例中，經修飾CH2結構域多肽包含在39位之Pro、Phe或Ala；在40位之Gln、Pro、Arg、Lys、Ala或Ile；在41位之Thr、Ser、Gly、Met、Val、Phe或Trp；在42位之Pro、Val或Ala；在43位之Pro；在44位之Trp或Gln；在68位之Glu；在70位之Tyr；在71位之Thr、His或Gln；及/或在72位之Tyr、Asn、Asp或Ser。
在一些實施例中，經修飾CH2結構域多肽包含在39位之Met；在40位之Leu或Glu；在41位之Trp；在42位之Pro；在43位之Val；在44位之Thr；在68位之Val或Thr；在70位之His；在71位之His、Arg或Asn；及/或在72位之Pro。
在一些實施例中，經修飾CH2結構域多肽包含在39位之Asp；在40位之Asp；在41位之Leu；在42位之Thr；在43位之Phe；在44位之Gln；在68位之Val或Leu；在70位之Val；在71位之Thr；及/或在72位之Pro。
在一些實施例中，特異性結合轉鐵蛋白受體之經修飾CH2結構域多肽與SEQ ID NO：63-85中任一個之胺基酸4-113具有至少70%一致性、至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，此類經修飾CH2結構域多肽包含SEQ ID NO：63-85中任一個之胺基酸39-44及/或胺基酸68-72。
在一些實施例中，本發明之經修飾CH2結構域多肽與SEQ ID NO：1之胺基酸4-113具有至少70%一致性、至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性，其限制條件為一致性百分比不包括該組位置39、40、41、42、43、44、68、70、71及72。在一些實施例 中，該經修飾CH2結構域多肽包含如SEQ ID NO：63-85中任一個中所陳述的胺基酸39-44及/或胺基酸68-72。
在一些實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽包含SEQ ID NO：187-204中任一個之胺基酸序列。在其他實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽包含SEQ ID NO：187-204中任一個之胺基酸序列，但其中有一個或兩個胺基酸經取代。在其他實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽包含SEQ ID NO：187-204中任一個之胺基酸序列，但其中有三個胺基酸經取代。
在一些實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽包含SEQ ID NO：205-215中任一個之胺基酸序列。在其他實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽包含SEQ ID NO：205-215中任一個之胺基酸序列，但其中有一個胺基酸經取代或其中有兩個胺基酸經取代。
在另外的實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽包含SEQ ID NO：63-85中任一個之胺基酸39-72。在一些實施例中，該多肽包含與SEQ ID NO：63-85中任一個之胺基酸39-72具有至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：63-85中之任一個。在另外的實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：63-85中之任一個，但無胺基末端處之前三個胺基酸「PCP」。在另外的實施例中，該多肽可以與SEQ ID NO：63-85中之任一個或與如在無胺基末端處之前三個胺基酸「PCP」情況下所測定的SEQ ID NO：63-85中之任一個具有至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。
在一些實施例中，根據本發明之經修飾CH2結構域多肽在包含41、42、43、44、45、65、66、67、69及73的一組胺基酸位置(v組)中包含至少三 個或至少四個，且典型地五個、六個、七個、八個、九個或十個取代。可以在該等位置處引入之示例性取代顯示於表3中。在一些實施例中，經修飾CH2結構域多肽包含在如下位置處之至少一個取代：在41位之Val或Asp；在42位之Pro、Met或Asp；在43位之Pro或Trp；在44位之Arg、Trp、Glu或Thr；在45位之Met、Tyr或Trp；在65位之Leu或Trp；在66位之Thr、Val、Ile或Lys；在67位之Ser、Lys、Ala或Leu；在69位之His、Leu或Pro；或在73位之Val或Trp。在一些實施例中，在位置41、42、43、44、45、65、66、67、69及73中之兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或全部十個位置具有如本段中所說明之取代。在一些實施例中，經修飾CH2結構域多肽可以在該組之一或多個位置處包含特定胺基酸之保守取代，例如在同一帶電分組、疏水性分組、側鏈環結構分組(例如芳族胺基酸)或大小分組，及/或極性或非極性分組中之胺基酸。
在一些實施例中，經修飾CH2結構域多肽包含在41位之Val；在42位之Pro；在43位之Pro；在44位之Arg或Trp；在45位之Met；在65位之Leu；在66位之Thr；在67位之Ser；在69位之His；及/或在73位之Val。
在一些實施例中，經修飾CH2結構域多肽包含在41位之Asp；在42位之Met或Asp；在43位之Trp；在44位之Glu或Thr；在45位之Tyr或Trp；在65位之Trp；在66位之Val、Ile或Lys；在67位之Lys、Ala或Leu；在69位之Leu或Pro；及/或在73位之Trp。
在一些實施例中，特異性結合轉鐵蛋白受體之經修飾CH2結構域多肽與SEQ ID NO：86-90中任一個之胺基酸4-113具有至少70%一致性、至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，此類經修飾CH3結構域多肽包含SEQ ID NO：86-90中任一個之胺基酸41-45及/或胺基酸65-73。
在一些實施例中，本發明之經修飾CH2結構域多肽與SEQ ID NO：1之胺基酸4-113具有至少70%一致性、至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性，其限制條件為一致性百分比不包括該組位置41、42、43、44、45、65、66、67、69及73。在一些實施例中，該經修飾CH2結構域多肽包含如SEQ ID NO：86-90中任一個中所陳述的胺基酸41-45及/或胺基酸65-73。
在一些實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽包含SEQ ID NO：216-220中任一個之胺基酸序列。在其他實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽包含SEQ ID NO：216-220中任一個之胺基酸序列，但其中有一個或兩個胺基酸經取代。
在一些實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽包含SEQ ID NO：221-224中任一個之胺基酸序列。在其他實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽包含SEQ ID NO：221-224中任一個之胺基酸序列，但其中有一個胺基酸經取代或其中有兩個胺基酸經取代。在其他實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽包含SEQ ID NO：221-224中任一個之胺基酸序列，但其中有三個或四個胺基酸經取代。
在另外的實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽包含SEQ ID NO：86-90中任一個之胺基酸41-73。在另外的實施例中，該多肽可以包含與SEQ ID NO：86-90中任一個之胺基酸41-73具有至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：86-90中之任一個。在另外的實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：86-90中之任一個，但無胺基末端處之前三個胺基酸「PCP」。在另外的實施例中，該多肽可以與SEQ ID NO：86-90中之任一個或與如在無胺基末端處之前三個胺基酸「PCP」情況下所測定的SEQ ID NO：86-90中之任一個具有至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。
在一些實施例中，根據本發明之經修飾CH2結構域多肽在包含45、47、49、95、97、99、102、103及104的一組胺基酸位置(vi組)中包含至少三個或至少四個，且典型地五個、六個、七個、八個或九個取代。可以在該等位置處引入之示例性取代顯示於表4中。在一些實施例中，經修飾CH2結構域多肽在103位包含Trp。在一些實施例中，經修飾CH2結構域多肽包含在如下位置處之至少一個取代：在45位之Trp、Val、Ile或Ala；在47位之Trp或Gly；在49位之Tyr、Arg或Glu；在95位之Ser、Arg或Gln；在97位之Val、Ser或Phe；在99位之Ile、Ser或Trp；在102位之Trp、Thr、Ser、Arg或Asp；在103位之Trp；或在104位之Ser、Lys、Arg或Val。在一些實施例中，在位置45、47、49、95、97、99、102、103及104中之兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個或全部九個位置具有如本段中所說明之取代。在一些實施例中，經修飾CH2結構域多肽可以在該組之一或多個位置處包含特定胺基酸之保守取代，例如在同一帶電分組、疏水性分組、側鏈環結構分組(例如芳族胺基酸)或大小分組，及/或極性或非極性分組中之胺基酸。
在一些實施例中，經修飾CH2結構域多肽包含選自以下之兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個或九個位置：45位係Trp、Val、Ile或Ala；47位係Trp或Gly；49位係Tyr、Arg或Glu；95位係Ser、Arg或Gln；97位係Val、Ser或Phe；99位係Ile、Ser或Trp；102位係Trp、Thr、Ser、Arg或Asp；103位係Trp；及104位係Ser、Lys、Arg或Val。
在一些實施例中，經修飾CH2結構域多肽包含在45位之Val或Ile；在47位之Gly；在49位之Arg；在95位之Arg；在97位之Ser；在99位之Ser；在102位之Thr、Ser或Arg；在103位之Trp；及/或在104位之Lys或Arg。
在一些實施例中，特異性結合轉鐵蛋白受體之經修飾CH2結構域多 肽與SEQ ID NO：91-95中任一個之胺基酸4-113具有至少70%一致性、至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，此類經修飾CH3結構域多肽包含SEQ ID NO：91-95中任一個之胺基酸45-49及/或胺基酸95-104。
在一些實施例中，本發明之經修飾CH2結構域多肽與SEQ ID NO：1之胺基酸4-113具有至少70%一致性、至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性，其限制條件為一致性百分比不包括該組位置45、47、49、95、97、99、102、103及104。在一些實施例中，該經修飾CH2結構域多肽包含如SEQ ID NO：91-95中任一個中所陳述的胺基酸45-49及/或胺基酸95-104。
在一些實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽包含SEQ ID NO：225-228中任一個之胺基酸序列。在其他實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽包含SEQ ID NO：225-228中任一個之胺基酸序列，但其中有一個或兩個胺基酸經取代。
在一些實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽包含SEQ ID NO：229-233中任一個之胺基酸序列。在其他實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽包含SEQ ID NO：229-223中任一個之胺基酸序列，但其中有一個胺基酸經取代或其中有兩個胺基酸經取代。在其他實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽包含SEQ ID NO：229-233中任一個之胺基酸序列，但其中有三個、四個或五個胺基酸經取代。
在另外的實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽包含SEQ ID NO：91-95中任一個之胺基酸45-104。在另外的實施例中，該多肽可以與SEQ ID NO：91-95中任一個之胺基酸45-104具有至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。
在一些實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：91-95中之任一個。在另外的實施例中，該多肽包含SEQ ID NO：91-95中之任一個，但無胺基末端處之 前三個胺基酸「PCP」。在另外的實施例中，該多肽可以與SEQ ID NO：91-95中之任一個或與如在無胺基末端處之前三個胺基酸「PCP」情況下所測定的SEQ ID NO：91-95中之任一個具有至少75%一致性、至少80%一致性、至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。
本發明之經修飾CH3或CH2結構域多肽可以接合至Fc區之另一結構域。在一些實施例中，本發明之經修飾CH3結構域多肽接合至CH2結構域，該CH2結構域可以為天然存在之CH2結構域或變異體CH2結構域，典型地在該CH2結構域之C末端處。在一些實施例中，本發明之經修飾CH2結構域多肽接合至CH3結構域，該CH3結構域可以為天然存在之CH3結構域或CH3變異體結構域，典型地在該CH3結構域之N末端處。在一些實施例中，包含經修飾CH2結構域接合至CH3結構域之多肽，或包含經修飾CH3結構域接合至CH2結構域之多肽進一步包含抗體之部分或完整鉸鏈區，由此產生經修飾CH3結構域多肽或經修飾CH2結構域多肽作為具有部分或完整鉸鏈區之Fc區之一部分的形式。該鉸鏈區可以來自任何免疫球蛋白亞類或同型。示例性免疫球蛋白鉸鏈係IgG鉸鏈區，諸如IgG1鉸鏈區，例如人類IgG1鉸鏈區胺基酸序列EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：234)。在另外的實施例中，可以呈含有鉸鏈區或部分鉸鏈區之Fc形式的多肽進一步接合至另一部分，例如Fab片段，由此產生轉鐵蛋白受體結合Fc-Fab融合物。在一些實施例中，該轉鐵蛋白受體結合Fc-Fab融合物包含經修飾CH3結構域多肽或經修飾CH2結構域多肽、鉸鏈區及Fab片段。Fab片段可以針對任何所關注靶，例如治療性神經靶，在此情況下，藉由經修飾CH3結構域多肽或經修飾CH2結構域多肽結合至轉鐵蛋白受體所介導的跨血腦屏障穿胞運輸將Fab遞送至靶。
在一些實施例中，接合至轉鐵蛋白受體結合多肽的Fab片段可以結 合至τ蛋白(例如人類τ蛋白)或其片段。在一些實施例中，Fab片段可以結合至磷酸化τ蛋白、未磷酸化之τ蛋白、τ蛋白之剪接同功型、N末端截短之τ蛋白、C末端截短之τ蛋白及/或其片段。
在一些實施例中，接合至轉鐵蛋白受體結合多肽的Fab片段可以結合至β-分泌酶1(BACE1)蛋白(例如人類BACE1蛋白)或其片段。在一些實施例中，Fab片段可以結合至BACE1蛋白之一或多種同功型，或其片段。
在一些實施例中，接合至轉鐵蛋白受體結合多肽的Fab片段可以結合至骨髓細胞上表現之觸發受體2(TREM2)蛋白(例如人類TREM2蛋白)或其片段。
在一些實施例中，接合至轉鐵蛋白受體結合多肽的Fab片段可以結合至α-突觸核蛋白(例如人類α-突觸核蛋白)或其片段。在一些實施例中，Fab片段可以結合至單體α-突觸核蛋白、寡聚α-突觸核蛋白、α-突觸核蛋白原纖維、可溶性α-突觸核蛋白及/或其片段。
在一些實施例中，包含本發明之經修飾CH2或CH3結構域多肽的Fc-Fab融合物係二聚體之次單元。在一些實施例中，二聚體係異二聚體。在一些實施例中，二聚體係同二聚體。在一些實施例中，二聚體包含結合至轉鐵蛋白受體之單一多肽，亦即，對於轉鐵蛋白受體結合為單價的。在一些實施例中，二聚體包含結合至轉鐵蛋白受體之第二多肽。該第二多肽可以包含該Fc-Fab融合物中存在之相同經修飾CH3結構域多肽(或經修飾CH2結構域多肽)以提供二價結合同二聚體，或本發明之第二經修飾CH3結構域多肽(或經修飾CH2結構域多肽)可以提供第二轉鐵蛋白受體結合位點。在一些實施例中，二聚體包括含經修飾CH3結構域多肽或經修飾CH2結構域多肽的第一次單元，及含CH2及CH3結構域之第二次單元，該CH2及CH3結構域均不結合轉鐵蛋白受體。
轉鐵蛋白受體結合多肽亦可與除Fab外的不同所關注多肽融合。舉 例而言，在一些實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽可以與不同多肽融合，該不同多肽係靶向轉鐵蛋白受體表現細胞或藉由穿胞運輸跨內皮，例如血腦屏障遞送所需的。在一些實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽與可溶性蛋白質，例如受體或生長因子、細胞介素或酶的細胞外結構域融合。
在又其他實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽可以與可用於蛋白質純化的肽或蛋白質(例如聚組胺酸)、抗原決定基標籤(例如FLAG、c-Myc、血球凝集素標籤及類似物)、麩胱甘肽S轉移酶(GST)、硫氧還蛋白、蛋白質A、蛋白質G或麥芽糖結合蛋白(MBP)融合。在一些情況下，與轉鐵蛋白受體結合多肽融合的肽或蛋白質可以包含蛋白酶裂解位點，諸如因子Xa或凝血酶裂解位點。
本發明之轉鐵蛋白受體結合多肽例如基於多肽之形式，可以具有較寬範圍的結合親和力。舉例而言，在一些實施例中，包含經修飾CH3結構域或經修飾CH2結構域的多肽對轉鐵蛋白受體之結合親和力在1pM至10μM之範圍內。在一些實施例中，親和力可以按單價形式量測。在其他實施例中，親和力可以按二價形式，例如以包含多肽-Fab融合蛋白之二聚體形式量測。
用於分析結合親和力、結合動力學及交叉反應性之方法係此項技術中所知的。該等方法包括但不限於，固相結合檢定(例如ELISA檢定)、免疫沈澱法、表面電漿子共振(例如BiacoreTM(GE Healthcare,Piscataway,NJ))、動力學排除檢定(例如KinExA®)、流式細胞測量術、螢光活化細胞分選(FACS)、生物膜層干涉法(例如Octet®(FortéBio,Inc.,Menlo Park,CA))及西方墨點分析。在一些實施例中，使用ELISA測定結合親和力及/或交叉反應性。用於進行ELISA檢定之方法係此項技術中所知的，且在以下實例部分中亦有描述。在一些實施例中，使用表面電漿子共振(SPR)測定結合親和力、結合動力學及/或交叉反應性。在一些實施例中，使用動力學排除檢定測定結合親和力、結合動力學及/或交叉反應性。在一些實施例中，使用生物膜層干涉檢定測定結合親和力、結合動力學及/ 或交叉反應性。
本文所提供的經修飾成結合轉鐵蛋白受體且起始跨BBB轉運之多肽亦可包含另外的突變，例如以增加血清穩定性、調節效應子功能、影響糖基化、降低在人體中之免疫原性，及/或提供多肽之節及孔異二聚化。
在一些實施例中，根據本發明之多肽與相應的野生型Fc區(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)具有至少約75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性。
根據本發明之多肽亦可引入在指定胺基酸組範圍外之其他突變，例如以影響糖基化、增加血清半衰期，或對於CH3結構域，提供包含經修飾CH3結構域之多肽的節及孔異二聚化。一般而言，該方法涉及在第一多肽之界面處引入突起(「節」)且在第二多肽界面中引入相應空腔(「孔」)，由此該突起可以安置於空腔中以促進異二聚體形成且阻礙同二聚體形成。突起係藉由用較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)替代來自第一多肽之界面的小胺基酸側鏈來構築。藉由用較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)替代較大胺基酸側鏈，在第二多肽之界面中產生與該等突起相同或類似大小的補償性空腔。此類另外的突變係在多肽中對經修飾CH3或CH2結構域與轉鐵蛋白受體之結合不具有負面影響的位置。
在節及孔二聚化方法的一個示例性實施例中，待二聚化之第一Fc多肽次單元中對應於SEQ ID NO：1之139位的位置具有色胺酸替代天然蘇胺酸，且二聚體之第二Fc多肽在對應於SEQ ID NO：1之180位處具有纈胺酸替代天然酪胺酸。Fc多肽之第二次單元可以進一步包含取代，其中在對應於SEQ ID NO：1之139位之位置處的天然蘇胺酸經絲胺酸取代且在對應於SEQ ID NO：1之141位之位置處的天然白胺酸經丙胺酸取代。
本文所描述之多肽亦可經工程改造成含有針對異二聚化之其他修飾，例如CH3-CH3界面內接觸殘基之靜電工程改造，該等接觸殘基為天然地帶電或疏水補丁(patch)修飾。
在一些實施例中，可以引入增加血清半衰期之修飾。舉例而言，在一些實施例中，Fc區包括在對應於SEQ ID NO：1之25位的位置處包含Tyr、在對應於SEQ ID NO：1之27位的位置處包含Thr且在對應於SEQ ID NO：1之29位的位置處包含Glu的CH2結構域。
在一些實施例中，如參照SEQ ID NO：1所確定，在位置17-30、52-57、80-90、156-163及201-208中之一或多個位置處引入突變，例如取代。在一些實施例中，如參照SEQ ID NO：1所確定，在位置24、25、27、28、29、80、81、82、84、85、87、158、159、160、162、201、206、207或209處引入一或多個突變。在一些實施例中，如參照SEQ ID NO：1所確定，在25位、27位及29位中之一個、兩個或三個中引入突變。在一些實施例中，如參照SEQ ID NO：1所編號，該等突變係M25Y、S27T及T29E。在一些實施例中，本文所述之多肽進一步包含突變M25Y、S27T及T29E。在一些實施例中，如參照SEQ ID NO：1所確定，在201位及207位中之一個或兩個中引入突變。在一些實施例中，如參照SEQ ID NO：1所編號，該等突變係M201L及N207S。在一些實施例中，本文所述之多肽進一步包含N207S且存在或不存在M201L。在一些實施例中，如參照SEQ ID NO：1所編號，本文所述之多肽在位置T80、E153及N207中之一個、兩個或全部三個處包含取代。在一些實施例中，突變係T80Q及N207A。在一些實施例中，本文所述之多肽包含突變T80A、E153A及N207A。在一些實施例中，如參照SEQ ID NO：1所編號，本文所述之多肽在位置T23及M201處包含取代。在一些實施例中，本文所述之多肽包含突變T23Q及M201L。在一些實施例中，如參照SEQ ID NO：1所編號，本文所述之多肽在位置M201及N207處 包含取代。在一些實施例中，本文所述之多肽包含取代M201L及N207S。在一些實施例中，本文所述之多肽包含N207S或N207A取代。
在一些實施例中，包含經修飾CH2或CH3結構域之Fc區具有效應子功能，亦即，其能夠在結合至介導效應子功能之效應細胞上表現的Fc受體時誘導某些生物功能。效應細胞包括但不限於，單核細胞、巨噬細胞、嗜中性細胞、樹突狀細胞、嗜伊紅細胞、肥大細胞、血小板、B細胞、大顆粒淋巴細胞、郎格罕氏細胞(Langerhans' cell)、自然殺手(NK)細胞及細胞毒性T細胞。
抗體效應子功能之實例包括但不限於，C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞介導之吞噬作用(ADCP)、細胞表面受體(例如B細胞受體)下調及B細胞活化。效應子功能可以隨抗體類別而變化。舉例而言，天然人類IgG1及IgG3抗體在結合至免疫系統細胞上存在之適當Fc受體時能夠引起ADCC及CDC活性；且天然人類IgG1、IgG2、IgG3及IgG4在結合至免疫細胞上存在之適當Fc受體時能夠引起ADCP功能。
在一些實施例中，本文所述之多肽可以包括調節效應子功能的另外的修飾。或者，在一些實施例中，本發明的包含經修飾CH2或CH3結構域之多肽可以包括增強效應子功能的另外的修飾。
調節效應子功能之示例性Fc多肽突變包括但不限於，在CH2結構域中，例如對應於SEQ ID NO：1之7位及8位處之取代。在一些實施例中，在該經修飾CH2結構域中之取代包含在SEQ ID NO：1之7位及8位處Ala。在一些實施例中，在該經修飾CH2結構域中之取代包含在SEQ ID NO：1之7位及8位處Ala及在102位處之Gly。
調節效應子功能之另外的Fc多肽突變包括但不限於，在位置238、 265、269、270、297、327及329(EU編號方案，對應於如參照SEQ ID NO：1所編號的位置11、38、42、43、70、100及102)處的一或多個取代。示例性取代(如根據EU編號方案編號)包括以下：329位可以具有脯胺酸經甘胺酸或精胺酸或足夠大以破壞Fc/Fcγ受體界面之胺基酸殘基取代的突變，該Fc/Fcγ受體界面係形成於Fc之脯胺酸329與FcγRIII之色胺酸殘基Trp 87及Trp 110之間。另外的示例性取代包括S228P、E233P、L235E、N297A、N297D及P331S。亦可能存在多個取代，例如人類IgG1 Fc區之L234A及L235A；人類IgG1 Fc區之L234A、L235A及P329G；人類IgG4 Fc區之S228P及L235E；人類IgG1 Fc區之L234A及G237A；人類IgG1 Fc區之L234A、L235A及G237A；人類IgG2 Fc區之V234A及G237A；人類IgG4 Fc區之L235A、G237A及E318A；以及人類IgG4 Fc區之S228P及L236E。在一些實施例中，本發明之多肽可以具有一或多個調節ADCC之胺基酸取代，例如根據EU編號方案，在位置298、333及/或334處之取代。
在一些實施例中，本文所述之多肽可以具有一或多個增加或減弱ADCC之胺基酸取代或者可以具有改變C1q結合及/或CDC之突變。
本文所述之多肽(例如純系CH3C.35.20.1、CH3C.35.23.2、CH3C.35.23.3、CH3C.35.23.4、CH3C.35.21.17.2、CH3C.35.23、CH3C.35.21、CH3C.35.20.1.1、CH3C.23.2.1及CH3C.35.23.1.1中之任一個)可以包含另外的突變，包括節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))，及/或增加血清穩定性之突變(例如，(i)如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E，或(ii)如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)。
在一些實施例中，本文所述之多肽(例如純系CH3C.35.20.1、CH3C.35.23.2、CH3C.35.23.3、CH3C.35.23.4、CH3C.35.21.17.2、CH3C.35.23、CH3C.35.21、CH3C.35.20.1.1、CH3C.23.2.1及CH3C.35.23.1.1中之任一個)可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)且與SEQ ID NO：4-95、236-299及422-435中任一個之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有SEQ ID NO：4-95、236-299及422-435中任一個之序列的多肽可經修飾成具有節突變。
在一些實施例中，本文所述之多肽(例如純系CH3C.35.20.1、CH3C.35.23.2、CH3C.35.23.3、CH3C.35.23.4、CH3C.35.21.17.2、CH3C.35.23、CH3C.35.21、CH3C.35.20.1.1、CH3C.23.2.1及CH3C.35.23.1.1中之任一個)可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))且與SEQ ID NO：4-95、236-299及422-435中任一個之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有SEQ ID NO：4-95、236-299及422-435中任一個之序列的多肽可經修飾成具有節突變及調節效應子功能之突變。
在一些實施例中，本文所述之多肽(例如純系CH3C.35.20.1、CH3C.35.23.2、CH3C.35.23.3、CH3C.35.23.4、CH3C.35.21.17.2、CH3C.35.23、CH3C.35.21、CH3C.35.20.1.1、CH3C.23.2.1及CH3C.35.23.1.1中之任一個)可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、增加血清穩定性之突變(例如，(i)如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E，或(ii)如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)且與SEQ ID NO：4-95、236-299及422-435中任一個之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有SEQ ID NO：4-95、236-299及422-435中任一個 之序列的多肽可經修飾成具有節突變及增加血清穩定性之突變。
在一些實施例中，本文所述之多肽(例如純系CH3C.35.20.1、CH3C.35.23.2、CH3C.35.23.3、CH3C.35.23.4、CH3C.35.21.17.2、CH3C.35.23、CH3C.35.21、CH3C.35.20.1.1、CH3C.23.2.1及CH3C.35.23.1.1中之任一個)可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))、增加血清穩定性之突變(例如，(i)如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E，或(ii)如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)且與SEQ ID NO：4-95、236-299及422-435中任一個之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有SEQ ID NO：4-95、236-299及422-435中任一個之序列的多肽可經修飾成具有節突變、調節效應子功能之突變及增加血清穩定性之突變。
在一些實施例中，本文所述之多肽(例如純系CH3C.35.20.1、CH3C.35.23.2、CH3C.35.23.3、CH3C.35.23.4、CH3C.35.21.17.2、CH3C.35.23、CH3C.35.21、CH3C.35.20.1.1、CH3C.23.2.1及CH3C.35.23.1.1中之任一個)可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)且與SEQ ID NO：4-95、236-299及422-435中任一個之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有SEQ ID NO：4-95、236-299及422-435中任一個之序列的多肽可經修飾成具有孔突變。
在一些實施例中，本文所述之多肽(例如純系CH3C.35.20.1、CH3C.35.23.2、CH3C.35.23.3、CH3C.35.23.4、CH3C.35.21.17.2、CH3C.35.23、CH3C.35.21、CH3C.35.20.1.1、CH3C.23.2.1及CH3C.35.23.1.1中之任一個)可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G (例如L7A及L8A))且與SEQ ID NO：4-95、236-299及422-435中任一個之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有SEQ ID NO：4-95、236-299及422-435中任一個之序列的多肽可經修飾成具有孔突變及調節效應子功能之突變。
在一些實施例中，本文所述之多肽(例如純系CH3C.35.20.1、CH3C.35.23.2、CH3C.35.23.3、CH3C.35.23.4、CH3C.35.21.17.2、CH3C.35.23、CH3C.35.21、CH3C.35.20.1.1、CH3C.23.2.1及CH3C.35.23.1.1中之任一個)可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、增加血清穩定性之突變(例如，(i)如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E，或(ii)如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)且與SEQ ID NO：4-95、236-299及422-435中任一個之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有SEQ ID NO：4-95、236-299及422-435中任一個之序列的多肽可經修飾成具有孔突變及增加血清穩定性之突變。
在一些實施例中，本文所述之多肽(例如純系CH3C.35.20.1、CH3C.35.23.2、CH3C.35.23.3、CH3C.35.23.4、CH3C.35.21.17.2、CH3C.35.23、CH3C.35.21、CH3C.35.20.1.1、CH3C.23.2.1及CH3C.35.23.1.1中之任一個)可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))、增加血清穩定性之突變(例如，(i)如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E，或(ii)如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)且與SEQ ID NO：4-95、236-299及422-435中任一個之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有SEQ ID NO：4-95、236-299及422-435中任一個之序列的多肽可經修飾成具有孔突變、 調節效應子功能之突變及增加血清穩定性之突變。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)且與SEQ ID NO：349之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變之純系CH3C.35.20.1具有SEQ ID NO：349之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))且與SEQ ID NO：350或351之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變及調節效應子功能之突變的純系CH3C.35.20.1具有SEQ ID NO：350或351之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E)且與SEQ ID NO：352之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.20.1具有SEQ ID NO：352之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)且與SEQ ID NO：485之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.20.1具有SEQ ID NO：485之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1 編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E)且與SEQ ID NO：353或354之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變、調節效應子功能之突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.20.1具有SEQ ID NO：353或354之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)且與SEQ ID NO：486或487之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變、調節效應子功能之突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.20.1具有SEQ ID NO：486或487之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)且與SEQ ID NO：355之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變之純系CH3C.35.20.1具有SEQ ID NO：355之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))且與SEQ ID NO：356或357之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變及調節效應子功能之突變的純系CH3C.35.20.1具有SEQ ID NO：356或357之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、增加血清穩定性之突變(例如， 如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E)且與SEQ ID NO：358之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.20.1具有SEQ ID NO：358之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)且與SEQ ID NO：488之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.20.1具有SEQ ID NO：488之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E)且與SEQ ID NO：359或360之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變、調節效應子功能之突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.20.1具有SEQ ID NO：359或360之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)且與SEQ ID NO：489或490之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變、調節效應子功能之突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.20.1具有SEQ ID NO：489或490之序 列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)且與SEQ ID NO：361之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變之純系CH3C.35.23.2具有SEQ ID NO：361之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))且與SEQ ID NO：362或363之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變及調節效應子功能之突變的純系CH3C.35.23.2具有SEQ ID NO：362或363之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E)且與SEQ ID NO：364之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23.2具有SEQ ID NO：364之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)且與SEQ ID NO：492之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23.2具有SEQ ID NO：492之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1 編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E)且與SEQ ID NO：365或366之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變、調節效應子功能之突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23.2具有SEQ ID NO：365或366之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)且與SEQ ID NO：493或494之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變、調節效應子功能之突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23.2具有SEQ ID NO：493或494之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)且與SEQ ID NO：367之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變之純系CH3C.35.23.2具有SEQ ID NO：367之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))且與SEQ ID NO：368或369之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變及調節效應子功能之突變的純系CH3C.35.23.2具有SEQ ID NO：368或369之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、增加血清穩定性之突變(例如， 如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E)且與SEQ ID NO：370之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23.2具有SEQ ID NO：370之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)且與SEQ ID NO：495之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23.2具有SEQ ID NO：495之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E)且與SEQ ID NO：371或372之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變、調節效應子功能之突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23.2具有SEQ ID NO：371或372之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)且與SEQ ID NO：496或497之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變、調節效應子功能之突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23.2具有SEQ ID NO：496或497之序 列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.3可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)且與SEQ ID NO：373之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變之純系CH3C.35.23.3具有SEQ ID NO：373之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.3可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))且與SEQ ID NO：374或375之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變及調節效應子功能之突變的純系CH3C.35.23.3具有SEQ ID NO：374或375之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.3可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E)且與SEQ ID NO：376之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23.3具有SEQ ID NO：376之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.3可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)且與SEQ ID NO：499之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23.3具有SEQ ID NO：499之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.3可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1 編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E)且與SEQ ID NO：377或378之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變、調節效應子功能之突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23.3具有SEQ ID NO：377或378之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.3可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)且與SEQ ID NO：500或501之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變、調節效應子功能之突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23.3具有SEQ ID NO：500或501之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.3可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)且與SEQ ID NO：379之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變之純系CH3C.35.23.3具有SEQ ID NO：379之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.3可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))且與SEQ ID NO：380或381之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變及調節效應子功能之突變的純系CH3C.35.23.3具有SEQ ID NO：380或381之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.3可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、增加血清穩定性之突變(例如， 如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E)且與SEQ ID NO：382之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23.3具有SEQ ID NO：382之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.3可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)且與SEQ ID NO：502之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23.3具有SEQ ID NO：502之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.3可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E)且與SEQ ID NO：383或384之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變、調節效應子功能之突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23.3具有SEQ ID NO：383或384之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.3可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)且與SEQ ID NO：503或504之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變、調節效應子功能之突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23.3具有SEQ ID NO：503或504之序 列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.4可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)且與SEQ ID NO：385之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變之純系CH3C.35.23.4具有SEQ ID NO：385之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.4可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))且與SEQ ID NO：386或387之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變及調節效應子功能之突變的純系CH3C.35.23.4具有SEQ ID NO：386或387之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.4可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E)且與SEQ ID NO：388之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23.4具有SEQ ID NO：388之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.4可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)且與SEQ ID NO：506之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23.4具有SEQ ID NO：506之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.4可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1 編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E)且與SEQ ID NO：389或390之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變、調節效應子功能之突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23.4具有SEQ ID NO：389或390之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.4可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)且與SEQ ID NO：507或508之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變、調節效應子功能之突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23.4具有SEQ ID NO：507或508之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.4可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)且與SEQ ID NO：391之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變之純系CH3C.35.23.4具有SEQ ID NO：391之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.4可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))且與SEQ ID NO：392或393之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變及調節效應子功能之突變的純系CH3C.35.23.4具有SEQ ID NO：392或393之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.4可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、增加血清穩定性之突變(例如， 如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E)且與SEQ ID NO：394之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23.4具有SEQ ID NO：394之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.4可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)且與SEQ ID NO：509之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23.4具有SEQ ID NO：509之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.4可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E)且與SEQ ID NO：395或396之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變、調節效應子功能之突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23.4具有SEQ ID NO：395或396之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.4可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)且與SEQ ID NO：510或511之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變、調節效應子功能之突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23.4具有SEQ ID NO：510或511之序 列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21.17.2可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)且與SEQ ID NO：397之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變之純系CH3C.35.21.17.2具有SEQ ID NO：397之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21.17.2可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))且與SEQ ID NO：398或399之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變及調節效應子功能之突變的純系CH3C.35.21.17.2具有SEQ ID NO：398或399之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21.17.2可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E)且與SEQ ID NO：400之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.21.17.2具有SEQ ID NO：400之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21.17.2可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)且與SEQ ID NO：513之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.21.17.2具有SEQ ID NO：513之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21.17.2可以具有節突變(例如，如 參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E)且與SEQ ID NO：401或402之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變、調節效應子功能之突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.21.17.2具有SEQ ID NO：401或402之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21.17.2可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)且與SEQ ID NO：514或515之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變、調節效應子功能之突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.21.17.2具有SEQ ID NO：514或515之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21.17.2可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)且與SEQ ID NO：403之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變之純系CH3C.35.21.17.2具有SEQ ID NO：403之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21.17.2可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))且與SEQ ID NO：404或405之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變及調節效應子功能之突變的純系CH3C.35.21.17.2具有SEQ ID NO：404或405之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21.17.2可以具有孔突變(例如，如 參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E)且與SEQ ID NO：406之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.21.17.2具有SEQ ID NO：406之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21.17.2可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)且與SEQ ID NO：516之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.21.17.2具有SEQ ID NO：516之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21.17.2可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E)且與SEQ ID NO：407或408之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變、調節效應子功能之突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.21.17.2具有SEQ ID NO：407或408之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21.17.2可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)且與SEQ ID NO：517或518之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變、調節效應子功能之突 變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.21.17.2具有SEQ ID NO：517或518之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)且與SEQ ID NO：409之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變之純系CH3C.35.23具有SEQ ID NO：409之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))且與SEQ ID NO：410或411之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變及調節效應子功能之突變的純系CH3C.35.23具有SEQ ID NO：410或411之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E)且與SEQ ID NO：412之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23具有SEQ ID NO：412之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)且與SEQ ID NO：520之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23具有SEQ ID NO：520之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23可以具有節突變(例如，如參照 SEQ ID NO：1編號的T139W)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E)且與SEQ ID NO：413或414之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變、調節效應子功能之突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23具有SEQ ID NO：413或414之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)且與SEQ ID NO：521或522之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變、調節效應子功能之突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23具有SEQ ID NO：521或522之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)且與SEQ ID NO：415之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變之純系CH3C.35.23具有SEQ ID NO：415之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))且與SEQ ID NO：416或417之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變及調節效應子功能之突變的純系CH3C.35.23具有SEQ ID NO：416或417之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23可以具有孔突變(例如，如參照 SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E)且與SEQ ID NO：418之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23具有SEQ ID NO：418之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)且與SEQ ID NO：523之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23具有SEQ ID NO：523之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E)且與SEQ ID NO：419或420之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變、調節效應子功能之突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23具有SEQ ID NO：419或420之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)且與SEQ ID NO：524或525之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變、調節效應子功能之突變 及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23具有SEQ ID NO：524或525之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)且與SEQ ID NO：436之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變之純系CH3C.35.21具有SEQ ID NO：436之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))且與SEQ ID NO：437或438之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變及調節效應子功能之突變的純系CH3C.35.21具有SEQ ID NO：437或438之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E)且與SEQ ID NO：439之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.21具有SEQ ID NO：439之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)且與SEQ ID NO：527之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.21具有SEQ ID NO：527之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21可以具有節突變(例如，如參照 SEQ ID NO：1編號的T139W)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E)且與SEQ ID NO：440或441之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變、調節效應子功能之突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.21具有SEQ ID NO：440或441之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)且與SEQ ID NO：528或529之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變、調節效應子功能之突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.21具有SEQ ID NO：528或529之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)且與SEQ ID NO：442之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變之純系CH3C.35.21具有SEQ ID NO：442之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))且與SEQ ID NO：443或444之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變及調節效應子功能之突變的純系CH3C.35.21具有SEQ ID NO：443或444之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21可以具有孔突變(例如，如參照 SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E)且與SEQ ID NO：445之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.21具有SEQ ID NO：445之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)且與SEQ ID NO：530之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.21具有SEQ ID NO：530之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E)且與SEQ ID NO：446或447之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變、調節效應子功能之突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.21具有SEQ ID NO：446或447之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.21可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)且與SEQ ID NO：531或532之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變、調節效應子功能之突變 及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.21具有SEQ ID NO：531或532之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1.1可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)且與SEQ ID NO：448之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變之純系CH3C.35.20.1.1具有SEQ ID NO：448之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1.1可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))且與SEQ ID NO：449或450之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變及調節效應子功能之突變的純系CH3C.35.20.1.1具有SEQ ID NO：449或450之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1.1可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E)且與SEQ ID NO：451之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.20.1.1具有SEQ ID NO：451之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1.1可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)且與SEQ ID NO：534之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.20.1.1具有SEQ ID NO：534之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1.1可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E)且與SEQ ID NO：452或453之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變、調節效應子功能之突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.20.1.1具有SEQ ID NO：452或453之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1.1可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)且與SEQ ID NO：535或536之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變、調節效應子功能之突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.20.1.1具有SEQ ID NO：535或536之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1.1可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)且與SEQ ID NO：454之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變之純系CH3C.35.20.1.1具有SEQ ID NO：454之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1.1可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))且與SEQ ID NO：455或456之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變及調節效應子功能之突變的純系CH3C.35.20.1.1具有SEQ ID NO：455或456之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1.1可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E)且與SEQ ID NO：457之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.20.1.1具有SEQ ID NO：457之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1.1可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)且與SEQ ID NO：537之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.20.1.1具有SEQ ID NO：537之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1.1可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E)且與SEQ ID NO：458或459之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變、調節效應子功能之突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.20.1.1具有SEQ ID NO：458或459之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.20.1.1可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)且與SEQ ID NO：538或539之序列具有至少85%一致性、至少90%一 致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變、調節效應子功能之突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.20.1.1具有SEQ ID NO：538或539之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2.1可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)且與SEQ ID NO：460之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變之純系CH3C.35.23.2.1具有SEQ ID NO：460之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2.1可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))且與SEQ ID NO：461或462之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變及調節效應子功能之突變的純系CH3C.35.23.2.1具有SEQ ID NO：461或462之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2.1可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E)且與SEQ ID NO：463之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23.2.1具有SEQ ID NO：463之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2.1可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)且與SEQ ID NO：541之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23.2.1具有SEQ ID NO：541之序 列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2.1可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E)且與SEQ ID NO：464或465之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變、調節效應子功能之突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23.2.1具有SEQ ID NO：464或465之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2.1可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)且與SEQ ID NO：542或543之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變、調節效應子功能之突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23.2.1具有SEQ ID NO：542或543之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2.1可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)且與SEQ ID NO：466之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變之純系CH3C.35.23.2.1具有SEQ ID NO：466之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2.1可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))且與SEQ ID NO：467或468之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變及調節效應子功能之突變的純系 CH3C.35.23.2.1具有SEQ ID NO：467或468之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2.1可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E)且與SEQ ID NO：469之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23.2.1具有SEQ ID NO：469之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2.1可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)且與SEQ ID NO：544之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23.2.1具有SEQ ID NO：544之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2.1可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E)且與SEQ ID NO：470或471之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變、調節效應子功能之突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23.2.1具有SEQ ID NO：470或471之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.2.1可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存 在M201L)且與SEQ ID NO：545或546之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變、調節效應子功能之突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23.2.1具有SEQ ID NO：545或546之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.1.1可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)且與SEQ ID NO：472之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變之純系CH3C.35.23.1.1具有SEQ ID NO：472之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.1.1可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))且與SEQ ID NO：473或474之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變及調節效應子功能之突變的純系CH3C.35.23.1.1具有SEQ ID NO：473或474之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.1.1可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E)且與SEQ ID NO：475之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23.1.1具有SEQ ID NO：475之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.1.1可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)且與SEQ ID NO：548之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節 突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23.1.1具有SEQ ID NO：548之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.1.1可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E)且與SEQ ID NO：476或477之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變、調節效應子功能之突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23.1.1具有SEQ ID NO：476或477之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.1.1可以具有節突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139W)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)且與SEQ ID NO：549或550之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有節突變、調節效應子功能之突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23.1.1具有SEQ ID NO：549或550之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.1.1可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)且與SEQ ID NO：478之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變之純系CH3C.35.23.1.1具有SEQ ID NO：478之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.1.1可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))且與SEQ ID NO：479或480之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少 95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變及調節效應子功能之突變的純系CH3C.35.23.1.1具有SEQ ID NO：479或480之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.1.1可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E)且與SEQ ID NO：481之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23.1.1具有SEQ ID NO：481之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.1.1可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)且與SEQ ID NO：551之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23.1.1具有SEQ ID NO：551之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.1.1可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))、增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的M25Y、S27T及T29E)且與SEQ ID NO：482或483之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變、調節效應子功能之突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23.1.1具有SEQ ID NO：482或483之序列。
在一些實施例中，純系CH3C.35.23.1.1可以具有孔突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的T139S、L141A及Y180V)、調節效應子功能之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的L7A、L8A及/或P102G(例如L7A及L8A))、 增加血清穩定性之突變(例如，如參照SEQ ID NO：1編號的N207S且存在或不存在M201L)且與SEQ ID NO：552或553之序列具有至少85%一致性、至少90%一致性或至少95%一致性。在一些實施例中，具有孔突變、調節效應子功能之突變及增加血清穩定性之突變的純系CH3C.35.23.1.1具有SEQ ID NO：552或553之序列。
在一些實施例中，根據本發明的包含經修飾CH2或CH3結構域之轉鐵蛋白受體結合多肽係經由連接子連接至藥劑，例如內化至細胞中及/或跨內皮，諸如血腦屏障穿胞運輸之藥劑。該連接子可以為適合將藥劑接合至多肽之任何連接子。在一些實施例中，該連接係酶可裂解的。在某些實施例中，該連接可藉由中樞神經系統中存在之酶裂解。
在一些實施例中，連接子係肽連接子。肽連接子可以組態成使其允許該藥劑及轉鐵蛋白受體結合多肽相對於彼此旋轉，及/或對蛋白酶消化具有抗性。在一些實施例中，該連接子可以為可撓性連接子，例如含有諸如Gly、Asn、Ser、Thr、Ala及類似物之胺基酸。此類連接子係使用已知參數設計。舉例而言，該連接子可以具有重複序列，諸如Gly-Ser重複序列。
在各種實施例中，偶聯物可以使用熟知之化學交聯試劑及方案產生。舉例而言，熟習此項技術者已知眾多化學交聯劑且可用於使多肽與所關注藥劑交聯。舉例而言，交聯劑係異雙官能交聯劑，其可用於以逐步方式連接分子。異雙官能交聯劑使得能夠設計出更偏向用於偶聯蛋白質之偶聯方法，由此減少不想要副反應，諸如同源蛋白質聚合物之發生。此項技術中已知多種異雙官能交聯劑，包括N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)或其水溶性類似物N-羥基磺基琥珀醯亞胺(磺基-NHS)、4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸琥珀醯亞胺酯(SMCC)、間順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基琥珀醯亞胺酯(MBS)；(4-碘代 乙醯基)胺基苯甲酸N-琥珀醯亞胺酯(SIAB)、4-(對順丁烯二醯亞胺基苯基)丁酸琥珀醯亞胺酯(SMPB)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)；4-琥珀醯亞胺基氧基羰基-a-甲基-a-(2-吡啶基二硫基)-甲苯(SMPT)、3-(2-吡啶基二硫基)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(SPDP)及6-[3-(2-吡啶基二硫基)丙醯胺基]己酸琥珀醯亞胺酯(LC-SPDP)。具有N-羥基琥珀醯亞胺部分之該等交聯劑可以呈N-羥基磺基琥珀醯亞胺類似物形式獲得，其一般具有較高水溶性。此外，在連接鏈中具有二硫橋的該等交聯劑可轉而以烷基衍生物形式獲得以便減少體內連接子裂解之量。除異雙官能交聯劑外，亦存在多種其他交聯劑，包括同雙官能交聯劑及光反應性交聯劑。辛二酸雙琥珀醯亞胺酯(DSS)、雙順丁烯二醯亞胺基己烷(BMH)及二甲基庚二醯亞胺酯.2HCl(DMP)係有用同雙官能交聯劑之實例，且雙-[B-(4-疊氮基水楊基醯胺基)乙基]二硫化物(BASED)及6(4'-疊氮基-2'-硝基苯基胺基)己酸N-琥珀醯亞胺酯(SANPAH)係有用的光反應性交聯劑之實例。
所關注試劑可以為治療劑，包括細胞毒性劑、DNA或RNA分子、化學部分及類似物。在一些實施例中，該試劑可以為肽或小分子治療劑或顯影劑。在一些實施例中，該小分子小於1000Da、小於750Da或小於500Da.
