CN112812167B - 一种促进细胞存活的Netrin-1模拟肽、Netrin-1截短多肽及其应用 - Google Patents

一种促进细胞存活的Netrin-1模拟肽、Netrin-1截短多肽及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种促进细胞存活的Netrin‑1模拟肽、Netrin‑1截短多肽及其应用，属于人工突变多肽技术领域。截短体Pep407为Netrin‑1的第407～443位氨基酸序列，是Netrin‑1与受体DCC结合的关键氨基酸序列，Pep407能与受体DCC结合激活Netrin‑1下游信号通路，模拟Netrin‑1生物学活性。本发明还提供了一种更短的模拟肽(Netrin‑1的第407～422位氨基酸序列)，该模拟肽不仅能与受体DCC结合能激活Netrin‑1下游信号通路，而且能有效抑制细胞死亡，促进细胞存活，同时通过添加穿膜肽给药出血性脑卒中小鼠模型，能有效达到治疗出血性脑卒中的效果。

Description

一种促进细胞存活的Netrin-1模拟肽、Netrin-1截短多肽及其应用
技术领域
本发明属于人工突变多肽技术领域，具体涉一种促进细胞存活的Netrin-1模拟肽、Netrin-1截短多肽及其应用。
背景技术
Netrin-1是神经系统分泌的导向因子，能够与受体DCC相互作用，激活下游信号通路，发挥抑制细胞凋亡，促进神经突起生长的功能。现有技术已有多篇文献报道在模拟人类脑卒中的大/小鼠的脑缺血模型、脑出血模型及蛛网膜下出血模型中进行损伤区域的脑立体定位注射Netrin-1全长蛋白或过表达Netrin-1的腺相关病毒，可以在局部表达大量的Netrin-1蛋白。这些大量聚集的蛋白随后能够与膜上受体结合进而激活细胞内的信号传递，最终实现了有效改善模型动物行为学，并能大大减少/改善损伤过程导致的细胞凋亡、血脑屏障完整性、炎症反应。
全长形式的Netrin-1存在分子量太大无法通过血脑屏障，具有丝裂原活性存在潜在机体致癌率，目的蛋白片段太长不易大规模工业化生产的问题，因此如能围绕Netrin-1开展潜在多肽药物设计有着巨大的现实意义。DCC作为Netrin-1重要的受体之一，被报道参与脑出血中Netrin-1减少细胞死亡，维持血脑屏障，改善模型小鼠行为学的过程中。为了解决血脑屏障的问题，同时降低对机体的致癌率，通过进一步缩小最小有效结构域，找到Netrin-1模拟肽用于神经保护作用具有重要的药物研究价值。目前尚未有关于Netrin-1的模拟肽的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种促进细胞存活的Netrin-1模拟肽及其应用，所述Netrin-1模拟肽不仅能激活Netrin-1下游信号通路，而且能有效改善出血性脑卒中小鼠模型的神经认知功能、减小脑血肿体积以及抑制神经元死亡。
本发明的目的还在于提供一种Netrin-1截短体及其应用，能够与DCC受体结合，也能激活Netrin-1下游信号通路，模拟Netrin-1生物学活性。
本发明提供了一种Netrin-1的截短体Pep 422，所述Netrin-1的截短体Pep 422的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明提供了一种促进细胞存活的Netrin-1模拟肽，包括穿膜肽-结合肽；
所述结合肽为所述Netrin-1的截短体Pep 422。
优选的，所述Netrin-1模拟肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明提供了所述Netrin-1的截短体Pep 422或所述促进细胞存活的Netrin-1模拟肽在制备预防和/或治疗出血性脑卒中的药物中的应用。
本发明提供了所述Netrin-1的截短体Pep 422或所述促进细胞存活的Netrin-1模拟肽在制备神经保护的药物中的应用。
本发明提供了一种Netrin-1的截短体Pep 407，所述Netrin-1的截短体Pep 407的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
本发明提供了一种具有Netrin-1活性的人工模拟肽，包括穿膜肽-结合肽；所述结合肽为所述Netrin-1的截短体Pep 407。
优选的，所述人工模拟肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
本发明提供了所述Netrin-1的截短体Pep 407或所述人工模拟肽在制备预防和/或治疗出血性脑卒中或神经保护的药物中的应用。
本发明提供了所述Netrin-1的截短体Pep 422、所述促进细胞存活的Netrin-1模拟肽、所述Netrin-1的截短体Pep 407或所述人工模拟肽作为Netrin-1的替代物在制备治疗肿瘤的药物或筛选抗肿瘤的药物中的应用。
本发明提供的Netrin-1的截短体Pep 422，是由16个氨基酸残基组成，来自于Netrin-1氨基酸序列407-422位，是目前验证的最小功能片段。所述截短体Pep 422是Netrin-1与受体DCC结合的关键位点。该截短体Pep 422能够与受体DCC结合，激活FAK、Src、ERK等下游信号通路，发挥与全长Netrin-1类似的生物学作用。细胞和动物水平实验结果均表明，该截短体Pep 422能够抑制细胞死亡，在出血性脑卒中模型中减少血肿体积、改善模型动物的认知功能。该截短体Pep 422可在体外合成，规模化工业生产，应用于抑制出血性脑卒中引起的神经元死亡，促进神经元存活，起神经保护作用。同时所述截短体Pep 422的分子量远远低于Netrin-1，大大降低了血脑屏障的难度，减少致癌率。
本发明提供了一种促进细胞存活的Netrin-1模拟肽，包括穿膜肽-结合肽；所述结合肽为所述Netrin-1的截短体Pep 422。所述穿膜肽的添加有利于使结合肽穿透血脑屏障，发挥抑制出血性脑卒中引起的神经元死亡，促进神经元存活的神经保护作用。
本发明提供了一种Netrin-1的截短体Pep 407，来源于Netrin-1的EGF3结构域，由37个氨基酸残基组成，位于Netrin-1氨基酸序列407-443位。实验表明，Netrin-1能够与DCC在细胞膜结合，而缺失407-443位氨基酸的Netrin-1缺失突变体不能与受体DCC结合，表明407-443位氨基酸序列是Netrin-1与DCC结合的关键位点。免疫荧光染色实验结果表明GST-407可以与受体DCC结合，表明：407～443位氨基酸组成的多肽能够与受体DCC结合。同时Netrin-1的截短体Pep 407能够激活Netrin-1下游信号通路，模拟Netrin-1生物学活性。
附图说明
图1为验证Netrin-1407～443位点为Netrin-1与受体DCC结合的关键位点图；
图2为Pep407激活Netrin-1/DCC下游信号通路结果图；
图3为Pep422能激活Netrin-1/DCC下游FAK信号通路的结果图；
图4为Pep422能结合受体DCC的结果图；
图5为Hemin诱导细胞死亡结果图；
图6为Pep422对细胞存活的影响结果图；
图7为Tat422模拟肽处理出血性脑卒中动物模型后细胞死亡，脑血肿和改善动物神经功能结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种Netrin-1的截短体Pep 407，所述Netrin-1的截短体Pep 407的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示(HPVGAAGKTCNQTTGQCP CKDGVTGITCNRCAKGYQQ)，其对应的核苷酸序列为SEQ ID NO：7(CACCCAGTGGGTGCTGCTGGCAAGACCTGCAATCAAACCACTGGCC AATGTCCCTGCAAGGACGGCGTGACGGGCATCACCTGCAACCGATGTG CCAAAGGCTACCAGCAG)。所述截短体Pep407是来自Netrin-1的EGF3结构域，为Netrin-1的407～443位氨基酸。为了验证Pep 407对Netrin-1的生物学功能，构建缺失407～443位氨基酸的Netrin-1缺失突变载体，转染细胞后，得到的Netrin-1缺失突变蛋白则无法与DCC的FN5结构域结合，而Netrin-1蛋白能够与DCC在细胞膜结合，缺失407～443位氨基酸的Netrin-1不能与受体DCC结合，表明截短体Pep407是Netrin-1与受体DCC结合的关键位点。为了验证截短体Pep 407的单独生物学作用，将截短体Pep 407与GST构建重组载体，表达的GST-407融合蛋白能够与受体DCC结合。为了进一步验证截短体Pep 407是否能模拟Netrin-1生物学活性，采用截短体Pep 407单独处理原代神经元培养物，结果表明Netrin-1下游信号通路GST-407融合蛋白可以激活Netrin-1/DCC信号通路下游分子的磷酸化(包括p-FAK 861，p-SFK418和p-P44/42分子的磷酸化)，可以模拟Netrin-1生物学活性。
本发明提供了一种具有Netrin-1活性的人工模拟肽，包括穿膜肽-结合肽；所述结合肽为所述Netrin-1的截短体Pep 407。本发明对所述穿膜肽的氨基酸序列不做具体限定，采用本领域所熟知的穿膜肽氨基酸序列即可。在本发明实施例中，所述穿膜肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示(YGRKKRRQRRR)。所述人工模拟肽的氨基酸序列优选如SEQ ID NO：4所示(YGRKKRRQRRRHPVGAAGKTCNQTTGQCPCKDGVTGITCNRCAK GYQQ)。本发明对所述人工模拟肽的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的人工模拟肽的制备方法即可，例如人工合成或重组表达获得。基于所述结合肽的生物学性能，本发明提供的人工模拟肽不仅能有效与受体DCC结合，可以激活Netrin-1/DCC信号通路下游分子的磷酸化(包括p-FAK 861，p-SFK418，p-P44/42分子的磷酸化)，可以模拟Netrin-1生物学活性，同时在穿膜肽的作用下，实现结合肽穿透血脑屏障，进入脑部发病部位，实现对脑部细胞的保护，尤其是神经细胞的保护和出血性脑卒中疾病的治疗作用。
