CN108245680B - Ripk4作为靶位点在制备治疗膀胱癌药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明的研究表明,BUC中RIPK4明显上调,RIPK4的表达诱导过度,而沉默RIPK4抑制体外和体内BUC的侵袭和转移。因此,RIPK4可作为靶位点在制备治疗膀胱癌药物中的应用。所述膀胱癌是指BUC。此外,我们证明RIPK4的上调会导致血管内皮生长因子A(VEGF‑A)水平增加。因此,RIPK4在制备靶向负性调控VEGF‑A表达制剂中可应用。同时,VEGF‑A也可作为靶位点在制备治疗膀胱癌药物中应用。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及RIPK4作为靶位点在制备治疗膀胱癌药物中的应用。
背景技术
膀胱尿路上皮癌(BUC)的发病率和死亡率在中国泌尿生殖系统肿瘤居首。BUC可分为非侵入性和侵入性亚型,后者具有更大的转移风险。转移性BUC仍然是一种致死性疾病,除一线治疗之外几乎没有治疗选择:转移性疾病患者的5年生存率仅为5%。
人膀胱肿瘤标本和小鼠模型研究BUC的进展和转移已经涉及多个信号通路。目前,对BUC中调节NF-κB通路的精确分子机制知之甚少。受体相互作用蛋白激酶4(RIPK4)是RIP激酶家族的成员,并且是丝氨酸/苏氨酸激酶。它最初被确定为角质形成细胞分化的重要调节因子,其编码基因在Bartsocas-Papas综合征中突变。最近,一些研究表明,RIPK4在某些类型的癌症如皮肤癌,卵巢癌,宫颈癌和结肠直肠癌中过表达,并且在异种移植肿瘤模型中,RIPK4表达增加促进卵巢癌。然而,RIPK4在BUC中的临床和生物学意义在很大程度上还不清楚。因此,需要广泛调查RIPK4在BUC中的功能。
发明内容
本发明旨在提供一种可以用于制备治疗膀胱癌药物的新靶点。
本发明通过评估RIPK4对NF-κB激活和BUC进展的影响。我们观察到,BUC中RIPK4明显上调,这种过度表达与BUC患者的生存期和临床病理特征显著相关。RIPK4的过度表达诱导,而沉默RIPK4抑制体外和体内BUC的侵袭和转移。此外,我们证明RIPK4可能通过K63连接,促进肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2),受体相互作用蛋白(RIP)和NF-κB的必需调节因子(NEMO)的多聚泛素化,从而在控制BUC的侵袭和转移中起重要作用。这促进NF-κB-p65的细胞质核转位,使NF-κB活性增加,最终导致血管内皮生长因子A(VEGF-A)水平增加。我们的研究结果表明,RIPK4是BUC在侵袭和转移中的关键参与者,并且RIPK4可成为BUC这种恶性肿瘤患者的新型预后生物标志物和治疗靶标。
本发明在25例冷冻保存的膀胱标本和112例BUC石蜡标本中检测RIPK4的表达。进行体内和体外测定来验证RIPK4对NF-κB通路介导的BUC进展的作用。
本发明在BUC组织中观察到RIPK4的高表达,并且是总体生存差的独立预测因子。上调或下调RIPK4的表达分别增强或抑制BUC细胞在体外和体内的迁移和侵袭。机制上,RIPK4促进由K63连接的,肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2),受体相互作用蛋白(RIP)和NF-κB必需调节因子(NEMO)的多聚泛素化。RIPK4还促进NF-κB-p65的核定位,并极大维持了NF-κB的活化,导致VEGF-A的上调,最终促进BUC细胞的侵袭性。
本发明的数据强调了RIPK4在BUC中的分子病因学和临床的重要性:RIPK4的上调促进NF-κB活化,并上调VEGF-A和促进BUC进展。靶向RIPK4可能是提高BUC患者生存率的一种新的治疗策略。
总之,本发明的研究表明,BUC中RIPK4明显上调,RIPK4的过度表达诱导,而沉默RIPK4抑制体外和体内BUC的侵袭和转移。因此,RIPK4可作为靶位点在制备治疗膀胱癌药物中的应用。所述膀胱癌是指BUC。此外,我们证明RIPK4的上调会导致血管内皮生长因子A(VEGF-A)水平增加。因此,RIPK4在制备靶向负性调控VEGF-A表达制剂中可应用。同时,VEGF-A也可作为靶位点在制备治疗膀胱癌药物中应用。
