TW201942139A - 用於以腦為標靶之長效蛋白質接合物、其製備方法及包括該接合物之組成物 - Google Patents

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Abstract

本發明係有關一種以腦為標靶之長效接合物，其包含以腦為標靶之肽與生理活性物質，並有關一種包含該生理活性物質而具有改良的持續性與安定性之長效接合物，其可通過血腦障壁(BBB)且包含生理活性物質。本發明包含以腦為標靶之肽與生理活性物質之以腦為標靶之長效接合物可以通過血腦障壁，因此可以治療與腦疾病相關之疾病，此外，可以在活體內維持生理活性物質活性並增加其在血液中之半衰期。

Description

用於以腦為標靶之長效蛋白質接合物、其製備方法及包括該接合物之組成物
本發明係有關一種可以靶向腦之長效蛋白質接合物，及其製造方法。此外，本發明係有關一種以腦為標靶之新穎肽及其用途。
儘管不斷要求有效傳送醫療劑至腦部，但針對腦部之新藥劑之發展速度遠低於彼等針對身體其他部位之藥劑之發展。這種緩慢的進展主要歸因於大多數藥物無法通過形成血腦障壁(下文稱為BBB)之腦毛細血管壁滲入腦。BBB為由腦血管之內皮細胞與星細胞之間形成之緊密連結所建立之結構，而星細胞進一步強化此等緊密連結，其角色在於防止血中物質通過血管壁自由擴散進入腦實質。基於此理由，為了治療腦疾病所發展之許多藥物具有之問題在於其等無法順利通過BBB壁。幾乎100%大分子藥物及超過98%小分子藥物無法通過BBB。僅有極少數藥物，例如，具有高脂質溶解性且分子量為400至500道爾吞或更低之小分子藥物 確實可以通過BBB。此外，此等可以通過BBB之小分子中，僅少部份可以讓醫藥上顯著量通過BBB。
僅有一些腦疾病(如憂鬱症、情感疾患、慢性疼痛與癲癇)會對通過BBB之小分子藥物有反應。大多數腦疾病(如：阿茲海默氏症(Alzheimer’s disease)、中風/保護神經、腦與脊柱傷害、腦癌、腦部HIV感染、造成共濟失調之疾患、肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、亨丁頓氏症(Huntington disease)、影響腦部之幼年先天遺傳異常、帕金森氏症(Parkinson’s disease)、及多發性硬化對一般脂溶性小分子量藥物沒有反應。
目前，正在積極發展可以傳送藥物通過BBB之載劑。同時，雖然已知通過BBB且可以傳送藥物、siRNA等等之具有特定胺基酸序列之肽，然而，有關傳送具有特定結構之大型生理活性物質之可能性研究仍然遠低於期待(Kumar等人，Nature.2007,448：39-43)。此外，仍然需要發展及研究可以治療腦疾病之新穎及改良藥物，其中僅有極少數有效小分子藥物可以利用。
本發明之目的係提供一種以腦為標靶之長效接合物，其可以通過血腦障壁(BBB)，維持生理活性有效性，且包含可以延長生理活性物質半衰期之生物相容性物質。
明確言之，本發明一項目的係提供一種以腦為標靶之長效接合物，其中由生理活性物質與以腦為標靶之肽分別地獨立藉由肽連接子或非肽連接子連接免疫球蛋白Fc區。
更明確言之，本發明一項目的係提供一種以腦為標靶之長效接合物，其中由生理活性物質藉由相互結合性，連接已與免疫球蛋白Fc區融合之以腦為標靶之肽之免疫球蛋白Fc區。
本發明另一個目標係提供一種編碼以腦為標靶之長效接合物之多核苷酸；含其之表現載體；包含該多核苷酸或表現載體之宿主細胞；及包含上述至少一者之套組。
本發明再另一個目標係提供一種組成物，例如，醫藥組成物，其包含以腦為標靶之長效接合物。
本發明再另一個目標係提供一種以腦為標靶之長效接合物之用途，其係用於製備醫藥製劑。
本發明再另一個目標係提供一種製備以腦為標靶之長效接合物之方法。
本發明再另一個目標係提供一種以腦為標靶之肽；編碼該肽之多核苷酸；包含該多核苷酸之表現載體；包含該多核苷酸或含該多核苷酸之表現載體之宿主細胞；及包含上述至少一者之套組。
為了達成上述目的，本發明態樣提供一種以腦為標靶之長效接合物，其可以通過血腦障壁，維持生理活性有效性，且包含可以延長生理活性物質半衰期之生物相容性物質。
在一項明確實施例中，本發明係有關一種以腦為標靶之長效接合物，其中生理活性物質與以腦為標靶之肽分別地獨立藉由肽連接子或非肽連接子連接免疫球蛋白Fc區。
根據前述實施例之接合物中，接合物係其中生理活性物質已藉由相互結合性連接已與免疫球蛋白Fc區融合之以腦為標靶之肽之免疫球蛋白Fc區。
根據前述實施例中任一項之接合物中，該接合物係以下式1代表：[式1]X-L1-F-L2-Y
其中：X為生理活性物質；Y為以腦為標靶之肽(BTP)L1與L2為肽連接子或非肽連接子，其中當L1與L2為肽連接子時，肽連接子包含0至1,000個胺基酸；及F為包含FcRn-結合區之免疫球蛋白恆定區。
根據前述實施例中任一項之接合物中，F與免疫球蛋白Fc區可呈二聚體型。
根據前述實施例中任一項之以腦為標靶之長效接合物中，該長效接合物之特徵在於其可通過血腦障壁，及傳送生理活性物質進入腦組織。
根據前述實施例中任一項之以腦為標靶之長效接合物中，該以腦為標靶之肽包括肽、蛋白質、或抗體，且其中各肽、蛋白質、或抗體包含可以通過血腦障壁之胺基酸序列。
根據前述實施例中任一項之以腦為標靶之長效接合物中，該以腦為標靶之肽係透過被動轉運途徑或經由受體介導之轉運途徑而通過血 腦障壁，但該轉運途徑不受限制。例如，該以腦為標靶之肽可為可以通過血腦障壁之肽、蛋白質、或抗體，但其等之型態與大小不受特別限制。
根據前述實施例中任一項之以腦為標靶之長效接合物中，該以腦為標靶之肽係經由受體介導之轉運途徑通過血腦障壁。
根據前述實施例中任一項之以腦為標靶之長效接合物中，該經由受體介導之轉運途徑之特徵在於通過血腦障壁係經由選自下列各物所組成群中之任一者之藉由受體介導之轉運途徑而進行：胰島素受體、轉鐵蛋白受體、低密度脂蛋白受體、低密度脂蛋白受體相關蛋白質、瘦素受體、菸鹼乙醯膽鹼受體、穀胱甘肽轉運子、鈣激活之鉀通道、與高糖化終產物受體(RAGE)，及該等受體之配體、及與該等受體或配體結合之抗體，但不受此限制。該以腦為標靶之肽可選自由可通過血腦障壁之肽、蛋白質、或抗體所組成之群中，或其可為自該肽、蛋白質、或抗體中單離之部份肽序列，但不受此限制。
根據前述實施例中任一項之以腦為標靶之長效接合物中，該生理活性物質可選自下列各物組成之群中：毒素；或類升糖素肽-1(GLP-1)受體促效劑；升糖素受體促效劑；胃抑制性多肽(GIP)受體促效劑；纖維母細胞生長因子(FGF)受體促效劑；膽囊收縮素受體促效劑；胃泌素受體促效劑；黑皮質素受體促效劑；人類生長激素；生長激素釋放激素；生長激素釋放肽；干擾素；干擾素受體；群落刺激因子(粒細胞群落刺激因子)；介白素；介白素受體；酵素；介白素結合性蛋白質；細胞激素結合性蛋白質；巨噬細胞活化因子；巨噬細胞肽；B細胞因子；T細胞因子；蛋白質A；抑制過敏因子；壞死糖蛋白；免疫毒素；淋巴毒素；腫瘤壞死因子；腫瘤壓制劑；轉化生長因子；α-1抗胰蛋白酶；白蛋白；α-乳白蛋白；載脂蛋白-E；紅血球生成素；高糖基化紅血球生成素；血管生成素；血紅素；凝血酶； 凝血酶受體活化肽；凝血酶調節素；凝血因子VII；凝血因子VIIa；凝血因子VIII；凝血因子IX；凝血因子XIII；血纖維蛋白溶酶原活化劑；纖維蛋白結合性肽；尿激酶；鏈激酶；水蛭素；蛋白質C；C-反應性蛋白質；腎素抑制劑；膠原酶抑制劑；超氧化物歧化酶；瘦素；血小板衍生之生長因子；上皮生長因子；表皮生長因子；血管新生抑制素；血管收縮素；骨成形性生長因子；骨成形性蛋白質；抑鈣激素；胰島素；心房肽；軟骨誘發因子；依降鈣素(elcatonin)；結締組織活化因子；組織因子途徑抑制劑；促濾泡激素；黃體激素；黃體激素釋放激素；神經生長因子；軸突生成因子-1；腦利鈉肽；膠質細胞源性神經營養因子；神經突起導向因子(netrin)；嗜中性球抑制因子；神經營養因子；神經營養蛋白(neurturin)；副甲狀腺激素；鬆弛素；胰泌素；體介素；類胰島素生長因子；腎上腺皮質素；升糖素；膽囊收縮素；胰多肽；胃泌素釋放肽；促腎上腺皮質激素釋放因子；促甲狀腺激素；自分泌運動因子；乳鐵蛋白；肌肉生長抑制素；活性依賴性神經保護性蛋白質(ADNP)、β-分泌酶1(BACE1)、類澱粉蛋白前驅蛋白(APP)、神經細胞附著分子(NCAcleM)、類澱粉蛋白β、Tau、晚期糖基化終產物受體(RAGE)、α-突觸核蛋白(synuin)、或其促效劑或拮抗劑；受體、受體促效劑；細胞表面抗原；單株抗體；多株抗體；抗體片段；由病毒衍生之疫苗抗原；激活至少一種受體促效劑之雜合多肽或嵌合多肽；及其類似物。
根據前述實施例中任一項之以腦為標靶之長效接合物中，該毒素係選自下列各物組成之群中：美登素(maytansine)或其衍生物、微管蛋白抑制素(auristatin)或其衍生物、倍癌黴素(duocarmycin)或其衍生物、及吡咯并苯并二氮呯(PBD)或其衍生物；類升糖素肽-1(GLP-1)受體促效劑係選自下列各物組成之群中：天然外泌肽(exendin)-3或天然外泌肽(exendin)-4，與其類似物； FGF受體促效劑係選自下列各物組成之群中：FGF1或其類似物、FGF19或其類似物、FGF21或其類似物、及FGF23或其類似物；干擾素係選自下列各物組成之群中：干擾素-α、干擾素-β、及干擾素-γ；干擾素受體係選自下列各物組成之群中：干擾素-α受體、干擾素-β受體、干擾素-γ受體、及可溶型I干擾素受體；介白素係選自下列各物組成之群中：介白素-1、介白素-2、介白素-3、介白素-4、介白素-5、介白素-6、介白素-7、介白素-8、介白素-9、介白素-10、介白素-11、介白素-12、介白素-13、介白素-14、介白素-15、介白素-16、介白素-17、介白素-18、介白素-19、介白素-20、介白素-21、介白素-22、介白素-23、介白素-24、介白素-25、介白素-26、介白素-27、介白素-28、介白素-29、及介白素-30；介白素受體為介白素-1受體或介白素-4受體；酵素係選自下列各物組成之群中：β-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸酯酶、酸性α-葡萄糖苷酶、酸性神經醯胺酶、酸性神經鞘磷脂酶、半乳糖神經醯胺酶、芳基硫酸酯酶A、芳基硫酸酯酶B、β-己醣胺酶A、β-己醣胺酶B、肝素N-硫酸酯酶、α-D-甘露糖苷酶、β-葡萄醣醛酸酶、N-乙醯半乳糖胺-6硫酸酯酶、溶小體酸性脂酶、α-N-乙醯基-葡萄糖胺酶、葡萄糖神經醯胺酶、丁醯基膽鹼酯酶、幾丁質酶、麩胺酸脫羧酶、伊米苷酶(imiglucerase)、脂酶、尿酸酶、血小板活化因子乙醯基水解酶、中性肽鏈內切酶、髓過氧化物酶、α-半乳糖苷酶-A、阿爾發半乳糖苷酶 (agalsidase)α、阿爾發半乳糖苷酶(agalsidase)β、α-L-艾杜糖醛酸酶、丁醯基膽鹼酯酶、殼糖酶、麩胺酸脫羧酶、及伊米苷酶(imiglucerase)；介白素結合性蛋白質為IL-18bp；細胞激素結合性蛋白質為腫瘤壞死因子(TNF)結合性蛋白質；神經生長因子係選自下列各物組成之群中：神經生長因子、睫神經營養因子、軸突生成因子-1、腦利鈉肽、膠質細胞源性神經營養因子、神經突起導向因子(netrin)、嗜中性球抑制因子、神經營養因子、及神經營養蛋白(neurturin)；肌肉生長抑制素受體係選自下列各物組成之群中：TNFR(P75)、TNFR(P55)、IL-1受體、VEGF受體、及B細胞活化因子受體；肌肉生長抑制素受體拮抗劑為IL1-Ra；細胞表面抗原係選自下列各物組成之群中：CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD11a、CD11b、CD18、CD19、CD20、CD23、CD25、CD33、CD38、CD40、CD45、與CD69；及抗體片段係選自下列各物組成之群中：scFv、Fab、Fab'、F(ab')2、與Fd。
根據前述實施例中任一項之以腦為標靶之長效接合物中，GLP-1受體促效劑係選自下列各物組成之群中：天然外泌肽-4；外泌肽-4衍生物，其中該外泌肽之N-末端胺基已缺失；外泌肽-4衍生物，其中該外泌肽之N-末端胺基係經羥基取代；外泌肽-4衍生物，其中該外泌肽-4之N-末端胺基係經二甲基修飾；外泌肽-4衍生物，其中該外泌肽-4之N-末端胺基係經羧基取代；外泌肽-4衍生物，其中該外泌肽-4之第一個胺 基酸組胺酸之α-碳已缺失；外泌肽-4衍生物，其中該外泌肽-4之第12個胺基酸離胺酸被絲胺酸取代；及外泌肽-4衍生物，其中該外泌肽-4之第12個胺基酸離胺酸被精胺酸取代。
根據前述實施例中任一項之以腦為標靶之長效接合物中，L1係連接F之N-末端區，及L2係連接F之C-末端區。
根據前述實施例中任一項之接合物中，L1係連接X之N-末端或C-末端，及L2係連接Y之N-末端區或C-末端區。
根據前述實施例中任一項之接合物中，L1係連接X之N-末端或C-末端，及L2係連接Y之N-末端區。
根據前述實施例中任一項之以腦為標靶之長效接合物中，式1之F-L2-Y係以下式2代表：
Figure TW201942139A_D0001
其中：Fa與Fb分別為單股多肽鏈，其包含鉸鏈區、CH2域、與CH3域，其中Fa與Fb係藉由鉸鏈區中之二硫鍵連接，藉以使該接合物包含Fc片段，及Fa與L1係共價鍵結；各BTPa1、......、BTPan彼此相同或相異，為以腦為標靶之肽；各BTPb1、......、BTPbn' 彼此相同或相異，為以腦為標靶之肽；各L2a1、......、L2an彼此相同或相異，為肽連接子；及各L2b1、......、L2bn' 彼此相同或相異，為肽連接子； 其中n與n'分別獨立地為整數。
根據前述實施例中任一項之接合物中，各L2a1、......、L2an彼此相同或相異，為肽連接子、及各L2b1、......、L2bn' 彼此相同或相異，為肽連接子，其中n與n'分別獨立地為整數。
根據前述實施例中任一項之以腦為標靶之長效接合物中，L1係連接Fa之N-末端，及L2a1與L2b1分別連接Fa與Fb之C-末端。
根據前述實施例中任一項之接合物中，式1之X-L1-F-L2-Y具有下式3代表之結構：
Figure TW201942139A_D0002
其中，X為生理活性物質；L1a與L1b分別獨立地為肽連接子或非肽連接子；Fa與Fb分別為單股多肽鏈，其包含鉸鏈區、CH2域、與CH3域，其中Fa與Fb係藉由鉸鏈區中之二硫鍵連接，藉以使該接合物包含Fc片段，及Fa與Fb係分別與L1a及L1b共價鍵結；各BTPa1、......、BTPan彼此相同或相異，為以腦為標靶之肽；各BTPb1、......、BTPbn' 彼此相同或相異，為以腦為標靶之肽；各L2a1、......、L2an分別獨立地為肽連接子或非肽連接子；及各L2b1、......、L2bn' 分別獨立地為肽連接子或非肽連接子；其中n與n'分別獨立地為整數。
根據前述實施例中任一項之接合物中，各L2a1、......、L2an彼此相同或相異，為肽連接子、及各L2b1、......、L2bn' 彼此相同或相異，為肽連接子，其中n與n'分別獨立地為整數。
根據前述實施例中任一項之接合物中，L1a與L1b分別連接Fa與Fb之N-末端，及L2a1與L2b1分別連接Fa與Fb之C-末端。
根據前述實施例中任一項之接合物中，式1之X-L1-F-L2-Y具有下式4之結構：
Figure TW201942139A_D0003
其中：X為生理活性物質；L1為肽連接子或非肽連接子；Fa與Fb分別為單股多肽鏈，其包含鉸鏈區、CH2域、與CH3域，其中Fa與Fb係藉由鉸鏈區中之二硫鍵連接，藉以使該接合物包含Fc片段，及Fa係與L1共價鍵結；各BTPa1、......、BTPan彼此相同或相異，為以腦為標靶之肽；各BTPb1、......、BTPbn' 彼此相同或相異，為以腦為標靶之肽；各L2a1、......、L2an分別獨立地為肽連接子或非肽連接子；及各L2b1、......、L2bn' 分別獨立地為肽連接子或非肽連接子；其中n與n'分別獨立地為整數。
根據前述實施例中任一項之接合物中， 各L2a1、......、L2an彼此相同或相異，為肽連接子；及各L2b1、......、L2bn' 彼此相同或相異，為肽連接子，其中n與n'分別獨立地為整數。
根據前述實施例中任一項之接合物中，L1係連接Fa之N-末端，及L2a1與L2b1分別連接Fa與Fb之C-末端。
根據前述實施例中任一項之以腦為標靶之長效接合物中，n=n'，且分別符合以下條件：L2a1=L2b1、......、L2an=L2bn' ，及BTPa1=BTPb1、......、BTPan=BTPbn' 。
根據前述實施例中任一項之接合物中，式1中，F為FaFb，及L2-Y為(L2a-Ya)n與(L2b-Yb)n'，其中該接合物係由下式5代表：
Figure TW201942139A_D0004
其中，X為生理活性物質；L1為肽連接子或非肽連接子；Fa與Fb分別為免疫球蛋白Fc區，其包含鉸鏈區、CH2域、與CH3域，明確言之Fa與Fb分別為單股多肽鏈，其包含鉸鏈區、CH2域、與CH3域，其中Fa與Fb係藉由鉸鏈區中之二硫鍵連接，藉以使該接合物包含Fc片段，及Fa係與L1共價鍵結；各Ya與Yb彼此相同或相異，為以腦為標靶之肽；及各L2a與L2b彼此相同或相異，為肽連接子； 其中n與n'分別獨立地為1或更大之整數。
根據前述實施例中任一項之接合物中，式1中，X為Xa與Xb；L1為L1a與L1b；F為Fa與Fb；及L2-Y為(L2a-Ya)n與(L2b-Yb)n' ，其中該接合物係以下式6代表：
Figure TW201942139A_D0005
其中，X為生理活性物質；L1a與L1b分別獨立地為肽連接子或非肽連接子，明確言之肽連接子；肽連接子可包含0至1,000個胺基酸；Fa與Fb分別為單股多肽鏈，其包含鉸鏈區、CH2域、與CH3域，其中Fa與Fb係藉由鉸鏈區中之二硫鍵連接，藉以使該接合物包含Fc片段，及Fa與Fb係分別與L1a及L1b共價鍵結；各Ya與Yb彼此相同或相異，為以腦為標靶之肽；及各L2a與L2b彼此相同或相異，為肽連接子；其中n與n'分別獨立地為1或更大之整數。
根據前述實施例中任一項之接合物中，各BTPa1、......、BTPan係彼此相同，為以腦為標靶之肽；各BTPb1、......、BTPbn' 係彼此相同，為以腦為標靶之肽；各L2a1、......、L2an為肽連接子；及各L2b1、......、L2bn' 為肽連接子。
根據前述實施例中任一項之接合物中，各BTPa1、......、BTPan係彼此相異，為以腦為標靶之肽；各BTPb1、......、BTPbn' 係彼此相異，為以腦為標靶之肽；各L2a1、......、L2an為肽連接子；及各L2b1、......、L2bn' 為肽連接子。
根據前述實施例中任一項之接合物中，n=n'，且符合下列任一條件：BTPa1≠BTPb1、......及BTPan≠BTPbn' 。
根據前述實施例中任一項之接合物中，n=n'，且分別符合以下條件：L2a1≠L2b1、......、L2an≠L2bn' 、及/或BTPa1≠BTPb1、......、BTPan≠BTPbn' 。
根據前述實施例中任一項之接合物中，各BTPa1、......、BTPan係彼此相同，為以腦為標靶之肽；各BTPb1、......、BTPbn' 係彼此相同，為以腦為標靶之肽；各L2a1、......、L2an為肽連接子；及各L2b1、......、L2bn' 為肽連接子。
根據前述實施例中任一項之接合物中，各BTPa1、......、BTPan係彼此相異，為以腦為標靶之肽；各BTPb1、......、BTPbn' 係彼此相異，為以腦為標靶之肽；各L2a1、......、L2an為肽連接子；及各L2b1、......、L2bn' 為肽連接子。
根據前述實施例中任一項之接合物中，n與n'分別獨立地為1至5之整數，亦即1、2、3、4、或5。
根據前述實施例中任一項之以腦為標靶之長效接合物中，L1係連接X之胺基或硫醇基。
根據前述實施例中任一項之以腦為標靶之長效接合物中， L1、L1a、或L1b係連接X之N-末端胺基、位在離胺酸殘基側鏈之胺基、或位在半胱胺酸殘基側鏈之-SH基(硫醇基)。
根據前述實施例中任一項之接合物中，以腦為標靶之肽(BTP)包含選自胺基酸序列SEQ ID NO：2、4、6、8、10、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、及85之胺基酸。
根據前述實施例中任一項之以腦為標靶之長效接合物中，X係生理活性物質，為由2至1,000個胺基酸組成之多肽。
根據前述實施例中任一項之接合物中，L1、L1a、或L1b為大小為0.5kDa至100kDa之非肽連接子。
根據前述實施例中任一項之接合物中，非肽連接子為聚乙二醇。
根據前述實施例中任一項之接合物中，L1、L1a、或L1b為包含0至1,000個胺基酸之肽連接子。
根據前述實施例中任一項之接合物中，L2為肽連接子。
根據前述實施例中任一項之接合物中，肽連接子為(GS)m、(GGS)m、(GGGS)m、或(GGGGS)m，其中m為1至10。
根據前述實施例中任一項之以腦為標靶之長效接合物中，L2為肽連接子((GS)m、(GGS)m、(GGGS)m、或(GGGGS)m，其中m為1至10)。
根據前述實施例中任一項之以腦為標靶之長效接合物為融合蛋白質，其係在基因階層融合，其中L1a與L1b分別連接X之C-末端區及Fa與Fb之N-末端區；及L2a與L2b分別連接Fa與Fb之C-末端區。
根據前述實施例中任一項之以腦為標靶之長效接合物中，L1與L2為肽連接子((GS)m、(GGS)m、(GGGS)m、或(GGGGS)m，其中m為1至10)，及以腦為標靶之長效接合物係呈融合蛋白質型式。
根據前述實施例中任一項之以腦為標靶之長效接合物中，該生理活性物質為醫療性酵素，接合物係呈融合蛋白質型式，且相較於未與Fc區融合之醫療性酵素，該融合蛋白質會提高安定性及降低其對溶小體受體之結合親和力。
根據前述實施例中任一項之接合物中，L1與L2其中之一為肽連接子，另一個為非肽連接子。
根據前述實施例中任一項之接合物中，L1與L2二者均為肽連接子。
根據前述實施例中任一項之接合物中，當L1為非肽連接子或肽連接子及L2為肽連接子時，該肽連接子包含0至1,000個胺基酸。
根據前述實施例中任一項之接合物中，式1之以腦為標靶之長效接合物係其中X之N-末端與F之N-末端係利用L1連接，及Y之N-末端與F之C-末端係利用L2連接。
根據前述實施例中任一項之長效接合物中，式1之以腦為標靶之長效接合物係其中L1一端與X之離胺酸殘基或半胱胺酸殘基等等連接，及L1之另一端與F之N-末端連接；及Y之N-末端與F之C-末端係利用L2連接。
根據前述實施例中任一項之接合物中，非肽連接子係選自下列各物組成之群中：聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚 氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多醣、葡聚糖、聚乙烯乙基醚、生物降解性聚合物、脂質聚合物、幾丁質、玻尿酸、脂肪酸、高分子量聚合物、低分子量化合物、核苷酸、及其組合。
根據前述實施例中任一項之以腦為標靶之長效接合物中，當式1之L1與L2中任一個或兩個為肽連接子時，X與F、或F與Y係利用L1與L2，經由共價化學鍵、非共價化學鍵、或其組合彼此連接；及L1與L2分別包含0至1,000個胺基酸。當肽連接子包含零個胺基酸時，其等係利用肽鍵(其係共價鍵)連接。