所關注試劑可以連接至轉鐵蛋白受體結合多肽之N末端或C末端區，或附接至多肽之任何區域，只要該試劑不干擾轉鐵蛋白受體結合多肽與轉鐵蛋白受體之結合即可。
在另一態樣中，提供將CH2或CH3結構域多肽工程改造成具有轉鐵蛋白受體結合特異性的方法。在一些實施例中，CH3結構域多肽之修飾包含取代如本文所述之(i)組及/或(ii)組中之各種胺基酸。在一些實施例中，該方法包括修飾編碼CH3結構域多肽之聚核苷酸以在CH3結構域(i)組中之三個、四個、五個、六個、七個、八個或全部九個位置處併入胺基酸變化。在一些實施例中， 該方法包括修飾編碼CH3結構域多肽之聚核苷酸以在CH3結構域(ii)組中之三個、四個、五個、六個、七個或全部八個位置處併入胺基酸變化。引入所需位置之胺基酸可以藉由隨機突變或部分隨機突變以產生在該組各種位置處具有胺基酸取代之CH3結構域多肽文庫來產生。在一些實施例中，CH3結構域多肽在Fc區之情況下經歷突變，該Fc區可以含有或可以不含完整鉸鏈區之一部分或全部。
在一個態樣中，CH3結構域藉由以下方式工程改造成特異性結合至轉鐵蛋白受體：(a)將編碼CH3結構域之聚核苷酸修飾成在如參照SEQ ID NO：1之胺基酸114-220編號的位置153、157、159、160、161、162、163、164、165、186、187、188、189、194、197或199處具有至少五個胺基酸取代；及(b)表現並回收包含經修飾CH3結構域之多肽。在一些實施例中，CH3結構域修飾成在位置153、157、159、160、161、162、163、164、165、186、187、188、189、194、197或199處具有至少5個取代，其中該等取代係選自以下：在153位之Trp、Tyr、Leu或Gln；在157位之Leu、Tyr、Met或Val；在159位之Leu、Thr、His或Pro；在160位之Val或酸性胺基酸；在161位之芳族胺基酸，例如Trp；在162位之Val、Ser或Ala；在163位之Ser；在164位之Ser、Thr、Gln或Phe；在165位之Gln、Phe或His；在186位之Glu、Ala、Ser、Leu、Thr或Pro；在187位之Arg、Gly或Pro；在188位之Glu；在189位之Thr或酸性胺基酸；在194位之Trp、Tyr、His或Phe；在197位之Thr、Glu或Lys；及在199位之Trp或Gly。
在另一態樣中，CH3結構域藉由以下方式工程改造成特異性結合至轉鐵蛋白受體：(a)將編碼CH3結構域之聚核苷酸修飾成在如參照SEQ ID NO：1之胺基酸114-220編號的位置118、119、120、122、210、211、212及213處具有至少五個胺基酸取代；及(b)表現並回收包含經修飾CH3結構域之多肽。在一 些實施例中，CH3結構域修飾成在位置118、119、120、122、210、211、212及213處具有至少5個取代，其中該等取代係選自以下：在118位之Phe或Ile；在119位之Asp、Glu、Gly、Ala，或Lys；在120位之Tyr、Met、Leu、Ile或Asp；在122位之Thr或Ala；在210位之Gly；在211位之Phe；在212位之His、Tyr、Ser或Phe；及在213位之Asp。
CH2結構域多肽可以按類似方式，藉由在CH2結構域(iii)組、(iv)組、(v)組或(vi)組之三個至所有位置中任一個中引入突變，工程改造成結合轉鐵蛋白受體。因此，在一些實施例中，CH2結構域多肽之修飾包含取代如本文所述之(iii)組、(iv)組、(v)組及/或(vi)組中之各種胺基酸。在一些實施例中，該方法包括修飾編碼CH2結構域多肽之聚核苷酸以在CH2結構域(iii)組中之三個、四個、五個、六個、七個、八個或全部九個位置處併入胺基酸變化。在一些實施例中，該方法包括修飾編碼CH2結構域多肽之聚核苷酸以在CH2結構域(iv)組中之三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或全部十個位置處併入胺基酸變化。在一些實施例中，該方法包括修飾編碼CH2結構域多肽之聚核苷酸以在CH2結構域(v)組中之三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或全部十個位置處併入胺基酸變化。在一些實施例中，該方法包括修飾編碼CH2結構域多肽之聚核苷酸以在CH2結構域(vi)組中之三個、四個、五個、六個、七個、八個或全部九個位置處併入胺基酸變化。引入所需位置之胺基酸可以藉由隨機突變或部分隨機突變以產生在該組各種位置處具有胺基酸取代之CH2結構域多肽文庫來產生。在一些實施例中，CH2結構域多肽在Fc區之情況下經歷突變，該Fc區可以含有或可以不含完整鉸鏈區之一部分或全部。
在一個態樣中，CH2結構域藉由以下方式工程改造成特異性結合至轉鐵蛋白受體：(a)將編碼CH2結構域之聚核苷酸修飾成在如參照SEQ ID NO：1之胺基酸4-113編號的位置47、49、56、58、59、60、61、62及63處具有至少 五個胺基酸取代；及(b)表現並回收包含經修飾CH2結構域之多肽。在一些實施例中，CH2結構域修飾成在位置47、49、56、58、59、60、61、62及63處具有至少5個取代，其中該等取代係選自以下：在47位之Glu、Gly、Gln、Ser、Ala、Asn、Tyr或Trp；在49位之Ile、Val、Asp、Glu、Thr、Ala或Tyr；在56位之Asp、Pro、Met、Leu、Ala、Asn或Phe；在58位之Arg、Ser、Ala或Gly；在59位之Tyr、Trp、Arg或Val；在60位之Glu；在61位之Trp或Tyr；在62位之Gln、Tyr、His、Ile、Phe、Val或Asp；及在63位之Leu、Trp、Arg、Asn、Tyr或Val。
在另一態樣中，CH2結構域藉由以下方式工程改造成特異性結合至轉鐵蛋白受體：(a)將編碼CH2結構域之聚核苷酸修飾成在如參照SEQ ID NO：1之胺基酸4-113編號的位置39、40、41、42、43、44、68、70、71及72處具有至少五個胺基酸取代；及(b)表現並回收包含經修飾CH2結構域之多肽。在一些實施例中，CH2結構域修飾成在位置39、40、41、42、43、44、68、70、71及72處具有至少5個取代，其中該等取代係選自以下：在39位之Pro、Phe、Ala、Met或Asp；在40位之Gln、Pro、Arg、Lys、Ala、Ile、Leu、Glu、Asp或Tyr；在41位之Thr、Ser、Gly、Met、Val、Phe、Trp或Leu；在42位之Pro、Val、Ala、Thr或Asp；在43位之Pro、Val或Phe；在44位之Trp、Gln、Thr或Glu；在68位之Glu、Val、Thr、Leu或Trp；在70位之Tyr、His、Val或Asp；在71位之Thr、His、Gln、Arg、Asn或Val；及在72位之Tyr、Asn、Asp、Ser或Pro。
在又一態樣中，CH2結構域藉由以下方式工程改造成特異性結合至轉鐵蛋白受體：(a)將編碼CH2結構域之聚核苷酸修飾成在如參照SEQ ID NO：1之胺基酸4-113編號的位置41、42、43、44、45、65、66、67、69及73處具有至少五個胺基酸取代；及(b)表現並回收包含經修飾CH2結構域之多肽。在一些實施例中，CH2結構域修飾成在位置41、42、43、44、45、65、66、67、69及 73處具有至少5個取代，其中該等取代係選自以下：在41位之Val或Asp；在42位之Pro、Met或Asp；在43位之Pro或Trp；在44位之Arg、Trp、Glu或Thr；在45位之Met、Tyr或Trp；在65位之Leu或Trp；在66位之Thr、Val、Ile或Lys；在67位之Ser、Lys、Ala或Leu；在69位之His、Leu或Pro；及在73位之Val或Trp。
在另一態樣中，CH2結構域藉由以下方式工程改造成特異性結合至轉鐵蛋白受體：(a)將編碼CH2結構域之聚核苷酸修飾成在如參照SEQ ID NO：1之胺基酸4-113編號的位置45、47、49、95、97、99、102、103及104處具有至少五個胺基酸取代；及(b)表現並回收包含經修飾CH2結構域之多肽。在一些實施例中，CH2結構域修飾成在位置45、47、49、95、97、99、102、103及104處具有至少5個取代，其中該等取代係選自以下：在45位之Trp、Val、Ile或Ala；在47位之Trp或Gly；在49位之Tyr、Arg或Glu；在95位之Ser、Arg或Gln；在97位之Val、Ser或Phe；在99位之Ile、Ser或Trp；在102位之Trp、Thr、Ser、Arg或Asp；103位之Trp；及在104位之Ser、Lys、Arg或Val。
包含突變之CH3及/或CH2結構域的多肽可以使用多種系統表現。舉例而言，在一些實施例中，突變多肽係在展示系統中表現。在其他示例性實施例中，突變多肽係以宿主細胞分泌之可溶性多肽形式表現。在一些實施例中，表現系統係展示系統，例如病毒展示系統、細胞表面展示系統諸如酵母展示系統、mRNA展示系統或聚核糖體展示系統。使用已知方法篩選文庫以鑑別轉鐵蛋白受體結合物，該等結合物可以進一步表徵以確定結合動力學。另外的突變則可以引入所選純系中初始胺基酸組((i)組或(ii)組)中各位置；或在該組範圍外的同樣存在於所選純系之結合區中的其他位置。
本文所描述之經修飾轉鐵蛋白受體結合多肽典型地使用重組方法製 備。因此，在一些態樣中，本發明提供經分離之核酸，其包含編碼含本文所描述之多肽之任一多肽的核酸序列；及宿主細胞，該等核酸係引入該等宿主細胞中以用於複製多肽編碼核酸及/或表現該等多肽。在一些實施例中，宿主細胞係真核細胞，例如人類細胞。
在另一態樣中，提供包含編碼本文所述多肽之核苷酸的聚核苷酸。該等聚核苷酸可以為單股或雙股的。在一些實施例中，該聚核苷酸係DNA。在特定實施例中，該聚核苷酸係cDNA。在一些實施例中，該聚核苷酸係RNA。
在一些實施例中，該聚核苷酸係包括在核酸構築體內。在一些實施例中，該構築體係可複製之載體。在一些實施例中，該載體係選自質體、病毒載體、噬菌粒、酵母染色體載體及非游離型哺乳動物載體。
在一些實施例中，該聚核苷酸在表現構築體中可操作地連接至一或多個調控核苷酸序列。在一系列實施例中，核酸表現構築體適合用作表面表現文庫。在一些實施例中，該文庫適於在酵母中表面表現。在一些實施例中，該文庫適於在噬菌體中表面表現。在另一系列實施例中，核酸表現構築體適於在允許分離毫克量或公克量多肽之系統中表現多肽。在一些實施例中，該系統係哺乳動物細胞表現系統。在一些實施例中，該系統係酵母細胞表現系統。
用於產生重組多肽之表現媒介包括質體及其他載體。例如，適合載體包括以下類型之質體：用於在原核細胞，諸如大腸桿菌中表現的pBR322源性質體、pEMBL源性質體、pEX源性質體、pBTac源性質體及pUC源性質體。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo及pHyg源性載體係適於轉染真核細胞之哺乳動物表現載體的實例。或者，可以使用病毒衍生物，諸如牛乳頭瘤病毒(BPV-1)或艾-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus)(pHEBo、pREP源性及p205)在真核細胞中短暫表現多肽。在一些實施例中，利用桿狀病毒表現系統表現重組多肽可能為合 乎需要的。此類桿狀病毒表現系統之實例包括pVL源性載體(諸如pVL1392、pVL1393及pVL941)、pAcUW源性載體(諸如pAcUW1)及pBlueBac源性載體。另外的表現系統包括腺病毒、腺相關病毒及其他病毒表現系統。
載體可以轉型至任何適合宿主細胞中。在一些實施例中，宿主細胞，例如細菌或酵母細胞，可能適於用作表面表現文庫。在一些細胞中，載體在宿主細胞中表現以表現相對較大量的多肽。此類宿主細胞包括哺乳動物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞及原核細胞。在一些實施例中，細胞係哺乳動物細胞，諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、NS0細胞、Y0細胞、HEK293細胞、COS細胞、Vero細胞或HeLa細胞。
用編碼轉鐵蛋白受體結合多肽之表現載體轉染的宿主細胞可以在允許多肽表現之適當條件下培養。該等多肽可以自細胞分泌並自含有該等多肽之細胞及培養基混合物分離。或者，該多肽可以保留在細胞質中或膜部分中並使用所需方法收集細胞、溶解並分離出多肽。
根據本發明之轉鐵蛋白受體結合多肽可以用於治療許多適應症。在一些實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽係用於將治療劑遞送至表現轉鐵蛋白受體之靶細胞。在一些實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽可用於跨內皮，例如血腦屏障轉運治療部分以經腦吸收。
在一些實施例中，本發明之轉鐵蛋白受體結合多肽可以用於，例如偶聯至治療劑，遞送治療劑以治療神經病症，諸如腦或中樞神經系統(CNS)的疾病。示例性疾病包括阿茲海默氏病、帕金森氏病、肌萎縮側索硬化、額顳葉癡呆、血管性癡呆、路易體癡呆(Lewy body dementia)、皮克氏病(Pick's disease)、原發性年齡相關τ蛋白病或進行性核上麻痹。在一些實施例中，該疾病可以為τ蛋白病、朊病毒病(諸如牛海綿狀腦病、癢病、克-雅二氏症候群(Creutzfeldt-Jakob syndrome)、庫魯病(kuru)、傑茨曼-斯脫司勒-史茵克病(Gerstmann-Straussler-Scheinker disease)、慢性消耗性疾病及致死性家族性失眠症)、延髓麻痹、運動神經元疾病或神經系統異變性病症(諸如卡那凡氏病(Canavan disease)、亨廷頓氏病(Huntington's disease)、神經元蠟樣脂褐質沈積症、亞歷山大氏病(Alexander's disease)、妥瑞氏症候群(Tourette's syndrome)、蒙氏卷髮症候群(Menkes kinky hair syndrome)、科凱恩氏症候群(Cockayne syndrome)、哈-斯二氏症候群(Halervorden-Spatz syndrome)、拉福拉氏病(lafora disease)、瑞特氏症候群(Rett syndrome)、肝豆狀核變性、雷-納二氏症候群(Lesch-Nyhan syndrome)、弗雷德里希氏共濟失調(Friedreich's ataxia)、脊髓性肌肉萎縮症及尤-蘭二氏症候群(Unverricht-Lundborg syndrome))。在一些實施例中，該疾病係中風或多發性硬化。在一些實施例中，患者可以為無症狀的，但具有與腦或CNS疾病相關之標記物。在一些實施例中，提供本發明之轉鐵蛋白受體結合多肽於製造用於治療神經病症之藥物中的用途。
在一些實施例中，本發明之轉鐵蛋白受體結合多肽用於治療癌症。在一些實施例中，該癌症係原發性CNS癌症，諸如神經膠質瘤、多形性膠質母細胞瘤、腦膜瘤、星形細胞瘤、聽神經瘤、軟骨瘤、寡樹突膠質細胞瘤、髓母細胞瘤、節細胞膠質瘤、許旺氏瘤(Schwannoma)、神經纖維瘤、神經母細胞瘤，或硬膜外、髓鞘內或硬膜內腫瘤。在一些實施例中，該癌症係實體腫瘤，或在其他實施例中，該癌症係非實體腫瘤。實體腫瘤癌症包括中樞神經系統腫瘤、乳癌、前列腺癌、皮膚癌(包括基底細胞癌、細胞癌、鱗狀細胞癌及黑色素瘤)、子宮頸癌、子宮癌、肺癌、卵巢癌、睪丸癌、甲狀腺癌、星形細胞瘤、神經膠質瘤、胰臟癌、間皮瘤、胃癌、肝癌、結腸癌、直腸癌、腎癌(包括腎母細胞瘤)、膀胱癌、食道癌、喉癌、腮腺癌、膽道癌、子宮內膜癌、腺癌、小細胞癌、神經母細胞瘤、腎上腺皮質癌、上皮癌、韌帶樣瘤、促纖維增生性小圓細胞腫瘤、 內分泌腫瘤、尤文氏肉瘤家族腫瘤(Ewing sarcoma family tumor)、生殖細胞腫瘤、肝母細胞瘤、肝細胞癌、非橫紋肌肉瘤軟組織肉瘤、骨肉瘤、外周原始神經外胚層腫瘤、視網膜母細胞瘤及橫紋肌肉瘤。在一些實施例中，提供本發明之轉鐵蛋白受體結合多肽於製造用於治療癌症之藥物中的用途。
在一些實施例中，本發明之轉鐵蛋白受體結合多肽可用於治療自身免疫性或炎性疾病。此類疾病之實例包括但不限於，強直性脊柱炎、關節炎、骨關節炎、類風濕性關節炎、牛皮癬性關節炎、氣喘、硬皮病、中風、動脈粥樣硬化、克羅恩氏病(Crohn's disease)、結腸炎、潰瘍性結腸炎、皮膚炎、憩室炎、纖維化、特發性肺纖維化、纖維肌痛、肝炎、腸易激症候群(IBS)、狼瘡、全身性紅斑狼瘡(SLE)、腎炎、多發性硬化及潰瘍性結腸炎。在一些實施例中，提供本發明之轉鐵蛋白受體結合多肽於製造用於治療自身免疫性或炎性疾病之藥物中的用途。
在一些實施例中，本發明之轉鐵蛋白受體結合多肽可用於治療心血管疾病，諸如冠狀動脈疾病、心臟病發作、心律失常或心律不齊、心臟衰竭、心臟瓣膜病、充血性心臟病、心肌疾病、心肌病、心包疾病、主動脈疾病、馬凡氏症候群(marfan syndrome)、血管疾病(vascular disease)及血管疾病(blood vessel disease)。在一些實施例中，提供本發明之轉鐵蛋白受體結合多肽於製造用於治療心血管疾病之藥物中的用途。
在一些實施例中，該方法亦包括向受試者投予一或多種其他治療劑。例如，在用於治療腦或中樞神經系統疾病之一些實施例中，該方法可以包括向受試者投予神經保護劑，例如抗膽鹼劑、多巴胺劑、麩胺酸能劑、組蛋白去乙醯化酶(HDAC)抑制劑、大麻鹼、半胱天冬酶抑制劑、褪黑激素、抗炎劑、激素(例如雌激素或孕酮)或維生素。在一些實施例中，該方法包括向受試者投予用於治療神經病症之認知或行為症狀的藥劑(例如抗抑鬱劑、多巴胺促效劑或抗精神 病劑)。
本發明之轉鐵蛋白受體結合多肽係以治療有效量或劑量投予受試者。可用的示例性劑量包括約0.01mg/kg至約500mg/kg，或約0.1mg/kg至約200mg/kg，或約1mg/kg至約100mg/kg，或約10mg/kg至約50mg/kg的日劑量範圍。然而，劑量可能根據若干因素而變化，包括所選投藥途徑、該組成物之調配物、患者反應、病況之嚴重程度、受試者之體重及處方醫師之判斷。根據個別患者之要求，該劑量可以隨時間增加或減少。在一些實施例中，患者最初給予較低劑量，接著將劑量增加至患者耐受之有效劑量。有效劑量之確定係在熟習此項技術者之能力範圍內。
在各種實施例中，本發明之轉鐵蛋白受體結合多肽係非經腸投予。在一些實施例中，該多肽係經靜脈內投予。靜脈內投藥可以藉由例如經約10至約30分鐘時間，或經至少1小時、2小時或3小時之時間輸注進行。在一些實施例中，該多肽係經靜脈內推注投予。亦可使用輸注與推注投藥之組合。
在一些非經腸實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽係經腹膜內、皮下、皮內或肌肉內投予。在一些實施例中，該多肽係經皮內或肌肉內投予。在一些實施例中，該多肽係經鞘內，諸如藉由硬膜外投藥或腦室內投予。
在其他實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽可以經口投予、經肺投予、鼻內投予、眼內投予或經表面投予。亦可採用肺投藥，例如藉由使用吸入器或霧化器投予，並與氣霧劑一起調配。
在另一態樣中，提供包含根據本發明之轉鐵蛋白受體結合多肽的醫藥組成物及套組。
有關製備用於本發明中之調配物的指導可以見於熟習此項技術者已 知的有關醫藥製備及調配之多種手冊中。
在一些實施例中，醫藥組成物包含如本文所描述之轉鐵蛋白受體結合多肽且進一步包含一或多種醫藥學上可接受之載劑及/或賦形劑。醫藥學上可接受之載劑包括在生理上相容且較佳不干擾或以其他方式抑制活性劑之活性的任何溶劑、分散介質或包衣劑。各種醫藥學上可接受之賦形劑係熟知的。
在一些實施例中，該載劑適於靜脈內、鞘內、腦室內、肌肉內、經口、腹膜內、經皮、表面或皮下投予。醫藥學上可接受之載劑可以含有一或多種用於例如使組成物穩定，或者增加或減少多肽之吸收的生理上可接受之化合物。生理上可接受之化合物可以包括例如碳水化合物，諸如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或麩胱甘肽；螯合劑；低分子量蛋白質；減少活性劑之清除或水解的組成物；或者賦形劑，或其他穩定劑及/或緩衝劑。其他醫藥學上可接受之載劑及其調配物亦可用於此項技術中。
