CN105593243A - 维持FcRn结合强度的免疫球蛋白Fc缀合物 - Google Patents

维持FcRn结合强度的免疫球蛋白Fc缀合物 Download PDF

Info

Publication number
CN105593243A
CN105593243A CN201480049342.0A CN201480049342A CN105593243A CN 105593243 A CN105593243 A CN 105593243A CN 201480049342 A CN201480049342 A CN 201480049342A CN 105593243 A CN105593243 A CN 105593243A
Authority
CN
China
Prior art keywords
immunoglobulin
conjugate
segments
fcrn
active polypeptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201480049342.0A
Other languages
English (en)
Inventor
黄祥渊
李钟守
洪性熙
崔仁荣
郑圣烨
权世昌
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hanmi Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Hanmi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hanmi Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Hanmi Pharmaceutical Co Ltd
Priority to CN202310310247.2A priority Critical patent/CN116082528A/zh
Publication of CN105593243A publication Critical patent/CN105593243A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Abstract

本发明涉及生理活性多肽-免疫球蛋白Fc片段缀合物，其包含通过非肽基连接体与具有FcRn-结合区域的免疫球蛋白Fc片段连接的生理活性多肽并且维持免疫球蛋白Fc片段的内在结合亲和力；制备该缀合物的方法；维持该缀合物对FcRn内在结合亲和力的方法；以及包含该缀合物的组合物，其维持免疫球蛋白Fc片段对FcRn的内在结合亲和力。

