JP7072524B2 - Bdnfを含む融合蛋白質 - Google Patents
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Description
(a)CDR1が配列番号66又は配列番号67のアミノ酸配列を含んでなり,
(b)CDR2が配列番号13又は配列番号14のアミノ酸配列を含んでなり,且つ
(c)CDR3が配列番号15又は配列番号16のアミノ酸配列を含んでなるものである,
融合蛋白質。
2.上記1の融合蛋白質であって,重鎖のフレームワーク領域3が配列番号68のアミノ酸配列を含んでなるものである,融合蛋白質。
3.上記1又は2の融合蛋白質であって,但し該重鎖の可変領域において,
CDR2の配列番号13又は配列番号14のアミノ酸配列に代えてこれに対し80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなり,且つ
CDR3の配列番号15又は配列番号16のアミノ酸配列に代えてこれに対し80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるものである,
融合蛋白質。
4.上記1又は2の融合蛋白質であって,但し該重鎖の可変領域において,
CDR2の配列番号13又は配列番号14のアミノ酸配列に代えてこれに対し90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなり,且つ
CDR3の配列番号15又は配列番号16のアミノ酸配列に代えてこれに対し90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるものである,
融合蛋白質。
5.上記1又は2の融合蛋白質であって,但し該重鎖の可変領域において,
(a)CDR1については配列番号66又は配列番号67,
(b)CDR2については配列番号13又は配列番号14,
(c)CDR3については配列番号15又は配列番号16,及び
(d)フレームワーク領域3については配列番号68,
のうち少なくとも1つのアミノ酸配列に代えてこれに対し1~5個のアミノ酸の置換,欠失又は付加による改変がなされたアミノ酸配列を含んでなるものであり,
ここに,CDR1については,配列番号66又は配列番号67のアミノ酸配列のN末端側から5番目に位置するメチオニンが,改変後のアミノ酸配列においても同じ位置にあり,且つ
フレームワーク領域3については,配列番号68のN末端側から17番目に位置するロイシンが,改変後のアミノ酸配列においても同じ位置にあるものである,
融合蛋白質。
6.上記1又は2の融合蛋白質であって,但し該重鎖の可変領域において,
(a)CDR1については配列番号66又は配列番号67,
(b)CDR2については配列番号13又は配列番号14,
(c)CDR3については配列番号15又は配列番号16,及び
(d)フレームワーク領域3については配列番号68,
のうち少なくとも1つのアミノ酸配列に代えてこれに対し1~3個のアミノ酸の置換,欠失又は付加による改変がなされたアミノ酸配列を含んでなるものであり,
ここに,CDR1については,配列番号66又は配列番号67のアミノ酸配列のN末端側から5番目に位置するメチオニンが,改変後のアミノ酸配列においても同じ位置にあり,且つフレームワーク領域3については,配列番号68のN末端側から17番目に位置するロイシンが,改変後のアミノ酸配列においても同じ位置にあるものである,融合蛋白質。
7.上記1の融合蛋白質であって,該重鎖の可変領域が配列番号69のアミノ酸配列を含んでなるものである,融合蛋白質。
8.上記7の融合蛋白質であって,但し該重鎖の可変領域のうち,CDR1の配列番号66又は配列番号67及びフレームワーク領域3の配列番号68の各アミノ酸配列以外の部分において,該部分に代えて該部分と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるものである,融合蛋白質。
9.上記7の融合蛋白質であって,但し該重鎖の可変領域のうち,CDR1の配列番号66又は配列番号67及びフレームワーク領域3の配列番号68の各アミノ酸配列以外の部分において,該部分に代えて該部分と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるものである,融合蛋白質。
10.上記7の融合蛋白質であって,但し該重鎖の可変領域を構成するアミノ酸配列に代えてこれに対し1~5個のアミノ酸の置換,欠失又は付加による改変がなされたアミノ酸配列を含んでなるものであり,
ここに,CDR1については,配列番号67のアミノ酸配列のN末端から5番目に位置するメチオニンが,改変後のアミノ酸配列においても同じ位置にあり,且つフレームワーク領域3については,配列番号68のN末端側から17番目に位置するロイシンが,改変後のアミノ酸配列においても同じ位置にあるものである,融合蛋白質。
11.上記7の融合蛋白質であって,但し該重鎖の可変領域を構成するアミノ酸配列に代えてこれに対し1~3個のアミノ酸の置換,欠失又は付加による改変がなされたアミノ酸配列を含んでなるものであり,
ここに,CDR1については,配列番号67のアミノ酸配列のN末端から5番目に位置するメチオニンが,改変後のアミノ酸配列においても同じ位置にあり,且つフレームワーク領域3については,配列番号68のN末端側から17番目に位置するロイシンが,改変後のアミノ酸配列においても同じ位置にあるものである,融合蛋白質。
12.上記7の融合蛋白質であって,該重鎖のアミノ酸配列が,配列番号70又は配列番号72のアミノ酸配列を含んでなるものである,融合蛋白質。
13.上記12の融合蛋白質であって,但し該重鎖のうち,CDR1の配列番号66又は配列番号67及びフレームワーク領域3の配列番号68の各アミノ酸配列以外の部分に代えて該部分に対し80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるものである,融合蛋白質。
14.上記12の融合蛋白質であって,但し該重鎖のうち,CDR1の配列番号66又は配列番号67及びフレームワーク領域3の配列番号68の各アミノ酸配列以外の部分に代えて当該部分に対し90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるものである,融合蛋白質。
15.上記12の融合蛋白質であって,但し該重鎖を構成するアミノ酸配列に代えてこれに対し1~5個のアミノ酸の置換,欠失又は付加による改変がなされたアミノ酸配列を含んでなるものであり,
ここに,CDR1については,配列番号67のアミノ酸配列のN末端から5番目に位置するメチオニンが,改変後のアミノ酸配列においても同じ位置にあり,且つフレームワーク領域3については,配列番号68のN末端側から17番目に位置するロイシンが,改変後のアミノ酸配列においても同じ位置にあるものである,融合蛋白質。
16.上記12の融合蛋白質であって,但し該重鎖を構成するアミノ酸配列に代えてこれに対し1~3個のアミノ酸の置換,欠失又は付加による改変がなされたアミノ酸配列を含んでなるものであり,
ここに,CDR1については,配列番号67のアミノ酸配列のN末端から5番目に位置するメチオニンが,改変後のアミノ酸配列においても同じ位置にあり,且つフレームワーク領域3については,配列番号68のN末端側から17番目に位置するロイシンが,改変後のアミノ酸配列においても同じ位置にあるものである,融合蛋白質。
17.上記1~16の何れかの融合蛋白質であって,該抗体の軽鎖の可変領域において,
(a)CDR1が配列番号6又は配列番号7のアミノ酸配列を含んでなり,
(b)CDR2が配列番号8若しくは配列番号9のアミノ酸配列,又はアミノ酸配列Lys-Val-Serを含んでなり,且つ
(c)CDR3が配列番号10のアミノ酸配列を含んでなるものである,
融合蛋白質。
18.上記17の融合蛋白質であって,但し,該軽鎖の可変領域において,
(a)CDR1の配列番号6又は配列番号7のアミノ酸配列に代えてこれに対し80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなり,
(b)CDR2の配列番号8若しくは配列番号9のアミノ酸配列,又はアミノ酸配列Lys-Val-Serに代えてこれに対し80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなり,且つ
(c)CDR3の配列番号10のアミノ酸配列に代えてこれに対し80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるものである,
融合蛋白質。
19.上記17の融合蛋白質であって,但し,該軽鎖の可変領域において,
(a)CDR1の配列番号6又は配列番号7のアミノ酸配列に代えてこれに対し90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなり,
(b)CDR2の配列番号8若しくは配列番号9のアミノ酸配列,又はアミノ酸配列Lys-Val-Serに代えてこれに対し90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなり,且つ
(c)CDR3の配列番号10のアミノ酸配列に代えてこれに対し90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるものである,
融合蛋白質。
20.上記17の融合蛋白質であって,但し該軽鎖の可変領域において,
(a)CDR1については配列番号6又は配列番号7,
(b)CDR2については配列番号8若しくは配列番号9,又はアミノ酸配列Lys-Val-Ser,及び
(c)CDR3については配列番号10,
のうち少なくとも1つのアミノ酸配列に代えてこれに対し1~5個のアミノ酸の置換,欠失又は付加による改変がなされたアミノ酸配列を含んでなるものである,融合蛋白質。
21.上記17の融合蛋白質であって,但し該軽鎖の可変領域において,
(a)CDR1については配列番号6又は配列番号7,
(b)CDR2については配列番号8若しくは配列番号9,又はアミノ酸配列Lys-Val-Ser,及び
(c)CDR3については配列番号10,
のうち少なくとも1つのアミノ酸配列に代えてこれに対し1~3個のアミノ酸の置換,欠失又は付加による改変がなされたアミノ酸配列を含んでなるものである,融合蛋白質。
22.上記1~16の何れかの融合蛋白質であって,該抗体の軽鎖の可変領域が,配列番号17,配列番号18,配列番号19,配列番号20,配列番号21又は配列番号22のアミノ酸配列を含んでなるものである,融合蛋白質。
23.上記22の融合蛋白質であって,但し該軽鎖の可変領域のアミノ酸配列に代えてこれに対し80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるものである,融合蛋白質。
24.上記22の融合蛋白質であって,但し該軽鎖の可変領域のアミノ酸配列に代えてこれに対し90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるものである,融合蛋白質。
25.上記22の融合蛋白質であって,但し該軽鎖の可変領域のアミノ酸配列に代えてこれに対し1~5個のアミノ酸の置換,欠失又は付加による改変がなされたアミノ酸配列を含んでなるものである,融合蛋白質。
26.上記22の融合蛋白質であって,但し該軽鎖の可変領域のアミノ酸配列に代えてこれに対し1~3個のアミノ酸の置換,欠失又は付加による改変がなされたアミノ酸配列を含んでなるものである,融合蛋白質。
27.上記1~16の何れかの融合蛋白質であって,該抗体の軽鎖が,配列番号23,配列番号25,配列番号27又は配列番号29のアミノ酸配列を含んでなるものである,融合蛋白質。
28.上記27の融合蛋白質であって,但し該軽鎖のアミノ酸配列に代えてこれに対し80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるものである,融合蛋白質。
29.上記27の融合蛋白質であって,但し該軽鎖のアミノ酸配列に代えてこれに対し90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなるものである,融合蛋白質。
30.上記27の融合蛋白質であって,但し該軽鎖のアミノ酸配列に代えてこれに対し1~5個のアミノ酸の置換,欠失又は付加による改変がなされたアミノ酸配列を含んでなるものである,融合蛋白質。