下面对本发明做进一步解释和说明:
我们的研究表明,NF-κB的激活在BUC进展中是重要的。因此,加强我们对NF-κB信号调节的理解可能会确定BUC治疗的新靶点。在本研究中,观察到RIPK4通过RIP的募集和泛素化促进NF-κB活动。沉默RIPK4显著减少NF-κB活动,而过度表达RIPK4促进NF-κB活动。因此,结果揭示了BUCs中活化NF-κB的新机制。
含有N端RIP样激酶结构域和以11个重复锚蛋白为特征的C端区域的RIPK4是调节信号转导的Ser/Thr激酶家族的成员(Meylan等人,2002)。到目前为止,RIPK4在恶性肿瘤发病机制中的作用尚未被广泛研究。Liu和他的同事报道,RIPK4在宫颈鳞状细胞癌中过表达,体外RIPK4敲低减少了细胞迁移和侵袭(Liu等,2015)。类似地,RIPK4在皮肤,卵巢和结直肠癌中过表达(Huang等,2013)。然而,(Adams等人,2007)发现RIPK4在过度增殖的角质上皮细胞中下调(Adams等人,2007);在肝细胞癌和舌鳞状细胞癌中,RIPK4的表达也下调(Heim等,2015;Wang等,2014)。这些研究中的不一致表明,在不同的肿瘤中,RIPK4具有不同的致癌机制。为了探讨RIPK4作为BUC的治疗靶点的用途,我们观察到BUC细胞系和原代BUC组织中RIPK4水平增加,并且与BUC中的进展和患者存活率正相关。过度表达RIPK4促进BUC的上皮间质转移和入侵/转移,但沉默RIPK4减少BUC的上皮间质转移和入侵/转移。因此,我们的研究结果表明,RIPK4在BUCs中起着致癌基因的作用,并且RIPK4过表达促进BUC进展。
然而,RIPK4调节BUC细胞的分子机制转移/入侵尚不清楚。为了更深入地了解RIPK4参与的下游分子过程和BUC的侵袭和转移,使用DNA微阵列技术比较了用shRIPK4或shNC转染的T24细胞之间的全基因表达谱,与迁移和血管生成有关的差异表达的基因中,有17个差异表达≥2倍。随后,使用western印迹分析这17个基因的蛋白质水平。在RIPK4-shRNAT24和RT4细胞中使用western印迹在蛋白质水平验证VEGF-A的这种下调。相比之下,RIPK4的过度表达增加了BIU87细胞中VEGF-A的蛋白质水平。此外,我们观察到我们BUC队列的RIPK4水平和VEGF-A水平之间的显著正相关性。总之,我们的研究结果暗示RIPK4可能通过BUC细胞中VEGF-A调节细胞迁移和侵袭。
近来,血管生成被确定为药理学抗BUC策略有效且重要的靶标;例如使用针对VEGF和VEGF受体的单克隆抗体(Vogelzang,2013)。迫切需要发现新的和改进的抗血管生成剂来治疗BUC患者。在本研究中,我们显示RIPK4的过度表达导致BUC细胞中某些已知的促血管生成因子如VEGF-A的上调。这表明RIPK4可能是BUC治疗的一个吸引人的靶标。因此,有必要进一步评估BUC患者血液中RIPK4水平与其存活率之间的相关性。我们的结果表明RIPK4在NF-κB活化中具有重要作用。此外,我们假设RIPK4反应中的NF-κB激活主要由RIP的募集和泛素化所刺激。我们的研究结果显示RIPK4对NF-κB通路激活有很大的影响,提示在不同的细胞类型中NF-κB调控的基因可能有不同的分子机制,这可能取决于细胞的具体情况。我们实验室正在研究RIPK4激活和维持NF-κB活性的机制。
总之,我们在BUC中报道了RIPK4的表达模型,并证实了RIPK4在癌症侵袭中的潜在作用。此外,RIPK4的功能和机制研究表明,通过NF-κB通路上调VEGF-A,其在细胞上皮间质转移,侵袭和转移中起关键作用。我们还发现RIPK4的水平与BUC中VEGF-A的水平相关。我们的研究结果显示,RIPK4的高表达是BUC患者新的独立预后因素,使临床医生能够识别需要更强化治疗的高危患者。因此,靶向RIPK4途径可能是BUC或其他癌症患者改善治疗和存活的一种新策略。为了增强我们对癌症进展的生物基础的理解,需要进一步研究RIPK4在人类癌症中的表达机制。
附图说明
