KR101872559B1 - FcRn 결합력이 유지되는 면역글로불린 Fc 결합체 - Google Patents
FcRn 결합력이 유지되는 면역글로불린 Fc 결합체 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은, 생리활성 폴리펩타이드 및 FcRn 결합 영역을 포함한 면역글로불린 Fc 단편이 비펩타이드성 링커를 통하여 연결된, 생리활성 폴리펩타이드-면역글로불린 Fc 단편의 결합체로서, 면역글로불린 Fc 단편의 고유 결합력을 유지하는 것을 특징으로 하는 결합체, 상기 결합체의 제조 방법, 상기 결합체의 FcRn에 대한 고유 결합력을 유지시키는 방법 및 상기 결합체를 포함하며 면역글로불린 Fc 단편의 FcRn에 대한 고유 결합력이 유지된 것을 특징으로 하는, 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은, 생리활성 폴리펩타이드 및 FcRn 결합 영역을 포함한 면역글로불린 Fc 단편이 비펩타이드성 링커를 통하여 연결된, 생리활성 폴리펩타이드-면역글로불린 Fc 단편의 결합체로서, 면역글로불린 Fc 단편의 고유 결합력을 유지하는 것을 특징으로 하는 결합체, 상기 결합체의 제조 방법, 상기 결합체의 FcRn에 대한 고유 결합력을 유지시키는 방법 및 상기 결합체를 포함하며 면역글로불린 Fc 단편의 FcRn에 대한 고유 결합력이 유지된 것을 특징으로 하는, 조성물에 관한 것이다.
단백질의 혈중 반감기를 증가시키기 위해서 폴리에틸렌 글리콜 고분자, 알부민, 지방산, 항체 Fc(constant region)와 같은 캐리어를 결합시킨 단백질 결합체 또는 복합체에 대한 연구가 다양하게 이루어졌다. 지금까지 알려진 연구 내용의 대부분은 혈중 반감기를 증가시켜 약물 투여 간격을 줄여 환자의 편의성을 증대시키는 것에 목적을 두고 있다. 그러나, 기존의 많은 기술들이 치료 단백질과 캐리어 단백질 간의 비특이적인 결합을 통해 공간 장애 등으로 인한 단백질의 활성 감소 등의 문제를 나타내었다. 또한 혈중 알부민과의 가역적인 결합으로 혈중 반감기를 증가시키는 지방산 결합체의 경우, 단백질과 지방산의 가역적 결합으로 인하여, 단백질 의약품 소실의 가장 큰 부분을 차지하는 신장 클리어런스(renal clearance)를 피할 수 없어 그 혈중 반감기를 현저히 연장하는데 한계를 가지고 있다.
또한, 단백질을 비롯한 생리활성 물질의 반감기를 증가시키기 위해 면역글로불린 단편을 이용하려는 노력이 경주되고 있다. 면역글로불린 Fc의 CH2-CH3 부분에는 항체의 반감기를 길게 해주는 FcRn(protection receptor) 결합부위가 존재한다. FcRn은 MHC class I 관련 단백질로서 혈관 내피세포에서 발현되며 IgG와 알부민에 결합한다. 특징적인 점은 IgG와 FcRn 사이의 결합이 pH가 약산성일 때 강하며 중성 pH에서는 결합력이 없다는 점이다. 따라서 IgG가 혈관에서 혈관내피세포로 피노사이토시스(pinocytosis)나 엔도사이토시스(endocytosis)에 의하여 세포 내로 들어와 리소좀(lysosome, pH 6.0) 내로 들어오게 되더라도 FcRn에 의하여 보호되어 분해되지 않고 있다가 리사이클링(recycling)에 의하여 세포막과 융합하면 pH 7.4에서 IgG가 FcRn로부터 떨어져서 다시 혈관으로 배출되게 된다. 이러한 과정으로, FcRn 결합부위가 있는 IgG1, IgG2 및 IgG4의 인체 내 반감기는 평균 3주로 타 단백질에 비해 긴 반감기를 갖고 있다.
따라서 면역글로불린의 Fc 단편을 생리활성물질에 연결하여, FcRn 리사이클링에 의해 생리활성물질의 반감기를 증가시킬 수 있으나, 이때 생리활성물질과 면역글로불린 Fc 단편이 서로 연결될 때, 생리활성물질의 활성을 저해시키지 않으면서도 면역글로불린 Fc 단편의 FcRn에 대한 결합력 역시 유지시킬 수 있는 방법의 개발이 요구된다.
이에, 본 발명자들은 생리활성 폴리펩타이드의 활성을 저해시키지 않으면서도, 면역글로불린 Fc 단편 자체의 FcRn에 대한 고유 결합력이 유지되고, 중성 pH에서 FcRn으로부터 용이하게 해리될 수 있는 결합체를 제조하기 위하여 예의 노력한 결과, 생리활성 폴리펩타이드 및 FcRn 결합 영역을 포함하는 면역글로불린 Fc 단편을 비펩타이드성 링커로 연결시킨 결합체의 경우, FcRn에 대한 면역글로불린 Fc 단편의 고유 결합력을 유지하면서도, pH 7.4의 중성에서는 용이하게 해리될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 생리활성 폴리펩타이드 및 FcRn 결합 영역을 포함한 면역글로불린 Fc 단편이 비펩타이드성 링커를 통하여 연결된, 생리활성 폴리펩타이드-면역글로불린 Fc 단편의 결합체로서, 상기 생리활성 폴리펩타이드-면역글로불린 Fc 단편의 결합체는, pH 6.0에서의 FcRn에 대한 결합량(binding amount at pH 6.0)과 pH 7.4에서의 FcRn에 대한 결합량(binding amount at pH 7.4)의 비율이 면역글로불린 Fc 단편을 FcRn에 대하여 같은 조건에서 측정하였을 때 나타내는 비율의 ±6% 이내인 결합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 생리활성 폴리펩타이드 및 FcRn 결합 영역을 포함한 면역글로불린 Fc 단편이 비펩타이드성 링커를 통하여 연결된, 생리활성 폴리펩타이드-면역글로불린 Fc 단편의 결합체로서, 상기 생리활성 폴리펩타이드-면역글로불린 Fc 단편의 결합체는, pH 6.0에서의 FcRn에 대한 결합량(binding amount at pH 6.0)과 pH 7.4에서의 FcRn에 대한 결합량(binding amount at pH 7.4)을 하기 수학식 1에 대입하여 결합비율 값을 산출하였을 때, 결합비율 값이 면역글로불린 Fc 단편을 FcRn에 대하여 같은 조건에서 측정하였을 때 나타내는 결합비율의 ±6% 이내인 결합체를 제공하는 것이다.
[수학식 1]
본 발명의 또 다른 목적은 (a) FcRn 결합 영역을 포함하는 면역글로불린 Fc 단편 및 생리활성 폴리펩타이드를, 비펩타이드성 링커를 통하여 서로 연결하여, 생리활성 폴리펩타이드-면역글로불린 Fc 단편의 결합체의 혼합물을 제조하는 단계; 및 (b) pH 6.0에서의 FcRn에 대한 결합량 및 pH 7.4에서의 FcRn에 대한 결합량을 상기 수학식 1에 대입하여 결합비율 값을 산출하였을 때, 상기 생리활성 폴리펩타이드-면역글로불린 Fc 단편의 결합체의 결합비율 값이 면역글로불린 Fc 단편의 결합비율 값 ±6% 범위 내인 결합체를 분리하는 단계를 포함하여, 면역글로불린 Fc 단편의 FcRn에 대한 고유한 결합력을 유지하는, 생리활성 폴리펩타이드-면역글로불린 Fc 단편 결합체의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 생리활성 폴리펩타이드 및 FcRn 결합 영역을 포함하는 면역글로불린 Fc 단편을 비펩타이드성 링커를 통하여 연결시키는 단계를 포함하는, 생리활성 폴리펩타이드-면역글로불린 Fc 단편 결합체의 FcRn에 대한 고유 결합력을 유지시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 생리활성 폴리펩타이드-면역글로불린 Fc 단편의 결합체를 포함하며, 면역글로불린 Fc 단편의 FcRn에 대한 고유 결합력이 유지된 것을 특징으로 하는, 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 생리활성 폴리펩타이드 및 FcRn 결합 영역을 포함한 면역글로불린 Fc 단편이 비펩타이드성 링커를 통하여 연결된, 생리활성 폴리펩타이드-면역글로불린 Fc 단편의 결합체로서, 상기 생리활성 폴리펩타이드-면역글로불린 Fc 단편의 결합체는, pH 6.0에서의 FcRn에 대한 결합량(binding amount at pH 6.0)과 pH 7.4에서의 FcRn에 대한 결합량(binding amount at pH 7.4)의 비율이 면역글로불린 Fc 단편을 FcRn에 대하여 같은 조건에서 측정하였을 때 나타내는 비율의 ±6% 이내인 결합체이다.
