WO2022139114A1 - 췌장관 선암 아형 판별방법 및 아형 판별키트 - Google Patents

췌장관 선암 아형 판별방법 및 아형 판별키트 Download PDF

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배진기
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이철주
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Definitions

  • the present invention relates to a method and a subtype discrimination kit for pancreatic duct adenocarcinoma, and more specifically, to a patient's It relates to a method and a subtype discrimination kit for diagnosing pancreatic duct adenocarcinoma subtypes.
  • Pancreatic cancer is the ninth most common cancer among cancers in Korea, but it is the fifth most common cancer in mortality as most of the diagnosed patients die. In the United States, pancreatic cancer is currently the fourth leading cause of cancer-related deaths and is projected to become the second leading cause of cancer-related deaths in the United States by 2030. Because there is no effective systemic treatment method for pancreatic cancer, a cure can be expected only through surgery. In patients with stage II or less surgery (about 20% of all patients), even if surgery and chemotherapy are actively performed, about 70% of patients recur, and the 5-year survival rate is only about 20%, so it is the most incurable tumor. to be. That is, only about 5-8% of pancreatic cancer patients can be cured, and more than 90% of the remaining patients are tumors that are refractory to the current treatment methods, surgery and chemotherapy. Efforts to overcome pancreatic cancer are urgently needed.
  • pancreatic cancer also uses genetic proteomic data-based pancreatic cancer subtype identification technology based on subtype pathogenesis to determine the subtype of pancreatic cancer patients.
  • Patent Document 1 discloses a method for determining the subtype of a pancreatic tumor by using TPI1, GAPDH, ENO1, LDHA, and PGK1 to classify the subtypes of pancreatic cancer into four types.
  • Patent Document 0001 International Publication No. 2020-205993 (2020.10.08.)
  • An object of the present invention is to provide a method and a subtype discrimination kit for discriminating a patient's pancreatic ductal adenocarcinoma subtype using stratified pancreatic ductal adenocarcinoma subtype information.
  • One embodiment of the present invention provides a method for subtyping pancreatic duct adenocarcinoma comprising the steps of (1) to (4) below.
  • Subtype 1 (Sub1) representative genes: CLDN18, EPS8L3, CAPN5, GMDS, BCAS1, IDH1, DDAH1, SOD1, VIL1, GPX2, AOC1, LGALS4, MICU2, POF1B, MICU1, PLS1, and BDH1
  • Subtype 2 (Sub2) representative genes: UNC5B, PPP1R3G, IGFBP3, EDIL3, CLSTN1, COL11A1, P4HA1, PDLIM4, ST5, FSTL1, PPP1R13L, PLTP, PDLIM7, and CALU
  • Subtype 3 (Sub3) representative genes: MYH9, FLNA, P4HA2, LOXL2, FN1, CD55, FLT1, ECM1, CCDC80, TSKU, HTRA1, COL12A1, SPON2, and ANGPTL2
  • Subtype 4 (Sub4) representative genes: PLEC, LPGAT1, NRDC, PRPF40A, CSDE1, IPO7, CDK1, HMGA1, DDX5, RASA1, ADSS, GMPS, CSE1L, PSME3, CAPRIN1, and BZW1
  • Subtype 5 (Sub5) representative genes: HSPB6, HSPA12A, ANXA6, VIM, UCHL1, PRPH, MAP1B, CD81, ANK2, AKAP12, ITSN1, RTN1, COL28A1, KCTD12, SPON1, SYNPO2, and EPB41L3
  • Subtype 6 (Sub6) representative genes: CTNND2, DTNA, REG1A, PRSS2, CPA1, CPB1, ACAT1, CPA2, PNLIPRP1, PRDX4, SNTB1, PDCD4, CTRC, FKBP11, and SEC11C
  • pancreatic duct adenocarcinoma subtype determination kit includes an agent for measuring the expression level of a representative gene of pancreatic duct adenocarcinoma subtypes 1 to 6, and the representative gene of pancreatic duct adenocarcinoma subtypes 1 to 6 is at least one selected from the group consisting of can
  • Subtype 1 (Sub1) representative genes: CLDN18, EPS8L3, CAPN5, GMDS, BCAS1, IDH1, DDAH1, SOD1, VIL1, GPX2, AOC1, LGALS4, MICU2, POF1B, MICU1, PLS1, and BDH1
  • Subtype 2 (Sub2) representative genes: UNC5B, PPP1R3G, IGFBP3, EDIL3, CLSTN1, COL11A1, P4HA1, PDLIM4, ST5, FSTL1, PPP1R13L, PLTP, PDLIM7, and CALU
  • Subtype 3 (Sub3) representative genes: MYH9, FLNA, P4HA2, LOXL2, FN1, CD55, FLT1, ECM1, CCDC80, TSKU, HTRA1, COL12A1, SPON2, and ANGPTL2
  • Subtype 4 (Sub4) representative genes: PLEC, LPGAT1, NRDC, PRPF40A, CSDE1, IPO7, CDK1, HMGA1, DDX5, RASA1, ADSS, GMPS, CSE1L, PSME3, CAPRIN1, and BZW1
  • Subtype 5 (Sub5) representative genes: HSPB6, HSPA12A, ANXA6, VIM, UCHL1, PRPH, MAP1B, CD81, ANK2, AKAP12, ITSN1, RTN1, COL28A1, KCTD12, SPON1, SYNPO2, and EPB41L3
  • Subtype 6 (Sub6) representative genes: CTNND2, DTNA, REG1A, PRSS2, CPA1, CPB1, ACAT1, CPA2, PNLIPRP1, PRDX4, SNTB1, PDCD4, CTRC, FKBP11, and SEC11C
  • Another embodiment of the present invention provides a method for predicting the prognosis of a patient with pancreatic ductal adenocarcinoma comprising the steps of (1) to (5) below.
  • Subtype 1 (Sub1) representative genes: CLDN18, EPS8L3, CAPN5, GMDS, BCAS1, IDH1, DDAH1, SOD1, VIL1, GPX2, AOC1, LGALS4, MICU2, POF1B, MICU1, PLS1, and BDH1
  • Subtype 2 (Sub2) representative genes: UNC5B, PPP1R3G, IGFBP3, EDIL3, CLSTN1, COL11A1, P4HA1, PDLIM4, ST5, FSTL1, PPP1R13L, PLTP, PDLIM7, and CALU
  • Subtype 3 (Sub3) representative genes: MYH9, FLNA, P4HA2, LOXL2, FN1, CD55, FLT1, ECM1, CCDC80, TSKU, HTRA1, COL12A1, SPON2, and ANGPTL2
  • Subtype 4 (Sub4) representative genes: PLEC, LPGAT1, NRDC, PRPF40A, CSDE1, IPO7, CDK1, HMGA1, DDX5, RASA1, ADSS, GMPS, CSE1L, PSME3, CAPRIN1, and BZW1
  • Subtype 5 (Sub5) representative genes: HSPB6, HSPA12A, ANXA6, VIM, UCHL1, PRPH, MAP1B, CD81, ANK2, AKAP12, ITSN1, RTN1, COL28A1, KCTD12, SPON1, SYNPO2, and EPB41L3
  • Subtype 6 (Sub6) representative genes: CTNND2, DTNA, REG1A, PRSS2, CPA1, CPB1, ACAT1, CPA2, PNLIPRP1, PRDX4, SNTB1, PDCD4, CTRC, FKBP11, and SEC11C
  • Genetic proteomic analysis can improve understanding of PDAC and stratification of PDAC patients, and can improve treatment for pancreatic cancer patients by discriminating pancreatic ductal adenocarcinoma subtypes.
  • subtypes of pancreatic duct adenocarcinoma patients can be discriminated according to the genetic proteomic analysis of PDAC. This will enable precise medical technology for pancreatic cancer that can provide optimal treatment for each subtype according to the development of customized therapeutics for each subtype in the future.
  • the present invention it is possible to predict the prognosis by discriminating the pancreatic cancer subtype, and it is possible to develop a new drug tailored to the subtype.
  • 1 and 2 are mutant-protein abundance and phosphorylation correlations and the association of apoptosis and actin cytoskeleton in PDAC.
  • A Mutations per megabase of individual patients (top), SMG mutation types in each patient (middle right); mutation frequency for each gene in the patient (middle left); Clinical parameters for each patient (bottom).
  • B Comparison of frequencies of somatic mutations in SMG. Red labeling indicates genes detected with significantly higher frequency (p ⁇ 0.05 by proportionality test) in this cohort than in other cohorts.
  • C Phosphorylated peptides up-regulated in expression in tumors with somatic mutations in KRAS, SMAD4 and ARID1A. Color bars represent the slope of the log 2 -fold-change of phosphorylated peptide intensity compared to the average intensity.
  • the heat map shows the significance of the enrichment of each process by the protein for which the mutation-phosphorylation correlation is confirmed. Significance is expressed as -log 10 (p), where p is the p value for the enrichment.
  • Lollipop plots show somatic mutations (circles) and phosphorylation sites (triangles) detected in the gene structure (top). The height of the lollipop indicates the number of patients with the corresponding mutation, and the color indicates the type of mutation (see legend in A).
  • FIG. 2 (A) Workflow for PDAC genetic proteomic analysis. Exome-sequencing analysis of tumor tissue and blood samples and RNA-sequencing of tumor tissue were performed on tumors from 196 patients, whereas mass spectrometry-based proteomic analysis (global proteome and phosphorylated proteome) was performed on tumors from 150 patients. was performed for The distribution of tumor cell fidelity is shown for 196 tumors (bottom left). Tumors with cellular fidelity greater than 15% were used for proteomic analysis, and tumors with cellular fidelity greater than 19% were used for proteomic analysis. (B) Number of non-overlapping peptides identified in global proteome and phosphorylated proteome data.
  • (C) Number of protein-coding genes identified from mRNA sequencing and proteome data (global proteome and phosphorylated proteome). The average number of peptide and protein-coding genes is shown in (B) and (C), respectively.
  • (D) The number of somatic mutations altering the gene and protein sequences carrying the mutations identified in the exome-sequencing data.
  • E This cohort and TCGA (Cancer Genome Atlas Research Network. Electronic address and Cancer Genome Atlas Research, 2017), Bailey et al. (Bailey et al., 2016), Biankin et al. (Biankin et al., 2012) , Witkiewicz et al.
  • Figures 3 and 4 are for mRNA-protein abundance correlations and novel oncogenes and tumor suppressor candidates.
  • FIG. 1 Representative images (F) and quantification (G) (n ⁇ 2/condition) of wound healing measured 0 or 48 h after wounding induced by scratching AsPC1 cells transduced with the indicated shRNAs. Wound healing was quantified at 48 h.
  • H-I AsPC1 counts (H) (n ⁇ 2/condition) after overexpression of the indicated tumor suppressor candidates. Cell number is determined on day 3 (I). Data are presented as mean ⁇ SEM. *, p ⁇ 0.05 by two-way (D and H) and one-way (E, G and I) analyzes of variance (ANOVA) with Dunnett's post-hoc correction; **, p ⁇ 0.01; ***, p ⁇ 0.001; ****, p ⁇ 0.0001.
  • IQGAP2 was excluded from functional experiments due to its large gene size, and KRT19 was excluded due to its participation in a wide range of functions.
  • the mRNA expression profile of AsPC1 cells was obtained from Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) (Ghandi et al., 2019). FPKM, fragments per kilobase of transcript per million.
  • 5 and 6 are for the redefinition of PDAC subtypes by genetic proteomic analysis.
  • the rna1-3 defining RNA1-3, respectively, are shown in the first heat map. The number of mRNAs in ran1-3 is indicated in parentheses.
  • heat maps show tumors classified as RNA1-3 based on rna1-3 (left) and non-rna1-3-associated tumors (right).
  • Subtype bar plots were plotted by molecular signatures defined by Moffitt et al. (Moffitt et al., 2015), Collisson et al. (Collisson et al., 2011), Bailey et al. (Bailey et al., 2016).
  • F Survival period of tumor-bearing patients in Sub1-6.
  • G Distribution of somatic mutations in SMG in Sub1-6 and clinical parameters for each patient (bottom).
  • H Distribution of mutations per somatic megabase identified in tumors of Sub1-6. In the violin plot, the line represents the median. *, p ⁇ 0.05 by one-way ANOVA using Sidak's post-hoc correction.
  • the center and border colors of the nodes indicate that their genes and proteins are the signatures of Sub5-6 (green for Sub5, dark green for Sub6) and Sub2-4 (orange for Sub2, red for Sub3, dark red for Sub4). Indicates whether or not is selected.
  • the circle P in the node represents the phosphorylated peptide defining the corresponding subtype. arrow, activate; restraint sign, restraint; solid arrow, direct activation; dashed arrow, indirect activation; Gray line, protein-protein interaction.
  • D Distribution of tumor cell fidelity in Sub1-6. The median cell fidelity is indicated by the red line.
  • E Cell counts for cultured Sub4 (SNU3608) and Sub6 (SNU3573) tumors. Data are presented as mean ⁇ SEM. **** by two-way ANOVA using Sidak's post-hoc correction for the entire time range; p ⁇ 0.0001.
  • Figure 8 shows the mRNA, protein and phosphorylation signatures defining Sub1-6 for gene set enrichment analysis (GSEA), and how the mRNA and protein signatures defining Sub6 in Figure 8 (A) are selected and used for GSEA. shown as an example.
  • Integration clustering top left shows that Sub6 is defined by RNA3, Prot5 and Phos4 clusters.
  • 416 genes rna3 defining RNA3 were selected as mRNA signatures (S6-G), and 945 proteins (prot5) and 1030 phosphorylated peptides (phos4) defining Prot5 and Phos5, respectively, were selected based on this information. was chosen as the protein signature (S6-P) (bottom right and top).
  • the resulting protein was used for GSEA.
  • B Distribution of subtypes of tumors carrying somatic mutations in TP53 or ARID1A and altering protein abundance or phosphorylation levels of the corresponding protein-coding genes. The color of the heat map below the bar plot represents the patient's subtype.
  • C Number of patients with or without protein-rich mutations, or in which the intensity of phosphorylated peptides was higher (positive) or lower (negative) than the median value across patients. The color of the stacked bar plot represents the patient's subtype.
  • 9 and 10 relate to the inhibition of T cell proliferation of pro-tumorigenic PMN-MDSCs.
  • M-MDSC monocyte MDSC.
  • D-E Representative FACS data using the indicated markers. Boxes represent PMN-MDSCs. Superscript H: high, L: low.
  • I Co-culture of PMN-MDSCs and T cells isolated from orthotopic PDAC models and naive Balb/c mice, respectively. The FACS scheme for CFSE analysis for CD8+ and CD4+ is shown.
  • C Schematic procedure for development of an orthotopic PDAC model transplanted with cells derived from Sub4 (SNU3608) and Sub6 (SNU3573) tumors in Balb/c-nu mice.
  • D Representative ultrasound images of SNU3608 and SNU3573 tumors taken on days 8, 22 and 36. Dotted circles indicate tumors.
  • E Total images of SNU3608 and SNU3573 tumors taken at day 42.
  • G FACS gating scheme for myeloid populations and chemokine receptors. The contour line shows the cell density distribution. Solid lines represent indicated cell populations in individual plots.
  • Red arrow heads indicate the flow of FACS gating.
  • H-J Percentage of indicated immune cells in SNU3608 and SNU3573 tumors measured in blood (H), spleen (I) and bone marrow (BM, J).
  • PMN-MDSCs polymorphic nuclear bone marrow-derived suppressor cells; M-MDSC, monocyte MDSC.
  • K-N Expression levels of CXCR2 and CXCR4 measured in blood (L), spleen (M), and BM (N) of Balb/c-nu mice bearing SNU3608 and SNU3573 tumors (K), as well as SNU3608 and SNU3573 tumors (K-N). The number or percentage of four marked PMN-MDSC groups, defined according to .
  • n 3 or 4 (naive), 8 to 10 (SNU3608 or SNU3573). *, p ⁇ 0.05 by two-way ANOVA using Sidak's post-hoc correction; **, p ⁇ 0.01; ****, p ⁇ 0.0001.
  • FIG. 11 is a schematic diagram for performing MRM-MS analysis on a mixture of a protein extracted from a lesion tissue of a patient with pancreatic duct adenocarcinoma and a stable isotope-labeled peptide of a representative gene of subtypes 1 to 6;
  • FIG. 13 shows a pancreatic cancer sample processing method to which the pancreatic cancer tissue shredding process and ultra-high pressure pressure circulation technology are applied.
