CN112226510A - Mtx1基因或其表达产物在制备诊断、预防或治疗肝癌的产品中的应用及相关试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及MTX1基因或其表达产物在制备诊断、预防或治疗肝癌的产品中的应用及相关试剂，属于医学诊断治疗产品制备技术领域。本发明的MTX1基因及其表达产物可作为肝癌治疗的药物靶点，以及判断肝癌患者对索拉非尼疗效的分子标记，对于肝癌患者是否使用索拉非尼治疗具有重要的指导意义，整个预测评估简便易行，可行性高。

Description

MTX1基因或其表达产物在制备诊断、预防或治疗肝癌的产品 中的应用及相关试剂
技术领域
本发明涉及医学诊断治疗产品制备技术领域，具体涉及MTX1基因或其表达产物在制备诊断、预防或治疗肝癌的产品中的应用及相关试剂。
背景技术
肝癌(肝细胞癌)是临床上常见的消化系统恶性肿瘤。肝癌之所以会成为恶性程度很高的肿瘤，主要是因为肝脏神经细胞主要分布在肝脏包膜，肝脏实质间缺乏神经细胞，疼痛反应差，且肝脏具有强大的代偿功能，所以肿瘤在发展过程中极难被察觉。然而当病人出现肝腹水、黄疸、明显消瘦、腹部疼痛等症状时，通常肝癌都已进入晚期，而此时的肝癌预后差，存活时间较短。系统化疗和靶向治疗成为中晚期肝癌患者的主要治疗手段，然而由于肝癌细胞具有很强的耐药性，现有肝癌治疗药物的效果都很不理想。因此，研究和探索肝癌细胞的耐药机制，发掘耐药分子靶点和标记物，对肝癌新药研发和用药指导具有重要意义。
传统化疗药物在肝癌的治疗上收效甚微，而索拉非尼的问世，使肝癌的治疗获得了巨大突破。索拉非尼(Sorafenib)是一种多靶点、多激酶抑制剂的口服药，可以通过血小板源生长因子受体(PDGFR)和血管内皮生长因子受体(VEGFR)抵抗肿瘤血管的生成，还可以通过阻断Raf/MEK/ERK信号传导通路抑制肿瘤细胞的增长和繁殖。2007年被美国FDA批准用于治疗不可切除的肝细胞癌。2008年被正式批准进入我国市场，成为第一个用于治疗晚期肝癌的一线用药及手术和肝移植后的辅助用药。我国2019年版《原发性肝癌诊疗规范》推荐，索拉非尼可用于肝功能Child-Pugh A级或B级的患者，且相对于肝功能Child-Pugh B级，Child-Pugh A级的患者生存获益更明显。多项临床研究表明，索拉非尼可使不同国家地区、不同肝病背景的晚期肝癌患者具有一定的生存获益，这些研究奠定了索拉非尼治疗晚期肝癌的一线地位，使其成为进展期肝癌的标准一线疗法，并被多部国内外指南推荐为肝癌治疗标准。
近年来，除了索拉非尼单独用药外，有关索拉非尼联合用药治疗肝癌的临床研究越来越多，索拉非尼通过联合其他抗肿瘤药物取长补短也进一步提高了治疗效果。例如：索拉非尼联合卡培他滨对肝细胞癌治疗的临床研究显示，两者联合可发挥协同作用，治疗疗效较好且毒性反应没有增加。索拉非尼联合阿霉素的临床研究也显示，索拉非尼联合阿霉素可协同抑制或阻断细胞增殖和生存相关的过程，在抑制肿瘤生长和肿瘤新生血管形成方面有部分调节通路重合，可以通过“增色效应”协同抗肿瘤。虽然索拉非尼对部分中晚期肝癌患者的效果显著，但是还是有一部分患者会由于原发性耐药或者获得性耐药的原因降低其治疗效果。原发性耐药是癌细胞本身对索拉非尼耐受，其遗传背景并不因索拉非尼的影响而发生改变；而获得性耐药是在治疗过程中由于癌细胞基因突变和一些性状的改变而继发的耐药，其中性状改变包括癌细胞发生自噬，上皮间质转化(EMT)，肿瘤微环境的改变等。
肝癌发病的分子机制十分复杂，与多种基因突变和信号通路的异常改变相关。这些基因的突变、异常表达和信号通路的活化是索拉非尼原发性耐药的根本原因。此前大量研究通过索拉非尼处理肝癌细胞系筛选表达差异的基因来寻找索拉非尼的耐药靶点。研究结果显示一些蛋白质，如Gal-1，TARBP2等参与索拉非尼耐药。但这种获得性耐药靶点筛选方法很难鉴定出原发性耐药靶点，而且也不容易分辨它们在获得性耐药过程中所发挥的具体作用是驱动性质还是伴随性质。目前并没有一种能够高效增强肝癌细胞对索拉非尼的抵抗性的药物。
发明内容
本发明的目的在于提供MTX1基因或其表达产物在制备诊断、预防或治疗肝癌的产品中的应用及相关试剂。本发明的MTX1基因及其表达产物可作为肝癌治疗的药物靶点，以及判断肝癌患者对索拉非尼疗效的分子标记，对于肝癌患者是否使用索拉非尼治疗具有重要的指导意义，整个预测评估简便易行，可行性高。
本发明提供了检测MTX1基因或其表达产物的试剂在制备诊断肝癌的产品中的应用。
本发明还提供了检测MTX1基因或其表达产物的试剂在制备判断肝癌患者对索拉菲尼疗效的产品中的应用。
优选的是，所述产品包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术或免疫测定的方法检测MTX1基因或其表达产物的变化的试剂。
