CN110100000B - 含有bdnf的融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种融合蛋白，其为BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，在该抗体的重链的可变区中，(a)CDR1含有序列号66或序列号67的氨基酸序列、(b)CDR2含有序列号13或序列号14的氨基酸序列、并且(c)CDR3含有序列号15或序列号16的氨基酸序列。

Description

含有BDNF的融合蛋白
技术领域
本发明涉及能够通过血脑屏障的BDNF，更详细而言，涉及新型抗人转铁蛋白受体抗体与BDNF的融合蛋白、其制造方法及其使用方法。
背景技术
对除包括脑室周围器官(松果体、脑垂体、最后区等)在内的几个区域以外的大部分脑组织供给血液的毛细血管与存在于肌肉等其它组织中的毛细血管不同，形成其内皮的内皮细胞彼此通过牢固的细胞间接合而紧密结合。因此会妨碍物质从血液向脑部的被动转运，虽然也有例外，但除了脂溶性高的物质或分子量小(200～500道尔顿以下)且在生理pH附近为电中性的物质以外，均难以从毛细血管向脑中迁移。这种通过脑内的毛细血管内皮来限制血液与脑组织液之间的物质交换的机制被称为血脑屏障(Blood-Brain Barrier，BBB)。此外，血脑屏障不仅限制脑的组织液与血液之间的物质交换，而且还限制包括脑和脊髓在内的中枢神经系统的组织液与血液之间的物质交换。
由于血脑屏障的存在，中枢神经系统的大部分细胞不会受到血中的激素、淋巴因子等物质的浓度变动等的影响，从而能保持其生化学的稳态。
但是，血脑屏障的存在在药剂开发上引起问题。例如已知：脑源性神经营养因子(BDNF；Brain-derived neurotrophic factor)为神经营养因子家族中的一员，其二聚体与位于靶细胞表面上的高亲和性BDNF受体(TrkB；也被称为Tyrosine receptor kinase B,Tropomyosin receptor kinase B或Tropomyosin-related Kinase B)特异性结合，在中枢神经系统和周围神经系统的细胞分化、功能维持、突触形成以及损伤时的再生和修复等中发挥重要的作用(非专利文献1和2)。因此，期待开发BDNF来作为阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈症等神经退行性疾病、肌萎缩性侧索硬化症等脊髓退行性疾病以及糖尿病性神经障碍、脑缺血性疾病、Rett综合征等发育障碍、精神分裂症、抑郁症等多种疾病的治疗剂(非专利文献3～8)。但是，由于高分子蛋白质通常极难通过血脑屏障，因此在将BDNF本身作为中枢神经系统的疾病治疗药或作为作用于中枢神经系统的疾病治疗药并通过外周给药使用方面存在较大障碍。
关于用于使应在中枢神经系统中起作用的这种蛋白质等高分子物质通过血脑屏障的方法，已经开发出各种方法。例如，在神经生长因子的情况下，尝试了通过使包封有神经生长因子的脂质体与脑内毛细血管的内皮细胞的细胞膜融合而使其通过血脑屏障的方法，但未达到实用化(非专利文献9)。在α-L-艾杜糖醛酸酶的情况下，进行了通过增加每次给药的酶量来提高其血药浓度、从而提高血脑屏障中的酶的被动转运的尝试，并且示出了使用Hurler综合征的动物模型通过该方法缓解了中枢神经系统(CNS)的异常(非专利文献10)。
此外，为了避开血脑屏障，还进行了将高分子物质直接给药于髓腔内或脑内的尝试。例如报道了：向Hurler综合征(粘多糖症I型)的患者的髓腔内给药人α-L-艾杜糖醛酸酶的方法(专利文献1)、向Niemann-Pick(尼曼-匹克)病的患者的脑室内给药人酸性鞘磷脂酶的方法(专利文献2)、向Hunter综合征的模型动物的脑室内给药艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(I2S)的方法(专利文献3)。认为根据这样的方法可以切实地使药剂作用于中枢神经系统，但另一方面存在侵入性极高的问题。
作为使高分子物质通过血脑屏障而到达脑内的方法，报道了多种按照与存在于脑内毛细血管的内皮细胞上的膜蛋白具有亲和性的方式来修饰高分子物质的方法。作为存在于脑内毛细血管的内皮细胞上的膜蛋白，可以列举胰岛素、转铁蛋白、胰岛素样生长因子(IGF-I，IGF-II)、LDL、来普汀(leptin)等化合物的受体。
例如报道了如下技术：将神经生长因子(NGF)以与胰岛素的融合蛋白的形态合成，通过与胰岛素受体的结合而使该融合蛋白通过血脑屏障(专利文献4～6)。此外报道了如下技术：将神经生长因子(NGF)以与抗胰岛素受体抗体的融合蛋白的形态合成，通过与胰岛素受体的结合而使该融合蛋白通过血脑屏障(专利文献4和7)。
报道了如下技术：将脑源性神经营养因子(BDNF)以与抗胰岛素受体抗体的融合蛋白的形态合成，使该融合蛋白通过与胰岛素受体的结合而通过血脑屏障(非专利文献11)。报道了如下技术：将神经生长因子(NGF)以与转铁蛋白的融合蛋白的形态合成，通过与转铁蛋白受体(TfR)的结合而使该融合蛋白通过血脑屏障(专利文献8)。此外报道了如下技术：将神经生长因子(NGF)以与抗转铁蛋白受体抗体(抗TfR抗体)的融合蛋白的形态合成，通过与TfR的结合而使该融合蛋白通过血脑屏障(专利文献4和9)。此外报道了如下技术：将添加有聚乙二醇(PEG)的脑源性神经营养因子(BDNF)以通过链霉亲和素-生物素接头与小鼠抗大鼠转铁蛋白受体抗体(抗TfR抗体)进行化学结合而成的缀合物的形态合成，在大鼠中，通过与TfR的结合而使该缀合物通过血脑屏障(非专利文献12)。
报道了：对使用抗TfR抗体的技术进行进一步审视，在通过与抗TfR抗体结合而使药剂通过血脑屏障的技术中，在使用链霉亲和素的情况下可以使用单链抗体(非专利文献13)。此外报道了：与人TfR(hTfR)的解离常数较大的抗hTfR抗体(低亲和性抗hTfR抗体)可以制成药剂在通过血脑屏障的技术中适当利用(专利文献10和11，非专利文献14)。进一步报道了：与hTfR的亲和性依赖于pH而变化的抗TfR抗体可以作为用于使药剂通过血脑屏障的载体使用(专利文献12，非专利文献15)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特表2007-504166号公报
专利文献2:日本特表2009-525963号公报
专利文献3:日本特开2012-62312号公报
专利文献4:美国专利5154924号公报
专利文献5:日本特开2011-144178号公报
专利文献6:美国专利2004/0101904号公报
专利文献7:日本特表2006-511516号公报
专利文献8:日本特开H06-228199号公报
专利文献9:美国专利5977307号公报
专利文献10:WO2012/075037
专利文献11:WO2013/177062
专利文献12:WO2012/143379
非专利文献
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发明内容
发明所要解决的问题
在上述背景下，本发明的目的在于提供：使给药于血中的BDNF能够通过血脑屏障从而能够在脑内起作用的、新型抗TfR抗体与BDNF的融合蛋白；其制造方法；使用方法；以及，通过给药该融合蛋白而实现的、规定范围的疾病的预防和/或治疗方法。
用于解决问题的方法
在面对上述目的的研究中，本发明人反复进行了深入研究，结果发现，通过本说明书中详述的抗体制作方法得到的识别hTfR的胞外区的抗人转铁蛋白受体抗体(抗hTfR抗体)中具有的特定抗体、尤其是重链的CDR1含有序列号66或序列号67的氨基酸序列而成的抗体、进而在此基础上重链的框架区3含有序列号68的氨基酸序列而成的抗体，在给药于血中时显著高效地通过血脑屏障，并且还发现，将该抗体与BDNF融合而成的融合蛋白也通过血脑屏障，从而完成了本发明。
即，本发明提供以下方案。
1.一种融合蛋白，其为脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophicfactor，BDNF)与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其中，在该抗体的重链的可变区中，
(a)CDR1含有序列号66或序列号67的氨基酸序列，
(b)CDR2含有序列号13或序列号14的氨基酸序列，并且
(c)CDR3含有序列号15或序列号16的氨基酸序列。
2.根据上述1的融合蛋白，其中，重链的框架区3含有序列号68的氨基酸序列。
3.根据上述1或2的融合蛋白，其中，在该重链的可变区中，
代替CDR2的序列号13或序列号14的氨基酸序列，含有相对于该序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列，并且
代替CDR3的序列号15或序列号16的氨基酸序列，含有相对于该序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列。
4.根据上述1或2的融合蛋白，其中，在该重链的可变区中，
代替CDR2的序列号13或序列号14的氨基酸序列，含有相对于该序列具有90％以上的同源性的氨基酸序列，并且
代替CDR3的序列号15或序列号16的氨基酸序列，含有相对于该序列具有90％以上的同源性的氨基酸序列。
5.根据上述1或2的融合蛋白，其中，在该重链的可变区中，
代替(a)CDR1的序列号66或序列号67、(b)CDR2的序列号13或序列号14、(c)CDR3的序列号15或序列号16、以及(d)框架区3的序列号68中的至少1个氨基酸序列，含有相对于该序列进行了1～5个氨基酸的置换、缺失或添加的改造的氨基酸序列，
在此，关于CDR1，位于序列号66或序列号67的氨基酸序列的N末端侧起第5位的甲硫氨酸在改造后的氨基酸序列中也位于相同的位置，并且
关于框架区3，位于序列号68的N末端侧起第17位的亮氨酸在改造后的氨基酸序列中也位于相同的位置。
6.根据上述1或2的融合蛋白，其中，在该重链的可变区中，
代替(a)CDR1的序列号66或序列号67、(b)CDR2的序列号13或序列号14、(c)CDR3的序列号15或序列号16、以及(d)框架区3的序列号68中的至少1个氨基酸序列，含有相对于该序列进行了1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的改造的氨基酸序列，
在此，关于CDR1，位于序列号66或序列号67的氨基酸序列的N末端侧起第5位的甲硫氨酸在改造后的氨基酸序列中也位于相同的位置，并且
关于框架区3，位于序列号68的N末端侧起第17位的亮氨酸在改造后的氨基酸序列中也位于相同的位置。
7.根据上述1的融合蛋白，其中，该重链的可变区含有序列号69的氨基酸序列。
8.根据上述7的融合蛋白，其中，在该重链的可变区中，在CDR1的序列号66或序列号67以及框架区3的序列号68的各氨基酸序列以外的部分中，代替该部分，含有与该部分具有80％以上的同源性的氨基酸序列。
9.根据上述7的融合蛋白，其中，在该重链的可变区中，在CDR1的序列号66或序列号67以及框架区3的序列号68的各氨基酸序列以外的部分中，代替该部分，含有与该部分具有90％以上的同源性的氨基酸序列。
10.根据上述7的融合蛋白，其中，代替构成该重链的可变区的氨基酸序列，含有相对于该序列进行了1～5个氨基酸的置换、缺失或添加的改造的氨基酸序列，
在此，关于CDR1，位于序列号67的氨基酸序列的N末端起第5位的甲硫氨酸在改造后的氨基酸序列中也位于相同的位置，并且关于框架区3，位于序列号68的N末端侧起第17位的亮氨酸在改造后的氨基酸序列中也位于相同的位置。
11.根据上述7的融合蛋白，其中，代替构成该重链的可变区的氨基酸序列，含有相对于该序列进行了1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的改造的氨基酸序列，
在此，关于CDR1，位于序列号67的氨基酸序列的N末端起第5位的甲硫氨酸在改造后的氨基酸序列中也位于相同的位置，并且关于框架区3，位于序列号68的N末端侧起第17位的亮氨酸在改造后的氨基酸序列中也位于相同的位置。
12.根据上述7的融合蛋白，其中，该重链的氨基酸序列含有序列号70或序列号72的氨基酸序列。
13.根据上述12的融合蛋白，其中，在该重链中，代替CDR1的序列号66或序列号67以及框架区3的序列号68的各氨基酸序列以外的部分，含有相对于该部分具有80％以上的同源性的氨基酸序列。
14.根据上述12的融合蛋白，其中，在该重链中，代替CDR1的序列号66或序列号67以及框架区3的序列号68的各氨基酸序列以外的部分，含有相对于该部分具有90％以上的同源性的氨基酸序列。
15.根据上述12的融合蛋白，其中，代替构成该重链的氨基酸序列，含有相对于该序列进行了1～5个氨基酸的置换、缺失或添加的改造的氨基酸序列，
在此，关于CDR1，位于序列号67的氨基酸序列的N末端起第5位的甲硫氨酸在改造后的氨基酸序列中也位于相同的位置，并且关于框架区3，位于序列号68的N末端侧起第17位的亮氨酸在改造后的氨基酸序列中也位于相同的位置。
16.根据上述12的融合蛋白，其中，代替构成该重链的氨基酸序列，含有相对于该序列进行了1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的改造的氨基酸序列，
在此，关于CDR1，位于序列号67的氨基酸序列的N末端起第5位的甲硫氨酸在改造后的氨基酸序列中也位于相同的位置，并且关于框架区3，位于序列号68的N末端侧起第17位的亮氨酸在改造后的氨基酸序列中也位于相同的位置。
17.根据上述1～16中任一项的融合蛋白，其中，在该抗体的轻链的可变区中，
(a)CDR1含有序列号6或序列号7的氨基酸序列，
(b)CDR2含有序列号8或序列号9的氨基酸序列、或者氨基酸序列Lys-Val-Ser，并且
(c)CDR3含有序列号10的氨基酸序列。
18.根据上述17的融合蛋白，其中，在该轻链的可变区中，
(a)代替CDR1的序列号6或序列号7的氨基酸序列，含有相对于该序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列，
(b)代替CDR2的序列号8或序列号9的氨基酸序列、或者氨基酸序列Lys-Val-Ser，含有相对于该序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列，并且
(c)代替CDR3的序列号10的氨基酸序列，含有相对于该序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列。
19.根据上述17的融合蛋白，其中，在该轻链的可变区中，
(a)代替CDR1的序列号6或序列号7的氨基酸序列，含有相对于该序列具有90％以上的同源性的氨基酸序列，
(b)代替CDR2的序列号8或序列号9的氨基酸序列、或者氨基酸序列Lys-Val-Ser，含有相对于该序列具有90％以上的同源性的氨基酸序列，并且
(c)代替CDR3的序列号10的氨基酸序列，含有相对于该序列具有90％以上的同源性的氨基酸序列。
20.根据上述17的融合蛋白，其中，在该轻链的可变区中，
代替(a)CDR1的序列号6或序列号7、(b)CDR2的序列号8或序列号9、或者氨基酸序列Lys-Val-Ser、以及(c)CDR3的序列号10中的至少1个氨基酸序列，含有相对于该序列进行了1～5个氨基酸的置换、缺失或添加的改造的氨基酸序列。
21.根据上述17的融合蛋白，其中，在该轻链的可变区中，
代替(a)CDR1的序列号6或序列号7、(b)CDR2的序列号8或序列号9、或者氨基酸序列Lys-Val-Ser、以及(c)CDR3的序列号10中的至少1个氨基酸序列，含有相对于该序列进行了1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的改造的氨基酸序列。
22.根据上述1～16中任一项的融合蛋白，其中，该抗体的轻链的可变区含有序列号17、序列号18、序列号19、序列号20、序列号21或序列号22的氨基酸序列。
23.根据上述22的融合蛋白，其中，代替该轻链的可变区的氨基酸序列，含有相对于该序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列。
24.根据上述22的融合蛋白，其中，代替该轻链的可变区的氨基酸序列，含有相对于该序列具有90％以上的同源性的氨基酸序列。
25.根据上述22的融合蛋白，其中，代替该轻链的可变区的氨基酸序列，含有相对于该序列进行了1～5个氨基酸的置换、缺失或添加的改造的氨基酸序列。
26.根据上述22的融合蛋白，其中，代替该轻链的可变区的氨基酸序列，含有相对于该序列进行了1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的改造的氨基酸序列。
27.根据上述1～16中任一项的融合蛋白，其中，该抗体的轻链含有序列号23、序列号25、序列号27或序列号29的氨基酸序列。
28.根据上述27的融合蛋白，其中，代替该轻链的氨基酸序列，含有相对于该序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列。
29.根据上述27的融合蛋白，其中，代替该轻链的氨基酸序列，含有相对于该序列具有90％以上的同源性的氨基酸序列。
30.根据上述27的融合蛋白，其中，代替该轻链的氨基酸序列，含有相对于该序列进行了1～5个氨基酸的置换、缺失或添加的改造的氨基酸序列。
31.根据上述27的融合蛋白，其中，代替该轻链的氨基酸序列，含有相对于该序列进行了1～3个氨基酸的置换、缺失或添加的改造的氨基酸序列。
32.根据上述1～31中任一项的融合蛋白，其中，该抗体为Fab抗体、F(ab’)2抗体或F(ab’)抗体。
33.根据上述1～31中任一项的融合蛋白，其中，该抗体为选自由scFab、scF(ab’)、scF(ab’)2和scFv组成的组中的单链抗体。
34.根据上述33的融合蛋白，其中，该抗体的轻链和重链通过接头序列而结合。
35.根据上述34的融合蛋白，其中，在该轻链的C末端侧通过接头序列结合该重链。
36.根据上述34的融合蛋白，其中，在该重链的C末端侧通过接头序列结合该轻链。
37.根据上述34～36中任一项的融合蛋白，其中，该接头序列由8～50个氨基酸残基构成。
38.根据上述37的融合蛋白，其中，该接头序列选自由氨基酸序列Gly-Ser、氨基酸序列Gly-Gly-Ser、氨基酸序列Gly-Gly-Gly、序列号3、序列号4和序列号5的各氨基酸序列、相当于3个序列号3的氨基酸序列连接而成的氨基酸序列的氨基酸序列、以及10个以下的这些氨基酸序列连接而成的序列组成的组。
39.根据上述1～38中任一项的融合蛋白，其中，该BDNF结合于该抗体的轻链或重链的C末端侧或N末端侧。
40.根据上述39的融合蛋白，其中，该BDNF直接或通过接头结合于该抗体的轻链或重链的C末端侧或N末端侧。
41.根据上述40的融合蛋白，其中，该接头为由1～50个氨基酸残基构成的肽。
42.根据上述41的融合蛋白，其中，该接头为含有选自由氨基酸序列Gly-Ser、氨基酸序列Gly-Gly-Ser、序列号3、序列号4、以及序列号5组成的组的氨基酸序列的肽。
43.根据上述1～42中任一项的融合蛋白，其中，该BDNF为人BDNF。
44.根据上述43的融合蛋白，其中，该人BDNF含有序列号51的氨基酸序列或与其实质上一致的氨基酸序列，或者该人BDNF具有与序列号51所示的蛋白质同一性质的功能。
45.根据上述1～44中任一项的融合蛋白，其对于人转铁蛋白受体的胞外区和猴转铁蛋白受体的胞外区这两者具有亲和性。
46.根据上述45的融合蛋白，其中，该抗人转铁蛋白受体抗体与人转铁蛋白受体的胞外区的解离常数为1×10-10M以下，与猴转铁蛋白受体的胞外区的解离常数为1×10-9M以下。
47.根据上述43的融合蛋白，其中
该轻链含有序列号23的氨基酸序列，并且
(a)该重链在其C末端侧通过由氨基酸序列Gly-Ser构成的接头与人BDNF结合，由此形成有序列号52的氨基酸序列，或者
(b)该重链在其C末端侧通过如下接头与人BDNF结合，由此形成有序列号54的氨基酸序列，该接头为由继氨基酸序列Gly-Ser之后连接5个氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号3)而成的共计27个氨基酸构成的接头。
48.根据上述1至31中任一项的融合蛋白，其中，该抗体为抗原结合性片段。
49.根据上述48的融合蛋白，其为在该抗原结合性片段的N末端侧直接或通过接头而结合人BDNF而成的融合蛋白。
50.根据上述48或49的融合蛋白，其中，该抗原结合性片段为单链抗体。
51.根据上述50的融合蛋白，其通过接头序列将该抗体的轻链可变区与重链可变区结合而成。
52.根据上述51的融合蛋白，其为在该轻链可变区的C末端侧通过该接头序列结合该重链可变区而成的融合蛋白。
53.根据上述51的融合蛋白，其为在该重链可变区的C末端侧通过该接头序列结合该轻链可变区而成的融合蛋白。
54.根据上述51～53中任一项的融合蛋白，其中，该接头序列由8～50个氨基酸残基构成。
55.根据上述54的融合蛋白，其中，该接头序列选自由氨基酸序列Gly-Ser、氨基酸序列Gly-Gly-Ser、氨基酸序列Gly-Gly-Gly、序列号3、序列号4和序列号5的各氨基酸序列、相当于3个序列号3的氨基酸序列连接而成的氨基酸序列的氨基酸序列、以及10个以下的这些氨基酸序列接连而成的序列组成的组。
56.根据上述50～55中任一项的融合蛋白，其中，该抗体包含具有序列号69的氨基酸序列的重链可变区、以及具有序列号18的氨基酸序列的轻链可变区。
57.根据上述56的融合蛋白，其中，该抗体由序列号57的氨基酸序列构成，该融合蛋白通过在该抗体的N末端侧直接或通过接头结合人BDNF而成。
58.根据上述57的融合蛋白，其中，该抗体由序列号57的氨基酸序列构成，该融合蛋白通过在该抗体的N末端侧通过接头结合人BDNF前体而成、且包含序列号59的氨基酸序列。
59.根据上述57的融合蛋白，其中，该抗体由序列号57的氨基酸序列构成，该融合蛋白通过在该抗体的N末端侧通过接头结合人BDNF而成、且包含序列号60的氨基酸序列。
60.根据上述48或49的融合蛋白，其中，该抗原结合性片段为Fab、F(ab')2、或F(ab')中的任意一者。
61.根据上述60的融合蛋白，其为在Fab、F(ab')2、或F(ab')中的任意一者的轻链或重链的N末端侧直接或通过接头结合人BDNF而成。
62.根据上述61的融合蛋白，其中，该抗体的轻链由序列号23的氨基酸序列构成，且该抗体的重链为由序列号61的氨基酸序列构成的Fab重链，在该重链的N末端侧直接或通过接头结合人BDNF。
63.根据上述62的融合蛋白，其中，该接头为包含选自由氨基酸序列Gly-Ser、氨基酸序列Gly-Gly-Ser、序列号3的氨基酸序列、序列号4的氨基酸序列、以及序列号5的氨基酸序列组成的组中的氨基酸序列的肽。
64.根据上述62的融合蛋白，其中，
该轻链含有序列号23的氨基酸序列，且
由该Fab重链与在其N末端侧通过接头结合的人BDNF前体构成的部分形成有序列号63的氨基酸序列。
65.根据上述62的融合蛋白，其中，
该轻链含有序列号23的氨基酸序列，且
由Fab重链与在其N末端侧通过接头结合的人BDNF构成的部分形成有序列号65的氨基酸序列。
66.根据上述48～62中任一项的融合蛋白，其中，人IgG Fc区或其一部分被导入至人BDNF与该抗体之间。
67.根据上述66的融合蛋白，其中，在人BDNF的C末端侧直接或通过接头序列结合人IgG Fc区，而且，在该人IgG Fc区的C末端侧直接或通过接头序列结合该抗体。
68.根据上述66或67的融合蛋白，其中，人IgG Fc区含有序列号75所示的氨基酸序列。
69.根据上述68的融合蛋白，其中，
该重链在人BDNF的C末端侧直接或通过接头序列结合该人IgG Fc区，并且在该人IgG Fc区的C末端侧直接或通过接头序列结合该重链。
70.根据上述69的融合蛋白，其中，
该轻链含有序列号23的氨基酸序列，并且
该重链在人BDNF的C末端侧通过接头序列结合人IgG Fc区，并且在该人IgG Fc区的C末端侧通过接头序列结合该重链，由此形成有序列号74的氨基酸序列。
71.根据上述48～62中任一项的融合蛋白，其中，进一步导入有白蛋白亲和性肽。
72.根据上述71的融合蛋白，其中，在该抗体的C末端侧直接或通过接头序列而结合有白蛋白亲和性肽。
73.根据上述71或72的融合蛋白，其中，白蛋白亲和性肽包含序列号85所示的氨基酸序列。
74.根据上述73的融合蛋白，其中，
该重链直接或通过接头序列结合于人BDNF的C末端侧，并且在该重链的C末端侧直接或通过接头序列结合有白蛋白亲和性肽。
75.根据上述74的融合蛋白，其中，
该轻链含有序列号23的氨基酸序列，并且
该重链通过接头序列结合于人BDNF前体的C末端侧，并且在该重链的C末端侧通过接头序列结合有白蛋白亲和性肽，由此形成有序列号87的氨基酸序。
76.根据上述74的融合蛋白，其中，
该轻链含有序列号23的氨基酸序列，并且
该重链通过接头序列结合于人BDNF的C末端侧，并且在该重链的C末端侧通过接头序列结合有白蛋白亲和性肽，由此形成有序列号88的氨基酸序列。
77.一种DNA片段，其编码上述1～76中任一项的融合蛋白。
78.一种表达载体，其整合有上述77的DNA片段。
79.一种哺乳动物细胞，其用上述78的表达载体进行了转化。
80.一种药剂，其为用于预防和/或治疗能通过暴露于BDNF而受益的疾病或障碍的药剂，其含有上述1～76中任一项的融合蛋白作为有效成分。
81.根据上述80的药剂，其中，该疾病或障碍为神经系统的疾病或障碍。
82.根据上述81的药剂，其中，该神经系统的疾病或障碍为神经退行性疾病、抑郁症、精神分裂症、癫痫、自闭症、Rett综合征、West综合征、新生儿惊厥、痴呆伴发问题行为、焦虑症、疼痛、赫希施普龙病或快速眼动睡眠行为障碍。
83.根据上述82的药剂，其中，该神经退行性疾病为脑神经退行性疾病、脊髓退行性疾病、视网膜退行性疾病或周围神经退行性疾病。
84.根据上述83的药剂，其中，该脑神经退行性疾病为脑神经系统的神经退行性疾病、脑缺血性疾病、创伤性脑损伤、白质脑病或多发性硬化症。
85.根据上述84的药剂，其中，该脑神经系统的神经退行性疾病为阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈症、路易体痴呆、匹克氏病、多系统萎缩症、进行性上行性麻痹或唐氏综合征。
86.上述1～76中任一项的融合蛋白在预防和/或治疗能通过暴露于BDNF而受益的疾病或障碍中的应用。
87.上述1～76中任一项的融合蛋白在制造用于预防和/或治疗能通过暴露于BDNF而受益的疾病或障碍的药物中的应用。
88.一种预防和/或治疗能通过暴露于BDNF而受益的疾病或障碍的方法，其包括如下步骤：向具有该疾病或伤害的患者的血中给药含有治疗上有效量的上述1～76中任一项的融合蛋白的药物组合物。
发明效果
本发明中，对于不能通过血脑屏障的脑源性神经营养因子(BDNF)，通过使其形成与特定的抗hTfR抗体的融合蛋白的形态，能够通过血脑屏障。因此，通过将BDNF以这种融合蛋白的形态通过静脉注射等给药于血中，能够使其作用于中枢神经系统。
附图说明
图1是示出单次静脉内给药抗hTfR抗体后的、食蟹猴的大脑皮质的针对抗hTfR抗体的免疫组织化学染色的结果的附图代用照片。(a)为未给药抗hTfR抗体，(b)为给药抗hTfR抗体号3。各照片右下方的线条为表示50μm的标尺。
图2是示出单次静脉内给药抗hTfR抗体后的、食蟹猴的海马的针对抗hTfR抗体的免疫组织化学染色的结果的图。(a)为未给药抗hTfR抗体，(b)为给药抗hTfR抗体号3。各照片右下方的线条为表示50μm的标尺。
图3是示出单次静脉内给药抗hTfR抗体后的、食蟹猴的小脑的针对抗hTfR抗体的免疫组织化学染色的结果的附图代用照片。(a)为未给药抗hTfR抗体，(b)为给药抗hTfR抗体号3。各照片右下方的线条为表示50μm的标尺。
图4是示出单次静脉内给药后的、食蟹猴的脑以外的各种脏器中的人源化抗hTfR抗体的蓄积量的图。纵轴表示各脏器的单位湿重中人源化抗hTfR抗体的量(μg/g湿重)。白柱从左侧起依次表示给药人源化抗hTfR抗体号3、人源化抗hTfR抗体号3-2、人源化抗hTfR抗体号3(IgG4)和人源化抗hTfR抗体号3-2(IgG4)后的猴的各脏器中的蓄积量，黑柱表示给药曲妥珠单抗(赫赛汀(Herceptin)TM)后的猴的各脏器中的蓄积量。ND表示未测定。
图5是示出单次静脉内给药后的、食蟹猴的大脑皮质的针对人源化抗hTfR抗体的免疫组织化学染色的结果的附图代用照片。(a)为给药赫赛汀，(b)为给药人源化抗hTfR抗体号3，(c)为给药人源化抗hTfR抗体号3-2，(d)为给药人源化抗hTfR抗体号3(IgG4)，(e)为给药人源化抗hTfR抗体号3-2(IgG4)。各照片右下方的线条为表示20μm的标尺。
图6是示出单次静脉内给药后的、食蟹猴的海马的针对人源化抗hTfR抗体的免疫组织化学染色的结果的图。(a)为给药赫赛汀，(b)为给药人源化抗hTfR抗体号3，(c)为给药人源化抗hTfR抗体号3-2，(d)为给药人源化抗hTfR抗体号3(IgG4)，(e)为给药人源化抗hTfR抗体号3-2(IgG4)。各照片右下方的线条为表示20μm的标尺。
图7是示出单次静脉内给药后的、食蟹猴的小脑的针对人源化抗hTfR抗体的免疫组织化学染色的结果的图。(a)为给药赫赛汀，(b)为给药人源化抗hTfR抗体号3，(c)为给药人源化抗hTfR抗体号3-2，(d)为给药人源化抗hTfR抗体号3(IgG4)，(e)为给药人源化抗hTfR抗体号3-2(IgG4)。各照片右下方的线条为表示20μm的标尺。
图8是示出单次静脉内给药后的、食蟹猴的延髓的针对人源化抗hTfR抗体的免疫组织化学染色的结果的图。(a)为给药赫赛汀，(b)为给药人源化抗hTfR抗体号3，(c)为给药人源化抗hTfR抗体号3-2，(d)为给药人源化抗hTfR抗体号3(IgG4)，(e)为给药人源化抗hTfR抗体号3-2(IgG4)。各照片右下方的线条为表示20μm的标尺。
图9是表示将BDNF-抗hTfR抗体融合蛋白单次静脉内给药后的hTfR-KI小鼠的脑内浓度变化的图。横轴是表示给药后的时间(小时)，纵轴是表示脑的每克重量(湿重)的BDNF-抗hTfR抗体融合蛋白的浓度(nM，二聚物换算)。
图10是表示将BDNF-抗hTfR抗体融合蛋白单次静脉内给药后的给药后3小时的食蟹猴脑内的各部位中的BDNF-抗hTfR抗体融合蛋白的浓度(nM，二聚物换算)的图。
图11是表示将BDNF-抗hTfR抗体融合蛋白(hBDNF-抗hTfR抗体(3N)ABD)单次静脉内给药后的hTfR-KI小鼠的脑内浓度变化的图。横轴是表示给药后的时间(小时)，纵轴是表示脑的每克重量(湿重)的BDNF-抗hTfR抗体融合蛋白的浓度(nM，二聚物换算)。
具体实施方式
在本发明中，“抗体”这一术语主要是指人抗体、小鼠抗体、人源化抗体、人抗体与其它哺乳动物的抗体的嵌合抗体和小鼠抗体与其它哺乳动物的抗体的嵌合抗体中的任意一种，但只要具有与特定的抗原特异性结合的性质则不限于这些抗体，此外，对抗体的动物种属也没有特别限制。其中，优选的是人源化抗体。
在本发明中，“人抗体”这一术语是指其蛋白质全体由源自人的基因编码的抗体。但是，出于提升基因的表达效率等目的而在不使原始的氨基酸序列发生改变的条件下在原始的人的基因中引入了变异的基因所编码的抗体也包含在“人抗体”中。此外，将编码人抗体的2个以上的基因组合、将某一人抗体的一部分置换为另一人抗体的一部分而制作的抗体也为“人抗体”。人抗体具有免疫球蛋白轻链的3个互补性决定区(CDR)和免疫球蛋白重链的3个互补性决定区(CDR)。免疫球蛋白轻链的3个CDR从位于N末端侧的CDR起依次称为CDR1、CDR2和CDR3。免疫球蛋白重链的3个CDR也从位于N末端侧的CDR起依次称为CDR1、CDR2和CDR3。通过将某一人抗体的CDR置换为另一人抗体的CDR而改变了人抗体的抗原特异性、亲和性等的抗体也包含在人抗体中。
在本发明中，通过改造原始的人抗体的基因而在原始的抗体的氨基酸序列中引入置换、缺失、添加等变异的抗体也包含在“人抗体”中。在用其它氨基酸置换原始的抗体的氨基酸序列中的氨基酸的情况下，所置换的氨基酸的个数优选为1～20个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个。在使原始的抗体的氨基酸序列中的氨基酸缺失的情况下，缺失的氨基酸的个数优选为1～20个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个。此外，引入了组合有这些氨基酸的置换和缺失的变异的抗体也为人抗体。在添加氨基酸的情况下，在原始的抗体的氨基酸序列中或者N末端或C末端添加优选1～20个、更优选1～5个、进一步优选1～3个氨基酸。引入了组合有这些氨基酸的添加、置换和缺失的变异的抗体也为人抗体。引入了变异的抗体的氨基酸序列与原始的抗体的氨基酸序列优选显示80％以上的同源性，更优选显示90％以上的同源性，进一步优选显示95％以上的同源性，更进一步优选显示98％以上的同源性。即，在本发明中述及“源自人的基因”时，除了源自人的原始的基因以外，还包含通过对其施加改造而得到的基因。
在本发明中，在述及“小鼠抗体”时，是指其蛋白质全体由源自小鼠的基因编码的抗体。但是，出于提升基因的表达效率等目的而在不使原始的氨基酸序列发生改变的条件下在原始的小鼠的基因中引入了变异后的基因所编码的抗体也包含在“小鼠抗体”中。此外，将编码小鼠抗体的2个以上的基因组合、将某一小鼠抗体的一部分置换为另一小鼠抗体的一部分而得到的抗体也包含在小鼠抗体中。小鼠抗体具有免疫球蛋白轻链的3个互补性决定区(CDR)和免疫球蛋白重链的3个互补性决定区(CDR)。免疫球蛋白轻链的3个CDR从位于N末端侧的CDR起依次称为CDR1、CDR2和CDR3。免疫球蛋白重链的3个CDR从位于N末端侧的CDR起依次称为CDR1、CDR2和CDR3。例如，通过将某一小鼠抗体的CDR置换为另一小鼠抗体的CDR而改变了小鼠抗体的抗原特异性、亲和性等的抗体也包含在小鼠抗体中。
在本发明中，通过改造原始的小鼠抗体的基因而在原始的抗体的氨基酸序列引入了置换、缺失、添加等变异的抗体也包含在“小鼠抗体”中。在用其它氨基酸置换原始的抗体的氨基酸序列中的氨基酸的情况下，所置换的氨基酸的个数优选为1～20个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个。在使原始的抗体的氨基酸序列中的氨基酸缺失时，缺失的氨基酸的个数优选为1～20个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个。此外，引入了组合有这些氨基酸的置换和缺失的变异的抗体也包含在“小鼠抗体”中。在添加氨基酸的情况下，在原始的抗体的氨基酸序列中或者N末端侧或C末端侧添加优选1～20个、更优选1～5个、进一步优选1～3个氨基酸。引入了组合有这些氨基酸的添加、置换和缺失的变异的抗体也包含在“小鼠抗体”中。引入了变异的抗体的氨基酸序列与原始的抗体的氨基酸序列优选显示80％以上的同源性，更优选显示90％以上的同源性，进一步优选显示95％以上的同源性，更进一步优选显示98％以上的同源性。即，在本发明中述及“源自小鼠的基因”时，除了源自小鼠的原始的基因以外，还包含通过对其施加改造而得到的基因。
在本发明中，“人源化抗体”这一术语是指：可变区的一部分(例如，特别是CDR的全部或一部分)的氨基酸序列源自人以外的哺乳动物、除此以外的区域源自人的抗体。例如，作为人源化抗体，可以列举通过将构成人抗体的免疫球蛋白轻链的3个互补性决定区(CDR)和免疫球蛋白重链的3个互补性决定区(CDR)置换为其它哺乳动物的CDR而制作的抗体。成为被移植到人抗体的合适位置的CDR的来源的其它哺乳动物的生物种属，只要为人以外的哺乳动物则没有特别限定，优选为小鼠、大鼠、兔、马或人以外的灵长类，更优选为小鼠和大鼠，进一步优选为小鼠。
在本发明中，“嵌合抗体”这一术语是指：来自2个以上的不同种属的、2个以上的不同的抗体片段连接成的抗体。
人抗体与其它哺乳动物的抗体的嵌合抗体是指：人抗体的一部分被置换为人以外的哺乳动物的抗体的一部分而得到的抗体。抗体由以下说明的Fc区、Fab区和铰链区构成。作为这样的嵌合抗体的具体例子，可以列举Fc区源自人抗体而Fab区源自其它哺乳动物的抗体的嵌合抗体。铰链区源自人抗体或其它哺乳动物的抗体中的任意一者。相反地，可以列举Fc区源自其它哺乳动物而Fab区源自人抗体的嵌合抗体。铰链区源自人抗体或其它哺乳动物的抗体中的任意一者。
此外，也可以说抗体由可变区和恒定区构成。作为嵌合抗体的其他具体例子，可以列举重链的恒定区(CH)和轻链的恒定区(CL)源自人抗体而重链的可变区(VH)和轻链的可变区(VL)源自其它哺乳动物的抗体的嵌合抗体，相反地，可以列举重链的恒定区(CH)和轻链的恒定区(CL)源自其它哺乳动物的抗体而重链的可变区(VH)和轻链的可变区(VL)源自人抗体的嵌合抗体。在此，其它哺乳动物的生物种属只要为人以外的哺乳动物则没有特别限定，优选为小鼠、大鼠、兔、马或人以外的灵长类，例如小鼠。
小鼠抗体与其它哺乳动物的抗体的嵌合抗体是指：小鼠抗体的一部分被置换为小鼠以外的哺乳动物的抗体的一部分而得到的抗体。作为这样的嵌合抗体的具体例子，可以列举Fc区源自小鼠抗体而Fab区源自其它哺乳动物的抗体的嵌合抗体，相反地，可以列举Fc区源自其它哺乳动物而Fab区源自小鼠抗体的嵌合抗体。在此，其它哺乳动物的生物种属优选为人。
人抗体与小鼠抗体的嵌合抗体特指“人/小鼠嵌合抗体”。人/小鼠嵌合抗体中，可以列举Fc区源自人抗体而Fab区源自小鼠抗体的嵌合抗体，相反地，可以列举Fc区源自小鼠抗体而Fab区源自人抗体的嵌合抗体。铰链区源自人抗体或小鼠抗体中的任意一者。作为人/小鼠嵌合抗体的其他具体例子，可以列举重链的恒定区(CH)和轻链的恒定区(CL)源自人抗体而重链的可变区(VH)和轻链的可变区(VL)源自小鼠抗体的人/小鼠嵌合抗体，相反地，可以列举重链的恒定区(CH)和轻链的恒定区(CL)源自小鼠抗体而重链的可变区(VH)和轻链的可变区(VL)源自人抗体的人/小鼠嵌合抗体。
抗体原本具有由2条免疫球蛋白轻链和2条免疫球蛋白重链共计4条多肽链构成的基本结构。但是，在本发明中，述及“抗体”时，不仅包含具有该基本结构的抗体，
(1)由1条免疫球蛋白轻链和1条免疫球蛋白重链共计2条多肽链构成的抗体，以及如以下详述的
(2)在免疫球蛋白轻链的C末端侧结合接头序列、并且进一步在其C末端侧结合免疫球蛋白重链而成的单链抗体，和
(3)在免疫球蛋白重链的C末端侧结合接头序列、并且进一步在其C末端侧结合免疫球蛋白轻链而成的单链抗体，而且，
(4)从本来意义上的抗体的基本结构中缺失了Fc区的由Fab区构成的抗体以及由Fab区和铰链区的全部或一部分构成的抗体(包括Fab、F(ab’)和F(ab’)2)也包含在本发明的“抗体”中。
在此，Fab是指：含有可变区和CL区域(轻链的恒定区)的轻链以及含有可变区和CH1区域(重链的恒定区的部分1)的重链以各自中存在的半胱氨酸残基彼此通过二硫键结合而得到的分子。在Fab中，重链除了可变区和CH1区域(重链的恒定区的部分1)以外可以进一步含有铰链区的一部分，但此时的铰链区缺失了存在于铰链区且使抗体的重链彼此结合的半胱氨酸残基。在Fab中，轻链和重链通过二硫键结合，所述二硫键形成于存在于轻链的恒定区(CL区域)的半胱氨酸残基和存在于重链的CH1区域或铰链区的半胱氨酸残基之间。在本说明书中，将形成Fab的重链称为“Fab重链”。Fab缺失了存在于铰链区且使抗体的重链彼此结合的半胱氨酸残基，由1条轻链和1条重链构成。在F(ab’)中，其重链除了可变区和CH1区域以外还含有具有使重链彼此结合的半胱氨酸残基的铰链区的全部或一部分。F(ab’)2是指；2个F(ab’)以存在于相互的铰链区中的半胱氨酸残基彼此通过二硫键结合而得到的分子。在本说明书中，将形成F(ab’)或F(ab’)2的重量称为“Fab’重量”。此外，多个抗体直接或通过接头结合而得到的二聚体、三聚体等聚合物也是抗体。进而，不限于这些，含有免疫球蛋白分子的一部分且具有与抗原特异性结合的性质的物质均包含在本发明所述的“抗体”中。即，在本发明中，述及免疫球蛋白轻链时，含有源自免疫球蛋白轻链的具有其可变区的全部或一部分氨基酸序列物质。此外，述及免疫球蛋白重链时，包含源自免疫球蛋白重链的具有其可变区的全部或一部分氨基酸序列的物质。因此，只要具有可变区的全部或一部分氨基酸序列，则例如Fc区缺失的物质也是免疫球蛋白重链。
此外，在此，Fc或Fc区是指：抗体分子中的、含有由CH2区域(重链的恒定区的部分2)和CH3区域(重链的恒定区的部分3)构成的片段的区域。Fc或Fc区除了CH2区域和CH3区域以外还可以含有铰链区的一部分。
进而，在本发明中，在述及“抗体”时，还包含：
(5)将构成上述(4)所示的Fab、F(ab’)或F(ab’)2的轻链和重链通过接头序列结合而分别形成的单链抗体scFab、scF(ab’)和scF(ab’)2。在此，就scFab、scF(ab’)和scF(ab’)2而言，可以在轻链的C末端侧结合接头序列、并且进一步使其C末端侧结合重链，此外，也可以在重链的C末端侧结合接头序列、并且进一步使其C末端侧结合轻链。进而，使轻链的可变区和重链的可变区通过接头序列结合而形成的单链抗体scFv也包含在本发明的抗体中。就scFv而言，可以使轻链的可变区的C末端侧结合接头序列、并且进一步使其C末端侧结合重链的可变区，此外，也可以使重链的可变区的C末端侧结合接头序列、并且进一步使其C末端侧结合轻链的可变区。