  • the present invention relates to a method and a kit for subtyping pancreatic duct adenocarcinoma.
  • PDAC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma
  • the present invention shows that protein and genomic data are complementary.
  • the availability of phosphorylation data provides information on signaling pathways with activity correlating with somatic mutations in SMG, suggesting an association between mutations and signaling pathways in pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC).
  • PDAC pancreatic ductal adenocarcinoma
  • mRNA-protein abundance correlation was used. Also, to more precisely define PDAC subtypes, protein abundance and phosphorylation data were combined with mRNA abundance. GSEA and network analysis of mRNA and protein signatures that define PDAC subtypes characterize the subtypes. Genetic proteomic analysis through effective integration of genomic, mRNA, and protein data provides valuable information that can help elucidate PDAC pathogenesis, stratify PDAC patients, and potentially identify therapeutic targets.
  • the present invention performed proteogenomic analysis on PDAC samples by combining mRNA expression data for pancreatic duct adenocarcinoma lesion tissue samples with global proteomic data and phosphorylated proteomic data. Six pancreatic duct adenocarcinoma subtypes and representative genes of each subtype were identified.
  • Subtype 1 (Sub1) representative genes: CLDN18, EPS8L3, CAPN5, GMDS, BCAS1, IDH1, DDAH1, SOD1, VIL1, GPX2, AOC1, LGALS4, MICU2, POF1B, MICU1, PLS1, BDH1
  • Subtype 2 (Sub2) representative genes: UNC5B, PPP1R3G, IGFBP3, EDIL3, CLSTN1, COL11A1, P4HA1, PDLIM4, ST5, FSTL1, PPP1R13L, PLTP, PDLIM7, CALU
  • Subtype 3 (Sub3) representative genes: MYH9, FLNA, P4HA2, LOXL2, FN1, CD55, FLT1, ECM1, CCDC80, TSKU, HTRA1, COL12A1, SPON2, ANGPTL2
  • Subtype 4 (Sub4) representative genes: PLEC, LPGAT1, NRDC, PRPF40A, CSDE1, IPO7, CDK1, HMGA1, DDX5, RASA1, ADSS, GMPS, CSE1L, PSME3, CAPRIN1, BZW1
  • Subtype 5 (Sub5) representative genes: HSPB6, HSPA12A, ANXA6, VIM, UCHL1, PRPH, MAP1B, CD81, ANK2, AKAP12, ITSN1, RTN1, COL28A1, KCTD12, SPON1, SYNPO2, EPB41L3
  • Subtype 6 (Sub6) representative genes: CTNND2, DTNA, REG1A, PRSS2, CPA1, CPB1, ACAT1, CPA2, PNLIPRP1, PRDX4, SNTB1, PDCD4, CTRC, FKBP11, SEC11C
  • Pancreatic ductal adenocarcinoma presubtype representative genes KRT19, RAB27B, QSOX1, VILL, GNPAT, ABCC3, GP2, ETHE1, BPNT1, AGR2, PIGR, SRC, CTSE, JUP, RPL7, TSPAN8, SRM, VDAC1, SCP2, RPS3, AK4, RPL9, RDX, RPL3, RPL13A, RPL5, RPS9, HK2, RAB25, GNG2, RPL15, RPL37, RPS7, RPL8, RPL18A, RPL6, PABPC4, INF2, SLC25A24, MYH14, GALNT7, GSDMB, MCU CYP2S1, HTATIP2, SDCBP2, SYTL2, PREB, MYO6, PKP3, SNTB2, S100A11
  • the method for determining a subtype of pancreatic duct adenocarcinoma may include the following steps (1) to (4).
  • Subtype 1 (Sub1) representative genes: CLDN18, EPS8L3, CAPN5, GMDS, BCAS1, IDH1, DDAH1, SOD1, VIL1, GPX2, AOC1, LGALS4, MICU2, POF1B, MICU1, PLS1, BDH1
  • Subtype 2 (Sub2) representative genes: UNC5B, PPP1R3G, IGFBP3, EDIL3, CLSTN1, COL11A1, P4HA1, PDLIM4, ST5, FSTL1, PPP1R13L, PLTP, PDLIM7, CALU
  • Subtype 3 (Sub3) representative genes: MYH9, FLNA, P4HA2, LOXL2, FN1, CD55, FLT1, ECM1, CCDC80, TSKU, HTRA1, COL12A1, SPON2, ANGPTL2
  • Subtype 4 (Sub4) representative genes: PLEC, LPGAT1, NRDC, PRPF40A, CSDE1, IPO7, CDK1, HMGA1, DDX5, RASA1, ADSS, GMPS, CSE1L, PSME3, CAPRIN1, BZW1
  • Subtype 5 (Sub5) representative genes: HSPB6, HSPA12A, ANXA6, VIM, UCHL1, PRPH, MAP1B, CD81, ANK2, AKAP12, ITSN1, RTN1, COL28A1, KCTD12, SPON1, SYNPO2, EPB41L3
  • Subtype 6 (Sub6) representative genes: CTNND2, DTNA, REG1A, PRSS2, CPA1, CPB1, ACAT1, CPA2, PNLIPRP1, PRDX4, SNTB1, PDCD4, CTRC, FKBP11, SEC11C
  • the expression level of the representative gene of the subtypes 1 to 6 may be compared with the expression level of the representative gene of the pancreatic duct adenocarcinoma presubtype (All Sub). Accordingly, the reliability of subtype discrimination can be improved. More specifically, the expression levels of the genes most contributing to the differentiation between the subtypes 1 to 6 and the following pancreatic duct adenocarcinoma presubtypes may be combined and compared.
  • pancreatic duct adenocarcinoma presubtype representative genes are KRT19, RAB27B, QSOX1, VILL, GNPAT, ABCC3, GP2, ETHE1, BPNT1, AGR2, PIGR, SRC, CTSE, JUP, RPL7, TSPAN8, SRM, VDAC1, SCP2 , RPS3, AK4, RPL9, RDX, RPL3, RPL13A, RPL5, RPS9, HK2, RAB25, GNG2, RPL15, RPL37, RPS7, RPL8, RPL18A, RPL6, PABPC4, INF2, SLC25A24, MYH14, GALNT7, GSDMB GOLM1, MCU , CYP2S1, HTATIP2, SDCBP2, SYTL2, PREB, MYO6, PKP3, SNTB2, and S100A11.
  • the measurement and comparison of the expression level of the representative gene of the pancreatic duct adenocarcinoma presubtype and subtypes 1 to 6 is a stable isotope marker representing the representative gene of the pancreatic duct adenocarcinoma presubtype and the genes for each subtype.
  • the quantitative mass spectrometry may be MRM-MS (Multiple Reaction Monitoring-Mass Spectrometry), PRM-MS (Parallel Reaction Monitoring-Mass Spectrometry), DIA-MS (Data Independent Acquisition Mass Spectrometry), or the like.
  • MRM-MS Multiple Reaction Monitoring-Mass Spectrometry
  • PRM-MS Parallel Reaction Monitoring-Mass Spectrometry
  • DIA-MS Data Independent Acquisition Mass Spectrometry
  • FIG. 11 is a schematic diagram of MRM-MS analysis performed on a mixture of peptides extracted from lesion tissues of a patient with pancreatic duct adenocarcinoma and a panel of stable isotope-labeled peptides of representative genes of subtypes 1 to 6;
  • MRM-MS Multiple Reaction Monitoring/Mass Spectrometry
  • QQQ triple quadrupole mass spectrometry
  • MS1 a peptide having a specific mass/charge for the selected target proteins
  • MS2 a fragment having a characteristic mass/charge among fragments generated when the peptide collides with the second quadrupole (Fragment ion) , MS2)
  • the precursor ion/fragment ion pair obtained from MS1 and MS2, respectively is called the specific transition of the target protein (specific mass fingerprint of the target protein).
  • the quantitative information of all target proteins in the sample is measured through a standard, a peptide of the same amino acid sequence substituted with an isotope. Quantities can be simultaneously analyzed for relative or absolute quantification in a short period of time. With this principle, MRM-MS can selectively detect and quantify only the target analyte with high sensitivity, and the cost required for analysis can be reduced.
  • the MRM-MS analysis can be performed by comparing the signal strength of the patient-derived peptide compared to the representative peptide of the subtype, and the signal strength ratio is a peptide with the peptide and the peptide elution time as two axes. It can be expressed as a star signal strength contour map.
  • Such a subtype representative peptide intensity contour map for each subtype can be used to compare patterns with a subtype representative peptide intensity contour map obtained from an endoscopic tissue of a pancreatic cancer patient who is diagnosed with a hospital to be diagnosed. have.
  • the pancreatic cancer lesion tissue disruption in step (1) may be cryopreserved by cryogenic crushing. Fine tissue powder can be obtained by freezing and crushing by the cryogenic temperature.
  • cryogenic temperature is an optimal tissue sample processing technique to minimize the loss of tumor tissue.
  • cryogenic temperature may be liquid nitrogen temperature (-196° C.).
  • the first process for obtaining the peptide from the tissue is a tissue homogenization process, and tissue degeneration can be minimized by treating the tissue within 1 minute in a cryogenic state.
  • Cryo-fragmentation by cryogenic temperature is an optimized method for a very small amount of pancreatic cancer patient samples because there is no process of exposing the tissue to the outside during the process of crushing it into a powder state, so there is no sample loss.
  • the step of extracting and digesting the protein in step (2) to obtain a peptide sample may be performed by a pressure circulation technique.
  • the pressure circulation technology is to cross-apply ultra-high pressure (45,000 psi) and low pressure ( ⁇ 15 psi) to the shredded pancreatic cancer tissue sample, thereby extracting and digesting proteins more effectively.
  • the time to obtain the peptide from the tissue may be 3 hours or less. This is very fast compared to the conventional method, which takes 30 hours, and is a high-efficiency technique that can apply 16 tissue samples at the same time. Therefore, subtyping can be performed on a large number of patients.
  • FIG. 13 shows a pancreatic cancer sample processing method to which the pancreatic cancer tissue shredding process and ultra-high pressure pressure circulation technology are applied.
  • the subtypes 2 to 4 may have invasive properties, and the subtypes 5 and 6 may have immunogenicity.
  • the subtype 4 has invasive properties and proliferative properties, and may have low T cell proliferation.
  • the subtypes 2 to 4 may be associated with an epithelial mesenchymal transition (EMT)-related process.
  • EMT epithelial mesenchymal transition
  • subtype 5 and subtype 6 may be associated with an immune-related process.
  • the subtype 1 may be involved in carbohydrate/lipid metabolism.
  • the PDAC subtypes contain mRNA/protein signatures and cellular pathways for each subtype, as well as anti-inflammatory immune cell profiles. PDAC patients can be further stratified according to prognosis by classifying them into subtypes 2-4 (poor prognostic subtypes) or subtypes 1, 5, and 6 (good prognostic subtypes) based on the mRNA and protein signatures of their tumors.
  • pancreatic duct adenocarcinoma subtype determination kit includes a formulation for measuring the expression level of representative genes of pancreatic duct adenocarcinoma subtypes 1 to 6, and the representative genes of pancreatic duct adenocarcinoma subtypes 1 to 6 are composed of It can be selected from the group being.
  • Subtype 1 (Sub1) representative genes: CLDN18, EPS8L3, CAPN5, GMDS, BCAS1, IDH1, DDAH1, SOD1, VIL1, GPX2, AOC1, LGALS4, MICU2, POF1B, MICU1, PLS1, BDH1
  • Subtype 2 (Sub2) representative genes: UNC5B, PPP1R3G, IGFBP3, EDIL3, CLSTN1, COL11A1, P4HA1, PDLIM4, ST5, FSTL1, PPP1R13L, PLTP, PDLIM7, CALU
  • Subtype 3 (Sub3) representative genes: MYH9, FLNA, P4HA2, LOXL2, FN1, CD55, FLT1, ECM1, CCDC80, TSKU, HTRA1, COL12A1, SPON2, ANGPTL2
  • Subtype 4 (Sub4) representative genes: PLEC, LPGAT1, NRDC, PRPF40A, CSDE1, IPO7, CDK1, HMGA1, DDX5, RASA1, ADSS, GMPS, CSE1L, PSME3, CAPRIN1, BZW1
  • Subtype 5 (Sub5) representative genes: HSPB6, HSPA12A, ANXA6, VIM, UCHL1, PRPH, MAP1B, CD81, ANK2, AKAP12, ITSN1, RTN1, COL28A1, KCTD12, SPON1, SYNPO2, EPB41L3
  • Subtype 6 (Sub6) representative genes: CTNND2, DTNA, REG1A, PRSS2, CPA1, CPB1, ACAT1, CPA2, PNLIPRP1, PRDX4, SNTB1, PDCD4, CTRC, FKBP11, SEC11C
  • the pancreatic duct adenocarcinoma subtype discrimination kit includes an agent for measuring the expression level of the pancreatic ductal adenocarcinoma presubtype representative gene (All Sub), and the representative gene expression level of the subtypes 1 to 6 is It can be compared with the expression level of the pancreatic duct adenocarcinoma representative gene.
  • pancreatic duct adenocarcinoma presubtype representative genes are KRT19, RAB27B, QSOX1, VILL, GNPAT, ABCC3, GP2, ETHE1, BPNT1, AGR2, PIGR, SRC, CTSE, JUP, RPL7, TSPAN8, SRM, VDAC1, SCP2 , RPS3, AK4, RPL9, RDX, RPL3, RPL13A, RPL5, RPS9, HK2, RAB25, GNG2, RPL15, RPL37, RPS7, RPL8, RPL18A, RPL6, PABPC4, INF2, SLC25A24, MYH14, GALNT7, GSDMB GOLM1, MCU , CYP2S1, HTATIP2, SDCBP2, SYTL2, PREB, MYO6, PKP3, SNTB2, and S100A11.
  • the agent for measuring the expression level of the representative gene of the pancreatic duct adenocarcinoma presubtype and subtypes 1 to 6 is a stable isotope representing the representative gene of the pancreatic duct adenocarcinoma presubtype and genes for each subtype. a panel of labeled peptides.
  • Another embodiment of the present invention relates to a method for predicting the prognosis of a patient with pancreatic ductal adenocarcinoma comprising the steps of (1) to (5) below.
  • Subtype 1 (Sub1) representative genes: CLDN18, EPS8L3, CAPN5, GMDS, BCAS1, IDH1, DDAH1, SOD1, VIL1, GPX2, AOC1, LGALS4, MICU2, POF1B, MICU1, PLS1, BDH1
  • Subtype 2 (Sub2) representative genes: UNC5B, PPP1R3G, IGFBP3, EDIL3, CLSTN1, COL11A1, P4HA1, PDLIM4, ST5, FSTL1, PPP1R13L, PLTP, PDLIM7, CALU
  • Subtype 3 (Sub3) representative genes: MYH9, FLNA, P4HA2, LOXL2, FN1, CD55, FLT1, ECM1, CCDC80, TSKU, HTRA1, COL12A1, SPON2, ANGPTL2
  • Subtype 4 (Sub4) representative genes: PLEC, LPGAT1, NRDC, PRPF40A, CSDE1, IPO7, CDK1, HMGA1, DDX5, RASA1, ADSS, GMPS, CSE1L, PSME3, CAPRIN1, BZW1
  • Subtype 5 (Sub5) representative genes: HSPB6, HSPA12A, ANXA6, VIM, UCHL1, PRPH, MAP1B, CD81, ANK2, AKAP12, ITSN1, RTN1, COL28A1, KCTD12, SPON1, SYNPO2, EPB41L3
  • Subtype 6 (Sub6) representative genes: CTNND2, DTNA, REG1A, PRSS2, CPA1, CPB1, ACAT1, CPA2, PNLIPRP1, PRDX4, SNTB1, PDCD4, CTRC, FKBP11, SEC11C
  • the expression level of the representative gene of the subtypes 1 to 6 may be compared with the expression level of the representative gene of the pancreatic duct adenocarcinoma presubtype (All Sub).