本文所描述之醫藥組成物可以熟習此項技術者已知之方式，例如藉助於習知混合、溶解、製粒、製糖衣丸、乳化、囊封、包封或凍乾方法製造。以下方法及賦形劑僅為示例性的且決不作為限制。
對於經口投予，轉鐵蛋白受體結合多肽可以藉由與此項技術中熟知的醫藥學上可接受之載劑組合來調配。該等載劑能夠將該等化合物調配為錠劑、丸劑、糖衣丸、膠囊、乳液、親脂性及親水性懸浮液、液體、凝膠、糖漿、漿液、懸浮液及類似物，以便供待治療之患者口服。可以藉由將多肽與固體賦形劑混合，視情況研磨所得混合物，並且必要時，在添加適合的佐劑後處理顆粒混合物，以獲得錠劑或糖衣丸核心，來得到口服醫藥製劑。適合的賦形劑包括例如填充劑，諸如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纖維素製劑，諸如玉米澱粉、小麥澱粉、大米澱粉、馬鈴薯澱粉、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉，及/或聚乙烯吡咯啶酮。必要時，可 添加崩解劑，諸如交聯聚乙烯吡咯啶酮、瓊脂，或者海藻酸或其鹽，諸如海藻酸鈉。
如上文所揭示，本文所描述之轉鐵蛋白受體結合多肽可以調配用於藉由注射，例如藉由推注或連續輸注非經腸投予。對於注射，可以藉由在水性或非水性溶劑，諸如植物油或其他類似油、合成脂肪酸甘油酯、高級脂肪酸或丙二醇酯中溶解、懸浮或乳化該等多肽；且必要時，添加習知添加劑，諸如增溶劑、等滲劑、懸浮劑、乳化劑、穩定劑及防腐劑，將其調配成製劑。在一些實施例中，可以在水溶液中，較佳在生理上相容之緩衝液，諸如漢氏溶液(Hanks's solution)、林格氏溶液或生理食鹽水緩衝液中調配多肽。注射用調配物可以單位劑型提供於例如加有防腐劑的安瓿或多劑量容器中。該等組成物可以呈諸如於油性或水性媒劑中的懸浮液、溶液或乳液的形式，且其可含有調配劑，諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。
在一些實施例中，轉鐵蛋白受體結合多肽係製備成例如於含有活性劑之固體疏水性聚合物之半滲透基質中的持續釋放、控制釋放、延長釋放、定時釋放或延遲釋放調配物形式遞送。已經確定且熟習此項技術者熟知各種類型的持續釋放材料。延長釋放調配物包括膜包覆之錠劑、多顆粒或丸粒系統、使用親水性或親脂性材料之基質技術及含有成孔賦形劑的基於蠟之錠劑。取決於設計，持續釋放遞送系統可以在數小時或數天時間內，例如經4、6、8、10、12、16、20、24小時或更長時間釋放化合物。通常，持續釋放調配物可以使用天然存在或合成聚合物，例如聚合乙烯吡咯啶酮，諸如聚乙烯吡咯啶酮；羧基乙烯基親水性聚合物；疏水性及/或親水性水膠體，諸如甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙基纖維素及羥丙基甲基纖維素；及羧基聚甲烯製備。
典型地，用於活體內投予之醫藥組成物係無菌的。滅菌可以根據此項技術中已知之方法，例如熱滅菌、蒸汽滅菌、無菌過濾或照射實現。
本發明之醫藥組成物的劑量及所需藥物濃度可以取決於預期的特定用途而變化。適當投予劑量或途徑之確定係在熟習此項技術者之技能範圍內。適合劑量於以上第VII部分中亦有描述。
在一些實施例中，提供包含如本文所描述之轉鐵蛋白受體結合多肽的套組。在一些實施例中，該等套組係用於預防或治療神經病症，諸如腦或中樞神經系統(CNS)疾病。
在一些實施例中，該套組另外包含一或多種另外的治療劑。舉例而言，在一些實施例中，該套組包含如本文所描述之轉鐵蛋白受體結合多肽且進一步包含一或多種用於治療神經病症之另外的治療劑。在一些實施例中，該套組另外包含說明材料，其含有關於實踐本文所描述之方法的指導(亦即，方案)(例如有關使用該套組跨血腦屏障投予組成物的說明書)。儘管該等說明材料典型地包含書面或印刷材料，但其不限於此。能夠儲存此類說明書並將其傳達給終端使用者之任何媒體均涵蓋在本發明中。此類媒體包括但不限於，電子存儲媒體(例如磁盤、磁帶、盒式磁盤、晶片)、光學媒體(例如CD-ROM)及類似物。此類媒體可以包括提供此類說明材料之網際網路站點的位址。
本發明將藉助於具體實例更詳細地描述。提供以下實例僅用於說明目的，且不意欲以任何方式限制本發明。熟習此項技術者將易於認識到，可以改變或修改多種非關鍵參數以得到基本上相同之結果。已作出大量努力來確保所用數值(例如量、溫度等)的準確性，但仍可能存在一些實驗誤差及偏差。除非另外指示，否則本發明之實踐將採用此項技術之技能範圍內的蛋白質化學、生物化學、重組DNA技術及藥理學之習知方法。該等技術將於文獻中完整地闡明。另外，熟習此項技術者應顯而易見，適用於某些文庫的工程改造方法亦可用於 本文所述之其他文庫。
將編碼轉鐵蛋白受體(TfR)胞外結構域(ECD)(人類(SEQ ID NO：235)或食蟹獼猴(SEQ ID NO：300)TfR之殘基121-760)的DNA選殖至帶有C末端可裂解His及Avi標籤的哺乳動物表現載體中。將質體轉染至HEK293細胞中並使其表現。使用Ni-NTA層析法，隨後尺寸排阻層析法移除任何聚集之蛋白質，自收集之上清液純化得到胞外結構域。產率為每公升培養物約5mg。將蛋白質儲存於10mM K3PO4(pH 6.7)、100mM KCl、100mM NaCl及20%甘油中並在-20℃下冷凍。
將編碼改變之TfR頂端結構域(SEQ ID NO：301)(人類或食蟹獼猴TfR之殘基326-379及194-296)的DNA選殖至帶有供純化之N末端His標籤及供活體外生物素化之Avi標籤的pET28載體中。將該質體與BirA表現載體一起共轉型至BL21(DE3)細胞中。在37℃下，使細胞在LB培養基中生長至對數期，且接著用1mM異丙基1-硫代-β-D-半乳糖哌喃糖苷(IPTG)誘導，隨後在18℃下培養隔夜。將細胞溶解並將可溶性部分施加至Ni-NTA管柱上進行親和純化，隨後進行尺寸排阻層析以移除任何聚集之蛋白質。產率為每公升培養物約10mg。將蛋白質儲存於50mM HEPES(pH 7.5)、150mM NaCl及1mM DTT中並在-20℃下冷凍。
使用EZ-link磺基-NHS-LC-生物素套組(自Thermo Scientific獲得)使純化之TfR ECD生物素化。使用五倍莫耳過量之生物素進行反應。藉由針對PBS充分透析來移除過量的生物素。
使用BirA-500(來自Avidity有限公司的BirA生物素-蛋白質連接酶標準反應套組)使Avi標記之TfR ECD及頂端結構域生物素化。反應後，藉由尺寸排阻層析法進一步純化經標記之蛋白質以移除過量的BirA酶。將最終的材料儲 存於10mM K3PO4(pH 6.7)、100mM KCl、100mM NaCl及20%甘油中並在-20℃下冷凍。
本實例描述本發明多肽之設計、產生及表徵。出於本實例及比較在純系序列中相同之胺基酸的目的，認為「保守」突變係在所有鑑別之純系中存在的突變(非保守胺基酸取代)，而「半保守」突變係在>50%純系中存在之突變。
除非另外指示，否則本節中胺基酸殘基之位置係基於SEQ ID NO：1編號，人類IgG1野生型Fc區在胺基末端具有來自鉸鏈之三個殘基，即PCP。
藉由選擇某些溶劑暴露表面補丁進行修飾，構築所選補丁之胺基酸組成因隨機突變而改變的表面展示文庫，且接著使用標準表現展示技術，針對所需功能篩選表面展示之序列變異體，將新分子識別位點工程改造至多肽Fc區中。如本文所使用，術語「隨機突變」包括部分隨機突變以及具有預定核苷酸或胺基酸混合比的序列變化。選擇用於隨機突變的典型表面暴露補丁具有在600至1500Å2之間的面積，且包含約7至15個胺基酸。
根據本文所述之方法，設計並產生以下定位區。如本文所使用，術語「定位區」係指形成連續表面的一系列表面暴露之胺基酸殘基，該等胺基酸殘基可以改變(例如藉由將突變引入肽編碼基因序列中以在定位區中所列位置處產生胺基酸取代、插入及/或缺失)。
CH2A2定位區(表1)包括如參照SEQ ID NO：1中所述之人類IgG1 Fc區胺基酸序列編號的胺基酸位置47、49、56、58、59、60、61、62及63。CH2A2定位區係設計成沿β摺疊、相鄰轉角及隨後之環形成表面。其自FcγR及FcRn 結合位點完全移除。
CH2C定位區(表2)包括如參照SEQ ID NO：1中所述之人類IgG1 Fc區胺基酸序列編號的胺基酸位置39、40、41、42、43、44、68、70、71及72。CH2C定位區利用沿靠近鉸鏈且與CH2區之FcγR結合位點極其接近的一系列環的溶劑暴露殘基。
CH2D定位區(表3)包括如參照SEQ ID NO：1中所述之人類IgG1 Fc區胺基酸序列編號的胺基酸位置41、42、43、44、45、65、66、66、69及73。與CH2C類似，CH2D定位區利用沿在CH2區頂部且與FcγR結合位點極其接近的一系列環的溶劑暴露殘基。CH2C及CH2D定位區在很大程度上共享一個環且在用於結合之第二環中存在不同。
CH2E3定位區(表4)包括如參照SEQ ID NO：1中所述之人類IgG1 Fc區胺基酸序列編號的胺基酸位置45、47、49、95、97、99、102、103及104。CH2E3定位區位置亦接近FcγR結合位點，但除利用一些環殘基外，亦利用在鄰近FcγR結合位點附近之環之β摺疊上的溶劑暴露殘基。
CH3B定位區(表5)包括如參照SEQ ID NO：1中所述之人類IgG1 Fc區胺基酸序列編號的胺基酸位置118、119、120、122、210、211、212及213。CH3B定位區主要由兩個平行β摺疊上的溶劑暴露殘基以及靠近CH3區C末端之若干較低結構化之殘基構成。其遠離FcγR及FcRn結合位點。
CH3C定位區(表6)包括如參照SEQ ID NO：1中所述之人類IgG1 Fc 區胺基酸序列編號的胺基酸位置157、159、160、161、162、163、186、189及194。CH3C定位區位置藉由包括來自遠離FcγR及FcRn結合位點的兩個環之溶劑暴露殘基而形成連續表面。
合成編碼野生型人類Fc序列(SEQ ID NO：1)的DNA模板並將其併入噬菌粒載體中。噬菌粒載體含有ompA或pelB前導序列、Fc插入序列與c-Myc及6×His抗原決定基標籤之融合物，以及琥珀終止密碼子，後接M13衣殼蛋白pIII。
產生在隨機突變之相應位置處含有「NNK」三密碼子之引子，其中N係任何DNA鹼基(亦即，A、C、G或T)且K係G或T。或者，使用進行「軟」隨機突變之引子，其中在每一隨機突變位置使用對應於70%野生型鹼基及10%其他三個鹼基中之每一個的鹼基混合物。藉由以PCR擴增Fc區中對應於隨機突變區域之片段，且接著使用含SfiI限制性位點之末端引子組裝，隨後用SfiI消化並連接至噬菌粒載體中來產生文庫。或者，使用該等引子進行Kunkel誘變。熟習此項技術者已知進行Kunkel誘變之方法。將連接之產物或Kunkel產物轉型至電感受態大腸桿菌TG1細胞株(自Lucigen®獲得)中。在回收並生長隔夜後，用M13K07輔助噬菌體感染大腸桿菌細胞，之後用5% PEG/NaCl使文庫噬菌體沈澱，將其再懸浮於含15%甘油之PBS中，並冷凍待用。典型文庫大小在約109至約1011個轉型體範圍內。經由pIII融合之Fc與未連接至pIII之可溶性Fc(該可溶性Fc係由於琥珀終止密碼子在pIII之前而產生)之間配對，將Fc二聚體展示於噬菌體上。
合成編碼野生型人類Fc序列的DNA模板並將其併入酵母展示載體中。對於CH2及CH3文庫，將Fc多肽展示於Aga2p細胞壁蛋白上。兩種載體 均含有具有Kex2裂解序列之前原前導肽，及c-Myc抗原決定基標籤與Fc末端之融合物。
使用與關於噬菌體文庫所描述之方法類似的方法，不過用含該載體同源末端之引子進行片段擴增來組裝酵母展示文庫。將線性化載體及組裝之文庫插入序列經電穿孔放入新鮮製備之電感受態酵母(亦即，EBY100菌株)中。電穿孔方法係熟習此項技術者所知的。在選擇性SD-CAA培養基中回收之後，使酵母生長至匯合並分離兩次，接著藉由轉移至SG-CAA培養基中誘導蛋白質表現。典型文庫大小在約107至約109個轉型體範圍內。藉由相鄰展示之Fc單體配對來形成Fc二聚體。
噬菌體方法改編自Phage Display：A Laboratory Manual(Barbas,2001)。另外的方案詳情可自該參考文獻獲得。
將人類TfR靶塗佈於MaxiSorp®微量滴定板上(典型地1-10μg/mL於PBS中，200μL)，在4℃下保持隔夜。所有結合均在室溫下進行，除非另外說明。將噬菌體文庫添加至各孔中並培育隔夜進行結合。用含0.05% Tween® 20之PBS(PBST)充分洗滌微量滴定孔並藉由將該等孔與酸(典型地為含500mM KCl之50mM HCl，或100mM甘胺酸，pH 2.7)一起培育30分鐘來溶離經結合噬菌體。用1M Tris(pH 8)中和經溶離之噬菌體，並使用TG1細胞和M13/KO7輔助噬菌體擴增，並使其在37℃下於含50μg/mL羧苄西林及50μg/mL卡那黴素之2YT培養基中生長隔夜。將自含靶之孔溶離之噬菌體的力價與自不含靶之孔回收之噬菌體的力價相比較來評估富集情況。隨後藉由縮短結合期間之培育時間以及增加洗滌時間及洗滌次數來增加選擇嚴格度。
使用NHS-PEG4-生物素(自PierceTM獲得)，經由游離胺使人類TfR靶生物素化。對於生物素化反應，在PBS中使用3倍至5倍莫耳過量之生物素試劑。用Tris淬滅反應，隨後在PBS中充分透析。將生物素化之靶固定於塗有抗生蛋白鏈菌素之磁珠(亦即，自Thermo Fisher獲得的M280-抗生蛋白鏈菌素珠粒)上。將噬菌體展示文庫與塗有靶之珠粒一起在室溫下培育1小時。接著移除未結合之噬菌體並用PBST洗滌珠粒。藉由與含500mM KCl之50mM HCl(或0.1M甘胺酸，pH 2.7)一起培育30分鐘來溶離經結合噬菌體，且接著如上文關於板分選所描述進行中和及繁殖。
在三輪至五輪淘選後，藉由在噬菌體上表現Fc或在大腸桿菌周質中可溶性表現Fc來篩選單一純系。該等表現方法係熟習此項技術者所知的。使個別噬菌體上清液或周質提取物暴露於塗有靶或陰性對照的經阻斷ELISA板且隨後，對於周質提取物使用HRP偶聯之山羊抗Fc(自Jackson Immunoresearch獲得)或對於噬菌體使用抗M13(GE Healthcare)進行偵測，接著用TMB試劑(自Thermo Fisher獲得)顯色。將OD450值為背景值約5倍的孔視為陽性純系並測序，之後，將一些純系表現為可溶性Fc片段或Fc片段與Fab片段之融合物形式。
以與Ackerman等人，2009 Biotechnol.Prog.25(3),774中所描述類似之方法進行MACS及FACS選擇。用生物素化靶標記抗生蛋白鏈菌素磁珠(例如來自ThermoFisher之M-280抗生蛋白鏈菌素珠粒)並將其與酵母(典型地5-10×文庫多樣性)一起培育。移除未結合之酵母，洗滌珠粒，並使經結合酵母在選擇性培養基中生長並誘導用於後續數輪選擇。
用抗c-Myc抗體標記酵母以監測表現及生物素化靶(濃度隨分選次數 而變化)。在一些實驗中，為增強相互作用之親合力，將靶與抗生蛋白鏈菌素-Alexa Fluor® 647預混合。在其他實驗中，在與抗生蛋白鏈菌素-Alexa Fluor® 647結合並洗滌後，偵測生物素化靶。使用FACS Aria III細胞分選儀分選具有結合之單一酵母。使分選之酵母在選擇性培養基中生長，接著誘導用於後續數輪選擇。
在獲得富集之酵母群後，將酵母塗鋪於SD-CAA瓊脂板上並使單一集落生長並誘導表現，接著如上文所描述進行標記以確定其結合至靶的傾向。隨後對結合靶之陽性單一純系進行測序，之後，一些純系表現為可溶性Fc片段或Fc片段與Fab片段之融合物形式。
自淘選輸出物選擇純系且使其在96孔深孔板各孔中生長。該等純系使用自動誘導培養基(自EMD Millipore獲得)誘導周質表現，或用輔助噬菌體感染以將個別Fc變異體經噬菌體展示於噬菌體上。使培養物生長隔夜且離心以使大腸桿菌沈澱。對於噬菌體ELISA，直接使用含噬菌體之上清液。對於周質表現，將沈澱物再懸浮於20%蔗糖中，隨後用水以4：1稀釋，並在4℃下振盪1小時。對板離心以使固體沈澱且上清液用於ELISA中。
用典型地0.5mg/mL靶塗佈ELISA板隔夜，接著用1% BSA阻斷，隨後添加噬菌體或周質提取物。在培育1小時並洗掉經結合蛋白質之後，添加HRP偶聯之二級抗體(亦即，抗Fc或抗M13，分別針對可溶性Fc或噬菌體展示之Fc)並培育30分鐘。再次洗滌板，且接著用TMB試劑顯色並用2N硫酸淬滅。使用酶標儀(BioTek®)定量在450nm下之吸光度並在適用時，使用Prism軟體繪製結合曲線。將測試純系之吸光度信號與陰性對照(不含Fc之噬菌體或周質提取物)相比較。在一些檢定中，在結合步驟期間添加典型地大量莫耳過量(大於10 倍過量)的可溶性鐵飽和轉鐵蛋白。
將Fc變異體多肽(在噬菌體上、周質提取物中或以與Fab片段之融合物形式可溶地表現)添加至96孔V形底培養板(每孔約100,000個細胞於PBS+1% BSA(PBSA)中)中，並在4℃下培育1小時。隨後對板離心並移除培養基，且接著用PBSA洗滌細胞一次。將細胞再懸浮於含二級抗體(山羊抗人類IgG-Alexa Fluor® 647(自Thermo Fisher獲得))之PBSA中。30分鐘後，對板離心並移除培養基，用PBSA洗滌細胞1-2次，且接著在流式細胞儀(亦即，FACSCantoTM II流式細胞儀)上讀取板。使用FlowJo軟體計算各條件下之中值螢光度值並用Prism軟體繪製結合曲線。
如上文所描述，針對TfR淘選及分選有關CH2A2之噬菌體及酵母文庫。在四輪噬菌體淘選之後，如以上題為「藉由ELISA篩選」之部分中所描述，在ELISA檢定中鑑別結合人類及/或食蟹獼猴(cyno)TfR之純系。代表性純系之序列分為兩組：第1組含有15個獨特序列(亦即，SEQ ID NO：47-61)且第2組含有單一獨特序列(亦即，SEQ ID NO：62)。第1組序列在60-61位具有保守Glu-Trp基元。在任何其他位置未發現共同序列，不過58位偏好Arg且59位偏好Trp或Tyr。
在噬菌體表面上表現個別CH2A2變異體且利用ELISA，針對與人類TfR、食蟹獼猴TfR或不相關對照之結合進行檢定。利用ELSA，針對結合至C末端c-Myc抗原決定基標籤之抗Myc抗體9E10確定Fc之表現。圖1A-1D中顯示的四個代表性純系之資料展示，其全部充分表現且結合至人類TfR，但均不結 合至不相關對照。第1組的三個純系亦結合至食蟹獼猴TfR，而第2組的一個純系(亦即，純系2A2.16)對人類TfR具有特異性。
在另一檢定中，噬菌體之濃度保持恆定(亦即，為約EC50)且添加不同濃度之可溶性競爭物，即鐵飽和轉鐵蛋白或人類TfR。圖2A及2B顯示，添加濃度達5μM之鐵飽和轉鐵蛋白對結合無明顯影響。相反，可溶性人類TfR可以競爭結合至表面吸附之人類TfR，表明特異性相互作用。
CH2A2變異體藉由選殖至含抗BACE1可變區序列之表現載體中而表現為Fc與抗BACE1 Fab片段之融合物形式。在293或CHO細胞中表現後，藉由蛋白質A及尺寸排阻層析法純化所得CH2A2-Fab融合物，且接著使用ELISA、表面電漿子共振(SPR；亦即，使用BiacoreTM儀器)、生物膜層干涉法(亦即，使用Octet® RED系統)、細胞結合(例如流式細胞測量術)及本文所述之其他方法檢定結合。另外，藉由熱解鏈、冷凍-解凍及熱加速變性來表徵所得多肽-Fab融合物之穩定性。
構築兩個二級文庫以增強初始匹配(hit)針對人類及食蟹獼猴TfR之結合親和力。第一個文庫係基於第1組純系產生。60位及61位之保守EW基元保持不變，且使用軟隨機突變使58位之半保守R突變。其他文庫位置(亦即，位置47、49、56、59、62及63)藉由飽和誘變進行突變。第二個文庫係基於第2組純系構築。此文庫係藉由使原始CH2A2文庫位置軟隨機突變產生，但使用純系2A2.16(SEQ ID NO：62)作為模板(而非野生型Fc(SEQ ID NO：1))。構築兩個文庫，使用上文所述之方法進行噬菌體及酵母展示。
使用上述方法篩選該等文庫並藉由ELISA鑑別出結合人類TfR之若干純系(表1)。
