CN110312532A - 脑靶向长效蛋白质缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含脑靶向肽和生理活性物质的脑靶向长效缀合物，并且涉及包含具有提高的耐久性和稳定性的生理活性物质的长效缀合物，所述长效缀合物能够穿过血脑屏障(BBB)并且包含生理活性物质。包含脑靶向肽和生理活性物质的本发明的脑靶向长效缀合物能够穿过血脑屏障，因而能够治疗与脑病相关的疾病，并且还能够维持生理活性物质在体内的活性并增加其在血液中的半衰期。

Description

脑靶向长效蛋白质缀合物
技术领域
本发明涉及能够靶向脑的长效蛋白缀合物和其制备方法。另外，本发明涉及新型脑靶向肽及其应用。
背景技术
尽管对脑有效递送治疗剂的需求正在增长，但用于脑的新型药剂的开发进展速度要比身体其他部分的慢得多。这种缓慢的进展很大程度上是由于这样的情况所致：大多数药物不能通过形成血脑屏障(在下文中，BBB)的脑毛细血管壁渗透到脑中。BBB是通过脑血管内皮细胞之间的紧密连接和进一步加强这些紧密连接的星形胶质细胞建立的结构，并且其具有防止血液中的物质通过血管壁自由扩散到脑实质中的作用。因此，许多被开发用于治疗脑病的药物存在这样的问题：其不能很好地穿过BBB几乎100％的大分子药物和超过98％的小分子药物都不能穿过BBB。只有极少数的药物，例如具有高脂溶性并且分子量为400至500道尔顿或更小的小分子药物，能够实际上穿过BBB。另外，在能够穿过BBB的这些小分子当中，只有小部分能够以药学上显著的量穿过BBB。
只有一些脑病，如抑郁、情感障碍、慢性疼痛和癫痫，能够对穿过BBB的小分子药物作出反应。大多数脑病，如阿尔茨海默病、中风/神经保护、脑和脊髓损伤、脑癌、脑HIV感染、产生共济失调的障碍、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、杭廷顿舞蹈病、影响脑的儿童先天性遗传错误、帕金森病和多发性硬化，对常规脂溶性小分子量药物没有反应。
目前，能够递送药物通过BBB的载体的开发正在积极进行中。同时，虽然已知具有特定氨基酸序列的肽穿过BBB并且能够递送药物、siRNA等，然而，对递送具有特定结构的大尺寸生理活性物质的可能性的研究还远未达到期望(Kumar et al.,Nature.2007,448:39-43)。另外，关于极少有效小分子药物可用的脑病的治疗，新型和改进药物的开发和研究需求增加。
发明内容
[技术问题]
本发明的一个目标是提供脑靶向长效缀合物，该脑靶向长效缀合物能够穿过血脑屏障(BBB)，维持生理活性的有效性，并且含有能够延长生理活性物质的半衰期的生物相容性物质。
本发明的另一目标是提供脑靶向长效缀合物，其中生理活性物质通过相互结合(mutual binding)而连接至融合了免疫球蛋白Fc区的脑靶向肽的免疫球蛋白Fc区。
本发明的再另一目标是提供式1的脑靶向长效缀合物，其是含有脑靶向肽和生理活性物质的长效缀合物。
X-L1-F-L2-Y
其中，
X是生理活性物质；
Y是脑靶向肽；
L1和L2是肽连接体或非肽连接体，其中当L1和L2是肽连接体时，该肽连接体包括0至1,000个氨基酸；并且
F是包含FcRn结合区的免疫球蛋白恒定区。
本发明的再另一目标是提供编码通过融合或非肽连接体连接了免疫球蛋白Fc区的脑靶向肽或生理活性物质的多核苷酸；含有该多核苷酸的载体；含有该载体的转化体；和包括该多核苷酸、载体和转化体中的一种或多种的试剂盒。
本发明的再另一目标是提供脑靶向肽缀合物被编码然后化学连接后的脑靶向长效缀合物，其中脑靶向肽缀合物的免疫球蛋白Fc区(其融合至脑靶向肽缀合物的脑靶向肽)通过相互结合而连接至生理活性物质。
本发明的再另一目标是提供用于制备脑靶向肽缀合物被编码然后化学连接后的脑靶向长效缀合物的方法，其中脑靶向肽缀合物的免疫球蛋白Fc区(其融合至脑靶向肽缀合物的脑靶向肽)通过相互结合而连接至生理活性物质。
本发明的再另一目标是提供用于制备上述式1的脑靶向长效缀合物的方法。
本发明的再另一目标是提供含有脑靶向长效缀合物的组合物。
本发明的再另一目标是提供脑靶向长效缀合物在制备药剂中的用途。
本发明的再另一目标是提供新型脑靶向肽。
本发明的再另一目标是提供编码脑靶向肽的多核苷酸；含有该多核苷酸的载体；含有该载体的转化体；和包括该多核苷酸、载体和转化体中的一种或多种的试剂盒。
[技术方案]
为了实现上述目标，本发明一方面提供了脑靶向长效缀合物，其能够穿过BBB，维持生理活性的有效性，并且含有能够延长生理活性物质的半衰期的生物相容性物质；或用于制备脑靶向长效缀合物的方法。
在更具体的实施方式中，本发明提供了式1的脑靶向长效缀合物：
[式1]
X-L1-F-L2-Y
其中，
X是生理活性物质；
Y是脑靶向肽；
L1和L2是肽连接体或非肽连接体，其中当L1和L2是肽连接体时，该肽连接体包括0至1,000个氨基酸；并且
F是包含FcRn结合区的免疫球蛋白恒定区。
在具体实施方式中，F可以是二聚体形式。
在根据前述实施方式的脑靶向长效缀合物中，长效缀合物穿过血脑屏障并将生理活性物质递送至脑组织中。
在根据前述实施方式的脑靶向长效缀合物中，脑靶向肽包括肽、蛋白质或抗体，并且其中肽、蛋白质或抗体中的每一种都含有允许穿过血脑屏障的氨基酸序列。
在根据前述实施方式中任一项的脑靶向长效缀合物中，脑靶向肽可通过被动转运途径或受体介导转运途径穿过血脑屏障，但转运途径不限于此。例如，脑靶向肽可以是能够穿过血脑屏障的肽、蛋白质或抗体，但其类型和大小不受具体限制。
在根据前述实施方式中任一项的脑靶向长效缀合物中，术语“氨基酸”指代包括任何天然存在的或非天然存在的或合成的氨基酸残基的氨基酸部分，即，包括任何通过一个、两个、三个或更多个碳原子(一般通过单个(α)碳原子)直接连接的至少一个羧基残基和至少一个氨基残基的部分。
在根据前述实施方式中任一项的脑靶向长效缀合物中，脑靶向肽通过受体介导转运途径穿过血脑屏障。
在根据前述实施方式中任一项的脑靶向长效缀合物中，受体介导转运途径的特征在于穿过血脑屏障是经由受体介导转运途径、通过选自以下中的任一种来进行的：胰岛素受体、转铁蛋白受体、低密度脂蛋白受体、低密度脂蛋白受体相关蛋白质、瘦蛋白受体、烟碱性乙酰胆碱受体、谷胱甘肽转运体、钙激活钾通道和晚期糖基化终产物受体(RAGE)、以及受体的配体和结合该受体或配体的抗体，但不限于此。脑靶向肽可选自能够穿过血脑屏障的肽、蛋白质或抗体，或者其可以是从该肽、蛋白质或抗体中分离的部分肽序列，但不限于此。
在根据前述实施方式中任一项的脑靶向长效缀合物中，生理活性物质可选自毒素；或胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂；胰高血糖素受体激动剂；胃抑多肽(GIP)受体激动剂；成纤维细胞生长因子(FGF)受体激动剂；缩胆囊素受体激动剂；胃泌素受体激动剂；黑皮质素受体激动剂；人生长激素；生长激素释放激素；生长激素释放肽；干扰素；干扰素受体；集落刺激因子(粒细胞集落刺激因子)；白介素；白介素受体；酶；白介素结合蛋白；细胞因子结合蛋白；巨噬细胞激活因子；巨噬细胞肽；B细胞因子；T细胞因子；蛋白质A；变态反应抑制因子；坏死糖蛋白；免疫毒素；淋巴毒素；肿瘤坏死因子；肿瘤抑制物；转化生长因子；α-1抗胰蛋白酶；白蛋白；α-乳白蛋白；载脂蛋白-E；促红细胞生成素；高度糖基化的促红细胞生成素；血管生成素；血红蛋白；凝血酶；凝血酶受体激活肽；血栓调节素；凝血因子VII；凝血因子VIIa；凝血因子VIII；凝血因子IX；凝血因子XIII；纤溶酶原激活物；纤维蛋白结合肽；尿激酶；链激酶；水蛭素；蛋白质C；C反应蛋白；肾素抑制物；胶原酶抑制物；超氧化物歧化酶；瘦蛋白；血小板衍生生长因子；上皮生长因子；表皮生长因子；制管张素；血管紧张素；骨形态发生生长因子；骨形态发生蛋白；降钙素；胰岛素；房肽素；软骨诱导因子；依降钙素(elcatonin)；结缔组织激活因子；组织因子途径抑制物；促卵泡激素；黄体生成激素；黄体生成激素释放激素；神经生长因子；轴突发生因子-1(axogenesis factor-1)；脑促尿钠排泄肽；胶质衍生神经营养因子；导蛋白；嗜中性白细胞抑制因子；神经营养因子；神经秩蛋白(neurturin)；甲状旁腺激素；松弛素；分泌素；生长调节素；胰岛素样生长因子；肾上腺皮质激素；胰高血糖素；缩胆囊素；胰多肽；胃泌素释放肽；促皮质素释放因子；促甲状腺激素；自家趋化素(autotaxin)；乳铁蛋白；肌肉生长抑制素(myostatin)；活动依赖性神经保护蛋白(ADNP)、β-分泌酶1(BACE1)、淀粉样前体蛋白(APP)、神经细胞黏着分子(NCAM)、淀粉样蛋白β、tau、晚期糖基化终产物受体(RAGE)、α-突触核蛋白、或其激动剂或拮抗剂；受体、受体激动剂；细胞表面抗原；单克隆抗体；多克隆抗体；抗体片段；病毒衍生的疫苗抗原；激活至少一种受体激动剂的杂合多肽或嵌合多肽；及其类似物。
在根据前述实施方式中任一项的脑靶向长效缀合物中，毒素选自美登素或其衍生物、澳瑞他汀(auristatin)或其衍生物、倍癌霉素或其衍生物、和吡咯并苯并二氮杂(PBD)或其衍生物；
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂选自天然毒蜥外泌肽-3(native exendin-3)或天然毒蜥外泌肽-4(native exendin-4)及其类似物；
FGF受体激动剂选自FGF1或其类似物、FGF19或其类似物、FGF21或其类似物、和FGF23或其类似物；
干扰素选自干扰素-α、干扰素-β和干扰素-γ；
干扰素受体选自干扰素-α受体、干扰素-β受体、干扰素-γ受体和可溶性I型干扰素受体；
白介素选自白介素-1、白介素-2、白介素-3、白介素-4、白介素-5、白介素-6、白介素-7、白介素-8、白介素-9、白介素-10、白介素-11、白介素-12、白介素-13、白介素-14、白介素-15、白介素-16、白介素-17、白介素-18、白介素-19、白介素-20、白介素-21、白介素-22、白介素-23、白介素-24、白介素-25、白介素-26、白介素-27、白介素-28、白介素-29和白介素-30；
白介素受体是白介素-1受体或白介素-4受体；
酶选自β-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸酯酶、酸性α-葡糖苷酶、酸性神经酰胺酶、酸性鞘磷脂酶、半乳糖脑苷脂酶、芳基硫酸酯酶A、芳基硫酸酯酶B、β-氨基己糖酶A、β-氨基己糖酶B、肝素N-硫酸酯酶、α-D-甘露糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、N-乙酰半乳糖胺-6硫酸酯酶、溶酶体酸性脂肪酶、α-N-乙酰氨基葡糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、丁酰胆碱酯酶、几丁质酶、谷氨酸脱羧酶、伊米苷酶(imiglucerase)、脂肪酶、尿酸酶、血小板激活因子乙酰水解酶、中性肽链内切酶、髓过氧化物酶、α-半乳糖苷酶-A、阿加糖酶α(agalsidaseα)、阿加糖酶β(agalsidaseβ)、α-L-艾杜糖苷酸酶、丁酰胆碱酯酶、几丁质酶、谷氨酸脱羧酶和伊米苷酶；
白介素结合蛋白是IL-18bp；
细胞因子结合蛋白是肿瘤坏死因子(TNF)结合蛋白；
神经生长因子选自神经生长因子、睫状节神经细胞营养因子、轴突发生因子-1、脑促尿钠排泄肽、胶质衍生神经营养因子、导蛋白、嗜中性白细胞抑制因子、神经营养因子和神经秩蛋白；
肌肉生长抑制素受体选自TNFR(P75)、TNFR(P55)、IL-1受体、VEGF受体和B细胞激活因子受体；
肌肉生长抑制素受体拮抗剂是IL1-Ra；
细胞表面抗原选自CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD11a、CD11b、CD18、CD19、CD20、CD23、CD25、CD33、CD38、CD40、CD45和CD69；并且
抗体片段选自scFv、Fab、Fab′、F(ab′)2和Fd。
在根据前述实施方式中任一项的脑靶向长效缀合物中，GLP-1受体激动剂选自天然毒蜥外泌肽-4；毒蜥外泌肽-4衍生物，其中毒蜥外泌肽-4的N端胺基缺失；毒蜥外泌肽-4衍生物，其中毒蜥外泌肽-4的N端胺基用羟基取代；毒蜥外泌肽-4衍生物，其中毒蜥外泌肽-4的N端胺基用二甲基修饰；毒蜥外泌肽-4衍生物，其中毒蜥外泌肽-4的N端胺基用羧基取代；毒蜥外泌肽-4衍生物，其中毒蜥外泌肽-4的第1位氨基酸——组氨酸——的α碳缺失；毒蜥外泌肽-4衍生物，其中毒蜥外泌肽-4的第12位氨基酸——赖氨酸——用丝氨酸取代；以及毒蜥外泌肽-4衍生物，其中毒蜥外泌肽-4的第12位氨基酸——赖氨酸——用精氨酸取代。
在根据前述实施方式中任一项的脑靶向长效缀合物中，L1连接至F的N端区，并且L2连接至F的C端区。
在根据前述实施方式中任一项的脑靶向长效缀合物中，式1的F-L2-Y由下式2表示：
[式2]
其中：
Fa和Fb各自是单链多肽链，该单链多肽链包括含有铰链区、CH2结构域和CH3结构域的免疫球蛋白Fc区，其中Fa和Fb通过铰链区中的二硫键连接，借此缀合物包含Fc片段，并且Fa和L1共价键合；
BTPa1、……、BTPan中的每一个彼此相同或不同，是脑靶向肽；
BTPb1、……、BTPbn′中的每一个彼此相同或不同，是脑靶向肽；
L2a1、……、L2an中的每一个彼此相同或不同，是肽连接体；并且
L2b1、……、L2bn′中的每一个彼此相同或不同，是肽连接体；
其中n和n′各自独立地是整数。
在根据前述实施方式中任一项的脑靶向长效缀合物中，L1连接至Fa的N端，并且L2a1和L2b1各自连接至Fa和Fb的C端。
根据前述实施方式中任一项的脑靶向长效缀合物中，n＝n′，并且各自满足L2a1＝L2b1、……、L2an＝L2bn′和BTPa1＝BTPb1、……、BTPan＝BTPbn′的条件。
在根据前述实施方式中任一项的脑靶向长效缀合物中，F是Fa和Fb，L2-Y是(L2a-Y)n和(L2b-Y)n′，其中脑靶向长效缀合物由下式3表示：
[式3]
其中X是生理活性物质；
L1是肽连接体或非肽连接体；
Fa和Fb各自是含有铰链区、CH2结构域和CH3结构域的免疫球蛋白Fc区，并且Fa和Fb通过铰链区中的半胱氨酸残基之间的二硫键彼此共价键合；
Ya和Yb是脑靶向肽，彼此种类相同或彼此种类不同；
L2a和L2b分别是肽连接体，彼此种类相同或彼此种类不同；并且
n和n′各自独立地是1或更大的整数。
在根据前述实施方式中任一项的脑靶向长效缀合物中，L1连接至Fa的N端区，并且L2a和L2b各自分别连接至Fa和Fb的C端区。
在根据前述实施方式中任一项的脑靶向长效缀合物中，L1连接至X的胺基或巯基。
在根据前述实施方式中任一项的脑靶向长效缀合物中，L1连接至X的N端胺基，所述胺基位于赖氨酸残基的侧链，或连接至位于半胱氨酸残基的侧链的-SH基团(巯基)。
在根据前述实施方式中任一项的脑靶向长效缀合物中，作为生理活性物质的X是由2至1,000个氨基酸组成的多肽。
在根据前述实施方式中任一项所述的脑靶向长效缀合物中，n和n′是1至5的整数。
在根据前述实施方式中任一项的脑靶向长效缀合物中，L1是大小为0.5kDa至100kDa的非肽连接体。
在根据前述实施方式中任一项的脑靶向长效缀合物中，非肽连接体是聚乙二醇。
在根据前述实施方式中任一项的脑靶向长效缀合物中，作为肽连接体的L2是(GS)m、(GGS)m、(GGGS)m或(GGGGS)m，其中m是1至10。
在根据前述实施方式中任一项的脑靶向长效缀合物中，式1的L1和L2中的一个是肽连接体，并且另一个是非肽连接体。