31.上記27の融合蛋白質であって,但し該軽鎖のアミノ酸配列に代えてこれに対し1~3個のアミノ酸の置換,欠失又は付加による改変がなされたアミノ酸配列を含んでなるものである,融合蛋白質。
32.上記1~31の何れかの融合蛋白質であって,該抗体が,Fab抗体,F(ab’)2抗体,又はF(ab’)抗体である,融合蛋白質。
33.上記1~31の何れか融合蛋白質であって,該抗体が,scFab,scF(ab’),scF(ab’)2及びscFvからなる群から選ばれる一本鎖抗体である,融合蛋白質。
34.上記33の融合蛋白質であって,該抗体の軽鎖と重鎖とがリンカー配列を介して結合しているものである,融合蛋白質。
35.上記34の融合蛋白質であって,該軽鎖のC末端側において,リンカー配列を介して該重鎖が結合しているものである,融合蛋白質。
36.上記34の融合蛋白質であって,該重鎖のC末端側において,リンカー配列を介して該軽鎖が結合しているものである,融合蛋白質。
37.上記34~36の何れかの融合蛋白質であって,該リンカー配列が,8~50個のアミノ酸残基からなるものである,融合蛋白質。
38.上記37の融合蛋白質であって,該リンカー配列が,アミノ酸配列Gly-Ser,アミノ酸配列Gly-Gly-Ser,アミノ酸配列Gly-Gly-Gly,配列番号3,配列番号4,及び配列番号5の各アミノ酸配列,配列番号3のアミノ酸配列の3個が連続したものに相当するアミノ酸配列,及びこれらのアミノ酸配列の10個以下が連続してなる配列からなる群より選ばれるものである,融合蛋白質。
39.上記1~38の何れかの融合蛋白質であって,該BDNFが,該抗体の軽鎖又は重鎖のC末端側又はN末端側に結合したものである,融合蛋白質。
40.上記39の融合蛋白質であって,該BDNFが,該抗体の軽鎖又は重鎖のC末端側又はN末端側に,直接又はリンカーを介して結合したものである,融合蛋白質。
41.該リンカーが,1~50個のアミノ酸残基からなるペプチドである,上記40の融合蛋白質。
42.該リンカーが,アミノ酸配列Gly-Ser,アミノ酸配列Gly-Gly-Ser,配列番号3,配列番号4,及び配列番号5からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるペプチドである,上記41の融合蛋白質。
43.該BDNFがヒトBDNFである,上記1~42の何れかの融合蛋白質。
44.該ヒトBDNFが,配列番号51のアミノ酸配列又はこれと実質的に同一のアミノ酸配列を含んでなるものであるか,または配列番号51で表される蛋白質と同質の機能を有するものである,上記43の融合蛋白質。
45.上記1~44の何れかの融合蛋白質であって,ヒトトランスフェリン受容体の細胞外領域及びサルトランスフェリン受容体の細胞外領域の双方に対して親和性を有するものである,融合蛋白質。
46.上記45の融合蛋白質であって,該抗ヒトトランスフェリン受容体抗体が,ヒトトランスフェリン受容体の細胞外領域との解離定数が1×10-10M以下であり,サルトランスフェリン受容体の細胞外領域との解離定数が1×10-9M以下のものである,融合蛋白質。
47.上記43の融合蛋白質であって,
該軽鎖が,配列番号23のアミノ酸配列を含んでなり,且つ
(a)該重鎖が,そのC末端側でアミノ酸配列Gly-Serからなるリンカーを介して,ヒトBDNFと結合し,それにより配列番号52のアミノ酸配列を形成しているものであるか,又は
(b)該重鎖が,そのC末端側でアミノ酸配列Gly-Serに続いてアミノ酸配列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(配列番号3)が5個連続してなる計27個のアミノ酸からなるリンカーを介して,ヒトBDNFと結合し,それにより配列番号54のアミノ酸配列を形成しているものである,
融合蛋白質。
48.該抗体が抗原結合性断片である,上記1~31の何れか1項の融合蛋白質。
49.該抗原結合性断片のN末端側に,直接又はリンカーを介して,ヒトBDNFが結合してなるものである,上記48の融合蛋白質。
50.該抗原結合性断片が一本鎖抗体である,上記48又は49の融合蛋白質。
51.上記50の融合蛋白質であって,該抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域がリンカー配列を介して結合してなるものである,融合蛋白質。
52.上記51の融合蛋白質であって,該軽鎖可変領域のC末端側に,該リンカー配列を介して,該重鎖可変領域が結合してなるものである,融合蛋白質。
53.上記51の融合蛋白質であって,該重鎖可変領域のC末端側に,該リンカー配列を介して,該軽鎖可変領域が結合してなるものである,融合蛋白質。
54.上記51~53の何れかの融合蛋白質であって,該リンカー配列が,8~50個のアミノ酸残基からなるものである,融合蛋白質。
55.上記54の融合蛋白質であって,該リンカー配列が,アミノ酸配列Gly-Ser,アミノ酸配列Gly-Gly-Ser,アミノ酸配列Gly-Gly-Gly,配列番号3,配列番号4,及び配列番号5の各アミノ酸配列,配列番号3のアミノ酸配列の3個が連続したものに相当するアミノ酸配列,及びこれらのアミノ酸配列の10個以下が連続してなる配列からなる群より選ばれるものである,融合蛋白質。
56.上記50~55の何れかの融合蛋白質であって,該抗体が,配列番号69のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と,配列番号18のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含んでなるものである,融合蛋白質。
57.上記56の融合蛋白質であって,該抗体が,配列番号57のアミノ酸配列からなり,そのN末端側に,直接又はリンカーを介して,ヒトBDNFが結合してなるものである,融合蛋白質。
58.上記57の融合蛋白質であって,該抗体が配列番号57のアミノ酸配列からなり,そのN末端側に,リンカーを介して,ヒトプロBDNFが結合してなる,配列番号59のアミノ酸配列を含んでなるものである,融合蛋白質。
59.上記57の融合蛋白質であって,該抗体が配列番号57のアミノ酸配列からなり,そのN末端側に,リンカーを介して,ヒトBDNFが結合してなる,配列番号60のアミノ酸配列を含んでなるものである,融合蛋白質。
60.該抗原結合性断片が,Fab,F(ab’)2,又はF(ab’)の何れかである,上記48又は49の融合蛋白質。
61.上記60の融合蛋白質であって,Fab,F(ab’)2,又はF(ab’)の何れかの軽鎖又は重鎖のN末端側に,直接又はリンカーを介して,ヒトBDNFが結合してなるものである,融合蛋白質。
62.上記61の融合蛋白質であって,該抗体の軽鎖が配列番号23のアミノ酸配列からなり,且つ該抗体の重鎖が配列番号61のアミノ酸配列からなるFab重鎖であり,該重鎖のN末端側に,直接又はリンカーを介してヒトBDNF,が結合してなるものである,融合蛋白質。
63.上記62の融合蛋白質であって、該リンカーが,アミノ酸配列Gly-Ser,アミノ酸配列Gly-Gly-Ser,配列番号3のアミノ酸配列,配列番号4のアミノ酸配列,及び配列番号5のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるペプチドである,融合蛋白質。
64.上記62の融合蛋白質であって,
該軽鎖が配列番号23のアミノ酸配列を含んでなり,且つ
該Fab重鎖とそのN末端側に,リンカーを介して,結合したヒトプロBDNFとからなる部分が配列番号63のアミノ酸配列を形成しているものである,融合蛋白質。
65.上記62の融合蛋白質であって,
該軽鎖が配列番号23のアミノ酸配列を含んでなり,且つ
Fab重鎖とそのN末端側に,リンカーを介して,結合したヒトBDNFとからなる部分が配列番号65のアミノ酸配列を形成しているものである,融合蛋白質。
66.上記48~62の何れかの融合蛋白質であって,ヒトIgG Fc領域又はその一部が,ヒトBDNFと該抗体との間に導入されてなるものである,融合蛋白質。
67.上記66の融合蛋白質であって,ヒトBDNFのC末端側に,直接又はリンカー配列を介して,ヒトIgG Fc領域が結合してなり,且つ,該ヒトIgG Fc領域のC末端側に直接又はリンカー配列を介して該抗体が結合してなるものである,融合蛋白質。
68.上記66又は67の融合蛋白質であって,ヒトIgG Fc領域が配列番号75で示されるアミノ酸配列を含んでなるものである,融合蛋白質。
69.上記68の融合蛋白質であって,
該重鎖が,ヒトBDNFのC末端側に,直接又はリンカー配列を介して,該ヒトIgG Fc領域が結合してなり,且つ,該ヒトIgG Fc領域のC末端側に直接又はリンカー配列を介して該重鎖が結合したものである,融合蛋白質。
70.上記69の融合蛋白質であって,
該軽鎖が,配列番号23のアミノ酸配列を含んでなり,且つ
該重鎖が,ヒトBDNFのC末端側に,リンカー配列を介して,ヒトIgG Fc領域が結合してなり,且つ,該ヒトIgG Fc領域のC末端側にリンカー配列を介して該重鎖が結合したものであり,それにより配列番号74のアミノ酸配列を形成しているものである,融合蛋白質。
71.上記48~62の何れかの融合蛋白質であって,さらにアルブミン親和性ペプチドが導入されてなるものである,融合蛋白質。
72.上記71の融合蛋白質であって,該抗体のC末端側に,直接又はリンカー配列を介して,アルブミン親和性ペプチドが結合してなるものである,融合蛋白質。
73.上記71又は72の融合蛋白質であって,アルブミン親和性ペプチドが配列番号85で示されるアミノ酸配列を含んでなるものである,融合蛋白質。
74.上記73の融合蛋白質であって,
該重鎖が,ヒトBDNFのC末端側に,直接又はリンカー配列を介して結合してなり,且つ,該重鎖のC末端側に直接又はリンカー配列を介してアルブミン親和性ペプチドが結合したものである,融合蛋白質。
75.上記74の融合蛋白質であって,
該軽鎖が,配列番号23のアミノ酸配列を含んでなり,且つ
該重鎖が,ヒトプロBDNFのC末端側に,リンカー配列を介して結合してなり,且つ,該重鎖のC末端側にリンカー配列を介してアルブミン親和性ペプチドが結合したものであり,それにより配列番号87のアミノ酸配列を形成しているものである,融合蛋白質。
76.上記74の融合蛋白質であって,
該軽鎖が,配列番号23のアミノ酸配列を含んでなり,且つ
該重鎖が,ヒトBDNFのC末端側に,リンカー配列を介して結合してなり,且つ,該重鎖のC末端側にリンカー配列を介してアルブミン親和性ペプチドが結合したものであり,それにより配列番号88のアミノ酸配列を形成しているものである,融合蛋白質。
77.上記1~76の何れかの融合蛋白質をコードする,DNA断片。
78.上記77のDNA断片を組み込んでなる,発現ベクター。
79.上記78の発現ベクターで形質転換された哺乳動物細胞。
80.BDNFへの曝露によって利益を得ることができる疾患又は障害の予防及び/又は治療のための薬剤であって,上記1~76の何れかの融合蛋白質を有効成分として含んでなる,薬剤。
81.該疾患又は障害が,神経系の疾患又は障害である上記80の薬剤。
82.該神経系の疾患又は障害が,神経変性疾患,うつ病,統合失調症,てんかん,自閉症,Rett症候群,West症候群,新生児痙攣,認知症に伴う問題行動,不安症,疼痛,ヒルシュスプルング病又はレム睡眠行動障害である,上記81の薬剤。
83.該神経変性疾患が,脳神経変性疾患,脊髄変性疾患,網膜変性疾患又は末梢神経変性疾患である,上記82の薬剤。
84.該脳神経変性疾患が,脳神経系の神経変性疾患,脳虚血性疾患,外傷性脳損傷,白質脳症又は多発性硬化症である,上記83の薬剤。
85.該脳神経系の神経変性疾患が,アルツハイマー病,パーキンソン病,ハンチントン病,レビー小体型認知症,ピック病,多系統萎縮症,進行性上行性麻痺又はダウン症候群である,上記84の薬剤。
86.BDNFへの曝露によって利益を得ることができる疾患又は障害の予防及び/又は治療のための,上記1~76の何れかの融合蛋白質の使用。
87.BDNFへの曝露によって利益を得ることができる疾患又は障害の予防及び/又は治療用の医薬の製造のための,上記1~76の何れかの融合蛋白質の使用。
88.BDNFへの曝露によって利益を得ることができる疾患又は障害の予防及び/又は治療の方法であって,該疾患又は傷害を有する患者の血中に,上記1~76の何れかの融合蛋白質の治療上有効量を含有する医薬組成物を投与することを含むものである,方法。
(1)1本の免疫グロブリン軽鎖と1本の免疫グロブリン重鎖の計2本のポリペプチド鎖からなるものや,以下に詳述するように,