如上文所描述，針對TfR淘選及分選有關CH2C之噬菌體及酵母文庫。在四輪噬菌體淘選後，如以上題為「藉由ELISA篩選」部分中所述，在ELISA檢定中鑑別出結合人類及/或食蟹獼猴(cyno)TfR之純系(亦即，第1組及4個純系)，且在四輪或五輪酵母分選後，如以上題為「酵母選擇之通用方法」部分中所述，藉由酵母結合檢定鑑別另外的純系(亦即，第2組及3個純系)。代表性純系之序列分為四組：第1組含有16個獨特序列(亦即，SEQ ID NO：63-78)，第2組含有4個獨特序列(亦即，SEQ ID NO：79-82)，第3組含有2個獨特序列(亦即，SEQ ID NO：83-84)且第4組含有單一序列(亦即，SEQ ID NO：85)。第1組序列具有在39位之半保守Pro、在42位之半保守Pro、在43位之保守Pro、在44位之半保守Trp、在68位之半保守Glu、在70位之保守Tyr及在其他文庫位置之極少特定偏好。第2組序列具有在39位之保守Met、在40位之半保守L、在42位之保守Pro、在43位之保守Val、在44位之半保守Pro、在68位之半保守Thr、在70位之保守His及在72位之保守Pro。第3組2個序列僅68位不同，此處存在Val或Leu。第4組由單一純系(亦即，CH2C.23)組成，其序列如SEQ ID NO：85中所示。
CH2C變異體藉由選殖至含抗BACE1可變區序列之表現載體中而表現為Fc與Fab片段之融合物形式。在293或CHO細胞中表現後，藉由蛋白質A及尺寸排阻層析法純化所得多肽-Fab融合物，接著檢定其與人類或食蟹獼猴TfR之結合。如圖3A中所示，第4組純系CH2C.23與鐵飽和轉鐵蛋白競爭。圖3B中顯示出屬於第1組序列之純系針對人類及食蟹獼猴TfR之結合力價。在存在或不存在鐵飽和Tf下，在噬菌體上測試來自其他序列組之代表性純系之結合(參看圖3C)，且在鐵飽和轉鐵蛋白存在下，藉由生物膜層干涉法(亦即，使用Octet® RED系統)測試純系CH2C.7與人類TfR之結合(參看圖3D)。除不與鐵飽和Tf競爭的測試純系CH2C.23外，大多數純系與食蟹獼猴TfR顯示出一定交叉反應性。
如上文所描述，針對TfR淘選及分選有關CH3B之噬菌體及酵母文庫。在四輪噬菌體淘選後，如以上題為「藉由ELISA篩選」部分中所述，在ELISA檢定中鑑別出結合人類及/或食蟹獼猴TfR之純系，且在四輪或五輪酵母分選後，如以上題為「酵母選擇之通用方法」部分中所述，藉由酵母結合檢定鑑別另外的純系。自噬菌體及酵母鑑別的全部17個純系(亦即，SEQ ID NO：30-46)具有相關序列；該等序列具有在118位之半保守Phe、在119位之半保守帶負電Asp或Glu、在122位之半保守Thr、在210位之保守G、在211位之保守Phe、在212位之半保守His及在213位之保守Asp。若干純系具有T123I突變，該突變不在文庫設計中有意突變之位置，但可能因重組或PCR錯誤而引入。
在噬菌體表面上表現兩個代表性純系CH3B.11(SEQ ID NO：40)及CH3B.12(SEQ ID NO：41)，且在存在或不存在鐵飽和Tf下，測試其與人類及食蟹獼猴TfR之結合。添加鐵飽和Tf對純系無影響(圖4A)。另外，CH3B變異體藉由選殖至含抗BACE1可變區序列之表現載體中而表現為與Fab片段之融合物形式。在293或CHO細胞中表現後，藉由蛋白質A及尺寸排阻層析法純化所得多肽-Fab融合物，接著檢定其與人類或食蟹獼猴TfR之結合(圖4B)。所有純系顯示與兩種直系同源物之特異性結合。
使用與以上關於CH2A2之其他文庫設計及篩選所述的方法類似的 額外工程改造方法改善CH3B純系之親和力。詳言之，如圖5(深色表面表示原始文庫定位區；淺色補丁表示新誘變之位置)中所示，選擇若干組靠近互補位的四至七個殘基補丁進行進一步變化。使用純系CH3B.12(SEQ ID NO：41)作為起點；選擇用於飽和(亦即，NNK)誘變之殘基如下：CH3B-補丁1(SEQ ID NO：101)：胺基酸位置127、128、129、131、132、133及134；CH3B-補丁2(SEQ ID NO：102)：胺基酸位置121、206、207及209；CH3B-補丁3(SEQ ID NO：103)：胺基酸位置125、214、217、218、219及220；CH3B-補丁4(SEQ ID NO：104)：胺基酸位置115、117、143、174及176；及CH3B-補丁5(SEQ ID NO：105)：胺基酸位置155、157、158、193、194及195。
使用PCR誘變產生文庫且如以上題為「產生噬菌體展示文庫」及「產生酵母展示文庫」部分中所描述，將其放入酵母及噬菌體中。使用上述方法篩選該等文庫並藉由ELISA鑑別出結合人類TfR之若干純系(表5)。
如上文所述，針對TfR淘選有關CH2D之噬菌體文庫。如以上題為「藉由ELISA篩選」之部分中所描述，在ELISA檢定中鑑別結合人類及/或食蟹獼猴TfR之純系。鑑別出五個獨特純系，該等純系歸為分別具有2個及3個序列之兩個序列家族(表3)。序列組1(亦即，純系CH2D.1(SEQ ID NO：86)及CH2D.2(SEQ ID NO：87))具有在40-45位之保守VPPXM(SEQ ID NO：111)基元、在64-67位之SLTS(SEQ ID NO：112)基元及在73位之V。在40位之突變未包括在設計中且其可能歸因於PCR錯誤或重組。序列組2(亦即，純系CH2D.3(SEQ ID NO：88)、CH2D.4(SEQ ID NO：89)及CH2D.5(SEQ ID NO：90))具有在41位之保守D、在42位之半保守D、在43位之保守W、在44位之半保守E、在45位之 保守芳族胺基酸(W或Y)、在64-65位之保守PW基元及在73位之保守W。
CH2D變異體藉由選殖至含抗BACE1可變區序列之表現載體中而表現為與Fab片段之融合物形式。在293或CHO細胞中表現後，藉由蛋白質A及尺寸排阻層析法純化所得多肽-Fab融合物，接著在存在或不存在鐵飽和Tf下，使用本文先前所描述之方法，檢定其與食蟹獼猴及人類TfR之結合。
如上文所述，針對TfR淘選有關CH2E3之噬菌體文庫。如以上題為「藉由ELISA篩選」之部分中所描述，在ELISA檢定中鑑別結合人類及/或食蟹獼猴TfR之純系。自5個序列鑑別出三個序列組，不過其中兩個組各自僅由一個獨特序列組成(表4)。序列組2具有3個獨特序列(亦即，純系CH2E3.2(SEQ ID NO：92)、CH2E3.3(SEQ ID NO：93)及CH2E3.4(SEQ ID NO：94))具有在45位之半保守Val、在47位之保守Gly、在49位之保守Arg、在95位之保守Arg、在97位及99位之保守Ser、在103位之保守Trp及在104位之Arg或Lys。
CH2E3變異體藉由選殖至含抗BACE1可變區序列之表現載體中而表現為與Fab片段之融合物形式。在293或CHO細胞中表現後，藉由蛋白質A及尺寸排阻層析法純化所得多肽-Fab融合物，接著在存在或不存在鐵飽和Tf下，使用本文先前所描述之結合方法，檢定其與食蟹獼猴及人類TfR之結合。
如上文所描述，針對TfR淘選並分選有關CH3C之酵母文庫。前三輪分選之群體富集FACS圖顯示於圖6中。在另兩輪分選後，對單一純系測序並 鑑別出四個獨特序列(亦即，純系CH3C.1(SEQ ID NO：4)、CH3C.2(SEQ ID NO：5)、CH3C.3(SEQ ID NO：6)及CH3C.4(SEQ ID NO：7))。該等序列在161位具有保守Trp，且在194位皆具有芳族殘基(亦即，Trp、Tyr或His)。在其他位置存在較大多樣性。
在CHO或293細胞中將選自CH3C文庫之四個純系表現為Fc與Fab片段之融合物形式，並藉由蛋白質A及尺寸排阻層析法純化，且接著在存在或不存在鐵飽和Tf下，利用ELISA針對與人類TfR之結合進行篩選。如圖7中所示，該等純系均結合至人類TfR且添加過量(5μM)鐵飽和Tf不影響該結合。然而，該等純系不明顯結合至食蟹獼猴TfR。亦測試純系與內源性表現人類TfR之293F細胞的結合。圖8顯示，該等純系結合至293F細胞，但總體結合大體上不如高親和力陽性對照。
接下來，測試純系CH3C.3是否能內化於TfR表現細胞中。使黏附HEK 293細胞在96孔板中生長至約80%匯合，移除培養基且添加1μM濃度樣品：CH3C.3、抗TfR基準陽性對照抗體(Ab204)、抗BACE1基準陰性對照抗體(Ab107)及人類IgG同型對照(自Jackson Immunoresearch獲得)。在37℃及8% CO2濃度下培育該等細胞30分鐘，接著洗滌，用0.1% TritonTM X-100透性化，並用抗人類IgG-Alexa Fluor® 488二級抗體染色。再次洗滌後，在高內含物螢光顯微鏡(亦即，Opera PhenixTM系統)下獲取細胞圖像，並定量每個細胞之斑點數，如圖9中所示。在1μM下，純系CH3C.3顯示與陽性抗TfR對照類似的內化傾向，而陰性對照不顯示內化作用。
產生其他文庫以改善初始CH3C匹配針對人類TfR之親和力，並嘗試引入與食蟹獼猴TfR之結合。使用軟隨機突變方法，其中基於原始四個匹配 中之每一個，產生DNA寡聚物以引入軟誘變。經由獨立片段構建定位區之第一部分(WESXGXXXXXYK；SEQ ID NO：113)及定位區之第二部分(TVXKSXWQQGXV；SEQ ID NO：114)，因此，軟隨機突變之定位區在PCR擴增期間該改組(例如，來自純系CH3C.1之定位區的第一部分與來自純系CH3C.1、CH3C.2、CH3C.3及CH3C.4之定位區的第二部分混合等等)。混合所有片段且接著將其引入酵母中以實現表面表現及選擇。
選擇方案顯示於圖10中。在一輪MACS及三輪FACS後，對個別純系測序(純系CH3C.17(SEQ ID NO：8)、CH3C.18(SEQ ID NO：9)、CH3C.21(SEQ ID NO：10)、CH3C.25(SEQ ID NO：11)、CH3C.34(SEQ ID NO：12)、CH3C.35(SEQ ID NO：13)、CH3C.44(SEQ ID NO：14)及CH3C.51(SEQ ID NO：15))。所選純系分為兩個常見序列組。第1組純系(亦即，純系CH3C.18、CH3C.21、CH3C.25及CH3C.34)分別具有在157位半保守之Leu、在159位之Leu或His以及在160位及162位分別保守及半保守之Val，及在186位、189位及194位半保守之P-T-W基元。第2組純系分別具有在157位之保守Tyr、在位置159-163處之基元TXWSX(SEQ ID NO：602)以及在186位、189位及194位之保守基元S/T-E-F。在另外的研究中，使用純系CH3C.18及CH3.35作為各序列組之代表性成員。應注意，純系CH3C.51具有來自第1組之其定位區的第一部分及來自第2組之其定位區的第二部分。
使來自軟誘變文庫之純系形式改換為Fc-Fab融合物多肽且如上文所述進行表現及純化。如圖12中所示，該等變異體相較於初始文庫選擇之首位純系(CH3C.3)具有改善的與人類TfR之ELISA結合，且另外，不與鐵飽和Tf競爭。如下表7中所示，鐵飽和Tf之存在或不存在不明顯影響EC50值而超出實驗誤差範圍。
值得注意的是，純系CH3C.35與人類TfR之結合與高親和力抗Tfr對照抗體Ab204大致相當。如圖13中所示，選自軟隨機突變文庫之純系亦具有改善的與293F細胞之細胞結合。在類似細胞結合檢定中，測試該等純系與在表面上高水準穩定表現人類或食蟹獼猴TfR之CHO-K1細胞的結合。選自軟隨機突變文庫之純系結合至表現人類TfR(圖14A)以及食蟹獼猴TfR(圖14B)之細胞且不結合至親本CHO-K1細胞(圖14C)。相較於人類TfR，針對食蟹獼猴TfR之幅值及結合EC50值明顯較低。資料概述於下表8中。
為了確定工程改造之CH3C Fc區是否結合至TfR之頂端結構域，在噬菌體表面上表現TfR頂端結構域(人類及食蟹獼猴分別為SEQ ID NOS：107及108)。為了正確摺疊並展示頂端結構域，須截短一個環且需要將序列環形佈置； 鑑別出噬菌體上表現的人類及食蟹獼猴之序列分別為SEQ ID NO：109及110。將純系CH3C.18及CH3C.35塗佈於ELISA板上並遵循先前描述之噬菌體ELISA方案。簡言之，在用1%PBSA洗滌並阻斷後，添加噬菌體展示之稀釋液並在室溫下培育1小時。隨後洗滌板並添加抗M13-HRP，且再次洗滌之後，用TMB受質使板顯色並用2N H2SO4淬滅。在本檢定中，CH3C.18及CH3C.35均結合至頂端結構域。
由於已知與食蟹獼猴TfR之結合比與人類TfR之結合要弱得多，故假定在食蟹獼猴與人類頂端結構域之間存在的一或多個胺基酸差異可能引起結合差異。因此，在人類TfR頂端結構域中作出一系列六個點突變，其中人類殘基經相應食蟹獼猴殘基置換。使該等突變體展示於噬菌體上且藉由OD268使噬菌體濃度正規化並藉由噬菌體ELISA滴定測試與CH3C.18及CH3C.35之結合(圖16B及16C)。捕捉於抗Myc抗體9E10上顯示，所有突變體之展示量係類似的(圖16A)。與人類TfR突變之結合清楚顯示出R208G突變之顯著影響，表明此殘基係抗原決定基之關鍵部分且受此位置處食蟹獼猴殘基之負面影響。對噬菌體展示之食蟹獼猴頂端結構域進行G208R突變且顯示，此突變明顯改善與食蟹獼猴頂端結構域之結合(圖16D及16E)。該等結果顯示，CH3C純系結合至TfR之頂端結構域且208位對於結合很重要，而位置247、292、364、370及372明顯不重要。
為瞭解Fc結構域中對於TfR結合最重要之殘基，產生一系列突變體純系CH3C.18及CH3C.35，其中各突變體在TfR結合定位區中有一個位置回復突變成野生型。所得變異體重組表現為CH3C Fc-Fab融合物形式且測試其與人類或食蟹獼猴TfR之結合(圖17)。對於CH3C.35，位置161及194對於結合很重要；該等位置中之任一個回復突變成野生型完全消除與人類TfR之結合。意 外地是，163位回復突變成野生型使得與食蟹獼猴TfR之結合明顯增強，同時對人類結合具有極少影響。相反，殘基163回復突變成野生型在CH3C.18中具有極少影響，但在此變異體中，189位及194位回復突變使得與人類TfR之結合完全消除。在兩種變異體中，其他單一回復突變對人類TfR結合具有中等(不利)影響，同時在許多情況下，使得與食蟹獼猴TfR之結合消除。
製備其他文庫以進一步增加CH3C變異體對食蟹獼猴TfR之親和力。該等文庫係設計成理論多樣性少於約107個純系，由此可以使用酵母表面展示研究整個多樣性空間。該等文庫之設計顯示於圖18中。使用四個文庫設計；所有文庫均使用含NNK或其他簡併密碼子位置之簡併寡核苷酸產生，並藉由重疊PCR擴增，如上文所述。
第一個文庫係基於類CH3C.35序列之共同序列(圖18A)。此處，位置157-161恆定保持為YGTEW(SEQ ID NO：115)，而位置162、163、186、189及194則使用飽和誘變進行突變。
第二個文庫係基於類CH3C.18序列之共同序列(圖18B)。此處，157位侷限於Leu及Met，159位侷限於Leu及His，160位恆定保持為Val，161位侷限於Trp及Gly，162位侷限於Val及Ala，163位完全隨機突變，164位添加至定位區中且完全隨機突變，186位軟隨機突變，189位完全隨機突變，且194位侷限於芳族胺基酸及Leu。
第三個文庫添加新隨機突變之位置至該文庫中(圖18C)。產生兩種形式，分別具有CH3C.18及CH3C.35作為起始定位區，且接著藉由飽和誘變使其他位置隨機突變：E153、E155、Y164、S188及Q192。
第四個文庫對於CH3C.18保持某些位置恆定，但允許在其他位置存在變化，相較於共同序列文庫偏差較少(圖18D)。位置160、161及186固定不 變，且位置157、159、162、163及189藉由飽和誘變隨機突變；194位突變但侷限於芳族胺基酸及Leu。
在酵母中針對食蟹獼猴TfR對該等文庫進行四至五輪選擇，且對單一純系測序並將其轉化成多肽-Fab融合物，如上文所述。自第二個文庫(亦即，CH3.18親本純系之衍生物)觀察到最豐富的食蟹獼猴TfR結合，不過在huTfR結合方面亦存在一定損失。
如上文所述，利用純化之CH3C Fc-Fab融合物及塗佈於板上的人類或食蟹獼猴TfR進行結合ELISA。來自CH3C.18成熟文庫、CH3C.3.2-1、CH3C.3.2-5及CH3C.3.2-19之變異體以大致相等的EC50值結合人類及食蟹獼猴TfR，而親本純系CH3C.18及CH3C.35與人類TfR之結合比與食蟹獼猴TfR之結合強10倍(圖19)。
接下來，測試新多肽是否內化於人類及猴細胞中。使用先前上文在題為「第一代CH3C純系之表徵」部分中所描述的方案，測試於人類HEK293細胞及恆河猴LLC-MK2細胞中之內化情況。如圖20中所示，類似地結合人類及食蟹獼猴TfR之變異體，即CH3C.3.2-5及CH3C.3.2-19相較於CH3C.35在LLC-MK2細胞中具有明顯改善之內化作用。
針對其他親和力成熟純系CH3C.18及CH3C.35之額外工程改造涉及添加另外的突變至經由直接相互作用、第二殼相互作用或結構穩定化增強結合之主鏈(亦即，非定位區)位置。此目的係經由產生「NNK步行」或「NNK補丁」文庫並進行選擇來實現。NNK步行文庫涉及使互補位附近之殘基逐一發生NNK突變。藉由觀察結合至FcgRI(PDB ID：4W4O)之Fc的結構，鑑別出如圖21中所示之原始文庫位置附近的44個殘基為詢問之候選物。具體言之，將以下殘基 作為靶進行NNK誘變：K21、R28、Q115、R117、E118、Q120、T132、K133、N134、Q135、S137、K143、E153、E155、S156、G158、Y164、K165、T166、D172、S173、D174、S176、K182、L183、T184、V185、K187、S188、Q191、Q192、G193、V195、F196、S197、S199、Q211、S213、S215、L216、S217、P218、G219及K220。使用Kunkel誘變技術產生44個單點NNK文庫，且彙集產物並如以上關於其他酵母文庫所描述，經由電穿孔將其引入酵母中。
組合該等微型文庫(其各自具有一個位置突變，產生20種變異體)產生一個小型文庫，該文庫係使用酵母表面展示針對引起較高親和力結合的任何位置進行選擇。如上文所述，使用TfR頂端結構域蛋白質進行選擇(圖22)。在三輪分選之後，對來自富集酵母文庫之純系進行測序，並鑑別出若干「熱點」位置，其中某些點突變明顯改善與頂端結構域蛋白質之結合。對於CH3C.35，該等突變包括E153(突變成Trp、Tyr、Leu或Gln)及S188(突變成Glu)。CH3C.35單突變體及組合突變體之序列陳述於SEQ ID NO：21-23、236-241及297-299中。對於CH3C.18，該等突變包括E153(突變成Trp、Tyr或Leu)及K165(突變成Gln、Phe或His)。CH3C.18單一突變體之序列陳述於SEQ ID NO：242-247中。
「NNK補丁」方法類似於以上關於CH3B文庫所描述之方法，但利用直接鄰近CH3C定位區之補丁。使用純系CH3C.35作為起點並產生以下文庫：CH3C-補丁1：胺基酸位置：K21、R28、Y164、K165及T166；CH3C-補丁2：胺基酸位置：Q115、R117、E118、Q120及K143；CH3C-補丁3：胺基酸位置：T132、K133、N134、Q135及S137；CH3C-補丁4：胺基酸位置：E153、E155、S156及G158；CH3C-補丁5：胺基酸位置：D172、S173、D174、S176及K182；CH3C-補丁6：胺基酸位置：L183、T184、V185、K187及S188；CH3C-補丁7：胺基酸位置：Q191、Q192、G193、V195及F196； CH3C-補丁8：胺基酸位置：S197、S199、Q211、S213及S215；及CH3C-補丁9：胺基酸位置：L216、S217、P218、G219及K220。
如上文所述，使用TfR頂端結構域蛋白質進行選擇。不過，未鑑別出結合增強之純系。
在另一態樣中，本發明之特徵在於一種用於增強包含非天然結合位點之經修飾Fc多肽與靶(例如轉鐵蛋白受體)之結合的方法，該方法包括：(a)在該非天然結合位點之10Å內(例如在9Å、8Å、7Å、6Å、5Å、4Å、3Å、2Å或1Å內)之一或多個位置處引入一或多個取代；及(b)測試該經修飾Fc多肽與該靶之結合。經修飾Fc多肽與靶(例如轉鐵蛋白受體)之結合特性可以使用此項技術中可用之方法，例如噬菌體及酵母選擇方法、ELISA、表面電漿子共振(SPR；亦即，使用BiacoreTM儀器)及FACS確定。
在一些實施例中，該非天然結合位點在以下位置中之一或多個處包含取代：157、159、160、161、162、163、186、189及194。