在根据前述实施方式中任一项的脑靶向长效缀合物中，当式1的L1是非肽连接体并且L2是肽连接体时，肽连接体含有0至1,000个氨基酸。
在根据前述实施方式中任一项的脑靶向长效缀合物中，关于式1的脑靶向长效缀合物，X的N端和F的N端通过L1连接，并且Y的N端和F的C端通过L2连接。
在根据前述实施方式中任一项的脑靶向长效缀合物中，关于式1的脑靶向长效缀合物，L1的末端连接至X的赖氨酸残基或半胱氨酸残基等，并且L1的另一末端连接至F的N端；并且Y的N端和F的C端通过L2连接。
在根据前述实施方式中任一项的脑靶向长效缀合物中，当式1的L1和L2中的任一者或两者是非肽连接体时，该非肽连接体选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、可生物降解聚合物、脂质聚合物、几丁质、透明质酸、脂肪酸、高分子量聚合物、低分子量化合物、核苷酸及其组合。
在根据前述实施方式中任一项的脑靶向长效缀合物中，当式1的L1和L2中的任一者或两者是肽连接体时，X和F、或者F和Y通过L1和L2经由共价化学键、非共价化学键或其组合彼此连接；并且L1和L2各自含有0至1,000个氨基酸。当肽连接体含有0个氨基酸时，其通过肽键(即共价键)连接。
在根据前述实施方式中任一项的脑靶向长效缀合物中，当式1的L1和L2中的任一者或两者是肽连接体时，L1和L2不含有氨基酸，其中(i)X和F、或者F和Y通过肽键连接；或(ii)X和F、以及F和Y通过肽键连接。
在根据前述实施方式中任一项的脑靶向长效缀合物中，当L1和L2中的任一个是肽连接体并且这二者中的另一个是非肽连接体时，肽连接体是含有0至1,000个氨基酸的连接体，并且非肽连接体是聚乙二醇。
在根据前述实施方式中任一项的脑靶向长效缀合物中，式1的F包括免疫球蛋白Fc区。
在根据前述实施方式中任一项的脑靶向长效缀合物中，免疫球蛋白Fc区包括选自CH1、CH2、CH3和CH4结构域的一至四个结构域。
在根据前述实施方式中任一项的脑靶向长效缀合物中，免疫球蛋白Fc区进一步包括铰链区。
在根据前述实施方式中任一项的脑靶向长效缀合物中，免疫球蛋白Fc区是IgG的Fc区。
在根据前述实施方式中任一项的脑靶向长效缀合物中，关于免疫球蛋白Fc区，恒定区衍生自IgG1或IgG4。
在根据前述实施方式中任一项的脑靶向长效缀合物中，免疫球蛋白Fc区是IgG4Fc区。
在根据前述实施方式中任一项的脑靶向长效缀合物中，免疫球蛋白Fc区是人类序列的非糖基化的IgG4 Fc区。
本发明的另一方面提供了用于制备式1的脑靶向长效缀合物的方法。
在具体实施方式中，方法包括(i)制备：(a)X-L1-F，其中X、L1和F连接，X是生理活性物质，L1是肽或非肽连接体，F包括免疫球蛋白Fc区；和(b)L2-Y，其中Y与L2连接，Y是脑靶向肽，L2是肽或非肽连接体；和(ii)连接(a)X-L1-F与(b)L2-Y。
在另一具体实施方式中，(a)的L1是肽连接体，并且(b)的L2是非肽连接体。
在另一具体实施方式中，方法包括(i)制备：(a)X-L1，其中X与L1连接，X是生理活性物质，L1是肽或非肽连接体；和(b)F-L2-Y，其中Y、L2和F连接，Y是脑靶向肽，L2是肽或非肽连接体，F包括免疫球蛋白Fc区；和(ii)连接(a)X-L1与(b)F-L2-Y。
在再另一具体实施方式中，(a)的L1是非肽连接体，并且(b)的L2是肽连接体。
在再另一具体实施方式中，方法是用于制备式1的脑靶向长效缀合物的方法，其包括(i)制备F-L2-Y，其中Y、L2和F连接，Y是脑靶向肽，L2是肽或非肽连接体，F包括免疫球蛋白Fc区；和(ii)通过L1连接F-L2-Y与X，L1是肽或非肽连接体。
在再另一具体实施方式中，L1是非肽连接体，并且L2是肽连接体。
在再另一具体实施方式中，非肽连接体与X和Y通过各个其对应的官能团连接，并且具体地，非肽连接体的反应基团选自醛基、马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺衍生物。
本发明的再另一方面提供了包含彼此不同的生理活性物质的长效缀合物，在脑靶向肽缀合物中，脑靶向肽融合至免疫球蛋白Fc区，被编码然后化学结合，并且不同的生理活性物质被连接至化学结合的免疫球蛋白Fc区。
化学结合的免疫球蛋白Fc区缀合物包括两个免疫球蛋白Fc区(其中单体Fc区被连接起来的Fc区二聚体形式)，并且分别与这两个免疫球蛋白Fc区中每一个结合的生理活性物质可连接至免疫球蛋白Fc区(单体Fc区)的单个位点或两个免疫球蛋白Fc区(每个Fc区二聚体形式)的两个位点。
化学结合可以是共价键，更具体地二硫键，并且还更具体地在两个免疫球蛋白Fc区的铰链区中形成的二硫键，但结合不具体受限于此。
更具体地，长效缀合物可以是这样的形式：其中二聚体通过(i)第一免疫球蛋白Fc区(其中脑靶向肽通过上述肽连接体(例如，肽键)连接至一分子免疫球蛋白Fc区的C端区)与(ii)第二免疫球蛋白Fc区(其中脑靶向肽通过上述肽连接体(例如，肽键)连接至一分子免疫球蛋白Fc区的C端区)之间的化学键形成，并且一分子生理活性物质可连接至这两个免疫球蛋白Fc区分子中的一个的N端区；或者可以是这样的形式：其中生理活性物质连接至两个免疫球蛋白Fc区分子的N端区中的每一个，但形式不具体受限于此。融合蛋白形式的第一和第二免疫球蛋白Fc区可通过免疫球蛋白Fc区与脑靶向肽之间的肽键框内(in-frame)融合，并且免疫球蛋白Fc区可包括铰链区、CH2结构域和CH3结构域，但免疫球蛋白Fc区不具体受限于此。
第一和第二免疫球蛋白Fc区之间的化学键可具体地是共价键，更具体地是二硫键，并且更具体地是在两个免疫球蛋白Fc区的铰链区中形成的二硫键，但化学键不具体受限于此。
本发明的再另一方面提供了含有脑靶向长效蛋白缀合物的组合物。
本发明的再另一方面提供了脑靶向长效蛋白缀合物在制备药学药物中的用途。
本发明的再另一方面提供了新型脑靶向肽。
在具体实施方式中，脑靶向肽是由选自SEQ ID NO：2、4、6、8、10、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40的氨基酸序列的任一个氨基酸序列组成的肽。
本发明的再另一方面提供了编码脑靶向肽的分离的多核苷酸。
本发明的再另一方面提供了含有该多核苷酸的重组表达载体。
本发明的再另一方面提供了含有该重组表达载体的转化体。
[有益效果]
含有脑靶向肽和生理活性物质的本发明的脑靶向长效缀合物具有这样的效果：其能够在体内穿过血脑屏障(BBB)，维持生理活性，并且显著增加血液半衰期。脑靶向长效缀合物还提高了稳定性，并因此可用作用于治疗脑相关疾病的治疗剂。另外，本发明提供了新型脑靶向肽，并且因此新型脑靶向长效缀合物可被制备用作治疗脑相关疾病的治疗剂。
附图说明
图1显示了确认脑靶向肽的血脑屏障穿过水平的转胞吞作用实验结果。
图2显示了在小鼠中进行的脑分布实验的结果，确认脑靶向肽的血脑屏障穿过水平。
图3显示了确认连接免疫球蛋白Fc区的脑靶向肽的血脑屏障穿过水平和单独免疫球蛋白Fc区的血脑屏障穿过水平的结果。
图4显示了确认含有GIP衍生物(即，生理活性物质)的脑靶向长效缀合物的血脑屏障穿过水平的转胞吞作用实验结果。
图5显示了确认含有艾杜硫酸酯酶(idursulfase)(即，生理活性物质)的脑靶向长效缀合物关于维持生理活性的能力的结果。
具体实施方式
在下文中，本发明将作详细描述。同时，本文公开的各解释和示例性实施方式都可适用于其对应的其它解释和示例性实施方式。即，本文公开的各种因素的所有组合都属于本发明的范围。另外，本发明的范围不应受下文提供的具体公开内容限制。
另外，关于本发明中描述的发明具体实施方式的多种等同形式，本领域普通技术人员将会认识到或有能力利用不超过常规实验进行确认。另外，这种等同形式意图包括在本发明中。
在本发明的整个说明书中，使用氨基酸的常规单字母和三字母代码。另外，使用通常允许用于其它氨基酸的三字母代码，如二氨基丙酸(DAP)。另外，本文提到的氨基酸根据IUPAC-IUB的命名规则进行缩写。
本发明的一个方面提供了含有脑靶向肽和生理活性物质的脑靶向长效缀合物。更具体地，脑靶向长效缀合物可以是这样的缀合物：其中脑靶向肽(其基于免疫球蛋白Fc区通过肽连接体和/或直接融合或者非肽连接体而连接)与生理活性物质连接，但不限于此。本发明的脑靶向长效缀合物的特征在于脑靶向肽通过肽连接体、直接融合或非肽连接体连接至免疫球蛋白Fc区，不连接至生理活性物质。
在更具体的实施方式中，本发明提供了下式1的脑靶向长效缀合物：
[式1]
X-L1-F-L2-Y
在式1中，
X是生理活性物质；
Y是脑靶向肽；
L1和L2是肽连接体或非肽连接体；
当L1和L2是肽连接体时，肽连接体含有0至1,000个氨基酸；并且
F是包含FcRn结合区的免疫球蛋白恒定区。
本发明的长效缀合物形式的特征在于生理活性物质基于脑靶向肽和Fc区而连接。具体地，本发明的长效缀合物的特征在于脑靶向肽通过肽连接体连接至免疫球蛋白Fc区，并且生理活性物质通过非肽连接体连接至其；然而，两种类型都可通过肽连接体和/或非肽连接体连接，但连接不限于此。肽连接体可以是含有0至1,000个氨基酸的连接体，但可形成本发明缀合物的任何肽连接体都可不限制地被包括在内。当肽连接体不含有氨基酸时，缀合物可以是通过肽键代替连接体而融合的形式。
脑靶向长效缀合物的式1的“F-L2-Y”可以是具有下式2的结构的脑靶向长效缀合物。
[式2]
在上式2中，
Fa和Fb各自是单链多肽链，其包括含有铰链区、CH2结构域和CH3结构域的免疫球蛋白Fc区，其中Fa和Fb通过铰链区中的二硫键连接，并且从而含有Fc片段，并且Fa和L1彼此共价键合；
BTPa1、……、BTPan中的每一个彼此相同或不同，是脑靶向肽；
BTPb1、……、BTPbn′中的每一个彼此相同或不同，是脑靶向肽；
L2a1、……、L2an中的每一个彼此相同或不同，是肽连接体；并且
L2b1、……、L2bn′中的每一个彼此相同或不同，是肽连接体；
其中n和n′可各自独立地是整数。
在脑靶向长效缀合物中，L1可连接至Fa的N端，并且L2a1和L2b1可各自分别连接至Fa和Fb的C端。
在式2的脑靶向长效缀合物中，n＝n′，并且各自满足L2a1＝L2b1、……、L2an＝L2bn′和BTPa1＝BTPb1、……、BTPan＝BTPbn′的条件，但条件不限于此。
脑靶向长效缀合物的式1的F是Fa和Fb，并且“L2-Y”是(L2a-Y)n和(L2b-Y)n′，并且脑靶向长效缀合物可由下式3表示。
[式3]
在上式3中，
X是生理活性物质；
L1是肽连接体或非肽连接体；
Fa和Fb各自是含有铰链区、CH2结构域和CH3结构域的免疫球蛋白Fc区，并且Fa和Fb通过铰链区中的半胱氨酸残基之间的二硫键彼此共价键合；
Ya和Yb是脑靶向肽，彼此种类相同或彼此种类不同；
L2a和L2b是肽连接体，彼此种类相同或彼此种类不同；并且
n和n′各自独立地是1或更大的整数。
当n和n′各自独立地是2或更大的整数时，脑靶向长效缀合物可以是这样的缀合物：其中至少两个相同或不同的脑靶向肽被连接，并且所述至少两个相同或不同的脑靶向肽可以是串联连接形式，但连接形式不限于此。
n和n′可以是1或2或更大的整数，并且n和n′可以是相同或不同的整数，但n和n′不限于此。n和n′可以是1至10，和1至5，例如，n和n′可以各自是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，但n的数目被非限制地包括——如果Fc区和生理活性物质作为部分被连接，构成待通过穿过BBB而递送的本发明脑靶向长效缀合物的一部分。
脑靶向长效缀合物可以是这样的缀合物：其中X的N端区和F的N端区通过L1连接，并且Y的N端区和F的C端区通过L2连接。另外，脑靶向长效缀合物可以是这样的形式：其中L1的一个末端连接至X的赖氨酸残基或半胱氨酸残基等，并且L1的另一末端连接至F的N端区；并且Y的N端区和F的C端区通过L2连接。
脑靶向长效缀合物可以是这样的形式：其中L1连接至F的N端区，并且L2连接至F的C端区；或L1连接至Fa的N端区，并且L2a和L2b各自分别连接至Fa和Fb的C端区。
L1可连接至X的胺基或巯基；并且L1可连接至X的N端胺基，所述胺基位于赖氨酸残基的侧链，或位于半胱氨酸残基的侧链的-SH基团(巯基)，但不限于此。
如本文所用，术语“N端区”指代肽或蛋白质的氨基末端，并且出于本发明的目的，指代能够结合包括非肽连接体等在内的连接体的位点。例如，N端区附近的氨基酸残基以及N端区的最末端氨基酸残基可都被包括在内，并且具体地，可包括从最末端区起第一至第二十个氨基酸残基，但氨基酸残基的位点不具体受限于此。
如本文所用，术语“C端区”指代肽或蛋白质的羧基末端，并且出于本发明的目的，指代能够结合包括非肽连接体等在内的连接体的位点。例如，C端附近的氨基酸残基以及C端区的最末端氨基酸残基可都被包括在内，并且具体地，可包括从最末端起第一至第二十个氨基酸残基，但氨基酸残基的位点不具体受限于此。
如本文所用，术语“脑靶向长效缀合物”指代这样的缀合物：其包括脑靶向肽和生理活性物质以及免疫球蛋白恒定区，并且具有其中脑靶向肽和生理活性物质各自分别直接或间接连接至FcRn结合区的结构。术语“脑靶向长效缀合物”可与“长效缀合物”交换使用，并且其指代这样的物质：其中长效缀合物中包括的生理活性物质连接至生物相容性物质——该生物相容性物质包括能够延长生理活性物质的活性持续时间并具有FcRn结合区的免疫球蛋白恒定区——和含有0至1,000个氨基酸的肽连接体和/或非肽连接体。
脑靶向长效缀合物能够通过穿过血脑屏障将生理活性物质递送至脑组织中，但不具体受限于此。
在下文中，构成脑靶向长效缀合物的要素将作更详细地描述。
如本文所用，术语“脑靶向肽”包括含有能够穿过BBB的氨基酸序列的肽或蛋白质或抗体。脑靶向肽相应于构成本发明的脑靶向长效缀合物的一部分。
另外，脑靶向肽可以是从已知的肽、蛋白质或抗体分离并且具有能够穿过BBB的活性的序列。
如本文所用，术语“氨基酸”指代包括任何天然存在的或非天然存在的或合成的氨基酸残基的氨基酸部分，即，包括任何通过一个、两个、三个或更多个碳原子(一般通过单个(α)碳原子)直接连接的至少一个羧基残基和至少一个氨基残基的部分。
本发明的脑靶向肽可特征在于其能够通过被动转运途径或受体介导转运途径穿过血脑屏障，但转运途径不限于此。例如，脑靶向肽可以是能够穿过血脑屏障的肽、蛋白质或抗体，但其类型和大小不受具体限制。
同时，脑靶向肽可以是通过受体介导转运途径穿过血脑屏障的肽。
同时，脑靶向肽可以是通过受体介导转运途径穿过血脑屏障的肽。
具体地，脑靶向肽可通过经由受体介导转运途径、通过选自以下的任一种而穿过血脑屏障：胰岛素受体、转铁蛋白受体、低密度脂蛋白受体、低密度脂蛋白受体相关蛋白质、瘦蛋白受体、烟碱性乙酰胆碱受体、谷胱甘肽转运体、钙激活钾通道和晚期糖基化终产物受体(RAGE)、以及受体的配体和结合该受体或配体的抗体，但途径不具体受限于此；并且另外可选自能够穿过血脑屏障的肽、蛋白质和抗体，或者可以是从该肽、蛋白质和抗体分离的部分肽序列，但途径不具体受限于此。例如，SEQ ID NO：2的HAITYPRH肽(BTP1肽)、SEQ ID NO：4的THR肽(BTP2肽)、SEQ ID NO：6的Angiopep-2肽(BTP3肽)、SEQ ID NO：8的ApoB肽(BTP4肽)、SEQ ID NO：10的ApoE肽(BTP5肽)等可以被使用，但任何能够通过穿过血脑屏障将所连接的F-L2-Y结构递送至脑的肽都可非限制地被包括在内。
在另一具体实施方式中，SEQ ID NO：20的BTP6肽、SEQ ID NO：22的BTP7肽、SEQ IDNO：24的BTP8肽、SEQ ID NO：26的BTP9肽、SEQ ID NO：28的BTP10肽、SEQ ID NO：30的BTP11肽、SEQ ID NO：32的BTP12肽、SEQ ID NO：34的BTP13肽、SEQ ID NO：36的BTP14肽、SEQ IDNO：38的BTP15肽、或SEQ ID NO：40的BTP16肽，但该肽不限于此。