Description

维持FcRn结合强度的免疫球蛋白Fc缀合物
技术领域
本发明涉及生理活性多肽-免疫球蛋白Fc片段缀合物，所述缀合物包括通过非肽基连接体与具有FcRn-结合区域的免疫球蛋白Fc片段连接的生理活性多肽，并且能够维持免疫球蛋白Fc片段内在结合亲和力；制备该缀合物的方法、维持该缀合物对FcRn的内在结合亲和力的方法；以及包括该缀合物的组合物，所述组合物能够维持免疫球蛋白Fc片段对FcRn的内在结合亲和力。
背景技术
已经对包含与蛋白质连接以增加蛋白质血清半衰期的载体——如聚乙二醇聚合物、白蛋白、脂肪酸或抗体Fc(恒定区)——的蛋白质缀合物或复合物进行了各种研究。迄今为止已知有关此类蛋白质缀合物或复合物的研究主要目的是增加药物的血清半衰期以缩短给药间隔，从而提高患者方便性。然而，许多常规技术存在问题，如由于例如由治疗性蛋白和载体蛋白之间的非特异性结合引起的空间位阻而使治疗性蛋白的活性降低。此外，在可逆结合至血清白蛋白以增加其血清半衰期的脂肪酸缀合物的情况下，因为由于蛋白质和脂肪酸之间的可逆结合而无法避免肾脏清除——导致蛋白质药物的最大损失，显著提高蛋白质药物的血清半衰期是有限的。
而且，已经做出努力以利用免疫球蛋白片段增加包括蛋白质的生物活性物质的半衰期。免疫球蛋白Fc的CH2-CH3区域包括延长抗体半衰期的FcRn(保护性受体)-结合位点。FcRn是在血管内皮细胞中表达的MHCI类相关蛋白质，并且与IgG和白蛋白结合。典型地，IgG和FcRn在弱酸性pH下彼此紧密结合并且在中性pH下彼此解离。因此，当IgG通过胞饮作用或内吞作用从血管进入血管内皮细胞并进入溶酶体(pH6.0)时，其受到FcRn保护而不被降解。当IgG通过再循环与细胞膜融合时，其在pH7.4下与FcRn解离并且被释放到血管中。因为该过程，包括FcRn-结合位点的IgG1、IgG2和IgG4的体内半衰期平均为3周，比其它蛋白质的体内半衰期长。
因此，当免疫球蛋白Fc片段与生物活性物质连接时，可以通过FcRn-介导的再循环增加生物活性物质的半衰期。对此，有必要开发出能够在生物活性物质和免疫球蛋白Fc片段连接在一起时维持免疫球蛋白Fc片段对FcRn结合亲和力而不降低生物活性物质活性的方法。
发明内容
技术问题
本发明人已作出大量努力来开发这样的缀合物，其能够维持免疫球蛋白Fc片段自身对FcRn的内在结合亲和力而不降低生理活性多肽的活性，并且能够在中性pH下容易与FcRn解离。结果，本发明人发现，包括通过非肽基连接体与具有FcRn-结合区域的免疫球蛋白Fc片段连接的生理活性多肽的缀合物能够维持免疫球蛋白Fc片段对FcRn的内在结合亲和力，同时，能够在7.4的中性pH下容易与FcRn解离，从而完成本发明。
技术方案
本发明的一个目的是提供包含通过非肽基连接体与包括FcRn-结合区域的免疫球蛋白Fc片段连接的生理活性多肽的生理活性多肽-免疫球蛋白Fc片段缀合物，其中在pH6.0下与FcRn结合的缀合物的量和在pH7.4下与FcRn结合的缀合物的量的结合比率在通过在用于该缀合物的相同条件下测量免疫球蛋白Fc片段与FcRn结合的量而测定的比率的±6％范围内。
本发明的另一个目的是提供包含通过非肽基连接体与包括FcRn-结合区域的免疫球蛋白Fc片段连接的生理活性多肽的生理活性多肽-免疫球蛋白Fc片段缀合物，其中通过将在pH6.0下与FcRn结合的缀合物的量和在pH7.4下与FcRn结合的缀合物的量代入下列等式1而测定的结合比率在通过在用于该缀合物的相同条件下测量与FcRn结合的免疫球蛋白Fc片段的量而测定的结合比率的±6％范围内：
等式1
结合比率(％)＝(在pH7.4下结合的量/在pH6.0下结合的量)×100。
本发明的又一个目的是提供用于制备维持免疫球蛋白Fc片段对FcRn的内在结合亲和力的生理活性多肽-免疫球蛋白Fc片段缀合物的方法，所述方法包括：(a)通过非肽基连接体将生理活性多肽与具有FcRn-结合区域的免疫球蛋白Fc片段连接，以制备生理活性多肽-免疫球蛋白Fc片段缀合物的混合物；和(b)从该混合物中分离出生理活性多肽-免疫球蛋白Fc片段缀合物，所述缀合物，如通过将在pH6.0下与FcRn结合的量和在pH7.4下与FcRn结合的量代入等式1所测定的，显示出在免疫球蛋白Fc片段结合比率的±6％范围内的结合比率。
本发明的又一个目的是提供维持生理活性多肽-免疫球蛋白Fc片段缀合物对FcRn内在结合亲和力的方法，所述方法包括通过非肽基连接体将生理活性多肽与包含FcRn-结合区域的免疫球蛋白Fc片段连接。
本发明的又一个目的是提供包含生理活性多肽-免疫球蛋白Fc片段缀合物的组合物，其维持免疫球蛋白Fc片段对FcRn的内在结合亲和力。
有利效果
如上所述，本发明的缀合物维持免疫球蛋白Fc片段对FcRn的内在结合亲和力，同时，在中性pH(如pH7.4)下容易与FcRn解离。因此，其能够有利地用于增加生理活性多肽的血清半衰期。
附图描述
图1是显示再循环与FcRn结合的蛋白质的过程的示意图。
图2显示在酸性pH下免疫球蛋白-蛋白质缀合物与FcRn结合的传感图(sensograms)。
图3显示在中性pH下免疫球蛋白-蛋白质缀合物与FcRn结合的传感图。
图4显示对GLP-1R激动剂-免疫球蛋白片段缀合物的体内药物代谢动力学进行比较的测试结果。
具体实施方式
为实现上述目的，一方面，本发明提供了包括通过非肽基连接体与包含FcRn-结合区域的免疫球蛋白Fc片段连接的生理活性多肽的生理活性多肽-免疫球蛋白Fc片段缀合物，其中在pH6.0下与FcRn结合的缀合物的量和在pH7.4下与FcRn结合的缀合物的量的结合比率在通过在用于该缀合物的相同条件下测量免疫球蛋白Fc片段与FcRn结合的量而测定的比率的±6％范围内。
在一个实施方式中，根据本发明的缀合物，如使用下列等式所测定的，显示出在免疫球蛋白Fc片段结合比率的±6％范围内的结合比率：
等式1
结合比率(％)＝(在pH7.4下结合的量/在pH6.0下结合的量)×100。
在另一个实施方式中，可以在pH4.0-9.0下通过使具有与其连接的非肽基连接体的生理活性多肽与免疫球蛋白Fc片段反应，从而通过非肽基连接体将生理活性多肽与免疫球蛋白Fc片段的除FcRn-结合区域外的部分连接而得到根据本发明的缀合物。
在又一个实施方式中，包含在根据本发明的缀合物中的非肽基连接体可选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、可生物降解聚合物、脂质聚合物、几丁质、透明质酸及其组合。
在又一个实施方式中，包含在根据本发明的缀合物中的非肽基连接体可以是由下列式1表示的聚乙二醇聚合物：
式1
其中n的范围从10至2400。
在又一个实施方式中，包含在根据本发明的缀合物中的非肽基连接体可具有选自醛基、丙醛基、丁醛基、马来酰亚胺基以及琥珀酰亚胺衍生物的反应性基团。
在又一个实施方式中，包含在根据本发明的缀合物中的生理活性多肽可选自胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、人生长激素(hGH)、红细胞生成素(EPO)、胰高血糖素、泌酸调节肽、胰岛素、生长激素释放激素、生长激素释放肽、干扰素、干扰素受体、G蛋白偶联受体、白细胞介素、白细胞介素受体、酶、白细胞介素结合蛋白、细胞因子结合蛋白、巨噬细胞活化因子、巨噬细胞肽、B细胞因子、T细胞因子、蛋白A、变态反应抑制剂、细胞坏死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、肿瘤坏死因子、肿瘤阻抑剂、转移生长因子、α-1抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳清蛋白、脱脂载脂蛋白-E、高度糖基化红细胞生成素、血管生成素、血红蛋白、凝血酶、凝血酶受体活化肽、凝血调节蛋白、血液因子VII、VIIa、VIII、IX和XIII、纤溶酶原活化因子、纤维蛋白结合肽、尿激酶、链激酶、蛭素、蛋白质C、C-反应蛋白、肾素抑制剂、胶原酶抑制剂、超氧化物歧化酶、瘦蛋白、血小板衍生生长因子、上皮生长因子、表皮生长因子、制管张素、血管紧张素、骨生长因子、骨刺激蛋白、降钙素、心钠素、软骨诱导因子、依降钙素、结缔组织活化因子、组织因子通道抑制剂、促滤泡激素、黄体生成素、黄体生成素释放激素、神经生长因子、甲状旁腺激素、松弛素、促胰液素、生长调节素、胰岛素样生长因子、肾上腺皮质激素、缩胆囊素、胰多肽、胃泌素释放肽、促肾上腺皮质激素释放因子、促甲状腺激素、自毒素(autotaxin)、乳铁蛋白、肌生成抑制蛋白(myostatin)、细胞表面抗原、病毒衍生的疫苗抗原、单克隆抗体、多克隆抗体以及抗体片段。
在又一个实施方式中，包含在根据本发明的缀合物中的包含FcRn-结合区域的免疫球蛋白Fc片段可包括CH2结构域、CH3结构域、或二者。
在又一个实施方式中，包含在根据本发明的缀合物中的免疫球蛋白Fc片段可以是以非糖基化的形式。
在又一个实施方式中，包含在根据本发明的缀合物中的免疫球蛋白Fc片段可包括铰链区。