本发明提供了所述Netrin-1的截短体Pep 407或所述人工模拟肽在制备预防和/或治疗出血性脑卒中或神经保护的药物中的应用。本发明对所述药物的剂型没有特殊限制，采用本领域所熟知的多肽药物剂型即可。本发明对所述药物的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的药物制备方法即可。
根据上述Pep 407和人工模拟肽能够替代Netrin-1模拟Netrin-1生物学活性，因此，本发明还提供了所述Netrin-1的截短体Pep 407或所述人工模拟肽作为Netrin-1的替代物在筛选抗肿瘤的药物中的应用。
为了进一步获得替代Netrin-1的更小的功能性片段，本发明还提供了一种Netrin-1的截短体Pep 422，所述Netrin-1的截短体Pep 422的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示(HPVGAAGKTCNQTTGQ)。所述Netrin-1的截短体Pep 422是来自Netrin-1的EGF3结构域中，是407～422位点氨基酸序列。将上述截短体Pep 407在422位和423位点氨基酸之间进一步截断，获得Pep422，剩余部分再次截短得到Pep 433(氨基酸序列为CPCKDGVTGIT，SEQ IDNO：6)，虽然Pep 422和Pep 433均能激活Netrin-1下游信号通路，但是Pep 422在细胞水平上能有效抑制Hemin诱导的细胞死亡，促进细胞存活，而Pep 433不能抑制细胞死亡，也不能促进细胞存活。因此，选择Pep 422连同穿膜肽用于出血性脑卒中小鼠模型中，减少血肿体积、改善模型动物的认知功能。同时本发明实验证明，Pep 422能结合受体DCC，激活Netrin-1/DCC下游的信号通路；并且当DCC被敲除后Pep 422不能Netrin-1/DCC下游的信号通路。
本发明提供了一种促进细胞存活的Netrin-1模拟肽，包括穿膜肽-结合肽；所述结合肽为所述Netrin-1的截短体Pep 422。本发明对所述穿膜肽的氨基酸序列不做具体限定，采用本领域所熟知的穿膜肽的氨基酸序列即可。本发明实施例中，所述穿膜肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示(YGRKKRRQRRR)。在本发明中，所述Netrin-1模拟肽的氨基酸序列优选如SEQ ID NO：2所示(YGRKKRRQRRRHPVGAAGKTCNQTTGQ)。
本发明提供了所述Netrin-1的截短体Pep 422或所述促进细胞存活的Netrin-1模拟肽在制备神经保护的药物中的应用。在细胞水平上，为了验证Pep 422是否可以减少脑出血后二次损伤过程中的细胞死亡，本发明以利用Hemin刺激体外培养细胞体系来模拟脑组织脑出血后二次损伤过程，结果表明加入Pep422后可以有效改善Hemin诱导的细胞死亡。
本发明提供了所述Netrin-1的截短体Pep 422或所述促进细胞存活的Netrin-1模拟肽在制备预防和/或治疗出血性脑卒中的药物中的应用。以出血性脑卒中小鼠模型为对象，注射所述模拟肽，结果表明模拟肽给药组较对照组明显减少血肿体积；同时用FJB染色标记退行性的神经元，发现所述模拟肽给药组退行性神经元数目明显减少，说明截短体Pep422或模拟肽在动物水平上能有效治疗出血性脑卒中疾病。
鉴于于本发明提供的Pep 422、模拟肽、Pep 407和人工模拟肽均能够替代Netrin-1发挥生物学功能，因此，本发明还提供了所述Netrin-1的截短体Pep 422、所述促进细胞存活的Netrin-1模拟肽、所述Netrin-1的截短体Pep407或所述人工模拟肽作为Netrin-1的替代物在制备治疗肿瘤的药物或筛选抗肿瘤的药物中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的一种促进细胞存活的Netrin-1模拟肽、Netrin-1截短多肽及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
构建了缺失407-443位氨基酸的Netrin-1缺失突变载体(见图1中A)，其中外源插入片段分别为小鼠全长Netrin-1(氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，核苷酸序列如SEQ IDNO：9所示)和Netrin-1缺失突变体(记为Netrin-1(Δ407-443)，氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示)，以载体Pcdna3.1-Myc-His-B为载体骨架，插入的酶切位点为BamHI和EcoRV。将全长Netrin-1及Netrin-1缺失载体瞬时转染到293T细胞中，转染48小时后收集培养上清。因为Netrin-1为分泌型蛋白，上清液中含有大量Netrin-1或Netrin-1缺失突变体。将含有Netrin-1和Netrin-1缺失突变体的培养上清分别添加到转染有受体DCC的293T细胞中，免疫荧光染色，并收集过表达40小时的细胞裂解液与GST-DCC-FN5融合蛋白共孵育进行GSTpull down实验。具体内容如下：
1.将重组质粒转入大肠杆菌BL21菌株中，37℃振荡培养。当菌液OD值达到0.6时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃诱导3～4h。
2.4000rpm/min离心10min将表达GST融合蛋白和GST蛋白的大肠杆菌分别收集到1.5ml离心管中。每管加入0.9ml细菌裂解液重悬，按照功率300～400w，超声9s，间歇6s，进行超声裂解，重复裂解过程6次。在4℃，15000rpm条件下离心30min。
3.将上清转入新的离心管中，加入45μl 10％NP40，使其终浓度为0.5％。加入40μl预处理的50％谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B珠子在4℃摇床上混合1h。4℃，500g/min离心5min。
4.含有0.5％NP-40的裂解液洗涤珠子3次，再用不含0.5％NP-40的裂解液洗涤珠子3次。
5.每个样品中加入等体积(40μl)的PBS重悬珠子，4℃保存。
6.前一天晚上将293细胞铺于一个10cm板中；第二天早上转染相应表达载体，5小时后换液；转染24～48小时后，提蛋白。
7.按照500～1000μg蛋白上清中加入含2～5μg GST融合蛋白的琼脂糖4B珠子用于沉淀目的蛋白，4℃孵育过夜，按500g/min离心5min；然后用PBST洗珠子4次，每次按500g/min离心5min；洗脱后的珠子加入2x loading buffer煮沸，用于Westernblot检测。(参考文献：Lenormand,J.L.,B.Benayoun,M.Guillier,M.Vandromme,M.P.Leibovitch,andS.A.Leibovitch.1997.Mos activates myogenic differentiation bypromotingheterodimerization ofMyoD and E12 proteins.Molecular and cellularbiology.17:584-593.)。
结果表明，全长Netrin-1可以与受体DCC的FN5结构域结合，但缺失后则无法与受体DCC的FN5结构域结合(图1中B和图1中C)。免疫荧光染色结果显示，全长Netrin-1能够与受体DCC在细胞膜结合，而Netrin-1缺失突变体不能与受体DCC在细胞膜结合(图1中D)。上述结果表明：缺失407-443位氨基酸的Netrin-1不能与受体DCC结合，表明407-443位氨基酸序列(记为Pep 407)是Netrin-1与DCC结合的关键位点。
实施例2
为了进一步验证结果准确性，按照实施例1的方法构建表达Pep 407(Netrin-1407-443位氨基酸)的GST表达载体，命名为GST-407(氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示，见图1中A)，以PGEX-5X-1载体为载体骨架，插入的酶切位点为XhoI及BamHI。将GST-407表达载体转入大肠杆菌BL21感受态细胞中，诱导表达GST融合蛋白。收集菌液，超声破碎细菌壁。由于GST能够与琼脂糖珠子结合，从而将该融合蛋白纯化出来。将获得的蛋白上清与含有将谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4B珠子相结合。经裂解液洗脱，去掉非特异性结合蛋白，获得目的蛋白。进一步将与目的蛋白结合后的珠子与洗脱液(50mMTris-HCl，10mM还原性谷胱甘肽，pH值8.0)混合1小时。之后用过滤柱过滤并收集流出的洗脱液，此过程可多次清洗珠子，目的蛋白进入洗脱液中。随后将洗脱液用10kDa超滤管(Millipore UFC901096)浓缩，蛋白浓度达到1μg/μl。将GST-407融合与收集的过表达DCC的细胞裂解液共孵育按照实施例1的方法进行GST pull down实验。
结果表明，Pep 407能够与DCC结合(图1中E)。将纯化的GST-407融合蛋白添加到过表达DCC的293T细胞中，免疫荧光染色结果表明GST-407可以与DCC结合(图1中F)。将FITC修饰的407-443多肽添加到转染DCC的293T细胞中，免疫荧光染色结果显示该多肽能够与DCC在细胞膜共定位。这些结果进一步表明：Pep 407(407-443位氨基酸组成的多肽)能够与DCC结合。