图1.RIPK4在BUC细胞系和组织中的表达。(A)通过western印迹检测的5个BUC细胞系中RIPK4蛋白的水平。(B)通过qRT-PCR分析分析确定,与来自15位患者的配对的相邻正常膀胱尿路上皮组织标本相比,BUC组织中的RIPK4表达增加。(D)免疫组织化学的典型图像显示在一个BUC组织样品中RIPK4的低表达和在三个BUC组织样品中RIPK4的高表达。原始放大倍数,×200。(E)Kaplan-Meier生存曲线比较所有BUC患者的低和高RIPK4表达水平与累积生存率之间的关系。
图2.下调或上调RIPK4的表达分别增强或抑制体外和体内BUC细胞的迁移和入侵能力。(A)用表达RIPK4shRNA-1,shRNA-2,shRNA-3和shRNA-4的慢病毒或对照shRNA感染T24和RT4细胞;蛋白质印迹测量RIPK4蛋白质水平。(B)伤口愈合测定显示与对照细胞相比,RIPK4沉默的T24和RT4细胞具有较低的运动性。(C)Matrigel入侵检测显示,与对照细胞相比,RIPK4沉默的T24和RT4细胞的侵袭能力降低。(D)条件培养基培养沉默RIPK4和对照shNC人脐静脉内皮细胞(HUVEC)典型图像。(E)在严重联合免疫缺陷(SCID-Beige)小鼠体内,沉默RIPK4抑制T24和RT4细胞侵袭和转移。上图:用T24-载体,T24-shRIPK4,RT4-载体,RT4-shRIPK4细胞注射的小鼠的四个肺结节样品进行苏木精和曙红染色的实例。原始放大倍数,×200;下图:尾部注射混和的对照shRNAT24和对照shRNART4,和RIPK4shRNAT24与RIPK4shRNART4细胞后8周,小鼠肺部转移的数目(每组n=7),在解剖显微镜下检查结节。对照shRNAT24和RT4细胞(红色;平均值±SEM,T24为13.3±4.1,RT4为14.4±7.0)RIPK4shRNAT24和RIPK4shRNA RT4(蓝色;平均值±SEM,T24为6.2±2.8,RT4为3.4±2.8)。(F)蛋白质印迹显示BIU87-RIPK4细胞中的异位RIPK4表达显著高于BIU87-载体细胞中RIPK4的表达。(G)伤口愈合测定证明BIU87-RIPK4细胞比BIU87-载体细胞具有更高的运动性。(H)细胞侵袭实验(transwell)表明RIPK4的异位过表达增强BIU87细胞的侵袭。(I)用条件培养基培养RIPK4-过表达细胞和载体对照细胞的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的典型图像。(J)体内重度联合免疫缺陷(SCID-Beige)小鼠,其RIPK4的过表达促进BIU87细胞侵袭和转移。上图:BIU87载体和BIU87-RIPK4细胞注射小鼠的四个肺结节样品,用苏木精和伊红染色,原始放大倍数,×200。下图:尾部注射BIU87-载体细胞和BIU87-RIPK4细胞8周,在解剖显微镜下检查小鼠肺部转移结节的数目(每组n=7)。BIU87-载体细胞(红色;平均值±SEM,3.0±2.2)和BIU87-RIPK4细胞(蓝色;平均值±SEM,平均值±SEM,11.1±4.9)。通过Student's t检验,*P<0.05,**P<0.01。
图3.RIPK4调节BUC细胞和组织中的VEGF-A表达。(A)使用DNA微阵列实验,转染T24-shRIPK4与转染对照T24-shNC相比较,差异表达基因(>2倍,P<0.001)根据它们的功能分类。每个类别中的基因用括号括起来。(B)T24-shRIPK4细胞与T24-shNC细胞相比较,CDH1,CD82,HPSE,MMP7,MET,TP53,SMAD2,CD44,FN1,FAT1,ITGB3,KISS1,MMP11,MMP13,VEGF-A,TGFB1和MTSS1这17个与迁移/血管生成相关基因,显示超过2倍的mRNA差异表达。(C)蛋白质印迹分析显示在T24和RT4细胞中通过shRNA转染导致RIPK4沉默,VEGF-A水平降低而CD82水平升高;而在BIU87细胞中,通过pcDNA-RIPK4转染RIPK4异位过表达,VEGF-A水平升高和CD82水平降低。(D)免疫组织化学图像显示了典型BUC组织样品中高表达的RIPK4和高表达的VEGF-A。原始放大倍数,×200。RIPK4和VEGF-A水平呈正相关(P=0.005)。(E)VEGF-A的上调与BUC患者的存活率低显著相关。