在又一个实施方式中，包含在根据本发明的缀合物中的免疫球蛋白Fc片段可选自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM、其组合及其杂合(hybrids)。
在又一个实施方式中，包含在根据本发明的缀合物中的免疫球蛋白Fc片段可以是IgG4Fc片段。
另一方面，本发明提供了制备维持免疫球蛋白Fc片段对FcRn的内在结合亲和力的生理活性多肽-免疫球蛋白Fc片段缀合物的方法，该方法包括：(a)通过非肽基连接体将生理活性多肽与包含FcRn-结合区域的免疫球蛋白Fc片段连接而制备生理活性多肽-免疫球蛋白Fc片段缀合物的混合物；和(b)从该混合物中分离出生理活性多肽-免疫球蛋白Fc片段缀合物，所述缀合物，如通过将在pH6.0下与FcRn结合的量和在pH7.4下与FcRn结合的量代入等式1所测定的，显示出在免疫球蛋白Fc片段结合比率的±6％范围内的结合比率。
在一个实施方式中，用于根据本发明的制备方法的非肽基连接体可以是由下式1表示的聚乙二醇聚合物：
式1
其中n的范围从10至2400。
在又一个实施方式中，在根据本发明的制备方法的步骤(b)中分离的缀合物可具有非肽基连接体与免疫球蛋白Fc片段N-末端结合的结构。
又一方面，本发明提供了维持生理活性多肽-免疫球蛋白Fc片段缀合物对FcRn的内在结合亲和力的方法，该方法包括通过非肽基连接体将生理活性多肽与包含FcRn-结合区域的免疫球蛋白Fc片段连接。
在一个实施方式中，可以在体内实施对内在结合亲和力的维持。
又一方面，本发明提供了包括生理活性多肽-免疫球蛋白Fc片段缀合物的组合物，其维持免疫球蛋白Fc片段对FcRn的内在结合亲和力。
发明方式
一方面，本发明提供了包括通过非肽基连接体与包含FcRn-结合区域的免疫球蛋白Fc片段连接的生理活性多肽的生理活性多肽-免疫球蛋白Fc片段缀合物，其中在pH6.0下与FcRn结合的缀合物的量和在pH7.4下与FcRn结合的缀合物的量的比率在通过在用于该缀合物的相同条件下测量与FcRn结合的免疫球蛋白Fc片段的量而测定的比率的±6％范围内。
如本文使用的，表述“生理活性多肽-免疫球蛋白Fc片段缀合物的结合量”是指在所关注的pH下与FcRn结合的缀合物蛋白质的浓度相对于与FcRn结合或未结合的缀合物蛋白质的总浓度的比率。在本发明中，由于该结合量用于计算在两个pH下结合的量之间的比率，因此结合量之间的比率可由在一个pH下测得的绝对结合量计算出，并且还可通过测量与所结合的缀合物的量成比例且容易测量的其它物理量来测定。例如，可以通过测量表面等离子共振(SPR)信号并计算pH6.0和pH7.4下信号之间的比率来测定结合量之间的比率。此外，其它方法也可用于测定结合量之间的比率。
具体地，本发明提供了包括通过非肽基连接体与包含FcRn-结合区域的免疫球蛋白Fc片段连接的生理活性多肽的生理活性多肽-免疫球蛋白Fc片段缀合物，其中通过将在pH6.0下与FcRn结合的缀合物的量和在pH7.4下与FcRn结合的缀合物的量代入下列等式1而测定的结合比率小于通过在用于该缀合物的相同条件下测量与FcRn结合的免疫球蛋白Fc片段的量而测定的结合比率的±6％范围：
等式1
结合比率(％)＝(在pH7.4下结合的量/在pH6.0下结合的量)×100。
结合比率可以通过将在pH7.4下与FcRn结合的缀合物(或免疫球蛋白Fc片段)的量除以在pH6.0下与FcRn结合的缀合物(或免疫球蛋白Fc片段)的量并将该相除值乘以100而作为百分比(％)值得到。
可以利用由WeirongWang等人(DRUGMETABOLISMANDDISPOSITION39：1469-1477，2011)提出的用于预测单克隆抗体半衰期的方法计算结合比率，但并不具体限于此。在上述文献描述的方法中，具有高结合比率的单克隆抗体显示出短的体内半衰期。
可具体利用表面等离子共振法进行测量结合比率的方法，但并不具体限于此。
例如，可通过下述步骤进行测量结合比率的方法：使用胺偶联试剂盒等将FcRn固定在生物传感器芯片(例如，BiacoreCM5生物传感器芯片)上，向FcRn固定化生物传感器芯片注射含有待测量与FcRn结合程度的物质(如，缀合物或免疫球蛋白Fc片段)的酸性缓冲液(如，pH6.0缓冲液)，然后将中性缓冲液(例如，pH7.4缓冲液)注入到生物传感器芯片中。这种情况下，可以通过在将pH6.0缓冲液中的样品注入芯片完成之前测量平衡状态下的共振单位(RU)以确定pH6.0下结合的量，在注射pH7.4缓冲液之后测量共振单位以确定pH7.4下结合的量，然后将pH7.4下结合的量除以pH6.0下结合的量来测定结合比率。要以百分比表示结合比率时，则可以将相除值乘以100。
上述方法中，pH6.0缓冲液的组成不受具体限制，只要其可以引起待测量与FcRn结合程度的物质和FcRn之间的结合。例如，pH6.0缓冲液可以是含盐(如磷酸盐)的缓冲液。缓冲液中的盐浓度可以是50-200mM，但并不限于此。另外，可以在约25℃温度下将缓冲液注入到FcRn固定化生物传感器芯片中，但测量温度可在缓冲液pH不变化的温度范围内变化。
此外，pH6.0缓冲液可含有待测量与FcRn结合程度的物质。pH6.0缓冲液中待测量与FcRn结合程度的物质的浓度不受具体限制，只要可以测得与FcRn的结合程度。例如，pH6.0缓冲液中待测量与FcRn结合程度的物质的浓度可以在100nM和12.5nM之间。
上述方法中，pH7.4缓冲液的组成不受具体限制，只要其可以引起待测量与FcRn结合程度的物质和FcRn之间的解离。例如，pH7.4缓冲液可以是含磷酸盐的缓冲液。缓冲液中的盐浓度可以是50-200mM，但并不限于此。另外，可以在25～37℃温度下将pH7.4缓冲液注入到FcRn固定化生物传感器芯片中，但并不限于此。在具体实施方式中，在25℃温度下测量结合量之间的比率。
而且，在pH6.0下FcRn和待测量与FcRn结合程度的物质之间的结合量可以是在将pH6.0样品注射完成之前的2-60秒测量的共振单位值。FcRn和待测量与FcRn结合程度的物质之间的结合优选在测量时间点处于平衡状态。
另外，在pH7.4下FcRn和待测量与FcRn结合程度的物质之间的结合量可以是在将pH7.4缓冲液注射之后的10-20秒测量的共振单位值。测量时间点优选在RU值快速变化的时间点和在RU值达到0之前之间。
在免疫球蛋白Fc片段和根据本发明的缀合物之间的结合比率的对比中，结合比率优选在相同实验条件下通过相同实验方法测定的值，但缓冲液的组成和温度可根据缀合物的类型而变化。
上述表面等离子共振方法是用于测定结合比率的方法中的一种。除表面等离子共振方法之外，任何方法都可用于本发明，只要其是可以测量与FcRn结合的缀合物的量的方法，如酶联免疫吸附测定法(ELISA)。此外，结合量的单位可根据所用方法而变化。
当包括通过非肽基连接体连接至具有FcRn-结合区域的免疫球蛋白Fc片段的生理活性多肽的生理活性多肽-免疫球蛋白Fc片段缀合物的结合比率，如通过上述方法所测定的，在免疫球蛋白Fc片段自身结合比率的±6.0％范围内时，生理活性多肽-免疫球蛋白Fc片段缀合物具有长的体内半衰期。
本发明中发现，即使当生理活性多肽通过非肽基连接体与具有FcRn-结合区域的免疫球蛋白Fc片段共价连接形成缀合物时，也可以维持免疫球蛋白Fc片段对FcRn的内在结合亲和力，这表明免疫球蛋白Fc片段的细胞内再循环能够容易发生，以增加体内半衰期。具体地，当非肽基连接体与免疫球蛋白Fc片段的除FcRn-结合区外的部分结合时，其不降低免疫球蛋白Fc片段对FcRn的结合亲和力。当非肽基连接体为聚乙二醇(-[O-CH2-CH2]n-)时，-[O-CH2-CH2]n-中的n为10或更大，具体地10-2400，更具体地10-480，并且甚至更具体地50-250，但并不限于此。
发现，当-[O-CH2-CH2]n-中的n具体为10-2400以及更具体为50-2400时，聚乙二醇并不影响生理活性多肽和免疫球蛋白Fc片段中每一个的生理活性和FcRn-结合活性。本发明正是基于该特性。
如本文使用的，术语“生理活性多肽-免疫球蛋白Fc片段缀合物”是指这样的缀合物，其包括通过非肽基连接体与具有FcRn-结合区域的免疫球蛋白Fc片段共价连接的生理活性多肽，并且如通过将pH6.0下与FcRn结合的量和pH7.4下与FcRn结合的量代入等式1所测定的，显示出在免疫球蛋白Fc片段结合比率的±6.0％范围内的结合比率。
可将缀合物中的非肽基连接体连接至远离免疫球蛋白Fc片段的FcRn-结合区域的氨基酸残基，例如，对应于根据Kabat编号系统编号的CH2的位置252-257和307-311以及CH2的位置433-436的区域。非肽基连接体可优选连接至免疫球蛋白Fc片段的N-末端或C-末端，更优选连接至N-末端，但并不限于此。
当非肽基连接体与免疫球蛋白Fc片段的N-末端或C-末端连接时，其基本上不降低免疫球蛋白Fc片段对FcRn的结合亲和力，因而可以维持缀合物的免疫球蛋白Fc片段对FcRn的内在结合亲和力。