根據前述實施例中任一項之以腦為標靶之長效接合物中，當式1之L1與L2中任一個或兩個為肽連接子時，L1與L2係由0個胺基酸組成，其中(i)X與F、或F與Y利用肽鍵連接；或(ii)X與F、及F與Y利用肽鍵連接。
根據前述實施例中任一項之以腦為標靶之長效接合物中，當L1與L2中任一個為肽連接子及這兩個其中另一個為非肽連接子時，肽連接子係包含0至1,000個胺基酸之連接子及非肽連接子為聚乙二醇。
根據前述實施例中任一項之以腦為標靶之長效接合物中，式1之F包括免疫球蛋白Fc區。
根據前述實施例中任一項之以腦為標靶之長效接合物中，免疫球蛋白Fc區包括一至四個選自下列各者組成之群中之域：CH1、CH2、CH3、及CH4域。
根據前述實施例中任一項之以腦為標靶之長效接合物中，免疫球蛋白Fc區進一步包括鉸鏈區。
根據前述實施例中任一項之接合物中，免疫球蛋白Fc區係衍生自IgG、IgA、IgD、IgE、或IgM。
根據前述實施例中任一項之以腦為標靶之長效接合物中，免疫球蛋白Fc區為IgG之Fc區。
根據前述實施例中任一項之以腦為標靶之長效接合物中，在免疫球蛋白Fc區方面，恆定區係衍生自IgG1或IgG4。
根據前述實施例中任一項之以腦為標靶之長效接合物中，免疫球蛋白Fc區為IgG4 Fc區。
根據前述實施例中任一項之以腦為標靶之長效接合物中，免疫球蛋白Fc區為人類序列之無糖基化IgG4 Fc區。
根據前述實施例中任一項之接合物中，免疫球蛋白Fc區之各域為具有衍生自選自IgG、IgA、IgD、IgE、及IgM所組成群中之免疫球蛋白之不同來源之域之雜合物。
根據前述實施例中任一項之接合物中，免疫球蛋白Fc區為由短鏈免疫球蛋白(其係由相同來源之域構成)組成之二聚體或多聚體。
根據前述實施例中任一項之接合物中，免疫球蛋白Fc區包含天然免疫球蛋白Fc區之胺基酸序列或其經修飾之胺基酸序列。
根據前述實施例中任一項之接合物中，免疫球蛋白Fc區在天然免疫球蛋白Fc區之至少一個胺基酸中包含選自下列各物組成之群中之變異：取代、加成、缺失、修飾、及其組合。
根據前述實施例中任一項之接合物中，免疫球蛋白Fc區係其中不會發生鏈交換功能者。
根據前述實施例中任一項之接合物中，F係呈二聚體型式，其中兩個包含鉸鏈區、CH2域、與CH3域之單股多肽鏈係利用二硫鍵連接。
根據前述實施例中任一項之接合物中，該構成免疫球蛋白Fc區之鉸鏈區可包含或基本上其組成為胺基酸序列SEQ ID NO：14，或可能為其中在胺基酸序列SEQ ID NO：14之第二個胺基酸絲胺酸(Ser，S)經修飾形成脯胺酸(Pro，P)。
根據前述實施例中任一項之接合物中，該構成免疫球蛋白Fc區之CH2域可包含或基本上其組成為胺基酸序列SEQ ID NO：15，或可能為其中在胺基酸序列SEQ ID NO：15之第67個胺基酸天冬醯胺(Asn，N)經修飾形成麩醯胺(Gln，Q)。
根據前述實施例中任一項之接合物中，F係呈二聚體型式，其中兩個包含衍生自IgG之鉸鏈區、CH2域、與CH3域之單股多肽鏈係利用二硫鍵連接，其中鉸鏈區包含胺基酸序列SEQ ID NO：14或在胺基酸序列SEQ ID NO：14中第2個胺基酸絲胺酸(Ser，S)經修飾形成脯胺酸(Pro，P)之胺基酸序列；及/或CH2域包含胺基酸序列SEQ ID NO：15或在胺基酸序列SEQ ID NO：15中第67個胺基酸天冬醯胺(Asn，N)經修飾形成麩醯胺(Gln，Q)之胺基酸序列；及/或CH3域包含胺基酸序列SEQ ID NO：16。
根據前述實施例中任一項之接合物中，構成F之包含免疫球蛋白恆定區之單股多肽鏈中，在胺基酸序列SEQ ID NO：105之第二個胺基酸被脯胺酸取代；第71個胺基酸被麩醯胺取代；或第二個胺基酸 被脯胺酸取代及第71個胺基酸被麩醯胺取代。
根據前述實施例中任一項之接合物中，構成F之包含免疫球蛋白恆定區之單股多肽鏈包含胺基酸序列SEQ ID NO：106。
根據前述實施例中任一項之接合物中，接合物包括兩個免疫球蛋白Fc區(Fc區之二聚體型，其中由單體Fc區連接)，且與兩個免疫球蛋白Fc區分別結合之生理活性物質可以連接在免疫球蛋白Fc區之單一位點(單體Fc區)或兩個免疫球蛋白Fc區之兩個位點(Fc區之各二聚體型)。
根據前述實施例中任一項之接合物中，兩個免疫球蛋白恆定區鏈之間之化學結合性可能為共價鍵，更明確言之二硫鍵，及甚至更明確言之，在兩個免疫球蛋白Fc區之鉸鏈區中形成二硫鍵。
根據前述實施例中任一項之接合物中，接合物可呈之型式係其中在以下二者之間利用化學鍵形成二聚體：(i)第一個免疫球蛋白Fc區，其中以腦為標靶之肽係經由上述肽連接子(例如：肽鍵)連接一個免疫球蛋白Fc區分子之C-末端區，與(ii)第二個免疫球蛋白Fc區，其中以腦為標靶之肽係經由上述肽連接子(例如：肽鍵)連接一個免疫球蛋白Fc區分子之C-末端區，且一個生理活性物質分子可以連接兩個免疫球蛋白Fc區中一個分子之N-末端區；或可呈之型式係其中由生理活性物質連接兩個免疫球蛋白Fc區分子之各N-末端區。
根據前述實施例中任一項之接合物中，第一個免疫球蛋白Fc區與第二個免疫球蛋白Fc區係呈融合蛋白質型式，其中免疫球蛋白Fc區係利用肽鍵，與以腦為標靶之肽同義融合，且其中免疫球蛋白Fc區係 呈包含鉸鏈區、CH2域、與CH3域之型式。
根據前述實施例中任一項之接合物中，第一個與第二個免疫球蛋白Fc區之間之化學鍵明確言之，可為共價鍵，更明確言之為二硫鍵，及更明確言之，為在兩個免疫球蛋白Fc區之鉸鏈區中形成之二硫鍵。
本發明另一態樣提供一種編碼以腦為標靶之長效接合物之多核苷酸；含其之表現載體；及包含該多核苷酸或表現載體之宿主細胞。
在一項明確實施例中，該多核苷酸係編碼以腦為標靶之長效接合物之多核苷酸，其係呈由胺基酸序列組成之融合蛋白質型式。
本發明又另一態樣提供一種包含以腦為標靶之接合物之組成物。
在一項明確實施例中，該組成物為醫藥組成物。
本發明又另一態樣提供一種由以腦為標靶之長效接合物於製備醫藥製劑上之用途。
本發明又另一態樣提供一種製備以腦為標靶之長效接合物之方法。
在一項明確實施例中，該製備方法包括：(a)培養宿主細胞；及(b)從培養之宿主細胞或其培養物中回收以腦為標靶之長效接合物。
另一項明確實施例中，該製備方法包括：(i)製備： (a)X-L1-F，其中由X(其係生理活性物質)、L1(其係肽連接子或非肽連接子)、與F(其包含免疫球蛋白Fc區)連接；及(b)L2-Y，其中由Y(其係以腦為標靶之肽)、與L2(其係肽連接子或非肽連接子)連接；及(ii)連接(a)X-L1-F與(b)L2-Y。
又另一項實施例中，該製備方法包括：(i)製備：(a)X-L1，其中由X(其係生理活性物質)、與L1(其係肽連接子或非肽連接子)連接；及(b)F-L2-Y，其中由Y(其係以腦為標靶之肽)、L2(其係肽連接子或非肽連接子)、與F連接；及(ii)連接(a)X-L1與(b)F-L2-Y。
又另一項實施例中，該製備方法包括：(a)由L1(其係在兩個末端具有相同或相異反應性官能基之非肽聚合物)中任一個反應性官能基與X(其係游離之生理活性物質)反應，得到X-L1，其係已連接之物質，其中由非肽聚合物利用末端與生理活性物質共價鍵結；及(b)由F-L2-Y連接在該已連接物質之未反應末端之反應性官能基，得到X-L1-F-L2-Y。
根據前述實施例之製備方法，在步驟(b)中，由該已連接物質之未反應末端之反應性官能基連接下式2之Fa：[式2]
Figure TW201942139A_D0006
其中：Fa與Fb分別為單股多肽鏈，其包含鉸鏈區、CH2域、與CH3域，其中Fa與Fb係藉由鉸鏈區中之二硫鍵連接，藉以讓接合物包含Fc片段，及Fa係與L1共價鍵結；各BTPa1、......、BTPan彼此相同或相異，為以腦為標靶之肽；各BTPb1、......、BTPbn' 彼此相同或相異，為以腦為標靶之肽；各L2a1、......、L2an分別獨立地為肽連接子或非肽連接子；及各L2b1、......、L2bn' 分別獨立地為肽連接子或非肽連接子；其中n與n'分別獨立地為整數。
根據前述實施例之製備方法中，反應性官能基係選自下列各物組成之群中：醛基、馬來醯亞胺基、及琥珀醯亞胺衍生物。
根據前述實施例之製備方法中，該醛基為丙醛基或丁醛基。
根據前述實施例之製備方法中，該琥珀醯亞胺衍生物為羧甲基琥珀醯亞胺基酯、戊酸琥珀醯亞胺基酯、甲基丁酸琥珀醯亞胺基酯、甲基丙酸琥珀醯亞胺基酯、丁酸琥珀醯亞胺基酯、丙酸琥珀醯亞胺基酯、N-羥基琥珀醯亞胺、或碳酸琥珀醯亞胺基酯。
根據前述實施例之製備方法中，該反應性官能基中兩個末端均為醛基。
根據前述實施例之製備方法中，非肽聚合物分別在其末端 具有醛基與馬來醯亞胺基作為反應性官能基。
根據前述實施例之製備方法中，非肽聚合物分別在其末端具有醛基與琥珀醯亞胺基作為反應性官能基。
又另一項實施例中，該製備方法包括：培養宿主細胞，其包含編碼下式3之X-L1a-Fa-(L2a1-BTPa1)-......-(L2an-BTPan)之表現匣與編碼下式3之X-L1b-Fb-(L2b1-BTPb1)-......-(L2bn' -BTPbn' )之表現匣；及從培養之宿主細胞或其培養物中得到式3接合物：
Figure TW201942139A_D0007
其中：X為生理活性物質；L1a與L1b為肽連接子；Fa與Fb分別為單股多肽鏈，其包含鉸鏈區、CH2域、與CH3域，其中Fa與Fb係藉由鉸鏈區中之二硫鍵連接，藉以使該接合物包含Fc片段，及Fa與Fb係分別與L1a及L1b共價鍵結；各BTPa1、......、BTPan彼此相同或相異，為以腦為標靶之肽；各BTPb1、......、BTPbn' 彼此相同或相異，為以腦為標靶之肽；各L2a1、......、L2an為肽連接子；及各L2b1、......、L2bn' 為肽連接子；其中n與n'分別獨立地為整數。
根據前述實施例之製備方法中，X-L1a-Fa-(L2a1- BTPa1)-......-(L2an-BTPan)與X-L1b-Fb-(L2b1-BTPb1)-......-(L2bn' -BTPbn' )係呈融合蛋白質之型式表現，及在再折疊過程中，由Fa與Fb之間結合形成接合物。
為了達成上述目的，本發明又另一態樣提供一種新穎之以腦為標靶之肽。
在一項明確實施例中，該以腦為標靶之肽(BTP)包含或基本上其組成為選自下列各物所組成群中之胺基酸序列：胺基酸序列SEQ ID NO：2、4、6、8、10、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、及85。
為了達成上述目的，本發明又另一態樣提供一種編碼以腦為標靶之肽之分離之多核苷酸；含其之重組表現載體；包含該多核苷酸或重組表現載體之宿主細胞；及包含上述至少一者之套組。
本發明包含以腦為標靶之肽與生理活性物質之以腦為標靶之長效接合物具有可以在活體內通過血腦障壁(BBB)、維持生理活性、及顯著延長血液半衰期之效力。以腦為標靶之長效接合物亦具有改良之安定性，因此可用為治療腦相關疾病之醫療劑。此外，本發明提供一種新穎之以腦為標靶之肽，因此可以製備以腦為標靶之長效接合物，用為治療腦相關疾病之醫療劑。
第1圖出示證實以腦為標靶之肽通過血腦障壁之通過量之 胞移作用實驗結果。
第2圖出示於小鼠中證實以腦為標靶之肽通過血腦障壁之通過量所進行之腦分佈實驗結果。
第3圖出示證實與免疫球蛋白Fc區連接之以腦為標靶之肽通過血腦障壁之通過量及免疫球蛋白Fc區單獨通過血腦障壁之通過量之結果。
第4圖出示證實包含GIP衍生物(亦即生理活性物質)之以腦為標靶之長效接合物通過血腦障壁之通過量之胞移作用實驗結果。
第5圖出示證實包含艾杜硫酶(idursulfase)(亦即生理活性物質)以腦為標靶之長效接合物在維持生理活性之能力結果。
第6圖出示證實融合蛋白質(其中連接免疫球蛋白Fc區與以腦為標靶之肽)於腦部分佈之結果。
第7圖出示使用SDS-PAGE證實艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶-Fc-BTP22(其係重組蛋白質)之結果
第8圖出示使用SDS-PAGE證實艾杜糖酸酸2-硫酸酯酶-10kDa PEG-Fc-BTP28接合物之結果。
第9圖出示證實艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶-Fc-BTP22融合蛋白質與艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶-Fc-BTP28接合物之活體外酵素活性結果。
第10圖出示證實艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶-Fc-BTP22融合蛋白質之腦組織分佈結果。
第11圖出示證實艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶-Fc-BTP22融合 蛋白質與艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶-Fc-BTP28接合物之活體外效力之實驗結果。
下文將詳細說明本發明。
同時，本文所揭示各說明與例舉之實施例分別可以應用在其他說明與例舉之實施例。亦即本文所揭示各種不同因子之組合均屬於本發明之範圍。此外，本發明之範圍不受限於下文提供之明確揭示內容。
此外，習此相關技藝之人士採用例行實驗即咸了解或可以證實與本發明所說明本發明明確實施例之許多均等物。此外，此等同等物均計畫包括在本發明內。
本發明說明書全文中，採用胺基酸習用之單字母與三字母代碼。此外，亦採用一般容許用於其他胺基酸之三字母代碼，如二胺基丙酸(DAP)。此外，本文所述及胺基酸係依據IUPAC-IUB之命名規則，以縮寫表示。
本發明一項態樣提供一種以腦為標靶之長效接合物，其包含以腦為標靶之肽與生理活性物質。
更明確言之，以腦為標靶之長效接合物可為其中由以腦為標靶之肽(其係藉由肽連接子與/或非肽連接子來連接免疫球蛋白Fc區)與生理活性物質連接，但不受此限制。
本發明以腦為標靶之長效接合物之特徵在於該以腦為標靶之肽係藉由肽連接子(包括經由肽鍵直接融合)或非肽連接子來連接免疫球 蛋白Fc區，但不與生理活性物質連接。
更明確實施例中，本發明提供一種下式1以腦為標靶之長效接合物：[式1]X-L1-F-L2-Y
式1中，X為生理活性物質；Y為以腦為標靶之肽；L1與L2為肽連接子或非肽連接子；當L1與L2為肽連接子時，肽連接子包含0至1,000個胺基酸；及F為包含FcRn-結合區之免疫球蛋白恆定區。
本發明長效接合物型之特徵在於由生理活性物質連接以Fc區為主之以腦為標靶之肽。
明確言之，本發明長效接合物之特徵在於該以腦為標靶之肽係藉由肽連接子連接免疫球蛋白Fc區，該生理活性物質再藉由非肽連接子與其連接；或本發明長效接合物之特徵在於該以腦為標靶之肽與生理活性物質二者均藉由肽連接子連接免疫球蛋白Fc區，但本發明不特別受此限制。
兩種型態之以腦為標靶之肽與生理活性物質均可藉由肽連接子與/或非肽連接子連接，但該等連接法不受此限制。
肽連接子可能為包含0至1,000個胺基酸之連接子，但任何可以形成本發明接合物之肽連接子均包括在內，沒有限制。當肽連接子 沒有包含胺基酸時，該接合物可能呈利用肽鍵連接之型式。
以腦為標靶之長效接合物之式1「F-L2-Y」可能為具有下式2結構之以腦為標靶之長效接合物。
Figure TW201942139A_D0008
上式2中，Fa與Fb分別為單股多肽鏈，其包含鉸鏈區、CH2域、與CH3域，其中Fa與Fb係藉由鉸鏈區中之二硫鍵連接，藉以使接合物包含Fc片段，及Fa與L1係彼此共價鍵結；各BTPa1、......、BTPan彼此相同或相異，為以腦為標靶之肽；各BTPb1、......、BTPbn' 彼此相同或相異，為以腦為標靶之肽；各L2a1、......、L2an，分別獨立地為肽連接子或非肽連接子；及各L2b1、......、L2bn' 分別獨立地為肽連接子或非肽連接子；其中n與n'分別獨立地為整數。
更明確言之，式2中，各L2a1、......、L2an彼此相同或相異，可為肽連接子，及各L2b1、......、L2bn' 彼此相同或相異，可為肽連接子，其中n與n'可以分別獨立地為整數，但本發明不特別受此限制。
以腦為標靶之長效接合物中，L1可以連接Fa之N-末端，及L2a1與L2b1可以分別連接Fa與Fb之C-末端。
式2之以腦為標靶之長效接合物中，n=n'，且分別符合以下條件：L2a1=L2b1、......、L2an=L2bn' 與BTPa1=BTPb1、......、BTPan =BTPbn' ，但該等條件不受其等限制。
更明確言之，式1「X-L1-F-L2-Y」可能具有下式3結構。亦即，該接合物可由下式3代表：
Figure TW201942139A_D0009
其中：X為生理活性物質；L1a與L1b分別獨立地為肽連接子或非肽連接子；Fa與Fb分別為單股多肽鏈，其包含鉸鏈區、CH2域、與CH3域，其中Fa與Fb係藉由鉸鏈區中之二硫鍵連接，藉以使該接合物包含Fc片段，及Fa與Fb係分別與L1a與L1b共價鍵結；各BTPa1、......、BTPan彼此相同或相異，為以腦為標靶之肽；各BTPb1、......、BTPbn' 彼此相同或相異，為以腦為標靶之肽；各L2a1、......、L2an分別獨立地為肽連接子或非肽連接子；及各L2b1、......、L2bn' 分別獨立地為肽連接子或非肽連接子；其中n與n'分別獨立地為整數。
更明確言之，式3中，各L2a1、......、L2an彼此相同或相異，可為肽連接子，及各L2b1、......、L2bn' 彼此相同或相異，可為肽連接子，其中n與n'可以分別獨立地為整數。
此外，更明確言之，式3中，各L可為肽連接子，及如式3代表之接合物可呈融合蛋白質型式，但本發明不特別受此限制。
式3中，L1a與L1b係/可以分別連接Fa與Fb之N-末端；L2a1與L2b1係/可以分別連接Fa與Fb之C-末端；L1a與L1b係/可以分別連接X之C-末端；及L2a1與L2b1分別連接其所連接之以腦為標靶之肽(BTP)之N-末端，但其等不特別受此限制。
更明確言之，式1「X-L1-F-L2-Y」可具有下式4之結構：
Figure TW201942139A_D0010
其中：X為生理活性物質；L1為肽連接子或非肽連接子；Fa與Fb分別為單股多肽鏈，其包含鉸鏈區、CH2域、與CH3域，其中Fa與Fb係藉由鉸鏈區中之二硫鍵連接，藉以使該接合物包含Fc片段，及Fa與L1共價鍵結；各BTPa1、......、BTPan彼此相同或相異，為以腦為標靶之肽；各BTPb1、......、BTPbn' 彼此相同或相異，為以腦為標靶之肽；各L2a1、......、L2an分別獨立地為肽連接子或非肽連接子；及各L2b1、......、L2bn' 分別獨立地為肽連接子或非肽連接子；其中n與n'分別獨立地為整數。
更明確言之，式4中，各L2a1、......、L2an彼此相同或相異，可為肽連接子，及各L2b1、......、L2bn' 彼此相同或相異，可為肽連接子，其中n與n'可以分別獨立地為整數，但本發明不特別受此限制。
式4中，L1係/可以連接Fa之N-末端；L2a1與L2b1係/可以分別連接Fa與Fb之C-末端；L1係/可以連接X之N-末端；及L2a1與L2b1可以分別連接其所連接以腦為標靶之肽(BTP)之N-末端，但本發明不特別受此限制。
上式中，n=n'，且分別符合以下條件L2a1=L2b1、......、L2an=L2bn' 及BTPa1=BTPb1、......、BTPan=BTPbn' ，但本發明不特別受此限制。
當n與n'分別獨立地為整數2或更大時，該以腦為標靶之長效接合物可為其中連接至少兩個相同或相異之以腦為標靶之肽，且該等至少兩個相同或相異之以腦為標靶之肽可呈串聯連接型式，但連接型式不受此限制。
n與n'可為整數1或2或更大，及n與n'可為相同或相異整數，但n與n'不受其等限制。n與n'可為1至10，及1至5，例如：n與n'可以分別為1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10，但若Fc區與生理活性物質連接成為構成本發明以腦為標靶之長效接合物之部份體之一部分，以通過BBB傳送時，所包括之n數字沒有限制。
式1中，F為Fa與Fb，及L2-Y為(L2a-Ya)n與(L2b-Yb)n'，及該接合物可由下式5代表：
Figure TW201942139A_D0011
其中， X為生理活性物質；L1為肽連接子或非肽連接子，明確言之非肽連接子；Fa與Fb分別為免疫球蛋白Fc區，其包含鉸鏈區、CH2域、與CH3域，明確言之Fa與Fb分別為單股多肽鏈，其包含鉸鏈區、CH2域、與CH3域，其中Fa與Fb係藉由鉸鏈區中之二硫鍵連接，藉以使該接合物包含Fc片段，及Fa係與L1共價鍵結；各Ya與Yb彼此相同或相異，為以腦為標靶之肽；及各L2a與L2b彼此相同或相異，為肽連接子；其中n與n'分別獨立地為1或更大之整數。
當n與n'分別獨立地為整數2或更大時，該以腦為標靶之長效接合物可能為其中連接至少兩個相同或相異之以腦為標靶之肽，且該等至少兩個相同或相異之以腦為標靶之肽可呈串聯連接型式，但連接型式不受此限制。
n與n'可為整數1或2或更大，及n與n'可為相同或相異之整數，但n與n'不受其等限制。n與n'可為1至10、及1至5，例如，n與n'可以分別為1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10，但所包括之n數字沒有特別限制。
該以腦為標靶之長效接合物可能為其中該X之N-末端區與F之N-末端區利用L1連接，及Y之N-末端區與F之C-末端區利用L2連接。此外，該以腦為標靶之長效接合物可呈之型式係其中由L1之一端連接X之離胺酸殘基或半胱胺酸殘基等等，及由L1之一端連接F之N-末端區；及由Y之N-末端區與F之C-末端區藉由L2連接。
該以腦為標靶之長效接合物可呈之型式係其中L1係連接F之N-末端區，及L2係連接F之C-末端區；或L1係連接Fa之N-末端區，及L2a與L2b分別連接Fa與Fb之C-末端區。
L1可以連接X之胺基或硫醇基；及L1可以連接X之N-末端胺基、位在離胺酸殘基側鏈之胺基、或位在半胱胺酸殘基側鏈之-SH基(硫醇基)上，但不受此限制。
本文所採用術語「N-末端區」係指肽或蛋白質之胺基末端，及為了本發明之目的，係指可以與連接子(包括非肽連接子等等)結合之位點，例如，在N-末端區周圍之胺基酸殘基及N-末端區之最末端胺基酸殘基均包括在內，且明確言之，可以包括從最末端區起第一個至第20個胺基酸殘基，但胺基酸殘基之位點不特別受此限制。
本文所採用術語「C-末端區」係指肽或蛋白質之羧基末端，及為了本發明之目的，係指可以與連接子(包括非肽連接子等等)結合之位點，例如，在C-末端周圍之胺基酸殘基及C-末端區之最末端胺基酸殘基均包括在內，且明確言之，可以包括從最末端起第一個至第20個胺基酸殘基，但胺基酸殘基之位點不特別受此限制。
式1中，X為Xa與Xb；L1為L1a與L1b；F為Fa與Fb；及L2-Y為(L2a-Ya)n與(L2b-Yb)n' 。接合物可由下式6代表：
Figure TW201942139A_D0012
其中： X為生理活性物質；L1a與L1b分別獨立地為肽連接子或非肽連接子，明確言之肽連接子；肽連接子可包含0至1,000個胺基酸；Fa與Fb分別為單股多肽鏈，其包含鉸鏈區、CH2域、與CH3域，其中Fa與Fb係藉由鉸鏈區中之二硫鍵連接，藉以使該接合物包含Fc片段，及Fa與Fb係分別與L1a及L1b共價鍵結；各Ya與Yb彼此相同或相異，為以腦為標靶之肽；及各L2a與L2b彼此相同或相異，為肽連接子；其中n與n'分別獨立地為整數。
上述諸式中，n與n'可為1至5，例如：n與n'可為1、2、3、4、或5，但其等不特別受此限制。本文中，n=n'，但不受此限制。