优选的是，所述产品包括试剂盒、芯片或制剂。
本发明还提供了下调或沉默MTX1基因或其表达产物表达的试剂在制备预防和/或治疗肝癌的药物中的应用。
本发明还提供了下调或沉默MTX1基因或其表达产物表达的试剂在制备抑制肝癌细胞增殖的药物中的应用。
本发明还提供了下调或沉默MTX1基因或其表达产物表达的试剂在制备抑制肝癌细胞成瘤能力的药物中的应用。
本发明还提供了下调或沉默MTX1基因或其表达产物表达的试剂在制备增强肝癌细胞对索拉菲尼敏感性的药物中的应用。
本发明还提供了基于上述技术方案所述应用的试剂，所述试剂包括siRNA。
优选的是，所述siRNA的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明提供了MTX1基因或其表达产物在制备诊断、预防或治疗肝癌的产品中的应用及相关试剂。在本发明中，下调MTX1基因能够显著抑制肝癌细胞增殖，且增强肝癌细胞对索拉非尼的敏感性。本发明的MTX1基因及其表达产物可作为肝癌治疗的药物靶点，以及判断肝癌患者对索拉非尼疗效的分子标记，对于肝癌患者是否使用索拉非尼治疗具有重要的指导意义，整个预测评估简便易行，可行性高。
附图说明
图1为本发明提供的CRISPR/Cas9转录激活文库筛选索拉非尼耐药(增敏)基因流程示意图；
图2A为本发明提供的肝癌细胞株HCC-LM3和PLC/PRF/5分别感染过表达MTX1的慢病毒LV-MTX1后蛋白水平的表达情况结果图；
图2B-1为本发明提供的MTX1过表达促进肝癌细胞PLC/PRF/5生长，且增加肝癌细胞对索拉非尼的抵抗作用结果图；
图2B-2为本发明提供的MTX1过表达促进肝癌细胞HCC-LM3生长，且增加肝癌细胞对索拉非尼的抵抗作用结果图；
图2C-1为本发明提供的过表达MTX1促进肝癌细胞的克隆形成能力，且增强了索拉非尼处理下肝癌细胞株HCC-LM3和PLC/PRF/5的克隆形成能力，进而说明MTX1增强肝癌细胞对索拉非尼的抵抗性结果图；
图2C-2为图2C-1中PLC/PRF/5细胞形成克隆数的统计图，显示了MTX1过表达促进该细胞的克隆形成能力；
图2C-3为图2C-1中HCC-LM3细胞形成克隆数的统计图，显示了MTX1过表达促进该细胞的克隆形成能力；
图3A为本发明提供的稳定表达MTX1的肝癌细胞株PLC/PRF/5中分别转染MTX1-siRNA后蛋白水平的表达情况结果图；
图3B-1为本发明提供的下调MTX1表达的肝癌细胞PLC/PRF/5生长受到抑制，并且沉默MTX1增强肝癌细胞对索拉非尼的敏感性结果图；
图3B-2为本发明提供的下调MTX1表达的肝癌细胞HCC-LM3生长受到抑制，并且沉默MTX1增强肝癌细胞对索拉非尼的敏感性结果图；
图4A为本发明提供的MTX1过表达增强了Huh7肝癌细胞在裸鼠皮下的成瘤能力以及索拉非尼处理下肝癌细胞形成肿瘤的能力结果图；
图4B为本发明提供的图4A中Huh7细胞的皮下所成肿瘤的质量统计示意图，显示了MTX1过表达对索拉非尼抵抗。
具体实施方式
本发明提供了检测MTX1基因或其表达产物的试剂在制备诊断肝癌的产品中的应用。在本发明中，所述MTX1基因的cDNA序列如SEQ ID NO.3所示，MTX1基因所编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。索拉非尼的耐药问题是制约肝癌患者预后及获益的重要因素。本发明通过CRISPR/Cas9组学筛选，鉴定出MTX1是阻碍肝癌患者对索拉非尼敏感性的关键致癌基因之一，并通过设计一系列细胞和动物实验阐明MTX1在肝癌发生中的促癌作用以及参与肝癌细胞对索拉非尼耐药的作用，为肝癌的诊断、治疗及逆转索拉非尼耐药提供新的治疗策略。在本发明中，所述产品优选包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术或免疫测定的方法检测MTX1基因或其表达产物的变化的试剂。在本发明中，所述产品优选包括试剂盒、芯片或制剂。
本发明还提供了检测MTX1基因或其表达产物的试剂在制备判断肝癌患者对索拉菲尼疗效的产品中的应用。在本发明中，所述产品优选包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术或免疫测定的方法检测MTX1基因或其表达产物的变化的试剂。在本发明中，所述产品优选包括试剂盒、芯片或制剂。
本发明还提供了下调或沉默MTX1基因或其表达产物表达的试剂在制备预防和/或治疗肝癌的药物中的应用。
本发明还提供了下调或沉默MTX1基因或其表达产物表达的试剂在制备抑制肝癌细胞增殖的药物中的应用。
本发明还提供了下调或沉默MTX1基因或其表达产物表达的试剂在制备抑制肝癌细胞成瘤能力的药物中的应用。