(2)免疫グロブリン軽鎖のC末端側にリンカー配列を,そして更にそのC末端側に免疫グロブリン重鎖を結合させてなるものである一本鎖抗体,及び
(3)免疫グロブリン重鎖のC末端側にリンカー配列を,そして更にそのC末端側に免疫グロブリン軽鎖を結合させてなるものである一本鎖抗体も含まれる。また,
(4)本来の意味での抗体の基本構造からFc領域が欠失したものであるFab領域からなるもの及びFab領域とヒンジ部の全部若しくは一部とからなるもの(Fab,F(ab’)及びF(ab’)2を含む)も,本発明における「抗体」に含まれる。
(5)上記(4)で示したFab,F(ab’)又はF(ab’)2を構成する軽鎖と重鎖を,リンカー配列を介して結合させて,それぞれ一本鎖抗体としたscFab,scF(ab’),及びscF(ab’)2も含まれる。ここで,scFab,scF(ab’),及びscF(ab’)2にあっては,軽鎖のC末端側にリンカー配列を,そして更にそのC末端側に重鎖を結合させてなるものでもよく,また,重鎖のC末端側にリンカー配列を,そして更にそのC末端側に軽鎖を結合させてなるものでもよい。更には,軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域をリンカー配列を介して結合させて一本鎖抗体としたscFvも,本発明における抗体に含まれる。scFvにあっては,軽鎖の可変領域のC末端側にリンカー配列を,そして更にそのC末端側に重鎖の可変領域を結合させてなるものでもよく,また,重鎖の可変領域のC末端側にリンカー配列を,そして更にそのC末端側に軽鎖の可変領域を結合させてなるものでもよい。
(a)hTfRとの解離定数:好ましくは1×10-10M以下,より好ましくは2.5×10-11M以下,更に好ましくは5×10-12M以下,更により好ましくは1×10-12M以下,
(b)サルTfRとの解離定数:好ましくは1×10-9M以下,より好ましくは5×10-10M以下,更に好ましくは1×10-10M以下,例えば7.5×10-11M以下。
(A)配列番号51のアミノ酸配列,
(B)配列番号51のアミノ酸配列において,1若しくは複数のアミノ酸が欠失,付加,挿入もしくは置換され,且つ配列番号51のアミノ酸配列からなる蛋白質と同質の機能を有する又は配列番号51のアミノ酸配列からなる蛋白質を特異的に認識する抗体によって認識され得る,アミノ酸配列,
(C)配列番号51のアミノ酸配列と少なくとも80%以上の相同性を有し,且つ配列番号51のアミノ酸配列からなる蛋白質と同質の機能を有する又は配列番号51のアミノ酸配列からなる蛋白質を特異的に認識する抗体によって認識され得る,アミノ酸配列,
(D)配列番号50の塩基配列を有するDNAによりコードされるアミノ酸配列,又は
(E)配列番号50の塩基配列を有するDNAに対し相補性を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされ,かつ配列番号51のアミノ酸配列からなる蛋白質と同質の機能を有する又は配列番号51のアミノ酸配列からなる蛋白質を特異的に認識する抗体によって認識され得る,アミノ酸配列。
(i)配列番号51のアミノ酸配列中の1~30個,好ましくは1~20個,より好ましくは1~10個,更に好ましくは1~数(6,5,4,3若しくは2)個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列,
(ii)配列番号51のアミノ酸配列に1~30個,好ましくは1~20個,より好ましくは1~10個,更に好ましくは1~数(6,5,4,3若しくは2)個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列,
(iii)配列番号51のアミノ酸配列に1~30個,好ましくは1~20個,より好ましくは1~10個,更に好ましくは1~数(6,5,4,3若しくは2)個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列,
(iv)配列番号51のアミノ酸配列中の1~30個,好ましくは1~20個,より好ましくは1~10個,さらに好ましくは1~数(6,5,4,3若しくは2)個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列,
又は
(v)それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質などのいわゆる変異体も含まれる。
(F)配列番号51のアミノ酸配列をコードする塩基配列,
(G)配列番号51のアミノ酸配列において,1又は複数のアミノ酸が欠失,付加,挿入若しくは置換され,且つ配列番号51のアミノ酸配列からなる蛋白質と同質の機能を有する又は配列番号51のアミノ酸配列からなる蛋白質を特異的に認識する抗体によって認識され得るアミノ酸配列をコードする塩基配列,
(H)配列番号51のアミノ酸配列と少なくとも80%以上の相同性を有し,かつ,配列番号51のアミノ酸配列からなる蛋白質と同質の機能を有する又は配列番号51のアミノ酸配列からなる蛋白質を特異的に認識する抗体によって認識され得るアミノ酸配列をコードする塩基配列,
(I)配列番号50の塩基配列を有するDNAによりコードされるアミノ酸配列をコードする塩基配列,又は
(J)配列番号50の塩基配列を有するDNAに対し相補性を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされ,かつ配列番号51のアミノ酸配列からなる蛋白質と同質の機能を有する又は配列番号51のアミノ酸配列からなる蛋白質を特異的に認識する抗体によって認識され得るアミノ酸配列をコードする塩基配列,を有する遺伝子が挙げられる。
(1)ヒト化抗hTfR抗体の軽鎖が,配列番号23のアミノ酸配列を含んでなり,且つ
ヒト化抗hTfR抗体の重鎖が,そのC末端側で,アミノ酸配列Gly-Serからなるリンカーを介して,ヒトBDNFと結合しており,それにより配列番号52のアミノ酸配列を含んでなるものである,
融合蛋白質;及び
(2)ヒト化抗hTfR抗体の軽鎖が,配列番号23のアミノ酸配列含んでなり,且つヒト化抗hTfR抗体の重鎖が,そのC末端側で,アミノ酸配列Gly-Serに続いてアミノ酸配列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(配列番号3)が5個連続してなる計27個のアミノ酸からなるリンカーを介して,ヒトBDNFと結合しており,それにより配列番号54のアミノ酸配列を含んでなるものである,
融合蛋白質,
が例示できる。
(1)配列番号23のアミノ酸配列を有するヒト化抗hTfR抗体の軽鎖と,配列番号70のアミノ酸配列を有するヒト化抗hTfR抗体の重鎖のC末端側に,アミノ酸配列Gly-Serからなるリンカーを介して,配列番号51のアミノ酸配列を有するヒトBDNFが結合したものとを含む,融合蛋白質;及び
(2)配列番号23のアミノ酸配列を有するヒト化抗hTfR抗体の軽鎖と,配列番号70のアミノ酸配列を有するヒト化抗hTfR抗体の重鎖のC末端側に,アミノ酸配列Gly-Serに続いてアミノ酸配列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(配列番号3)が5個連続してなる計27個のアミノ酸からなるリンカーを介して,配列番号51のアミノ酸配列を有するヒトBDNFが結合したものとを含む,融合蛋白質,
である。
なお,上記(1)及び(2)において,ヒト化抗hTfR抗体の重鎖を,配列番号70のアミノ酸配列を有するものから配列番号72のアミノ酸配列を有するものに置き換えることができる。配列番号70と72のアミノ酸配列を有するものは,それぞれIgG1タイプとIgG4タイプの抗体である。配列番号70のアミノ酸配列を有するものをコードする塩基配列としては配列番号71で示されるものが,配列番号72のアミノ酸配列を有するものをコードする塩基配列としては配列番号76で示されるものが例示できる。
(1)軽鎖が配列番号23のアミノ酸配列からなり,且つFab重鎖とそのN末端側に,リンカーを介して,結合したヒトプロBDNFとからなる部分が,配列番号63のアミノ酸配列からなるものである,融合蛋白質;及び,
(2)軽鎖が配列番号23のアミノ酸配列からなり,且つFab重鎖とそのN末端側に,リンカーを介して,結合したヒトBDNFとからなる部分が,配列番号65のアミノ酸配列からなるものである,融合蛋白質
が挙げられる。
(1)BDNFと抗hTfR抗体との融合蛋白質であって,該抗hTfR抗体が抗原結合性断片であり,この抗原結合性断片のN末端側に,直接又はリンカーを介してヒトBDNFが結合したものである,融合蛋白質。
(2)BDNFと抗hTfR抗体との融合蛋白質であって,該抗hTfR抗体が一本鎖抗体であり,この一本鎖抗体のN末端側に,直接又はリンカーを介してヒトBDNFが結合したものである,融合蛋白質。
(3)BDNFと抗hTfR抗体との融合蛋白質であって,該抗hTfR抗体がFab,F(ab’)2,又はF(ab’)の何れかであり,これらFab,F(ab’)2,又はF(ab’)の重鎖又は軽鎖のN末端側に,直接又はリンカーを介してヒトBDNFが結合したものである,融合蛋白質。
ここで,上記(3)の場合は,ヒトBDNFは,抗hTfR抗体のFab,F(ab’)2,又はF(ab’)の何れかの重鎖のN末端側と,特に好適に結合させることができる。従って,より具体的には,以下のようなものを例示することができる。
(4)BDNFと抗hTfR抗体との融合蛋白質であって,該抗hTfR抗体がFab,F(ab’)2,又はF(ab’)の何れかであり,これらFab,F(ab’)2,又はF(ab’)の重鎖のN末端側に,直接又はリンカーを介してヒトBDNFが結合したものである,融合蛋白質。
(a)hTfRとの解離定数:好ましくは1×10-10M以下,より好ましくは2.5×10-11M以下,更に好ましくは5×10-12M以下,更により好ましくは1×10-12M以下
(b)サルTfRとの解離定数:好ましくは1×10-9M以下,より好ましくは5×10-10M以下,更に好ましくは1×10-10M以下,例えば7.5×10-11M以下。
CDR1が配列番号66又は配列番号67のアミノ酸配列を含んでなり,CDR2が配列番号13又は配列番号14のアミノ酸配列を含んでなり,且つCDR3が配列番号15又は配列番号16のアミノ酸配列を含んでなるもの。
CDR1が配列番号66のアミノ酸配列を含んでなり,CDR2が配列番号13のアミノ酸配列を含んでなり,及びCDR3が配列番号15に記載のアミノ酸配列を含んでなるもの。
CDR1が配列番号6又は配列番号7のアミノ酸配列を含んでなり,CDR2が配列番号8若しくは配列番号9のアミノ酸配列,又はアミノ酸配列Lys-Val-Ser,及びCDR3として配列番号10のアミノ酸配列を含んでなるものである軽鎖と,CDR1が配列番号66又は配列番号67のアミノ酸配列,CDR2が配列番号13又は配列番号14のアミノ酸配列を含んでなり,及びCDR3として配列番号15又は配列番号16のアミノ酸配列を含んでなるものである重鎖との組み合わせ。
CDR1が配列番号6のアミノ酸配列を含んでなり,CDR2が配列番号8のアミノ酸配列を含んでなり,及びCDR3が配列番号10のアミノ酸配列を含んでなるものである軽鎖と,CDR1が配列番号66のアミノ酸配列を含んでなり,CDR2が配列番号13のアミノ酸配列を含んでなり,及びCDR3が配列番号15のアミノ酸配列を含んでなるものである重鎖の組み合わせ。
抗hTfR抗体であって,軽鎖の可変領域が,配列番号17,配列番号18,配列番号19,配列番号20,配列番号21,及び配列番号22で示されるアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含んでなり,重鎖の可変領域が,配列番号69で示されるアミノ酸配列を含んでなるものである,抗hTfR抗体。
(1a)軽鎖の可変領域が配列番号18のアミノ酸配列を含み且つ重鎖の可変領域が配列番号69のアミノ酸配列を含むもの,
(1b)軽鎖の可変領域が配列番号20のアミノ酸配列を含み且つ重鎖の可変領域が配列番号69のアミノ酸配列を含むもの,
(1c)軽鎖の可変領域が配列番号21のアミノ酸配列を含み且つ重鎖の可変領域が配列番号69のアミノ酸配列を含むもの,及び
(1d)軽鎖の可変領域が配列番号22のアミノ酸配列を含み且つ重鎖の可変領域が配列番号69のアミノ酸配列を含むものが挙げられる。
(2a)軽鎖が配列番号23のアミノ酸配列を含み且つ重鎖が配列番号70又は72のアミノ酸配列を含むもの,