同時，L1、L1a、或L1b係連接X之N-末端胺基、位在離胺酸殘基側鏈上之胺基、或位在半胱胺酸殘基側鏈上之-SH基(硫醇基)上，但不特別受此限制。
上述諸式中，n=n'，且可分別符合下列條件：L2a1=L2b1、......、L2an=L2bn' 與BTPa1=BTPb1、......、BTPan=BTPbn' 。特定言之，各BTPa1、......、BTPan係彼此相同，可為以腦為標靶之肽，各BTPb1、......、BTPbn' 係彼此相同，可為以腦為標靶之肽，各L2a1、......、L2an可為肽連接子，及各L2b1、......、L2bn' 可為肽連接子；或各BTPa1、......、BTPan係彼此相異，可為以腦為標靶之肽，各 BTPb1、......、BTPbn' 係彼此相異，可為以腦為標靶之肽，各L2a1、......、L2an可為肽連接子，及各L2b1、......、L2bn' 可為肽連接子，但其等不受此限制。
上述諸式中，n=n'，且可分別符合下列任一條件：BTPa1≠BTPb1、......與BTPan≠BTPbn' 。例如：可分別符合下列條件：L2a1≠L2b1、......、L2an≠L2bn' 、BTPa1≠BTPb1、......、BTPan≠BTPbn' ，及a≠b。特定言之，各BTPa1、......、BTPan係彼此相同，可為以腦為標靶之肽，各BTPb1、......、BTPbn' 係彼此相同，可為以腦為標靶之肽，各L2a1、......、L2an可為肽連接子，及各L2b1、......、L2bn' 可為肽連接子；或各BTPa1、......、BTPan係彼此相異，可為以腦為標靶之肽，各BTPb1、......、BTPbn' 係彼此相異，可為以腦為標靶之肽，各L2a1、......、L2an可為肽連接子，及各L2b1、......、L2bn' 可為肽連接子，但其等不受此限制。
該以腦為標靶之長效接合物為在基因階層融合之融合蛋白質，其中L1可以連接X之C-末端區，明確言之L1a與L1b可以分別連接X之C-末端區，及L2a與L2b可以分別連接Fa與Fb之C-末端區，但本發明不特別受此限制。
此等以腦為標靶之長效融合蛋白質中，L1(L1a與L1b)與L2(L2a與L2b)為肽連接子。例如：肽連接子可為(GS)m、(GGS)m、(GGGS)m、或(GGGGS)m，其中m為1至10，但其等不特別受此限制。
本文所採用術語「以腦為標靶之長效接合物」係指接合物，其包括以腦為標靶之肽與生理活性物質、及免疫球蛋白恆定區，且具 有之結構中係由該以腦為標靶之肽與生理活性物質分別直接或間接連接FcRn-結合區。本發明中，術語「以腦為標靶之長效酵素接合物」可與「以腦為標靶之長效接合物」或「長效接合物」交換使用。
術語「以腦為標靶之長效接合物」可與「長效接合物」交換使用，且所指之物質係其中由包括在長效接合物中之生理活性物質連接一種生物相容性物質，其包括可以延長生理活性物質活性效期之免疫球蛋白恆定區且具有FcRn-結合區，及包含0至1,000個胺基酸之肽連接子與/或非肽連接子。
該以腦為標靶之長效接合物可以通過血腦障壁傳送生理活性物質進入腦部組織，但不特別受此限制。
下文中，將更詳細說明構成以腦為標靶之長效接合物之元素。
本文所採用術語「以腦為標靶之肽」包括包含可以通過BBB之胺基酸序列之肽、或蛋白質、或抗體。該以腦為標靶之肽對應於構成本發明以腦為標靶之長效接合物之一個部份體。
此外，該以腦為標靶之肽可為從已知肽、蛋白質、或抗體分離，且具有可以通過BBB之活性之序列。
本文所採用術語「胺基酸」係指包括任何天然或非天然或合成胺基酸殘基之胺基酸部份體，亦即任何包括至少一個羧基殘基與至少一個胺基殘基之部份體，其等係利用一、二、三個、或更多個碳原子(通常係利用單一(α)碳原子)直接連接。
本發明該以腦為標靶之肽之特徵在於其可經由被動轉運途 徑或藉由受體介導之轉運途徑通過血腦障壁，但轉運途徑不受限制。例如：該以腦為標靶之肽可為可以通過血腦障壁之肽、蛋白質、或抗體，但其型態與大小不受特別限制。
同時，該以腦為標靶之肽可為經由利用受體介導之轉運途徑通過血腦障壁者。
同時，該以腦為標靶之肽可為經由利用受體介導之轉運途徑通過血腦障壁者。
明確言之，該以腦為標靶之肽可以藉由經由選自下列各物組成之群中之任一者之受體介導之轉運途徑通過血腦障壁：胰島素受體、轉鐵蛋白受體、低密度脂蛋白受體、低密度脂蛋白受體相關蛋白質、瘦素受體、菸鹼乙醯膽鹼受體、穀胱甘肽轉運子、鈣激活之鉀通道、及晚期糖基化終產物受體(RAGE)、及該等受體之配體及會與該等受體或配體結合之抗體，但該途徑不受特別限制；此外，可選自可通過血腦障壁之肽、蛋白質、及抗體所組成之群中，或可為自該等肽、蛋白質、及抗體單離之部份肽序列，但該途徑不特別受此限制。可以使用例如：SEQ ID NO：2之HAITYPRH肽(BTP1肽)、SEQ ID NO：4之THR肽(BTP2肽)、SEQ ID NO：6之Angiopep-2肽(BTP3肽)、SEQ ID NO：8之ApoB肽(BTP4肽)、SEQ ID NO：10之ApoE肽(BTP5肽)等等，但任何可以通過血腦障壁傳送已連接之F-L2-Y結構至腦部之肽均包括在內，沒有限制。
另一項明確實施例中，SEQ ID NO：20之BTP6肽、SEQ ID NO：22之BTP7肽、SEQ ID NO：24之BTP8肽、SEQ ID NO：26之BTP9肽、SEQ ID NO：28之BTP10肽、SEQ ID NO：30之BTP11 肽、SEQ ID NO：32之BTP12肽、SEQ ID NO：34之BTP13肽、SEQ ID NO：36之BTP14肽、SEQ ID NO：38之BTP15肽、SEQ ID NO：40之BTP16肽、或SEQ ID NO：85之BTP17肽，但肽不受此限制。
另一項明確實施例中，該以腦為標靶之肽可為：(1)Angiopep-2：TFFYGGSRGKRNNFKTEEY-OH(SEQ ID NO：41)，(2)ApoB(3371-3409)：SVIDALQYKLEGTTRLTRKRGLKLATALSLSNKFVEGS(SEQ ID NO：42)，(3)ApoE(159-167)2：(LRKLRKRLL)2(SEQ ID NO：10)，(4)肽-22：Ac-C(&)MPRLRGC(&)-NH 2(SEQ ID NO：43)，(5)THR：THRPPMWSPVWP-NH 2(SEQ ID NO：44)，(6)THR retro-enantio：pwvpswmpprht-NH 2(SEQ ID NO：45)，(7)CRT：C(&)RTIGPSVC(&)(SEQ ID NO：46)，(8)瘦素30：YQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVL(SEQ ID NO：47)，(9)RVG29：YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG-OH(SEQ ID NO：48)，(10)DCDX：GreirtGraerwsekf-OH(SEQ ID NO：49)，(11)Apamin：C(&1)NC(&2)KAPETALC(&1)-ARRC(&2)QQH-NH 2(SEQ ID NO：50)，(12)MiniAp-4：[Dap](&)KAPETALD(&)(SEQ ID NO：51)， (13)GSH：γ-L-麩胺醯基-CG-OH(14)G23：HLNILSTLWKYRC(SEQ ID NO：52)，(15)g7：GFtGFLS(O-β-Glc)-NH 2(SEQ ID NO：53)，(16)TGN：TGNYKALHPHNG(SEQ ID NO：54)，(17)TAT(47-57)：YGRKKRRQRRR-NH 2(SEQ ID NO：55)，(18)SynB1：RGGRLSYSRRRFSTSTGR(SEQ ID NO：56)，(19)二酮基哌
Figure TW201942139A_D0013
：&(N-MePhe)-(N-MePhe)二酮基哌
Figure TW201942139A_D0014
，或(20)PhPro：(苯基脯胺酸)4-NH 2(SEQ ID NO：57)，但肽不受此限制。
上述序列中，&為依據(J.Pept.Res.,2005,65,550-555；J.Spengler等人)所說明環狀肽命名法之代號，且「&」表示連結點。例如：單一鏈中第一個「&」表示化學鍵端點位置，及第二個「&」表示化學鍵附接位置。例如：「&Ala-Ala-Phe-Leu-Pro&」意指在丙胺酸與脯胺酸之間形成化學鍵，藉以形成環狀肽。若其中有兩個或更多個化學鍵，則可採用如：&1與&2之代號來表示形成對應化學鍵之位置。例如：若其中以「&1Asp(&2)-Trp-Phe-Dpr(&2)-Leu-Met&1」表示時，意指在Asp與Met之間形成化學鍵，及在Asp與Dpr之間形成化學鍵。同時，[Dap]代表二胺基丙酸。
本文所採用術語「生理活性物質」可為形成以腦為標靶之長效接合物之部份體之組成份，統稱具有某些活體內生理活性之物質，且此等物質具有多種不同生理活性。生理活性物質X可為由2個胺基酸至1,000個胺基酸、2個胺基酸至950個胺基酸、2個胺基酸至900個胺基 酸、2個胺基酸至850個胺基酸、2個胺基酸至800個胺基酸、2個胺基酸至750個胺基酸、2個胺基酸至700個胺基酸、5個胺基酸至700個胺基酸、5個胺基酸至650個胺基酸、5個胺基酸至600個胺基酸、5個胺基酸至550個胺基酸、5個胺基酸至500個胺基酸、5個胺基酸至450個胺基酸、5個胺基酸至400個胺基酸、5個胺基酸至350個胺基酸、5個胺基酸至300個胺基酸、5個胺基酸至250個胺基酸、5個胺基酸至200個胺基酸、5個胺基酸至150個胺基酸、5個胺基酸至100個胺基酸、5個胺基酸至90個胺基酸、約5個胺基酸至約80個胺基酸、5個胺基酸至70個胺基酸、5個胺基酸至60個胺基酸、5個胺基酸至50個胺基酸、5個胺基酸至40個胺基酸、5個胺基酸至30個胺基酸、5個胺基酸至25個胺基酸、或5個胺基酸至20個胺基酸組成之多肽，但不受此限制。構成該生理活性物質之多肽包括所有肽、寡肽、多肽、或蛋白質。
該生理活性物質可為毒素或生理活性多肽，且可包括各種不同生理活性多肽，如細胞激素、介白素、介白素結合性蛋白質、酵素、抗體、生長因子、轉錄因子、凝血因子、疫苗、結構蛋白質、配體蛋白質或受體、細胞表面抗原、及用於預防或治療人類疾病之受體拮抗劑、於小腸與胰臟中分泌且對糖尿病與肥胖症具有醫療效力之生理活性肽、及G蛋白質偶聯受體(GPCR)促效劑或拮抗劑、或其類似物，生理活性物質不受其等限制。
本文所採用術語「X之類似物」係指具有與X相同活性型態之物質，其包括所有X之促效劑、X之衍生物、X之片段、X之變體等等。
明確言之，該毒素可選自具有針對癌細胞細胞凋亡之效力之：美登素(maytansine)與/或其衍生物、微管蛋白抑制素(auristatin)與/或其衍生物、倍癌黴素(duocarmycin)與/或其衍生物、吡咯并苯并二氮呯(PBD)與/或其衍生物，但亦包括對癌細胞之細胞凋亡有效之任何毒素，沒有限制。
明確言之，生理活性多肽實例可包括GLP-1受體促效劑、升糖素受體促效劑、胃抑制性多肽(GIP)受體促效劑、纖維母細胞生長因子(FGF)受體促效劑(FGF1、FGF19、FGF21、FGF23等等)、膽囊收縮素受體促效劑、胃泌素受體促效劑、黑皮質素受體促效劑、人類生長激素、生長激素釋放激素、生長激素釋放肽、干擾素與干擾素受體(例如，干擾素-α、-β與-γ、可溶型I干擾素受體等等)、群落刺激因子、介白素(例如，介白素-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12、-13、-14、-15、-16、-17、-18、-19、-20、-21、-22、-23、-24、-25、-26、-27、-28、-29、-30等等)與介白素受體(例如：IL-1受體、IL-4受體等等)、酵素(例如：β-葡萄糖苷酶)、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸酯酶、酸性α-葡萄糖苷酶、酸性神經醯胺酶、酸性神經鞘磷脂酶、半乳糖神經醯胺酶、芳基硫酸酯酶A、B、β-己醣胺酶A、B、肝素N-硫酸酯酶、α-D-甘露糖苷酶、β-葡萄醣醛酸酶、N-乙醯半乳糖胺-6硫酸酯酶、溶小體酸性脂酶、α-N-乙醯基-葡萄糖胺酶、葡萄糖神經醯胺酶、丁醯基膽鹼酯酶、幾丁質酶、麩胺酸脫羧酶、伊米苷酶(imiglucerase)、脂酶、尿酸酶、血小板活化因子乙醯基水解酶、中性肽鏈內切酶、髓過氧化物酶、α-半乳糖苷酶-A、阿爾 發半乳糖苷酶(agalsidase)、α、β、α-L-艾杜糖醛酸酶、丁醯基膽鹼酯酶、殼糖酶、麩胺酸脫羧酶、伊米苷酶(imiglucerase)、脂酶、尿酸酶、血小板活化因子乙醯基水解酶、中性肽鏈內切酶、及髓過氧化物酶等等)、介白素與細胞激素結合性蛋白質(例如：IL-18bp、TNF結合性蛋白質等等)、巨噬細胞活化因子、巨噬細胞肽、B細胞因子、T細胞因子、蛋白質A、抑制過敏因子、壞死糖蛋白、免疫毒素、淋巴毒素、腫瘤壞死因子、腫瘤壓制劑、轉化生長因子、α-1抗胰蛋白酶、白蛋白、α-乳白蛋白、載脂蛋白-E、紅血球生成素、高糖化紅血球生成素、血管生成素、血紅素、凝血酶、凝血酶受體活化肽、凝血酶調節素、凝血因子VII、凝血因子VIIa、凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血因子XIII、血纖維蛋白溶酶原活化劑、纖維蛋白結合性肽、尿激酶、鏈激酶、水蛭素、蛋白質C、C-反應性蛋白質、腎素抑制劑、膠原酶抑制劑、超氧化物歧化酶、瘦素、血小板衍生之生長因子、上皮生長因子、表皮生長因子、血管新生抑制素、血管收縮素、骨成形性生長因子；骨成形性蛋白質、抑鈣激素、胰島素、心房肽、軟骨誘發因子、依降鈣素(elcatonin)、結締組織活化因子、組織因子途徑抑制劑、促濾泡激素、黃體激素、黃體激素釋放激素、神經生長因子(例如：神經生長因子、睫神經營養因子、軸突生成因子-1、腦利鈉肽、膠質細胞源性神經營養因子、神經突起導向因子(netrin)、嗜中性球抑制因子、神經營養因子、神經營養蛋白(neurturin))、副甲狀腺激素、鬆弛素、胰泌素、體介素、類胰島素生長因子、腎上腺皮質素、升糖素、膽囊收縮素、胰多肽、胃泌素釋放肽、促腎上腺皮質激素釋放因子、促甲狀腺激素、自分泌運動因子、乳鐵蛋白、肌肉生長抑制素、活性依賴 性神經保護性蛋白(ADNP)、β-分泌酶1(BACE1)、類澱粉蛋白前驅蛋白(APP)、神經細胞附著分子(NCAM)、類澱粉蛋白β、Tau、晚期糖基化終產物受體(RAGE)、α-突觸核蛋白(synuclein)、或其促效劑或拮抗劑、其受體(例如：TNFR(P75)、TNFR(P55)、IL-1受體、VEGF受體、B細胞活化因子受體等等)、受體拮抗劑(例如：IL1-Ra等等)、細胞表面抗原(例如，CD 2、3、4、5、7、11a、11b、18、19、20、23、25、33、38、40、45、69等等)、單株抗體、多株抗體、抗體片段(例如：scFv、Fab、Fab'、F(ab')2與Fd)、由病毒衍生之疫苗抗原、激活至少一種受體促效劑之雜合多肽或嵌合多肽等等，但生理活性多肽不受此限制。
本文所採用術語「艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶」係與韓特氏症候群(Hunter syndrome)(MPS-II)有關之硫酸酯酶酵素，為硫酸肝素與硫酸皮膚素之溶小體降解作用必要之酵素。一項本發明實施例中，「艾杜硫酶(idursulfase)」為純化型艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，可作為艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶使用，該艾杜硫酶顯然包括在艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶中。艾杜硫酶可為例如，艾杜硫酶α或艾杜硫酶β，但不受此限制。
艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶可採用相關技藝已知之方法製備或製造，明確言之，其可從已插入動物細胞表現載體且培養之動物細胞中，在培養後純化，或可自商品購買酵素使用，但艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶之製法不受其等限制。
本發明適用之生理活性多肽可為天然型，或彼等由原核細胞(如大腸桿菌(埃希氏菌屬(Escherichia)coli)或真核細胞(如酵母細胞、昆蟲細胞、或動物細胞)之基因重組法製備者。此外，生理活性多肽可為具 有與天然型或相同物種同等活性之類似物(例如，在一或多個胺基酸位置之突變衍生物)，但適用之生理活性多肽不受此限制。
同時，GLP-1受體促效劑可選自下列各物組成之群中：天然外泌肽-4；外泌肽-4衍生物，其中該外泌肽-4之N-末端胺基已缺失；外泌肽-4衍生物，其中該外泌肽-4之N-末端胺基係經羥基取代；外泌肽-4衍生物，其中該外泌肽-4之N-末端胺基係經二甲基修飾；外泌肽-4衍生物，其中該外泌肽-4之N-末端胺基係經羧基取代；外泌肽-4衍生物，其中該外泌肽-4之第一個胺基酸組胺酸之α-碳已缺失；外泌肽-4衍生物，其中該外泌肽-4之第12個胺基酸離胺酸被絲胺酸取代、及外泌肽-4衍生物，其中該外泌肽-4之第12個胺基酸離胺酸被精胺酸取代，但GLP-1受體促效劑不特別受此限制。
在一項明確實施例中，本發明提供一種以腦為標靶之長效接合物，其特徵在於生理活性物質經由相互結合性，連接已與免疫球蛋白Fc區融合之以腦為標靶之肽之免疫球蛋白Fc區。
本文所採用術語「F」係指包括免疫球蛋白恆定區與FcRn-結合區之物質，及明確言之，其相當於構成本發明以腦為標靶之長效接合物之一個部份體。例如，F可為包括FcRn-結合區之免疫球蛋白Fc區。
由於免疫球蛋白Fc區為可於活體內代謝之生物降解性多肽，其可安全用為藥物載劑。此外，相較於免疫球蛋白完整分子，免疫球蛋白Fc區具有相當低分子量，有利於接合物之製備、純化、及產率。此外，由於已移除Fab區(其因具有不同於抗體之胺基酸序列而與抗體具有高度異質性)，因此應可大幅提高物質之同質性，亦可降低誘發血液抗原 性之風險。
已與免疫球蛋白Fc區融合之以腦為標靶之肽接合物係藉由肽鍵連接免疫球蛋白Fc區，且在表現該肽接合物之宿主細胞中製得該長效接合物。該表現宿主可為微生物，如大腸桿菌(Escherichia coli)或酵母細胞、昆蟲細胞、動物細胞等等，沒有限制。
本文所採用術語「免疫球蛋白恆定區」可為形成以腦為標靶之長效接合物之部份體之組成份，且包括重鏈恆定區2(CH2)與重鏈恆定區3(CH3)，不包括免疫球蛋白之重鏈與輕鏈可變區及輕鏈恆定區(CL1)。鉸鏈區可包括在重鏈恆定區中。
免疫球蛋白恆定區可為免疫球蛋白Fc區。
F之免疫球蛋白恆定區可包括1至4個選自下列各物組成之群中之域：CH1、CH2、CH3、及CH4域。
本發明免疫球蛋白恆定區可為1)CH1域、CH2域、CH3域、及CH4域，2)CH1域與CH2域，3)CH1域與CH3域，4)CH2域與CH3域，及5)選自：CH1域、CH2域、CH3域、及CH4域中一或兩個或更多個域與免疫球蛋白之鉸鏈區(或一部份鉸鏈區)之間之組合(例如：CH2域與CH3域與鉸鏈區(或一部份鉸鏈區)之間之組合)，及6)重鏈恆定區與輕鏈恆定區之各域之間之二聚體。本發明鉸鏈區不僅包括天然鉸鏈區，而且包括相關技藝已知所有鉸鏈區之一部份。
明確言之，F之免疫球蛋白恆定區可以包括鉸鏈區、CH2域、及CH3域，但不特別受此限制。
此外，本發明免疫球蛋白Fc區不僅包括天然胺基酸序列， 而且包括其序列衍生物(突變體)。胺基酸序列衍生物係指其中至少一個胺基酸殘基因缺失、插入、非保留性或保留性取代、或其組合而有差異之胺基酸序列。例如：已知位置214至238、297至299、318至322、或327至331之胺基酸殘基對免疫球蛋白Fc之接合很重要，可用為適合修飾之位點。此外，可能使用各種不同其他種類之衍生物，包括已缺失可以形成二硫鍵的一區或缺失天然Fc之N-末端之一些胺基酸殘基或在天然Fc之N-末端增加甲硫胺酸殘基者。此外，為了移除效應子功能，可以缺失補體結合位點，如C1q結合位點與抗體依賴性細胞介導細胞毒性作用(ADCC)位點。製備此等免疫球蛋白Fc區之序列衍生物之技術已揭示於國際專利公告案編號WO 97/34631、WO 96/32478等等。
相關技藝上已知一般不會改變蛋白質或肽活性而在蛋白質與肽中進行之胺基酸交換(H.Neurath,R.L.Hill,The Proteins,Academic Press,New York,1979)。最常發生之交換為Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、及Asp/Gly。有些例子中，Fc區可經過磷酸化、硫酸化、丙烯酸化、糖基化、甲基化、法呢基化、乙醯化、醯胺化等等修飾。
上述免疫球蛋白恆定區衍生物可為彼等顯示與本發明免疫球蛋白恆定區同等生物活性且具有針對熱、pH等等之改良之結構安定性。
例如：免疫球蛋白Fc區可為其中可能沒有出現鏈交換功能者。
此外，F(明確言之免疫球蛋白Fc區)可為二聚體型，其中兩個包含鉸鏈區、CH2域、與CH3域之單股多肽鏈係利用二硫鍵連接。
構成免疫球蛋白Fc區之鉸鏈區可包含或基本上其組成為胺基酸序列SEQ ID NO：14，或可為胺基酸序列SEQ ID NO：14中第二個胺基酸絲胺酸(Ser，S)經修飾形成脯胺酸(Pro，P)者，但不特別受此限制。
構成免疫球蛋白Fc區之CH2域可包含或基本上其組成為胺基酸序列SEQ ID NO：15，或可為胺基酸序列SEQ ID NO：15中第67個胺基酸天冬醯胺(Asn，N)經修飾形成麩醯胺(Gln，Q)者，但不特別受此限制。
更明確言之，F係呈二聚體型，其中兩個包含衍生自IgG之鉸鏈區、CH2域、與CH3域之單股多肽鏈係藉由二硫鍵連接，其中該鉸鏈區包含胺基酸序列SEQ ID NO：14或胺基酸序列SEQ ID NO：14中第二個胺基酸絲胺酸(Ser，S)經修飾形成脯胺酸(Pro，P)之胺基酸序列，及/或CH2域包含胺基酸序列SEQ ID NO：15或胺基酸序列SEQ ID NO：15中第67個胺基酸天冬醯胺(Asn，N)經修飾形成麩醯胺(Gln，Q)之胺基酸序列，及/或CH3域包含胺基酸序列SEQ ID NO：16，但其不受此限制。
明確言之，構成F之包含免疫球蛋白恆定區之單股多肽鏈可為胺基酸序列SEQ ID NO：105中第2個胺基酸被脯胺酸取代；第71個胺基酸被麩醯胺取代；或第二個胺基酸被脯胺酸取代且第71個胺基酸被麩醯胺取代者。更明確言之，構成F之包含免疫球蛋白恆定區之單股多 肽鏈可為包括胺基酸序列SEQ ID NO：106者，但不特別受此限制。
此外，免疫球蛋白Fc區可為得自從人類或動物，如牛、羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠、天竺鼠等等活體內單離之天然型，或可為得自轉化動物細胞或微生物之重組體或其衍生物。本文中，Fc區可得自天然免疫球蛋白，其係從活的人體或動物體單離之完整免疫球蛋白，再以蛋白酶處理已單離之免疫球蛋白。當使用木瓜酵素處理該完整之免疫球蛋白時，其會裂解成Fab與Fc區，而當使用胃蛋白酶該完整之免疫球蛋白時，其會裂解成pF'c與F(ab)2片段。此等片段可採用分子篩析層析法分離等等單離。更明確實施例中，與人類衍生之Fc區有關時，該免疫球蛋白Fc區可為得自微生物之重組免疫球蛋白Fc區。