하나의 구체예로서, 본 발명에 따른 결합체는 하기 수학식 1의 결합비율이 면역글로불린 Fc 단편의 해당 결합 비율 값의 ±6% 내인 것을 특징으로 한다.
[수학식 1]
또 하나의 구체예로서, 본 발명에 따른 결합체는 비펩타이드성 링커가 연결된 생리활성 폴리펩타이드와 면역글로불린 Fc 단편을 pH 4.0 내지 9.0에서 반응시켜, 생리활성 폴리펩타이드가 비펩타이드성 링커를 통하여 면역글로불린 Fc 단편 중 FcRn 결합 영역 이외의 부분에 연결시킨 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 본 발명에 따른 결합체에 포함되는 비펩타이드성 링커는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 본 발명에 따른 결합체에 포함되는 비펩타이드성 링커는 하기 화학식 1로 표시되는 폴리에틸렌글리콜 중합체인 것을 특징으로 한다.
[화학식 1]
여기서, n= 10 내지 2400이다.
또 하나의 구체예로서, 본 발명에 따른 결합체에 포함되는 상기 비펩타이드성 링커의 반응기는 알데히드 그룹, 프로피온알데히드 그룹, 부틸 알데히드 그룹, 말레이미드 그룹 및 석시니미드 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 본 발명에 따른 결합체에 포함되는 생리활성 폴리펩타이드는 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1), 호중구 증가 인자(G-CSF), 인간 성장 호르몬(hGH), 에리스로포이에틴(EPO), 글루카곤, 옥신토모듈린, 인슐린, 성장 호르몬 방출 호르몬, 성장 호르몬 방출 펩타이드, 인터페론, 인터페론 수용체, 지프로테인 관련수용체(G protein-coupled receptor), 인터루킨, 인터루킨 수용체, 효소류, 인터루킨 결합 단백질, 사이토카인 결합 단백질, 마크로파지 활성인자, 마크로파지 펩타이드, B 세포인자, T 세포인자, 단백질 A, 알러지 억제인자, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사인자, 종양 억제인자, 전이 성장인자, 알파-1 안티트립신, 알부민, α-락트알부민, 아포리포단백질-E, 고 당쇄화 적혈구 생성인자, 안지오포에이틴류, 헤모글로빈, 트롬빈, 트롬빈 수용체 활성 펩타이드, 트롬보모듈린, 혈액인자 Ⅶ, Ⅶa, Ⅷ, Ⅸ, 및 XIII, 플라즈미노젠 활성인자, 피브린-결합 펩타이드, 유로키나제, 스트렙토키나제, 히루딘, 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라게나제 억제제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 렙틴, 혈소판 유래 성장인자, 상피세포 성장인자, 표피세포 성장인자, 안지오스타틴, 안지오텐신, 골 형성 성장인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 아트리오펩틴, 연골 유도인자, 엘카토닌, 결합조직 활성인자, 조직인자 경로 억제제, 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장인자, 부갑상선 호르몬, 릴랙신, 씨크레틴, 소마토메딘, 인슐린 유사 성장인자, 부신피질 호르몬, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩타이드, 가스트린 방출 펩타이드, 코티코트로핀 방출인자, 갑상선 자극호르몬, 오토탁신, 락토페린, 미오스타틴, 세포표면항원, 바이러스 유래 백신 항원, 단일클론 항체, 다중클론 항체 및 항체 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 본 발명에 따른 결합체에 포함되는 FcRn 결합 영역을 포함하는 면역글로불린 Fc 단편은 CH2 도메인, CH3 도메인 또는 둘 다를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 본 발명에 따른 결합체에 포함되는 면역글로불린 Fc 단편은 비당쇄화된 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 본 발명에 따른 결합체에 포함되는 면역글로불린 Fc 단편은 힌지(hinge) 영역을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 본 발명에 따른 결합체에 포함되는 면역글로불린 Fc 단편은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, 이들의 조합(combination) 및 이들의 하이브리드(hybrid)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
또 하나의 구체예로서, 본 발명에 따른 결합체에 포함되는 면역글로불린 Fc 단편은 IgG4 Fc 단편인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 (a) FcRn 결합 영역을 포함하는 면역글로불린 Fc 단편 및 생리활성 폴리펩타이드를 비펩타이드성 링커를 통하여 서로 연결하여, 생리활성 폴리펩타이드-면역글로불린 Fc 단편의 결합체의 혼합물을 제조하는 단계; 및 (b) pH 6.0에서의 FcRn에 대한 결합량 및 pH 7.4에서의 FcRn에 대한 결합량을 상기 수학식 1에 대입하여 결합비율 값을 산출하였을 때, 상기 생리활성 폴리펩타이드-면역글로불린 Fc 단편의 결합체의 해당 결합비율 값이 면역글로불린 Fc 단편의 결합비율 값 ± 6.0% 범위 내인 결합체를 분리하는 단계를 포함하여, 면역글로불린 Fc 단편의 FcRn에 대한 고유한 결합력을 유지하는, 생리활성 폴리펩타이드-면역글로불린 Fc 단편 결합체의 제조 방법이다.
하나의 구체예로서, 본 발명에 따른 제조방법에 사용되는 비펩타이드성 링커는 하기 화학식 1로 표시되는 폴리에틸렌글리콜 중합체인 것을 특징으로 한다.
[화학식 1]
여기서, n=10 내지 2400이다.
또 하나의 구체예로서, 본 발명에 따른 제조방법에서 상기 (b) 단계에서 분리된 결합체는 비펩타이드성 링커가 면역글로불린 Fc 단편의 N-말단에 결합된 형태인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 생리활성 폴리펩타이드 및 FcRn 결합 영역을 포함하는 면역글로불린 Fc 단편을 비펩타이드성 링커를 통하여 연결시키는 단계를 포함하는, 생리활성 폴리펩타이드-면역글로불린 Fc 단편 결합체의 FcRn에 대한 고유 결합력을 유지시키는 방법이다.
하나의 구체예로서, 본 발명에 따른 상기 방법에서 고유 결합력의 유지는 in vivo에서 이루어지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 생리활성 폴리펩타이드-면역글로불린 Fc 단편의 결합체를 포함하며, 면역글로불린 Fc 단편의 FcRn에 대한 고유 결합력이 유지된 것을 특징으로 하는, 조성물이다.
본 발명의 결합체는 FcRn에 대한 면역글로불린 Fc 단편의 고유 결합력을 유지하면서도, pH 7.4와 같은 중성에서는 용이하게 해리되므로, 이를 생리활성 폴리펩타이드의 혈중 반감기 증대에 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은, FcRn에 결합된 단백질의 리싸이클링(recycling) 과정의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는, 산성 pH에서의 FcRn에 대한 면역글로불린 단백질의 결합체 센소 그람을 나타낸 것이다.
도 3은, 중성 pH에서의 FcRn에 대한 면역글로불린 단백질의 결합체 센소 그람을 나타낸 것이다.
도 4는, GLP-1R 작용제 결합체의 인 비보 약물 동태 비교 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 2는, 산성 pH에서의 FcRn에 대한 면역글로불린 단백질의 결합체 센소 그람을 나타낸 것이다.
도 3은, 중성 pH에서의 FcRn에 대한 면역글로불린 단백질의 결합체 센소 그람을 나타낸 것이다.
도 4는, GLP-1R 작용제 결합체의 인 비보 약물 동태 비교 시험 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 하나의 양태로서 생리활성 폴리펩타이드 및 FcRn 결합 영역을 포함한 면역글로불린 Fc 단편이 비펩타이드성 링커를 통하여 연결된, 생리활성 폴리펩타이드-면역글로불린 Fc 단편의 결합체로서, 상기 생리활성 폴리펩타이드-면역글로불린 Fc 단편의 결합체는, pH 6.0에서의 FcRn에 대한 결합량(binding amount at pH 6.0)과 pH 7.4에서의 FcRn에 대한 결합량(binding amount at pH 7.4)의 비율이 면역글로불린 Fc 단편을 FcRn에 대하여 같은 조건에서 측정하였을 때 나타내는 결합비율의 ±6% 이내인 결합체를 제공한다.