实施例3
由实施例2结果可知，Pep 407能够与DCC结合，但为了进一步验证Pep 407多肽能否激活Netrin-1下游信号通路，模拟Netrin-1的生物学功能进行如下实验。将胚胎期17天的小鼠鼠脑分离皮层后进行原代神经元培养；体外培养3天之后利用收集的Netrin-1上清、Netrin-1缺失突变体分别以1.5μM的浓度添加到培养基中对神经元刺激20分钟，随后收集蛋白进行后续的实验(见图2中A)。
Western blot结果表明Netrin-1可以激活FAK的861位点磷酸化，Netrin-1缺失突变体无法激活FAK-861位磷酸化。上述结果说明缺失Netrin-1Pep 407不仅影响Netrin-1/DCC相互结合还会影响Netrin-1激活DCC下游通路(图2中B和图2中C)。Pep 407多肽能够激活Netrin-1下游信号通路，模拟Netrin-1生物学活性。
为进一步探究Pep 407多肽单独存在时是否也可以激活DCC下游信号通路。继续进行原代神经元培养，并分别添加GST蛋白，GST-407融合及Netrin-1全长蛋白刺激，收集细胞总蛋白后进行Western blot，检测多肽对Netrin-1/DCC通路下游p-FAK 861、p-SFK418、p-P44/42水平的影响(其中，p-代表磷酸化的-)。
结果表明单独表达的GST蛋白无法激活下游分子的磷酸化改变，而GST-407融合蛋白或Netrin-1全长蛋白则可以激活Netrin-1下游信号通路(图2中D)。统计结果表明，虽然GST-407融合蛋白可以激活Netrin-1/DCC信号通路下游分子的磷酸化，但这种激活作用稍弱于Netrin-1全长所发挥的作用(图2中E至图2中G)。
实施例4
考虑到GST-407融合蛋白中包含的多肽大小为37aa，但该片段的大小仍然显得有些大，因此通过将其截断，以期获得更小的功能性片段。人工合成Pep407-422(命名为Pep422，HPVGAAGKTCNQTTGQ，SEQ ID NO：1)与Pep423-433(命名为Pep433，CPCKDGVTGIT，SEQID NO：6)及对照多肽(TPCCGKTDVGI，SEQ ID NO：14)，并添加到原代培养的神经元细胞中培养，采用Westernblot实验检测FAK的磷酸化结果(具体参见Burnette,W.N.1991.WesternBlotting-a Citation-Classic Commentary on Western Blotting-ElectrophoreticTransfer Of Proteins From Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gels ToUnmodified Nitrocellulose And Radiographic Detection with Antibody AndRadioiodinated Protein-a,by Burnette,W.N.Cc/Life Sci:8-8.)。
Westernblot实验结果表明：Pep422和Pep433多肽都可以激活FAK的磷酸化(图3中A至图3中G)，表明Pep422和Pep433这两种多肽都能激活Netrin-1下游信号通路。
实施例5
为了间接证明407-422片段能结合受体DCC，分离出生当天DCC敲除小鼠及其同窝对照小鼠的海马神经元进行培养(图4中A和图4中B)。培养3天之后，分别添加浓度均为1.5μM的Pep control，Netrin-1，Pep 422和Pep433处理1个小时。然后利用Westernblot检测FAK的磷酸化变化。具体内容如下:
取出生当天小鼠脑组织，显微镜下分离海马。用解剖剪刀将海马剪成小的组织块，按照1对海马对应2ml胰酶的比例加入胰酶消化液，37℃消化20分钟。随后，加入几滴血清终止胰酶消化，将消化的组织块转移到新的含10％的DMEM/F12培养基中，用移液器吹打至单细胞。1000rpm/min离心5分钟收集细胞。将用含10％的DMEM/F12培养基重悬细胞，并按照1×106/ml接种到PLL包被的培养板中。8小时后更换为Neuronal培养基(含2％B27，1％L-谷氨酰胺)。参考文献：Dotti,C.G.,C.A.Sullivan,and G.A.Banker.1988.Theestablishment ofpolarityby hippocampal neurons in culture.The Journal ofneuroscience:the officialjournal ofthe Society forNeuroscience.8:1454-1468.
实验结果表明：Netrin-1，Pep 422和Pep433都能促进p-FAK861的水平，并且Netrin-1，Pep 422和Pep433对FAK磷酸化的调节作用依赖受体DCC。当DCC被敲除之后，Netrin-1，Pep 422和Pep433不能促进FAK的磷酸化，间接证明407-422片段能结合受体DCC(图4中C和图4中D)。
实施例6
脑出血过程会造成原发损伤和二次损伤，原发损伤过程主要由于血管破裂血肿过程造成的损伤，而二次损伤则主要由于释放的血液组分分解后的产物对脑组织产生的影响。Hemin是血红蛋白分解产物，因此想利用Hemin刺激体外培养细胞体系来模拟脑组织脑出血后二次损伤过程。
为了探究这些多肽是否可以减少脑出血后二次损伤过程中的细胞死亡，在体外Hemin刺激模型中进行相关实验。以培养的小鼠嗅球GnRH神经元的细胞系NLT细胞为材料，将生长状态良好的NLT细胞铺到96孔板中，利用CCK8试剂盒检测了不同剂量Hemin对细胞存活率的影响。
结果发现，在60μM Hemin时细胞存活率为50％(图5中A)；之后对60μM Hemin刺激NLT细胞不同时间情况下细胞存活率的检测，结果发现6h时细胞存活率为50％(图5中B)。
实施例7
为了确定Pep422和Pep433多肽是否具有细胞毒性，通过CCK8来检测细胞的存活率。具体方法为：
1)贴壁的NLT细胞按照细胞接种量为6×104个/mL铺到96孔板中，每孔100μL溶液；原代培养的皮层神经元需要将96孔板经过多聚赖氨酸包被后再按照1×106个/mL铺到96孔板中，每孔100微升。
2)NLT细胞培养过夜后在镜下观察到细胞达到70％-80％融合度就可进行后续操作；原代神经元则需要培养三日后进行后续操作。
3)根据实验需要添加影响因素，设置实验组和对照组；实验组为hemin处理或hemin与其他药物处理的，对照组为不加药物处理的，每组设置3个重复孔。
4)每孔加入10微升CCK-8溶液。设置两组对照，一组空白对照A1为无细胞但加入细胞培养液、药物和CCK-8溶液；另一组空白对照组B1为无细胞、加入培养基及CCK-8但不加药物处理。
5)加入CCK-8的96孔板需用锡箔纸包住避光并放37℃培养箱中孵育两小时；孵育结束后将孔板放置在酶标仪上检测，用450nm波长测定吸光度，用650nm波长作为参考波长进行双波长测定。
6)测定所获得的结果按照如下式I进行计算细胞存活率：
细胞存活率(％)＝(实验组OD值-A1组OD值)/(对照组OD值-B1组OD值)×100％式I。
CCK8检测结果表明神经元在加入多肽后并不会改变细胞的存活，这说明多肽都不具有细胞毒性(图6中A)；接着我们将不同浓度的多肽和Hemin混合后加入细胞中，CCK8检测结果发现添加Netrin-1全长及Pep422能够提高细胞存活率，1.5μM时就能显著提高细胞的存活达到60％以上；这些结果间接的表明了Pep422可以有效减少Hemin导致的细胞死亡(图6中B)；之后我们利用活死细胞检测试剂盒直接检测培养的NLT细胞状态，荧光的图像表明加入Pep422后可以有效改善Hemin诱导的细胞死亡(图6中C～图6中E)。
实施例8
鉴于在Hemin诱导的细胞模型中发现多肽Pep422可以减少细胞的死亡，为进一步探究小鼠脑出血模型中多肽Pep422是否仍可以减少细胞死亡，开展动物实验。为了确保多肽能够透过血脑屏障进入大脑内，在Pep422的N端加上了Tat序列(YGRKKRRQRRR，SEQ IDNO：15)，记为Tat422模拟肽，进行小鼠出血性脑卒中模型的构建及小鼠的行为学数据采集。方法如下：
临床上多数脑出血患者致病原因是由于基底神经节区域动脉破裂出血后造成脑部损伤，术后患者均表现为不同程度的一侧偏瘫及肢体不协调。基于这个现象，研究者们一般选择注射自体血或Ⅶ胶原酶到动物纹状体区域来模拟人类脑出血。纹状体是基底神经节区域最大的核团，它调控着触觉信息的传入及协调精细运动，纹状体区域的受损会导致运动功能障碍。Ⅶ胶原酶注射可以很好的模拟人类脑出血患者血管破裂的现象，故相较于注射自体血的模型更多的被应用(Liesz et al.,2011；Lei et al.,2014)。
首先将实验所用的C57小鼠进行粘条实验和圆筒实验，检测小鼠是否存在运动障碍及肢体不协调，不合格的小鼠将被剔除(Lei et al.,2014；Alim et al.,2019)。之后小鼠被随机分为两组，一组为假手术组，另一组为脑出血(ICH)组。ICH组通过脑立体定位注射0.045IUⅦ型胶原酶到右侧纹状体的方式构建小鼠的脑出血模型，假手术组则注射等体积无菌的0.9％医用生理盐水到右侧纹状体区域。
对注射后1天、3天的小鼠进行粘条去除实验、圆筒实验发现注射一天后ICH组的小鼠运动障碍最严重，注射后一天ICH组表现出损伤侧肢体去除粘条时间较对照组明显增长，前肢同时触碰圆筒壁的次数减少，单侧前肢触碰圆筒壁次数增加的现象。注射三天后这种运动障碍有所改善，但损伤侧肢体去除粘条时间较对照组仍较对照组时间长。这些现象及统计数据说明ICH组小鼠出现了严重的前肢不对称及运动能力障碍，这与人类脑出血患者发病后表现出的一侧偏瘫，运动能力障碍相似，说明我们的模型构建的比较成功。