本发明还提供了下调或沉默MTX1基因或其表达产物表达的试剂在制备增强肝癌细胞对索拉菲尼敏感性的药物中的应用。
本发明还提供了基于上述技术方案所述应用的试剂，所述试剂包括siRNA。
在本发明中，所述siRNA的正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明在所述应用验证过程中，使用到的材料以及操作方法优选如下：
(1)细胞系和试剂
1)HCC-LM3、PLC/PRL/5，Huh7肝癌细胞来自中国科学院上海细胞库。采用含10％胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中培养肝癌细胞。0.25％的胰蛋白酶(含EDTA)用于消化细胞。
2)用于干扰MTX1表达的siRNA由上海吉码制药技术有限公司合成，序列如下：siRNA1：正义链5-AAGUAUGUACCUCUUUUCGAAdTdT-3(SEQ ID NO.5)；反义链5-TTCGAAAAGAGGTACATACTTdTdT-3(SEQ ID NO.6)。
siRNA2：正义链5-AAAGAAGAACUUUUGAGAGCCdTdT-3(SEQ ID NO.7)；反义链5-GGCTCTCAAAAGTTCTTCTTTdTdT-3(SEQ ID NO.8)。
siRNA3：正义链5-CCCACAUUCUCAGUCUCUAdTdT-3(SEQ ID NO.1)；反义链5-TAGAGACTGAGAATGTGGG dTdT-3(SEQ ID NO.2)。
作为干扰对照的NC非特异性核苷酸序列为：
siNC：正义链5-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3(SEQ ID NO.9)；反义链5-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3(SEQ ID NO.10)。
3)用于过表达MTX1基因的慢病毒LV-MTX1及其对照慢病毒LV-Vec由吉满生物技术(上海)有限公司构建包装。
4)抗体：MTX1(ab233205，Abcam，Cambridge，MA，USA)，β-actin(#81178；SantaCruz Biotechnology，Dallas，TX，USA)，GAPDH(#60004-1-Ig，Proteintech，China)。
5)索拉非尼(Sorafenib；Cell Signaling Technology)被制备为DMSO中10mM储备溶液。出于实验目的，在添加至细胞培养物之前将药物稀释在新鲜培养基中。在检测MTX1在肝癌细胞对索拉非尼敏感性上所起作用的实验中，对照组用DMSO进行处理。
(2)肝癌细胞过表达MTX1基因稳定株的构建
1)接种肝癌细胞至30～40％汇合度时感染。
2)先加入终浓度为4ug/ml polybrene，可帮助慢病毒提高感染效率。
3)再加入病毒液感染细胞，24h后吸出含病毒的培养基，加入完全培养基，培养箱中培养48h后，换上终浓度为1ug/ml的嘌呤霉素(Puromycin)的培养基,筛选稳定转导的细胞株(两至三天换一次液)。
(3)使用MTX1小干扰RNA转染肝癌细胞
1)接种细胞至30～40％汇合度时转染。
2)使用Opti-MEM培养基稀释
Figure BDA0002725561100000061
3000试剂(2管)，充分混匀。
3)使用Opti-MEM培养基稀释MTX1-siRNA，并加入已经稀释的
Figure BDA0002725561100000062
3000试剂(1:1比例)。
4)室温孵育5分钟，滴加入细胞中。
5)37℃孵育细胞48h，然后分析转染细胞。
(4)细胞生长曲线的测定
1)将对数生长期的肝癌细胞按5×103/100μl/孔接种于96孔板内。每天每组三复孔，按5～7天接种细胞。
2)待细胞基本贴壁后，分为两组，一组加入索拉非尼处理，另一组加入相同浓度的DMSO处理，观察细胞状态和数目。用CCK-8显色剂(Cell Counting Kit-8，DOJINDO，Japan)进行显色反应，每100μl培养液加10μl CCK-8，37℃，5％CO2培养箱放置孵育1h 15min，酶标仪测定450nm处的吸光度，记录细胞实际的起始密度。
3)显微镜下观察细胞形态，固定时间间隔测量，记录细胞生长状况。
4)一般测5至7天。待测定结束后，收集数据进行处理，绘出图表。
(5)细胞克隆形成实验
1)将成功感染慢病毒LV-NC和LV-MTX1的过表达肝癌稳定株HCC-LM3和PLC/PRF/5，按一定数目接种于6孔板，培养24h待其贴壁后，分为两组，一组加入适当浓度的索拉非尼，另一组加入相同浓度DMSO处理，以检测索拉非尼对这些稳定细胞株长期处理的影响。