본 발명에서 생리활성 폴리펩타이드-면역글로불린 Fc 단편의 결합체의 결합량이란, 해당되는 pH에서 FcRn에 결합하고 있거나 결합하고 있지 않은 채로 존재하는 결합체 단백질의 총 농도 중에서 FcRn에 결합하고 있는 비율을 가리킨다. 본 발명에서 이러한 결합량은 두 pH 지점에서의 결합량의 비를 계산하는데 쓰이므로, 한 측정 pH에서의 절대적인 결합량을 구하여 이로부터 결합량비를 계산하여도 좋지만, 결합체의 결합량에 비례하면서 측정하기도 쉬운 다른 물리량을 측정하므로써 대체할 수 있다. 예를 들어, 표면 플라스몬 공명(SPR)의 공명 신호를 측정하고, pH 6.0과 7.4에서의 신호의 비를 계산하여 결합량의 비를 구할 수 있으며, 그 밖에 다른 방법도 가능하다.
구체적으로, 본 발명은 생리활성 폴리펩타이드 및 FcRn 결합 영역을 포함한 면역글로불린 Fc 단편이 비펩타이드성 링커를 통하여 연결된, 생리활성 폴리펩타이드-면역글로불린 Fc 단편의 결합체로서, 상기 생리활성 폴리펩타이드-면역글로불린 Fc 단편의 결합체는, pH 6.0에서의 FcRn에 대한 결합량(binding amount at pH 6.0) 및 pH 7.4에서의 FcRn에 대한 결합량(binding amount at pH 7.4)을 하기 수학식 1에 대입하여 산출하였을 때, 그 값(결합비율)이 면역글로불린 Fc 단편을 FcRn에 대하여 같은 조건에서 측정하였을 때 나타내는 값(결합비율)의 ±6% 범위 내인 것이 특징인 결합체를 제공한다.
[수학식 1]
상기 결합비율 값은 pH 7.4에서 상기 결합체(또는 면역글로불린 Fc 단편)가 FcRn에 결합하는 양을 pH 6.0에서 상기 결합체(또는 면역글로불린 Fc 단편)가 FcRn에 결합하는 양으로 나눈 값에 100을 곱하여 퍼센트(%) 값으로 나타낼 수 있다.
상기 결합비율 값을 측정하는 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 모노클로날 항체의 반감기를 예측하기 위한 Weirong Wang 그룹이 제안한 방법(DRUG METABOLISM AND DISPOSITION 39:1469-1477, 2011)을 이용하여 산출할 수 있다. 상기 문헌에 기술된 방법에서는 결합비율 값이 높은 모노클로날 항체의 경우 in vivo 반감기가 짧은 것으로 나타났다.
상기 결합비율 값을 측정하는 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance)을 이용할 수 있다.
예컨대, FcRn을 바이오센서 칩(예, 비아코어 CM5 바이오센서칩)에 아민 커플링 키트 등을 이용하여 고정시키고, FcRn이 고정된 바이오센서 칩에 FcRn과의 결합 정도를 측정하고자 하는 물질(예, 결합체 또는 면역글로불린 Fc 단편)을 포함하는 산성인 완충액(예, pH 6.0인 완충액)을 주입하여 FcRn에 결합시킨 다음, 중성인 완충액(예, pH 7.4인 완충액)을 주입함으로써 수행될 수 있다. 여기서, pH 6.0의 완충액 내 샘플이 주입 완료되기 전 평형 상태에서의 공명 단위(resonance unit, RU)를 측정하여 pH 6.0에서의 결합량을 산출하고, pH 7.4인 완충액 주입 후에 공명 단위를 측정하여 pH 7.4에서의 결합량을 산출한 다음, 상기 pH 6.0에서의 결합량을 pH 7.4에서의 결합량으로 나누어 결합비율을 산출할 수 있고, 백분율로 나타내고자 하는 경우, 상기 나눈 값에 100을 곱하여 결합비율 값을 산출할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 pH 6.0인 완충액은 FcRn과의 결합 정도를 측정하고자 하는 물질과 FcRn과의 결합을 유도할 수 있다면 그 조성은 특별히 제한되지 않으나, 그 예로 인산염 등의 염을 포함하는 완충액일 수 있다. 상기 완충액에 포함하는 염의 농도는 50 내지 200 mM일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, FcRn이 고정된 바이오센서 칩에 주입될 때 상기 완충액은 25℃ 내외의 온도일 수 있으나, 완충액의 pH가 변하지 않는 온도 범위내에서는 측정온도를 변화시킬 수 있다.
또한, 상기 pH 6.0인 완충액은 FcRn과의 결합 정도를 측정하고자 하는 물질을 포함할 수 있으며, FcRn과의 결합 정도를 측정할 수 있다면 그 농도는 특별히 제한되지 않으나, 그 예로 100 nM 내지 12.5 nM의 농도로 FcRn과의 결합 정도를 측정하고자 하는 물질을 포함할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 pH 7.4인 완충액은 FcRn과의 결합 정도를 측정하고자 하는 물질과 FcRn 간의 해리를 유도할 수 있다면 그 조성은 특별히 제한되지 않으나, 그 예로 인산염을 포함하는 완충액일 수 있다. 상기 완충액에 포함하는 염의 농도는 50내지 200 mM일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, FcRn이 고정된 바이오센서 칩에 주입될 때 상기 완충액은 25-37℃의 온도일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 한 구체적인 실시 형태에서 결합량 비율을 측정하는 온도는 25℃이다.
또한, pH 6.0에서 FcRn과 이와의 결합 정도를 측정하고자 하는 물질 간의 결합량은, pH 6.0의 샘플 주입이 완료되기 2 내지 60초 전에 측정된 공명 단위 값일 수 있다. 측정 시점에서 FcRn과 이와의 결합 정도를 측정하고자 하는 물질 간의 결합은 평형 상태(equilibrium state)에 있는 것이 바람직하다.
또한, pH 7.4에서 FcRn과 이와의 결합 정도를 측정하고자 하는 물질 간의 결합량은, pH 7.4인 완충액의 주입 후 10 내지 20 초 후에 측정된 공명 단위 값일 수 있다. 측정 시점은 RU값이 급속히 변화하는 점과 RU값이 0가 되기 전 사이에 있는 것이 바람직하다.
면역글로불린 Fc 단편과 본 발명에 따른 결합체 간의 결합비율 비교에 있어서, 각각의 결합비율 값은 동일한 실험 방법 및 조건 하에서 산출된 값임이 바람직하나, 결합체의 종류에 따라 완충액의 조성 및 온도 등에는 차이를 보일 수 있다.
상기 기술한 표면 플라스몬 공명은 결합비율 값을 산출하기 위한 방법 중 하나의 예시로서, 상기 방법 외에도 효소면역흡착법 (ELISA, enzyme immunosorbent assay) 등과 같이 FcRn과 결합체 간의 결합량을 측정할 수 있는 방법이라면 어떠한 방법이라도 사용 가능하다. 또한, 상기 결합량은 사용하는 방법에 따라 그 단위가 달라질 수 있다.
이와 같은 방법을 통하여 측정된 생리활성 폴리펩타이드 및 FcRn 결합 영역을 포함한 면역글로불린 Fc 단편이 비펩타이드성 링커를 통하여 연결된, 생리활성 폴리펩타이드-면역글로불린 Fc 단편의 결합체의 결합비율 값이 면역글로불린 Fc 단편 자체를 이용하여 동일한 조건으로 측정하여 산출된 결합비율 값과 ±6.0% 범위 내인 경우, 생체 내 지속성이 우수한 효과를 가진다.
본 발명에서는, 생리활성 폴리펩타이드 및 FcRn 결합 영역을 포함하는 면역글로불린 Fc 영역을 비펩타이드성 링커로 공유결합적으로 연결시키는 경우, 결합체 형태가 되어도, FcRn에 대한 면역글로불린 Fc 단편의 고유 결합력이 유지되어, 세포 내 리싸이클링이 원활히 일어나 체내 반감기를 증대시킬 수 있음을 확인하였다. 특히, 비펩타이드성 링커가 면역글로불린 Fc 단편의 FcRn 결합영역 이외에 결합하는 경우, FcRn 결합력을 저하시키지 않으며, 비펩타이드성 중합체가 폴리에틸렌글리콜인 경우, 특별히 이에 제한되지 않으나, -[O-CH2-CH2]n-에서 n이 10 이상, 구체적으로 10 내지 2400, 보다 구체적으로 10 내지 480이며, 더욱 구체적으로 50 내지 250이나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로 10 내지 2400, 보다 구체적으로 50 내지 2400인 경우, 생리활성 폴리펩타이드 및 Fc 영역의 생리활성 기능 및 FcRn 결합 기능 각각에 영향을 미치지 않음을 확인하였다. 본 발명은 이러한 특징에 기초한 것이다.
