CN105031611B - netrin‑1蛋白在制备用于肿瘤治疗的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了netrin‑1蛋白在制备用于肿瘤治疗的药物中的用途。具体地，本发明公开了netrin‑1蛋白在制备用于肿瘤治疗的药物中的用途，所述肿瘤选自胰腺癌，更优选为胰导管腺癌。本发明的公开对于预防、诊断和治疗胰导管腺癌以及开发治疗胰导管腺癌的药物具有积极意义。

Description

netrin-1蛋白在制备用于肿瘤治疗的药物中的用途

技术领域

本发明涉及蛋白在肿瘤诊断和治疗中的应用，特别涉及netrin-1蛋白在制备用于肿瘤治疗的药物中的用途。

背景技术

胰导管腺癌(Pancreatic Ductal Adenocarcinoma，PDAC)是最致命的肿瘤之一，在所有的胰腺肿瘤中，胰导管腺癌占到了95％以上的比例。胰导管腺癌病例在发现时多数就已经是晚期肿瘤或者已经发生了远程转移，仅有不足20％的患者能够获得手术治疗的机会，总体的中位生存期不足1年。目前对于胰腺癌的发病机制了解甚少，这也限制了针对性的治疗方案和药物的开发。近年来，对于胰腺癌的分子水平的表达变化以及基因突变，基因组上SNP的大规模分析方兴未艾，随着多种肿瘤模式生物，异体移植模型的应用，对于胰腺癌发生发展相关分子机制的研究也有了长足的进步。多种胰导管腺癌相关的基因突变，如KRAS，p53，CDKN2A，转化生长因子受体(TGFβ)在患者病理组织内被检出，这提示了相应分子对于胰腺导管腺肿瘤发生发展的关键性。基因表达谱的分析则提供了更加广泛跟胰腺癌发生发展过程息息相关分子的表达变化情况。病理组织的表达芯片分析揭示了多达数百个存在明显的表达变化的基因，包括MAPK、hedgehog、Notch在内的多个信号通路也被观察到了表达和磷酸化水平的变化。这些变化向我们展示了胰导管腺癌发生发展中潜在的调控过程，并给新的药物靶标和治疗途径的探索提供了参考。

最新的研究提示了轴突引导通路与胰腺癌的相关性。netrin-1分子作为轴突引导过程中的重要分子，通过受体DCC，Neogenin，UNC5家族成员等分子介导了轴突沿netrin-1浓度梯度的生长和排斥作用。除了参与神经系统的轴突导向以外，netrin-1也在上皮组织来源器官的早期形成和分支发生过程中，发挥重要的功能，通过与受体相互结合，介导上皮组织的粘附和迁移等过程，从而构建器官的正常形态和功能。此外，其受体是自身参与细胞凋亡过程的“依赖型受体”，所以netrin-1与肿瘤的相关性很早就得到了相当的关注，其受体DCC以及UNC5家族部分成员(UNC5A，5B，5C)可以在配体netrin-1缺失时诱导细胞凋亡过程而在存在netrin-1结合时抑制凋亡维持细胞的生存。netrin-1还参与到p53通路的调控过程，p53可以作为转录因子促进UNC5B的表达，从而通过该依赖型受体诱导细胞凋亡过程，netrin-1与UNC5B的结合则可以阻断p53介导的细胞凋亡过程。

ITGB4和Integrin β4是同一种蛋白，只不过ITGB4表示基因，而Integrin β4 表示蛋白。Integrins β4在肿瘤研究较多，但是在PDAC中功能的研究相对较少。Integrin β4在多种肿瘤细胞中表达均上调，如乳腺癌，膀胱癌，结直肠癌和胰腺癌等。并且Integrin β4表达越高，临床预后越差。Integrin β4主要从以下几方面参与肿瘤的发生发展:稳定细胞之间的黏附，促进肿瘤迁移和侵袭，抑制肿瘤细胞凋亡，和促进肿瘤血管的发生。Integrin β4可以调节细胞连接半桥粒结构的稳定性。其下游主要与integrin连接激酶相结合，向细胞核内传递信号。另外，Integrin β4可以与酪氨酸激酶受体相结合，如EGFR、ERBB2、Met和Ron。酪氨酸激酶的激活可以使Integrin β4激活，导致半桥粒的解聚，促进细胞迁移。

早在2003年，Mayra Yebra等第一次证明Integrin α3β1和Integrin α6β4是netrin-1的受体，参与胰腺细胞中netrin-1介导的细胞黏附和迁移。

细胞迁移和侵袭是肿瘤细胞的重要特征。在PDAC细胞中，过表达Integrin β4可以促进EMT，进而促进PDAC细胞的迁移和侵袭。提示Integrin与PDAC的迁移和侵袭相关。过表达Integrins可以激活转录因子AP1，进而增加MMP9的表达水平。目前为止，只有为数不多的几篇报道研究netrin-1在PDAC发生发展中的作用，只是在细胞水平发现netrin-1可以促进PDAC的发生发展，但缺乏动物水平的实验。而且netrin-1在PDAC中的作用受体，下游信号通路，以及netrin-1所调节的效应基因等问题都鲜有研究。对于netrin-1在肿瘤诊断、预防和治疗中的应用，特别是对胰导管腺癌诊断、预防和治疗中的应用目前更是鲜有研究。

发明内容

与之前研究的结果相反，申请人的研究发现过表达netrin-1可以抑制PDAC细胞的3D生长，并且在动物移植瘤实验中也得到了相似的结论：netrin-1可以抑制PDAC细胞的成瘤。另外，我们在分子水平上详细阐述了netrin-1抑制PDAC发生发展的分子机制，这可以为PDAC的药物筛选以及药物靶点的鉴定提供参考。

本发明一方面提供一条完整的UNC5B信号通路，其披露了netrin-1通过与UNC5B结合激活下游信号通路进而抑制ITGB4的表达，通过integrin β4蛋白表达水平的降低来抑制肿瘤生长。其中所述信号通路包括以下蛋白：UNC5B、netrin-1、integrin β4、FAK、pp2a、Mek2、Erk1/2、c-Jun。

本发明另一方面提供netrin-1蛋白在制备用于肿瘤治疗的药物中的用途。优选地，本发明提供netrin-1蛋白在用于制备抑制肿瘤集落形成的药物中的用途。

在还一方面，本发明提供检测netrin-1蛋白表达的试剂在制备肿瘤诊断试剂盒中的用途。

优选地，所述试剂为netrin-1蛋白的抗体。优选地，所述肿瘤为胰腺癌，更优选为胰腺导管癌，最优选为I/II期胰导管腺癌。优选地，当检测netrin-1表达降低时，则提示具有患有肿瘤的高风险。

本发明还提供含有编码netrin-1蛋白的核酸的载体在制备用于肿瘤治疗的药物中的用途。优选地，所述载体为过表达netrin-1蛋白的载体。优选地，所述药物为抑制肿瘤集落形成的药物。所述药物还可用于降低肿瘤细胞对细胞外基质组分的黏附能力。

在另一方面，本发明还提供integrin β4蛋白在制备用于肿瘤治疗的药物中的用途。

本发明还提供用于抑制integrin β4蛋白表达的试剂在制备用于肿瘤治疗的药物中的用途，所述试剂为用于对ITGB4进行RNAi干扰的序列，其序列如SEQ ID NO:5-6所示。所述序列通过RNAi抑制ITGB4基因的表达，从而抑制integrin β4蛋白表达。优选地，所述载体为ITGB4的RNAi载体，更优选为pSIREN-ITGB4RNAi载体。

在又一方面，本发明还提供UNC5B蛋白在制备用于肿瘤治疗的药物中的用途。

本发明还提供用于抑制UNC5B蛋白表达的试剂在制备用于肿瘤治疗的药物中的用途，所述试剂用于对UNC5B进行RNAi干扰的序列，其序列如SEQ ID NO:1-4所示。所述序列通过RNAi抑制UNC5B基因的表达，从而抑制UNC5B蛋白表达。优选地，所述试剂为UNC5B的RNAi载体，更优选为pSIREN-UNC5B RNAi载体。