(2b)軽鎖が配列番号25のアミノ酸配列を含み且つ重鎖が配列番号70又は72のアミノ酸配列を含むもの,
(2c)軽鎖が配列番号27のアミノ酸配列を含み且つ重鎖が配列番号70又は72のアミノ酸配列を含むもの,
(2d)軽鎖が配列番号29のアミノ酸配列を含み且つ重鎖が配列番号70又は72のアミノ酸配列を含むものが挙げられる。
(3a)軽鎖が配列番号23のアミノ酸配列を含み且つFab重鎖が配列番号61のアミノ酸配列を含むもの,
(3b)軽鎖が配列番号25のアミノ酸配列を含み且つFab重鎖が配列番号61のアミノ酸配列を含むもの,
(3c)軽鎖が配列番号27のアミノ酸配列を含み且つFab重鎖が配列番号61のアミノ酸配列を含むもの,
(3d)軽鎖が配列番号29のアミノ酸配列を含み且つFab重鎖が配列番号61のアミノ酸配列を含むものが挙げられる。
(4a)軽鎖が配列番号23のアミノ酸配列を含み且つFc領域を導入したFab重鎖が配列番号81のアミノ酸配列を含むもの,
(4b)軽鎖が配列番号25のアミノ酸配列を含み且つFc領域を導入したFab重鎖が配列番号81のアミノ酸配列を含むもの,
(4c)軽鎖が配列番号27のアミノ酸配列を含み且つFc領域を導入したFab重鎖が配列番号81のアミノ酸配列を含むもの,
(4d)軽鎖が配列番号29のアミノ酸配列を含み且つFc領域を導入したFab重鎖が配列番号81のアミノ酸配列を含むものが挙げられる。
アルブミン親和性ペプチドが配列番号85で示されるアミノ酸配列を有するアルブミン結合ドメインであり,
(5a)軽鎖が配列番号23のアミノ酸配列を含み,且つアルブミン親和性ペプチドを導入したFab重鎖が配列番号89のアミノ酸配列を含むもの,
(5b)軽鎖が配列番号25のアミノ酸配列を含み,且つアルブミン親和性ペプチドを導入したFab重鎖が配列番号89のアミノ酸配列を含むもの,
(5c)軽鎖が配列番号27のアミノ酸配列を含み,且つアルブミン親和性ペプチドを導入したFab重鎖が配列番号89のアミノ酸配列を含むもの,
(5d)軽鎖が配列番号29のアミノ酸配列を含み,且つアルブミン親和性ペプチドを導入したFab重鎖が配列番号89のアミノ酸配列を含むものが挙げられる。
本発明の融合蛋白質は,後述の実施例に記載された方法又は本分野で周知の方法により製造することができる。
例えば,本明細書の実施例16及び17に記載したように取得した抗ヒトトランスフェリン抗体の重鎖のN末端に,直接又はリンカー(例えば,配列番号3が5回繰り返される25個のアミノ酸からなるもの)を介して,BDNFのC末端を融合させたものである融合蛋白質をコードするDNAを有する発現用ベクターと,当該抗体の軽鎖をコードするDNAを有する動植物細胞発現用ベクターをそれぞれ構築して,適当なホスト細胞に併せて導入することにより,本発明の融合蛋白質を産生する細胞あるいはトランスジェニック動植物を得ることができる。あるいは,取得した抗ヒトトランスフェリン抗体の軽鎖のN末端に,直接又はリンカー(例えば,配列番号3が5回繰り返される25個のアミノ酸からなるもの)を介してBDNFのC末端を融合させたものである融合蛋白質をコードするDNAを有する発現用ベクターと,当該抗体の重鎖をコードするDNAを有する発現用ベクターをそれぞれ構築して,適当なホスト細胞に併せて導入することにより,本発明の融合蛋白質を産生する細胞あるいはトランスジェニック動植物を得ることができる。
BDNFの機能は,BDNF受容体(TrkB)に対する結合親和性(Eur J Neurosci(1994)6:1389-1405),BDNF受容体のリン酸化を指標としたBDNF受容体の活性化(Biochim Biophys Acta(2015)1852:862-872),BDNF受容体の活性化に伴う細胞内カルシウム増加等の細胞内シグナル伝達増強活性(Nature Reviews Neuroscience(2009)10:850-860),TrkB発現神経細胞に対する増殖促進作用(岐阜薬科大学紀要(2006)55:53-54),生存維持作用(Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry(2015)60:11-17),神経突起伸展作用(J Biol Chem(2007)282:34525-34534)等を調べることによりインビトロで評価できる。インビトロで用いる細胞としては,TrkBを内在性に発現する細胞であっても外来性に強制発現させた細胞であってもよい。例えば,BAF細胞,CHO細胞,PC-12細胞等にTrkB遺伝子を導入して強制発現させた細胞や,海馬や線条体等の初代培養神経細胞を用いることができる。
なお,ある疾患モデル動物,例えばパーキンソン病モデル動物において本発明の融合蛋白質(hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白質)を末梢から投与することにより当該疾患又は障害が改善されたということは,BDNFが本来有する効果を発揮し得る程度に本発明の融合蛋白質が必要部位(例えば脳内)に到達したことを示しており,このことは,本発明の融合蛋白質は,当該疾患に限らず,BDNFへの曝露によって利益を得ることができる疾患および障害を治療するのに広く使用することができることを意味する。
本発明の融合蛋白質は,薬剤として,凍結乾燥品,又は水性液剤等の形態で医療機関に供給することができる。水性液剤の場合,薬剤を,安定化剤,緩衝剤,等張化剤を含有する溶液に予め溶解したものを,バイアル又は注射器に封入した製剤として供給できる。注射器に封入された製剤は,一般にプレフィルドシリンジ製剤と呼称される。プレフィルドシリンジ製剤とすることにより,患者自身による薬剤の投与を簡易にすることができる。
ヒト脾臓Quick Clone cDNA(Clontech社)を鋳型として,プライマーhTfR5’(配列番号41)及びプライマーhTfR3’(配列番号42)を用いて,PCRによりヒトトランスフェリン受容体(hTfR)をコードする遺伝子断片を増幅させた。増幅させたhTfRをコードする遺伝子断片を,MluIとNotIで消化し,pCI-neoベクター(Promega社)のMluIとNotI間に挿入した。得られたベクターを,pCI-neo(hTfR)と名付けた。次いで,このベクターを,MluIとNotIで消化して,hTfRをコードする遺伝子断片を切り出し,国際公開公報(WO2012/063799)に記載された発現ベクターであるpE-mIRES-GS-puroのMluIとNotIの間に組み込むことにより,hTfR発現用ベクターであるpE-mIRES-GS-puro(hTfR)を構築した。
エレクトロポレーション法により,CHO-K1細胞にpE-mIRES-GS-puro(hTfR)を導入した後,メチオニンスルホキシミン(MSX)及びピューロマイシンを含むCD OptiCHOTM培地(Invitrogen社)を用いて細胞の選択培養を行い,組換えhTfR発現細胞を得た。この組換えhTfR発現細胞を培養して,組換えhTfRを調製した。
実施例2で調製した組換えhTfRを抗原として用いてマウスを免疫した。免疫は,マウスに抗原を静脈内投与又は腹腔内投与して行った。
最後に細胞を投与した日の約1週間後にマウスの脾臓を摘出してホモジナイズし,脾細胞を分離した。得られた脾細胞をマウスミエローマ細胞株(P3.X63.Ag8.653)とポリエチレングリコール法を用いて細胞融合させた。細胞融合終了後,(1X)HATサプリメント(Life Technologies社)及び10% Ultra low IgGウシ胎児血清(Life Technologies社)を含むRPMI1640培地に細胞を懸濁させ,細胞懸濁液を96ウェルプレート20枚に200μL/ウェルずつ分注した。炭酸ガス培養器(37℃,5%CO2)で細胞を10日間培養した後,各ウェルを顕微鏡下で観察し,単一のコロニーが存在するウェルを選択した。
組換えhTfR溶液(Sino Biologics社)を50mM炭酸ナトリウム緩衝液(pH9.5~9.6)で希釈して5μg/mLの濃度に調整し,これを固相溶液とした。固相溶液を,Nunc MaxiSorpTM flat-bottom 96ウェルプレート(基材:ポリスチレン,Nunc社製)の各ウェルに50μLずつ添加した後,プレートを室温で1時間静置し,組換えhTfRをプレートに吸着させて固定した。固相溶液を捨て,各ウェルを250μLの洗浄液(PBS-T:0.05% Tween20を含有するPBS)で3回洗浄した後,各ウェルにブロッキング液(1% BSAを含有するPBS)を200μLずつ添加し,プレートを室温で1時間静置した。
実施例5で選択したクローン3株からcDNAを調製し,このcDNAを鋳型として抗体の軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子を増幅させた。増幅させた遺伝子の塩基配列を翻訳し,この細胞株の産生する抗hTfR抗体番号3の抗体について,軽鎖及び重鎖の可変領域のアミノ酸配列を決定した。
抗hTfR抗体とヒトTfR及びサルTfRへの親和性の測定は,バイオレイヤー干渉法(BioLayer Interferometry:BLI)を用いた生体分子相互作用解析システムであるOctetRED96(ForteBio社,a division of Pall Corporation)を用いて実施した。バイオレイヤー干渉法の基本原理について,簡単に説明する。センサーチップ表面に固定された生体分子の層(レイヤー)に特定波長の光を投射したとき,生体分子のレイヤーと内部の参照となるレイヤーの二つの表面から光が反射され,光の干渉波が生じる。測定試料中の分子がセンサーチップ表面の生体分子に結合することにより,センサー先端のレイヤーの厚みが増加し,干渉波に波長シフトが生じる。この波長シフトの変化を測定することにより,センサーチップ表面に固定された生体分子に結合する分子数の定量及び速度論的解析をリアルタイムで行うことができる。測定は,概ねOctetRED96に添付の操作マニュアルに従って実施した。ヒトTfRとしては,N末端にヒスチジンタグが付加した,配列番号1に示されるアミノ酸配列の中でN末端側から89番目のシステイン残基からC末端のフェニルアラニンまでの,hTfRの細胞外領域のアミノ酸配列を有する組換えヒトTfR(rヒトTfR:Sino Biological社)を用いた。サルTfRとしては,N末端にヒスチジンタグが付加した,配列番号2に示されるアミノ酸配列の中でN末端側から89番目のシステイン残基からC末端のフェニルアラニンまでの,カニクイザルのTfRの細胞外領域のアミノ酸配列を有する組換えサルTfR(rサルTfR:Sino Biological社)を用いた。
次いで,抗hTfR抗体番号3について,各抗体がBBBを通過して脳内に移行することを,マウストランスフェリン受容体の細胞外領域をコードする遺伝子をヒトトランスフェリン受容体遺伝子の細胞外領域をコードする遺伝子に置換したhTfRノックインマウス(hTfR-KIマウス)を用いて評価した。hTfR-KIマウスは,概ね下記の方法で作製した。また,抗hTfR抗体番号3としては,実施例7で調製した精製品を用いた。
抗hTfR抗体番号3を,5.0mg/kgの用量で雄性カニクイザルに単回静脈内投与し,投与8時間後に生理食塩液で全身潅流を実施した。また,陰性対照として,抗hTfR抗体を非投与の1匹の個体を同様に全身潅流した。潅流後,延髄を含む脳組織を摘出した。この脳組織を用いて,以下の抗hTfR抗体の濃度測定及び免疫組織化学染色を行った。抗hTfR抗体番号3としては,実施例7に記載の抗体の精製品を用いた。
抗hTfR抗体番号3の軽鎖及び重鎖の可変領域に含まれるアミノ酸配列のヒト化を試みた。そうして,配列番号17~配列番号22に示されるアミノ酸配列を有するヒト化された軽鎖の可変領域と,配列番号31~配列番号36に示されるアミノ酸配列を有するヒト化された重鎖の可変領域を得た(ヒト化抗hTfR抗体番号3の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列1~6,及びヒト化抗hTfR抗体番号3の重鎖の可変領域のアミノ酸配列1~6)。
上記の抗hTfR抗体番号3について,それぞれヒト化抗hTfR抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域を含む,軽鎖及び重鎖の全長をコードする遺伝子を含むDNA断片を人工的に合成した。このとき,軽鎖の全長をコードする遺伝子の5’側には,5’端から順にMluI配列とリーダーペプチドをコードする配列とを,3’側にはNotI配列を導入した。また,重鎖の全長をコードする遺伝子の5’側には,5’端から順にMluI配列とリーダーペプチドをコードする配列とを,3’側にはNotI配列を導入した。なお,ここで導入したリーダーペプチドは,ヒト化抗体の軽鎖及び重鎖をホスト細胞である哺乳動物細胞で発現させたときに,軽鎖及び重鎖が細胞外に分泌されるように,分泌シグナルとして機能するものである。