본 발명에서 용어, "생리활성 폴리펩타이드-면역글로불린 Fc 단편의 결합체"는 생리활성 폴리펩타이드 및 FcRn 결합 영역을 포함한 면역글로불린 Fc 단편이 비펩타이드성 링커를 통하여 공유결합적으로 연결된 결합체로서, pH 6.0에서의 FcRn에 대한 결합량 및 pH 7.4에서의 FcRn에 대한 결합량을 상기 수학식 1에 대입하여 산출하였을 때, 그 값이 면역글로불린 Fc 단편의 값에 대하여 ±6.0% 범위를 나타내는 것을 특징으로 한다.
상기 결합체에서, 비펩타이드성 링커는 면역글로불린 Fc 단편 중 FcRn 결합 영역, 예컨대 CH2의 252~257, 307~311 그리고 CH3 433~436(이상 kabat numbering) 영역으로부터 떨어진 아미노산의 잔기에 결합된 것일 수 있으며, 바람직하게는 면역글로불린 Fc의 N-말단 또는 C-말단, 더욱 바람직하게는 N-말단에 본 발명의 비펩타이드성 링커가 연결된 형태이나, 이에 제한되지 않는다.
면역글로불린 Fc의 N-말단 또는 C-말단에 본 발명의 비펩타이드성 링커가 결합하면, FcRn에 대한 결합력을 거의 감소시키지 않아, 면역글로불린 Fc 단편 고유의 FcRn에 대한 결합력을 결합체 형태에서도 유지시킬 수 있다.
본 발명에서 용어, "비펩타이드성 링커"는 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체 적합성 중합체를 의미하며, 상기 반복 단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결된다. 이와 같은 비펩타이드성 링커는 양 말단 또는 세 말단을 가질 수 있다.
본 발명에 사용가능한 비펩타이드성 링커는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, PLA(폴리락트산, polylactic acid) 및 PLGA(폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성 된 군으로부터 선택될 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜이며, 그 예로 하기 화학식 1로 표시되는 폴리에틸렌글리콜 중합체이나, 이에 제한되지 않는다.
[화학식 1]
여기서, n= 10 내지 2400이며,
바람직하게는 n= 10 내지 480이며,
더욱 바람직하게는 n = 50 내지 250이나, 이에 제한되지 않는다.
한편, 상기 화학식 1로 표시되는 폴리에틸렌글리콜과 대응되는 분자량을 가지는 다른 비펩타이드성 링커도 본 발명의 범주에 포함된다.
또한, 당 분야에 이미 알려진 이들의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 비펩타이드성 링커의 유도체들도 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명에서 비펩타이드성 링커로 사용되는 폴리에틸렌글리콜은, 양쪽에 결합된 생리활성 폴리펩타이드와 면역글로불린 Fc 단편 간에 공간 장애를 가져오지 않아, 생리활성 폴리펩타이드의 생리적 활성 유지 및 면역글로불린 Fc 단편의 FcRn 결합력 유지 효과를 모두 가져올 수 있는 이점이 있다.
기존 인프레임 퓨전(inframe fusion) 방법으로 제조된 융합 단백질에서 사용된 펩타이드성 링커의 경우, 생체 내에서 단백질분해효소에 의해 쉽게 절단되어 캐리어에 의한 활성 약물의 혈중반감기 증가 효과를 기대만큼 얻을 수 없는 단점이 있으며, 본 발명의 비펩타이드 링커를 이용한 결합체는 이와 같은 단점을 획기적으로 극복하였다. 비펩타이드 링커는 단백질분해효소에 저항성 있는 중합체를 사용하여 캐리어와 유사하게 펩타이드의 혈중반감기를 유지할 수 있다. 그러므로, 본 발명에서 사용될 수 있는 비펩타이드성 링커는 상기와 같은 역할, 즉 생체 내 단백질분해효소에 저항성이 있는 중합체이면 제한없이 사용될 수 있다.
또한, 상기 면역글로불린 Fc 단편과 결합되는 본 발명의 비펩타이드성 링커는 한 종류의 중합체뿐만 아니라 상이한 종류의 중합체들의 조합이 사용될 수도 있다.
본 발명에 사용되는 비펩타이드성 링커는 면역글로불린 Fc 단편 및 생리활성 폴리펩타이드와 결합될 수 있는 반응기를 가진다.
상기 비펩타이드성 중합체의 양 말단 반응기는 반응 알데히드 그룹, 프로피온 알데히드 그룹, 부틸 알데히드 그룹, 말레이미드(maleimide) 그룹 및 석시니미드(succinimide) 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 상기에서, 석시니미드 유도체로는 석시니미딜 프로피오네이트, 히드록시 석시니미딜, 석시니미딜 카르복시메틸 또는 석시니미딜 카보네이트가 이용될 수 있다. 특히, 상기 비펩타이드성 링커가 양 말단에 반응 알데히드 그룹의 반응기를 갖는 경우, 비특이적 반응을 최소화하고, 비펩타이드성 링커의 양 말단에서 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린과 각각 결합하는데 효과적이다. 알데히드 결합에 의한 환원성 알킬화로 생성된 최종 산물은 아미드 결합으로 연결된 것보다 훨씬 안정적이다. 알데히드 반응기는 낮은 pH에서 N-말단에 선택적으로 반응하며, 높은 pH, 예를 들어 pH 9.0 조건에서는 라이신 잔기와 공유결합을 형성할 수 있다. 여기서, 비펩타이드성 링커는 자체적으로 두 개 이상의 알데히드기를 포함한 것이거나, 두 개 이상의 알코올기가 알데히드를 포함하는 작용기로 치환된 것일 수 있다.
상기 비펩타이드성 링커의 양 말단 반응기는 서로 같거나 다를 수 있다. 예를 들어, 한쪽 말단에는 말레이미드 그룹을, 다른 쪽 말단에는 알데히드 그룹, 프로피온 알데히드 그룹, 또는 부틸 알데히드 등의 알킬 알데히드 그룹을 가질 수 있다. 양쪽 말단에 히드록시 반응기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 비펩타이드성 링커로 이용하는 경우에는 공지의 화학반응에 의해 상기 히드록시기를 상기 다양한 반응기로 활성화하거나, 상업적으로 입수 가능한 변형된 반응기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 본 발명의 결합체를 제조할 수 있다.
본 발명에서 용어, "생리활성 폴리펩타이드"는 생체 내에서 어떤 생리작용을 가지는 폴리펩타이드를 총칭하는 개념으로서, 폴리펩타이드 구조를 가진다는 공통점을 가지며, 다양한 생리활성을 가진다. 상기 생리활성 폴리펩타이드는 유전표현과 생리기능을 조정하여 생체 내에서 기능조절에 관여하는 물질의 결핍이나 과도한 분비에 의해 비정상적인 병태를 보일 때 이를 바로잡아 주는 역할을 하는 것을 포함하며, 일반적인 단백질 치료제 역시 포함할 수 있다. 또한, 상기 생리활성 폴리펩타이드는 천연형 폴리펩타이드 외에도 이의 유도체도 모두 포함하는 개념이다.
본 발명의 결합체에서, 생리활성 폴리펩타이드는 본 발명의 결합체 구조를 통하여 혈중 반감기 증대를 나타낼 수 있는 생리활성 폴리펩타이드라면 특별히 그 종류 및 크기에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 대표적인 생리활성 폴리펩타이드의 예로서, 인슐린, 인터페론, 인간 성장 호르몬 및 GLP-1 작용제의 다양한 생리활성 폴리펩타이드를 이용하여 결합체를 제조하였으며, 상기 폴리펩타이드의 종류 및 크기에 관계없이 면역글로불린 Fc 단편 자체의 FcRn에 대한 고유 결합력을 여전히 유지시킬 수 있음을 확인하였다.