图4.特定shRNA沉默VEGF-A或NF-κB-p65后可部分抑制RIPK4介导的BUC的BIU87细胞EMT和入侵/迁移。(A)通过western印迹,测量表达VEGF-A shRNA-1,shRNA-2,shRNA-3和shRNA-4的慢病毒或对照shRNA感染BIU87细胞的VEGF-A蛋白水平。(B)通过western印迹,测量表达NF-κB-p65shRNA-1,shRNA-2,shRNA-3和shRNA-4的慢病毒或对照shRNA感染BIU87细胞的NF-κB-p65蛋白水平。(C)Western blot结果显示沉默RIPK4-BIU87细胞的VEGF-A或NF-κB-p65,细胞核内NF-κB-p65和VEGF-A表达下降。使用β-肌动蛋白作为内部参照。(D)Western blot结果显示,沉默RIPK4-BIU87细胞的VEGF-A或NF-κB-p65沉默后,间充质细胞标志物(波形蛋白和纤连蛋白)水平降低,上皮标志物E-钙粘蛋白和β-catenin)增加。使用β-肌动蛋白作为内部参照。(E)伤口愈合测定显示沉默VEGF-A或NF-κB-p65可抑制RIPK4-BIU87细胞增强的迁移能力。(F)Transwell实验显示shVEGF-A或shNF-κB-p65处理后RIPK4-BIU87细胞的侵袭能力受到显著抑制。三个独立的实验数据,平均值±SE。(G)所示条件培养基培养转导载体,RIPK4,RIPK4shNF-κB-p65,RIPK4shVEGF-A的人脐静脉内皮细胞(HUVEC),其血管形成实验的典型图像。Student t检验*P<0.05。
图5.过度表达RIPK4激活NF-κB信号传导。(A)在所示细胞中分析NF-κB萤光素酶报道基因的活性。每条代表三次独立实验的平均值±SD。(B)EMSA显示在RIPK4转导的细胞中内源性NF-κB活性增加并且在RIPK4沉默的细胞中活性降低。OCT-1-DNA结合复合物作对照。(C)Western印迹所示细胞中核NF-κB-p65,细胞质NF-κB-p65,IKK,p-IKK,IκB和p-IκB水平。使用β-肌动蛋白作为对照。(D)相对于对照shNC T24和RT4细胞,免疫荧光染色显示shRIPK4T24和RT4细胞中p65水平降低,以及与BIU87-载体细胞相比,BIU87-RIPK4细胞中p65水平升高。Student's t检验,*P<0.05,**P<0.01。
图6.RIPK4维持NF-κB激活。(A)RIPK4稳定BUC细胞中的TRAF2,RIP和NEMO含量。(B)用TNF-α(10ng/mL)处理的指定细胞,Western印迹分析K63连接的RIP(上图),TRAF2(中图)和NEMO(下图)多聚泛素化水平。(C)Western印迹分析TNF-α(10ng/mL)处理的指定细胞中的IκBα表达的水平,使用β-肌动蛋白作对照。
图7:BUC细胞系和组织中RIPK4的表达和EMT标志物之间的相关性。(A,B)蛋白质印迹和免疫荧光染色测定显示与那些对照shRNA处理的细胞相比,shRIPK4敲低RIPK4导致T24细胞中上皮生成物(E-钙粘蛋白和β-连环蛋白)水平升高和间充质标志物(波形蛋白和纤连蛋白)水平降低。(C,D)蛋白质印迹和免疫荧光染色测定显示与对照shRNA处理的细胞相比,shRIPK4敲低RIPK4导致RT4细胞中上皮生成物(E-钙粘蛋白和β-连环蛋白)水平增加和间充质标志物(波形蛋白和纤连蛋白)水平降低。(E,F)Western印迹和免疫荧光染色测定显示与BIU87-载体细胞相比,BIU87-RIPK4细胞中的上皮标志物(E-钙粘蛋白和β-连环蛋白)水平降低以及间充质标志物(波形蛋白和纤连蛋白)水平升高。(G)免疫组织化学染色显示BUC组中高水平的RIPK4伴随E-钙粘蛋白和β-连环蛋白水平的降低以及波形蛋白和纤连蛋白水平增加。原始放大倍数,×200。
图8:RIPK4/NF-κB/VEGF-A轴在人类BUCs中的临床相关性。(A)EMSA显示NF-κB-DNA复合物;蛋白质印迹显示RIPK4表达;qRT-PCR分析临床样本VEGF-AmRNA的表达。(B)112例人原发BUC标本,RIPK4水平与NF-κB-p65表达正相关,显示两个典型案例。原始放大倍数,×200。(C)p-p65的阳性表达与BUC患者的较差存活显著相关。