  • pancreatic ductal adenocarcinoma presubtype representative genes are KRT19, RAB27B, QSOX1, VILL, GNPAT, ABCC3, GP2, ETHE1, BPNT1, AGR2, PIGR, SRC, CTSE, JUP, RPL7, TSPAN8, SRM, VDAC1, SCP2, RPS3, AK4 , RPL9, RDX, RPL3, RPL13A, RPL5, RPS9, HK2, RAB25, GNG2, RPL15, RPL37, RPS7, RPL8, RPL18A, RPL6, PABPC4, INF2, SLC25A24, MYH14, GALNT7, GOLM1, MCU, GSDMB, CYPS2 , SDCBP2, SYTL2, PREB, MYO6, PKP3, SNTB2, and S100A11.
  • the subtypes 2 to 4 may be predicted to have a poorer prognosis than those of subtype 1, subtype 5, and subtype 6.
  • Sub4 exhibits elevated PMN-MDSCs contributing to tumor cell proliferation by reducing T cell activity and high invasive activity. This pattern suggests that both invasive and PMN-MDSCs should be addressed when treating Sub4 tumors, by targeting invasion-related RHOA and/or TGFB signaling and pro-tumorigenic PMN-MDSCs at once.
  • the PDAC cohort does not contain acinar cell carcinoma, Sub6 has low cell fidelity and has some endocrine properties.
  • CEACAM1, PVR and PVRL2 were higher in Sub2-4 than in Sub5-6, but the levels of CD48, IGSF11, CD96, CD244 and BTLA were higher in Sub5-6.
  • CEACAM1, HMGB1 and CD274 showed the highest mRNA expression levels in Sub4 across all subtypes. Consistent with the mRNA data, higher levels of proteins CEACAM1 and PVR were detected in Sub1-4 than in Sub5-6, and the highest protein level of CD274 was detected in Sub4.
  • CEACAM1, PVR and CD274 inhibit the activity of T cells, and/or natural killer (NK) cells (Qin et al., 2019).
  • NK natural killer
  • This type of immunosuppression is observed in a variety of cancers, including PDAC (Dong et al., 2002; Feig et al., 2013; Nishiwada et al., 2015).
  • the immune checkpoints revealed in Sub5-6 were not detected by proteomic analysis.
  • PMN-MDSC mainly pro-tumorigenic neutrophils, infiltrated Sub4 tumors at high levels.
  • PMN-MDSC-mediated immunosuppression has been demonstrated in lung cancer (Huang et al., 2013), colon cancer (Jung et al., 2017a; Jung et al., 2017b), breast cancer (Alizadeh et al., 2014), head cancer ( In head cancer and neck cancer (Brandau et al., 2011), in kidney cancer (Rodriguez et al., 2009) and gastric cancer (Wang et al., 2013) as well as in PDAC (Porembka et al. , 2012) have been reported.
  • CEACAM1, PVR and CD274 are expressed at high levels in PMN-MDSCs, suggesting a potential association of immune checkpoints and PMN-MDSCs. How these proteins correlate with anti-tumor immunodeficiency in Sub4 tumors can be investigated in future detailed functional studies.
  • each of the mRNA expression data, global proteome data, and phosphorylation proteome data was used to cluster patient tumor samples, and through this, 3 (RNA1-3), 5 (Prot1- 5), 5 (Phos1-5) patient clusters were identified.
  • the signature genes (rna1-3) and proteins (prot1-5) showing significantly higher expression in the patient samples of each cluster compared to the rest of the patient samples through statistical comparative analysis , phosphorylated peptides (phos1-5) were selected.
  • pooled clustering of 150 patient samples was performed to finally derive 6 subtypes (Sub1-6).
  • Partial least squares (PLS) analysis was performed on previously selected signature proteins (prot1-5) and phosphorylated peptides (phos1-5) to derive subtype representative peptides for classifying these six patient subtypes.
  • PLS analysis was performed after conversion into sibling peptides corresponding to each protein.
  • a model was created that simultaneously predicts whether 150 patients belong to a specific subtype (Sub1-6) or all subtypes of 150 patients. .
  • the contribution of individual peptides to patient subtype prediction was quantified with variable importance in projection (VIP) values.
  • peptides containing only one phosphorylation among them and suitable for use in MRM-MS analysis were selected, and finally 16 phosphorylated peptides were derived.
  • the final 150 subtype representative peptides were derived by adding two KRAS mutant protein peptides showing differences in expression between subtypes to the 16 phosphorylated peptides and 132 global peptides finally derived through the above process.
  • Subtype 1 (Sub1) representative genes: CLDN18, EPS8L3, CAPN5, GMDS, BCAS1, IDH1, DDAH1, SOD1, VIL1, GPX2, AOC1, LGALS4, MICU2, POF1B, MICU1, PLS1, BDH1
  • Subtype 2 (Sub2) representative genes: UNC5B, PPP1R3G, IGFBP3, EDIL3, CLSTN1, COL11A1, P4HA1, PDLIM4, ST5, FSTL1, PPP1R13L, PLTP, PDLIM7, CALU
  • Subtype 3 (Sub3) representative genes: MYH9, FLNA, P4HA2, LOXL2, FN1, CD55, FLT1, ECM1, CCDC80, TSKU, HTRA1, COL12A1, SPON2, ANGPTL2
  • Subtype 4 (Sub4) representative genes: PLEC, LPGAT1, NRDC, PRPF40A, CSDE1, IPO7, CDK1, HMGA1, DDX5, RASA1, ADSS, GMPS, CSE1L, PSME3, CAPRIN1, BZW1
  • Subtype 5 (Sub5) representative genes: HSPB6, HSPA12A, ANXA6, VIM, UCHL1, PRPH, MAP1B, CD81, ANK2, AKAP12, ITSN1, RTN1, COL28A1, KCTD12, SPON1, SYNPO2, EPB41L3
  • Subtype 6 (Sub6) representative genes: CTNND2, DTNA, REG1A, PRSS2, CPA1, CPB1, ACAT1, CPA2, PNLIPRP1, PRDX4, SNTB1, PDCD4, CTRC, FKBP11, SEC11C
  • Pancreatic ductal adenocarcinoma presubtype representative genes KRT19, RAB27B, QSOX1, VILL, GNPAT, ABCC3, GP2, ETHE1, BPNT1, AGR2, PIGR, SRC, CTSE, JUP, RPL7, TSPAN8, SRM, VDAC1, SCP2, RPS3, AK4, RPL9, RDX, RPL3, RPL13A, RPL5, RPS9, HK2, RAB25, GNG2, RPL15, RPL37, RPS7, RPL8, RPL18A, RPL6, PABPC4, INF2, SLC25A24, MYH14, GALNT7, GSDMB, MCU CYP2S1, HTATIP2, SDCBP2, SYTL2, PREB, MYO6, PKP3, SNTB2, S100A11
  • All 150 derived subtype representative gene peptide samples were mixed to constitute a subtype representative peptide sample, which was mixed with a pancreatic cancer patient-derived peptide sample to discriminate the subtype of the pancreatic cancer patient.
  • a Barocycler device based on pressure circulation technology was used to obtain a sample of a peptide derived from a pancreatic cancer patient.
  • an ultra-high pressure of 45,000 psi and a low pressure of 15 psi were alternately applied to the microtube containing the tissue sample and the lysis buffer to effectively collapse the cell wall, and then the protein was extracted.
  • peptide samples were obtained from 16 pancreatic cancer tissue samples within 3 hours by applying an ultra-high pressure of 20,000 psi and a low pressure of 15 psi alternately.
  • the obtained peptide sample from a pancreatic cancer patient was subjected to a C18 spin column-based desalting process, and then a peptide sample derived from a pancreatic cancer patient containing quantitative information was finally obtained through BCA quantification.
  • a subtype discriminating peptide sample was constructed by mixing a patient-derived peptide sample and a subtype representative peptide sample containing information on 150 subtype representative genes. As the top-3 transition, y-ion for charge state +2 and +3 was selected.

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Abstract

본 발명은 PDAC의 유전단백체 분석에 따라 췌장관 선암 환자의 아형을 판별하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 일 실시형태에 따른 췌장암 아형 판별방법은 (1) 췌장관 선암 환자로부터 분리된 췌장관 선암 병변 조직을 파쇄하는 단계; (2) 상기 병변 조직으로부터 단백질을 추출하고 소화하여 환자 펩티드 시료를 얻는 단계; (3) 상기 환자 펩티드시료로부터 췌장관 선암 아형 1 내지 6의 대표유전자 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (4) 상기 췌장관 선암 아형 1 내지 6의 대표유전자 발현 수준을 비교하여, 췌장관 선암 환자의 아형을 판별하는 단계를 포함한다.

Description

췌장관 선암 아형 판별방법 및 아형 판별키트
본 발명은 췌장관 선암 아형 판별방법 및 아형 판별키트에 관한 것으로, 보다 구체적으로 게놈, mRNA, 및 단백질 데이터의 통합에 의한 유전단백체 분석에 따라 계층화된 췌장관 선암의 아형정보를 이용하여, 환자의 췌장관 선암 아형을 판별하는 방법 및 아형 판별키트에 관한 것이다.
췌장암은 대한민국에서 발생하는 암 중에서 발생률은 9위이지만, 진단받은 환자들의 대부분이 사망하여 사망률은 5위인 암종이다. 미국에서는 현재 췌장암이 암 관련 사망의 네번째 주요 원인이며 2030년까지 미국에서 암 관련 사망의 두번째 주요 원인이 될 것으로 예측된다. 췌장암은 아주 효과적인 전신 치료 방법이 없기 때문에 수술에 의해서만 완치를 기대할 수 있으나, 해부학적 특성상 주요 혈관 침범이나 전신 전이로 발전되어 환자의 80%에서 완치가 불가능한 상태로 발견된다. 수술이 가능한 2기 이내의 환자(전체 환자 중 20% 내외)에서 수술 및 항암치료 등을 적극적으로 하여도 약 70% 환자에서 재발하며, 5년 생존율은 20% 정도에 불과하여 가장 치료가 안되는 종양이다. 즉, 췌장암은 전체 환자 중 약 5~8%만이 완치가 가능하고 나머지 90%이상의 환자는 현재의 치료 방법인 수술 및 항암치료에 모두 불응성인 종양이므로, 이에 대한 기전 연구 및 그를 이용한 선택적 치료를 통한 췌장암 극복의 노력이 절실하다.
전통적으로, 췌장암에는 5-fluouracil(5-FU) 또는 겜시타빈(gemcitabne)을 기반으로 하는 항암 화학 치료를 시행하지만 반응율이 낮고, 아직까지는 일관되게 뚜렷한 효과를 보이는 항암제가 없으며, 기존의 임상적인 진단 방법인 영상학적, 병리적 검사 등으로는 치료 반응성/저항성, 조기 재발 가능성 및 예후를 예측할 수 없으므로, 췌장암을 생물학적 기전에 따라 분류하고, 그에 따른 적절한 치료 및 예후 예측을 할 수 있는 새로운 접근 방법이 필수적이다.
최근 다양한 암 질환에 대한 유전단백체 연구 결과에 따라, 유전체 데이터보다는 유전단백체 통합데이터가 보다 정밀한 암 아형 정보를 제공하며, 분류된 각 아형별 암 발병기전에 대한 보다 완전한 정보를 제공하고 있다. 따라서, 췌장암 역시 유전단백체 데이터 기반 아형별 발병기전에 근거한 췌장암 아형 판별 기술로 췌장암 환자의 아형을 판별함으로써, 향후 아형별 맞춤형 치료제 개발에 따른 아형별 최적 치료가 가능한 췌장암 정밀 의료 기술 개발이 가능해질 것이다. 예를 들어, 특허문헌 1 에는 TPI1, GAPDH, ENO1, LDHA, 및 PGK1 등을 이용하여 췌장암의 아형을 4종으로 구분한 췌장 종양의 아형을 결정하기 위한 방법이 게시되어 있다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
(특허문헌 0001) 국제공개공보 2020-205993 호 (2020.10.08.)
본 발명은 계층화된 췌장관 선암의 아형정보를 이용하여 환자의 췌장관 선암 아형을 판별하는 방법 및 아형 판별키트를 제공하고자 한다.
본 발명의 일 실시형태는 하기 (1) 내지 (4)의 단계를 포함하는 췌장관 선암 아형 판별방법을 제공한다.
(1) 췌장관 선암 환자로부터 분리된 췌장관 선암 병변 조직을 파쇄하는 단계;
(2) 상기 병변 조직으로부터 단백질을 추출하고 소화하여 환자별 펩티드 시료를 얻는 단계;
(3) 상기 추출된 환자별 펩티드 시료로부터 췌장관 선암 아형 1 내지 6의 대표유전자 발현 수준을 측정하는 단계로서, 상기 췌장관 선암 아형 1 내지 6의 대표유전자는 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상이며;
아형 1(Sub1) 대표유전자: CLDN18, EPS8L3, CAPN5, GMDS, BCAS1, IDH1, DDAH1, SOD1, VIL1, GPX2, AOC1, LGALS4, MICU2, POF1B, MICU1, PLS1, 및 BDH1
아형 2(Sub2) 대표유전자: UNC5B, PPP1R3G, IGFBP3, EDIL3, CLSTN1, COL11A1, P4HA1, PDLIM4, ST5, FSTL1, PPP1R13L, PLTP, PDLIM7, 및 CALU
아형 3(Sub3) 대표유전자: MYH9, FLNA, P4HA2, LOXL2, FN1, CD55, FLT1, ECM1, CCDC80, TSKU, HTRA1, COL12A1, SPON2, 및 ANGPTL2
아형 4(Sub4) 대표유전자: PLEC, LPGAT1, NRDC, PRPF40A, CSDE1, IPO7, CDK1, HMGA1, DDX5, RASA1, ADSS, GMPS, CSE1L, PSME3, CAPRIN1, 및 BZW1
아형 5(Sub5) 대표유전자: HSPB6, HSPA12A, ANXA6, VIM, UCHL1, PRPH, MAP1B, CD81, ANK2, AKAP12, ITSN1, RTN1, COL28A1, KCTD12, SPON1, SYNPO2, 및 EPB41L3
아형 6(Sub6) 대표유전자: CTNND2, DTNA, REG1A, PRSS2, CPA1, CPB1, ACAT1, CPA2, PNLIPRP1, PRDX4, SNTB1, PDCD4, CTRC, FKBP11, 및 SEC11C
(4) 상기 췌장관 선암 아형 1 내지 6의 대표유전자 발현 수준을 비교하여, 췌장관 선암 환자의 아형을 판별하는 단계.
본 발명의 다른 실시형태는 췌장관 선암 아형을 판별하기 위한 키트를 제공한다. 상기 췌장관 선암 아형 판별 키트는 췌장관 선암 아형 1 내지 6의 대표유전자 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하고, 상기 췌장관 선암 아형 1 내지 6의 대표유전자는 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
아형 1(Sub1) 대표유전자: CLDN18, EPS8L3, CAPN5, GMDS, BCAS1, IDH1, DDAH1, SOD1, VIL1, GPX2, AOC1, LGALS4, MICU2, POF1B, MICU1, PLS1, 및 BDH1
아형 2(Sub2) 대표유전자: UNC5B, PPP1R3G, IGFBP3, EDIL3, CLSTN1, COL11A1, P4HA1, PDLIM4, ST5, FSTL1, PPP1R13L, PLTP, PDLIM7, 및 CALU
아형 3(Sub3) 대표유전자: MYH9, FLNA, P4HA2, LOXL2, FN1, CD55, FLT1, ECM1, CCDC80, TSKU, HTRA1, COL12A1, SPON2, 및 ANGPTL2
아형 4(Sub4) 대표유전자: PLEC, LPGAT1, NRDC, PRPF40A, CSDE1, IPO7, CDK1, HMGA1, DDX5, RASA1, ADSS, GMPS, CSE1L, PSME3, CAPRIN1, 및 BZW1
아형 5(Sub5) 대표유전자: HSPB6, HSPA12A, ANXA6, VIM, UCHL1, PRPH, MAP1B, CD81, ANK2, AKAP12, ITSN1, RTN1, COL28A1, KCTD12, SPON1, SYNPO2, 및 EPB41L3
아형 6(Sub6) 대표유전자: CTNND2, DTNA, REG1A, PRSS2, CPA1, CPB1, ACAT1, CPA2, PNLIPRP1, PRDX4, SNTB1, PDCD4, CTRC, FKBP11, 및 SEC11C
본 발명의 또 다른 실시형태는 하기 (1) 내지 (5)의 단계를 포함하는 췌장관 선암 환자의 예후예측방법을 제공한다.