进而，本说明书中所述的“抗体”中，除了全长抗体、上述(1)～(3)所示的抗体以外，还包含作为涵盖了上述(4)和(5)的概念的、全长抗体的一部分缺损的抗原结合性片段(抗体片段)的任一形态。
“抗原结合性片段”这一术语是指保持了与抗原的特异性结合活性的至少一部分的抗体片段。作为结合性片段的例子，除了例如上述(4)和(5)所示的例子以外，还包含：可变区(Fv)、以适当的接头将重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)连接而成的单链抗体(scFv)、作为含有重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的多肽的二聚体的双链抗体、作为在scFv的重链(H链)上结合有恒定区的一部分(CH3)的肽的二聚体的微抗体(Minibody)、其它低分子化抗体等。但是，只要具有与抗原的结合能力则不限于这些分子。此外，这些结合性片段不仅包含将抗体蛋白的全长分子用适当的酶处理而得到的产物，也包含使用经基因工程方法改造后的抗体基因在适当的宿主细胞中产生的蛋白质。
在本发明中，在述及“单链抗体”时，是指在含有免疫球蛋白轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列的C末端侧结合接头序列、进一步在其C末端侧结合含有免疫球蛋白重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列而成的、能够与特定抗原特异性结合的蛋白质。例如，上述(2)、(3)和(5)所示的抗体包含在单链抗体中。此外，在含有免疫球蛋白重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列的C末端侧结合接头序列、进一步在其C末端侧结合含有免疫球蛋白轻链的可变区的全部或一部的氨基酸序列而成的、能够与特定抗原特异性结合的蛋白质也是本发明中的“单链抗体”。就在免疫球蛋白重链的C末端侧通过接头序列结合免疫球蛋白轻链而成的单链抗体而言，通常免疫球蛋白重链的Fc区是缺失的。免疫球蛋白轻链的可变区具有3个与抗体的抗原特异性相关的互补性决定区(CDR)。同样，免疫球蛋白重链的可变区也具有3个CDR。这些CDR为决定抗体的抗原特异性的主要区域。因此，优选单链抗体中含有免疫球蛋白重链的全部3个CDR和免疫球蛋白轻链的全部3个CDR。但是，只要可维持抗体的抗原特异性的亲和性，则也可以设为缺失了1个或多个CDR的单链抗体。
在单链抗体中，配置于免疫球蛋白的轻链和重链之间的接头序列为由优选2～50个、更优选8～50个、进一步优选10～30个、更进一步优选12～18个或15～25个、例如15个或25个氨基酸残基构成的肽链。就这种接头序列而言，只要用其连接两条链而成的抗hTfR抗体可保持对hTfR的亲和性则对其氨基酸序列没有限定，优选仅由甘氨酸构成或由甘氨酸和丝氨酸构成的接头序列。可以列举例如：含有氨基酸序列Gly-Ser、氨基酸序列Gly-Gly-Ser、氨基酸序列Gly-Gly-Gly、氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号3)、氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号4)、氨基酸序列Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(序列号5)或者相当于2～10个或2～5个这些氨基酸序列连接而成的序列的序列的接头序列。例如，在由免疫球蛋白重链的可变区的全部区域构成的氨基酸序列的C末端侧通过接头序列结合免疫球蛋白轻链的可变区时，优选含有由相当于3个氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号3)连接而成的序列的、共计15个氨基酸构成的接头序列的接头。
在本发明中，“人转铁蛋白受体”或“hTfR”这一术语是指具有序列号1的氨基酸序列的膜蛋白。在本发明的一个实施方式中，应与BDNF融合的抗hTfR抗体是与序列号1的氨基酸序列中从N末端起第89位的半胱氨酸残基到C末端的苯丙氨酸为止的部分(hTfR的胞外区)特异性结合的抗体，但不限于此。此外，在本发明中，“猴转铁蛋白受体”或“猴TfR”这一术语，特指源自食蟹猴(Macaca fascicularis)的、具有序列号2的氨基酸序列的膜蛋白。在实施方式之一中，本发明的抗hTfR抗体是还与序列号2的氨基酸序列中从N末端起第89位的半胱氨酸残基到C末端的苯丙氨酸为止的部分(猴TfR的胞外区)结合的抗体，但不限于此。
作为针对hTfR的抗体的制作方法，通常为如下方法：使用导入有整合了hTfR基因的表达载体的细胞，制作重组人转铁蛋白受体(rhTfR)，使用该rhTfR免疫小鼠等动物，从而得到。从免疫后的动物中取出产生针对hTfR的抗体的细胞，使其与骨髓瘤细胞融合，由此，可以制作具有抗hTfR抗体产生能力的杂交瘤细胞。
此外，利用体外免疫法以rhTfR免疫由小鼠等动物得到的免疫系统细胞，由此也可以获得产生针对hTfR的抗体的细胞。使用体外免疫法时，对该免疫系统细胞的来源动物种属没有特别限定，优选为小鼠、大鼠、兔、豚鼠、狗、猫、马和包括人在内的灵长类，更优选为小鼠、大鼠和人，进一步优选为小鼠和人。作为小鼠的免疫系统细胞，例如可以使用由小鼠的脾脏制备的脾细胞。作为人的免疫系统细胞，可以使用由人的外周血、骨髓、脾脏等制备的细胞。在利用体外免疫法免疫人的免疫系统细胞时，可以得到针对hTfR的人抗体。
利用体外免疫法免疫免疫系统细胞后，使细胞与骨髓瘤细胞融合，由此，可以制作具有抗体产生能力的杂交瘤细胞。此外，还可以：从免疫后的细胞中提取mRNA并合成cDNA，以该cDNA为模板通过PCR反应扩增含有编码免疫球蛋白的轻链和重链的基因的DNA片段，使用这些人工再构建抗体基因。
利用上述方法得到的状态的杂交瘤细胞中还含有产生将hTfR以外的蛋白质识别为抗原的抗体的细胞。此外，产生抗hTfR抗体的杂交瘤细胞未必全部都产生对hTfR显示高亲和性的抗hTfR抗体。
同样，人工再构建的抗体基因中还含有编码将hTfR以外的蛋白质识别为抗原的抗体的基因。此外，编码抗hTfR抗体的基因未必全部具有编码对hTfR显示高亲和性的抗hTfR抗体等所期望的特性。
因此，需要从上述得到的状态的杂交瘤细胞中选择出产生具有所期望的特性(对hTfR的高亲和性等)的抗体的杂交瘤细胞的步骤。此外，就人工再构建的抗体基因而言，需要从该抗体基因中选择出编码具有所期望的特性(对hTfR的高亲和性等)的抗体的基因的步骤。作为选择出产生对hTfR显示高亲和性的抗体(高亲和性抗体)的杂交瘤细胞或编码高亲和性抗体的基因的方法，以下详述的方法是有效的。需要说明的是，对hTfR显示高亲和性的抗体是指：利用实施例7中记载的方法测定出的与hTfR的解离常数(KD)优选为1×10-8M以下的抗体，更优选为1×10-9M以下的抗体，进一步优选为1×10-10M以下抗体，另外进一步优选为1×10-11M以下的抗体。例如，作为优选的例子，可以列举解离常数为1×10-13M～1×10- 9M的抗体、1×10-13M～1×10-10M的抗体。
例如，在选择产生对hTfR为高亲和性的抗体的杂交瘤细胞时可使用以下方法：将重组hTfR添加到板中并在其中保持后，添加杂交瘤细胞的培养上清，然后将不与重组hTfR结合的抗体从板中除去，测定保持在板中的抗体的量。根据该方法，添加到板中的杂交瘤细胞的培养上清中所含的抗体对hTfR的亲和性越高，则保持在板中的抗体的量越多。因此，可以测定板中所保持的抗体的量，选择保持有更多抗体的板所对应的杂交瘤细胞来作为产生对hTfR具有相对高的亲和性的抗hTfR抗体的细胞株。从这样选择出的细胞株中提取mRNA并合成cDNA，以该cDNA为模板使用PCR法来扩增含有编码抗hTfR抗体的基因的DNA片段，由此，还可以分离出编码高亲和性抗体的基因。
在从上述人工再构建的抗体基因中选择编码具有高亲和性的抗hTfR抗体的基因时，暂时将人工再构建的抗体基因整合到表达载体中，将该表达载体导入到宿主细胞中。此时，就作为宿主细胞使用的细胞而言，只要是可以通过导入整合有人工再构建的抗体基因的表达载体而表达抗体基因的细胞，则不论原核细胞、真核细胞均可以，没有特别限定，优选源自人、小鼠、中国仓鼠等哺乳动物的细胞，特别优选源自中国仓鼠卵巣的CHO细胞或源自小鼠骨髓瘤的NS/0细胞。此外，用于整合并表达编码抗体基因的基因的表达载体，只要是导入到哺乳动物细胞内时表达该基因的载体则可以没有特别限定地使用。整合到表达载体中的该基因被配置于可以在哺乳动物细胞内调节基因转录频率的DNA序列(基因表达控制部位)的下游。作为本发明中可以使用的基因表达控制部位，可以列举例如：源自巨细胞病毒的启动子、SV40早期启动子、人延伸因子-1α(EF-1α)启动子、人泛素C启动子等。
导入有这样的表达载体的哺乳动物细胞能够表达整合到表达载体中的上述人工再构建的抗体。在从这样得到的表达人工再构建的抗体的细胞中选择产生对hTfR具有高亲和性的抗体的细胞时可使用以下方法：将重组hTfR添加到板中并在其中保持后，使重组hTfR接触细胞的培养上清，然后将不与重组hTfR结合的抗体从板中除去，测定保持在板中的抗体的量。根据该方法，细胞的培养上清中所含的抗体对hTfR的亲和性越高，则保持在板中的抗体的量越多。因此，可以测定保持在板中的抗体的量，选择保持有更多抗体的板所对应的细胞来作为产生对hTfR具有相对高的亲和性的抗hTfR抗体的细胞株，进而，可以选择出编码对hTfR具有高亲和性的抗hTfR抗体的基因。从这样选择出的细胞株中，将含有编码抗hTfR抗体的基因的DNA片段使用PCR法扩增，由此，可以分离出编码高亲和性抗体的基因。
关于从上述人工再构建的抗体基因中选择编码具有高亲和性的抗hTfR抗体的基因，也可以如下进行：将人工再构建的抗体基因整合到表达载体中，将该表达载体导入到大肠杆菌中，使用培养该大肠杆菌而得到的培养上清或含有使大肠杆菌溶解而得到的抗体的溶液，通过与上述选择杂交瘤细胞时同样的方法来选择具有所期望的基因的大肠杆菌。所选择的大肠杆菌株是表达编码对hTfR具有相对高的亲和性的抗hTfR抗体的基因的细胞株。可以从该细胞株中选择编码对hTfR具有相对高的亲和性的抗hTfR抗体的基因。在使抗体分泌到大肠杆菌的培养上清中的情况下，按照在N末端侧结合分泌信号序列的方式将抗体基因整合到表达载体中即可。
作为选择编码具有高亲和性的抗hTfR抗体的基因的其他方法，有如下方法：使上述人工再构建的抗体基因所编码的抗体保持在噬菌体颗粒上并使其表达。此时，以编码单链抗体的基因的形式进行抗体基因的再构建。使抗体保持在噬菌体颗粒上的方法记载于国际公开公报(WO1997/09436，WO1995/11317)等中，是公知的。在从保持人工再构建的抗体基因所编码的抗体的噬菌体中选择保持对hTfR具有高亲和性的抗体的噬菌体时，可使用以下方法：将重组hTfR添加到板中并保持后，使其接触噬菌体，然后从板中除去不与重组hTfR结合的噬菌体，测定板中所保持的噬菌体的量。根据该方法，保持在噬菌体颗粒上的抗体对hTfR的亲和性越高，则板中所保持的噬菌体的量越多。因此，可以测定板中所保持的噬菌体的量，选择保持有更多噬菌体的板所对应的噬菌体颗粒来作为产生对hTfR具有相对高的亲和性的抗hTfR抗体的噬菌体颗粒，进而，可以选择出编码对hTfR具有高亲和性的抗hTfR抗体的基因。从这样选择出的噬菌体颗粒中，将含有编码抗hTfR抗体的基因的DNA片段使用PCR法扩增，由此，可以分离出编码高亲和性抗体的基因。
利用使用了酶免疫测定法(EIA、ELISA)的直接和间接夹心分析、流式细胞术、表面等离子激元共振法(以下称为“SPR法”)、生物膜层干涉法(以下称为“BLI法”)或免疫沉降分析等公知的结合分析，可以选择出产生对hTfR具有高亲和性的抗体的杂交瘤细胞。可以：由该产生高亲和性抗体的细胞制备cDNA，以其为模板，将含有以下基因的DNA片段通过PCR法等扩增并分离，所述基因为编码抗hTfR抗体的轻链、抗hTfR抗体的重链或作为抗hTfR抗体的单链抗体的全部或其一部分的基因。同样地，还可以：将含有编码抗hTfR抗体的轻链的可变区的全部或其一部分的基因的DNA片段、含有编码抗hTfR抗体的重链的可变区的全部或其一部分的基因的DNA片段通过PCR法等扩增并分离。
将该编码具有高亲和性的抗hTfR抗体的轻链和重链的基因的全部或其一部分整合到表达载体中，使用该表达载体转化哺乳动物细胞等宿主细胞并培养所得到的转化细胞，由此，可以产生具有高亲和性的抗hTfR抗体。还可以：由分离出的编码抗hTfR抗体的基因的碱基序列翻译出抗hTfR抗体的氨基酸序列，人工合成出编码该氨基酸序列的DNA片段。在人工合成DNA片段时，还可以通过选择合适的密码子而使宿主细胞中的抗hTfR抗体的表达量增加。
为了向原始的抗hTfR抗体的氨基酸序列中引入置换、缺失、添加等变异，也可以向分离出的DNA片段中所含的编码抗hTfR抗体的基因中适宜引入变异。引入变异后的编码抗hTfR抗体的基因与原始的基因优选具有80％以上的同源性，更优选具有90％以上的同源性，但对同源性没有特别限制。通过在氨基酸序列中引入变异，还可以改变与抗hTfR抗体结合的糖链数、糖链种类，从而增加抗hTfR抗体在生物体内的稳定性。
在向编码抗hTfR抗体的轻链的可变区的全部或其一部分的基因中引入变异时，引入变异后的基因与原始的基因优选具有80％以上的同源性，更优选具有90％以上的同源性，但对同源性没有特别限制。在用其它氨基酸置换轻链的可变区的氨基酸序列的氨基酸时，所置换的氨基酸的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个，更进一步优选为1～2个。在使轻链的可变区的氨基酸序列中的氨基酸缺失时，缺失的氨基酸的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个，更进一步优选为1～2个。此外，还可以引入组合有这些氨基酸的置换和缺失的变异。在向轻链的可变区添加氨基酸时，向轻链的可变区的氨基酸序列中或者N末端或C末端添加优选1～10个、更优选1～5个、进一步优选1～3个、更进一步优选1～2个氨基酸。还可以引入组合有这些氨基酸的添加、置换和缺失的变异。引入了变异的轻链的可变区的氨基酸序列与原始的轻链的可变区的氨基酸序列优选具有80％以上的同源性，更优选显示90％以上的同源性，进一步优选显示95％以上的同源性。特别是在用其它氨基酸置换CDR的氨基酸序列的氨基酸时，所置换的氨基酸的个数优选为1～5个，更优选为1～3个，进一步优选为1～2个，更进一步优选为1个。在使CDR的氨基酸序列中的氨基酸缺失时，缺失的氨基酸的个数优选为1～5个，更优选为1～3个，进一步优选为1～2个，更进一步优选为1个。此外，还可以引入组合有这些氨基酸的置换和缺失的变异。在添加氨基酸时，向该氨基酸序列中或者N末端或C末端添加优选1～5个、更优选1～3个、进一步优选1～2个、更进一步优选1个氨基酸。还可以引入组合有这些氨基酸的添加、置换和缺失的变异。引入了变异的各CDR的氨基酸序列与原始的各CDR的氨基酸序列优选具有80％以上的同源性，更优选显示90％以上的同源性，进一步优选显示95％以上的同源性。
在向编码抗hTfR抗体的重链的可变区的全部或其一部分的基因中引入变异时，引入变异后的基因与原始的基因优选具有80％以上的同源性，更优选具有90％以上的同源性，但对同源性没有特别限制。在用其它氨基酸置换重链的可变区的氨基酸序列的氨基酸时，所置换的氨基酸的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个，另外进一步优选为1～2个。在使重链的可变区的氨基酸序列中的氨基酸缺失时，缺失的氨基酸的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个，另外进一步优选为1～2个。此外，还可以引入组合有这些氨基酸的置换和缺失的变异。在向重链的可变区添加氨基酸时，向重链的可变区的氨基酸序列中或者N末端或C末端添加优选1～10个、更优选1～5个、进一步优选1～3个、更进一步优选1～2个氨基酸。还可以引入组合有这些氨基酸的添加、置换和缺失的变异。引入了变异的重链的可变区的氨基酸序列与原始的重链的可变区的氨基酸序列优选具有80％以上的同源性，更优选显示90％以上的同源性，进一步优选显示95％以上的同源性。特别是在用其它氨基酸置换CDR的氨基酸序列的氨基酸时，所置换的氨基酸的个数优选为1～5个，更优选为1～3个，进一步优选为1～2个，更进一步优选为1个。在使CDR的氨基酸序列中的氨基酸缺失时，缺失的氨基酸的个数优选为1～5个，更优选为1～3个，进一步优选为1～2个，更进一步优选为1个。此外，还可以引入组合有这些氨基酸的置换和缺失的变异。在添加氨基酸时，向该氨基酸序列中或者N末端或C末端添加优选1～5个、更优选1～3个、进一步优选1～2个、更进一步优选1个氨基酸。还可以引入组合有这些氨基酸的添加、置换和缺失的变异。引入了变异的各CDR的氨基酸序列与原始的各CDR的氨基酸序列优选具有80％以上的同源性，更优选显示90％以上的同源性，进一步优选显示95％以上的同源性。
还可以将对上述抗hTfR抗体的轻链的可变区的变异和对上述抗hTfR抗体的重链的可变区的变异组合，在抗hTfR抗体的轻链和重链的可变区这两者中引入变异。
作为上述抗hTfR抗体的轻链和重链的氨基酸序列中的氨基酸的利用其它氨基酸进行的置换，可以列举例如：芳香族氨基酸(Phe、Trp、Tyr)、脂肪族氨基酸(Ala、Leu、Ile、Val)、极性氨基酸(Gln、Asn)、碱性氨基酸(Lys、Arg、His)、酸性氨基酸(Glu、Asp)、具有羟基的氨基酸(Ser、Thr)等被分类为同一组的氨基酸间的置换。可以预测这样的类似氨基酸的置换并不会使蛋白质的表型发生变化(即、保守氨基酸置换)。
需要说明的是，在向抗hTfR抗体中引入变异而在C末端或N末端添加了氨基酸的情况下，如果该添加的氨基酸在使抗hTfR抗体与BDNF融合时位于抗hTfR抗体与BDNF之间，则该添加的氨基酸构成接头的一部分。关于抗hTfR抗体与BDNF的融合蛋白中配置在抗hTfR抗体与BDNF之间的接头序列，将在后文详述。
培养利用上述方法等选择出的产生对hTfR具有较高亲和性的抗hTfR抗体的细胞而得到的抗hTfR抗体、以及使编码具有高亲和性的抗hTfR抗体的基因表达而得到的抗hTfR抗体，也可以通过向其氨基酸序列中引入置换、缺失、添加等变异而改造成具有所期望的特性的抗体。向抗hTfR抗体的氨基酸序列中引入变异可通过向与其氨基酸序列对应的基因中引入变异来进行。
抗hTfR抗体可以通过向该抗体的可变区的氨基酸序列中引入置换、缺失、添加等变异而适当调节抗体对hTfR的亲和性。例如，在抗体与抗原的亲和性高、在水性溶液中的解离常数显著低的情况下，将其给药于生物体内时，抗体不与抗原解离，其结果是可能产生功能上的不良情况。这种情况下，可通过向抗体的可变区引入变异而将解离常数阶梯性地调整为原始的抗体的2～5倍、5～10倍、10～100倍等，获得与目的相符的最优选的抗体。相反地，还可以通过该变异的引入将解离常数阶梯性地调整为原始的抗体的1/2～1/5倍、1/5～1/10倍、1/10～1/100倍等。
向抗hTfR抗体的氨基酸序列中引入置换、缺失、添加等变异例如如下进行：以编码抗hTfR抗体的基因为模板，利用PCR等方法向基因的碱基序列的特定位点引入变异或随机地引入变异。
目的在于调整抗体与hTfR的亲和性的、向抗hTfR抗体的氨基酸序列中引入变异例如可以如下进行：将编码作为单链抗体的抗hTfR抗体的基因整合到噬菌粒中，使用该噬菌粒制作在衣壳蛋白表面上表达单链抗体的噬菌体，一边通过使诱变剂等发挥作用而向编码单链抗体的基因上引入变异一边使噬菌体增殖，从增殖后的噬菌体中，利用上述方法选择出表达具有所期望的解离常数的单链抗体的噬菌体，或者通过在一定条件下使用抗原柱进行纯化而得到表达具有所期望的解离常数的单链抗体的噬菌体。
由前述杂交瘤细胞产生的抗体利用实施例7中记载的方法测定的与hTfR的解离常数(KD)优选为1×10-8M以下，更优选为1×10-9M以下，进一步优选为1×10-10M以下，另外进一步优选为1×10-11M以下。例如，作为优选的例子，可以列举解离常数为1×10-13M～1×10-9M的抗体、为1×10-13M～1×10-10M的抗体。在抗体为单链抗体时也同样。对于暂且得到的抗体，可以向编码该抗体的基因中引入变异等适当进行改造以使其具有所期望的特性。
通过从如上得到的抗hTfR抗体中选择出对猴TfR具有亲和性的抗体，可以得到对人和猴的TfR均有亲和性的抗体。对猴TfR具有亲和性的抗体例如可以通过使用了重组猴TfR的ELISA法等进行选择，所述重组猴TfR使用基因重组技术制作。在该ELISA法中，将重组猴TfR添加到板中并在其中保持后，使其接触抗hTfR抗体，然后将不与重组猴TfR结合的抗体从板中除去，测定保持在板中的抗体的量。对重组猴TfR的亲和性越高则保持在板中的抗体的量越多，因此，可以选择保持有更多抗体的板所对应的抗体作为对猴TfR具有亲和性的抗体。需要说明的是，这里所谓的“猴”优选为除人以外的被分类为类人猿的动物，更优选为被分类为猴科的动物，进一步优选为被分类为猕猴属的动物，例如食蟹猴或猕猴，特别是食蟹猴在用于评价方面更优选。
对人和猴的hTfR均具有亲和性的抗体具有如下有利效果：可以使用猴观察给药该抗体与BDNF的融合蛋白时的生物体内的动态。例如，在对本发明的抗hTfR抗体与BDNF的融合蛋白进行药物开发时，由于可以用猴实施该药物的药代动力学研究，因此可以显著促进该药物的开发。
在本发明中，对于对hTfR具有相对高的亲和性且对猴TfR也具有亲和性的抗体，特别是利用实施例7中记载的方法进行测定时，与人以及猴的TfR的解离常数如下：
(a)与hTfR的解离常数：优选为1×10-10M以下，更优选为2.5×10-11M以下，进一步优选为5×10-12M以下，更进一步优选为1×10-12M以下；
(b)与猴TfR的解离常数：优选为1×10-9M以下，更优选为5×10-10M以下，进一步优选为1×10-10M以下，例如为7.5×10-11M以下。
例如，可以列举与hTfR以及猴TfR的解离常数分别为1×10-10M以下和1×10-9M以下、1×10-11M以下和5×10-10M、5×10-12M以下和1×10-10M以下、5×10-12M以下和7.5×10-11M以下、1×10-12M以下和1×10-10M以下、1×10-12M以下和7.5×10-11M以下的抗体。在此，与人的TfR的解离常数没有特别明确的下限，但例如可以设为5×10-13M、1×10-13M等。而且，与猴的TfR的解离常数也没有特别明确的下限，但例如可以设为1×10-11M、1×10-12M等。抗体为单链抗体时也同样。
在利用上述的选择出产生高亲和性抗体的细胞的方法得到的、对hTfR具有相对高的亲和性的抗体为人以外的动物的抗体的情况下，可以制成人源化抗体。人源化抗体是指：在维持对抗原的特异性的情况下、使用人以外的动物的抗体的可变区的一部分(例如特别是CDR的全部或一部分)的氨基酸序列、并将人抗体的合适区域用该序列置换(该序列向人抗体的移植)而得到的抗体。例如，作为人源化抗体，可以列举将构成人抗体的免疫球蛋白轻链的3个互补性决定区(CDR)和免疫球蛋白重链的3个互补性决定区(CDR)用其它哺乳动物的CDR置换而得到的抗体。整合到人抗体中的CDR的来源生物种属只要为人以外的哺乳动物则没有特别限定，优选为小鼠、大鼠、兔、马、人以外的灵长类，更优选为小鼠和大鼠，进一步优选为小鼠。但也可以形成人抗体的一部分被其他的人抗体的一部分置换而得到的抗体。
人源化抗体的制作方法在该技术领域中是公知的，最常规的是基于Winter等设计的将位于人抗体的可变区中的互补性决定区(CDR)的氨基酸序列置换为非人哺乳动物的抗体的CDR的方法(Verhoeyen M.Science.239.1534-1536(1988))的制作方法。在此，公知的是，为了再现供体抗体所具有的本来活性，不仅利用非人哺乳动物的抗体的CDR、而且也利用参与CDR的结构保持或与抗原的结合的CDR外的区域的氨基酸序列来置换成为受体的人抗体的对应位置有时是必要的(Queen C.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.86.10029-10033(1989)。在此，CDR外的区域也称为框架区(FR)。
抗体的重链和轻链的可变区均含有4个框架区1～4(FR1～4)。FR1是与CDR1在其N末端侧邻接的区域，在构成重链和轻链的各肽中，由从其N末端至与CDR1的N末端邻接的氨基酸为止的氨基酸序列构成。FR2在构成重链和轻链的各肽中由CDR1与CDR2之间的氨基酸序列构成。FR3在构成重链和轻链的各肽中由CDR2与CDR3之间的氨基酸序列构成。FR4由与CDR3的C末端邻接的氨基酸至可变区的C末端为止的氨基酸序列构成。但是不限定于此，在本发明中，也可以将上述各FR区域中的、除其N末端侧的1～5个氨基酸和/或C末端侧的1～5个氨基酸以外的区域作为框架区。
人源化抗体的制作包括如下操作：移植非人哺乳动物的抗体的CDR(和必要时其周边的FR)来代替人抗体的可变区CDR(和必要时其周边的FR)。在该操作中，成为基础的人抗体的可变区的框架区可以从含有种系抗体基因序列的公共DNA数据库等得到。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列和氨基酸序列可以从“VBase”人生殖细胞系序列数据库(可以在互联网中用www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase获得)中选择。另外，还可以从发表的文献、例如“Kabat EA.Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,美国保健福祉省,NIH Publication No.91-3242(1991)”、“Tomlinson IM.J.Mol.Biol.227.776-98(1992)”、“Cox JPL.Eur.J Immunol.24:827-836(1994)”等中记载的DNA序列和氨基酸序列中选择。
如上所述，在人源化抗体中，被移植到原始的人抗体的可变区的非人哺乳动物的抗体区域通常含有CDR本身或CDR和其周边的FR。但是，与CDR一起被移植的FR也参与CDR的结构保持或与抗原的结合，认为实质上也具有决定抗体的互补性的功能，因此，在本发明中，“CDR”这一术语在制作人源化抗体时是指从非人哺乳动物的抗体中被移植到人源化抗体的区域或可被移植的区域。即，就CDR而言，即使是通常被视为FR的区域，只要其参与CDR的结构保持或与抗原的结合而被认为实质上具有决定抗体的互补性的功能，则在本发明中也包含在CDR中。
就本发明中的抗hTfR抗体而言，在通过静脉注射等将其给药于生物体内时，可以与存在于脑内的毛细血管的内皮细胞上的hTfR高效地结合。此外，与hTfR结合后的抗体通过胞吞作用、转胞吞作用等机制通过血脑屏障而被摄入脑内。因此，通过预先使BDNF与本发明的抗hTfR抗体结合，可以使BDNF高效地通过血脑屏障而到达脑内。此外，本发明的抗hTfR抗体在通过血脑屏障后可以到达大脑的脑实质、海马的神经元样细胞、小脑的浦肯野细胞等、或者至少到达这些中的任意一者。并且，还有望到达大脑的纹状体的神经元样细胞和中脑的黑质的神经元样细胞。因此，通过使BDNF与本发明的抗hTfR抗体结合，可以使其到达这些组织或细胞。
在使通常不能通过血脑屏障、因此静脉内给药时不能在脑内发挥功能的BDNF从血中到达脑内并在脑内发挥功能方面，使用抗hTfR抗体与BDNF的融合蛋白可能成为有效的手段。特别是本发明的抗hTfR抗体与BDNF的融合蛋白在通过血脑屏障后会到达大脑的脑实质、海马的神经元样细胞、小脑的浦肯野细胞等、或者至少到达这些中的任意一者。并且还有望到达大脑的纹状体的神经元样细胞和中脑的黑质的神经元样细胞。因此，通过将BDNF以与本发明的抗hTfR抗体分子结合的形态利用静脉内给药等进行血中给药，能够使BDNF的功能在这些脑的组织或细胞中发挥、强化。
在本说明书中，BDNF是1982年被Barde等发现、于1990年被Jones等克隆的公知蛋白质(EMBO J,(1982)1:549-553,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87:8060-8064)，作为一例，示出序列号51的人成熟BDNF的氨基酸序列，也可以是含有与其实质上一致的氨基酸序列的蛋白质、源自其它恒温动物(例如豚鼠、大鼠、小鼠、鸡、兔、狗、猪、绵羊、牛、猴等)的BDNF。
此外，在本说明书中，BDNF不仅包含表示人成熟BDNF的特定的氨基酸序列(序列号51)所示的“蛋白质”或“(多)肽”，而且只要与这些具有同一性质的功能则其同族体(同源物、剪接变体)、变异体、衍生物和氨基酸修饰体等也包含在BDNF中。
在此，“同一性质的功能”例如是指：从生理学或药理学上来看，其性质在定性上相同，功能的程度(例如约0.1～约10倍、优选为0.5～2倍)、蛋白质的分子量等定量要素可以不同。此外，将具有天然BDNF所具有的功能、例如(1)对BDNF受体(TrkB)的亲和力、(2)BDNF受体的磷酸化活性、(3)对神经细胞的增殖促进作用、(4)对神经细胞的生存维持作用、(5)对神经细胞的轴突延长作用的蛋白质、或者(6)可被特异性识别由序列号51的氨基酸序列构成的蛋白质的抗体识别的蛋白质视为与BDNF“具有同一性质的功能的蛋白质”。
上述的BDNF的功能可以用后述的“(2)BDNF的功能的评价方法”部分所记载的公知的各种评价方法、本说明书的实施例23之后记载的方法来考察。
在此，作为同源物，可以例示与人的蛋白质对应的小鼠、大鼠等其它生物种属的蛋白质，这些除了由Maisonpierre等(Genomics(1991)10:558-568)进行了报道的物质以外，也可以由UniProt所刊载的蛋白质的氨基酸序列(P21237-1、P23363-1、P25429-1、Q7YRB4-1、P14082-1、Q5IS78-1、Q95106-1)等推演地进行鉴定。此外，变异体包含天然存在的等位基因变异体、非天然存在的变异体、以及具有通过人为地缺失、置换、添加或插入而进行了改造的氨基酸序列的变异体。需要说明的是，作为上述变异体，可以列举与无变异的蛋白质或(多)肽至少70％、优选80％、更优选90％、更进一步优选95％、更加优选97％、特别优选98％、最优选99％同源的变异体。此外，氨基酸修饰体包含天然存在的氨基酸修饰体、非天然存在的氨基酸修饰体，具体可以列举氨基酸的磷酸化体。
进而，在本说明书中，“BDNF”可以是可发挥与BDNF同一性质的功能的上述BDNF的前躯体(prepro体)或从该前躯体中切除信号序列而得到的前体，其不仅包含表示人BDNF前躯体的特定的氨基酸序列(UniProt ID No.P23560-1)所示的“蛋白质”或“(多)肽”，而且只要与这些具有同一性质的功能则其同族体(同源物、剪接变体)、变异体、衍生物、前体和氨基酸修饰体等也包含在BDNF中。作为人BDNF的前体(前体BDNF)，可以列举序列号56的氨基酸序列。
在此，与BDNF前躯体同一性质的功能是指BDNF前躯体所具有的功能，例如可生成BDNF的前体(前体BDNF)或成熟BDNF的功能，与BDNF的前体同一性质的功能是指BDNF的前体所具有的功能，例如对p75受体的亲和力。
在此，作为人BDNF前躯体的剪接变体，可以列举UniProt所刊载的蛋白质的氨基酸序列(P23560-2、P23560-3、P23560-4、P23560-5)等。此外，编码这些人BDNF前躯体蛋白质的基因也是公知的，可以列举例如http://www.ncbi.nlm.nih.gov中刊载的基因的碱基序列(NM_001143805.1、NM_001143806.1、NM_001143807.1、NM_001143808.1、NM_001143809.1、NM_001143810.1、NM_001143811.1、NM_001143812.1、NM_001143813.1、NM_001143814.1、NM_001143816.1、NM_001709.4、NM_170731.4、NM_170732.4、NM_170733.3、NM_170734.3、NM_170735.5)等。
作为BDNF前躯体的同源物及其剪接变体，可以例示与人的蛋白质对应的小鼠、大鼠等其它生物种属的蛋白质及其剪接变体，这些可以由http://www.ncbi.nlm.nih.gov中刊载的基因的碱基序列(NM_001048139.1、NM_001048141.1、NM_001048142.1、NM_001285416.1、NM_001285417.1、NM_001285418.1、NM_001285419.1、NM_001285420.1、NM_001285421.1、NM_001285422.1、NM_007540.4等小鼠BDNF基因的碱基序列，NM_001270630.1、NM_001270631.1、NM_001270632.1、NM_001270633.1、NM_001270634.1、NM_001270635.1、NM_001270636.1、NM_001270637.1、NM_001270638.1、NM_012513.4等大鼠BDNF基因的碱基序列)等推演地进行鉴定。
此外，BDNF前躯体的变异体包含：天然存在的等位基因变异体、非天然存在的变异体、以及具有通过人为地缺失、置换、添加或插入而进行了改造的氨基酸序列的变异体。需要说明的是，作为上述变异体，可以列举与无变异的蛋白质或(多)肽至少70％、优选80％、更优选90％、进一步优选95％、另外进一步优选97％、特别优选98％、最优选99％同源的变异体。此外，氨基酸修饰体包含天然存在的氨基酸修饰体、非天然存在的氨基酸修饰体，具体可以列举氨基酸的磷酸化体。
作为序列号51的氨基酸序列或与其实质上一致的氨基酸序列，可以列举以下的(A)～(E)：
(A)序列号51的氨基酸序列，
(B)在序列号51的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、添加、插入或置换、并且具有与由序列号51的氨基酸序列构成的蛋白质同一性质的功能的、或者可被特异性识别由序列号51的氨基酸序列构成的蛋白质的抗体识别的氨基酸序列，
(C)与序列号51的氨基酸序列具有至少80％以上的同源性、并且具有与由序列号51的氨基酸序列构成的蛋白质同一性质的功能的、或者可被特异性识别由序列号51的氨基酸序列构成的蛋白质的抗体识别的氨基酸序列，
(D)由具有序列号50的碱基序列的DNA编码的氨基酸序列，或者
(E)由与相对于具有序列号50的碱基序列的DNA具有互补性的DNA在严格条件下杂交的DNA编码、并且具有与由序列号51的氨基酸序列构成的蛋白质同一性质的功能的、或者可被特异性识别由序列号51的氨基酸序列构成的蛋白质的抗体识别的氨基酸序列。
具体可以列举：由序列号51的氨基酸序列构成的人蛋白质在其它哺乳动物中的直向同源物的氨基酸序列、或者由序列号51的氨基酸序列构成的人蛋白质或其直向同源物在剪接变体、等位基因变异体或多态性变体中的氨基酸序列。
在此，“同源性”是指：使用该技术领域中公知的数学算法对2个氨基酸序列进行比对时，最佳的比对(优选的是，该算法为了进行最佳的比对可考虑向一个或两个序列中引入空位)中一致氨基酸和类似氨基酸残基相对于发生重叠的全部氨基酸残基的比例(％)。“类似氨基酸”是指物理化学性质类似的氨基酸，可以列举例如被分类在芳香族氨基酸(Phe、Trp、Tyr)、脂肪族氨基酸(Ala、Leu、Ile、Val)、极性氨基酸(Gln、Asn)、碱性氨基酸(Lys、Arg、His)、酸性氨基酸(Glu、Asp)、具有羟基的氨基酸(Ser、Thr)等中的同一组中的氨基酸。利用这样的类似氨基酸进行的置换有望不引起蛋白质的表型变化(即，保守性氨基酸置换)。
本说明书中的氨基酸序列的同源性可以使用同源性计算算法NCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment SearchTool)在以下的条件(期望值＝10；允许空位；matrix＝BLOSUM62；filtering＝OFF)下进行计算。作为用于确定氨基酸序列的同源性的其它算法，可以列举例如：Karlin等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:5873-5877(1993)中记载的算法[该算法已整合到NBLAST和XBLAST程序(version 2.0)中(Altschul等，Nucleic Acids Res.,25:3389-3402(1997))]，Needleman等,J.Mol.Biol.,48:444-453(1970)中记载的算法[该算法已整合到GCG软件包中的GAP程序中]，Myers和Miller,CABIOS,4:11-17(1988)中记载的算法[该算法已整合到作为CGC序列比对软件包的一部分的ALIGN程序(version 2.0)中]，Pearson等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:2444-2448(1988)中记载的算法[该算法已整合到GCG软件包中的FASTA程序中]等，这些也可同样优选使用。
上述(E)中的严格条件可以列举：例如Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,6.3.1-6.3.6,1999中记载的条件，例如6×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)/45℃下的杂交，然后以0.2×SSC/0.1％SDS/50～65℃下洗涤一次以上等，本领域技术人员可以适当选择可提供与上述同等的严格性的杂交条件。
更优选的是，作为“与序列号51的氨基酸序列实质上一致的氨基酸序列”，可以列举：与序列号51的氨基酸序列具有约70％以上、优选约80％以上、更优选约90％以上、进一步优选约95％以上、另外进一步优选约97％以上、特别优选约98％以上、最优选约99％以上的一致性的氨基酸序列。
作为本发明中的蛋白质：BDNF，还包含例如含有下述氨基酸序列的蛋白质等所谓的突变体：
(i)序列号51的氨基酸序列中的1～30个、优选为1～20个、更优选为1～10个、进一步优选为1～数(6、5、4、3或2)个氨基酸发生了缺失的氨基酸序列，
(ii)在序列号51的氨基酸序列中添加了1～30个、优选为1～20个、更优选为1～10个、进一步优选为1～数(6、5、4、3或2)个氨基酸的氨基酸序列，
(iii)在序列号51的氨基酸序列中插入了1～30个、优选为1～20个、更优选为1～10个、进一步优选为1～数(6、5、4、3或2)个氨基酸的氨基酸序列，
(iv)序列号51的氨基酸序列中的1～30个、优选为1～20个、更优选为1～10个、进一步优选为1～数(6、5、4、3或2)个氨基酸被其它氨基酸置换的氨基酸序列，或者
(v)对上述进行组合而成的氨基酸序列。
在如上述那样发生氨基酸序列的插入、缺失、添加或置换时，该插入、缺失、添加或置换的位置只要使施加了这种变更的蛋白质具有与由序列号51的氨基酸序列构成的蛋白质同一性质的功能、或者可被特异性识别由序列号51的氨基酸序列构成的蛋白质的抗体识别，则没有特别限定。例如，除了由序列号51的氨基酸序列构成的成熟BDNF以外，在其N末端添加了甲硫氨酸的Met-BDNF等只要具有与由序列号51的氨基酸序列构成的蛋白质同一性质的功能，则也可作为BDNF用于本发明的融合蛋白中。
在此，作为人为地进行氨基酸的缺失、添加、插入或置换时的方法，可以列举例如：对编码序列号51的氨基酸序列的DNA实施惯用的位点特异性突变的引入、然后通过常规方法使该DNA表达的方法。在此，作为位点特异性突变的引入方法，可以列举例如：利用琥珀突变的方法(缺口双链法，Nucleic Acids Res.,12,9441-9456(1984))、基于使用了突变引入用引物的PCR的方法等。
作为BDNF的优选例子，可以列举例如：由序列号51的氨基酸序列构成的人蛋白质、或者其等位基因变异体或多态性变体等。
“编码BDNF的基因”表示具有编码氨基酸序列的碱基序列的基因，所述氨基酸序列是指上述(A)～(E)所示的、序列号51的氨基酸序列或与其实质上一致的氨基酸序列。具体可以列举具有以下(F)～(J)的碱基序列的基因：
(F)编码序列号51的氨基酸序列的碱基序列，
(G)编码如下氨基酸序列的碱基序列：在序列号51的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、添加、插入或置换、并且具有与由序列号51的氨基酸序列构成的蛋白质同一性质的功能的、或者可被特异性识别由序列号51的氨基酸序列构成的蛋白质的抗体识别的氨基酸序列，
(H)编码如下氨基酸序列的碱基序列：与序列号51的氨基酸序列具有至少80％以上的同源性、并且具有与由序列号51的氨基酸序列构成的蛋白质同一性质的功能的、或者可被特异性识别由序列号51的氨基酸序列构成的蛋白质的抗体识别的氨基酸序列，
(I)编码如下氨基酸序列的碱基序列：由具有序列号50的碱基序列的DNA编码的氨基酸序列，或者