2)培养2-3周，期间每隔3-5天更换新鲜培养液并按分组加索拉非尼或DMSO处理，直至有肉眼可见的细胞克隆形成。
3)吸去培养皿内的培养基，将6孔板置于冰上并用预冷的PBS(4℃)漂洗2次。用预冷的100％甲醇(4℃)固定10min。
4)将细胞从冰上取出，室温平衡，然后用结晶紫染色液覆盖细胞染色。室温下孵育10min，弃去结晶紫染色，用蒸馏水洗涤细胞数次，直至染液不再流出。
5)克隆形成染色结果拍照，按照相同的标准(细胞克隆大小)对每个培养皿上的细胞克隆进行计数。
(6)蛋白定量
1)BSA标准品溶液按照试剂说明书使用PBS稀释。
2)测定前，按照BCA Reagent A:BCA Reagent B＝100:1的比例混合后配制成工作液。
3)BSA标准曲线的制备。
4)分别取100μL稀释后的BSA标准品溶液加入到96孔微孔板中，每个浓度取2个平行样。
5)在每个孔中加入100μL工作液后，立即混匀。
6)37℃水浴槽中反应30min后，冷却至室温。
7)使用分光光度计测定562nm的吸光度值。尽可能在20min内检验完毕所有样品。8)各浓度的BSA标准品溶液的吸光度值减去Blank值的平均值，绘制BSA标准品溶液的标准曲线。
9)分别取100μL待检测样品稀释液加入到96孔微孔板中，每个样品取2个平行样。
10)在每个孔中加入100μL工作液后，立即混匀。
11)37℃水浴槽中反应30min后，冷却至室温。
12)使用酶标仪测定562nm的吸光度值。
13)各浓度的BSA标准品溶液的吸光度值减去Blank值的平均值，绘制BSA标准品溶液的标准曲线。
(7)Western Blot实验
1)经蛋白定量后。剩余上清与1/4体积的5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液混合，在100℃金属浴中煮5min，使蛋白变性后上样。
2)电泳，浓缩胶电压80V，分离胶电压150V，直至溴酚蓝到达胶的底端。
3)结束电泳，将胶浸泡在转膜缓冲液中，在夹子上依次铺上海绵，滤纸、凝胶、NC膜、滤纸、海绵，用玻璃棒赶走气泡，250mA恒流湿转1h。
4)转膜结束后，将硝酸纤维膜放在封闭液中室温温和振荡1h。
5)将膜按照将要孵育的一抗的蛋白分子量剪开。
6)将膜放入一抗中，以PBST缓冲液作为稀释液，MTX1(1:500)，β-actin(1:1000)，GAPDH(1:10000)配好后，分别放入湿盒中室温孵育1h 30min。
7)一抗结束后，用PBST温和振荡洗膜3次，每次5min。
8)将膜分别放在以PBST缓冲液作为稀释液，1：1000稀释的R800和M800二抗中，放入湿盒中室温孵育1h。
9)二抗结束后，用PBST缓冲液温和振荡洗膜3次，每次5min，注意避光。用Odessey扫膜仪进行扫描。
(8)裸鼠成瘤实验
1)所用小鼠为5～6周大小的雄性BLAB/c裸鼠，购买自上海斯莱克实验动物有限公司。
2)取成功感染慢病毒LV-NC和LV-MTX1的Huh7过表达MTX1的肝癌稳定株，以3×106个相同数量注射入裸鼠腹部皮下。
3)随机将小鼠分为两组：实验组小鼠每天索拉非尼灌胃，对照组使用DMSO灌胃。
观察瘤体的生长情况，在约4～8周待最大瘤体直径达15mm时牺牲小鼠，瘤体拍照并称重。
下面结合具体实施例对本发明所述的MTX1基因或其表达产物在制备诊断、预防或治疗肝癌的产品中的应用及相关试剂做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
CRISPR/Cas9转录激活文库筛选参与肝癌索拉非尼耐药的基因
本发明利用购买自吉凯公司的CRISPR-PoolTMSAM human library对在全基因组范围内对肝癌细胞HCC-LM3的基因进行转录激活，结合二代测序技术可以快速筛选到影响肝癌细胞对索拉非尼耐药的关键基因。CRISPR-PoolTMSAM-Human-Dual vector是双载体系统，有两种不同的病毒，包含70290种SAM-sgRNA靶点，涵盖23430种编码基因转录本。CRISPR/Cas9转录激活系统可以利用dCas9-VP64来激活基因的转录，并借助两个激活结构域(MS2和p65)来增强转录激活，从而实现编码基因的高通量上调。
首先，本发明用购买自上海吉凯基因化学技术有限公司的EF1α-MS2-p65-HSF1-2A-Hygro-WPRE病毒液感染肝癌细胞HCC-LM3，经潮霉素B(Hygromycin B)筛选获得稳定株后，再由CRISPR-PoolTMSAM human/Dual慢病毒感染，经杀稻瘟菌素S(Blasticidin S)和潮霉素B(Hygromycin B)双重筛选，待细胞遗传背景稳定后加入索拉非尼处理细胞，经过两轮处理，抽提加药前后该肝癌细胞的基因组DNA(前后样品均有3个重复)，经PCR/RNA-seq检测sgRNA的富集情况，筛选流程示意图如图1(CRISPR/Cas9转录激活文库筛选索拉非尼耐药(增敏)基因流程示意图)。