(1) 췌장관 선암 환자로부터 분리된 췌장관 선암 병변 조직을 파쇄하는 단계;
(2) 상기 병변 조직으로부터 단백질을 추출하고 소화하여 환자별 펩티드 시료를 얻는 단계;
(3) 상기 추출된 환자별 펩티드 시료로부터 췌장관 선암 아형 1 내지 6의 대표유전자 발현 수준을 측정하는 단계로서, 상기 췌장관 선암 아형 1 내지 6의 대표유전자는 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상이며;
아형 1(Sub1) 대표유전자: CLDN18, EPS8L3, CAPN5, GMDS, BCAS1, IDH1, DDAH1, SOD1, VIL1, GPX2, AOC1, LGALS4, MICU2, POF1B, MICU1, PLS1, 및 BDH1
아형 2(Sub2) 대표유전자: UNC5B, PPP1R3G, IGFBP3, EDIL3, CLSTN1, COL11A1, P4HA1, PDLIM4, ST5, FSTL1, PPP1R13L, PLTP, PDLIM7, 및 CALU
아형 3(Sub3) 대표유전자: MYH9, FLNA, P4HA2, LOXL2, FN1, CD55, FLT1, ECM1, CCDC80, TSKU, HTRA1, COL12A1, SPON2, 및 ANGPTL2
아형 4(Sub4) 대표유전자: PLEC, LPGAT1, NRDC, PRPF40A, CSDE1, IPO7, CDK1, HMGA1, DDX5, RASA1, ADSS, GMPS, CSE1L, PSME3, CAPRIN1, 및 BZW1
아형 5(Sub5) 대표유전자: HSPB6, HSPA12A, ANXA6, VIM, UCHL1, PRPH, MAP1B, CD81, ANK2, AKAP12, ITSN1, RTN1, COL28A1, KCTD12, SPON1, SYNPO2, 및 EPB41L3
아형 6(Sub6) 대표유전자: CTNND2, DTNA, REG1A, PRSS2, CPA1, CPB1, ACAT1, CPA2, PNLIPRP1, PRDX4, SNTB1, PDCD4, CTRC, FKBP11, 및 SEC11C
(4) 상기 췌장관 선암 아형 1 내지 6의 대표유전자 발현 수준을 비교하여, 췌장관 선암 환자의 아형을 판별하는 단계; 및
(5) 상기 아형별 판별에 따라 예후를 예측하는 단계.
본 발명의 일 실시형태에 따른 유전단백체 분석은 PDAC에 대한 이해와 PDAC 환자의 계층화를 개선하고, 췌장관 선암 아형을 판별하여 췌장암 환자에 대한 치료를 개선할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면 PDAC의 유전단백체 분석에 따라 췌장관 선암 환자의 아형을 판별할 수 있다. 이는 향후 아형별 맞춤형 치료제 개발에 따른 아형별 최적 치료가 가능한 췌장암 정밀 의료기술을 가능하게 한다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면 췌장암 아형을 판별하여 예후를 예측할 수 있고, 아형에 맞는 맞춤형 신약개발이 가능하다.
도 1 및 도 2는 돌연변이-단백질 풍부 및 인산화 상관관계와 PDAC에서 세포사멸과 액틴 세포골격의 연관에 대한 것임.
도 1의 (A) 개별 환자의 메가베이스 당 돌연변이(상단), 환자 각각의 SMG 돌연변이 유형(중간 오른쪽); 환자의 각 유전자에 대한 돌연변이 빈도(왼쪽 가운데); 각 환자에 대한 임상 매개 변수(하단). (B) SMG의 체세포 돌연변이의 빈도 비교. 빨간색 라벨링은 본 코호트에서 다른 코호트에서보다 유의하게 더 높은 빈도(비례 테스트에 의해 p < 0.05)로 검출되는 유전자를 나타낸다. (C) KRAS, SMAD4 및 ARID1A에서 체세포 돌연변이를 지닌 종양에서 발현이 상향 조절된 인산화된 펩티드. 컬러 막대는 평균 강도에 비해 인산화된 펩티드 강도의 log2-fold-change의 기울기를 나타낸다. (D) 인산화 수준이 KRAS, SMAD4 및 ARID1A 에서의 체세포 돌연변이와 상관 관계가 있는 단백질 관련 세포 처리. 열 지도는 돌연변이-인산화 상관 관계가 확인되는 단백질에 의한 각 공정의 농축(enrichment)의 유의성을 보인다. 유의성은 -log10 (p)로 표시되고, 여기서 p는 농축에 대한 p 값이다. (E-G) 체세포 돌연변이와 TP53(E), RB1(F) 및 ATM(G)에서의 단백질 풍부 또는 인산화 수준과의 연관성. 막대 사탕(lollipop) 플롯은 유전자 구조(상단)에서 검출된 체세포 돌연변이(원) 및 인산화 부위(삼각형)를 보인다. 막대 사탕의 높이는 해당하는 돌연변이를 갖는 환자의 수를 나타내고, 색상은 돌연변이 유형을 나타낸다(A의 범례 참조). 샘플은 체세포 돌연변이를 기반으로 분류된다. 모든 환자에 걸쳐 평균 수준에 대해 정규화된 인산화된 펩티드 강도 또는 단백질 풍부는 막대 그래프로 표시된다(하단; 빨간색 및 파란색, 평균보다 높고 낮음, 각각). 풍부한 돌연변이 부위는 화살표로 표시된다. (H) EMT-관련 단백질과 KRAS, SMAD4 또는 ARID1A에서 강력한 돌연변이 인산화 상관 관계(주황색 노드) 간의 상호 작용을 설명하는 네트워크 모델. 회색 노드는 노드 간의 연결을 증가시키기 위해 경로에 추가되었지만, 유의한 돌연변이-인산화 상관 관계는 없는 분자를 나타낸다. 실선 화살표는 직접 활성화; 점선 화살표는 간접 활성화; 회색 선은 단백질-단백질 상호 작용; 두꺼운 선은 원형질막. (I) ARID1A에서 단백질 풍부 및 인산화 수준과 체세포 돌연변이의 연관.
도 2의 (A) PDAC의 유전단백체 분석을 위한 워크 플로우. 종양 조직과 혈액 샘플의 엑솜-시퀀싱 분석 및 종양 조직의 RNA-시퀀싱은 196 명의 환자로부터의 종양에 대해 수행된 반면 질량 분석-기반 단백질체 분석(글로벌 프로데옴 및 인산화프로테옴)은 150 명의 환자로부터의 종양에 대해 수행되었다. 종양 세포충실도의 분포는 196 개의 종양에 대해 표시되었다(왼쪽 하단). 15 % 초과의 세포충실도를 갖는 종양은 유전단백체 분석에 사용되었고, 19 % 초과의 세포충실도를 갖는 종양은 단백질체 분석에 사용되었다. (B) 글로벌 프로테옴 및 인산화프로테옴 데이터에서 확인된 비-중복 펩티드의 숫자. (C) mRNA 시퀀싱 및 프로테옴 데이터(글로벌 프로테옴 및 인산화프로테옴)에서 확인된 단백질-코딩 유전자의 수. 펩티드 및 단백질-코딩 유전자의 평균 수는 각각 (B) 및 (C)에 표시된다. (D) 엑솜-시퀀싱 데이터에서 확인된 돌연변이를 운반하는 단백질 서열 및 유전자를 변경하는 체세포 돌연변이의 수. (E) 본 코호트 및 TCGA(Cancer Genome Atlas Research Network. Electronic address and Cancer Genome Atlas Research, 2017), Bailey et al.(Bailey et al., 2016), Biankin et al.(Biankin et al., 2012), Witkiewicz et al.(Witkiewicz et al., 2015), 및 Waddell et al.(Waddell et al., 2015)의 이전 코호트에서 확인된 유의하게 돌연변이된 유전자(SMG) 간의 관계. (F-H) KMT2D (F), AHNAK2 (G) 및 FCGBP (H)에서 단백질 풍부 또는 인산화펩티드 수준과 체세포 돌연변이의 연관성. 각 유전자에 대해, 막대 사탕 플롯(상단)은 검출된 체세포 돌연변이(원) 및 인산화 부위(삼각형)를 보여준다. 막대 사탕의 높이는 해당 돌연변이를 갖는 환자의 수를 나타내고, 색상은 범례에 표시된 돌연변이 유형을 나타낸다. 단백질 풍부 또는 인산화된 펩티드의 강도는 막대 플롯에 보여지는 모든 환자들에 걸쳐 중앙값에 비례하여 정규화되었다(하단, 빨간색 및 파란색, 중앙값보다 더 높거나 중앙값보다 더 낮음). (I) 복제 수 변이(copy number variations)(CNV)와 mRNA(왼쪽) 및 단백질(오른쪽) 발현 수준 간의 상관 관계. 빨간색과 파란색은 각각 양 및 음의 상관 관계를 나타낸다. 열 지도의 대각선 및 비-대각선 요소는 CNV 와 mRNA 또는 단백질 발현 수준 사이의 시스 및 트랜스 상관 관계를 나타낸다. 염색체를 따라, 특이적으로 mRNA 또는 단백질 발현 수준 및 일반적으로 mRNA 및 단백질 발현 수준 모두와 상관 관계가 있는 CNV의 수는 파란색(상단)과 검은 색(하단) 막대로 각각 표시되었다.
도 3 및 도 4는 mRNA-단백질 풍부 상관관계와 새로운 종양 유전자 및 종양 억제제 후보에 대한 것임
도 3의 (A) 유의미한 (FDR <0.01) 및 유의미하지 않은 (FDR> 0.1) mRNA-단백질 상관 관계를 갖는 유전자에 대한 생존 차이(카이 제곱 통계값) 분포. p <0.01, Student's t-검정. 바이올린 플롯에서 선은 중앙값을 나타낸다. (B) 양성 및 음성 mRNA 생존 상관 관계를 나타내는 유전자로 표시되는 세포 과정. 각 과정의 농축 유의성은 -log10 (p) 로 표시된다, 여기서 p는 농축에 대한 p 값이다. 빨간색 점선: p = 0.05. (C) 종양 유전자 및 종양 억제제 후보의 선택. 유의미한(FDR <0.01) mRNA-단백질 상관 관계를 갖는 유전자 중, 12 종 종양 억제제 및 19 종 종양 유전자 후보는 4 개의 PDAC 코호트 모두에서 각각 유의한 양성(위험 비율 <1) 및 음성(위험 비율> 1) mRNA-생존 상관 관계로 식별되었다. 기준(그림 7D)에 따르면, 6 개의 종양 억제제와 4 개의 종양 유전자가 추가 연구를 위해 선택되었다. (D-E) 대조군 shRNA(shCtrl) 또는 녹다운을 유도하기 위해 종양 유전자 후보를 표적으로 하는 표시된 shRNA의 발현시 AsPC1 카운트 (D)(n ≥ 3/조건). 5 일차에 결정되는 세포 수 (E). (F-G) 표시된 shRNA로 형질 도입된 AsPC1 세포를 스크래치하여 유발된 상처 후 0 또는 48 시간에 측정된 상처 치유의 대표 이미지 (F) 및 정량화 (G) (n ≥ 2/조건). 상처 치유는 48 시간에 정량화되었다. (H-I) 표시된 종양 억제제 후보의 과발현 후 AsPC1 카운트 (H)(n ≥ 2/조건). 세포 수는 3 일(I)에 결정된다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. Dunnett의 사후 수정을 통한 분산(ANOVA)의 양방향 (D 및 H) 및 단방향 (E, G 및 I) 분석에 의해 *, p <0.05; **, p <0.01; ***, p <0.001; ****, p <0.0001.
도 4의 (A) 환자 전체에 걸친 개별 유전자의 mRNA 및 단백질 풍부의 Spearman 상관 계수 분포. 노란색과 파란색은 각각 양 및 음의 상관 관계를 나타낸다. (B) KEGG 경로와의 높고 낮은 mRNA-단백질 풍부 상관 관계를 갖는 유전자의 차별적 관련성. 각 KEGG 경로에 관련된 유전자는 노란색(양의 상관 관계) 및 파란색(음의 상관 관계) 막대에 의해 나타내진다. (C) 가장 높은 mRNA 발현 수준을 갖는 환자와 가장 낮은 mRNA 발현 수준을 갖는 환자의 상위 25 % 와 하위 25 % 간의 유의한(파란색) 및 유의하지 않은(빨간색) 생존 차이를 각각 가진 유전자에 대한 mRNA-단백질 상관 관계의 누적 밀도 분포. Kolmogorov-Smirnov 테스트에 의해 p <0.01. (D) 기능적 실험을 위한 종양 억제제 및 종양 유전자 후보 선택. 4개의 PDAC 코호트에서, 각각, 현저하게 양성(위험 비율 <1) 및 음성(위험 비율> 1) mRNA-생존 상관 관계를 갖는 종양 억제제(TS) 후보 12 개 및 종양 유전자 후보 19 개 중, 3 개 이상의 PDAC 코호트에서 바람직한 생존 곡선 패턴(빨간색과 파란색 선, 가장 높고 가장 낮은 mRNA 발현 수준을 갖는 환자의 상위 및 하위 25 %)을 갖는 후보가 선택되었으며, 결과적으로 10 개의 TS 및 16 개의 종양 유전자 후보가 생성된다. 그 중 이전에 췌장암에 보고된 적이 없는 9 개의 TS 와 7 개의 종양 유전자 후보가 선택되었다. 마지막으로, 그 중, AsPC1 세포에서 발현된 유전자(FPKM> 1)의 중앙값 발현(log2-FPKM = 3.11)보다 더 작고 더 큰 발현 수준을 갖는 7 개의 TS 및 5 개의 종양 유전자 후보. 그 중, IQGAP2는 그의 큰 유전자 크기로 인해, 기능적 실험에서 제외되었고, KRT19는 광범위한 기능에 대한 참여로 인해 제외되었다. AsPC1 세포의 mRNA 발현 프로파일은 Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE)(Ghandi et al.,2019)로부터 수득되었다. FPKM, 백만 당 전사체 킬로베이스 당 단편. (E) 녹다운 후 AsPC1 세포에서 정량적 RT-PCR 분석을 사용하여 측정된 종양 유전자 후보의 상대 mRNA 발현 수준. mRNA 수준은 GAPDH, 18s RNA 및 HPRT(조건 당 n = 3)에 의해 정규화되었고, 이어서 대조군 shRNA 형질 도입 세포(shCtrl)에 의한 표적 유전자 (예를 들어, shDCBLD2)의 결과 값으로 정규화되었다. Student's t-검정에 의한 **, p <0.01; ***, p <0.001. (F-G) 면역 블롯팅에서 얻은 대표 이미지(F) 및 과발현 후 AsPC1 세포에서 종양 억제제 후보의 상대적 단백질 수준(G). 표적 유전자의 단백질 수준은 α-액틴의 수준으로 정규화되었다.
도 5 및 도 6은 유전단백체 분석에 의한 PDAC 아형 재정의에 대한 것임.
도 5의 (A) TCGA, PACA AU 및 PACA-CA 코호트에서 mRNA 시그니처(rna1-3)에 의해 정의된 RNA1-3 클러스터. RNA1-3을 정의하는 rna1-3 은 각각 첫번째 열 지도에서 보여진다. ran1-3에서 mRNA의 수는 괄호 안에 표시된다. 각 코호트에 대해 열 지도는 rna1-3(왼쪽) 및 rna1-3와 관련이 없는 종양(오른쪽)을 기반으로 RNA1-3으로 분류된 종양을 보여준다. 아형 막대 플롯은 Moffitt et al.(Moffitt et al., 2015), Collisson et al.(Collisson et al., 2011), Bailey et al.(Bailey et al., 2016)에 의해 정의된 분자 시그니처에 의해 예측된 아형을 보여준다. (B) TCGA, PACA-AU 및 PACA-CA 코호트에서 RNA1-3 클러스터에 속하는 종양 환자의 진단 후 생존. (C-D) 글로벌 프로테옴 및 인산화프로테옴 데이터를 기반으로 Prot1-5(C) 및 Phos1-4(D)를 정의하는 단백질 시그니처(prot1-5 및 phos1-4). 단백질과 인산화펩티드의 수는 괄호 안에 표시된다. (E) mRNA, 단백질 및 인산화 데이터의 통합 클러스터링으로 식별되는 6 개의 아형(Sub1-6). 열 지도는 개별 데이터 유형의 클러스터링으로부터 식별된 해당 클러스터(행)에 대한 지시 벡터를 보여준다. 빨간색, 해당 클러스터에 속하는 개별 샘플의 멤버십; 상단의 색상 막대, Sub1-6; rna1-3에 의해 정의된 RNA1-3 클러스터. (F) Sub1-6에서 종양이 있는 환자의 생존 기간. (G) Sub1-6에서 SMG의 체세포 돌연변이 분포 및 각 환자에 대한 임상 매개 변수(하단). (H) Sub1-6의 종양에서 확인된 체세포 메가베이스 당 돌연변이 분포. 바이올린 플롯에서, 선은 중앙값을 나타낸다. Sidak의 사후 보정을 사용하는 단방향 ANOVA에 의해 *, p <0.05.