在一些實施例中，參照SEQ ID NO：1，在該非天然結合位點之10Å內之一或多個位置處的該一或多個取代係選自由以下組成之群：K21、R28、Q115、R117、E118、Q120、T132、K133、N134、Q135、S137、K143、E153、E155、S156、G158、Y164、K165、T166、D172、S173、D174、S176、K182、L183、T184、V185、K187、S188、Q191、Q192、G193、V195、F196、S197、S199、Q211、S213、S215、L216、S217、P218、G219及K220。
如關於先前之酵母文庫所描述，產生另一文庫，以鑑別NNK步行文庫中之突變組合，同時在其周圍添加若干另外的位置。在該文庫中，YxTEWSS及TxxExxxxF基元保持不變，且有六個位置完全隨機突變：E153、K165、K187、S188、S197及S199。包括位置E153及S188係因為其係NNK步行文庫中之「熱 點」。包括位置K165、S197及S199係因為其構成可以定位結合區之核心的一部分，而選擇K187係因為其鄰近188位。
如先前所描述，僅用食蟹獼猴TfR頂端結構域分選該文庫。五輪分選後，對富集之匯集物進行測序，且所鑑別之獨特純系之CH3區的序列陳述於SEQ ID NO：248-265中。
設計新一批文庫以研究主要結合互補位中的整個可接受之多樣性。所用方法類似於NNK步行文庫。用NNK密碼子使原始定位區位置(157、159、160、161、162、163、186、189及194)加兩個熱點(153及188)各自獨立地隨機突變以在酵母上產生一系列單位置飽和誘變文庫。此外，使每個位置個別地回復突變成野生型殘基，並將該等個別純系展示於酵母上。圖23顯示親本純系CH3C.35.21之結合與野生型形式及單位置NNK文庫的比較。注意到，位置153、162、163及188係在回復突變成野生型殘基後與TfR保持顯著結合的唯一位置(關於186回復突變成野生型觀察到有一些殘留但明顯減弱的結合)。
針對人類TfR頂端結構域對單位置NNK文庫進行三輪分選以收集約前5%之結合物，且接著對來自各文庫之至少16個純系進行測序。結果指示在CH3C.35純系之背景下各位置處可以接受而不會明顯減弱與人類TfR之結合的胺基酸。概述於下：153位：Trp、Leu或Glu；157位：Tyr或Phe；159位：僅Thr；160位：僅Glu；161位：僅Trp；162位：Ser、Ala或Val(應注意，儘管野生型Asn殘基看來保持一定結合，但 其未出現在後續文庫分選中)；163位：Ser或Asn；186位：Thr或Ser；188位：Glu或Ser；189位：僅Glu；及194位：僅Phe。
以上殘基當作為單一變化或組合變化取代至純系CH3C.35中時，表示保持與TfR頂端結構域之結合的互補位多樣性。在該等位置具有突變的純系顯示於表9中，且該等純系之CH3結構域的序列陳述於SEQ ID NO：237-241、264及266-296中。
儘管Fc結構域天然地形成同二聚體，但稱為「孔中節」之一系列不對稱突變可能使兩個Fc片段優先異二聚體化，其中一個Fc單元具有T139W節突變(使用EU編號方案，該突變對應於366位)且另一個Fc單元具有T139S、L141A及Y180V孔突變(使用EU編號方案，分別對應於位置366、368及407)。在一些實施例中，本發明之經修飾CH3結構域包含在139位之Trp。在一些實施例中，本發明之經修飾CH3結構域包含在139位之Ser、在141位之Ala及在180位之Val。異二聚體TfR結合多肽係藉由兩個質體(亦即，節-Fc及孔-Fc)之短暫共轉染在293或CHO細胞中表現，而多肽-Fab融合物係藉由三個質體(亦即，節-Fc-Fab重鏈、孔-Fc-Fab及共同輕鏈)之短暫共轉染表現。以與同二聚體相同之方式純化所分泌的異二聚體多肽或多肽-Fab融合物(亦即，使用蛋白質A隨後尺寸排阻層析進行兩管柱純化，必要時，接著進行濃縮及緩衝液交換)。使用質譜法或疏水相互作用層析法測定所形成的異二聚體對比同二聚體(例如節-節或 孔-孔配對的Fc)的量。由典型製備型層析法測定超過95%多肽且通常超過98%為異二聚體。為清楚起見，以此方式產生的所有單價TfR結合物(Fc同二聚體)均稱為「ZZ.mono」，其中ZZ係多肽之名稱且「.mono」指示單價TfR結合。對於異二聚體多肽及多肽-Fab融合物，除非另外指示，否則賦予TfR結合之突變包括「節」突變，而非TfR結合Fc區與「孔」區一起使用。在一些情況下，在該等構築體中亦包括改變Fc特性的額外突變，諸如對於經修飾FcγR或FcRn結合分別為L7A/L8A、M25Y/S27T/T29E、N207S或N207S/M201L。
在ELISA中，使用修改的上述程序，量測單價CH3C多肽之結合。將含1μg/mL抗生蛋白鏈菌素之PBS塗佈於96孔ELISA板上，保持隔夜。洗滌後，用含1% BSA之PBS阻斷該等板，接著添加1μg/mL生物素化之人類或食蟹獼猴TfR，並培育30分鐘。再次洗滌後，將多肽之連續稀釋液添加至板中並培育1小時。洗滌板並添加二級抗體(亦即，抗κ-HRP，1：5,000)，保持30分鐘，並再次洗滌板。用TMB受質使板顯色並用2N H2SO4淬滅，且接著在BioTek®酶標儀上讀取在450nm下之吸光度。結果顯示於圖24中，其中直接比較了標準(亦即，二價TfR結合)與單價TfR結合多肽。Ab204係高親和力抗TfR對照抗體。
進一步測試與內源性表現人類TfR之293F細胞以及經人類TfR或食蟹獼猴TfR穩定轉染之CHO-K1的結合(圖25)。
一般而言，相較於二價多肽，觀察到單價多肽與人類TfR之結合明顯減少，且在該等檢定中，單價多肽與食蟹獼猴之結合太弱而無法偵測。
接下來，測試CH3C多肽之單價形式是否能內化於表現人類TfR之HEK293細胞中。使用以上關於內化檢定所描述之方法。如比較二價與單價多肽之圖26中所示，單價多肽亦可內化，但總體信號比對應二價形式要弱，此可能 歸因於結合親和力/親合力之損失。
使用生物膜層干涉法(亦即，使用Octet® RED系統)測定若干單價及二價CH3C多肽變異體與抗BACE1 Fab之融合物的結合動力學，並將其與其二價等效物相比較。將TfR捕捉於抗生蛋白鏈菌素感測器上，接著使CH3C多肽與其結合並洗滌。將感測器圖譜與1：1結合模型擬合；二價多肽之KD(app)值表示所希望的與TfR二聚體之結合。結果示於表10以及圖27及28中。
n.d.=因結合信號太弱而無法測定
轉化成單價形式的多肽因親合力損失而具有明顯較弱的KD(app)值。先前藉由ELISA顯示具有類似人類及食蟹獼猴TfR結合的純系CH3C.3.2-1、CH3C.3.2-5及CH3C.3.2-19在人類與食蟹獼猴TfR之間亦具有極其類似的KD(app)值。嘗試測試該等多肽之單價形式，但在此檢定中結合太弱而無法計算動力學參數。
使用BiacoreTM T200儀器，藉由表面電漿子共振測定純系變異體對重組TfR頂端結構域之親和力。BiacoreTM S系列CM5感測器晶片用抗人類Fab(來自GE Healthcare之人類Fab捕捉套組)固定。將5μg/mL多肽-Fab融合物捕捉於各流槽上，保持1分鐘，並在室溫下，以30μL/分鐘流速注入人類或食蟹獼猴頂 端結構域之連續3倍稀釋液。用45分鐘締合及3分鐘解離分析各樣品。每次注射後，使用10mM鹽酸甘胺酸(pH 2.1)使晶片再生。藉由用以類似密度捕捉不相關IgG之流槽減去RU來校正結合反應。藉由使用BiacoreTM T200評價軟體v3.1，針對濃度擬合平衡時之反應來獲得穩態親和力。
為了測定純系變異體對重組TfR胞外結構域(ECD)之親和力，用抗生蛋白鏈菌素固定BiacoreTM S系列CM5感測器晶片。將生物素化之人類或食蟹獼猴TfR ECD捕捉於各流槽上，保持1分鐘，並在室溫下，以30μL/分鐘流速注入純系變異體之連續3倍稀釋液。用45分鐘締合及3分鐘解離分析各樣品。藉由用類似密度的不含TfR ECD之流槽減去RU來校正結合反應。藉由使用BiacoreTM T200評價軟體v3.1，針對濃度擬合平衡時之反應來獲得穩態親合力。
結合親和力概述於表11中。藉由穩態擬合獲得親和力。
產生其他CH3C變異體CH3C.35.20.1.1、CH3C.35.23.2.1、 CH3C.35.23.1.1、CH3C.35.S413、CH3C.35.23.3.1、CH3C.35.N390.1及CH3C.35.23.6.1並遵循與先前所描述相同之方法，量測其與人類TfR之結合親和力。CH3C.35.20.1.1、CH3C.35.23.2.1、CH3C.35.23.1.1、CH3C.35.S413、CH3C.35.23.3.1、CH3C.35.N390.1及CH3C.35.23.6.1之結合親和力分別為620nM、690nM、750nM、1700nM、1900nM、2000nM及2100nM。
使用FortéBio® Octet® RED384儀器，使用FortéBio®抗生蛋白鏈菌素生物感測器進行FcRn結合檢定。在動力學緩衝液(自FortéBio®獲得)中將生物素化重組BACE1稀釋至10μg/mL濃度並將其捕捉至個別生物感測器上，保持1分鐘。接著在動力學緩衝液中保持1分鐘以確定基線。在存在或不存在1μM人類TfR ECD下，使10μg/mL多肽-Fab融合物(包含抗BACE1 Fab臂)結合至感測器尖端。利用3分鐘締合及3分鐘解離來分析重組人類FcRn(pH5.5)與固定之多肽-Fab融合物的結合。
自該等實驗(圖29)獲得的感測器圖譜指示，多肽-Fab融合物變異體在酸性pH(pH 5.5)下結合至FcRn且TfR結合不會明顯干擾FcRn結合。
本實例描述本發明之CH3C變異體多肽在小鼠血漿及腦組織中的藥物動力學/藥效學(PK/PD)特徵。
由於多肽-Fab融合物僅結合人類TfR且不結合鼠類TfR，故測試若干CH3C變異體在野生型小鼠中之藥物動力學(PK)以展示在缺乏TfR介導之清除的模型中的活體內穩定性。研究設計顯示於下表12中。對6-8週齡的C57Bl6小鼠靜脈內給藥並在表12中所指示的時間點，經由下頜下抽血取得活體血液。將血液收集於EDTA血漿管中，以14,000rpm離心5分鐘且接著分離血漿以供 後續分析。
Ab122用作抗RSV對照，其在小鼠中具有標準PK。Ab153用作抗BACE1對照，其在小鼠中具有標準PK。在本研究中Ab153的Fab臂與多肽融合。
使用普通人類IgG檢定(MSD®人類IgG套組#K150JLD-4)，遵循製造商之方案定量小鼠血漿中之多肽濃度。簡言之，用MSD®阻斷劑A阻斷預塗板30分鐘。使用Hamilton® NIMBUS液體處理器以1：2,500稀釋血漿樣品，並一式兩份添加至經阻斷的板中。亦在同一板上分析給藥溶液以確定正確劑量。使用四參數邏輯斯蒂回歸(four-parameter logistic regression)擬合標準曲線0.78-200ng/mL IgG。圖30及表13顯示該等資料之分析。除CH3C.3.2-5具有明顯較快之 清除率及較短半衰期外，所有CH3C多肽變異體均具有與標準Ab122相當之清除率及半衰期值。值得注意的是，此變異體係CH3C.3.2-19之點突變體(N163D)，而CH3C.3.2-19具有標準PK概況。
根據下表14中之研究設計(所有多肽-Fab融合物均針對Ab153 Fab)，在野生型小鼠中進行另一項PK研究。
如先前的研究中所描述，處理小鼠及樣品。資料提供於表15中。
自清除率值顯而易見，該等多肽-Fab融合物在野生型小鼠中展現與標準對照抗體類似之清除率。
使用CRISPR/Cas9技術產生在鼠類Tfrc基因內表現人類Tfrc頂端結構域之轉殖基因小鼠。在內源啟動子控制下在活體內表現所得嵌合TfR。
對嵌合huTfR頂端結構域雜合小鼠(n=4隻/組)靜脈內給與42mg/kg Ab153或單價CH3C.35.N163，且野生型小鼠(n=3)靜脈內給與50mg/kg對照人類IgG1。Ab153用作對照，其在小鼠中具有標準PK。給藥後24小時，對所有小鼠灌注PBS。灌注之前，經由心臟穿刺將血液收集於EDTA血漿管中，並以14,000rpm離心5分鐘。接著分離血漿用於後續PK及PD分析。在灌注後，提取腦並分離半腦以在10倍組織重量的含1% NP-40之PBS(對於PK)或5M GuHCl(對於PD)中均質化。
圖31顯示腦PK研究之結果。單價CH3C.35.N163組之吸收高於Ab153及對照人類IgG1組中之吸收。
如表16之研究設計中所示，對純合hTfR頂端結構域+/+小鼠靜脈內注射50mg/kg抗BACE1抗體Ab153、抗TfR/BACE1雙特異性抗體Ab116、CH3C.35.21.mono與Ab153 Fab之融合物或CH3C.35.N153.mono與Ab153 Fab之融合物。在本研究中，所有Fc均具有LALAPG突變以移除效應子功能。
24小時後，經由心臟穿刺收集血液並對小鼠灌注PBS。在10倍組織重量的含1% NP-40於PBS中之溶解緩衝液中使腦組織均質化。將血液收集於EDTA管中以防止凝塊並以14,000rpm離心7分鐘以分離血漿。使用普通人類IgG檢定(MSD人類IgG套組#K150JLD)，遵循製造商之說明書定量小鼠血漿和腦溶解產物中之多肽濃度。簡言之，用MSD阻斷劑A阻斷預塗板30分鐘。使用Hamilton Nimbus液體處理器以1：10,000稀釋血漿樣品，並一式兩份添加至經阻斷的板中。在1% NP40溶解緩衝液中使血液樣品均質化且溶解產物以1：10稀釋以用於PK分析。亦在同一板上分析給藥溶液以確定正確劑量。使用四參數邏輯斯蒂回歸擬合標準曲線0.78-200ng/mL IgG。
24小時後，TfR結合多肽之血漿含量低於抗BACE1之含量，此可能歸因於該抗體經由結合至周圍表現之hTfR頂端結構域而清除(圖32A)。在腦中，抗TfR/BACE1之濃度相較於抗BACE1明顯增加(圖32B)。關於CH3C.35.21.mono觀察到最大幅度增加，而且腦吸收亦相較於含CH3C35.N153.bi之抗BACE有明顯改良。工程改造之TfR結合多肽在血腦屏障處因TfR介導之穿胞運輸而顯著累積，由此驗證工程改造之TfR結合至Fc區中之效用。
使用BACE1抑制澱粉樣前驅物APP裂解作為抗體在血漿及腦中之活性的藥效讀出。在10倍組織重量的5M鹽酸胍中使腦組織均質化且接著在含0.25%酪蛋白緩衝液之PBS中以1：10稀釋。使用夾心ELISA量測血漿及腦溶解產物中之小鼠Aβ40含量。用對Aβ40肽之C末端具有特異性的多株捕捉抗體 (Millipore #ABN240)塗佈384孔MaxiSorp板。在ELISA板上以1：2對酪蛋白稀釋之胍腦溶解產物進一步稀釋且同時添加偵測抗體，即生物素化之M3.2。分析1：5稀釋之血漿。在4℃下培育樣品隔夜，隨後依序添加抗生蛋白鏈菌素-HRP及TMB受質。使用四參數邏輯斯蒂回歸擬合標準曲線0.78-50pg/mL msAβ40。
由於所有多肽上均存在抗BACE1 Fab，使得所有多肽之血漿澱粉樣β蛋白(Aβ)降低至與未處理之野生型小鼠類似的程度(圖33A)。相較於抗BACE1，用TfR結合多肽處理使hTfR頂端結構域+/+小鼠中之Aβ降低有所增加，表明在腦中實現BACE1靶接合(圖33B)。工程改造之多肽融合物及抗TfR/BACE1雙特異性抗體在腦中之靶接合量類似。
為了評價TfR結合親和力對PK及腦吸收之影響，產生抗BACE1 Ab153及TfR結合多肽融合物(CH3C.35.21：Ab153、CH3C.35.20：Ab153、CH3C.35：Ab153融合物)，如藉由Biacore所量測，該等融合物對頂端人類TfR之結合親和力不同。CH3C.35.21：Ab153、CH3C.35.20：Ab153、CH3C.35：Ab153融合物與人類TfR之結合親和力分別為100nM、170nM及620nM。對hTfR頂端結構域+/+基因敲入小鼠全身性投予50mg/kg Ab153或多肽-Fab融合物，並在給藥後1天、3天及7天，評價血漿PK及腦PKPD。如前一部分中所述，進行腦及血漿PKPD分析。由於TfR在周圍組織上表現，CH3C.35.21：Ab153、CH3C.35.20：Ab153及CH3C.35：Ab153融合物在血漿中展現的清除率比單獨Ab153要快，符合靶介導之清除率且指示活體內TfR結合(圖44A)。值得關注的是，腦中CH3C.35.21：Ab153、CH3C.35.20：Ab153及CH3C.35：Ab153融合物的濃度相較於Ab153明顯增加，在給藥後1天時達到超過30nM的最大腦濃度，與在此相同時間點時僅為約3nM的Ab153腦濃度形成對比(圖44B)。 CH3C.35.21：Ab153、CH3C.35.20：Ab153及CH3C.35：Ab153融合物的腦暴露量增加使得小鼠腦中內源性小鼠Aβ含量相較於給與Ab153之小鼠中的Aβ含量降低約55-60%(圖44C)。當CH3C.35.21：Ab153、CH3C.35.20：Ab153及CH3C.35：Ab153融合物在腦中保持較高濃度時，仍保持較低的腦Aβ含量，且到第7天，暴露量降低時回到與Ab153處理小鼠類似之水準。腦暴露量隨時間降低與CH3C.35.21：Ab153、CH3C.35.20：Ab153及CH3C.35：Ab153融合物之周圍暴露量降低有關，展示明確的活體內PK/PD關係(比較圖44A與44C)。另外，在該單次高劑量之後，Ab153處理之小鼠與多肽-Fab融合物處理之小鼠的總腦TfR含量相當，表明多肽-Fab融合物之腦暴露量增加對腦中TfR之表現無顯著影響(圖44D)。
為了進一步評價PK及腦吸收與較寬親和力範圍之TfR結合多肽-Fab融合物之間的關係，產生對hTfR結合具有較寬親和力範圍的其他融合物。CH3C.35.23：Ab153及CH3C.35.23.3：Ab153融合物對人類TfR之結合親和力分別為420nM及1440nM。如上文所述，對hTfR頂端結構域+/+基因敲入小鼠給藥。在給藥後1天、4天、7天及10天，評價血漿PK及腦PKPD。多肽-Fab融合物之周圍PK與hTfR親和力相關，其中親和力較高之CH3C.35.23：Ab153融合物展現的清除率比親和力明顯較低之CH3C.35.23.3：Ab153融合物要快(圖45A)。CH3C.35.23：Ab153及CH3C.35.23.3：Ab153融合物均具有明顯高於單獨Ab153之腦暴露量，且CH3C.35.23：Ab153在給藥後1天時在腦中達到約36nM(圖45B)。儘管血漿濃度類似，但該CH3C.35.23.3：Ab153融合物可能因對hTfR之親和力比CH3.35.23：Ab153融合物低約3.5倍而使其最大腦吸收低於CH3.35.23：Ab153融合物。值得關注的是，由於親和力較低之融合物到第10天時提供較為持續之周圍暴露量，故其腦暴露量亦高於親和力較高之CH3C.35.23：Ab153融合物的腦暴露量。由此說明對於較低親和力的TfR結合多肽-Fab融合物，較低腦Cmax但隨 時間較高的持續PK存在平衡。相較於單獨抗BACE1，在給與抗BACE1多肽融合物之小鼠的腦中觀察到明顯較低濃度之Aβ40(圖45C)。該Aβ40減少之持續時間與腦中huIgG1暴露量隨時間之變化一致(圖45B)。值得注意的是，給與CH3C.35：Ab153融合物之小鼠在單次劑量後7-10天仍展現持續的腦Aβ40減少。在給藥後1天時，給與Ab153之小鼠與給與CH3C.35：Ab153融合物之小鼠之間的總腦TfR含量相當(圖45D)。總體而言，該等資料展示，TfR結合多肽融合物在單次劑量後可以增加抗BACE1之腦暴露量，由此明顯減少腦Aβ40。
本實例描述CH3C.18與轉鐵蛋白受體頂端結構域(TfR-AD)之間之結合界面的結晶及分析。
在初始細胞密度為2.5×106個細胞/mL之Expi293細胞中表現人類轉鐵蛋白受體頂端結構域(TfR-AD)及工程改造之人類Fc(CH3C.18 Fc)(分別為SEQ ID NO：301及302)。必要時，以200mL或更高體積進行表現。轉染後20小時，添加糖基化抑制劑Kifunensine，其最終濃度為25μM。轉染後3至4天，當細胞活力明顯降低時，收集表現培養物。