pEF/myc/nucベクター(インビトロジェン社)を,KpnIとNcoIで消化し,EF-1αプロモーターおよびその第一イントロンを含む領域を切り出し,これをT4 DNAポリメラーゼで平滑末端化処理した。pCI-neo(インビトロジェン社)を,BglIIおよびEcoRIで消化して,CMVのエンハンサー/プロモーターおよびイントロンを含む領域を切除した後に,T4 DNAポリメラーゼで平滑末端化処理した。これに,上記のEF-1αプロモーターおよびその第一イントロンを含む領域を挿入して,pE-neoベクターを構築した。pE-neoベクターを,SfiIおよびBstXIで消化し,ネオマイシン耐性遺伝子を含む約1kbpの領域を切除した。pcDNA3.1/Hygro(+)(インビトロジェン社)を鋳型にしてプライマーHyg-Sfi5’(配列番号43)およびプライマーHyg-BstX3’(配列番号44)を用いて,PCR反応によりハイグロマイシン遺伝子を増幅した。増幅したハイグロマイシン遺伝子を,SfiIおよびBstXIで消化し,上記のネオマイシン耐性遺伝子を切除したpE-neoベクターに挿入して,pE-hygrベクターを構築した。
CHO細胞(CHO-K1:American Type Culture Collectionから入手)を,下記の方法により,GenePulser(Bio-Rad社)を用いて,実施例11で構築した軽鎖発現用ベクターpE-hygr(LC3)及び重鎖発現用ベクターpE-neo(HC3)で形質転換した。細胞の形質転換は概ね以下の方法で行った。5×105個のCHO-K1細胞をCD OptiCHOTM培地(ライフテクノロジー社)を添加した3.5cm培養ディッシュに播種し,37℃,5%CO2の条件下で一晩培養した。培地をOpti-MEMTM I培地(ライフテクノロジー社)に交換し,細胞を5×106細胞/mLの密度となるように懸濁した。細胞懸濁液100μLを採取し,これにOpti-MEMTM I培地で100μg/mLに希釈したpE-hygr(LC3)及びpE-neo(HC3)プラスミドDNA溶液を5μLずつ添加した。GenePulser(Bio-Rad社)を用いて,エレクトロポレーションを実施し,細胞にプラスミドを導入した。細胞を,37℃,5%CO2の条件下で一晩培養した後,0.5mg/mLのハイグロマイシン及び0.8mg/mLのG418を添加したCD OptiCHOTM培地で選択培養した。
次いで,限界希釈法により,1ウェルあたり1個以下の細胞が播種されるように,96ウェルプレート上に選択培養で選択された細胞を播種し,各細胞が単クローンコロニーを形成するように約10日間培養した。単クローンコロニーが形成されたウェルの培養上清を採取し,培養上清中のヒト化抗体含量をELISA法にて調べ,ヒト化抗体高発現細胞株を選択した。
実施例12で得られた抗体番号3発現株,抗体番号3-2発現株,抗体番号3-3発現株及び抗体番号3-4発現株を,それぞれ細胞濃度が約2×105個/mLとなるように,CD OptiCHOTM培地で希釈し,1Lの三角フラスコに200mLの細胞懸濁液を加え,37℃で,5%CO2と95%空気からなる湿潤環境で約70rpmの撹拌速度で6~7日間培養した。培養上清を遠心操作により回収し,0.22μmフィルター(Millipore社)でろ過して,培養上清とした。回収した培養上清に,150mM NaClを含む5倍容の20mM Tris緩衝液(pH8.0)を添加し,予め150mM NaClを含むカラム体積3倍容の20mM Tris緩衝液(pH8.0)で平衡化しておいたProtein Aカラム(カラム体積:1mL,Bio-Rad社)に負荷した。次いで,カラム体積の5倍容の同緩衝液によりカラムを洗浄した後,150mM NaClを含むカラム体積の4倍容の50mMグリシン緩衝液(pH2.8)で,吸着したヒト化抗体を溶出させ,溶出画分を採取した。溶出画分に1M Tris緩衝液(pH8.0)を添加して中和して,これを抗体の精製品とした。
実施例13で得たヒト化抗hTfR抗体のヒトTfR及びサルTfRへの親和性を,実施例7に記載の方法で測定した。表6にヒト化抗hTfR抗体番号3~3-4(表中,No.3~3-4にそれぞれ対応)のヒトTfRに対する会合速度定数(kon)及び解離速度定数(koff)の測定結果,及び解離定数(KD)を示す。
ヒト化抗hTfR抗体番号3,ヒト化抗hTfR抗体番号3-2,ヒト化抗hTfR抗体番号3(IgG4)及びヒト化抗hTfR抗体番号3-2(IgG4)の4種の抗体を用いて,サルを用いた薬物動態解析を行った。なお,ヒト化抗hTfR抗体番号3は重鎖がIgG1であり,ヒト化抗hTfR抗体番号3(IgG4)はヒト化抗hTfR抗体番号3の重鎖を可変領域はそのままにしてIgG4としたものである。また,ヒト化抗hTfR抗体番号3-2は重鎖がIgG1であり,ヒト化抗hTfR抗体番号3-2(IgG4)はヒト化抗hTfR抗体番号3-2の重鎖を可変領域はそのままにしてIgG4としたものである。これら4種の抗体を,それぞれ,5.0mg/kgの用量でそれぞれ雄性カニクイザルに単回静脈内投与し,投与前,投与後2分,30分,2時間,4時間及び8時間後に末梢血を採取し,採血後に全身潅流を実施した。また,陰性対照として,HER2蛋白に対するヒト化抗体であるトラスツズマブ(ハーセプチンTM,中外製薬)を,同様にして一匹の個体に投与し,投与前,投与後2分,30分,2時間,4時間及び8時間後に末梢血を採取し,採血後に全身潅流を実施した。潅流後,延髄を含む脳組織,脊髄組織及びその他の組織(肝臓,心臓,脾臓及び骨髄を含む)を摘出した。この脳組織,脊髄組織及びその他の組織を用いて,以下のヒト化抗hTfR抗体の濃度測定及び免疫組織化学染色を行った。
配列番号56で示されるアミノ酸配列を有するhBDNFのプロ体のC末端側に,Gly-Serに続いて配列番号3で示されるアミノ酸配列Gly-Gly-Gly-Gly-Serが5回繰り返される計27個のアミノ酸からなるリンカー配列を介して,配列番号77で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗hTfR抗体Fab重鎖を融合させた融合蛋白質をコードする遺伝子を含む,配列番号78で示される塩基配列を有するDNA断片を人工的に合成した。ここで,配列番号77で示されるアミノ酸配列は,配列番号37で示されるアミノ酸配列のN末端側から1番目~226番目に相当する。ここでN末端側から1番目~118番目のアミノ酸配列が配列番号32(ヒト化抗hTfR抗体番号3の重鎖の可変領域のアミノ酸配列2)に相当し,119番目~216番目のアミノ酸配列がCH1領域に相当し,217番目~226番目のアミノ酸配列がヒンジ部に相当する。
実施例15-2で得られたhBDNF-抗hTfR抗体(3)1発現株を用いて,実施例13に記載の方法で,hBDNF-抗hTfR抗体(3)1の精製品を得た。
配列番号37で示されるヒト化抗hTfR抗体番号3の重鎖の可変領域において,CDR1を配列番号12で示されるものとしたときの,当該CDR1のアミノ酸配列を1個置換するとともに,フレームワーク領域3のアミノ酸配列を1個置換するヒト化抗体の重鎖を作成した。この新たな抗体の重鎖は,CDR1に配列番号66(又はこれを含む配列番号67)のアミノ酸配列を含み,フレームワーク領域3に配列番号68のアミノ酸配列を含むものであり,従って,配列番号37で示されるヒト化抗hTfR抗体番号3の重鎖のアミノ酸配列を構成するアミノ酸を2個置換したものである。この新たな抗体(ヒト化抗hTfR抗体番号3N)の重鎖は,配列番号70のアミノ酸配列を含み,その可変領域は配列番号69で示されるアミノ酸配列を含んでなる。
配列番号70で示されるアミノ酸配列からなる抗体の重鎖をコードする遺伝子を含むDNA断片(配列番号71)を人工的に合成した。このDNA断片の5’側には,5’端から順にMluI配列とリーダーペプチドをコードする配列とを,3’側にはNotI配列を導入した。こうして合成したDNAを実施例11に記載の方法でpE-neoベクターに組み込み,得られたベクターを,ヒト化抗hTfR抗体番号3Nの重鎖発現用ベクターのpE-neo(HC3)Nとした。このpE-neo(HC3)Nと実施例11で構築した軽鎖発現用ベクターpE-hygr(LC3)とを用いて,実施例12に記載の方法でCHO細胞を形質転換させて,ヒト化抗hTfR抗体番号3N発現株を得た。
実施例17で得られたヒト化抗hTfR抗体番号3N発現株を用いて,実施例13に記載の方法で,ヒト化抗hTfR抗体番号3Nの精製品を得た。なお,ヒト化抗hTfR抗体番号3Nは,ヒト化抗hTfR抗体番号3の重鎖のアミノ酸配列中,表10及び表11で示される2箇所のアミノ酸を置換したものである。一方,ヒト化抗hTfR抗体番号3Nとヒト化抗hTfR抗体番号3の軽鎖のアミノ酸配列は同一である。
実施例13で得たヒト化抗hTfR抗体番号3と実施例17で得たヒト化抗hTfR抗体番号3NのヒトTfRへの親和性を,実施例7に記載の方法で測定した。表12にそれぞれの抗体のヒトTfRに対する会合速度定数(kon)及び解離速度定数(koff)の測定結果,及び解離定数(KD)を示す。なお,ヒト化抗hTfR抗体番号3のヒトTfRへの親和性を示す測定値は,表6に示されたものと異なるが,実験誤差である。
実施例13で得たヒト化抗hTfR抗体番号3と実施例17で得たヒト化抗hTfR抗体番号3Nを,それぞれ,5.0mg/kgの用量でそれぞれ雄性カニクイザルに単回静脈内投与し,投与8時間後に全身潅流を実施した。潅流後,延髄を含む脳組織及び脊髄組織を摘出した。脳組織については,摘出後に大脳皮質,小脳,海馬及び延髄に分けた。
配列番号81で示されるアミノ酸配列からなるヒトIgG Fc領域が導入されたヒト化抗hTfR抗体3NのFab重鎖のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含むDNA断片(配列番号82)を人工的に合成した。このDNA断片の5’側には,5’端から順にMluI配列とリーダーペプチドをコードする配列とが,3’側にはNotI配列が導入されている。こうして合成したDNAを実施例11に記載の方法でpE-neoベクターに組み込み,得られたベクターをpE-neo(Fc-Fab HC(3N))とした。このpE-neo(Fc-Fab HC(3N))と実施例11で構築した軽鎖発現用ベクターpE-hygr(LC3)とを用いて,実施例12に記載の方法でCHO細胞を形質転換させて,Fc-Fab(3N)発現株を得た。
Fc-Fab(3N)発現株を用いて,実施例13に記載の方法で,Fc-Fab(3N)の精製品を得た。
実施例20-3で得られたFc-Fab(3N)の精製品のヒトTfR及びサルTfRへの親和性を,実施例7に記載の方法で測定した。結果を表14-2に示す。この結果は,Fc-Fab(3N)は,脳組織内で機能させるべき薬剤をこれらの抗体と結合させることにより,その薬剤を効率良く脳組織に蓄積させることができる性質を有することを示すものである。
実施例20-3で得られたFc-Fab(3N)を,5.0mg/kgの用量で雄性カニクイザルに単回静脈内投与し,投与8時間後に全身潅流を実施した。潅流後,延髄を含む脳組織及び脊髄組織を摘出した。脳組織については,摘出後に大脳皮質,小脳,海馬及び延髄に分けた。
(1)配列番号56で示されるアミノ酸配列を有するhBDNFのプロ体のC末端側に,配列番号3で示されるアミノ酸配列Gly-Gly-Gly-Gly-Serが5回繰り返される計25個のアミノ酸からなるリンカー配列を介して,配列番号61で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗hTfR抗体3NFab重鎖を融合させた融合蛋白質をコードする遺伝子を含む,配列番号62で示される塩基配列を有するDNA断片を人工的に合成した。ここで,配列番号61で示されるアミノ酸配列は,配列番号70で示されるヒト化抗hTfR抗体番号3Nの重鎖のアミノ酸配列のN末端側から1番目~226番目に相当する。ここでN末端側から1番目~118番目のアミノ酸配列が配列番号69(ヒト化抗hTfR抗体番号3Nの重鎖の可変領域のアミノ酸配列)に相当し,119番目~216番目のアミノ酸配列がCH1領域に相当し,217番目~226番目のアミノ酸配列がヒンジ部に相当する。