此外，免疫球蛋白恆定區可呈天然聚醣型、比天然型更長或更短之聚醣型、或脫糖基化型。可採用常用方法延長、縮短、或脫除免疫球蛋白Fc聚醣，如化學法、酵素法、及使用微生物之基因工程法。脫除Fc區之聚醣所得到之免疫球蛋白Fc區顯示顯著降低其與補體(C1q部份)之結合親和力，並降低或排除抗體依賴性細胞毒性或補體依賴性細胞毒性，因此不會誘發活體內不必要之免疫反應。基於此點，以脫糖基化或無糖基化免疫球蛋白Fc區中之免疫球蛋白Fc區為符合本發明原始目的作為藥物載劑之較適合型式。
本文所採用術語「脫糖基化」係指使用酵素脫除Fc區之糖部份體，及術語「無糖基化」係指由原核細胞生物，更明確言之大腸桿菌(E.coli)製造之未糖基化免疫球蛋白恆定區。
同時，免疫球蛋白Fc區可衍生自人類或其他動物，包括 牛、羊、豬、小鼠、兔、倉鼠、大鼠、與天竺鼠，以衍生自人類較佳。
此外，免疫球蛋白(Ig)Fc區可衍生自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM、或其組合或雜合體。例如，其可衍生自IgG或IgM，其係人類血液中含量最多之蛋白質，且其可衍生自IgG，已知其可加強配體結合性蛋白質之半衰期。同時，本文所採用術語「組合」係指相同來源之編碼單鏈免疫球蛋白Fc區之多肽與不同來源之單鏈多肽連接形成二聚體或多聚體。亦即，可由選自：IgG Fc、IgA Fc、IgM Fc、IgD Fc、及IgE Fc片段所組成群中之二個或更多個片段製備二聚體或多聚體。
本文所採用術語「雜合體」係指免疫球蛋白Fc區之單鏈中出現對應於不同來源之二種或更多種免疫球蛋白Fc片段之序列。本發明中，可能有各種不同型態之雜合體。亦即，雜合體域可由1至4個選自由IgG Fc、IgM Fc、IgA Fc、IgE Fc、與IgD Fc之CH1、CH2、CH3、及CH4所組成群中之域組成，且可進一步包含鉸鏈區。
同時，IgG亦可分成IgG1、IgG2、IgG3與IgG4子群，而且本發明可包括其組合或雜合體，例如，IgG2與IgG4子群，明確言之，IgG4之Fc區幾乎沒有效應子功能，如補體依賴性細胞毒性(CDC)，但不受此限制。此外，在一項實施例中，免疫球蛋白Fc區可為IgG1 Fc區或IgG4 Fc區，但不受此限制。
本文所採用術語，式1之「L1與/或L2」，其係形成以腦為標靶之長效接合物之部份體之構成元素，係指連接以腦為標靶之肽或生理活性物質與免疫球蛋白Fc區之連接子。連接子基本上係指可以使用共價鍵等等連接兩個融合對象之連接體。除了連接融合對象以外，連接子亦 可具有在融合對象之間提供某個大小間隙或提供可撓性或剛性的角色，但連接子之角色不特別受此限制。
在一項明確實施例中，式1之L1與L2其中之一可為肽連接子，式1之L1與L2其中另一個可為非肽連接子。或者，式1之L1與L2其中之一可為肽連接子，式1之L1與L2其中另一個可為非肽連接子，及L1與L2二者均可為肽連接子，而L1與L2二者均可為非肽連接子，但式1之L1與L2不特別受此限制。
另一項明確實施例中，當式1之L1與L2中任一個或兩個為非肽連接子時，非肽連接子可為選自下列各物所組成群中：聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多醣、葡聚糖、聚乙烯乙基醚、生物降解性聚合物、脂質聚合物、幾丁質、玻尿酸、脂肪酸、高分子量聚合物、低分子量化合物、核苷酸、及其組合，但非肽連接子不受此限制。
又另一項明確實施例中，當L1為非肽連接子及L2為肽連接子時，肽連接子可包含0至1,000個胺基酸。另一項明確實施例中，當L1為非肽連接子及L2為肽連接子，及肽連接子不包含胺基酸時，F與Y(其係以腦為標靶之肽)可直接融合(例如：肽鍵)形成。
又另一項明確實施例中，當式1之L1與L2中任一個或兩個為肽連接子時，X與F、或F與Y利用L1與L2，藉由共價化學鍵、非共價化學鍵、或其組合彼此連接；且L1與L2分別包含0至1,000個胺基酸。當肽連接子不包含胺基酸時，X與F、或F與Y可利用肽鍵連接。
又另一項明確實施例中，當式1之L1與L2中任一個或兩 個為肽連接子，及L1與L2分別由0個胺基酸組成時，(i)X與F、或F與Y可藉由肽鍵連接；或(ii)X與F、或F與Y可藉由肽鍵連接。
本文所採用術語「肽連接子」包括連結兩個融合對象之肽接合物或胺基酸之聚合物。明確言之，肽連接子可能包含0至1,000個胺基酸序列、及更明確言之，0至900個胺基酸序列、0至800個胺基酸序列、0至700個胺基酸序列、0至600個胺基酸序列、0至500個胺基酸序列、0至400個胺基酸序列、0至300個胺基酸序列、0至250個胺基酸序列、0至200個胺基酸序列、0至150個胺基酸序列、0至100個胺基酸序列、0至90個胺基酸序列、0至80個胺基酸序列、0至70個胺基酸序列、0至60個胺基酸序列、0至50個胺基酸序列、0至40個胺基酸序列、0至30個胺基酸序列、0至25個胺基酸序列、0至20個胺基酸序列、0至15個胺基酸序列、或0至10個胺基酸序列，但胺基酸序列之數不特別受此限制。
此外，肽連接子實例包括由胺基酸序列組成之肽，其所呈之型式為其中GGGGS(SEQ ID NO：58)部份體、GS部份體、GGGS(SEQ ID NO：59)部份體、或GGSG(SEQ ID NO：60)部份體係重複的，且此等部份體可以重複1至10次，但部份體不特別受此限制。
此外，當L2為肽連接子時，L2為(GS)m、(GGS)m、(GGGS)m、或(GGGGS)m，及m可為1至10，但不受此限制。
又另一項明確實施例中，當L1與L2其中任一個為肽連接子，此二者其中另一個為非肽連接子時，肽連接子為包含0至1,000個胺基酸之連接子，及非肽連接子為聚乙二醇，但連接子不受其等限制。
本文所採用術語「非肽連接子」係指生物相容性連接子，其中連接兩個或更多重複單位，且由重複單位經由肽鍵以外之任何共價鍵彼此連接。
又另一項明確實施例中，當非肽連接子與X與Y係分別藉由其個別官能基連接時，非肽連接子之官能基可選自下列各物組成之群中：醛基、馬來醯亞胺基、及琥珀醯亞胺衍生物。L1可為在兩端具有官能基之非肽聚合物，且在兩端之官能基可為胺反應性基團或硫醇反應性基團，及在兩端之官能基可為彼此相同型態或彼此相異型態，但不受此限制。
非肽聚合物(其係本發明所使用之非肽連接子)可選自下列各物所組成群中：聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多醣、葡聚糖、聚乙烯乙基醚、生物降解性聚合物，如聚乳酸(PLA)與聚乳酸-乙醇酸(PLGA)、脂質聚合物、幾丁質、玻尿酸、寡核苷酸、及其組合，例如，聚乙二醇，但非肽聚合物不受限制。相關技藝已知之其衍生物及很容易在相關技藝之技術階層製備之衍生物亦包括在本發明範圍內。
有關本發明所使用之非肽聚合物，任何對活體內蛋白質降解作用具有抗性之聚合物均可使用，沒有限制。非肽聚合物之分子量可在0kDa以上至約100kDa之範圍內，例如：約0.5kDa至約100kDa、約1kDa至約100kDa、或約1kDa至約20kDa，但分子量不受此限制。
本文所採用術語「約」係指包括所有±0.5、±0.4、±0.3、±0.2、±0.1等等之範圍，且包括接在彼等數值之後之所有等同或類似數 值，但該範圍不受此限制。
此外，有關非肽連接子，不僅可使用單一一種聚合物，而且可以組合使用不同種類之聚合物。
同時，非肽聚合物(其係本發明使用之非肽連接子)可能具有與F及X或Y之官能基連接之官能基，因此免疫球蛋白Fc區與生理活性物質之間可以形成共價鍵。
明確言之，非肽連接子可具有至少兩個末端官能基，明確言之2或3個末端官能基，及更明確言之兩個末端官能基。
官能基可選自下列各物組成之群中：醛基、馬來醯亞胺基、及琥珀醯亞胺衍生物，但官能基不受此限制。
上文中，醛基實例可包括丙醛基或丁醛基，但醛基不受此限制。
上文中，琥珀醯亞胺衍生物實例可包括戊酸琥珀醯亞胺基酯、甲基丁酸琥珀醯亞胺基酯、甲基丙酸琥珀醯亞胺基酯、丁酸琥珀醯亞胺基酯、丙酸琥珀醯亞胺基酯、N-羥基琥珀醯亞胺、羥基琥珀醯亞胺基、羧甲基琥珀醯亞胺基酯、或碳酸琥珀醯亞胺基酯，但琥珀醯亞胺衍生物不受此限制。
非肽連接子兩端上之官能基可以彼此相同或相異。
例如，非肽連接子之一端之官能基可能為馬來醯亞胺基，及另一端之官能基可能為醛基(例如，丙醛基或丁醛基)。當使用兩端均具有羥基官能基之聚乙二醇作為非肽聚合物時，可以藉由已知化學反應，在各種不同反應性基團中激活羥基，或可以使用具有自商品購得之經修飾反 應基之聚乙二醇製備本發明接合物。
此外，非肽聚合物可為均官能性非肽聚合物，其中非肽連接子之所有兩端或三端均為醛基。
例如，非肽連接子可為兩端均具有丙醛基之非肽聚合物，明確言之，兩端均具有丙醛基之聚乙二醇，但不特別受此限制。
當非肽連接子之兩端均具有反應性醛基之官能基時，可以有效將非特異性反應降至最低，並在兩端分別連接生理活性多肽與免疫球蛋白。由醛鍵經還原性胺化法形成之最終反應產物之安定性顯著高於彼等由醯胺鍵形成者之安定性。醛官能基在低pH選擇在N-末端上反應，在高pH(例如：pH 9.0)，可以與離胺酸殘基形成共價鍵。
接合物包括免疫球蛋白Fc區(Fc區之二聚體型，其中連接單體Fc區)，其係由兩個鏈組成，且該分別結合兩個免疫球蛋白Fc區其中之一之生理活性物質可連接在免疫球蛋白Fc區之單一位點(單體Fc區)或兩個免疫球蛋白Fc區之兩個位點(Fc區之各二聚體型)。
化學結合性可為共價鍵，更明確言之為二硫鍵，及甚至更明確言之為在兩個免疫球蛋白Fc區之鉸鏈區中形成之二硫鍵，但結合性不特別受此限制。
更明確言之，該以腦為標靶之長效接合物可呈之型式係其中在以下二者之間利用化學鍵形成之二聚體：(i)第一個免疫球蛋白Fc區，其中以腦為標靶之肽係經由上述肽連接子(例如，肽鍵)連接其中一個免疫球蛋白Fc區分子之C-末端區，與(ii)第二個免疫球蛋白Fc區，其中以腦為標靶之肽係經由上述肽連接子(例如，肽鍵)連接其中一個免疫球蛋 白Fc區分子之C-末端區，及其中一個生理活性物質分子可連接兩個免疫球蛋白Fc區分子其中一個的N-末端區；或可呈之型式係其中生理活性物質連接兩個免疫球蛋白Fc區分子之各N-末端區，但該等型式不特別受此限制。呈融合蛋白質型式之第一個與第二個免疫球蛋白Fc區可以利用肽鍵，在免疫球蛋白Fc區與以腦為標靶之肽之間進行同義融合，且免疫球蛋白Fc區可能包括鉸鏈區、CH2域、與CH3域，但免疫球蛋白Fc區不特別受此限制。
第一個與第二個免疫球蛋白Fc區之間之化學鍵明確言之可能為共價鍵，更明確言之為二硫鍵，及更明確言之，為在兩個免疫球蛋白Fc區之鉸鏈區中形成之二硫鍵，但化學鍵不特別受此限制。
本發明又另一態樣提供一種編碼接合物之經分離之多核苷酸；包含該多核苷酸之表現載體；及包含該表現載體之宿主細胞。
編碼接合物之經分離之多核苷酸包括與對應序列具有75%或更高，明確言之85%或更高，更明確言之90%或更高，甚至更明確言之95%之同一性之多核苷酸，均包括在本發明範圍內。
根據本發明重組載體通常可以構築成載體或用於表現純系之載體，且可使用原核生物或真核生物細胞作為宿主細胞構築。
本文所採用術語「載體」係指可以在適當宿主細胞中表現標靶蛋白質之重組載體，其係包括以操縱方式連接之必要調節因子之基因構築體，以便表現基因插入物。
本發明以腦為標靶之長效接合物可以由重組載體於宿主細胞中進行轉化或轉染後製得。
本發明中，編碼該接合物之多核苷酸係以操縱方式連接啟動子。
包含根據本發明多核苷酸之重組載體之轉化方法不受上述實施例之限制，且可以採用相關技藝上常用之轉化或轉染方法，沒有限制。
由包含根據本發明多核苷酸之重組載體至進入宿主細胞中即可得到本發明轉形體。
適用於本發明之宿主沒有特別限制，只要其可以表現本發明多核苷酸即可。適當宿主實例可包括屬於埃希氏菌屬(Escherichia)之細菌，如大腸桿菌(E.coli)；屬於桿菌屬(Bacillus)之細菌，如枯草桿菌(Bacillus subtilis)；屬於假單胞菌屬之細菌(Pseudomonas)，如戀臭假單胞菌(Pseudomonas putida)；酵母，如畢赤酵母(Pichia pastoris)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；昆蟲細胞，如秋行軍蟲(Spodoptera frugiperda)(Sf9)，及動物細胞，如CHO、COS、或BSC等等。
本發明又另一態樣提供一種包含以腦為標靶之長效接合物之組成物。
在一項明確實施例中，該組成物可為醫藥組成物。
本發明又另一態樣提供一種以腦為標靶之長效接合物之用途，其係用於製備醫藥製劑。
本發明又另一態樣提供一種製備以腦為標靶之長效接合物之方法。
在一項明確實施例中，該製備方法可包含(a)培養宿主細胞；及(b)從培養之宿主細胞或其培養物回收以腦為標靶之長效接合物。
另一項明確實施例中，製備方法可包含：(i)製備：(a)X-L1-F，其中由X(其係生理活性物質)、L1(其係肽連接子或非肽連接子)、與F(其包含免疫球蛋白Fc區)連接；及(b)L2-Y，其中由Y(其係以腦為標靶之肽)、與L2(其係肽連接子或非肽連接子)連接；及(ii)連接(a)X-L1-F與(b)L2-Y。
特定言之，又另一項明確實施例中，(a)之L1可為肽連接子，及(b)之L2可為非肽連接子。
另一項明確實施例中，製備方法可包含：(i)製備：(a)X-L1，其中由X(其係生理活性物質)、與L1(其係肽連接子或非肽連接子)連接；及(b)F-L2-Y，其中由Y(其係以腦為標靶之肽)、L2(其係肽連接子或非肽連接子)、與F連接；及(ii)連接(a)X-L1與(b)F-L2-Y。
特定言之，又另一項明確實施例中，(a)之L1可為非肽連接子，及(b)之L2可為肽連接子。
另一項明確實施例中，製備方法可包括： (a)由L1(其係兩端具相同或相異反應性官能基之非肽聚合物)之任一個反應性官能基與X(其係游離之生理活性物質)反應，得到X-L1，其係已連接之物質，其中非肽聚合物經由末端，與生理活性物質共價鍵結；及(b)由F-L2-Y連接該已連接之物質之未反應末端之反應性官能基，得到X-L1-F-L2-Y。
根據前述實施例之製備方法中，(b)中，由已連接之物質之未反應末端上之反應性官能基連接下式2之Fa：
Figure TW201942139A_D0015
其中：Fa與Fb分別為單股多肽鏈，其包含鉸鏈區、CH2域、與CH3域，其中Fa與Fb係藉由鉸鏈區中之二硫鍵連接，藉以使該接合物包含Fc片段，及Fa係與L1共價鍵結；各BTPa1、......、BTPan彼此相同或相異，為以腦為標靶之肽；各BTPb1、......、BTPbn' 彼此相同或相異，為以腦為標靶之肽；各L2a1、......、L2an分別獨立地為肽連接子或非肽連接子；及各L2b1、......、L2bn' 分別獨立地為肽連接子或非肽連接子；其中n與n'分別獨立地為整數。
製備方法中，反應性官能基可選自下列各物組成之群中：醛基、馬來醯亞胺基、及琥珀醯亞胺衍生物。
醛基可為丙醛基或丁醛基。
琥珀醯亞胺衍生物可為羧甲基琥珀醯亞胺基酯、戊酸琥珀醯亞胺基酯、甲基丁酸琥珀醯亞胺基酯、甲基丙酸琥珀醯亞胺基酯、丁酸琥珀醯亞胺基酯、丙酸琥珀醯亞胺基酯、N-羥基琥珀醯亞胺、或碳酸琥珀醯亞胺基酯。
非肽聚合物之兩個末端之反應性官能基可為醛基。
同時，非肽聚合物可在其末端分別具有醛基與馬來醯亞胺基作為其反應性官能基。
同時，非肽聚合物可在其末端分別具有醛基與琥珀醯亞胺作為其反應性官能基。
製備方法可包括：培養宿主細胞，其包含編碼下式3之X-L1a-Fa-(L2a1-BTPa1)-......-(L2an-BTPan)之表現匣與編碼式3之X-L1b-Fb-(L2b1-BTPb1)-......-(L2bn' -BTPbn' )之表現匣；及從培養之宿主細胞或其培養物得到式3接合物：
Figure TW201942139A_D0016
其中：X為生理活性物質；L1a與L1b為肽連接子；Fa與Fb分別為單股多肽鏈，其包含鉸鏈區、CH2域、與CH3域，其中Fa與Fb係藉由鉸鏈區中之二硫鍵連接，藉以使該接合物包含Fc片段，及Fa與Fb係分別與L1a與L1b共價鍵結； 各BTPa1、......、BTPan彼此相同或相異，為以腦為標靶之肽；各BTPb1、......、BTPbn' 彼此相同或相異，為以腦為標靶之肽；各L2a1、......、L2an為肽連接子；及各L2b1、......、L2bn' 為肽連接子；其中n與n'分別獨立地為整數。
特定言之，X-L1a-Fa-(L2a1-BTPa1)-......-(L2an-BTPan)與X-L1b-Fb-(L2b1-BTPb1)-......-(L2bn' -BTPbn' )可呈融合蛋白質型式表現，且於再折疊過程中，Fa與Fb之間之結合可以形成接合物。
本發明又另一態樣提供以腦為標靶之肽、編碼以腦為標靶之肽之經分離之多核苷酸、包含該多核苷酸之表現載體、及包含該表現載體之轉化體。
同時，該以腦為標靶之肽可包括彼等呈肽本身、其鹽(例如：肽之醫藥上可接受之鹽)、或其溶劑合物等所有型式。
此外，該以腦為標靶之肽可為任何醫藥上可接受之型式。
鹽之種類沒有特別限制。然而，該鹽較佳為對個體(例如：哺乳動物)有效，但不特別受此限制。
術語「醫藥上可接受」係指在藥理-醫學判斷下，可以有效用於所計畫用途且不會誘發過度毒性、刺激性、過敏反應等等之物質。
本文所採用術語「醫藥上可接受之鹽」係指衍生自醫藥上可接受之無機鹽類、有機鹽類、或鹼類之鹽。合適鹽類實例可能包括鹽酸、溴酸、硫酸、硝酸、過氯酸、富馬酸、馬來酸、磷酸、乙醇酸、乳 酸、水楊酸、琥珀酸、對甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等等。衍生自合適鹼類之鹽實例可能包括鹼金屬，如鈉、鉀等等；鹼土金屬，如鎂；銨等等。
本文所採用術語「溶劑合物」係指由根據本發明肽或其鹽與溶劑分子之間形成之複合物。
編碼該以腦為標靶之肽之經分離之多核苷酸包括與相關序列具有75%或更高，明確言之85%或更高，更明確言之90%或更高，及甚至更明確言之95%之序列同一性之多核苷酸序列，均包括在本發明範圍內。
下文中，將會參考下列實例更詳細說明本發明。然而，此等實例僅供說明，本發明無意受此等實例限制。
實例1：其中連接免疫球蛋白Fc區與以腦為標靶之肽之融合蛋白質之製法
製備包含以腦為標靶之肽與生理活性多肽之長效接合物，其中由生物相容性物質(其包括免疫球蛋白恆定區且具有FcRn-結合區)、以腦為標靶之肽、及生理活性物質利用肽連接子，製備已與免疫球蛋白Fc區及以腦為標靶之肽連接之融合蛋白質。
基於此，選擇5種肽作為以腦為標靶之肽(表1)。
選擇包括鉸鏈區之IgG4 Fc區，作為可以延長所連接生理活性多肽半衰期之生物相容性物質，由包括鉸鏈區之IgG4 Fc區與以腦為標靶之肽在基因階層融合，並取各融合產物插入個別表現載體中。
融合蛋白質之合成法係由包括鉸鏈區之IgG4 Fc區與以腦為標靶之肽藉由肽連接子連接或採用直接融合法連接，明確言之，由包括鉸鏈區之IgG4 Fc區與以腦為標靶之肽藉由肽鍵連接(由韓國Bioneer Corporation合成)(表2)。由下表2之序列可見，該包含包括鉸鏈區之IgG4 Fc區與以腦為標靶之肽之融合蛋白質之製法係由以腦為標靶之肽之N-末端，使用連接子或採用直接融合法，連接IgG4 Fc區之C-末端。
由於該編碼以腦為標靶之肽(其已與合成之免疫球蛋白Fc區融合)之基因在其兩端包括NdeI與BamHI，因此由該基因插入pET22b 表現載體中，使用NdeI與BamHI消解。取該表現載體(其中已插入編碼與合成之免疫球蛋白Fc區融合之以腦為標靶之肽之基因)插入BL21(DE3)菌株中，藉以表現其中連接免疫球蛋白Fc區與以腦為標靶之肽之長效融合蛋白質。
實例2：以腦為標靶之肽製法
為了檢測已與免疫球蛋白Fc區融合之各種不同以腦為標靶之肽，另外設計及合成包括以腦為標靶之BTP1至BTP5之肽(表3)。
為了證實以腦為標靶之肽確實可以以腦為標靶，而進行活體內及活體外試驗。
實例3：以腦為標靶之肽之胞移作用分析法
進行胞移作用實驗，以測定以腦為標靶之肽通過血腦障壁(BBB)之量。取hCMEC/D3細胞(係人類腦內皮細胞)於微孔膜，依5×104個細胞/cm2濃度培養10天。為了證實BBB形成，使用FITC-葡聚糖(70kDa)進行滲透性試驗，藉以證實有緊密的結合形成。然後，取25mM FITC-BTP5、FITC-BTP11、FITC-BTP12、FITC-BTP16、及FITC-外泌肽4、FITC-P-8(陰性對照組，P-8)置於hCMEC/D3細胞上。在2小時及24小時後，測定FITC之螢光強度(第1圖)。
結果，所有BTP之通過量均顯示高於彼等外泌肽-4及陰性對照組(P-8)。證實以腦為標靶之肽(如BTP5、BTP11、及BTP16)之通過量會隨時間提高。
此等結果顯示，以腦為標靶之肽已在本發明中證實可以有效通過BBB。
實例4：證實以腦為標靶之肽之腦分佈
於小鼠中進行腦分佈試驗，以測定以腦為標靶之肽之BBB通過量。經由小鼠之總頸動脈(CCA)對小鼠投與濃度2mg/隻，分離小鼠腦部，切成片段，在顯微鏡下，利用FITC之螢光觀察以腦為標靶之肽之BBB通過量(第2圖)。
基於注射特性，經由CCA注射之以腦為標靶之肽一定會分 佈在腦部區域的一邊，因此在放大12.5倍的顯微鏡下可能會觀察到分佈在腦部一邊的試驗結果。此外，使用放大200倍的顯微鏡證實，在含有在長期記憶扮演重要角色的海馬迴細胞體之區域中觀察到FITC螢光。由此等結果證實，以腦為標靶之肽通過BBB並進入腦組織。
此等結果顯示本發明以腦為標靶之肽不僅可於活體外用於靶向腦部，而且可於活體內進入腦部，表示已與以腦為標靶之肽連接之生理活性物質亦可通過BBB並有效傳送至腦部。此外，此等結果顯示，呈長效接合物型式之本發明接合物可以延長活體內效期，且隨著效期延長，可以更有效進行靶向腦部。
實例5：包含免疫球蛋白Fc區與以腦為標靶之肽之融合蛋白質之表現載體製法
構築可以表現其他融合蛋白質之表現載體。選擇包含鉸鏈區之IgG4 Fc區作為可以延長所連接生理活性多肽之半衰期之生物相容性物質，並由包含鉸鏈區之IgG4 Fc區與以腦為標靶之肽在基因階層融合，取融合產物嵌入個別表現載體中。
融合蛋白質之合成法係由包括鉸鏈區之IgG4 Fc區與以腦為標靶之肽，利用肽連接子連接或採用直接融合法連接，及明確言之，藉由肽鍵連接包括鉸鏈區之IgG4 Fc區與以腦為標靶之肽(由韓國Bioneer Corporation合成)(表4)。由下表4之序列可見，包含IgG4 Fc區(其具有下表4序列且包括鉸鏈區)與以腦為標靶之肽之融合蛋白質製法係由以腦為標靶之肽之N-末端使用連接子或採用直接融合法，連接IgG4 Fc區之C-末端。
由於該編碼以腦為標靶之肽(其已與合成之免疫球蛋白Fc區融合)之基因在其兩端包括NdeI與BamHI，因此由該基因插入pET22b 表現載體中，使用NdeI與BamHI消解。取該表現載體(其中已插入編碼與合成之免疫球蛋白Fc區融合之以腦為標靶之肽之基因)插入BL21(DE3)菌株中，藉以表現其中連接免疫球蛋白Fc區與以腦為標靶之肽之長效融合蛋白質。
實例6：其中連接免疫球蛋白Fc區與至少兩個以腦為標靶之肽之融合蛋白質之表現載體製法