优选地，所述肿瘤选自胰腺癌，更优选为胰导管腺癌。

本发明还提供一种用于治疗和/或抑制肿瘤的药物组合物，其包含netrin-1蛋白或含有编码netrin-1蛋白核酸的载体、以及一种或多种药用赋形剂或药用载体，所述肿瘤优选为胰腺癌，更优选为胰腺导管腺癌。

在本发明所述的用于治疗和/或抑制肿瘤的药物组合物中，netrin-1有效测试浓度为0-50ng/mL，优选为10、20、30、40、50ng/mL，更优选为10或20ng/mL，最优选为20ng/mL，所述浓度为20ng/mL的netrin-1具有意想不到的治疗效果。

优选地，所述药物组合物包含过表达netrin-1蛋白的载体。

优选地，上述所有药物为抑制肿瘤集落形成的药物。

本发明还提供UNC5B信号通路蛋白在制备用于肿瘤治疗的药物中的用途，其中所述UNC5B信号通路蛋白选自UNC5B、netrin-1和integrin β4。

优选地，所述蛋白为UNC5B。

优选地，所述蛋白为netrin-1。

优选地，所述蛋白为integrin β4。

优选地，所述药物为抑制肿瘤集落形成的药物。

本发明还提供检测UNC5B信号通路蛋白表达的试剂在制备肿瘤诊断试剂盒中的用途，优选地，所述试剂为抗netrin-1的抗体。

本发明还提供分离的核酸，其是用于对UNC5B信号通路蛋白进行RNAi干扰的序列。

优选地，所述核酸为SEQ ID NO:1-4所示的UNC5B的RNAi干扰序列。

优选地，所述核酸为SEQ ID NO:5-6所示的ITGB4的RNAi干扰序列。

本发明还提供所述核酸在制备用于肿瘤治疗的药物中的用途，其中所述肿瘤选自胰腺癌，更优选为胰导管腺癌。

本发明还提供包含所述核酸序列的载体。

本发明提供所述编码UNC5B信号通路蛋白的核酸。

本发明进一步提供编码netrin-1的核酸，其中核酸为如Genbank的序列NM_004822.2所示的mRNA。

本发明还提供含有编码UNC5B信号通路蛋白核酸的载体在制备用于肿瘤治疗的药物中的用途。

优选地，所述核酸为编码netrin-1的核酸。

本发明所述的肿瘤选自胰腺癌，更优选为胰导管腺癌。

在另一方面，本发明还提供用于治疗和/或抑制肿瘤的药物组合物，其含有根据本发明的UNC5B信号通路蛋白、编码所述蛋白的核酸、或含有所述核酸的载体，以及一种或多种药用赋形剂或药用载体，所述肿瘤优选为胰腺癌，更优选为胰腺导管癌。

优选地，所述药物组合物包含UNC5B的RNAi载体，更优选为pSIREN-UNC5B RNAi载体。

优选地，所述药物组合物包含ITGB4的RNAi载体，更优选为pSIREN-ITGB4RNAi载体。

本发明还提供试剂在制备肿瘤诊断试剂盒中的用途，其中所述试剂用于检测所述UNC5B信号通路蛋白或编码所述蛋白的核酸序列的表达，所述肿瘤优选为胰腺癌，更优选为胰腺导管癌，最优选为I/II期胰导管腺癌。

本发明首次在动物水平的实验上证实了UNC5B信号通路蛋白，如UNC5B、netrin-1和integrin β4在肿瘤治疗中的前景。并首次公开了netrin-1在抑制肿瘤的信号通路上的作用受体、下游信号通路、以及netrin-1所调节的效应基因等。本发明首次证明过表达netrin-1可以抑制胰导管腺癌生长，以及证明在在动物移植瘤实验中通过抑制UNC5B或integrin β4的表达也可以抑制胰导管腺癌生长。本发明的公布对于预防、诊断和治疗胰导管腺癌以及开发治疗胰导管腺癌的药物具有积极意义。

附图说明

图1A至1D，图1A表示构建过表达netrin-1逆转录病毒所使用的pMSCV载体。载体全长约6.5kb，载体上包括一个5’LTR启动子。该启动子可以转录下游的Ψ+病毒包装信号以及插入到多克隆位点(MCS)的目的基因，所述多克隆位点如图1B所示。该载体含真核筛选基因Neo和原核筛选基因氨苄抗性基因。图1C表 示构建RNAi干扰用逆转录病毒载体所使用的RNAi-ready pSIREN-RetroQ载体。载体全长约6.4kb，包含了U6病毒启动子及其下游的shRNA插入位点。其他组件还包括CMV启动子和下游的Ψ+病毒包装信号，PGK启动子启动的嘌呤霉素抗性基因以及在细菌中表达的氨苄抗性基因。图1D显示下游的shRNA插入位点(BamHI，EcoRI粘性末端)。

图2表示构建netrin-1过表达的MiaPaCa II细胞系。Western blot显示，感染逆转录病毒的Miapaca II细胞成功过表达netrin-1蛋白。

图3A和图3B，图3A表示过表达和未过表达netrin-1的Miapaca II细胞系在鸡胚胎绒毛尿囊膜上成瘤能力的比较。过表达netrin-1的Miapaca II细胞在鸡胚胎绒毛尿囊膜(CAM)上的成瘤能力显著下降。bar＝1mm.图3B表示过表达netrin-1的Miapaca II细胞降低其在鸡胚胎绒毛尿囊膜上肿瘤形成的面积。统计结果显示过表达netrin-1的Miapaca II细胞在鸡胚胎绒毛尿囊膜(CAM)上形成的肿瘤面积(N＝12)显著低于未过表达netrin-1的Miapaca II细胞形成的肿瘤面积(N＝7)。

图4A至4D，其中图4A至图4C表示过表达netrin-1显著降低Miapaca II细胞在联合重症免疫缺陷小鼠(SCID-biege mouse)移植瘤的成瘤能力，图4A表示netrin-1+的MiapacaII细胞在联合重症免疫缺陷小鼠中的成瘤能力；图4B表示netrin-1-的Miapaca II细胞在联合重症免疫缺陷小鼠中的成瘤能力；图4C表示同时移植netrin-1+和netrin-1-的Miapaca II细胞在联合重症免疫缺陷小鼠中的成瘤能力。每组肿瘤细胞接种量为5X10⁶细胞。Bar＝1cm.图4D表示过表达netrin-1降低Miapaca II细胞在联合重症免疫缺陷小鼠形成的肿瘤的相对重量。统计结果显示过表达netrin-1的Miapaca II细胞在联合重症免疫缺陷小鼠形成的肿瘤的相对重量(N＝10)显著低于未过表达netrin-1的Miapaca II细胞形成的肿瘤的相对重量(N＝11)。

图5A和图5B，其中图5A表示过表达/未过表达netrin-1降低Miapaca II细胞在裸鼠体内形成的肿瘤的生长曲线。将处于对数生长期的netrin-1过表达细胞(N＝10)和对照组(N＝10)按照5×10⁶个细胞/裸鼠接种到雄性裸鼠皮下，令其生长28天，每两天测量细胞长成的肿瘤的大小。图5B表示netrin-1显著地降低Miapaca II细胞在Matrigel中的3D生长能力。如图所示，过表达netrin-1的Miapaca II细胞在第二天，第六天和第十天的形成的克隆均小于正常Miapaca II细胞形成的克隆。

