KR20190114911A - 뇌 표적 지속형 치료학적 효소 결합체 - Google Patents

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KR20190114911A
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Abstract

본 발명은 면역글로불린 Fc 영역이 비펩타이드성 또는 펩타이드성 링커를 통하여 효소와 뇌 표적 펩타이드에 연결된 결합체, 이의 제조 방법 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

Description

뇌 표적 지속형 치료학적 효소 결합체 {Brain-targeted long-acting therapeutic enzyme conjugates}
본 발명은 뇌 표적 가능한 지속형 효소 결합체, 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
치료학적 효소류와 같은 단백질은 일반적으로 안정성이 낮아 쉽게 변성되고 혈액 내 단백질 가수분해효소에 의해 분해되어 혈중 농도 및 역가를 유지하기 위해서는 환자에게 자주 투여할 필요가 있다. 그러나 대부분 주사제 형태로 환자에게 투여되는 단백질 의약품의 경우, 활성 폴리펩타이드의 혈중 농도를 유지하기 위해 자주 주사를 놓는 것은 환자에게 엄청난 고통을 야기하게 된다. 이러한 문제점을 해결하기 위해, 치료학적 효소류의 혈중 안정성을 증가시키고 혈중 약물 농도를 오랫동안 높게 지속시켜 약효를 극대화하려는 노력이 계속되어 왔다. 이러한 치료학적 효소류의 지속성 제제는 치료학적 효소류의 안정성을 높이는 동시에 약물 자체의 역가가 충분히 높게 유지되어야 하고 환자에게 면역반응을 유발하지 않아야 한다.
특히, 헌터 증후군 (Hunter syndrome, 또는 Hunter disease)은 뮤코다당체침작증 Ⅱ (mucopolysaccharidosis Ⅱ, MPS Ⅱ) 이라고도 불리며, 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disease, LSD)의 일종이다. 상기 질환은 특정 효소의 유전적 결함으로 인해 생기는 병으로 사망에까지 이르는 치명적인 병이며, 결함이 있는 효소의 보충치료가 필수적이다 (Frances M. Platt et al., J Cell Biol. 2012 Nov 26;199(5):723-34).
효소 보충 치료는 리소좀 축적 질환에서 표준이 되는 치료로 부족한 효소를 보충하는 것을 통해 기존의 증상이 완화되거나 질환의 진행을 늦추는 효과를 볼 수 있다. 그러나 지속적으로 1-2주마다 2-6시간 동안 약물을 정맥으로 투여해야 된다는 점에서 환자 및 가족의 일상 생활이 제한 받을 수 있다.
더욱이 헌터 증후군의 치료에 사용되는 재조합 효소의 경우, 사람에서의 반감기는 짧게는 10분에서 3시간 미만으로 그 지속시간이 매우 짧아 평생 효소를 투여해야 하는 환자의 불편함을 야기 하고 있고, 생체 내 축적 위치가 상이한 문제점이 있다.
또한, 헌터 증후군을 포함한 많은 리소좀 축적 질환 환자들의 뉴런들 및 뇌척수막에서 글리코아미노글리칸 (glycoaminoglycans, GAG)이 많이 생성되는 경우가 종종 존재하고, 여러 형태의 신경계 증상들을 유발시킨다. 이러한 이유로 뇌로의 효과적인 치료 약제 전달의 필요성이 대두되고 있으나, 뇌로 약물을 전달하는 방법의 개발은 나머지 신체에 비하여 훨씬 느린 속도로 진행되고 있다. 이러한 느린 진행은 대부분의 약제가 뇌혈관 장벽(blood-brain barrier, BBB)을 형성하는 뇌 모세관 벽(brain capillary wall)을 통하여 뇌 내로 침투할 수 없는 상황에 상당 부분 기인한다. 뇌혈관 장벽(blood-brain barrier, BBB)이란 뇌혈관의 내피세포 간의 조밀한 연결(tight junction) 및 이를 더욱 강화하는 성상세포(astrocyte)로 이루어진 구조물로서, 혈관 내부의 물질이 혈관벽을 통과하여 뇌 실질 내로 쉽게 나오지 않게 해 주는 기능을 한다. 이런 이유로 뇌질환 치료제로 개발된 상당수의 약이 뇌혈관 장벽의 통과가 잘 이루어지지 않는 문제점을 갖고 있다. 거의 100%의 거대-분자 약제 및 98% 이상의 소형-분자 약제는 BBB를 통과하지 못한다. 극히 일부의 약제, 높은 지질 용해도 및 400-500 달톤(dalton) 이하의 분자량을 보유하는 소형 분자만이 BBB를 실제로 통과한다. 또한, BBB를 통과하는 소형 분자 중에서, 극히 일부만 약학적으로 유의한 양으로 BBB를 통과한다.
헌터 증후군 치료에 있어서 전통적인 요법으로는 이러한 리소좀 축적 질환들을 성공적으로 치료되지 못하고 있어, 뇌 표적과 동시에 지속형 치료제의 개발 필요성은 더욱 더 커지고 있는 상황이다.
본 발명의 하나의 목적은 치료학적 효소, 특히 이두로네이트 2-설파타제(iduronate-2-sulfatase)와 뇌 표적 펩타이드가 각각 독립적으로 면역글로불린 Fc 영역에 펩타이드성 링커 또는 비펩타이드성 링커로 연결된, 뇌 표적 지속형 효소 결합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 뇌 표적 지속형 효소 결합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 발현 벡터, 및 상기 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 뇌 표적 지속형 효소 결합체를 포함하는 조성물, 예컨대 리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 약제의 제조에 있어서 상기 뇌 표적 지속형 효소 결합체의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 뇌 표적 지속형 효소 결합체의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명을 구현하는 하나의 양태는 뇌 표적 지속형 효소 결합체이다.
하나의 구체예에서, 본 발명은 치료학적 효소와 뇌 표적 펩타이드가 각각 독립적으로 면역글로불린 Fc 영역에 펩타이드성 링커 또는 비펩타이드성 링커로 연결된, 뇌 표적 지속형 효소 결합체에 관한 것이다.
앞선 구체예에 따른 결합체로서, 상기 뇌 표적 지속형 효소 결합체는 하기 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 한다:
[화학식 1]
X-L1-F-L2-Y
여기에서,
X는 치료학적 효소며,
Y는 뇌 표적 펩타이드 (BTP)이고,
L1 및 L2는 각각 독립적으로 펩타이드성 링커 또는 비펩타이드성 링커이며,
L1 및 L2가 펩타이드성 링커일 때, 상기 펩타이드성 링커는 0개부터 1000개의 아미노산을 포함하며,
F는 FcRn 결합 부위를 포함하는 면역글로불린 불변 영역임.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 뇌 표적 펩타이드는 뇌 혈관 장벽을 통과 가능한 아미노산 서열을 가지는, 펩타이드, 단백질 또는 항체를 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 뇌 표적 펩타이드는 수동전달(passive transport)에 의한 경로 또는 수용체 매개 전달(receptor-mediated transport)에 의한 경로를 통해 뇌 혈관 장벽을 통과하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 수용체 매개 전달에 의한 경로는 인슐린 수용체(insulin receptor), 트랜스페린 수용체(transferrin receptor), 저밀도 지질단백질 수용체(low density lipoprotein receptor), 저밀도 지질단백질 수용체 관련 단백질(Low density lipoprotein receptor-related protein), 렙틴 수용체(leptin receptor), 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nicotinic acetylcholine receptor), 글루타티온 수송체(Glutathione transporter), 칼슘의존성 칼륨통로(calcium-activated potassium channel), 및 RAGE (receptor for advanced glycation endproducts), 및 상기 수용체들의 리간드 및 상기 수용체 또는 리간드에 결합하는 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 통하여 수용체 매개 전달 경로에 의해 뇌 혈관 장벽을 통과하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 F는 이량체 형태인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 L1은 F의 N-말단 영역에 연결되고, L2는 F의 C-말단 영역에 연결된 것 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 L1은 X의 N-말단 또는 C-말단에 연결되고, L2는 Y의 N-말단 또는 C-말단 영역에 연결된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 L1은 X의 N-말단 또는 C-말단에 연결되고, L2는 Y의 N-말단 영역에 연결된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 화학식 1의 F-L2-Y는 하기 화학식 2로 표시되는 구조인 것을 특징으로 한다:
[화학식 2]
Figure pat00001
여기에서,
Fa 및 Fb는 각각 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬로서, Fa와 Fb는 힌지 영역에서 이황화 결합으로 서로 연결되고, 이로써 상기 결합체는 Fc 절편을 포함하며, Fa는 L1과 공유결합으로 연결되고,
각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이고,
각각의 BTPb1, ······, BTPbn'은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이며,
각각의 L2a1, ······, L2an은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이고,
각각의 L2b1, ······, L2bn'은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이며,
이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 각각의 L2a1, ······, L2an은 서로 같거나 다른 펩타이드성 링커이고, 각각의 L2b1, ······, L2bn'은 서로 같거나 다른 펩타이드성 링커이며, 이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, L1은 Fa의 N-말단에 연결된 것이고, L2a1 및 L2b1는 각각 Fa 및 Fb의 C-말단에 연결된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 화학식 1의 X-L1-F-L2-Y는 하기 화학식 3으로 표시되는 구조인 것을 특징으로 한다:
[화학식 3]
Figure pat00002
여기에서,
X는 치료학적 효소고,
L1a 및 L1b는 각각 독립적으로 펩타이드성 링커 또는 비펩타이드성 링커이며,
Fa 및 Fb는 각각 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬로서, Fa와 Fb는 힌지 영역에서 이황화 결합으로 서로 연결되고, 이로써 상기 결합체는 Fc 절편을 포함하며, Fa 및 Fb는 각각 L1a 및 L1b와 공유결합으로 연결되고,
각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이고,
각각의 BTPb1, ······, BTPbn'은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이며,
각각의 L2a1, ······, L2an은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이고,
각각의 L2b1, ······, L2bn'은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이며,
이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서,
각각의 L2a1, ······, L2an은 서로 같거나 다른 펩타이드성 링커이고,
각각의 L2b1, ······, L2bn'은 서로 같거나 다른 펩타이드성 링커이며,
이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 L1a 및 L1b는 각각 Fa 및 Fb의 N-말단에 연결된 것이고, L2a1 및 L2b1는 각각 Fa 및 Fb의 C-말단에 연결된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서,
상기 화학식 1의 X-L1-F-L2-Y는 하기 화학식 4로 표시되는 구조인 것을 특징으로 한다:
[화학식 4]
Figure pat00003
여기에서,
X는 치료학적 효소고,
L1은 펩타이드성 링커 또는 비펩타이드성 링커이며,
Fa 및 Fb는 각각 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬로서, Fa와 Fb는 힌지 영역에서 이황화 결합으로 서로 연결되고, 이로써 상기 결합체는 Fc 절편을 포함하며, Fa는 L1과 공유결합으로 연결되고,
각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이고,
각각의 BTPb1, ······, BTPbn'은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이며,
각각의 L2a1, ······, L2an은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이고,
각각의 L2b1, ······, L2bn'은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이며,
이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서,
각각의 L2a1, ······, L2an은 서로 같거나 다른 펩타이드성 링커이고,
각각의 L2b1, ······, L2bn'은 서로 같거나 다른 펩타이드성 링커이며,
이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서,
L1은 Fa의 N-말단에 연결된 것이고, L2a1 및 L2b1는 각각 Fa 및 Fb의 C-말단에 연결된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, n=n'이고, 각각 L2a1 = L2b1, ······, L2an = L2bn'과 BTPa1 = BTPb1, ······, BTPan = BTPbn'의 조건을 만족하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 화학식 1에서 F는 Fa 및 Fb이며, L2-Y는 (L2a-Ya)n 및 (L2b-Yb)n'로서, 하기 화학식 5로 표시되는 결합체인 것을 특징으로 한다:
[화학식 5]
Figure pat00004
여기에서, 상기 X는 치료학적 효소고,
L1은 펩타이드성 링커 또는 비펩타이드성 링커이며, 구체적으로는 비펩타이드성 링커이며,
Fa 및 Fb는 각각 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬로서, Fa와 Fb는 힌지 영역에서 이황화 결합으로 서로 연결되고, 이로써 상기 결합체는 Fc 절편을 포함하며, Fa는 L1과 공유결합으로 연결되고,
Ya 및 Yb는 뇌 표적 펩타이드로, 이들은 서로 같거나 다른 종류이고,
L2a 및 L2b 각각은 펩타이드성 링커로, 상기 L2a 및 L2b는 서로 같은 종류 또는 다른 종류이며,
n 및 n'은 각각 독립적으로 1이상의 자연수임.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 화학식 1에서 X는 Xa 및 Xb이고, L1은 L1a 및 L1b이며, F는 Fa 및 Fb이며, L2-Y는 (L2a-Ya)n 및 (L2b-Yb)n'로서, 하기 화학식 6으로 표시되는 결합체인 것을 특징으로 한다:
[화학식 6]
Figure pat00005
여기서, 상기 X는 치료학적 효소고,
L1a 및 L1b은 각각 독립적으로 펩타이드성 링커 또는 비펩타이드성 링커이며, 구체적으로는 펩타이드성 링커이며,
상기 펩타이드성 링커는 0개 내지 1000개의 아미노산을 포함할 수 있으며,
Fa 및 Fb는 각각 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬로서, Fa와 Fb는 힌지 영역에서 이황화 결합으로 서로 연결되고, 이로써 상기 결합체는 Fc 절편을 포함하며, Fa 및 Fb는 각각 L1a 및 L1b와 공유결합으로 연결되고,
Ya 및 Yb는 뇌 표적 펩타이드로, 이들은 서로 같거나 다른 종류이고,
L2a 및 L2b 각각은 펩타이드성 링커로, 상기 L2a 및 L2b는 서로 같은 종류 또는 다른 종류이며,
n 및 n'은 각각 독립적으로 1이상의 자연수임.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, n=n'이고, 각각 L2a1 = L2b1, ······, L2an = L2bn'과 BTPa1 = BTPb1, ······, BTPan = BTPbn'의 조건을 만족하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 같은 뇌 표적 펩타이드이고, 각각의 BTPb1, ······, BTPbn'은 서로 같은 뇌 표적 펩타이드이며, 각각의 L2a1, ······, L2an은 펩타이드성 링커이고, 각각의 L2b1, ······, L2bn'은 펩타이드성 링커인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 다른 뇌 표적 펩타이드이고, 각각의 BTPb1, ······, BTPbn'은 서로 다른 뇌 표적 펩타이드이며, 각각의 L2a1, ······, L2an은 펩타이드성 링커이고, 각각의 L2b1, ······, L2bn'은 펩타이드성 링커인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, n=n'이고, BTPa1 ≠ BTPb1, ······, BTPan ≠ BTPbn' 중 어느 하나의 요건을 만족하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 같은 뇌 표적 펩타이드이고, 각각의 BTPb1, ······, BTPbn'은 서로 같은 뇌 표적 펩타이드이며, 각각의 L2a1, ······, L2an은 펩타이드성 링커이고, 각각의 L2b1, ······, L2bn'은 펩타이드성 링커인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 다른 뇌 표적 펩타이드이고, 각각의 BTPb1, ······, BTPbn'은 서로 다른 뇌 표적 펩타이드이며, 각각의 L2a1, ······, L2an은 펩타이드성 링커이고, 각각의 L2b1, ······, L2bn'은 펩타이드성 링커인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 n 및 n'은 1 내지 5, 즉 1, 2, 3, 4, 또는 5인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 L1, L1a, 또는 L1b는 X의 N-말단 아민기, 라이신의 측쇄에 위치한 아민기, 또는 시스테인의 측쇄에 위치한 -SH 기 (티올기)에 연결된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 뇌 표적 펩타이드 (BTP)는 서열번호: 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 및 53으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, L1, L1a, 또는 L1b는 0.5 내지 100 kDa 크기의 비펩타이드성 링커인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 비펩타이드성 링커는 폴리에틸렌글리콜인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, L1, L1a, 또는 L1b는 0개 내지 1000개의 아미노산을 포함하는 펩타이드성 링커인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 L2는 펩타이드성 링커인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 펩타이드성 링커는 (GS)m, (GGS)m, (GGGS)m, 또는 (GGGGS)m이며, m은 1 내지 10인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 L1 및 L2 중 하나는 펩타이드성 링커이고, 또 다른 하나는 비펩타이드성 링커인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 L1 및 L2 모두 펩타이드성 링커인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 L1은 비펩타이드성 링커 또는 펩타이드성 링커이고, L2는 펩타이드성 링커일 때, 펩타이드성 링커는 0부터 1000개의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 비펩타이드성 링커는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 다당류, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히알루론산, 지방산, 고분자 중합체, 저분자 화합물, 뉴클레오타이드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 L1 및 L2 중 어느 하나 또는 둘 다 펩타이드성 링커일 때, 상기 X와 F, 또는 F와 Y는 공유 화학결합, 비공유 화학결합 또는 이들의 조합으로 L1 및 L2 에 의해 서로 결합되고, L1 및 L2 가 0부터 1000개의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 한다. 펩타이드성 링커가 0개의 아미노산일 경우는 공유 화학결합인 펩타이드 결합에 의해 결합된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, L1 및 L2 중 어느 하나 또는 둘 다 펩타이드성 링커일 때, L1 및 L2 는 0개의 아미노산으로 이루어진 것으로,
(i) X와 F, 또는 F와 Y는 펩타이드 결합에 의해 결합된 것이고; 또는
(ii) X와 F, 및 F와 Y는 펩타이드 결합에 의해 결합된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 화학식 1의 상기 L1 및 L2 중 어느 하나 또는 둘 다 펩타이드성 링커일 때, L1 및 L2 는 0개의 아미노산으로 이루어진 것으로, (i) X와 F, 또는 F와 Y는 펩타이드 결합에 의해 결합된 것이고; 또는 (ii) X와 F, 및 F와 Y는 펩타이드 결합에 의해 결합된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, L1 및 L2 중 어느 하나는 펩타이드성 링커이고, 이 중 다른 하나는 비펩타이드성 링커일 때, 펩타이드성 링커는 0부터 1000개의 아미노산을 포함하는 링커이며, 비펩타이드성 링커는 폴리에틸렌 글리콜인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, F는 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 내지 4개의 도메인을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 힌지 영역을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 IgG, IgA, IgD, IgE 또는 IgM에서 유래된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역의 각각의 도메인이 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM로 이루어진 군에서 선택되는 면역글로불린에서 유래된 상이한 기원을 가진 도메인의 하이브리드인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 동일한 기원의 도메인으로 이루어진 단쇄 면역글로불린으로 구성된 이량체 또는 다량체인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG의 Fc 영역인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG4 Fc 영역인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 비당쇄화된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 인간 서열의 비당쇄화 IgG4 Fc 영역인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 면역글로불린 Fc 영역의 서열을 포함하거나, 이의 변이된 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, L1에 의해 X의 N-말단 및 F의 N-말단이 연결된 것이고, L2에 의해 Y의 N-말단 및 F의 C-말단이 연결된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, L1의 일 말단은 X의 라이신 잔기 또는 시스테인 잔기에, L1의 다른 말단은 F의 N-말단에 연결된 것이고, L2에 의해 Y의 N-말단 및 F의 C-말단이 연결된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은, 천연형 면역글로불린 Fc 영역에서 적어도 하나 이상의 아미노산에 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion), 수식(modification) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 변형이 일어날 수 있는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 사슬 교환 기능이 일어나지 않을 수 있는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 결합체는 Fc 영역이 결합 또는 융합되지 않은 치료학적 효소에 비해 안정성이 증가되고, 리소좀 수용체에 대한 결합력이 감소된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 F는 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬 두 개가 서로 이황화 결합으로 연결된 이량체 형태인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역을 구성하는 힌지 영역은 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이로 필수적으로 구성되는 것이거나, 혹은 상기 서열번호: 5의 아미노산 서열에서 2 번째 아미노산인 세린(Ser, S)이 프롤린 (Pro, P)으로 변이된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역을 구성하는 CH2 도메인은 서열번호: 6의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이로 필수적으로 구성되는 것이거나, 혹은 상기 서열번호: 6의 아미노산 서열에서 67번째 아미노산인 아스파라긴 (Asn, N)이 글루타민 (Gln, Q)으로 변이된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 F는 IgG 유래의 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬 두 개가 서로 이황화 결합으로 연결된 이량체 형태로서, 상기 힌지 영역이 서열번호: 5의 아미노산 서열, 혹은 상기 서열번호: 5의 아미노산 서열에서 2 번째 아미노산인 세린(Ser, S)이 프롤린 (Pro, P)으로 변이된 서열을 포함하고/하거나 상기 CH2 도메인이 서열번호: 6의 아미노산 서열 또는 상기 서열번호: 6의 아미노산 서열에서 67번째 아미노산인 아스파라긴 (Asn, N)이 글루타민 (Gln, Q)으로 변이된 서열을 포함하고/하거나 CH3 도메인이 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 F를 구성하는 면역글로불린 불변영역을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬은 서열번호: 92에서 2번째 아미노산이 프롤린으로 치환되거나; 71번째 아미노산이 글루타민으로 치환되거나; 또는 2번째 아미노산은 프롤린으로, 71번째 아미노산은 글루타민으로 치환된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 F를 구성하는 면역글로불린 불변영역을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬은 서열번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 치료학적 효소는 베타글루코시다제 (beta-glucosidase), 알파갈락토시다제 (alpha-galactosidase), 베타갈락토시다제 (beta-galactosidase), 이두로니다제 (iduronidase), 이두로네이트 2-설파타제 (iduronate-2-sulfatase), 갈락토스-6-설파타제 (Galactose-6-sulfatase), 산성 알파-글루코시다제 (acid alpha-glucosidase), 산성 세라미다제 (acid ceramidase), 산성 스핑고미엘리나제 (acid sphingomyelinsase), 갈락토세레브로시다제 (galactocerebrosidsase), 아릴설파타제 (arylsulfatase) A, B, 베타-헥소사미니다제 (beta-hexosaminidase) A, B, 헤파린-N-설파타제 (heparin N-sulfatase), 알파-D-마노시다제 (alpha-D-mannosidase), 베타-글루쿠로니다제 (beta-glucuronidase), N-아세틸갈락토사민-6-설파타제 (N-acetylgalactosamine-6 sulfatase), 리소좀 산성 리파제 (lysosomal acid lipase), 알파-N-아세틸-글루코사미니다제 (alpha-N-acetyl-glucosaminidase), 글루코세레브로시다제 (glucocerebrosidase), 부티릴콜린에스터라제 (butyrylcholinesterase), 키티나제 (Chitinase), 글루타메이트 디카르복실라제 (glutamate decarboxylase), 이미글루세라제 (imiglucerase), 리파아제 (lipase), 우리카제 (Uricase), 혈소판활성인자 아세틸하이드로라제 (Platelet-Activating Factor Acetylhydrolase), 뉴트럴 엔도펩티다제 (neutral endopeptidase), 및 미엘로퍼옥시다제 (myeloperoxidase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다. 앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 이두로네이트 2-설파타제는 뮤코다당체침작증 Ⅱ (mucopolysaccharidosis Ⅱ, MPS Ⅱ)를 치료할 수 있는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 결합체는 치료학적 효소, 구체적으로 이두로네이트 2-설파타제 효소 자체 보다 세포외배출 (transcytosis), 및/또는 생체 이용율 (bioavailability, BA)이 증가된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 세포 외 배출은 면역글로불린 Fc 영역과 FcRn (neonatal Fc receptor)와의 결합에 의한 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 결합체는 면역글로불린 Fc 영역이 결합하지 않은 치료학적 효소, 구체적으로 이두로네이트 2-설파타제 효소보다 조직 분포성 (tissue distribution)이 증가된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 결합체는 면역글로불린 Fc 영역이 결합하지 않은 치료학적 효소, 구체적으로 이두로네이트 2-설파타제보다 골수 표적성이 증가된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 F는 천연형 면역글로불린의 Fc 영역의 서열을 포함하거나, 천연형 면역글로불린 Fc 영역에서 적어도 하나 이상의 아미노산에 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion), 수식(modification) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 변형이 일어난 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 결합체로서, 상기 F는 IgG 유래의 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬 두 개가 서로 이황화 결합으로 연결된 이량체 형태로서,
상기 힌지 영역은 서열번호: 5의 아미노산 서열, 또는 상기 서열번호: 5의 아미노산 서열에서 2 번째 아미노산인 세린(Ser, S)이 프롤린 (Pro, P)으로 변이된 서열을 포함하고;
상기 CH2 도메인은 서열번호: 6의 아미노산 서열, 또는 상기 서열번호: 6의 아미노산 서열에서 67번째 아미노산인 아스파라긴 (Asn, N)이 글루타민 (Gln, Q)으로 변이된 서열을 포함하고;
CH3 도메인이 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하고; 또는
상기 F를 구성하는 면역글로불린 불변영역을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬은 서열번호: 92에서 2번째 아미노산이 프롤린으로 치환되거나; 71번째 아미노산이 글루타민으로 치환되거나; 또는 2번째 아미노산은 프롤린으로, 71번째 아미노산은 글루타민으로 치환된 것을 특징으로 한다.