如本文使用的，术语“非肽基连接体”是指由彼此相连的两个或更多个重复单元构成的生物相容性聚合物，其中重复单元通过任意非肽共价键彼此相连。该非肽基连接体可具有两个或三个末端。
本发明中使用的非肽基连接体可选自可生物降解聚合物，如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇与丙二醇的共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚，可生物降解聚合物，如聚乳酸(PLA)和聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)、脂质聚合物、几丁质、透明质酸及其组合，但并不限于此。优选地，非肽基连接体为聚乙二醇，例如，由下列式1表示的聚乙二醇聚合物，但不限于：
式1
其中n的范围从10至2400，优选从10至480，更优选从50至250，但并不限于此。
同时，其它具有对应于式1的聚乙二醇的分子量的非肽基连接体也落在本发明的范围内。
此外，本领域已知的它们的衍生物以及可以在现有技术中容易制备得到的非肽基连接体衍生物也落在本发明的范围内。
用作本发明中的非肽基连接体的聚乙二醇的优点在于，它并不导致结合至其两端的生理活性多肽和免疫球蛋白Fc片段之间的空间位阻，因此可以维持生理活性多肽的生理活性和免疫球蛋白Fc片段对FcRn的结合亲和力两者。
用于由常规框内(in-frame)融合法制得的融合蛋白的肽基连接体的缺点在于：其容易在体内被蛋白酶裂解，因而不能获得通过载体增加活性药物血清半衰期的预期效果。然而，包含根据本发明的非肽基连接体的缀合物明显地克服了该缺点。非肽基连接体可以是对蛋白酶具有抗性以维持肽的血清半衰期的聚合物，与载体相似。因此，任何非肽基连接体都可不受任何限制地用于本发明，只要其是具有上述功能的聚合物，即，在体内对蛋白酶具有抗性的聚合物。
此外，与本发明中的免疫球蛋白Fc片段连接的非肽基连接体不仅可以由一种聚合物制成，还可以由不同种类的聚合物制成。
用于本发明的非肽基连接体具有能够与免疫球蛋白Fc片段和生理活性多肽结合的反应性基团。
在非肽基聚合物两端的反应性基团优选选自反应性醛基、丙醛基、丁醛基、马来酰亚胺基以及琥珀酰亚胺衍生物。在此，琥珀酰亚胺衍生物可以是琥珀酰亚氨基丙酸酯、羟基琥珀酰亚氨基、琥珀酰亚氨基羧甲基或者琥珀酰亚氨基碳酸酯。具体地，当非肽基聚合物在其两端具有反应性醛基时，生理活性多肽和免疫球蛋白分别有效地结合至非肽基连接体的两端，同时使非特异性反应最小化。通过醛键经还原性烷基化产生的最终产物比通过酰胺键连接的更为稳定。醛反应性基团可以在低pH下选择性地结合至N-末端，并且在高pH下(例如，在pH9.0下)可以与赖氨酸残基形成共价键。在此，非肽基连接体可含有两个或更多个醛基或具有两个或更多个被包括醛的官能团取代的醇基团。
在非肽基聚合物两端的反应性基团可以是相同或者不同的。例如，非肽基连接体的一端可具有马来酰亚胺基，而另一端可具有醛基、丙醛基或烷基醛基，如丁醛。当在两端具有羟基反应性基团的聚乙二醇用作非肽基连接体时，可以通过已知的化学反应将羟基活化成多种反应性基团。可选地，具有修饰反应性基团的商业上可获得的聚乙二醇可用于制备本发明的缀合物。
如本文使用的，术语“生理活性多肽”统称为在体内具有任意生理活性的多肽，其通常具有多肽结构并且具有多种生理活性。生理活性多肽包括有调控基因表达和生理功能并且矫正由于与体内调节功能有关的物质分泌不足或过多而造成的异常状况作用的那些。生理活性多肽还可包括普通蛋白质治疗剂。此外，术语“生理活性多肽”意思是不仅包括天然多肽，还包括其衍生物。
本发明缀合物中的生理活性多肽的种类和大小不受具体限制，只要其是可以显示通过本发明的缀合物结构增加血清半衰期的生理活性多肽。在本发明的实施方式中，使用多种生理活性多肽制备缀合物，所述生理活性多肽包括胰岛素、干扰素、人生长激素和GLP-1激动剂，这些都是生理活性多肽的代表性实例，并且发现，不论生理活性多肽的种类和大小，都可以维持免疫球蛋白Fc片段自身对FcRn的内在结合亲和力。
包含在根据本发明的缀合物中的生理活性多肽选自胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、人生长激素(hGH)、红细胞生成素(EPO)、胰高血糖素、泌酸调节肽、胰岛素、生长激素释放激素、生长激素释放肽、干扰素、干扰素受体、G蛋白偶联受体、白细胞介素、白细胞介素受体、酶、白细胞介素结合蛋白、细胞因子结合蛋白、巨噬细胞活化因子、巨噬细胞肽、B细胞因子、T细胞因子、蛋白A、变态反应抑制剂、细胞坏死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、肿瘤坏死因子、肿瘤阻抑剂、转移生长因子、α-1-抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳清蛋白、脱脂载脂蛋白-E、高度糖基化红细胞生成素、血管生成素、血红蛋白、凝血酶、凝血酶受体活化肽、凝血调节蛋白、血液因子VII、VIIa、VIII、IX和XIII、纤溶酶原活化因子、纤维蛋白结合肽、尿激酶、链激酶、蛭素、蛋白质C、C-反应蛋白、肾素抑制剂、胶原酶抑制剂、超氧化物歧化酶、瘦蛋白、血小板衍生生长因子、上皮生长因子、表皮生长因子、制管张素、血管紧张素、骨生长因子、骨刺激蛋白、降钙素、心钠素、软骨诱导因子、依降钙素、结缔组织活化因子、组织因子通道抑制剂、促滤泡激素、黄体生成素、黄体生成素释放激素、神经生长因子、甲状旁腺激素、松弛素、促胰液素、生长调节素、胰岛素样生长因子、肾上腺皮质激素、缩胆囊素、胰多肽、胃泌素释放肽、促肾上腺皮质激素释放因子、促甲状腺激素、自毒素、乳铁蛋白、肌生成抑制蛋白、细胞表面抗原、病毒衍生的疫苗抗原、单克隆抗体、多克隆抗体以及抗体片段，但并不限于此。此外，如本文使用的，术语“生理活性多肽”意思是不仅包括天然生理活性多肽，而且包括每种多肽的激动剂、前体、衍生物、片段或变体。在此，泌酸调节肽衍生物的实例包括所有在韩国专利申请公开号10-2012-0137271中公开的那些，并且胰岛素释放肽衍生物的实例包括韩国专利申请公开号10-2009-0008151中公开的那些，但并不限于此。
如本文使用的，术语“免疫球蛋白Fc片段”是指含有免疫球蛋白的重链恒定区、不包括免疫球蛋白的重链恒定区1(CH1)和轻链恒定区1(CL1)的蛋白质。Fc片段可包括重链恒定区中的铰链区。在本发明中，免疫球蛋白Fc片段优选包括CH2结构域、CH3结构域或二者，因为应维持免疫球蛋白Fc片段对FcRn的结合亲和力。
另外，本发明中的免疫球蛋白Fc区可以是这样的延伸Fc片段，其除免疫球蛋白的重链和轻链可变区之外包括重链恒定区1(CH1)和/或轻链恒定区1(CL1)中的一部分或全部，只要其维持其对FcRn的内在结合亲和力，即使在它与生理活性多肽和非肽基连接体连接时。
由于免疫球蛋白Fc片段是在体内代谢的生物可降解多肽，因此其用作药物载体是安全的。另外，由于免疫球蛋白Fc片段的分子量低于整个免疫球蛋白分子，因此有利于制备、纯化和生产该缀合物。此外，由于除去了Fab区——其由于抗体之间氨基酸序列的差异而显示出高度非均一性，因此Fc片段具有明显增加的均一性并且引起血清抗原性的可能性小。
本发明中，免疫球蛋白Fc片段不仅包括天然氨基酸序列，还包括其序列突变体。如本文使用的，术语“氨基酸序列突变体”是指由于一个或多个氨基酸残基的缺失、插入、非保守性或保守性取代或其组合而不同于天然氨基酸序列的序列。例如，在IgGFc的情况下，已知对结合重要的位置214至238、297至299、318至322或327至331处的氨基酸残基可用作合适的修饰目标。
此外，各种突变体也是可能的，包括具有能够形成二硫键区域的缺失、在天然Fc的N-末端处数个氨基酸残基的缺失、或在天然Fc的N-末端处甲硫氨酸残基的添加的突变体。此外，为消除效应子功能，可去除补体-结合位点，如C1q-结合位点，并且还可去除抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)位点。国际专利公开号WO97/34631和WO96/32478中公开了制备此类免疫球蛋白Fc片段序列衍生物的技术。
蛋白质和肽中通常不改变分子活性的氨基酸交换是本领域已知的(H.Neurath，R.L.Hill，TheProteins，AcademicPress，NewYork，1979)。最常发生的交换是两个方向上的Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/PHe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly。
在某些情况下，免疫球蛋白Fc片段还可通过例如磷酸化、硫酸化、丙烯酰化、糖基化、甲基化、法尼基化、乙酰化或酰胺化而被修饰。
上述Fc突变体是显示出与本发明Fc片段相同的生物活性，但对热、pH等具有改善的结构稳定性的突变体。