在另一具体实施方式中，脑靶向肽可以是：
(1)Angiopep-2：TFFYGGSRGKRNNFKTEEY-OH(SEQ ID NO：41)，
(2)ApoB(3371-3409)：SVIDALQYKLEGTTRLTRKRGLKLATALSLSNKFVEGS(SEQ ID NO：42)，
(3)ApoE(159-167)2：(LRKLRKRLL)2(SEQ ID NO：43)，
(4)肽-22：Ac-C(&)MPRLRGC(&)-NH2(SEQ ID NO：44)，
(5)THR：THRPPMWSPVWP-NH2(SEQ ID NO：45)，
(6)THR retro-enantio：pwvpswmpprht-NH2(SEQ ID NO：46)，
(7)CRT：C(&)RTIGPSVC(&)(SEQ ID NO：47)，
(8)瘦蛋白30：YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVL(SEQ ID NO：48)，
(9)RVG29：YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG-OH(SEQ ID NO：49)
(10)DCDX：GreirtGraerwsekf-OH(SEQ ID NO：50)
(11)蜂毒明肽：C(&1)NC(&2)KAPETALC(&1)-ARRC(&2)QQH-NH2(SEQ ID NO：51)，
(12)MiniAp-4：[Dap](&)KAPETALD(&)(SEQ ID NO：52)，
(13)GSH：γ-L-谷氨酰基-CG-OH
(14)G23：HLNILSTLWKYRC(SEQ ID NO：53)，
(15)g7：GFtGFLS(O-β-Glc)-NH2(SEQ ID NO：54)，
(16)TGN：TGNYKALHPHNG(SEQ ID NO：55)，
(17)TAT(47-57)：YGRKKRRQRRR-NH2(SEQ ID NO：56)，
(18)SynB1：RGGRLSYSRRRFSTSTGR(SEQ ID NO：57)，
(19)二酮哌嗪：&(N-MePhe)-(N-MePhe)二酮哌嗪，或
(20)PhPro：(苯基脯氨酸)4-NH2(SEQ ID NO：58)，
但肽不限于此。
在上述序列中，&是根据(J.Pept.Res.,2005,65,550-555；J.Spengler et al.)中描述的环状肽命名法的符号，并且“&”表示连接点。例如，单链中的第一个“&”表示化学键的一端的位置，并且第二个“&”表示该化学键所附接的位置。例如，“&Ala-Ala-Phe-Leu-Pro&”意为在丙氨酸和脯氨酸之间形成化学键，从而形成环状肽。在两个或更多个化学键存在的情况下，可以使用诸如&1和&2的代码，以表示相应化学键形成的位置。例如，在表示为“&1Asp(&2)-Trp-Phe-Dpr(&2)-Leu-Met&1”的情况下，意为在Asp和Met之间形成化学键，并且在Asp和Dpr之间形成化学键。同时，[Dap]代表二氨基丙酸。
如本文所用，术语“生理活性物质”——其可以是形成脑靶向长效缀合物的部分的结构——统一指代在体内具有某些生理活性的物质，并且这些物质具有各种生理活性。生理活性物质X可以是由2个氨基酸至1,000个氨基酸、2个氨基酸至950个氨基酸、2个氨基酸至900个氨基酸、2个氨基酸至850个氨基酸、2个氨基酸至800个氨基酸、2个氨基酸至750个氨基酸、2个氨基酸至700个氨基酸、5个氨基酸至700个氨基酸、5个氨基酸至650个氨基酸、5个氨基酸至600个氨基酸、5个氨基酸至550个氨基酸、5个氨基酸至500个氨基酸、5个氨基酸至450个氨基酸、5个氨基酸至400个氨基酸、5个氨基酸至350个氨基酸、5个氨基酸至300个氨基酸、5个氨基酸至250个氨基酸、5个氨基酸至200个氨基酸、5个氨基酸至150个氨基酸、5个氨基酸至100个氨基酸、5个氨基酸至90个氨基酸、约5个氨基酸至约80个氨基酸、5个氨基酸至70个氨基酸、5个氨基酸至60个氨基酸、5个氨基酸至50个氨基酸、5个氨基酸至40个氨基酸、5个氨基酸至30个氨基酸、5个氨基酸至25个氨基酸、或5个氨基酸至20个氨基酸组成的多肽，但不限于此。构成生理活性物质的多肽包括所有肽、寡肽、多肽和蛋白质。
生理活性物质可以是毒素或生理活性多肽，并且可包括各种生理活性多肽，如细胞因子、白介素、白介素结合蛋白、酶、抗体、生长因子、转录因子、凝血因子、疫苗、结构蛋白、配体蛋白或受体、细胞表面抗原、和用于预防或治疗人类疾病的受体拮抗剂、小肠和胰腺中分泌的对糖尿病和肥胖呈现治疗效果的生理活性肽、以及G蛋白偶联受体(GPCR)激动剂或拮抗剂、或其类似物，但生理活性物质不限于此。
如本文所用，术语“X的类似物”指代能够呈现与X相同类型活性的物质，并且其包括所有X激动剂、X衍生物、X片段、X变体等。
具体地，毒素可选自美登素和/或其衍生物、澳瑞他汀和/或其衍生物、倍癌霉素和/或其衍生物、吡咯并苯并二氮杂(PBD)和/或其衍生物——其对癌细胞的凋亡有效，但对癌细胞凋亡呈现效果的任何毒素可非限制地被包括在内
具体地，生理活性多肽的实例可包括GLP-1受体激动剂、胰高血糖素受体激动剂、胃抑多肽(GIP)受体激动剂、成纤维细胞生长因子(FGF)受体激动剂(FGF1、FGF19、FGF21、FGF23等)、缩胆囊素受体激动剂、胃泌素受体激动剂、黑皮质素受体激动剂、人生长激素、生长激素释放激素、生长激素释放肽、干扰素和干扰素受体(例如，干扰素-α、-β和-γ、可溶性I型干扰素受体等)、集落刺激因子、白介素(例如，白介素-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12、-13、-14、-15、-16、-17、-18、-19、-20、-21、-22、-23、-24、-25、-26、-27、-28、-29、-30等)和白介素受体(例如，IL-1受体、IL-4受体等)、酶(例如，β-葡糖苷酶)、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸酯酶、酸性α-葡糖苷酶、酸性神经酰胺酶、酸性鞘磷脂酶、半乳糖脑苷脂酶、芳基硫酸酯酶A、B、β-氨基己糖酶A、B、肝素N-硫酸酯酶、α-D-甘露糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、N-乙酰半乳糖胺-6硫酸酯酶、溶酶体酸性脂肪酶、α-N-乙酰氨基葡糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、丁酰胆碱酯酶、几丁质酶、谷氨酸脱羧酶、伊米苷酶、脂肪酶、尿酸酶、血小板激活因子乙酰水解酶、中性肽链内切酶、髓过氧化物酶、α-半乳糖苷酶-A、阿加糖酶α、β、α-L-艾杜糖苷酸酶、丁酰胆碱酯酶、几丁质酶、谷氨酸脱羧酶、伊米苷酶、脂肪酶、尿酸酶、血小板激活因子乙酰水解酶、中性肽链内切酶和髓过氧化物酶等)、白介素和细胞因子结合蛋白(例如，IL-18bp、TNF结合蛋白等)、巨噬细胞激活因子、巨噬细胞肽、B细胞因子、T细胞因子、蛋白质A、变态反应抑制因子、坏死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、肿瘤坏死因子、肿瘤抑制物、转化生长因子、α-1抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳白蛋白、载脂蛋白-E、促红细胞生成素、高度糖基化的促红细胞生成素、血管生成素、血红蛋白、凝血酶、凝血酶受体激活肽、血栓调节素、凝血因子VII、凝血因子VIIa、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子XIII、纤溶酶原激活物、纤维蛋白结合肽、尿激酶、链激酶、水蛭素、蛋白质C、C反应蛋白、肾素抑制物、胶原酶抑制物、超氧化物歧化酶、瘦蛋白、血小板衍生生长因子、上皮生长因子、表皮生长因子、制管张素、血管紧张素、骨形态发生生长因子；骨形态发生蛋白、降钙素、胰岛素、房肽素、软骨诱导因子、依降钙素、结缔组织激活因子、组织因子途径抑制物、促卵泡激素、黄体生成激素、黄体生成激素释放激素、神经生长因子类(例如，神经生长因子、睫状节神经细胞营养因子、轴突发生因子-1、脑促尿钠排泄肽、胶质衍生神经营养因子、导蛋白、嗜中性白细胞抑制因子、神经营养因子、神经秩蛋白)、甲状旁腺激素、松弛素、分泌素、生长调节素、胰岛素样生长因子、肾上腺皮质激素、胰高血糖素、缩胆囊素、胰多肽、胃泌素释放肽、促皮质素释放因子、促甲状腺激素、自家趋化素、乳铁蛋白、肌肉生长抑制素、活动依赖性神经保护蛋白(ADNP)、β-分泌酶1(BACE1)、淀粉样前体蛋白(APP)、神经细胞黏着分子(NCAM)、淀粉样蛋白β、tau、晚期糖基化终产物受体(RAGE)、α-突触核蛋白、或其激动剂或拮抗剂、其受体(例如，TNFR(P75)、TNFR(P55)、IL-1受体、VEGF受体、B细胞激活因子受体等)、受体拮抗剂(例如，IL1-Ra等)、细胞表面抗原(例如，CD2、3、4、5、7、11a、11b、18、19、20、23、25、33、38、40、45、69等)、单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段(例如，scFv、Fab、Fab′、F(ab′)2和Fd)、病毒衍生的疫苗抗原、激活至少一种受体激动剂的杂合多肽或嵌合多肽等，但生理活性多肽但不限于此。
如本文所用，术语“艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶”——其是与亨特综合征(MPS-II)相关的硫酸酯酶——是硫酸肝素和硫酸皮肤素的溶酶体降解所需的酶。在本发明的具体实施方式中，“艾杜硫酸酯酶”——其是艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的纯化型——可作为艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶使用，并且显然艾杜硫酸酯酶被包括在艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶内。艾杜硫酸酯酶可以是例如艾杜硫酸酯酶α或艾杜硫酸酯酶β，但不限于此。
艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶可通过本领域已知方法准备或制备，并且具体地，其可由插入了动物细胞表达载体并被培养的动物细胞并且在其培养后纯化，或者可商购的酶可以被购买使用，但艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的准备方法不限于此。
适用于本发明的生理活性多肽可以是天然形式，或者是通过在原核细胞如大肠杆菌(Escherichia coli)或真核细胞诸如酵母细胞、昆虫细胞或动物细胞中进行基因重组而制备的那些。另外，生理活性多肽可以是具有等同于天然形式或相同物种的活性的类似物(例如，一个或多个氨基酸位置处的突变衍生物)，但适用的生理活性多肽不限于此。
同时，GLP-1受体激动剂可选自天然毒蜥外泌肽-4；毒蜥外泌肽-4衍生物，其中毒蜥外泌肽-4的N端胺基缺失；毒蜥外泌肽-4衍生物，其中毒蜥外泌肽-4的N端胺基用羟基取代；毒蜥外泌肽-4衍生物，其中毒蜥外泌肽-4的N端胺基用二甲基修饰；毒蜥外泌肽-4衍生物，其中毒蜥外泌肽-4的N端胺基用羧基取代；毒蜥外泌肽-4衍生物，其中毒蜥外泌肽-4的第1位氨基酸——组氨酸——的α碳缺失；毒蜥外泌肽-4衍生物，其中毒蜥外泌肽-4的第12位氨基酸——赖氨酸——用丝氨酸取代；以及毒蜥外泌肽-4衍生物，其中毒蜥外泌肽-4的第12位氨基酸——赖氨酸用精氨酸取代，但GLP-1受体激动剂不具体受限于此。
在具体实施方式中，本发明提供了脑靶向长效缀合物，其特征在于生理活性物质通过相互结合而连接至与免疫球蛋白Fc区融合的脑靶向肽的免疫球蛋白Fc区。
如本文所用，术语“F”指代包括免疫球蛋白恒定区和FcRn结合区的物质，并且具体地，其相应于构成本发明脑靶向长效缀合物的一部分。例如，F可以是包括FcRn结合区的免疫球蛋白Fc区。
在另一具体实施方式中，与免疫球蛋白Fc区融合的脑靶向肽的免疫球蛋白Fc区可以是免疫球蛋白Fc区以外的生物相容性物质。
如本文所用，术语“生物相容性物质”指代这样的物质：当该物质融合至或共价结合至生理活性物质以形成缀合物时，可通过增加生理活性物质的体内半衰期而延长活性持续时间。例如，由于最优先之处在于增加半衰期和生物利用度以及维持持续活性，因此可融合或连接至生理活性物质的那些物质的实例可以是各种生物相容性物质，例如，聚乙二醇、脂肪酸、胆固醇、白蛋白和其片段、白蛋白结合物质、弹性蛋白、弹性蛋白的水溶性前体和弹性蛋白蛋白质部分序列的若干重复单元的聚合物、抗体、抗体片段、FcRn结合物质、体内结缔组织、核苷酸、纤连蛋白、转铁蛋白、多糖、聚合物等可被非限制地包括在内。
由于免疫球蛋白Fc区是可在体内代谢的可生物降解多肽，其安全用作药物载体。另外，免疫球蛋白Fc区与免疫球蛋白的全分子相比具有相对低的分子量，其在缀合物的制备、纯化和收率方面是有利的。另外，由于因抗体与抗体之间氨基酸序列的差异而呈现高异质性的Fab区被去除，预期物质的同质性可被大幅提高并且引起血液抗原性的风险也可以被降低。
与免疫球蛋白Fc区融合的脑靶向肽缀合物通过肽键连接至免疫球蛋白Fc区，并且在表达其的宿主细胞中作为长效缀合物产生。表达宿主可以非限制地是微生物如大肠杆菌或酵母细胞、昆虫细胞、动物细胞等。
如本文所用，术语“免疫球蛋白恒定区”可以是形成脑靶向长效缀合物的部分的结构，并且包括免疫球蛋白的重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)，不包括重链和轻链可变区和轻链恒定区(CL1)。铰链区可被包括在重链恒定区中。
免疫球蛋白恒定区可以是免疫球蛋白Fc区。
F的免疫球蛋白恒定区可包括选自CH1、CH2、CH3和CH4结构域的一至四个结构域。
本发明的免疫球蛋白恒定区可以是1)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域，2)CH1结构域和CH2结构域，3)CH1结构域和CH3结构域，4)CH2结构域和CH3结构域，和5)选自CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域中的一个或两个或更多个结构域与免疫球蛋白的铰链区(或部分铰链区)之间的组合(例如，CH2结构域和CH3结构域与铰链区(或部分铰链区)之间的组合)，和6)重链恒定区和轻链恒定区的各结构域之间的二聚体。本发明的铰链区不仅包括天然铰链区，而且包括部分或全部本领域已知的铰链区。
具体地，F的免疫球蛋白恒定区可包括铰链区、CH2结构域和CH3结构域，但不具体受限于此。
另外，本发明的免疫球蛋白Fc区不仅包括天然氨基酸序列，而且包括其序列衍生物(突变体)。氨基酸序列衍生物指代因缺失、插入、非保守或保守取代或其组合而具有至少一个氨基酸残基差异的氨基酸序列。例如，已知对免疫球蛋白Fc的缀合非常重要的位置214至238、297至299、318至322或327至331处的氨基酸残基可用作用于适当的修饰位点。另外，各种其它种类的衍生物是可能的，包括如下衍生物：缺失能够形成二硫键的区域、或缺失天然Fc的N端的一些氨基酸残基或在天然Fc的N端添加甲硫氨酸残基的衍生物。进一步地，为了去除效应功能，缺失可发生在补体结合位点，如C1q结合位点和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)位点。制备这种免疫球蛋白Fc区的序列衍生物的技术在国际专利公开号WO97/34631、WO 96/32478等中被公开。