構築可以表現其他融合蛋白質之表現載體，以提高受體結合親和力。選擇包括鉸鏈區之IgG4 Fc區作為可以延長所連接生理活性多肽半衰期之生物相容性物質，並在基因階層，採用定點誘變法PCR，由連接子與以腦為標靶之肽插入所構築之表現載體。明確言之，採用表5所揭示SEQ ID NO之引子，由連接子與以腦為標靶之肽插入免疫球蛋白Fc區之C-末端與以腦為標靶之肽之N-末端之間，或以腦為標靶之肽之C-末端與包括載體之BamHI位點之位點之間。構築表現融合蛋白質(表6)之表現載體，該融合蛋白質包含兩個或更多個複製之以腦為標靶之肽。此等融合蛋白質具有表6所示之序列。例如，Fc-BTP22接合物中，連接子穿插在兩個表2之BTP5肽單位之中，藉以連接在Fc片段CH3區之C-末端方向。明確言之，由下表6證實，可由免疫球蛋白Fc區之C-末端與各以腦為標靶之肽之N-末端，藉由肽連接子或採用直接融合法連接，製成融合蛋白質。此時，以腦為標靶之肽係呈串聯方式連接，因此該以腦為標靶之肽係呈由單一單位之以腦為標靶之肽利用連接子連接之型式。
實例7：其中融合免疫球蛋白Fc區與以腦為標靶之肽之融合蛋白質之表現
其中連接免疫球蛋白Fc區與以腦為標靶之肽之融合蛋白質 係於pET22b載體之T7啟動子(Novagen)調控下進行表現。由大腸桿菌(E.coli)BL21-DE3(E.coli B F-dcm ompT hsdS(rB - mB -)gal λDE3)；Novagen)使用各構築之表現載體轉化。根據Novagen建議之方法進行轉化。收集其中已轉化各重組表現載體之單一純系，接種至包含胺苄青黴素(ampicillin)(50μg/mL)之2×Luria營養液(LB)培養基中，於37℃培養15小時。取重組菌株培養液與包含30%甘油之2×LB培養基依1：1比例混合(v/v)，各取1mL混合物等份加至凍存管中，存放在-140℃，所得物質用為製造重組融合蛋白質之細胞母液。
為了表現其中融合免疫球蛋白Fc區與以腦為標靶之肽之接合物，讓每一小瓶細胞母液溶解，接種至500mL之2×Luria營養液(LB)中，於37℃之振盪水浴中培養14至16小時。當600nm之OD到達4.0或更高時，結束培養，所得培養物用為菌種培養基。取菌種培養基(1.6L)接種至發酵培養基中，開始進行初次批式發酵。培養條件為37℃，供應空氣(2L/分鐘；1vvm)，及攪拌速率(650rpm)，使用20%氨水溶液維持pH在6.70。發酵進程中，當培養物之營養素受到限制時，添加饋料溶液進行饋料批式培養。依據OD值追蹤細菌生長，當OD值達到120或更高時，引進IPTG至終濃度為0.5mM為止。引進後繼續進行培養約23至25小時。培養完成時，離心收集重組菌株，存放在-80℃備用。
實例8：其中融合免疫球蛋白Fc區與以腦為標靶之肽之融合蛋白質之回收及再折疊
打破細胞，再折疊，由實例7所表現之融合蛋白質(其中由各免疫球蛋白Fc區與各以腦為標靶之肽融合)轉化成可溶型。取相當於 200mL各細胞培養營養液之細胞集結塊再懸浮於200mL溶胞緩衝液(50mM Tris、pH 9.0、1mM EDTA(pH 8.0)、0.2M NaCl、及0.5% Triton X-100)中。使用微射流破菌機M-110EH(機型M1475C，AC Technology Corp.)，在壓力15,000psi打破細胞。打破之細胞溶胞物於12,200×g與4℃離心30分鐘，上清液棄置，再懸浮於200mL溶胞緩衝液(0.5% Triton X-100與20mM Tris(pH 8.0))中。於12,200×g及4℃離心30分鐘後，取集結塊再懸浮於200mL洗滌緩衝液(20mM Tris(pH 8.0))，然後再依相同方式離心。集結塊再懸浮於100mL緩衝液(8M胍-HCl與50mM Tris(pH 8.0))中，於室溫攪拌2小時。2小時後，所得物於12,200×g與23℃離心30分鐘，收集上清液。然後，添加2.5mM二硫蘇糖醇，混合物於37℃攪拌30分鐘。由融合蛋白質(其中由溶解之免疫球蛋白Fc區與以腦為標靶之肽融合)進行再折疊時，使用蠕動幫浦，依流速1mL/min，添加3.5L緩衝液(3M尿素、1mM半胱胺酸、0.160M精胺酸、50mM Tris(pH 9.2)、及20%甘油)，同時在4℃攪拌36小時。融合蛋白質(其中由溶解之免疫球蛋白Fc區與以腦為標靶之肽融合)中之免疫球蛋白Fc區係呈二聚體表現。
實例9：採用親和性層析法純化
當再折疊完成時，樣本於12,200×g與4℃離心30分鐘，收集上清液，使用Satorius濾器(0.22μm)過濾，及使用50% HCl調整樣本pH至pH 7.5。讓樣本結合在已經過10mM Tris(pH 7.0)緩衝液平衡之蛋白質A-sepharose(GE Healthcare)管柱，然後使用10mM檸檬酸鈉(pH 3.3)與10%甘油緩衝液，溶離其中融合免疫球蛋白Fc區與以腦為標 靶之肽之接合物蛋白質。
實例10：採用疏水性層析法純化
在溶出之樣本中添加0.6M硫酸銨後，讓含有0.6M硫酸銨之樣本結合在已使用10mM Tris(pH 7.0)緩衝液與作為緩衝液之0.6M硫酸銨平衡之苯基HP(GE Healthcare)管柱，使用10mM Tris(pH 7.5)緩衝液，依0%至100%之線性濃度梯度，使用6份管柱體積，溶離其中融合免疫球蛋白Fc區與以腦為標靶之肽之融合蛋白質。
實例11：證實其中連接免疫球蛋白Fc區與以腦為標靶之肽之融合蛋白質之腦分佈
於小鼠中進行腦分佈試驗，以測定其中連接免疫球蛋白Fc區與以腦為標靶之肽之融合蛋白質之血腦障壁通過量。經由靜脈內注射投與小鼠濃度10mg/kg。2小時後，分離小鼠之腦部，測定其中連接免疫球蛋白Fc區與以腦為標靶之肽之融合蛋白質之濃度，藉以證實融合蛋白質之血腦障壁通過量(第3圖)。
結果，測得免疫球蛋白Fc區與以腦為標靶之肽之血腦障壁通過量顯示高於彼等免疫球蛋白Fc區之通過量，且腦中免疫球蛋白Fc區與以腦為標靶之肽濃度高於免疫球蛋白Fc區濃度之程度高於在血清中之程度。已證實，若融合蛋白質中由兩種或更多種相同種類以腦為標靶之肽連接免疫球蛋白Fc區時，所測得之濃度高於僅連接一種以腦為標靶之肽時之濃度，亦顯示具有較高T/S比值。
此等結果建議，其中免疫球蛋白Fc區與該以腦為標靶之肽之本發明融合蛋白質可以有效通過BBB並傳送進入腦部。此外，此等結 果建議，呈長效接合物型式之本發明融合蛋白質可提高其活體內效期，且隨著效期提高可以更有效地靶向腦部。
下文中，進行進一步實驗來證實本發明長效融合蛋白質即使其中已由生理活性物質與其中已連接免疫球蛋白Fc區與以腦為標靶之肽之長效融合蛋白質連接，是否仍可以通過BBB有效傳送至腦部，藉以具有生理活性。
實例12：包含艾杜硫酶與PEG之接合物製備
製備包含艾杜硫酶之以腦為標靶之長效接合物(約72kDa)作為包含典型大小之蛋白質作為生理活性物質之以腦為標靶之長效接合物實例。首先如下製備經單-聚乙二醇基化之接合物作為以腦為標靶之長效接合物之前體，其中由聚乙二醇作為連接子連接艾杜硫酶。
待艾杜硫酶(Shire，Ireland)濃縮至適當濃度後，用於10K丁基-ALD(2)PEG(10kDa聚乙二醇，其中兩端之氫分別經修飾形成丁醛，NOF，Japan)之聚乙二醇基化時，在艾杜硫酶對10K丁基-ALD(2)PEG之莫耳比設定為1：10及艾杜硫酶濃度設定在10mg/mL之條件下，於4℃反應約2小時。特定言之，添加氰基氫硼化鈉(NaBH3CN)(亦即還原劑)至0.1M磷酸鉀緩衝液(pH 6.0)，進行反應。艾杜硫酶-10K PEG(其係經單-聚乙二醇基化之接合物)之純化法係使用磷酸鉀緩衝液(pH 6.0)與NaCl之濃度梯度，添加反應物至Source 15Q管柱(GE，USA)。
實例13：以腦為標靶之長效接合物之艾杜硫酶-10kDa PEG-Fc-BTP22接合物製備
然後製備以腦為標靶之長效接合物，其係由艾杜硫酶-10kDa PEG接合物連接包含Fc片段之以腦為標靶之肽。在設定艾杜硫酶-10K PEG對Fc-BTP22(亦即以腦為標靶之融合蛋白質之代表性實例)之莫耳比為1：10及艾杜硫酶濃度為10mg/mL，於25℃進行反應15小時。特定言之，添加杜氏(Dulbecco’s)磷酸鹽緩衝液(DPBS)及包含10mM NaBH3CN作為還原劑之溶液作為反應物。
當反應完成時，使用磷酸鈉緩衝液(pH 6.0)與NaCl之濃度梯度，添加反應物至Source 15Q管柱(GE，USA)，然後使用硫酸銨之濃度梯度與磷酸鈉(pH 6.0)添加至Source 15ISO管柱(GE，USA)，藉以純化艾杜硫酶-10K PEG-Fc-BTP22(其係所需之以腦為標靶之長效接合物)。艾杜硫酶-10K PEG-Fc-BTP22可以與艾杜硫酶-Fc-BTP22交換使用。
實例14：包含GIP衍生物與PEG之接合物製備
製備具有葡萄依賴性促胰島素多肽(GIP)受體刺激活性之人造GIP衍生物之以腦為標靶之長效接合物，作為包含典型大小之肽作為生理活性物質之以腦為標靶之長效接合物實例，其係由40個胺基酸殘基組成。如下製備單-聚乙二醇基化接合物作為長效接合物之前體，其中由聚乙二醇作為連接子，連接人造GIP衍生物。
由10K MAL-PEG-ALD(10kDa聚乙二醇，其中一端之氫原子經修飾形成3-[N-(3-N-馬來醯亞胺基-1-側氧基脯胺醯基)胺基]丙基，相反端之氫原子經修飾形成3-側氧基丙基(丙醛基)，NOF，Japan)在GIP衍生物之C-末端半胱胺酸進行聚乙二醇基化，於GIP衍生物對PEG 之莫耳比設定在1：1.3及GIP衍生物濃度設定在3mg/mL之條件下，於4℃反應約1小時。特定言之，該反應係在溶劑(50mM Tris-HCl(pH 7.5)+45%異丙醇)中進行。GIP衍生物-10K PEG(其係單-聚乙二醇基化接合物)係採用SP HP(GE，USA)管柱，使用檸檬酸鈉緩衝液(pH 3.0)+45%乙醇與KCl之濃度梯度進行純化。
實例15：GIP衍生物-10K PEG-Fc-BTP22接合物製備
然後製備以腦為標靶之長效接合物，其係由GIP衍生物-10K PEG接合物連接包含Fc片段之以腦為標靶之肽。該反應係在總反應濃度設定在4.55mg/mL，而GIP衍生物-10K PEG(於實例14中純化)對Fc-BTP22之莫耳比設定在1：2，於4℃進行16小時。特定言之，添加DPBS及含有作為還原劑之20mM NaBH3CN之溶液作為反應物。
反應完成時，使用磷酸鈉緩衝液(pH 7.5)與硫酸銨之濃度梯度施加反應物至Source 15ISO管柱(GE，USA)，然後再施加一次至相同管柱，藉以純化該所需以腦為標靶之長效接合物之GIP衍生物-10K PEG-Fc-BTP22。GIP衍生物-10K PEG-Fc-BTP22可與GIP衍生物-FcBTP22交換使用。
實例16：以腦為標靶之長效接合物之胞移作用之分析法
進行胞移作用實驗，以證實得自實例之以腦為標靶之長效接合物通過血腦障壁之通過量。取hCMEC/D3細胞(其係人類腦內皮細胞)於微孔膜上，依5×104個細胞/cm2之濃度培養10天。為了證實有BBB形成，使用FITC-葡聚糖(70kDa)進行滲透試驗，藉以證實有緊密連結形成。然後取25mM長效接合物置於hCMEC/D3細胞。2小時及4小 時後，採用ELISA套組測定蛋白質濃度。
結果，實例15之GIP衍生物-10K PEG-Fc-BTP22之血腦障壁通過量顯示高於對照組，並證實GIP衍生物-10K PEG-Fc-BTP22之通過量會隨時間提高(第4圖)。亦在實例13之艾杜硫酶-10K PEG-Fc-BTP22觀察到類似之通過量(未出示數據)。
此等結果顯示，本發明所證實之以腦為標靶之長效接合物可以有效通過BBB。
實例17：艾杜硫酶-10kDa PEG-Fc-BTP22接合物活性測定法
為了檢測根據艾杜硫酶-10K PEG-Fc-BTP22接合物製備之艾杜硫酶之比活性所出現之任何變化，進行酵素比活性之活體外實驗。由4-甲基傘形基(umbelliferyl)-α-L-吡喃艾杜糖醛酸-2-硫酸酯鈉鹽(4MU-α-idopyraA-2)(已知其為艾杜硫酶之酵素受質)與艾杜硫酶β及IDS-Fc-BTP22，於37℃反應4小時，然後與α-艾杜糖醛酸酶(其係酵素之第二受質)於37℃反應24小時。測定對應物質之螢光，可測得終產物4-甲基傘酮(umbelliferone)(4MU)之酵素活性(第5圖)。
游離之艾杜硫酶與艾杜硫酶-10K PEG-Fc-BTP22之結果顯示，其酵素活性分別為23.4±1.94nmol/min/μg與10.8±1.39nmol/min/μg。特定言之，以每單位重量轉化率(μg)之比活性計算酵素活性數值。亦即以游離艾杜硫酶為例，由酵素反應數除以重量即可得到數值，及以艾杜硫酶-10K PEG-Fc-BTP22為例，由酵素反應數除以艾杜硫酶在接合物中所佔重量轉化率，即可得到數值。總結，艾杜硫酶 -10K PEG-Fc-BTP22之酵素活性為46.6%，相較於艾杜硫酶，有稍微部份下降。然而，已證實即使當酵素製成本發明以腦為標靶之長效接合物時，仍可在對應接合物中觀察到顯著酵素活性。
實例18：其中連接免疫球蛋白Fc區與以腦為標靶之肽之融合蛋白質之表現載體製備
構築表現載體，以表現其他融合蛋白質。選擇包含鉸鏈區之IgG4 Fc區作為可以延長已連接之生理活性多肽之半衰期之生物相容性物質，並由包含鉸鏈區之IgG4 Fc區與以腦為標靶之肽在基因階層融合，再將融合產物插入個別表現載體中。
融合蛋白質之合成法係藉由肽連接子或直接融合法，連接包括鉸鏈區之IgG4 Fc區與以腦為標靶之肽，明確言之，藉由肽鍵，連接包括鉸鏈區之IgG4 Fc區與以腦為標靶之肽(由韓國Bioneer Corporation合成)(表7)。由下表7之序列可見，包含IgG4 Fc區(其具有下表7序列且包括鉸鏈區)與以腦為標靶之肽之融合蛋白質係藉由以腦為標靶之肽之N-末端連接IgG4 Fc區之C-末端，使用肽連接子或藉由直接融合法連接製成。
由於該編碼以腦為標靶之肽(其已與合成之免疫球蛋白Fc區融合)之基因在其兩端包括NdeI與BamHI，因此由該基因插入pET22b表現載體中，使用NdeI與BamHI消解。取該表現載體(其中已插入編碼與合成之免疫球蛋白Fc區融合之以腦為標靶之肽之基因)插入BL21(DE3)菌株中，藉以表現其中連接免疫球蛋白Fc區與以腦為標靶之肽之長效融合蛋白質。
實例19：證實其中連接免疫球蛋白Fc區與以腦為標靶之肽之融合蛋白質之腦分佈
於小鼠中進行腦分佈試驗，以測定其中連接免疫球蛋白Fc區與以腦為標靶之肽之融合蛋白質之血腦障壁(BBB)通過量。經由靜脈內注射，投與小鼠劑量10mg/kg。2小時後，分離小鼠之腦部，測定其中連接免疫球蛋白Fc區與以腦為標靶之肽之融合蛋白質之濃度，以測定血腦障壁通過量(第6圖)。
結果，測得免疫球蛋白Fc區與以腦為標靶之肽之血腦障壁通過量顯示高於彼等免疫球蛋白Fc區之通過量，且腦中免疫球蛋白Fc區與以腦為標靶之肽濃度高於免疫球蛋白Fc區濃度之程度高於在血清中之程度。
實例20：艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶-Fc-BTP融合蛋白質製法
(1)製備艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶-Fc-BTP融合蛋白質之表現載體
為了製造酵素融合蛋白質，藉由重疊PCR，使用其中已引進天然艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS，SEQ ID NO：102)之表現載體(IDS cDNA，Cat No.EX-C0003-M02，Gencopoeia)、合成之連接子(SEQ ID NO：17)、與IgG4 Fc區(SEQ ID NO：11、12、及13)，構築融合蛋白質之表現載體。重疊PCR技術包括當PCR擴增各個酵素與連接子-Fc時，讓序列在引子中彼此重疊，因此所得PCR產物包含重疊序列。為了擴增融合蛋白質，初次PCR係於95℃ 1分鐘、57℃ 30秒、及68℃ 3分鐘進行，共25次；及二次PCR係在95℃ 1分鐘、57℃ 30秒、及68℃ 4分鐘進行，共25次。
明確言之，由IDS使用引子SEQ ID NO NO：86與87進行PCR，及由連接子-Fc使用引子SEQ ID NO：88與89進行PCR，藉以使IDS之PCR產物在3'包含連接子-Fc序列，及連接子-Fc之PCR產物在5'包含IDS序列。
二次PCR係使用從初次PCR得到之兩個PCR產物作為模板，使用引子SEQ ID NO：86與89進行，然後得到具有IDS-Fc序列之PCR產物。之後，使用KpnI與XhoI限制酶裂解重疊序列，所得PCR產物插入X0GC載體中，構築成表現IDS-Fc融合蛋白質之載體(pX0GC-酵素-Fc)。
採用定點誘變法PCR技術，移除所建立融合蛋白質序列之Fc區中之鏈交換與N-糖基化位點。明確言之，使用引子SEQ ID NO：90與91，以脯胺酸置換絲胺酸(其係涉及鏈交換之Fc區中第二個胺基酸)，及使用引子SEQ ID NO：92與93，以麩醯胺置換天冬醯胺(其係發生N-糖基化之Fc區中第71個胺基酸)。
採用定點誘變法PCR技術，以將BTP序列插入IDS-Fc融合蛋白質，其中已移除Fc區之鏈交換與N-糖基化位點。明確言之，使用引子SEQ ID NO：94與95進行初次PCR，嵌插Fc-BTP22之BTP5序列，結果證實，BTP5序列插入Fc區之C-末端。之後，使用引子SEQ ID NO：96與97進行二次PCR，插入連接子與BTP5序列。
進行初次與二次PCR，構築可在X0GC載體中表現IDS-Fc-BTP22融合蛋白質之載體。
上述實例所製備表現酵素融合蛋白質之載體稱為pX0GC-IDS-Fc-BTP22載體，具有下列序列(表11)。
(2)製備艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶-Fc-BTP22融合蛋白質之轉化CHO細胞株
取如上述製備之重組表現載體pX0GC-IDS-Fc-BTP22引入DG44/CHO細胞株(CHO/dhfr-)(購自Dr.Chasin of Columbia University)中，其中由於DHFR基因受損，因此未完成核酸生合成過 程，得到轉化體。之後，由轉化體表現艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶-Fc-BTP22融合蛋白質。
明確言之，充份培養DG44/CHO細胞株至覆蓋培養容器底部約80%至90%，然後使用Opti-MEM(Lifetechnology、Cat.No.51985034)洗滌細胞3次。
同時，分別取含Opti-MEM(3mL)與表現載體pX0GC-IDS-Fc-BTP22(5μg)之混合物、及含Opti-MEM(3mL)與脂染胺(20μL；Lifetechnology，Cat.No.18324-012)之混合物於室溫靜置30分鐘。之後，混合各混合物，加至培養之DG44/CHO細胞株中，然後於37℃與5% CO2之條件下培養約18小時，因此使表現載體pX0GC-IDS-Fc-BTP22進入DG44/CHO細胞株中。進一步，使用包含10% FBS之DMEM-F12(Lifetechnology，Cat.No.11330)培養基洗滌培養之細胞3次，添加培養基，再培養48小時。使用胰蛋白酶處理培養之細胞，以分離各培養之細胞，並將此等細胞接種至選擇性培養基中(MEM-α培養基(WELGENE，Cat.No.LM008-02)，不含次黃嘌呤-胸苷(HT)補充物，但包含10% FBS與1mg/mL G418(Cellgro，Cat.No.61-234-RG))。該選擇性培養基在培養同時，每2或3天更換一次，直到僅有轉化之細胞存活形成群落為止，然後從分離之細胞中選拔轉化之細胞。特定言之，為了改善艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶-Fc-BTP22接合物在所選拔轉化細胞中之表現程度，添加5nM MTX(Sigma，Cat.No.M8407)至選拔培養基，以逐漸提高濃度，然後在2至3週後，MTX含量上升至20nM。
此外，為了降低轉化細胞之異質性，進行限制稀釋法，以 確保單一純系。明確言之，取轉化之細胞稀釋至每孔0.7個細胞之比例，分別勻散至96孔盤中，然後培養2至3週，以測定是否出現單一純系。當在孔中檢測到形成簇集之單一純系時，取該單一純系移至24孔盤中，採用ELISA方法分析各純系之細胞生長速率及艾杜硫酶衍生物表現量，以選拔具有最佳艾杜硫酶衍生物表現量之純系。之後，取所選拔細胞株使用無血清培養基(EX-CELL CHO培養基；USA，Sigma，Cat.No.63289C)進行懸浮培養。
(3)使用轉化之艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶-Fc-BTP22/CHO製造重組蛋白質
取出從上述(2)選拔後進行懸浮培養後存放在液態氮中之艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶-Fc-BTP22接合物之表現細胞株1瓶(1×107細胞個/mL)，於37℃恆溫槽中儘速溶解。之後，使用菌種培養基(EX-CELL CHO培養基(Sigma，Cat.No.63289C)，補充麩醯胺(0.45g/L))洗滌所得物質一次，於90×g離心5分鐘後，接種至包含50mL菌種培養基之錐形瓶(USA，Corning，Cat.No.431144)中。所得物質於CO2培養箱(37℃，5% CO2)中培養1至2天，直到細胞濃度到達10×105個細胞/mL。然後，所得物質於包含新鮮菌種培養基(100mL)的新錐形瓶中次培養，依上述相同方式離心。採用上述相同方式進行次培養，同時提高培養體積2倍，直到得到足量細胞數為止。當得到足量細胞數時，取出在錐形瓶中生長之生產細胞，移至5L標準生物反應器中培養(Sartorious，機型biostat)。當目標細胞濃度到達10×106個細胞/mL時，添加丁酸鈉(Sigma，Cat No.58903C)至培養基中後，於33℃之溫度培養10天或更 久。當培養完畢時，培養基於3,000×g離心60分鐘，分離細胞與上清液。取上清液過濾，凍存在-20℃。
(4)艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶-Fc-BTP融合蛋白質純化
由上述(3)培養之培養基樣本接合在經過20mM Tris(pH 7.5)與甘油緩衝液平衡之rProtein A sepharose快速流管柱(GE Healthcare，USA)，及使用由0.1M檸檬酸鈉(pH 3.0至4.0)、氯化鈉、與甘油組成之緩衝液溶離。取溶出之樣本，使用硫酸銨之濃度梯度與Tris(pH 7.5)施加至Source 15ISO(GE Healthcare，USA)，然後純化呈重組蛋白質之艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶-Fc-BTP22。採用SDS-PAGE證實純化之重組蛋白質(亦即艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶-Fc-BTP22)，其結果示於第7圖。
實例21：艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶-10kDa PEG-Fc-BTP28接合物製備
為了以10K丙-ALD(2)PEG(在每個末端各具有一個丙醛基之10K PEG；NOF，Japan)在艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(Shire，Ireland)之N-末端進行聚乙二醇基化，依艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶對PEG之莫耳比(亦即1：10至20)及艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶濃度10mg/mL至20mg/mL，於2℃至8℃反應約1至2小時。特定言之，添加氰基氫硼化鈉(NaCNBH3)還原劑濃度20mM至0.1M磷酸鉀緩衝液(pH 6.0)中，進行反應。單-聚乙二醇基化艾杜硫酶-10K PEG係採用Source 15Q管柱(GE Healthcare，USA)，使用磷酸鈉之濃度梯度(pH 6.0)與氯化鈉作為反應溶液純化。