此外，这些Fc片段可获自从人和包括牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠以及豚鼠的动物中分离的天然形式，或者可以是获自转化的动物细胞或微生物的重组形式或其衍生物。在此，它们可通过从人或动物活体中分离出完整的免疫球蛋白并用蛋白酶对其进行处理而从天然免疫球蛋白中获得。当用木瓜蛋白酶对完整的免疫球蛋白进行处理时，其裂解为Fab和Fc。同时，当用胃蛋白酶对其进行处理时，其裂解为pF’c和F(ab)2。例如，可对这些片段进行尺寸排阻层析以分离Fc或pF’c。
优选地，它是使用人Fc片段从微生物中获得的重组免疫球蛋白Fc片段。
此外，免疫球蛋白Fc片段可以是具有天然糖链、与天然形式相比糖链增加或与天然形式相比糖链减少的形式，者可以是去糖基化的形式。免疫球蛋白Fc糖链的增加、减少或去除可利用常规方法进行，诸如化学方法、酶法和利用微生物的基因工程方法。通过将糖链从Fc中去除而获得的免疫球蛋白Fc片段显示出对补体(c1q)结合亲和力的急剧降低和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或补体依赖性细胞毒性的降低或丧失，因而不在体内引起不必要的免疫应答。对此，去糖基化或非糖基化(aglycosylated)形式的免疫球蛋白Fc片段更适于用作药物载体。
如本文使用的，术语“去糖基化”是指将糖部份从Fc片段中酶促去除，而术语“非糖基化”意思是原核生物(优选大肠杆菌)中产生的未糖基化Fc片段。
同时，免疫球蛋白Fc片段可来源于人或动物，诸如牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠或豚鼠。优选源于人。此外，免疫球蛋白Fc片段可以是源自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM，其组合或其杂合的Fc片段。优选其源自IgG或IgM，其是人血液中最丰富的蛋白质之一，并且最优选其源自已知提高配体结合蛋白质半衰期的IgG。
如本文使用的，术语“组合”是指编码相同来源的单链免疫球蛋白Fc片段的多肽和不同来源的单链多肽之间键的形成以形成二聚体或多聚体。换言之，二聚体或多聚体可以由选自IgGFc、IgAFc、IgMFc、IgDFc和IgEFc片段中的两个或更多个片段形成。
如本文使用的，术语“杂合”是指对应于单链免疫球蛋白Fc片段中不同来源的免疫球蛋白Fc片段的两个或更多个序列的存在。在本发明中，各种类型的杂合都是可能的。换言之，结构域杂合可以由选自IgGFc、IgMFc、IgAFc、IgEFc和IgDFc的CH1、CH2、CH3和CH4中的一至四个结构域构成，并且可包括铰链区。
另一方面，IgG可以划分成IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类，并且其组合或杂合可用于本发明，优选IgG2和IgG4亚类，最优选几乎不具有效应子功能诸如CDC(补体依赖性细胞毒性)的IgG4的Fc片段。换言之，用作本发明中药物载体的最优选免疫球蛋白Fc片段是源自人IgG4的未糖基化Fc片段。人Fc片段比非人Fc片段更优选，非人Fc片段可以在人体中充当抗原并引起不期望的免疫应答，如产生抗该抗原的新抗体。
在本发明的实施方式中，通过非肽基连接体将胰岛素、干扰素、人生长激素和GLP-1激动剂中的每一种与具有结合至FcRn能力的免疫球蛋白Fc片段连接，从而制得增加免疫球蛋白Fc片段对FcRn的内在结合亲和力并且可以在中性pH下容易从FcRn中解离并且还可以显示出与免疫球蛋白Fc片段相似解离度的缀合物(实施例以及图2和3)。此外，发现，本发明的缀合物相比于框内缀合物具有长的体内作用持续时间(图4)。
又一方面，本发明提供了制备维持免疫球蛋白Fc片段对FcRn的内在结合亲和力的生理活性多肽-免疫球蛋白Fc片段缀合物的方法，该方法包括以下步骤：(a)通过非肽基连接体将生理活性多肽与具有FcRn-结合区域的免疫球蛋白Fc片段连接而制备生理活性多肽-免疫球蛋白Fc片段缀合物的混合物；和(b)从该混合物中分离出生理活性多肽-免疫球蛋白Fc片段缀合物，所述缀合物，如通过将在pH6.0下与FcRn结合的量和在pH7.4下与FcRn结合的量代入下列等式1所测定的，显示出在免疫球蛋白Fc片段结合比率的±6％范围内的结合比率：
等式1
结合比率(％)＝(在pH7.4下结合的量/在pH6.0下结合的量)×100。
在此，生理活性多肽、免疫球蛋白Fc片段、非肽基连接体、缀合物和结合比率的测定如上所述。
本发明方法中的步骤(a)是通过非肽基连接体将生理活性多肽与免疫球蛋白Fc片段共价连接的步骤。步骤(a)可包括以下步骤：(i)将生理活性多肽和免疫球蛋白Fc片段中的任一个与非肽基连接体一端处的反应性基团连接；和(ii)将剩下的一个与非肽基连接体另一端处的反应性基团连接。在步骤(i)和(ii)之间步骤(a)可进一步包括将连接至非肽基连接体一端的生理活性多肽或免疫球蛋白Fc片段分离的步骤。为制备该缀合物，可将韩国专利号10-0725315的公开内容通过引用并入本文。
为了通过非肽基连接体将生理活性多肽与免疫球蛋白Fc的除FcRn-结合区外的部分连接，可将具有与其连接的非肽基连接体的生理活性多肽在pH4.0-9.0下与免疫球蛋白Fc片段反应。
当通过该过程制备缀合物时，除了维持免疫球蛋白Fc片段对FcRn的内在结合亲和力的缀合物之外，还可以生成副产物(诸如显示出免疫球蛋白Fc片段对FcRn的结合亲和力降低的缀合物)。为此，在通过非肽基连接体将生理活性多肽与免疫球蛋白连接的反应后，还需要从缀合物混合物中分离出维持免疫球蛋白Fc片段对FcRn的内在结合亲和力的生理活性多肽-免疫球蛋白Fc片段的过程。
因此，本发明的方法包括从缀合物混合物中分离生理活性多肽-免疫球蛋白Fc片段缀合物的步骤(b)，所述缀合物，如通过将在pH6.0下与FcRn结合的量和在pH7.4下与FcRn结合的量代入等式1所测定的，显示出在免疫球蛋白Fc片段结合比率的±6％范围内的结合比率。
步骤(b)优选是分离这样的缀合物的过程，在所述缀合物中非肽基连接体连接至远离免疫球蛋白Fc片段的FcRn-结合区的氨基酸残基，例如，对应于根据cobat编号系统编号的CH2的位置252-257和307-311以及CH2的位置433-436的区域。具体地，步骤(b)是选择性仅分离这样的缀合物的过程，在所述缀合物中非肽基连接体与免疫球蛋白Fc片段的N-末端连接，使得维持Fc片段对FcRn的内在结合亲和力。
步骤(b)中的分离和纯化条件可根据所使用的非肽基连接体、生理活性多肽等的类型而变化。
又一方面，本发明提供了维持生理活性多肽-免疫球蛋白Fc片段缀合物对FcRn的内在结合亲和力的方法，该方法包括通过非肽基连接体将生理活性多肽与包含FcRn-结合区域的免疫球蛋白Fc片段连接。
在此，生理活性多肽、免疫球蛋白Fc片段、非肽基连接体和缀合物如上所述。
本发明的优点在于，由于生理活性多肽是通过非肽基连接体与包含FcRn-结合区的免疫球蛋白Fc片段连接，因而维持了免疫球蛋白Fc片段对FcRn的内在结合亲和力，同时免疫球蛋白Fc片段可以在中性下容易地与FcRn解离并且可以容易被再循环，表明可以有效增加免疫球蛋白Fc片段的体内半衰期。
在此，可以在体内实施对内在结合亲和力的维持。
又一方面，本发明提供了包括生理活性多肽-免疫球蛋白Fc片段缀合物的组合物，其维持免疫球蛋白Fc片段对FcRn的内在结合亲和力。
在此，生理活性多肽、免疫球蛋白Fc片段和缀合物如上所述。
下文中，将参照实施例对本发明进行更加详细的描述。然而，应理解，这些实施例仅仅是为了举例说明，而不应被认为是对本发明范围的限制。
实施例：生理活性蛋白和包含FcRn-结合位点的Fc片段的缀合物的制备
(1)免疫球蛋白Fc片段的制备
根据以本发明人名字提交的韩国专利申请号10-2006-0077377(名称为“用于大规模生产无甲硫氨酸残基的免疫球蛋白Fc区的方法”)制备免疫球蛋白Fc片段。
(2)胰岛素-免疫球蛋白Fc片段缀合物的制备
进行反应以使3.4-kDa3-戊酮(propion)-ALD2PEG(IDB，韩国)在胰岛素β链的N-末端特异性PEG化。使用阳离子交换柱对反应溶液进行纯化。为制备胰岛素-免疫球蛋白Fc片段缀合物，将纯化的单PEG化胰岛素与免疫球蛋白Fc反应。此时，为了将胰岛素特异性引到免疫球蛋白Fc的N-末端，在pH6.0-8.2下进行反应。反应完成后，首先使用阴离子交换柱对反应溶液进行纯化，然后使用疏水柱进行纯化，从而得到包括位点特异性连接至免疫球蛋白的胰岛素的胰岛素缀合物。
(3)干扰素-免疫球蛋白Fc片段缀合物的制备