도 6의 (A) mRNA 시퀀싱 데이터의 클러스터링 결과. 개별 클러스터링 결과에서, 공표형(cophenetic) 상관 계수 플롯(왼쪽)은 어떻게 계수가 서로 다른 수의 클러스터(k = 2 ~ 6)로 다양해지는지 및 중간 절대 편차(MAD)의 다중 백분율(10-30 %)로 선택된 분자의 서로 다른 수는 언제 클러스터링에 사용되는지를 보여준다. 실루엣 너비(silhouette width) 점수 플롯(가운데)는 개별 유형의 데이터로부터 식별된 클러스터에서 양의 점수를 갖는 핵심 샘플을 보여준다. 열 지도(오른쪽)은 페어-와이즈 클러스터링(pair-wise clustering)으로부터 얻은 샘플 컨센서스(consensus)를 보여준다. 파란색에서 빨간색으로의 그라데이션은 결정된 클러스터 수(k = 3)로 100 번 클러스터링 시행하여 얻어진 클러스터링에서의 일치 비율을 나타낸다. 하단의 색상 막대는 클러스터에 속하는 샘플을 나타낸다: RNA1-3(A); Prot1-5(C); 및 Phos1-4(D). (B) RNA1-3에서 Moffitt et al.(Moffitt et al., 2015), Collisson et al.(Collisson et al., 2011), Bailey et al.(Bailey et al., 2016)에 의해 제공된 mRNA 시그니처 기반으로 정의된 아형의 비율(아형 범례 참조) 및 PDAC 코호트에서 상관 관계가 없는 종양이 표시되었다. (C-D) 프로테옴 데이터(C) 및 인산화프로테옴 데이터(D)의 글로벌 클러스터링 결과. (A)의 범례를 참조. 클러스터의 수 k는 단백질(C) 및 인산화 (D) 데이터에 대해 k = 5 및 4 로 각각 결정되었다.
도 7 및 도 8은 PDAC 아형과 별개의 세포 네트워크와의 연관에 관한 것임
도 7의 (A) Sub1-6을 정의하는 유전자(S1-G에서 S6-G)와 단백질(S1-P에서 S6-P)에 의해 표현되는 세포 과정. 열 지도는 Sub1-6을 정의하는 유전자 또는 단백질에 의한 세포 과정의 농축 유의성을 보여준다. 유의성은 -log10(p), 여기서 p는 농축에 대한 p 값으로 표시된다. (B-C) 면역-관련 과정(B, 상단), 췌장 분비(B, 하단)에 관련된 유전자 및 단백질과 Sub5-6(B) 및 Sub2-4(C)과 각각 관련된 RHOA 신호 간의 상호 작용을 보이는 네트워크 모델. 노드의 중심 및 경계 색상은 해당 유전자와 단백질이 Sub5-6(Sub5의 경우 녹색, Sub6의 경우 진한 녹색) 및 Sub2-4(Sub2의 경우 주황색, Sub3의 경우 빨간색, Sub4의 경우 진한 빨간색)의 시그니처로 선택되었는지 여부를 나타낸다. 노드의 원 P는 해당 아형을 정의하는 인산화된 펩티드를 나타낸다. 화살표, 활성화; 억제 기호, 억제; 실선 화살표, 직접 활성화; 점선 화살표, 간접 활성화; 회색 선, 단백질-단백질 상호 작용. (D) Sub1-6에서 종양 세포충실도의 분포. 세포충실도 중앙값은 빨간색 선으로 표시된다. (E) 배양된 Sub4(SNU3608) 및 Sub6(SNU3573) 종양에 대한 세포 수. 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. 전체 시간 범위에 대해 Sidak의 사후 보정을 사용한 양방향 ANOVA에 의해 ****; p <0.0001.
도 8은 Sub1-6을 정의하는 mRNA, 단백질 및 인산화 시그니처가 유전자 세트 농축 분석(GSEA)에 대한 것으로, 도 8의 (A) Sub6을 정의한 mRNA 및 단백질 시그니처를 어떻게 선택하고 GSEA를 위해 사용하는지가 예로 표시된다. 통합 클러스터링(왼쪽 상단)은 Sub6가 RNA3, Prot5 및 Phos4 클러스터에 의해 정의된다는 것을 보인다. 이 정보를 바탕으로, RNA3를 정의하는 416 개의 유전자(rna3)가 mRNA 시그니처(S6-G)로 선택되었고, 각각 Prot5 및 Phos5를 정의하는 945 개의 단백질(prot5) 및 1030 개의 인산화펩티드(phos4)는 단백질 시그니처(S6-P)로 선택되었다(오른쪽 하단 및 상단). 인산화펩티드를 phorphorylated 단백질로 맵핑하고, 그들을 945 개의 단백질(prot5)과 결합한 후, 생성된 단백질은 GSEA에 사용되었다. (B) TP53 또는 ARID1A의 체세포 돌연변이를 가지고 있으며 단백질 풍부 또는 상응하는 단백질-코딩 유전자의 인산화 수준을 변경시킨 종양의 아형 분포. 막대 플롯 아래의 열 지도 색상은 환자의 아형을 나타낸다. (C) 단백질이 풍부한 돌연변이가 있거나 없는, 또는 인산화된 펩티드의 강도가 환자에 결쳐 중앙값보다 높거나(양성) 낮은(음성) 환자의 수. 누적 막대 플롯의 색상은 환자의 아형을 나타낸다.
도 9 및 도 10은 친-종양형성의(pro-tumorigenic) PMN-MDSC의 T 세포 증식 억제에 관한 것임
도 9의 (A-B) Sub4(SNU3608) 및 Sub6(SNU3573) 종양에서 유래한 세포로 이식된 동소이식 PDAC 모델에서 시간 경과에 따른(A) 및 최종 포인트(B)에서 종양 부피 비교(n = 10/그룹). (C) SNU3608 및 SNU3573 종양에 침투하는 면역 세포 하위 집합의 수(n = 10/그룹). M-MDSC, 단핵구 MDSC. (D-E) 표시된 마커를 사용한 대표적인 FACS 데이터. 상자는 PMN-MDSC를 나타낸다. 위 첨자 H: 높음, L: 낮음. (F-G) CXCR2 및 CXCR4에 대한 발현 수준을 기반으로 정의된 PMN-MDSC의 표시된 그룹 네 가지의 백분율(F) 및 비율(G)(n = 8/그룹). (H) 높은 수준의 CXCR2 및 CXCR4을 나타내는 PMN-MDSC의 백분율. (I) PMN-MDSC 및 동소 이식 PDAC 모델 및 나이브 Balb/c 마우스 각각으로부터 단리된 T 세포의 공동 배양. CD8+ 및 CD4+ 에 대한 CFSE 분석을 위한 FACS 스킴이 보여진다. (J-M) CD8+(J) 및 CD4+ T 세포(L)용 CFSE 강도 분포. CFSE의 MFI는 결정된다(K 및 M; n = 3-4/그룹). Sidak의 사후 보정을 사용한 양방향 ANOVA(A, C 및 F) 및 Student's t-검정(B, H, K 및 M)에 의해 *, p <0.05; ***, p <0.001; ****, p <0.0001.
도 10의 (A) Sub1-6에 걸친 면역 세포 마커의 mRNA 및 단백질 발현 패턴. 열 지도는 Sub1-6에서 마커의 mRNA(왼쪽) 및 단백질(오른쪽) Z-점수를 보여준다. 각 아형에서, 각 마커에 대해, Z-점수는 Sub1-6에 걸친 발현 수준의 중앙값 및 표준 편차를 사용하는, 아형에서 중앙값 발현 수준을 자동-크기 조정하는 것을 통해 Sub1-6에서 계산되었다. (B) Sub1-6 에서의 T 세포(CD4 및 CD8A) 및 호중구 (CXCL1, CXCL8, 및 LCN2)를 위한 대표 마커의 발현 수준 분포. 바이올린 플롯에서 중앙선은 각 아형 마커의 중앙값 발현 수준을 나타낸다. (C) Balb/c-nu 마우스에서 Sub4(SNU3608) 및 Sub6(SNU3573) 종양으로부터 유래된 세포로 이식된 동소 이식 PDAC 모델의 개발을 위한 개략적 절차. (D) 8, 22 및 36 일에 찍은 SNU3608 및 SNU3573 종양의 대표 초음파 이미지. 점선 원은 종양을 나타낸다. (E) 42 일에 찍은 SNU3608 및 SNU3573 종양의 총 이미지. (F) 42 일에 측정된 SNU3608 및 SNU3573 종양의 무게 비교. Student's t-검정에 의해 p = 0.062. (G) 골수성 집단 및 케모카인 수용체에 대한 FACS 게이팅 방식. 등고선은 세포 밀도 분포를 보여준다. 실선은 개별 플롯에서 표시된 세포 집단을 나타낸다. 빨간색 화살표 머리는 FACS 게이팅의 흐름을 나타낸다. (H-J) 혈액(H), 비장(I) 및 골수(BM, J)에서 측정된 SNU3608 및 SNU3573 종양에서 표시된 면역 세포의 백분율. PMN-MDSC, 다형 핵 골수-유래 억제 세포; M-MDSC, 단핵구 MDSC. (K-N) SNU3608 및 SNU3573 종양(K)뿐 아니라, SNU3608 및 SNU3573 종양을 보유한 Balb/c-nu 마우스의 혈액(L), 비장(M), 및 BM(N)에서 측정된 CXCR2 및 CXCR4의 발현 수준에 따라 정의된, 4 개의 표시된 PMN-MDSC 그룹의 수 또는 백분율. n = 3 또는 4(나이브), 8 ~ 10(SNU3608 또는 SNU3573). Sidak의 사후 수정을 사용한 양방향 ANOVA에 의해 *, p <0.05; **, p <0.01; ****, p <0.0001.
도 11은 췌장관 선암 환자의 병변 조직으로부터 추출된 단백질과 아형 1 내지 6의 대표유전자의 안정동위원소 표지펩티드의 혼합물에 대한 MRM-MS 분석 수행에 대한 모식도이다.
도 12는 환자 시료와 아형별 대표 펩티드간의 MRM 신호 세기 및 등고선 지도이다.
도 13은 췌장암 조직 파쇄 과정과 초고압 압력순환기술을 적용한 췌장암 시료 처리방법을 나타내는 것이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 구현예 및 실시예에 한정되지 않는다.
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 개시 형태로 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로서 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 단계, 동작, 구성요소, 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 단계, 동작, 구성요소, 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
본 발명은 췌장관 선암 아형판별 방법 및 아형판별 키트에 관한 것이다.
본 발명의 목표는 췌장관 선암(Pancreatic Ductal Adenocarcinoma, PDAC) 환자 계층화를 개선하고, 잠재적인 치료 표적 또는 치명적 질병인 췌장암에 대한 환자 관리를 개선하기 위한 진단 마커를 식별하는 것이다.
본 발명은 단백질 및 게놈 데이터가 상호 보완적이라는 것을 보여준다. 인산화 데이터의 가용성은 췌장관 선암(Pancreatic Ductal Adenocarcinoma, PDAC)에서 돌연변이 및 신호 경로 사이의 연관성을 시사하는, SMG의 체세포 돌연변이와 상관 관계가 있는 활동을 갖는 신호 경로에 대한 정보를 제공한다.
PDAC에서 종양 유전자 및 종양 억제제 후보를 선별하기 위하여, mRNA-단백질 풍부 상관 관계를 사용했다. 또한 PDAC 아형을 보다 정확하게 정의하기 위하여, 단백질 풍부 및 인산화 데이터는 mRNA 풍부와 결합되었다. PDAC 아형을 정의하는 mRNA 및 단백질 시그니처의 GSEA 및 네트워크 분석은 아형의 특성을 밝혀낸다. 게놈, mRNA, 및 단백질 데이터의 효과적인 통합을 통한 유전단백체 분석은 PDAC 병인을 밝히고, PDAC 환자를 계층화하고 잠재적으로 치료 표적을 식별할 수 있게 도울 수 있는 유용한 정보를 제공한다.
본 발명은 췌장관 선암 병변 조직 샘플에 대한 mRNA 발현 데이터를 글로벌 단백체 데이터 및 인산화 단백체 데이터와 결합하여 PDAC 샘플에 대한 유전단백체(proteogenomic) 분석을 수행하였고, 이에 따라 하기 췌장관 선암 전아형 대표 유전자, 6개의 췌장관 선암 아형 및 각 아형의 대표유전자를 판별하였다.
아형 1(Sub1) 대표유전자: CLDN18, EPS8L3, CAPN5, GMDS, BCAS1, IDH1, DDAH1, SOD1, VIL1, GPX2, AOC1, LGALS4, MICU2, POF1B, MICU1, PLS1, BDH1
아형 2(Sub2) 대표유전자: UNC5B, PPP1R3G, IGFBP3, EDIL3, CLSTN1, COL11A1, P4HA1, PDLIM4, ST5, FSTL1, PPP1R13L, PLTP, PDLIM7, CALU
아형 3(Sub3) 대표유전자: MYH9, FLNA, P4HA2, LOXL2, FN1, CD55, FLT1, ECM1, CCDC80, TSKU, HTRA1, COL12A1, SPON2, ANGPTL2
아형 4(Sub4) 대표유전자: PLEC, LPGAT1, NRDC, PRPF40A, CSDE1, IPO7, CDK1, HMGA1, DDX5, RASA1, ADSS, GMPS, CSE1L, PSME3, CAPRIN1, BZW1
아형 5(Sub5) 대표유전자: HSPB6, HSPA12A, ANXA6, VIM, UCHL1, PRPH, MAP1B, CD81, ANK2, AKAP12, ITSN1, RTN1, COL28A1, KCTD12, SPON1, SYNPO2, EPB41L3
아형 6(Sub6) 대표유전자: CTNND2, DTNA, REG1A, PRSS2, CPA1, CPB1, ACAT1, CPA2, PNLIPRP1, PRDX4, SNTB1, PDCD4, CTRC, FKBP11, SEC11C
췌장관 선암 전아형 대표유전자(All Sub): KRT19, RAB27B, QSOX1, VILL, GNPAT, ABCC3, GP2, ETHE1, BPNT1, AGR2, PIGR, SRC, CTSE, JUP, RPL7, TSPAN8, SRM, VDAC1, SCP2, RPS3, AK4, RPL9, RDX, RPL3, RPL13A, RPL5, RPS9, HK2, RAB25, GNG2, RPL15, RPL37, RPS7, RPL8, RPL18A, RPL6, PABPC4, INF2, SLC25A24, MYH14, GALNT7, GOLM1, MCU, GSDMB, CYP2S1, HTATIP2, SDCBP2, SYTL2, PREB, MYO6, PKP3, SNTB2, S100A11
본 발명의 일 실시형태에 따른 췌장관 선암 아형 판별방법은 하기 (1) 내지 (4) 단계를 포함할 수 있다.