(J)编码如下氨基酸序列的碱基序列：由与相对于具有序列号50的碱基序列的DNA具有互补性的DNA在严格条件下杂交的DNA编码、并且具有与由序列号51的氨基酸序列构成的蛋白质同一性质的功能的、或者可被特异性识别由序列号51的氨基酸序列构成的蛋白质的抗体识别的氨基酸序列。
需要说明的是，在此，基因可以为cDNA或基因组DNA等DNA、或者mRNA等RNA中的任意一种，并且是同时包含单链核酸序列和双链核酸序列的概念。此外，在本说明书中，为了方便起见，将序列号2、序列号24、序列号26、序列号28、序列号30、序列号38、序列号40、序列号50、序列号53、序列号55、序列号58、序列号64等所示的核酸序列以DNA序列的形式记载，但在表示mRNA等RNA序列时，将胸腺嘧啶(T)解读为尿嘧啶(U)。
此外，作为本发明中使用的BDNF，可以是用聚乙二醇(PEG)等具有蛋白质稳定化作用的分子等进行了修饰的衍生物等(Drug Delivery System(1998)；13:173-178)。
作为本发明中的抗hTfR抗体与人BDNF的融合蛋白的一例，可以列举在构成抗hTfR抗体的“重链”的C末端侧通过接头序列融合有人BDNF的类型的融合蛋白。作为这样的融合蛋白，可以例示：
(1)人源化抗hTfR抗体的轻链含有序列号23的氨基酸序列、并且人源化抗hTfR抗体的重链在其C末端侧通过由氨基酸序列Gly-Ser构成的接头与人BDNF结合、由此含有序列号52的氨基酸序列的融合蛋白；以及
(2)人源化抗hTfR抗体的轻链含有序列号23的氨基酸序列、并且人源化抗hTfR抗体的重链在其C末端侧通过接头与人BDNF结合、由此含有序列号54的氨基酸序列的融合蛋白，所述接头由在氨基酸序列Gly-Ser之后连接5个氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号3)而成的共计27个氨基酸构成。
上述(1)以及(2)记载的融合蛋白为：
(1)含有具有序列号23的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的轻链、和在具有序列号70的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的重链的C末端侧通过由氨基酸序列Gly-Ser构成的接头结合有具有序列号51的氨基酸序列的人BDNF的结构的融合蛋白；以及
(2)含有具有序列号23的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的轻链、和在具有序列号70的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体的重链的C末端侧通过接头结合有具有序列号51的氨基酸序列的人BDNF的结构的融合蛋白，所述接头由在氨基酸序列Gly-Ser之后连接有5个氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号3)而成的共计27个氨基酸构成。
需要说明的是，上述(1)和(2)中，可以将人源化抗hTfR抗体的重链由具有序列号70的氨基酸序列的重链置换为具有序列号72的氨基酸序列的重链。具有序列号70和72的氨基酸序列的抗体分别为IgG1型和IgG4型的抗体。作为编码具有序列号70的氨基酸序列的重链的碱基序列可以例示序列号71所示的碱基序列，作为编码具有序列号72的氨基酸序列的重链的碱基序列可以例示序列号76所示的碱基序列。
这样的融合蛋白例如可以通过用如下表达载体转化哺乳动物细胞等宿主细胞并培养该宿主细胞而制造，所述表达载体为：整合有具有编码序列号52的氨基酸序列的碱基序列(序列号53)的DNA片段的表达载体、和整合有具有编码具有序列号23的氨基酸序列的抗hTfR抗体轻链的碱基序列(序列号24)的DNA片段的表达载体。或者，通过用如下表达载体转化哺乳动物细胞等宿主细胞并培养该宿主细胞而制造，所述表达载体为：整合有具有编码序列号54的氨基酸序列的碱基序列(序列号55)的DNA片段的表达载体、和整合有具有编码具有序列号23的氨基酸序列的抗hTfR抗体轻链的碱基序列(序列号24)的DNA片段的表达载体。
作为与人BDNF结合的抗hTfR抗体的1个优选的实施方式，可以列举该抗体的抗原结合性片段，具体可以列举单链抗体、Fab、F(ab’)和F(ab’)2等。
作为抗hTfR抗体为单链抗体时的、本发明的人源化抗hTfR抗体与人BDNF的融合蛋白的具体实施方式的一例，可以例示：由序列号59或60的氨基酸序列构成的融合蛋白，即，在人BDNF的C末端侧通过第1接头序列结合了单链抗体的融合蛋白，其中，所述第1接头序列由在氨基酸序列Gly-Ser之后连接有5个氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号3)而成的共计27个氨基酸构成。在此，该单链抗体是具有序列号57的氨基酸序列的单链抗体，即，在具有序列号69的氨基酸序列的重链的可变区的C末端通过第2接头序列结合了具有序列号18的氨基酸序列的轻链的可变区的单链抗体，其中，所述第2接头序列由3个氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号3)连接而成的共计15个氨基酸构成。因此，作为抗hTfR抗体为单链抗体时的、本发明的人源化抗hTfR抗体与人BDNF的融合蛋白的具体实施方式的一例，可以列举：在含有具有序列号69的氨基酸序列的重链可变区和具有序列号18的氨基酸序列的轻链可变区的单链抗体的N末端侧直接或通过接头结合了人BDNF的融合蛋白。
抗hTfR抗体为单链抗体的这种融合蛋白，例如可以通过用整合有具有编码序列号59的氨基酸序列的碱基序列(序列号58)的DNA片段的表达载体转化哺乳动物细胞等宿主细胞并培养该宿主细胞而制造。
作为抗hTfR抗体为单链抗体时本发明的人源化抗hTfR抗体与人BDNF的融合蛋白的其他具体方式的一例，可列举：于具有序列号61所记载的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体号3N的Fab重链的C末端侧、通过如下接头结合具有序列号23所记载的氨基酸序列的抗hTfR抗体轻链而成的融合蛋白，该融合蛋白为在具有序列号90所记载的氨基酸序列的单链抗体上结合有人BDNF的融合蛋白，所述接头由在序列号3所示的氨基酸序列连续6次而形成的氨基酸序列上连接氨基酸序列Gly-Gly而得到的32个氨基酸构成。人BDNF可结合至该单链抗体的C末端侧或N末端侧的任一侧，优选为N末端侧。而且，人BDNF可直接或通过接头结合至该单链抗体。
需要说明的是，在本发明中，当1个肽链中含有多个接头序列时，为了方便，将各接头序列从N末端侧起依次称为第1接头序列、第2接头序列。
作为抗hTfR抗体为Fab时的、本发明的人源化抗hTfR抗体与人BDNF的融合蛋白的具体实施方式的一例，可以列举：在人BDNF的C末端侧通过接头序列融合了含有抗hTfR抗体重链的可变区和CH1区域的区域的融合蛋白，其中，所述接头序列由5个氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号3)连接而成的共计25个氨基酸构成。此时，除了CH1区域以外还可以含有铰链区的一部分，但该铰链区不含用于形成重链间的二硫键的半胱氨酸残基。序列号63和65所示的融合蛋白为其优选的一例。序列号63所示的融合蛋白包含序列号56所示的人的前体BDNF的氨基酸序列，序列号65所示的融合蛋白包含序列号51所示的人的成熟BDNF的氨基酸序列。
序列号63和65中的抗hTfR抗体Fab重链的氨基酸序列与序列号70所示的人源化抗hTfR抗体的重链的氨基酸序列的N末端起第1位～第226位的部分相当，由序列号61的氨基酸序列构成。需要说明的是，序列号61的N末端起第1位～第118位的部分相当于可变区(序列号69)，第119位～第216位的部分与CH1区域相当，第217位～第226位的部分与铰链区相当。作为抗hTfR抗体为Fab时的、本发明的人源化抗hTfR抗体与人BDNF的融合蛋白的具体实施方式的一例，可以列举在人源化抗hTfR抗体的Fab、F(ab’)2或F(ab’)中的任一重链的N末端侧直接或通过接头结合了人BDNF的融合蛋白作为优选的一个实施方式。
作为抗hTfR抗体为Fab时的、本发明的人源化抗hTfR抗体与人BDNF的融合蛋白的具体实施方式的一例，可以列举：轻链由序列号23的氨基酸序列构成、并且重链为由序列号61的氨基酸序列构成的Fab重链且在该重链的N末端侧直接或通过接头结合了人BDNF的融合蛋白。更具体而言，可以列举：
(1)轻链由序列号23的氨基酸序列构成、并且由Fab重链和通过接头结合在其N末端侧的人前体BDNF构成的部分由序列号63的氨基酸序列构成的融合蛋白；以及
(2)轻链由序列号23的氨基酸序列构成、并且由Fab重链和通过接头结合在其N末端侧的人BDNF构成的部分由序列号65的氨基酸序列构成的融合蛋白。
抗hTfR抗体为Fab的这种融合蛋白，例如也可以通过用表达载体转化哺乳动物细胞等宿主细胞并培养该宿主细胞而制造，所述表达载体为：整合有具有编码序列号63的氨基酸序列的碱基序列(序列号62)的DNA片段的表达载体、和整合有具有编码具有序列号23的氨基酸序列的抗hTfR抗体轻链的碱基序列(序列号24)的DNA片段的表达载体。
抗hTfR抗体为Fab的这种融合蛋白，例如也可以通过用表达载体转化哺乳动物细胞等宿主细胞并培养该宿主细胞而制造，所述表达载体为：整合有具有编码序列号65的氨基酸序列的碱基序列(序列号64)的DNA片段的表达载体、和整合有具有编码具有序列号23的氨基酸序列的抗hTfR抗体轻链的碱基序列(序列号24)的DNA片段的表达载体。
需要说明的是，在向人BDNF(hBDNF)中引入变异而在C末端或N末端添加了氨基酸的情况下，如果该添加的氨基酸在使hBDNF与抗hTfR抗体融合时位于hBDNF与抗hTfR抗体之间，则该添加的氨基酸构成接头的一部分。
作为使抗hTfR抗体与BDNF结合的方法，有通过非肽接头或肽接头使其结合的方法。作为非肽接头，可以使用聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇与丙二醇的共聚物、多氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖类、葡聚糖、聚乙烯基醚、生物降解性高分子、脂质聚合物、壳多糖类和透明质酸、或者这些的衍生物，或者将这些组合使用。肽接头为由形成了肽键的1～50个氨基酸构成的肽链或其衍生物，其N末端和C末端分别与抗hTfR抗体或BDNF中的任意一者形成共价键，从而将抗hTfR抗体与BDNF结合。
使用作为非肽接头的PEG使本发明的抗hTfR抗体与BDNF结合而成的融合蛋白特指抗hTfR抗体-PEG-BDNF。抗hTfR抗体-PEG-BDNF可以如下制造：使抗hTfR抗体与PEG结合而制作抗hTfR抗体-PEG，然后使抗hTfR抗体-PEG与BDNF结合。或者，抗hTfR抗体-PEG-BDNF还可以如下制造：使BDNF与PEG结合而制作BDNF-PEG，然后使BDNF-PEG与抗hTfR抗体结合。在使PEG与抗hTfR抗体和BDNF结合时，可使用利用碳酸酯、羰基咪唑、羧酸的活性酯、吖内酯、环状亚胺硫酮、异氰酸酯、异硫氰酸酯、亚氨酸酯或醛等的官能团修饰后的PEG。这些被导入到PEG中的官能团主要通过与抗hTfR抗体和BDNF分子内的氨基反应而使PEG与hTfR抗体和BDNF形成共价键。对于此时使用的PEG的分子量和形状没有特别限定，其平均分子量(MW)优选为MW＝500～60000，更优选为MW＝500～20000。例如，平均分子量为约300、约500、约1000、约2000、约4000、约10000、约20000等的PEG可以优选作为非肽接头使用。
例如，抗hTfR抗体-PEG如下得到：将抗hTfR抗体与醛基改性PEG(ALD-PEG-ALD)按照该改性PEG相对于该抗体的摩尔比达到11、12.5、15、110、120等的方式混合，向其中添加NaCNBH3等还原剂而使其反应，从而得到。然后，使抗hTfR抗体-PEG在NaCNBH3等还原剂存在下与BDNF反应，从而得到抗hTfR抗体-PEG-BDNF。相反，通过先使BDNF与ALD-PEG-ALD结合而制作BDNF-PEG、然后使BDNF-PEG与抗hTfR抗体结合，也可以得到抗hTfR抗体-PEG-BDNF。
BDNF由于其二聚体与位于靶细胞表面上的高亲和性BDNF受体结合，因此被认为以二聚体形式发挥作用，但与抗hTfR抗体结合的BDNF可以是1分子也可以是2分子。例如，可以使在抗hTfR抗体上结合1分子BDNF而成的融合蛋白与BDNF反应而形成二聚体，也可以形成使2分子BDNF结合在抗hTfR抗体上的融合蛋白。此外，该结合既可以如下所示地将编码抗hTfR抗体和BDNF的DNA整合到表达载体中而得到，也可以通过在分别制造抗hTfR抗体和BDNF后进行化学结合而制作。具体而言，可以通过在抗hTfR抗体的重链或轻链的C末端侧或N末端侧通过接头序列或直接地利用肽键分别结合BDNF的N末端或C末端，从而使抗hTfR抗体和BDNF一体化。作为BDNF与抗hTfR抗体的融合蛋白的1个优选的实施方式，可以列举：在抗hTfR抗体的重链或轻链的N末端侧通过接头序列或直接地结合BDNF的C末端而得到的融合蛋白。
如前所述，作为与人BDNF结合的抗hTfR抗体的1个优选的实施方式，可以列举该抗体的抗原结合性片段，具体可以列举单链抗体、Fab、F(ab’)和F(ab’)2。因此，作为BDNF与抗hTfR抗体的融合蛋白的1个优选的实施方式，可以例示以下的融合蛋白。
(1)BDNF与抗hTfR抗体的融合蛋白，其中，该抗hTfR抗体为抗原结合性片段，在该抗原结合性片段的N末端侧直接或通过接头结合有人BDNF。
(2)BDNF与抗hTfR抗体的融合蛋白，其中，该抗hTfR抗体为单链抗体，在该单链抗体的N末端侧直接或通过接头结合有人BDNF。
(3)BDNF与抗hTfR抗体的融合蛋白，其中，该抗hTfR抗体为Fab、F(ab’)2或F(ab’)中的任意一种，在这些Fab、F(ab’)2或F(ab’)的重链或轻链的N末端侧直接或通过接头结合有人BDNF。
在此，在上述(3)的情况下，可以使人BDNF特别优选地与抗hTfR抗体的Fab、F(ab’)2或F(ab’)中的任意一者的重链的N末端侧结合。因此，更具体而言，可以例示以下的融合蛋白。
(4)BDNF与抗hTfR抗体的融合蛋白，其中，该抗hTfR抗体为Fab、F(ab’)2或F(ab’)中的任意一种，在这些Fab、F(ab’)2或F(ab’)的重链的N末端侧直接或通过接头结合有人BDNF。
融合蛋白中的抗hTfR抗体为Fab的形态时，也可以制作在其中进一步导入有另外的IgG的Fc区的形态的新的融合蛋白。由此，与原来的融合蛋白相比，可提高在血中等生物体内的稳定性。作为包含Fc区的此种融合蛋白，例如可列举：在人BDNF的C末端侧直接或通过接头序列结合人IgG Fc区、继而在其C末端侧直接或通过接头序列结合该抗hTfR抗体的Fab重链而成的融合蛋白。
人BDNF与人IgG Fc区之间的接头序列优选为由1～50个氨基酸构成。在此，氨基酸的个数可适当调整为1～17个、1～10个、10～40个、20～34个、23～31个、25～29个、27个等。对于这样的接头序列，其氨基酸序列并无限定，优选由甘氨酸与丝氨酸构成。例如可列举包含如下序列的接头序列：由甘氨酸或丝氨酸中的任一个氨基酸构成的序列、氨基酸序列Gly-Ser、氨基酸序列Gly-Gly-Ser、氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号3)、氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号4)、氨基酸序列Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(序列号5)、或者这些氨基酸序列1～10个或2～5个连结而成的由50个以下的氨基酸构成的序列、这些氨基酸序列1～10个或2～5个连结而成的由2～17个、2～10个、10～40个、20～34个、23～31个、25～29个、或25个氨基酸构成的序列等。例如，包含由5个氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号3)接连而成的共计25个氨基酸的序列可适宜地用作接头序列。关于人IgG Fc区与Fab重链之间的接头序列也相同。
而且，在制作包含人IgG Fc区的融合蛋白时，人IgG Fc区可结合于原本的抗hTfR抗体的重链和轻链的任意一者。而且，原本的抗体也可以为包括Fab、F(ab')2、F(ab')、及单链抗体的任意一种抗原结合性片段。
所导入的人IgG Fc区的IgG的类型并无特别限定，可为IgG1～IgG5的任一种。而且，所导入的人IgG Fc区可为Fc区的整体，也可以为其一部分。作为该人IgG Fc区的优选的一实施方式，可列举作为人IgG1的Fc的整个区域的具有序列号75所示的氨基酸序列的人IgG Fc区。Fc区优选以从N末端侧开始依次为BDNF、Fc区及Fab重链的方式导入。例如，作为导入有Fc区的融合蛋白，可列举在BDNF的C末端侧通过接头序列结合有Fc区的整体并且在其C末端侧通过接头序列结合有抗hTfR抗体的重链Fab的、包含序列号74所示的氨基酸序列的融合蛋白作为一例。
抗hTfR抗体与hBDNF的融合蛋白(抗hTfR抗体-hBDNF融合蛋白)也可以以具有对白蛋白的亲和性的方式进行改造。该改造例如可通过在抗hTfR抗体-hBDNF融合蛋白中导入对白蛋白具有亲和性的物质(例如，对于白蛋白具有亲和性的化合物、肽及蛋白质等)来进行。实施了该改造的抗hTfR抗体-hBDNF融合蛋白(改造融合蛋白)与白蛋白结合而在血中循环。白蛋白具有使与其结合的蛋白质稳定的功能。因此，改造融合蛋白给药至生物体内时，在血中的半衰期变长，因此可强化其药效。以具有对白蛋白的亲和性的方式进行改造在如下情形时更具效果，即抗hTfR抗体-hBDNF融合蛋白中的抗hTfR抗体为欠缺有助于抗体的稳定性的Fc区的抗体的情形、例如为Fab的情形。
而且，在抗hTfR抗体-hBDNF融合蛋白给药至生物体内时显示出免疫原性这样的情况下，以具有对白蛋白的亲和性的方式进行改造也是有效的。通过使改造融合蛋白与白蛋白结合，抗hTfR抗体-hBDNF融合蛋白中的显示出免疫原性的部位向免疫细胞的提呈受到抑制，因此能够降低免疫原性。
在抗hTfR抗体-hBDNF融合蛋白中导入具有对于白蛋白的亲和性的物质的情况下，供导入该物质的部分可为抗hTfR抗体的轻链、抗hTfR抗体的重链、hBDNF、及接头部分中的任意一者，也可以在它们中的两个以上的部分导入。
作为对于白蛋白具有亲和性的肽或蛋白质，例如可使用具有序列号85所示的氨基酸序列的、对源自链球菌菌株(Streptococcus strain)G418的蛋白质的白蛋白结合结构域(Alm T.Biotechnol J.5.605-17(2010))以显示出碱耐性的方式进行了改造而成的肽，但并不限定于此。作为使对于白蛋白具有亲和性的肽或蛋白质(白蛋白亲和性肽)与抗hTfR抗体-hBDNF融合蛋白结合的方法，有通过非肽接头或肽接头而结合的方法。作为非肽接头，可使用聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇与丙二醇的共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖类、葡聚糖、聚乙烯醚、生物降解性高分子、脂质聚合物、甲壳素类、及透明质酸、或者它们的衍生物、或它们的组合。肽接头是由肽键结合的1～50个氨基酸所构成的肽链或其衍生物，通过在其N末端和C末端分别与白蛋白亲和性肽或融合蛋白的任一者形成共价键，由此使白蛋白亲和性肽与融合蛋白结合。
将使用PEG作为非肽接头而使白蛋白亲和性肽与抗hTfR抗体-hBDNF融合蛋白结合而成的物质特别称为白蛋白亲和性肽-PEG-融合蛋白。白蛋白亲和性肽-PEG-融合蛋白可通过使白蛋白亲和性肽与PEG结合而制作白蛋白亲和性肽-PEG，继而使白蛋白亲和性肽-PEG与抗hTfR抗体-hBDNF融合蛋白结合而制造。或者，白蛋白亲和性肽-PEG-融合蛋白也可以通过使抗hTfR抗体-hBDNF融合蛋白与PEG结合而制作抗hTfR抗体-hBDNF融合蛋白-PEG，继而使抗hTfR抗体-hBDNF融合蛋白-PEG与白蛋白亲和性肽结合而制造。在使PEG与白蛋白亲和性肽及抗hTfR抗体-hBDNF融合蛋白结合时，可使用经碳酸酯、羰基咪唑、羧酸的活性酯、吖内酯、环状酰亚胺硫酮、异氰酸酯、异硫氰酸酯、酰亚胺酯、或醛等官能基修饰的PEG。这些导入至PEG的官能基主要与白蛋白亲和性肽及抗hTfR抗体-hBDNF融合蛋白分子内的氨基进行反应，由此PEG与白蛋白亲和性肽及抗hTfR抗体-hBDNF融合蛋白进行共价键结合。此时所使用的PEG的分子量及形状并无特别限定，其平均分子量(MW)优选为MW＝500～60000，更优选为MW＝500～20000。例如，平均分子量为约300、约500、约1000、约2000、约4000、约10000、约20000等的PEG可适宜地用作非肽接头。
例如，白蛋白亲和性肽-PEG可通过将白蛋白亲和性肽与醛基改性PEG(ALD-PEG-ALD)以该改性PEG相对于该白蛋白亲和性肽的摩尔比成为11、12.5、15、110、120等的方式进行混合，向其中添加NaCNBH3等还原剂并进行反应而获得。继而，使白蛋白亲和性肽-PEG在NaCNBH3等还原剂的存在下与抗hTfR抗体-hBDNF融合蛋白进行反应，由此可获得白蛋白亲和性肽-PEG-融合蛋白。也可以反过来首先使抗hTfR抗体-hBDNF融合蛋白与ALD-PEG-ALD结合而制作抗hTfR抗体-hBDNF融合蛋白-PEG，继而使抗hTfR抗体-hBDNF融合蛋白-PEG与白蛋白亲和性肽结合，由此获得白蛋白亲和性肽-PEG-融合蛋白。
也可以使抗hTfR抗体-hBDNF融合蛋白与白蛋白亲和性肽融合。该融合蛋白(抗hTfR抗体-hBDNF-白蛋白亲和性肽)可通过如下方式获得：将在编码抗hTfR抗体-hBDNF融合蛋白的重链或轻链的cDNA的3'末端侧或5'末端侧直接或通过编码接头序列的DNA片段以框内方式配置编码白蛋白亲和性肽的cDNA而成的DNA片段整合入哺乳动物细胞用表达载体中，对导入有该表达载体的哺乳动物细胞进行培养。在使编码白蛋白亲和性肽的DNA片段与重链(或重链与hBDNF的融合蛋白)结合的情形时，将整合有编码构成抗hTfR抗体的轻链与hBDNF的融合蛋白轻链(或轻链)的cDNA片段的哺乳动物细胞用表达载体也一并导入至相同宿主细胞中，而且，在使编码白蛋白亲和性肽的DNA片段与轻链(或轻链与hBDNF的融合蛋白)结合的情形时，将整合有编码抗hTfR抗体的重链与hBDNF的融合蛋白(或重链)的cDNA片段的哺乳动物细胞用表达载体也一并导入至同一宿主细胞中。即，白蛋白亲和性肽可结合至抗hTfR抗体-hBDNF融合蛋白的重链(包括重链与hBDNF的融合蛋白)或轻链(包括轻链与hBDNF的融合蛋白)的N末端侧或C末端侧的任意一者，但在使hBDNF结合至抗hTfR抗体的重链的N末端侧的情形时，优选结合至抗hTfR抗体的C末端侧，特别优选结合至重链的C末端侧。例如，作为导入有白蛋白亲和性肽的融合蛋白，可列举在人BDNF的C末端侧直接或通过接头序列结合有抗体的重链、并且在该重链的C末端侧直接或通过接头序列结合有白蛋白亲和性肽而形成的融合蛋白作为一例。
在使抗hTfR抗体-hBDNF融合蛋白与白蛋白亲和性肽融合的情况下，可直接或通过接头序列而融合。在此，接头序列优选由1～50个氨基酸构成。此处，氨基酸的个数可以适当调整为1～17个、1～10个、10～40个、20～34个、23～31个、25～29个、27个等。这样的接头序列并不限定于该氨基酸序列，优选为由甘氨酸与丝氨酸构成的序列。例如可列举包含以下序列的接头序列：由甘氨酸或丝氨酸的任意一个氨基酸构成的序列、氨基酸序列Gly-Ser、氨基酸序列Gly-Gly-Ser、氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号3)、氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号4)、氨基酸序列Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(序列号5)、或1～10个或2～5个这些氨基酸序列连结而成的由50个以下的氨基酸构成的序列、1～10个或2～5个这些氨基酸序列连结而成的由2～17个、2～10个、10～40个、20～34个、23～31个、25～29个、或25个氨基酸构成的序列等。例如，包含3个氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号3)接连而成的共计15个氨基酸的序列可适宜地用作接头序列。
作为导入有白蛋白亲和性肽的抗hTfR抗体-hBDNF融合蛋白的一例，有如下融合蛋白：在具有序列号56所示的氨基酸序列的hBDNF前体的C末端侧，通过由序列号3所示的氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser反复5次的共计25个氨基酸构成的接头序列，融合有具有与序列号61所示的氨基酸序列的第1位至第216位对应的氨基酸序列(序列号84)的人源化抗hTfR抗体3NFab重链，进而于其C末端侧通过由序列号3所示的氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser反复3次的共计15个氨基酸构成的接头序列而融合有序列号85所示的白蛋白结合结构域(ABD)的融合蛋白。
关于导入有白蛋白亲和性肽的抗hTfR抗体-hBDNF融合蛋白与白蛋白的结合亲和性，在通过实施例7所记载的生物膜层干涉法进行测定时，优选为1×10-7M以下，更优选为5×10-7M以下，进一步优选为1×10-8M以下，更进一步优选为1×10-9M以下。
Fab抗体也可以通过导入Fc区或白蛋白亲和性肽以外的方法而在血中稳定。例如，Fab抗体可通过对Fab抗体本身、或Fab抗体与其他蛋白质的融合体进行PEG修饰而稳定。该方法在蛋白质医药的领域中广泛地实施，经PEG化的红细胞生成素、干扰素等作为医药品得到实用化。而且，Fab抗体也可以通过对其导入突变而稳定化。例如，可通过将轻链的自N末端侧起第4位的甲硫氨酸置换为亮氨酸而使Fab抗体稳定。但是，突变的导入方法并不限定于此，也可以对重链导入突变。而且，Fab抗体的稳定方法并不限定于这些，可应用众所周知的全部方法。
就构成抗hTfR抗体的“轻链”的N末端侧结合有BDNF这样类型的融合蛋白而言，抗人转铁蛋白受体抗体包含含有轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列和含有重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列，BDNF结合在轻链的N末端侧。在此，抗hTfR抗体的轻链与BDNF既可以直接结合也可以通过接头结合。
就构成抗hTfR抗体的“重链”的N末端侧结合有BDNF这样类型的融合蛋白而言，抗人转铁蛋白受体抗体包含含有轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列和含有重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列，BDNF结合在重链的N末端侧。在此，抗hTfR抗体的重链与BDNF既可以直接结合也可以通过接头结合。
对于在构成抗hTfR抗体的“轻链”的C末端侧结合有BDNF的类型的融合蛋白，抗人转铁蛋白受体抗体含有包含轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列、以及包含重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列，BDNF结合于轻链的C末端侧。此处，抗hTfR抗体的轻链与BDNF可直接结合，也可以通过接头结合。
对于在构成抗hTfR抗体的“重链”的C末端侧结合有BDNF的类型的融合蛋白，抗人转铁蛋白受体抗体含有包含轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列、以及包含重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列，BDNF结合于重链的C末端侧者。此处，抗hTfR抗体的重链与BDNF可直接结合，也可以通过接头结合。
这样的抗hTfR抗体与BDNF的融合蛋白可以通过将DNA片段整合到哺乳动物细胞用表达载体中并培养导入了该表达载体的哺乳动物细胞而得到，所述DNA片段是在编码抗hTfR抗体的重链或轻链的cDNA的3’末端侧或5’末端侧直接或通过编码接头序列的DNA片段以框内方式配置编码BDNF的cDNA(序列号50)而成的DNA片段。在使编码BDNF的DNA片段与重链结合时，将整合有编码构成抗hTfR抗体的轻链的cDNA片段的哺乳动物细胞用表达载体也一并导入到同一宿主细胞中，此外，在使编码BDNF的DNA片段与轻链结合时，将整合有编码抗hTfR抗体的重链的cDNA片段的哺乳动物细胞用的表达载体也一并导入到同一宿主细胞中。
在此，在哺乳动物细胞中，将整合有编码在抗hTfR抗体的重链(或轻链)的C末端直接或通过接头序列结合BDNF而成的融合蛋白的cDNA片段的哺乳动物细胞用表达载体、和整合有编码抗hTfR抗体的轻链(或重链)的cDNA片段的哺乳动物细胞用表达载体一并导入到同一宿主细胞中，由此，可以制作由在抗hTfR抗体的重链(或轻链)的C末端侧结合了BDNF的融合蛋白、和抗hTfR抗体的重链(或轻链)构成的融合蛋白。
此外，通过将整合有编码在抗hTfR抗体的重链(或轻链)的N末端直接或通过接头序列结合BDNF而成的融合蛋白的cDNA片段的哺乳动物细胞用表达载体、和整合有编码抗hTfR抗体的轻链(或重链)的cDNA片段的哺乳动物细胞用表达载体导入到同一宿主细胞中，还可以制作由在抗hTfR抗体的重链(或轻链)的N末端侧结合BDNF而成的融合蛋白、和抗hTfR抗体的轻链(重链)构成的融合蛋白。
抗hTfR抗体为单链抗体时，抗hTfR抗体与BDNF结合而成的融合蛋白可以通过将DNA片段整合到哺乳动物细胞、酵母等真核生物或大肠杆菌等原核生物细胞用的表达载体中并使其在与导入有该表达载体的细胞所对应的细胞中表达而得到，所述DNA片段是在编码BDNF的cDNA的5’末端或3’末端直接或通过编码接头序列的DNA片段连接编码单链抗hTfR抗体的cDNA而得到的DNA片段。
抗hTfR抗体为Fab时，抗hTfR抗体与BDNF结合而成的融合蛋白可以通过将表达载体导入到同一宿主细胞中并使其在细胞中表达而得到，所述表达载体为：整合有在编码BDNF的cDNA的5’末端或3’末端直接或通过编码接头序列的DNA片段连接编码该Fab的重链和轻链中的任意一者的cDNA片段而成的DNA片段的表达载体(哺乳动物细胞、酵母等真核生物或大肠杆菌等原核生物细胞用)、和整合有编码该Fab重链和轻链中的另一者的cDNA片段的表达载体。
在抗hTfR抗体与BDNF之间配置接头序列时，接头序列优选由1～50个氨基酸构成。在此，氨基酸的个数可适当调整为1～17个、1～10个、10～40个、20～34个、23～31个、25～29个、27个等。这种接头序列只要其所连接的抗hTfR抗体可保持与hTfR的亲和性、且所连接的BDNF在生理条件下可发挥其生理活性，则对其氨基酸序列没有限定，优选由甘氨酸和丝氨酸构成的接头序列。可以列举例如含有如下序列的接头序列：由甘氨酸或丝氨酸中的任意1个氨基酸构成的序列、氨基酸序列Gly-Ser、氨基酸序列Gly-Gly-Ser、氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号3)、氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号4)、氨基酸序列Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(序列号5)、或者1～10个或2～5个这些氨基酸序列连接而成的、由50个以下的氨基酸构成的序列、由2～17个、2～10个、10～40个、20～34个、23～31个、25～29个或25个氨基酸构成的序列等。例如，可以优选使用含有5个氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号3)连接而成的共计25个氨基酸的序列作为接头序列。
在抗hTfR抗体与BDNF的融合蛋白中，抗hTfR抗体为单链抗体时，含有免疫球蛋白轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列与含有免疫球蛋白重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列通常通过接头序列而结合。此时，只要抗hTfR抗体可保持对hTfR的亲和性，则既可以是在含有免疫球蛋白轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列的C末端侧结合接头序列、进而在其C末端侧结合含有免疫球蛋白重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列而得到的融合蛋白，此外也可以是在含有免疫球蛋白重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列的C末端侧结合接头序列、进而在其C末端侧结合含有免疫球蛋白轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列而得到的融合蛋白。
配置在免疫球蛋白的轻链和重链之间的接头序列由优选为2～50个、更优选为8～50个、进一步优选为10～30个、更进一步优选为12～18个或15～25个、例如15个或25个氨基酸构成。就这种接头序列而言，只要用其连接两条链而成的抗hTfR抗体可与hTfR保持亲和性、且该抗体所结合的BDNF在生理条件下可发挥其生理活性，则对氨基酸序列没有限定，优选仅由甘氨酸构成或由甘氨酸和丝氨酸构成的接头序列。可以列举例如含有如下序列的接头序列：氨基酸序列Gly-Ser、氨基酸序列Gly-Gly-Ser、氨基酸序列Gly-Gly-Gly、氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号3)、氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号4)、氨基酸序列Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(序列号5)、或者2～10个或2～5个这些氨基酸序列连接而成的序列。例如，在由免疫球蛋白重链的可变区的全部区域构成的氨基酸序列的C末端侧通过接头序列结合免疫球蛋白轻链的可变区时，优选含有由3个序列号3所示的氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号3)连接而成的共计15个氨基酸的序列作为接头序列。
作为抗hTfR抗体与BDNF的融合蛋白的具体实施方式的一例，可以列举：在抗hTfR抗体重链的C末端通过作为接头序列的氨基酸序列Gly-Ser融合人BDNF而成的、具有序列号52的氨基酸序列的融合蛋白。使用通过一并导入整合有具有编码该融合蛋白的序列号53的碱基序列的DNA片段的表达载体、和整合有具有编码具有序列号23的氨基酸序列的抗hTfR抗体轻链的序列号24的碱基序列的DNA片段的表达载体而进行了转化的宿主细胞，由此，可以制作抗hTfR抗体与人BDNF的融合蛋白。
抗hTfR抗体为人以外的动物的抗体时，在将其给药于人时，非常担心激起针对该抗体的抗原抗体反应而产生不期望的副作用。人以外的动物的抗体通过形成人源化抗体可以减少这种抗原性，可以抑制给药于人时起因于抗原抗体反应的副作用的发生。此外，据报道，根据使用猴的实验，人源化抗体与小鼠抗体相比在血中更为稳定，认为可以使治疗效果相应地持续长时间。也可以通过使用人抗体作为抗hTfR抗体来抑制起因于抗原抗体反应的副作用的发生。
以下更详细地说明抗hTfR抗体为人源化抗体或人抗体的情况。人抗体的轻链有λ链和κ链。构成抗hTfR抗体的轻链可以为λ链和κ链中的任意一者。此外，人抗体的重链有γ链、μ链、α链、σ链和ε链，分别对应于IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。构成抗hTfR抗体的重链可以为γ链、μ链、α链、σ链和ε链中的任意一者，优选为γ链。进而，人抗体的重链的γ链有γ1链、γ2链、γ3链和γ4链，分别对应于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。构成抗hTfR抗体的重链为γ链时，该γ链可以为γ1链、γ2链、γ3链和γ4链中的任意一者，优选为γ1链或γ4链。抗hTfR抗体为人源化抗体或人抗体且为IgG时，人抗体的轻链也可以为λ链和κ链中的任意一者，人抗体的重链也可以为γ1链、γ2链、γ3链和γ4链中的任意一者，优选为γ1链或γ4链。例如，作为优选的抗hTfR抗体的一个实施方式，可以列举轻链为λ链、重链为γ1链的抗hTfR抗体。
在抗hTfR抗体为人源化抗体或人抗体时，可以通过在抗hTfR抗体的重链或轻链的N末端(或C末端)通过接头序列或直接地利用肽键分别结合BDNF的C末端(或N末端)而将抗hTfR抗体与BDNF连接。在使BDNF结合于抗hTfR抗体的重链的N末端侧(或C末端侧)时，在抗hTfR抗体的γ链、μ链、α链、σ链或ε链的N末端(或C末端)通过接头序列或直接地利用肽键分别结合BDNF的C末端(或N末端)。在抗hTfR抗体的轻链的N末端侧(或C末端侧)结合BDNF时，在抗hTfR抗体的λ链和κ链的N末端(或C末端)通过接头序列或直接地利用肽键分别结合BDNF的C末端(或N末端)。但是，在抗hTfR抗体为由缺失了Fc区的Fab区构成的抗体或由Fab区和铰链区的全部或一部分构成的抗体(Fab、F(ab’)和F(ab’)2)的情况下，可以在构成Fab、F(ab’)2和F(ab’)的重链或轻链的N末端(或C末端)通过接头序列或直接地利用肽键分别结合BDNF的C末端或N末端。
就作为抗hTfR抗体(人源化抗体或人抗体)的“轻链”的C末端侧或N末端侧结合有BDNF这样类型的融合蛋白而言，抗hTfR抗体包含含有轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列和含有重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列，BDNF结合在该轻链的C末端侧或N末端侧。在此，抗hTfR抗体的轻链与BDNF既可以直接结合也可以通过接头结合。
就作为抗hTfR抗体(人源化抗体或人抗体)的“重链”的C末端侧或N末端侧结合有BDNF这样类型的融合蛋白而言，抗人转铁蛋白受体抗体包含含有轻链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列和含有重链的可变区的全部或一部分的氨基酸序列，BDNF结合在该重链的C末端侧或N末端侧。在此，抗hTfR抗体的重链与BDNF既可以直接结合也可以通过接头结合。
在抗hTfR抗体与BDNF之间配置接头序列时，接头序列由优选为1～50个、更优选为10～40个、进一步优选为20～34个、例如27个氨基酸构成。构成接头序列的氨基酸的个数可适当调整为1～17个、1～10个、10～40个、20～34个、23～31个、25～29个、27个等。这种接头序列只要其所连接的抗hTfR抗体可保持对hTfR的亲和性、且所连接的BDNF在生理条件下可发挥其生理活性，则对氨基酸序列没有限定，优选由甘氨酸和丝氨酸构成的接头序列。可以列举例如含有如下序列的接头序列：由甘氨酸或丝氨酸中的任意1个氨基酸构成的序列、氨基酸序列Gly-Ser、氨基酸序列Gly-Gly-Ser、氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号3)、氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号4)、氨基酸序列Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(序列号5)、或者1～10个或2～5个这些氨基酸序列连接而成的、由50个以下的氨基酸构成的序列、由2～17个、2～10个、10～40个、20～34个、23～31个、25～29个或25个氨基酸构成的序列等。例如，可以优选使用含有5个氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号3)连接而成的共计25个氨基酸的序列作为接头序列。
抗hTfR抗体对hTfR的特异性亲和性主要依赖于抗hTfR抗体的重链和轻链的CDR的氨基酸序列。这些CDR的氨基酸序列只要使抗hTfR抗体具有对hTfR以及猴hTfR的特异性的亲和性则没有特别限制。
在本发明中，在抗hTfR抗体为人源化抗体或人抗体的情况下，对于对hTfR具有相对高的亲和性且对猴TfR也具有亲和性的抗体，特别是利用实施例7中记载的方法进行测定时，与人以及猴的TfR的解离常数如下：
(a)与hTfR的解离常数：优选为1×10-10M以下，更优选为2.5×10-11M以下，进一步优选为5×10-12M以下，更进一步优选为1×10-12M以下；