본 발명을 구현하는 다른 하나의 양태는 상기 뇌 표적 지속형 효소 결합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 발현 벡터, 및 상기 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포이다.
하나의 구체예로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 아미노산 서열로 구성되는 융합 단백질 형태인 뇌 표적 지속형 효소 결합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.
본 발명을 구현하는 다른 하나의 양태는 상기 뇌 표적 지속형 효소 결합체를 포함하는 조성물이다.
하나의 구체예로서, 상기 조성물은 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disease, LSD)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물인 것을 특징으로 한다.
구체적으로, 상기 조성물은 뮤코다당체침작증 Ⅱ (mucopolysaccharidosis Ⅱ, MPS Ⅱ)의 예방 또는 치료용인 것을 특징으로 한다.
본 발명을 구현하는 다른 하나의 양태는 약제의 제조에 있어서 상기 뇌 표적 지속형 효소 결합체의 용도이다.
본 발명을 구현하는 다른 하나의 양태는 상기 뇌 표적 지속형 효소 결합체의 제조 방법이다.
하나의 구체예로서, 상기 제조 방법은
(a) 상기 숙주세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 숙주세포 또는 이의 배양물로부터 뇌 표적 지속형 효소 결합체를 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
다른 하나의 구체예로서, 상기 제조 방법은
(i) (a) 치료학적 효소인 X, 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커인 L1, 및 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 F가 결합된, X-L1-F, 및 (b) 뇌 표적 펩타이드인 Y, 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커인 L2가 결합된 L2-Y를 제조하는 단계; 및
(ii) 상기 (a) X-L1-F 및 (b) L2-Y를 연결하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
다른 하나의 구체예로서, 상기 제조 방법은
(i) (a) 치료학적 효소인 X 및 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커인 L1이 결합된, X-L1, 및 (b) 뇌 표적 펩타이드인 Y, 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커인 L2 및 F가 결합된 F-L2-Y를 제조하는 단계; 및
(ii) 상기 (a) X-L1 및 (b) F-L2-Y를 연결하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
다른 하나의 구체예로서, 상기 제조 방법은
(a) 양 말단에 각각 같거나 서로 다른 반응성 작용기가 위치하는 비펩타이드성 중합체인 L1의 어느 한 반응성 작용기를 유리된 치료학적 효소인 X와 반응시켜 상기 말단을 통하여 비펩타이드성 중합체가 치료학적 효소에 공유결합으로 연결된 연결체인 X-L1를 얻는 단계; 및
(b) 상기 연결체의 반응하지 않은 말단의 반응성 작용기를 F-L2-Y에 연결시켜 X-L1-F-L2-Y를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예에 따른 제조 방법에서, 상기 (b) 단계는 상기 연결체의 반응하지 않은 말단의 반응성 작용기를 하기 화학식 2의 Fa에 연결시키는 것을 특징으로 한다:
[화학식 2]
Figure pat00006
여기에서,
Fa 및 Fb는 각각 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬로서, Fa와 Fb는 힌지 영역에서 이황화 결합으로 서로 연결되고, 이로써 상기 결합체는 Fc 절편을 포함하며, Fa는 L1과 공유결합으로 연결되고,
각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이고,
각각의 BTPb1, ······, BTPbn'은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이며,
각각의 L2a1, ······, L2an은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이고,
각각의 L2b1, ······, L2bn'은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이며,
이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수이다.
앞선 구체예에 따른 제조 방법에서, 상기 반응성 작용기는 알데히드기, 말레이미드기 및 석신이미드 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예에 따른 제조 방법에서, 상기 알데히드기는 프로피온알데히드기 또는 부틸알데히드기인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예에 따른 제조 방법에서, 상기 석신이미드 유도체는 석신이미딜 카르복시메틸, 석신이미딜 발레르에이트, 석신이미딜 메틸부타노에이트, 석신이미딜 메틸프로피온에이트, 석신이미딜 부타노에이트, 석신이미딜 프로피온에이트, N-하이드록시석신이미드인 또는 석신이미딜 카보네이트인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예에 따른 제조 방법에서, 상기 양 말단의 반응성 작용기는 모두 알데히드기인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예에 따른 제조 방법에서, 상기 비펩타이드성 중합체는 양 말단에 각각 알데하이드기와 말레이미드기를 반응성 작용기로 갖는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예에 따른 제조 방법에서, 상기 비펩타이드성 중합체는 양 말단에 각각 알데하이드기와 석신이미드기를 반응성 작용기로 갖는 것을 특징으로 한다.
다른 하나의 구체예로서, 상기 제조 방법은 하기 화학식 3의 X - L1a - Fa - (L2a1-BTPa1) - ...... - (L2an - BTPan)를 코딩하는 발현 카세트 및 X - L1b - Fb - (L2b1-BTPb1) - ...... - (L2bn' - BTPbn')를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 숙주세포를 배양하는 단계; 및 상기 배양된 숙주세포 또는 이의 배양물로부터 하기 화학식 3의 결합체를 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다:
[화학식 3]
Figure pat00007
여기에서,
X는 치료학적 효소고,
L1a 및 L1b는 펩타이드성 링커이며,
Fa 및 Fb는 각각 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬로서, Fa와 Fb는 힌지 영역에서 이황화 결합으로 서로 연결되고, 이로써 상기 결합체는 Fc 절편을 포함하며, Fa 및 Fb는 각각 L1a 및 L1b와 공유결합으로 연결되고,
각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이고,
각각의 BTPb1, ······, BTPbn'은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이며,
각각의 L2a1, ······, L2an은 펩타이드성 링커이고,
각각의 L2b1, ······, L2bn'은 펩타이드성 링커이며,
이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수이다.
앞선 구체예에 따른 제조 방법에서, 상기 결합체는 X - L1a - Fa - (L2a1-BTPa1) - ...... - (L2an - BTPan) 및 X - L1b - Fb - (L2b1-BTPb1) - ...... - (L2bn' - BTPbn')이 융합 단백질 형태로 발현되고 재접힘 과정에서 Fa 및 Fb 간의 결합이 형성되어 상기 결합체를 형성하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 뇌 표적 지속형 치료학적 효소 결합체, 특히 뇌 표적 지속형 이두로네이트 2-설파타제(iduronate-2-sulfatase) 효소 결합체는 상기 효소를 뇌로 전달이 가능하여 뮤코다당체침작증 II (mucopolysaccharidosis II, MPS II)의 치료에 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 상기 결합체는 면역글로불린 Fc 영역이 결합되지 않은 치료학적 효소 대비 향상된 생체 내 지속성, 세포외배출(transcytosis), 생체 이용율, 조직 분포성을 나타낼 수 있다.
도 1은 재조합 단백질 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22의 SDS-PAGE 확인 결과를 나타낸다.
도 2는 이두로네이트 2-설파타제-10kDa PEG-Fc-BTP28 결합체의 SDS-PAGE 확인 결과를 나타낸다.
도 3은 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22 융합단백질 및 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP28 결합체의 in vitro 효소 활성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22 융합단백질의 뇌 조직 분포를 확인한 도이다.
도 5는 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22 융합단백질과 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP28 결합체의 생체 내 효능을 확인한 실험 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
한편, 본원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
본 명세서 전반을 통하여, 아미노산에 대한 통상의 1문자 및 3문자 코드가 사용된다. 또한, Dap (다이아미노프로피오닉산, diaminopropionic acid) 등과 같은 다른 아미노산에 대해 일반적으로 허용되는 3문자 코드가 사용된다. 또한, 본 명세서에서 약어로 언급된 아미노산은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 기재되었다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 양태는 뇌 표적 지속형 효소 결합체를 제공한다.
구체적으로 치료학적 효소와 뇌 표적 펩타이드가 각각 독립적으로 면역글로불린 Fc 영역에 펩타이드성 링커 또는 비펩타이드성 링커로 연결된, 뇌 표적 지속형 효소 결합체를 제공한다.
보다 구체적으로, 상기 뇌 표적 지속형 효소 결합체는 면역글로불린 Fc 영역을 중심으로, 각각 펩타이드성 링커 및/또는 비펩타이드성 링커에 의해 연결된 뇌 표적 펩타이드 및 치료학적 효소가 결합된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 뇌 표적 지속형 효소 결합체는 생리 활성 물질이 아닌 뇌 표적 펩타이드가 면역글로불린 Fc 영역에 펩타이드성 링커 (펩타이드 결합을 통한 직접 융합을 포함한다) 혹은 비펩타이드성 링커에 의해 연결된 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 용어, "뇌 표적 지속형 효소 결합체"는, 뇌 표적 펩타이드 및 치료학적 효소를 포함하며, 면역글로불린 불변 영역을 포함하고 FcRn 결합 부위을 갖는 물질에 뇌 표적 펩타이드 및 치료학적 효소가 각각 직간접적으로 연결된 구조를 가지는 결합체를 말한다. 본 발명에서, "뇌 표적 지속형 효소 결합체"는 "뇌표적 지속형 결합체" 또는 "지속형 결합체"와 혼용되어 사용될 수 있다.
상기 지속형 결합체는 "지속성 결합체"와 혼용될 수 있으며, 상기 지속형 결합체에 포함되는 생리활성 물질이, 생리활성 물질의 활성 지속 시간을 늘려 줄 수 있는, 면역글로불린 불변 영역을 포함하며 FcRn 결합부위를 갖는 생체 적합성 물질과 상기 0개 내지 1000개의 아미노산을 포함하는 펩타이드성 링커 및/또는 비펩타이드성 링커와 결합한 물질을 의미한다.
상기 뇌 표적 지속형 결합체는 뇌 혈관 장벽을 통과하여, 뇌 조직 내로 생리활성 물질을 전달할 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 뇌 표적 지속형 효소 결합체는 하기 화학식 1로 표시되는 것일 수 있다:
[화학식 1]
X-L1-F-L2-Y
여기에서,
X는 치료학적 효소며,
Y는 뇌 표적 펩타이드 (BTP)이고,
L1 및 L2는 각각 독립적으로 펩타이드성 링커 또는 비펩타이드성 링커이며,
L1 및 L2가 펩타이드성 링커일 때, 상기 펩타이드성 링커는 0개부터 1000개의 아미노산을 포함하며,
F는 FcRn 결합 부위를 포함하는 면역글로불린 불변 영역임.
상기 펩타이드성 링커는 0개 내지 1000개의 아미노산을 포함하는 링커일 수 있으나, 본 발명의 결합체를 형성할 수 있는 펩타이드성 링커는 제한 없이 포함된다. 상기 펩타이드성 링커가 0개의 아미노산을 포함하는 경우, 이는 펩타이드 결합 형태의 연결일 수 있다.
상기 화학식 1의 F-L2-Y는 하기 화학식 2로 표시되는 구조일 수 있다:
[화학식 2]
Figure pat00008
여기에서,
Fa 및 Fb는 각각 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬로서, Fa와 Fb는 힌지 영역에서 이황화 결합으로 서로 연결되고, 이로써 상기 결합체는 Fc 절편을 포함하며, Fa는 L1과 공유결합으로 연결되고,
각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이고,
각각의 BTPb1, ······, BTPbn'은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이며,
각각의 L2a1, ······, L2an은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이고,
각각의 L2b1, ······, L2bn'은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이며,
이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수이다.
보다 구체적으로, 상기 화학식 2에서 각각의 L2a1, ······, L2an은 서로 같거나 다른 펩타이드성 링커이고, 각각의 L2b1, ······, L2bn'은 서로 같거나 다른 펩타이드성 링커이며, 이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
보다 구체적으로, 상기 화학식 2에서 L1은 Fa의 N-말단에 연결된 것이고, L2a1 및 L2b1는 각각 Fa 및 Fb의 C-말단에 연결된 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
보다 구체적으로, 상기 화학식 1의 X-L1-F-L2-Y는 하기 화학식 3으로 표시되는 구조일 수 있다. 즉, 상기 결합체는 하기 화학식 3으로 표시되는 것일 수 있다:
[화학식 3]
Figure pat00009
여기에서,
X는 치료학적 효소고,
L1a 및 L1b는 각각 독립적으로 펩타이드성 링커 또는 비펩타이드성 링커이며,
Fa 및 Fb는 각각 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬로서, Fa와 Fb는 힌지 영역에서 이황화 결합으로 서로 연결되고, 이로써 상기 결합체는 Fc 절편을 포함하며, Fa 및 Fb는 각각 L1a 및 L1b와 공유결합으로 연결되고,
각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이고,
각각의 BTPb1, ······, BTPbn'은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이며,
각각의 L2a1, ······, L2an은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이고,
각각의 L2b1, ······, L2bn'은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이며,
이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수이다.
보다 구체적으로, 상기 화학식 3에서 각각의 L2a1, ······, L2an은 서로 같거나 다른 펩타이드성 링커이고, 각각의 L2b1, ······, L2bn'은 서로 같거나 다른 펩타이드성 링커이며, 이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수일 수 있다.
보다 더 구체적으로, 상기 화학식 3에서 각 L은 펩타이드성 링커로서 상기 화학식 3으로 표시되는 결합체는 융합 단백질 형태일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 화학식 3에서 상기 L1a 및 L1b는 각각 Fa 및 Fb의 N-말단에 연결된 것이고/것이거나, L2a1 및 L2b1는 각각 Fa 및 Fb의 C-말단에 연결된 것이고/것이거나, 상기 L1a 및 L1b는 각각 X-의 C-말단에 연결된 것이고/것이거나, 상기 L2a1 및 L2b1는 이에 연결되는 뇌 표적 펩타이드 (BTP)의 N-말단에 연결된 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
보다 구체적으로, 상기 화학식 1의 X-L1-F-L2-Y는 하기 화학식 4로 표시되는 구조일 수 있다:
[화학식 4]
Figure pat00010
여기에서,
X는 치료학적 효소고,
L1은 펩타이드성 링커 또는 비펩타이드성 링커이며,
Fa 및 Fb는 각각 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬로서, Fa와 Fb는 힌지 영역에서 이황화 결합으로 서로 연결되고, 이로써 상기 결합체는 Fc 절편을 포함하며, Fa는 L1과 공유결합으로 연결되고,
각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이고,
각각의 BTPb1, ······, BTPbn'은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이며,
각각의 L2a1, ······, L2an은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이고,
각각의 L2b1, ······, L2bn'은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이며,
이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수이다.
보다 구체적으로, 상기 화학식 4에서 각각의 L2a1, ······, L2an은 서로 같거나 다른 펩타이드성 링커이고, 각각의 L2b1, ······, L2bn'은 서로 같거나 다른 펩타이드성 링커이며, 이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 화학식 4에서 L1은 Fa의 N-말단에 연결된 것이고/것이거나, L2a1 및 L2b1는 각각 Fa 및 Fb의 C-말단에 연결된 것이고/것이거나, L1은 X의 N-말단에 연결된 것이고/것이거나, L2a1 및 L2b1는 각각 이에 연결되는 뇌 표적 펩타이드 (BTP)의 N-말단에 연결된 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
상기 화학식(들)에서, n=n'이고, 각각 L2a1 = L2b1, ······, L2an = L2bn'과 BTPa1 = BTPb1, ······, BTPan = BTPbn'의 조건을 만족하는 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
상기 n 및 n'가 각각 독립적으로 2 이상의 자연수일 경우, 동일하거나 다른 종류의 뇌 표적 펩타이드가 2개 이상 연결되어 있는 것일 수 있으며, 상기 2이상의 뇌 표적 펩타이드는 종렬 (tandem)로 연결되어 있는 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 n 및 n'은 1 또는 2이상의 자연수일 수 있으며, n 및 n'은 동일한 자연수이거나, 서로 상이한 자연수일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. n 및 n'은 1 내지 10, 구체적으로 1 내지 5일 수 있으며, 그 예로, 각각 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 수 있으나, 본 발명의 뇌 표적 지속형 결합체의 한 모이어티(moiety)를 구성하는 일 부분으로 결합된 Fc 영역 및 생리 활성 물질을 BBB를 통과하여, 뇌로 전달시킬 수 있는 개수는 제한없이 포함된다.