分別用蛋白質A及Ni-NTA樹脂純化表現之TfR-AD及CH3C.18 Fc，隨後在Superdex200 26/60凝膠過濾管柱上進行尺寸排阻層析。使用以下緩衝液：蛋白質A洗滌緩衝液：20mM Hepes pH 7.4、100mM NaCl；蛋白質A溶離緩衝液：30mM甘胺酸pH 2.5(溶離物收集於含有1M Tris pH 9.0之管中以立即中和溶離物)；Ni-NTA洗滌緩衝液：30mM Tris pH8.0、10mM咪唑及200mM NaCl； Ni-NTA溶離緩衝液：30mM Tris pH 8.0、200mM NaCl及250mM咪唑；及尺寸排阻緩衝液(SEC)：30mM HEPES pH 7.5、200mM NaCl及3%甘油。
將純化之TfR-AD及CH3C.18 Fc與過量的頂端結構域混合，在室溫下培育1小時，並使用尺寸排阻層析法，在Superdex200 26/60凝膠過濾管柱上，使用先前提及之SEC緩衝液純化該複合物。尺寸排阻層析得到所預期的兩個主要峰：一個對應於該複合物(保留體積=180ml)且另一個對應於過量的頂端結構域(保留體積=240ml)。藉由考馬斯(Coomassie)染色之SDS-PAGE凝膠分析峰部分(圖34)。
利用坐滴氣相擴散法，在15℃及室溫(RT)下以8.5mg/mlL蛋白質濃度進行該複合物之初始結晶篩選。在含有25% PEG 3350、0.1M Tris pH 8.5及0.2M MgCl2之條件下觀察到大量細針狀晶體。在相同條件但在20% PEG 3350下，使用該等晶體接種以產生可安裝尺寸的單一細針。
使用補充有20%(v/v)乙二醇之結晶母液，藉由直接浸入液氮中使晶體急速冷卻。使用Rayonix 300高速偵測器，在先進光子源(Advanced Photon Source，APS)之SER-CAT射束線下收集X射線強度資料。晶體繞射至3.6Å，且屬於六方晶系空間群P6 4且具有呈不對稱單元之兩個複合分子(表17)。使用程式HKL2000對資料編索引，積分並按比例縮放。將自兩個晶體收集之資料合併以產生3.6Å資料。
1R合併=Σj(｜Ih-<I>h｜)/ΣIh，其中<Ih>係在對稱等效物內之平均強度
2R因子=Σ｜Fobs-Fcalc｜/Σ｜Fobs｜
藉由利用PHASER之分子置換法，使用CH3C.18 Fc二聚體及TFR-AD單體作為初始搜索模型來測定複合物之晶體結構。藉由剛性體精修，隨後使用REFMAC進行限制性精修，對模型進行精修。所有結晶學計算均利用CCP4套裝程式(www.ccp4.ac.uk/)進行。使用圖形程式COOT構建該複合物之電子密度模型。複合物分子之電子密度良好，尤其是在CH3C.18 Fc-TfF-AD界面處(2Fo-Fc圖譜等值線達到1.2δ水準)。在反復模型構建及精修之後，由於資料解析度降低及CH2結構域失序，而觀察到高R及自由R(R/自由R=0.30/0.39)。如在其他可用Fc結構中所見，CH2失序係因為CH2與CH3結構域之間存在可撓性彎角。
CH3C.18 Fc與TfR-AD之間之結合界面描繪於圖35A-35B及圖36A-36B中。如圖37A-37B中所示，在以下各殘基之間觀察到相互作用： CH3C.18之Trp154與TfR-AD之Arg208；CH3C.18之Glu155與TfR-AD之Arg208；CH3C.18之Ser156與TfR-AD之Arg208及Leu212；CH3C.18之Leu157與TfR-AD之Ser 199及Asn215；CH3C.18之His159與TfR-AD之Lys188、Ser199及Arg208；CH3C.18之Val160與TfR-AD之Gly207及Arg208；CH3C.18之Trp161與TfR-AD之Arg208、Val210及Leu212；CH3C.18之Ala162與TfR-AD之Arg208；CH3C.18之Val163與TfR-AD之Leu209；CH3C.18之Ser188與TfR-AD之Tyr211；CH3C.18之Thr189與TfR-AD之Tyr211及Leu212；CH3C.18之Gln192與TfR-AD之Lys158及Glu294；CH3C.18之Trp194與TfR-AD之Leu212、Val213、Glu214及Asn215；及CH3C.18之Phe196與TfR-AD之Arg208。
此外，如實例2題為「互補位定位」之部分中所描述且如圖37A-37B中所示，在CH3C定位區外的若干位置亦參與結合至TfR。
本實例描述CH3C.35與轉鐵蛋白受體頂端結構域(TfR-AD)之間之結合界面的結晶及分析。
在初始細胞密度為2.5×106個細胞/mL之CHO細胞中表現人類轉鐵蛋白受體頂端結構域(TfR-AD)及工程改造之人類Fc(CH3C.35 Fc)(分別為SEQ ID NO：301及421)。必要時，以500mL或更高體積進行表現。轉染後3至4天，當細胞活力明顯降低時，收集表現培養物。
分別用蛋白質A(Genescript)及Ni-NTA(Sigma)樹脂純化表現之TfR-AD及CH3C.35 Fc，隨後在Superdex200 26/60凝膠過濾管柱上進行尺寸排阻層析。使用以下緩衝液：蛋白質A溶離緩衝液：30mM甘胺酸pH 2.5(溶離物收集於含有1M Tris pH 9.0之管中以立即中和溶離物)；Ni-NTA溶離緩衝液：30mM Tris pH 8.0、200mM NaCl及250mM咪唑；及尺寸排阻緩衝液(SEC)：30mM HEPES pH 7.5、150mM NaCl、50mM KCl、3%甘油及0.01%疊氮化鈉。
將純化之TfR-AD及CH3C.35 Fc與過量的頂端結構域混合，在室溫下培育1小時，並使用尺寸排阻層析法，在Superdex200 26/60凝膠過濾管柱上，使用先前提及之SEC緩衝液純化該複合物。
利用坐滴氣相擴散法，在4℃、15℃及室溫(RT)下進行該複合物之初始結晶篩選。在含有25% PEG 3350、0.1M Bis-Tris pH 6.5及0.2M LiSO4之條件下觀察到大量細針狀晶體。在相同條件但使用20% PEG 3350下，使用該等晶體接種以產生單一細針且依序重複接種四次以產生可安裝尺寸之晶體。
使用補充有20%(v/v)乙二醇之結晶母液，藉由直接浸入液氮中使晶體急速冷卻。使用PILATUS偵測器，在鑽石光源(Diamond Light Source，DLS)之IO4射束線下收集X射線強度資料。使用尺寸為5微米之聚焦微束進行資料收集。晶體繞射至3.38Å，且屬於六方晶系空間群P6 4且具有呈不對稱單元之兩個複合分子(表18)。使用CCP4套裝軟體(Xia2-XDS及XSCALE)對資料編索引， 積分並按比例縮放。
1R合併=Σj(｜Ih-<I>h｜)/ΣIh，其中<Ih>係在對稱等效物內之平均強度
2R因子=Σ｜Fobs-Fcalc｜/Σ｜Fobs｜
藉由利用PHASER之分子置換法，使用CH3C.35 Fc-AD TfR複合物作為搜索模型來測定複合物之晶體結構。藉由剛性體精修，隨後使用REFMAC進行限制性精修，對模型進行精修。所有結晶學計算均利用CCP4套裝程式進行。使用圖形程式COOT構建該複合物之電子密度模型。該複合物分子之電子密度良好，尤其是在CH3C.35 Fc-TfF-AD界面處。
CH3C.35 Fc與TfR-AD之間的結合界面描繪於圖39A-39C中。圖39A顯示CH3C.35 Fc與TfR-AD之複合物在3.4Å處。圖39B顯示TfR-AD中之殘 基L209、L212及Y211使CH3C.35 Fc中之殘基W161穩定。圖39C顯示作為主要結合相互作用的CH3C.35 Fc中之殘基E160與TfR-AD中之殘基R208之間之鹽橋，此可部分引起Fc多肽與人類TfR(在208位之Arg)及與食蟹獼猴TfR(在208位Gly)之結合親和力的差異。圖40A顯示CH3C.35 Fc/TfR-AD複合物與CH3C.18 Fc/TfR-AD複合物(如實例6中所述)之間的重疊結構，展示CH3C.35與CH3C.18之間不存在明顯Fc主鏈構形變化。圖40B顯示圖40A中之重疊結構之放大圖。CH3C.35 Fc/TfR-AD複合物之TfR-AD中的殘基206-212呈現的構形不同於CH3C.18 Fc/TfR-AD複合物之TfR-AD中的殘基。TfR-AD中之殘基R208看起來埋在CH3C.18 Fc/TfR-AD複合物之表面下，而在CH3C.35 Fc/TfR-AD複合物中看起來暴露於溶劑。另外，CH3C.35 Fc/TfR-AD複合物之TfR-AD中的殘基L209看起來旋轉180°且結合至表面，而在CH3C.18 Fc/TfR-AD複合物中看起來遠離表面。
如圖41A及41B中所示，在以下各殘基之間觀察到相互作用：CH3C.35之Thr159與TfR-AD之Gly207、Arg208、Lys188及Leu209；CH3C.35之Glu160與TfR-AD之Arg208及Leu209；CH3C.35之Ser162與TfR-AD之Arg208及Leu209；CH3C.35之Ser156與TfR-AD之Leu209；CH3C.35之Trp161與TfR-AD之Leu209、Tyr211及Leu212；CH3C.35之Glu189與TfR-AD之Tyr211及Leu212；CH3C.35之Phe194與TfR-AD之Leu212、Asn215及Val213；CH3C.35之Tyr157與TfR-AD之Leu212、Asn215及Ser199；CH3C.35之Gln192與TfR-AD之Val213及Lys158；及CH3C.35之Phe196與TfR-AD之Val213及Leu212。
此外，如實例2題為「互補位定位」之部分中所描述且如圖41A及 41B中所示，在CH3C定位區外的若干位置亦參與結合至TfR。
本實例描述包含本發明之CH3C變異體多肽之Fc-Fab融合物在食蟹獼猴中的藥物動力學/藥效學(PK/PD)特徵。
在29天療程中，向2-4歲的雄性食蟹獼猴靜脈內投予單劑30mg/kg之Ab122(作為對照IgG之抗RSV抗體)、Ab153(抗BACE1抗體)、Ab210(抗TfR/BACE1雙特異性抗體)或包含CH3C變異體多肽與Ab153 Fab結構域之融合物的Fc-Fab融合多肽以評價血漿PK、血漿PD(Aβ40)及腦脊髓液(CSF)PD(Aβ40)(n=4隻/組)。為了確定基線，在給藥前7天，自每隻動物取得給藥前CSF及血液樣品。給藥後，在給藥後12小時、24小時、48小時、72小時及96小時，以及對於PD分析在研究日第8天、第11天、第15天、第18天、第22天、第25天及第29天，經由IT-L導管收集CSF。在給藥後0.25小時、1小時、6小時、12小時、24小時、72小時，以及在研究日第8天、第11天、第15天、第18天、第22天、第25天及第29天，收集血液樣品進行血漿及血清PK研究。
表19顯示出研究設計之概述。「CH3C.35.21.16：Ab153」係包含純系CH3C.35.21.16與Ab153 Fab結構域之融合物的單價Fc-Fab融合多肽。「CH3C.35.21：Ab153」係包含純系CH3C.35.21與Ab153 Fab結構域之融合物的單價Fc-Fab融合多肽。「CH3C.35.9：Ab153」係包含純系CH3C.35.21與Ab153 Fab結構域之融合物的二價Fc-Fab融合多肽。「CH3C.35.8：Ab153」係包含純系CH3C.35.20與Ab153 Fab結構域之融合物的二價Fc-Fab融合多肽。「LALAPG」指示抗體或Fc-Fab融合多肽在Fc序列中含有突變L7A、L8A及P102G(參照SEQ ID NO：1編號)。「LALAPG.YTE」指示Fc-Fab融合多肽在Fc序列中含有突變 L7A、L8A、P102G、M25Y、S27T及T29E(參照SEQ ID NO：1編號)。
使用人類IgG特異性夾心ELISA定量食蟹獼猴血清中抗體或Fc-Fab融合多肽之濃度。用對人類IgG Fc具有特異性之抗體塗佈384孔MaxiSorp板隔夜。血清樣品以1：100、1：1,000、1：10,000及1：100,000稀釋且添加至經阻斷之板中。偵測抗體係多株抗人類IgG猴吸收之抗體。獨立製備各抗體或Fc-Fab融合多肽之標準曲線(48-200,000pg/mL IgG)且檢定在血清中之定量下限(LLOQ)係20ng/mL。
使用MesoScale Discovery(MSD)多重套組(MSD #K15120E)量測食蟹獼猴CSF中之可溶性APPα/β含量。兩種不同的抗體特異性捕捉sAPPα或sAPPβ，且接著利用SULFO標籤標記之抗APP小鼠單株抗體偵測兩種分析物。使用MSD超靈敏套組(MSD #K151FTE)量測食蟹獼猴Aβ40含量。該檢定使用huAβ特異 性6E10抗體作為捕捉物且對該肽之C末端具有特異性之抗Aβ40抗體作為偵測分子。兩項檢定均根據製造商之說明書進行。簡言之，用MSD阻斷劑A阻斷預塗板1分鐘。CSF樣品以1：5稀釋且一式兩份添加至經阻斷之板中，隨後在4℃下培育隔夜。接下來，添加對應的偵測抗體並在Sector S600儀器上讀取板。使用四參數邏輯斯蒂回歸法擬合標準曲線，對於huAβ40為0.92-3750pg/mL且對於sAPPα/β兩者為0.1-100ng/mL。該等檢定對於Aβ40之LLOQ為73pg/mL且對於sAPPα/β之LLOQ為0.5ng/mL。
來自給藥後前7天之中期血清PK顯示，Ab210及CH3C.35.9：Ab153因其結合至周圍中之TfR而具有預期的靶介導之清除率(圖42A)。Ab153及Ab210抗體以及CH3C.35.9：Ab153使血漿Aβ40相較於對照IgG有明顯且持續之減少(圖42B)，證實全部三個分子均能夠在活體內以類似程度抑制BACE1活性。在CSF中，Ab210及CH3C.35.9：Ab153能夠使CSF Aβ40及sAPPβ/sAPPα比率相較於對照IgG分別減少約70%及約75%(圖43A及43B)。相較於對照IgG，作為不結合TfR之抗BACE1抗體Ab153對CSF Aβ40及sAPPβ/sAPPα比率顯示極小影響。該等結果展示，以CH3C變異體多肽(例如純系CH3C.35.9)結合至TfR使包含CH3C變異體多肽與抗BACE1抗體Fab結構域之融合物的Fc-Fab融合物(例如CH3C.35.9：Ab153)之CNS滲透性增強，由此抑制CSF Aβ40及sAPPβ/sAPPα產生。
在單次劑量後，亦評價血清PK、血漿Aβ及CSF Aβ含量，歷時四週。與在小鼠中觀察到的情形類似，TfR結合Fc-Fab融合物(CH3C.35.21.16：Ab153 LALAPG、CH3C.35.21.16：Ab153 LALAPGYTE及CH3C.35.21：Ab153 LALAPGYTE)之周圍血清PK因結合至周圍組織上之TfR而展現比Ab122及Ab153快的清除率(圖46A)。Ab153及CH3C：Ab153融合物使血漿Aβ含量相較 於對照IgG_Ab122減少超過約50%(圖46B)。Ab153與CH3C：Ab153融合物之最大Aβ類似，表明Fc修飾不影響抗BACE1 Fab在活體內抑制APP裂解之能力(圖46B)。血漿Aβ之持續時間與Ab153及CH3C：Ab153隨時間之暴露量相關。在CSF中，全部三種Fc-Fab融合物能夠使Aβ40及sAPPβ/sAPPα比率相較於對照IgG_Ab122明顯減少至約70%，而在給與Ab153之動物中未觀察到顯著減少(圖46C及46D)。該等結果展示，以CH3C變異體多肽(例如純系CH3C.35.21.16及CH3C.35.21)結合至TfR使包含CH3C變異體多肽與抗BACE1抗體Fab結構域之融合物的Fc-Fab融合物(例如CH3C.35.21.16：Ab153及CH3C.35.21：Ab153)之CNS滲透性增強，由此抑制CSF Aβ40及sAPPβ/sAPPα產生。
由於不成熟紅血球上TfR之表現量較高，故在整個研究過程中評價末梢血液臨床病理學以評價網狀紅血球數量、血清鐵及紅血球計數。血清鐵含量評估利用了使用TPTZ[2,4,6-三(2-吡啶基)-5-三嗪]作為色原體之方法的變化。在酸性介質中，轉鐵蛋白結合之鐵解離成游離三價鐵離子及載脂轉鐵蛋白。鹽酸及抗壞血酸鈉將三價鐵離子還原成亞鐵狀態。亞鐵離子接著與TPTZ反應形成藍色錯合物，該錯合物在600/800nm下以雙色法量測。吸光度增加與存在的轉鐵蛋白結合之鐵的量成正比。此係在Beckman/Olympus AU640e化學分析儀上進行。利用Siemens Advia 120自動血液系統分析絕對網狀紅血球及RBC形態。相較於給藥前值，Fc-Fab融合物對網狀紅血球數量無影響(圖47A)。另外，血清鐵以及紅血球數量亦不受影響(圖47B及47C)。總的說來，該等資料指示，經修飾TfR結合Fc多肽-Fab融合物可以將安全且有效地增加非人類靈長類動物中抗體之腦暴露量以產生穩定藥效學反應(亦即，CSF Aβ減少)。
本實例描述突變M201L及N207S與CH3C.35的相容性。
為了評價增加血清穩定性之突變，如參照SEQ ID NO：1編號的 M201L及N207S(根據EU編號的M428L/N434S；亦稱為「LS」突變)是否與TfR結合Fc修飾相容，向人類FcRn基因敲入小鼠給與10mg/kg之Ab153_LALAPG、Ab153_LALA.LS、CH3C.35.21：Ab153_LALA.LS或Ab153_LALAPG.YTE。14天內血漿PK評價顯示，Ab153_LALA.LS、CH3C.35.21：Ab153_LALA.LS及Ab153_LALAPG.YTE相較於無任何血清穩定性突變之Ab153_LALAPG有類似約2倍改良(圖48A及48B)。由此指示，用於TfR結合之額外Fc突變不影響LS突變改良活體內huIgG1半衰期之能力。
本實例描述CH3C.35.21單一胺基酸突變體文庫之構築。
使用Kunkel誘變構築各自含有CH3C.35.21之單一胺基酸取代的CH3C.35.21突變體文庫(Kunkel,Proc Natl Acad Sci U S A.82(2)：488-92,1985)。對於CH3C.35.21之各位置，使用簡併致突變寡核苷酸，使如根據SEQ ID NO：1編號之W153、Y157、T159、E160、W161、S162、S163、K165、T186、K187、E188、E189、F194、S197及S199(如根據EU編號方案所編號，W380、Y384、T386、E387、W388、S389、S390、K392、T413、K414、E415、E416、F421、S424及S426)個別地突變成密碼子NNK。為避免在文庫中獲得原始CH3C.35.21純系，使用單股DNA(ssDNA)Kunkel模板編碼野生型IgG1 Fc。組合使用兩個致突變寡核苷酸(其中一個具有NNK且另一個編碼另一CH3C.35.21區)，由此當併入兩個寡核苷酸時，其產生CH3C.35.21胺基酸序列，但在所需文庫位置處具有NNK密碼子。由於模板係野生型Fc，故單一寡核苷酸插入或無寡核苷酸插入將不結合TfR，因此該等構築體易於自任何分析中去除。類似地，來源於NNK位置之終止密碼子被排除。將文庫轉染至EBY100酵母中。對來自各文庫之八個集落進行測序以確保天然文庫含有所需位置隨機突變。
在TfR濃度下收集藉由酵母展示及流式細胞測量術量測的約前10%之呈環形排列之TfR頂端結構域結合群，由此提供用於區別親和力之最佳範圍。獲得12個純系各位置之序列。對於具有獨特群之文庫，利用較佳界定之高、中等、低閘控進行類似實驗。對每個收集之群的36個純系進行測序。另外，為了比較突變體與在相應胺基酸位置處具有野生型殘基之相應突變體的結合，使用致突變寡核苷酸以類似方法，使該位置處之胺基酸回復突變成野生型IgG1殘基。
表20顯示CH3C.35.21突變體之文庫。每一突變體含有CH3C.35.21之單一胺基酸取代。舉例而言，一個突變體可以含有W380E且其餘位置之胺基酸與CH3C.35.21中之該等胺基酸相同。表20中顯示之位置係根據EU編號方案編號。
本實例描述CH3C.18變異體文庫之構築。
分離單一純系，且使其在補充有0.2%葡萄糖之SG-CAA培養基中生長隔夜以誘導CH3C.18變異體之表面表現。對於每一純系，在pH 7.4之PBS+0.5% BSA中洗滌兩百萬個細胞三次。在4℃下，用生物素化靶、250nM人類TfR、250nM食蟹獼猴TfR或250nM不相關生物素化蛋白質對細胞染色，在 振盪下保持1小時，接著用相同緩衝液洗滌兩次。在4℃下，用中性抗生物素蛋白-Alexafluor647(AF647)對細胞染色，保持30分鐘，接著再洗滌兩次。使用抗c-myc抗體及抗雞-Alexfluor488(AF488)二級抗體量測表現量。使細胞再懸浮，並在BD FACS CantoII上量測AF647及AF488之中值螢光強度(MFI)。計算每一群體之TfR結合群之MFI並關於人類TfR、食蟹獼猴TfR或對照結合作圖(圖49)。