(b)与猴TfR的解离常数：优选为1×10-9M以下，更优选为5×10-10M以下，进一步优选为1×10-10M以下，例如为7.5×10-11M以下。
例如，可以列举与hTfR以及猴TfR的解离常数分别为1×10-10M以下和1×10-9M以下、1×10-11M以下和5×10-10M、5×10-12M以下和1×10-10M以下、5×10-12M以下和7.5×10-11M以下、1×10-12M以下和1×10-10M以下、1×10-12M以下和7.5×10-11M以下的抗体。在此，与人的TfR的解离常数没有特别明确的下限，但例如可以设为5×10-13M、1×10-13M等。而且，与猴的TfR的解离常数也没有特别明确的下限，但例如可以设为5×10-11M、1×10-11M、1×10-12M等。抗体为单链抗体时也同样。
作为应与BDNF融合且对于hTfR具有亲和性的抗体的优选实施方式，可例示抗体的重链的CDR具有以下所示的氨基酸序列的抗体。
即：
CDR1包含序列号66或序列号67的氨基酸序列，CDR2包含序列号13或序列号14的氨基酸序列，且CDR3包含序列号15或序列号16的氨基酸序列的抗体。
作为对于hTfR具有亲和性的抗体的更具体的实施方式，可例示抗体的重链的CDR具有以下所示的氨基酸序列的抗体。即：
CDR1包含序列号66的氨基酸序列，CDR2包含序列号13的氨基酸序列，及CDR3包含序列号15所记载的氨基酸序列的抗体。
在上述的优选实施方式中，可列举：在作为抗体的重链的框架区3的氨基酸序列而优选的序列中具有序列号68的氨基酸序列的抗体。
作为对于hTfR具有亲和性的抗体的优选轻链与重链的组合，可例示CDR具有以下所示的氨基酸序列的组合。即：
如下轻链与如下重链的组合，该轻链的CDR1包含序列号6或序列号7的氨基酸序列，CDR2包含序列号8或序列号9的氨基酸序列、或者氨基酸序列Lys-Val-Ser，且CDR3包含序列号10的氨基酸序列，该重链的CDR1包含序列号66或序列号67的氨基酸序列，CDR2包含序列号13或序列号14的氨基酸序列，且CDR3包含序列号15或序列号16的氨基酸序列。
作为对于hTfR具有亲和性的抗体的轻链与重链的组合的具体方式，可例示CDR具有以下所示的氨基酸序列的组合。即：
如下轻链与如下重链的组合，该轻链的CDR1包含序列号6的氨基酸序列，CDR2包含序列号8的氨基酸序列，且CDR3包含序列号10的氨基酸序列，该重链的CDR1包含序列号66的氨基酸序列，CDR2包含序列号13的氨基酸序列，且CDR3包含序列号15的氨基酸序列。
作为对于hTfR具有亲和性的人源化抗体的优选实施方式，可例示具有以下所示的氨基酸序列的抗体。即：
如下抗hTfR抗体，其轻链的可变区包含选自由序列号17、序列号18、序列号19、序列号20、序列号21、及序列号22所示的氨基酸序列所组成的组中的氨基酸序列，重链的可变区包含序列号69所示的氨基酸序列。
序列号17、序列号18、序列号19、序列号20、序列号21、及序列号22所示的轻链可变区的氨基酸序列是CDR1包含序列号6或7的氨基酸序列，CDR2包含序列号8或序列号9的氨基酸序列，且CDR3包含序列号10的氨基酸序列的序列。其中，在序列号17～22的氨基酸序列中，CDR的氨基酸序列并不限定于这些，包含这些CDR的氨基酸序列的区域、包含这些CDR的氨基酸序列的任意连续的3个以上氨基酸的氨基酸序列也可设为CDR。
序列号69所示的重链可变区的氨基酸序列中，CDR1包含序列号66或序列号67的氨基酸序列，CDR2包含序列号13或序列号14的氨基酸序列，且CDR3包含序列号15或序列号16的氨基酸序列。但是，在序列号69的氨基酸序列中，CDR的氨基酸序列并不限定于这些，包含这些CDR的氨基酸序列的区域、包含这些CDR的氨基酸序列的任意连续的3个以上氨基酸的氨基酸序列也可设为CDR。
作为对于hTfR具有亲和性的人源化抗体的更具体的实施方式的例子，可列举：
(1a)轻链的可变区包含序列号18的氨基酸序列且重链的可变区包含序列号69的氨基酸序列的抗体、
(1b)轻链的可变区包含序列号20的氨基酸序列且重链的可变区包含序列号69的氨基酸序列的抗体、
(1c)轻链的可变区包含序列号21的氨基酸序列且重链的可变区包含序列号69的氨基酸序列的抗体、及
(1d)轻链的可变区包含序列号22的氨基酸序列且重链的可变区包含序列号69的氨基酸序列的抗体。
作为对于hTfR具有亲和性的人源化抗体的更具体的实施方式的例子，可列举：
(2a)轻链包含序列号23的氨基酸序列且重链包含序列号70或72的氨基酸序列的抗体、
(2b)轻链包含序列号25的氨基酸序列且重链包含序列号70或72的氨基酸序列的抗体、
(2c)轻链包含序列号27的氨基酸序列且重链包含序列号70或72的氨基酸序列的抗体、
(2d)轻链包含序列号29的氨基酸序列且重链包含序列号70或72的氨基酸序列的抗体。
作为对于hTfR具有亲和性的作为Fab的人源化抗体的更具体的实施方式的例子，可列举：
(3a)轻链包含序列号23的氨基酸序列且Fab重链包含序列号61的氨基酸序列的抗体、
(3b)轻链包含序列号25的氨基酸序列且Fab重链包含序列号61的氨基酸序列的抗体、
(3c)轻链包含序列号27的氨基酸序列且Fab重链包含序列号61的氨基酸序列的抗体、
(3d)轻链包含序列号29的氨基酸序列且Fab重链包含序列号61的氨基酸序列的抗体。
在抗hTfR抗体为Fab的情况下，作为融合蛋白中导入有其他Fc区的融合蛋白的具体实施方式的例子，可列举：
(4a)轻链包含序列号23的氨基酸序列且导入有Fc区的Fab重链包含序列号81的氨基酸序列的融合蛋白、
(4b)轻链包含序列号25的氨基酸序列且导入有Fc区的Fab重链包含序列号81的氨基酸序列的融合蛋白、
(4c)轻链包含序列号27的氨基酸序列且导入有Fc区的Fab重链包含序列号81的氨基酸序列的融合蛋白、
(4d)轻链包含序列号29的氨基酸序列且导入有Fc区的Fab重链包含序列号81的氨基酸序列的融合蛋白。
需要说明的是，序列号81所示的氨基酸序列是如下序列：在人源化抗hTfR抗体3N的Fab重链的氨基酸序列(氨基酸序列61)的N末端侧，经由包含由5个氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号3)接连而成的共计25个氨基酸的接头序列，结合有具有序列号75所示的氨基酸序列的人IgG Fc区。
在上述(4a)～(4d)中，例如，在人BDNF的C末端侧直接或经由接头序列结合人IgGFc区，进而在该人IgG Fc区的C末端侧直接或经由接头序列结合抗人转铁蛋白受体抗体。
作为人IgG Fc区的优选的一实施方式，可列举具有序列号75的氨基酸序列的人IgG Fc区。而且，作为导入有人IgG Fc区的融合蛋白，可列举在BDNF的C末端侧经由接头序列结合有Fc区、在其C末端侧经由接头序列结合有抗hTfR抗体的重链Fab的具有序列号74的氨基酸序列的融合蛋白作为一例。
在抗hTfR抗体为Fab的情况下，作为将白蛋白亲和性肽导入至融合蛋白中所得的融合蛋白的具体实施方式的例子，可列举如下融合蛋白：
白蛋白亲和性肽为具有序列号85所示的氨基酸序列的白蛋白结合结构域，且
(5a)轻链包含序列号23的氨基酸序列，且导入有白蛋白亲和性肽的Fab重链包含序列号89的氨基酸序列，
(5b)轻链包含序列号25的氨基酸序列，且导入有白蛋白亲和性肽的Fab重链包含序列号89的氨基酸序列，
(5c)轻链包含序列号27的氨基酸序列，且导入有白蛋白亲和性肽的Fab重链包含序列号89的氨基酸序列，
(5d)轻链包含序列号29的氨基酸序列，且导入有白蛋白亲和性肽的Fab重链包含序列号89的氨基酸序列。
需要说明的是，序列号89所示的氨基酸序列是如下序列：在人源化抗hTfR抗体3N的Fab重链的氨基酸序列(氨基酸序列61)的C末端侧，经由包含3个氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号3)接连而成的共计15个氨基酸的接头序列，结合有具有序列号85所示的氨基酸序列的白蛋白亲和性肽。
在上述(5a)～(5d)中，例如在人BDNF的C末端侧直接或经由接头序列结合抗人转铁蛋白受体抗体，进而在该抗人转铁蛋白受体抗体的C末端侧直接或经由接头序列结合白蛋白亲和性肽。
作为白蛋白亲和性肽的优选的一实施方式，可列举具有序列号85的氨基酸序列的白蛋白亲和性肽。而且，作为导入有白蛋白亲和性肽的融合蛋白，可列举在人BDNF前体或人BDNF的C末端侧经由接头序列结合有Fab重链、在其C末端侧经由接头序列结合有白蛋白亲和性肽的具有序列号87或序列号88的氨基酸序列的导入有白蛋白亲和性肽的融合蛋白作为一例。
如上所述地例示出对hTfR具有亲和性的人源化抗体的优选的实施方式。就这些抗hTfR抗体的轻链和重链而言，可以出于将抗hTfR抗体与hTfR的亲和性调整至期望程度等目的，向其可变区的氨基酸序列中适当引入置换、缺失、添加等变异。此外，还可以出于将hBDNF的功能等调整为期望功能的目的，向hBDNF中适当引入置换、缺失、添加等变异。
在用其它氨基酸置换轻链的可变区的氨基酸序列的氨基酸时，所置换的氨基酸的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个，更进一步优选为1～2个。在使轻链的可变区的氨基酸序列中的氨基酸缺失时，缺失的氨基酸的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个，另外进一步优选为1～2个。此外，还可以引入组合有这些氨基酸的置换和缺失的变异。
在轻链的可变区添加氨基酸时，在轻链的可变区的氨基酸序列中或者N末端侧或C末端侧添加优选1～10个、更优选1～5个、进一步优选1～3个、更进一步优选1～2个氨基酸。还可以引入组合有这些氨基酸的添加、置换和缺失的变异。引入了变异的轻链的可变区的氨基酸序列与原始的轻链的可变区的氨基酸序列优选具有80％以上的同源性，更优选显示90％以上的同源性，进一步优选显示95％以上的同源性。
特别是用其它氨基酸置换轻链的各CDR或各框架区各自的氨基酸序列中的氨基酸时，所置换的氨基酸的个数优选为1～5个，更优选为1～3个，进一步优选为1～2个，更进一步优选为1个。在使各CDR或各框架区各自的氨基酸序列中的氨基酸缺失时，缺失的氨基酸的个数优选为1～5个，更优选为1～3个，进一步优选为1～2个，更进一步优选为1个。此外，还可以引入组合有这些氨基酸的置换和缺失的变异。
在向轻链的各CDR或各框架区各自的氨基酸序列中添加氨基酸时，在该氨基酸序列中或者N末端侧或C末端侧添加优选1～5个、更优选1～3个、进一步优选1～2个、更进一步优选1个氨基酸。还可以引入组合有这些氨基酸的添加、置换和缺失的变异。引入了变异的各CDR或各框架区各自的氨基酸序列与原始的各CDR的氨基酸序列优选具有80％以上的同源性，更优选显示90％以上的同源性，进一步优选显示95％以上的同源性。
在将作为重链的可变区的序列号69所示的氨基酸序列的氨基酸置换为其它氨基酸时，所置换的氨基酸的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个，更进一步优选为1～2个。使重链的可变区的氨基酸序列中的氨基酸缺失时，缺失的氨基酸的个数优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个，更进一步优选为1～2个。此外，还可以引入组合有这些氨基酸的置换和缺失的变异。
在向作为重链的可变区的序列号69所示的氨基酸序列添加氨基酸时，在重链的可变区的氨基酸序列中或者N末端侧或C末端侧添加优选1～10个、更优选1～5个、进一步优选1～3个、更进一步优选1～2个氨基酸。还可以引入组合有这些氨基酸的添加、置换和缺失的变异。引入了变异的重链的可变区的氨基酸序列与原始的重链的可变区的氨基酸序列优选具有80％以上的同源性，更优选显示90％以上的同源性，进一步优选显示95％以上的同源性。
特别是将序列号69所示的氨基酸序列中的各CDR或各框架区各自的氨基酸序列中的氨基酸置换为其它氨基酸时，所置换的氨基酸的个数优选为1～5个，更优选为1～3个，进一步优选为1～2个，更进一步优选为1个。在使各CDR各自的氨基酸序列中的氨基酸缺失时，缺失的氨基酸的个数优选为1～5个，更优选为1～3个，进一步优选为1～2个，更进一步优选为1个。此外，还可以引入组合有这些氨基酸的置换和缺失的变异。
在向序列号69所示的氨基酸序列中的各CDR或各框架区各自的氨基酸序列中添加氨基酸时，在该氨基酸序列中或者N末端侧或C末端侧添加优选1～5个、更优选1～3个、进一步优选1～2个氨基酸、更进一步优选1个氨基酸。还可以引入组合有这些氨基酸的添加、置换和缺失的变异。引入了变异的各CDR各自的氨基酸序列与原始的各CDR的氨基酸序列优选具有80％以上的同源性，更优选显示90％以上的同源性，进一步优选显示95％以上的同源性。
需要说明的是，在如上所述对作为抗hTfR抗体的重链的可变区的序列号69所示的氨基酸序列施加置换、缺失、附加等突变的情况下，原本的CDR1的自N末端侧起第5位的氨基酸即甲硫氨酸、与框架区3的自N末端侧起第17位的氨基酸即亮氨酸在与突变前相同的位置保守。而且，优选重链的CDR1及框架区3的氨基酸序列保守。
还可以将对上述抗hTfR抗体的轻链的可变区的变异与对上述抗hTfR抗体的重链的可变区的变异组合，在抗hTfR抗体的轻链和重链的可变区这两者中引入变异。
作为上述抗hTfR抗体的轻链及重链的氨基酸序列中的氨基酸被其他氨基酸的置换，例如可列举：芳香族氨基酸(Phe、Trp、Tyr)、脂肪族氨基酸(Ala、Leu、Ile、Val)、极性氨基酸(Gln、Asn)、碱性氨基酸(Lys、Arg、His)、酸性氨基酸(Glu、Asp)、具有羟基的氨基酸(Ser、Thr)等分类为同一组的氨基酸间的置换。可预测这种被类似氨基酸的置换不会给蛋白质的表型带来变化(即，为保守性氨基酸置换)。但是，本发明人首先发现，确认到与本发明具有同种效果的抗体号3(在本申请申请时未公开)的hTfR的框架区3的氨基酸序列即序列号83的第17位为Trp，相对于此，本申请发明中的抗hTfR抗体号3N的重链的框架区3具有序列号68的氨基酸序列，且其自N末端侧起第17位被置换为Leu。而且，CDR1的氨基酸序列中，序列号12的第5位的Thr如序列号66所示那样被置换为了Met。Trp与Leu并非上述类似关系，并且Thr与Met也并非上述类似关系。然而，如下所述，包含该置换的抗体号3N竟然出乎预料地表现出与抗体号3同种效果，而且表现出进一步优良的效果。
需要说明的是，在向抗hTfR抗体或hBDNF中引入变异而在C末端或N末端添加了氨基酸的情况下，如果该添加的氨基酸在使抗hTfR抗体与BDNF融合时位于抗hTfR抗体与BDNF之间，则该添加的氨基酸构成接头的一部分。
(1)融合蛋白的制造方法
本发明的融合蛋白可以通过后述实施例中记载的方法或本领域中公知的方法来制造。
例如，通过如本说明书的实施例16和17中记载的那样分别构建具有编码在所获得的抗人转铁蛋白抗体的重链的N末端直接或通过接头(例如，由序列号3重复5次的25个氨基酸构成的接头)融合了BDNF的C末端的融合蛋白的DNA的表达用载体、和具有编码该抗体的轻链的DNA的动植物细胞表达用载体，一并导入到合适的宿主细胞中，可以得到产生本发明的融合蛋白的细胞或转基因动植物。或者，通过分别构建具有编码在所取得的抗人转铁蛋白抗体的轻链的N末端直接或通过接头(例如，由序列号3重复5次的25个氨基酸构成的接头)融合了BDNF的C末端的融合蛋白的DNA的表达用载体、和具有编码该抗体的重链的DNA的表达用载体，一并导入到合适的宿主细胞中，可以得到产生本发明的融合蛋白的细胞或转基因动植物。
如前述那样构建的融合蛋白基因可以通过公知的方法来进行表达、并取得。为了使融合蛋白的表达量最大化，可以根据用于表达融合蛋白的细胞或动物种属的密码子使用频率对融合蛋白基因的碱基序列进行最优化。在哺乳类细胞的情况下，可以利用在常用的有用的启动子、要表达的抗体基因的3’侧下游功能性地结合了多聚A信号的DNA或含有该DNA的载体来使其表达。例如，作为启动子/增强子，可以列举人巨细胞病毒早期启动子/增强子(human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer)。
此外，作为其它可以用于本发明中使用的抗体表达的启动子/增强子，还可以使用逆转录病毒、多瘤病毒、腺病毒、猴病毒40(SV40)等病毒启动子/增强子、人延伸因子1α(hEF1α)等源自哺乳类细胞的启动子/增强子。
例如，在使用SV40启动子/增强子时，按照Mulligan等的方法(Mulligan,R.C.etal.,Nature(1979)277,108-114)可以容易地实施，此外，在使用hEF1α启动子/增强子时，按照Mizushima等的方法(Mizushima,S.and Nagata,S.Nucleic Acids Res.(1990)18,5322)可以容易地实施。
在大肠杆菌的情况下，可以使常用的有用的启动子、用于抗体分泌的信号序列、要表达的抗体基因功能性地结合并使其表达。例如，作为启动子，可以列举lacZ启动子、araB启动子。使用lacZ启动子时，按照Ward等的方法(Ward,E.S.et al.,Nature(1989)341,544-546；Ward,E.S.et al.,FASEB J.(1992)6,2422-2427)即可，使用araB启动子时，按照Better等的方法(Better,M.et al.,Science(1988)240,1041-1043)即可。
作为用于抗体分泌的信号序列，在大肠杆菌的周质中产生时，可以使用pelB信号序列(Lei,S.P.et al.,J.Bacteriol.(1987)169,4379-4383)。(参照例如国际公开第96/30394号)。
作为复制起点，可以使用源自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒(BPV)等的复制起点，进而，为了提高在宿主细胞系统中的基因拷贝数，表达载体可以含有作为选择标记的氨基糖苷磷酸转移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等。
在使用真核细胞时，有使用动物细胞、植物细胞或真菌细胞的产生系统。作为动物细胞，已知有：(1)哺乳类细胞，例如CHO、HEK293、COS、骨髓瘤、BHK(baby hamster kidney，幼仑鼠肾)，HeLa、Vero等；(2)两栖类细胞，例如非洲爪蟾卵母细胞；或(3)昆虫细胞，例如sf9、sf21、Tn5等。作为植物细胞，已知有源自烟草(Nicotiana tabacum)的细胞，可以对其进行愈伤组织培养。作为真菌细胞，已知有：酵母，例如酵母菌(Saccharomyces)属，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；丝状真菌，例如曲霉属(Aspergillus)属，例如黑曲霉(Aspergillus niger)等。
在使用原核细胞时，有使用细菌细胞的产生系统。作为细菌细胞，已知有大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌。
通过转化向这些细胞中导入目标抗体基因，对转化后的细胞进行离体(in vitro)培养，从而得到抗体。培养按照公知的方法来进行。例如，作为培养液，可以使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM，还可以组合使用胎牛血清(FCS)等血清补液。此外，也可以将导入了抗体基因的细胞移植到动物的腹腔等中，从而在体内(in vivo)产生抗体。
作为体内的产生系统，可以列举使用动物的产生系统、使用植物的产生系统。使用动物时，有使用哺乳类动物、昆虫的产生系统等。
作为哺乳类动物，可以使用山羊、猪、绵羊、小鼠、牛等(Vicki Glaser,SPECTRUMBiotechnology Applications,1993)。此外，作为昆虫，可以使用蚕。使用植物时，可以使用例如烟草。
向这些动物或植物中导入融合蛋白基因，在动物或植物的体内产生融合蛋白并回收。例如，将融合蛋白基因插入到编码山羊β-酪蛋白之类在乳汁中特征性地产生的蛋白质的基因中间，来制备融合基因。将含有插入有抗体基因的融合基因的DNA片段注入山羊胚胎中，将该胚胎导入到雌性山羊中。从接受了胚胎的山羊所生产的转基因山羊或然后代所产生的乳汁中得到期望的融合蛋白。为了使由转基因山羊产生的含有期望的融合蛋白的乳汁量增加，可以对转基因山羊适当地使用激素(Ebert,K.M.et al.,Bio/Technology(1994)12,699-702)。
此外，使用蚕时，使蚕感染插入有目标融合蛋白基因的杆状病毒，由该蚕的体液得到期望的抗体(Maeda,S.et al.,Nature(1985)315,592-594)。进而，使用烟草时，将目标融合蛋白基因插入植物表达用载体、例如pMON 530中，将该载体导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)之类的细菌中。使烟草、例如烟草(Nicotiana tabacum)感染该细菌，由该烟草的叶得到期望的融合蛋白(Julian,K.-C.Ma et al.,Eur.J.Immunol.(1994)24,131-138)。
可以从细胞内外、宿主细胞分离如前述那样产生、表达的融合蛋白，并纯化至均一。本发明中使用的融合蛋白的分离、纯化可以通过亲和色谱来进行。作为亲和色谱所用的柱，可以列举例如：蛋白A柱、蛋白G柱、蛋白L柱。作为蛋白A柱中使用的载体，可以列举例如：Hyper D、POROS、Sepharose F.F.等。此外，也可以使用通常用于蛋白质的分离，纯化方法，并没有任何限定。根据需要，也可以将上述亲和色谱以外的色谱、过滤、超滤、盐析、透析等组合，对本发明中使用的抗体进行分离、纯化。作为色谱，可以列举例如离子交换色谱、疏水性色谱、凝胶过滤等。这些色谱也可以用于HPLC(High performance liquidchromatography)。此外也可以使用反相HPLC(reverse phase HPLC)。
BDNF的同源二聚体与位于靶细胞表面上的BDNF受体(TrkB)特异性结合，在中枢神经和周围神经系统的细胞分化、功能维持、突触形成以及损伤时的再生和修复等中发挥重要的作用(非专利文献1、非专利文献2)。由于这样的作用，BDNF作为能够广泛用于中枢神经和周围神经有障碍的疾病的治疗的蛋白质而受到关注。
此外，据报道：在亨廷顿舞蹈症、帕金森病、阿尔茨海默病等各种神经系统疾病中，BDNF的表达下调、量降低(Nuerosci.Lett.(1999)270:45-48)，已知用浸透压泵等将BDNF持续注入这些疾病模型动物的脑内或髓腔内时，显示出抑制纹状体的神经细胞死亡、改善运动障碍、改善记忆力等效果(J.Nuerosci.(2004)24:7727-7739,Proc.Nati.Acad.Sci.USA(1992)89:11347-11351),Nat.Med.(2009)15:331-337)。
进而还已知，BDNF具有牙齿相关细胞和血管内皮细胞的增殖、分化促进、摄食调节、糖代谢等多种作用(Tissue Eng.(2005)11:1618-629,肥満研究(肥胖研究)(2009)15:97-99)。
由于这些作用，期待开发BDNF来作为阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈症等神经退行性疾病、肌萎缩性侧索硬化症等脊髓退行性疾病、以及糖尿病性神经障碍、脑缺血性疾病、Rett综合征等发育障碍、精神分裂症、抑郁症等各种疾病的治疗剂(非专利文献3、非专利文献4、非专利文献5、非专利文献6、非专利文献7、非专利文献8、WO91/03568)。
BDNF不能通过血脑屏障(BBB；Blood-Brain Barrier)，但本发明的融合蛋白(hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白)能够通过BBB，因此外周给药的本发明的融合蛋白可迁移到脑内并发挥BDNF本来具有的效果。这样的BDNF的功能可以通过以下方法来确认。
(2)BDNF的功能的评价方法
通过考察对BDNF受体(TrkB)的亲和力(Eur J Neurosci(1994)6:1389-1405)、以BDNF受体的磷酸化为指标的BDNF受体的活化(Biochim Biophys Acta(2015)1852:862-872)、与BDNF受体的活化相伴的细胞内钙增加等细胞内信号传导增强活性(NatureReviews Neuroscience(2009)10:850-860)、对表达TrkB的神经细胞的增殖促进作用(岐阜药科大学纪要(2006)55:53-54)、生存维持作用(Prog Neuropsychopharmacol BiolPsychiatry(2015)60:11-17)、轴突延长作用(J Biol Chem(2007)282:34525-34534)等，来离体评价BDNF的功能。作为离体使用的细胞，可以为内源性表达TrkB的细胞，也可以为外源性强制表达TrkB的细胞。例如，可以使用在BAF细胞、CHO细胞、PC-12细胞等中导入TrkB基因并强制表达的细胞、海马和纹状体等的原代培养神经细胞。
此外，可以通过考察对帕金森病、亨廷顿舞蹈症、阿尔茨海默病等疾病模型动物的治疗效果(Proc.Nati.Acad.Sci.USA(1994)91:8920-8924)，来体内评价BDNF的功能。例如，可以用实施例2～5中记载的方法考察帕金森病模型动物的运动功能障碍改善作用、纹状体多巴胺量恢复效果、纹状体多巴胺神经再生效果等，来评价本发明的融合蛋白(TfR抗体-BDNF融合蛋白)在体内的BDNF生物活性。作为帕金森病模型，可以利用进行了已知会特异性破坏多巴胺神经的MPTP处置的小鼠和猴。
(3)融合蛋白的用途
需要说明的是，通过外周对于某种疾病模型动物、例如帕金森病模型动物给药本发明的融合蛋白(hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白)，改善了该疾病或障碍则表明本发明的融合蛋白以BDNF可发挥本来具有的效果的程度到达了目标部位(例如脑内)，这意味着本发明的融合蛋白不限于该疾病、可以广泛用于治疗能通过暴露于BDNF而受益的疾病和障碍。
本发明可以用于：通过给药含有治疗有效量的本发明的融合蛋白作为有效成分的药物组合物，来治疗能通过暴露于BDNF而受益的疾病或障碍。因此，本发明此外提供一种能通过暴露于BDNF而受益的疾病或障碍的预防和/或治疗剂，其含有本发明的融合蛋白作为有效成分。在此，“治疗”这一术语不仅是指完全治愈，而且也含有症状改善。
作为能通过曝露于本发明的融合蛋白而受益的疾病或障碍，不仅含有由于BDNF的表达下调或量减少而发生的疾病或障碍，还含有能在BDNF作用下得到治疗的疾病或障碍，可以列举例如：神经系统的疾病或障碍(神经退行性疾病、抑郁症、精神分裂症、癫痫、自闭症、Rett综合征、West综合征、新生儿惊厥、痴呆伴发问题行为(例如徘徊、攻击性行为等)、焦虑症、疼痛、赫希施普龙病、快速眼动睡眠行为障碍等)及其它疾病或障碍。作为神经退行性疾病，可以列举以下的脑神经退行性疾病、脊髓退行性疾病、视网膜退行性疾病、周围神经退行性疾病等。
作为脑神经退行性疾病，可以列举例如：脑神经系统的神经退行性疾病(阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈症、路易体型痴呆、匹克氏病、多系统萎缩症、进行性核上性麻痹、唐氏综合征等)、脑缺血性疾病(脑卒中、脑梗塞、一过性脑缺血发作、蛛网膜下腔出血、缺血性脑病、脑梗塞(腔隙性脑梗塞、动脉粥样硬化性脑梗死、心源性脑梗塞、出血性脑梗塞、其他梗塞)等)、创伤性脑损伤、白质脑病和多发性硬化等。
作为脊髓退行性疾病，可以列举例如：肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、脊髓损伤、各种原因引起的脊髓障碍、脊髓性进行性肌萎缩症、和脊髓小脑变性等。
作为视网膜退行性疾病，可以列举例如：老年性黄斑变性(AMD)、糖尿病性视网膜病、视网膜色素变性、高血压性视网膜病、和青光眼等。
作为周围神经退行性疾病，可以列举例如：糖尿病性神经障碍、周围神经损伤、创伤性周围神经障碍、中毒、其它毒性物质引起的周围神经障碍、癌症化学治疗法引起的周围神经障碍、Guillain-Barre综合征、缺乏维生素等引起的周围神经障碍、淀粉样周围神经障碍、缺血性周围神经障碍、恶性肿瘤所伴随的周围神经障碍、尿毒症性周围神经障碍、物理原因引起的周围神经障碍、Charcot-Marie-Tooth病、酒精性周围神经障碍、植物性神经异常(无意识低血糖、胃轻瘫、神经性腹泻和便秘、勃起功能障碍、体位性低血压、心律失常、心力衰竭、无痛性心肌梗塞、出汗障碍、神经性膀胱等)、膀胱功能障碍(例如无抑制膀胱、反射性膀胱、自主性膀胱、知觉麻痹性膀胱、运动麻痹性膀胱等)等。
作为其它疾病或障碍，可以列举例如：牙周病、糖尿病、糖尿病性心肌病、糖尿病足、炎症性肠疾病(例如溃疡性大肠炎、克罗恩病等)、听觉障碍、骨病(例如骨质疏松症等)、关节疾病(例如夏科氏关节、骨关节炎、风湿性关节炎等)等。
本发明的融合蛋白可以以给药于血中并使其应该在中枢神经系统(CNS)中发挥药效的药剂形式使用。所述药剂大体上可通过基于点滴静脉注射等的静脉注射、皮下注射、肌肉注射给药于患者，但对给药途径没有特别限定。
(4)给药形态、给药量、给药方法
就本发明的融合蛋白而言，作为药剂可以以冷冻干燥品或水性液剂等形态提供给医疗机构。在水性液剂的情况下，可以以将药剂预先溶解于含有稳定剂、缓冲剂、等渗剂的溶液中并密封在药瓶或注射器中的制剂形式来提供。密封在注射器中的制剂通常被称为预填充注射器制剂。通过制成预填充注射器制剂，可以由患者本人容易地进行药剂的给药。
在以水性液剂形式来提供时，水性液剂中所含的与抗hTfR抗体结合的BDNF的浓度应根据用法用量来适当调整，为例如0.01～5mg/mL。此外，水性液剂中所含的稳定剂只要是药剂学上允许的稳定剂则没有特别限定，可以优选使用非离子型表面活性剂。作为这样的非离子型表面活性剂，可以单独使用聚山梨醇酯、泊洛沙姆等或将这些组合使用。作为聚山梨醇酯，特别优选聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80，作为泊洛沙姆，特别优选泊洛沙姆188(聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇)。此外、水性液剂中所含的非离子型表面活性剂的浓度优选为0.01～1mg/mL，更优选为0.01～0.5mg/mL，进一步优选为0.1～0.5mg/mL。作为稳定剂，还可以使用组氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸等氨基酸。作为稳定剂使用时的、水性液剂中所含的氨基酸的浓度优选为0.1～40mg/mL，更优选为0.2～5mg/mL，进一步优选为0.5～4mg/mL。水性液剂中所含的缓冲剂只要是药剂学上允许的缓冲剂则没有特别限定，优选磷酸盐缓冲剂，特别优选磷酸钠缓冲剂。作为缓冲剂使用磷酸钠缓冲剂时的、磷酸钠的浓度优选为0.01～0.04M。此外，用缓冲剂调整的水性液剂的pH优选为5.5～7.2。水性液剂中所含的等渗剂只要是药剂学上允许的等渗剂则没有特别限定，可以优选单独使用氯化钠、甘露醇或将它们组合作为等渗剂。
含有本发明的融合蛋白的上述药物的给药量还根据给药对象、对象疾病、症状、给药途径等而不同，例如在为了治疗和/或预防神经退行性疾病而使用时，给药量以有效量、例如治疗有效量计时，脑内的以BDNF计的浓度至少为约0.001ng/g以上、优选为超过0.01、0.1、1、10或100ng/g脑。此外，优选在给药1次后即使经过数天(1、2、3、4、5、6、7天)、2周、进而1个月BDNF的脑内水平也维持上升状态，以脑内维持浓度计，优选例如维持在超过约1ng/g脑、约10ng/g脑、约100ng/g脑、或约100ng/g脑的状态。
例如，给药量虽然不限于这些，但在几个实施方式中，以1次给药量计可以在0.0001～1、000mg/kg体重的范围内选择。或者，也可以在每个患者0.001～100,000mg的范围内选择。通常以约0.01～1000mg、约0.1～100mg、约1～100mg、约0.05～500mg、约0.5～50mg、或约5mg～50mg的给药量例如通过静脉内给药来进行给药。在症状特别重时，可以根据其症状而增加。
本发明的组合物、例如本发明的融合蛋白可以单独使用，或者也可以在不损害本发明的效果的范围内根据需要与其它药品或其它治疗法一起以同一制剂内或单独的组合物形式给药于患者。例如，作为阿尔茨海默型痴呆中与本发明的药物组合物组合使用的药物，可以列举阿尔茨海默病治疗药，例如多奈哌齐盐酸盐、利凡斯的明、氢溴酸加兰他敏盐酸盐等乙酰胆碱酯酶抑制剂或盐酸美金刚。此外可以列举目前处于临床开发阶段的索拉奈珠单抗(N Engl J Med.(2014)370:311-21)、冈特奈卢单抗(Arch Neurol.(2012)69:198-207)等抗Aβ抗体、维贝司他(AAIC 2013,Boston:Abs 01-06-05,Jul 2013)、AZD-3293(AAIC2014,Copenhargen:Abs P1-363,Jul 2014)等β淀粉样蛋白产生抑制剂等。作为在阿尔茨海默型痴呆中可与本发明的药物组合物组合使用的治疗法，可以列举脑部活化型康复疗法等。作为在帕金森病中可与本发明的药物组合物组合使用的药物，可以列举帕金森病治疗药，例如左旋多巴等多巴胺补充疗法药，他利克索、普拉克索，溴隐亭等多巴胺受体激动剂，MAO-B抑制剂，COMT抑制剂等多巴胺分解酶抑制剂，金刚烷胺和NOURIAST等多巴胺释放促进剂。作为在帕金森病中可与本发明的药物组合物组合使用的治疗法，可以列举丘脑刺激术、苍白球刺激术、底丘脑核刺激术等。作为在亨廷顿舞蹈症中可与本发明的药物组合物组合使用的药物，可以列举亨廷顿舞蹈症治疗药，例如丁苯那嗪等单胺囊泡转运体2抑制剂。作为在脑缺血性疾病中可与本发明的药物组合物组合使用的药物，可以列举Radicut(依达拉奉)等脑保护药。作为在脑缺血性疾病中可与本发明的药物组合物组合使用的治疗法，可以列举溶栓疗法、康复疗法等。
对给药本发明的药物组合物的时机没有特别限定，可以适宜地为其它药物的给药或治疗的前后或同时。
实施例
以下参照实施例更详细地说明本发明，但并不意味者本发明受实施例限定。需要说明的是，实施例1～15-3是关于参考例(抗体号3)的例子。
〔实施例1〕hTfR表达用载体的构建
以人脾脏Quick Clone cDNA(Clontech公司)为模板，用引物hTfR5’(序列号41)和引物hTfR3’(序列号42)通过PCR扩增编码人转铁蛋白受体(hTfR)的基因片段。将扩增出的编码hTfR的基因片段用MluI和NotI消化，并插入到pCI-neo载体(Promega公司)的MluI和NotI之间。将得到的载体命名为pCI-neo(hTfR)。然后将该载体用MluI和NotI消化，切出编码hTfR的基因片段，将其整合到国际公开公报(WO2012/063799)中记载的表达载体pE-mIRES-GS-puro的MluI和NotI之间，从而构建hTfR表达用载体pE-mIRES-GS-puro(hTfR)。
〔实施例2〕重组hTfR的制作
利用电穿孔法向CHO-K1细胞中导入pE-mIRES-GS-puro(hTfR)后，用含有甲硫氨酸砜亚胺(MSX)和嘌呤霉素的CD OptiCHOTM培养基(Invitrogen公司)进行细胞的选择培养，得到重组hTfR表达细胞。培养该重组hTfR表达细胞来制备重组hTfR。
〔实施例3〕使用重组hTfR免疫小鼠
使用实施例2中制备的重组hTfR作为抗原来免疫小鼠。将抗原静脉内给药或腹腔内给药于小鼠来进行免疫。
〔实施例4〕杂交瘤的制作
在最后给药细胞之日起约1周后，摘出小鼠的脾脏并均质化，分离脾细胞。用聚乙二醇法将得到的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞株(P3.X63.Ag8.653)进行细胞融合。在细胞融合结束后，将细胞悬浮于含有(1×)HAT补充剂(Life Technologies公司)和10％Ultra lowIgG胎牛血清(Life Technologies公司)的RPMI1640培养基中，将细胞悬浮液以200μL/孔分注到20块96孔板中。用二氧化碳培养箱(37℃，5％CO2)将细胞培养10天后，在显微镜下观察各孔，选择存在单一集落的孔。
在各孔的细胞达到几乎汇合的时刻回收培养上清，将其作为杂交瘤的培养上清，供于以下的筛选。
〔实施例5〕高亲和性抗体产生细胞株的筛选
将重组hTfR溶液(Sino Biologics公司)用50mM碳酸钠缓冲液(pH9.5～9.6)稀释而调整为5μg/mL的浓度，将其作为固相溶液。向Nunc MaxiSorpTM平底96孔板(基材：聚苯乙烯，Nunc公司制)的各孔中分别添加50μL固相溶液后，将板在室温下静置1小时，使重组hTfR吸附、固定于板。弃去固相溶液，将各孔用250μL洗涤液(PBS-T：含有0.05％Tween 20的PBS)洗涤3次后，向各孔中添加200μL封闭液(含有1％BSA的PBS)，将板在室温下静置1小时。
弃去封闭液，将各孔用250μL的PBS-T洗涤3次后，向各孔中分别添加50μL杂交瘤的培养上清，将板在室温下静置1小时，使培养上清中所含的小鼠抗hTfR抗体与重组hTfR结合。此时，作为对照，设置在孔中添加50μL不产生小鼠抗hTfR抗体的杂交瘤的培养上清的情形。此外，在加入了各培养上清的孔的横向的孔中设置添加50μL杂交瘤的培养用培养基的情形，将其作为空白对照孔(Mock well)。测定以n＝2来实施。然后弃去溶液，将各孔用250μL的PBS-T洗涤3次。
在上述各孔中添加100μL的HRP标记山羊抗小鼠免疫球蛋白抗体溶液(Promega公司)，将板在室温下静置1分钟。然后弃去溶液，将各孔用250μL的PBS-T洗涤3次。然后向各孔中添加50μL的显色用底物液TMB Stabilized Substrate for Horseradish Peroxidase(Promega公司)，在室温下静置10～20分钟。然后向各孔中添加100μL的终止液(2N硫酸)后，用酶标仪测定各孔在450nm处的吸光度。对各培养上清和对照取2个孔的平均值，从这些平均值中分别减去各培养上清和对照各自设置的2个空白对照孔的平均值，将结果作为测定值。
选择显示高测定值的孔中所添加的培养上清所对应的14种杂交瘤细胞，作为产生对hTfR显示高亲和性的抗体(高亲和性抗hTfR抗体)的细胞株(高亲和性抗体产生细胞株)。将这14种细胞株编号为克隆1株～克隆14株。从这些细胞株选择克隆3株，用于以下的实验。此外，将克隆3株所产生的抗hTfR抗体设为抗hTfR抗体号3。
〔实施例6〕高亲和性抗hTfR抗体的可变区的氨基酸序列的分析
由实施例5中选择出的克隆3株制备cDNA，以该cDNA为模板，扩增编码抗体的轻链和重链的基因。对扩增出的基因的碱基序列进行翻译，对于该细胞株所产生的抗hTfR抗体号3的抗体确定轻链和重链的可变区的氨基酸序列。
抗hTfR抗体号3是轻链的可变区含有序列号48记载的氨基酸序列、重链的可变区含有序列号49记载的氨基酸序列的抗体。此外，其轻链的可变区中，CDR1含有序列号6或7、CDR2含有序列号8或9、并且CDR3含有序列号10记载的氨基酸序列；其重链的可变区中，CDR1含有序列号11或12、CDR2含有序列号13或14、并且CDR3含有序列号15或16记载的氨基酸序列。但是，认为CDR不限于上述氨基酸序列，包含这些氨基酸序列的区域、包含这些氨基酸序列的一部分的由连续的3个以上的氨基酸构成的氨基酸序列也可以作为CDR。
将抗hTfR抗体号3的轻链的可变区的CDR1～3和重链的可变区的CDR1～3所含的氨基酸序列的序列号汇总示于表1。其中，表1例示出了各CDR的氨基酸序列，各CDR的氨基酸序列并不限于表1所记载的氨基酸序列，认为包含这些氨基酸序列的区域的氨基酸序列、包含这些氨基酸序列的一部分的由连续的3个以上的氨基酸构成的氨基酸序列也可以作为CDR。
[表1]
表1抗hTfR抗体号3的轻链及重链的可变区的CDR1～3中所含的氨基酸序列的序列号(各CDR的氨基酸序列的例示)
Figure GDA0002191125970000871
〔实施例7〕抗hTfR抗体对人TfR和猴TfR的亲和性的测定
抗hTfR抗体对人TfR和猴TfR的亲和性的测定用OctetRED96(ForteBio公司，Pall公司的一个分公司)来实施，所述OctetRED96为利用生物膜层干涉法(BioLayerInterferometry：BLI)的生物分子相互作用分析系统。对生物膜层干涉法的基本原理进行简单说明。对固定有传感器芯片表面的生物分子层(Layer)投射特定波长的光时，光被生物分子层和作为内部参照的层的两个表面反射，产生光的干涉波。测定试样中的分子与传感器芯片表面的生物分子结合而使传感器前端的层的厚度增加，使干涉波产生波长偏移。通过测定该波长偏移的变化，可以实时进行固定于传感器芯片表面的生物分子所结合的分子数的定量和动力学分析。测定大体上按照OctetRED96所附的操作手册来实施。作为人TfR，使用N末端添加有组氨酸标签的、具有序列号1所示的氨基酸序列中的从N末端侧起第89位的半胱氨酸残基到C末端的苯丙氨酸为止的hTfR的胞外区的氨基酸序列的重组人TfR(r人TfR：Sino Biological公司)。作为猴TfR，使用N末端添加有组氨酸标签的、具有序列号2所示的氨基酸序列中的从N末端侧起第89位的半胱氨酸残基到C末端的苯丙氨酸为止的食蟹猴的TfR的胞外区的氨基酸序列的重组猴TfR(r猴TfR：Sino Biological公司)。