图9:GEPIA的RIPK4和VEGF-AmRNA表达的分析。(A)在BUC中RIPK4水平与VEGF-A表达正相关。(B)黑素瘤中RIPK4水平与VEGF-A表达正相关。(C)胸腺瘤中RIPK4水平与VEGF-A表达呈正相关。
表1显示了BC患者中RIPK4水平与临床病理学变量之间的关系。
表2单变量分析112例BC患者生存,显示对BUC生存有影响的变量。
表3多变量分析112例BC患者生存,显示对BUC生存有影响的变量。
表4显示RIPK4表达水平和EMT maker之间的关系。
表5显示17个与转移和血管生成有关差异表达的基因(超过2倍的变化;P<0.001)。
表6显示BC患者RIPK4表达与VEGF-A,CD82,NF-κB-p65之间的关系。
具体实施方式
下面结合附图和实验数据对本发明做进一步的解释和说明
1、载体,逆转录病毒感染和转染
通过将PCR扩增的人RIPK4编码序列亚克隆到载体pMSCV(Clontech)中,构建过表达人RIPK4的载体pMSCV/RIPK4。我将四种短发夹RNA(shRNA)寡核苷酸沉默内源性RIPK4克隆到载体pSuper-retro-puro产生pSuper-retro-RIPK4-的shRNA(S)。构建慢病毒ShRNA的NF-κB-p65,构建慢病毒VEGF-A的ShRNA。慢病毒感染后48小时,选择稳定表达RIPK4,RIPK4-ShRNA,NF-κB-p65-ShRNA,and VEGF-A-ShRNA。
2、BUC患者RIPK4上调
为了评估在BUC中RIPK4的表达模型,我们对包括BIU87,5637,T24,EJ和RT4细胞在内的几种BUC细胞系中的RIPK4蛋白水平进行了分析,发现具有较强的侵袭性的T24,EJ和RT4中RIPK4水平高,而弱侵袭性的BIU87和5637中,RIPK4水平低,(图1A)。对15对人原代BUC组织及其相应的非癌性膀胱尿路上皮组织进行qRT-PCR。与相应的非癌组织相比,在原始BUC的86.7%(13/15)中检测到RIPK4在mRNA水平的过度表达(图1B)。与qRT-PCR分析的结果相一致,western blotting显示,86.7%(13/15)的人原代BUC组织中RIPK4的水平高于相同患者的匹配的非癌组织(图1C)。此外,在接受根治性膀胱切除术的112个临床组织中,使用IHC检测RIPK4的蛋白质水平。IHC结果显示RIPK4蛋白主要存在于癌细胞的细胞质中。在54/112(48.2%)的BUC中观察到RIPK4的水平高,其余58例(51.8%)的RIPK4水平低(图1D)。表1显示了BUC患者中RIPK4水平与临床病理学变量之间的关系。BUCs中高水平的RIPK4与高级别的pT状态(P=0.003)和pN状态(P=0.004)显著相关。RIPK4水平与其他临床病理特征无明显相关性,包括患者的年龄,性别,肿瘤大小,肿瘤大小多样性或肿瘤分级。Kaplan-Meier分析显示BUC患者的高水平的RIPK4其总体生存率(OS)较低,(P<0.001,图1E)。
在单变量分析中,BUC患者高水平的RIPK4与较低的总体生存率密切相关(P<0.001;补充表S2)。除了RIPK4水平外,还对患者的年龄,患者性别,肿瘤大小,肿瘤多样性,肿瘤分级和肿瘤分期值进行了单变量分析其对总生存率的影响。在单变量分析中显示对患者生存有显著影响的变量列于表2中,进一步进行多变量分析。结果显示高水平RIPK4是BUC患者总体生存率低的独立预测因子(P<0.001;附表S3)。
3、下调或上调RIPK4的表达增强或抑制体外和体内BUC细胞的迁移和入侵能力