图6A和图6B，其中图6A表示过表达netrin-1不影响Miapaca II细胞的生长曲线。细胞生长曲线测定采用碧云天公司的CCK-8试剂盒，测量450nm波长的吸收光从而得到细胞的相对密度，连续测量6天。图6B表示netrin-1重组蛋白刺激Miapaca II细胞不影响Miapaca II细胞生长曲线。细胞生长曲线测定采用碧云天公司的CCK-8试剂盒，测量450nm波长的吸收光从而得到细胞的相对密度，连续测量6天。

图7A和图7B，其中图7A.表示过表达netrin-1降低Miapaca II细胞的黏附能力，其中的粘附成分从左至右分别为纤连蛋白、胶原I、胶原IV、层粘连蛋白I、纤维蛋白原和BSA。接种2X10⁵细胞于已包被细胞外基质成分的细胞板中，孵育2小时。将已经黏附的细胞进行染色并测量其在560nm处的吸收光。结果显示netrin-1显著降低Miapaca II细胞对纤连蛋白和纤维蛋白原的黏附能力。图7B表示netrin-1重组蛋白刺激降低Miapaca II细胞的黏附能力，其中的粘附成分从左至右分别为纤连蛋白、胶原I、胶原IV、层粘连蛋白I、纤维蛋白原和BSA。接种2X10⁵细胞于已包被细胞外基质成分的细胞板中，孵育2小时。将已经黏附的细胞进行染色并测量其在560nm处的吸收光，结果显示netrin-1显著降低Miapaca II细胞对纤连蛋白和纤维蛋白原的黏附能力。

图8A和图8B，其中图8A表示过表达netrin-1不影响Miapaca II细胞的侵袭能力。Miapaca II细胞的侵袭能力检测采用细胞迁移试剂盒(CBL,cba-100)，通过测量其在560nm处的吸收光反应细胞的侵袭能力。图8B表示netrin-1重组蛋白刺激Miapaca II细胞促进细胞的迁移能力。Miapaca II细胞的迁移能力检测采用细胞迁移试剂盒(CBL,cba-100)，通过测量其在560nm处的吸收光反应细胞的迁移能力。

图9表示netrin-1在I/II期PDAC样品中呈现低表达。免疫组织化学染色反应netrin-1在正常胰腺组织(第1行)，I期PDAC(第2行)，II期PDAC(第3行)，III期PDAC(第4行)和IV期PDAC(第5行)中的表达水平。结果显示netrin-1在I/II期PDAC样品中呈现低表达，而在III/IV期PDAC表达回升。

图10表示netrin-1在I/II期PDAC样品中呈现低表达。相对于正常胰腺组织样品(N＝10)netrin-1在I期(N＝29)和II期(N＝24)PDAC样品中呈现低表达，而在III/IV期(N＝11)PDAC组织中表达回升。

图11A和图11B，其中图11A表示netrin-1不影响Miapaca II细胞形成的移植瘤的血管生成。免疫组织化学染色的方法检测CD-31在移植瘤中的密度来反应血管生成(200X)。箭头显示的阳性着色。图11B表示netrin-1不影响Miapaca II细胞形成的移植瘤的血管生成。对每个视野中的血管数量进行统计发现血管的生成在netrin-1过表达的移植瘤和对照组中没有差别。

图12A-图12C，其中图12A表示netrin-1不影响细胞的caspase-3的活性。使用可以诱导细胞凋亡剂量的阿霉素处理Miapaca II细胞，caspase-3的活性并未受到netrin-1过表达的影响。图12B表示netrin-1不影响细胞凋亡。使用可以诱导细胞凋亡剂量的阿霉素处理Miapaca II细胞，TUNEL分析显示netrin-1不影响阿霉素诱导的细胞凋亡。图12C表示netrin-1促进细胞的极化。免疫荧光分析显示，和对照相比，netrin-1过表达的MiapcapaII细胞中CTNNB，ZO-1和E-CAD的更趋向于极化分布。

图13A-图13D，图13A和图13B表示netrin-1过表达显著地降低ITGB4的表达水平。过表达netrin-1可以从mRNA水平(图13A)和蛋白水平(图13B)下 调integrin β4的表达水平。Real-time PCR和WB实验中均以GAPDH作为内参。图13C和图13D netrin-1重组蛋白刺激Miapaca II细胞可以显著地降低ITGB4的表达水平。使用不同浓度的netrin-1重组蛋白均可以从mRNA水平(图13C)和蛋白水平(图13D)下调integrin β4的表达水平。Real-time PCR和WB实验中均以GAPDH作为内参。

图14A-图14F，其中图14A和图14B表示Miapaca II细胞感染含有ITGB4基因干扰序列的慢病毒构建得到稳定干扰ITGB4的Miapaca II细胞系。结果显示两条干扰序列均可以有效的在mRNA水平(图14A)和蛋白水平(图14B表)降低ITGB4的表达。Real-time PCR和WB实验中均以GAPDH作为内参。图14C干扰ITGB4显著地降低Miapaca II细胞在鸡胚胎绒毛尿囊膜上的成瘤能力。接种3X10⁶细胞于鸡胚胎绒毛尿囊膜上，七天后观察肿瘤的大小。(bar＝1mm)。图14D干扰ITGB4的Miapaca II细胞和未干扰的细胞在鸡胚胎绒毛尿囊膜上形成的肿瘤的相对面积的统计结果。统计结果显示，干扰ITGB4后，鸡胚胎绒毛尿囊膜上形成的肿瘤的相对面积降低约72％。图14E表示干扰ITGB4显著地降低Miapaca II细胞在联合重症免疫缺陷小鼠(SCID-biege mouse)中的成瘤能力。接种3X10⁶细胞，生长28天后观察肿瘤的大小。(bar＝1cm)。图14F表示干扰ITGB4的Miapaca II细胞和未干扰的细胞在联合重症免疫缺陷小鼠(SCID-biege mouse)中形成的肿瘤相对重量的统计结果。统计结果显示，干扰ITGB4后，肿瘤的相对重量下降约73％。

图15A-图15D，其中图15A表示Real-time PCR检测Miapaca II细胞中netrin-1的受体表达水平。结果显示UNC5A，UNC5C和UNC5D在Miapaca II细胞中几乎不表达。受体DCC表达水平很低，而受体UNC5B、NEO1、ITGA6、ITGB4、ITGA3和ITGB1在MiaPaCa II细胞中表达水平较高，可能我为netrin-1的功能受体。实验的内参为GAPDH。图15B表示Real-time PCR检测阻断受体UNC5B、NEO1、ITGA6、ITGB4、ITGA3和ITGB1后，ITGB4在netrin-1重组蛋白(20ng/ml)刺激前后的表达变化。结果显示，阻断UNC5B后，ITGB4的表达水平不在受到netrin-1的调节。实验的内参为GAPDH。图15C表示构建干扰UNC5B的Miapaca II细胞。Miapaca II细胞感染UNC5B-RNAi的慢病毒有效地降低UNC5B的蛋白水平。实验的内参为GAPDH。图15D表示干扰UNC5B有效地抑制netrin-1导致的ITGB4表达下调，所述netrin-1浓度是0或20ng/ml。WB结果显示干扰UNC5B后，ITGB4的蛋白水平不在受到netrin-1的调节。实验的内参为GAPDH。

具体实施方式

一、实验材料和方法

1.实验用细胞系及菌株

1.1工具细胞系

逆转录的包被采用了人胚肾HEK293T工具细胞系(ATCC)。

1.2肿瘤细胞系

构建netrin-1过表达以及其他相关分子变异胰导管腺癌细胞系采用了MiaPacaII(ATCC)和CaPan1(ATCC)两种胰腺癌细胞系。

1.3实验用菌株

病毒构建质粒转化采用了DH5α感受态大肠杆菌(TIANGEN)。

2实验动物及饲料

2.1鸡胚

CAM上的肿瘤生成实验使用了Whiteleghorn鸡种蛋的鸡胚(维通利华)。

2.2免疫缺陷小鼠

小鼠上的肿瘤生成实验采用了雄性SCID-biege联合重症免疫缺陷小鼠进行肿瘤细胞种植。小鼠上的肿瘤生长曲线测定采用了雄性Balb/c NU-/-裸鼠进行肿瘤细胞种植。小鼠饲养环境为SPF级标准培养环境。