(1) 췌장관 선암 환자로부터 분리된 췌장관 선암 병변 조직을 파쇄하는 단계;
(2) 상기 병변 조직으로부터 단백질을 추출하고 소화하여 환자별 펩티드 시료를 얻는 단계;
(3) 상기 환자별 펩티드 시료로부터 췌장관 선암 아형 1 내지 6의 대표유전자 발현 수준을 측정하는 단계로서, 상기 췌장관 선암 아형 1 내지 6의 대표유전자는 하기로 구성되는 군으로부터 선택되며;
아형 1(Sub1) 대표유전자: CLDN18, EPS8L3, CAPN5, GMDS, BCAS1, IDH1, DDAH1, SOD1, VIL1, GPX2, AOC1, LGALS4, MICU2, POF1B, MICU1, PLS1, BDH1
아형 2(Sub2) 대표유전자: UNC5B, PPP1R3G, IGFBP3, EDIL3, CLSTN1, COL11A1, P4HA1, PDLIM4, ST5, FSTL1, PPP1R13L, PLTP, PDLIM7, CALU
아형 3(Sub3) 대표유전자: MYH9, FLNA, P4HA2, LOXL2, FN1, CD55, FLT1, ECM1, CCDC80, TSKU, HTRA1, COL12A1, SPON2, ANGPTL2
아형 4(Sub4) 대표유전자: PLEC, LPGAT1, NRDC, PRPF40A, CSDE1, IPO7, CDK1, HMGA1, DDX5, RASA1, ADSS, GMPS, CSE1L, PSME3, CAPRIN1, BZW1
아형 5(Sub5) 대표유전자: HSPB6, HSPA12A, ANXA6, VIM, UCHL1, PRPH, MAP1B, CD81, ANK2, AKAP12, ITSN1, RTN1, COL28A1, KCTD12, SPON1, SYNPO2, EPB41L3
아형 6(Sub6) 대표유전자: CTNND2, DTNA, REG1A, PRSS2, CPA1, CPB1, ACAT1, CPA2, PNLIPRP1, PRDX4, SNTB1, PDCD4, CTRC, FKBP11, SEC11C
(4) 상기 췌장관 선암 아형 1 내지 6의 대표유전자 발현 수준을 비교하여, 췌장관 선암 환자의 아형을 판별하는 단계.
본 발명의 일 실시형태에 따르면 상기 아형 1 내지 6의 대표유전자 발현 수준은 췌장관 선암 전아형 대표유전자(All Sub)의 발현수준과 비교될 수 있다. 이에 따라 아형 판별의 신뢰성을 높일 수 있다. 보다 구체적으로 상기 아형 1 내지 6 및 하기 췌장관 선암 전아형을 서로 구분하는 데에 가장 기여가 큰 유전자의 발현 수준을 조합하여 비교할 수 있다.
상기 췌장관 선암 전아형 대표 유전자(All Sub)는 KRT19, RAB27B, QSOX1, VILL, GNPAT, ABCC3, GP2, ETHE1, BPNT1, AGR2, PIGR, SRC, CTSE, JUP, RPL7, TSPAN8, SRM, VDAC1, SCP2, RPS3, AK4, RPL9, RDX, RPL3, RPL13A, RPL5, RPS9, HK2, RAB25, GNG2, RPL15, RPL37, RPS7, RPL8, RPL18A, RPL6, PABPC4, INF2, SLC25A24, MYH14, GALNT7, GOLM1, MCU, GSDMB, CYP2S1, HTATIP2, SDCBP2, SYTL2, PREB, MYO6, PKP3, SNTB2, 및 S100A11로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면 상기 췌장관 선암 전아형 대표유전자 및 아형 1 내지 6의 대표유전자 발현 수준의 측정 및 비교는 췌장관 선암 전아형 대표유전자 및 각 아형별 유전자들을 대표하는 안정동위원소 표지펩티드 패널을 구축하는 단계; 상기 환자별 펩티드 시료와 상기 안정동위원소 표지펩티드 패널을 혼합하는 단계; 및 상기 혼합물을 정량 질량분석법(Quantitative Mass Spectrometry)으로 분석하여 췌장관 선암 환자의 아형을 판별하는 단계로 수행될 수 있다.
이에 제한되지 않으나, 상기 정량 질량분석법은 MRM-MS(Multiple Reaction monitoring-Mass Spectrometry), PRM-MS(Parallel Reaction Monitoring-Mass Spectrometry), DIA-MS (Data Independent Acquisition Mass Spectrometry) 등 일 수 있다.
도 11은 췌장관 선암 환자의 병변 조직으로부터 추출된 펩티드와 아형 1 내지 6의 대표유전자의 안정동위원소 표지펩티드 패널의 혼합물에 대한 MRM-MS 분석 수행에 대한 모식도이다.
삼중 사중극자 질량분석기(Triple Quadrupole, QQQ)를 이용한 다중반응검지법(MRM-MS, Multiple Reaction Monitoring/Mass Spectrometry)은 이온을 4개의 전극주로 구성되는 사중 양극에 유도하여 질량/전하 비율에 따라 분석하는 방식이다. 선정된 타겟 단백질들에 특이적인 질량/전하를 가지는 펩티드(Precursor ion, MS1)를 선택하고, 두번째 사중극자에서 이 펩티드를 충돌시켰을 때 발생하는 파편들 중에서 특징적인 질량/전하를 가지는 단편(Fragment ion, MS2)을 선택하는데 이 때 MS1, MS2에서 각각 얻어지는 precursor ion/fragment ion의 쌍을 타겟 단백질의 특이적 transition(타겟 단백질의 특이적 질량 지문)이라 한다. 이 모든 transition들을 모든 타겟 단백질(100~300개 단백질)에 대해서 다중반응검지법을 측정하면 정량정보를 알고 있는 동위원소로 치환된 동일 아미노산서열의 펩티드인 표준물질을 통해 시료에 있는 모든 타겟 단백질의 양을 동시에 상대 혹은 절대 정량을 짧은 시간내에 분석할 수 있다. 이러한 원리로 MRM-MS는 목적하는 분석 대상만을 높은 민감도로 선택적 검출 및 정량이 가능하며, 분석에 필요한 비용이 감소할 수 있다.
현재 단백질 정량 분석에 가장 많이 사용되는 대표적 방법은 ELISA 어세이와 같은 항체에 의존하는 방법으로, 이는 새로운 항체들을 찾고 분석 과정을 최적화시키는 과정에서 비용이 많이 들고 시간이 오래 걸린다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 MRM-MS 분석은 아형 대표펩티드 대비 환자 유래 펩티드의 신호세기 비교를 통해 수행될 수 있으며, 상기 신호세기 비율은 펩티드와 펩티드 용출시간을 두 개의 축으로 한 펩티드별 신호세기 등고선 지도로 표현될 수 있다.
도 12는 환자 시료와 아형별 대표 펩티드간의 MRM 신호 세기 및 등고선 지도이다.
이와 같은 아형별 아형대표펩티드 세기 등고선 지도는 진단이 피병원에 내원하는 췌장암 환자의 내시경 조직에서 얻은 아형대표펩티드 세기 등고선 지도와 패턴 비교를 하는 데 이용될 수 있으며, 이에 따라 환자의 아형을 판정할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 단계 (1)의 췌장암 병변 조직 파쇄는 극저온에 의한 냉동 파쇄에 의할 수 있다. 상기 극저온에 의한 냉동 파쇄에 의하여 미세조직가루(fine tissue powder)를 얻을 수 있다.
극저온에 의한 냉동 파쇄는 종양 조직의 손실을 최소화하기 위한 최적의 조직시료 처리 기술이다. 이에 제한되지 않으나, 극저온은 액체질소온도(-196℃) 일 수 있다.
대규모의 췌장암 환자에 대한 아형 판별을 수행하기 위해서는 아형 대표 펩티드와 혼합될 환자 조직유래의 펩티드 시료가 빠르게 획득되어야 한다. 조직으로부터 펩티드를 획득하기 위한 첫번째 과정은 조직의 균질화 과정으로 극저온상태에서 1분 이내에 조직을 처리하여 조직의 변성을 최소화할 수 있다.
극저온에 의한 냉동파쇄는 조직이 분말 상태로 파쇄되는 과정 동안 외부로 노출되는 과정이 없기 때문에 시료의 손실이 발생하지 않아 극미량의 췌장암 환자 시료에도 최적화된 방법이다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 단계 (2)의 단백질 추출하고 소화하여 펩티드 시료를 얻는 단계는 압력순환기술에 의할 수 있다.
압력순환기술은 파쇄된 췌장암 조직 시료에 초고압(45,000psi)과 저압(~15psi)을 교차 적용하는 것으로, 이에 따라 보다 효과적으로 단백질을 추출하고 소화할 수 있다. 이에 따르면 조직으로부터 펩티드를 획득하는 시간이 3시간 이하일 수 있다. 이는 30시간이 소용되는 기존 방식과 비교하여 매우 빠르며, 동시에 16개의 조직시료를 적용할 수 있는 고효율 기법이다. 따라서 대규모 환자에 대한 아형 판별을 수행할 수 있다.
도 13은 췌장암 조직 파쇄 과정과 초고압 압력순환기술을 적용한 췌장암 시료 처리방법을 나타내는 것이다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 아형 2 내지 아형 4는 침습적 특성을 가지며, 상기 아형 5 및 아형 6은 면역원성을 가질 수 있다.
또한 상기 아형 4는 침습적 특성 및 증식성을 가지며, 낮은 T 세포 증식을 가질 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 아형 2 내지 아형 4는 상피 중간엽 전이(EMT)-관련 과정과 연관되어 있는 것일 수 있다.
또한 상기 아형 5 및 아형 6은 면역-관련 과정과 연관되어 있는 것일 수 있다.
상기 아형 1은 탄수화물/지질 대사에 관여하는 하는 것일 수 있다.
상기 PDAC 아형은 각 아형에 대한 mRNA/단백질 시그니처 및 세포 경로가 포함될 뿐 아니라, 항-염증성 면역 세포 프로파일도 포함한다. PDAC 환자는 그들 종양의 mRNA 및 단백질 시그니처에 기반한 아형 2-4 (불량한 예후 아형들) 또는 아형 1, 5, 6 (양호한 예후 아형들)로 분류하여 예후에 따라 추가 계층화할 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태는 췌장관 선암 아형을 판별할 수 있는 키트에 관한 것이다. 본 발명의 일 실시형태에 따른 췌장관 선암 아형 판별 키트는 췌장관 선암 아형 1 내지 6의 대표유전자 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하고, 상기 췌장관 선암 아형 1 내지 6의 대표유전자는 하기로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
아형 1(Sub1) 대표유전자: CLDN18, EPS8L3, CAPN5, GMDS, BCAS1, IDH1, DDAH1, SOD1, VIL1, GPX2, AOC1, LGALS4, MICU2, POF1B, MICU1, PLS1, BDH1
아형 2(Sub2) 대표유전자: UNC5B, PPP1R3G, IGFBP3, EDIL3, CLSTN1, COL11A1, P4HA1, PDLIM4, ST5, FSTL1, PPP1R13L, PLTP, PDLIM7, CALU
아형 3(Sub3) 대표유전자: MYH9, FLNA, P4HA2, LOXL2, FN1, CD55, FLT1, ECM1, CCDC80, TSKU, HTRA1, COL12A1, SPON2, ANGPTL2
아형 4(Sub4) 대표유전자: PLEC, LPGAT1, NRDC, PRPF40A, CSDE1, IPO7, CDK1, HMGA1, DDX5, RASA1, ADSS, GMPS, CSE1L, PSME3, CAPRIN1, BZW1
아형 5(Sub5) 대표유전자: HSPB6, HSPA12A, ANXA6, VIM, UCHL1, PRPH, MAP1B, CD81, ANK2, AKAP12, ITSN1, RTN1, COL28A1, KCTD12, SPON1, SYNPO2, EPB41L3
아형 6(Sub6) 대표유전자: CTNND2, DTNA, REG1A, PRSS2, CPA1, CPB1, ACAT1, CPA2, PNLIPRP1, PRDX4, SNTB1, PDCD4, CTRC, FKBP11, SEC11C
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 췌장관 선암 아형 판별키트는 췌장관 선암 전아형 대표유전자(All Sub)의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하고, 상기 아형 1 내지 6의 대표유전자 발현 수준은 췌장관 선암 대표유전자의 발현수준과 비교될 수 있다.
상기 췌장관 선암 전아형 대표 유전자(All Sub)는 KRT19, RAB27B, QSOX1, VILL, GNPAT, ABCC3, GP2, ETHE1, BPNT1, AGR2, PIGR, SRC, CTSE, JUP, RPL7, TSPAN8, SRM, VDAC1, SCP2, RPS3, AK4, RPL9, RDX, RPL3, RPL13A, RPL5, RPS9, HK2, RAB25, GNG2, RPL15, RPL37, RPS7, RPL8, RPL18A, RPL6, PABPC4, INF2, SLC25A24, MYH14, GALNT7, GOLM1, MCU, GSDMB, CYP2S1, HTATIP2, SDCBP2, SYTL2, PREB, MYO6, PKP3, SNTB2, 및 S100A11로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 상기 췌장관 선암 전아형 대표유전자 및 아형 1 내지 6의 대표유전자 발현 수준을 측정하는 제제는 췌장관 선암 전아형 대표유전자 및 각 아형별 유전자들을 대표하는 안정동위원소 표지 펩티드 패널을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 하기 (1) 내지 (5)의 단계를 포함하는 췌장관 선암 환자의 예후예측방법에 관한 것이다.
(1) 췌장관 선암 환자로부터 분리된 췌장관 선암 병변 조직을 파쇄하는 단계;
(2) 상기 병변 조직으로부터 단백질을 추출하고 소화하여 환자별 펩티드 시료를 얻는 단계;
(3) 상기 환자별 펩티드 시료로부터 췌장관 선암 아형 1 내지 6의 대표유전자 발현 수준을 측정하는 단계로서, 상기 췌장관 선암 아형 1 내지 6의 대표유전자는 하기로 구성되는 군으로부터 선택되며;
아형 1(Sub1) 대표유전자: CLDN18, EPS8L3, CAPN5, GMDS, BCAS1, IDH1, DDAH1, SOD1, VIL1, GPX2, AOC1, LGALS4, MICU2, POF1B, MICU1, PLS1, BDH1
아형 2(Sub2) 대표유전자: UNC5B, PPP1R3G, IGFBP3, EDIL3, CLSTN1, COL11A1, P4HA1, PDLIM4, ST5, FSTL1, PPP1R13L, PLTP, PDLIM7, CALU
아형 3(Sub3) 대표유전자: MYH9, FLNA, P4HA2, LOXL2, FN1, CD55, FLT1, ECM1, CCDC80, TSKU, HTRA1, COL12A1, SPON2, ANGPTL2
아형 4(Sub4) 대표유전자: PLEC, LPGAT1, NRDC, PRPF40A, CSDE1, IPO7, CDK1, HMGA1, DDX5, RASA1, ADSS, GMPS, CSE1L, PSME3, CAPRIN1, BZW1
아형 5(Sub5) 대표유전자: HSPB6, HSPA12A, ANXA6, VIM, UCHL1, PRPH, MAP1B, CD81, ANK2, AKAP12, ITSN1, RTN1, COL28A1, KCTD12, SPON1, SYNPO2, EPB41L3
아형 6(Sub6) 대표유전자: CTNND2, DTNA, REG1A, PRSS2, CPA1, CPB1, ACAT1, CPA2, PNLIPRP1, PRDX4, SNTB1, PDCD4, CTRC, FKBP11, SEC11C
(4) 상기 췌장관 선암 아형 1 내지 6의 대표유전자 발현 수준을 비교하여, 췌장관 선암 환자의 아형을 판별하는 단계; 및
(5) 상기 아형별 판별에 따라 예후를 예측하는 단계.
본 발명의 일 실시형태에 따르면 상기 아형 1 내지 6의 대표유전자 발현 수준은 췌장관 선암 전아형 대표유전자(All Sub)의 발현수준과 비교될 수 있다.
상기 췌장관 선암 전아형 대표유전자는 KRT19, RAB27B, QSOX1, VILL, GNPAT, ABCC3, GP2, ETHE1, BPNT1, AGR2, PIGR, SRC, CTSE, JUP, RPL7, TSPAN8, SRM, VDAC1, SCP2, RPS3, AK4, RPL9, RDX, RPL3, RPL13A, RPL5, RPS9, HK2, RAB25, GNG2, RPL15, RPL37, RPS7, RPL8, RPL18A, RPL6, PABPC4, INF2, SLC25A24, MYH14, GALNT7, GOLM1, MCU, GSDMB, CYP2S1, HTATIP2, SDCBP2, SYTL2, PREB, MYO6, PKP3, SNTB2, 및 S100A11로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면 상기 아형 2 내지 아형 4는 아형1, 아형 5 및 아형 6에 비하여 예후가 좋지 않은 것으로 예측될 수 있다.