将3.4-kDa3-戊酮-ALD2PEG(IDB，韩国)添加至含有溶于其中的人干扰素α-2b(hIFNα-2b；分子量：19kDa)的缓冲液并与其反应。为得到PEG特异性连接至干扰素-α的氨基末端并且PEG与干扰素-α以1∶1的比率彼此相连的缀合物，对反应混合物进行阴离子交换柱层析以纯化单PEG化IFNα-2b。为了将纯化的单PEG化干扰素特异性引到免疫球蛋白Fc的N-末端，在pH5.5-6.5下进行反应。在连接反应之后，为纯化所生成的干扰素-免疫球蛋白Fc片段缀合物，使反应混合物通过阴离子交换柱，以得到干扰素-免疫球蛋白Fc片段缀合物部分(fraction)。使用疏水柱对缀合物部分另外进行纯化，从而得到包括位点特异性连接至免疫球蛋白Fc的干扰素的干扰素缀合物。
(4)人生长激素-免疫球蛋白Fc片段缀合物的制备
将3.4-kDa3-戊酮-ALD2PEG(IDB，韩国)添加至含有溶于其中的人生长激素(hGH；分子量：22kDa)的缓冲液并与其反应。为得到PEG特异性连接至人生长激素的氨基末端并且PEG与人生长激素以1∶1的比率彼此相连的缀合物，对反应混合物进行阴离子交换柱层析以纯化单PEG化人生长激素(hGH)。为了将纯化的单PEG化人生长激素特异性引至并连接至免疫球蛋白Fc的N-末端，在pH5.5-6.5下进行反应。在连接反应之后，用阴离子交换柱纯化该反应混合物，从而得到包含位点特异性连接至免疫球蛋白Fc的人生长激素的人生长激素缀合物部分。
(5)GLP-1R激动剂-免疫球蛋白Fc片段缀合物的制备
使3.4-kDa3-戊酮-ALD2PEG(IDB，韩国)与咪唑并乙酰基毒晰外泌肽-4(CA毒晰外泌肽-4，Bachem，瑞士)的赖氨酸残基进行位点特异性反应。为得到PEG与GLP-1R激动剂以1∶1的比率彼此相连的缀合物，对反应混合物进行阴离子交换柱层析以纯化单PEG化毒晰外泌肽-4。为制备包括与免疫球蛋白Fc的N-末端特异性连接的单PEG化毒晰外泌肽-4的GLP-1R激动剂-免疫球蛋白Fc片段缀合物，在pH5.0-8.2下进行反应。在偶联反应之后，使用疏水柱和阴离子交换柱进行两步纯化过程，从而得到包括位点特异性连接至免疫球蛋白Fc的GLP-1R激动剂的GLP-1R激动剂-免疫球蛋白Fc片段缀合物。
比较实施例：包含框内连接至免疫球蛋白片段的GLP-1R激动剂的缀合物的制备
为与本发明的缀合物进行比较，通过基因重组法而不使用连接体制备具有免疫球蛋白Fc片段的GLP-1R激动剂的融合蛋白，所述免疫球蛋白Fc片段包括约50kDaFcRn位点。使用亲和柱从培养物中纯化包括框内连接至免疫球蛋白Fc片段的GLP-1R激动剂的缀合物(下文也称为“框内GLP-1R激动剂-免疫球蛋白Fc片段缀合物”)。
实验实施例1：对FcRn的结合亲和力的评价
在通过内吞作用引入细胞的蛋白质之中，具有FcRn-结合位点的蛋白质在酸性pH下与FcRn结合，而通过溶酶体降解将不与FcRn结合的蛋白质除去。当与FcRn结合的蛋白质在中性pH下与FcRn解离时，其被释放到细胞表面，而不与FcRn解离的FcRn-结合蛋白质经受溶酶体降解。该机理显示在图1中。
因此，为考查通过非肽基连接体将生理活性蛋白连接至包含FcRn结合位点的免疫球蛋白Fc而得到的实施例的缀合物是否可以维持免疫球蛋白Fc单独对FcRn的结合亲和力或者其是否可以在中性pH下容易与FcRn解离以及是否可以被释放到血液中，而进行下列实验。
具体地，为考查即使当形成本发明的缀合物时免疫球蛋白片段对FcRn的结合亲和力是否不会变化，使用SPR(表面等离子共振，BIACORE3000)对实施例或比较实施例的FcRn和缀合物之间的结合亲和力进行测量。作为FcRn，使用FCGRT&B2M二聚体受体(SinoBiologicalInc.)。利用胺偶联法将FcRn固定在CM5芯片上，然后以100nM至12.5nM之间的浓度将缀合物添加至其中，以测定其间的结合亲和力。然而，由于FcRn-介导的半衰期的增加取决于pH的机理，所以在酸性pH和中性pH每一个下进行实验。
(1)在酸性pH下免疫球蛋白-蛋白质缀合物对FcRn结合亲和力的测量
由于内吞蛋白质与FcRn的结合发生在酸性pH下，为了再现该结合，将磷酸盐缓冲液(pH6.0)用作运行缓冲液-1。在运行缓冲液-1中稀释所有免疫球蛋白片段-蛋白质缀合物以诱导结合，并且还使用运行缓冲液-1进行缀合物的解离。使免疫球蛋白片段-蛋白质缀合物的每一种与FcRn固定化芯片接触4分钟以诱导其结合，然后进行解离过程6分钟。接下来，为了测量免疫球蛋白片段-蛋白质缀合物在不同浓度下的值，即，将在不同浓度下的免疫球蛋白片段-蛋白质缀合物与芯片结合，使pH7.4Hepes缓冲液与结合至FcRn的免疫球蛋白片段-蛋白质缀合物接触约30秒。使用BIA评价软件中与漂移基线模型的1∶1朗缪尔结合分析每一种免疫球蛋白片段-蛋白质缀合物在酸性pH下对FcRn的结合亲和力，分析结果显示在图2中。
(2)在中性pH下免疫球蛋白-蛋白质缀合物对FcRn的结合亲和力的测量
由于当pH从酸性pH变为中性pH时，在与FcRn结合后发生缀合物从细胞中释放，因此将Hepes缓冲液(pH7.4)用作运行缓冲液-2。然而，使用包含每一种免疫球蛋白片段-蛋白质缀合物(其稀释在运行缓冲液-1中)的样品，对FcRn和每一种免疫球蛋白片段-蛋白质缀合物之间的结合诱导4分钟，然后使用运行缓冲液-2对每一种免疫球蛋白片段-蛋白质缀合物与FcRn的解离诱导1分钟。免疫球蛋白片段-蛋白质缀合物的传感图显示在图3中。免疫球蛋白片段-蛋白质缀合物与FcRn的解离度表示为根据下列等式2的结合比率(％)。此处，在pH6.0样品注射完成之前2秒测量的共振单位被选择作为与在pH6.0下结合的量成比例的物理量，并且在pH7.4下解离开始后10秒测量的共振单位被选择作为与在pH7.4下结合的量成比例的物理量。利用所选的共振单位，根据下列等式2计算结合比率：
等式2
结合比率(％)＝(在pH7.4下结合的量/在pH6.0下结合的量)×100。
如本文使用的，术语“结合比率”是指免疫球蛋白片段-蛋白质缀合物容易与FcRn解离的程度。可见，结合比率的值越小，在中性pH下缀合物的解离越好，并且缀合物的FcRn-介导的再循环越容易发生，反之，结合比率的值越大，在中性pH下缀合物的解离不充足，所以即使当通过结合至FcRn而被内吞时，缀合物更可能通过溶酶体降解除去。
结果，如图2和3中所示，实施例的各种免疫球蛋白片段-蛋白质缀合物的确以浓度依赖性方式与FcRn结合。结果同样显示在下表1中，利用等式2计算出的缀合物的解离度显示在下表2中。
表1：在pH6.0下免疫球蛋白片段-蛋白质缀合物对FcRn的结合亲和力的比较
*ka：缔合速率常数，kd：解离速率常数，KD：亲和力常数，结合比率：通过将在pH7.4下结合的量除以在pH6.0下结合的量并将相除值乘以100而得到的值。
表2：免疫球蛋白片段-蛋白质缀合物与FcRn解离度的比较
如在上表1和2中可以看到的，在酸性pH或中性pH下的结合亲和力在免疫球蛋白片段单独(没有与其连接的治疗性蛋白的独立Fc)和本发明的缀合物之间无显著差别。换言之，发现，在根据本发明生成的免疫球蛋白-蛋白质缀合物的情况下，即使在免疫球蛋白的确结合至生理活性蛋白时免疫球蛋白片段对FcRn的结合亲和力也没有改变，并且具体地，含有大小不同的各种生理活性蛋白质的缀合物显示出相似的结果。然而，比较实施例的框内GLP-1R激动剂-免疫球蛋白Fc片段缀合物显示出高结合比率，因此在中性pH下并不与FcRn适当地解离，这表明相比于本发明的缀合物，其对延长生理活性蛋白半衰期的作用较小。
实验实施例2：在GLP-1R激动剂-免疫球蛋白Fc片段缀合物之间的体内药物代谢动 力学的比较测试
为比较实施例(5)的GLP-1R激动剂-免疫球蛋白Fc片段缀合物和框内GLP-1R激动剂-免疫球蛋白Fc片段缀合物之间的体内药物代谢动力学，使用正常SD大鼠分析缀合物血清浓度中的变化。
具体地，在生理盐水中对GLP-1R激动剂-免疫球蛋白Fc片段缀合物(400mcg/kg)和框内GLP-1R激动剂-免疫球蛋白Fc片段缀合物(400mcg/kg)的每一种进行稀释，并以2mL/kg的剂量皮下施用给动物。在施用测试物质后4、8、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240、288、312和336小时，从大鼠的颈静脉中收集血液，并从血液中分离出血清。接下来，通过酶联免疫吸附试验对血清样品中的每一个的药物浓度进行定量，定量结果显示在图4中。
结果，GLP-1R激动剂-免疫球蛋白Fc片段缀合物和框内GLP-1R激动剂-免疫球蛋白Fc片段缀合物的血清半衰期分别为40.9小时和28小时，并且缀合物的最大血清浓度分别为1758.6ng/mL和742.7ng/mL。换言之，当以相同剂量将药物皮下施用给正常大鼠时，显示相比于框内GLP-1R激动剂-免疫球蛋白Fc片段缀合物，本发明的GLP-1R激动剂-免疫球蛋白片段缀合物在体内吸收和半衰期方面是优异的(图4)。
尽管已经参考具体的说明性实施方式描述了本发明，但本发明所属领域的技术人员理解，本发明可以以其它具体的形式体现而不背离本发明的技术精神或本质特征。因此，上述实施方式被认为是对各个方面的说明而非限制。此外，本发明的范围是由所附权利要求而不是详细描述限定，并且应理解，源自本发明含义和范围的所有修改或变化及其等价物都包含在所附权利要求的范围内。