상기 화학식 1에서 F는 Fa 및 Fb이며, L2-Y는 (L2a-Ya)n 및 (L2b-Yb)n'로서, 상기 결합체는 하기 화학식 5로 표시되는 것일 수 있다:
[화학식 5]
Figure pat00011
여기에서, 상기 X는 치료학적 효소고,
L1은 펩타이드성 링커 또는 비펩타이드성 링커이며, 구체적으로는 비펩타이드성 링커이며,
Fa 및 Fb는 각각 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬로서, Fa와 Fb는 힌지 영역에서 이황화 결합으로 서로 연결되고, 이로써 상기 결합체는 Fc 절편을 포함하며, Fa는 L1과 공유결합으로 연결되고,
Ya 및 Yb는 뇌 표적 펩타이드로, 이들은 서로 같거나 다른 종류이고,
L2a 및 L2b 각각은 펩타이드성 링커로, 상기 L2a 및 L2b는 서로 같은 종류 또는 다른 종류이며,
n 및 n'은 각각 독립적으로 1이상의 자연수임.
상기 n 및 n'가 각각 독립적으로 2 이상의 자연수일 경우, 동일하거나 다른 종류의 뇌 표적 펩타이드가 2개 이상 연결되어 있는 것일 수 있으며, 상기 2이상의 뇌 표적 펩타이드는 종렬 (tandem)로 연결되어 있는 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 n 및 n'은 1 또는 2이상의 자연수일 수 있으며, n 및 n'은 동일한 자연수이거나, 서로 상이한 자연수일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. n 및 n'은 1 내지 10, 또는 1 내지 5일 수 있으며, 그 예로, 각각 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 뇌 표적 지속형 결합체는 L1에 의해 X의 N-말단 영역 및 F의 N-말단 영역이 연결된 것이고, L2에 의해 Y의 N-말단 영역 및 F의 C-말단 영역이 연결된 것일 수 있다. 또한, 상기 뇌 표적 지속형 결합체는 L1의 일 말단은 X의 라이신 잔기 또는 시스테인 잔기 등에, L1의 다른 말단은 F의 N-말단 영역에 연결된 것이고, L2에 의해 Y의 N-말단 영역 및 F의 C-말단 영역이 연결된 형태일 수 있다.
상기 뇌 표적 지속형 결합체의 L1은 F의 N-말단 영역에 연결되고, L2는 F의 C-말단 영역에 연결된 것일 수 있으며, 상기 L1은 Fa의 N-말단 영역에 연결된 것이고, L2a 및 L2b는 각각 Fa 및 Fb의 C-말단 영역에 연결된 것일 수 있다. 상기 L1은 X의 아민기 또는 티올기에 연결된 것일 수 있으며, L1은 X의 N-말단 아민기, 라이신의 측쇄에 위치한 아민기, 또는 시스테인의 측쇄에 위치한 -SH 기 (티올기)에 연결된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "N-말단 영역"은 펩타이드 또는 단백질의 아미노 말단을 의미하는 것으로, 본 발명의 목적상 비펩타이드성 링커를 비롯한 링커와 결합할 수 있는 위치를 말한다. 그 예로, 이에 제한되지는 않으나, N-말단 영역의 최말단 아미노산 잔기뿐만 아니라 N-말단 주위의 아미노산 잔기를 모두 포함할 수 있으며, 구체적으로는 최말단으로부터 첫 번째 내지 20 번째의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 그러나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 "C-말단 영역"은 펩타이드 또는 단백질의 카르복실 말단을 의미하는 것으로, 본 발명의 목적상 비펩타이드성 링커를 비롯한 링커와 결합할 수 있는 위치를 말한다. 그 예로, 이에 제한되지는 않으나, C-말단 영역의 최말단 아미노산 잔기뿐만 아니라 C-말단 영역 주위의 아미노산 잔기를 모두 포함할 수 있으며, 구체적으로는 최말단으로부터 첫 번째 내지 20번째의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 그러나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 화학식 1에서 X는 Xa 및 Xb이고, L1은 L1a 및 L1b이며, F는 Fa 및 Fb이며, L2-Y는 (L2a-Ya)n 및 (L2b-Yb)n'로서, 상기 결합체는 하기 화학식 6으로 표시되는 것일 수 있다:
[화학식 6]
Figure pat00012
여기서, 상기 X는 치료학적 효소고,
L1a 및 L1b은 각각 독립적으로 펩타이드성 링커 또는 비펩타이드성 링커이며, 구체적으로는 펩타이드성 링커이며,
상기 펩타이드성 링커는 0개 내지 1000개의 아미노산을 포함할 수 있으며,
Fa 및 Fb는 각각 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬로서, Fa와 Fb는 힌지 영역에서 이황화 결합으로 서로 연결되고, 이로써 상기 결합체는 Fc 절편을 포함하며, Fa 및 Fb는 각각 L1a 및 L1b와 공유결합으로 연결되고,
Ya 및 Yb는 뇌 표적 펩타이드로, 이들은 서로 같거나 다른 종류이고,
L2a 및 L2b 각각은 펩타이드성 링커로, 상기 L2a 및 L2b는 서로 같은 종류 또는 다른 종류이며,
n 및 n'은 각각 독립적으로 1이상의 자연수임.
상술한 화학식(들)에서 상기 n 및 n'은 1 내지 5, 즉 1, 2, 3, 4, 또는 5일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 여기서 n=n'일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 상기 L1, L1a, 또는 L1b는 X의 N-말단 아민기, 라이신의 측쇄에 위치한 아민기, 또는 시스테인의 측쇄에 위치한 -SH 기 (티올기)에 연결된 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
상술한 화학식(들)에서 상기 n=n'이고, 각각 L2a1 = L2b1, ······, L2an = L2bn', BTPa1 = BTPb1, ······, BTPan = BTPbn' 의 조건을 만족할 수 있으며, 이때 각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 같은 뇌 표적 펩타이드이고, 각각의 BTPb1, ······, BTPbn'은 서로 같은 뇌 표적 펩타이드이며, 각각의 L2a1, ······, L2an은 펩타이드성 링커이고, 각각의 L2b1, ······, L2bn'은 펩타이드성 링커일 수 있거나; 또는 상기 각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 다른 뇌 표적 펩타이드이고, 각각의 BTPb1, ······, BTPbn'은 서로 다른 뇌 표적 펩타이드이며, 각각의 L2a1, ······, L2an은 펩타이드성 링커이고, 각각의 L2b1, ······, L2bn'은 펩타이드성 링커일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상술한 화학식(들)에서 상기 n=n'이고, BTPa1 ≠ BTPb1, ······, BTPan ≠ BTPbn' 중 어느 하나의 요건을 만족하는 것일 수 있으며, 예컨대 각각 L2a1 ≠ L2b1, ······, L2an ≠ L2bn', BTPa1 ≠ BTPb1, ······, BTPan ≠ BTPbn' 및 a≠b의 조건을 만족할 수 있으며, 이때 각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 같은 뇌 표적 펩타이드이고, 각각의 BTPb1, ······, BTPbn'은 서로 같은 뇌 표적 펩타이드이며, 각각의 L2a1, ······, L2an은 펩타이드성 링커이고, 각각의 L2b1, ······, L2bn'은 펩타이드성 링커일 수 있거나; 또는 각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 다른 뇌 표적 펩타이드이고, 각각의 BTPb1, ······, BTPbn'은 서로 다른 뇌 표적 펩타이드이며, 각각의 L2a1, ······, L2an은 펩타이드성 링커이고, 각각의 L2b1, ······, L2bn'은 펩타이드성 링커일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 뇌 표적 지속형 효소 결합체는 유전자 수준에서 융합된 융합단백질로, 상기 L1은 X의 C-말단 영역, 구체적으로는 L1a 및 L1b는 각각의 X의 C-말단 영역에 연결된 것이고, L2a 및 L2b는 각각 Fa 및 Fb의 C-말단 영역에 연결된 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
이러한 뇌 표적 지속형 융합단백질에서, 상기 L1 (L1a 및 L1b) 및 L2 (L2a 및 L2b)는 펩타이드성 링커이다. 그 예로, (GS)m, (GGS)m, (GGGS)m, 또는 (GGGGS)m이며, m은 1 내지 10일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 뇌 표적 지속형 결합체를 구성하는 요소들을 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
본 발명에서, "뇌 표적 펩타이드"는 뇌 혈관 장벽을 통과할 수 있는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드, 또는 단백질, 또는 항체를 포함한다. 상기 뇌 표적 펩타이드는 본 발명의 뇌 표적 지속형 결합체를 구성하는 하나의 모이어티에 해당한다.
또한, 상기 뇌 표적 펩타이드는 공지의 펩타이드, 단백질, 또는 항체로부터 분리된 일부 서열로서, BBB를 통과하여 뇌 혈관 장벽을 통과할 수 있는 활성을 보유한 것일 수 있다.
본 발명에서 용어 "아미노산"은 임의의 자연-발생 또는 비-자연 발생 또는 합성 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 모이어티(moiety), 다시 말하면, 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 탄소 원자, 전형적으로, 1개의 (αα) 탄소원자에 의해 직접적으로 연결된 적어도 하나의 카르복실 잔기와 적어도 하나의 아미노 잔기를 포함하는 임의의 모이어티를 의미한다.
본 발명의 뇌 표적 펩타이드는 수동전달(passive transport)에 의한 경로 또는 수용체 매개 전달(receptor-mediated transport)에 의한 경로를 통해 뇌 혈관 장벽을 통과하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그 예로 뇌 혈관 장벽을 통과할 수 있는 펩타이드, 단백질 또는 항체로 특별히 그 종류 및 크기에 제한을 두지 않는다.
한편, 상기 뇌 표적 펩타이드는 수용체 매개 전달에 의한 경로를 통해 뇌 혈관 장벽을 통과하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 뇌 표적 펩타이드는 인슐린 수용체(insulin receptor); 트랜스페린 수용체(transferrin receptor); 저밀도 지질단백질 수용체(low density lipoprotein receptor); 저밀도 지질단백질 수용체 관련 단백질(Low density lipoprotein receptor-related protein); 렙틴 수용체(leptin receptor); 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nicotinic acetylcholine receptor); 글루타티온 수송체(Glutathione transporter); 칼슘의존성 칼륨통로(calcium-activated potassium channel); 및 RAGE (receptor for advanced glycation endproducts); 및 상기 수용체들의 리간드, 및 상기 수용체 또는 리간드에 결합하는 항체로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 통하여 수용체 매개 전달 경로에 의해 뇌 혈관 장벽을 통과할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
상기 뇌 표적 펩타이드는 서열번호: 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 및 53 으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
또한, 상기 뇌 표적 펩타이드는 다음과 같은 것일 수 있다:
(1) Angiopep-2 : TFFYGGSRGKRNNFKTEEY-OH (서열번호: 72),
(2) ApoB(3371-3409) : SVIDALQYKLEGTTRLTRKRGLKLATALSLSNKFVEGS (서열번호: 73),
(3) ApoE(159-167)2 : (LRKLRKRLL)2 (서열번호: 16),
(4) 펩타이드-22 : Ac-C(&)MPRLRGC(&)-NH 2 (서열번호: 74),
(5) THR : THRPPMWSPVWP-NH 2 (서열번호: 75),
(6) THR retro-enantio : pwvpswmpprht-NH 2 (서열번호: 76),
(7) CRT : C(&)RTIGPSVC(&)(서열번호: 77),
(8) Leptin 30 : YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVL(서열번호: 78),
(9) RVG29 : YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG-OH(서열번호: 79)
(10) DCDX : GreirtGraerwsekf-OH (서열번호: 80)
(11) Apamin : C(&1)NC(&2)KAPETALC(&1)-ARRC(&2)QQH-NH 2 (서열번호: 81),
(12) MiniAp-4 : [Dap](&)KAPETALD(&)(서열번호: 82),
(13) GSH : γ-L-glutamyl-CG-OH
(14) G23 : HLNILSTLWKYRC(서열번호: 83),
(15) g7 : GFtGFLS(O-β-Glc)-NH 2 (서열번호: 84),
(16) TGN : TGNYKALHPHNG (서열번호: 85),
(17) TAT(47-57) : YGRKKRRQRRR-NH 2 (서열번호: 86),
(18) SynB1 : RGGRLSYSRRRFSTSTGR (서열번호: 87),
(19) Diketopiperazines : &(N-MePhe)-(N-MePhe)Diketopiperazines, 또는
(20) PhPro : (Phenylproline)4-NH 2 (서열번호: 88) 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 서열에서 &은 J. Pept. Res., 2005, 65, 550-555 (J.Spengler et al.)에 기재된 고리형 펩타이드에 대한 명명법에 따른 기호로서, '&'은 연결 위치(connecting point)를 말한다. 예를 들어, 단일 쇄에서 첫 번째로 기재된 '&'은 화학 결합의 일 말단의 위치를, 두 번째로 기재된 '&'은 상기 화학 결합이 부착되는 부위를 말한다. 예컨대, "&Ala-Ala-Phe-Leu-Pro&"은 알라닌과 프롤린 간에 화학 결합이 형성되어 고리형 펩타이드를 형성함을 나타낸다. 2 이상의 화학 결합이 존재할 경우, 해당 화학 결합이 형성되는 위치를 나타내기 위하여 &1, &2와 같은 기호를 사용할 수 있다. 예를 들어, &1Asp(&2)-Trp-Phe-Dpr(&2)-Leu-Met&1과 같이 표시된 경우, Asp 및 Met 간에 화학 결합이 형성되고, Asp 및 Dpr 간에 화학 결합이 형성되는 것을 말한다. 한편, [Dap]은 다이아미노프로피오닉산(diaminopropionic acid)을 나타낸다.
본 발명의 용어, "치료학적 효소" 또는 "효소"는, 효소의 부족, 결핍, 기능 이상 등에 의해 발병되는 질병을 치료하기 위한 효소로서, 효소 대체 요법 (enzyme replacement therapy), 투여 등을 통해 상기 질병을 가진 개체를 치료할 수 있는 효소를 의미한다.
상기 치료학적 효소는 베타글루코시다제 (beta-glucosidase), 알파갈락토시다제 (alpha-galactosidase), 베타갈락토시다제 (beta-galactosidase), 이두로니다제 (iduronidase), 이두로네이트 2-설파타제 (iduronate-2-sulfatase), 갈락토스-6-설파타제 (Galactose-6-sulfatase), 산성 알파-글루코시다제 (acid alpha-glucosidase), 산성 세라미다제 (acid ceramidase), 산성 스핑고미엘리나제 (acid sphingomyelinsase), 갈락토세레브로시다제 (galactocerebrosidsase), 아릴설파타제 (arylsulfatase) A, B, 베타-헥소사미니다제 (beta-hexosaminidase) A, B, 헤파린-N-설파타제 (heparin N-sulfatase), 알파-D-마노시다제 (alpha-D-mannosidase), 베타-글루쿠로니다제 (beta-glucuronidase), N-아세틸갈락토사민-6-설파타제 (N-acetylgalactosamine-6 sulfatase), 리소좀 산성 리파제 (lysosomal acid lipase), 알파-N-아세틸-글루코사미니다제 (alpha-N-acetyl-glucosaminidase), 글루코세레브로시다제 (glucocerebrosidase), 부티릴콜린에스터라제 (butyrylcholinesterase), 키티나제 (Chitinase), 글루타메이트 디카르복실라제 (glutamate decarboxylase), 이미글루세라제 (imiglucerase), 리파아제 (lipase), 우리카제 (Uricase), 혈소판활성인자 아세틸하이드로라제 (Platelet-Activating Factor Acetylhydrolase), 뉴트럴 엔도펩티다제 (neutral endopeptidase), 및 미엘로퍼옥시다제 (myeloperoxidase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 특정 효소의 부족 또는 결핍 등으로 인해 발병하는 뮤코다당체침작증 Ⅱ (mucopolysaccharidosis Ⅱ, MPS Ⅱ)의 치료를 위한 효소일 수 있고, 보다 구체적으로, 이두로네이트 2-설파타제(iduronate-2-sulfatase)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "이두로네이트 2-설파타제(iduronate-2-sulfatase)"는, 헌터 증후군(Hunter syndrome, MPS-II)에 관계된 설파타제 효소로서, 헤파란 설페이트(heparin sulfate) 및 데르마탄 설페이트(dermatan sulfate)의 리소좀 분해에 필요한 효소이다. 본 발명의 한 구체적인 형태에서는 "이두로네이트 2-설파타제(iduronate-2-sulfatase)"로 사람 이두로네이트 2-설파타제의 한 정제 형태인 "이두설파제(idursulfase)"를 사용할 수 있다. 상기 이두설파제는 예를 들어 이두설파제 알파 또는 이두설파제 베타일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 이두로네이트 2-설파타제 효소는 당업계에서 알려진 방법으로 준비 또는 제조할 수 있으며, 구체적으로, 동물세포 발현 벡터를 삽입한 동물세포를 배양하여, 배양물로부터 정제할 수 있고, 또는 상업적으로 이용 가능한 효소를 구입하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 효소 결합체에 포함될 수 있는 이두로네이트-2-설파타제는 천연형일 수 있으며, 천연형 전장(全長) 길이일 수도 있고, 그 일부로 구성된 단편일 수 있다. 혹은 이두로네이트-2-설파타제는 천연형 서열에서 일부 아미노산에 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion), 수식(modification) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 변형이 일어난 효소 유도체(analog)일 수 있다. 예컨대 천연형과 동등한 활성 또는 동종의 활성을 보유하는 아날로그일 수 있으며, 예를 들자면 하나 이상의 아미노산 위치에서 돌연변이가 일어난 유도체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 이두로네이트-2-설파타제의 유도체가 천연형의 활성보다 증가한 활성을 가지는 경우는 물론이고, 천연형에 견주어 적어도 유의한 수준 이상의 활성을 갖는 한, 본 발명에 제한없이 포함된다.
상기 효소 유도체는 해당 효소의 바이오시밀러와 바이오베터 형태를 포함하는데, 바이오시밀러의 예를 들자면 공지 효소와 발현 숙주의 차이, 당화의 양상과 정도의 차이, 특정 위치의 잔기가 해당 효소의 기준 서열에 비추어 볼 때 100% 치환이 아닌 경우, 그 치환 정도의 차이도 본 발명의 효소 결합체에서 사용할 수 있는 바이오시밀러 효소에 해당한다. 상기 효소는 유전자 재조합을 통해 동물세포, 대장균, 효모, 곤충세포, 식물세포, 살아있는 동물 등에서 생산할 수 있으며 생산 방법은 이에 한정되지 않으며, 상업적으로 이용 가능한 효소일 수도 있다.
또한, 상기 효소 또는 이의 유도체와 80% 이상, 구체적으로 90% 이상, 보다 구체적으로 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 효소는 재조합 기술에 의해 미생물로부터 수득하거나, 상업적으로 이용가능 한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다..
본 발명의 용어, "상동성(homology)"은, 야생형(wild type) 단백질의 아미노산 서열 또는 이를 코딩하는 염기 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 염기 서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 상동성은 두 서열을 육안으로 비교하여 결정할 수도 있으나, 비교대상이 되는 서열을 나란히 배열하여 상동성 정도를 분석해 주는 생물정보 알고리즘(bioinformatic algorithm)을 사용하여 결정할 수 있다. 상기 두 개의 아미노산 서열 사이의 상동성은 백분율로 표시할 수 있다. 유용한 자동화된 알고리즘은 Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, W, USA)의 GAP, BESTFIT, FASTA와 TFASTA 컴퓨터 소프트웨어 모듈에서 이용가능하다. 상기 모듈에서 자동화된 배열 알고리즘은 Needleman & Wunsch와 Pearson & Lipman과 Smith & Waterman 서열 배열 알고리즘을 포함한다. 다른 유용한 배열에 대한 알고리즘과 상동성 결정은 FASTP, BLAST, BLAST2, PSIBLAST와 CLUSTAL W를 포함하는 소프트웨어에서 자동화되어 있다.
상기 효소 또는 이의 유도체의 서열 및 이를 코딩하는 염기서열의 정보는 NCBI 등 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다.
본 발명에서 "F"는 면역글로불린 불변 영역을 포함하며, FcRn 결합부위를 포함하는 물질을 말한다. 구체적으로, 본 발명의 뇌 표적 지속형 결합체를 구성하는 하나의 모이어티에 해당한다. 그 예로, 상기 F는 FcRn 결합부위를 함유하는 면역글로불린 Fc 영역일 수 있다.
면역글로불린 Fc 영역은 생체 내에서 대사되는 생분해성의 폴리펩타이드이기 때문에, 약물의 캐리어로 사용하기에 안전하다. 또한, 면역글로불린 Fc 영역은 면역글로불린 전체 분자에 비해 상대적으로 분자량이 적기 때문에 결합체의 제조, 정제 및 수율 면에서 유리할 뿐만 아니라, 아미노산 서열이 항체마다 다르기 때문에 높은 비균질성을 나타내는 Fab 부분이 제거되기 때문에, 물질의 동질성이 크게 증가되고 혈중 항원성의 유발 가능성도 낮아지게 되는 효과도 기대할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 면역글로불린 Fc 영역과 융합된 뇌 표적 펩타이드 결합체는 면역글로불린 Fc 영역과 펩타이드 결합으로 연결되어 발현 숙주에서 지속형 결합체로 생산된다. 발현 숙주는 외부 유전자로 형질전환시켜 단백질을 생산할 수 있는 대장균과 같은 미생물일 수 있으며, 효모, 곤충세포, 동물세포등 제한이 없다.