2.3饲料

小鼠饲料由维通利华提供的经过了放射线照射处理标准SPF级实验小鼠饲料。

3组织芯片

人胰导管腺癌组织样本来源于人胰腺癌组织芯片(human pancreas cancertissure array)PATMA012(Creative Bioarray，PATMA012)。该组织芯片包括了65例胰导管腺癌样本，10例正常的胰腺导管组织样本，以及胰神经内分泌肿瘤，胰岛细胞癌，腺泡细胞癌，鳞状细胞癌，侵润性粘液性囊腺癌样本各1个。

4基因表达水平及蛋白质相互作用的分析方法

4.1基因表达芯片

测量相关基因在MiaPaCa II细胞中表达水平的基因表达芯片采用了Affymetrix公司的全基因组表达芯片GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0Array，该芯片包含针对47,000个转录本的探针，而这些探针针对超过10000个基因的表达水平。

5细胞培养基和细胞培养方法

5.1细胞培养基

胰腺癌细胞系和工具细胞HEK293T细胞系的完全培养基都采用添加10％胎牛血清(Gibco)的DMEM高糖培养基(Gibco)，抗生素采用100×青-链霉素溶液。在信号通路相关实验和转染的实验中采用无血清培养基。

6逆转录载体构建和病毒包装

6.1.过表达netrin-1用逆转录病毒载体Ad-NTN1的构建

pMSCV载体信息

鼠干细胞病毒(murine stem cell virus，MSCV)载体来自于鼠胚胎干细胞病毒(MESV)和LN逆转录病毒载体。载体上包括一个5’LTR启动子，这个启动子来自鼠PCMV病毒，经过了位点修改和删减后表现出更强的转录活性并可以抵制胚 胎干细胞以及胚胎干细胞来源的肿瘤对于转录的抑制。该启动子可以转录下游的Ψ+病毒包装信号以及插入到多克隆位点(MCS)的目的基因。

netrin-1mRNA插入片段序列

人netrin-1 mRNA序列来自Genbank的序列NM_004822.2，在终止密码子之前添加了同一读码框中c-myc标签序列。

6.2. RNAi干扰用逆转录病毒载体的构建

pSIREN载体信息

RNAi-ready pSIREN-RetroQ线性化载体是用于表达shRNA(small hairpin RNA)的自身干扰逆转录病毒表达载体。载体上包含了U6病毒启动子及其下游的shRNA插入位点(BamHI，EcoRI粘性末端)。其他组件还包括CMV启动子和下游的Ψ+病毒包装信号，PGK启动子启动的嘌呤霉素抗性基因以及在细菌中表达的氨苄抗性基因。

RNAi干扰片段的合成

RNAi干扰片段由invitrogen提供的shRNA设计服务根据mRNA序列设计，由clonetech提供二级结构的设计，最终由invitrogen合成为带有BamHI和EcoRI粘性末端全长约70bp的插入片段。其中integrin β4，UNC5B基因分别针对mRNA序列NM_000213.3和NM_170744.4设计。

ITGB4的干扰序列：

SEQ ID NO:1为1#正义链:

5'-gatccGCGACTACACTATTGGATTTTCAAGAGAAATCCAATAGTGTAGTCGCTTTTTTg-----3'

SEQ ID NO:2为1#反义链：

5'-aattcAAAAAAGCGACTACACTATTGGATTTCTCTTGAAAATCCAATAGTGTAGTCGCg-----3'

SEQ ID NO:3为2#正义链：

5'-gatccGCACGTGTGAGGAATGCAATTCAAGAGATTGCATTCCTCACACGTGCTTTTTTg-----3'

SEQ ID NO:4为2#反义链：

5'-aattcAAAAAAGCACGTGTGAGGAATGCAATCTCTTGAATTGCATTCCTCACACGTGCg-----3'

UNC5B的干扰序列：

SEQ ID NO:5为正义链：

5'-gatccGCCACACAGATCTACTTCAATTCAAGAGATTGAAGTAGATCTGTGTGGTTTTTTg-----3'

SEQ ID NO:6为反义链：

5'-aattcAAAAAACCACACAGATCTACTTCAATCTCTTGAATTGAAGTAGATCTGTGTGGCg-----3'

7.细胞生长粘附迁移等特性的探查

7.1细胞生长曲线测定

将不同表达状态或者不同处理的细胞分别种到一个6孔板中，每天采用由碧云天提供的CCK-8活细胞计数试剂盒进行计数，持续6天。450nm吸光度使用synergy 4(BioTeklnc.)酶标仪测定。

7.2细胞粘附能力测定

采用CellBioLab提供的CAB-070细胞粘附检验试剂盒检测不同处理的细胞针对各种细胞外基质蛋白的粘附能力。560nm吸光度使用synergy 4(BioTek lnc.)酶标仪测定。

7.3细胞侵袭和迁移能力的测定

采用CellBioLab提供的CAB-100细胞侵袭与迁移检验试剂盒检测不同处理的细胞受到趋化因子作用的迁移能力和向周围组织的侵袭能力。560nm吸光度使用synergy 4(BioTek lnc.)酶标仪测定。

8受体以及信号通路的阻断

8.1抗体阻断实验

8.1.1细胞培养与准备

在6孔板中将细胞培养到细胞融合度大于80％。

8.1.2抗体阻断

将细胞培养基转换为无血清培养基，在培养基中按照1:50的比例加入抗DCC、UNC5B、neogenin、integrin α3、integrin α6的抗体，处理12小时候弃去培养基改换为完全培养基继续培养12小时。

8.2抑制剂信号通路的阻断实验

8.2.1细胞培养与准备

在6孔板中将细胞培养到细胞覆盖面积超过80％。

8.2.2信号通路阻断剂的配制和使用

FAK的活性抑制剂FAK inhibitor 14(Merck)和AKT的活性抑制剂294002(Merck)按照50ug/mL溶解于DMSO中，并且按照1:1000的比例加入到细胞培养基中培养2小时。Apocynin稀释到终浓度1mM处理细胞48小时；一氧化氮清除剂Carboxy-PTIO以终浓度60μM处理细胞48小时；eNOS抑制剂L-NAME以终浓度30μM处理细胞48小时；PP1和PP2A抑制剂Okadaic acid钾盐以终浓度1μM处理细胞6小时。

9肿瘤细胞的动物移植模型的建立与统计

9.1鸡胚胎绒毛尿囊膜(CAM)肿瘤移植模型的建立

细胞培养与计数

将胰腺癌细胞株培养到对数生长期，消化后稀释细胞悬液到10⁶到10⁷个细胞 每毫升培养基。取10uL细胞稀释液加入到细胞计数板夹层中，镜下计数乘以稀释倍数就等于原液内细胞的浓度。

鸡蛋的准备和培养

将种蛋放置于37～38℃，湿度60％的孵箱内，胚胎所在端(通常为较大一端)向上放置，每天翻动。培养至胚胎发育第2天，在蛋侧面开口，吸取蛋清3mL，用隔水薄膜封闭开口，继续培养至胚胎发育第10天。

细胞种植

将疏水塑料环(直径1cm)放置于鸡蛋绒毛尿囊膜(Chorioallantoic membrane，CAM)上，用纤维轻轻划伤环内的CAM，将3～5×10⁶个细胞(体积30uL)滴注到环内划伤区域，封闭开口，继续培养至胚胎发育第17天。