将实施例5中选择出的克隆3株按照细胞浓度达到约2×105个/mL的方式用含有(1×)HAT补充剂(Life Technologies公司)和10％Ultra low IgG胎牛血清(LifeTechnologies公司)的RPMI1640培养基稀释，向1L的三角烧瓶中加入200mL的细胞悬浮液，在37℃下在含有5％CO2和95％空气的湿润环境中，以约70rpm的搅拌速度培养6～7天。对培养液进行离心操作后，用0.22μm过滤器(Millipore公司)过滤，回收培养上清。将回收的培养上清上样到预先用含有150mM NaCl的为柱体积的3倍体积的20mM Tris缓冲液(pH8.0)平衡了的蛋白G柱(柱体积：1mL，GE Healthcare公司)。然后用柱体积的5倍体积的同一缓冲液洗涤柱后，用含有150mM NaCl的柱体积的4倍体积的50mM甘氨酸缓冲液(pH2.8)洗脱所吸附的抗体，收集洗脱级分。向洗脱级分中添加1M Tris缓冲液(pH8.0)将pH调整为7.0。将其作为抗hTfR抗体号3的纯化品用于以下的实验。
将抗hTfR抗体号3的纯化品用HBS-P+(含有150mM NaCl、50μM EDTA和0.05％表面活性剂P20的10mM HEPES)进行2系列稀释，制备0.78125～50nM(0.117～7.5μg/mL)的7级浓度的抗体溶液。将该抗体溶液作为样品溶液。将r人TfR和r猴TfR分别用HBS-P+稀释，制备25μg/mL的溶液，分别作为r人TfR-ECD(Histag，组氨酸标签)溶液和r猴TfR-ECD(Histag)溶液。
将上述进行2系列稀释而制备的样品溶液以200μL/孔添加至96孔板，黑色(greiner bioone公司)中。另外，将上述制备的r人TfR-ECD(Histag)溶液和r猴TfR-ECD(Histag)溶液以200μL/孔添加至规定的孔中。向基线、解离用和洗涤用的孔中以200μL/孔添加HBS-P+。向再生用的孔中以200μL/孔添加10mM甘氨酸-HCl，pH1.7。向活性化用的孔中以200μL/孔添加0.5mM NiCl2溶液。将该板和生物传感器(Biosensor/Ni-NTA：ForteBio公司，Pall公司的一个分公司)设置在OctetRED96的规定位置。
使OctetRED96在下述表2所示的条件下工作，在取得数据后，用OctetRED96附带的分析软件将结合反应曲线拟合为1：1结合模型或2：1结合模型，测定抗hTfR抗体对r人TfR和r猴TfR的缔合速率常数(kon)和解离速率常数(koff)，计算解离常数(KD)。需要说明的是，测定在25～30℃的温度下实施。
[表2]
表2OctetRED96的工作条件
Figure GDA0002191125970000891
表3中示出抗hTfR抗体号3对人TfR和猴TfR的缔合速率常数(kon)和解离速率常数(koff)的测定结果和解离常数(kD)。
[表3]
表3抗hTfR抗体号3对人TfR及猴TfR的亲和性
kon(M-1s-1) koff(s-1) K0(M)
人TfR 6.53x 105 ＜1.0x 10-7 ＜1.0x 10-12
猴TfR 3.89x 105 ＜1.0x 10-7 ＜1.0x 10-12
抗hTfR抗体对人TfR的亲和性的测定结果是抗hTfR抗体号3与人TfR的解离常数为1×10-12M以下，与猴TfR的解离常数也为1×10-12M以下。这些结果表明抗hTfR抗体号3是不仅对人TfR具有高亲和性、也对猴TfR具有高亲和性的抗体。
〔实施例7-2〕抗hTfR抗体的使用小鼠的脑迁移评价
然后，对于抗hTfR抗体号3，使用将编码小鼠转铁蛋白受体的胞外区的基因置换为编码人转铁蛋白受体基因的胞外区的基因的hTfR敲入小鼠(hTfR-KI小鼠)，来评价各抗体通过BBB迁移到脑内的情况。hTfR-KI小鼠大体上通过下述方法来制作。另外，作为抗hTfR抗体号3，使用实施例7中制备的纯化品。
化学合成具有序列号45所示的碱基序列的DNA片段，所述序列号45所示的碱基序列为如下序列：在编码胞内区为小鼠TfR的氨基酸序列、胞外区为人TfR的氨基酸序列的嵌合hTfR的cDNA的3’侧配置有被loxP序列夹着的新霉素抗性基因。通过常规方法将该DNA片段整合到具有序列号46所示的碱基序列作为5’臂序列、具有序列号47所示的碱基序列作为3’臂序列的打靶载体中，利用电穿孔法将其导入到小鼠ES细胞中。在新霉素存在下对基因导入后的小鼠ES细胞进行选择培养，选择打靶载体已通过同源重组整合到染色体的小鼠ES细胞。将得到的基因重组小鼠ES细胞注入到ICR小鼠的8细胞期胚胎(宿主胚胎)，移植到通过与进行了输精管结扎的小鼠交配而得到的假孕小鼠(受体小鼠)。对于得到的产仔(嵌合小鼠)进行毛色判定，选择ES细胞在生物体的形成中有高效贡献的个体、即白色毛相对于整体毛色所占的比率高的个体。将该嵌合小鼠个体与ICR小鼠交配，得到F1小鼠。选出白色的F1小鼠，对从尾部组织提取的DNA进行分析，将染色体上小鼠转铁蛋白受体基因被置换为嵌合hTfR的小鼠作为hTfR-KI小鼠。
用荧光素标记试剂盒-NH2(同仁化学研究所)按照所附的操作手册通过异硫氰酸荧光素(FITC)对抗hTfR抗体号3的纯化品进行荧光标记。制备含有该FITC荧光标记的抗体的PBS溶液。将该抗体溶液按照给药的抗hTfR抗体的用量达到3mg/kg的方式对1只hTfR-KI小鼠(雄，10～12周龄)进行静脉注射。另外，作为对照。将同样制备的含有FITC荧光标记小鼠IgG1(西格玛公司)的PBS溶液以3mg/kg的用量对1只hTfR-KI小鼠(雄，10～12周龄)进行静脉注射。在静脉注射起约8小时后、用生理盐水进行全身灌流，摘取脑(含有大脑和小脑的部分)。测定所摘出的脑的重量(湿重)后，添加含有蛋白酶抑制剂混合物(西格玛公司)的T-PER(Thermo Fisher Scientific公司)，将脑组织制成匀浆液。将匀浆液离心并回收上清，用以下方法测定上清中所含的FITC荧光标记的抗体的量。首先，将抗FITC抗体(Bethyl公司)向High Bind Plate(高结合板)(Meso Scale Diagnostics公司)的各孔中各添加10μL，静置1小时，使其固定于板。然后向各孔中添加SuperBlock Blocking buffer in PBS(SuperBlock(PBS)封闭缓冲液)(Thermo Fisher Scientific公司)各150μL，振荡1小时，对板进行封闭。然后向各孔中添加脑组织的匀浆液的上清各25μL，振荡1小时。然后向各孔中添加SULFO-标签抗小鼠抗体(山羊)(Meso Scale Diagnostics公司)各25μL，振荡1小时。然后向各孔中添加Read buffer T(Meso Scale Diagnostics公司)各150μL，用SectorTMImager 6000reader测定来自各孔的发光量。利用浓度已知的FITC荧光标记的抗hTfR抗体的标准试样的测定值制作标准曲线，将各试样的测定值代入到标准曲线中，从而计算脑的每克重量(湿重)中所含的抗体量(脑组织中的抗hTfR抗体的浓度)。将其结果示于表4。
与对照相比，抗hTfR抗体号3在脑组织中的浓度为约27.8倍。该结果表明抗hTfR抗体号3具有积极通过BBB迁移到脑内的性质。
[表4]
表4脑组织中的抗hTfR抗体的浓度
Figure GDA0002191125970000921
〔实施例8〕抗hTfR抗体的使用猴的药代动力学分析
将抗hTfR抗体号3以5.0mg/kg的用量对雄性食蟹猴进行单次静脉内给药，给药8小时后用生理盐水实施全身灌流。另外，作为阴性对照，对未给药抗hTfR抗体的1只个体同样地进行全身灌流。灌流后，摘出包括延髓在内的脑组织。使用该脑组织，进行以下抗hTfR抗体的浓度测定和免疫组织化学染色。作为抗hTfR抗体号3，使用实施例7中记载的抗体的纯化品。
脑组织中的抗hTfR抗体的浓度测定大体上按照以下步骤进行。对于所采集的组织，将脑组织分成大脑、小脑、海马和延髓后，分别用含有蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich公司)的RIPA缓冲液(和光纯药工业株式会社)制成匀浆液离心，回收上清。将亲和纯化山羊抗小鼠IgG FcγpAb(Jackson ImmunoResearch公司)向高结合板(Meso ScaleDiagnostics公司)的各孔中添加各10μL，静置1小时，将其固定于板。然后向各孔中添加SuperBlock blocking buffer in PBS(Thermo Fisher Scientific公司)各150μL，振荡1小时，将板封闭。然后向各孔中添加脑组织的匀浆液的上清各25μL，振荡1小时。然后向各孔中添加亲和纯化山羊抗小鼠IgG Fab-生物素(Jackson ImmunoResearch公司)各25μL，振荡1小时。然后向各孔中添加SULFO-Tag-Streptavidin(SULFO标记的链霉亲和素)(MesoScale Diagnostics公司)各25μL，振荡0.5小时。向各孔中添加Read buffer T(Meso ScaleDiagnostics公司)各150μL，用SectorTM Imager 6000reader(Meso Scale Diagnostics公司)测定来自各孔的发光量。利用浓度已知的抗hTfR抗体的标准试样的测定值制作标准曲线，将各试样的测定值代入到标准曲线中，从而计算各脑组织的每克重量(湿重)中所含的抗体的量(脑组织中的抗hTfR抗体的浓度)。
将脑组织中的抗hTfR抗体的浓度测定的结果示于表5。在大脑、小脑、海马和颈脊髓中均确认到抗hTfR抗体号3的蓄积。这些结果表明抗hTfR抗体号3具有通过血脑屏障、在脑组织中蓄积的性质，表明通过使应在脑组织内发挥作用的药剂与这些抗体结合、从而可以使该药剂高效地在脑组织中蓄积。
[表5]
表5脑组织中的抗hTfR抗体的浓度(μg/g湿重)
抗体号 大脑 小脑海马 颈脊髓
3 0.72 0.60.33 0.31
脑组织中的抗hTfR抗体的免疫组织化学染色大体上按照以下步骤进行。用TissueTek Cryo 3DM(Sakura Finetek株式会社)将采集的组织快速冷冻到-80℃，制作组织的冷冻块。将该冷冻块薄切成4μm后，贴合于MAS涂层载玻片(松浪硝子株式会社)。使组织薄片与4％多聚甲醛(和光纯药工业株式会社)在4℃下反应5分钟，将组织薄片固定在载玻片上。然后，使组织薄片与含有0.3％双氧水的甲醇溶液(和光纯药工业株式会社)反应30分钟，使内源性过氧化物酶失活。然后使载玻片与SuperBlock blocking buffer in PBS在室温下反应30分钟，进行封闭。然后使组织薄片与小鼠IgG-重链和轻链抗体(Bethyl Laboratories公司)在室温下反应1小时。将组织薄片用DAB底物(3，3’-二氨基联苯胺，VectorLaboratories公司)显色，用Mayer’s苏木精(Merck公司)进行对比染色，脱水，透明后密封，用光学显微镜观察。
图1示出大脑皮质的抗hTfR抗体的免疫组织化学染色的结果。给药抗hTfR抗体号3的猴的大脑皮质中，确认到血管的特异性染色(图1b)。而且在脑血管外的脑实质区域也广泛确认到特异性染色。另一方面，作为对照的未给药抗hTfR抗体的猴的大脑皮质中未确认到染色，表明几乎不存在背景的染色(图1a)。
图2示出海马的抗hTfR抗体的免疫组织化学染色的结果。给药抗hTfR抗体号3的猴的大脑皮质中，确认到血管的特异性染色(图2b)。进而神经元样细胞也确认到特异性染色，另外在脑血管外的脑实质区域也广泛确认到特异性染色。另一方面，作为对照的未给药抗hTfR抗体的猴的海马中未确认到染色，表明几乎不存在背景的染色(图2a)。
图3示出小脑的抗hTfR抗体的免疫组织化学染色的结果。给药抗hTfR抗体号3的猴的大脑皮质中，确认到血管的特异性染色(图3b)。进而浦肯野细胞也确认到特异性染色。另一方面，作为对照的未给药抗hTfR抗体的猴的小脑中未确认到染色，表明几乎不存在背景的染色(图3a)。
根据以上的大脑、海马和小脑的免疫组织化学染色的结果，可认为：抗hTfR抗体号3可以与存在于脑血管内皮表面的hTfR结合，且在与hTfR结合后，通过血脑屏障向脑实质内迁移，进而在海马中从脑实质内被摄入到神经元样细胞中，在小脑中被摄入到浦肯野细胞中。
〔实施例9〕人源化抗hTfR抗体的制作
尝试了抗hTfR抗体号3的轻链和重链的可变区中所含的氨基酸序列的人源化。于是得到具有序列号17～序列号22所示的氨基酸序列的人源化的轻链的可变区、和具有序列号31～序列号36所示的氨基酸序列的人源化的重链的可变区(人源化抗hTfR抗体号3的轻链的可变区的氨基酸序列1～6、以及人源化抗hTfR抗体号3的重链的可变区的氨基酸序列1～6)。
〔实施例10〕编码人源化抗hTfR抗体的基因的构建
对于上述抗hTfR抗体号3，人工合成了含有如下基因的DNA片段，所述基因为编码分别包含人源化抗hTfR抗体的轻链和重链的可变区的轻链和重链的全长的基因。此时，在编码轻链的全长的基因的5’侧，从5’端起依次导入MluI序列和编码前导肽的序列，在3’侧导入NotI序列。另外，在编码重链的全长的基因的5’侧，从5’端起依次导入MluI序列和编码前导肽的序列，在3’侧导入NotI序列。需要说明的是，在此，所导入的前导肽发挥分泌信号的作用，即，使人源化抗体的轻链和重链在作为宿主细胞的哺乳动物细胞中表达时，使轻链和重链被分泌到细胞外。
对于抗hTfR抗体号3的轻链，合成了编码可变区具有序列号18所示的氨基酸序列的序列号23所示的氨基酸序列的轻链(以下，人源化抗hTfR抗体号3的轻链)的全长的DNA片段(序列号24)。对于抗hTfR抗体号3的重链，合成了编码可变区具有序列号32所示的氨基酸序列的序列号37所示的氨基酸序列的重链(以下，人源化抗hTfR抗体号3的重链)的全长的DNA片段(序列号38)。序列号38所示的DNA片段所编码的人源化抗hTfR抗体的重链为IgG1。
对于抗hTfR抗体号3的轻链，还合成了编码可变区具有序列号20所示的氨基酸序列的序列号25所示的氨基酸序列的轻链(以下，人源化抗hTfR抗体号3-2的轻链)的全长的DNA片段(序列号26)、编码可变区具有序列号21所示的氨基酸序列的序列号27所示的氨基酸序列的轻链(以下，人源化抗hTfR抗体号3-3的轻链)的全长的DNA片段(序列号28)、和编码可变区具有序列号22所示的氨基酸序列的序列号29所示的氨基酸序列的轻链(以下，人源化抗hTfR抗体号3-4的轻链)的全长的DNA片段(序列号30)。
进而，对于抗hTfR抗体号3的重链，合成了编码可变区具有序列号32所示的氨基酸序列的序列号39所示的氨基酸序列的重链(以下，人源化抗hTfR抗体号3的重链IgG4)的全长的DNA片段(序列号40)。该序列号40所示的DNA片段所编码的人源化抗hTfR抗体的重链为IgG4。
〔实施例11〕人源化抗hTfR抗体表达载体的构建
将pEF/myc/nuc载体(Invitrogen公司)用KpnI和NcoI消化，切出含有EF-1α启动子及其第一内含子的区域，将其用T4 DNA聚合酶进行平末端化处理。将pCI-neo(Invitrogen公司)用BglII和EcoRI消化，切出含有CMV的增强子/启动子和内含子的区域后，用T4 DNA聚合酶进行平末端化处理。向其中插入上述含有EF-1α启动子及其第一内含子的区域，构建pE-neo载体。将pE-neo载体用SfiI和BstXI消化，切出含有新霉素抗性基因的约1kbp的区域。以pcDNA3.1/Hygro(+)(Invitrogen公司)为模板用引物Hyg-Sfi5’(序列号43)和引物Hyg-BstX3’(序列号44)通过PCR反应扩增潮霉素基因。将扩增出的潮霉素基因用SfiI和BstXI消化，插入到上述切除了新霉素抗性基因的pE-neo载体中，构建pE-hygr载体。
将pE-hygr载体和pE-neo载体分别用MluI和NotI消化。将实施例10中合成的编码人源化抗hTfR抗体号3的轻链的DNA片段(序列号24)和编码重链的DNA片段(序列号38))用MluI和NotI消化，分别插入到pE-hygr载体和pE-neo载体的MluI-NotI之间。将得到的载体分别作为人源化抗hTfR抗体号3的轻链表达用载体pE-hygr(LC3)、人源化抗hTfR抗体号3的重链表达用载体pE-neo(HC3)用于以下实验。
进而，对于抗hTfR抗体号3的轻链，将实施例10中合成的编码人源化抗hTfR抗体号3-2的轻链的DNA片段(序列号26)、编码人源化抗hTfR抗体号3-3的轻链的DNA片段(序列号28)和编码人源化抗hTfR抗体号3-4的轻链的DNA片段(序列号30)用MluI和NotI消化，插入到pE-hygr载体的MluI-NotI之间，分别构建人源化抗hTfR抗体号3-2的轻链表达用载体pE-hygr(LC3-2)、人源化抗hTfR抗体号3-3的轻链表达用载体pE-hygr(LC3-3)和人源化抗hTfR抗体号3-4的轻链表达用载体pE-hygr(LC3-4)。
进而，同样地对于抗hTfR抗体号3的重链，将实施例10中合成的编码人源化抗hTfR抗体号3的重链IgG4的DNA片段(序列号40)用MluI和NotI消化，插入到pE-neo载体的MluI-NotI之间，构建人源化抗hTfR抗体号3的重链IgG4表达用载体pE-neo(HC3-IgG4)。
〔实施例12〕人源化抗hTfR抗体表达用细胞的构建
利用下述方法，用GenePulser(Bio-Rad公司)通过实施例11中构建的轻链表达用载体pE-hygr(LC3)和重链表达用载体pE-neo(HC3)转化CHO细胞(CHO-K1：由美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)获得)。细胞的转化为大体上按照以下方法进行。将5×105个CHO-K1细胞接种到添加有CD OptiCHOTM培养基(LIFE TECHNOLOGYINC.)的3.5cm培养盘中，在37℃、5％CO2的条件下培养过夜。将培养基交换为Opti-MEMTM I培养基(LIFE TECHNOLOGY INC.)，按照达到5×106细胞/mL的密度使细胞悬浮。取细胞悬浮液100μL，向其中添加用Opti-MEMTM I培养基稀释成100μg/mL的pE-hygr(LC3)和pE-neo(HC3)质粒DNA溶液各5μL。用GenePulser(Bio-Rad公司)实施电穿孔，向细胞中导入质粒。将细胞在37℃、5％CO2的条件下培养过夜后，用添加有0.5mg/mL的潮霉素和0.8mg/mL的G418的CD OptiCHOTM培养基进行选择培养。
然后，利用有限稀释法按照每1孔中接种1个以下细胞的方式在96孔板上接种通过选择培养所选出的细胞，按照使各细胞形成单克隆集落的方式培养约10天。采集形成了单克隆集落的孔的培养上清，通过ELISA法考察培养上清中的人源化抗体含量，选择人源化抗体高表达细胞株。
该时的ELISA法大体上通过以下的方法实施。向96孔微量滴定板(Nunc公司)的各孔中，添加将山羊抗人IgG多克隆抗体溶液用0.05M碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)稀释成4μg/mL的溶液各100μL，在室温下至少静置1小时，使抗体吸附于板。然后用PBS-T将各孔洗涤3次后，将Starting Block(PBS)Blocking Buffer(Thermo Fisher Scientific公司)向各孔中添加各200μL，将板在室温下静置30分钟。将各孔用PBS-T洗涤3次后，将用在PBS中添加有0.5％BSA和0.05％Tween 20的溶液(PBS-BT)稀释成合适浓度的培养上清或人IgG标准品向各孔中添加各100μL，将板在室温下至少静置1小时。将板用PBS-T洗涤3次后，将用PBS-BT稀释的HRP标记抗人IgG多克隆抗体溶液向各孔中添加各100μL，将板在室温下至少静置1小时。用PBS-T将各孔洗涤3次后，将含有磷酸-柠檬酸缓冲液(pH 5.0)的0.4mg/mL邻苯二胺向各孔中添加各100μL，在室温下静置8～20分钟。然后，将1mol/L硫酸向各孔中添加各100μL，使反应停止，用96孔板酶标仪测定各孔在490nm处的吸光度。将与显示高测定值的孔对应的细胞作为人源化抗hTfR抗体号3的高表达细胞株。将其作为抗体号3表达株。
进而，同样用实施例11中构建的轻链表达用载体pE-hygr(LC3-2)和重链表达用载体pE-neo(HC3)转化CHO细胞，得到人源化抗hTfR抗体号3-2的高表达细胞株。将其作为抗体号3-2表达株。
进而，同样用实施例11中构建的轻链表达用载体pE-hygr(LC3-3)和重链表达用载体pE-neo(HC3)转化CHO细胞，得到人源化抗hTfR抗体号3-3的高表达细胞株。将其作为抗体号3-3表达株。
进而，同样用实施例11中构建的轻链表达用载体pE-hygr(LC3-4)和重链表达用载体pE-neo(HC3)转化CHO细胞，得到人源化抗hTfR抗体号3-4的高表达细胞株。将其作为抗体号3-4表达株。
进而，同样用实施例11中构建的轻链表达用载体pE-hygr(LC3)和重链表达用载体pE-neo(HC3-IgG4)转化CHO细胞，得到人源化抗hTfR抗体号3(IgG4)的高表达细胞株。将其作为抗体号3(IgG4)表达株。
进而，同样用实施例11中构建的轻链表达用载体pE-hygr(LC3-2)和重链表达用载体pE-neo(HC3-IgG4)转化CHO细胞，得到人源化抗hTfR抗体号3-2(IgG4)的高表达细胞株。将其作为抗体号3-2(IgG4)表达株。
〔实施例13〕人源化抗hTfR抗体的纯化
将实施例12中得到的抗体号3表达株、抗体号3-2表达株、抗体号3-3表达株和抗体号3-4表达株分别按照细胞浓度达到约2×105个/mL的方式用CD OptiCHOTM培养基稀释，向1L的三角烧瓶中加入200mL的细胞悬浮液，在37℃下在含有5％CO2和95％空气的湿润环境中，以约70rpm的搅拌速度培养6～7天。通过离心操作回收培养上清，用0.22μm过滤器(Millipore公司)过滤，作为培养上清。向所回收的培养上清中添加含有150mM NaCl的5倍体积的20mM Tris缓冲液(pH8.0)，上样到预先用含有150mM NaCl的为柱体积的3倍体积的20mM Tris缓冲液(pH8.0)平衡化的蛋白质A柱(柱体积：1mL，Bio-Rad公司)中。然后用柱体积的5倍体积的同一缓冲液洗涤柱后，用含有150mM NaCl的柱体积的4倍体积的50mM甘氨酸缓冲液(pH2.8)洗脱所吸附的人源化抗体，收集洗脱级分，向洗脱级分中添加1M Tris缓冲液(pH8.0)进行中和，将其作为抗体的纯化品。
在此，将从抗体号3表达株的培养上清纯化的抗体作为人源化抗hTfR抗体号3。将从抗体号3-2表达株的培养上清纯化的抗体作为人源化抗hTfR抗体号3-2。将从抗体号3-3表达株的培养上清纯化的抗体作为人源化抗hTfR抗体号3-3。另外，将从抗体号3-4表达株的培养上清纯化的抗体作为人源化抗hTfR抗体号3-4。
另外，对于实施例12中得到的抗体号3(IgG4)表达株和抗体号3-2(IgG4)表达株，也与上述同样地进行培养，由其培养上清分别得到纯化的人源化抗hTfR抗体号3(IgG4)和人源化抗hTfR抗体号3-2(IgG4)。这2种抗体用于记载于实施例15的使用猴的药代动力学分析。
〔实施例14〕人源化抗hTfR抗体对人TfR和猴TfR的亲和性的测定
通过实施例7中记载的方法测定了实施例13中得到的人源化抗hTfR抗体对人TfR和猴TfR的亲和性。表6中示出人源化抗hTfR抗体号3～3-4(表中，分别对应于No.3～3-4)对人TfR的缔合速率常数(kon)和解离速率常数(koff)的测定结果和解离常数(kD)。
[表6]
表6人源化抗hTfR抗体对人TfR的亲和性
抗体号 kon(M-1s-1) koff(s-1) KD(M)
3 1.19x 106 ＜1.0x 10-7 ＜1.0x 10-12
3-2 6.06x 105 1.45x 10-5 2.39x 10-11
3-3 6.00x 105 1.25x 10-5 2.09x 10-11
3-4 1.01x 106 ＜1.0x 10-7 ＜1.0x 10-12
表7中示出人源化抗hTfR抗体号3～3-4(表中，分别对应于抗体号3～3-4)对猴TfR的缔合速率常数(kon)和解离速率常数(koff)的测定结果和解离常数(kD)。
[表7]
表7人源化抗hTfR抗体对猴TfR的亲和性
抗体号 kon(M-1s-1) koff(s-1) KD(M)
3 6.03x 105 6.76x 10-4 1.12x10-9
3-2 4.95x 105 8.76x 10-4 1.77x 10-9
3-3 4.88x 105 9.32x 10-4 1.91x 10-9
3-4 5.19x105 1.35x 1O-4 2.60x 10-10
人源化抗hTfR抗体号3～3-4对人TfR的亲和性的测定结果是，人源化抗hTfR抗体号3和3-4抗体与人TfR的解离常数小于1×10-12M(表6)。另外，人源化抗hTfR抗体号3-2和3-3与人TfR的解离常数分别为2.39×10-11M和2.09×10-11M。另一方面，关于与这些抗体对应的人源化前的抗hTfR抗体(抗体号3)与人TfR的解离常数小于1×10-12M(表3)。这些结果表明抗hTfR抗体对人TfR的高亲和性在抗体人源化的前后得到维持。
然后观察人源化抗hTfR抗体对猴TfR的亲和性的测定结果，就人源化抗hTfR抗体号3～3-4而言，与人源化前的这些抗体对应的抗hTfR抗体号3与猴TfR的解离常数小于1×10-12M，但人源化后为2.60×10-10M～1.91×10-9M，观察到对猴TfR的亲和性降低(表3、表7)。虽然对于人源化抗hTfR抗体号3观察到与猴TfR的亲和性降低，但这些结果表明抗hTfR抗体对猴TfR的高亲和性在抗体人源化前后并非丧失、而是大体上得到维持。
〔实施例15〕人源化抗hTfR抗体的使用猴的药代动力学分析
使用人源化抗hTfR抗体号3、人源化抗hTfR抗体号3-2、人源化抗hTfR抗体号3(IgG4)和人源化抗hTfR抗体号3-2(IgG4)这4种抗体，进行使用猴的药代动力学分析。需要说明的是，人源化抗hTfR抗体号3的重链为IgG1，人源化抗hTfR抗体号3(IgG4)是将人源化抗hTfR抗体号3的重链在可变区保持原样的状态下变更为IgG4的抗体。另外，人源化抗hTfR抗体号3-2的重链为IgG1，人源化抗hTfR抗体号3-2(IgG4)是将人源化抗hTfR抗体号3-2的重链在可变区保持原样的状态下变更为IgG4的抗体。将这4种抗体分别以5.0mg/kg的用量分别对雄性食蟹猴进行单次静脉内给药，在给药前、给药后2分钟、30分钟、2小时、4小时和8小时后采集外周血，采血后实施全身灌流。另外，作为阴性对照，将针对HER2蛋白的作为人源化抗体的曲妥珠单抗(HerceptinTM，中外制药)同样地给药于一只个体，在给药前、给药后2分钟、30分钟、2小时、4小时和8小时后采集外周血，采血后实施全身灌流。灌流后，摘出包括延髓在内的脑组织、脊髓组织及其它组织(包括肝脏、心脏、脾脏和骨髓)。使用该脑组织、脊髓组织及其它组织进行以下的人源化抗hTfR抗体的浓度测定和免疫组织化学染色。
组织中和外周血中的人源化抗hTfR抗体的浓度测定大体上按照以下步骤进行。需要说明的是，对于脑，将所采集的组织分成大脑皮质、小脑、海马和延髓后，进行人源化抗hTfR抗体的浓度测定。将所采集的组织分别用含有蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich公司)的RIPA缓冲液(和光纯药工业株式会社)制成匀浆液，离心回收上清。对于外周血，分离出血清。将Anti-Human Kappa Light Chain Goat IgG Biotin(抗人Kappa轻链山羊IgG生物素)(株式会社免疫生物研究所)、Sulfo-标签抗人IgG(H+L)抗体(Bethyl公司)和脑组织匀浆液添加到用SuperBlock blocking buffer in PBS(Thermo Fisher Scientific公司)实施了封闭的链霉亲和素板(Meso Scale Diagnostics公司)，振荡1小时而固定到板上。然后向各孔中各添加Read buffer T(Meso Scale Diagnostics公司)150μL，用SectorTMImager 6000reader测定来自各孔的发光量。利用浓度已知的抗hTfR抗体的标准试样的测定值制作标准曲线，将各被试样的测定值代入到标准曲线中，由此计算各组织中和外周血中所含的抗体的量。浓度的测定对各样品重复进行3次。。
将脑组织和脊髓组织中的人源化抗hTfR抗体的浓度测定的结果示于表8。
[表8]
表8脑组织中的人源化抗hTfR抗体的浓度(μg/g湿重)
抗体号 大脑皮质 小脑 海马 延髓 脊髓
3 0.67±0.12 O.61±0.02 0.49±0.02 0.59±0.10 0.46±0.17
3-2 1.05±0.07 0.72±0.04 0.72±0.07 0.69±0.03 0.46±0.02
3(IgG4) 0.65±0.05 0.59±0.03 0.56±0.02 0.59±0.02 0.46±0.07
3-2(lgG4) 0.76±0.02 0.57±0.07 0.62±0.05 0.73±0.16 0.48±0.03
阴性对照 0.0082±0.0032 0.0090±0.0067 0.0053±0.0009 0.011±0.003 0.15±0.04
人源化抗hTfR抗体号3、人源化抗hTfR抗体号3-2、人源化抗hTfR抗体号3(IgG4)和人源化抗hTfR抗体号3-2(IgG4)的抗体均确认到在大脑皮质、小脑、海马、延髓和脊髓中的蓄积(表8)。关于其量，人源化抗hTfR抗体号3与阴性对照的曲妥珠单抗(HerceptinTM)相比，大脑皮质中为约82倍，小脑中为约68倍，海马中为约92倍，延髓中为约54倍，脊髓中为约3.1倍，人源化抗hTfR抗体号3-2与阴性对照的曲妥珠单抗相比，大脑皮质中为约128倍，小脑中为约80倍，海马中为约136倍，延髓中为约63倍，脊髓中为约3.1倍，人源化抗hTfR抗体号3(IgG4)与阴性对照的曲妥珠单抗相比，大脑皮质中为约79倍，小脑中为约66倍，海马中为约106倍，延髓中为约54倍，脊髓中为约3.1倍，人源化抗hTfR抗体号3-2(IgG4)与阴性对照的曲妥珠单抗相比，大脑皮质中为约93倍，小脑中为约63倍，海马中为约117倍，延髓中为约66倍，脊髓中为约3.2倍(表9)。这些结果表明：这4种人源化抗hTfR抗体具有通过血脑屏障、在脑组织中蓄积的性质，通过使应在脑组织内发挥作用的药剂与这些抗体结合、从而可以使该药剂高效地在脑组织中蓄积。
[表9]
表9脑组织中的人源化抗hTfR抗体的蓄积量(与阴性对照比较的蓄积倍率)
抗体号 大脑皮质 小脑 海马 延髓 脊髓
3 82 68 g2 54 3.1
3-2 128 80 136 63 3.1
3(IgG4) 79 66 106 54 3.1
3-2(IgG4) 93 63 117 66 3.2
阴性对照 1 1 1 1 1
然后，将肝脏、心脏、脾脏和骨髓各组织中的人源化抗hTfR抗体的浓度测定的结果示于图4。在肝脏和脾脏中，4种人源化抗hTfR抗体和阴性对照曲妥珠单抗均确认到蓄积，关于其量，人源化抗hTfR抗体与曲妥珠单抗同等。心脏中，有人源化抗hTfR抗体与阴性对照曲妥珠单抗相比蓄积量更多的倾向，关于其量，止于阴性对照的1.5倍～2.8倍左右。骨髓中，有人源化抗hTfR抗体与阴性对照曲妥珠单抗相比蓄积量显著多的倾向，关于其量，为阴性对照的3.5～16倍。关于人源化抗hTfR抗体向骨髓中的蓄积，可认为原因在于，在作为造血器官的骨髓中，TfR的表达量多，通过与TfR结合，与阴性对照相比更多的人源化抗hTfR抗体蓄积下来。这些数据表明：这4种人源化抗hTfR抗体具有在作为中枢神经系统的大脑、小脑、海马和延髓中特异性蓄积的性质，表明通过使应在脑组织内发挥作用的药剂与这些抗体结合，可以使该药剂高效地在脑组织中蓄积。
然后，将人源化抗hTfR抗体的血药动力学的测定结果示于表9-2。4种人源化抗hTfR抗体与阴性对照曲妥珠单抗同样地在给药后8小时时显示血药浓度为60μg/mL以上的高值，表明在血中是稳定(表9-2)的。
[表9-2]
表9-2人源化抗hTfR抗体的血药动力学(μg/mL血液)
Figure GDA0002191125970001051
脑组织中的人源化抗hTfR抗体的免疫组织化学染色按照实施例8中记载的方法来进行。其中，此时使用Human IgG-heavy and light chain Antibody(人IgG重链和轻链抗体)(Bethyl Laboratories公司)来代替Mouse IgG-heavy and light chain Antibody(小鼠IgG重链和轻链抗体)(Bethyl Laboratories公司)。
图5示出大脑皮质的人源化抗hTfR抗体的免疫组织化学染色的结果。给药人源化抗hTfR抗体号3、人源化抗hTfR抗体号3-2、人源化抗hTfR抗体号3(IgG4)和人源化抗hTfR抗体号3-2(IgG4)的猴的大脑皮质中，确认到血管和神经元样细胞的特异性染色(分别如图5b～e)。特别是给药人源化抗hTfR抗体号3-2的猴的大脑皮质(图5c)中，在脑血管外的脑实质区域也广泛确认到特异性染色。需要说明的是，作为对照的给药Herceptin的猴的大脑皮质中未确认到染色，表明图5b～e中观察到的组织染色是对人源化抗hTfR抗体特异性的染色(图5a)。
图6示出海马的人源化抗hTfR抗体的免疫组织化学染色的结果。给药人源化抗hTfR抗体号3、人源化抗hTfR抗体号3-2、人源化抗hTfR抗体号3(IgG4)和人源化抗hTfR抗体号3-2(IgG4)的猴的海马中，确认到血管和神经元样细胞的特异性染色(分别如图6b～e)。需要说明的是，作为对照的给药Herceptin的猴的海马中未确认到染色，表明图6b～e中观察到的组织染色是对人源化抗hTfR抗体特异性的染色(图6a)。
图7示出小脑的人源化抗hTfR抗体的免疫组织化学染色的结果。给药人源化抗hTfR抗体号3、人源化抗hTfR抗体号3-2、人源化抗hTfR抗体号3(IgG4)和人源化抗hTfR抗体号3-2(IgG4)的猴的小脑中，确认到血管和浦肯野细胞的特异性染色(分别如图7b～e)。需要说明的是，作为对照的给药Herceptin的猴的小脑中未确认到染色，表明图7b～e中观察到的组织染色是对人源化抗hTfR抗体特异性的染色(图7a)。
图8示出延髓的人源化抗hTfR抗体的免疫组织化学染色的结果。给药人源化抗hTfR抗体号3、人源化抗hTfR抗体号3-2、人源化抗hTfR抗体号3(IgG4)和人源化抗hTfR抗体号3-2(IgG4)的猴的延髓中，确认到血管和神经元样细胞的特异性染色(分别如图8b～e)。需要说明的是，作为对照的给药Herceptin的猴的延髓中未确认到染色，表明图8b～e中观察到的组织染色是对人源化抗hTfR抗体特异性的染色(图8a)。
根据上述实施例8的大脑和小脑的免疫组织化学染色的结果，作为人源化前的小鼠抗体的抗hTfR抗体号3可以与存在于脑血管内皮表面的hTfR结合，且与hTfR结合后，通过血脑屏障向脑实质内迁移，进而，在海马中从脑实质内被摄入到神经元样细胞，在小脑中被摄入到浦肯野细胞。
根据实施例15的大脑、海马、小脑和延髓的免疫组织化学染色的结果，可知：供于实验的将抗hTfR抗体号3人源化而得到的4种人源化抗hTfR抗体与存在于脑血管内皮表面的hTfR结合，且与hTfR结合后，通过血脑屏障向脑实质内迁移，进而在大脑皮质中被摄入到神经元样细胞，在海马中从脑实质内被摄入到神经元样细胞，在小脑内被摄入到浦肯野细胞，在延髓内被摄入到神经元样细胞。
[实施例15-2]hBDNF-人源化抗hTfR抗体融合蛋白(hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白)表达用细胞的制作
人工合成包含编码如下融合蛋白的基因的具有序列号78所示的碱基序列的DNA片段，该融合蛋白是于具有序列号56所示的氨基酸序列的hBDNF的前体的C末端侧，经由由继Gly-Ser后序列号3所示的氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser反复5次的共计27个氨基酸构成的接头序列，融合具有序列号77所示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体Fab重链所得。此处，序列号77所示的氨基酸序列与序列号37所示的氨基酸序列的N末端侧起第1位～第226位相当。此处，N末端侧起第1位～第118位的氨基酸序列与序列号32(人源化抗hTfR抗体号3的重链的可变区的氨基酸序列2)相当，N末端侧起第119位～第216位的氨基酸序列与CH1区域相当，N末端侧起第217位～第226位的氨基酸序列与铰链部相当。
该DNA片段编码具有序列号79所示的氨基酸序列的hBDNF的前体与人源化抗hTfR抗体Fab重链的融合蛋白。具有序列号79所示的氨基酸序列的融合蛋白是在表达后经加工而成为具有序列号80所示的氨基酸序列的hBDNF与人源化抗hTfR抗体Fab重链的融合蛋白。在序列号79所示的氨基酸序列中，N末端侧起第1位～第110位的氨基酸序列是hBDNF自前体向成熟型加工时被去除的部分。利用MluI与NotI消化该DNA片段，整合至pE-neo载体的MluI与NotI之间，从而构建出pE-neo(BDNF-Fab HC-1)。
通过实施例12所记载的方法，利用pE-neo(BDNF-Fab HC-1)与实施例11中所构建的pE-hygr(LC3)转化CHO细胞(CHO-K1：自美国菌种保藏中心(American Type CultureCollection)获取)，从而获得表达hBDNF与人源化抗hTfR抗体的融合蛋白的细胞株。将该细胞株设为hBDNF-抗hTfR抗体(3)1表达株。将该细胞株所表达的hBDNF与人源化抗hTfR抗体的融合蛋白设为hBDNF-抗hTfR抗体(3)1。
[实施例15-3]hBDNF-抗hTfR抗体(3)1的制作
使用实施例15-2中所获得的hBDNF-抗hTfR抗体(3)1表达株，利用实施例13所记载的方法，获得hBDNF-抗hTfR抗体(3)1的纯化品。
〔实施例16〕向人源化抗hTfR抗体号3的重链中导入变异
制作了在序列号37所示的人源化抗hTfR抗体号3的重链的可变区中使CDR1为序列号12所示的序列、对该CDR1的氨基酸序列中的1个进行置换并且对框架区3的氨基酸序列中的1个进行置换的人源化抗体的重链。该新的抗体的重链中，CDR1含有序列号66(或含有其的序列号67)的氨基酸序列且框架区3含有序列号68的氨基酸序列，因此，对序列号37所示的构成人源化抗hTfR抗体号3的重链的氨基酸序列的氨基酸中的2个进行了置换。该新的抗体(人源化抗hTfR抗体号3N)的重链含有序列号70的氨基酸序列，其可变区含有序列号69所示的氨基酸序列。
表10示出了人源化抗hTfR抗体号3的重链中的序列号12的CDR1与人源化抗hTfR抗体号3N的重链中的序列号66的CDR1的比对。在该比对中，N末端侧起第5位的氨基酸从苏氨酸置换为甲硫氨酸。
表11示出人源化抗hTfR抗体号3的重链中的框架区3(序列号83)与人源化抗hTfR抗体号3N的重链中的框架区3(序列号68)的氨基酸序列的比对。在该比对中，N末端侧起第17位的氨基酸由色氨酸置换为亮氨酸。
[表10]
表10 CDR1的氨基酸序列的比对
Figure GDA0002191125970001081
*表示相同氨基酸。人源化抗hTfR抗体号3与人源化抗hTfR抗体号3N的CDR1的序列分别由序列号12和序列号66所示。
[表11]
表11框架区3(FR3)的氨基酸序列的比对
Figure GDA0002191125970001091
*表示相同氨基酸。人源化抗hTfR抗体号3与人源化抗hTfR抗体号3的FR3的序列分别由序列号83和序列号68所示。
〔实施例17〕人源化抗hTfR抗体号3N表达用细胞的构建
人工合成了含有编码由序列号70所示的氨基酸序列构成的抗体重链的基因的DNA片段(序列号71)。在该DNA片段的5’侧从5’端起依次导入编码MluI序列和前导肽的序列，在3’侧导入NotI序列。将这样合成的DNA用实施例11中记载的方法整合到pE-neo载体中，将得到的载体作为人源化抗hTfR抗体号3N的重链表达用载体的pE-neo(HC3)N。使用该pE-neo(HC3)N和实施例11中构建的轻链表达用载体pE-hygr(LC3)按照实施例12中记载的方法转化CHO细胞，得到人源化抗hTfR抗体号3N表达株。
〔实施例18〕人源化抗hTfR抗体号3N的纯化
使用实施例17中得到的人源化抗hTfR抗体号3N表达株按照实施例13中记载的方法得到人源化抗hTfR抗体号3N的纯化品。需要说明的是，人源化抗hTfR抗体号3N是在人源化抗hTfR抗体号3的重链的氨基酸序列中置换了表10和表11所示的2处氨基酸的抗体。另一方面，人源化抗hTfR抗体号3N与人源化抗hTfR抗体号3的轻链的氨基酸序列相同。