또한, 치료 전략은 아형 및 관련 경로 및/또는 면역 세포 프로필에 기반하여 채용될 수 있다. 예를 들면, Sub4는 높은 침습적 활동 및 T 세포 활성을 감소시켜 종양 세포 증식에 기여하는 증가된 PMN-MDSC를 보인다. 이러한 패턴은 침습성 및 PMN-MDSC 은 모두 Sub4 종양을 치료할 때, 침습-관련 RHOA 및/또는 TGFB 신호 및 프로-종양 형성 PMN-MDSC를 한 번에 표적화함으로써, 다루어져야 함을 시사한다. 흥미롭게도, PDAC 코호트는 선포(acinar) 세포 암종을 포함하지 않음에도 불구하고, Sub6 은 낮은 세포충실도를 갖고 일부 내분비 특성을 갖는다. 낮은 세포충실도 종양에서, 이러한 특성은 관 세포의 탈분화(Martens et al., 2019), 다량의 간질 세포(Bailey et al., 2016), 또는 선포 세포 오염(Puleo et al., 2018)으로 인해 발생한다고 시사되어진다. 유전단백체 시그니처는 내분비 특성이 있는, Sub6 로 분류된 낮은 세포충실도 종양에 적용된다. 그러나 그들이 또한 선포 세포 암종에 적용 가능한지 여부는 대규모 코호트에서 검사되어져야 할 것이다.
수 많은 면역 체크포인트 분자가 보고되었다(Kalbasi 및 Ribas, 2020; Wei et al., 2018). CEACAM1, PVR 및 PVRL2의 mRNA 발현 수준은 Sub5-6에서 보다 Sub2-4에서 더 높았지만, CD48, IGSF11, CD96, CD244 및 BTLA의 수준은 Sub5-6에서 더 높았다. 또한, CEACAM1, HMGB1 및 CD274는 모든 아형에 걸쳐 Sub4에서 가장 높은 mRNA 발현 수준을 나타냈다. mRNA 데이터와 일치하여, 더 높은 수준의 단백질 CEACAM1 및 PVR 이 Sub5-6 보다 Sub1-4에서 검출되었으며, CD274의 가장 높은 단백질 수준은 Sub4에서 감지되었다. CEACAM1, PVR 및 CD274는 T 세포, 및/또는 자연 살해(NK) 세포의 활성을 억제한다(Qin et al., 2019). 이러한 유형의 면역 억제는 PDAC를 포함한 다양한 암에서 관찰된다(Dong et al., 2002; Feig et al., 2013; Nishiwada et al., 2015). Sub5-6에서 밝혀진 면역 체크포인트는 단백질체(proteomic) 분석에 의해 검출되지 않는다. 또한, 주로 Pro-tumorigenic 호중구인 PMN-MDSC는 Sub4 종양에 높은 수준으로 침투하였다. PMN-MDSC 매개 면역 억제는 폐암에서(Huang et al., 2013), 결장암에서(Jung et al., 2017a; Jung et al., 2017b), 유방암에서(Alizadeh et al., 2014), 두부암(head cancer) 및 경부암(neck cancer)에서(Brandau et al., 2011), 신장암에서(Rodriguez et al., 2009) 및 위암에서(Wang et al.,2013)뿐 아니라 PDAC에서(Porembka et al., 2012) 보고되었다. 인간 혈액 atlas(Uhlen et al., 2019)에 따르면, CEACAM1, PVR 및 CD274는 면역 체크포인트 및 PMN-MDSC의 잠재적 연관성을 제안하는, PMN-MDSC에서 높은 수준으로 발현된다. 이러한 단백질이 Sub4 종양에서 항-종양 면역 결핍과 어떻게 연관되는지는 향후 상세한 기능 연구에서 조사할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
유전단백체 기반 PDAC 환자 아형 도출을 위해 먼저 mRNA 발현 데이터, 글로벌 프로테옴 데이터, 인산화프로테옴 데이터 각각을 사용하여 환자 종양 샘플들을 클러스터링하였으며, 이를 통해 각 데이터로부터 3개(RNA1-3), 5개 (Prot1-5), 5개 (Phos1-5)의 환자 클러스터를 확인하였다. 또한 각 환자 클러스터의 특성을 이해하기 위해 통계적 비교 분석을 통해 각 클러스터의 환자 샘플들에서 나머지 환자 샘플들에 비해 유의하게 높은 발현을 보이는 시그니처 유전자들 (rna1-3), 단백질들 (prot1-5), 인산화펩티드들(phos1-5)을 선정하였다. 마지막으로 150명 환자 샘플의 통합 클러스터링을 수행하여 최종적으로 6개의 아형 (Sub1-6)을 도출하였다.
도출된 각 아형과 연관이 있는 세포 프로세스를 결정하기 위해 먼저 각 아형에 대응되는 시그니처 유전자들 및 단백질들을 선택하였다. 이후 해당 유전자들 및 단백질들에 대한 기능농축분석을 통해 해당 세포 프로세스를 확인하였다. 이를 통해 Sub2-4는 공통적으로 상피 중간엽 전이(EMT) 관련 유전자들의 발현이 높은데, 그 중에서도 Sub2-3은 동일한 EMT 관련 단백질들의 발현이 높은 반면 Sub4는 세포주기 관련 단백질들의 발현이 높음을 확인하였다. Sub5-6의 경우 공통적으로 면역 관련 유전자들의 발현이 높은데, 그 중에서도 Sub5는 동일한 면역 관련 단백질들의 발현이 높은 반면 Sub6은 외분비 관련 단백질들의 발현이 높음을 확인하였다. 마지막으로, Sub1의 경우 고전적인 전구 PDAC 아형의 특징인 탄수화물/지질 대사 관련 유전자들 및 단백질들의 발현이 높음을 확인하였다.
이러한 6개의 환자 아형 구분을 위한 아형대표펩티드 도출을 위해 앞서 선정된 시그니처 단백질들 (prot1-5) 및 인산화펩티드들 (phos1-5)에 대해 Partial least squares (PLS) 분석을 수행하였다. 시그니처 단백질들의 경우 각 단백질에 대응되는 sibling 펩티드들로 변환한 후 PLS 분석을 수행하였다. PLS 분석을 통해 펩티드들의 150명 환자에서의 log2-fold-change 값을 이용해 150명 환자들이 특정 아형(Sub1-6)에 속하는지 여부 혹은 150명 환자의 전체 아형을 동시에 예측하는 모델을 생성하였다. 또한 개별 펩티드의 환자 아형 예측에 기여하는 정도를 variable importance in projection (VIP) 값으로 정량화하였다.
6개의 각 아형별 대표 인산화펩티드 도출을 위해 먼저 해당 아형에서 1) 시그니처로 동정되었고, 2) VIP 값이 1.5보다 크며, 3) VIP 값이 다른 아형에서의 VIP 값에 비해 크고, 4) 80% 이상의 환자에서 검출된 인산화펩티드들을 선정하였다. 전체 아형을 예측하는 대표 인산화펩티드의 경우 1) VIP 값이 1.5보다 크고, 2) 전체 환자의 80% 이상에서 검출된 인산화펩티드들을 선정하였다. 이후 이들 중 phosphorylation을 하나만 포함하며, MRM-MS 분석에 사용하기에 적합한 (펩티드의 길이, signal 펩티드 여부, missed cleavage 존재 여부 등을 고려) 펩티드들을 선별하였고, 최종적으로 16개의 인산화펩티드들을 도출하였다.
다음으로, 6개의 각 아형별 대표 글로벌 펩티드 도출을 위해 먼저 해당 아형에서 1) 시그니처로 동정되었고, 2) 80% 이상의 환자에서 검출된 단백질들을 선정하였다. 선정된 단백질의 sibling 펩티드들 중 해당 아형에서 1) VIP 값이 1.15보다 크고, 2) VIP 값이 다른 아형에서의 VIP 값에 비해 크며, 3) 80% 이상의 환자에서 검출된 펩티드들을 선정하였다. 전체 아형을 예측하는 대표 글로벌 펩티드의 경우 전체 환자의 80% 이상에서 검출된 단백질의 sibling 펩티드들 중 1) VIP 값이 1.15보다 크고, 2) 전체 환자의 80% 이상의 환자에서 검출된 펩티드들을 선정하였다. 이후 이들 중 MRM-MS 분석에 사용하기에 적합한 펩티드들을 각 시그니처 단백질 당 2개 이내로 선별하였고, 최종적으로 132개의 글로벌 펩티드들을 도출하였다.
위 과정을 통해 최종 도출된 16개의 인산화펩티드들, 132개의 글로벌 펩티드들에 아형 간 발현차를 보이는 KRAS 돌연변이 단백질 펩티드 2개를 추가하여 최종 150개의 아형대표 펩티드들을 도출하였다.
아형 1(Sub1) 대표유전자: CLDN18, EPS8L3, CAPN5, GMDS, BCAS1, IDH1, DDAH1, SOD1, VIL1, GPX2, AOC1, LGALS4, MICU2, POF1B, MICU1, PLS1, BDH1
아형 2(Sub2) 대표유전자: UNC5B, PPP1R3G, IGFBP3, EDIL3, CLSTN1, COL11A1, P4HA1, PDLIM4, ST5, FSTL1, PPP1R13L, PLTP, PDLIM7, CALU
아형 3(Sub3) 대표유전자: MYH9, FLNA, P4HA2, LOXL2, FN1, CD55, FLT1, ECM1, CCDC80, TSKU, HTRA1, COL12A1, SPON2, ANGPTL2
아형 4(Sub4) 대표유전자: PLEC, LPGAT1, NRDC, PRPF40A, CSDE1, IPO7, CDK1, HMGA1, DDX5, RASA1, ADSS, GMPS, CSE1L, PSME3, CAPRIN1, BZW1
아형 5(Sub5) 대표유전자: HSPB6, HSPA12A, ANXA6, VIM, UCHL1, PRPH, MAP1B, CD81, ANK2, AKAP12, ITSN1, RTN1, COL28A1, KCTD12, SPON1, SYNPO2, EPB41L3
아형 6(Sub6) 대표유전자: CTNND2, DTNA, REG1A, PRSS2, CPA1, CPB1, ACAT1, CPA2, PNLIPRP1, PRDX4, SNTB1, PDCD4, CTRC, FKBP11, SEC11C
췌장관 선암 전아형 대표유전자(All Sub): KRT19, RAB27B, QSOX1, VILL, GNPAT, ABCC3, GP2, ETHE1, BPNT1, AGR2, PIGR, SRC, CTSE, JUP, RPL7, TSPAN8, SRM, VDAC1, SCP2, RPS3, AK4, RPL9, RDX, RPL3, RPL13A, RPL5, RPS9, HK2, RAB25, GNG2, RPL15, RPL37, RPS7, RPL8, RPL18A, RPL6, PABPC4, INF2, SLC25A24, MYH14, GALNT7, GOLM1, MCU, GSDMB, CYP2S1, HTATIP2, SDCBP2, SYTL2, PREB, MYO6, PKP3, SNTB2, S100A11
도출된 150개의 아형 대표유전자 펩티드시료는 모두 혼합되어 아형대표펩티드 시료를 구성하였으며, 이는 췌장암 환자의 아형을 판별하기 위해 췌장암 환자 유래 펩티드 시료와 혼합한다. 이 때 췌장암 환자 유래 펩티드 시료를 획득하기 위해 압력순환기술 기반의 Barocycler 장비를 사용하였다. 우선 조직시료와 용해버퍼가 담겨있는 마이크로튜브에 45,000psi의 초고압과 15psi의 저압을 교차로 적용하여 효과적으로 세포벽을 붕괴한 후 단백질을 추출하였다. 이 후 단백질 소화를 수행하기 위해 소화효소인 Lys-C와 Trypsin을 추가하였으며, 20,000psi의 초고압과 15psi의 저압을 교차로 적용하여 전체적으로 3시간 이내에 16개의 췌장암 조직시료로부터 펩티드 시료를 획득하였다. 그 다음으로 획득한 췌장암 환자의 펩티드 시료는 C18 스핀컬럼 기반의 탈염과정을 수행한 후 BCA 정량을 통해 최종적으로 정량정보를 포함하는 췌장암 환자 유래 펩티드 시료를 획득하였다.
다음으로 췌장암 환자의 아형을 판별하기 위해 환자 유래 펩티드 시료와 150개의 아형 대표유전자 정보를 포함하는 아형대표펩티드 시료와 혼합하여 아형판별펩티드 시료를 구성하였으며, 각 펩티드별 재현성 있고 안정적으로 MRM 분석이 가능한 Top-3 transition으로 charge state +2, +3가에 대한 y-ion을 선정하였다.
전체 150개 아형 대표 펩티드의 아형 정보, 유전자 심볼, 단백질명칭은 다음 표 1과 같다.