肿瘤的收集和样本的处理

肿瘤在鸡胚上培养完毕后，沿环周围将长有肿瘤的CAM部分剪下，用生理盐水洗净后，放置于4％多聚甲醛中24～36小时，然后转移到75％酒精长期保存。

9.2重症联合免疫缺陷(SCID-biege)小鼠肿瘤移植模型的建立

9.2.1SCID-biege小鼠的准备和培养

SCID-biege小鼠在SPF培养环境饲养到5～7周。

9.2.2细胞培养和计数

同10.1.1。

9.2.3肿瘤细胞注射

将计数后的细胞按照3～5×10⁶细胞/100uL Matrigel(BD)与0～4℃matrigel混合成细胞悬液，将混合好的细胞悬液注射到SCID-biege小鼠背部皮下。在SPF环境下继续饲养28天。

9.2.4肿瘤的收集和样本的处理

将带肿瘤饲养了28天的SCID-biege小鼠处死，切开皮肤从皮下将肿瘤手术分离，称重后放入4％多聚甲醛溶液中放置4～7天时间，之后进行石蜡包埋。

9.3裸鼠(NU-/-)肿瘤模型的建立

9.3.1裸鼠的准备和培养

维通利华提供的Balb/c NU-/-免疫缺陷小鼠在SPF环境培养至4～5周。

9.3.2细胞的培养和计数

同10.1.1。

9.3.3肿瘤细胞注射

将计数后的细胞按照3～5×10⁶细胞/100uL Matrigel(BD)与0～4℃matrigel混合成细胞悬液，将混合好的细胞悬液注射到Balb/c NU-/-小鼠背部皮下。在SPF环境下继续饲养28天。

9.3.4生长过程中肿瘤大小的测量

每隔一天使用游标卡尺测量裸鼠肿瘤的长短直径，然后采用如下公式估算肿 瘤体积，V是估算体积，a是长直径，b是短径：

V＝1/2×ab2

9.4肿瘤大小与肿瘤生长曲线的统计

9.4.1鸡胚CAM肿瘤大小的计算和统计方法

鸡胚CAM肿瘤取下后采用体视镜(Carl Ziess)照相，然后使用IPP(Image-PROPlus 6.0.0.260)软件圈定并且计算肿瘤面积。对不同组别肿瘤面积大小的统计分析使用One-way ANOVA方差分析进行显著性分析，并且采用GraphPad Prism4.03.354软件绘图。

9.4.2 SCID-biege小鼠肿瘤大小的计算和统计方法

肿瘤从动物体分离后采用天平称重，对于不同组别肿瘤重量的统计分析使用One-way ANOVA方差分析进行显著性分析，并且采用GraphPad Prism 4.03.354软件绘图。

9.4.3肿瘤生长过程中大小的估算和统计方法

肿瘤生长过程中的大小采用V＝1/2×ab2进行估算，对于不同组别肿瘤生长过程中估算体积的统计分析采用Two-way ANOVA方差分析进行显著性分析，并且采用GraphPadPrism 4.03.354软件绘图。

10.体外肿瘤成瘤模型的建立与统计

10.1 matrigel模型的建立与统计

10.1.1 matrigel的处理

Matrigel(BD)冰冻分装保存在-20℃环境，使用前在冰上放置过夜融化，放置在冰上或者0～4℃环境保持matrigel处于液态。所有装载和转移matrigel的用品应该保持温度在0～4℃。

10.1.2 matrigel生长模型建立

在24孔板内按照100uL/cm2加入matrigel，水平晃动使得matrigel在孔里保持铺展均匀。在37℃放置30分钟。细胞悬液加入前悬液内细胞分散为单个，按照5～10×10⁴个细胞/mL向孔内加入0.5mL细胞悬液，连续培养12天。

10.1.3照相与统计

使用相差显微镜(Carl Ziess)照相，观察细胞团的生长情况，并且采用IPP软件进行肿瘤细胞团块的圈定和大小定量。对于不同组别细胞团块大小的统计使用One-wayANOVA方差分析进行显著性分析，并且采用GraphPad Prism 4.03.354软件绘图。

二、实施例

1.过表达netrin-1的胰导管腺癌细胞MiaPaCa II的成瘤能力显著下降

1.1 netrin-1蛋白过表达的MiaPaCa II细胞构建

在培养到对数生长期的MiaPaCa II细胞的培养基中加入含有Ad-NTN1逆转录 病毒(5MOI)的培养基，病毒处理48小时后使用800ng/mL G418进行筛选7天后收取上清样品进行netrin-1蛋白表达水平的蛋白印迹检测，至有稳定的netrin-1表达的混合克隆细胞株进行后续实验。对照细胞株使用空载体包装的逆转录病毒进行感染，筛选过程使用同浓度的G418进行筛选(图2)。

1.2 netrin-1过表达细胞在鸡胚胎绒毛尿囊膜(CAM)上的成瘤能力显著下降

培养到对数生长期的过表达netrin-1的MiaPaCa II细胞株和对照组细胞株按照每枚鸡蛋5×10⁶个细胞接种到发育第10天的鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)上，(温度、湿度)连续培养7天后收取肿瘤组织，照相(图3A)并对肿瘤生长的面积进行测算和统计比较(图3B)。结果表明netrin-1过表达显著降低了MiaPaCa II细胞株的成瘤能力，肿瘤组织面积下降84％。

1.3 netrin-1过表达降低癌细胞在联合重症免疫缺陷小鼠(SCID-biege mouse)移植瘤模型中的成瘤能力

培养到对数生长期的过表达netrin-1细胞株和对照细胞株按照每只小鼠5×10⁶个细胞接种到雄性SCID-biege小鼠皮下，连续培养30天，麻醉处死后取出肿瘤组织照相观察，netrin-1过表达细胞株形成的肿瘤体积小于对照组细胞株(图4A-C)。称重统计表明netrin-1过表达显著降低了MiaPaCa II细胞株的成瘤能力，肿瘤重量下降了74％(图4D)。

1.4 netrin-1过表达细胞株在裸鼠(Nude mice)移植瘤模型中肿瘤生长能力显著下降

培养到对数生长期的netrin-1过表达细胞按照5×10⁶个细胞/裸鼠接种到雄性裸鼠皮下，令其生长28天，每两天测量细胞长成的肿瘤的大小并进行统计。结果表明，netrin-1过表达的细胞株的肿瘤生长速度显著慢于没有过表达netrin-1的对照细胞株(p<0.01)。netrin-1对肿瘤生长表现出很强的抑制作用，肿瘤生长速度下降49％(图5A)。

1.5 netrin-1过表达显著抑制胰导管腺癌细胞MiaPaCa II细胞株在matrigel构成的重组基底膜上的集落形成能力

在预铺matrigel的重组基底膜细胞培养模型中按照每个孔5x10⁴个细胞分别种植过表达netrin-1和对照细胞，连续培养10天，在2天，6天，10天分别照相观察肿瘤细胞集落的形成情况。过表达netrin-1的细胞株在6天和10天时候形成的集落大小显著小于对照细胞株(图5B)。

2. netrin-1蛋白刺激不影响MiaPaCa II细胞的平面生长，但是降低细胞对细胞外基质组分的黏附能力并且诱导其迁移

2.1 netrin-1不影响平面培养的MiaPaCa II细胞生长

按照2×10³个细胞每个孔将netrin-1过表达的MiaPaCa II细胞株和对照组细胞株分别接种到96孔板上，连续培养6天，每天加入CCK-8染色剂(10uL染色液/100uL培养基)反应两个小时，测量450nm吸光度代表细胞数量。统计三次平行 实验中6天的测量值绘制为生长曲线图表明，netrin-1过表达对MiaPaCa II细胞的平面生长没有明显影响(图6A)。

2×10³个MiaPaCa II细胞每孔分组接种到96孔板上，每组按照netrin-1浓度0、10、20、50ng/mL梯度连续培养6天，每天加入MTT染色剂(10uL染色液/100uL培养基)反应两个小时，测量450nm吸光度代表细胞数量。6天的测量值绘制为生长曲线(图6B)，统计三次结果表明，0-50ng/ml的浓度范围内netrin-1浓度变化不能显著影响二维平面培养的MiaPaCaII的生长。