본 발명에서, "면역글로불린 불변영역"은 뇌 표적 지속형 결합체의 모이어티(moiety)를 이루는 일 구성일 수 있는 것으로, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역과 경쇄 불변영역(CL1)을 제외한, 중쇄 불변영역 2 (CH2)및 중쇄 불변영역 3(CH3) 부분을 포함한다. 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 부분을 포함하기도 한다.
상기 면역글로불린 불변 영역은 면역글로불린 Fc 영역일 수 있다.
상기 Fc의 면역글로불린 불변 영역은 면역글로불린 CH1, CH2, CH3, 및 CH4 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 내지 4개의 도메인을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 면역글로불린 불변영역은 1) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, 2) CH1 도메인 및 CH2 도메인, 3) CH1 도메인 및 CH3 도메인, 4) CH2 도메인 및 CH3 도메인, 5) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인 중 1개 또는 2개의 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)와의 조합 (예컨대, CH2 도메인과 CH3 도메인 그리고 힌지 영역 (또는 그 일부)와의 조합), 6) 중쇄 불변영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체일 수 있다. 본 발명의 힌지 영역은 천연의 힌지 영역뿐 아니라, 공지의 힌지 영역의 일부를 모두 포함한다.
구체적으로, 상기 Fc의 면역글로불린 불변 영역은 힌지 영역, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열유도체(mutant)를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연 아미노산 서열중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다. 예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다. 또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC(antibody dependent cell mediated cytotoxicity) 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제WO97/34631호, 국제특허공개 제WO96/32478호 등에 개시되어 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation) 및 아미드화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
상기 기술한 면역글로불린 불변 영역 유도체는 본 발명의 면역글로불린 불변 영역 영역과 동등한 생물학적 활성을 나타내며 면역글로불린 불변 영역의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 것일 수 있다.
예컨대, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 사슬 교환 기능이 일어나지 않을 수 있는 것일수 있다.
또한, 상기 F는 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬 두 개가 서로 이황화 결합으로 연결된 이량체 형태일 수 있다.
상기 면역글로불린 Fc 영역을 구성하는 힌지 영역은 서열번호: 5의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이로 필수적으로 구성되는 것이거나, 혹은 상기 서열번호: 5의 아미노산 서열에서 2 번째 아미노산인 세린(Ser, S)이 프롤린 (Pro, P)으로 변이된 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
상기 면역글로불린 Fc 영역을 구성하는 CH2 도메인은 서열번호: 6의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이로 필수적으로 구성되는 것이거나, 혹은 상기 서열번호: 6의 아미노산 서열에서 67번째 아미노산인 아스파라긴 (Asn, N)이 글루타민 (Gln, Q)으로 변이된 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
보다 더 구체적으로, 상기 F는 IgG 유래의 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬 두 개가 서로 이황화 결합으로 연결된 이량체 형태로서, 상기 힌지 영역이 서열번호: 5의 아미노산 서열, 혹은 상기 서열번호: 5의 아미노산 서열에서 2 번째 아미노산인 세린(Ser, S)이 프롤린 (Pro, P)으로 변이된 서열을 포함하고/하거나 상기 CH2 도메인이 서열번호: 6의 아미노산 서열 또는 상기 서열번호: 6의 아미노산 서열에서 67번째 아미노산인 아스파라긴 (Asn, N)이 글루타민 (Gln, Q)으로 변이된 서열을 포함하고/하거나 CH3 도메인이 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
구체적으로, 상기 F를 구성하는 면역글로불린 불변영역을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬은 서열번호: 92에서 2번째 아미노산이 프롤린으로 치환되거나; 71번째 아미노산이 글루타민으로 치환되거나; 또는 2번째 아미노산은 프롤린으로, 71번째 아미노산은 글루타민으로 치환된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 F를 구성하는 면역글로불린 불변영역을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬은 서열번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
또한, 이러한 면역글로불린 불변 영역은 인간, 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트 또는 기니아 픽 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 획득하는 방법일 수 있다. 파파인을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피 (size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다. 더 구체적인 실시 형태에서는 인간 유래의 Fc 영역을 미생물로부터 수득한 재조합형 면역글로불린 Fc 영역이다.
또한, 면역글로불린 불변 영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, Fc에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc 영역은 보체(c1q)와의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포 독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역 반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 불변 영역이라 할 것이다.
본 발명에서 "당쇄의 제거(Deglycosylation)"는 효소로 당을 제거한 Fc 영역을 말하며, 비당쇄화(Aglycosylation)는 원핵동물, 더 구체적인 실시 형태에서는 대장균에서 생산하여 당쇄화되지 않은 면역글로불린 불변 영역을 의미한다.
한편, 면역글로불린 Fc 영역은 인간 또는 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물기원일 수 있으며, 바람직하게는 인간기원이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합 (combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있다. 그 예로 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM 유래일 수 있으며, 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래일 수 있다. 한편, 본 발명에서 조합(combination)이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 Fc 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.
본 발명에서 "하이브리드(hybrid)"란 단쇄의 면역글로불린 Fc 영역 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 Fc 단편에 해당하는 서열이 존재함을 의미하는 용어이다. 본 발명의 경우 여러 형태의 하이브리드가 가능하다. 즉, IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc 및 IgD Fc의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하며, 힌지를 포함할 수 있다.
한편, IgG 역시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 서브클래스로 나눌 수 있고 본 발명에서는 이들의 조합 또는 이들의 혼성화도 가능하다. 그 예로, IgG2 및 IgG4 서브클래스이며, 구체적인 예로, 보체 의존적 독성(CDC, Complementdependent cytotoxicity)과 같은 이펙터 기능(effector function)이 거의 없는 IgG4의 Fc 영역일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 실시 형태의 한 예로 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG1 Fc 영역 또는 IgG4 Fc 영역이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 화학식 1의 "L1 및/또는 L2"는 상기 뇌 표적 지속형 결합체 또는 융합단백질의 모이어티 (moiety)를 이루는 일 구성요소로, 면역글로불린 Fc 영역에 뇌 표적 펩타이드 또는 생리활성 물질을 결합시키는 링커를 의미한다. 상기 링커(linker)란 기본적으로는 두 개의 융합 파트너를 공유결합 등을 이용하여 연결할 수 있는 연결체를 의미한다. 링커는 융합 파트너를 연결하는 역할 외에도 융합 파트너 사이에 일정한 크기의 간격을 부여하는 역할을 수행하거나, 유연성 또는 강직정을 제공하는 역할을 수행할 수 있다. 그러나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
하나의 구체예로서, 상기 화학식 1의 L1 및 L2 중 하나는 펩타이드성 링커이고, 또 다른 하나는 비펩타이드성 링커인 것을 특징으로 할 수 있다. 또는, 상기 L1 및 L2 중 하나는 펩타이드성 링커이고, 또 다른 하나는 비펩타이드성 링커일 수 있고, 상기 L1 및 L2 모두가 펩타이드성 링커일 수 있으며, 다른 한편으로는 상기 L1 및 L2 중 모두가 비펩타이드성 링커일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
또 하나의 구체예로서, 상기 화학식 1의 상기 L1 및 L2 중 어느 하나 또는 둘 다 비펩타이드성 링커일 때, 비펩타이드성 링커는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 다당류, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히알루론산, 지방산, 고분자 중합체, 저분자 화합물, 뉴클레오타이드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않는다.
또 하나의 구체예로서, 상기 L1은 비펩타이드성 링커이고, L2는 펩타이드성 링커일 때, 펩타이드성 링커는 0부터 1000개의 아미노산을 포함하는 것일 수 있다. 또 하나의 구체예로서, 상기 L1은 비펩타이드성 링커이고, L2는 펩타이드성 링커로 0개의 아미노산을 포함하는 것일 경우 F와 뇌 표적 펩타이드인 Y는 직접 융합 (예, 펩타이드 결합)에 의해 형성될 수 있다.
또 하나의 구체예로서, 상기 화학식 1의 상기 L1 및 L2 중 어느 하나 또는 둘 다 펩타이드성 링커일 때, 상기 X와 F, 또는 F와 Y는 공유 화학결합, 비공유 화학결합 또는 이들의 조합으로 L1 및 L2에 의해 서로 결합되고, L1 및 L2가 0부터 1000개의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 한다. 펩타이드성 링커가 0개의 아미노산 일 경우는 공유 화학결합인 펩타이드 결합에 의해 결합된 것일 수 있다.
또 하나의 구체예로서, 상기 화학식 1의 L1 및 L2 중 어느 하나 또는 둘 다 펩타이드성 링커일 때, L1 및 L2는 0개의 아미노산으로 이루어진 것으로, (i) X와 F, 또는 F와 Y는 펩타이드 결합에 의해 결합된 것이고; 또는 (ii) X와 F, 및 F와 Y는 펩타이드 결합에 의해 결합된 것일 수 있다.
본 발명에서 "펩타이드성 링커"는 두 개의 융합 파트너를 연결하는 펩타이드 결합 또는 아미노산의 중합체를 포함한다. 구체적으로, 상기 펩타이드성 링커는 0개 내지 1000개의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로 0개 내지 900개, 0개 내지 800개, 0개 내지 700개, 0개 내지 600개, 0개 내지 500개, 0개 내지 400개, 0개 내지 300개, 0개 내지 250개, 0개 내지 200개, 0개 내지 150개, 0개 내지 100개, 0개 내지 90개, 0개 내지 80개, 0개 내지 70개, 0개 내지 60개, 0개 내지 50개, 0개 내지 40개, 0개 내지 30개, 0개 내지 25개, 0개 내지 20개, 0개 내지 15개, 또는 0개 내지 10개의 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 펩타이드성 링커의 예로는, GGGGS (서열번호: 89) 모티프, GS 모티프, GGGS (서열번호: 90) 모티프, 또는 GGSG (서열번호: 91) 모티프가 반복되는 형태의 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드를 들 수 있으며, 상기 모티프가 1 내지 10번 반복될 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 L2가 펩타이드성 링커인 경우, L2는 (GS)m, (GGS)m, (GGGS)m, 또는 (GGGGS)m이며, m은 1 내지 10일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또 하나의 구체예로서, 상기 화학식 1의 L1 및 L2 중 어느 하나는 펩타이드성 링커이고, 이 중 다른 하나는 비펩타이드성 링커일 때, 펩타이드성 링커는 0부터 1000개의 아미노산을 포함하는 링커이며, 비펩타이드성 링커는 폴리에틸렌 글리콜인 것을 특징으로 할 수 있다. 그러나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 "비펩타이드성 링커"는 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체적합성 링커를 의미하며, 상기 반복 단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결된다.
또 하나의 구체예로서, 상기 비펩타이드성 링커 및 X 및 Y는 각각의 반응기에 의해 연결되고, 이때 비펩타이드성 링커의 반응기가 알데히드 그룹, 말레이미드(maleimide) 그룹 및 석시니미드 유도체(succinimide derivative)로 이루어진 군이 선택되는 것일 수 있다. 상기 L1은 양 말단 작용기를 가지는 비펩타이드성 중합체이고, 상기 양 말단 작용기는 각각 아민 반응기 (amine-reactive group) 또는 티올 반응기 (thiol-reactive group)이고, 상기 양 말단 작용기는 서로 같은 종류이거나, 다른 종류일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 사용 가능한 비펩타이드성 링커인 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 다당류, 덱스트란, 폴리비닐 에틸 에테르, PLA(폴리락트산, polylactic acid) 및 PLGA(폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히알루론산, 올리고뉴클에오타이드 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 그 예로 폴리에틸렌글리콜일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 당해 분야에 이미 알려진 이들의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명에서 사용될 수 있는 비펩타이드성 링커는 생체 내 단백질 분해 효소에 저항성 있는 중합체이면 제한 없이 사용될 수 있다. 비펩타이드성 중합체의 분자량은 0 초과 약 100 kDa 범위, 그 예로 약 0.5 내지 약 100 kDa, 약 1 내지 약 100 kDa 범위, 또는 약 1 내지 약 20 kDa 범위이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "약"은 ±0.5, ±0.4, ±0.3, ±0.2, ±0.1 등을 모두 포함하는 범위로, 약 이란 용어 뒤에 나오는 수치와 동등하거나 유사한 범위의 수치를 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 비펩타이드성 링커는 한 종류의 중합체뿐만 아니라 상이한 종류의 중합체들의 조합이 사용될 수도 있다.
한편, 본 발명에 사용되는 비펩타이드성 링커인 비펩타이드성 중합체는 면역글로불린 Fc 영역 및 생리 활성 물질이 공유결합을 형성할 수 있도록, 결합체를 형성하기 전, 비펩타이드성 링커는 F 및 X 또는 Y의 작용기와 결합될 수 있는 작용기를 보유할 수 있다.
구체적으로, 상기 비펩타이드성 링커는 적어도 2개의 말단 작용기를 가질 수 있으며, 구체적으로는 2개 또는 3개의 말단 작용기를 가질 수 있고, 보다 더 구체적으로는 2개의 말단 작용기를 가질 수 있다.
상기 작용기는 알데히드기, 말레이미드기 및 석시니미드 유도체로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기에서, 알데히드기로 프로피온 알데히드기 또는 부틸 알데히드기를 예로서 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기에서, 석시니미드 유도체로는 석시니미딜 발레르에이트, 석시니미딜 메틸부타노에이트, 석시니미딜 메틸프로피온에이트, 석시니미딜 부타노에이트, 석시니미딜 프로피오네이트, N-하이드록시석시니미드, 히드록시 석시니미딜, 석시니미딜 카르복시메틸 또는 석시니미딜 카보네이트가 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 비펩타이드성 링커의 양 말단 작용기는 서로 같거나 다를 수 있다.
예를 들어, 한쪽 말단에는 말레이미드기를, 다른 쪽 말단에는 알데히드기, 예컨대, 프로피온 알데히드기, 또는 부틸 알데히드기를 가질 수 있다. 양쪽 말단에 히드록시 작용기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 비펩타이드성 중합체로 이용하는 경우에는 공지의 화학반응에 의해 상기 히드록시기를 상기 다양한 반응기로 활성화하거나, 상업적으로 입수 가능한 변형된 반응기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 본 발명의 뇌표적 지속형 효소 결합체를 제조할 수 있다.
또한, 상기 비펩타이드성 링커의 양 말단 또는 세 말단이 모두 알데히드기인 동종 기능성 비펩타이드성 중합체일 수 있다.
예컨대, 상기 비펩타이드성 링커는 양 말단에 프로피온 알데히드기를 가지는 비펩타이드성 중합체, 구체적으로 양 말단에 프로피온 알데히드기를 가지는 PEG일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
상기 비펩타이드성 링커가 양 말단에 반응 알데히드기의 작용기를 갖는 경우, 비특이적 반응을 최소화하고, 비펩타이드성 중합체의 양 말단에서 생리 활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린과 각각 결합하는데 효과적이다. 알데히드 결합에 의한 환원성 아민화로 생성된 최종 산물은 아미드 결합으로 연결된 것보다 훨씬 안정적이다. 알데히드 작용기는 낮은 pH에서 N-말단에 선택적으로 반응하며, 높은 pH, 예를 들어 pH9.0 조건에서는 라이신 잔기와 공유결합을 형성할 수 있다.
상기 화학결합된 면역글로불린 Fc 영역 결합체는 2개의 사슬로 구성되는 면역글로불린 Fc 영역 (단량체 Fc 영역이 결합한 이량체 형태의 Fc 영역)을 가지며 각각에 결합하는 치료학적 효소는 1군데의 면역글로불린 영역 (단량체 Fc 영역)에만 결합되거나 2군데의 면역글로불린 영역 모두(이량체 형태의 Fc 영역 각각)에 결합될 수 있다.
상기 화학 결합은 공유결합일 수 있고, 보다 구체적으로 이황화 결합일 수 있고, 더욱 더 구체적으로는 두 면역글로불린 Fc 영역의 힌지 영역에서 형성되는 이황화 결합일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로, (i) 상기한 펩타이드성 링커 (예, 펩타이드 결합)를 통하여 뇌 표적 펩타이드가 한 분자의 면역글로불린 Fc 영역의 C-말단 부위에 연결된, 제1 면역글로불린 Fc 영역, 및 (ii) 상기한 펩타이드성 링커 (예, 펩타이드 결합)를 통하여 뇌 표적 펩타이드가 한 분자의 면역글로불린 Fc 영역의 C-말단 부위에 연결된, 제2 면역글로불린 Fc 영역이 화학결합을 통하여 이량체를 형성하고, 이러한 이량체 형태의 면역글로불린 Fc 영역 두 분자 중 한 분자의 N-말단 영역에 한 분자의 치료학적 효소가 연결되거나, 또는 두 분자 모두의 N-말단 영역 각각에 치료학적 효소가 하나씩 연결된 형태일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 상기한 제1 면역글로불린 Fc 영역 및 제2 면역글로불린 Fc 영역은 융합 단백질 형태로서, 면역글로불린 Fc 영역이 뇌 표적 펩타이드와 펩타이드 결합을 통하여 in-frame 융합된 것일 수 있으며, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 상기 제1 면역글로불린 Fc 영역 및 제2 면역글로불린 Fc 영역 간의 화학 결합은 구체적으로 공유결합일 수 있으며, 보다 구체적으로 이황화 결합일 수 있고, 더욱 더 구체적으로는 두 면역글로불린 Fc 영역의 힌지 영역에서 형성되는 이황화 결합일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명을 구현하는 다른 하나의 양태는 상기 결합체를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.
상기 결합체를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드는 해당 서열과 75% 이상, 구체적으로는 85% 이상, 보다 구체적으로는 90% 이상, 더욱 구체적으로는 95% 이상의 서열 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열을 본 발명의 범주에 포함한다.
본 발명에 따른 재조합 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있고, 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주세포로 하여 구축될 수 있다.
본 발명에서 용어, "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 핵산 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 핵산 구조물(construct)을 의미한다.
상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환(transformation) 또는 형질감염(transfection) 시킴으로써, 본 발명의 뇌 표적 지속형 결합체를 수득할 수 있다.
본 발명에서 상기 결합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 형질전환시키기 위한 방법은 상기 예들에 국한되지 않으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 형질전환 또는 형질감염 방법이 제한 없이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포 내로 도입함으로써 본 발명의 형질전환체(transformant)를 획득할 수 있다.
본 발명에 적합한 숙주는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 발현하도록 하는 한 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에 사용될 수 있는 숙주의 특정한 예로는 대장균(E. coli)과 같은 에스케리키아(Escherichia) 속 세균; 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실러스(Bacillus) 속 세균; 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)와 같은 슈도모나스(Pseudomonas) 속 세균; 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)와 같은 효모; 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충세포; 및 CHO, COS, BSC 등과 같은 동물세포가 있다.
본 발명은 또 하나의 양태로서, 상기 뇌 표적 지속형 효소 결합체를 포함하는 조성물을 제공한다.
하나의 구체예로서, 상기 조성물은 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disease, LSD)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물일 수 있다.
구체적으로, 상기 조성물은 뮤코다당체침작증 Ⅱ (mucopolysaccharidosis Ⅱ, MPS Ⅱ)의 예방 또는 치료용일 수 있다.
본 발명의 결합체는 효소 대체 요법 (enzymatic replacement therapy, ERT)의 약물로서 사용될 수 있다. 상기 효소 대체 요법은 질환의 원인이 되는 결핍 또는 부족 효소를 보충함으로써, 저하된 효소 기능의 회복을 통해 질병을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 용어, "리소좀 축적 질환 (lysosomal storage disease, LSD)"은, 상기와 같은 리소좀 기능의 상실로 인한 희귀 유전병을 의미하며, 결함이 있는 효소를 이용한 효소 대체 요법 (enzymatic replacement therapy)가 필수적이다. 상기 리소좀 축적 질환은 결핍된 효소에 따라, 뮤코다당체침작증 (mucopolysaccharidosis, MPS), 글리코겐 축적병 (glycogen storage disease), 스핑고지질증 (sphingolipidosis), 니만-피크병 (Niemann-Pick disease), 파브리병 (Fabry's disease), 고셰병 (Gaucher disease), 헌터증후군 (Hunter syndrome), 및 마로토 라미 증후군 (Maroteaux-Lamy syndrome) 등이 포함될 수 있다.