最终经深度测序分析，本发明筛选到sgRNA含量变化差异较大的MTX1，与加药前相比，耐药细胞中MTX1的sgRNA含量上升了5.74倍，这一结果表明MTX1的表达升高促进肝癌细胞对索拉非尼的耐受。因此选定MTX1作为肝癌细胞对索拉非尼耐药性研究的关键基因。MTX1的cDNA序列如SEQ ID NO.3所示，MTX1基因所编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
实施例2
外源表达MTX1基因促进肝癌细胞增殖，且增强肝癌细胞对索拉非尼的抵抗性
为了验证MTX1在肝癌发生中的功能以及探究其在肝癌细胞对索拉非尼耐药性上的影响，本发明利用生长曲线和克隆形成实验分别检测了短期和长期、在有或无索拉非尼处理肝癌细胞情况下，MTX1所起到的作用。
本发明首先利用过表达MTX1的慢病毒感染肝癌细胞株PLC/PRF/5和HCC-LM3，嘌呤霉素(Puromycin)筛选得到稳定过表达MTX1的PLC和HCC-LM3细胞株。(1)分别提取成功感染MTX1过表达慢病毒的PLC/PRF/5和HCC-LM3细胞株的蛋白质，经Westernblot检验证实过表达MTX1细胞株PLC-lvMTX1和HCC-LM3-lvMTX1的MTX1蛋白水平表达明显高于对照(图2A，肝癌细胞株HCC-LM3和PLC/PRF/5分别感染过表达MTX1的慢病毒LV-MTX1后蛋白水平的表达情况结果图，显示了MTX1在两株细胞中均成功过表达)。(2)本发明将成功感染了MTX1过表达慢病毒及其对照的肝癌细胞PLC/PRF/5和HCC-LM3，取对数生长期细胞，以每孔5*103个细胞接种于96孔板中，待其完全贴壁后分为两组，加入索拉非尼处理为实验组，DMSO处理为对照组，利用CCK8试剂盒检测了5天的细胞生长情况，实验结果表明MTX1的过量表达促进肝癌细胞的增殖，并且提高了索拉非尼诱导的肝癌细胞增殖能力(图2B-1和图2B-2，MTX1过表达促进肝癌细胞生长，且增加肝癌细胞对索拉非尼的抵抗作用结果图)。(3)将成功过表达MTX1的稳定株PLC-lvMTX1和HCC-LM3-lvMTX1(对照PLC-lvNC和HCC-LM3-lvNC)，以2*103个/孔的对数生长期细胞接种于六孔板中分成两组，即索拉非尼处理组和DMSO对照组，行平板克隆形成实验，结果显示MTX1显著增强肝癌细胞的增殖能力，并且经长期索拉非尼处理发现MTX1过表达增强了肝癌细胞对索拉非尼的抵抗性(图2C-1，图2C-2和图2C-3，过表达MTX1促进肝癌细胞的克隆形成能力，且增强了索拉非尼处理下肝癌细胞株HCC-LM3和PLC/PRF/5的克隆形成能力，进而说明MTX1增强肝癌细胞对索拉非尼的抵抗性结果图)。
实施例3
沉默MTX1抑制肝癌细胞生长，且降低了索拉非尼处理下肝癌细胞的增殖能力。为了进一步在细胞水平上明确MTX1在肝癌细胞生长上的促进作用，以及在抑制肝癌细胞对索拉非尼敏感性上的影响。本发明利用人工合成的MTX1的小干扰RNA感染肝癌细胞以降低MTX1的表达，为了使其作用效果更为明显，本发明选择对稳定过表达MTX1的PLC-lvMTX1和HCC-LM3-lvMTX1细胞株进行MTX1-siRNA的瞬时转染。(1)PLC-lvMTX1分别转染MTX1-siRNA1，2，3位点48h后(对照PLC-lvNC)，分别抽提其蛋白质，经过Westernblot检验证实MTX1-siRNA3更为有效，过表达MTX1细胞株PLC-lvMTX1在转染过siRNA3后，与转染siNC的细胞相比，MTX1的蛋白水平表达明显下降(图3A，稳定表达MTX1的肝癌细胞株PLC/PRF/5中分别转染MTX1-siRNA后蛋白水平的表达情况结果图，显示了位点3即siMTX1-3对MTX1表达的干扰效果最好)。(2)将分别转染siNC和MTX1-siRNA-3的PLC-lvMTX1和HCC-LM3-lvMTX1以每孔5*103个细胞接种于96孔板中，待其完全贴壁后分为两组，加入索拉非尼处理为实验组，DMSO处理为对照组，利用CCK8试剂盒检测了5天的细胞生长情况，实验结果表明沉默MTX1表达明显抑制肝癌细胞的增殖，并且抑制了索拉非尼处理的肝癌细胞增殖能力(图3B-1和图3B-2，下调MTX1表达的肝癌细胞HCC-LM3和PLC/PRF/5生长受到抑制，并且沉默MTX1增强肝癌细胞对索拉非尼的敏感性结果图)。
实施例4
MTX1增强肝癌细胞的成瘤能力，并在体内促进肝癌细胞对索拉非尼抵抗性