2.2 netrin-1过表达降低MiaPaCa II细胞对于细胞外基质蛋白的黏附能力

按每个孔2×10⁵个细胞将netrin-1过表达细胞株和对照组细胞株分别接种到预铺了细胞外基质(ECM)分子的48孔板中，静置40分钟，弃上清，洗去漂浮细胞后加入结晶紫染色液染色10分钟，洗去浮色后裂解细胞，测量裂解液的560nm吸光度代表贴壁细胞数量。统计三次平行结果比较netrin-1对于细胞黏附能力的影响表明，netrin-1过表达可以显著降低MiaPaCa II细胞对于细胞外基质分子纤连蛋白I、laminin IV的结合能力(图7A)。

将netrin-1按照0、10、20、50ng/mL浓度梯度处理的MiaPaCa II细胞分别按每个孔2×10⁵个细胞接种到预铺了细胞外基质(ECM)分子的48孔板中，静置40分钟，弃上清，洗去漂浮细胞后加入结晶紫染色液染色10分钟，洗去浮色后裂解细胞，测量裂解液的560nm吸光度代表贴壁细胞数量。统计三次平行结果比较netrin-1对于细胞黏附能力的影响表明，随着netrin-1处理浓度的提高，MiaPaCa II细胞对于细胞外基质分子纤连蛋白I、laminin IV的结合能力呈现逐渐降低的趋势(图7B)。

2.3 netrin-1过表达未显著改变的MiaPaCa II细胞的侵袭能力

按每个小室2×10⁵个细胞将悬浮在无血清培养基中的MiaPaCa II细胞接种到有孔小室中，小室下方加入含血清诱导培养基，37℃静置12小时，弃去培养基，除去没有穿孔的小室上方的细胞，对于孔下侧的细胞进行结晶紫染色，洗去浮色后裂解细胞，测量裂解液的560nm吸光度代表穿孔侵袭的细胞数量。统计三次平行结果比较netrin-1过表达细胞和普通低表达netrin-1的MiaPaCa II细胞的侵袭能力表明，netrin-1过表达的MiaPaCa II细胞的侵袭能力相对于普通MiaPaCa II细胞并无显著变化(图8A)。

2.4 netrin-1蛋白可以诱导MiaPaCa II细胞的迁移

按每个小室2×10⁵个细胞将MiaPaCa II细胞接种到有孔小室中，小室下方加入含血清诱导培养基其中分别按照浓度梯度0、10、20、50ng/mL加入netrin-1重组蛋白，37℃静置12小时，弃去培养基，除去没有穿孔的小室上方的细胞，对于孔下侧的细胞进行结晶紫染色，洗去浮色后裂解细胞，测量裂解液的560nm吸光度代表迁移细胞数量。统计三次平行结果比较netrin-1刺激对于细胞迁移的能力表明，netrin-1能够有效诱导MiaPaCa II细胞的穿孔迁移(图8B)。

3. netrin-1在人I/II期胰导管腺癌中呈低表达

3.1 netrin-1在胰导管腺癌临床标本中表达水平下降

为初步考察netrin-1与胰腺癌发病的相关性，我们对胰腺癌临床样本中的netrin-1表达水平进行了免疫组织化学分析。PATMA12组织芯片(Creative Bioarray)上有64个胰导管腺癌组织样本和10个正常胰腺导管样本，用抗netrin-1抗体(abcam)对于这一组织芯片杂交染色后进行观察，如图9所示，netrin-1在胰导管腺癌中的总体表达水平比较正常组织有所下降。统计结果表明，癌组织样本中netrin-1表达水平较正常胰腺导管组织样本显著下降。

3.2 netrin-1在I/II期胰导管腺癌样品中表达水平显著低于正常胰腺导管组织样品

进一步对PATMA12组织芯片上的胰导管腺癌组织样品根据其TMN肿瘤分期进行分类统计，netrin-1抗体染色水平显示在I、II期样本中(图9)，netrin-1表达水平相对于正常水平呈非常显著的下降(图10，I：p<0.05，II：p<0.01)。而III/IV期的netrin-1表达水平则有所回升，相比正常水平没有显著变化(图10，p>0.05)。这一结果提示netrin-1表达可能与胰腺癌早期的发生发展过程相关。

4. netrin-1不影响PDAC移植瘤的血管生成

进一步我们研究netrin-1是否可以影响PDAC移植瘤中血管生成。我们检测CD31在对照和过表达netrin-1的Miapaca II细胞形成的移植瘤的表达，从而评估移植瘤中血管的密度，netrin-1并不能增加PDAC移植瘤血管的密度。如图11A和11B所示。

5. netrin-1不影响PDAC细胞的凋亡但可以调节细胞的极化

同时我们使用阿霉素处理细胞检测caspase-3的活性发现，netrin-1也不能影响PDAC细胞的凋亡。另外，我们通过TUNEL染色确定了nerin-1不能诱导MiaPaCa II细胞凋亡(图12A和12B)。另外，我们检测netrin-1是否可以影响PDAC细胞的极化。我们发现netrin-1可以使β-catenin和E-cadherin呈极化分布,同时增加表皮细胞marker ZO-1的表达并降低integrin β4的表达(图12C)。

6. netrin-1蛋白刺激降低MiaPaCa II细胞中integrin β4基因ITGB4的表达。

6.1 netrin-1下调MiaPaCa II细胞中integrin β4基因ITGB4的表达

采用realtime RT-PCR方法对netrin-1过表达细胞株的integrin β4基因ITGB4的表达水平进行了检测，netrin-1过表达的MiaPaCa II细胞ITGB4表达水平相对于不过表达netrin-1的对照细胞株有显著下调。蛋白印迹实验表明integrin β4的蛋白水平在过表达netrin-1细胞株中也有明显的下降。(图13A和图13B)

Realtime RT-PCR实验检测经过netrin-1重组蛋白梯度浓度0、10、20、50ng/mL处理的MiaPaCa II细胞的ITGB4基因表达水平，结果表明netrin-1蛋白刺激可以显著下调ITGB4的RNA水平。蛋白印迹实验检测integrin β4蛋白水平显示integrin β4蛋白水平随着netrin-1浓度提高而逐渐下降(图13C和图13D)。

7. integrin β4蛋白表达敲低抑制MiaPaCa II细胞成瘤能力

7.1构建integrin β4表达干扰的MiaPaCa II细胞株

在培养到对数生长期的MiaPaCa II细胞的培养基中加入5MOI RNAi-ITGB4逆转录病毒，加入病毒48小时后使用100ug/mL嘌呤霉素的压力进行筛选并收取细胞样品进行integrin β4蛋白水平的蛋白印迹检测，至获得integrin β4表达水平显著下降的细胞株进行后续实验。对照细胞株使用含有GFP干扰序列的逆转录病毒进行感染，筛选过程使用同浓度的嘌呤霉素。(如图14A和图14B所示)

7.2 Integrin β4干扰细胞株在CAM移植瘤模型中成瘤能力下降

培养到对数生长期的integrin β4干扰细胞株和对照组细胞株按照每枚鸡蛋5×10⁶个细胞接种到10天的鸡蛋的绒毛尿囊膜(CAM)上，连续培养7天，从CAM上取下肿瘤组织，照相观察显示integrin β4干扰细胞株肿瘤的面积和大小小于对照组细胞(图14C)。对肿瘤生长的面积进行统计比较表明干扰integrin β4的表达显著降低了MiaPaCa II细胞株的成瘤能力，肿瘤组织面积下降72％(如图14C和图14D所示)。

7.3 Integrin β4干扰细胞株在SCID-biege小鼠移植瘤模型中成瘤能力下降

培养到对数生长期的integrin β4干扰细胞株和对照细胞株按照每只小鼠5×10⁶个细胞接种到雄性SCID-biege小鼠皮下，连续培养30天，麻醉处死后取出肿瘤组织称重统计表明integrin β4干扰细胞株的成瘤能力相比于对照的细胞株，肿瘤重量下降了73％(图14E和图14F)。