이두로네이트 2-설파타제가 결핍된 헌터 증후군 환자에게 본 발명의 이두로네이트 2-설파타제를 포함하는 뇌 표적 효소 결합체 또는 뇌 표적 효소 융합단백질을 투여함으로써, 헌터 증후군 환자의 증상을 완화, 또는 치료할 수 있다. 또한, 본 발명의 결합체 또는 융합단백질은 지속성이 증가되고, 뇌 조직으로의 전달, 세포외배출 및 생체내 이용율이 높은 효과를 가지므로, 적은 양의 투여로도 효과적인 헌터 증후군의 예방, 개선, 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 결합체는 상기 Fc 영역이 FcRn과 결합하여, 세포외배출(transcytosis)이 Fc 영역이 연결되지 않은 효소에 비하여 증가되는 효과를 가진다.
FcRn을 매개로 하는 증가된 세포외배출은 효소가 Fc 영역과 연결되어 큰 분자를 형성함에도 불구하고, 세포 내 흡수율을 유지하게 도와줄 뿐만 아니라, 치료 효소가 효소 활성을 오래 유지하면서 체내에 흡수되어 효소 자체의 기능을 수행할 수 있게 함으로써, 헌터 증후군의 치료를 가능케 한다.
한편, 치료학적 효소류 특히 헌터 증후군 치료에 사용되는 이두로네이트 2-설파타제는 생체내 이용율 (BA, bioavailability)이 낮아 정맥주사 (iv, intravenous)로 투여 해야 하는 단점이 있으며, 이러한 정맥주사는 매번 환자가 병원을 방문해야 하는 불편함을 야기한다. 또한, 이러한 정맥주사는 알레르기 타입의 과민성 반응을 유발하여 많은 빈도수로 약물 주입 관련 부작용 (infusion reaction)을 초래한다.
본 발명의 효소 결합체는 FcRn 결합 부위에 의한 세포외배출(transcytosis)로 인하여 생체내 이용율을 높여 정맥주사가 아닌 피하주사를 가능케 하고, 이러한 투여 방법의 변화는 자가주사를 가능케 하여 환자의 편의성을 높이며, 인퓨전 반응 (infusion reaction)을 감소시켜 부작용을 최소화 할 수 있다.
또한, 치료학적 효소류 특히 헌터 증후군에 사용되는 효소 대체 요법(ERT)을 위한 효소들은 특정 조직에 쌓인 노폐물을 제거해야 하므로, 각 조직으로의 고른 분포가 매우 중요하다. 그러나 현재 사용되고 있는 ERT 효소류들은 주로 간으로 많은 분포를 나타내고 있어, 다양한 장기로의 분포를 나타낼 수 있는 약물의 개발이 필수적이다.
본 발명의 치료학적 효소, 특히 이두로네이트 2-설파타제를 포함하는 효소 결합체는 증가된 혈중 반감기와 FcRn 결합 부위에 의한 세포외배출(transcytosis)로 인하여 간 외의 다양한 조직, 특히 골수, 비장, 신장 등에서도 생체내 농도가 높은 우수한 분포를 지니므로, 치료학적 효율을 극대화시킬 수 있다. 특히, 본 발명의 효소 결합체는 높은 골수 표적성을 나타낸다. 골수 조직은 골 내부에 존재하는 유연한 구조의 조직으로, 골수 조직으로의 표적성을 증대시킴으로써, 효소 대체 요법에 의한 골수에서의 약리 작용을 통해 추가 효과를 기대할 수 있어, 헌터 증후군을 효과적으로 치료할 수 있다.
특히 골수에서의 질환은 뼈의 이상증상 혹은 뼈의 생성 억제, 골수에서 필수적으로 만들어져야 되는 적혈구 생성 호르몬과 혈소판 생성 호르몬의 생성 억제를 통해 빈혈등 다양한 부작용을 야기하나 현재 상용화된 효소 치료제는 골수의 분포가 매우 낮아 상기와 같은 부작용이 빈번히 발생한다. 이러한 측면에서, 본 발명의 치료학적 효소를 포함하는 효소 결합체는 높은 골수 표적성을 가짐으로써, 우수한 효소 대체 요법의 치료제가 될 수 있다.
따라서, 본 발명의 뇌 표적 지속형 결합체는 면역글로불린 Fc 영역과 FcRn과의 결합에 의해, 면역글로불린 Fc 영역이 결합하지 않은 생리활성 물질보다 세포외배출, 생체 이용율, 조직 분포성, 및 골수 표적성이 증가한 것일 수 있다.
본 발명의 용어, "뮤코다당체침작증 (mucopolysaccharidosis, MPS)"은 점액성 다당의 유전성분해효소결핍증으로서, "뮤코다당증"이라고도 알려져 있다. 리소좀 효소의 부족으로 인한 리소좀 축적 질환의 하나이다. 당사슬분해효소, 설파타아제나 아세틸기 전이 효소의 결핍 등이 원인으로 알려져 있다. 지방연골이영양증 (gargoylis) 이라고도 한다. 주증상은 요(尿)에 점액성 다당이 과잉 배설되는 것이다. 현재는 6가지 병형으로 분류하는데, Ⅰ형은 후를러 증후군(Hurler syndrome), 샤이증후군(Scheie syndrome)이고, Ⅱ형은 헌터 증후군(Hunter syndrome), Ⅲ형은 산필립포증후근(Sanfilippo syndrome) A, B, C, D형이고, Ⅳ형은 모르키오증후군(Morquio syndrome) A, B형, Ⅵ형은 마로트-라미증후군(Maroteaux-Lamy syndrome), Ⅶ형은 슬라이증후군(Sly syndrome)이다.
본 발명의 용어, "헌터 증후군(Hunter syndrome, Hunter disease)"은 성염색체 열성 유전병으로서, 이두로네이트 2-설파타제 (Iduronate 2-sulfatase, IDS)의 결핍에 의해 발병하며, 상기 효소의 결핍으로 헤파란 설페이트(heparan sulfate), 및 데르마탄 설페이트(dermatan sulfate)가 축적되는 것으로 알려져 있다. 기능 저하, 점진적 청력 소실, 색소성 망막변성, 울혈유두(papilledema) 및 뇌수종 등의 증상을 나타낸다. 본 발명에서 "뮤코다당체침작증 Ⅱ"와 "헌터 증후군"은 혼용될 수 있다.
본 발명의 용어, "예방"은 상기 리소좀 저장 질환 치료를 위한 효소 또는 이를 포함하는 조성물의 투여로 상기 질병의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 상기 효소 또는 이를 포함하는 조성물의 투여로 리소좀 저장 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 조성물이 생체 내 표적에 도달할 수 있는 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 예를 들어 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피 내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 또는 직장 내 투여 등이 될 수 있다.
본 발명의 리소좀 저장 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 상기 리소좀 저장 질환의 원인이 되는 결핍 또는 부족 효소를 상기 질환을 가진 개체에 투여함으로써, 결핍 또는 부족한 효소의 기능을 회복시켜 리소좀 저장 질환을 치료하는 효과를 가질 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 양태는 세포외배출 (transcytosis), 생체 이용율, 조직 분포성, 및 골수 표적성을 증가시키는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 결합체가 FcRn 수용체와의 고유 결합을 통해 상기 효소 결합체가 세포막을 용이하게 통과할 수 있도록 하는 한편, 혈관에서 조직으로 보다 효과적으로 도달할 수 있도록 한다.
이에, 세포외배출 (transcytosis), 생체 이용율, 조직 분포성, 및 골수 표적성이 증가된 효과를 가져, 우수한 리소좀 저장 질환 치료 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 희석제는 비자연적으로 발생된 것일 수 있다. 상기 담체는 특별히 이에 제한되지는 않으나, 경구 투여 시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있고, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어 "약학적으로 허용가능한"이란 치료효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용을 일으키지 않는 것을 의미하며, 질환의 종류, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법, 투여횟수, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
또한, 상기 조성물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위 투여형의 제제, 구체적으로는 단백질 의약품의 투여에 유용한 제제 형태로 제형화시켜 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여 방법을 이용하여 경구, 또는 피부, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 수막강 내, 심실 내, 폐, 경피, 피하, 복 내, 비강 내, 소화관 내, 국소, 설하, 질 내 또는 직장 경로를 포함하는 비경구 투여 경로에 의하여 투여될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 효소 결합체는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 탄수화물, 아스코르브산(ascorbic acid) 또는 글루타티온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이트제, 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers) 등이 약제로 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량과 횟수는 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.
본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량 (single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량 (multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법 (fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 결합체의 바람직한 전체 용량은 하루에 환자 체중 1 kg당 약 0.0001 mg 내지 500 mg일 수 있다. 그러나 상기 결합체의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 본 발명의 조성물의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명은 또 하나의 양태로서, 약제의 제조에 있어서 상기 뇌 표적 지속형 효소 결합체의 용도를 제공한다.
본 발명은 또 하나의 양태로서, 상기 뇌 표적 지속형 효소 결합체를 제조하는 방법을 제공한다.
하나의 구체예로서, 상기 제조 방법은
(a) 상기 숙주세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 숙주세포 또는 이의 배양물로부터 뇌 표적 지속형 효소 결합체를 회수하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
다른 하나의 구체예로서, 상기 제조 방법은
(i) (a) 치료학적 효소인 X, 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커인 L1, 및 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 F가 결합된, X-L1-F, 및 (b) 뇌 표적 펩타이드인 Y, 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커인 L2가 결합된 L2-Y를 제조하는 단계; 및
(ii) 상기 (a) X-L1-F 및 (b) L2-Y를 연결하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
다른 하나의 구체예로서, 상기 제조 방법은
(i) (a) 치료학적 효소인 X 및 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커인 L1이 결합된, X-L1, 및 (b) 뇌 표적 펩타이드인 Y, 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커인 L2 및 F가 결합된 F-L2-Y를 제조하는 단계; 및
(ii) 상기 (a) X-L1 및 (b) F-L2-Y를 연결하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
다른 하나의 구체예로서, 상기 제조 방법은
(a) 양 말단에 각각 같거나 서로 다른 반응성 작용기가 위치하는 비펩타이드성 중합체인 L1의 어느 한 반응성 작용기를 유리된 치료학적 효소인 X와 반응시켜 상기 말단을 통하여 비펩타이드성 중합체가 치료학적 효소에 공유결합으로 연결된 연결체인 X-L1를 얻는 단계; 및
(b) 상기 연결체의 반응하지 않은 말단의 반응성 작용기를 F-L2-Y에 연결시켜 X-L1-F-L2-Y를 얻는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
앞선 구체예에 따른 제조 방법에서, 상기 (b) 단계는 상기 연결체의 반응하지 않은 말단의 반응성 작용기를 하기 화학식 2의 Fa에 연결시키는 것일 수 있다.
[화학식 2]
Figure pat00013
여기에서,
Fa 및 Fb는 각각 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬로서, Fa와 Fb는 힌지 영역에서 이황화 결합으로 서로 연결되고, 이로써 상기 결합체는 Fc 절편을 포함하며, Fa는 L1과 공유결합으로 연결되고,
각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이고,
각각의 BTPb1, ······, BTPbn'은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이며,
각각의 L2a1, ······, L2an은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이고,
각각의 L2b1, ······, L2bn'은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이며,
이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수이다.
상기 제조 방법에서, 상기 반응성 작용기는 알데히드기, 말레이미드기 및 석신이미드 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 알데히드기는 프로피온알데히드기 또는 부틸알데히드기일 수 있다.
상기 석신이미드 유도체는 석신이미딜 카르복시메틸, 석신이미딜 발레르에이트, 석신이미딜 메틸부타노에이트, 석신이미딜 메틸프로피온에이트, 석신이미딜 부타노에이트, 석신이미딜 프로피온에이트, N-하이드록시석신이미드인 또는 석신이미딜 카보네이트일 수 있다.
상기 비펩타이드성 중합체의 양 말단의 반응성 작용기는 모두 알데히드기일 수 있다.
다른 한편으로, 상기 비펩타이드성 중합체는 양 말단에 각각 알데하이드기와 말레이미드기를 반응성 작용기로 가질 수 있다.
다른 한편으로, 상기 비펩타이드성 중합체는 양 말단에 각각 알데하이드기와 석신이미드기를 반응성 작용기로 가질 수 있다.
상기 제조 방법은 하기 화학식 3의 X - L1a - Fa - (L2a1-BTPa1) - ...... - (L2an - BTPan)를 코딩하는 발현 카세트 및 X - L1b - Fb - (L2b1-BTPb1) - ...... - (L2bn' - BTPbn')를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 숙주세포를 배양하는 단계; 및 상기 배양된 숙주세포 또는 이의 배양물로부터 하기 화학식 3의 결합체를 수득하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
[화학식 3]
Figure pat00014
여기에서,
X는 치료학적 효소고,
L1a 및 L1b는 펩타이드성 링커이며,
Fa 및 Fb는 각각 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬로서, Fa와 Fb는 힌지 영역에서 이황화 결합으로 서로 연결되고, 이로써 상기 결합체는 Fc 절편을 포함하며, Fa 및 Fb는 각각 L1a 및 L1b와 공유결합으로 연결되고,
각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이고,
각각의 BTPb1, ······, BTPbn'은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이며,
각각의 L2a1, ······, L2an은 펩타이드성 링커이고,
각각의 L2b1, ······, L2bn'은 펩타이드성 링커이며,
이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수이다.
여기서, 상기 결합체는 X - L1a - Fa - (L2a1-BTPa1) - ...... - (L2an - BTPan) 및 X - L1b - Fb - (L2b1-BTPb1) - ...... - (L2bn' - BTPbn')이 융합 단백질 형태로 발현되고 재접힘 과정에서 Fa 및 Fb 간의 결합이 형성되어 상기 결합체를 형성하는 것일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 면역글로불린 Fc 영역 및 뇌 표적 펩타이드가 결합된 융합 단백질 발현 벡터의 제조
면역글로불린 불변 영역을 포함하며, FcRn 결합부위를 갖는 생체 적합성 물질, 뇌 표적 펩타이드 및 생리활성물질이, 펩타이드성 링커로 연결된, 뇌 표적 펩타이드 및 생리활성 폴리펩타이드를 포함하는 지속성 결합체를 제조하기 위해, 면역글로불린 Fc 영역 및 뇌 표적 펩타이드가 결합된 융합 단백질을 제조하였다.
결합된 생리활성 폴리펩타이드의 반감기를 증가시킬 수 있는, 생체 적합성 물질로 힌지 영역이 포함된 IgG4 Fc 영역을 선택하였으며, 상기 힌지 영역이 포함된 IgG4 Fc 영역과 뇌 표적 펩타이드를 유전자 수준에서 융합하여 발현 벡터에 각각 삽입하였다.
상기 힌지 영역이 포함된 IgG4 Fc 영역과 뇌 표적 펩타이드는 펩타이드 링커로 연결하거나, 직접 융합하는 방식에 의해 구체적으로, 하기와 같은 힌지 영역이 포함된 IgG4 Fc 영역과 뇌 표적 펩타이드가 포함된 융합 단백질을 합성하였다(Bioneer에서 합성) (표 1). 하기 표 1의 서열에서 알 수 있듯이, IgG4 Fc 영역의 C-말단에 뇌 표적 펩타이드의 N-말단이 펩타이드 링커로 연결되거나, 직접 융합하는 방식에 의해 제조된 면역글로불린 Fc 영역 및 뇌 표적 펩타이드가 결합된 융합 단백질을 제조하였다.
Figure pat00015
Figure pat00016
Figure pat00017
Figure pat00018
Figure pat00019
Figure pat00020
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Figure pat00034
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Figure pat00036
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Figure pat00038
Figure pat00039
Figure pat00040
Figure pat00041
Figure pat00042
합성된 면역글로불린 Fc 영역과 융합된 뇌 표적 펩타이드를 코딩하는 유전자는 양쪽 말단에 NdeI과 BamHI를 포함하고 있어 NdeI과 BamHI로 절단한 pET22b 발현 벡터에 삽입하였다. 상기 면역글로불린 Fc 영역과 융합된 뇌 표적 펩타이드를 코딩하는 유전자가 삽입된 발현벡터를 BL21(DE3)균주에 삽입하여 면역글로불린 Fc 영역과 뇌 표적 펩타이드가 연결된 지속형 융합 단백질을 발현시켰다.
실시예 2: 이두로네이트-2-설파타제-Fc-BTP 융합 단백질 발현 벡터의 제조
효소 융합단백질을 생산하기 위해 천연형 이두로네이트-2-설파타제 (Iduronate-2-sulfatase, IDS, 서열번호 69)가 삽입되어 있는 발현 벡터 (IDS cDNA, Cat No. EX-C0003-M02, Gencopoeia)와 합성된 링커(linker, 서열번호 17)와 IgG4 Fc 영역(서열번호 1, 2, 및 3)을 오버래핑 (overlap) PCR을 이용하여 융합단백질 발현 벡터를 제작하였다. 오버래핑 PCR 기법은 각 효소와 링커-Fc를 각각 PCR 증폭 할 때, 프라이머에 서로 중첩되는 서열을 포함하므로, 생산되는 PCR 산물은 중첩되는 서열을 포함하게 된다. 상기 융합단백질 증폭을 위한 PCR 조건은 1차는 95℃ 1분, 57℃ 30초, 68℃ 3분으로 이 과정을 25회 반복하였으며, 2차는 95℃ 1분, 57℃ 30초, 68℃ 4분으로 25회 반복하여 증폭하였다.
구체적으로, IDS는 서열번호 54, 55의 프라이머를 이용하여 PCR을 하고, 링커-Fc는 서열번호 56, 57의 프라이머를 이용하여 PCR을 함으로써, IDS PCR산물은 3'쪽에 링커-Fc 서열을 포함하게 되고, 링커-Fc PCR산물은 5'쪽에 IDS의 서열을 포함하게 된다.
상기 1차 PCR에서 수득된 두 개의 PCR 산물을 주형으로 하여 서열번호 54, 57의 프라이머를 사용하여 2차 PCR을 진행하여, IDS-Fc의 서열을 가진 PCR산물을 얻은 뒤 KpnI, XhoI 제한효소로 오버래핑 서열을 절단하고, 상기 수득된 PCR 산물을 X0GC 벡터에 삽입하여 IDS-Fc 융합단백질을 발현하는 벡터를 구축하였다 (pX0GC-효소-Fc).
Figure pat00043
구축된 융합단백질의 서열 중 Fc 영역에서 사슬 교환 (chain exchange)과 N-글리코실화 부위 (N-glycosylation site)를 제거하기 위하여 부위 특이적 변이 (site-directed mutagenesis) PCR기법을 이용하였다.
구체적으로, 서열번호 58 및 59의 프라이머를 이용하여 사슬 교환에 관여하는 Fc 영역의 2번째 아미노산인 세린 (Serine)을 프롤린 (Proline)으로 대체하였고, 서열번호 60 및 61의 프라이머를 이용하여 N-글리코실화가 이 이루어지는 Fc 영역의 71번째 아미노산인 아스파라긴 (Asparagine)을 글루타민 (Glutamine)으로 치환하였다.
Figure pat00044
Fc 영역에서 사슬 교환 (chain exchange)과 N-글리코실화 부위 (N-glycosylation site)가 제거된 IDS-Fc 융합단백질에 BTP 서열을 삽입하기 위하여 부위 특이적 변이 (site-directed mutagenesis) PCR기법을 이용하였다.
구체적으로, 서열번호 62, 63의 프라이머를 이용하여 Fc-BTP22의 BTP5 서열을 삽입하는 1차 PCR을 진행하여 BTP5 서열이 Fc 영역 C-말단에 삽입된 것을 확인 후, 서열번호 64 및 65의 프라이머를 이용하여 링커와 BTP5 서열을 삽입하는 2차 PCR을 진행 하였다.
상기 1차 PCR과 2차 PCR을 진행하여 X0GC 벡터에 IDS-Fc-BTP22 융합단백질을 발현하는 벡터를 구축하였다.
Figure pat00045
상기 실시예에서 제조된 효소 융합단백질 발현 벡터를 pX0GC-IDS-Fc-BTP22 벡터라 명명하였으며, 다음과 같은 서열을 가진다 (표 5).
Figure pat00046
Figure pat00047
Figure pat00048
실시예 3: 면역글로불린 Fc 영역 및 뇌 표적 펩타이드가 융합된 융합 단백질의 발현, 회수 및 재접힘 (refolding)
(1) 발현
pET22b 벡터 (노바젠사)의 T7 프로모터 조절하의 면역글로불린 Fc 영역 및 뇌 표적 펩타이드가 융합된 융합 단백질의 발현을 수행 하였다. 각각의 구축된 발현벡터로 E.coli BL21-DE3(E. coli B F-dcm ompT hsdS(rB-mB-) gal λDE3); 노바젠)을 형질전환하였다. 형질 전환 방법은 노바젠사에서 추천하는 방법을 따랐다. 각 재조합 발현 벡터가 형질 전환된 각각의 단일 콜로니를 취하여 암피실린(50㎍/ml)이 포함된 2X 루리아 브로스(Luria Broth, LB) 배지에 접종하고, 37℃에서 15시간 배양하였다. 재조합 균주 배양액과 30% 글리세롤이 포함된 2X LB 배지를 1:1(v/v)의 비율로 혼합하여 각 1ml씩 크라이오-튜브에 분주하고, -140℃에 보관하였다. 이를 재조합 융합 단백질의 생산을 위한 세포 스톡(cell stock)으로 사용하였다.