配列番号56で示されるアミノ酸配列を有するhBDNFのプロ体のC末端側に、配列番号3で示されるアミノ酸配列Gly-Gly-Gly-Gly-Serが5回繰り返される計25個のアミノ酸からなるリンカー配列を介して,配列番号61で示されるアミノ酸配列の第1番目から第216番目に対応するアミノ酸配列(配列番号84)を有するヒト化抗hTfR抗体3NFab重鎖を融合させ、更に、そのC末端側に、配列番号3で示されるアミノ酸配列Gly-Gly-Gly-Gly-Serが3回繰り返される計15個のアミノ酸からなるリンカー配列を介して,配列番号85で示されるABDを融合させた融合蛋白質をコードする遺伝子を含む,配列番号86で示される塩基配列を有するDNA断片を人工的に合成した。ここで,配列番号84で示されるアミノ酸配列は,配列番号70で示されるヒト化抗hTfR抗体番号3Nの重鎖のアミノ酸配列のN末端側から1番目~216番目に相当する。ここでN末端側から1番目~118番目のアミノ酸配列が配列番号69(ヒト化抗hTfR抗体番号3Nの重鎖の可変領域のアミノ酸配列)に相当し,119番目~216番目のアミノ酸配列がCH1領域に相当する。
hBDNF-ヒト化抗hTfR抗体融合蛋白質は,以下の方法で製造した。実施例21で得たhBDNF-抗hTfR抗体(3N)1発現株を,細胞濃度が約2×105個/mLとなるように,CD OptiCHOTM培地で希釈し,1Lの三角フラスコに200mLの細胞懸濁液を加え,37℃で,5%CO2と95%空気からなる湿潤環境で約70rpmの撹拌速度で6~7日間培養した。培養上清を遠心操作により回収し,0.22μmフィルター(Millipore社)でろ過して,培養上清とした。上記の回収した培養上清に,カラム体積の5倍容の150mM NaClを含む20mM Tris緩衝液(pH8.0)を添加し,カラム体積3倍容の150mM NaClを含む20mM Tris緩衝液(pH8.0)で予め平衡化しておいたProteinLカラム(カラム体積:1mL,GEヘルスケア社)に負荷した。次いで,カラム体積の5倍容の同緩衝液を供給してカラムを洗浄した後,150mM NaClを含むカラム体積の4倍容の50mM グリシン緩衝液(pH2.8)で,吸着したhBDNF-抗hTfR抗体(3N)1を溶出させた。溶出後直ちに1M Tris緩衝液(pH8.0)を用いてpH7.0に調整した。これをhBDNF-抗hTfR抗体(3N)1の精製品として以下の試験に用いた。
hBDNF-抗hTfR抗体(3N)2についてもhBDNF-抗hTfR抗体(3N)1と同様の手法で精製品を得た。
hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白質は,以下の方法で製造した。実施例21-2で得たhBDNF-抗hTfR抗体(3N)ABD発現株を,細胞濃度が約2×105個/mLとなるように,CD OptiCHOTM培地で希釈し,1Lの三角フラスコに200mLの細胞懸濁液を加え,37℃で,5%CO2と95%空気からなる湿潤環境で約70rpmの撹拌速度で6~7日間培養した。培養上清を遠心操作により回収し,0.22μmフィルター(Millipore社)でろ過して,培養上清とした。
実施例16,実施例22及び実施例22-2で製造したhBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白質が有するBDNF生物活性は,TrkB遺伝子をチャイニーズハムスター卵巣由来細胞(CHO細胞)に導入したCHO-TrkB細胞におけるCa濃度変化を指標とした細胞内シグナル伝達増強活性の測定により評価した。
実施例22及び実施例22-2で製造したhBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白質が有するBDNF生物活性を,ラット初代培養神経細胞におけるErkのリン酸化作用を指標とした細胞内シグナル伝達増強活性の測定により評価した。初代培養神経細胞は,マウスあるいはラット胎児の脳の各部位,例えば線条体,皮質,あるいは海馬などから調製するか,あるいは販売されている初代培養神経細胞を購入して使用するが、今回はラット胎児の線条体より調製した。
実施例22で製造したhBDNF-抗hTfR抗体(3N)1のヒトTfR及びサルTfRへの親和性を測定した。測定は概ね下記の方法で行った。
ビオチン標識されたウサギ抗ヒトBDNFポリクローナル抗体(抗ヒトBDNF抗体:PeproTech社)をHBS-P+(1%BSA)(150mM NaCl,50μM EDTA,0.05% Surfactant P20及び1%BSAを含む10mM HEPES)で希釈し,15μg/mLの溶液を調製し,この溶液をリガンド溶液1とした。抗hTfR抗体融合BDNF(hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1)の精製品を,HBS-P+(1%BSA)で希釈し,この溶液をリガンド溶液2とした。また、対照物質として、実施例15-3で得たhBDNF-抗hTfR抗体(3)1の精製品についてもHBS-P+(1%BSA)で希釈したリガンド溶液3を調製した。rヒトTfRとrサルTfRとを,それぞれHBS-P+(1%BSA)で2段階希釈し,0.78125~50nM(0.585~3.74μg/mL)の7段階の濃度の溶液を調製した。このTfR溶液をサンプル溶液とした。
hBDNF-抗hTfR抗体(3N)ABDと,ヒトTfR,サルTfR及びヒト血清アルブミン(HSA)への親和性の測定は,実施例25と同様に、バイオレイヤー干渉法(BioLayer Interferometry:BLI)を用いた生体分子相互作用解析システムであるOctetRED96(ForteBio社,a division of Pall Corporation)を用いて実施した。測定は,概ねOctetRED96に添付の操作マニュアルに従って実施した。以下に詳述する。
hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1について,BBBを通過して脳内に移行することを,マウストランスフェリン受容体の細胞外領域をコードする遺伝子をヒトトランスフェリン受容体遺伝子の細胞外領域をコードする遺伝子に置換したhTfRノックインマウス(hTfR-KIマウス)を用いて評価した。hTfR-KIマウスは,概ね下記の方法で作製した。また,hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1としては,実施例22に記載の精製品を用いた。
hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1を,5.0mg/kgの用量でそれぞれ雄性カニクイザルに単回静脈内投与し投与後0.083,0.5,1,3,24,72時間後に末梢血を採取し,採取後に生理食塩液で脳潅流を実施した。潅流後,脳組織を摘出した。
この脳組織を用いて,以下のhBDNF-抗hTfR抗体(3N)1の濃度測定及び免疫組織化学染色を行った。また,hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1としては,実施例22に記載の精製品を用いた。
hBDNF-抗hTfR抗体(3N)ABDについて,BBBを通過して脳内に移行することを,マウストランスフェリン受容体の細胞外領域をコードする遺伝子をヒトトランスフェリン受容体遺伝子の細胞外領域をコードする遺伝子に置換したhTfRノックインマウス(hTfR-KIマウス)を用いて評価した。hTfR-KIマウスは,概ね実施例7-2に記載の方法で作製した。また,hBDNF-抗hTfR抗体(3N)ABDとしては,実施例22-2に記載の精製品を用いた。
実施例22で製造したhBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白質のin vivo でのBDNF生物活性は,例えば,以下に記載するような方法を用いてMPTP処置したhTfR-KIマウスにおけるパーキンソン病症状改善効果によって評価できる。
実施例26に記載したhTfR-KIマウス(いずれも8-15週齢)を用いる。検疫・順化が終了したマウスに対し,生理的食塩液もしくは生理的食塩液に溶解させたMPTP(25あるいは30mg/kg)を,1日1回,5日間腹腔内投与,あるいは20mg/kgを1日の内に2時間おきに4回腹腔内投与する。
最終投与の3日以後に,Pole試験によりブラジキネジア症状を,またはロータロッド(Rota-rod)試験により協調運動能の低下を評価する。
MPTP処置マウスを,垂直に立てた木製の棒の上部5cm付近に頭部を上向きにつかまらせる。マウスが棒につかまってから下向きへ向きを変えるまでの時間(Tturn),およびつかまってから床面に下りるまでの時間(TLA)を測定する。加えて,マウスの動きを観察し,その症状を以下のようにスコア付けする。
0:四肢を上手に使って下りる/正常な動き。
1:棒の上部で向きを変える際にぎこちなさが見られる。
2:棒を跨ぎきれずに横すべりのような行動を取る。
3:落下する。
マウスをRota-rod装置(MK-610A,室町機械)の回転軸に1レーン毎に1匹ずつ乗せ,30秒間静置したのち1分間8rpmで軸の回転に順化させ,その後,3分間で25rpmまで回転数が上がる条件でトレーニングを行う。トレーニングの1時間後に以下の評価試験を行う。
実施例22で製造したhBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白質のin vivo でのBDNF生物活性は,例えば,以下に記載するような方法を用いてMPTP処置したサルにおけるパーキンソン病様症状改善効果によって評価できる。
配列番号4:リンカー例2のアミノ酸配列
配列番号5:リンカー例3のアミノ酸配列
配列番号6:マウス抗hTfR抗体番号3の軽鎖CDR1のアミノ酸配列1
配列番号7:マウス抗hTfR抗体番号3の軽鎖CDR1のアミノ酸配列2
配列番号8:マウス抗hTfR抗体番号3の軽鎖CDR2のアミノ酸配列1
配列番号9:マウス抗hTfR抗体番号3の軽鎖CDR2のアミノ酸配列2
配列番号10:マウス抗hTfR抗体番号3の軽鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号11:マウス抗hTfR抗体番号3の重鎖CDR1のアミノ酸配列1
配列番号12:マウス抗hTfR抗体番号3の重鎖CDR1のアミノ酸配列2
配列番号13:マウス抗hTfR抗体番号3の重鎖CDR2のアミノ酸配列1
配列番号14:マウス抗hTfR抗体番号3の重鎖CDR2のアミノ酸配列2
配列番号15:マウス抗hTfR抗体番号3の重鎖CDR3のアミノ酸配列1
配列番号16:マウス抗hTfR抗体番号3の重鎖CDR3のアミノ酸配列2
配列番号17:ヒト化抗hTfR抗体番号3の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列1
配列番号18:ヒト化抗hTfR抗体番号3の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列2
配列番号19:ヒト化抗hTfR抗体番号3の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列3
配列番号20:ヒト化抗hTfR抗体番号3の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列4
配列番号21:ヒト化抗hTfR抗体番号3の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列5
配列番号22:ヒト化抗hTfR抗体番号3の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列6
配列番号23:ヒト化抗hTfR抗体番号3の,可変領域としてアミノ酸配列2を含む軽鎖のアミノ酸配列
配列番号24:ヒト化抗hTfR抗体番号3の,可変領域としてアミノ酸配列2を含む軽鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列,合成配列
配列番号25:ヒト化抗hTfR抗体番号3の,可変領域としてアミノ酸配列4を含む軽鎖のアミノ酸配列
配列番号26:ヒト化抗hTfR抗体番号3の,可変領域としてアミノ酸配列4を含む軽鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列,合成配列