〔实施例19〕人源化抗hTfR抗体号3与人源化抗hTfR抗体号3N对人TfR和猴TfR的亲和性的比较
按照实施例7中记载的方法测定了实施例13中得到的人源化抗hTfR抗体号3和实施例17中得到的人源化抗hTfR抗体号3N对人TfR的亲和性。表12示出各抗体对人TfR的缔合速率常数(kon)和解离速率速率(koff)的测定结果、和解离常数(KD)。需要说明的是，表示人源化抗hTfR抗体号3对人TfR的亲和性的测定值与表6所示的值不同，为实验误差。
[表12]
表12人源化抗hTfR抗体对人TfR的亲和性
kon(M-1s-1) koff(s-1) K0(M)
人源化抗hTfR抗体3 8.47x 105 ＜1.0x 10-7 ＜1.0x 10-12
人源化抗hTfR抗体3N 7.84x 105 ＜1.0x 10-7 ＜1.0x 10-12
按照实施例7中记载的方法测定了实施例13中得到的人源化抗hTfR抗体号3与实施例18中得到的人源化抗hTfR抗体号3N对猴TfR的亲和性。表13中示出各抗体对猴TfR的缔合速率常数(kon)和解离速率速率(koff)的测定结果、和解离常数(KD)。需要说明的是，表示人源化抗hTfR抗体号3对猴TfR的亲和性的测定值与表7所示的值不同，为实验误差。
[表13]
表13人源化抗hTfR抗体对猴TfR的亲和性
kon(M-1s-1) koff(s-1) K0(M)
人源化抗hTfR抗体3 6.09x 105 8.06x 10-4 1.32x 10-9
人源化抗hTfR抗体3N 3.86x 105 1.96x10-5 5.07x 10-11
对人源化抗hTfR抗体号3N和人源化抗hTfR抗体号3与猴TfR的KD值进行比较，前者为5.07×10-11M，后者为1.32×10-9M，对人源化抗hTfR抗体号3N与猴TfR的KD值与人源化抗hTfR抗体号3的该值进行比较为约三十分之一。另一方面，对人源化抗hTfR抗体号3N和人源化抗hTfR抗体号3与人TfR的KD值进行比较，均小于1×10-12M，任一抗体与人TfR均具有高亲和性。另外，与对猴TfR的亲和性相比，任一抗体对人TfR均具有高亲和性。
就开发人源化抗hTfR抗体来作为药剂时实施的非临床试验的一环，通常实施使用猴的药理试验。在此，使用猴的药理试验的结果被用于判定实施使用人的临床试验的妥当性，因此优选在猴体内的行为与给药于人时的行为形式。如上述结果所示，人源化抗hTfR抗体号3N对猴TfR的亲和性显示为人源化抗hTfR抗体号3的约30倍的高值，因此人源化抗hTfR抗体号3N在猴体内的行为可以说更接近于给药于人时的行为。因此，通过使用人源化抗hTfR抗体号3N在使用猴的试验中可得到更能反映给药于人时的行为的结果。因此，通过使用猴的试验作为实施使用人的临床试验时的判断材料，将得到更有益的结果。
〔实施例20〕人源化抗hTfR抗体号3和人源化抗hTfR抗体号3N的使用猴的向脑组织的迁移性的比较
将实施例13中得到的人源化抗hTfR抗体号3和实施例17中得到的人源化抗hTfR抗体号3N分别分别以5.0mg/kg的用量分别对雄性食蟹猴进行单次静脉内给药，给药8小时后实施全身灌流。灌流后摘出包括延髓在内的脑组织和脊髓组织。对于脑组织，摘出后分成大脑皮质、小脑、海马和延髓。
各组织中所含的人源化抗hTfR抗体的浓度测定基于实施例15中记载的测定方法来进行。
将脑组织中的抗hTfR抗体的浓度测定的结果示于表14。对人源化抗hTfR抗体号3N和人源化抗hTfR抗体号3在大脑、小脑、海马中的浓度进行比较，人源化抗hTfR抗体号3N的浓度在大脑中为约1.42倍、在小脑中为约1.56倍、在海马中为约1.29倍，显示为比人源化抗hTfR抗体号3高的值。在延髓中两者的浓度大致相同。在脊髓中，人源化抗hTfR抗体号3N的浓度为约1.47倍，显示出比人源化抗hTfR抗体号3高的值。这些结果表明，人源化抗hTfR抗体号3N与人源化抗hTfR抗体号3相比具有更高效地通过血脑屏障并在大脑、小脑、海马等脑组织中蓄积的性质。即，表明人源化抗hTfR抗体号3N具有如下性质：通过使应在脑组织中发挥作用的药剂与这些抗体结合、从而从而可以使该药剂高效地在脑组织中蓄积。
[表14]
表14脑组织中的抗hTfR抗体的浓度(μg/g湿重)
抗体号 大脑 小脑 海马 延髓 颈脊髓
3 0.670 0.610 0.490 0.589 0.589
3N 0.953 0.950 0.631 0.586 0.672
〔实施例20-2〕hFc-人源化抗hTfR抗体表达用细胞的制作
人工合成了含有编码人源化抗hTfR抗体3N的Fab重链的氨基酸序列的基因的DNA片段(序列号82)，所述Fab重链的氨基酸序列导入有由序列号81所示的氨基酸序列构成的人IgG Fc区。在该DNA片段的5’侧从5’端起依次导入编码MluI序列和前导肽的序列，在3’侧导入NotI序列。将这样合成的DNA用实施例11中记载的方法整合到pE-neo载体中，将得到的载体作为pE-neo(Fc—Fab HC(3N))。使用该pE-neo(Fc—Fab HC(3N))和实施例11中构建的轻链表达用载体pE-hygr(LC3)按照实施例12中记载的方法转化CHO细胞，得到Fc-Fab(3N)表达株。
〔实施例20-3〕hFc-人源化抗hTfR抗体的制作
使用Fc-Fab(3N)表达株，按照实施例13中记载的方法得到Fc-Fab(3N)的纯化品。
〔实施例20-4〕hFc-人源化抗hTfR抗体对人TfR和猴TfR的亲和性的比较
按照实施例7中记载的方法测定了实施例20-3中得到的Fc-Fab(3N)的纯化品对人TfR和猴TfR的亲和性。将结果示于表14-2。该结果表明Fc-Fab(3N)具有下述性质：通过使应在脑组织中发挥作用的药剂与这些抗体结合，从而可以使该药剂高效地在脑组织中蓄积。
[表14-2]
表14-2 hFc-人源化抗hTfR抗体对人TfR及猴TfR的亲和性
kon(M-1s-1) koff(s-1) KD(M)
人TfR 6.67x 105 ＜1.0x 10-7 ＜1.0x 10-12
猴TfR 2.43x 105 2.09x 10-4 8.61x 10-10
〔实施例20-5〕hFc-人源化抗hTfR抗体的使用猴的向脑组织的迁移性的测定
将实施例20-3中得到的Fc-Fab(3N)分别以5.0mg/kg的用量对雄性食蟹猴进行单次静脉内给药，给药8小时后实施全身灌流。灌流后摘出包括延髓在内的脑组织和脊髓组织。对于脑组织，摘出后分成大脑皮质、小脑、海马和延髓。
各组织中所含的人源化抗hTfR抗体的浓度测定基于实施例15中记载的测定方法来进行。
将脑组织中的抗hTfR抗体的浓度测定的结果示于表14-3。Fc-Fab(3N)在大脑、小脑、海马中的浓度分别为0.80μg/g湿重、0.80μg/g湿重、和1.05μg/g湿重。另外，在延髓和颈脊髓中的浓度分别为0.67μg/g湿重和0.68μg/g湿重。这些结果表明即使使Fc区结合在作为Fab的人源化抗hTfR抗体的N末端侧、抗hTfR抗体也能够通过BBB。因此，在Fab上结合BDNF而成的结合体给药于生物体内时不稳定的情况下，可以通过在Fab的N末端侧结合Fc区而在维持从BBB通过的特性的条件下使所述结合体在生物体内稳定化、例如使该结合体的血中半衰期增加。
[表14-3]
表14-3脑组织中的hFc-人源化抗hTfR抗体的浓度(μg/g湿重)
大脑 小脑 海马 延髓 颈脊髓
hFc-人源化抗hTfR抗体 0.80 0.80 1.05 0.67 0.68
[实施例21]hBDNF-人源化抗hTfR抗体融合蛋白(hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白)表达用细胞的制作
(1)人工合成包含编码如下融合蛋白的基因的具有序列号62所示的碱基序列的DNA片段，该融合蛋白是于具有序列号56所示的氨基酸序列的hBDNF的前体的C末端侧，通过由序列号3所示的氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser反复5次的共计25个氨基酸构成的接头序列，融合具有序列号61所示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体3NFab重链所得。此处，序列号61所示的氨基酸序列相当于序列号70所示的人源化抗hTfR抗体号3N的重链的氨基酸序列的自N末端侧起第1位～第226位。此处，自N末端侧起第1位～第118位的氨基酸序列相当于序列号69(人源化抗hTfR抗体号3N的重链的可变区的氨基酸序列)，自N末端侧起第119位～第216位的氨基酸序列相当于CH1区域，自N末端侧起第217位～第226位的氨基酸序列相当于铰链部。
该DNA片段编码具有序列号63所示的氨基酸序列的hBDNF的前体与人源化抗hTfR抗体3NFab重链的融合蛋白。具有序列号63所示的氨基酸序列的融合蛋白是在表达后经加工而成为具有序列号65所示的氨基酸序列的hBDNF与人源化抗hTfR抗体Fab重链的融合蛋白。在序列号63所示的氨基酸序列中，自N末端侧起第1位～第110位的氨基酸序列是hBDNF自前体向成熟型加工时被去除的部分。利用MluI与NotI消化该DNA片段，整合至pE-neo载体的MluI与NotI之间，从而构建出pE-neo(BDNF-Fab HC(3N))。
(2)或者，人工合成包含编码如下融合蛋白的基因的具有序列号73所示的碱基序列的DNA片段，该融合蛋白是于具有序列号56所示的氨基酸序列的hBDNF的前体的C末端侧，通过由序列号3所示的氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser反复5次的共计25个氨基酸构成的接头序列，自N末端侧向C末端侧依序融合序列号75的Fc区的序列、由序列号3所示的氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser反复5次的共计25个氨基酸构成的接头序列、及具有序列号61所示的氨基酸序列的人源化抗hTfR抗体3NFab重链所得。
该DNA片段编码序列号74所示的融合蛋白。具有序列号74所示的氨基酸序列的融合蛋白是在表达后经加工而hBDNF的前体部分成为hBDNF。在序列号74所示的氨基酸序列中，自N末端侧起第1位～第110位的氨基酸序列是hBDNF自前体向成熟型加工时被去除的部分。利用MluI与NotI消化该DNA片段，整合至pE-neo载体的MluI与NotI之间，从而构建出pE-neo(BDNF-Fc-Fab HC(3N))。
通过pE-neo(BDNF-Fab HC(3N))与实施例11中所构建的pE-hygr(LC3)转化CHO细胞(CHO-K1：自美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection)获取)，从而获得表达hBDNF与人源化抗hTfR抗体3N的融合蛋白的细胞株。将该细胞株设为hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1表达株。将该细胞株所表达的hBDNF与人源化抗hTfR抗体的融合蛋白设为hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1。而且，通过pE-neo(BDNF-Fc-Fab HC(3N))与实施例11中所构建的pE-hygr(LC3)转化CHO细胞，从而获得另外的表达hBDNF与人源化抗hTfR抗体3N的融合蛋白的细胞株。将该细胞株设为hBDNF-抗hTfR抗体(3N)2表达株。将该细胞株所表达的hBDNF与人源化抗hTfR抗体的融合蛋白设为hBDNF-抗hTfR抗体(3N)2。
[实施例21-2]白蛋白结合结构域(ABD)附加型hBDNF-人源化抗hTfR抗体融合蛋白的表达用细胞的制作
人工合成包含编码如下融合蛋白的基因的具有序列号86所示的碱基序列的DNA片段，该融合蛋白是于具有序列号56所示的氨基酸序列的hBDNF的前体的C末端侧，通过由序列号3所示的氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser反复5次的共计25个氨基酸构成的接头序列，融合具有与序列号61所示的氨基酸序列的第1位至第216位对应的氨基酸序列(序列号84)的人源化抗hTfR抗体3NFab重链，进而于其C末端侧，通过由序列号3所示的氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser反复3次的共计15个氨基酸构成的接头序列，融合序列号85所示的ABD所得。此处，序列号84所示的氨基酸序列相当于序列号70所示的人源化抗hTfR抗体号3N的重链的氨基酸序列的自N末端侧起第1位～第216位。此处，自N末端侧起第1位～第118位的氨基酸序列相当于序列号69(人源化抗hTfR抗体号3N的重链的可变区的氨基酸序列)，自N末端侧起第119位～第216位的氨基酸序列相当于CH1区域。
该DNA片段编码具有序列号87所示的氨基酸序列的、于hBDNF的前体与人源化抗hTfR抗体3NFab重链的融合蛋白的C末端侧附加有ABD的融合蛋白。具有序列号87所示的氨基酸序列的融合蛋白是在表达后经加工而成为在具有序列号88所示的氨基酸序列的hBDNF与人源化抗hTfR抗体Fab重链的融合蛋白的C末端侧附加有ABD的融合蛋白。在序列号87所示的氨基酸序列中，自N末端侧起第1位～第110位的氨基酸序列是hBDNF自前体向成熟型加工时被去除的部分。利用MluI与NotI消化该DNA片段，整合至pE-neo载体的MluI与NotI之间，从而构建出pE-neo(BDNF-Fab HC(3N))ABD。
通过pE-neo(BDNF-Fab HC(3N))ABD与实施例11中所构建的pE-hygr(LC3)转化CHO细胞(CHO-K1：自美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection)获取)，从而获得表达在hBDNF与人源化抗hTfR抗体3N的融合蛋白的C末端侧附加有ABD的融合蛋白的细胞株。将该细胞株设为hBDNF-抗hTfR抗体(3N)ABD表达株。将该细胞株所表达的于hBDNF与人源化抗hTfR抗体的融合蛋白的C末端侧附加有ABD的融合蛋白设为hBDNF-抗hTfR抗体(3N)ABD。
[实施例22]hBDNF-人源化抗hTfR抗体融合蛋白的制造
hBDNF-人源化抗hTfR抗体融合蛋白通过以下的方法制造。将实施例21中所获得的hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1表达株以细胞浓度成为约2×105个/mL的方式用CD OptiCHOTM培养基进行稀释，向1L的三角烧瓶中添加200mL的细胞悬浮液，在37℃下且在包含5％CO2与95％空气的湿润环境下以约70rpm的搅拌速度培养6～7天。通过离心操作回收培养上清，利用0.22μm过滤器(Millipore公司)进行过滤，从而制成培养上清。向上述回收的培养上清中，添加柱体积5倍体积的包含150mL NaCl的20mM Tris(三羟甲基胺基甲烷)缓冲液(pH值8.0)，上样至预先经柱体积3倍体积的包含150mM NaCl的20mM Tris缓冲液(pH值8.0)平衡了的蛋白L柱(柱体积：1mL，GE healthcare公司)。继而，供给柱体积的5倍体积的上述缓冲液对柱进行洗涤后，利用包含150mM NaCl的柱体积的4倍体积的50mM甘氨酸缓冲液(pH值2.8)洗脱吸附的hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1。洗脱后立即使用1M Tris缓冲液(pH值8.0)而将pH值调整至7.0。将其作为hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1的纯化品而用于以下的试验。
关于hBDNF-抗hTfR抗体(3N)2，可利用与hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1相同的方法而获得纯化品。
[实施例22-2]hBDNF-抗hTfR抗体(3N)ABD的制造
hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白通过以下的方法制造。将实施例21-2中得到的hBDNF-抗hTfR抗体(3N)ABD表达株以细胞浓度成为约2×105个/mL的方式利用CD OptiCHOTM培养基进行稀释，向1L的三角烧瓶中添加200mL的细胞悬浮液，在37℃下且在包含5％CO2与95％空气的湿润环境下以约70rpm的搅拌速度培养6～7天。通过离心操作而回收培养上清，利用0.22μm过滤器(Millipore公司)进行过滤，从而制成培养上清。
将所回收的培养上清上样至经柱体积5倍体积的包含50mM的NaCl的10mM HEPES缓冲液(pH值7.0)平衡了的HR-S柱(柱体积：5mL，Bio Rad公司)。继而，供给柱体积5倍体积的上述缓冲液对柱进行洗涤后，利用柱体积15倍体积的包含1M的NaCl的10mM HEPES缓冲液(pH值8.2)洗脱所吸附的hBDNF-抗hTfR抗体(3N)ABD，回收包含hBDNF-抗hTfR抗体(3N)ABD的组分。将该步骤实施4次。
对上述洗脱组分添加4倍体积的10mM HEPES缓冲液(pH值7.0)进行稀释。将该经稀释的洗脱组分上样至经柱体积5倍体积的包含50mM的NaCl的10mM HEPES缓冲液(pH值7.0)平衡了的Nuvia cPrime柱(柱体积：5mL，Bio Rad公司)。供给柱体积25倍体积的包含1MNaCl的10mM HEPES缓冲液(pH值8.2)对柱进行洗涤后，利用15倍体积的包含2M的NaCl、0.4M精氨酸的10mM HEPES缓冲液(pH值8.5)洗脱所吸附的hBDNF-抗hTfR抗体(3N)ABD，回收包含hBDNF-抗hTfR抗体(3N)ABD的组分。将以上述方式回收的hBDNF-抗hTfR抗体(3N)ABD作为hBDNF-抗hTfR抗体(3N)ABD的纯化品而用于以下的实验。
[实施例23]使用BDNF受体(TrkB)表达细胞的hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白的BDNF活性的评价
对于实施例16、实施例22及实施例22-2中所制造的hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白所具有的BDNF生物活性，通过以将TrkB基因导入至源自中国仓鼠卵巢的细胞(CHO细胞)而得到的CHO-TrkB细胞中的Ca浓度变化作为指针的细胞内信号转导增强活性的测定进行评价。
将CHO细胞在传代用培养基(Nutrient Mixture F-12Ham，10％胎牛血清)中进行培养。其后，更换为评价用培养基(Nutrient Mixture F-12Ham，3％胎牛血清，10mM Hepes(pH值7.4))，制作细胞悬浮液。在细胞中导入表达原光蛋白(apoaequorin)及人TrkB(GenBank Acc.No.NP_001018074.1)的病毒，以成为2×103细胞/孔的方式接种至黑色384细胞培养用底部透明板(bottom clear plate)中后，于CO2培养箱(37℃、95％空气、5％CO2)内静置培养过夜。
将包含1μM的Viviren(Promega)的HHBS液(1×Hanks'Balanced Salt Solution(Hanks平衡盐溶液)，20mM HEPES(pH值7.4))以20μL/孔进行添加，在室温下静置4小时。利用包含0.1％的牛血清血蛋白的HHBS液，将BDNF及hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白(hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1及2、以及hBDNF-抗hTfR抗体(3N)ABD)分别稀释为目标浓度，添加后，利用FDSS7000(浜松光电)经时性地测定发光强度。将111ng/mL的BDNF(#450-02，Peprotech公司)所显示的发光强度设为100％，由所得到的发光强度计算相对的TrkB激动活性，由其剂量反应曲线算出EC50，设为BDNF活性。将hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白的评价结果示于表15中。
[表15]
表15 hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白的BDNF活性
Figure GDA0002191125970001191
[实施例24]使用大鼠原代培养神经细胞的hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白的TrkB受体信号增强作用的评价
通过以大鼠原代培养神经细胞中的Erk的磷酸化作用作为指标的细胞内信号转导增强活性的测定，评价实施例22及实施例22-2中制造的hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白所具有的BDNF生物活性。原代培养神经细胞是由小鼠或大鼠胎儿的脑的各部位、例如纹状体、皮质、或者海马等进行制备，或者购入所销售的原代培养神经细胞而使用，但本次是由大鼠胎儿的纹状体制备。
由胎生15-19天的幼崽大鼠脑采集纹状体，浸入冰浴冷却的cHBSS液(含有1mM丙酮酸、0.5％D(+)葡萄糖及10mM HEPES的Hanks'平衡盐溶液)中。除去cHBSS液，添加包含0.1mg/mL DNase I、5mM MgCl2及0.3mg/mL木瓜蛋白酶的cHBSS液(酶反应液)，在37℃下孵育1-5分钟。将酶反应液去除，添加冰浴冷却的含10％FBS的NGPS液(包含0.5mM L-谷氨酸及青霉素-链霉素液(DS Pharma Biomedical)的Neurobas培养基)，使酶反应停止。将含10％FBS的NGPS液去除，利用冰浴冷却的cHBSS液洗涤3次。继而在冰浴冷却的cHBSS液中使神经细胞分散，向70μm细胞滤网(Falcon 2350)进行添加，进一步追加cHBSS液进行过滤。对滤液进行离心(1000rpm、4分钟、室温)而收集沉淀物，使其再悬浮于cHBSS液中，计数悬浮液中的细胞数。以成为1×106细胞/mL的方式利用包含B-27TM(Serum-Free Supplement(无血清添加剂)(50X)，Invitrogen)的NGPS液进行稀释，接种至聚D-赖氨酸板后，在CO2培养箱(37℃、95％空气、5％CO2)内静置培养1周。
自各孔去除培养液，利用NGPS液对细胞进行洗涤后，添加NGPS液并在CO2培养箱(37℃、95％空气、5％CO2)内静置2小时。利用NGPS液将BDNF及hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白各自稀释为目标浓度，添加后，于CO2培养箱(37℃、95％空气、5％CO2)内静置30分钟。反应后，将培养板置于冰上，利用冰浴冷却的磷酸盐缓冲液洗涤。洗涤后，添加包含Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail)(ThermoFisher Scientific)的RIPA缓冲液(Pierce)，于冰上静置10分钟。使用细胞刮刀刮取细胞，回收至管中，利用涡旋搅拌器搅拌后，于冰上静置10分钟。进行离心(13500rpm、10分钟、4℃)而采集上清，于-80℃下冷冻保存直至Erk磷酸化检测(使用一部分进行蛋白质定量)。
蛋白质定量使用Pierce BCA蛋白质分析试剂盒(Thermo Fisher Scientific)进行。将上述采集样品以蛋白质浓度成为检测范围内的方式利用蒸馏水进行稀释，以10μL/孔的方式分注至96孔板中。而且，将蛋白质分析溶液(Protein assay solution)(试剂A：试剂B＝50：1混合液)以200μL/孔的方式进行添加。在37℃下孵育30分钟后，使用酶标仪测定吸光度(562nm)，由同时测定的牛血清白蛋白标准溶液的吸光度制作标准曲线，并由该曲线计算出蛋白浓度。
Erk磷酸化检测使用Erk 1/2ELISA Kit Simple Step(pT202/Y204+Total)(Abcam)进行。利用包含Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(Thermo)的RIPA缓冲液(Pierce)将上述采集样品以成为0.5mg/mL的方式进行稀释，并以50μL/孔的方式分注至检测试剂盒所自带的Simple Step Pre-Coated 96孔板中。将抗体混合物(AntibodyCocktail)以50μL/孔的方式进行添加，一面进行搅拌一面于室温下孵育1小时。利用洗涤缓冲液(Wash Buffer)(350μL/孔)对孔内进行洗涤后，将TMB底物以100μL/孔的方式进行添加，一面搅拌一面于室温遮光下孵育15分钟。将终止溶液(Stop Solution)(100μL/孔)以100μL/孔的方式进行添加而使反应终止，使用酶标仪对吸光度进行测定(450nm)。评价基于BDNF或hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白的磷酸化Erk水平相对于溶剂处理下确认到的磷酸化Erk水平的相对增加量，由此评价hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白所具有的BDNF生物活性。将Erk磷酸化活性的评价结果示于表15-2中。
[表15-2]
表15-2 hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白的Erk磷酸化活性
Figure GDA0002191125970001211
[实施例25]hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1对于人TfR及猴TfR的亲和性的测定
测定实施例22中制造的hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1对于人TfR及猴TfR的亲和性。测定大致通过下述方法进行。
利用HBS-P+(1％BSA)(包含150mM NaCl、50μM EDTA、0.05％Surfactant P20及1％BSA的10mM HEPES)稀释经生物素标记的兔抗人BDNF多克隆抗体(抗人BDNF抗体：PeproTech公司)，制备15μg/mL的溶液，将该溶液作为配体溶液1。利用HBS-P+(1％BSA)稀释抗hTfR抗体融合BDNF(hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1)的纯化品，将该溶液作为配体溶液2。此外，作为对照物质，对于实施例15-3中所获得的hBDNF-抗hTfR抗体(3)1的纯化品，也制备经HBS-P+(1％BSA)稀释所获得的配体溶液3。利用HBS-P+(1％BSA)将r人TfR与r猴TfR分别进行2系列稀释，从而制备0.78125～50nM(0.585～3.74μg/mL)的7级浓度的溶液。将该TfR溶液作为样品溶液。
将上述进行2系列稀释而制备的样品溶液以200μL/孔的方式添加至96孔板(黑色)(greiner bioone公司)中。而且，将上述制备的配体溶液1、配体溶液2及配体溶液3分别以200μL/孔的方式添加至规定的孔中。将HBS-P+(1％BSA)以200μL/孔的方式添加至基线、解离用及洗涤用的孔中。将该板与生物传感器(Biosensor/SA：ForteBio公司，Pall公司的一个分公司)设置在OctetRED96的规定位置上。
使OctetRED96在下述表15-3所示的条件下工作而将抗人BDNF抗体固相至传感器。继而，使OctetRED96在下述表15-4所示的条件下工作而取得数据后，使用OctetRED96自带的分析软件，将结合反应曲线拟合为1：1结合模型或2：1结合模型，测定抗hTfR抗体融合BDNF对于r人TfR及r猴TfR的缔合速率常数(kon)及解离速率常数(koff)，计算出解离常数(KD)。需要说明的是，测定在25～30℃的温度下实施。
[表15-3]
表15-3抗人BDNF抗体的固相化时的OctetRED96的工作条件
Figure GDA0002191125970001221
[表15-4]
表15-4动力学分析时的OctetRED96的工作条件
Figure GDA0002191125970001231
将hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1的对于人TfR及猴TfR的缔合速率常数(kon)及解离速率常数(koff)的测定结果、及解离常数(KD)示于表16中。hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1的与人TfR的解离常数为7.42×10-12M，与猴TfR的解离常数为7.94×10-10M。这些结果显示，hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1对于人TfR及猴TfR具有较高的亲和性。此外，hBDNF-抗hTfR抗体(3)1的对于人TfR及猴TfR的解离常数分别为2.51×10-10M与3.94×10-8M。即，可理解hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1与hBDNF-抗hTfR抗体(3)1相比，对于人TfR及猴TfR具有极高的亲和性。
[表16]
表16 hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1的对于人TfR及猴TfR的亲和性
kon(M-1s-1) koff(s-1) KD(M)
人TfR 4.77×105 3.54×10-6 7.42×10-12
猴TfR 2.45×105 1.96×10-4 7.94×10-10
[实施例25-2]hBDNF-抗hTfR抗体(3N)ABD的对于人TfR、猴TfR及HSA的亲和性的测定
hBDNF-抗hTfR抗体(3N)ABD对于人TfR、猴TfR及人血清白蛋白(HSA)的亲和性的测定是与实施例25同样地，应用使用了生物膜层干涉法(BioLayer Interferometry：BLI)的生物体分子相互作用分析系统即OctetRED96(ForteBio公司，Pall公司的一个分公司)而实施。测定大致依据OctetRED96所随附的操作指南实施。以下进行详述。
利用HBS-P+(1％BSA)(包含150mM NaCl、50μM EDTA、0.05％Surfactant P20及1％BSA的10mM HEPES)稀释经生物素标记的兔抗人BDNF多克隆抗体(抗人BDNF抗体：PeproTech公司)，制备25μg/mL的溶液，将该溶液设为配体溶液1。利用HBS-P+稀释hBDNF-抗hTfR抗体(3N)ABD的纯化品，将该溶液设为配体溶液2。利用HBS-P+分别对r人TfR与r猴TfR进行2系列稀释，制备0.78125～50nM(0.0585～3.74μg/mL)的7级浓度的溶液。将该TfR溶液设为TfR样品溶液。需要说明的是，r人TfR与r猴TfR使用实施例7中记载的r人TfR与r猴TfR。而且，利用HBS-P+对HSA(人血清白蛋白制剂(献血白蛋白25-日药-，日本制药株式会社)进行2系列稀释，制备3.13～200nM(0.208～13.3μg/mL)的7级浓度的溶液。将该HSA溶液设为HSA样品溶液。
将上述进行2系列稀释而制备的TfR样品溶液及HSA样品溶液分别以200μL/孔的方式添加至96孔板(黑色)(greiner bio-one公司)中。而且，将上述制备的配体溶液1及配体溶液2分别以200μL/孔的方式添加至规定的孔中。将HBS-P+以200μL/孔的方式添加至基线、解离用及洗涤用的孔中。将该板与生物传感器(Biosensor/SA：ForteBio公司，Pall公司的一个分公司)设置在OctetRED96的规定位置。
使OctetRED96在实施例25所记载的表15-3所示的条件下工作而将抗人BDNF抗体固相至传感器。继而，使OctetRED96于表16-2所示的条件下工作而取得数据后，使用OctetRED96自带的分析软件，将结合反应曲线拟合为1：1结合模型，测定hBDNF-抗hTfR抗体(3N)ABD对于r人TfR、r猴TfR及HSA的缔合速率常数(kon)及解离速率常数(koff)，算出解离常数(KD)。需要说明的是，测定在25～30℃的温度下实施。
[表16-2]
表16-2动力学分析时的OctetRED96的工作条件
Figure GDA0002191125970001251
将hBDNF-抗hTfR抗体(3N)ABD的对于人TfR、猴TfR及HSA的缔合速率常数(kon)及解离速率常数(koff)的测定结果、及解离常数(KD)示于表16-3中。
[表16-3]
表16-3 hBDNF-抗hTfR抗体(3N)ABD的对于人TfR、猴TfR及HSA的亲和性
kon(M-1s-1) koff(s-1) KD(M)
人TfR 7.07×105 4.00×10-5 5.66×10-11
猴TfR 2.31×105 1.45×10-4 6.26×10-10
HSA 6.13×104 8.29×10-4 1.35×10-8
hBDNF-抗hTfR抗体(3N)ABD的与人TfR及猴TfR的解离常数分别为5.66×10-11M及6.26×10-10M。这些结果显示，即使在hBDNF与抗hTfR抗体的融合蛋白的C末端侧附加ABD，该融合蛋白的对于人TfR及猴TfR的高亲和性也得到维持。而且，hBDNF-抗hTfR抗体(3N)ABD的与HSA的解离常数为1.35×10-8M。这些结果显示，hBDNF-抗hTfR抗体(3N)ABD对于TfR(人及猴)及HSA均具有高亲和性。即，显示将hBDNF-抗hTfR抗体(3N)ABD给药至人的血中时，通过ABD而与存在于血中的白蛋白结合，由此能够实现血中半衰期上升，并且，通过TfR而能够实现通过BBB。进而显示，通过与白蛋白结合，也可以使hBDNF-抗hTfR抗体(3N)的免疫原性降低。
[实施例26]hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1的使用小鼠的脑迁移评价
对于hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1，使用将编码小鼠转铁蛋白受体的胞外区的基因置换为编码人转铁蛋白受体基因的胞外区的基因所获得的hTfR基因敲入小鼠(hTfR-KI小鼠)，对hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1通过BBB而迁移至脑内的情况进行评价。hTfR-KI小鼠大致通过下述方法进行制作。而且，作为hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1，使用实施例22所记载的纯化品。
化学合成在编码细胞内区域为小鼠hTfR的氨基酸序列且胞外区为人hTfR的氨基酸序列的嵌合hTfR的cDNA的3'侧配置有由loxP序列夹着的新霉素抗性基因的、具有序列号45所示的碱基序列的DNA片段。通过常规方法，将该DNA片段整合至具有序列号46所示的碱基序列作为5'臂序列且具有序列号47所示的碱基序列作为3'臂序列的打靶载体(targeting vector)中，通过电穿孔法将其导入至小鼠ES细胞中。将基因导入后的小鼠ES细胞于新霉素存在下进行选择培养，选择出通过同源重组将打靶载体整合至了染色体中的小鼠ES细胞。将所获得的基因重组小鼠ES细胞注入至ICR小鼠的8细胞期胚胎(宿主胚胎)，移植至通过与进行过输精管结扎的小鼠交配而获得的假妊娠小鼠(受体小鼠)中。对于所获得的产仔(嵌合小鼠)进行毛色判定，筛选出ES细胞以高效率有助于生物体的形成的个体，即白色毛占整体毛的比率较高的个体。使该嵌合小鼠个体与ICR小鼠交配而获得F1小鼠。筛选白色的F1小鼠，对自尾巴的组织提取的DNA进行分析，将染色体上小鼠转铁蛋白受体基因被置换为嵌合hTfR的小鼠设为hTfR-KI小鼠。
将hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1溶液以所给药的用量成为5mg/kg的方式于各时间点静脉内给药至3只hTfR-KI小鼠(雄性、21～28周龄)。于静脉内给药后，在给药后0.17、1、3、8、24、48小时后采集外周血，于采集后利用生理盐水进行全身灌流，采集脑(包含大脑与小脑的部分)。测定所摘取的脑的重量(湿重)后，添加包含蛋白酶抑制剂混合物(ProteaseInhibitor Cocktail)的RIPA缓冲液(Nacalai Tesque)而将脑组织匀浆化。将匀浆进行离心而回收上清，利用以下的方法测定上清中所包含的hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1的量。
首先，于标准板(Standard Plate)(Meso Scale Diagnostics公司)的各孔中各添加25μL的兔抗人IgG H&L pre-adsorbed(Abcam公司)，静置1小时而固定在板上。继而，于各孔中各添加150μL的SuperBlock(PBS)封闭缓冲液，进行1小时振荡而将板封闭。继而，利用含有Tween 20的Tris缓冲盐水(Tris Buffered Saline with Tween 20)对各孔进行洗涤，并于各孔中各添加50μL的脑组织的匀浆的上清，进行1小时振荡。继而，于各孔中各添加50μL的经Sulfo-tag标记的抗BDNF抗体[35928.11](ab10505)(Abcam公司)，进行1小时振荡。继而，于各孔中各添加150μL的Read buffer T(Meso Scale Diagnostics公司)，利用SectorTMImager 6000reader测定来自各孔的发光量。根据浓度已知的标准试样的测定值制作标准曲线，于其中代入各试样的测定值，由此算出脑的每克重量(湿重)所包含的融合蛋白的量。
将脑组织中的hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1的浓度测定的结果示于图9。需要说明的是，hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1形成二聚物而在生物体内发挥其功能，因此在图9中，将换算为二聚物的值设为hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1的浓度(摩尔浓度)。以下，对于图10、表17、及表18所示的hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1的浓度也同样。hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1在给药后24小时，脑内浓度也显示出5.7nM的高值。而且，脑内浓度的半衰期为29小时。本结果显示，hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1具有通过血脑屏障而于脑组织中蓄积的性质，可通过使应于脑组织内发挥功能的药剂即BDNF与抗hTfR抗体(3N)1或其抗原结合性片段(抗体片段)结合，从而使该药剂高效率地于脑组织中蓄积。
继而，将hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1的血药动力学的测定结果示于表17。显示出hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1即便于给药后1小时血药浓度也显示15nM的高值，在血液中稳定(表17)。而且，血药浓度的半衰期为0.4小时。该结果显示，脑内浓度的半衰期显著长于血药浓度的半衰期。而且，对于Fc-Fab(3N)，也通过相同的试验测定hTfR-KI小鼠中的血药动力学，血药浓度的半衰期为5.3小时。该结果显示，通过导入人IgG Fc区而血药浓度的半衰期可明显延长。
[表17]
表17hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1的小鼠中的血药动力学(nM)
Figure GDA0002191125970001281
[实施例27]hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1的使用食蟹猴的脑迁移评价
将hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1以5.0mg/kg的用量分别单次静脉内给药至雄性食蟹猴，于给药后0.083、0.5、1、3、24、72小时后采集外周血，于采集后利用生理盐水实施脑灌流。灌流后，摘取脑组织。
使用该脑组织，进行以下的hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1的浓度测定及免疫组织化学染色。而且，作为hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1，使用实施例22所记载的纯化品。