면역글로불린 Fc 영역 및 뇌 표적 펩타이드가 융합된 결합체의 발현을 위하여, 각 세포 스톡(stock) 1 바이알(vial)을 녹여 500 ml의 2X 루리아 브로스(LB)에 접종하고 37℃에서 14~16시간 동안 진탕 배양하였다. OD600의 값이 4.0 이상을 나타내면 배양을 종료하고, 이를 종 배양액으로 사용하였다. 5 L 발효기(Ependorf, 미국)를 이용하여 종 배양액을 1.6 L의 발효 배지에 접종하고 초기 배치(bacth) 발효를 시작하였다. 배양조건은 온도 37℃, 공기량 2 L/분(1 vvm), 교반 속도 650 rpm 그리고 20% 암모니아수를 사용하여 pH 6.70으로 유지시켰다. 발효 진행은 배양액 내의 영양소가 제한되었을 때, 추가배지(feeding solution)를 첨가하여 유가배양을 진행하였다. 균주의 성장은 OD 값에 의해 모니터링하며, OD 값이 120이상에서 최종 농도 0.5mM의 IPTG로 도입하였다. 배양은 도입 후 약 23~25시간까지 더 진행하며, 배양 종료 후, 원심 분리기를 사용하여 재조합 균주를 수획하여 사용 시까지 -80℃에 보관하였다.
(2) 회수 및 재접힘
상기에서 발현시킨 면역글로불린 Fc 영역 및 뇌 표적 펩타이드가 융합된 융합 단백질들을 가용성 형태로 바꾸기 위해 세포를 파쇄하고 리폴딩하였다. 각 배양액 200 ml에 해당하는 세포 펠렛을 200 ml 용해 완충액(50 mM 트리스(pH 9.0), 1 mM EDTA(pH 8.0), 0.2 M 소디움 클로라이드 및 0.5% 트리톤 X-100)에 재부유하였다. 미세용액화(microfluidizer) 프로세서 M-110EH(AC Technology Corp. Model M1475C)를 이용하여 15,000 psi 압력으로 수행하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄된 세포 용해물을 12,200 g으로 4℃에서 30분 원심분리하여 상층액을 버리고, 200 mL 세척완충액(0.5% 트리톤 X-100 및 20 mM 트리스(pH 8.0))에 재부유하였다. 12,200g으로 4℃에서 30분 동안 원심분리하여 펠렛을 200 mL 세척완충액 (20mM 트리스(pH 8.0))에 재부유한 후, 동일한 방법으로 원심분리하였다. 펠렛을 취하여 100 mL의 완충액(8 M Guanidine-HCl, 50mM 트리스(pH 8.0))에 재부유하여 상온에서 2시간 동안 교반하였다. 2시간 후 12,200g으로 23℃에서 30분 동안 원심분리한 후 상층액을 취한 뒤 2.5 mM Dithiothreitol을 첨가한 후 37℃에서 30분동안 교반하였다. 가용화된 면역글로불린 Fc 영역 및 뇌 표적 펩타이드가 융합된 융합 단백질의 재접힘(refolding)을 위하여 여기에 3.5 L의 완충액(3 M 우레아, 1 mM 시스테인, 0.160 M 알지닌, 50mM 트리스 (pH 9.2), 20% 글리세롤)를 연동펌프(peristaltic pump)를 이용하여 1 ml/min의 유속으로 넣어주면서 4℃에서 36시간 교반하였다. 면역글로불린 Fc 영역 및 뇌 표적 펩타이드가 융합된 융합 단백질 내의 면역글로불린 Fc 영역은 이량체 (dimer)로 발현한다.
(3) 정제
(3)-1 친화성 결합 크로마토그래피 (affinity chromatography)정제
재접힘이 끝난 시료를 12,200g으로 4℃에서 30분 동안 원심분리한 후 상층액을 취하여 0.22㎛의 필터 (satorius)로 필터링한 후 시료의 pH를 50% HCl을 이용하여 pH7.5로 조정하였다. 10mM 트리스 (pH 7.0)을 완충액으로 평형화된 ProteinA-sepharose (GE healthcare사) 컬럼에 시료를 결합시킨 후, 100 mM 소디움 시트레이트 (pH 3.3)과 10% 글리세롤 완충액을 사용하여 면역글로불린 Fc 영역 및 뇌 표적 펩타이드가 융합된 결합체 단백질을 용출하였다.
(3)-2 소수성 결합 크로마토그래피 정제
용출된 시료에 0.6M 암모늄 설페이트를 삽입한뒤, 10mM 트리스 (pH 7.5)과 0.6M 암모늄 설페이트을 완충액으로 평형화된 Phenyl HP (GE healthcare사) 컬럼에 0.6M 암모늄 설페이트를 삽입한 시료를 결합시킨 후, 10 mM 트리스 (pH 7.5) 완충액을 사용하여 농도가 0% 에서 100% 가 되도록 6 컬럼 용량의 선형 농도구배로 면역글로불린 Fc 영역 및 뇌 표적 펩타이드가 융합된 융합 단백질을 용출하였다.
실시예 4: 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22 융합 단백질의 발현 및 정제
(1) 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22 융합 단백질의 형질 전환 CHO 세포주 제작
상기 실시예 2에서 제조한 재조합 발현벡터 pX0GC-IDS-Fc-BTP22를 DHFR 유전자가 훼손되어 핵산 생합성 과정이 불완전한 DG44/CHO 세포주(CHO/dhfr-)(콜럼비아 대학의 Chasin 박사로부터 구입)에 도입하여 형질전환체를 수득하고, 상기 형질전환체로부터 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22 융합 단백질을 발현시켰다.
구체적으로, 상기 DG44/CHO 세포주를 배양 용기 바닥의 80 내지 90% 정도를 덮을 정도로 배양시킨 다음, 상기 세포를 Opti-MEM(Lifetechnology사, cat. No. 51985034)으로 3회 세척하였다.
한편, 3 ㎖의 Opti-MEM과 5㎍의 발현 벡터 pX0GC-IDS-Fc-BTP22의 혼합물과, 3㎖의 Opti-MEM과 20 ㎕의 리포펙타민(Lifetechnology사, cat. no. 18324-012)의 혼합물을 각각 상온에서 30분 동안 정치시켰다. 이어, 상기 각 혼합물을 혼합하고 상기 배양된 DG44/CHO 세포주에 가한 다음, 37 ℃ 및 5% CO2 조건으로 약 18시간 동안 배양함으로써, 상기 발현 벡터 pX0GC-IDS-Fc-BTP22를 DG44/CHO 세포주에 도입하였다. 이어, 상기 배양된 세포를 10% FBS가 포함된 DMEM-F12(Lifetechnology사, cat. no. 11330) 배지로 3회 세척한 다음, 상기 배지를 가하고 48시간 동안 다시 배양하였다. 배양된 세포에 트립신을 가하여 배양된 세포들을 각각 분리하고, 이들을 선별배지(HT 보충제(Hypoxanthine-Thymidine)가 없고, 10% FBS 및 1㎎/㎖의 G418(Cellgro사, cat. no. 61-234 -RG)를 포함하는 MEM-α 배지(WELGENE사, cat. no. LM008-02))에 접종하였다. 형질전환된 세포들만이 생존하여 콜로니를 형성할 때까지, 상기 선별배지를 2일 또는 3일 간격으로 교환하며 배양함으로써, 상기 분리된 세포들로부터 형질전환된 세포를 선발하였다. 이때, 상기 선발된 형질전환된 세포에서 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22 결합체의 발현수준을 향상시키기 위하여, 5 nM MTX(Sigma사, cat. no. M8407)를 선별배지에 가하여 점차로 농도를 증가시켜서, 2 내지 3주 후에는 20 nM까지 MTX의 함량을 증가시켰다.
아울러, 상기 형질전환된 세포의 이종성(heterogeneity)을 감소시키기 위하여 한계희석법(limiting dilution method)을 수행하여 단일 클론을 확보하였다. 구체적으로, 96 웰 플레이트에 각 웰 당 0.7 세포수의 비율이 되도록 희석한 상기 형질전환된 세포를 각각 분주하고, 2 내지 3주간 배양하여 단일클론이 나타나는지를 확인하였다. 단일클론이 클러스터를 형성하는 웰이 검색되면, 상기 단일클론을 24웰 플레이트로 옮기고, 각 클론의 세포성장율(cell growth rate)과 이두설파제 유도체의 발현량을 ELISA 방법으로 분석하여, 이두설파제 유도체의 발현량이 가장 우수한 클론을 선별하였다. 그리고 선별된 세포주는 무혈청 배지(EX-CELL CHO 배지, 미국 Sigma사, cat. no. 63289C)를 이용하여 부유배양에 적응시켰다.
(2) 형질전환 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22/CHO를 이용한 재조합 단백질의 생산
상기 (1)에서 선별된 후 부유 배양에 적응되어 액체질소 탱크에 보관 중인 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22 결합체의 발현 세포주 1 바이알(1Х107 세포/㎖)을 꺼내어 37℃ 항온수조에서 최대한 신속히 녹인 후, 종균배양배지(글루타민 0.45g/L가 첨가된 EX-CELL CHO 배지(Sigma사, cat. no. 63289C))로 1회 세척하고 90Хg에서 5분 동안 원심분리하여 종균배양배지 50 mL이 들어있는 삼각 플라스크(Erlenmeyer flask; 미국 Corning사 cat. no. 431144)에 접종하였다. CO2 배양기(37℃, 5% CO2)에서 세포 농도가 10Х105 세포/㎖가 될 때까지 1~2일간 배양한 다음, 위에서와 같은 방법으로 원심분리하여 신선한 종균배양배지 100 mL이 들어있는 새로운 삼각 플라스크로 계대 배양하였다. 같은 방법으로 충분한 수의 세포가 얻어질 때까지 2배씩 배양 부피를 늘려가며 계대 배양하였다. 충분한 수의 세포가 얻어지면 삼각 플라스크에서 자라던 생산 세포를 5 L 규격의 생물반응기(Sartorious사, model: biostat)로 옮겨 배양하였다. 목표로 한 세포 농도인 10Х106 세포/㎖의 농도가 되면, 배양배지에 소디움부틸레이트(시그마사, cat no. 58903C)를 첨가하였으며, 온도를 33도로 맞추어 10일 이상 배양하였다. 배양이 종료되면 배양액을 3,000Хg 에서 60분간 원심분리하여 세포와 상등액으로 분리하였고, 그 중 상등액을 여과하여 -20℃ 냉동 보관하였다.
(3) 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP 융합 단백질의 정제
상기 (2)에서 배양된 배양액 시료를 20mM 트리스 (tris) (pH 7.5)와 글리세롤 (glycerol) 완충액으로 평형화된 rProtein A sepharose fast flow (GE healthcare, 미국) 컬럼에 결합시킨 후, 0.1M 구연산 나트륨 (sodium citrate) (pH 3.0~4.0)와 염화 나트륨 (sodium chloride) 그리고 글리세롤로 이루어진 완충액을 사용하여 용출하였다. 용출된 시료는 황산암모늄 (ammonium sulfate)과 트리스 (pH 7.5)의 농도 구배를 이용하여, Source 15ISO (GE healthcare, 미국)에 적용하여, 재조합 단백질인 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22 를 정제하였다.정제된 재조합 단백질 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22의 SDS-PAGE 확인 결과는 도 1과 같다.
실시예 5: 이두로네이트 2-설파타제와 PEG 결합체 제조
이두로네이트 2-설파타제(약 72kDa)를 포함하는 뇌 표적 지속형 결합체를 제조하였다. 이 뇌 표적 지속형 결합체의 전구체로서 먼저 이두로네이트 2-설파타제에 링커로서 폴리에틸렌글리콜이 연결된 모노페길화 결합체를 다음과 같이 제조하였다.
이두로네이트 2-설파타제(이두설파제, 아일랜드 Shire사)를 적정 농도까지 농축시킨후, 10K butyl-ALD(2) PEG(양 말단의 수소가 각각 부틸 알데하이드기로 개질되어 있는 10 kDa 폴리에틸렌글리콜, 일본 NOF사)를 이두로네이트 2-설파타제 N-말단에 페길화시키기 위하여, 이두로네이트 2-설파타제:10K butyl-ALD(2) PEG의 몰 비를 1:10으로, 이두로네이트 2-설파타제 농도를 10 mg/mL 로 하여 4°C에서 약 2시간 반응시켰다. 이때 0.1 M 인산칼륨(pH 6.0) 완충용액에 20 mM 농도의 NaBH3CN (sodium cyanoborohydirde) 환원제를 첨가하여 반응시켰다. 반응액은 인산나트륨(pH 6.0)과 NaCl 농도 구배를 이용한 Source 15Q(GE, 미국) 컬럼을 사용하여 모노페길화 결합체인 이두로네이트 2-설파타제-10 K PEG를 정제하였다.
실시예 6: 뇌 표적 지속형 결합체인 이두로네이트 2-설파타제-10 kDa PEG-Fc-BTP22 결합체의 제조
다음으로, 이두로네이트 2-설파타제-10 kDa PEG 결합체를 뇌 표적 펩타이드를 포함하는 Fc 절편에 연결시켜 뇌 표적 지속형 결합체를 제조하였다. 실시예 5에서 정제한 이두로네이트 2-설파타제-10 K PEG와 뇌 표적 융합 단백질의 대표예인 Fc-BTP22의 몰비가 1 : 10이 되도록 하고, 이두로네이트 2-설파타제 농도를 10 mg/mL로 하여 25°C에서 15시간 반응시켰다. 이때 반응액은 둘베코 인산 완충액(DPBS)과 환원제로서 10 mM NaBH3CN를 첨가한 용액을 사용하였다.
반응이 종결된 후 반응액을 인산나트륨 완충액(pH 6.0)과 NaCl 농도 구배를 이용하여 Source 15Q(GE, 미국) 컬럼에 적용하고, 황산암모늄과 인산나트륨(pH 6.0)의 농도 구배를 이용하여, Source 15ISO(GE, 미국)에 적용하여, 목적하는 뇌 표적 지속형 결합체인 이두로네이트 2-설파타제-10K PEG-Fc-BTP22를 정제하였다.
실시예 7: 이두로네이트 2-설파타제-10 kDa PEG-Fc-BTP22 결합체의 활성 측정
이두로네이트 2-설파타제-10K PEG-Fc-BTP22 결합체 제조에 따른 효소 활성 (specific activity) 변화가 있는지를 측정하고자 시험관 내 효소 활성 실험을 진행하였다. 이두로네이트 2-설파타제의 효소 기질로 알려진 4MU-α-IdopyraA-2 (4-Methylumbelliferyl-α-L-Idopyranosiduronic Acid-2-sulfate Sodium Salt) 를 이두설파제 베타 및 IDS-Fc-BTP22와 37℃에서 4시간 반응 후, 이차반응 효소인 α-이두로니다제 (α-Iduronidase)와 다시 37℃에서 24시간 반응하였다. 최종적으로 생성되는 4MU (4-Methylumbelliferone)에 대한 형광을 측정함으로써 해당물질에 대한 효소 활성을 측정하였다(도 6).
그 결과, 결합체를 형성하지 않은 유리 이두로네이트 2-설파타제와 이두로네이트 2-설파타제-10K PEG-Fc-BTP22의 효소 활성이 각각 23.4 ± 1.94, 10.8 ± 1.39 nmol/min/㎍로 나타났다. 여기서 효소 활성의 값은 이두로네이트 2-설파타제의 환산 중량(㎍) 당의 특이적 활성으로 계산하였는데, 즉 시간당 효소 반응의 수를 유리 이두로네이트 2-설파타제의 경우는 중량으로, 이두로네이트 2-설파타제-10K PEG-Fc-BTP22의 경우는 이 결합체 내에서 이두로네이트 2-설파타제 부분이 차지하는 환산 중량으로 나눈 값이다. 결론적으로 이두로네이트 2-설파타제 대비, 이두로네이트 2-설파타제 -10K PEG-Fc-BTP22 의 효소 활성이 46.6% 로서, 일부가 감소하긴 하였지만 효소를 본 발명의 뇌 표적 지속형 결합체로 제조하였을 때에도 그 결합체에서 유의미한 효소 활성이 나타남을 확인하였다.
실시예 8: 이두로네이트 2-설파타제-10kDa PEG-Fc-BTP28 결합체의 제조
10K propion-ALD(2) PEG (양 말단에 각각 프로피온 알데히드기를 하나씩 지니고 있는 10K PEG, NOF사, 일본)를 이두로네이트 2-설파타제의 N-말단 (Shire, Ireland)에 페길화시키기 위하여, 이두로네이트 2-설파타제 : PEG의 몰 비를 1:10~20, 이두로네이트 2-설파타제 농도를 10~20 mg/ml로 2~8°C에서 약 1~2시간 반응시켰다. 이때 반응은 0.1M 인산칼륨 (potassium phosphate)(pH 6.0) 완충용액에 20 mM 농도의 소디움 시아노보로하이드라이드(sodium cyanoborohydride (NaCNBH3)) 환원제를 첨가하여 반응시켰다. 반응액은 인산 나트륨 (sodium phosphate) (pH 6.0)과 염화 나트륨 농도 구배를 이용한 Source 15Q (GE healthcare, 미국) 컬럼을 사용하여 모노페길화된 (mono-PEGylated) 이두설파제-10K PEG를 정제하였다.
다음으로, 상기 정제된 모노 페길화된(mono-PEGylated) 이두설파제와 면역글로불린 Fc-BTP28의 몰비가 1:10~15이 되도록 하고, 전체 단백질 농도를 10~20 mg/ml로 하여 2~8°C에서 16시간 반응시켰다. 이때 반응액은 0.1 M 인산칼륨 (pH 6.0)과 환원제로서 20 mM 소디움 시아노보로하이드라이드를 첨가하였다.
반응이 종결된 후, 반응액을 인산 나트륨 (pH 5.6) 완충액과 염화 나트륨 농도 구배를 이용하여 Source 15Q (GE healthcare, 미국) 컬럼에 적용하고, 황산암모늄과 인산나트륨(pH 6.0)의 농도 구배를 이용하여 Source 15ISO (GE healthcare, 미국)에 적용하여, 이두로네이트 2-설파타제-10kDa PEG-Fc-BTP28 결합체(이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP28 결합체와 혼용될 수 있다)를 제조하였다. SDS-PAGE 확인 결과는 도 2와 같다.
실험예 1: 이두로네이트 2-설파타제 -Fc-BTP22 융합단백질 및 이두로네이트 2-설파타제-10kDa PEG-Fc-BTP28 결합체의 in vitro 효소 활성 확인
실시예 4에 따라 제조된 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22 융합단백질과 실시예 5에 따라 제조된 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP28 결합체의 지속형 결합체 제조에 따른 효소활성 변화를 측정하고자 in vitro 시험관 효소활성 측정을 진행하였다. 이두로네이트 2-설파타제의 효소기질로 알려진 4MU-α-IdopyraA-2 (4-Methylumbelliferyl a-L-Idopyranosiduronic Acid-2-sulfate Sodium Salt )를 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22 융합단백질 및 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP28 결합체와 37 ℃에서 4시간 반응 후, 이차반응 효소인 α-Iduronidase 와 다시 37 ℃에서 24시간 반응하였다. 최종적으로 생성되는 4-Methylumbelliferone (4MU) 에 대한 형광을 측정함으로써 해당물질에 대한 효소활성을 측정하였다 (도 3).그 결과, 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22 융합단백질과 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP28 결합체의 효소활성 (specific activity)이 각각 45.0 ± 11.4, 41.2 ± 1.2 nmol/min/μg 임을 확인하였다. 결론적으로 이두로네이트 2-설파타제 대비, 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22 융합단백질과 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP28 결합체의 효소활성이 95.5, 87.4% 로 뇌 표적 지속형 결합체 및 융합단백질 제조 후에도 효소 활성이 유사한 수준임을 확인하였다.