Claims (18)

1.生理活性多肽-免疫球蛋白Fc片段缀合物，其包括通过非肽基连接体与包含FcRn-结合区域的免疫球蛋白Fc片段连接的生理活性多肽，其中在pH6.0下与FcRn结合的缀合物的量和在pH7.4下与FcRn结合的缀合物的量的结合比率在通过在用于所述缀合物的相同条件下测量与FcRn结合的所述免疫球蛋白Fc片段的量而测定的比率的±6％范围内。
2.权利要求1所述的缀合物，其中所述生理活性多肽-免疫球蛋白Fc片段缀合物的结合比率，如使用下列等式所测定的，在所述免疫球蛋白Fc片段的结合比率的±6％范围内：
等式1
结合比率(％)＝(在pH7.4下结合的量/在pH6.0下结合的量)×100。
3.权利要求1或2所述的缀合物，其中所述缀合物是通过在pH4.0-9.0下使具有与其连接的所述非肽基连接体的所述生理活性多肽与所述免疫球蛋白Fc片段反应，从而通过所述非肽基连接体将所述生理活性多肽与所述免疫球蛋白Fc片段的除FcRn-结合区外的部分连接而获得。
4.权利要求1或2所述的缀合物，其中所述非肽基连接体选自聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚乙烯醇、多糖、葡聚糖、聚乙烯基乙醚、可生物降解聚合物、脂质聚合物、几丁质、透明质酸及其组合。
5.权利要求1或2所述的缀合物，其中所述非肽基连接体是由下列式1表示的聚乙二醇聚合物：
式1
其中n的范围从10至2400。
6.权利要求1或2所述的缀合物，其中所述非肽基连接体具有选自醛基、丙醛基、丁醛基、马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺衍生物的反应性基团，。
7.权利要求1或2所述的缀合物，其中所述生理活性多肽选自胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、人生长激素(hGH)、红细胞生成素(EPO)、胰高血糖素、泌酸调节肽、胰岛素、生长激素释放激素、生长激素释放肽、干扰素、干扰素受体、G蛋白偶联受体、白细胞介素、白细胞介素受体、酶、白细胞介素结合蛋白、细胞因子结合蛋白、巨噬细胞活化因子、巨噬细胞肽、B细胞因子、T细胞因子、蛋白A、变态反应抑制剂、细胞坏死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、肿瘤坏死因子、肿瘤阻抑剂、转移生长因子、α-1-抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳清蛋白、脱脂载脂蛋白-E、高度糖基化红细胞生成素、血管生成素、血红蛋白、凝血酶、凝血酶受体激活肽、凝血调节蛋白、血液因子VII、VIIa、VIII、IX和XIII、纤溶酶原激活因子、纤维蛋白结合肽、尿激酶、链激酶、蛭素、蛋白质C、C-反应蛋白、肾素抑制剂、胶原酶抑制剂、超氧化物歧化酶、瘦蛋白、血小板衍生生长因子、上皮生长因子、表皮生长因子、制管张素、血管紧张素、骨生长因子、骨刺激蛋白、降钙素、心钠素、软骨诱导因子、依降钙素、结缔组织活化因子、组织因子通道抑制剂、促滤泡激素、黄体生成素、黄体生成素释放激素、神经生长因子、甲状旁腺激素、松弛素、促胰液素、生长调节素、胰岛素样生长因子、肾上腺皮质激素、缩胆囊素、胰多肽、胃泌素释放肽、促肾上腺皮质激素释放因子、促甲状腺激素、自毒素、乳铁蛋白、肌生成抑制蛋白、细胞表面抗原、病毒衍生的疫苗抗原、单克隆抗体、多克隆抗体、以及抗体片段。
8.权利要求1或2所述的缀合物，其中包含所述FcRn-结合区的所述免疫球蛋白Fc片段包括CH2结构域、CH3结构域或二者。
9.权利要求1或2所述的缀合物，其中所述免疫球蛋白Fc片段是非糖基化的形式。
10.权利要求1或2所述的缀合物，其中所述免疫球蛋白Fc片段进一步包括铰链区。
11.权利要求1或2所述的缀合物，其中所述免疫球蛋白Fc片段选自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM、其组合、和其杂合。
12.权利要求1或2所述的缀合物，其中所述免疫球蛋白Fc片段是IgG4Fc片段。
13.制备维持免疫球蛋白Fc片段对FcRn的内在结合亲和力的生理活性多肽-免疫球蛋白Fc片段缀合物的方法，所述方法包括：
(a)通过非肽基连接体将生理活性多肽与包含FcRn-结合区域的免疫球蛋白Fc片段连接，以制备生理活性多肽-免疫球蛋白Fc片段缀合物的混合物；和
(b)从所述混合物中分离生理活性多肽-免疫球蛋白Fc片段缀合物，所述缀合物，如通过将在pH6.0下与FcRn结合的量和在pH7.4下与FcRn结合的量代入下列等式1所测定的，显示在所述免疫球蛋白Fc片段结合比率的±6％范围内的结合比率：
等式1
结合比率(％)＝(在pH7.4下结合的量/在pH6.0下结合的量)×100。
14.权利要求13所述的方法，其中所述非肽基连接体是由下列式1表示的聚乙二醇聚合物：
式1
其中n的范围从10至2400。
15.权利要求13所述的方法，其中在步骤(b)中分离的所述缀合物具有非肽基连接体与所述免疫球蛋白Fc片段的N-末端结合的结构。
16.维持生理活性多肽-免疫球蛋白Fc片段缀合物对FcRn的内在结合亲和力的方法，所述方法包括通过非肽基连接体将生理活性多肽与包含FcRn-结合区域的免疫球蛋白Fc片段连接。
17.权利要求16所述的方法，其中在体内实施对内在结合亲和力的维持。
18.组合物，其包括权利要求1所述的生理活性多肽-免疫球蛋白Fc片段缀合物，所述组合物维持所述免疫球蛋白Fc片段对FcRn的内在结合亲和力。
CN201480049342.0A 2013-07-12 2014-07-14 维持FcRn结合强度的免疫球蛋白Fc缀合物 Pending CN105593243A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310310247.2A CN116082528A (zh) 2013-07-12 2014-07-14 维持免疫球蛋白Fc片段与FcRn结合亲和力的免疫球蛋白Fc缀合物