隨後，使用純化之單-聚乙二醇基化艾杜硫酶對免疫球蛋白Fc-BTP28之莫耳比(亦即1：10至15)及總蛋白質濃度10mg/mL至20mg/mL，於2℃至8℃反應16小時。特定言之，添加0.1M磷酸鉀(pH 6.0)與20mM氰基氫硼化鈉分別作為反應溶液與還原劑。
反應完成後，使用磷酸鈉緩衝液之濃度梯度(pH 5.6)與氯化鈉，施加反應溶液至Source 15Q管柱(GE Healthcare，USA)，及使用硫酸銨之濃度梯度與磷酸鈉(pH 6.0)，施加至Source 15ISO(GE Healthcare，USA)，製備艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶-10kDa PEG-Fc-BTP28接合物(其可與術語「艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶-Fc-BTP28接合物」交換使用)。採用SDS-PAGE證實之結果示於第8圖。
實例22：證實艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶-Fc-BTP22融合蛋白質與艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶-10kDa PEG-Fc-BTP28接合物之活體外酵素活性
為了測定根據實例20製備之艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶-Fc-BTP22融合蛋白質及根據實例21製備之艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶-Fc-BTP28接合物製備之酵素活性變化，進行活體外試管酵素活性測定。由4MU-α-IdopyraA-2(4-甲基傘形基α-L-吡喃艾杜糖醛酸-2-硫酸酯鈉鹽)(已知其為艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶之酵素受質)與艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶-Fc-BTP22融合蛋白質及艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶-Fc-BTP28接合物，於37℃反應4小時，然後再次與α-艾杜糖醛酸酶(亦即第二次反應之酵素)，於37℃反應24小時。藉由測定最後產生之4-甲基傘酮(4MU)螢光，來測定對應物質之酵素活性(第9圖)。
結果證實艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶-Fc-BTP22融合蛋白質之酵素活性(比活性)及艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶-Fc-BTP28接合物之酵素活性(比活性)分別為45.0±11.4nmol/min/μg與41.2±1.2nmol/min/μg。因此，相較於艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶，艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶-Fc-BTP22融合蛋白質與艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶-Fc-BTP28接合物之酵素活性分別為95.5%與87.4%；因此證實即使在製備以腦為標靶之長效接合物與融合蛋白質後，仍具有類似之酵素活性程度。
實例23：證實艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶-Fc-BTP22融合蛋白質之腦組織分佈
為了測定根據實例20製備之艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶-Fc-BTP22融合蛋白質通過血腦障壁(BBB)之通過量，於正常小鼠中進行腦分佈實驗。在正常小鼠中經靜脈內注射劑量6.58nmol/kg。1小時後，分離小鼠之腦部，並測定各接合物蛋白質之濃度，以決定通過BBB之蛋白質通過量(第10圖)。結果，在腦部中測得以腦為標靶之長效艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶-Fc-BTP22融合蛋白質通過BBB之通過量，其濃度高於天然艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶；亦即以腦為標靶之長效艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶-Fc-BTP22融合蛋白質顯示較高之通過量。
實例24：根據投與艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶-Fc-BTP22融合蛋白質與艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶-10kDa PEG-Fc-BTP28接合物至其中已剔除艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶之小鼠中之活體內效力實驗
為了證實根據投與根據實例20製備之艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶-Fc-BTP22融合蛋白質及根據實例21製備之艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶- Fc-BTP28接合物之效力，準備7組小鼠。
第一組野生型(WT)小鼠(n=4)，投與以腦為標靶之長效艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶賦形劑。進一步在第二組，使用其中已剔除艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶之小鼠作為實驗組。第2組中，投與以腦為標靶之長效艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶賦形劑；第3組，一週一次經靜脈內投與艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(0.5mg/kg)；第4組，每2週一次經靜脈內投與艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶-Fc-BTP22融合蛋白質(2mg/kg)；第5組，每2週一次經皮下投與艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶-Fc-BTP22融合蛋白質(4mg/kg)；第6組，每2週一次經靜脈內投與艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶-Fc-BTP28接合物(2mg/kg)；及第7組，每2週一次經皮下投與艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶-Fc-BTP28接合物(4mg/kg)。進行實驗的同時，在投藥前及投藥後依一週間隔收集尿液，測定糖胺聚醣(GAG)含量，及測定肌酸酐含量，藉以校正GAG含量。測定GAG含量時，取尿液樣本(50μL)置入96孔盤中，添加二甲基亞甲基藍溶液(250μL)後，混合。之後，採用ELISA讀數機，在525nm定量GAG，然後彼此比較所得結果。採用單向ANOVA進行統計分析，比較賦形劑組(對照組)與實驗組。
由測定之GAG含量結果(如第11圖所示)證實，在接受投與艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶-Fc-BTP22融合蛋白質與艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶-Fc-BTP28接合物之組中，接受投藥2週後之尿中GAG下降之含量維持在正常小鼠之GAG含量程度。上述結果顯示，以腦為標靶之長效艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶-Fc-BTP22融合蛋白質與艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶-Fc-BTP28接合物將對韓特氏症候群(Hunter’s syndrome)具有醫療效力，該 疾病係因GAG未降解以致GAG累積所致。
實例25：其中由兩個或更多個彼此相異之以腦為標靶之肽與免疫球蛋白Fc區連接之融合蛋白質製備
(1)其中由兩個或更多個彼此相異之以腦為標靶之肽與免疫球蛋白Fc區連接之融合蛋白質之表現載體製備
為了表現其他融合蛋白質，如下製備表現載體。由於生物相容性物質可以延長其所連接之生理活性多肽之半衰期，因此選擇包括鉸鏈區之IgG4 Fc區，由包括鉸鏈區之IgG4 Fc區與兩個或更多個彼此相異之以腦為標靶之肽在基因階層融合，並取各融合產物插入個別表現載體中。
融合蛋白質之製法係由包括鉸鏈區之IgG4 Fc區與兩個或更多個彼此相異之以腦為標靶之肽連接，或藉由直接融合法製備；明確言之，使用表12所示之引子，製備具有表13中序列之融合蛋白質，其中由包括鉸鏈區之IgG4 Fc區利用肽鍵，在Fc CH3區之C-末端方向，連接兩個或更多個以腦為標靶之肽。明確言之，為了將BTP16序列與連接子插入Fc-BTP28表現載體中，利用定點誘變PCR技術，使用引子SEQ ID NO：107與108製備Fc-BTP29，及使用引子SEQ ID NO：109與110製備Fc-BTP30。如下表13序列所示，其中連接免疫球蛋白Fc區與以腦為標靶之肽之融合蛋白質之製法係由兩個或更多個以腦為標靶之肽之N-末端藉由肽連接子連接IgG4 Fc區之C-末端，或藉由直接融合法連接。
取表現載體插入BL21(DE3)菌株中，該表現載體中已插入編碼與免疫球蛋白Fc區融合之以腦為標靶之肽之基因，藉以表現其中連接免疫球蛋白Fc區與以腦為標靶之肽之長效融合蛋白質。
(2)其中由免疫球蛋白Fc區與兩個或更多個彼此相異之以腦為標靶之肽連接之融合蛋白質之純化
為了轉化在上述(1)中表現且其中融合免疫球蛋白Fc區與以腦為標靶之肽之融合蛋白質形成可溶型，打破細胞及再折疊。取對應於各培養溶液(200mL)之細胞集結塊再懸浮於200mL溶胞緩衝液(50mM Tris(pH 9.0)、1mM EDTA(pH 8.0)、0.2M氯化鈉、及0.5% Triton X-100)中。使用微射流破菌機M-110EH(AC Technology Corp.Model M1475C)，在15,000psi壓力打破細胞。打破之細胞溶胞物於12,200×g與4℃離心30分鐘，棄置上清液，取細胞溶胞物再懸浮於200mL洗滌緩衝液((0.5% TritonX-100與20mM Tris(pH 7.0))中。集結塊於12,200×g與4℃離心30分鐘而再懸浮於200mL洗滌緩衝液(20mM Tris(pH 7.0))中。之後，所得物質使用上述相同方法離心。得到集結塊，再懸浮於400mL緩衝液(8M尿素、20mM Tris(pH 7.0)、及1mM EDTA)後，於室溫攪拌3小時。3小時後，所得物質於12,200×g與4℃離心30分鐘。然後得到上清液，添加0.5mM半胱胺酸，然後於37℃攪拌30分鐘。由其中融合溶解之免疫球蛋白Fc區與以腦為標靶之肽之融合蛋白質進行再折疊時，使用蠕動幫浦慢慢添加600mL緩衝液(0.11mM半胱胺酸、0.5M精胺酸、及50mM Tris(pH 9.5))後，於4℃攪拌36小時。其中融合免疫球蛋白Fc區與以腦為標靶之肽之融合蛋白質中之免疫球蛋白Fc區係呈二聚體型式表現。
取再折疊樣本於12,200×g與4℃離心30分鐘。得到上清液後，使用濾器(0.22μm；Satorius)過濾。然後，使用50% HCl調整樣本pH至pH 7.5。樣本接合在經過緩衝液(10mM Tris(pH 7.0))平衡之Protein A-sepharose管柱(GE Healthcare)後，使用100mM檸檬酸鈉 (pH 3.3)與10%甘油緩衝液溶離其中融合免疫球蛋白Fc區與以腦為標靶之肽之接合物蛋白質。
添加0.6M硫酸銨至溶出之樣本中後，由其中已包含0.6M硫酸銨之樣本接合在經過緩衝液(10mM Tris(pH 7.5)與0.6M硫酸銨)平衡之Phenyl FF管柱(GE Healthcare)。然後，使用緩衝液(10mM Tris(pH 7.5))，使用10份管柱體積之0%至100%濃度之線性濃度梯度溶離其中融合免疫球蛋白Fc區與以腦為標靶之肽之融合蛋白質。
由於該以腦為標靶之肽已連接Fc區，如上述製備之長效接合物可以通過血腦障壁，維持該所連接生理活性物質之生理活性，因此可以提供改善之效期與安定性之長效接合物，藉以可以提供發展可以通過BBB之新穎醫療劑之平台。
習此相關技藝人士咸可由上文了解，本發明可在不修改本發明技術觀念或基本特徵下，依其他特定型式實施。依此方面，本文所揭示實施例僅供說明用，不應構成本發明之限制範圍。反之，本發明不僅計畫涵括例舉之實施例，而且涵括可以包括在如附錄申請專利範圍所定義本發明之精神與範圍內之各種不同替代物、修飾、均等物、及其他實施例。
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<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 1
Figure TW201942139A_D0065
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
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<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 3
Figure TW201942139A_D0067
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 4
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<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 5
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<211> 19
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<220>
<223> BTP
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<220>
<223> BTP
<400> 7
Figure TW201942139A_D0071
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<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 8
Figure TW201942139A_D0073
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<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 9
Figure TW201942139A_D0074
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<211> 18
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<220>
<223> BTP
<400> 10
Figure TW201942139A_D0075
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<211> 15
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<220>
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<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4鉸鏈
<400> 14
Figure TW201942139A_D0079
<210> 15
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4 CH2
<400> 15
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4 CH3
<400> 16
Figure TW201942139A_D0081
Figure TW201942139A_D0082
<210> 17
<211> 45
<212> DNA
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<220>
<223> 連結子
<400> 17
Figure TW201942139A_D0083
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<211> 15
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<213> 人工序列
<220>
<223> 連結子
<400> 18
Figure TW201942139A_D0084
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<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
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Figure TW201942139A_D0085
<210> 20
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 20
Figure TW201942139A_D0086
<210> 21
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 21
Figure TW201942139A_D0087
<210> 22
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 22
Figure TW201942139A_D0088
<210> 23
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 23
Figure TW201942139A_D0089
<210> 24
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 24
Figure TW201942139A_D0090
<210> 25
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 25
Figure TW201942139A_D0091
<210> 26
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 26
Figure TW201942139A_D0092
<210> 27
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 27
Figure TW201942139A_D0093
<210> 28
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 28
Figure TW201942139A_D0094
<210> 29
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 29
Figure TW201942139A_D0095
<210> 30
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 30
Figure TW201942139A_D0096
<210> 31
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 31
Figure TW201942139A_D0097
<210> 32
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 32
Figure TW201942139A_D0098
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 33
Figure TW201942139A_D0099
<210> 34
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 34
Figure TW201942139A_D0100
<210> 35
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 35
Figure TW201942139A_D0101
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 36
Figure TW201942139A_D0102
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 37
Figure TW201942139A_D0103
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 38
Figure TW201942139A_D0104
<210> 39
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 39
Figure TW201942139A_D0105
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 40
Figure TW201942139A_D0106
<210> 41
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 41