配列番号27:ヒト化抗hTfR抗体番号3の,可変領域としてアミノ酸配列5を含む軽鎖のアミノ酸配列
配列番号28:ヒト化抗hTfR抗体番号3の,可変領域としてアミノ酸配列5を含む軽鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列,合成配列
配列番号29:ヒト化抗hTfR抗体番号3の,可変領域としてアミノ酸配列6を含む軽鎖のアミノ酸配列
配列番号30:ヒト化抗hTfR抗体番号3の,可変領域としてアミノ酸配列6を含む軽鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列,合成配列
配列番号31:ヒト化抗hTfR抗体番号3の重鎖の可変領域のアミノ酸配列1
配列番号32:ヒト化抗hTfR抗体番号3の重鎖の可変領域のアミノ酸配列2
配列番号33:ヒト化抗hTfR抗体番号3の重鎖の可変領域のアミノ酸配列3
配列番号34:ヒト化抗hTfR抗体番号3の重鎖の可変領域のアミノ酸配列4
配列番号35:ヒト化抗hTfR抗体番号3の重鎖の可変領域のアミノ酸配列5
配列番号36:ヒト化抗hTfR抗体番号3の重鎖の可変領域のアミノ酸配列6
配列番号37:ヒト化抗hTfR抗体番号3の,可変領域としてアミノ酸配列2を含む重鎖のアミノ酸配列
配列番号38:ヒト化抗hTfR抗体番号3の,可変領域としてアミノ酸配列2を含む重鎖のアミノ酸配列コードする塩基配列,合成配列
配列番号39:ヒト化抗hTfR抗体番号3の,可変領域としてアミノ酸配列2を含む重鎖(IgG4)のアミノ酸配列
配列番号40:ヒト化抗hTfR抗体番号3の,可変領域としてアミノ酸配列2を含む重鎖(IgG4)のアミノ酸配列をコードする塩基配列,合成配列
配列番号41:プライマーhTfR5’,合成配列
配列番号42:プライマーhTfR3’,合成配列
配列番号43:プライマーHyg-Sfi5’,合成配列
配列番号44:プライマーHyg-BstX3’,合成配列
配列番号45:キメラhTfRをコードするcDNAの3’側にloxP配列で挟み込んだネオマイシン耐性遺伝子を配置したDNAの塩基配列,合成配列
配列番号46:ターゲッティングベクターの5’アーム配列,合成配列
配列番号47:ターゲッティングベクターの3’アーム配列,合成配列
配列番号48:マウス抗hTfR抗体番号3の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号49:マウス抗hTfR抗体番号3の重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号52:ヒト化抗hTfR抗体番号3Nの重鎖とhBDNFの融合蛋白質(1)のアミノ酸配列
配列番号53:ヒト化抗hTfR抗体番号3Nの重鎖とhBDNFの融合蛋白質(1)のアミノ酸配列をコードする塩基配列,合成配列
配列番号54:ヒト化抗hTfR抗体番号3Nの重鎖とhBDNFの融合蛋白質(2)のアミノ酸配列
配列番号55:ヒト化抗hTfR抗体番号3Nの重鎖とhBDNFの融合蛋白質(2)のアミノ酸配列をコードする塩基配列,合成配列
配列番号57:1本鎖ヒト化抗hTfR抗体番号3Nのアミノ酸配列
配列番号58:hBDNFのプロ体と1本鎖ヒト化抗hTfR抗体番号3Nの融合蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列,合成配列
配列番号59:hBDNFのプロ体と1本鎖ヒト化抗hTfR抗体番号3Nの融合蛋白質のアミノ酸配列
配列番号60:hBDNFと1本鎖ヒト化抗hTfR抗体番号3Nの融合蛋白質のアミノ酸配列
配列番号61:ヒト化抗hTfR抗体番号3NのFab重鎖のアミノ酸配列
配列番号62:hBDNFのプロ体とヒト化抗hTfR抗体番号3NのFab重鎖との融合蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列,合成配列
配列番号63:hBDNFのプロ体とヒト化抗hTfR抗体番号3NのFab重鎖との融合蛋白質のアミノ酸配列
配列番号64:hBDNFとヒト化抗hTfR抗体番号3NのFab重鎖との融合蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列,合成配列
配列番号65:hBDNFとヒト化抗hTfR抗体番号3NのFab重鎖との融合蛋白質のアミノ酸配列
配列番号66:ヒト化抗hTfR抗体番号3Nの重鎖CDR1のアミノ酸配列1
配列番号67:ヒト化抗hTfR抗体番号3Nの重鎖CDR1のアミノ酸配列2
配列番号68:ヒト化抗hTfR抗体番号3Nの重鎖フレームワーク領域3のアミノ酸配列
配列番号69:ヒト化抗hTfR抗体番号3Nの重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号70:ヒト化抗hTfR抗体番号3Nの重鎖のアミノ酸配列
配列番号71:ヒト化抗hTfR抗体番号3Nの重鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列,合成配列
配列番号72:ヒト化抗hTfR抗体番号3Nの重鎖(IgG4)のアミノ酸配列
配列番号73:ヒトIgG Fc領域を導入したhBDNFのプロ体とヒト化抗hTfR抗体3NのFab重鎖との融合蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列,合成配列
配列番号74:ヒトIgG Fc領域を導入したhBDNFのプロ体とヒト化抗hTfR抗体3NのFab重鎖との融合蛋白質のアミノ酸配列
配列番号75:ヒトIgGのFc領域のアミノ酸配列の一例
配列番号76:ヒト化抗hTfR抗体番号3Nの重鎖(IgG4)のアミノ酸配列をコードする塩基配列,合成配列
配列番号77:ヒト化抗hTfR抗体3のFab重鎖のアミノ酸配列
配列番号78:hBDNFのプロ体とヒト化抗hTfR抗体番号3のFab重鎖との融合蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列,合成配列
配列番号79:hBDNFのプロ体とヒト化抗hTfR抗体番号3のFab重鎖との融合蛋白質のアミノ酸配列
配列番号80:hBDNFとヒト化抗hTfR抗体番号3のFab重鎖との融合蛋白質のアミノ酸配列
配列番号81:ヒトIgG Fc領域を導入したヒト化抗hTfR抗体3NのFab重鎖のアミノ酸配列
配列番号82:ヒトIgG Fc領域を導入したヒト化抗hTfR抗体3NのFab重鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列,合成配列
配列番号83:ヒト化抗hTfR抗体番号3の重鎖フレームワーク領域3のアミノ酸配列
配列番号84:ヒト化抗hTfR抗体番号3NのFab重鎖のアミノ酸配列(2)
配列番号85:アルブミン結合ドメインのアミノ酸配列
配列番号86:hBDNFのプロ体、ヒト化抗hTfR抗体番号3NのFab重鎖、及びABDの融合蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列,合成配列
配列番号87:hBDNFのプロ体、ヒト化抗hTfR抗体番号3NのFab重鎖、及びABDの融合蛋白質のアミノ酸配列
配列番号88:hBDNF、ヒト化抗hTfR抗体番号3NのFab重鎖、及びABDの融合蛋白質のアミノ酸配列
配列番号89:アルブミン親和性ペプチドを導入したFab重鎖のアミノ酸配列
配列番号90:1本鎖ヒト化抗hTfR抗体番号3N(2)のアミノ酸配列
Claims (71)
- 脳由来神経栄養因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)と抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって,該抗体が重鎖の可変領域において,
(a)CDR1が配列番号66又は配列番号67のアミノ酸配列を含んでなり,
(b)CDR2が配列番号13又は配列番号14のアミノ酸配列を含んでなり,且つ
(c)CDR3が配列番号15又は配列番号16のアミノ酸配列を含んでなり,
該抗体が軽鎖の可変領域において,
(a)CDR1が配列番号6又は配列番号7のアミノ酸配列を含んでなり,
(b)CDR2が配列番号8又は配列番号9のアミノ酸配列を含んでなり,且つ
(c)CDR3が配列番号10のアミノ酸配列を含んでなるものである,
融合蛋白質。 - 請求項1の融合蛋白質であって,重鎖のフレームワーク領域3が配列番号68のアミノ酸配列を含んでなるものである,融合蛋白質。
- 請求項1又は2の融合蛋白質であって,
該抗体が重鎖の可変領域において、
(a)CDR1が配列番号66のアミノ酸配列からなり,
(b)CDR2が配列番号13のアミノ酸配列からなり,且つ
(c)CDR3が配列番号15のアミノ酸配列からなり,
該抗体が軽鎖の可変領域において,
(a)CDR1が配列番号6のアミノ酸配列からなり,
(b)CDR2が配列番号8のアミノ酸配列からなり,且つ
(c)CDR3が配列番号10のアミノ酸配列からなるものである,
融合蛋白質。 - 請求項1又は2の融合蛋白質であって,
該抗体が重鎖の可変領域において、
(a)CDR1が配列番号67のアミノ酸配列からなり,
(b)CDR2が配列番号14のアミノ酸配列からなり,且つ
(c)CDR3が配列番号16のアミノ酸配列からなり,
該抗体が軽鎖の可変領域において,
(a)CDR1が配列番号7のアミノ酸配列からなり,
(b)CDR2が配列番号9のアミノ酸配列からなり,且つ
(c)CDR3が配列番号10のアミノ酸配列からなるものである,
融合蛋白質。 - 請求項1~4の何れかの融合蛋白質であって,該重鎖の可変領域が配列番号69のアミノ酸配列を含んでなるものである,融合蛋白質。
- 請求項1~5の何れかの融合蛋白質であって,該抗体の軽鎖の可変領域が,配列番号17,配列番号18,配列番号19,配列番号20,配列番号21又は配列番号22のアミノ酸配列を含んでなるものである,融合蛋白質。
- 請求項1~6の何れかの融合蛋白質であって,該抗体の軽鎖が,配列番号23,配列番号25,配列番号27又は配列番号29のアミノ酸配列を含んでなるものである,融合蛋白質。
- 脳由来神経栄養因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)と抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との融合蛋白質であって,該抗体が重鎖の可変領域において,配列番号69のアミノ酸配列を含んでなるものであり,且つ該抗体が軽鎖の可変領域において,配列番号18のアミノ酸配列を含んでなるものである,融合蛋白質。
- 請求項8の融合蛋白質であって,
該抗体の軽鎖が,配列番号23のアミノ酸配列を含んでなるものであり,且つ該抗体の重鎖が配列番号61のアミノ酸配列を含んでなるものである,融合蛋白質。 - 請求項1~9の何れかの融合蛋白質であって,該抗体が,Fab抗体,F(ab’)2抗体,又はF(ab’)抗体である,融合蛋白質。
- 請求項1~9の何れかの融合蛋白質であって,該重鎖のアミノ酸配列が,配列番号70又は配列番号72のアミノ酸配列を含んでなるものである,融合蛋白質。
- 請求項1~9の何れかの融合蛋白質であって,該抗体が,scFab,scF(ab’),scF(ab’)2及びscFvからなる群から選ばれる一本鎖抗体である,融合蛋白質。
- 請求項12の融合蛋白質であって,該抗体の軽鎖と重鎖とがリンカー配列を介して結合しているものである,融合蛋白質。
- 請求項13の融合蛋白質であって,該軽鎖のC末端側において,リンカー配列を介して該重鎖が結合しているものである,融合蛋白質。
- 請求項13の融合蛋白質であって,該重鎖のC末端側において,リンカー配列を介して該軽鎖が結合しているものである,融合蛋白質。
- 請求項13~15の何れかの融合蛋白質であって,該リンカー配列が,8~50個のアミノ酸残基からなるものである,融合蛋白質。
- 請求項16の融合蛋白質であって,該リンカー配列が,アミノ酸配列Gly-Ser,アミノ酸配列Gly-Gly-Ser,アミノ酸配列Gly-Gly-Gly,配列番号3,配列番号4,及び配列番号5の各アミノ酸配列,配列番号3のアミノ酸配列の3個が連続したものに相当するアミノ酸配列,及びこれらのアミノ酸配列の10個以下が連続してなる配列からなる群より選ばれるものである,融合蛋白質。
- 請求項1~17の何れかの融合蛋白質であって,該BDNFが,該抗体の軽鎖又は重鎖のC末端側又はN末端側に結合したものである,融合蛋白質。