随后将小鼠模型分为假手术组(saline)、ICH组、ICH+Tat组、ICH+Tat422组。Tat和Tat422模拟肽的注射量12mg/kg，注射方式腹腔注射。按照(图7中A)所示的示意图进行小鼠模型的构建及小鼠的行为学数据采集。比较了手术前及手术后五天体重的变化，对照组体重基本一致，ICH各组都呈现不同程度的体重减轻(图7中B)；之后对小鼠进行了粘条去除实验和圆筒实验，结果表明注射多肽Tat422五天后小鼠行为有了明显的改善(图7中C和图7中D)。
脑出血后不仅会表现出血肿面积增大、行为学异常，在病理上还表现为脑中凋亡细胞数目增加，退行性的神经元数目增加。通过HE染色标记病变区域的方法再次标记血肿区域，统计结果表明注射Tat422模拟肽后较ICH组明显减少血肿体积(图7中E至图7中F)；之后用FJB染色标记退行性的神经元,发现Tat422模拟肽处理组退行性神经元数目明显减少(图7中G至图7中I)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
                         序列表
<110>  东北师范大学
<120>  一种促进细胞存活的Netrin-1模拟肽、Netrin-1截短多肽及其应用
<160>  15
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  1
<211>  16
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  1
His Pro Val Gly Ala Ala Gly Lys Thr Cys Asn Gln Thr Thr Gly Gln
1               5                   10                  15
<210>  2
<211>  27
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  2
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg His Pro Val Gly Ala
1               5                   10                  15
Ala Gly Lys Thr Cys Asn Gln Thr Thr Gly Gln
            20                  25
<210>  3
<211>  37
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  3
His Pro Val Gly Ala Ala Gly Lys Thr Cys Asn Gln Thr Thr Gly Gln
1               5                   10                  15
Cys Pro Cys Lys Asp Gly Val Thr Gly Ile Thr Cys Asn Arg Cys Ala
            20                  25                  30
Lys Gly Tyr Gln Gln
        35
<210>  4
<211>  48
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  4
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg His Pro Val Gly Ala
1               5                   10                  15
Ala Gly Lys Thr Cys Asn Gln Thr Thr Gly Gln Cys Pro Cys Lys Asp
            20                  25                  30
Gly Val Thr Gly Ile Thr Cys Asn Arg Cys Ala Lys Gly Tyr Gln Gln
        35                  40                  45
<210>  5
<211>  11
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  5
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1               5                   10
<210>  6
<211>  11
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  6
Cys Pro Cys Lys Asp Gly Val Thr Gly Ile Thr
1               5                   10
<210>  7
<211>  111
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  7
cacccagtgg gtgctgctgg caagacctgc aatcaaacca ctggccaatg tccctgcaag  60
gacggcgtga cgggcatcac ctgcaaccga tgtgccaaag gctaccagca g          111
<210>  8
<211>  604
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  8
Met Met Arg Ala Val Trp Glu Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ala Val Ala
1               5                   10                  15
Cys Leu Val Gly Ala Val Arg Gly Gly Pro Gly Leu Ser Met Phe Ala
            20                  25                  30
Gly Gln Ala Ala Gln Pro Asp Pro Cys Ser Asp Glu Asn Gly His Pro
        35                  40                  45
Arg Arg Cys Ile Pro Asp Phe Val Asn Ala Ala Phe Gly Lys Asp Val
    50                  55                  60
Arg Val Ser Ser Thr Cys Gly Arg Pro Pro Ala Arg Tyr Cys Val Val
65                  70                  75                  80
Ser Glu Arg Gly Glu Glu Arg Leu Arg Ser Cys His Leu Cys Asn Ser
                85                  90                  95
Ser Asp Pro Lys Lys Ala His Pro Pro Ala Phe Leu Thr Asp Leu Asn
            100                 105                 110
Asn Pro His Asn Leu Thr Cys Trp Gln Ser Glu Asn Tyr Leu Gln Phe
        115                 120                 125
Pro His Asn Val Thr Leu Thr Leu Ser Leu Gly Lys Lys Phe Glu Val
    130                 135                 140
Thr Tyr Val Ser Leu Gln Phe Cys Ser Pro Arg Pro Glu Ser Met Ala
145                 150                 155                 160
Ile Tyr Lys Ser Met Asp Tyr Gly Arg Thr Trp Val Pro Phe Gln Phe
                165                 170                 175
Tyr Ser Thr Gln Cys Arg Lys Met Tyr Asn Arg Pro His Arg Ala Pro
            180                 185                 190
Ile Thr Lys Gln Asn Glu Gln Glu Ala Val Cys Thr Asp Ser His Thr
        195                 200                 205
Asp Met Arg Pro Leu Ser Gly Gly Leu Ile Ala Phe Ser Thr Leu Asp
    210                 215                 220
Gly Arg Pro Ser Ala His Asp Phe Asp Asn Ser Pro Val Leu Gln Asp
225                 230                 235                 240