为了确定RIPK4在BUC侵袭和转移中的功能,我们构建了转染shRNA或阴性对照shNC至T24和RT4细胞的几种稳定细胞系。在所测试的四种RIPK4shRNA中,ShRNA-3在T24和RT4细胞系中产生最一致的敲低结果,因此被选择用于后续研究(图2A)。伤口愈合和基质胶侵袭实验表明,与对照shNC细胞相比,ShRNA-3转染敲低RIPK4显著降低了T24和RT4细胞的迁移和侵袭能力(图2B和C)。另外,RIPK4-shRNA T24和RIPK4-shRNART4细胞的条件培养基显示出诱导HUVEC的促血管生成能力下降(图2D)。更重要的是,在肺转移体内动物模型,敲低T24和RT4细胞中的RIPK4后,转移结节的大小和数目显著减少(图2E)。这些结果意味着敲低RIPK4抑制BUC细胞的侵袭和转移。为了进一步评估RIPK4在BUC进展中的功能,我们在BUC细胞系BIU87中短暂表达RIPK4。通过蛋白质印迹,在BIU87-RIPK4稳定细胞中发现RIPK4蛋白质的水平高,而在对照组稳定的BIU87-Vector细胞系中RIPK4蛋白质的水平低(图2F)。RIPK4的过表达,使BIU87细胞的迁移和侵袭能力显著增加(图2G和H)。另外,RIPK4转导的BIU87细胞的条件培养基显示诱导HUVEC血管形成的能力增强(图2I)。此外,在体内肺转移动物模型的BIU87细胞中,过度表达RIPK4后其转移结节的大小和数量急剧增加(图2J)。这些结果与敲低RIPK4数据一致,并显示RIPK4促进BUC细胞的侵袭和转移。
4、RIPK4上调了VEGF-A的表达
为了进一步研究在BUC中RIPK4介导的细胞迁移/侵入的基本分子机制,使用DNA微阵列比较转染了shRNARIPK4和shNC的T24细胞的全基因表达谱。在233个差异表达基因中(超过2倍的变化;P<0.001),97个上调,136个下调(图3A)。其中有17个基因与转移和血管生成有关(CDH1,CD82,HPSE,MMP7,MET,TP53,SMAD2,CD44,FN1,FAT1,ITGB3,KISS1,MMP11,MMP13,VEGF-A,TGFB1和MTSS1)(图3B和Supplementary Table S5)。Western印迹也显示,使用shRIPK4转染敲低RIPK4显著下调VEGF-A水平,并显著增加T24和RT4细胞中CD82的丰度(图3C)。一致地,通过pcDNA-RIPK4转染BIU87细胞使RIPK4过度表达,显著上调VEGF-A水平,降低CD82水平(图3C)。此外,我们在112例BUC标本上进行了RIPK4和VEGF-A的IHC染色。结果显示,在该BUC组中,RIPK4水平与VEGF-A水平呈正相关(P=0.005,图3D和补充表6)。然而,低RIPK4和高RIPK4组之间的CD82水平没有显著差异(P=0.411,补充表6)。重要的是,我们观察到BUC组中较高的VEGF-A水平和较差的存活率之间的关系(P<0.001,图3E),这与BUC标本中RIPK4的水平较高一致。这些结果表明VEGF-A在RIPK4促进BUC的侵袭和转移中起主要作用。
5、VEGF-A介导RIPK4诱导BUC细胞EMT和侵袭/转移
为了研究RIPK4和EMT之间的关系,在沉默T24和RT4细胞中的RIPK4后,如western印迹(图7A和C)和免疫荧光染色(图7B和D)所示两种上皮标志物E-钙粘蛋白(E-cadherin)和β-连环蛋白(β-catenin)的蛋白质水平增加,而两种间充质标志物纤连蛋白(fibronectin)和波形蛋白(vimentin)的蛋白质水平降低。相比之下,在BIU87细胞中RIPK4异位过表达后,Western印迹(图7E)和免疫荧光染色(图7F)显示,E-钙粘蛋白和β-连环蛋白水平降低,而纤连蛋白和波形蛋白的纤连蛋白和波形蛋白增加。此外,对112个主要BUC组织进行IHC染色。图7G显示了BUC组织中EMT标志物的典型IHC染色。RIPK4水平与间充质标志物Vimentin(P<0.001),fibronectin(P=0.002)呈正相关,与上皮标志物E-cadherin(P<0.001),β-catenin(P<0.001)呈负相关(表4)这些数据表明,在BUC进展中,RIPK4促成了EMT过程。
VEGF-A和NF-κB-p65促进RIPK4诱导BUC细胞的EMT。免疫荧光染色显示RIPK4-BIU87T24细胞沉默VEGF-A或NF-κB-p65后,E-cadherin水平升高。免疫荧光染色显示RIPK4-BIU87T24细胞沉默VEGF-A或NF-κB-p65后,β-catenin水平升高。免疫荧光染色显示RIPK4-BIU87T24细胞中沉默VEGF-A或NF-κB-p65后,波形蛋白的水平降低。免疫荧光染色显示RIPK4-BIU87T24细胞沉默VEGF-A或NF-κB-p65后,纤连蛋白水平降低。