8. netrin-1通过结合细胞表面受体UNC5B抑制integrin β4的表达

8.1 MiaPaCa II细胞中表达多种已知的netrin-1受体

采用realtime RT-PCR方法检测已经报道的netrin-1受体基因在MiaPaCa II细胞中的表达情况，结果显示UNC5B，DCC，NEO1，ITGB4，ITGB1，ITGA6，ITGA3等基因有较为明显的表达(图15A)。

8.2阻断UNC5B特异性得抑制netrin-1蛋白对MiaPaCa II细胞株中ITGB4表达的下调

使用受体unc5b，neogenin1，integrinα3β1，integrinα6β4，dcc的抗体与细胞共同孵育12小时，之后用20ng/mL netrin-1重组蛋白刺激阻断后的细胞，收取细胞样品用realtime RT-PCR检测ITGB4基因的表达(图15B)显示阻断受体unc5b可以有效消除netrin-1对于integrin β4的表达下调作用，而阻断其它受体则不影响其对于ITGB4基因表达的影响。

8.3构建单纯UNC5B干扰的MiaPaCa II细胞株

在培养到对数生长期的MiaPaCa II细胞的培养基中加入5MOI RNAi-UNC5B逆转录病毒，加入病毒48小时后使用100ug/mL嘌呤霉素的压力进行筛选并收取细胞样品进行UNC5B蛋白水平的蛋白印迹检测(图15C)，至获得UNC5B表达水平显著下降的细胞株进行后续实验。对照细胞株使用含有GFP干扰序列的逆转 录病毒进行感染，筛选过程使用同浓度的嘌呤霉素。

8.4 UNC5B干扰阻断netrin-1下调的MiaPaCa II细胞株integrin β4的表达

收取UNC5B干扰和对照细胞株细胞进行20ng/mL netrin-1重组蛋白刺激，收取细胞样品进行蛋白质提取并进行蛋白印迹，结果表明UNC5B基因表达干扰消除了netrin-1对于integrin β4表达的影响(图15D)。

9. netrin-1激活UNC5B下游FAK信号通路实现对于integrin β4表达的调控

9.1 netrin-1蛋白刺激MiaPaCa II细胞可以提高细胞中FAK磷酸化水平

FAK是与netrin-1的受体DCC和UNC5相互作用并且传递netrin-1信号的重要下游激酶，同时FAK也是细胞内参与细胞粘附迁移过程的激酶(1)。蛋白印迹检测已报道的unc5b受体下游激酶FAK在netrin-1梯度浓度刺激下的磷酸化水平变化，FAK磷酸化水平随着netrin-1浓度提高呈现逐渐上升的趋势，但FAK蛋白表达水平基本不受影响。

9.2干扰UNC5B表达可以阻断netrin-1活化FAK

为了确认激酶FAK是netrin-1的下游调控信号通路，采用蛋白印迹方法检测了netrin-1刺激UNC5B干扰的细胞株中FAK的磷酸化水平，结果提示在UNC5B干扰下，netrin-1刺激不能增加FAK磷酸化水平，提示胰腺癌细胞株MiaPaCa中UNC5B受体介导了netrin-1对下游FAK的激活。

9.3抑制FAK活性可阻断netrin-1下调integrin β4的表达

将FAK活性阻断剂14(FAK inhibitor 14，50nM)和MiaPaCa II细胞共同孵育两小时后，使用netrin-1梯度刺激孵育后的细胞，提取细胞蛋白样本用蛋白印迹检测integrinβ4的表达水平。FAK通路被阻断剂阻断之后，integrin β4的表达不再受到netrin-1刺激的调控，表明netrin-1通过激活FAK来实现对于integrin β4表达的调控。

10 netrin-1通过抑制MEK/ERK/c-Jun的活性降低Integrin β4的表达

10.1 netrin-1抑制MEK/ERK的活性

netrin-1的刺激可以降低MEK/ERK的磷酸化，抑制MEK/ERK信号通路的活性，低活性的MEK/ERK信号通路使细胞周期停滞，进而抑制肿瘤的发展。提示在Miapaca II细胞中，MEK/ERK有不依赖于RKIP(Raf kinase inhibition protein)的方式降低MEK/ERK的活性。

10.2 netrin-1降低c-Jun的磷酸化

实验结果显示，Miapaca II细胞中，netrin-1刺激可以显著降低c-Jun磷酸化的水平，c-Jun磷酸化水平的降低减少c-Jun的入核，从而降低转录活性。

10.3 netrin-1降低pc-Jun与Integrin β4启动子的结合能力

c-Jun可以与c-Fos形成异二聚体AP-1，激活的转录因子AP-1可以促进细胞周期相关基因转录，推动处于G1期的细胞进入细胞周期。有研究表明，在乳腺上皮中，AP-1可以促进Integrin β4的表达促进腺泡的形成过程。染色质免疫共沉淀 结果显示，netrin-1可以降低pc-Jun在Integrin β4启动子的结合，说明c-Jun可以直接调控Integrin β4的表达，而netrin-1介导的c-Jun磷酸化的降低直接导致pc-Jun与Integrin β4启动子结合能力降低。

11. netrin-1通过诱导产生NO降低MEK/ERK激酶活性

11.1 netrin-1可以诱导NO的生成

netrin-1通过升高NO的浓度抑制MEK/ERK的活性。我们首先通过Griess法检测netrin-1是否可以诱导NO的生成。结果显示，netrin-1的刺激可以诱导Miapaca II细胞生成NO，NO生成量随netrin-1的刺激时间延长而增加。在一氧化氮合酶抑制剂L-NAME存在的情况下，NO的生成被抑制，提示netrin-1增加NO浓度依赖于一氧化氮合酶。

11.2 netrin-1导致的MEK/REK活性的降低依赖NO

为了研究NO的生成是否可以抑制MEK/ERK活性，我们使用NO清除剂PTIO和一氧化氮合酶抑制剂L-NAME清除Miapaca II细胞内的NO，检测netrin-1是否可以影响MEK/ERK等活性。结果显示，PTIO清除细胞内NO或者使用L-NAME抑制一氧化氮合酶的活性均可以抵消netrin-1导致的MEK/ERK和c-Jun活性的降低，并且可以抵消netrin-1诱导的Integrin β4表达水平的下降，说明NO对netrin-1的功能的发挥起到关键作用。

11.3 netrin-1诱导NO的生成依赖FAK的激活

FAK作为膜连接受体，趋向于在信号传递的早期发挥作用，所以我们检测抑制FAK的活性是否可以抑制NO的生成。使用FAK抑制剂PF-562271抑制可以显著抑制netrin-1诱导的NO的生成，表明netrin-1诱导Miapaca II细胞NO的生成依赖FAK激酶的活化。

12. netrin-1通过增加蛋白磷酸酶2A(PP2A)的表达量和活性降低MEK/ERK激酶活性和Integrin β4的表达

12.1 netrin-1增加PP2A的表达和活性

有研究表明NO可以激活ERK，AKT和c-myc等促癌通路促进肿瘤的发。但本研究发现NO可以降低MEK/ERK信号通路的活性，提示在PDAC细胞系中存在依赖NO的降低MEK/ERK活性的途径。Real-time PCR结果显示，netrin-1过表达的Miapaca II细胞与未过表达的Miapaca II细胞相比，PP2Ac的表达量增加约1.5倍。蛋白印迹结果也证明，过表达netrin-1可以增加PP2Ac的表达量。为了研究netrin-1是否可以影响PP2Ac的活性，我们检测PP2Ac的磷酸化和酪氨酸3硝基化修饰是否改变。PP2Ac的Y307残基的磷酸化降低PP2Ac的活性，相反，PP2Ac第284位酪氨酸的3硝基化增加PP2Ac的活性。蛋白印迹结果显示，netrin-1可以降低PP2Ac的磷酸化水平。接下来我们通过免疫沉淀反应分别富集过表达netrin-1和对照Miapacan II细胞的PP2Ac蛋白，使用硝基酪氨酸的抗体检测PP2Ac的硝基化水平。结果表示，netrin-1刺激可以显著增加PP2Ac的酪氨酸3硝基化水平。降 低的磷酸化和增加的酪氨酸3硝基化都说明，netrin-1可以增加PP2Ac的活性。