Trp Val Thr Ala Thr Asp Ile Arg Val Ala Phe Ser Arg Leu His Thr
                245                 250                 255
Phe Gly Asp Glu Asn Glu Asp Asp Ser Glu Leu Ala Arg Asp Ser Tyr
            260                 265                 270
Tyr Tyr Ala Val Ser Asp Leu Gln Val Gly Gly Arg Cys Lys Cys Asn
        275                 280                 285
Gly His Ala Ala Arg Cys Val Arg Asp Arg Asp Asp Ser Leu Val Cys
    290                 295                 300
Asp Cys Arg His Asn Thr Ala Gly Pro Glu Cys Asp Arg Cys Lys Pro
305                 310                 315                 320
Phe His Tyr Asp Arg Pro Trp Gln Arg Ala Thr Ala Arg Glu Ala Asn
                325                 330                 335
Glu Cys Val Ala Cys Asn Cys Asn Leu His Ala Arg Arg Cys Arg Phe
            340                 345                 350
Asn Met Glu Leu Tyr Lys Leu Ser Gly Arg Lys Ser Gly Gly Val Cys
        355                 360                 365
Leu Asn Cys Arg His Asn Thr Ala Gly Arg His Cys His Tyr Cys Lys
    370                 375                 380
Glu Gly Phe Tyr Arg Asp Met Gly Lys Pro Ile Thr His Arg Lys Ala
385                 390                 395                 400
Cys Lys Ala Cys Asp Cys His Pro Val Gly Ala Ala Gly Lys Thr Cys
                405                 410                 415
Asn Gln Thr Thr Gly Gln Cys Pro Cys Lys Asp Gly Val Thr Gly Ile
            420                 425                 430
Thr Cys Asn Arg Cys Ala Lys Gly Tyr Gln Gln Ser Arg Ser Pro Ile
        435                 440                 445
Ala Pro Cys Ile Lys Ile Pro Val Ala Pro Pro Thr Thr Ala Ala Ser
    450                 455                 460
Ser Val Glu Glu Pro Glu Asp Cys Asp Ser Tyr Cys Lys Ala Ser Lys
465                 470                 475                 480
Gly Lys Leu Lys Met Asn Met Lys Lys Tyr Cys Arg Lys Asp Tyr Ala
                485                 490                 495
Val Gln Ile His Ile Leu Lys Ala Asp Lys Ala Gly Asp Trp Trp Lys
            500                 505                 510
Phe Thr Val Asn Ile Ile Ser Val Tyr Lys Gln Gly Thr Ser Arg Ile
        515                 520                 525
Arg Arg Gly Asp Gln Ser Leu Trp Ile Arg Ser Arg Asp Ile Ala Cys
    530                 535                 540
Lys Cys Pro Lys Ile Lys Pro Leu Lys Lys Tyr Leu Leu Leu Gly Asn
545                 550                 555                 560
Ala Glu Asp Ser Pro Asp Gln Ser Gly Ile Val Ala Asp Lys Ser Ser
                565                 570                 575
Leu Val Ile Gln Trp Arg Asp Thr Trp Ala Arg Arg Leu Arg Lys Phe
            580                 585                 590
Gln Gln Arg Glu Lys Lys Gly Lys Cys Lys Lys Ala
        595                 600
<210>  9
<211>  1815
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  9
atgatgcgcg ctgtgtggga ggcgctggcg gcgctggcgg cggtggcgtg cctggtgggc  60
gcggtgcgcg gcgggcccgg gcttagcatg ttcgccggcc aggcggcgca gcctgatcct 120
tgctcggatg agaatggaca cccgcgccgc tgcatcccgg actttgtcaa cgcggccttc 180
ggcaaggacg tgcgcgtgtc cagcacctgc ggccggcccc cggcgcgcta ctgcgtggtg 240
agcgagcgtg gtgaagagcg gctgcgctcc tgtcacctct gcaactcttc ggatcccaag 300
aaagcgcacc cgcccgcctt cctcaccgac ctcaataacc cgcacaacct gacgtgctgg 360
cagtccgaga actacctgca gttcccgcac aacgtgacgc tcactctgtc gctcggcaag 420
aagtttgagg tgacctatgt gagcctgcaa ttctgctcgc cgcggccaga gtccatggcc 480
atctacaagt ccatggacta cgggcgcacg tgggtgccct tccagttcta ttccacgcag 540
tgccgcaaaa tgtacaaccg gccgcaccgc gcgcctatca ccaaacagaa cgagcaggag 600
gccgtgtgca ccgactcgca caccgacatg cgcccgctct ctggcgggct gatcgctttc 660
agcacgctgg acgggcggcc ctcggcgcac gacttcgaca actcgccggt gctgcaggac 720
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aacgaagacg actcggagct ggcgcgcgac tcctattact atgcagtgtc tgacctgcag 840
gttggcggcc gctgcaagtg caacggccac gcggcgcgtt gcgtgcgcga ccgagacgac 900
agtctggtgt gtgactgtag gcacaacacg gccggccctg aatgcgaccg ttgcaagccc 960
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cactactgca aggagggctt ctaccgagac atgggcaagc ctatcaccca ccggaaggct 1200
tgcaaagcct gtgattgcca cccagtgggt gctgctggca agacctgcaa tcaaaccact 1260
ggccaatgtc cctgcaagga cggcgtgacg ggcatcacct gcaaccgatg tgccaaaggc 1320
taccagcaga gccgctcccc catcgcccct tgcatcaaga ttcctgtggc gccacccacc 1380
actgcagcca gcagcgtgga ggaaccggaa gactgtgact cctattgcaa ggcctccaaa 1440