体外实验已经明确表明MTX1促进肝癌细胞的增殖，且增强肝癌细胞对索拉非尼的耐药性，接下来本发明利用荷瘤裸鼠模型来研究MTX1在肝癌发生上的作用，以及对索拉非尼处理下肝癌细胞裸鼠皮下成瘤能力的影响。将3×106个分别过表达的MTX1的Huh7细胞(慢病毒感染形成稳定细胞株)和对照细胞注射入裸鼠腹部皮下，随机将小鼠分为两组：实验组使小鼠连续索拉非尼灌胃，对照组连续DMSO灌胃。观察瘤体的生长情况，在约4～8周待最大瘤体直径达15mm时牺牲小鼠，瘤体拍照并称重。结果表明MTX1的过表达促进了肝癌细胞的成瘤能力，并且有效提升索拉非尼处理下的肝癌细胞在裸鼠皮下的成瘤能力(图4A为MTX1过表达增强了Huh7肝癌细胞在裸鼠皮下的成瘤能力以及索拉非尼处理下肝癌细胞形成肿瘤的能力结果图(体积)，显示了过表达MTX1促进Huh7细胞在裸鼠皮下的成瘤能力，且具有显著的抵抗索拉非尼疗效的能力，图4B为MTX1过表达增强了Huh7肝癌细胞在裸鼠皮下的成瘤能力以及索拉非尼处理下肝癌细胞形成肿瘤的能力结果图(质量)，无论在体积还是肿瘤质量上，索拉非尼处理情况下MTX1过表达组都比对照组大，同时两组具有统计学意义)，即MTX1在肝癌中存在致癌性且增强肝癌细胞对索拉非尼的耐药性。
索拉非尼的耐药问题是制约肝癌患者预后及获益的重要因素。本发明通过CRISPR/Cas9组学筛选，鉴定出MTX1是阻碍肝癌患者对索拉非尼敏感性的关键致癌基因之一，并通过设计一系列细胞和动物实验阐明MTX1在肝癌发生中的促癌作用以及参与肝癌细胞对索拉非尼耐药的作用，为肝癌的治疗及逆转索拉非尼耐药提供新的治疗策略。因此本发明研究具有较强的理论和现实意义。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海市东方医院（同济大学附属东方医院）
<120> MTX1基因或其表达产物在制备诊断、预防或治疗肝癌的产品中的应用及相关试剂
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cccacauucu cagucucuat t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tagagactga gaatgtgggt t 21
<210> 3
<211> 1401
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgctgctcg ggggaccccc ccgcagtccc cgctcgggga cgagccccaa ggggccctgg 60
agcagtacag gccacgtgca gtttggcaag agcccccaga cctggcccag gcgcacaaga 120
ccccgctctc cagagcctgc cgcgccttca ggggttcggg gctccacttg gacgaggcgc 180
cgtgactctc cgaggcgcgc cgggccgaca gcgctgtccc gctacgtggg ccacctctgg 240
atgggccggc ggccgccctc ccccgaggcc cgcggcccag tcccccgcag ttcagctgcc 300
agtcgggcca gaagaagcct cgcctccccg gggatctccc caggccccct gaccgcaacg 360
atcggagggg cggtggcggg gggcgggccc aggcagggga gggcagaagc acacaaggaa 420
gtgtttccgg gacagagggt gggcaagatg gcggcgccca tggagctgtt ctgctggtca 480
gggggctggg ggctgccgtc agtggacctg gacagcctgg ccgtgctgac ctatgccaga 540
tttactggtg ctccactgaa ggtacacaag atcagcaacc cctggcagag cccttcagga 600
actctgcctg cccttcggac cagtcatgga gaggtcatct cagttccaca caagatcatc 660
acccaccttc gaaaagagaa gtacaatgct gattatgatc tgtcagctcg gcaaggggca 720
gacaccctgg ccttcatgtc tctcctggag gagaagttgc tcccggtgct ggtacatact 780
ttttggatag acaccaagaa ctacgtggaa gtgacccgga agtggtatgc agaggctatg 840