- 請求項18の融合蛋白質であって,該BDNFが,該抗体の軽鎖又は重鎖のC末端側又はN末端側に,直接又はリンカーを介して結合したものである,融合蛋白質。
- 該リンカーが,1~50個のアミノ酸残基からなるペプチドである,請求項19の融合蛋白質。
- 該リンカーが,アミノ酸配列Gly-Ser,アミノ酸配列Gly-Gly-Ser,配列番号3,配列番号4,及び配列番号5からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるペプチドである,請求項20の融合蛋白質。
- 該リンカーが、アミノ酸配列Gly-Ser,アミノ酸配列Gly-Gly-Ser,アミノ酸配列Gly-Gly-Gly,配列番号3,配列番号4,及び配列番号5の各アミノ酸配列,並びにこれらのアミノ酸配列の10個以下が連続してなる配列からなる群より選ばれるものである,請求項21の融合蛋白質。
- 該BDNFがヒトBDNFである,請求項1~22の何れかの融合蛋白質。
- 該ヒトBDNFが,配列番号51のアミノ酸配列を含んでなるものである,請求項23の融合蛋白質。
- 該ヒトBDNFが,配列番号51のアミノ酸配列を有するヒトBDNFの同族体,変異体,誘導体,又はアミノ酸修飾体であり,配列番号51のアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み,且つ,以下の(1)~(6)で示される機能のいずれかを有するものである,請求項23の融合蛋白質;
(1)BDNF受容体(TrkB)に対する結合親和性を有すること,
(2)BDNF受容体のリン酸化活性を有すること,
(3)神経細胞に対する増殖促進作用を有すること,
(4)神経細胞に対する生存維持作用を有すること,
(5)神経細胞に対する神経突起伸展作用を有すること,及び
(6)配列番号51のアミノ酸配列からなる蛋白質を特異的に認識する抗体によって認識され得ること。 - 該ヒトBDNFが,配列番号51のアミノ酸配列を有するヒトBDNFの同族体,変異体,誘導体,又はアミノ酸修飾体であり,配列番号51のアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み,且つ,以下の(1)及び(2)で示される機能を有するものである,請求項23の融合蛋白質;
(1)BDNF受容体(TrkB)に対する結合親和性を有すること,及び
(2)BDNF受容体のリン酸化活性を有すること。 - 該ヒトBDNFが,配列番号56のアミノ酸配列を含んでなるものである,請求項23の融合蛋白質。
- 請求項1~27の何れかの融合蛋白質であって,ヒトトランスフェリン受容体の細胞外領域及びサルトランスフェリン受容体の細胞外領域の双方に対して親和性を有するものである,融合蛋白質。
- 該抗ヒトトランスフェリン受容体抗体が,ヒトトランスフェリン受容体の細胞外領域との解離定数が1×10-10M以下であり,且つサルトランスフェリン受容体の細胞外領域との解離定数が1×10-9M以下のものであり,該抗ヒトトランスフェリン受容体抗体が該BDNFと結合したものである,請求項28の融合蛋白質。
- 請求項23の融合蛋白質であって,
該軽鎖が,配列番号23のアミノ酸配列を含んでなり,且つ
(a)該重鎖が,そのC末端側でアミノ酸配列Gly-Serからなるリンカーを介して,ヒトBDNFと結合し,それにより配列番号52のアミノ酸配列を形成しているものであるか,又は
(b)該重鎖が,そのC末端側でアミノ酸配列Gly-Serに続いてアミノ酸配列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(配列番号3)が5個連続してなる計27個のアミノ酸からなるリンカーを介して,ヒトBDNFと結合し,それにより配列番号54のアミノ酸配列を形成しているものである,
融合蛋白質。 - 該抗体が抗原結合性断片である,請求項1~9の何れかの融合蛋白質。
- 該抗原結合性断片のN末端側に,直接又はリンカーを介して,ヒトBDNFが結合してなるものである,請求項31の融合蛋白質。
- 該抗原結合性断片が一本鎖抗体である,請求項31又は32の融合蛋白質。
- 請求項33の融合蛋白質であって,該抗体の軽鎖可変領域と重鎖可変領域がリンカー配列を介して結合してなるものである,融合蛋白質。
- 請求項34の融合蛋白質であって,該軽鎖可変領域のC末端側に,該リンカー配列を介して,該重鎖可変領域が結合してなるものである,融合蛋白質。
- 請求項34の融合蛋白質であって,該重鎖可変領域のC末端側に,該リンカー配列を介して,該軽鎖可変領域が結合してなるものである,融合蛋白質。
- 請求項34~36の何れかの融合蛋白質であって,該リンカー配列が,8~50個のアミノ酸残基からなるものである,融合蛋白質。
- 請求項37の融合蛋白質であって,該リンカー配列が,アミノ酸配列Gly-Ser,アミノ酸配列Gly-Gly-Ser,アミノ酸配列Gly-Gly-Gly,配列番号3,配列番号4,及び配列番号5の各アミノ酸配列,配列番号3のアミノ酸配列の3個が連続したものに相当するアミノ酸配列,及びこれらのアミノ酸配列の10個以下が連続してなる配列からなる群より選ばれるものである,融合蛋白質。
- 請求項33~38の何れかの融合蛋白質であって,該抗体が,配列番号69のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と,配列番号18のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域とを含んでなるものである,融合蛋白質。
- 請求項39の融合蛋白質であって,該抗体が,配列番号57のアミノ酸配列からなり,そのN末端側に,直接又はリンカーを介して,ヒトBDNFが結合してなるものである,融合蛋白質。
- 請求項40の融合蛋白質であって,該抗体が配列番号57のアミノ酸配列からなり,そのN末端側に,リンカーを介して,ヒトプロBDNFが結合してなる,配列番号59のアミノ酸配列を含んでなるものである,融合蛋白質。
- 請求項40の融合蛋白質であって,該抗体が配列番号57のアミノ酸配列からなり,そのN末端側に,リンカーを介して,ヒトBDNFが結合してなる,配列番号60のアミノ酸配列を含んでなるものである,融合蛋白質。
- 該抗原結合性断片が,Fab,F(ab’)2,又はF(ab’)の何れかである,請求項31又は32の融合蛋白質。
- 請求項43の融合蛋白質であって,Fab,F(ab’)2,又はF(ab’)の何れかの軽鎖又は重鎖のN末端側に,直接又はリンカーを介して,ヒトBDNFが結合してなるものである,融合蛋白質。
- 請求項44の融合蛋白質であって,該抗体の軽鎖が配列番号23のアミノ酸配列からなり,且つ該抗体の重鎖が配列番号61のアミノ酸配列からなるFab重鎖であり,該重鎖のN末端側に,直接又はリンカーを介してヒトBDNF,が結合してなるものである,融合蛋白質。
- 請求項45の融合蛋白質であって、該リンカーが,アミノ酸配列Gly-Ser,アミノ酸配列Gly-Gly-Ser,配列番号3のアミノ酸配列,配列番号4のアミノ酸配列,及び配列番号5のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるペプチドである,融合蛋白質。
- 請求項45の融合蛋白質であって、該リンカーが,アミノ酸配列Gly-Ser,アミノ酸配列Gly-Gly-Ser,アミノ酸配列Gly-Gly-Gly,配列番号3,配列番号4,及び配列番号5の各アミノ酸配列,並びにこれらのアミノ酸配列の10個以下が連続してなる配列からなる群より選ばれるものである,融合蛋白質。
- 請求項45~47の何れかの融合蛋白質であって,
該軽鎖が配列番号23のアミノ酸配列を含んでなり,且つ
該Fab重鎖とそのN末端側に,リンカーを介して,結合したヒトプロBDNFとからなる部分が配列番号63のアミノ酸配列を形成しているものである,融合蛋白質。 - 請求項45~47の何れかの融合蛋白質であって,
該軽鎖が配列番号23のアミノ酸配列を含んでなり,且つ
Fab重鎖とそのN末端側に,リンカーを介して,結合したヒトBDNFとからなる部分が配列番号65のアミノ酸配列を形成しているものである,融合蛋白質。 - 請求項31~45の何れかの融合蛋白質であって,ヒトIgG Fc領域又はその一部が,ヒトBDNFと該抗体との間に導入されてなるものである,融合蛋白質。
- 請求項50の融合蛋白質であって,ヒトBDNFのC末端側に,直接又はリンカー配列を介して,ヒトIgG Fc領域が結合してなり,且つ,該ヒトIgG Fc領域のC末端側に直接又はリンカー配列を介して該抗体が結合してなるものである,融合蛋白質。
- 請求項50又は51の融合蛋白質であって,ヒトIgG Fc領域が配列番号75で示されるアミノ酸配列を含んでなるものである,融合蛋白質。
- 請求項52の融合蛋白質であって,
該重鎖が,ヒトBDNFのC末端側に,直接又はリンカー配列を介して,該ヒトIgG Fc領域が結合してなり,且つ,該ヒトIgG Fc領域のC末端側に直接又はリンカー配列を介して該重鎖が結合したものである,融合蛋白質。 - 請求項53の融合蛋白質であって,
該軽鎖が,配列番号23のアミノ酸配列を含んでなり,且つ
該重鎖が,ヒトBDNFのC末端側に,リンカー配列を介して,ヒトIgG Fc領域が結合してなり,且つ,該ヒトIgG Fc領域のC末端側にリンカー配列を介して該重鎖が結合したものであり,それにより配列番号74のアミノ酸配列を形成しているものである,融合蛋白質。 - 請求項31~45の何れかの融合蛋白質であって,さらにアルブミン親和性ペプチドが導入されてなるものである,融合蛋白質。
- 請求項55の融合蛋白質であって,該抗体のC末端側に,直接又はリンカー配列を介して,アルブミン親和性ペプチドが結合してなるものである,融合蛋白質。
- 請求項55又は56の融合蛋白質であって,アルブミン親和性ペプチドが配列番号85で示されるアミノ酸配列を含んでなるものである,融合蛋白質。
- 請求項57の融合蛋白質であって,
該重鎖が,ヒトBDNFのC末端側に,直接又はリンカー配列を介して結合してなり,且つ,該重鎖のC末端側に直接又はリンカー配列を介してアルブミン親和性ペプチドが結合したものである,融合蛋白質。 - 請求項58の融合蛋白質であって,
該軽鎖が,配列番号23のアミノ酸配列を含んでなり,且つ
該重鎖が,ヒトプロBDNFのC末端側に,リンカー配列を介して結合してなり,且つ,該重鎖のC末端側にリンカー配列を介してアルブミン親和性ペプチドが結合したものであり,それにより配列番号87のアミノ酸配列を形成しているものである,融合蛋白質。 - 請求項58の融合蛋白質であって,
該軽鎖が,配列番号23のアミノ酸配列を含んでなり,且つ
該重鎖が,ヒトBDNFのC末端側に,リンカー配列を介して結合してなり,且つ,該重鎖のC末端側にリンカー配列を介してアルブミン親和性ペプチドが結合したものであり,それにより配列番号88のアミノ酸配列を形成しているものである,融合蛋白質。 - 請求項1~60の何れかの融合蛋白質をコードする,DNA断片。
- 請求項61のDNA断片を組み込んでなる,発現ベクター。
- 請求項62の発現ベクターで形質転換された哺乳動物細胞。
- BDNFへの曝露によって利益を得ることができる疾患又は障害の予防及び/又は治療のための薬剤であって,請求項1~60の何れかの融合蛋白質を有効成分として含んでなる,薬剤。
- 該疾患又は障害が,神経系の疾患又は障害である請求項64の薬剤。
- 該神経系の疾患又は障害が,神経変性疾患,うつ病,統合失調症,てんかん,自閉症,Rett症候群,West症候群,新生児痙攣,認知症に伴う問題行動,不安症,疼痛,ヒルシュスプルング病又はレム睡眠行動障害である,請求項65の薬剤。
- 該神経変性疾患が,脳神経変性疾患,脊髄変性疾患,網膜変性疾患又は末梢神経変性疾患である,請求項66の薬剤。
- 該脳神経変性疾患が,脳神経系の神経変性疾患,脳虚血性疾患,外傷性脳損傷,白質脳症又は多発性硬化症である,請求項67の薬剤。
- 該脳神経系の神経変性疾患が,アルツハイマー病,パーキンソン病,ハンチントン病,レビー小体型認知症,ピック病,多系統萎縮症,進行性上行性麻痺又はダウン症候群である,請求項68の薬剤。
- BDNFへの曝露によって利益を得ることができる疾患又は障害の予防及び/又は治療用の医薬の製造のための,請求項1~60の何れかの融合蛋白質の使用。
- 請求項63に記載の哺乳動物細胞を培養することを含む、請求項1~60の何れかの融合蛋白質の製造方法。
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