ggcaagctga agatgaacat gaagaaatac tgcaggaagg actatgctgt ccagatccac 1500
atcctgaagg ccgacaaagc aggggactgg tggaagttca ccgtgaacat catctccgtg 1560
tacaagcagg gcacaagtcg tattcgccgt ggtgaccaga gtttgtggat ccgctcacga 1620
gacatcgcct gcaagtgtcc caaaatcaag cccctcaaga agtacttgct gttgggtaat 1680
gccgaggact cacctgacca gagtggcatc gtggcagaca agagcagcct ggtgatccag 1740
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tgcaagaagg cctag                                                  1815
<210>  10
<211>  567
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  10
Met Met Arg Ala Val Trp Glu Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ala Val Ala
1               5                   10                  15
Cys Leu Val Gly Ala Val Arg Gly Gly Pro Gly Leu Ser Met Phe Ala
            20                  25                  30
Gly Gln Ala Ala Gln Pro Asp Pro Cys Ser Asp Glu Asn Gly His Pro
        35                  40                  45
Arg Arg Cys Ile Pro Asp Phe Val Asn Ala Ala Phe Gly Lys Asp Val
    50                  55                  60
Arg Val Ser Ser Thr Cys Gly Arg Pro Pro Ala Arg Tyr Cys Val Val
65                  70                  75                  80
Ser Glu Arg Gly Glu Glu Arg Leu Arg Ser Cys His Leu Cys Asn Ser
                85                  90                  95
Ser Asp Pro Lys Lys Ala His Pro Pro Ala Phe Leu Thr Asp Leu Asn
            100                 105                 110
Asn Pro His Asn Leu Thr Cys Trp Gln Ser Glu Asn Tyr Leu Gln Phe
        115                 120                 125
Pro His Asn Val Thr Leu Thr Leu Ser Leu Gly Lys Lys Phe Glu Val
    130                 135                 140
Thr Tyr Val Ser Leu Gln Phe Cys Ser Pro Arg Pro Glu Ser Met Ala
145                 150                 155                 160
Ile Tyr Lys Ser Met Asp Tyr Gly Arg Thr Trp Val Pro Phe Gln Phe
                165                 170                 175
Tyr Ser Thr Gln Cys Arg Lys Met Tyr Asn Arg Pro His Arg Ala Pro
            180                 185                 190
Ile Thr Lys Gln Asn Glu Gln Glu Ala Val Cys Thr Asp Ser His Thr
        195                 200                 205
Asp Met Arg Pro Leu Ser Gly Gly Leu Ile Ala Phe Ser Thr Leu Asp
    210                 215                 220
Gly Arg Pro Ser Ala His Asp Phe Asp Asn Ser Pro Val Leu Gln Asp
225                 230                 235                 240
Trp Val Thr Ala Thr Asp Ile Arg Val Ala Phe Ser Arg Leu His Thr
                245                 250                 255
Phe Gly Asp Glu Asn Glu Asp Asp Ser Glu Leu Ala Arg Asp Ser Tyr
            260                 265                 270
Tyr Tyr Ala Val Ser Asp Leu Gln Val Gly Gly Arg Cys Lys Cys Asn
        275                 280                 285
Gly His Ala Ala Arg Cys Val Arg Asp Arg Asp Asp Ser Leu Val Cys
    290                 295                 300
Asp Cys Arg His Asn Thr Ala Gly Pro Glu Cys Asp Arg Cys Lys Pro
305                 310                 315                 320
Phe His Tyr Asp Arg Pro Trp Gln Arg Ala Thr Ala Arg Glu Ala Asn
                325                 330                 335
Glu Cys Val Ala Cys Asn Cys Asn Leu His Ala Arg Arg Cys Arg Phe
            340                 345                 350
Asn Met Glu Leu Tyr Lys Leu Ser Gly Arg Lys Ser Gly Gly Val Cys
        355                 360                 365
Leu Asn Cys Arg His Asn Thr Ala Gly Arg His Cys His Tyr Cys Lys
    370                 375                 380
Glu Gly Phe Tyr Arg Asp Met Gly Lys Pro Ile Thr His Arg Lys Ala
385                 390                 395                 400
Cys Lys Ala Cys Asp Cys Ser Arg Ser Pro Ile Ala Pro Cys Ile Lys
                405                 410                 415
Ile Pro Val Ala Pro Pro Thr Thr Ala Ala Ser Ser Val Glu Glu Pro
            420                 425                 430
Glu Asp Cys Asp Ser Tyr Cys Lys Ala Ser Lys Gly Lys Leu Lys Met
        435                 440                 445
Asn Met Lys Lys Tyr Cys Arg Lys Asp Tyr Ala Val Gln Ile His Ile
    450                 455                 460
Leu Lys Ala Asp Lys Ala Gly Asp Trp Trp Lys Phe Thr Val Asn Ile
465                 470                 475                 480
Ile Ser Val Tyr Lys Gln Gly Thr Ser Arg Ile Arg Arg Gly Asp Gln
                485                 490                 495