12.2 netrin-1通过NO增加PP2Ac的磷酸化

我们已经证明netrin-1不仅可以促使NO的生成，而且激活PP2A的表达和活性。NO和PP2A之间是否存在相互调节的关系尚不清楚。为了研究NO是否可以使PP2Ac发生去磷酸化而激活，我们使用一氧化氮清除剂PTIO和一氧化氮合酶抑制剂L-NAME处理Miapaca II细胞，检测PP2Ac的磷酸化水平。实验结果显示NO的清除可以抑制netrin-1诱导的PP2Ac的磷酸化水平降低，说明netrin-1降低PP2Ac磷酸化水平依赖NO。

12.3 netrin-1通过增加PP2A活性抑制MEK/ERK/c-Jun的活性并下调Integrin β4的表达

为了研究PP2A活性的增加是否可以抑制MEK/ERK激酶和转录因子c-Jun的转录的活性，首先我们使用PP2Ac抑制剂Okadaic acid钾盐处理netrin-1过表达和对照MiapacaII细胞，6小时后检测MEK2，ERK1/2，c-Jun的活性和Integrin β4的表达量。Okadaic acid钾盐使PP2Ac的磷酸化水平明显增加，提示PP2A的活性受到抑制。MEK2，ERK1/2和c-Jun的磷酸化水平明显升高，并且其磷酸化水平不再受到netrin-1的调节，说明PP2A可以抑制MEK2，ERK1/2和c-Jun的活性。相对于未处理的细胞，Okadaic acid钾盐的处理可以减弱netrin-1导致的Integrin β4的表达降低。这可能是因为Okadaic acid钾盐处理时间只有6小时，使Integrin β4的蛋白并未完全恢复。

NO可以与超氧化物反应形成过氧硝酸盐。这种具有生物反应活性的NO衍生物可以与靶蛋白的酪氨酸残基结合，形成3硝基酪氨酸，参与调节靶蛋白的活性，该反应可以被NADPH氧化酶抑制剂Apocynin抑制，导致PP2A活性降低(2)。我们证明，netrin-1可以增加PP2Ac的酪氨酸3硝基化修饰，从而活化PP2A。为了进一步证明netrin-1通过增加PP2A活性抑制MEK/ERK/c-Jun的活性并下调integrin β4的表达，我们使用Apocynin处理Miapaca II细胞，蛋白印迹检测MEK2，ERK1/2和c-Jun的磷酸化以及integrin β4的表达水平。使用Apocynin抑制PP2A的活性同样抑制netrin-1诱导的MEK/ERK信号活性的降低，c-Jun磷酸化水平的降低和Integrin β4表达的水平的降低。结果说明PP2A在netrin-1诱导Integrin β4表达下降过程中起到非常关键的作用。

13. netrin-1通过受体UNC5B降低MEK/ERK激酶活性并降低Integrin β4的表达

13.1 netrin-1通过受体UNC5B下调Integrin β4的表达

我们使用抗体阻断的方法研究netrin-1的效应受体。使用受体UNC5B，Neogenin1，Integrin α3β1和Integrin α6β4的抗体与细胞共同孵育12小时，之后用netrin-1重组蛋白(20ng/ml)刺激阻断后的细胞，通过蛋白印迹检测MEK/ERK信号通路和Integrin β4的表达水平的变化。结果表明，阻断受体Integrin α6β4，Integrin α3β1和Neogenin1后，netrin-1激活FAK活性，抑制MEK2-ERK1/2活性和下调Integrin β4的效应不受影响，而阻断受体UNC5B后，netrin-1产生的效应消失。说明netrin-1通过其受体UNC5B下调Integrin β4的表达。

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11.Persad S,Troussard AA,McPhee TR,Mulholland DJ,Dedhar S.Tumorsuppressor PTEN inhibits nuclear accumulation of beta-catenin and T cell/lymphoid enhancer factor 1-mediated transcriptional activation.The Journal ofcell biology2001；153(6):1161-74.

12.Troussard AA,Tan C,Yoganathan TN,Dedhar S.Cell-extracellularmatrix interactions stimulate the AP-1 transcription factor in an integrin-linked kinase-and glycogen synthase kinase 3-dependent manner.Molecular andcellular biology1999；19(11):7420-7.

13.Kumar AS,Naruszewicz I,Wang P,Leung-Hagesteijn C,Hannigan GE.ILKAPregulates ILK signaling and inhibits anchorage-independentgrowth.Oncogene2004；23(19):3454-61.

14.Attwell S,Roskelley C,Dedhar S.The integrin-linked kinase(ILK)suppresses anoikis.Oncogene 2000；19(33):3811-5.

15.Paoli P,Giannoni E,Chiarugi P.Anoikis molecular pathways and itsrole in cancer progression.Biochimica et biophysica acta 2013；1833(12):3481-98.

16.Nicholson KM,Anderson NG.The protein kinase B/Akt signallingpathway in human malignancy.Cellular signalling 2002；14(5):381-95.

17.Masugi Y,Yamazaki K,Emoto K,Effendi K,Tsujikawa H,Kitago M等人.Upregulation of integrin beta4promotes epithelial-mesenchymal transition andis a novel prognostic marker in pancreatic ductal adenocarcinoma.Laboratoryinvestigation；a journal of technical methods and pathology 2015；95(3):308-19.

18.Troussard AA,Costello P,Yoganathan TN,Kumagai S,Roskelley CD,Dedhar S.The integrin linked kinase(ILK)induces an invasive phenotype via AP-1transcription factor-dependent upregulation of matrix metalloproteinase 9(MMP-9).Oncogene 2000；19(48):5444-52.

19.Zhang Y,Chen K,Tu Y,Wu C.Distinct roles of two structurallyclosely related focal adhesion proteins,alpha-parvins and beta-parvins,inregulation of cell morphology and survival.The Journal of biologicalchemistry 2004；279(40):41695-705.

20.Rosenberger G,Jantke I,Gal A,Kutsche K.Interaction of alphaPIX(ARHGEF6)with beta-parvin(PARVB)suggests an involvement of alphaPIX inintegrin-mediated signaling.Human molecular genetics 2003；12(2):155-67.

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22.Tan C,Cruet-Hennequart S,Troussard A,Fazli L,Costello P,Sutton K等人.Regulation of tumor angiogenesis by integrin-linked kinase(ILK).Cancercell2004；5(1):79-90。

Claims (7)

1.netrin-1蛋白在制备用于肿瘤治疗的药物中的用途，其中所述肿瘤为I/II期胰导管腺癌。

2.含有编码netrin-1蛋白的核酸的载体在制备用于肿瘤治疗的药物中的用途，其中所述肿瘤为I/II期胰导管腺癌。

3.根据权利要求2所述的用途，其中所述含有编码netrin-1蛋白的核酸的载体为过表达netrin-1蛋白的载体。

4.根据权利要求中1-3中任一项所述的用途，其中所述I/II期胰导管腺癌为MIAPACAII细胞系。

5.根据权利要求中1-3中任一项所述的用途，其中所述药物中进一步包含一种或多种药用赋形剂或药用载体。

6.根据权利要求5所述的用途，其中所述netrin-1的有效测试浓度为10-50ng/mL。

7.根据权利要求6所述的用途，其中所述netrin-1的有效测试浓度为10、20、30、40或50ng/mL。