Figure TW201942139A_D0107
<210> 42
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 42
Figure TW201942139A_D0108
Figure TW201942139A_D0109
<210> 43
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)
<223> Xaa1係經乙醯化
<400> 43
Figure TW201942139A_D0110
<210> 44
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 44
Figure TW201942139A_D0111
<210> 45
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 45
Figure TW201942139A_D0112
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 46
Figure TW201942139A_D0113
<210> 47
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 47
Figure TW201942139A_D0114
<210> 48
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 48
Figure TW201942139A_D0115
<210> 49
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 49
Figure TW201942139A_D0116
<210> 50
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 50
Figure TW201942139A_D0117
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)
<223> Xaa係二胺基丙酸
<400> 51
Figure TW201942139A_D0118
<210> 52
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 52
Figure TW201942139A_D0119
<210> 53
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)
<223> O-beta-Glc係經附接至其
<400> 53
Figure TW201942139A_D0120
<210> 54
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 54
Figure TW201942139A_D0121
<210> 55
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 55
Figure TW201942139A_D0122
<210> 56
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<400> 56
Figure TW201942139A_D0123
<210> 57
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(4)
<223> Xaa=苯基脯胺酸
<400> 57
Figure TW201942139A_D0124
<210> 58
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連結子 部分體
<400> 58
Figure TW201942139A_D0125
<210> 59
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連結子 部分體
<400> 59
Figure TW201942139A_D0126
<210> 60
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連結子 部分體
<400> 60
Figure TW201942139A_D0127
<210> 61
<211> 124
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 61
Figure TW201942139A_D0128
<210> 62
<211> 124
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 62
Figure TW201942139A_D0129
<210> 63
<211> 112
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 63
Figure TW201942139A_D0130
<210> 64
<211> 112
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 64
Figure TW201942139A_D0131
<210> 65
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 65
Figure TW201942139A_D0132
<210> 66
<211> 130
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 66
Figure TW201942139A_D0133
<210> 67
<211> 118
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 67
Figure TW201942139A_D0134
<210> 68
<211> 118
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 68
Figure TW201942139A_D0135
<210> 69
<211> 97
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 69
Figure TW201942139A_D0136
<210> 70
<211> 97
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 70
Figure TW201942139A_D0137
<210> 71
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 71
Figure TW201942139A_D0138
Figure TW201942139A_D0139
<210> 72
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 72
Figure TW201942139A_D0140
<210> 73
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 連結子
<400> 73
Figure TW201942139A_D0141
<210> 74
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP5
<400> 74
Figure TW201942139A_D0142
<210> 75
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 連結子
<400> 75
Figure TW201942139A_D0143
<210> 76
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連結子
<400> 76
Figure TW201942139A_D0144
<210> 77
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 連結子
<400> 77
Figure TW201942139A_D0145
<210> 78
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP5
<400> 78
Figure TW201942139A_D0146
<210> 79
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP11
<400> 79
Figure TW201942139A_D0147
<210> 80
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP11
<400> 80
Figure TW201942139A_D0148
<210> 81
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP16
<400> 81
Figure TW201942139A_D0149
<210> 82
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP16
<400> 82
Figure TW201942139A_D0150
<210> 83
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP16
<400> 83
Figure TW201942139A_D0151
<210> 84
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP17
<400> 84
Figure TW201942139A_D0152
<210> 85
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP17
<400> 85
Figure TW201942139A_D0153
<210> 86
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 86
Figure TW201942139A_D0154
<210> 87
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 87
Figure TW201942139A_D0155
<210> 88
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 88
Figure TW201942139A_D0156
<210> 89
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 89
Figure TW201942139A_D0157
<210> 90
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 90
Figure TW201942139A_D0158
<210> 91
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 91
Figure TW201942139A_D0159
<210> 92
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 92
Figure TW201942139A_D0160
<210> 93
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 93
Figure TW201942139A_D0161
<210> 94
<211> 97
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 94
Figure TW201942139A_D0162
<210> 95
<211> 97
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 95
Figure TW201942139A_D0163
<210> 96
<211> 124
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 96
Figure TW201942139A_D0164
<210> 97
<211> 124
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 97
Figure TW201942139A_D0165
<210> 98
<211> 1650
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 98
Figure TW201942139A_D0166
Figure TW201942139A_D0167
<210> 99
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 經修飾IgG4鉸鏈
<400> 99
Figure TW201942139A_D0168
<210> 100
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 經修飾IgG4 CH2
<400> 100
Figure TW201942139A_D0169
<210> 101
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP5
<400> 101
Figure TW201942139A_D0170
<210> 102
<211> 550
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 智人(Homo sapiens)
<400> 102
Figure TW201942139A_D0171
Figure TW201942139A_D0172
Figure TW201942139A_D0173
<210> 103
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 經修飾IgG4鉸鏈
<400> 103
Figure TW201942139A_D0174
<210> 104
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 經修飾IgG4 CH2
<400> 104
Figure TW201942139A_D0175
<210> 105
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4 Fc
<400> 105
Figure TW201942139A_D0176
<210> 106
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 經修飾IgG4 Fc
<400> 106
Figure TW201942139A_D0177
<210> 107
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP29_F引子
<400> 107
Figure TW201942139A_D0178
<210> 108
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP29_R引子
<400> 108
Figure TW201942139A_D0179
<210> 109
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP30_F引子
<400> 109
Figure TW201942139A_D0180
<210> 110
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BTP30_R引子
<400> 110
Figure TW201942139A_D0181

Claims (67)

  1. 一種下式1之以腦為標靶之長效接合物，[式1]X-L 1-F-L 2-Y其中：X為生理活性物質；Y為以腦為標靶之肽(BTP)L 1與L 2為肽連接子或非肽連接子，其中當L 1與L 2為肽連接子時，該肽連接子包含0至1,000個胺基酸；及F為包含FcRn-結合區之免疫球蛋白恆定區。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中該長效接合物可以通過血腦障壁，藉以傳送生理活性物質進入腦部組織。
  3. 如申請專利範圍第1或2項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中該以腦為標靶之肽包含肽、蛋白質、或抗體，及其中各肽、蛋白質、或抗體包含可以通過血腦障壁之胺基酸序列。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中該以腦為標靶之肽經過被動轉運途徑或藉由受體介導之轉運途徑通過血腦障壁。
  5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中該生理活性物質係選自下列各物組成之群中：毒素；或類升糖素肽-1(GLP-1)受體促效劑；升糖素受體促效劑；胃抑制性多肽(GIP)受體促效劑；纖維母細胞生長因子(FGF)受體促效劑；膽囊收縮素受體促效 劑；胃泌素受體促效劑；黑皮質素受體促效劑；人類生長激素；生長激素釋放激素；生長激素釋放肽；干擾素；干擾素受體；群落刺激因子；介白素；介白素受體；酵素；介白素結合性蛋白質；細胞激素結合性蛋白質；巨噬細胞活化因子；巨噬細胞肽；B細胞因子；T細胞因子；蛋白質A；抑制過敏因子；壞死糖蛋白；免疫毒素；淋巴毒素；腫瘤壞死因子；腫瘤壓制劑；轉化生長因子；α-1抗胰蛋白酶；白蛋白；α-乳白蛋白；載脂蛋白-E；紅血球生成素；高糖基化紅血球生成素；血管生成素；血紅素；凝血酶；凝血酶受體活化肽；凝血酶調節素；凝血因子VII；凝血因子VIIa；凝血因子VIII；凝血因子IX；凝血因子XIII；血纖維蛋白溶酶原活化劑；纖維蛋白結合性肽；尿激酶；鏈激酶；水蛭素；蛋白質C；C-反應性蛋白質；腎素抑制劑；膠原酶抑制劑；超氧化物歧化酶；瘦素；血小板衍生之生長因子；上皮生長因子；表皮生長因子；血管新生抑制素；血管收縮素；骨成形性生長因子；骨成形性蛋白質；抑鈣激素；胰島素；心房肽；軟骨誘發因子；依降鈣素(elcatonin)；結締組織活化因子；組織因子途徑抑制劑；促濾泡激素；黃體激素；黃體激素釋放激素；神經生長因子；軸突生成因子-1；腦利鈉肽；膠質細胞源性神經營養因子；神經突起導向因子(netrin)；嗜中性球抑制因子；神經營養因子；神經營養蛋白(neurturin)；副甲狀腺激素；鬆弛素；胰泌素；體介素；類胰島素生長因子；腎上腺皮質素；升糖素；膽囊收縮素；胰多肽；胃泌素釋放肽；促腎上腺皮質激素釋放因子；促甲狀腺激素；自分泌運動因子；乳鐵蛋白；肌肉生長抑制素；活性依賴性神經保護性蛋白(ADNP)、β-分泌酶1(BACE1)、類澱粉蛋白前驅蛋白(APP)、神經細胞附著分子(NCAM)、類澱粉蛋白β、Tau、晚期糖基化終產物受體(RAGE)、α-突觸核蛋白(synuclein)、或其等之促效劑或拮抗劑；受體、受體促效劑；細胞表面抗原；單株抗體；多株抗體；抗體片段；由 病毒衍生之疫苗抗原；激活至少一種受體促效劑之雜合多肽或嵌合多肽；及其類似物。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中：該毒素係選自下列各物組成之群中：美登素(maytansine)或其衍生物、微管蛋白抑制素(auristatin)或其衍生物、倍癌黴素(duocarmycin)或其衍生物、及吡咯并苯并二氮呯(PBD)或其衍生物；該類升糖素肽-1(GLP-1)受體促效劑係選自下列各物組成之群中：天然外泌肽(exendin)-3或天然外泌肽-4，與其類似物；該FGF受體促效劑係選自下列各物組成之群中：FGF1或其類似物、FGF19或其類似物、FGF21或其類似物、及FGF23或其類似物；該干擾素係選自下列各物組成之群中：干擾素-α、干擾素-β、及干擾素-γ；該干擾素受體係選自下列各物組成之群中：干擾素-α受體、干擾素-β受體、干擾素-γ受體、及可溶型I干擾素受體；該介白素係選自下列各物組成之群中：介白素-1、介白素-2、介白素-3、介白素-4、介白素-5、介白素-6、介白素-7、介白素-8、介白素-9、介白素-10、介白素-11、介白素-12、介白素-13、介白素-14、介白素-15、介白素-16、介白素-17、介白素-18、介白素-19、介白素-20、介白素-21、介白素-22、介白素-23、介白素-24、介白素-25、介白素-26、介白素-27、介白素-28、介白素-29、及介白素-30；該介白素受體為介白素-1受體或介白素-4受體； 該酵素係選自下列各物組成之群中：β-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸酯酶、酸性α-葡萄糖苷酶、酸性神經醯胺酶、酸性神經鞘磷脂酶、半乳糖神經醯胺酶、芳基硫酸酯酶A、芳基硫酸酯酶B、β-己醣胺酶A、β-己醣胺酶B、肝素 N-硫酸酯酶、α-D-甘露糖苷酶、β-葡萄醣醛酸酶、 N-乙醯半乳糖胺-6硫酸酯酶、溶小體酸性脂酶、α- N-乙醯基-葡萄糖胺酶、葡萄糖神經醯胺酶、丁醯基膽鹼酯酶、幾丁質酶、麩胺酸脫羧酶、伊米苷酶(imiglucerase)、脂酶、尿酸酶、血小板活化因子乙醯基水解酶、中性肽鏈內切酶、髓過氧化物酶、α-半乳糖苷酶-A、阿爾發半乳糖苷酶(agalsidase)α、阿爾發半乳糖苷酶(agalsidase)β、α-L-艾杜糖醛酸酶、丁醯基膽鹼酯酶、幾丁質酶、麩胺酸脫羧酶、及伊米苷酶(imiglucerase)；該介白素結合性蛋白質為IL-18bp；該細胞激素結合性蛋白質為TNF結合性蛋白質；該神經生長因子係選自下列各物組成之群中：神經生長因子、睫神經營養因子、軸突生成因子-1、腦利鈉肽、膠質細胞源性神經營養因子、神經突起導向因子(netrin)、嗜中性球抑制因子、神經營養因子、及神經營養蛋白(neurturin)；該肌肉生長抑制素受體係選自下列各物組成之群中：TNFR(P75)、TNFR(P55)、IL-1受體、VEGF受體、及B細胞活化因子受體；該肌肉生長抑制素受體拮抗劑為IL1-Ra； 該細胞表面抗原係選自下列各物組成之群中：CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD11a、CD11b、CD18、CD19、CD20、CD23、CD25、CD33、CD38、CD40、CD45、及CD69；及該抗體片段係選自下列各物組成之群中：scFv、Fab、Fab '、F(ab ') 2、及Fd。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中該GLP-1受體促效劑係選自下列各物組成之群中：天然外泌肽-4；外泌肽-4衍生物，其中該外泌肽-4之N-末端胺基已缺失；外泌肽-4衍生物，其中該外泌肽-4之N-末端胺基係經羥基取代；外泌肽-4衍生物，其中該外泌肽-4之N-末端胺基係經二甲基修飾；外泌肽-4衍生物，其中該外泌肽-4之N-末端胺基係經羧基取代；外泌肽-4衍生物，其中該外泌肽-4之第一個胺基酸組胺酸之α-碳已缺失；外泌肽-4衍生物，其中該外泌肽-4之第12個胺基酸離胺酸被絲胺酸取代；及外泌肽-4衍生物，其中該外泌肽-4之第12個胺基酸離胺酸被精胺酸取代。