생리활성 폴리펩타이드는 글루카곤 유사 펩타이드-1(GLP-1), 호중구 증가 인자(G-CSF), 인간 성장 호르몬(hGH), 에리스로포이에틴(EPO), 글루카곤, 옥신토모듈린, 인슐린, 성장 호르몬 방출 호르몬, 성장 호르몬 방출 펩타이드, 인터페론, 인터페론 수용체, 지프로테인 관련수용체(G protein-coupled receptor), 인터루킨, 인터루킨 수용체, 효소류, 인터루킨 결합 단백질, 사이토카인 결합 단백질, 마크로파지 활성인자, 마크로파지 펩타이드, B 세포인자, T 세포인자, 단백질 A, 알러지 억제인자, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사인자, 종양 억제인자, 전이 성장인자, 알파-1 안티트립신, 알부민, α-락트알부민, 아포리포단백질-E, 고 당쇄화 적혈구 생성인자, 안지오포에이틴류, 헤모글로빈, 트롬빈, 트롬빈 수용체 활성 펩타이드, 트롬보모듈린, 혈액인자 Ⅶ, Ⅶa, Ⅷ, Ⅸ, 및 XIII, 플라즈미노젠 활성인자, 피브린-결합 펩타이드, 유로키나제, 스트렙토키나제, 히루딘, 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라게나제 억제제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 렙틴, 혈소판 유래 성장인자, 상피세포 성장인자, 표피세포 성장인자, 안지오스타틴, 안지오텐신, 골 형성 성장인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 아트리오펩틴, 연골 유도인자, 엘카토닌, 결합조직 활성인자, 조직인자 경로 억제제, 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장인자, 부갑상선 호르몬, 릴랙신, 씨크레틴, 소마토메딘, 인슐린 유사 성장인자, 부신피질 호르몬, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩타이드, 가스트린 방출 펩타이드, 코티코트로핀 방출인자, 갑상선 자극호르몬, 오토탁신, 락토페린, 미오스타틴, 세포표면항원, 바이러스 유래 백신 항원, 단일클론 항체, 다중클론 항체 및 항체 단편로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 기술된 생리활성 폴리펩타이드들은 천연형 형태의 생리활성 폴리펩타이드 뿐만 아니라, 각 폴리펩타이드의 작용제, 전구물질, 유도체, 단편 또는 변이체를 모두 포괄하는 개념이다. 여기서, 옥신토모듈린 유도체의 예는 한국공개특허 제10-2012-0137271호에 개시된 것을 모두 포함하며, 인슐린 분비 펩타이드 유도체의 예에 대해서는 한국공개특허 제10-2009-0008151호에 개시된 것 역시 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, "면역글로불린 Fc 단편"은, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역, 중쇄 불변영역 1(CH1)과 경쇄 불변영역(CL1)을 제외한, 중쇄 불변영역을 의미한다. 다만, 상기 Fc 단편은 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 부분을 포함하기도 한다. 본 발명에서 상기 면역글로불린 Fc 단편은, 면역글로불린 Fc 단편의 FcRn에 대한 결합력을 유지하여야 하므로, CH2 도메인, CH3 도메인, 또는 둘 다를 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 단편은 생리활성 폴리펩타이드와 비펩타이드성 링커와 서로 연결되어도, 고유의 FcRn 결합력을 유지하는 한, 면역 글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄불변영역 1(CL1)을 포함하는 확장된 Fc 단편일 수 있다.
이러한 면역글로불린 Fc 단편은 생체 내에서 대사되는 생분해성의 폴리펩타이드이기 때문에, 약물의 캐리어로 사용하기에 안전하다. 또한, 면역글로불린 Fc 단편은 면역글로불린 전체 분자에 비해 상대적으로 분자량이 작기 때문에 결합체의 제조, 정제 및 수율 면에서 유리할 뿐만 아니라, 아미노산 서열이 항체마다 다르기 때문에 높은 비균질성을 나타내는 Fab 부분이 제거되어 물질의 동질성이 크게 증가되고 혈중 항원성의 유발 가능성도 낮아지게 되는 효과도 기대할 수 있다
본 발명에서, 상기 면역글로불린 Fc 단편은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열 변이체(mutant)를 포함한다. 아미노산 서열 변이체란 천연 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다. 예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다.
또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 변이체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC(antibody dependent cell mediated cytotoxicity) 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 단편의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제WO 97/34631호, 국제특허공개 제96/32478호 등에 개시되어 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York,197 9). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화 (acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation) 및 아밀화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
상기 기술한 Fc 변이체는 본 발명의 Fc 단편과 동일한 생물학적 활성을 나타내나 Fc 단편의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 변이체다.
또한, 이러한 Fc 단편은 인간 및 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체 일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 얻을 수 있다. 파파인을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다.
바람직하게는 인간 유래의 Fc 단편을 미생물로부터 수득한 재조합형 면역글로불린 Fc 단편이다.
또한, 면역글로불린 Fc 단편은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, Fc에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc 단편은 보체(c1q)의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 단편이라 할 것이다.
본 발명에서 "당쇄의 제거(Deglycosylation)"는 효소로 당을 제거한 Fc 단편을 말하며, "비당쇄화(Aglycosylation)"는 원핵동물, 바람직하게는 대장균에서 생산하여 당쇄화되지 않은 Fc 단편을 의미한다.
한편, 면역글로불린 Fc 단편은 인간 또는 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물기원일 수 있으며, 바람직하게는 인간기원이다. 또한, 면역글로불린 Fc 단편은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 Fc 단편일 수 있다. 바람직하게는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM 유래이며 가장 바람직하게는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래이다.
한편, 본 발명에서 "조합(combination)"은 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 Fc 단편을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.
본 발명에서 "하이브리드(hybrid)"는 단쇄의 면역글로불린 Fc 단편 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 Fc 단편에 해당하는 서열이 존재함을 의미하는 용어이다. 본 발명의 경우 여러 형태의 하이브리드가 가능하다. 즉, IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc 및 IgD Fc의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하며, 힌지를 포함할 수 있다.
한편, IgG 역시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 서브클래스로 나눌 수 있고 본 발명에서는 이들의 조합 또는 이들의 혼성화도 가능하다. 바람직하게는 IgG2 및 IgG4 서브클래스이며, 가장 바람직하게는 보체 의존적 독성(CDC, complementdependent cytotoxicity)과 같은 이펙터 기능(effector function)이 거의 없는 IgG4의 Fc 단편이다. 즉, 가장 바람직한 본 발명의 약물의 캐리어용 면역글로불린 Fc 단편은, 인간 IgG4 유래의 비당쇄화된 Fc 단편이다. 인간 유래의 Fc 단편은 인간 생체에서 항원으로 작용하여 이에 대한 새로운 항체를 생성하는 등의 바람직하지 않은 면역 반응을 일으킬 수 있는 비인간 유래의 Fc 단편에 비하여 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에서는 인슐린, 인터페론, 인간성장호르몬 및 GLP-1 작용제 각각을 FcRn 결합 능력을 가지는 면역글로불린 Fc 단편과 비펩타이드성 중합체와 연결하여, 결합체로서, 면역글로불린 Fc 단편 고유의 FcRn에 대한 결합력을 유지시키고, 중성의 pH에서 FcRn으로부터 용이하게 해리되며 면역글로불린 Fc 단편과 유사한 해리 정도를 나타낼 수 있는 결합체를 제조하였다(실시예, 도 2 및 3). 또한, 본 발명의 결합체가 인프레임 결합체에 비하여 체내 지속성이 우수함을 확인하였다(도 4).
본 발명은 또 하나의 양태로서 (a) FcRn 결합 영역을 포함하는 면역글로불린 Fc 단편 및 생리활성 폴리펩타이드를 비펩타이드성 링커를 통하여 서로 연결하여, 생리활성 폴리펩타이드-면역글로불린 Fc 단편의 결합체의 혼합물을 제조하는 단계; 및 (b) pH 6.0에서의 FcRn에 대한 결합량(binding amount at pH 6.0) 및 pH 7.4에서의 FcRn에 대한 결합량(binding amount at pH 7.4)을 하기 수학식 1에 대입하여 결합비율 값을 산출하였을 때, 상기 생리활성 폴리펩타이드-면역글로불린 Fc 단편의 결합체의 해당 결합비율 값이 면역글로불린 Fc 단편의 결합비율 값 ± 6.0% 범위 내인 결합체를 분리하는 단계를 포함하여, 면역글로불린 Fc 단편의 FcRn에 대한 고유한 결합력을 유지하는, 생리활성 폴리펩타이드-면역글로불린 Fc 단편 결합체의 제조 방법을 제공한다.
[수학식 1]
상기 생리활성 폴리펩타이드, 면역글로불린 Fc 단편, 비펩타이드성 링커,결합체 및 상기 결합비율 값의 산출에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명의 방법에서 상기 (a) 단계는 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 단편을 비펩타이드성 링커를 통하여 공유결합적으로 서로 연결하는 단계이다. (a) 단계는, (i) 생리활성 폴리펩타이드 또는 면역글로불린 Fc 단편 중 어느 하나를 먼저 비펩타이드성 링커의 한 말단의 반응기에 연결하는 단계 및 (ii) 비펩타이드성 링커의 다른 말단의 반응기에 나머지 하나를 연결하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 (i) 및 (ii) 단계 사이에, 추가로 비펩타이드성 링커의 한 말단에 생리활성 폴리펩타이드 또는 면역글로불린 Fc 단편이 결합된 것을 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 결합체 제조에 있어서,대한민국 등록특허 제10-0725315호는 본 발명의 참고자료로서 포함될 수 있다.