通常不改变蛋白质或肽活性的蛋白质和肽中的氨基酸交换是本领域已知的(H.Neurath,R.L.Hill,The Proteins,Academic Press,New York,1979)。最常发生的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。在一些情况下，Fc区可通过磷酸化、硫酸化、丙烯酸化、糖基化、甲基化、法尼基化、乙酰化、酰胺化等被修饰。
上述免疫球蛋白恒定区衍生物可以是显示与本发明的免疫球蛋白恒定区相同的生物活性并且对热、pH等具有提高的结构稳定性的那些衍生物。
另外，免疫球蛋白Fc区可得自由人或动物如牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠、豚鼠等体内分离的天然形式，或者可以是得自转化的动物细胞或微生物的其重组体或衍生物。在本文中，Fc区可得自天然免疫球蛋白——通过将完整的免疫球蛋白从活人体或动物体分离和用蛋白酶处理分离的免疫球蛋白。当用木瓜蛋白酶处理完整的免疫球蛋白时，其被切割成Fab和Fc区，而当用胃蛋白酶处理完整的免疫球蛋白时，其被切割成pF′c和F(ab)2片段。这些片段可利用尺寸排阻色谱法等分离。在更具体的实施方式中，免疫球蛋白Fc区可以是从关于人源Fc区的微生物获得的重组免疫球蛋白Fc区。
另外，免疫球蛋白恒定区可以是天然聚糖的形式、与天然型相比聚糖增加或减少、或者去糖基化形式。免疫球蛋白Fc聚糖的增加、减少或去除可通过常规方法如化学方法、酶法和利用微生物的基因工程法来实现。通过从Fc区去除聚糖所获得的免疫球蛋白Fc区显示了对补体(C1q部分)的结合亲和力显著降低或抗体依赖性细胞毒性或补体依赖性细胞毒性降低或丧失，并且因此其在体内不引起不必要的免疫应答。关于这点，去糖基化或非糖基化的免疫球蛋白Fc区中的免疫球蛋白Fc区可以是更适于作为药物载体实现本发明原始目标的形式。
如本文所用，术语“去糖基化”指代从Fc区酶促地去除糖部分，以及术语“非糖基化”指代在原核生物(更具体地，大肠杆菌)中产生的非糖基化的免疫球蛋白恒定区。
同时，免疫球蛋白Fc区可衍生自人或动物，包括牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠和豚鼠，并且优选地，其衍生自人。
另外，免疫球蛋白(Ig)Fc区可衍生自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM或其组合或杂合。例如，其可衍生自人血液中最丰富的蛋白质之中的IgG或IgM，并且其可衍生自已知增加配体结合蛋白的半衰期的IgG。同时，如本文所用，术语“组合”意为编码相同来源的单链免疫球蛋白Fc区的多肽连接至不同来源的单链多肽以形成二聚体或多聚体。即，可从选自IgG Fc、IgA Fc、IgM Fc、IgD Fc和IgE Fc片段的两个或更多个片段制备二聚体或多聚体。
如本文所用，术语“杂合”意为相应于不同来源的两个或更多个免疫球蛋白Fc片段的序列存在于免疫球蛋白Fc区的单链中。在本发明中，各种杂合形式是可能的。即，杂合结构域可由选自IgG Fc、IgM Fc、IgA Fc、IgE Fc和IgD Fc的CH1、CH2、CH3和CH4的一至四个结构域构成，并且可进一步包括铰链区。
同时，IgG还可分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类，并且本发明可包括其组合或杂合，例如，IgG2和IgG4亚类，以及具体地，很少具有效应功能如补体依赖性细胞毒性(CDC)的IgG4的Fc区，但不限于此。另外，在实施方式中，免疫球蛋白Fc区可以是IgG1 Fc区或IgG4Fc区，但不限于此。
如本文所用，术语式1的“L1和/或L2”——其是形成脑靶向长效缀合物的一部分的构成要素——指代将脑靶向肽或生理活性物质连接至免疫球蛋白Fc区的连接体。连接体基本上指代能够利用共价键等连接两个融合配偶体的连接体。除了连接融合配偶体之外，连接体还能够起到提供融合配偶体之间某个尺寸的间隙或提供柔性或刚性的作用，但连接体的作用不具体受限于此。
在具体实施方式中，式1的L1和L2中的一个可以是肽连接体，并且式1的L1和L2中的另一个可以是非肽连接体。可选地，式1的L1和L2中的一个可以是肽连接体，式1的L1和L2中的另一个可以是非肽连接体，以及L1和L2两者都可以是肽连接体，同时L1和L2两者都可以是非肽连接体，但式1的L1和L2不具体受限于此。
在另一具体实施方式中，当式1的L1和L2中的任一者或两者是非肽连接体时，该非肽连接体可选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、可生物降解聚合物、脂质聚合物、几丁质、透明质酸、脂肪酸、高分子量聚合物、低分子量化合物、核苷酸及其组合，但非肽连接体不限于此。
在再另一具体实施方式中，当L1是非肽连接体并且L2是肽连接体时，该肽连接体可含有0至1,000个氨基酸。在另一具体实施方式中，当L1是非肽连接体并且L2是肽连接体时，肽连接体不含有氨基酸，F和作为脑靶向肽的Y可直接通过融合形成。
在再另一具体实施方式中，当L1和L2中的任一者或两者是肽连接体时，X和F、或者F和Y通过L1和L2经由共价化学键、非共价化学键或其组合彼此连接；并且L1和L2各自含有0至1,000个氨基酸。当肽连接体不含有氨基酸时，X和F、或者F和Y可通过肽键连接。
在再另一具体实施方式中，当L1和L2中的任一者或两者是肽连接体并且L1和L2各自不含有氨基酸时，(i)X和F、或者F和Y可通过肽键连接；或(ii)X和F、或者F和Y可通过肽键连接。
如本文所用，术语“肽连接体”包括连接两个融合配偶体或氨基酸聚合物的肽缀合物。具体地，肽连接体可含有0至1,000个氨基酸序列，并且更具体地，0至900个氨基酸序列、0至800个氨基酸序列、0至700个氨基酸序列、0至600个氨基酸序列、0至500个氨基酸序列、0至400个氨基酸序列、0至300个氨基酸序列、0至250个氨基酸序列、0至200个氨基酸序列、0至150个氨基酸序列、0至100个氨基酸序列、0至90个氨基酸序列、0至80个氨基酸序列、0至70个氨基酸序列、0至60个氨基酸序列、0至50个氨基酸序列、0至40个氨基酸序列、0至30个氨基酸序列、0至25个氨基酸序列、0至20个氨基酸序列、0至15个氨基酸序列、或0至10个氨基酸序列，但氨基酸序列的数目不具体受限于此。
另外，肽连接体的实例可包括由氨基酸序列组成的肽，该氨基酸序列为这样的形式：其中GGGGS(SEQ ID NO：59)基序、GS基序、GGGS(SEQ ID NO：60)基序或GGSG(SEQ ID NO：61)基序重复，并且这些基序可重复1至10次，但基序不具体受限于此。
另外，当L2是肽连接体时，L2是(GS)m、(GGS)m、(GGGS)m或(GGGGS)m，并且m可以是1至10，但不限于此。
在再另一具体实施方式中，当L1和L2中的任一个是肽连接体并且这二者中的另一个是非肽连接体时，该肽连接体是含有0至1,000个氨基酸的连接体，并且该非肽连接体是聚乙二醇，但连接体不限于此。
如本文所用，术语“非肽连接体”指代其中两个或更多个重复单元被连接的生物相容性连接体，并且重复单元通过肽键以外的任何共价键彼此连接。
在再另一具体实施方式中，当非肽连接体与X和Y各自通过其对应的官能团连接时，非肽连接体的官能团可选自醛基、马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺衍生物。L1可以是两端都具有官能团的非肽聚合物，并且两端的官能团可以是胺反应基团或巯基反应基团，并且两端处的官能团可以彼此是相同种类或彼此是不同种类，但不限于此。
作为用于本发明的非肽连接体的非肽聚合物可选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、可生物降解聚合物如聚乳酸(PLA)和聚乳酸-乙醇酸(PLGA)、脂质聚合物、几丁质、透明质酸、寡核苷酸及其组合，以及例如聚乙二醇，但非肽聚合物不限于此。本领域已知的其衍生物和本领域技术水平上可容易制备的衍生物也被包括在本发明的范围内。
关于用于本发明的非肽聚合物，具有体内蛋白质降解耐性的任何聚合物可被非限制地使用。非肽聚合物的分子量可在如下范围内：超过0kDa至约100kDa，例如，约0.5kDa至约100kDa、约1kDa至约100kDa、或约1kDa至约20kDa，但分子量不限于此。
如本文所用，术语“约”指代包括±0.5、±0.4、±0.3、±0.2、±0.1等全部的范围，并且包括等同于或近似于跟随该数值的所有数值，但范围不限于此。
另外，关于非肽连接体，不仅可以使用单一种类的聚合物，还可以使用不同种类的聚合物的组合。
同时，作为用于本发明的非肽连接体的非肽聚合物可具有官能团，该官能团连接至F和X或Y的官能团，使得免疫球蛋白Fc区和生理活性物质可在其之间形成共价键。
具体地，非肽连接体可具有至少两个末端官能团，具体地2或3个末端官能团，并且更具体地两个末端官能团。
官能团可选自醛基、马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺衍生物，但官能团不限于此。
在上文中，醛基的实例可包括丙醛基或丁醛基，但醛基不限于此。
在上文中，琥珀酰亚胺衍生物的实例可包括琥珀酰亚胺戊酸基、琥珀酰亚胺甲基丁酸基、琥珀酰亚胺甲基丙酸基、琥珀酰亚胺丁酸基、琥珀酰亚胺丙酸基、N-羟基琥珀酰亚胺基、羟基琥珀酰亚胺、琥珀酰亚胺羧甲基或琥珀酰亚胺碳酸基，但琥珀酰亚胺衍生物不限于此。
非肽连接体的两端的官能团可以彼此相同或不同。
例如，非肽连接体的一端处的官能团可以是马来酰亚胺基，并且另一端的官能团可以是醛基(例如，丙醛基或丁醛基)。当在两端都具有羟基官能团的聚乙二醇用作非肽聚合物时，可以通过各种反应基团已知的化学反应使羟基活化，或者利用具有可商购的修饰反应基团的聚乙二醇制备本发明的缀合物。
另外，非肽聚合物可以是同一功能的(homo-functional)非肽聚合物，其中非肽连接体的两个末端或三个末端都是醛基。
例如，非肽连接体可以是在两端都具有丙醛基的非肽聚合物，并且具体地可以是在两端都具有丙醛基的聚乙二醇，但不具体受限于此。
当非肽连接体在两端都具有反应性醛基官能团时，其有效最小化非特异性反应和分别在两端连接生理活性多肽与免疫球蛋白。通过醛键经还原胺化所形成的终产物与通过酰胺键形成的那些相比显著更加稳定。醛官能团选择性地在低pH下在N端处反应，并且可在高pH(例如，pH 9.0)下与赖氨酸残基形成共价键。
本发明的脑靶向缀合物可以是其中含有彼此不同的生理活性物质的长效缀合物，其可以如下方式制备：编码然后化学结合融合至免疫球蛋白Fc区的脑靶向肽缀合物，然后将不同的生理活性物质连接至化学结合的免疫球蛋白Fc区。
化学结合的免疫球蛋白Fc区缀合物包括两个免疫球蛋白Fc区(其中单体Fc区被连接起来的Fc区二聚体形式，)，并且与所述两个免疫球蛋白Fc区中每一个结合的生理活性物质可连接至免疫球蛋白Fc区(单体Fc区)的单个位点或两个免疫球蛋白Fc区(每个Fc区二聚体形式)的两个位点。
化学结合可以是共价键，更具体地二硫键，并且还更具体地在两个免疫球蛋白Fc区的铰链区中形成的二硫键，但键合不具体受限于此。
更具体地，脑靶向长效缀合物可以是这样的形式：其中通过(i)第一免疫球蛋白Fc区(其中脑靶向肽通过上述肽连接体(例如，肽键)连接至一分子免疫球蛋白Fc区的C端区)与(ii)第二免疫球蛋白Fc区(其中脑靶向肽通过上述肽连接体(例如，肽键)连接至一分子免疫球蛋白Fc区的C端区)之间的化学键形成二聚体，并且一分子生理活性物质可连接至两个免疫球蛋白Fc区分子中的一个的N端区；或者可以是这样的形式：其中生理活性物质连接至两个免疫球蛋白Fc区分子的N端区中的每一个，但形式不具体受限于此。融合蛋白形式的第一和第二免疫球蛋白Fc区可通过免疫球蛋白Fc区与脑靶向肽之间的肽键框内融合，并且免疫球蛋白Fc区可包括铰链区、CH2结构域和CH3结构域，但免疫球蛋白Fc区不具体受限于此。
第一和第二免疫球蛋白Fc区之间的化学键可具体地是共价键，更具体地二硫键，并且更具体地在两个免疫球蛋白Fc区的铰链区中形成的二硫键，但化学键不具体受限于此。
本发明的再另一方面提供了用于制备式1的脑靶向长效缀合物的方法。
在具体实施方式中，用于制备式1的脑靶向长效缀合物的方法可包括：i)制备：(a)X-L1-F，其中X、L1和F连接，X是生理活性物质，L1是肽或非肽连接体，F包含免疫球蛋白Fc区；和(b)L2-Y，其中Y与L2连接，Y是脑靶向肽，L2是肽或非肽连接体；和(ii)连接(a)X-L1-F与(b)L2-Y。具体地，在具体实施方式中，(a)的L1可以是肽连接体，并且(b)的L2可以是非肽连接体。
在另一具体实施方式中，用于制备式1的脑靶向长效缀合物的方法可包括：(i)制备：(a)X-L1，其中X与L1连接，X是生理活性物质，L1是肽或非肽连接体；和(b)F-L2-Y，其中Y、L2和F连接，Y是脑靶向肽，L2是肽或非肽连接体，F包含免疫球蛋白Fc区；和(ii)连接(a)X-L1与(b)F-L2-Y。具体地，在具体实施方式中，(a)的L1可以是非肽连接体，并且(b)的L2可以是肽连接体。
在再另一具体实施方式中，用于制备式1的脑靶向长效缀合物的方法可包括：(i)制备：(a)X-L1，其中X与L1连接，X是生理活性物质，L1是肽或非肽连接体；和(b)F-L2-Y，其中Y、L2和F连接，Y是脑靶向肽，L2是肽或非肽连接体，F包含免疫球蛋白Fc区；和(ii)连接(a)X-L1与(b)F-L2-Y。具体地，在具体实施方式中，L1可以是非肽连接体，并且L2可以是肽连接体。L2可以不含有氨基酸，在这种情况下，长效缀合物可以F-Y形式直接融合。
在再另一具体实施方式中，非肽连接体与X和Y可通过其对应的官能团连接，其中非肽连接体的官能团可选自醛基、马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺衍生物。
本发明的含有脑靶向肽和生理活性物质的长效缀合物能够穿过血脑屏障、维持生理活性、并从而呈现提高的耐久性和稳定性。
本发明的再另一方面提供了脑靶向肽、编码脑靶向肽的分离的多核苷酸、含有该多核苷酸的表达载体、和含有该表达载体的转化体。
同时，脑靶向肽可包括肽本身、其盐(例如，该肽的药学上可接受的盐)或其溶剂化物形式的所有肽。
另外，脑靶向肽可以是任何药学上可接受的形式。
盐的种类不作具体限制。然而，盐优选是对于对象(例如，哺乳动物)安全和有效的盐，但不具体受限于此。
术语“药学上可接受的”指代处于医药决策的范围内能够有效用于目的用途而不引起过度毒性、刺激、过敏反应等的物质。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”指代衍生自药学上可接受的无机盐、有机盐或碱的盐。适合的盐的实例可包括盐酸、溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、甲苯-p-磺酸、酒石酸、醋酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。衍生自适合的碱的盐的实例可包括碱金属，如钠、钾等；碱土金属，如镁；铵等。