ccctttcccc tcaacttctt cctgcctggc cgcatgcagc ggcagtacat ggaacggcta 900
cagctgctga ctggggagca caggcctgag gacgaggaag agctggagaa ggagctgtac 960
cgagaggctc gggagtgtct gaccctgctc tctcagcgcc tgggctctca aaagttcttc 1020
tttggagatg cccctgcctc cttggacgcc ttcgtcttca gctacttggc cctgctgctg 1080
caggcaaagc tgcccagtgg gaagctgcag gtccacctgc gtgggctgca caacctctgt 1140
gcctattgta cccacattct cagtctctac ttcccctggg atggagctga ggtaccaccg 1200
caacgccaga caccagcagg cccagagact gaggaggagc cataccggcg ccggaaccag 1260
atcctatctg tgctggcagg actggcagcc atggtgggct acgccttgct cagcggcatt 1320
gtctccatcc agcgggcaac gcctgctcgg gccccaggca cccggaccct gggcatggct 1380
gaggaggatg aagaggaatg a 1401
<210> 4
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Leu Leu Gly Gly Pro Pro Arg Ser Pro Arg Ser Gly Thr Ser Pro
1 5 10 15
Lys Gly Pro Trp Ser Ser Thr Gly His Val Gln Phe Gly Lys Ser Pro
20 25 30
Gln Thr Trp Pro Arg Arg Thr Arg Pro Arg Ser Pro Glu Pro Ala Ala
35 40 45
Pro Ser Gly Val Arg Gly Ser Thr Trp Thr Arg Arg Arg Asp Ser Pro
50 55 60
Arg Arg Ala Gly Pro Thr Ala Leu Ser Arg Tyr Val Gly His Leu Trp
65 70 75 80
Met Gly Arg Arg Pro Pro Ser Pro Glu Ala Arg Gly Pro Val Pro Arg
85 90 95
Ser Ser Ala Ala Ser Arg Ala Arg Arg Ser Leu Ala Ser Pro Gly Ile
100 105 110
Ser Pro Gly Pro Leu Thr Ala Thr Ile Gly Gly Ala Val Ala Gly Gly
115 120 125
Gly Pro Arg Gln Gly Arg Ala Glu Ala His Lys Glu Val Phe Pro Gly
130 135 140
Gln Arg Val Gly Lys Met Ala Ala Pro Met Glu Leu Phe Cys Trp Ser
145 150 155 160
Gly Gly Trp Gly Leu Pro Ser Val Asp Leu Asp Ser Leu Ala Val Leu
165 170 175
Thr Tyr Ala Arg Phe Thr Gly Ala Pro Leu Lys Val His Lys Ile Ser
180 185 190
Asn Pro Trp Gln Ser Pro Ser Gly Thr Leu Pro Ala Leu Arg Thr Ser
195 200 205
His Gly Glu Val Ile Ser Val Pro His Lys Ile Ile Thr His Leu Arg
210 215 220
Lys Glu Lys Tyr Asn Ala Asp Tyr Asp Leu Ser Ala Arg Gln Gly Ala
225 230 235 240
Asp Thr Leu Ala Phe Met Ser Leu Leu Glu Glu Lys Leu Leu Pro Val
245 250 255
Leu Val His Thr Phe Trp Ile Asp Thr Lys Asn Tyr Val Glu Val Thr
260 265 270
Arg Lys Trp Tyr Ala Glu Ala Met Pro Phe Pro Leu Asn Phe Phe Leu