脑组织中的hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1的浓度测定大致通过以下的步骤进行。对于所采集的组织，将脑组织分为大脑皮质、小脑、海马及纹状体等后，分别利用包含蛋白酶抑制剂混合物(Protease Inhibitor Cocktail)(Sigma-Aldrich公司)的RIPA缓冲液(Nacalai Tesque公司)进行匀浆化，并进行离心而回收上清。将抗人Kappa轻链山羊IgG生物素(株式会社免疫生物研究所)、Sulfotag抗BDNF抗体(Abcam公司)及脑组织匀浆添加至利用含有SuperBlock封闭缓冲液的PBS(SuperBlock blocking buffer in PBS)(ThermoFisher Scientific公司)实施过封闭的链霉亲和素板(Meso Scale Diagnostics公司)中，进行1小时静置而固定在板上。继而，于各孔中各添加150μL的Read buffer T(Meso ScaleDiagnostics公司)，使用SectorTM Imager 6000reader(Meso Scale Diagnostics公司)测定来自各孔的发光量。根据浓度已知的标准试样的测定值制作标准曲线，于其中代入各试样的测定值，由此算出各脑组织的每克重量(湿重)所包含的融合蛋白的量(脑组织中浓度)。
将脑组织中的hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1的浓度测定的结果示于图10。本结果显示，hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1具有通过血脑屏障而于脑组织中蓄积的性质，并且显示出，可通过使应于脑组织内发挥功能的药剂即BDNF与抗hTfR抗体(3N)1或其抗原结合性片段(抗体片段)结合，从而使该药剂高效率地蓄积于脑组织中。
继而，将hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1的血药动力学的测定结果示于表18。显示hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1即使在给药后1小时，血药浓度也显示30nM的高值，在血液中稳定(表18)。
[表18]
8hBDNF-抗hTfR抗体(3N)1的食蟹猴中的血药动力学(nM)
Figure GDA0002191125970001291
脑组织中的hBDNF-人源化抗hTfR抗体融合蛋白的免疫组织化学染色可通过实施例15所记载的方法进行。
[实施例28]hBDNF-抗hTfR抗体(3N)ABD的使用小鼠的脑迁移评价
对于hBDNF-抗hTfR抗体(3N)ABD，使用将编码小鼠转铁蛋白受体的胞外区的基因置换为编码人转铁蛋白受体基因的胞外区的基因所获得的hTfR基因敲入小鼠(hTfR-KI小鼠)，对hBDNF-抗hTfR抗体(3N)ABD通过BBB而迁移至脑内的情况进行评价。hTfR-KI小鼠大致通过实施例7-2所记载的方法制作。而且，作为hBDNF-抗hTfR抗体(3N)ABD，使用实施例22-2所记载的纯化品。
将hBDNF-抗hTfR抗体(3N)ABD溶液以所给药的用量成为2.15mg/kg的方式于各时间点静脉内给药至3只hTfR-KI小鼠(雄性、19～21周龄)中。于静脉内给药后，在给药后0.167、1、3、8、24、48、72小时后利用生理盐水进行全身灌流，采集脑(包含大脑与小脑的部分)。测定所摘取的脑的重量(湿重)后，添加包含蛋白酶抑制剂混合物(ProteaseInhibitor Cocktail)的RIPA缓冲液(Nacalai Tesque)而将脑组织匀浆化。将匀浆进行离心而回收上清，利用以下的方法测定上清中所包含的hBDNF-抗hTfR抗体(3N)ABD的量。
首先，在标准板(Standard Plate)(Meso Scale Diagnostics公司)的各孔中各添加25μL的兔抗人IgG H&L pre-adsorbed(Abcam公司)，于4℃下静置过夜而固定在板上。继而，于各孔中各添加150μL的SuperBlock(PBS)封闭缓冲液，进行1小时振荡而将板封闭。继而，利用含有Tween 20的Tris缓冲盐水(Tris Buffered Saline with Tween 20)对各孔进行洗涤，于各孔中各添加50μL的脑组织的匀浆的上清，进行1小时振荡。继而，于各孔中各添加50μL的经Sulfo-tag标记的抗BDNF抗体[35928.11](ab10505)(Abcam公司)，进行1小时振荡。继而，于各孔中各添加150μL的Read buffer T(Meso Scale Diagnostics公司)，利用SectorTM Imager 6000reader测定来自各孔的发光量。根据浓度已知的标准试样的测定值制作标准曲线，于其中代入各试样的测定值，由此算出脑的每克重量(湿重)所包含的抗体的量。
将脑组织中的hBDNF-抗hTfR抗体(3N)ABD的浓度测定的结果示于图11。hBDNF-抗hTfR抗体(3N)ABD的脑内浓度于给药8小时后显示2.98nM的Cmax，于给药72小时为0.7nM。
本结果显示，hBDNF-抗hTfR抗体(3N)ABD具有通过血脑屏障而于脑组织中蓄积的性质，并且显示出，可通过使应于脑组织内发挥功能的药剂即BDNF与这些抗体结合，从而使该药剂高效率地蓄积至脑组织中。
继而，将hBDNF-抗hTfR抗体(3N)ABD的血药动力学的测定结果示于表19。hBDNF-抗hTfR抗体(3N)ABD的血药浓度于给药1小时后显示179.8nM，于3小时后也显示出53.4nM的高值，在血中稳定(表19)。该结果显示，通过导入白蛋白亲和性肽而血液中的稳定性提高，且血液中半衰期可显著地延长。
[表19]
表19hBDNF-抗hTfR抗体(3N)ABD的小鼠中的血药动力学(nM)
Figure GDA0002191125970001311
[实施例29]使用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)处理帕金森病模型小鼠的本发明的融合蛋白的运动功能改善作用的研究
实施例22中所制造的hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白的体内(in vivo)的BDNF生物活性例如可使用如以下所记载的方法，通过经MPTP处理的hTfR-KI小鼠的帕金森病症状改善效果来进行评价。
(1)帕金森病模型小鼠的制作
使用实施例26所记载的hTfR-KI小鼠(均为8-15周龄)。对于检疫、驯化已完成的小鼠，将生理盐水或溶解于生理盐水中的MPTP(25或30mg/kg)以1天1次的方式进行5天腹腔内给药，或者以20mg/kg于1天内间隔2小时地进行4次腹腔内给药。
于最终给药的3天后，通过爬杆试验评价动作缓慢症状，或者通过转棒(Rota-rod)试验评价协调运动能力的降低。
(2)爬杆试验
使MPTP处理小鼠以头部朝上的方式抓住垂直竖立的木制棒的上部5cm附近。测定小鼠从抓住棒开始向下方改变朝向为止的时间(Tturn)、及从抓住开始下降至地面为止的时间(TLA)。此外，观察小鼠的活动，以下述方式对其症状进行评分。
0：熟练地使用四肢下降/正常的活动。
1：在棒的上部改变朝向时可见笨拙。
2：未完全跨过棒而采取侧滑的行动。
3：掉落。
首先进行1次训练后，每隔5分钟进行1次，反复进行3次试验。将3次的平均时间用于分组用数据。基于体重与爬杆试验的数据，通过多变量完全随机分配，将MPTP处理小鼠分为3或4个组。
在生理盐水处理小鼠(溶剂处理组)、MPTP处理小鼠(溶剂处理组、本发明的融合蛋白处理组)的合计4～5个组中，以1周进行1～2次的方式反复进行4～8周静脉内给药。于最终给药后1周后再次进行爬杆试验(与采集上述分组用数据时相同的实验方法)，从而评价动作缓慢症状的改善作用。通过给药至静脉内的本发明的融合蛋白迁移至脑内而于脑内发挥BDNF活性，可改善帕金森病模型动物的动作缓慢等运动功能的障碍。
如此可确认给药至静脉内的本发明的融合蛋白可迁移至疾病模型动物的脑内而发挥BDNF活性。
(3)转棒(Rota-rod)试验
在Rota-rod装置(MK-610A，室町机械)的旋转轴上，每1道各载置1只小鼠，静置30秒钟后，使小鼠适应轴以8rpm旋转1分钟，其后，在以3分钟使旋转数上升至25rpm的条件下进行训练。在训练的1小时后进行以下的评价试验。
在本试验中，使小鼠适应以8rpm旋转的轴的运动30秒钟后，在以5分钟使旋转数上升至40rpm的条件下测定小鼠自轴掉落的时间。间隔1小时重复本试验3次，将3次的平均时间用于分组用数据。基于体重与Rota-rod试验的数据，通过多变量完全随机分配，将MPTP处理小鼠分为3或4个组。
在生理盐水处理小鼠(溶剂处理组)、MPTP处理小鼠(溶剂处理组、本发明的融合蛋白处理组)的合计4～5个组中，以1周进行1～2次的方式反复进行4～8周静脉内给药。于最终给药后1周后再次进行Rota-Rod试验(与采集上述分组用数据时相同的实验方法)，评价协调运动能力的改善作用。通过给药至静脉内的本发明的融合蛋白迁移至脑内而于脑内发挥BDNF活性，可改善帕金森病模型动物的协调运动能力等运动功能的障碍。
由此，可确认给药至静脉内的本发明的融合蛋白可迁移至疾病模型动物的脑内而发挥BDNF活性。
[实施例30]使用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)处理帕金森病模型猴的本发明的融合蛋白的运动功能改善效果的研究
实施例22中所制造的hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白在体内(in vivo)的BDNF生物活性例如可使用如以下所记载的方法，通过经MPTP处理的猴的帕金森病样症状改善效果而进行评价。
对于在MPTP处理前的5天以正常行动为代表进行过评价的雄性恒河猴(5～8岁)或食蟹猴(4～8岁)，进行1周最大连续5天且4周以上的静脉内给药、或者肌肉内给药或皮下给药MPTP(0.2mg/kg或其以上，且以2mg/kg作为上限)，确认UPDRS得分的降低或运动量的降低。或者，仅对于颈内动脉的单侧，给药1次、或将给药间隔设为5～10天而给药2次MPTP(0.2mg/kg或其以上，且以2mg/kg作为上限)，以UPDRS得分(J Neurosci Methods.2000；96:71-76)、运动量、进而旋转运动量为指标，确认帕金森病样症状，结束MPTP处理。
确认到于MPTP最终给药后1周以后帕金森病样症状稳定后，1周1次或2次静脉内或皮下给药hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白(0.03～10mg/kg)，通过UPDRS、运动量、或旋转运动的评价来评价运动功能的改善度。通过给药至静脉内或皮下的hBDNF-抗hTfR抗体融合蛋白迁移至脑内而于脑内发挥BDNF活性，由此可改善帕金森病模型动物的运动功能的障碍。
由此，可确认给药至静脉内的本发明的融合蛋白可迁移至疾病模型动物(猴)的脑内而发挥BDNF活性。
产业上的可利用性
本发明的hBDNF与抗hTfR抗体的融合蛋白可有效地通过血脑屏障，因此作为提供使hBDNF在中枢神经系统中发挥作用的改良方法有用性较高。
序列表自由文本
序列号3：接头例1的氨基酸序列
序列号4：接头例2的氨基酸序列
序列号5：接头例3的氨基酸序列
序列号6：小鼠抗hTfR抗体号3的轻链CDR1的氨基酸序列1
序列号7：小鼠抗hTfR抗体号3的轻链CDR1的氨基酸序列2
序列号8：小鼠抗hTfR抗体号3的轻链CDR2的氨基酸序列1
序列号9：小鼠抗hTfR抗体号3的轻链CDR2的氨基酸序列2
序列号10：小鼠抗hTfR抗体号3的轻链CDR3的氨基酸序列
序列号11：小鼠抗hTfR抗体号3的重链CDR1的氨基酸序列1
序列号12：小鼠抗hTfR抗体号3的重链CDR1的氨基酸序列2
序列号13：小鼠抗hTfR抗体号3的重链CDR2的氨基酸序列1
序列号14：小鼠抗hTfR抗体号3的重链CDR2的氨基酸序列2
序列号15：小鼠抗hTfR抗体号3的重链CDR3的氨基酸序列1
序列号16：小鼠抗hTfR抗体号3的重链CDR3的氨基酸序列2
序列号17：人源化抗hTfR抗体号3的轻链的可变区的氨基酸序列1
序列号18：人源化抗hTfR抗体号3的轻链的可变区的氨基酸序列2
序列号19：人源化抗hTfR抗体号3的轻链的可变区的氨基酸序列3
序列号20：人源化抗hTfR抗体号3的轻链的可变区的氨基酸序列4
序列号21：人源化抗hTfR抗体号3的轻链的可变区的氨基酸序列5
序列号22：人源化抗hTfR抗体号3的轻链的可变区的氨基酸序列6
序列号23：人源化抗hTfR抗体号3的、可变区含有氨基酸序列2的轻链的氨基酸序列
序列号24：编码人源化抗hTfR抗体号3的、可变区含有氨基酸序列2的轻链的氨基酸序列的碱基序列，合成序列
序列号25：人源化抗hTfR抗体号3的、可变区含有氨基酸序列4的轻链的氨基酸序列
序列号26：编码人源化抗hTfR抗体号3的、可变区含有氨基酸序列4的轻链的氨基酸序列的碱基序列，合成序列
序列号27：人源化抗hTfR抗体号3的、可变区含有氨基酸序列5的轻链的氨基酸序列
序列号28：编码人源化抗hTfR抗体号3的、可变区含有氨基酸序列5的轻链的氨基酸序列的碱基序列，合成序列
序列号29：人源化抗hTfR抗体号3的、可变区含有氨基酸序列6的轻链的氨基酸序列
序列号30：编码人源化抗hTfR抗体号3的、可变区含有氨基酸序列6的轻链的氨基酸序列的碱基序列，合成序列
序列号31：人源化抗hTfR抗体号3的重链的可变区的氨基酸序列1
序列号32：人源化抗hTfR抗体号3的重链的可变区的氨基酸序列2
序列号33：人源化抗hTfR抗体号3的重链的可变区的氨基酸序列3
序列号34：人源化抗hTfR抗体号3的重链的可变区的氨基酸序列4
序列号35：人源化抗hTfR抗体号3的重链的可变区的氨基酸序列5
序列号36：人源化抗hTfR抗体号3的重链的可变区的氨基酸序列6
序列号37：人源化抗hTfR抗体号3的、可变区含有氨基酸序列2的重链的氨基酸序列
序列号38：编码人源化抗hTfR抗体号3的、可变区含有氨基酸序列2的重链的氨基酸序列的碱基序列，合成序列
序列号39：人源化抗hTfR抗体号3的、可变区含有氨基酸序列2的重链(IgG4)的氨基酸序列
序列号40：编码人源化抗hTfR抗体号3的、可变区含有氨基酸序列2的重链(IgG4)的氨基酸序列的碱基序列，合成序列
序列号41：引物hTfR5’，合成序列
序列号42：引物hTfR3’，合成序列
序列号43：引物Hyg-Sfi5’，合成序列
序列号44：引物Hyg-BstX3’，合成序列
序列号45：在编码嵌合hTfR的cDNA的3’侧配置有被loxP序列夹持的新霉素抗性基因的DNA的碱基序列，合成序列
序列号46：打靶载体的5’臂序列，合成序列
序列号47：打靶载体的3’臂序列，合成序列
序列号48：小鼠抗hTfR抗体号3的轻链的可变区的氨基酸序列
序列号49：小鼠抗hTfR抗体号3的重链的可变区的氨基酸序列
序列号52：人源化抗hTfR抗体号3N的重链与hBDNF的融合蛋白(1)的氨基酸序列
序列号53：编码人源化抗hTfR抗体号3N的重链与hBDNF的融合蛋白(1)的氨基酸序列的碱基序列、合成序列
序列号54：人源化抗hTfR抗体号3N的重链与hBDNF的融合蛋白(2)的氨基酸序列
序列号55：编码人源化抗hTfR抗体号3N的重链与hBDNF的融合蛋白(2)的氨基酸序列的碱基序列、合成序列
序列号57：单链人源化抗hTfR抗体号3N的氨基酸序列
序列号58：编码hBDNF的前体与单链人源化抗hTfR抗体号3N的融合蛋白的氨基酸序列的碱基序列、合成序列
序列号59：hBDNF的前体与单链人源化抗hTfR抗体号3N的融合蛋白的氨基酸序列
序列号60：hBDNF与单链人源化抗hTfR抗体号3N的融合蛋白的氨基酸序列
序列号61：人源化抗hTfR抗体号3N的Fab重链的氨基酸序列
序列号62：编码hBDNF的前体与人源化抗hTfR抗体号3N的Fab重链的融合蛋白的氨基酸序列的碱基序列、合成序列
序列号63：hBDNF的前体与人源化抗hTfR抗体号3N的Fab重链的融合蛋白的氨基酸序列
序列号64：编码hBDNF与人源化抗hTfR抗体号3N的Fab重链的融合蛋白的氨基酸序列的碱基序列、合成序列
序列号65：hBDNF与人源化抗hTfR抗体号3N的Fab重链的融合蛋白的氨基酸序列
序列号66：人源化抗hTfR抗体号3N的重链CDR1的氨基酸序列1
序列号67：人源化抗hTfR抗体号3N的重链CDR1的氨基酸序列2
序列号68：人源化抗hTfR抗体号3N的重链框架区3的氨基酸序列
序列号69：人源化抗hTfR抗体号3N的重链的可变区的氨基酸序列
序列号70：人源化抗hTfR抗体号3N的重链的氨基酸序列
序列号71：编码人源化抗hTfR抗体号3N的重链的氨基酸序列的碱基序列，合成序列
序列号72：人源化抗hTfR抗体号3N的重链(IgG4)的氨基酸序列
序列号73：编码导入有人IgG Fc区的hBDNF的前体与人源化抗hTfR抗体3N的Fab重链的融合蛋白的氨基酸序列的碱基序列、合成序列
序列号74：导入有人IgG Fc区的hBDNF的前体与人源化抗hTfR抗体3N的Fab重链的融合蛋白的氨基酸序列
序列号75：人IgG的Fc区的氨基酸序列的一例
序列号76：编码人源化抗hTfR抗体号3N的重链(IgG4)的氨基酸序列的碱基序列，合成序列
序列号77：人源化抗hTfR抗体3的Fab重链的氨基酸序列
序列号78：编码hBDNF的前体与人源化抗hTfR抗体号3的Fab重链的融合蛋白的氨基酸序列的碱基序列、合成序列
序列号79：hBDNF的前体与人源化抗hTfR抗体号3的Fab重链的融合蛋白的氨基酸序列
序列号80：hBDNF与人源化抗hTfR抗体号3的Fab重链的融合蛋白的氨基酸序列
序列号81：导入有人IgG Fc区的人源化抗hTfR抗体3N的Fab重链的氨基酸序列
序列号82：编码导入有人IgG Fc区的人源化抗hTfR抗体3N的Fab重链的氨基酸序列的碱基序列，合成序列
序列号83：人源化抗hTfR抗体号3的重链框架区3的氨基酸序列
序列号84：人源化抗hTfR抗体号3N的Fab重链的氨基酸序列(2)
序列号85：白蛋白结合结构域的氨基酸序列
序列号86：编码hBDNF的前体、人源化抗hTfR抗体号3N的Fab重链、及ABD的融合蛋白的氨基酸序列的碱基序列、合成序列
序列号87：hBDNF的前体、人源化抗hTfR抗体号3N的Fab重链、及ABD的融合蛋白的氨基酸序列
序列号88：hBDNF、人源化抗hTfR抗体号3N的Fab重链、及ABD的融合蛋白的氨基酸序列
序列号89：导入有白蛋白亲和性肽的Fab重链的氨基酸序列
序列号90：单链人源化抗hTfR抗体号3N(2)的氨基酸序列
SEQUENCE LISTING
<110> JCR制药股份有限公司（JCR PHARMACEUTICALS CO., LTD.）
<120> 含有BDNF的融合蛋白（FUSION PROTEIN CONTAINING BDNF）
<130> FP17-0781-00
<150> JP2016-252147
<151> 2016-12-26
<160> 90
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 760
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
Met Met Asp Gln Ala Arg Ser Ala Phe Ser Asn Leu Phe Gly Gly Glu
1 5 10 15
Pro Leu Ser Tyr Thr Arg Phe Ser Leu Ala Arg Gln Val Asp Gly Asp
20 25 30
Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Val Asp Glu Glu Glu Asn Ala
35 40 45
Asp Asn Asn Thr Lys Ala Asn Val Thr Lys Pro Lys Arg Cys Ser Gly
50 55 60
Ser Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val Ile Val Phe Phe Leu Ile Gly
65 70 75 80
Phe Met Ile Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys Gly Val Glu Pro Lys Thr
85 90 95
Glu Cys Glu Arg Leu Ala Gly Thr Glu Ser Pro Val Arg Glu Glu Pro
100 105 110
Gly Glu Asp Phe Pro Ala Ala Arg Arg Leu Tyr Trp Asp Asp Leu Lys
115 120 125
Arg Lys Leu Ser Glu Lys Leu Asp Ser Thr Asp Phe Thr Gly Thr Ile
130 135 140
Lys Leu Leu Asn Glu Asn Ser Tyr Val Pro Arg Glu Ala Gly Ser Gln
145 150 155 160
Lys Asp Glu Asn Leu Ala Leu Tyr Val Glu Asn Gln Phe Arg Glu Phe
165 170 175
Lys Leu Ser Lys Val Trp Arg Asp Gln His Phe Val Lys Ile Gln Val
180 185 190
Lys Asp Ser Ala Gln Asn Ser Val Ile Ile Val Asp Lys Asn Gly Arg
195 200 205
Leu Val Tyr Leu Val Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Val Ala Tyr Ser Lys
210 215 220
Ala Ala Thr Val Thr Gly Lys Leu Val His Ala Asn Phe Gly Thr Lys
225 230 235 240
Lys Asp Phe Glu Asp Leu Tyr Thr Pro Val Asn Gly Ser Ile Val Ile
245 250 255
Val Arg Ala Gly Lys Ile Thr Phe Ala Glu Lys Val Ala Asn Ala Glu
260 265 270
Ser Leu Asn Ala Ile Gly Val Leu Ile Tyr Met Asp Gln Thr Lys Phe
275 280 285
Pro Ile Val Asn Ala Glu Leu Ser Phe Phe Gly His Ala His Leu Gly
290 295 300
Thr Gly Asp Pro Tyr Thr Pro Gly Phe Pro Ser Phe Asn His Thr Gln
305 310 315 320
Phe Pro Pro Ser Arg Ser Ser Gly Leu Pro Asn Ile Pro Val Gln Thr
325 330 335
Ile Ser Arg Ala Ala Ala Glu Lys Leu Phe Gly Asn Met Glu Gly Asp
340 345 350
Cys Pro Ser Asp Trp Lys Thr Asp Ser Thr Cys Arg Met Val Thr Ser
355 360 365
Glu Ser Lys Asn Val Lys Leu Thr Val Ser Asn Val Leu Lys Glu Ile
370 375 380
Lys Ile Leu Asn Ile Phe Gly Val Ile Lys Gly Phe Val Glu Pro Asp
385 390 395 400
His Tyr Val Val Val Gly Ala Gln Arg Asp Ala Trp Gly Pro Gly Ala
405 410 415
Ala Lys Ser Gly Val Gly Thr Ala Leu Leu Leu Lys Leu Ala Gln Met
420 425 430
Phe Ser Asp Met Val Leu Lys Asp Gly Phe Gln Pro Ser Arg Ser Ile
435 440 445
Ile Phe Ala Ser Trp Ser Ala Gly Asp Phe Gly Ser Val Gly Ala Thr
450 455 460
Glu Trp Leu Glu Gly Tyr Leu Ser Ser Leu His Leu Lys Ala Phe Thr
465 470 475 480
Tyr Ile Asn Leu Asp Lys Ala Val Leu Gly Thr Ser Asn Phe Lys Val
485 490 495
Ser Ala Ser Pro Leu Leu Tyr Thr Leu Ile Glu Lys Thr Met Gln Asn
500 505 510
Val Lys His Pro Val Thr Gly Gln Phe Leu Tyr Gln Asp Ser Asn Trp
515 520 525
Ala Ser Lys Val Glu Lys Leu Thr Leu Asp Asn Ala Ala Phe Pro Phe
530 535 540
Leu Ala Tyr Ser Gly Ile Pro Ala Val Ser Phe Cys Phe Cys Glu Asp
545 550 555 560
Thr Asp Tyr Pro Tyr Leu Gly Thr Thr Met Asp Thr Tyr Lys Glu Leu
565 570 575
Ile Glu Arg Ile Pro Glu Leu Asn Lys Val Ala Arg Ala Ala Ala Glu
580 585 590
Val Ala Gly Gln Phe Val Ile Lys Leu Thr His Asp Val Glu Leu Asn
595 600 605
Leu Asp Tyr Glu Arg Tyr Asn Ser Gln Leu Leu Ser Phe Val Arg Asp
610 615 620
Leu Asn Gln Tyr Arg Ala Asp Ile Lys Glu Met Gly Leu Ser Leu Gln
625 630 635 640
Trp Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Asp Phe Phe Arg Ala Thr Ser Arg Leu
645 650 655
Thr Thr Asp Phe Gly Asn Ala Glu Lys Thr Asp Arg Phe Val Met Lys
660 665 670
Lys Leu Asn Asp Arg Val Met Arg Val Glu Tyr His Phe Leu Ser Pro
675 680 685
Tyr Val Ser Pro Lys Glu Ser Pro Phe Arg His Val Phe Trp Gly Ser
690 695 700
Gly Ser His Thr Leu Pro Ala Leu Leu Glu Asn Leu Lys Leu Arg Lys
705 710 715 720
Gln Asn Asn Gly Ala Phe Asn Glu Thr Leu Phe Arg Asn Gln Leu Ala
725 730 735
Leu Ala Thr Trp Thr Ile Gln Gly Ala Ala Asn Ala Leu Ser Gly Asp
740 745 750
Val Trp Asp Ile Asp Asn Glu Phe
755 760
<210> 2
<211> 760
<212> PRT
<213> 食蟹猴（Macaca fascicularis）
<400> 2
Met Met Asp Gln Ala Arg Ser Ala Phe Ser Asn Leu Phe Gly Gly Glu
1 5 10 15
Pro Leu Ser Tyr Thr Arg Phe Ser Leu Ala Arg Gln Val Asp Gly Asp
20 25 30
Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Val Asp Asp Glu Glu Asn Ala
35 40 45
Asp Asn Asn Thr Lys Ala Asn Gly Thr Lys Pro Lys Arg Cys Gly Gly
50 55 60
Asn Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val Ile Ile Phe Phe Leu Ile Gly
65 70 75 80
Phe Met Ile Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys Gly Val Glu Pro Lys Thr
85 90 95
Glu Cys Glu Arg Leu Ala Gly Thr Glu Ser Pro Ala Arg Glu Glu Pro
100 105 110
Glu Glu Asp Phe Pro Ala Ala Pro Arg Leu Tyr Trp Asp Asp Leu Lys
115 120 125
Arg Lys Leu Ser Glu Lys Leu Asp Thr Thr Asp Phe Thr Ser Thr Ile
130 135 140
Lys Leu Leu Asn Glu Asn Leu Tyr Val Pro Arg Glu Ala Gly Ser Gln
145 150 155 160
Lys Asp Glu Asn Leu Ala Leu Tyr Ile Glu Asn Gln Phe Arg Glu Phe
165 170 175
Lys Leu Ser Lys Val Trp Arg Asp Gln His Phe Val Lys Ile Gln Val
180 185 190
Lys Asp Ser Ala Gln Asn Ser Val Ile Ile Val Asp Lys Asn Gly Gly
195 200 205
Leu Val Tyr Leu Val Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Val Ala Tyr Ser Lys
210 215 220
Ala Ala Thr Val Thr Gly Lys Leu Val His Ala Asn Phe Gly Thr Lys
225 230 235 240
Lys Asp Phe Glu Asp Leu Asp Ser Pro Val Asn Gly Ser Ile Val Ile
245 250 255
Val Arg Ala Gly Lys Ile Thr Phe Ala Glu Lys Val Ala Asn Ala Glu
260 265 270
Ser Leu Asn Ala Ile Gly Val Leu Ile Tyr Met Asp Gln Thr Lys Phe
275 280 285
Pro Ile Val Lys Ala Asp Leu Ser Phe Phe Gly His Ala His Leu Gly
290 295 300
Thr Gly Asp Pro Tyr Thr Pro Gly Phe Pro Ser Phe Asn His Thr Gln
305 310 315 320
Phe Pro Pro Ser Gln Ser Ser Gly Leu Pro Asn Ile Pro Val Gln Thr
325 330 335
Ile Ser Arg Ala Ala Ala Glu Lys Leu Phe Gly Asn Met Glu Gly Asp
340 345 350
Cys Pro Ser Asp Trp Lys Thr Asp Ser Thr Cys Lys Met Val Thr Ser
355 360 365
Glu Asn Lys Ser Val Lys Leu Thr Val Ser Asn Val Leu Lys Glu Thr
370 375 380
Lys Ile Leu Asn Ile Phe Gly Val Ile Lys Gly Phe Val Glu Pro Asp
385 390 395 400
His Tyr Val Val Val Gly Ala Gln Arg Asp Ala Trp Gly Pro Gly Ala
405 410 415
Ala Lys Ser Ser Val Gly Thr Ala Leu Leu Leu Lys Leu Ala Gln Met
420 425 430
Phe Ser Asp Met Val Leu Lys Asp Gly Phe Gln Pro Ser Arg Ser Ile
435 440 445
Ile Phe Ala Ser Trp Ser Ala Gly Asp Phe Gly Ser Val Gly Ala Thr
450 455 460
Glu Trp Leu Glu Gly Tyr Leu Ser Ser Leu His Leu Lys Ala Phe Thr
465 470 475 480
Tyr Ile Asn Leu Asp Lys Ala Val Leu Gly Thr Ser Asn Phe Lys Val
485 490 495
Ser Ala Ser Pro Leu Leu Tyr Thr Leu Ile Glu Lys Thr Met Gln Asp
500 505 510
Val Lys His Pro Val Thr Gly Arg Ser Leu Tyr Gln Asp Ser Asn Trp
515 520 525
Ala Ser Lys Val Glu Lys Leu Thr Leu Asp Asn Ala Ala Phe Pro Phe
530 535 540
Leu Ala Tyr Ser Gly Ile Pro Ala Val Ser Phe Cys Phe Cys Glu Asp
545 550 555 560
Thr Asp Tyr Pro Tyr Leu Gly Thr Thr Met Asp Thr Tyr Lys Glu Leu
565 570 575
Val Glu Arg Ile Pro Glu Leu Asn Lys Val Ala Arg Ala Ala Ala Glu
580 585 590
Val Ala Gly Gln Phe Val Ile Lys Leu Thr His Asp Thr Glu Leu Asn
595 600 605
Leu Asp Tyr Glu Arg Tyr Asn Ser Gln Leu Leu Leu Phe Leu Arg Asp
610 615 620
Leu Asn Gln Tyr Arg Ala Asp Val Lys Glu Met Gly Leu Ser Leu Gln
625 630 635 640
Trp Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Asp Phe Phe Arg Ala Thr Ser Arg Leu
645 650 655
Thr Thr Asp Phe Arg Asn Ala Glu Lys Arg Asp Lys Phe Val Met Lys
660 665 670
Lys Leu Asn Asp Arg Val Met Arg Val Glu Tyr Tyr Phe Leu Ser Pro
675 680 685
Tyr Val Ser Pro Lys Glu Ser Pro Phe Arg His Val Phe Trp Gly Ser
690 695 700
Gly Ser His Thr Leu Ser Ala Leu Leu Glu Ser Leu Lys Leu Arg Arg
705 710 715 720
Gln Asn Asn Ser Ala Phe Asn Glu Thr Leu Phe Arg Asn Gln Leu Ala
725 730 735
Leu Ala Thr Trp Thr Ile Gln Gly Ala Ala Asn Ala Leu Ser Gly Asp
740 745 750
Val Trp Asp Ile Asp Asn Glu Phe
755 760
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Amino acid sequence of exemplified linker 1
<400> 3
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence of exemplified linker 2
<400> 4
Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence of exemplified linker 3
<400> 5
Ser Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence 1 of CDR 1 in the light chain of mouse
anti-hTfR antibody No.3
<400> 6
Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 7
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence 2 of CDR 1 in the light chain of mouse
anti-hTfR antibody No.3
<400> 7
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 8
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence 1 of CDR 2 in the light chain of mouse
anti-hTfR antibody No.3
<400> 8
Lys Val Ser Asn Arg Phe
1 5
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence 2 of CDR 2 in the light chain of mouse
anti-hTfR antibody No.3
<400> 9
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence of CDR 3 in the light chain of mouse
anti-hTfR antibody No. 3
<400> 10
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence 1 of CDR 1 in the heavy chain of mouse
anti-hTfR antibody No.3
<400> 11
Asn Tyr Trp Leu Gly
1 5
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence 2 of CDR 1 in the heavy chain of mouse
anti-hTfR antibody No.3
<400> 12
Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr Trp
1 5
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence 1 of CDR 2 in the heavy chain of mouse
anti-hTfR antibody No.3
<400> 13
Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro
1 5
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence 2 of CDR 2 in the heavy chain of mouse
anti-hTfR antibody No.3
<400> 14
Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Val