如本文所用，术语“溶剂化物”指代根据本发明的肽或其盐与溶剂分子之间形成的复合物。
编码脑靶向肽的分离的多核苷酸包括与相应序列75％或更高，具体地85％或更高，更具体地90％或更高，并且还更具体地95％的序列同源性的多核苷酸序列，被包括在本发明的范围内。
根据本发明的重组载体一般可构建为用于克隆的载体或表达载体，并且可利用原核或真核细胞作为宿主细胞来构建。
如本文所用，术语“载体”指代能够在适当的宿主细胞中表达目标蛋白的重组载体，其是包括被可操作地连接调节因子以能够表达基因插入物的基因构建物。
本发明的脑靶向长效缀合物可通过进行重组载体在宿主细胞中的转化或转染来获得。
在本发明中，编码脑靶向肽的多核苷酸能够被可操作地连接至启动子。
用于转化含有根据本发明的多核苷酸的重组载体的方法不限于以上实施方式，并且本领域常规使用的转化或转染方法可以被非限制地使用。
本发明的转化体可通过将含有根据本发明的多核苷酸的重组载体导入宿主细胞来获得。
用于本发明的适当宿主可不作具体地限制，只要其能够表达本发明的多核苷酸。适当宿主的实例可包括：属于埃希氏菌(Escherichia)属的细菌，如大肠杆菌(E.coli)；属于芽孢杆菌(Bacillus)属的细菌，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；属于假单胞菌(Pseudomonas)属的细菌，如恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)；酵母，如毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；昆虫细胞，如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf9)，以及动物细胞，如CHO、COS和BSC。
在下文中，将参考以下实施例对本发明作更详细的描述。然而，这些实施例仅出于示例性目的，并且本发明不意图被这些实施例限制。
实施例1：其中免疫球蛋白Fc区与脑靶向肽相缀合的融合蛋白的制备
为制备含有脑靶向肽和生理活性多肽的长效缀合物——其中包括免疫球蛋白恒定区和FcRn结合区的生物相容性物质、脑靶向肽和生理活性物质通过肽连接体连接，制备连接免疫球蛋白Fc区和脑靶向肽的融合蛋白。
关于这点，五种肽被选为脑靶向肽(表1)。
[表1]
作为能够增加其所连接的生理活性多肽的半衰期的生物相容性物质，选择了包括铰链区的IgG4 Fc区，并且将包括铰链区的IgG4 Fc区与脑靶向肽以基因水平融合，并且将各融合产物插入对应的表达载体。
通过肽连接体或通过直接融合方法连接包括铰链区的IgG4 Fc区与脑靶向肽，并且具体地通过经肽键连接包括铰链区的IgG4 Fc区与脑靶向肽，合成了融合蛋白(由韩国Bioneer公司合成)(表2)。由下表2中的序列可见，利用连接体或通过直接融合方法，通过将脑靶向肽的N端连接至IgG4 Fc区的C端，制备了含有包括铰链区的IgG4 Fc区和脑靶向肽的融合蛋白。
[表2]
由于编码融合至合成免疫球蛋白Fc区的脑靶向肽的基因在其两端包括NdeI和BamHI，将该基因插入通过NdeI和BamHI消化的pET22b表达载体。将插入有编码融合至合成免疫球蛋白Fc区的脑靶向肽的基因的表达载体插入BL21(DE3)菌株，并从而表达其中免疫球蛋白Fc区与脑靶向肽被连接起来的长效融合蛋白。
实施例2：脑靶向肽的制备
为检测融合至免疫球蛋白Fc区的各种脑靶向肽，设计并合成用于脑靶向的包括BTP1至BTP5的另外的肽(表3)。
[表3]
为了确认脑靶向肽是否实际上能够用于脑靶向，进行了体外和体内测试。
实施例3：脑靶向肽的转胞吞作用试验
进行转胞吞作用实验以确定脑靶向肽的血脑屏障(BBB)穿过水平。将人脑内皮细胞hCMEC/D3细胞以5×104个细胞/cm2的浓度在微孔膜上培养10天。为了确认BBB形成，用FITC-葡聚糖(70kDa)进行渗透测试，从而确认紧密连接的形成。然后，将25mM的FITC-BTP5、FITC-BTP11、FITC-BTP12、FITC-BTP16和FITC-毒蜥外泌肽4、FITC-P-8(阴性对照，P-8)置于hCMEC/D3细胞上。2小时和24小时之后，测量FITC的荧光强度(图1)。
结果是，与毒蜥外泌肽-4和阴性对照(P-8)相比，所有BTP都显示出较高的穿过水平。确认脑靶向肽如BTP5、BTP11和BTP16的穿过水平随时间提高。
这些结果表明本发明中确认的脑靶向肽能够有效地穿过BBB。
实施例4：脑靶向肽的脑分布的确认
在小鼠中进行脑分布测试，以确定脑靶向肽的BBB穿过水平。通过小鼠的颈总动脉(CCA)以2mg/头的浓度对小鼠给药，并将小鼠的脑分离并切成片段，并利用FITC的荧光在显微镜下观察脑靶向肽的BBB穿过水平(图2)。
经由CCA注射的脑靶向肽根据注射特征必扩散到脑区的一侧，并且测试结果是，用12.5×放大率的显微镜可以观察到向脑一侧的扩散。另外，确认用200×放大率的显微镜在海马(其在长期记忆中起重要作用)细胞体存在的区域中观察到FITC的荧光。有这些结果确认，脑靶向肽穿过BBB并进入了脑组织。
这些结果表明，本发明的脑靶向肽不仅可用于在体外靶向，还可用于在体内靶向脑，表明连接至脑靶向肽的生理活性物质也能够穿过BBB并且被有效递送至脑。此外，这些结果表明，关于长效缀合物形式的本发明缀合物，体内持续时间增加，并且随着持续时间增加，对脑的靶向能够更有效地进行。
实施例5：含有免疫球蛋白Fc区和脑靶向肽的融合蛋白的表达载体的制备
构建表达载体以表达另外的融合蛋白。含有铰链区的IgG4 Fc区被选为能够增加所连接的生理活性多肽的半衰期的生物相容性物质，并且将含有铰链区的IgG4 Fc区和脑靶向肽在基因水平上融合，并将融合产物插入对应的表达载体。
通过经由肽连接体或经由直接融合方法将包括铰链区的IgG4 Fc区与脑靶向肽连接，并且具体地通过经由肽键将包括铰链区的IgG4 Fc区与脑靶向肽连接，合成融合蛋白(由韩国Bioneer公司合成)(表4)。从下表4的序列中可见，利用连接体或通过直接融合方法，通过将脑靶向肽的N端连接至IgG4 Fc区的C端，制备了包含IgG4 Fc区和脑靶向肽的融合蛋白，该IgG4 Fc区具有下表4的序列并且包括铰链区与。
[表4]
由于编码融合至合成免疫球蛋白Fc区的脑靶向肽的基因在其两端处包括NdeI和BamHI，将该基因插入被NdeI和BamHI消化的pET22b表达载体。将插入有编码融合至合成免疫球蛋白Fc区的脑靶向肽的基因的表达载体插入BL21(DE3)菌株，从而表达其中免疫球蛋白Fc区与脑靶向肽被连接起来的长效融合蛋白。
实施例6：其中免疫球蛋白Fc区和至少两个脑靶向肽相连接的融合蛋白的表达载 体的制备
构建表达载体以表达另外的融合蛋白，从而增加受体结合亲和力。包括铰链区的IgG4Fc区被选为能够增加所连接的生理活性多肽的半衰期的生物相容性物质，并且通过定点诱变PCR在基因水平上将连接体和脑靶向肽插入所构建的表达载体。具体地，利用SEQ IDNO引物(表5)，将连接体和脑靶向肽插入免疫球蛋白Fc区的C端和脑靶向肽的N端之间，或脑靶向肽的C端和载体的BamHI位点所在位点之间。构建表达含有两个或更多个重复的脑靶向肽的融合蛋白(表6)的表达载体。这些融合蛋白具有表6中所示的序列。例如，在Fc-BTP22缀合物中，连接体被插入表2的BTP5肽的两个单元中，从而连接至Fc片段的CH3区的C端方向。具体地，如下表6中确认，通过将免疫球蛋白Fc区的C端与各脑靶向肽的N端连接，或者通过直接融合方法，制备融合蛋白。在这种情况下，串联连接形式的脑靶向肽意为脑靶向肽是其中单个单元的脑靶向肽通过连接体连接起来的形式。
[表5]
[表6]
实施例7：其中免疫球蛋白Fc区和脑靶向肽相融合的融合蛋白的表达
在pET22b载体(Novagen)的T7启动子的控制下，进行其中免疫球蛋白Fc区和脑靶向肽被连接起来的融合蛋白的表达。利用各构建表达载体，转化大肠杆菌BL21-DE3(大肠杆菌B F-dcm ompT hsdS(rB-mB-)galλDE)(Novagen)。转化按照Novagen建议的方法进行。收集其中转化各重组表达载体的单个菌落，并将其接种到含有氨苄青霉素(50μg/mL)的2L×Luria肉汤(LB)培养基中，并在37℃下培养15小时。将重组菌株培养肉汤和含有30％甘油的2×LB培养基以1：1的比例(v/v)混合，并将混合物各1mL等分到冷冻管中并在-140℃储存，并将所得物用作生产重组融合蛋白的细胞原液。
为了表达其中免疫球蛋白Fc区和脑靶向肽相融合的缀合物，将各小瓶的细胞原液溶解，接种到500mL的2×Luria肉汤(LB)中，并在37℃下在振荡水浴中培养14至16小时。当600nm的OD达到4.0或更高时，终止培养，并将所得培养物用作种子培养基。将种子培养基(1.6L)接种到发酵培养基中并开始初始分批发酵。培养条件为37℃，空气供应(2L/分钟；1vvm)，以及搅拌速度(650rpm)，并使用20％氨水溶液将pH维持在6.70。关于发酵的进程，当培养基中的营养物有限时，通过添加进料溶液(feeding solution)处理补料分批培养物(fed-batch culture)。基于OD值来监测细菌生长，并且当OD值达到120或更高时，向其引入IPTG至终浓度为0.5mM。引入后，进一步处理培养物约23至25小时。培养完成后，通过离心机收集重组菌株，并储存在-80℃直至使用。
实施例8：其中免疫球蛋白Fc区和脑靶向肽相融合的融合蛋白的回收和重折叠
将细胞破碎并重折叠，以将实施例7中表达的融合蛋白(其中各免疫球蛋白Fc区和各脑靶向肽相融合)转换成可溶形式。将200mL各细胞培养肉汤相应的细胞团重悬于200mL裂解缓冲液(50mM Tris，pH9.0，1mM EDTA(pH8.0)，0.2M NaCl，和0.5％Triton X-100)中。利用微流化处理器M-110EH(M1475C型,AC Technology Corp.)，将细胞在15,000psi的压力下破碎。将破碎的细胞裂解物在4℃下以12,200×g离心30分钟，并弃去上清液，并重悬于200mL裂解缓冲液(0.5％Triton X-100和1mM EDTA(pH 8.0))中。在4℃下以12,200×g离心30分钟后，将细胞团重悬于200mL洗涤缓冲液(20mM Tris(pH8.0))中，然后以相同方式离心。将细胞团重悬于100mL缓冲液(8M盐酸胍和50mM Tris(pH8.0))中，并在室温下搅拌2小时。2小时后，将所得物在23℃下以12,200×g离心30分钟，并收集上清液。然后，向其加入2.5mM二硫苏糖醇，并将混合物在37℃下搅拌30分钟。关于其中溶解化免疫球蛋白Fc区和脑靶向肽相融合的融合蛋白的重折叠，利用蠕动泵将3.5L缓冲液(3M尿素、1mM半胱氨酸、0.160M精氨酸、50mM Tris(pH9.2)和20％甘油)以1mL/min的流速加入其中，同时在4℃下搅拌36小时。将其中溶解化免疫球蛋白Fc区和脑靶向肽相融合的融合蛋白中的免疫球蛋白Fc区被表达为二聚体。
实施例9：通过亲和色谱法纯化
重折叠完成后，将样品在4℃下以12,200×g离心30分钟并收集上清液，并利用Satorius过滤器(0.22μm)过滤，并且用50％HCl将样品的pH调节至pH 7.5。使样品结合至用10mM Tris(pH 7.0)缓冲液平衡的蛋白质A-琼脂糖(GE healthcare)柱，然后洗脱其中免疫球蛋白Fc区和脑靶向肽相融合的缀合蛋白质。
实施例10：通过疏水色谱法纯化
在将0.6M硫酸铵引入洗脱的样品后，使引入有0.6M硫酸铵的样品结合至利用10mMTris(pH 7.0)缓冲液和0.6M硫酸铵作为缓冲液平衡的苯基HP(GE healthcare)柱，利用6个柱体积的0％至100％线性浓度梯度的10mM Tris(pH 7.5)缓冲液洗脱其中免疫球蛋白Fc区和脑靶向肽相融合的融合蛋白。
实施例11：其中免疫球蛋白Fc区和脑靶向肽相连接的融合蛋白的脑分布确认
在小鼠中进行脑分布测试，以确定其中免疫球蛋白Fc区和脑靶向肽相连接的融合蛋白的血脑屏障穿过水平。经由静脉内注射以10mg/kg的浓度向小鼠给药。两小时后，分离小鼠的脑，并测量其中免疫球蛋白Fc区和脑靶向肽相连接的融合蛋白的浓度，从而确认融合蛋白的血脑屏障穿过水平(图3)。
结果是，显示所测免疫球蛋白Fc区和脑靶向肽的血脑屏障穿过水平高于免疫球蛋白Fc区的情况，并且与免疫球蛋白Fc区的情况相比，免疫球蛋白Fc区和脑靶向肽的浓度在脑中高于在血清中。确认在其中两个或更多个同类脑靶向肽连接至免疫球蛋白Fc区的融合蛋白的情况下，所测浓度高于仅连接一个脑靶向肽时，并且还显示具有较高T/S比。
这些结果表明，其中免疫球蛋白Fc区和脑靶向肽相连接的本发明融合蛋白能够有效地穿过BBB并被递送到脑中。此外，这些结果表明，长效缀合物形式的本发明融合蛋白增加其体内持续时间，并且随着持续时间增加，脑的靶向可以更有效地进行。
在下文中，进行进一步的实验以确认本发明的长效融合蛋白是否，即使在生理活性物质连接至其中免疫球蛋白Fc区和脑靶向肽相连接的长效融合蛋白的情况下，也能够通过穿过BBB而被有效地传递送到脑，从而呈现生理活性。
实施例12：包含艾杜硫酸酯酶和PEG的缀合物的制备
制备含有艾杜硫酸酯酶(大约72kDa)的脑靶向长效缀合物，作为含有一般尺寸的蛋白质作为生理活性物质的脑靶向长效缀合物的实例。作为脑靶向长效缀合物的前体，首先如下制备单聚乙二醇化(mono-pegylated)缀合物，其中聚乙二醇作为连接体与艾杜硫酸酯酶连接。
在将艾杜硫酸酯酶(Shire，爱尔兰)浓缩至适当的浓度后，为了10K丁基-ALD(2)PEG(两端的氢均被修饰成丁醛的10kDa聚乙二醇，NOF，日本)的聚乙二醇化，在艾尔硫酸酯酶与10K丁基-ALD(2)PEG的摩尔比设定为1:10并且艾杜硫酸酯酶浓度设定为10mg/mL的条件下，在4℃下进行反应约2小时。具体地，反应通过将氰基硼氢化钠(NaBH3CN)——即还原剂——加入0.1M磷酸钾缓冲液(pH6.0)进行。利用磷酸钾缓冲液(pH 6.0)和NaCl浓度梯度将反应物施加于Source 15Q柱(GE，美国)，纯化艾杜硫酸酯酶-10K PEG——即单聚乙二醇化缀合物。
实施例13：作为脑靶向长效缀合物的艾杜硫酸酯酶-10KDa PEG-Fc-BTP22缀合物 的制备
然后，通过将艾杜硫酸酯酶-10KDa PEG缀合物与含有脑靶向肽的Fc片段连接，制备脑靶向长效缀合物。通过将艾杜硫酸酯酶-10K PEG与Fc-BTP22(即，脑靶向融合蛋白的代表性实例)的摩尔比设定为1:10并将艾杜硫酸酯酶浓度设定为10mg/mL，反应在25℃下进行15小时。具体地，将Dulbecco磷酸盐缓冲液(DPBS)和作为还原剂的10mM NaBH3CN加入作为反应物。
反应完成后，将反应物利用磷酸钠缓冲液(pH 6.0)和NaCl浓度梯度施加于Source15Q柱(GE，美国)，然后利用硫酸铵浓度梯度和磷酸钠(pH 6.0)施加于Source 15ISO柱(GE，美国)，从而纯化艾杜硫酸酯酶-10K PEG-Fc-BTP22——即目标脑靶向长效缀合物。艾杜硫酸酯酶-10K PEG-Fc-BTP22可与艾杜硫酸酯酶-Fc-BTP22互换使用。
实施例14：包含GIP衍生物和PEG的缀合物的制备
制备由40个氨基酸残基组成的具有葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)受体刺激活性的人工GIP衍生物的脑靶向长效缀合物，作为含有一般尺寸的肽作为生理活性物质的脑靶向长效缀合物的实例。作为长效缀合物的前体，如下制备单聚乙二醇化缀合物，其中聚乙二醇作为连接体连接至人工GIP衍生物。