실험예 2: 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22 융합단백질의 뇌 조직 분포 확인
이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22 융합단백질의 뇌 혈관 장벽(blood brain barrier, BBB) 통과 정도를 확인하기 위해 정상 마우스에서 뇌 분포 실험(brain distribution)을 진행하였다. 정상 마우스의 정맥내 주사(intravenous)를 통해 6.58nmol/kg로 투여한 뒤 1시간 후 마우스의 뇌를 분리한 후 각 결합체 단백질의 농도를 측정하여 뇌 혈관 장벽(BBB) 통과 정도를 확인하였다 (도 4). 그 결과, 뇌 표적 지속형 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22 융합단백질의 뇌 혈관 장벽 통과 정도는 천연형 이두로네이트 2-설파타제보다 뇌에서 높은 농도로 측정되어 높은 통과 정도를 보였다. 현재 무코다당류 타입 II (mucopolysaccharide type Ⅱ, MPSⅡ)의 치료는 효소 대체요법(enzyme replacement therapy, ERT)으로서 천연형 이두로네이트 2-설파타제를 정맥 주사하는 방법이 주를 이루고 있으나, 이는 BBB 통과가 어려워 뇌를 포함하는 중추신경계에 효과적으로 작용하지 못하는 한계가 있다. 하지만 본 발명에서의 뇌 표적 지속형 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22 융합단백질은 뇌로의 전달에 대한 가능성이 확인되어 기존의 효소 대체요법의 한계를 극복할 수 있음을 시사한다.
실험예 3: 이두로네이트 2-설파타제 넉아웃 마우스에서 이두로네이트 2-설파타제- -Fc-BTP22 융합단백질 및 이두로네이트 2-설파타제-10kDa PEG-Fc-BTP28 결합체의 투여에 따른 생체 내 ( in vivo ) 효능 시험
실시예 4에 따른 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22 융합단백질과 실시예 5에 따른 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP28 결합체의 투여에 따른 효능을 확인하기 위하여 마우스를 7그룹으로 준비하였다.
첫 번째 그룹의 야생형 (WT) 마우스 (n=4)에는 뇌 표적 지속형 이두로네이트 2-설파타제 부형제를 투여하였고, 두 번째 그룹부터는 이두로네이트 2-설파타제 넉아웃마우스 (n=4) 시험군으로, 군 2: 뇌 표적 지속형 이두로네이트 2-설파타제 부형제 투여, 군 3: 이두로네이트 2-설파타제 0.5 mg/kg (주 1회, 정맥투여), 군 4: 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22 융합단백질 2 mg/kg (2주 1회, 정맥투여), 군 5: 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22 융합단백질 4 mg/kg (2주 1회, 피하투여), 군 6: 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP28의 결합체 2 mg/kg (2주 1회, 정맥투여), 군 7: 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP28의 결합체 4 mg/kg (2주 1회, 피하투여)이 있다. 실험이 진행되는 동안 투여 전과 투여 후 1주 간격으로 소변을 채취하여 각각 글리코사미노글리칸 (glycosaminoglycan, GAG) 함량을 측정하고 크레아티닌 함량을 측정하여 GAG 함량을 보정하였다.GAG 측정을 위해, 소변 샘플 50μL를 96웰 플레이트에 넣고 디메틸메틸렌블루(dimethylmethylene blue) 용액을 250μL 첨가한 후 섞어주고 ELISA 리더에 의해 525nm에서 GAG를 정량 한 후, 상호 비교하였다. 통계 처리는 일원분산 분석(one-way ANOVA)을 사용하여 부형제 군(대조군) 및 시험군 사이를 비교하였다.GAG 함량을 측정한 결과, 도 5에서 보는 바와 같이, 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22 융합단백질과 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP28 결합체 투여 군은 2주 후 소변의 GAG 감소량이 정상 마우스의 GAG 함량 수준으로 유지되는 것을 확인하였다. 상기 결과는 뇌 표적 지속형 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP22 융합단백질과 이두로네이트 2-설파타제-Fc-BTP28 결합체가 GAG가 분해되지 않아 축적되는 헌터증후군에 치료효과를 가질 수 있음을 시사한다.
실험예 4: 면역글로불린 Fc 영역과 서로 다른 뇌 표적 펩타이드가 2개 이상 연결되어 있는 융합 단백질의 제조
(1) 면역글로불린 Fc 영역과 서로 다른 뇌 표적 펩타이드가 2개 이상 연결되어 있는 융합 단백질의 발현벡터의 제조
추가적인 융합단백질을 발현하기 위해 다음과 같이 발현벡터를 제조하였다. 결합된 생리활성 폴리펩타이드의 반감기를 증가시킬 수 있는, 생체 적합성 물질로 힌지 영역이 포함된 IgG4 Fc 영역을 선택하였으며, 상기 힌지 영역이 포함된 IgG4 Fc 영역과 서로 다른 2개 이상의 뇌 표적 펩타이드를 유전자 수준에서 융합하여 발현 벡터에 각각 삽입하였다.
상기 힌지 영역이 포함된 IgG4 Fc 영역과 서로 다른 2개 이상의 뇌 표적 펩타이드는 펩타이드 링커로 연결하거나, 직접 융합하는 방식에 의해 구체적으로, 하기 표 7과 같은 서열을 지니는, 힌지 영역이 포함된 IgG4 Fc 영역과 이 Fc CH3 영역의 C-말단 방향에 2개 이상의 뇌 표적 펩타이드가 펩타이드 결합으로 연결된 융합 단백질들을 하기의 Primer (표 6)를 이용하여 제조하였다. 구체적으로는 Fc-BTP28 발현벡터에 BTP16 서열과 Linker를 삽입하기 위하여 서열번호 94, 95의 프라이머를 이용하여 Fc-BTP29를, 서열번호 96, 97번의 프라이머를 이용하여 Fc-BTP30을 Site-mutagenesis PCR 기법을 이용하여 제조하였다. 하기 표 7의 서열에서 알 수 있듯이, IgG4 Fc 영역의 C-말단에 두 개 이상의 뇌 표적 펩타이드의 N-말단이 펩타이드 링커로 연결되거나, 직접 융합하는 방식에 의해 제조된 면역글로불린 Fc 영역 및 뇌 표적 펩타이드가 결합된 융합 단백질을 제조하였다.
Figure pat00049
Figure pat00050
Figure pat00051
Figure pat00052
상기 면역글로불린 Fc 영역과 융합된 뇌 표적 펩타이드를 코딩하는 유전자가 삽입된 발현벡터를 BL21(DE3)균주에 삽입하여 면역글로불린 Fc 영역과 뇌 표적 펩타이드가 연결된 지속형 융합 단백질을 발현시켰다.
(2) 면역글로불린 Fc 영역과 서로 다른 뇌 표적 펩타이드가 2개 이상 연결되어 있는 융합 단백질의 정제
상기 (1)에서 발현시킨 면역글로불린 Fc 영역 및 뇌 표적 펩타이드가 융합된 융합 단백질들을 가용성 형태로 바꾸기 위해 세포를 파쇄하고 리폴딩하였다. 각 배양액 200 ml에 해당하는 세포 펠렛을 200 ml 용해 완충액(50 mM 트리스(pH 9.0), 1 mM EDTA(pH 8.0), 0.2 M 소디움 클로라이드 및 0.5% 트리톤 X-100)에 재부유하였다. 미세용액화(microfluidizer) 프로세서 M-110EH(AC Technology Corp. Model M1475C)를 이용하여 15,000 psi 압력으로 수행하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄된 세포 용해물을 12,200 g으로 4℃에서 30분 원심분리하여 상층액을 버리고, 200 mL 세척완충액(0.5% 트리톤 X-100 및 20 mM 트리스(pH 7.0))에 재부유하였다. 12,200g으로 4℃에서 30분 동안 원심분리하여 펠렛을 200 mL 세척완충액 (20mM 트리스(pH 7.0))에 재부유한 후, 동일한 방법으로 원심분리하였다. 펠렛을 취하여 400 mL의 완충액(8 M Urea, 20 mM 트리스(pH 7.0), 1 mM EDTA)에 재부유하여 상온에서 3시간 동안 교반하였다. 3시간 후 12,200g으로 4℃에서 30분 동안 원심분리한 후 상층액을 취한 뒤 0.5 mM 시스테인을 첨가한 후 37℃에서 30분동안 교반하였다. 가용화된 면역글로불린 Fc 영역 및 뇌 표적 펩타이드가 융합된 융합 단백질의 재접힘(refolding)을 위하여 여기에 600 mL의 완충액(0.11 mM 시스테인, 0.5 M 알지닌, 50 mM 트리스 (pH 9.5))를 연동펌프(peristaltic pump)를 이용하여 천천히 넣어주면서 4℃에서 36시간 교반하였다. 면역글로불린 Fc 영역 및 뇌 표적 펩타이드가 융합된 융합 단백질 내의 면역글로불린 Fc 영역은 이량체 (dimer)로 발현한다.
재접힘이 끝난 시료를 12,200g으로 4℃에서 30분 동안 원심분리한 후 상층액을 취하여 0.22㎛의 필터 (satorius)로 필터링한 후 시료의 pH를 50% HCl을 이용하여 pH7.5로 조정하였다. 10mM 트리스 (pH 7.0)을 완충액으로 평형화된 ProteinA-sepharose (GE healthcare사) 컬럼에 시료를 결합시킨 후, 100 mM 소디움 시트레이트 (pH 3.3)과 10% 글리세롤 완충액을 사용하여 면역글로불린 Fc 영역 및 뇌 표적 펩타이드가 융합된 결합체 단백질을 용출하였다.
용출된 시료에 0.6M 암모늄 설페이트를 삽입한뒤, 10mM 트리스 (pH 7.5)과 0.6M 암모늄 설페이트을 완충액으로 평형화된 Phenyl FF (GE healthcare사) 컬럼에 0.6M 암모늄 설페이트를 삽입한 시료를 결합시킨 후, 10 mM 트리스 (pH 7.5) 완충액을 사용하여 농도가 0% 에서 100% 가 되도록 10 컬럼 용량의 선형 농도구배로 면역글로불린 Fc 영역 및 뇌 표적 펩타이드가 융합된 융합 단백질을 용출하였다.
이로부터 제조된 융합 단백질을 이두로네이트 2-설파타제와 결합시킴으로써 본 발명의 뇌 표적으로 하는 지속형 이두로네이트 2-설파타제 결합체를 제조할 수 있다.
상기와 같은 결과들은 본 발명의 뇌 표적 지속형 이두로네이트 2-설파타제 결합체가 기존의 다른 치료적 효소에 비하여 체내 노출 정도 및 조직 분포성이 우수하고, 뇌 조직으로의 이두로네이트 2-설파타제 전달정도가 증가되며, 리소좀 축적 질환의 획기적인 치료제로 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> HANMI PHARM. CO., LTD. <120> Brain-targeted long-acting therapeutic enzyme conjugates <130> KPA180361-KR-P1 <150> KR 10-2018-0037714 <151> 2018-03-30 <150> KR 10-2018-0069887 <151> 2018-06-18 <160> 97 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 hinge <400> 1 atgccatcat gccca 15 <210> 2 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 CH2 <400> 2 gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacacc 60 ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac 120 cctgaggtcc agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 180 ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 240 caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccatcc 300 tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 330 <210> 3 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 CH3 <400> 3 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag 60 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 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Glu Lys Met Lys Thr Ser Ala Ser Pro Phe Phe Leu Ala Val Gly 210 215 220 Tyr His Lys Pro His Ile Pro Phe Arg Tyr Pro Lys Glu Phe Gln Lys 225 230 235 240 Leu Tyr Pro Leu Glu Asn Ile Thr Leu Ala Pro Asp Pro Glu Val Pro 245 250 255 Asp Gly Leu Pro Pro Val Ala Tyr Asn Pro Trp Met Asp Ile Arg Gln 260 265 270 Arg Glu Asp Val Gln Ala Leu Asn Ile Ser Val Pro Tyr Gly Pro Ile 275 280 285 Pro Val Asp Phe Gln Arg Lys Ile Arg Gln Ser Tyr Phe Ala Ser Val 290 295 300 Ser Tyr Leu Asp Thr Gln Val Gly Arg Leu Leu Ser Ala Leu Asp Asp 305 310 315 320 Leu Gln Leu Ala Asn Ser Thr Ile Ile Ala Phe Thr Ser Asp His Gly 325 330 335 Trp Ala Leu Gly Glu His Gly Glu Trp Ala Lys Tyr Ser Asn Phe Asp 340 345 350 Val Ala Thr His Val Pro Leu Ile Phe Tyr Val Pro Gly Arg Thr Ala 355 360 365 Ser Leu Pro Glu Ala Gly Glu Lys Leu Phe Pro Tyr Leu Asp Pro Phe 370 375 380 Asp Ser Ala Ser Gln Leu Met Glu Pro Gly Arg Gln Ser Met Asp Leu 385 390 395 400 Val Glu Leu Val Ser Leu Phe Pro Thr Leu Ala Gly Leu Ala Gly Leu 405 410 415 Gln Val Pro Pro Arg Cys Pro Val Pro Ser Phe His Val Glu Leu Cys 420 425 430 Arg Glu Gly Lys Asn Leu Leu Lys His Phe Arg Phe Arg Asp Leu Glu 435 440 445 Glu Asp Pro Tyr Leu Pro Gly Asn Pro Arg Glu Leu Ile Ala Tyr Ser 450 455 460 Gln Tyr Pro Arg Pro Ser Asp Ile Pro Gln Trp Asn Ser Asp Lys Pro 465 470 475 480 Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ile Met Gly Tyr Ser Ile Arg Thr Ile Asp 485 490 495 Tyr Arg Tyr Thr Val Trp Val Gly Phe Asn Pro Asp Glu Phe Leu Ala 500 505 510 Asn Phe Ser Asp Ile His Ala Gly Glu Leu Tyr Phe Val Asp Ser Asp 515 520 525 Pro Leu Gln Asp His Asn Met Tyr Asn Asp Ser Gln Gly Gly Asp Leu 530 535 540 Phe Gln Leu Leu Met Pro 545 550 <210> 70 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified IgG4 hinge <400> 70 Pro Pro Cys Pro 1 <210> 71 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified IgG4 CH2 <400> 71 Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 110 <210> 72 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BTP <400> 72 Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Ser Arg Gly Lys Arg Asn Asn Phe Lys Thr 1 5 10 15 Glu Glu Tyr <210> 73 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BTP <400> 73 Ser Val Ile Asp Ala Leu Gln Tyr Lys Leu Glu Gly Thr Thr Arg Leu 1 5 10 15 Thr Arg Lys Arg Gly Leu Lys Leu Ala Thr Ala Leu Ser Leu Ser Asn 20 25 30 Lys Phe Val Glu Gly Ser 35 <210> 74 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BTP <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Xaa1 is acetylated <400> 74 Cys Met Pro Arg Leu Arg Gly Cys 1 5 <210> 75 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BTP <400> 75 Thr His Arg Pro Pro Met Trp Ser Pro Val Trp Pro 1 5 10 <210> 76 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BTP <400> 76 Pro Trp Val Pro Ser Trp Met Pro Pro Arg His Thr 1 5 10 <210> 77 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BTP <400> 77 Cys Arg Thr Ile Gly Pro Ser Val Cys 1 5 <210> 78 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BTP <400> 78 Tyr Gln Gln Ile Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Ile Gln Ile 1 5 10 15 Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu 20 25 30 <210> 79 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BTP <400> 79 Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Pro Gly Thr Pro Cys Asp 1 5 10 15 Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Asn Gly 20 25 <210> 80 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BTP <400> 80 Gly Arg Glu Ile Arg Thr Gly Arg Ala Glu Arg Trp Ser Glu Lys Phe 1 5 10 15 <210> 81 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BTP <400> 81 Cys Asn Cys Lys Ala Pro Glu Thr Ala Leu Cys Ala Arg Arg Cys Gln 1 5 10 15 Gln His <210> 82 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BTP <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Xaa is diaminopropionic acid <400> 82 Xaa Lys Ala Pro Glu Thr Ala Leu Asp 1 5 <210> 83 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BTP <400> 83 His Leu Asn Ile Leu Ser Thr Leu Trp Lys Tyr Arg Cys 1 5 10 <210> 84 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BTP <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7) <223> O-beta-Glc is attached thereto <400> 84 Gly Phe Thr Gly Phe Leu Ser 1 5 <210> 85 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BTP <400> 85 Thr Gly Asn Tyr Lys Ala Leu His Pro His Asn Gly 1 5 10 <210> 86 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BTP <400> 86 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 87 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BTP <400> 87 Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe Ser Thr Ser Thr 1 5 10 15 Gly Arg <210> 88 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BTP <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(4) <223> Xaa = Phenylproline <400> 88 Xaa Xaa Xaa Xaa 1 <210> 89 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker motif <400> 89 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 90 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker motif <400> 90 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 91 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker motif <400> 91 Gly Gly Ser Gly 1 <210> 92 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 Fc <400> 92 Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 1 5 10 15 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 20 25 30 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 35 40 45 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 50 55 60 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 65 70 75 80 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 85 90 95 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 100 105 110 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 115 120 125 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 130 135 140 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 145 150 155 160 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 165 170 175 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 180 185 190 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 195 200 205 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 210 215 220 <210> 93 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> modified IgG4 Fc <400> 93 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 1 5 10 15 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 20 25 30 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 35 40 45 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 50 55 60 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 65 70 75 80 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 85 90 95 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 100 105 110 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 115 120 125 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 130 135 140 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 145 150 155 160 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 165 170 175 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 180 185 190 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 195 200 205 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 210 215 220 <210> 94 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BTP29_F <400> 94 aaaccccgaa agttcgtgtg ggcggaggtg gctctaagct ggtgttcttt gcagaagatt 60 gaggatccga attcgagct 79 <210> 95 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BTP29_R <400> 95 agctcgaatt cggatcctca atcttctgca aagaacacca gcttagagcc acctccgccc 60 acacgaactt tcggggttt 79 <210> 96 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BTP30_F <400> 96 tggtgttctt tgcagaagat ggcggaggtg gctctaagtg gaaaaccccg aaagttcgtg 60 tgtaaggatc cgaattcgag ct 82 <210> 97 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BTP30_R <400> 97 agctcgaatt cggatcctta cacacgaact ttcggggttt tccacttaga gccacctccg 60 ccatcttctg caaagaacac ca 82

Claims (66)

  1. 치료학적 효소와 뇌 표적 펩타이드가 각각 독립적으로 면역글로불린 Fc 영역에 펩타이드성 링커 또는 비펩타이드성 링커로 연결된,
    뇌 표적 지속형 효소 결합체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 뇌 표적 지속형 효소 결합체는 하기 화학식 1로 표시되는,
    뇌 표적 지속형 효소 결합체:
    [화학식 1]
    X-L1-F-L2-Y
    여기에서,
    X는 치료학적 효소이며,
    Y는 뇌 표적 펩타이드 (BTP)이고,
    L1 및 L2는 각각 독립적으로 펩타이드성 링커 또는 비펩타이드성 링커이며,
    L1 및 L2가 펩타이드성 링커일 때, 상기 펩타이드성 링커는 0개부터 1000개의 아미노산을 포함하며,
    F는 FcRn 결합 부위를 포함하는 면역글로불린 불변 영역임.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 뇌 표적 펩타이드는 뇌 혈관 장벽을 통과 가능한 아미노산 서열을 가지는, 펩타이드, 단백질 또는 항체를 포함하는 것인,
    뇌 표적 지속형 효소 결합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뇌 표적 펩타이드는 수동전달(passive transport)에 의한 경로 또는 수용체 매개 전달(receptor-mediated transport)에 의한 경로를 통해 뇌 혈관 장벽을 통과하는 것인,
    뇌 표적 지속형 효소 결합체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 수용체 매개 전달에 의한 경로는 인슐린 수용체(insulin receptor), 트랜스페린 수용체(transferrin receptor), 저밀도 지질단백질 수용체(low density lipoprotein receptor), 저밀도 지질단백질 수용체 관련 단백질(Low density lipoprotein receptor-related protein), 렙틴 수용체(leptin receptor), 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nicotinic acetylcholine receptor), 글루타티온 수송체(Glutathione transporter), 칼슘의존성 칼륨통로(calcium-activated potassium channel), 및 RAGE (receptor for advanced glycation endproducts), 및 상기 수용체들의 리간드 및 상기 수용체 또는 리간드에 결합하는 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 통하여 수용체 매개 전달 경로에 의해 뇌 혈관 장벽을 통과하는,
    뇌 표적 지속형 효소 결합체.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 L1은 F의 N-말단 영역에 연결되고, L2는 F의 C-말단 영역에 연결된 것인,
    뇌 표적 지속형 효소 결합체.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 L1은 X의 N-말단 또는 C-말단에 연결되고, L2는 Y의 N-말단 또는 C-말단 영역에 연결된 것인,
    뇌 표적 지속형 효소 결합체.
  8. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 L1은 X의 N-말단 또는 C-말단에 연결되고, L2는 Y의 N-말단 영역에 연결된 것인,
    뇌 표적 지속형 효소 결합체.