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20130082509 2013-07-12
KR10-2013-0082509 2013-07-12
PCT/KR2014/006328 WO2015005747A1 (ko) 2013-07-12 2014-07-14 FcRn 결합력이 유지되는 면역글로불린 Fc 결합체

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310310247.2A Division CN116082528A (zh) 2013-07-12 2014-07-14 维持免疫球蛋白Fc片段与FcRn结合亲和力的免疫球蛋白Fc缀合物

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105593243A true CN105593243A (zh) 2016-05-18

Family

ID=52280325

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480049342.0A Pending CN105593243A (zh) 2013-07-12 2014-07-14 维持FcRn结合强度的免疫球蛋白Fc缀合物
CN202310310247.2A Pending CN116082528A (zh) 2013-07-12 2014-07-14 维持免疫球蛋白Fc片段与FcRn结合亲和力的免疫球蛋白Fc缀合物

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310310247.2A Pending CN116082528A (zh) 2013-07-12 2014-07-14 维持免疫球蛋白Fc片段与FcRn结合亲和力的免疫球蛋白Fc缀合物

Country Status (22)

Country Link
US (2) US20160152684A1 (zh)
EP (1) EP3020732B1 (zh)
JP (2) JP2016525099A (zh)
KR (2) KR101872559B1 (zh)
CN (2) CN105593243A (zh)
AR (1) AR096890A1 (zh)
AU (1) AU2014287879B2 (zh)
CA (1) CA2917838C (zh)
DK (1) DK3020732T3 (zh)
EA (1) EA034297B1 (zh)
ES (1) ES2799326T3 (zh)
HK (1) HK1221957A1 (zh)
HU (1) HU231424B1 (zh)
IL (1) IL243567B (zh)
MX (1) MX2016000344A (zh)
MY (1) MY180374A (zh)
NO (1) NO20160182A1 (zh)
PH (1) PH12016500111A1 (zh)
PT (1) PT3020732T (zh)
TW (1) TWI693236B (zh)
UA (1) UA119644C2 (zh)
WO (1) WO2015005747A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110312532A (zh) * 2016-12-19 2019-10-08 韩美药品株式会社 脑靶向长效蛋白质缀合物

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20130049671A (ko) 2011-11-04 2013-05-14 한미사이언스 주식회사 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법
AR090281A1 (es) 2012-03-08 2014-10-29 Hanmi Science Co Ltd Proceso mejorado para la preparacion de un complejo polipeptidico fisiologicamente activo
CN117065044A (zh) * 2014-03-31 2023-11-17 韩美药品株式会社 通过使用免疫球蛋白Fc片段连接改善蛋白质和肽的溶解度的方法
AR107483A1 (es) * 2016-01-29 2018-05-02 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugado de enzimas terapéuticas
WO2021010531A1 (ko) * 2019-07-18 2021-01-21 한미약품 주식회사 단백질 결합체의 신규 제조 방법
KR102382593B1 (ko) * 2020-01-29 2022-04-05 고려대학교 산학협력단 pH-감응성 Fc 변이체

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005047336A1 (en) * 2003-11-13 2005-05-26 Hanmi Pharmaceutical. Co. Ltd. Protein complex using immunoglobulin fragment andmethod for the preparation thereof
WO2006107124A1 (en) * 2005-04-08 2006-10-12 Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. Immunoglobulin fc fragment modified by non-peptide polymer and pharmaceutical composition comprising the same
CN1859925A (zh) * 2002-12-26 2006-11-08 山景医药公司 具有保留的受体结合活性的细胞因子、趋化因子、生长因子、多肽激素及其拮抗剂的聚合物缀合物
CN102112493A (zh) * 2008-07-23 2011-06-29 韩美控股株式会社 包含具有三个官能性末端的非肽基聚合物的多肽复合物

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6030613A (en) * 1995-01-17 2000-02-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
CA2249195A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
US20050176108A1 (en) * 2003-03-13 2005-08-11 Young-Min Kim Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life
KR100609434B1 (ko) 2004-12-30 2006-08-03 한국항공우주연구원 트랜스버살 필터
US7625564B2 (en) * 2006-01-27 2009-12-01 Novagen Holding Corporation Recombinant human EPO-Fc fusion proteins with prolonged half-life and enhanced erythropoietic activity in vivo
JP2008169195A (ja) * 2007-01-05 2008-07-24 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd キャリア物質を用いたインスリン分泌ペプチド薬物結合体
KR20080098216A (ko) * 2007-05-04 2008-11-07 한미약품 주식회사 캐리어 물질을 이용한 나트륨 배설 펩타이드 약물 결합체
CA2687377C (en) * 2007-05-30 2013-05-14 Genexine Co., Ltd. Immunoglobulin fusion proteins
JP2009019027A (ja) 2007-07-16 2009-01-29 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd アミノ末端のアミノ酸が変異したインスリン分泌ペプチド誘導体
KR20120138241A (ko) * 2010-03-11 2012-12-24 화이자 인코포레이티드 ｐＨ 의존성 항원 결합을 갖는 항체
AR081066A1 (es) * 2010-04-02 2012-06-06 Hanmi Holdings Co Ltd Conjugado de insulina donde se usa un fragmento de inmunoglobulina
US8883134B2 (en) * 2010-10-20 2014-11-11 Handok Pharmaceuticals, Inc. Human interleukin-1 receptor antagonist—hybrid Fc fusion protein
UA113626C2 (xx) * 2011-06-02 2017-02-27 Композиція для лікування діабету, що містить кон'югат інсуліну тривалої дії та кон'югат інсулінотропного пептиду тривалої дії
EP3434687B1 (en) 2011-06-10 2021-03-10 Hanmi Science Co., Ltd. Novel oxyntomodulin derivatives and pharmaceutical composition for treating obesity comprising the same
RU2733544C2 (ru) * 2011-06-17 2020-10-05 Ханми Сайенс Ко., Лтд. Конъюгат, содержащий оксинтомодулин и фрагмент иммуноглобулина, и его применение
AU2012305062B2 (en) * 2011-09-05 2017-06-22 Beijing Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. A pharmaceutical composition for treating cancer, comprising interferon alpha conjugate
KR20130049671A (ko) * 2011-11-04 2013-05-14 한미사이언스 주식회사 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법
KR102041412B1 (ko) * 2011-12-30 2019-11-11 한미사이언스 주식회사 면역글로불린 Ｆｃ 단편 유도체

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1859925A (zh) * 2002-12-26 2006-11-08 山景医药公司 具有保留的受体结合活性的细胞因子、趋化因子、生长因子、多肽激素及其拮抗剂的聚合物缀合物
WO2005047336A1 (en) * 2003-11-13 2005-05-26 Hanmi Pharmaceutical. Co. Ltd. Protein complex using immunoglobulin fragment andmethod for the preparation thereof
WO2006107124A1 (en) * 2005-04-08 2006-10-12 Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. Immunoglobulin fc fragment modified by non-peptide polymer and pharmaceutical composition comprising the same
CN102112493A (zh) * 2008-07-23 2011-06-29 韩美控股株式会社 包含具有三个官能性末端的非肽基聚合物的多肽复合物

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110312532A (zh) * 2016-12-19 2019-10-08 韩美药品株式会社 脑靶向长效蛋白质缀合物

Also Published As

Publication number Publication date
IL243567A0 (en) 2016-03-31
TW201546093A (zh) 2015-12-16
EA034297B1 (ru) 2020-01-27
MX2016000344A (es) 2016-05-05
PT3020732T (pt) 2020-06-25
HK1221957A1 (zh) 2017-06-16
AR096890A1 (es) 2016-02-03
KR20180071241A (ko) 2018-06-27
JP2020125337A (ja) 2020-08-20
CN116082528A (zh) 2023-05-09
CA2917838A1 (en) 2015-01-15
HU231424B1 (hu) 2023-08-28
PH12016500111A1 (en) 2016-04-18
JP2016525099A (ja) 2016-08-22
EP3020732A1 (en) 2016-05-18
CA2917838C (en) 2023-06-20
TWI693236B (zh) 2020-05-11
UA119644C2 (uk) 2019-07-25
AU2014287879A1 (en) 2016-02-11
EA201690114A1 (ru) 2016-07-29
AU2014287879B2 (en) 2020-01-02
US20220380437A1 (en) 2022-12-01
JP6880278B2 (ja) 2021-06-02
EP3020732A4 (en) 2016-12-28
KR20150008011A (ko) 2015-01-21
IL243567B (en) 2020-11-30
HUP1600206A2 (hu) 2016-05-30
US20160152684A1 (en) 2016-06-02
ES2799326T3 (es) 2020-12-16
DK3020732T3 (da) 2020-06-15
MY180374A (en) 2020-11-28
EP3020732B1 (en) 2020-03-18
KR101872559B1 (ko) 2018-06-28
KR102076718B1 (ko) 2020-02-12
NO20160182A1 (en) 2016-03-02
NZ716275A (en) 2021-09-24
WO2015005747A1 (ko) 2015-01-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6976400B2 (ja) 受容体媒介クリアランスが減少した、生理活性ポリペプチド単量体と免疫グロブリンＦｃ断片との結合体及びその製造方法
CN105593243A (zh) 维持FcRn结合强度的免疫球蛋白Fc缀合物
CN109069569A (zh) 使用脂肪酸衍生物的蛋白缀合物及其制备方法
CN105229025B (zh) 位点特异性胰岛素缀合物
US20230027238A1 (en) Methods of treatment using g-csf protein complex
US20230248843A1 (en) Novel method for preparing long-acting drug conjugate through preparation of intermediate
US20230330184A1 (en) Methods of treating neutorpenia using g-csf protein complex
NZ716275B2 (en) An Immunoglobulin Fc Conjugate which Maintains Binding Affinity of Immunoglobulin Fc Fragment to FcRn

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160518

RJ01 Rejection of invention patent application after publication