表21顯示CH3C.18變異體之文庫。每一列表示在各位置處含有指定胺基酸取代的變異體且其餘位置之胺基酸與野生型Fc中之胺基酸相同。表21中顯示之位置係根據EU編號方案編號。
若出現矛盾，表(例如表9)中描述的各純系之胺基酸取代指示在該純系之定位區位置處之胺基酸取代，而非序列表中陳述之序列中所見的胺基酸。
應瞭解，本文所述之實例及實施例僅出於說明的目的，並且熟習此項技術者將提出根據該等實例及實施例的各種修改或改變，且該等修改及改變均包括在本申請案精神及範圍以及隨附申請專利範圍之範疇內。本文引用之序列登錄號的序列係以引用之方式併入本文中。
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<212> PRT
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<212> PRT
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<223> 合成構築體
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<223> Xaa可為任何天然存在的胺基酸
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成構築體
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<223> Xaa可為任何天然存在的胺基酸
<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa可為任何天然存在的胺基酸
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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<220>
<223> 合成構築體
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<220>
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成構築體
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成構築體
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 151
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<211> 5
<212> PRT
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<220>
<223> 合成構築體
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<220>
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<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 156
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<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
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<223> 合成構築體
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成構築體
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<221> MISC_FEATURE
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa=Glu或Arg
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<400> 572
<210> 573
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa=Ser,Thr，或Trp
<400> 573
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (86)..(86)
<223> Xaa=Ser,Cys,Pro,Met，或Trp
<400> 574
<210> 575
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa=Glu或Trp
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Xaa=Trp,Tyr,His，或Phe
<400> 576
<210> 577
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> Xaa=Glu或Trp
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (44)..(44)
<223> Xaa=Val,Trp,Leu，或Tyr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (46)..(46)
<223> Xaa=Leu,Pro,Phe,Thr，或His
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (47)..(47)
<223> Xaa=Pro,Val，或Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (49)..(49)
<223> Xaa=Ala,Ser,Val，或Gly
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50)..(50)
<223> Xaa=Leu,His,Gln,Gly,Val,Ala,Asn,Asp,Thr，或Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (51)..(51)
<223> Xaa=Thr,Phe,Gln,Val，或Tyr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (73)..(73)
<223> Xaa=Leu,Ser,Glu,Ala，或Pro
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (76)..(76)
<223> Xaa=Glu,Asp,Thr，或Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (81)..(81)
<223> Xaa=Trp,Tyr,His，或Phe
<400> 577
<210> 578
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa=Glu或Trp
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa=Trp,Leu，或Tyr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa=Thr或His
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa=Ala,Ser，或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> Xaa=Val,Thr，或Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> Xaa=Tyr或Gln
<400> 578
<210> 579
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa=Thr或Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Xaa=Trp,Tyr,His，或Phe
<400> 579
<210> 580
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (40)..(40)
<223> Xaa=Glu或Trp
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (44)..(44)
<223> Xaa=Trp,Leu，或Tyr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (46)..(46)
<223> Xaa=Thr或His
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (49)..(49)
<223> Xaa=Ala,Ser，或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (50)..(50)
<223> Xaa=Val,Thr，或Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (51)..(51)
<223> Xaa=Tyr或Gln
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (76)..(76)
<223> Xaa=Thr或Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (81)..(81)
<223> Xaa=Trp,Tyr,His，或Phe
<400> 580
<210> 581
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 581
<210> 582
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 582
<210> 583
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 583
<210> 584
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 584
<210> 585
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 585
<210> 586
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 586
<210> 587
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 590
<210> 591
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 593
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 600
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 602
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 603
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 605
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 606
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 607
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 608
<210> 609
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa=Glu,Leu,Ser,Val,Trp，或Tyr
<400> 609
<210> 610
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa=Tyr,Phe,Met,Pro,Val，或Trp
<400> 610
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa=Thr,Asn，或Val
<400> 611
<210> 612
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa=Glu,Ile,Pro，或Val
<400> 612
<210> 613
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa=Ser,Ala,Ile,Thr，或Val
<400> 613
<210> 614
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> Xaa=Ser,Asn,Arg，或Thr
<400> 614
<210> 615
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa=Thr,His，或Ser
<400> 615
<210> 616
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa=Glu,Ser,Asp,Gly,Thr,Pro,Gln，或Arg
<400> 616
<210> 617
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa=Glu或Arg
<400> 617
<210> 618
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Xaa=Phe,His,Lys，或Tyr
<400> 618
<210> 619
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> Xaa=Ser,Thr，或Trp
<400> 619
<210> 620
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> Xaa=Ser,Cys,Pro,Met，或Trp
<400> 620
<210> 621
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可為任何天然存在的胺基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可為任何天然存在的胺基酸
<400> 621
<210> 622
<211> 181
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (97)..(97)
<223> Xaa=Asp或Glu
<400> 622
<210> 623
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人
<400> 623
<210> 624
<211> 326
<212> PRT
<213> 智人
<400> 624
<210> 625
<211> 377
<212> PRT
<213> 智人
<400> 625
<210> 626
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人
<400> 626
Claims (20)
- 一種Fc區，其包含結合至人類轉鐵蛋白受體1(TfR1)之經修飾之CH3結構域，且能夠跨血腦屏障(BBB)運輸，其中該經修飾之CH3結構域在包含157、159、160、161、162、163、186、189及194的一組胺基酸位置中包含5、6、7、8或9個取代，其中該等取代及該等位置係參照SEQ ID NO：1之胺基酸114-220所決定。
- 如申請專利範圍第1項之Fc區，其與SEQ ID NOS：4-46、236-299、302及347-553中任一序列競爭結合至人類TfR1。
- 如申請專利範圍第1項或第2項之Fc區，其中該經修飾之CH3結構域結合至人類TfR1之頂端結構域。
- 如申請專利範圍第1項或第2項之Fc區，其中該經修飾之CH3結構域結合至抗原決定基，該抗原決定基包含具序列SEQ ID NO：235之人類TfR1之胺基酸208。
- 如申請專利範圍第1項或第2項之Fc區，其中該經修飾之CH3結構域結合至人類TfR1，但不抑制轉鐵蛋白與人類TfR1之結合。
- 如申請專利範圍第1項或第2項之Fc區，其中該經修飾之CH3結構域接合至Fab。
- 如申請專利範圍第1項或第2項之Fc區，其中該Fc區接合至抗體可變區或治療性多肽。
- 如申請專利範圍第1項或第2項之Fc區，其中該經修飾之CH3結構域在包含153、164、165及188之位置，進一步包含1、2、3或4個取代，且其中該等取代及該等位置係參照SEQ ID NO：1之胺基酸114-220所決定。
- 如申請專利範圍第8項之Fc區，其中該經修飾之CH3結構域包含至少一個選自以下之取代：153位係Trp、Leu或Glu；157位係Tyr或Phe； 159位係Thr；160位係Glu；161位係Trp；162位係Ser、Ala、Val或Asn；163位係Ser或Asn；186位係Thr或Ser；188位係Glu或Ser；189位係Glu；及194位係Phe。
- 一種聚核苷酸，其包含編碼如申請專利範圍第1項至第9項中任一項之Fc區之核苷酸序列。
- 一種載體，其包含聚核苷酸，該聚核苷酸包含編碼如申請專利範圍第1項至第9項中任一項之Fc區之核苷酸序列。
- 一種宿主細胞，其包含聚核苷酸，該聚核苷酸包含編碼如申請專利範圍第1項至第9項中任一項之Fc區之核苷酸序列。
- 一種產生包含經修飾之CH3結構域之Fc區之方法，其包含在表現由申請專利範圍第10項之聚核苷酸所編碼之Fc區之條件下培養宿主細胞。
- 一種用於增強Fc區與人類轉鐵蛋白受體1(TfR1)結合之方法，該Fc區包含經修飾之CH3結構域，且該CH3結構域包含非天然結合位點，該方法包括：(a)在該非天然結合位點之10Å內之一或多個位置處引入一或多個取代；及(b)測試該經修飾之CH3結構域與人類TfR1之結合。
- 如申請專利範圍第14項之方法，其中該非天然結合位點在以下位置中之一或多個處包含取代：157、159、160、161、162、163、186、189及194；且其中該等取代及位置係參照SEQ ID NO：1之胺基酸114-220所決定。
- 一種將Fc區之CH3結構域工程改造成結合至人類轉鐵蛋白受體1(TfR1)之方法，該方法包含：(a)在將溶劑暴露之表面補丁(solvent-exposed surface patch)處修飾編碼該CH3結構域之聚核苷酸；(b)表現包含該經修飾之CH3結構域之多肽；及 (c)測定該經修飾之CH3結構域是否結合至該人類TfR1。
- 一種包含如申請專利範圍第1至9項中任一項之Fc區之多肽之用途，其係用於製備用於治療個體之神經病症之藥物，其中該多肽可遞送跨血腦屏障(BBB)之治療劑以治療神經病症。
- 如申請專利範圍第17項之用途，其中該多肽偶聯至該治療劑。
- 如申請專利範圍第17項或第18項之用途，其中該治療劑包含抗體可變區或治療性多肽。
- 一種如申請專利範圍第1至9項中任一項之Fc區之用途，其係用於製備用於跨血腦屏障(BBB)之穿胞運輸之藥物，其中該藥物係用於使BBB與該Fc區接觸。
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