이때, 생리활성 폴리펩타이드가 비펩타이드성 링커를 통하여 면역글로불린 Fc 단편 중 FcRn 결합 영역 이외의 부분에 연결되기 위하여, 비펩타이드성 링커가 연결된 생리활성 폴리펩타이드와 면역글로불린 Fc 단편을 pH 4.0~9.0에서 반응시킬 수 있다.
이러한 과정을 통하여 결합체를 제조하는 경우에는, 면역글로불린 Fc 단편의 FcRn에 대한 고유한 결합력을 유지하는, 결합체 외에도 면역글로불린 Fc 단편의 FcRn에 대한 결합력이 저해된 결합체 등의 부산물이 발생할 수 있다. 따라서, 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린 Fc 단편을 비펩타이드성 링커를 통하여 연결하는 반응 후에, 이들 혼합물로부터 면역글로불린 Fc 단편의 FcRn에 대한 고유한 결합력을 유지하는, 생리활성 폴리펩타이드-면역글로불린 Fc 단편 결합체를 분리하는 과정이 추가로 필요하다.
따라서, 본 발명의 방법은, (b) pH 6.0에서의 FcRn에 대한 결합량(binding amount at pH 6.0) 및 pH 7.4에서의 FcRn에 대한 결합량(binding amount at pH 7.4)을 상기 수학식 1에 대입하여 결합 비율 값을 산출하였을 때, 상기 생리활성 폴리펩타이드-면역글로불린 Fc 단편의 결합체의 해당 결합비율 값이 면역글로불린 Fc 단편의 결합비율 값 ± 6.0% 범위 내인 결합체를 분리하는 단계를 포함한다.
여기서, (b) 단계는 바람직하게는, 비펩타이드성 링커가 면역글로불린 Fc 단편 중 FcRn 결합 영역, 예컨대 CH2의 252~257, 307~311 그리고 CH3 433~436(이상 cobat numbering) 영역으로부터 떨어진 아미노산의 잔기에 결합된 결합체를 분리하기 위한 것으로서, 상기 면역글로불린 Fc 단편의 N-말단에 비펩타이드성 링커가 결합되어, Fc 단편의 고유한 FcRn 결합능이 유지된 결합체만을 특이적으로 분리하기 위한 과정이다.
이때, 사용되는 비펩타이드성 링커, 생리활성 폴리펩타이드 등의 종류에 따라 분리 정제 조건은 달라질 수 있다.
본 발명의 또 하나의 양태로서 생리활성 폴리펩타이드 및 FcRn 결합 영역을 포함하는 면역글로불린 Fc 단편을 비펩타이드성 링커를 통하여 연결시키는 단계를 포함하는, 생리활성 폴리펩타이드-면역글로불린 Fc 단편 결합체의 FcRn에 대한 고유 결합력을 유지시키는 방법을 제공한다.
상기 생리활성 폴리펩타이드, 면역글로불린 Fc 단편, 비펩타이드성 링커 및 결합체에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명은, 생리활성 폴리펩타이드 및 FcRn 결합 영역을 포함하는 면역글로불린 Fc 단편을 비펩타이드성 링커로 연결시켜, 면역글로불린 Fc 단편의 고유의 FcRn 결합력을 유지시키면서도 중성의 pH에서는 FcRn과 용이하게 해리되어 리싸이클링이 원활히 일어나, 체내 반감기가 효과적으로 증대될 수 있는 이점을 가진다.
이때, 고유 결합력의 유지는 in vivo에서 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명의 또 하나의 양태로서 생리활성 폴리펩타이드-면역글로불린 Fc 단편의 결합체를 포함하며, 면역글로불린 Fc 단편의 FcRn에 대한 고유 결합력이 유지된 것을 특징으로 하는, 조성물을 제공한다.
상기 생리활성 폴리펩타이드, 면역글로불린 Fc 단편, 및 결합체에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
이하, 하기 예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예: FcRn 결합 부위를 포함하는 면역글로불린 Fc 단편 및 생리활성단백질의 결합체의 제조
(1) 면역글로불린 Fc 단편 제조
본 발명자가 기출원하였던 대한민국 출원번호 제10-2006-0077377호 '메티오닌 잔기가 제거된 면역글로불린 Ｆc 영역의 대량 생산방법'에 따라 면역글로불린 Fc 단편을 제조하였다.
(2) 인슐린-결합체 제조
3.4 kDa 프로피온(propion)-ALD2 PEG(IDB, 한국)를 인슐린 베타 체인의 N-말단에 특이적으로 페길화(PEGylation)시키기 위하여 반응시켰다. 반응액은 양이온 교환 컬럼을 사용하여 정제하였다. 인슐린 결합체의 제조를 위해, 정제된 모노 페길화된 인슐린과 면역글로불린 Fc 반응시켰다. 이때 반응은 면역글로불린 Fc의 N 말단에 특이적으로 보내기 위하여 pH 6.0~8.2에서 수행되었다. 반응 종결된 후 반응액은 음이온 교환 컬럼을 사용하여 1차 정제한 후 소수성 컬럼을 사용하여 2차 정제하여 위치 특이적으로 연결된 인슐린-결합체를 얻었다.
(3) 인터페론-결합체 제조
3.4 kDa 프로피온-ALD2 PEG(IDB. 한국)를 인간 인터페론 알파-2b(hIFNα-2b, 분자량 19 kDa)가 용해된 완충용액에 첨가하여 반응시켰다. 인터페론 알파의 아미노 말단 부위에 선택적으로 PEG가 연결되고, PEG와 인터페론 알파가 1:1로 결합된 연결체를 얻기 위하여 상기 반응 혼합물을 음이온 교환 컬럼을 실시하여 모노페길화된 인터페론(mono-PEGylated IFNα-2b)를 정제하였다. 정제된 모노페길화된 인터페론을 면역글로불린 Fc의 N 말단에 특이적으로 보내기 위하여 pH 5.5~6.5 조건에서 반응하였다. 결합반응 후 생성된 인터페론-결합체를 정제하기 위하여 반응 혼합물을 음이온 교환 컬럼에 통과시켜 인터페론-결합체 분획을 얻었다. 추가로 소수성 컬럼을 수행하여 최종적으로 위치 특이적으로 연결된 인터페론-결합체를 최종 정제하였다.
(4) 인성장호르몬-결합체 제조
3.4 kDa 프로피온-ALD2 PEG(IDB. 한국)를 인성장호르몬(hGH, 분자량 22 kDa)이 용해된 완충용액에 첨가하여 반응하였다. 인성장호르몬의 아미노 말단 부위에 선택적으로 PEG가 연결되고, PEG와 인성장호르몬이 1:1로 결합된 연결체를 얻기 위하여 상기 반응 혼합물을 음이온 교환 컬럼을 실시하여 모노 페길화된 인성장호르몬(mono-PEGylated hGH)을 정제하였다. 정제된 모노 페길화된 인성장호르몬에 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단에 특이적으로 결합시키기 위하여 N 말단에 특이적으로 보내기 위하여 pH 5.5~6.5에서 반응하였다. 결합반응 후 반응 혼합물을 음이온 교환 컬럼을 수행하여 최종적으로 위치 특이적으로 인성장호르몬-결합체 분획을 정제하였다.
(5) GLP-1R 작용제-결합체 제조
3.4 kDa 프로피온-ALD2 PEG(IDB. 한국)를 이미다조-아세틸 엑센딘-4(CA 엑센딘-4, Bachem, 스위스)의 라이신(Lysine)과 위치특이적으로 반응시킨 후, PEG와 GLP-1R 작용제가 1:1로 결합된 연결체를 얻기 위하여 상기 반응 혼합물을 양이온 교환 컬럼을 실시하여 모노페길화된(mono-PEGylated) 엑센딘-4를 정제하였다. 면역글로블린 Fc의 N 말단과 특이적으로 모노페길화된 엑센딘-4가 연결된 GLP-1R 작용제-결합체를 제조하기 위하여 pH 5.0~8.2 조건에서 반응하였다. 커플링 반응 후 소수성 컬럼과 음이온교환 컬럼을 이용한 2단계 정제방법을 사용하여 최종적으로 위치특이적으로 결합된 GLP-1R 작용제-결합체를 정제하였다.
비교예: 인프레임 GLP-1R 작용제-면역글로불린 단편 결합체의 제조
본 발명의 결합체에 대한 비교예로서, GLP-1R 작용제와 약50 kDa의 FcRn 부위를 포함하는 면역글로불린 Fc를, 링커 없이 유전자 재조합 방법으로 융합 단백질 형태로 제조하였다. 인프레임 GLP-1R 작용제-면역글로불린 Fc 결합체는 친화성 컬럼을 사용하여 배양액으로부터 정제하였다.