  8. 如申請專利範圍第4項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中該利用受體介導之轉運途徑中，以腦為標靶之長效接合物係利用選自下列各物組成之群中之任一受體所介導之轉運途徑通過血腦障壁：胰島素受體、轉鐵蛋白受體、低密度脂蛋白受體、低密度脂蛋白受體相關蛋白質、瘦素受體、菸鹼乙醯膽鹼受體、穀胱甘肽轉運子、鈣激活之鉀通道、及晚期糖基化終產物受體(RAGE)、及該等受體之配體、及與該等受體或配體結合之抗體。
  9. 如申請專利範圍第1至8項中任一項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中L 1係連接F之N-末端區，及L 2係連接F之C-末端區。
  10. 如申請專利範圍第1至9項中任一項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中L 1係連接X之N-末端或C-末端，及L 2係連接Y之N-末端區或C-末端區。
  11. 如申請專利範圍第1至9項中任一項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中L 1係連接X之N-末端或C-末端，及L 2係連接Y之N-末端區。
  12. 如申請專利範圍第1至11項中任一項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中式1 F-L 2-Y係由下式2代表：
    Figure TW201942139A_C0001
     其中：F a與F b分別為單股多肽鏈，其包含鉸鏈區、CH2域、與CH3域，其中F a與F b係藉由鉸鏈區中之二硫鍵連接，藉以使該接合物包含Fc片段，及F a與L 1係彼此共價鍵結；各BTP a1、......、BTP an彼此相同或相異，為以腦為標靶之肽；各BTP b1、......、BTP bn' 彼此相同或相異，為以腦為標靶之肽；各L 2a1、......、L 2an，分別獨立地為肽連接子或非肽連接子；及各L 2b1、......、L 2bn' 分別獨立地為肽連接子或非肽連接子；其中n與n '分別獨立地為整數。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中各L 2a1、......、L 2an彼此相同或相異，為肽連接子，及 各L 2b1、......、L 2bn' 彼此相同或相異，為肽連接子；其中n與n '分別獨立地為整數。
  14. 如申請專利範圍第12項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中L 1係連接F a之N-末端，及L 2a1與L 2b1分別連接F a與F b之C-末端。
  15. 如申請專利範圍第1至14項中任一項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中式1 X-L 1-F-L 2-Y係由下式3代表：
    Figure TW201942139A_C0002
     其中：X為生理活性物質；L 1a與L 1b分別獨立地為肽連接子或非肽連接子；F a與F b分別為單股多肽鏈，其包含鉸鏈區、CH2域、與CH3域，其中F a與F b係藉由鉸鏈區中之二硫鍵連接，藉以使該接合物包含Fc片段，及F a與F b係分別與L 1a與L 1b共價鍵結；各BTP a1、......、BTP an彼此相同或相異，為以腦為標靶之肽；各BTP b1、......、BTP bn' 彼此相同或相異，為以腦為標靶之肽；各L 2a1、......、L 2an分別獨立地為肽連接子或非肽連接子；及各L 2b1、......、L 2bn' 分別獨立地為肽連接子或非肽連接子；其中n與n '分別獨立地為整數。
  16. 如申請專利範圍第15項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中各L 2a1、......、L 2an彼此相同或相異，為肽連接子；及 各L 2b1、......、L 2bn' 彼此相同或相異，為肽連接子；其中n與n '分別獨立地為整數。
  17. 如申請專利範圍第15或16項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中L 1a與L 1b分別連接F a與F b之N-末端；及L 2a1與L 2b1分別連接F a與F b之C-末端。
  18. 如申請專利範圍第1至14項中任一項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中式1 X-L 1-F-L 2-Y係由下式4代表：
    Figure TW201942139A_C0003
     其中：X為生理活性物質；L 1為肽連接子或非肽連接子；F a與F b分別為單股多肽鏈，其包含鉸鏈區、CH2域、與CH3域，其中F a與F b係藉由鉸鏈區中之二硫鍵連接，藉以使該接合物包含Fc片段，及F a係與L 1共價鍵結；各BTP a1、......、BTP an彼此相同或相異，為以腦為標靶之肽；各BTP b1、......、BTP bn' 彼此相同或相異，為以腦為標靶之肽；各L 2a1、......、L 2an分別獨立地為肽連接子或非肽連接子；及各L 2b1、......、L 2bn' 分別獨立地為肽連接子或非肽連接子；其中n與n '分別獨立地為整數。
  19. 如申請專利範圍第18項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中 各L 2a1、......、L 2an彼此相同或相異，為肽連接子；及各L 2b1、......、L 2bn' 彼此相同或相異，為肽連接子；其中n與n '分別獨立地為整數。
  20. 如申請專利範圍第18或19項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中L 1係連接F a之N-末端，及L 2a1與L 2b1分別連接F a與F b之C-末端。
  21. 如申請專利範圍第1至14項中任一項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中式1 X-L 1-F-L 2-Y係由下式5代表：
    Figure TW201942139A_C0004
     其中：X為生理活性物質；L 1為肽連接子或非肽連接子；F a與F b分別為單股多肽鏈，其包含鉸鏈區、CH2域、與CH3域，其中F a與F b係藉由鉸鏈區中之二硫鍵連接，藉以使該接合物包含Fc片段，及F a係與L 1共價鍵結；各Y a與Y b彼此相同或相異，為以腦為標靶之肽；及各L 2a與L 2b彼此相同或相異，為肽連接子；其中n與n '分別獨立地為整數。
  22. 如申請專利範圍第1至14項中任一項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中式1 X-L 1-F-L 2-Y係由下式6代表：
    Figure TW201942139A_C0005
     其中：X為生理活性物質；L 1a與L 1b分別獨立地為肽連接子或非肽連接子；F a與F b分別為單股多肽鏈，其包含鉸鏈區、CH2域、與CH3域，其中F a與F b係藉由鉸鏈區中之二硫鍵連接，藉以使該接合物包含Fc片段，及F a與F b係分別與L 1a與L 1b共價鍵結；各Y a與Y b彼此相同或相異，為以腦為標靶之肽；及各L 2a與L 2b彼此相同或相異，為肽連接子；其中n與n '分別獨立地為整數。
  23. 如申請專利範圍第12至20項中任一項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中n=n '，且分別符合以下條件：L 2a1=L 2b1、......、L 2an=L 2bn' 與BTP a1=BTP b1、......、BTP an=BTP bn' 。
  24. 如申請專利範圍第23項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中各BTP a1、......、BTP an係彼此相同，為以腦為標靶之肽；各BTP b1、......、BTP bn' 係彼此相同，為以腦為標靶之肽；各L 2a1、......、L 2an為肽連接子；及各L 2b1、......、L 2bn' 為肽連接子。
  25. 如申請專利範圍第23項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中 各BTP a1、......、BTP an係彼此相異，為以腦為標靶之肽；各BTP b1、......、BTP bn' 係彼此相異，為以腦為標靶之肽；各L 2a1、......、L 2an為肽連接子；及各L 2b1、......、L 2bn' 為肽連接子。
  26. 如申請專利範圍第12至20項中任一項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中n=n '，且符合下列任一條件：BTP a1≠BTP b1、......與BTP an≠BTP bn' .。
  27. 如申請專利範圍第26項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中各BTP a1、......、BTP an係彼此相同，為以腦為標靶之肽；各BTP b1、......、BTP bn' 係彼此相同，為以腦為標靶之肽；各L 2a1、......、L 2an為肽連接子；及各L 2b1、......、L 2bn' 為肽連接子。
  28. 如申請專利範圍第26項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中各BTP a1、......、BTP an係彼此相異，為以腦為標靶之肽；各BTP b1、......、BTP bn' 係彼此相異，為以腦為標靶之肽；各L 2a1、......、L 2an為肽連接子；及各L 2b1、......、L 2bn' 為肽連接子。
  29. 如申請專利範圍第12至28項中任一項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中n與n '為1至5。
  30. 如申請專利範圍第12至29項中任一項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中L 1、L 1a、或L 1b係連接X之N-末端胺基、位在離胺酸殘基側鏈之胺基、或位在半胱胺酸殘基側鏈之-SH基(硫醇基)。
  31. 如申請專利範圍第1至30項中任一項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中L 1、L 1a、或L 1b係連接X之N-末端胺基、位在離胺酸殘基側鏈之胺基、或位在半胱胺酸殘基側鏈之-SH基(硫醇基)。
  32. 如申請專利範圍第1至31項中任一項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中X(其係生理活性物質)為由2至1,000個胺基酸組成之多肽。
  33. 如申請專利範圍第1至32項中任一項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中L 1、L 1a、或L 1b分別獨立地為大小為0.5kDa至100kDa之非肽連接子。
  34. 如申請專利範圍第33項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中非肽連接子為聚乙二醇。
  35. 如申請專利範圍第1至32項中任一項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中L 1、L 1a、或L 1b為包含0至1,000個胺基酸之肽連接子。
  36. 如申請專利範圍第1至35項中任一項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中L 2、L 2a、或L 2b為肽連接子。
  37. 如申請專利範圍第35或36項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中肽連接子為(GS)m、(GGS)m、(GGGS)m、或(GGGGS)m，其中m為1至10。
  38. 如申請專利範圍第1項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中L 1與L 2其中之一為肽連接子，另一個為非肽連接子。
  39. 如申請專利範圍第1項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中L 1與L 2二者均為肽連接子。
  40. 如申請專利範圍第1項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中當L 1為非肽連接子及L 2為肽連接子時，該肽連接子包含0至1,000個胺基酸。
  41. 如申請專利範圍第1或33項中任一項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中非肽連接子係選自下列各物組成之群中：聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇-丙二醇共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多醣、葡聚糖、聚乙烯乙基醚、生物降解性聚合物、脂質聚合物、幾丁質、玻尿酸、脂肪酸、高分子量聚合物、低分子量化合物、核苷酸、及其組合。
  42. 如申請專利範圍第1項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中當L 1與L 2其中之一或二者為肽連接子時，X與F、或F與Y利用L 1與L 2，經由共價化學鍵、非共價化學鍵、或其組合彼此連接；及L 1與L 2分別包含0至1,000個胺基酸。
  43. 如申請專利範圍第1項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中當L 1與L 2其中之一或二者為肽連接子時，L 1與L 2分別由0個胺基酸組成，其中：(i)X與F、或F與Y藉由肽鍵連接；或(ii)X與F、及F與Y藉由肽鍵連接。
  44. 如申請專利範圍第1項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中當L 1與L 2其中之一為肽連接子，且這兩個其中另一個為非肽連接子時，該肽連接子為包含0至1,000個胺基酸之連接子，及該非肽連接子為聚乙二醇。
  45. 如申請專利範圍第1至44項中任一項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中F包含免疫球蛋白Fc區。
  46. 如申請專利範圍第45項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中免疫球蛋白Fc區包含1至4個選自下列各物組成之群中之域：CH1、CH2、CH3、及CH4域。
  47. 如申請專利範圍第45或46項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中免疫球蛋白Fc區進一步包含鉸鏈區。
  48. 如申請專利範圍第45至47項中任一項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中免疫球蛋白Fc區為IgG之Fc區。
  49. 如申請專利範圍第48項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中免疫球蛋白Fc區為IgG4 Fc區。
  50. 如申請專利範圍第49項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中免疫球蛋白Fc區為人類序列之無糖基化IgG4 Fc區。
  51. 如申請專利範圍第1項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中X之N-末端與F之N-末端係藉由L 1連接，及Y之N-末端與F之C-末端係藉由L 2連接。
  52. 如申請專利範圍第1項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中：L 1之一端連接X之離胺酸殘基或半胱胺酸殘基，及L 1之另一端係連接F之N-末端；及Y之N-末端係藉由L 2連接F之C-末端。
  53. 如申請專利範圍第1項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中F包含天然免疫球蛋白之Fc區之胺基酸序列，且在天然免疫球蛋白 Fc區之至少一個胺基酸包含選自下列各物組成之群中之變異：取代、加成、缺失、修飾、及其組合。
  54. 如申請專利範圍第53項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中F係呈二聚體型式，其中兩個包含衍生自IgG之鉸鏈區、CH2域、與CH3域之單股多肽鏈係藉由二硫鍵連接，其中鉸鏈區包含胺基酸序列SEQ ID NO：14或胺基酸序列SEQ ID NO：14中第二個胺基酸絲胺酸(Ser，S)經修飾形成脯胺酸(Pro，P)之胺基酸序列；CH2域包含胺基酸序列SEQ ID NO：15或胺基酸序列SEQ ID NO：15中第67個胺基酸天冬醯胺(Asn，N)經修飾形成麩醯胺(Gln，Q)之胺基酸序列；CH3域包含胺基酸序列SEQ ID NO：16；或在構成F之包含免疫球蛋白恆定區之單股多肽鏈中，胺基酸序列SEQ ID NO：105中第二個胺基酸被脯胺酸取代；第71個胺基酸被麩醯胺取代；或第二個胺基酸被脯胺酸取代及第71個胺基酸被麩醯胺取代。
  55. 如申請專利範圍第1至54項中任一項所述之以腦為標靶之長效接合物，其中以腦為標靶之肽(BTP)包含選自胺基酸序列SEQ ID NO：2、4、6、8、10、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、及85中之胺基酸序列。
  56. 一種編碼如申請專利範圍第1至55項中任一項所述之以腦為標靶之長效接合物之多核苷酸，其中該長效接合物係呈由胺基酸序列組成之融合蛋白質型式。
  57. 一種表現載體，其包含如申請專利範圍第56項所述之多核苷酸。
  58. 一種宿主細胞，其中已引進如申請專利範圍第57項所述之表現載體。
  59. 一種製備以腦為標靶之長效接合物之方法，其包括：(a)培養如申請專利範圍第58項所述之宿主細胞；及(b)從培養之宿主細胞或其培養物回收以腦為標靶之長效接合物。
  60. 一種製備如申請專利範圍第1項所述之以腦為標靶之長效接合物之方法，其包括：(i)製備：(a)X-L 1-F，其中由X(其係生理活性物質)、L 1(其係肽連接子或非肽連接子)、與F(其包含免疫球蛋白Fc區)連接；及(b)L 2-Y，其中由Y(其係以腦為標靶之肽)與L 2(其係肽連接子或非肽連接子)連接；及(ii)連接(a)X-L 1-F與(b)L 2-Y。
  61. 一種製備如申請專利範圍第1項所述之以腦為標靶之長效接合物之方法，其包括：(i)製備：(a)X-L 1，其中由X(其係生理活性物質)、與L 1(其係肽連接子或非肽連接子)連接；及(b)F-L 2-Y，其中由Y(其係以腦為標靶之肽)、L 2(其係肽連接子或非肽連接子)、與F連接；及 (ii)連接(a)X-L 1與(b)F-L 2-Y。
  62. 一種製備如申請專利範圍第1項所述之以腦為標靶之長效接合物1之方法，其包括：(a)由L 1(其係在兩端具有相同或相異反應性官能基之非肽聚合物)中任一個反應性官能基與游離X反應，得到X-L 1，其係已連接之物質，其中由非肽聚合物經由末端與X共價鍵結；及(b)由F-L 2-Y連接該已連接之物質未反應末端之反應性官能基，得到X-L 1-F-L 2-Y。
  63. 如申請專利範圍第62項所述之方法，其中，步驟(b)中，該已連接之物質未反應末端之反應性官能基係連接下式2之Fa：
    Figure TW201942139A_C0006
     其中：F a與F b分別為單股多肽鏈，其包含鉸鏈區、CH2域、與CH3域，其中F a與F b係藉由鉸鏈區中之二硫鍵連接，藉以使該接合物包含Fc片段，及F a係與L 1共價鍵結；各BTP a1、......、BTP an彼此相同或相異，為以腦為標靶之肽；各BTP b1、......、BTP bn' 彼此相同或相異，為以腦為標靶之肽；各L 2a1、......、L 2an分別獨立地為肽連接子或非肽連接子；及各L 2b1、......、L 2bn' 分別獨立地為肽連接子或非肽連接子；其中n與n '分別獨立地為整數。
  64. 如申請專利範圍第62項所述之方法，其中該反應性官能基係選自下列各物組成之群中：醛基、馬來醯亞胺基、及琥珀醯亞胺衍生物。
  65. 如申請專利範圍第64項所述之方法，其中醛基為丙醛基或丁醛基。
  66. 如申請專利範圍第64項所述之方法，其中琥珀醯亞胺衍生物為羧甲基琥珀醯亞胺基酯、戊酸琥珀醯亞胺基酯、甲基丁酸琥珀醯亞胺基酯、甲基丙酸琥珀醯亞胺基酯、丁酸琥珀醯亞胺基酯、丙酸琥珀醯亞胺基酯、 N-羥基琥珀醯亞胺、或碳酸琥珀醯亞胺基酯。
  67. 一種製備如申請專利範圍第12項所述之以腦為標靶之長效接合物之方法，其包括：培養包含編碼下式3之X-L 1a-F a-(L 2a1-BTP a1)-......-(L 2an-BTP an)之表現匣與編碼式3之X-L 1b-F b-(L 2b1-BTP b1)-......-(L 2bn' -BTP bn' )之表現匣之宿主細胞；及從培養之宿主細胞或其培養物中得到式3接合物：
    Figure TW201942139A_C0007
     其中：X為生理活性物質；L 1a與L 1b為肽連接子；F a與F b分別為單股多肽鏈，其包含鉸鏈區、CH2域、與CH3域，其中F a與F b係藉由鉸鏈區中之二硫鍵連接，藉以使該接合物包含Fc片段，及F a與F b係分別與L 1a及L 1b共價鍵結； 各BTP a1、......、BTP an彼此相同或相異，為以腦為標靶之肽；各BTP b1、......、BTP bn' 彼此相同或相異，為以腦為標靶之肽；各L 2a1、......、L 2an為肽連接子；及各L 2b1、......、L 2bn' 為肽連接子；其中n與n '分別獨立地為整數。
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