为了将10K MAL-PEG-ALD(10KDa聚乙二醇，其中一端的氢原子被修饰为3-[N-(3-N-马来酰亚胺基-1-氧代脯胺酰基)氨基)]丙基(3-[N-(3-N-maleimido-1-oxoprolyl)amino]propyl)并且相反端(opposite end)的氢原子被修饰为3-氧代丙基(丙醛基)，NOF，日本)聚乙二醇化至GIP衍生物的C端半胱氨酸，在GIP衍生物与PEG的摩尔比设定为1：1.3并且GIP衍生物浓度设定为3mg/mL的条件下，反应在4℃下进行约1小时。具体地，反应在溶剂(50mM Tris-HCl(pH7.5)+45％异丙醇)中进行。利用SP HP(GE，美国)柱——利用柠檬酸钠缓冲液(pH 3.0)+45％乙醇和KCl浓度梯度)，纯化GIP衍生物-10K PEG，即单聚乙二醇化缀合物。
实施例15：GIP衍生物-10K PEG-Fc-BTP22a缀合物的制备
然后，通过将GIP衍生物-10K PEG缀合物与含有脑靶向肽的Fc片段连接，制备脑靶向长效缀合物。通过将总反应浓度设定为4.55mg/mL，同时将GIP衍生物-10K PEG(在实施例14中纯化)与Fc-BTP22的摩尔比设定为1:2，反应在4℃下进行16小时。具体地，将20mMNaBH3CN作为还原剂添加到反应物中。
反应完成后，利用磷酸钠缓冲液(pH 7.5)和硫酸铵浓度梯度将反应物施加于Source15ISO柱(GE，美国USA)，然后再次施加于相同的柱，从而纯化GIP衍生物-10K PEG-Fc-BTP22——即目标脑靶向长效缀合物。GIP衍生物-10K PEG-Fc-BTP22可与GIP衍生物-FcBTP22互换使用。
实施例16：脑靶向长效缀合物的转胞吞作用分析
进行转录吞作用实验，以确认实施例中获得的脑靶向长效缀合物的血脑屏障穿过水平。将人脑内皮细胞的hCMEC/D3细胞以5×104个细胞/cm2的浓度在微孔膜上培养10天。为了确认BBB形成，用FITC-葡聚糖(70kDa)进行渗透测试，从而确认紧密连接的形成。然后，将25mM长效缀合物置于hCMEC/D3细胞上。2小时和4小时后，利用ELISA试剂盒测量蛋白质浓度。
结果是，GIP衍生物-10K PEG-Fc-BTP22显示血脑屏障穿过水平高于对照组，并且确认GIP衍生物-10K PEG-Fc-BTP22的穿过水平随时间增加(图4)。艾杜硫酸酯酶-10K PEG-Fc-BTP22观察到类似的穿过水平(数据未显示)。
这些结果表明，本发明中确认的脑靶向长效缀合物能够有效地穿过BBB。
实施例17：艾杜硫酸酯酶-10KDa PEG-Fc-BTP22缀合物的活性测量
为了考察根据艾杜硫酸酯酶-10K PEG-Fc-BTP22缀合物制备的艾杜硫酸酯酶的比活性的任何变化的存在，进行酶比活性体外实验。将4-甲基伞形酮基α-L-艾杜吡喃糖艾杜糖醛酸-2-硫酸钠盐(4MU-α-idopyraA-2)——已知其是艾杜硫酸酯酶的酶底物——与艾杜硫酸酯酶β和IDS-Fc-BTP22在37℃下反应4小时，然后与α-艾杜糖苷酸酶(其为二级反应酶)在37℃下反应24小时。通过测量相应物质的荧光来测量4-甲基伞形酮(4 MU)终产物的酶活性(图5)。
结果是，游离艾杜硫酸酯酶和艾杜硫酸酯酶-10K PEG-Fc-BTP22的酶活性分别显示为23.4±1.94nmol/min/μg和10.8±1.39nmol/min/μg。具体地，以比活性/重量(μg)转换率(specific activity per converted rate of weight(μg))来计算酶活性的值。即，在游离艾杜硫酸酯酶的情况下，该值通过将酶反应数除以重量而获得，而在艾杜硫酸酯酶-10K PEG-Fc-BTP22的情况下，该值通过将酶反应数除以缀合物内艾杜硫酸酯酶部分所具有的重量转换率而获得。总之，艾杜硫酸酯酶-10K PEG-Fc-BTP22的酶活性为46.6％，并且与艾杜硫酸酯酶相比部分略有降低。然而，确认即使当该酶被制备成本发明的脑靶向长效缀合物时，在相应的缀合物中也观察到显著的酶活性。
由于连接至Fc区的脑靶向肽，上述制备的长效缀合物能够穿过血脑屏障，维持所连接的生理活性物质的生理活性，因而能够提供持续时间和稳定性提高的长效缀合物，从而能够为开发能够穿过BBB的新型治疗剂提供平台。
根据前述内容，本发明所属领域技术人员将能够理解在不改变本发明的技术思路或重要特性的情况下本发明可以以其他具体形式实施。关于这点，本文公开的示例性实施方式只是出于示例目的并且不应该被解释为限制本发明的范围。相反，本发明意图不仅涵盖示例性实施方式，而且涵盖所附权利要求限定的本发明的精神和范围内可包括的各种替代形式、修改、等同形式和其他实施方式。
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ggtctgaaac tggccaccgc actgtcactg agcaataaat ttgttgaagg tagc 114
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Ser Val Ile Asp Ala Leu Gln Tyr Lys Leu Glu Gly Thr Thr Arg Leu
1 5 10 15
Thr Arg Lys Arg Gly Leu Lys Leu Ala Thr Ala Leu Ser Leu Ser Asn
20 25 30
Lys Phe Val Glu Gly Ser
35
<210> 9
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP5
<400> 9
ctgcgtaaac tgcgcaaacg tctgttactg cgtaaactgc gcaaacgtct gtta 54
<210> 10
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP5
<400> 10
Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg
1 5 10 15
Leu Leu
<210> 11
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4的铰链
<400> 11
atgccatcat gccca 15
<210> 12
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4的CH2
<400> 12
gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacacc 60
ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac 120
cctgaggtcc agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 180
ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 240
caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccatcc 300
tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 330
<210> 13
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4的CH3
<400> 13
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 60
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 120
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 180
gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg 240
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 300
ctctccctgt ctctgggtaa a 321
<210> 14
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4的铰链
<400> 14
Pro Ser Cys Pro
1
<210> 15
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4的CH2
<400> 15
Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
100 105 110
<210> 16
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4的CH3
<400> 16
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
100 105
<210> 17
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接体 15个氨基酸
<400> 17
ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatcg 45
<210> 18
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接体 15个氨基酸
<400> 18
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 19
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP6
<400> 19
taccaacaga tcctcaccag tatgccttcc agaaacgtga tccaaatatc caacgacctg 60
gagaacctcc gggatcttct tcacgtgctg 90
<210> 20
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP6
<400> 20
Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln Ile
1 5 10 15
Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu
20 25 30
<210> 21
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP7
<400> 21
tacaccattt ggatgcccga gaatccgaga cctgggacac cttgtgacat ttttaccaat 60
agtagaggga agagagcatc caatggg 87
<210> 22
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP7
<400> 22
Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Pro Gly Thr Pro Cys Asp
1 5 10 15
Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Asn Gly
20 25
<210> 23
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP8
<400> 23
aagtcagtca gaacttggaa tgagatcata ccttcaaaag ggtgtttaag agttgggggg 60
aggtgtcatc ctcatgtgaa cggg 84
<210> 24
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP8
<400> 24
Lys Ser Val Arg Thr Trp Asn Glu Ile Ile Pro Ser Lys Gly Cys Leu
1 5 10 15
Arg Val Gly Gly Arg Cys His Pro His Val Asn Gly
20 25
<210> 25
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP9
<400> 25
catctgaata ttctgagcac cctgtggaaa tatcgt 36
<210> 26
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP9
<400> 26
His Leu Asn Ile Leu Ser Thr Leu Trp Lys Tyr Arg
1 5 10
<210> 27
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP10
<400> 27
ctgcgcaagc tgcgtaagcg gctcctccgc gatgccgatg acctgttacg taaacttcgc 60
aaacgtctgc ttcgtgacgc agacgatctg 90
<210> 28
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP10
<400> 28
Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu Leu
1 5 10 15
Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Arg Asp Ala Asp Asp Leu
20 25 30
<210> 29
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP11
<400> 29
accgaggagc tgcgggtgcg cctcgcctcc cacctgcgca agctgcgtaa gcggctcctc 60
60
<210> 30
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP11
<400> 30
Thr Glu Glu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu Arg
1 5 10 15
Lys Arg Leu Leu
20
<210> 31
<211> 102
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP12
<400> 31
ctgcgggtgc gcctcgcctc ccacctgcgc aagctgcgta agcggctcct cttacgtgtt 60
cgtctggcaa gccatcttcg taaacttcgc aaacgtctgc tt 102
<210> 32
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP12
<400> 32
Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu
1 5 10 15