275 280 285
Pro Gly Arg Met Gln Arg Gln Tyr Met Glu Arg Leu Gln Leu Leu Thr
290 295 300
Gly Glu His Arg Pro Glu Asp Glu Glu Glu Leu Glu Lys Glu Leu Tyr
305 310 315 320
Arg Glu Ala Arg Glu Cys Leu Thr Leu Leu Ser Gln Arg Leu Gly Ser
325 330 335
Gln Lys Phe Phe Phe Gly Asp Ala Pro Ala Ser Leu Asp Ala Phe Val
340 345 350
Phe Ser Tyr Leu Ala Leu Leu Leu Gln Ala Lys Leu Pro Ser Gly Lys
355 360 365
Leu Gln Val His Leu Arg Gly Leu His Asn Leu Cys Ala Tyr Cys Thr
370 375 380
His Ile Leu Ser Leu Tyr Phe Pro Trp Asp Gly Ala Glu Val Pro Pro
385 390 395 400
Gln Arg Gln Thr Pro Ala Gly Pro Glu Thr Glu Glu Glu Pro Tyr Arg
405 410 415
Arg Arg Asn Gln Ile Leu Ser Val Leu Ala Gly Leu Ala Ala Met Val
420 425 430
Gly Tyr Ala Leu Leu Ser Gly Ile Val Ser Ile Gln Arg Ala Thr Pro
435 440 445
Ala Arg Ala Pro Gly Thr Arg Thr Leu Gly Met Ala Glu Glu Asp Glu
450 455 460
Glu Glu
465
<210> 5
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaguauguac cucuuuucga att 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttcgaaaaga ggtacatact ttt 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aaagaagaac uuuugagagc ctt 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggctctcaaa agttcttctt ttt 23
<210> 9
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
uucuccgaac gugucacgut t 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acgugacacg uucggagaat t 21

Claims (10)

1.检测MTX1基因或其表达产物的试剂在制备诊断肝癌的产品中的应用。
2.检测MTX1基因或其表达产物的试剂在制备判断肝癌患者对索拉菲尼疗效的产品中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述产品包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术或免疫测定的方法检测MTX1基因或其表达产物的变化的试剂。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂盒、芯片或制剂。
5.下调或沉默MTX1基因或其表达产物表达的试剂在制备预防和/或治疗肝癌的药物中的应用。
6.下调或沉默MTX1基因或其表达产物表达的试剂在制备抑制肝癌细胞增殖的药物中的应用。
7.下调或沉默MTX1基因或其表达产物表达的试剂在制备抑制肝癌细胞成瘤能力的药物中的应用。
8.下调或沉默MTX1基因或其表达产物表达的试剂在制备增强肝癌细胞对索拉菲尼敏感性的药物中的应用。
9.基于权利要求5～8任一项所述应用的试剂，其特征在于，所述试剂包括siRNA。
10.根据权利要求9所述的试剂，其特征在于，所述siRNA的正义链的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
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