실험예 1: FcRn에 대한 결합력 평가
엔도사이토시스(endocytosis)를 통하여 세포 내로 유입된 단백질 중 FcRn 결합 부위를 가지고 있는 단백질은 산성 pH에서 FcRn과 결합하게 되며, 유입된 단백질 중 FcRn에 결합하지 않은 단백질은 리소좀 분해(lysosomal degradation)를 통해 제거되게 된다. 여기서, FcRn에 결합한 단백질은, 중성 pH에서 해리되면 다시 세포 표면에 배출되게 되며, 반면 해리되지 못한 FcRn 결합 단백질은 리소좀 분해를 거치게 된다. 이러한 메커니즘을 도 1에 나타내었다.
따라서, 생리활성 단백질에 FcRn 결합부위를 포함하는 면역글로불린 Fc를 비펩타이드성 링커를 통해 연결한, 실시예의 결합체가 면역글로불린 Fc 단독의 FcRn에 대한 결합력을 그대로 유지하는지, 또한 중성 pH에서 용이하게 해리되어 혈중으로 배출될 수 있는지를 하기 실험을 통하여 확인하였다.
구체적으로, 면역글로불린 단편의 FcRn에 대한 결합력이 본 발명의 결합체를 형성하여도 변화가 없음을 확인하기 위해 SPR(surface Plasmon resonance, BIACORE 3000)을 이용하여 FcRn과 실시예 또는 비교예의 결합체 간의 결합력을 확인하였다. FcRn은 Sino Biological Inc에서 구매한 인간 FCGRT&B2M의 이량체(dimer) 형태의 수용체를 사용하였다. FcRn을 CM5칩에 아민 결합법을 이용하여 고정화시킨 후, 100nM 내지 12.5nM 사이의 농도로 결합체를 흘려 그 결합력을 확인하였다. 단, 이 FcRn를 매개로 하는 반감기 증가 메커니즘은 pH에 의존하기 때문에 중성과 산성에 대한 실험을 각각 진행하였다.
(1) 산성 pH에서의 FcRn에 대한 면역글로불린 단백질 결합체의 결합력 측정
엔도사이토시스된 단백질의 FcRn 결합은 산성 pH에서 일어나므로 이를 재현하기 위해 pH 6.0의 인산버퍼(phosphate buffer)를 기본버퍼-1(running buffer-1)로 사용하였다. 모든 면역글로불린 단편-단백질 결합체들은 이 기본버퍼-1로 희석하여 결합을 유도하고 해리 또한 기본버퍼-1로 진행하였다. 칩에 고정화된 FcRn에 면역글로불린 단편-단백질 결합체를 4분간 흘려 결합을 유도한 후, 6분간 해리 과정을 거쳤다. 그 후, 다른 농도의 면역글로불린 단편-단백질 결합체들을 결합시키기 위하여 FcRn과 결합되어 있는 면역글로불린 단편-단백질 결합체에 pH 7.4의 헤페스 버퍼(HBS-EP)를 약 30초간 흘려주었다. 산성에서의 FcRn과 면역글로불린 단편-단백질 결합체 결합력은 BIAevaluation 프로그램의 1:1 Langmuir binding with drifting baseline model을 이용하여 분석하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
(2) 중성 pH에서의 FcRn에 대한 면역글로불린 단편-단백질의 결합체의 결합력 측정
FcRn에 결합 후 세포 밖으로의 배출은 산성 pH에서 중성 pH 바뀌면서 이루어지기 때문에 이를 재현하기 위해 기본버퍼로 헤페스버퍼(pH 7.4, 기본버퍼-2)를 사용하였다. 단, FcRn과 면역글로불린 단편-단백질의 결합체 간의 결합은 기본버퍼-1로 면역글로불린 단편-단백질의 결합체를 희석하여 4분간 결합을 유도하였으며, 그 후 FcRn에서 면역글로불린 단편-단백질의 결합체의 해리 과정은 동일한 기본버퍼-2를 사용하여 1분간 흘려주어 센서그람을 확인하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 이때 FcRn으로부터 면역글로불린 단편-단백질의 결합체의 해리 정도를 결합비율(%)로 표시하였으며 이는 다음과 같은 수학식 1을 따른다. 여기서, pH 6.0의 시료 주입이 완료되기 2초 전에 측정한 공명 단위를 pH 6.0에서의 결합량에 비례하는 물리량으로, pH 7.4 해리 단계(dissociation)에 들어간 후 10초 후 측정한 공명 단위를 pH 7.4에서의 결합량에 비례하는 물리량으로 택하여 결합 비율을 산정하였다.
[수학식 1]
여기서, "결합비율"은 FcRn으로부터 면역글로불린 단편-단백질의 결합체가 얼마나 용이하게 해리가 되는가를 의미한다. 이 숫자가 작으면 작을수록 중성에서의 해리가 좋고, FcRn을 매개로 한 리사이클링이 잘 이루어짐을 예상할 수 있으며, 반대로 이의 숫자가 클수록 중성에서의 해리가 좋지 않아 FcRn에 붙어 엔도사이토시스가 되었더라도 리소좀 분해 과정을 통해 제거될 가능성이 크다는 것을 예상할 수 있다.
그 결과, 도 2 및 3에 나타낸 바와 같이, 실시예의 다양한 면역글로불린 단편-단백질의 결합체들은 농도 의존적으로 FcRn에 결합하는 결과를 나타내었다. 또한, 상기 결과를 하기 표 1에 다시 나타내었으며, 수학식 1로 산출한 실시예의 결합체들의 해리 정도를 표2에 나타내었다.
| 시험물질 | pH 6.0 | ||
|
ka
(1/ Ms , X10 5 ) |
kd
(1/s, X10 -3 ) |
K
D
( nM ) |
|
| 면역글로불린 단편 | 4.8 | 10.5 | 22.0 ± 3.0 |
| 인슐린-결합체 | 3.1 | 7.1 | 22.6 ± 3.9 |
| 인터페론-결합체 | 3.0 | 9.3 | 30.0 ± 4.8 |
| 인성장호르몬-결합체 | 1.2 | 3.6 | 26.8 ± 9.0 |
| GLP-1R 작용제-결합체 | 3.8 | 9.5 | 24.7 ± 5.5 |
| 인프레임 GLP-1R 작용제-면역글로불린 단편 결합체 | 3.2 | 5.3 | 17.0 ± 3.7 |
*ka: 결합상수(association rate constant), kd: 해리상수(dissociation rate constant), KD:친화상수(affinity constant), 결합비율: pH를 6.0에서 7.4로 전환하였을 때, pH 7.4에서의 결합량을 pH 6.0에서의 결합량으로 나눈 후 100을 곱한 값
| 시험물질 | 농도 ( nM ) | pH6 .0에서의 결합량 ( RU ) | pH7 .4에서의 결합량 ( RU ) | 결합 비율 (%) |
평균
결합 비율 (%) |
| 면역글로불린 단편 | 100 | 163.7 | 4.8 | 2.9 | 5.4 ± 2.0 |
| 50 | 137.4 | 6.5 | 4.7 | ||
| 25 | 110.9 | 7.4 | 6.6 | ||
| 12.5 | 88.0 | 6.5 | 7.3 | ||
| 인슐린-결합체 | 100 | 214.1 | 4.8 | 2.2 | 5.0 ± 2.2 |
| 50 | 174.3 | 8.0 | 4.6 | ||
| 25 | 143.9 | 8.4 | 5.9 | ||
| 12.5 | 106.6 | 7.9 | 7.4 | ||
| 인터페론-결합체 | 100 | 196.9 | 6.4 | 3.2 | 5.0 ± 1.6 |
| 50 | 157.2 | 6.7 | 4.3 | ||
| 25 | 120.3 | 6.7 | 5.6 | ||
| 12.5 | 91.3 | 6.4 | 7.0 | ||
| 인성장호르몬-결합체 | 100 | 205.7 | 8.2 | 4.0 | 6.6 ± 2.6 |
| 50 | 153.0 | 7.7 | 5.1 | ||
| 25 | 111.9 | 8.3 | 7.4 | ||
| 12.5 | 82.9 | 8.1 | 9.8 | ||
| GLP-1R 작용제-결합체 | 100 | 163.5 | 6.2 | 3.8 | 6.6 ± 2.6 |
| 50 | 135.5 | 8.1 | 5.9 | ||
| 25 | 107.7 | 7.2 | 6.7 | ||
| 12.5 | 86.2 | 8.6 | 10.0 | ||
| 인프레임 GLP-1R 작용제-면역글로불린 단편 결합체 | 100 | 301.7 | 38.2 | 12.7 | 12.7 ± 0.3 |
| 50 | 249.5 | 31.2 | 12.5 | ||
| 25 | 197.6 | 25.9 | 13.1 | ||
| 12.5 | 148.7 | 18.6 | 12.5 |
상기 표 1과 표 2에 나타낸 바와 같이, 면역글로불린 단편 단독(치료용 단백질이 결합되어 있지 않은 독립 Fc)과 본 발명의 결합체를 서로 비교하였을 때, 산성이나 중성에서 결합력에 대해 유의적인 차이는 보이지 않음을 확인하였다. 즉, 본 기술로 생산된 면역글로불린 단백질의 결합체는 면역글로불린이 생리활성단백질과 결합하더라도 면역글로불린 단편의 FcRn에 대한 결합 특성이 변하지 않았으며, 특히, 크기가 서로 다른 다양한 생리활성 단백질에 대해 결합체를 형성하여도 유사한 결과를 나타냄을 확인하였다. 반면, 비교예의 인프레임 GLP-1R 작용제-면역글로불린 단편 결합체의 경우, 결합비율 값이 높아 중성에서 적절히 해리될 수 없어 생리활성 단백질의 반감기를 연장하는 것에 있어 본 발명의 결합체에 비해 그 효과가 낮음을 나타내었다.