Ser Leu Trp Ile Arg Ser Arg Asp Ile Ala Cys Lys Cys Pro Lys Ile
            500                 505                 510
Lys Pro Leu Lys Lys Tyr Leu Leu Leu Gly Asn Ala Glu Asp Ser Pro
        515                 520                 525
Asp Gln Ser Gly Ile Val Ala Asp Lys Ser Ser Leu Val Ile Gln Trp
    530                 535                 540
Arg Asp Thr Trp Ala Arg Arg Leu Arg Lys Phe Gln Gln Arg Glu Lys
545                 550                 555                 560
Lys Gly Lys Cys Lys Lys Ala
                565
<210>  11
<211>  1704
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  11
atgatgcgcg ctgtgtggga ggcgctggcg gcgctggcgg cggtggcgtg cctggtgggc  60
gcggtgcgcg gcgggcccgg gcttagcatg ttcgccggcc aggcggcgca gcctgatcct 120
tgctcggatg agaatggaca cccgcgccgc tgcatcccgg actttgtcaa cgcggccttc 180
ggcaaggacg tgcgcgtgtc cagcacctgc ggccggcccc cggcgcgcta ctgcgtggtg 240
agcgagcgtg gtgaagagcg gctgcgctcc tgtcacctct gcaactcttc ggatcccaag 300
aaagcgcacc cgcccgcctt cctcaccgac ctcaataacc cgcacaacct gacgtgctgg 360
cagtccgaga actacctgca gttcccgcac aacgtgacgc tcactctgtc gctcggcaag 420
aagtttgagg tgacctatgt gagcctgcaa ttctgctcgc cgcggccaga gtccatggcc 480
atctacaagt ccatggacta cgggcgcacg tgggtgccct tccagttcta ttccacgcag 540
tgccgcaaaa tgtacaaccg gccgcaccgc gcgcctatca ccaaacagaa cgagcaggag 600
gccgtgtgca ccgactcgca caccgacatg cgcccgctct ctggcgggct gatcgctttc 660
agcacgctgg acgggcggcc ctcggcgcac gacttcgaca actcgccggt gctgcaggac 720
tgggtcacgg ccaccgacat ccgcgtggct ttcagccgcc tgcacacgtt cggcgacgag 780
aacgaagacg actcggagct ggcgcgcgac tcctattact atgcagtgtc tgacctgcag 840
gttggcggcc gctgcaagtg caacggccac gcggcgcgtt gcgtgcgcga ccgagacgac 900
agtctggtgt gtgactgtag gcacaacacg gccggccctg aatgcgaccg ttgcaagccc 960
ttccactacg accggccctg gcagcgcgcc acggcccgcg aggccaacga gtgcgtggcc 1020
tgcaactgca acctccatgc tcggcgctgc agattcaaca tggagctcta taagctatca 1080
gggcgcaaga gcgggggagt ctgtctcaac tgccgccaca acactgcggg ccgccactgc 1140
cactactgca aggagggctt ctaccgagac atgggcaagc ctatcaccca ccggaaggct 1200
tgcaaagcct gtgattgcag ccgctccccc atcgcccctt gcatcaagat tcctgtggcg 1260
ccacccacca ctgcagccag cagcgtggag gaaccggaag actgtgactc ctattgcaag 1320
gcctccaaag gcaagctgaa gatgaacatg aagaaatact gcaggaagga ctatgctgtc 1380
cagatccaca tcctgaaggc cgacaaagca ggggactggt ggaagttcac cgtgaacatc 1440
atctccgtgt acaagcaggg cacaagtcgt attcgccgtg gtgaccagag tttgtggatc 1500
cgctcacgag acatcgcctg caagtgtccc aaaatcaagc ccctcaagaa gtacttgctg 1560
ttgggtaatg ccgaggactc acctgaccag agtggcatcg tggcagacaa gagcagcctg 1620
gtgatccagt ggcgggacac atgggcacgg cggctgcgca agttccagca acgggagaag 1680
aagggcaagt gcaagaaggc ctag                                        1704
<210>  12
<211>  269
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  12
Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro
1               5                   10                  15
Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu
            20                  25                  30
Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu
        35                  40                  45
Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys
    50                  55                  60
Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn
65                  70                  75                  80
Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu
                85                  90                  95
Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser
            100                 105                 110
Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu
        115                 120                 125
Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn
    130                 135                 140
Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp
145                 150                 155                 160
Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu
                165                 170                 175
Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr
            180                 185                 190
Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala
        195                 200                 205
Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Glu Val Leu
    210                 215                 220
Phe Gln Gly Pro Leu Gly Ser Pro Glu Phe Pro Gly Arg Leu Glu Arg