아형정보 유전자심볼 단백질명칭
Sub1 CLDN18 claudin 18
Sub1 EPS8L3 phosphatase and actin regulator 2
Sub1 CAPN5 calpain 5
Sub1 GMDS GDP-mannose 4,6-dehydratase
Sub1 BCAS1 breast carcinoma amplified sequence 1
Sub1 IDH1 Isocitrate dehydrogenase [NADP]
Sub1 DDAH1 dimethylarginine dimethylaminohydrolase 1
Sub1 SOD1 superoxide dismutase 1
Sub1 VIL1 villin 1
Sub1 GPX2 glutathione peroxidase 2
Sub1 AOC1 amine oxidase, copper containing 1
Sub1 LGALS4 galectin 4
Sub1 MICU2 mitochondrial calcium uptake 2
Sub1 POF1B premature ovarian failure, 1B
Sub1 MICU1 mitochondrial calcium uptake 1
Sub1 PLS1 plastin 1
Sub1 BDH1 3-hydroxybutyrate dehydrogenase 1
Sub2 UNC5B unc-5 netrin receptor B
Sub2 PPP1R3G protein phosphatase 1 regulatory subunit 3G
Sub2 IGFBP3 insulin like growth factor binding protein 3
Sub2 EDIL3 EGF like repeats and discoidin domains 3
Sub2 CLSTN1 Calsyntenin-1
Sub2 COL11A1 collagen type XI alpha 1 chain
Sub2 P4HA1 prolyl 4-hydroxylase subunit alpha 1
Sub2 PDLIM4 PDZ and LIM domain 4
Sub2 ST5 DENN domain-containing protein 2B
Sub2 FSTL1 Follistatin-related protein 1
Sub2 PPP1R13L RelA-associated inhibitor
Sub2 PLTP phospholipid transfer protein
Sub2 PDLIM7 PDZ and LIM domain protein 7
Sub2 CALU Calumenin
Sub3 MYH9 myosin heavy chain 9
Sub3 FLNA Filamin-A
Sub3 P4HA2 prolyl 4-hydroxylase subunit alpha 2
Sub3 LOXL2 lysyl oxidase like 2
Sub3 FN1 fibronectin 1
Sub3 CD55 CD55 molecule (Cromer blood group)
Sub3 FLT1 fms related tyrosine kinase 1
Sub3 ECM1 extracellular matrix protein 1
Sub3 CCDC80 coiled-coil domain containing 80
Sub3 TSKU tsukushi, small leucine rich proteoglycan
Sub3 HTRA1 HtrA serine peptidase 1
Sub3 COL12A1 collagen type XII alpha 1 chain
Sub3 SPON2 spondin 2
Sub3 ANGPTL2 angiopoietin like 2
Sub4 PLEC Plectin
Sub4 LPGAT1 Acyl-CoA:lysophosphatidylglycerol acyltransferase 1
Sub4 NRDC Nardilysin
Sub4 PRPF40A Pre-mRNA-processing factor 40 homolog A
Sub4 CSDE1 Cold shock domain-containing protein E1
Sub4 IPO7 Importin-7
Sub4 CDK1 cyclin dependent kinase 1
Sub4 HMGA1 high mobility group AT-hook 1
Sub4 DDX5 Probable ATP-dependent RNA helicase DDX5
Sub4 RASA1 Ras GTPase-activating protein 1
Sub4 ADSS Adenylosuccinate synthetase isozyme 2
Sub4 GMPS GMP synthase [glutamine-hydrolyzing]
Sub4 CSE1L Exportin-2
Sub4 PSME3 proteasome activator subunit 3
Sub4 CAPRIN1 Caprin-1
Sub4 BZW1 Basic leucine zipper and W2 domain-containing protein 1
Sub5 HSPB6 heat shock protein family B (small) member 6
Sub5 HSPA12A heat shock protein family A (Hsp70) member 12A
Sub5 ANXA6 Annexin A6
Sub5 VIM Vimentin
Sub5 UCHL1 ubiquitin C-terminal hydrolase L1
Sub5 PRPH peripherin
Sub5 MAP1B Microtubule-associated protein 1B
Sub5 CD81 CD81 molecule
Sub5 ANK2 ankyrin 2
Sub5 AKAP12 A-kinase anchoring protein 12
Sub5 ITSN1 Intersectin-1
Sub5 RTN1 Reticulon-1
Sub5 COL28A1 collagen type XXVIII alpha 1 chain
Sub5 KCTD12 BTB/POZ domain-containing protein KCTD12
Sub5 SPON1 spondin 1
Sub5 SYNPO2 synaptopodin 2
Sub5 EPB41L3 erythrocyte membrane protein band 4.1 like 3
Sub5 AKAP12 A-kinase anchoring protein 12
Sub6 CTNND2 catenin delta 2
Sub6 DTNA dystrobrevin alpha
Sub6 REG1A regenerating family member 1 alpha
Sub6 PRSS2 protease, serine 2
Sub6 CPA1 carboxypeptidase A1
Sub6 CPB1 carboxypeptidase B1
Sub6 ACAT1 acetyl-CoA acetyltransferase 1
Sub6 CPA2 carboxypeptidase A2
Sub6 PNLIPRP1 pancreatic lipase related protein 1
Sub6 PRDX4 peroxiredoxin 4
Sub6 SNTB1 syntrophin beta 1
Sub6 PDCD4 programmed cell death 4
Sub6 CTRC chymotrypsin C
Sub6 FKBP11 FK506 binding protein 11
Sub6 SEC11C SEC11 homolog C, signal peptidase complex subunit
Sub6 CPA1 carboxypeptidase A1
All Sub KRT19 Keratin, type I cytoskeletal 19
All Sub RAB27B RAB27B, member RAS oncogene family
All Sub QSOX1 quiescin sulfhydryl oxidase 1
All Sub VILL villin like
All Sub GNPAT Dihydroxyacetone phosphate acyltransferase
All Sub ABCC3 ATP binding cassette subfamily C member 3
All Sub GP2 glycoprotein 2
All Sub ETHE1 Persulfide dioxygenase ETHE1, mitochondrial
All Sub BPNT1 3'(2'),5'-bisphosphate nucleotidase 1
All Sub AGR2 anterior gradient 2, protein disulphide isomerase family member
All Sub PIGR polymeric immunoglobulin receptor
All Sub SRC SRC proto-oncogene, non-receptor tyrosine kinase
All Sub CTSE cathepsin E
All Sub JUP Junction plakoglobin
All Sub RPL7 ribosomal protein L7
All Sub TSPAN8 tetraspanin 8
All Sub SRM spermidine synthase
All Sub VDAC1 Voltage-dependent anion-selective channel protein 1
All Sub SCP2 sterol carrier protein 2
All Sub RPS3 ribosomal protein S3
All Sub AK4 adenylate kinase 4
All Sub RPL9 60S ribosomal protein L9
All Sub RDX Radixin
All Sub RPL3 ribosomal protein L3
All Sub RPL13A ribosomal protein L13a
All Sub RPL5 ribosomal protein L5
All Sub RPS9 ribosomal protein S9
All Sub HK2 hexokinase 2
All Sub RAB25 RAB25, member RAS oncogene family
All Sub GNG2 Guanine nucleotide-binding protein G(I)/G(S)/G(O) subunit gamma-2
All Sub RPL15 ribosomal protein L15
All Sub RPL37 ribosomal protein L37
All Sub RPS7 40S ribosomal protein S7
All Sub RPL8 ribosomal protein L8
All Sub RPL18A 60S ribosomal protein L18a
All Sub RPL6 ribosomal protein L6
All Sub PABPC4 poly(A) binding protein cytoplasmic 4
All Sub INF2 Inverted formin-2
All Sub SLC25A24 Calcium-binding mitochondrial carrier protein SCaMC-1
All Sub MYH14 Myosin-14
All Sub GALNT7 polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase 7
All Sub GOLM1 Golgi membrane protein 1
All Sub MCU Calcium uniporter protein, mitochondrial
All Sub GSDMB gasdermin B
All Sub CYP2S1 Cytochrome P450 2S1
All Sub HTATIP2 Oxidoreductase HTATIP2
All Sub SDCBP2 syndecan binding protein 2
All Sub SYTL2 synaptotagmin like 2
All Sub PREB Prolactin regulatory element-binding protein
All Sub MYO6 Unconventional myosin-VI
All Sub PKP3 plakophilin 3
All Sub SNTB2 syntrophin beta 2
All Sub S100A11 S100 calcium binding protein A11
Mutation KRAS GTPase KRas
Mutation KRAS GTPase KRas

Claims (14)

  1. 하기 (1) 내지 (4)의 단계를 포함하는 췌장관 선암 아형 판별방법:
    (1) 췌장관 선암 환자로부터 분리된 췌장관 선암 병변 조직을 파쇄하는 단계;
    (2) 상기 병변 조직으로부터 단백질을 추출하고 소화하여 환자별 펩티드 시료를 얻는 단계;
    (3) 상기 환자별 펩티드 시료로부터 췌장관 선암 아형 1 내지 6의 대표유전자 발현 수준을 측정하는 단계로서, 상기 췌장관 선암 아형 1 내지 6의 대표유전자는 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상이며;
    아형 1(Sub1) 대표유전자: CLDN18, EPS8L3, CAPN5, GMDS, BCAS1, IDH1, DDAH1, SOD1, VIL1, GPX2, AOC1, LGALS4, MICU2, POF1B, MICU1, PLS1, 및 BDH1
    아형 2(Sub2) 대표유전자: UNC5B, PPP1R3G, IGFBP3, EDIL3, CLSTN1, COL11A1, P4HA1, PDLIM4, ST5, FSTL1, PPP1R13L, PLTP, PDLIM7, 및 CALU
    아형 3(Sub3) 대표유전자: MYH9, FLNA, P4HA2, LOXL2, FN1, CD55, FLT1, ECM1, CCDC80, TSKU, HTRA1, COL12A1, SPON2, 및 ANGPTL2
    아형 4(Sub4) 대표유전자: PLEC, LPGAT1, NRDC, PRPF40A, CSDE1, IPO7, CDK1, HMGA1, DDX5, RASA1, ADSS, GMPS, CSE1L, PSME3, CAPRIN1, 및 BZW1
    아형 5(Sub5) 대표유전자: HSPB6, HSPA12A, ANXA6, VIM, UCHL1, PRPH, MAP1B, CD81, ANK2, AKAP12, ITSN1, RTN1, COL28A1, KCTD12, SPON1, SYNPO2, 및 EPB41L3
    아형 6(Sub6) 대표유전자: CTNND2, DTNA, REG1A, PRSS2, CPA1, CPB1, ACAT1, CPA2, PNLIPRP1, PRDX4, SNTB1, PDCD4, CTRC, FKBP11, 및 SEC11C
    (4) 상기 췌장관 선암 아형 1 내지 6의 대표유전자 발현 수준을 비교하여, 췌장관 선암 환자의 아형을 판별하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 아형 1 내지 6의 대표유전자의 발현 수준의 비교는 상기 아형 1 내지 6 및 하기 췌장관 선암 전아형을 서로 구분하는 데에 가장 기여가 큰 유전자의 발현 수준을 조합하여 비교하는 췌장관 선암 아형 판별방법.
    췌장관 선암 전아형 대표유전자(All Sub): KRT19, RAB27B, QSOX1, VILL, GNPAT, ABCC3, GP2, ETHE1, BPNT1, AGR2, PIGR, SRC, CTSE, JUP, RPL7, TSPAN8, SRM, VDAC1, SCP2, RPS3, AK4, RPL9, RDX, RPL3, RPL13A, RPL5, RPS9, HK2, RAB25, GNG2, RPL15, RPL37, RPS7, RPL8, RPL18A, RPL6, PABPC4, INF2, SLC25A24, MYH14, GALNT7, GOLM1, MCU, GSDMB, CYP2S1, HTATIP2, SDCBP2, SYTL2, PREB, MYO6, PKP3, SNTB2, 및 S100A11
  3. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (1)의 췌장암 병변 조직 파쇄는 극저온 냉동파쇄에 의한 것인 췌장관 선암 아형 판별방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (2)의 단백질 추출은 압력순환기술에 의한 것인 췌장관 선암 아형 판별방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (3)의 췌장관 선암 아형 1 내지 6의 대표유전자는 췌장관 선암 병변 조직 샘플에 대한 mRNA 데이터 및, 글로벌 단백체 데이터 및 인산화 단백체 데이터를 결합한 유전단백체 분석으로 식별된 것인 췌장관 선암 아형 판별방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 췌장관 선암 전아형 대표유전자 및 아형 1 내지 6의 대표유전자 발현 수준의 측정 및 비교는
    상기 췌장관 선암 전아형 대표유전자 및 각 아형별 유전자들을 대표하는 안정동위원소 표지펩티드 패널을 구축하는 단계;
    상기 환자별 펩티드시료와 상기 안정동위원소 표지펩티드 패널을 혼합하는 단계; 및
    상기 혼합물을 정량 질량분석법(Quantitative Mass Spectrometry)으로 분석하여 췌장관 선암 환자의 아형을 판별하는 단계;
    를 포함하는 췌장관 선암 아형 판별방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 정량 질량분석법은 안정동위원소 표지펩티드 대비 환자 추출 펩티드의 신호세기 비교를 통해 수행되는 췌장관 선암 아형 판별방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 신호세기 비율은 펩티드와 펩티드 용출시간을 두 개의 축으로 한 펩티드별 신호세기 등고선 지도로 표현되는 췌장관 선암 아형 판별방법.
  9. 췌장관 선암 아형을 판별하기 위한 키트로서, 췌장관 선암 아형 1 내지 6의 대표유전자 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하고, 상기 췌장관 선암 아형 1 내지 6의 대표유전자는 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 췌장관 선암 아형 판별키트:
    아형 1(Sub1) 대표유전자: CLDN18, EPS8L3, CAPN5, GMDS, BCAS1, IDH1, DDAH1, SOD1, VIL1, GPX2, AOC1, LGALS4, MICU2, POF1B, MICU1, PLS1, 및 BDH1
    아형 2(Sub2) 대표유전자: UNC5B, PPP1R3G, IGFBP3, EDIL3, CLSTN1, COL11A1, P4HA1, PDLIM4, ST5, FSTL1, PPP1R13L, PLTP, PDLIM7, 및 CALU
    아형 3(Sub3) 대표유전자: MYH9, FLNA, P4HA2, LOXL2, FN1, CD55, FLT1, ECM1, CCDC80, TSKU, HTRA1, COL12A1, SPON2, 및 ANGPTL2
    아형 4(Sub4) 대표유전자: PLEC, LPGAT1, NRDC, PRPF40A, CSDE1, IPO7, CDK1, HMGA1, DDX5, RASA1, ADSS, GMPS, CSE1L, PSME3, CAPRIN1, 및 BZW1
    아형 5(Sub5) 대표유전자: HSPB6, HSPA12A, ANXA6, VIM, UCHL1, PRPH, MAP1B, CD81, ANK2, AKAP12, ITSN1, RTN1, COL28A1, KCTD12, SPON1, SYNPO2, 및 EPB41L3
    아형 6(Sub6) 대표유전자: CTNND2, DTNA, REG1A, PRSS2, CPA1, CPB1, ACAT1, CPA2, PNLIPRP1, PRDX4, SNTB1, PDCD4, CTRC, FKBP11, 및 SEC11C
  10. 제9항에 있어서,
    상기 췌장관 선암 아형 판별키트는 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 췌장관 선암 전아형 대표유전자의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하고, 상기 아형 1 내지 6의 대표유전자 발현 수준과 비교되는 것인 췌장관 선암 아형 판별키트.
    췌장관 선암 전아형 대표유전자(All Sub): KRT19, RAB27B, QSOX1, VILL, GNPAT, ABCC3, GP2, ETHE1, BPNT1, AGR2, PIGR, SRC, CTSE, JUP, RPL7, TSPAN8, SRM, VDAC1, SCP2, RPS3, AK4, RPL9, RDX, RPL3, RPL13A, RPL5, RPS9, HK2, RAB25, GNG2, RPL15, RPL37, RPS7, RPL8, RPL18A, RPL6, PABPC4, INF2, SLC25A24, MYH14, GALNT7, GOLM1, MCU, GSDMB, CYP2S1, HTATIP2, SDCBP2, SYTL2, PREB, MYO6, PKP3, SNTB2, 및 S100A11
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    상기 췌장관 선암 전아형 대표유전자 및 아형 1 내지 6의 대표유전자 발현 수준을 측정하는 제제는 췌장관 선암 전아형 대표유전자 및 각 아형별 유전자들을 대표하는 안정동위원소 표지펩티드 패널을 포함하는 췌장관 선암 아형 판별 키트.
  12. 하기 (1) 내지 (5)의 단계를 포함하는 췌장관 선암 환자의 예후예측방법:
    (1) 췌장관 선암 환자로부터 분리된 췌장관 선암 병변 조직을 파쇄하는 단계;
    (2) 상기 병변 조직으로부터 단백질을 추출하고 소화하여 환자별 펩티드시료를 얻는 단계;
    (3) 상기 환자별 펩티드 시료로부터 췌장관 선암 아형 1 내지 6의 대표유전자 발현 수준을 측정하는 단계로서, 상기 췌장관 선암 아형 1 내지 6의 대표유전자는 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상이며;
    아형 1(Sub1) 대표유전자: CLDN18, EPS8L3, CAPN5, GMDS, BCAS1, IDH1, DDAH1, SOD1, VIL1, GPX2, AOC1, LGALS4, MICU2, POF1B, MICU1, PLS1, 및 BDH1
    아형 2(Sub2) 대표유전자: UNC5B, PPP1R3G, IGFBP3, EDIL3, CLSTN1, COL11A1, P4HA1, PDLIM4, ST5, FSTL1, PPP1R13L, PLTP, PDLIM7, 및 CALU
    아형 3(Sub3) 대표유전자: MYH9, FLNA, P4HA2, LOXL2, FN1, CD55, FLT1, ECM1, CCDC80, TSKU, HTRA1, COL12A1, SPON2, 및 ANGPTL2
    아형 4(Sub4) 대표유전자: PLEC, LPGAT1, NRDC, PRPF40A, CSDE1, IPO7, CDK1, HMGA1, DDX5, RASA1, ADSS, GMPS, CSE1L, PSME3, CAPRIN1, 및 BZW1
    아형 5(Sub5) 대표유전자: HSPB6, HSPA12A, ANXA6, VIM, UCHL1, PRPH, MAP1B, CD81, ANK2, AKAP12, ITSN1, RTN1, COL28A1, KCTD12, SPON1, SYNPO2, 및 EPB41L3
    아형 6(Sub6) 대표유전자: CTNND2, DTNA, REG1A, PRSS2, CPA1, CPB1, ACAT1, CPA2, PNLIPRP1, PRDX4, SNTB1, PDCD4, CTRC, FKBP11, 및 SEC11C
    (4) 상기 췌장관 선암 아형 1 내지 6의 대표유전자 발현 수준을 비교하여, 췌장관 선암 환자의 아형을 판별하는 단계; 및
    (5) 상기 아형별 판별에 따라 예후를 예측하는 단계.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 아형 1 내지 6의 대표유전자 발현 수준은 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 췌장관 선암 전아형 대표유전자의 발현수준과 비교되는 것인 췌장관 선암 환자의 예후예측방법.
    췌장관 선암 전아형 대표유전자(All Sub): KRT19, RAB27B, QSOX1, VILL, GNPAT, ABCC3, GP2, ETHE1, BPNT1, AGR2, PIGR, SRC, CTSE, JUP, RPL7, TSPAN8, SRM, VDAC1, SCP2, RPS3, AK4, RPL9, RDX, RPL3, RPL13A, RPL5, RPS9, HK2, RAB25, GNG2, RPL15, RPL37, RPS7, RPL8, RPL18A, RPL6, PABPC4, INF2, SLC25A24, MYH14, GALNT7, GOLM1, MCU, GSDMB, CYP2S1, HTATIP2, SDCBP2, SYTL2, PREB, MYO6, PKP3, SNTB2, 및 S100A11
  14. 제12항에 있어서,
    상기 아형 2 내지 아형 4는 아형1, 아형 5 및 아형 6에 비하여 예후가 좋지 않은 것으로 예측되는 췌장관 선암 환자의 예후예측방법.
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