실험예 2: GLP-1R 작용제-결합체의 인 비보 약물 동태 비교시험
실시예 (5)의 GLP-1R 작용제-결합체와 인프레임 GLP-1R 작용제-면역글로불린 단편 결합체의 인 비보 약물동태를 비교하기 위하여 정상 SD 랫트를 이용하여 혈중 농도의 변화를 확인하였다.
구체적으로, 상기 동물에 GLP-1R 작용제-결합체(400 mcg/kg), 인프레임 GLP-1R 작용제-면역글로불린 단편 결합체(400 mcg/kg)를 2 mL/kg의 투여용량이 되도록 각 물질의 생리 식염수로 희석하여 피하 투여하였다. 그리고 상기 시험물질 투여 후 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216, 240, 288, 312 및 336 시간에 랫트의 경정맥에서 채혈하여 혈청으로 분리하였다. 이후 혈청 시료를 효소 면역법을 이용하여 약물의 농도를 정량하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
그 결과, GLP-1R 작용제-결합체와 인프레임 GLP-1R 작용제-면역글로불린 단편 결합체의 혈중 반감기는 각각 40.9 시간과 28 시간이었고 최대 혈청 농도는 1758.6 ng/mL과 742.7 ng/mL을 나타내었다. 즉, 동일 용량의 약물을 정상 랫트에 피하 투여하였을 때, 본 발명의 GLP-1R 작용제-결합체가 인프레임 GLP-1R 작용제-면역글로불린 단편 결합체보다 체내 흡수 및 지속성 측면에서 우수한 결과를 나타내었다(도 4).
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그 리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (20)
- 한 분자의 생리활성 폴리펩타이드가 비펩타이드성 링커를 통하여 FcRn 결합 영역을 포함한 면역글로불린 Fc 단편에 연결된, 생리활성 폴리펩타이드-면역글로불린 Fc 단편의 결합체로서, 상기 면역글로불린 Fc 단편은 비펩타이드성 중합체로 추가로 개질되지 않은 것이고,
상기 생리활성 폴리펩타이드-면역글로불린 Fc 단편의 결합체는, pH 6.0에서의 FcRn에 대한 결합량(binding amount at pH 6.0)과 pH 7.4에서의 FcRn에 대한 결합량(binding amount at pH 7.4)의 비율이 상기 결합체에 사용된 것과 동일한 종류의 면역글로불린 Fc 단편을 FcRn에 대하여 같은 조건에서 측정하였을 때 나타내는 비율의 ±6% 이내이며,
상기 면역글로불린 Fc 단편은 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하며,
상기 생리활성 폴리펩타이드는 인슐린, 인터페론, 인간 성장호르몬, 또는 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체 작용제 (GLP-1R 작용제)인, 결합체.
- 제1항에 있어서, 상기 생리활성 폴리펩타이드-면역글로불린 Fc 단편의 결합체는 하기 수학식 1의 결합비율이 상기 결합체에 사용된 것과 동일한 종류의 면역글로불린 Fc 단편의 해당 결합비율 값의 ±6% 내인 것이 특징인 결합체:
[수학식 1]
.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 결합체는 비펩타이드성 링커가 연결된 생리활성 폴리펩타이드와 면역글로불린 Fc 단편을 pH 4.0 내지 9.0에서 반응시켜, 생리활성 폴리펩타이드가 비펩타이드성 링커를 통하여 면역글로불린 Fc 단편 중 FcRn 결합 영역 이외의 부분에 연결시킨 것인, 결합체.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 비펩타이드성 링커는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 결합체.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 비펩타이드성 링커는 하기 화학식 1로 표시되는 폴리에틸렌글리콜인, 결합체.
[화학식 1]
여기서, n= 10 내지 2400이다.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 비펩타이드성 링커의 반응기는 알데히드 그룹, 프로피온알데히드 그룹, 부틸 알데히드 그룹, 말레이미드 그룹 및 석시니미드 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 결합체.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 GLP-1R 작용제는 데스아미노-히스티딜-엑센딘-4, 베타-히드록시 이미다조프로피오닐-엑센딘-4, 베타-카르복시 이미다조프로필-엑센딘-4, 디메틸-히스티딜-엑센딘-4, 또는 이미다조아세틸-엑센딘-4인, 결합체.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 면역글로불린 Fc 단편은 비당쇄화된 것인, 결합체.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 면역글로불린 Fc 단편은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, 이들의 조합(combination) 및 이들의 하이브리드(hybrid)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것에서 유래되는 것인, 결합체.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 면역글로불린 Fc 단편은 IgG4 Fc 단편인, 결합체.
- 제1항에 있어서,
상기 생리활성 폴리펩타이드-면역글로불린 Fc 단편의 결합체는, pH 6.0에서의 FcRn에 대한 결합량(binding amount at pH 6.0)과 pH 7.4에서의 FcRn에 대한 결합량(binding amount at pH 7.4)의 비율이 상기 결합체에 사용된 것과 동일한 종류의 면역글로불린 Fc 단편을 FcRn에 대하여 같은 조건에서 측정하였을 때 나타내는 비율의 ±4% 이내인, 결합체.
- (a) FcRn 결합 영역을 포함하는 면역글로불린 Fc 단편 및 생리활성 폴리펩타이드를 비펩타이드성 링커를 통하여 서로 연결하여, 생리활성 폴리펩타이드-면역글로불린 Fc 단편의 결합체의 혼합물을 제조하는 단계; 및
(b) pH 6.0에서의 FcRn에 대한 결합량(binding amount at pH 6.0) 및 pH 7.4에서의 FcRn에 대한 결합량(binding amount at pH 7.4)을 하기 수학식 1에 대입하여 결합비율 값을 산출하였을 때, 상기 생리활성 폴리펩타이드-면역글로불린 Fc 단편의 결합체의 해당 결합비율 값이 면역글로불린 Fc 단편의 결합비율 값 ± 6.0% 범위 내인 결합체를 분리하는 단계를 포함하여,
제1항 또는 제2항의 생리활성 폴리펩타이드-면역글로불린 Fc 단편 결합체의 제조 방법으로서, 상기 면역글로불린 Fc 단편은 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하며, 비펩타이드성 중합체로 추가로 개질되지 않은 것이며, 상기 생리활성 폴리펩타이드는 인슐린, 인터페론, 인간 성장호르몬, 또는 글루카곤 유사 펩타이드-1 수용체 작용제 (GLP-1R 작용제)인, 방법:
[수학식 1]
.
- 제14항에 있어서, 상기 (b) 단계는 결합체 분리 전에 수학식 1을 이용하여 결합체의 결합비율 값과 면역글로불린 Fc 단편의 결합비율 값을 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제14항에 있어서,
상기 비펩타이드성 링커는 하기 화학식 1로 표시되는 폴리에틸렌글리콜인, 방법.
[화학식 1]
여기서, n=10 내지 2400이다.
- 제14항에 있어서,
상기 (b) 단계에서 분리된 결합체는 비펩타이드성 링커가 면역글로불린 Fc 단편의 N-말단에 결합된 형태인 것인 방법.
- 삭제
- 제14항에 있어서,
상기 면역글로불린 Fc 단편은 비당쇄화된 것인, 방법.
- 제14항에 있어서,
상기 면역글로불린 Fc 단편은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, 이들의 조합(combination) 및 이들의 하이브리드(hybrid)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것에서 유래되는 것인, 방법.
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