为了研究在RIPK4诱导BUC细胞的EMT和侵袭/转移是否需要VEGF-A,使用shRNA使BIU87-RIPK4细胞中的VEGF-A表达沉默(图4A和C)。ShVEGF-A处理抑制RIPK4诱导的EMT,如BIU87-RIPK4细胞中上皮标志物(E-钙粘蛋白和β-连环蛋白)丰度上升和间充质标志物(波形蛋白和纤连蛋白)水平降低所示(图4D和图8)。另外,创伤愈合(图4E),侵袭实验(transwell assays)(图4F)和HUVEC血管形成实验(图4G)表明,VEGF-A沉默后,显著抑制BIU87-RIPK4细胞的迁移和侵袭能力。总之,这些数据提供了证据表明VEGF-A介导RIPK4诱导的EMT和BUC细胞的侵袭/转移。
6、过表达的RIPK4激活NF-κB信号
NF-κB是VEGF-A转录的关键调节因子(Karin和Greten,2005)。因此,我们研究了BUC中RIPK4参与调节NF-κB通路。RIPK4的过度表达显著提高了NF-κB荧光素酶报告基因的活性,而RIPK4的沉默显著降低了报告基因的活性(图5A)。重要的是,在RIPK4沉默的细胞中NF-κB-p65的核水平显著降低,而在RIPK4转导的细胞中则增加(图5B和C)。相比之下,通过免疫荧光染色证明的(图5D),在BIU87细胞中异位过表达RIPK4后,NF-κB-p65的水平增加,而沉默RIPK4NF-κB-p65的水平减低。为了进一步证实RIPK4介导BUC的EMT和侵袭/转移通过NF-κB活化发生,在RIPK4-过表达细胞中使用靶向编码NF-κB-p65(RELA),shRNA-NF-κB-p65基因的shRNA(图4B和4C)阻断NF-κB途径。正如所料,shRNA-NF-κB-p65抑制了RIPK4过表达对NF-κB活化的刺激作用(图4C)。此外,正如BIU87-RIPK4中上皮标志物(E-钙粘蛋白和β-连环蛋白)水平升高和间充质标志物(波形蛋白和纤连蛋白)水平降低(图4D和图8),RIPK4诱导的EMT也被shRNA-NF-κB-p65抑制。此外,通过伤口愈合(图4E),transwell实验(图4F)和HUVEC血管生成实验(图4G)证实,shRNA-NF-κB-p65减少了RIPK4诱导的侵袭和转移。综上
所述,我们的结果表明RIPK4的致癌活性依赖于NF-κB的激活。
7、RIPK4维持NF-κB激活
刺激肿瘤坏死因子(TNF)诱导NF-κB受体复合物中的RIP,TRAF2和NEMO在快速募集和泛素化,该过程对于TNF诱导的NF-κB活化是关键的(Ea等,2006;Wang等al,2001)。与载体对照细胞相比,分离RIPK4过表达细胞的细胞膜,观察到RIP,TRAF2和NEMO的水平显著增加,并且与RNAi载体转导的细胞相比,分离沉默RIPK4细胞的细胞膜,相同蛋白质(RIP,TRAF2和NEMO)的水平显著降低(图6A)。图6B显示RIPK4转导的细胞K63连接RIP,TRAF2和NEMO的多聚泛素化水平高于相应的对照细胞,RIPK4沉默的细胞中K63-多聚泛素化水平低。这表明在NF-κB信号传导中,RIPK4促进泛素共轭结合。NF-κB信号通路可根据不同的诱导因子如TNF和IL-1β进一步细分;因此,我们进一步观察到,TNF-α处理过表达RIPK4细胞的IκB下降水平显著延长,而在RIPK4沉默的细胞中缩短(图6C)。这些结果表明RIPK4通过促进NF-κB信号传导的相关蛋白泛素化结合来维持NF-κB活化。
8、人BUC中RIPK4诱导的NF-kB激活的临床相关性
最后,我们研究了BUC细胞RIPK4激活NF-κB的临床相关性。EMSA和qRT-PCR结果显示人类BUC的RIPK4水平与NF-κB活性呈正相关,并且与NF-κB下游基因VEGF-AmRNA表达水平呈正相关(图8A)。一致的是,对112个组织标本的IHC分析显示,RIPK4水平与p-p65水平呈正相关(P<0.001;图8B)。重要的是,p-p65的阳性与该BUC队列的生存率差有关(P=0.001,图8C)。此外,根据标准处理流程,GEPIA(http://gepia.cancerpku.cn)分析TCGA中的23种癌症和正常样品的RNA测序表达数据的结果,BUC(r=0.2,P=5.5e-05),黑色素瘤(r=0.45,P=3.5e-05)和胸腺瘤组织(r=0.73,P=9.7e-21)中RIPK4的水平与VEGF-A表达水平显著相关(图9)。这些数据支持了我们的假设,即RIPK4过表达激活NF-κB信号转导途径,最终导致侵袭性的BUC表型和BUC的不良临床结果。