225                 230                 235                 240
Pro His His Pro Val Gly Ala Ala Gly Lys Thr Cys Asn Gln Thr Thr
                245                 250                 255
Gly Gln Cys Pro Cys Lys Asp Gly Val Thr Gly Ile Thr
            260                 265
<210>  13
<211>  819
<212>  DNA
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  13
atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt  60
ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 120
tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180
ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac 240
atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg 300
gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360
gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420
acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 480
gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540
aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 600
tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 660
ctgatcgaag gtcgtgggat cccccaccct gtgggtgctg ctggcaaaac ctgcaaccaa 720
accaccggcc agtgtccctg caaggacggc gtgacgggta tcacctgcaa ccgctgcgcc 780
aaaggctacc agcagctcga gcggccgcat cgtgactga                        819
<210>  14
<211>  11
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  14
Thr Pro Cys Cys Gly Lys Thr Asp Val Gly Ile
1               5                   10
<210>  15
<211>  11
<212>  PRT
<213>  人工序列(Artificial Sequence)
<400>  15
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1               5                   10

Claims (5)

1.一种促进细胞存活的Netrin-1模拟肽，其特征在于，为穿膜肽-结合肽；所述结合肽为Netrin-1的截短体Pep 422，所述Netrin-1的截短体Pep 422的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述Netrin-1模拟肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.Netrin-1的截短体Pep 422或权利要求1所述促进细胞存活的Netrin-1模拟肽在制备治疗出血性脑卒中的药物中的应用，所述Netrin-1的截短体Pep 422的氨基酸序列如SEQID NO：1所示。
3.Netrin-1的截短体Pep 422或权利要求1所述促进细胞存活的Netrin-1模拟肽在制备神经保护的药物中的应用，所述Netrin-1的截短体Pep 422的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
4.一种具有Netrin-1活性的人工模拟肽，其特征在于，为穿膜肽-结合肽；所述结合肽为Netrin-1的截短体Pep 407，所述Netrin-1的截短体Pep 407的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述人工模拟肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
5.权利要求4所述人工模拟肽在制备治疗出血性脑卒中或神经保护的药物中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117736272B (zh) * 2024-02-19 2024-04-30 四川省医学科学院·四川省人民医院 一种具有促成骨功能的生物活性多肽

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110312532A (zh) * 2016-12-19 2019-10-08 韩美药品株式会社 脑靶向长效蛋白质缀合物
TW201942139A (zh) * 2018-03-30 2019-11-01 南韓商韓美藥品股份有限公司 用於以腦為標靶之長效蛋白質接合物、其製備方法及包括該接合物之組成物
WO2020041142A1 (en) * 2018-08-23 2020-02-27 Rutgers, The State University Of New Jersey Treating spinal cord injury (sci) and brain injury using gsx1

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX336675B (es) * 2006-02-28 2016-01-27 Centre Nat Rech Scient Cribado para compuestos anticancerigenos utilizando actividad de netrina-1.
EP2708231A1 (en) * 2012-09-12 2014-03-19 Netris Pharma Combined treatment with netrin-1 interfering drug and chemotherapeutic drug
WO2015118514A1 (en) * 2014-02-10 2015-08-13 University Of Manitoba Netrin-1 and dependence receptor proteins and methods of use
US10550163B2 (en) * 2014-04-03 2020-02-04 The Regents Of The University Of California Peptide fragments of netrin-1 and compositions and methods thereof
CN105031611B (zh) * 2015-06-18 2018-02-09 中国医学科学院基础医学研究所 netrin‑1蛋白在制备用于肿瘤治疗的药物中的用途
WO2020123576A1 (en) * 2018-12-12 2020-06-18 The Regents Of The University Of California Modified netrin-1 peptides and compositions for cardioprotection

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110312532A (zh) * 2016-12-19 2019-10-08 韩美药品株式会社 脑靶向长效蛋白质缀合物
TW201942139A (zh) * 2018-03-30 2019-11-01 南韓商韓美藥品股份有限公司 用於以腦為標靶之長效蛋白質接合物、其製備方法及包括該接合物之組成物
WO2020041142A1 (en) * 2018-08-23 2020-02-27 Rutgers, The State University Of New Jersey Treating spinal cord injury (sci) and brain injury using gsx1

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Itokazu 等.Identification of the Neogenin-Binding Site on the Repulsive Guidance Molecule A.PLOS ONE.2012,第7卷(第3期),e32791. *
Li 等.Induction of cardioprotection by small netrin-1-derived peptides.Am J Physiol Cell Physiol.2015,第309卷(第2期),C100-C106. *

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