  9. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 화학식 1의 F-L2-Y는 하기 화학식 2로 표시되는 구조인 것인,
    뇌 표적 지속형 효소 결합체:
    [화학식 2]
    Figure pat00053


    여기에서,
    Fa 및 Fb는 각각 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬로서, Fa와 Fb는 힌지 영역에서 이황화 결합으로 서로 연결되고, 이로써 상기 결합체는 Fc 절편을 포함하며, Fa는 L1과 공유결합으로 연결되고,
    각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이고,
    각각의 BTPb1, ······, BTPbn'은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이며,
    각각의 L2a1, ······, L2an은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이고,
    각각의 L2b1, ······, L2bn'은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이며,
    이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수이다.
  10. 제9항에 있어서,
    각각의 L2a1, ······, L2an은 서로 같거나 다른 펩타이드성 링커이고,
    각각의 L2b1, ······, L2bn'은 서로 같거나 다른 펩타이드성 링커이며,
    이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수인,
    뇌 표적 지속형 효소 결합체.
  11. 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, L1은 Fa의 N-말단에 연결된 것이고, L2a1 및 L2b1는 각각 Fa 및 Fb의 C-말단에 연결된 것인,
    뇌 표적 지속형 효소 결합체.
  12. 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 화학식 1의 X-L1-F-L2-Y는 하기 화학식 3으로 표시되는 구조인,
    뇌 표적 지속형 효소 결합체:
    [화학식 3]
    Figure pat00054


    여기에서,
    X는 치료학적 효소이고,
    L1a 및 L1b는 각각 독립적으로 펩타이드성 링커 또는 비펩타이드성 링커이며,
    Fa 및 Fb는 각각 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬로서, Fa와 Fb는 힌지 영역에서 이황화 결합으로 서로 연결되고, 이로써 상기 결합체는 Fc 절편을 포함하며, Fa 및 Fb는 각각 L1a 및 L1b와 공유결합으로 연결되고,
    각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이고,
    각각의 BTPb1, ······, BTPbn'은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이며,
    각각의 L2a1, ······, L2an은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이고,
    각각의 L2b1, ······, L2bn'은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이며,
    이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수이다.
  13. 제12항에 있어서,
    각각의 L2a1, ······, L2an은 서로 같거나 다른 펩타이드성 링커이고,
    각각의 L2b1, ······, L2bn'은 서로 같거나 다른 펩타이드성 링커이며,
    이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수인,
    뇌 표적 지속형 효소 결합체.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서,
    상기 L1a 및 L1b는 각각 Fa 및 Fb의 N-말단에 연결된 것이고, L2a1 및 L2b1는 각각 Fa 및 Fb의 C-말단에 연결된 것인,
    뇌 표적 지속형 효소 결합체.
  15. 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 화학식 1의 X-L1-F-L2-Y는 하기 화학식 4로 표시되는 구조인,
    뇌 표적 지속형 효소 결합체:
    [화학식 4]
    Figure pat00055


    여기에서,
    X는 치료학적 효소이고,
    L1은 펩타이드성 링커 또는 비펩타이드성 링커이며,
    Fa 및 Fb는 각각 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬로서, Fa와 Fb는 힌지 영역에서 이황화 결합으로 서로 연결되고, 이로써 상기 결합체는 Fc 절편을 포함하며, Fa는 L1과 공유결합으로 연결되고,
    각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이고,
    각각의 BTPb1, ······, BTPbn'은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이며,
    각각의 L2a1, ······, L2an은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이고,
    각각의 L2b1, ······, L2bn'은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이며,
    이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수이다.
  16. 제15항에 있어서,
    각각의 L2a1, ······, L2an은 서로 같거나 다른 펩타이드성 링커이고,
    각각의 L2b1, ······, L2bn'은 서로 같거나 다른 펩타이드성 링커이며,
    이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수인,
    뇌 표적 지속형 효소 결합체.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, L1은 Fa의 N-말단에 연결된 것이고, L2a1 및 L2b1는 각각 Fa 및 Fb의 C-말단에 연결된 것인,
    뇌 표적 지속형 효소 결합체.
  18. 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 1의 X-L1-F-L2-Y는 하기 화학식 5로 표시되는 구조인,
    뇌 표적 지속형 효소 결합체:
    [화학식 5]
    Figure pat00056


    여기에서,
    상기 X는 치료학적 효소이고,
    L1은 펩타이드성 링커 또는 비펩타이드성 링커이고,
    Fa 및 Fb는 각각 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬로서, Fa와 Fb는 힌지 영역에서 이황화 결합으로 서로 연결되고, 이로써 상기 결합체는 Fc 절편을 포함하며, Fa는 L1과 공유결합으로 연결되고,
    각각의 Ya 및 Yb는 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드고,
    각각의 L2a 및 L2b는 서로 같거나 다른 펩타이드성 링커이며,
    이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수이다.
  19. 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화학식 1의 X-L1-F-L2-Y는 하기 화학식 5로 표시되는 구조인,
    뇌 표적 지속형 효소 결합체:
    [화학식 6]
    Figure pat00057


    여기에서,
    상기 X는 치료학적 효소이고,
    L1a 및 L1b는 각각 독립적으로 펩타이드성 링커 또는 비펩타이드성 링커이며,
    Fa 및 Fb는 각각 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬로서, Fa와 Fb는 힌지 영역에서 이황화 결합으로 서로 연결되고, 이로써 상기 결합체는 Fc 절편을 포함하며, Fa 및 Fb는 각각 L1a 및 L1b와 공유결합으로 연결되고,
    각각의 Ya 및 Yb는 서로 같거나 다른 뇌표적 펩타이드이고,
    각각의 L2a 및 L2b는 서로 같거나 서로 다른 펩타이드성 링커이며,
    이 때 n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수이다.
  20. 제9항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, n=n'이고, 각각 L2a1 = L2b1, ······, L2an = L2bn'과 BTPa1 = BTPb1, ······, BTPan = BTPbn'의 조건을 만족하는,
    뇌 표적 지속형 효소 결합체.
  21. 제20항에 있어서,
    각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 같은 뇌 표적 펩타이드이고,
    각각의 BTPb1, ······, BTPbn'은 서로 같은 뇌 표적 펩타이드이며,
    각각의 L2a1, ······, L2an은 펩타이드성 링커이고,
    각각의 L2b1, ······, L2bn'은 펩타이드성 링커인, 뇌 표적 지속형 결합체.
  22. 제20항에 있어서,
    각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 다른 뇌 표적 펩타이드이고,
    각각의 BTPb1, ······, BTPbn'은 서로 다른 뇌 표적 펩타이드이며,
    각각의 L2a1, ······, L2an은 펩타이드성 링커이고,
    각각의 L2b1, ······, L2bn'은 펩타이드성 링커인, 뇌 표적 지속형 결합체.
  23. 제9항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    n=n'이고,
    BTPa1 ≠ BTPb1, ······, BTPan ≠ BTPbn' 중 어느 하나의 요건을 만족하는
    뇌 표적 지속형 결합체.
  24. 제23항에 있어서,
    각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 같은 뇌 표적 펩타이드이고,
    각각의 BTPb1, ······, BTPbn'은 서로 같은 뇌 표적 펩타이드이며,
    각각의 L2a1, ······, L2an은 펩타이드성 링커이고,
    각각의 L2b1, ······, L2bn'은 펩타이드성 링커인, 뇌 표적 지속형 결합체.
  25. 제23항에 있어서,
    각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 다른 뇌 표적 펩타이드이고,
    각각의 BTPb1, ······, BTPbn'은 서로 다른 뇌 표적 펩타이드이며,
    각각의 L2a1, ······, L2an은 펩타이드성 링커이고,
    각각의 L2b1, ······, L2bn'은 펩타이드성 링커인, 뇌 표적 지속형 결합체.
  26. 제9항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 n 및 n'은 1 내지 5인,
    뇌 표적 지속형 효소 결합체.
  27. 제2항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 L1, L1a, 또는 L1b는 X의 N-말단 아민기, 라이신의 측쇄에 위치한 아민기, 또는 시스테인의 측쇄에 위치한 -SH 기 (티올기)에 연결된 것인,
    뇌 표적 지속형 효소 결합체.
  28. 제2항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, L1, L1a, 또는 L1b는 각각 독립적으로 0.5 내지 100 kDa 크기의 비펩타이드성 링커인,
    뇌 표적 지속형 효소 결합체.
  29. 제28항에 있어서, 상기 비펩타이드성 링커는 폴리에틸렌글리콜인, 뇌 표적 지속형 효소 결합체.
  30. 제2항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, L1, L1a, 또는 L1b는 0개 내지 1000개의 아미노산을 포함하는 펩타이드성 링커인, 뇌 표적 지속형 효소 결합체.
  31. 제2항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 L2는 펩타이드성 링커인,
    뇌 표적 지속형 효소 결합체.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 펩타이드성 링커는 (GS)m, (GGS)m, (GGGS)m, 또는 (GGGGS)m이며, m은 1 내지 10인,
    뇌 표적 지속형 효소 결합체.
  33. 제2항에 있어서, 상기 L1 및 L2 중 하나는 펩타이드성 링커이고, 또 다른 하나는 비펩타이드성 링커인 것인,
    뇌 표적 지속형 효소 결합체.
  34. 제2항에 있어서, 상기 L1 및 L2 모두 펩타이드성 링커인,
    뇌 표적 지속형 효소 결합체.
  35. 제2항에 있어서, 상기 L1은 비펩타이드성 링커 또는 펩타이드성 링커이고, L2는 펩타이드성 링커일 때, 펩타이드성 링커는 0부터 1000개의 아미노산을 포함하는 것인,
    뇌 표적 지속형 효소 결합체.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비펩타이드성 링커는 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 다당류, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히알루론산, 지방산, 고분자 중합체, 저분자 화합물, 뉴클레오타이드 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인,
    뇌 표적 지속형 효소 결합체.
  37. 제2항에 있어서, 상기 L1 및 L2 중 어느 하나 또는 둘 다 펩타이드성 링커일 때, 상기 X와 F, 또는 F와 Y는 공유 화학결합, 비공유 화학결합 또는 이들의 조합으로 L1 및 L2 에 의해 서로 결합되고, L1 및 L2 가 0부터 1000개의 아미노산을 포함하는 것인, 뇌 표적 지속형 효소 결합체.
  38. 제2항에 있어서, L1 및 L2 중 어느 하나 또는 둘 다 펩타이드성 링커일 때, L1 및 L2 는 0개의 아미노산으로 이루어진 것으로,
    (i) X와 F, 또는 F와 Y는 펩타이드 결합에 의해 결합된 것이고; 또는
    (ii) X와 F, 및 F와 Y는 펩타이드 결합에 의해 결합된 것인,
    뇌 표적 지속형 효소 결합체.
  39. 제2항에 있어서, L1 및 L2 중 어느 하나는 펩타이드성 링커이고, 이 중 다른 하나는 비펩타이드성 링커일 때,
    펩타이드성 링커는 0부터 1000개의 아미노산을 포함하는 링커이며,
    비펩타이드성 링커는 폴리에틸렌 글리콜인 것인,
    뇌 표적 지속형 효소 결합체.
  40. 제2항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, F는 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 것인, 뇌 표적 지속형 효소 결합체.
  41. 제40항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 내지 4개의 도메인을 포함하는, 뇌 표적 지속형 효소 결합체.
  42. 제41항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 힌지 영역을 포함하는 것인, 뇌 표적 지속형 효소 결합체.
  43. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG의 Fc 영역인 것인, 뇌 표적 지속형 효소 결합체.
  44. 제43항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG4 Fc 영역인, 뇌 표적 지속형 효소 결합체.
  45. 제40항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역글로불린 Fc 영역은 비당쇄화된 것인, 뇌 표적 지속형 효소 결합체.
  46. 제45항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역이 인간 서열의 비당쇄화 IgG4 Fc 영역인, 뇌 표적 지속형 효소 결합체.
  47. 제2항에 있어서, L1에 의해 X의 N-말단 및 F의 N-말단이 연결된 것이고, L2에 의해 Y의 N-말단 및 F의 C-말단이 연결된, 뇌 표적 지속형 결합체.
  48. 제2항에 있어서,
    L1의 일 말단은 X의 라이신 잔기 또는 시스테인 잔기에, L1의 다른 말단은 F의 N-말단에 연결된 것이고,
    L2에 의해 Y의 N-말단 및 F의 C-말단이 연결된, 뇌 표적 지속형 결합체.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뇌 표적 펩타이드 (BTP)는 서열번호: 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 및 53으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 뇌 표적 지속형 결합체.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료학적 효소는 베타글루코시다제 (beta-glucosidase), 알파갈락토시다제 (alpha-galactosidase), 베타갈락토시다제 (beta-galactosidase), 이두로니다제 (iduronidase), 이두로네이트 2-설파타제 (iduronate-2-sulfatase), 갈락토스-6-설파타제 (Galactose-6-sulfatase), 산성 알파-글루코시다제 (acid alpha-glucosidase), 산성 세라미다제 (acid ceramidase), 산성 스핑고미엘리나제 (acid sphingomyelinsase), 갈락토세레브로시다제 (galactocerebrosidsase), 아릴설파타제 (arylsulfatase) A, B, 베타-헥소사미니다제 (beta-hexosaminidase) A, B, 헤파린-N-설파타제 (heparin N-sulfatase), 알파-D-마노시다제 (alpha-D-mannosidase), 베타-글루쿠로니다제 (beta-glucuronidase), N-아세틸갈락토사민-6-설파타제 (N-acetylgalactosamine-6 sulfatase), 리소좀 산성 리파제 (lysosomal acid lipase), 알파-N-아세틸-글루코사미니다제 (alpha-N-acetyl-glucosaminidase), 글루코세레브로시다제 (glucocerebrosidase), 부티릴콜린에스터라제 (butyrylcholinesterase), 키티나제 (Chitinase), 글루타메이트 디카르복실라제 (glutamate decarboxylase), 이미글루세라제 (imiglucerase), 리파아제 (lipase), 우리카제 (Uricase), 혈소판활성인자 아세틸하이드로라제 (Platelet-Activating Factor Acetylhydrolase), 뉴트럴 엔도펩티다제 (neutral endopeptidase), 및 미엘로퍼옥시다제 (myeloperoxidase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 뇌 표적 지속형 효소 결합체.
  51. 제50항에 있어서,
    상기 이두로네이트 2-설파타제는 뮤코다당체침작증 Ⅱ (mucopolysaccharidosis Ⅱ, MPS Ⅱ)를 치료할 수 있는 것인, 뇌 표적 지속형 효소 결합체.
  52. 제1항에 있어서, 상기 F는 천연형 면역글로불린의 Fc 영역의 서열을 포함하거나, 천연형 면역글로불린 Fc 영역에서 적어도 하나 이상의 아미노산에 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion), 수식(modification) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 변형이 일어난 것인, 결합체.
  53. 제52항에 있어서, 상기 F는 IgG 유래의 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬 두 개가 서로 이황화 결합으로 연결된 이량체 형태로서,
    상기 힌지 영역은 서열번호: 5의 아미노산 서열, 또는 상기 서열번호: 5의 아미노산 서열에서 2 번째 아미노산인 세린(Ser, S)이 프롤린 (Pro, P)으로 변이된 서열을 포함하고;
    상기 CH2 도메인은 서열번호: 6의 아미노산 서열, 또는 상기 서열번호: 6의 아미노산 서열에서 67번째 아미노산인 아스파라긴 (Asn, N)이 글루타민 (Gln, Q)으로 변이된 서열을 포함하고;
    CH3 도메인이 서열번호: 7의 아미노산 서열을 포함하고; 또는
    상기 F를 구성하는 면역글로불린 불변영역을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬은 서열번호: 92에서 2번째 아미노산이 프롤린으로 치환되거나; 71번째 아미노산이 글루타민으로 치환되거나; 또는 2번째 아미노산은 프롤린으로, 71번째 아미노산은 글루타민으로 치환된 것인, 결합체.
  54. 아미노산 서열로 구성되는 융합 단백질 형태인, 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 따른 뇌 표적 지속형 효소 결합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  55. 제54항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  56. 제55항의 발현 벡터가 도입된, 숙주세포.
  57. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항의 뇌 표적 지속형 효소 결합체를 포함하는
    리소좀 축적 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  58. (a) 제56항의 숙주세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배양된 숙주세포 또는 이의 배양물로부터 뇌 표적 지속형 효소 결합체를 회수하는 단계를 포함하는,
    뇌 표적 지속형 효소 결합체를 제조하는 방법.
  59. 하기 단계를 포함하는, 제2항의 뇌 표적 지속형 효소 결합체를 제조하는 방법:
    (i) (a) 치료학적 효소인 X, 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커인 L1, 및 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 F가 결합된, X-L1-F, 및 (b) 뇌 표적 펩타이드인 Y, 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커인 L2가 결합된 L2-Y를 제조하는 단계; 및
    (ii) 상기 (a) X-L1-F 및 (b) L2-Y를 연결하는 단계.
  60. 하기 단계를 포함하는, 제2항의 뇌 표적 지속형 효소 결합체를 제조하는 방법:
    (i) (a) 치료학적 효소인 X 및 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커인 L1이 결합된, X-L1, 및 (b) 뇌 표적 펩타이드인 Y, 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커인 L2 및 F가 결합된 F-L2-Y를 제조하는 단계; 및
    (ii) 상기 (a) X-L1 및 (b) F-L2-Y를 연결하는 단계.
  61. (a) 양 말단에 각각 같거나 서로 다른 반응성 작용기가 위치하는 비펩타이드성 중합체인 L1의 어느 한 반응성 작용기를 유리된 치료학적 효소인 X와 반응시켜 상기 말단을 통하여 비펩타이드성 중합체가 치료학적 효소에 공유결합으로 연결된 연결체인 X-L1를 얻는 단계; 및
    (b) 상기 연결체의 반응하지 않은 말단의 반응성 작용기를 F-L2-Y에 연결시켜 X-L1-F-L2-Y를 얻는 단계를 포함하는,
    제2항의 뇌 표적 지속형 효소 결합체를 제조하는 방법.
  62. 제61항에 있어서,
    상기 (b) 단계는 상기 연결체의 반응하지 않은 말단의 반응성 작용기를 하기 화학식 2의 Fa에 연결시키는 것인, 방법:
    [화학식 2]
    Figure pat00058


    여기에서,
    Fa 및 Fb는 각각 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬로서, Fa와 Fb는 힌지 영역에서 이황화 결합으로 서로 연결되고, 이로써 상기 결합체는 Fc 절편을 포함하며, Fa는 L1과 공유결합으로 연결되고,
    각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이고,
    각각의 BTPb1, ······, BTPbn'은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이며,
    각각의 L2a1, ······, L2an은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이고,
    각각의 L2b1, ······, L2bn'은 각각 독립적으로 펩타이드성 또는 비펩타이드성 링커이며,
    이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수이다.
  63. 제61항에 있어서, 상기 반응성 작용기는 알데히드기, 말레이미드기 및 석신이미드 유도체로 이루어진 군으로부터 선택하는 것인, 방법.
  64. 제63항에 있어서, 상기 알데히드기는 프로피온알데히드기 또는 부틸알데히드기인, 방법.
  65. 제63항에 있어서,
    상기 석신이미드 유도체는 석신이미딜 카르복시메틸, 석신이미딜 발레르에이트, 석신이미딜 메틸부타노에이트, 석신이미딜 메틸프로피온에이트, 석신이미딜 부타노에이트, 석신이미딜 프로피온에이트, N-하이드록시석신이미드인 또는 석신이미딜 카보네이트인 것인 방법.
  66. 하기 화학식 3의 X - L1a - Fa - (L2a1-BTPa1) - ...... - (L2an - BTPan)를 코딩하는 발현 카세트 및 X - L1b - Fb - (L2b1-BTPb1) - ...... - (L2bn' - BTPbn')를 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 숙주세포를 배양하는 단계; 및 상기 배양된 숙주세포 또는 이의 배양물로부터 하기 화학식 3의 결합체를 수득하는 단계를 포함하는,
    제12항의 뇌 표적 지속형 효소 결합체를 제조하는 방법:
    [화학식 3]
    Figure pat00059


    여기에서,
    X는 치료학적 효소이고,
    L1a 및 L1b는 펩타이드성 링커이며,
    Fa 및 Fb는 각각 힌지 영역, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 한 가닥의 폴리펩타이드 사슬로서, Fa와 Fb는 힌지 영역에서 이황화 결합으로 서로 연결되고, 이로써 상기 결합체는 Fc 절편을 포함하며, Fa 및 Fb는 각각 L1a 및 L1b와 공유결합으로 연결되고,
    각각의 BTPa1, ······, BTPan은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이고,
    각각의 BTPb1, ······, BTPbn'은 서로 같거나 다른 뇌 표적 펩타이드이며,
    각각의 L2a1, ······, L2an은 펩타이드성 링커이고,
    각각의 L2b1, ······, L2bn'은 펩타이드성 링커이며,
    이 때, n 및 n'은 각각 독립적으로 자연수이다.
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