Leu Leu Arg Val Arg Leu Ala Ser His Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg
20 25 30
Leu Leu
<210> 33
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP13
<400> 33
ggtaaaggcc cgaaatggat gcgttga 27
<210> 34
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP13
<400> 34
Gly Lys Gly Pro Lys Trp Met Arg
1 5
<210> 35
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP14
<400> 35
ggtcataaag caaaaggccc gcgtaaatga 30
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP14
<400> 36
Gly His Lys Ala Lys Gly Pro Arg Lys
1 5
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP15
<400> 37
gttattgcaa aaattaagaa accgaaatga 30
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP15
<400> 38
Val Ile Ala Lys Ile Lys Lys Pro Lys
1 5
<210> 39
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP16
<400> 39
aagtggaaaa ccccgaaagt tcgtgtgtga 30
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP16
<400> 40
Lys Trp Lys Thr Pro Lys Val Arg Val
1 5
<210> 41
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 41
Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Ser Arg Gly Lys Arg Asn Asn Phe Lys Thr
1 5 10 15
Glu Glu Tyr
<210> 42
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 42
Ser Val Ile Asp Ala Leu Gln Tyr Lys Leu Glu Gly Thr Thr Arg Leu
1 5 10 15
Thr Arg Lys Arg Gly Leu Lys Leu Ala Thr Ala Leu Ser Leu Ser Asn
20 25 30
Lys Phe Val Glu Gly Ser
35
<210> 43
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 43
Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg Leu Leu Leu Arg Lys Leu Arg Lys Arg
1 5 10 15
Leu Leu
<210> 44
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)
<223> Xaa1是乙酰化的
<400> 44
Cys Met Pro Arg Leu Arg Gly Cys
1 5
<210> 45
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 45
Thr His Arg Pro Pro Met Trp Ser Pro Val Trp Pro
1 5 10
<210> 46
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 46
Pro Trp Val Pro Ser Trp Met Pro Pro Arg His Thr
1 5 10
<210> 47
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 47
Cys Cys Arg Thr Ile Gly Pro Ser Val Cys
1 5 10
<210> 48
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 48
Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln Ile
1 5 10 15
Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu
20 25 30
<210> 49
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 49
Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Pro Gly Thr Pro Cys Asp
1 5 10 15
Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Asn Gly
20 25
<210> 50
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 50
Gly Arg Glu Ile Arg Thr Gly Arg Ala Glu Arg Trp Ser Glu Lys Phe
1 5 10 15
<210> 51
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 51
Cys Asn Cys Lys Ala Pro Glu Thr Ala Leu Cys Ala Arg Arg Cys Gln
1 5 10 15
Gln His
<210> 52
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<220>
<221> MISC_特征
<222> (1)
<223> Xaa是二氨基丙酸
<400> 52
Xaa Lys Ala Pro Glu Thr Ala Leu Asp
1 5
<210> 53
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 53
His Leu Asn Ile Leu Ser Thr Leu Trp Lys Tyr Arg Cys
1 5 10
<210> 54
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<220>
<221> MISC_特征
<222> (7)
<223> O-β-Glc附接至其
<400> 54
Gly Phe Thr Gly Phe Leu Ser
1 5
<210> 55
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 55
Thr Gly Asn Tyr Lys Ala Leu His Pro His Asn Gly
1 5 10
<210> 56
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 56
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
<210> 57
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 57
Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe Ser Thr Ser Thr
1 5 10 15
Gly Arg
<210> 58
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 58
Phe Pro Phe Pro Phe Pro Phe Pro
1 5
<210> 59
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽连接体基序
<400> 59
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 60
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽连接体基序
<400> 60
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 61
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽连接体基序
<400> 61
Gly Gly Ser Gly
1
<210> 62
<211> 124
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc-BTP22-F
<400> 62
tctccctgtc tctgggtaaa ggtggaggcg gttcacttcg caagttacgt aaacgcttac 60
tgttacgtaa acttcggaag cgcttactgg gcggaggtgg ctctctgcgt aaactgcgca 120
aacg 124
<210> 63
<211> 124
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc-BTP22-R
<400> 63
cgtttgcgca gtttacgcag agagccacct ccgcccagta agcgcttccg aagtttacgt 60
aacagtaagc gtttacgtaa cttgcgaagt gaaccgcctc cacctttacc cagagacagg 120
gaga 124
<210> 64
<211> 112
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc-BTP23-F
<400> 64
aactgcgcaa acgtctgtta ggcggtggcg gatcgctgcg taaactgcgc aaacgtctgt 60
tacttcggaa gctgagaaaa cgcttacttt aaggatccga attcgagctc cg 112
<210> 65
<211> 112
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc-BTP23-R
<400> 65
cggagctcga attcggatcc ttaaagtaag cgttttctca gcttccgaag taacagacgt 60
ttgcgcagtt tacgcagcga tccgccaccg cctaacagac gtttgcgcag tt 112
<210> 66
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc-BTP24-F
<400> 66
tctccctgtc tctgggtaaa ggtggaggcg gttcaacaga agagttacgt gttcgtctgg 60
caagccattt acgtaaactt cgcaaacgtc tgttaggcgg aggtggctct accgaggagc 120
tgcgggtgcg 130
<210> 67
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc-BTP24-R
<400> 67
cgcacccgca gctcctcggt agagccacct ccgcctaaca gacgtttgcg aagtttacgt 60
aaatggcttg ccagacgaac acgtaactct tctgttgaac cgcctccacc tttacccaga 120
gacagggaga 130
<210> 68
<211> 118
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc-BTP25-F
<400> 68
agctgcgtaa gcggctcctc ggcggtggcg gatcgacgga agaacttcgc gtccggttag 60
cgtcacatct tcggaaatta cggaagcgct tgctgtgagg atccgaattc gagctccg 118
<210> 69
<211> 118
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc-BTP25-R
<400> 69
cggagctcga attcggatcc tcacagcaag cgcttccgta atttccgaag atgtgacgct 60
aaccggacgc gaagttcttc cgtcgatccg ccaccgccga ggagccgctt acgcagct 118
<210> 70
<211> 97
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc-BTP26-F
<400> 70
tctccctgtc tctgggtaaa ggtggaggcg gttcaaaatg gaagacacca aaggtgcgcg 60
ttggcggagg tggctctaag tggaaaaccc cgaaagt 97
<210> 71
<211> 97
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc-BTP26-R
<400> 71
actttcgggg ttttccactt agagccacct ccgccaacgc gcacctttgg tgtcttccat 60
tttgaaccgc ctccaccttt acccagagac agggaga 97
<210> 72
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc-BTP27-F
<400> 72
aaaccccgaa agttcgtgtg ggcggtggcg gatcgaaatg gaaaactcct aaagtacggg 60
tctgaggatc cgaattcgag ctccg 85
<210> 73
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc-BTP27-R
<400> 73
cggagctcga attcggatcc tcagacccgt actttaggag ttttccattt cgatccgcca 60
ccgcccacac gaactttcgg ggttt 85
<210> 74
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接体
<400> 74
ggtggaggcg gttca 15