表1显示了BC患者中RIPK4水平与临床病理学变量之间的关系。
Supplementary Table 1.Correlationbetween RIPK4andtheclinicopathological features of BC
Abbreviations:aChi-square test;bmedian age;cmedian size;BC=bladderurothelial carcinoma;Significant associations are shown in bold face in thep-value column(p-value<0.05).
表2单变量分析112例BC患者生存,显示对BUC生存有影响的变量。
Abbreviations:amedian age;bmedian size;HR=hazard ratio;CI=
confidence interval;BC=bladder urothelial carcinoma;Significant
associations are shown in bold face in thep-value column(p-value<0.05).
表3多变量分析112例BC患者生存,显示对BUC生存有影响的变量
Supplementary Table3.Multivariate analysis ofsurvival in 112cases ofBC
Abbreviations:HR=hazard ratio;CI=confidence interval;BC=bladderurothelial carcinoma;Significant associations are shown in bold face in thep-value column(p-value<0.05).
表4显示RIPK4表达水平和EMT maker之间的关系
Supplementary Table 4.Association between the expression ofRIPK4andEMT markers in BC
Abbreviations:aFisher’s exact test;EMT=epithelial-mesenchymaltransition;BC=bladder urothelial carcinoma;Significant associations areshown in bold face in the p-value column(p-value<0.05).
表5显示17个与转移和血管生成有关差异表达的基因(超过2倍的变化;P<0.001)Supplementary Table 5A list ofdifferentially expressed genes related tomigration and angiogenesis ofBC(Fold change>2;P<0.001)
表6显示BC患者RIPK4表达与VEGF-A,CD82,NF-κB-p65之间的关系
Supplementary Table6.Associationbetween the expression ofRIPK4andVEGF-A,CD82NF-κB-p65in BC
Abbreviations:aFisher’s exact test;BC=bladder urothelial carcinoma;Significant associations are shown in bold face in thep-value column(p-value<0.05).
Claims (2)
1.RIPK4的抑制剂在制备治疗膀胱癌药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述膀胱癌是指BUC。
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