<210> 75
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP5
<400> 75
cttcgcaagt tacgtaaacg cttactgtta cgtaaacttc ggaagcgctt actg 54
<210> 76
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接体
<400> 76
ggcggaggtg gctct 15
<210> 77
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接体
<400> 77
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 78
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 连接体
<400> 78
ggcggtggcg gatcg 15
<210> 79
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP5
<400> 79
ctgcgtaaac tgcgcaaacg tctgttactt cggaagctga gaaaacgctt actttaa 57
<210> 80
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP11
<400> 80
acagaagagt tacgtgttcg tctggcaagc catttacgta aacttcgcaa acgtctgtta 60
60
<210> 81
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP16
<400> 81
aagtggaaaa ccccgaaagt tcgtgtg 27

Claims (43)

1.式1的脑靶向长效缀合物：
[式1]
X-L1-F-L2-Y
其中：
X是生理活性物质；
Y是脑靶向肽；
L1和L2是肽连接体或非肽连接体，其中当L1和L2是肽连接体时，所述肽连接体包含0至1,000个氨基酸；并且
F是包含FcRn结合区的免疫球蛋白恒定区。
2.权利要求1所述的脑靶向长效缀合物，其中所述长效缀合物穿过所述血脑屏障，从而递送生理活性物质至脑组织中。
3.权利要求1所述的脑靶向长效缀合物，其中所述脑靶向肽包含肽、蛋白质或抗体，并且其中所述肽、蛋白质或抗体中的每一种都包含允许穿过所述血脑屏障的氨基酸序列。
4.权利要求3所述的脑靶向长效缀合物，其中所述脑靶向肽通过被动转运途径或受体介导转运途径穿过所述血脑屏障。
5.权利要求1所述的脑靶向长效缀合物，其中所述生理活性物质选自毒素；或胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂；胰高血糖素受体激动剂；胃抑多肽(GIP)受体激动剂；成纤维细胞生长因子(FGF)受体激动剂；缩胆囊素受体激动剂；胃泌素受体激动剂；黑皮质素受体激动剂；人生长激素；生长激素释放激素；生长激素释放肽；干扰素；干扰素受体；集落刺激因子；白介素；白介素受体；酶；白介素结合蛋白；细胞因子结合蛋白；巨噬细胞激活因子；巨噬细胞肽；B细胞因子；T细胞因子；蛋白质A；变态反应抑制因子；坏死糖蛋白；免疫毒素；淋巴毒素；肿瘤坏死因子；肿瘤抑制物；转化生长因子；α-1抗胰蛋白酶；白蛋白；α-乳白蛋白；载脂蛋白-E；促红细胞生成素；高度糖基化的促红细胞生成素；血管生成素；血红蛋白；凝血酶；凝血酶受体激活肽；血栓调节素；凝血因子VII；凝血因子VIIa；凝血因子VIII；凝血因子IX；凝血因子XIII；纤溶酶原激活物；纤维蛋白结合肽；尿激酶；链激酶；水蛭素；蛋白质C；C反应蛋白；肾素抑制物；胶原酶抑制物；超氧化物歧化酶；瘦蛋白；血小板衍生生长因子；上皮生长因子；表皮生长因子；制管张素；血管紧张素；骨形态发生生长因子；骨形态发生蛋白；降钙素；胰岛素；房肽素；软骨诱导因子；依降钙素；结缔组织激活因子；组织因子途径抑制物；促卵泡激素；黄体生成激素；黄体生成激素释放激素；神经生长因子；轴突发生因子-1；脑促尿钠排泄肽；胶质衍生神经营养因子；导蛋白；嗜中性白细胞抑制因子；神经营养因子；神经秩蛋白；甲状旁腺激素；松弛素；分泌素；生长调节素；胰岛素样生长因子；肾上腺皮质激素；胰高血糖素；缩胆囊素；胰多肽；胃泌素释放肽；促皮质素释放因子；促甲状腺激素；自家趋化素；乳铁蛋白；肌肉生长抑制素；活动依赖性神经保护蛋白(ADNP)、β-分泌酶1(BACE1)、淀粉样前体蛋白(APP)、神经细胞黏着分子(NCAM)、淀粉样蛋白β、tau、晚期糖基化终产物受体(RAGE)、α-突触核蛋白或其激动剂或拮抗剂；受体、受体激动剂；细胞表面抗原；单克隆抗体；多克隆抗体；抗体片段；病毒衍生的疫苗抗原；激活至少一种受体激动剂的杂合多肽或嵌合多肽；及其类似物。
6.权利要求5所述的脑靶向长效缀合物，其中：
所述毒素选自美登素或其衍生物、澳瑞他汀或其衍生物、倍癌霉素或其衍生物、和吡咯并苯并二氮杂(PBD)或其衍生物；
所述胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂选自天然毒蜥外泌肽-3或天然毒蜥外泌肽-4及其类似物；
所述FGF受体激动剂选自FGF1或其类似物、FGF19或其类似物、FGF21或其类似物和FGF23或其类似物；
所述干扰素选自干扰素-α、干扰素-β和干扰素-γ；
所述干扰素受体选自干扰素-α受体、干扰素-β受体、干扰素-γ受体和可溶性I型干扰素受体；
所述白介素选自白介素-1、白介素-2、白介素-3、白介素-4、白介素-5、白介素-6、白介素-7、白介素-8、白介素-9、白介素-10、白介素-11、白介素-12、白介素-13、白介素-14、白介素-15、白介素-16、白介素-17、白介素-18、白介素-19、白介素-20、白介素-21、白介素-22、白介素-23、白介素-24、白介素-25、白介素-26、白介素-27、白介素-28、白介素-29和白介素-30；
所述白介素受体是白介素-1受体或白介素-4受体；
所述酶选自β-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸酯酶、酸性α-葡糖苷酶、酸性神经酰胺酶、酸性鞘磷脂酶、半乳糖脑苷脂酶、芳基硫酸酯酶A、芳基硫酸酯酶B、β-氨基己糖酶A、β-氨基己糖酶B、肝素N-硫酸酯酶、α-D-甘露糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、N-乙酰半乳糖胺-6硫酸酯酶、溶酶体酸性脂肪酶、α-N-乙酰氨基葡糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、丁酰胆碱酯酶、几丁质酶、谷氨酸脱羧酶、伊米苷酶、脂肪酶、尿酸酶、血小板激活因子乙酰水解酶、中性肽链内切酶、髓过氧化物酶、α-半乳糖苷酶-A、阿加糖酶α、阿加糖酶β、α-L-艾杜糖苷酸酶、丁酰胆碱酯酶、几丁质酶、谷氨酸脱羧酶和伊米苷酶；
所述白介素结合蛋白是IL-18bp；
所述细胞因子结合蛋白是TNF结合蛋白；
所述神经生长因子选自神经生长因子、睫状节神经细胞营养因子、轴突发生因子-1、脑促尿钠排泄肽、胶质衍生神经营养因子、导蛋白、嗜中性白细胞抑制因子、神经营养因子和神经秩蛋白；
所述肌肉生长抑制素受体选自TNFR(P75)、TNFR(P55)、IL-1受体、VEGF受体和B细胞激活因子受体；
所述肌肉生长抑制素受体拮抗剂是IL1-Ra；
所述细胞表面抗原选自CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD11a、CD11b、CD18、CD19、CD20、CD23、CD25、CD33、CD38、CD40、CD45和CD69；并且
所述抗体片段选自scFv、Fab、Fab′、F(ab′)2和Fd。
7.权利要求6所述的脑靶向长效缀合物，其中所述GLP-1受体激动剂选自天然毒蜥外泌肽-4；毒蜥外泌肽-4衍生物，其中毒蜥外泌肽-4的N端胺基缺失；毒蜥外泌肽-4衍生物，其中毒蜥外泌肽-4的N端胺基用羟基取代；毒蜥外泌肽-4衍生物，其中毒蜥外泌肽-4的N端胺基用二甲基修饰；毒蜥外泌肽-4衍生物，其中毒蜥外泌肽-4的N端胺基用羧基取代；毒蜥外泌肽-4衍生物，其中毒蜥外泌肽-4的第1位氨基酸组氨酸的α碳缺失；毒蜥外泌肽-4衍生物，其中毒蜥外泌肽-4的第12位氨基酸赖氨酸用丝氨酸取代；以及毒蜥外泌肽-4衍生物，其中毒蜥外泌肽-4的第12位氨基酸赖氨酸用精氨酸取代。
8.权利要求4所述的脑靶向长效缀合物，其中，在所述受体介导转运途径中，所述脑靶向长效缀合物经由受体介导转运途径、通过选自以下中的任一种而穿过所述血脑屏障：胰岛素受体、转铁蛋白受体、低密度脂蛋白受体、低密度脂蛋白受体相关蛋白质、瘦蛋白受体、烟碱性乙酰胆碱受体、谷胱甘肽转运体、钙激活钾通道、和晚期糖基化终产物受体(RAGE)、以及所述受体的配体和结合所述受体或配体的抗体。
9.权利要求1所述的脑靶向长效缀合物，其中L1连接至F的N端区，并且L2连接至F的C端区。
10.权利要求1所述的脑靶向长效缀合物，其中式1的F-L2-Y由下式2表示：
[式2]
其中：
Fa和Fb各自是单链多肽链，所述单链多肽链包括含有铰链区、CH2结构域和CH3结构域的免疫球蛋白Fc区，其中Fa和Fb通过所述铰链区中的二硫键连接并从而包含Fc片段，并且Fa和L1彼此共价键合；
BTPa1、……、BTPan中的每一个彼此相同或不同，是脑靶向肽；
BTPb1、……、BTPbn′中的每一个彼此相同或不同，是脑靶向肽；
L2a1、……、L2an中的每一个彼此相同或不同，是肽连接体；并且
L2b1、……、L2bn′中的每一个彼此相同或不同，是肽连接体；
其中n和n′各自独立地是整数。
11.权利要求10所述的脑靶向长效缀合物，其中L1连接至Fa的N端，并且L2a1和L2b1各自分别连接至Fa和Fb的C端。
12.权利要求11所述的脑靶向长效缀合物，其中n＝n′，并且各自满足L2a1＝L2b1、……、L2an＝L2bn′和BTPa1＝BTPb1、……、BTPan＝BTPbn′的条件。
13.权利要求10所述的脑靶向长效缀合物，其中L1连接至X的N端胺基，所述胺基位于赖氨酸残基的侧链，或连接至位于半胱氨酸残基的侧链的-SH基团(巯基)。
14.权利要求10所述的脑靶向长效缀合物，其中作为生理活性物质的X是由2至1,000个氨基酸组成的多肽。
15.权利要求10所述的脑靶向长效缀合物，其中n和n′是1至5的整数。
16.权利要求10所述的脑靶向长效缀合物，其中L1是大小为0.5kDa至100kDa的非肽连接体。
17.权利要求16所述的脑靶向长效缀合物，其中所述非肽连接体是聚乙二醇。
18.权利要求1所述的脑靶向长效缀合物，其中作为肽连接体的L2是(GS)m、(GGS)m、(GGGS)m或(GGGGS)m，其中m是1至10。
19.权利要求1所述的脑靶向长效缀合物，其中L1和L2中的一个是肽连接体，并且另一个是非肽连接体。
20.权利要求1所述的脑靶向长效缀合物，其中当L1是非肽连接体并且L2是肽连接体时，所述肽连接体包含0至1,000个氨基酸。
21.权利要求1或10所述的脑靶向长效缀合物，其中当L1和L2中的任一者或两者是非肽连接体时，所述非肽连接体选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、可生物降解聚合物、脂质聚合物、几丁质、透明质酸、脂肪酸、高分子量聚合物、低分子量化合物、核苷酸及其组合。
22.权利要求1所述的脑靶向长效缀合物，其中当L1和L2中的任一者或两者是肽连接体时，X和F、或者F和Y通过L1和L2经由共价化学键、非共价化学键或其组合彼此连接；并且L1和L2各自包含0至1,000个氨基酸。
23.权利要求1所述的脑靶向长效缀合物，其中当L1和L2中的任一者或两者是肽连接体时，L1和L2各自包含0至1,000个氨基酸，其中：
(i)X和F、或者F和Y通过肽键连接；或者
(ii)X和F、以及F和Y通过肽键连接。
24.权利要求1所述的脑靶向长效缀合物，其中当L1和L2中的任一个是肽连接体并且两者中的另一个是非肽连接体时，所述肽连接体是包含0至1,000个氨基酸的连接体，并且所述非肽连接体聚乙二醇。
25.权利要求1所述的脑靶向长效缀合物，其中F包含免疫球蛋白Fc区。
26.权利要求25所述的脑靶向长效缀合物，其中所述免疫球蛋白Fc区包含选自CH1、CH2、CH3和CH4结构域中的一个或四个结构域。
27.权利要求25所述的脑靶向长效缀合物，其中所述免疫球蛋白Fc区进一步包含铰链区。
28.权利要求10或25所述的脑靶向长效缀合物，其中所述免疫球蛋白Fc区是IgG的Fc区。
29.权利要求28所述的脑靶向长效缀合物，其中所述免疫球蛋白Fc区是IgG4 Fc区。
30.权利要求29所述的脑靶向长效缀合物，其中所述免疫球蛋白Fc区是人类序列的非糖基化IgG4 Fc区。
31.权利要求1所述的脑靶向长效缀合物，其中X的N端和F的N端通过L1连接，并且Y的N端和F的C端通过L2连接。
32.权利要求1所述的脑靶向长效缀合物，其中：
L1的末端连接至X的赖氨酸残基或半胱氨酸残基，并且L1的另一末端连接至F的N端；并且
Y的N端和F的C端通过L2连接。
33.用于制备权利要求1所述的脑靶向长效缀合物的方法，其包括：
(i)制备：
(a)X-L1-F，其中X、L1和F连接，X是生理活性物质，L1是肽或非肽连接体，F包含免疫球蛋白Fc区；和
(b)L2-Y，其中Y与L2连接，Y是脑靶向肽，L2是肽或非肽连接体；和
(ii)连接(a)X-L1-F与(b)L2-Y。
34.用于制备权利要求1所述的脑靶向长效缀合物的方法，其包括：
(i)制备：
(a)X-L1，其中X与L1连接，X是生理活性物质，L1是肽或非肽连接体；和
(b)F-L2-Y，其中Y、L2和F连接，Y是脑靶向肽，L2是肽或非肽连接体，F包含免疫球蛋白Fc区；和
(ii)连接(a)X-L1与(b)F-L2-Y。
35.用于制备权利要求1所述的脑靶向长效缀合物的方法，其包括：
(i)制备F-L2-Y，其中Y、L2和F连接，Y是脑靶向肽，L2是肽或非肽连接体，F包含免疫球蛋白Fc区；和
(ii)通过L1连接F-L2-Y与X，L1是肽或非肽连接体。
36.权利要求33至35中任一项所述的方法，其中(a)的L1是肽连接体，并且(b)的L2是非肽连接体。
37.权利要求33至35中任一项所述的方法，其中(a)的L1是非肽连接体，并且(b)的L2是肽连接体。
38.权利要求1所述的脑靶向长效缀合物，其中L1是两端均具有官能团的非肽连接体，其中两端的所述官能团各自是胺反应基团或巯基反应基团，并且两端的所述官能团彼此种类相同或彼此种类不同。
39.权利要求33至35中任一项所述的方法，其中非肽连接体与X和Y通过其各自的官能团连接，其中所述非肽连接体的官能团选自醛基、马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺衍生物。
40.脑靶向肽，其由选自SEQ ID NO：2、4、6、8、10、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40的氨基酸序列的任一种氨基酸序列组成。
41.分离的多核苷酸，其编码权利要求40所述的脑靶向肽。
42.重组表达载体，其包含权利要求41所述的多核苷酸。
43.转化体，其包含权利要求42所述的重组表达载体。
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