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence 1 of CDR 3 in the heavy chain of mouse
anti-hTfR antibody No.3
<400> 15
Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr
1 5
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence 2 of CDR 3 in the heavy chain of mouse
anti-hTfR antibody No.3
<400> 16
Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr
1 5 10
<210> 17
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence 1 of the variable region of the light chain
of humanized anti-hTfR antibody No.3
<400> 17
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 18
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence 2 of the variable region of the light chain
of humanized anti-hTfR antibody No.3
<400> 18
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 19
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence 3 of the variable region of the light chain
of humanized anti-hTfR antibody No.3
<400> 19
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 20
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence 4 of the variable region of the light chain
of humanized anti-hTfR antibody No.3
<400> 20
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 21
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence 5 of the variable region of the light chain
of humanized anti-hTfR antibody No.3
<400> 21
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 22
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence 6 of the variable region of the light chain
of humanized anti-hTfR antibody No.3
<400> 22
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Phe Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 23
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence of the light chain of humanized anti-hTfR
antibody No.3 containing amino acid sequence 2 as the variable
region
<400> 23
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 24
<211> 740
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the light
chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 containing amino acid
sequence 2 as the variable region, synthetic sequence
<400> 24
acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60
ggagtgcaca gcgacatcgt gatgacccag actcccctga gcctgagcgt gacacctggc 120
cagcctgcca gcatcagctg cagaagctct cagagcctgg tgcacagcaa cggcaacacc 180
tacctgcact ggtatctgca gaagcccggc cagagccctc agctgctgat ctacaaggtg 240
tccaacagat tcagcggcgt gcccgacaga ttctccggca gcggctctgg caccgacttc 300
accctgaaga tttccagagt ggaagccgag gacgtgggcg tgtactactg cagccagagc 360
acccacgtgc cctggacatt cggccagggc accaaggtgg aaatcaagag aaccgtggcc 420
gctcccagcg tgttcatctt cccacctagc gacgagcagc tgaagtccgg cacagcctct 480
gtcgtgtgcc tgctgaacaa cttctacccc cgcgaggcca aggtgcagtg gaaggtggac 540
aacgccctgc agagcggcaa cagccaggaa agcgtgaccg agcaggactc caaggacagc 600
acctacagcc tgagcagcac cctgaccctg agcaaggccg actacgagaa gcacaaggtg 660
tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctg tctagccccg tgaccaagag cttcaacaga 720
ggcgagtgct aagcggccgc 740
<210> 25
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence of the light chain of humanized anti-hTfR
antibody No.3 containing amino acid sequence 4 as the variable
region
<400> 25
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 26
<211> 740
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the light
chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 containing amino acid
sequence 4 as the variable region, synthetic sequence
<400> 26
acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60
ggagtgcaca gcgacatcgt gatgacccag agccccctga gcctgcctgt gacacctggc 120
gagcctgcca gcatcagctg cagatctagc cagagcctgg tgcacagcaa cggcaacacc 180
tacctgcact ggtatctgca gaagcccggc cagagccctc agctgctgat ctacaaggtg 240
tccaacagat tcagcggcgt gcccgacaga ttctccggca gcggctctgg caccgacttc 300
accctgaaga tctccagagt ggaagccgag gacgtgggcg tgtactactg cagccagagc 360
acccacgtgc cctggacatt cggccagggc accaaggtgg aaatcaagag aaccgtggcc 420
gctcccagcg tgttcatctt cccacctagc gacgagcagc tgaagtccgg cacagcctct 480
gtcgtgtgcc tgctgaacaa cttctacccc cgcgaggcca aggtgcagtg gaaggtggac 540
aacgccctgc agagcggcaa cagccaggaa agcgtgaccg agcaggactc caaggacagc 600
acctacagcc tgagcagcac cctgaccctg agcaaggccg actacgagaa gcacaaggtg 660
tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctg tctagccccg tgaccaagag cttcaacaga 720
ggcgagtgct aagcggccgc 740
<210> 27
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence of the light chain of humanized anti-hTfR
antibody No.3 containing amino acid sequence 5 as the variable
region
<400> 27
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 28
<211> 740
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the light
chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 containing amino acid
sequence 5 as the variable region, synthetic sequence
<400> 28
acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60
ggagtgcaca gcgacatcgt gatgacccag acacccctga gcctgcctgt gacacctggc 120
gagcctgcca gcatcagctg cagatctagc cagagcctgg tgcacagcaa cggcaacacc 180
tacctgcact ggtatctgca gaagcccggc cagagccctc agctgctgat ctacaaggtg 240
tccaacagat tcagcggcgt gcccgacaga ttctccggca gcggctctgg caccgacttc 300
accctgaaga tctccagagt ggaagccgag gacgtgggcg tgtactactg cagccagagc 360
acccacgtgc cctggacatt cggccagggc accaggctgg aaatcaagag aaccgtggcc 420
gctcccagcg tgttcatctt cccacctagc gacgagcagc tgaagtccgg cacagcctct 480
gtcgtgtgcc tgctgaacaa cttctacccc cgcgaggcca aggtgcagtg gaaggtggac 540
aacgccctgc agagcggcaa cagccaggaa agcgtgaccg agcaggactc caaggacagc 600
acctacagcc tgagcagcac cctgaccctg agcaaggccg actacgagaa gcacaaggtg 660
tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctg tctagccccg tgaccaagag cttcaacaga 720
ggcgagtgct aagcggccgc 740
<210> 29
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence of the light chain of humanized anti-hTfR
antibody No.3 containing amino acid sequence 6 as the variable
region
<400> 29
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Phe Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 30
<211> 740
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the light
chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 containing amino acid
sequence 6 as the variable region, synthetic sequence
<400> 30
acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60
ggagtgcaca gcgacatcgt gatgacccag actcccctga gcctgagcgt gacacctggc 120
cagcctgcca gcatcagctg cagatccagc cagagcctgg tgcacagcaa cggcaacacc 180
tacctgcact ggtatctgca gaagcccggc cagagccctc agctgctgat ctacaaggtg 240
tccaacagat tcagcggcgt gcccgacaga ttctccggca gcggctctgg caccgacttc 300
accctgaaga tttccagagt ggaagccgag gacgtgggcg tgttcttctg cagccagagc 360
acccacgtgc cctggacatt cggccagggc accaaggtgg aaatcaagag aaccgtggcc 420
gctcccagcg tgttcatctt cccacctagc gacgagcagc tgaagtccgg cacagcctct 480
gtcgtgtgcc tgctgaacaa cttctacccc cgcgaggcca aggtgcagtg gaaggtggac 540
aacgccctgc agagcggcaa cagccaggaa agcgtgaccg agcaggactc caaggacagc 600
acctacagcc tgagcagcac cctgaccctg agcaaggccg actacgagaa gcacaaggtg 660
tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctg tctagccccg tgaccaagag cttcaacaga 720
ggcgagtgct aagcggccgc 740
<210> 31
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence 1 of the variable region of the heavy chain
of humanized anti-hTfR antibody No.3
<400> 31
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Val Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 32
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence 2 of the variable region of the heavy chain
of humanized anti-hTfR antibody No.3
<400> 32
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 33
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence 3 of the variable region of the heavy chain
of humanized anti-hTfR antibody No.3
<400> 33
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Val Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 34
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence 4 of the variable region of the heavy chain
of humanized anti-hTfR antibody No.3
<400> 34
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Val Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 35
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence 5 of the variable region of the heavy chain
of humanized anti-hTfR antibody No.3
<400> 35
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Val Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Val Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 36
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence 6 of the variable region of the heavy chain
of humanized anti-hTfR antibody No.3
<400> 36
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Val Lys Ala Ile Ile Ser Ala Asp Thr Ser Ile Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 37
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence of the heavy chain of humanized anti-hTfR
antibody No.3 containing amino acid sequence 2 as the variable
region
<400> 37
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 38
<211> 1427
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the heavy
chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 containing amino acid
sequence 2 as the variable region, synthetic sequence
<400> 38
acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60
ggagtgcaca gcgaggtgca actagtgcag tctggagcag aggtgaaaaa gcccggggag 120
tctctgaaga tttcctgtaa gggttctgga tacagcttta ccaactactg gctgggatgg 180
gtgcgccaga tgcccgggaa aggcctggag tggatggggg acatctaccc cggcggagac 240
taccctacat acagcgagaa gttcaaggtc caggtcacca tctcagccga caagtccatc 300
agcaccgcct acctgcagtg gagcagcctg aaggcctcgg acaccgccat gtattactgt 360
gcgagatcag gcaattacga cgaagtggcc tactggggcc aaggaaccct ggtcaccgtc 420
tcctcagcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 480
tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 540
gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 600
tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 660
cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 720
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacacg tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 780
ggaggtccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 840
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 900
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 960
tacaacagca cgtaccgggt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1020
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1080
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1140
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1200
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1260
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1320
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1380
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaataag cggccgc 1427
<210> 39
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence of the heavy chain (IgG4) of humanized
anti-hTfR antibody No.3 containing amino acid sequence 2 as the
variable region
<400> 39
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 40
<211> 1418
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the heavy
chain (IgG4) of humanized anti-hTfR antibody No.3 containing
amino acid sequence 2 as the variable region, synthetic sequence
<400> 40
acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60
ggagtgcaca gcgaggtgca actagtgcag tctggagcag aggtgaaaaa gcccggggag 120
tctctgaaga tttcctgtaa gggttctgga tacagcttta ccaactactg gctgggatgg 180
gtgcgccaga tgcccgggaa aggcctggag tggatggggg acatctaccc cggcggagac 240
taccctacat acagcgagaa gttcaaggtc caggtcacca tctcagccga caagtccatc 300
agcaccgcct acctgcagtg gagcagcctg aaggcctcgg acaccgccat gtattactgt 360
gcgagatcag gcaattacga cgaagtggcc tactggggcc aaggaaccct ggtcaccgtc 420
tcctcagcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg cgccctgctc caggagcacc 480
tccgagagca cagccgccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 540
gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 600
tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacg 660
aagacctaca cctgcaacgt agatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 720
gagtccaaat atggtccccc atgcccacca tgcccagcac ctgagttcct ggggggtcca 780
tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag gacactctca tgatctcccg gacccctgag 840
gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 900
gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc 960
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 1020
tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa 1080
gccaaagggc agccccgaga gccacaggtg tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg 1140
accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 1200
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1260
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aggctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320
gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacacag 1380
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaataa gcggccgc 1418
<210> 41
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Primer hTfR5', synthetic sequence
<400> 41
ccgacgcgtc gccaccatga tggatcaagc tagatcagca ttc 43
<210> 42
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Primer hTfR3', synthetic sequence
<400> 42
ataatgcggc cgcttaatga tgatgatgat gatgaaactc attgtcaatg tcccaaacg 59
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Primer Hyg-Sfi5', synthetic sequence
<400> 43
gaggccgcct cggcctctga 20
<210> 44
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Primer Hyg-BstX3', synthetic sequence
<400> 44
aaccatcgtg atgggtgcta ttcctttgc 29
<210> 45
<211> 4460
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> "Nucleotide sequence of the DNA formed of a cDNA encoding
chimeric hTfR and a loxP-flanked neomycin resistance gene placed
on the cDNA's 3' side, synthetic sequence "
<400> 45
gtttatcctc ccttgtagca gctgagaatg atggatcaag ccagatcagc attctctaac 60
ttgtttggtg gggaaccatt gtcatacacc cggtttagcc ttgctcggca agtagatgga 120
gataacagtc atgtggagat gaaactggct gcagatgaag aagaaaatgc cgacaataac 180
atgaaggcta gtgtcagaaa acccaagagg tttaatggaa gactctgctt tgcagctatt 240
gcactagtca ttttcttctt gattggattc atgagtggct acctgggcta ttgtaaaggg 300
gtagaaccaa aaactgagtg tgagagactg gcaggaaccg agtctccagt gagggaggag 360
ccaggagagg acttccctgc agcacgtcgc ttatattggg atgacctgaa gagaaagttg 420
tcggagaaac tggacagcac agacttcacc ggcaccatca agctgctgaa tgaaaattca 480
tatgtccctc gtgaggctgg atctcaaaaa gatgaaaatc ttgcgttgta tgttgaaaat 540
caatttcgtg aatttaaact cagcaaagtc tggcgtgatc aacattttgt taagattcag 600
gtcaaagaca gcgctcaaaa ctcggtgatc atagttgata agaacggtag acttgtttac 660
ctggtggaga atcctggggg ttatgtggcg tatagtaagg ctgcaacagt tactggtaaa 720
ctggtccatg ctaattttgg tactaaaaaa gattttgagg atttatacac tcctgtgaat 780
ggatctatag tgattgtcag agcagggaaa atcacctttg cagaaaaggt tgcaaatgct 840
gaaagcttaa atgcaattgg tgtgttgata tacatggacc agactaaatt tcccattgtt 900
aacgcagaac tttcattctt tggacatgct catctgggga caggtgaccc ttacacacct 960
ggattccctt ccttcaatca cactcagttt ccaccatctc ggtcatcagg attgcctaat 1020
atacctgtcc agacaatctc cagagctgct gcagaaaagc tgtttgggaa tatggaagga 1080
gactgtccct ctgactggaa aacagactct acatgtagga tggtaacctc agaaagcaag 1140
aatgtgaagc tcactgtgag caatgtgctg aaagagataa aaattcttaa catctttgga 1200
gttattaaag gctttgtaga accagatcac tatgttgtag ttggggccca gagagatgca 1260
tggggccctg gagctgcaaa atccggtgta ggcacagctc tcctattgaa acttgcccag 1320
atgttctcag atatggtctt aaaagatggg tttcagccca gcagaagcat tatctttgcc 1380
agttggagtg ctggagactt tggatcggtt ggtgccactg aatggctaga gggatacctt 1440
tcgtccctgc atttaaaggc tttcacttat attaatctgg ataaagcggt tcttggtacc 1500
agcaacttca aggtttctgc cagcccactg ttgtatacgc ttattgagaa aacaatgcaa 1560
aatgtgaagc atccggttac tgggcaattt ctatatcagg acagcaactg ggccagcaaa 1620
gttgagaaac tcactttaga caatgctgct ttccctttcc ttgcatattc tggaatccca 1680
gcagtttctt tctgtttttg cgaggacaca gattatcctt atttgggtac caccatggac 1740
acctataagg aactgattga gaggattcct gagttgaaca aagtggcacg agcagctgca 1800
gaggtcgctg gtcagttcgt gattaaacta acccatgatg ttgaattgaa cctggactat 1860
gagaggtaca acagccaact gctttcattt gtgagggatc tgaaccaata cagagcagac 1920
ataaaggaaa tgggcctgag tttacagtgg ctgtattctg ctcgtggaga cttcttccgt 1980
gctacttcca gactaacaac agatttcggg aatgctgaga aaacagacag atttgtcatg 2040
aagaaactca atgatcgtgt catgagagtg gagtatcact tcctctctcc ctacgtatct 2100
ccaaaagagt ctcctttccg acatgtcttc tggggctccg gctctcacac gctgccagct 2160
ttactggaga acttgaaact gcgtaaacaa aataacggtg cttttaatga aacgctgttc 2220
agaaaccagt tggctctagc tacttggact attcagggag ctgcaaatgc cctctctggt 2280
gacgtttggg acattgacaa tgagttttaa cgtggctcgc tgatcagcct cgactgtgcc 2340
ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg 2400
tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag 2460
gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga 2520
caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctatggct tctgaggcgg aaagaaccag 2580
ctggggctcg atcctctagt taagcttccc agcggccgct atcgaattcc gatcatattc 2640
aataaccctt aatataactt cgtataatgt atgctatacg aagttattag gtctgaagag 2700
gagtttacgt ccagccaagc taattctacc gggtagggga ggcgcttttc ccaaggcagt 2760
ctggagcatg cgctttagca gccccgctgg gcacttggcg ctacacaagt ggcctctggc 2820
ctcgcacaca ttccacatcc accggtaggc gccaaccggc tccgttcttt ggtggcccct 2880
tcgcgccacc ttctactcct cccctagtca ggaagttccc ccccgccccg cagctcgcgt 2940
cgtgcaggac gtgacaaatg gaagtagcac gtctcactag tctcgtgcag atggacagca 3000
ccgctgagca atggaagcgg gtaggccttt ggggcagcgg ccaatagcag ctttgctcct 3060
tcgctttctg ggctcagagg ctgggaaggg gtgggtccgg gggcgggctc aggggcgggc 3120
tcaggggcgg ggcgggcgcc cgaaggtcct ccggaggccc ggcattctgc acgcttcaaa 3180
agcgcacgtc tgccgcgctg ttctcctctt cctcatctcc gggcctttcg acctgcagcc 3240
aatatgggat cggccattga acaagatgga ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg 3300
gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg 3360
ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc 3420
ctgaatgaac tgcaggacga ggcagcgcgg ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct 3480
tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa 3540
gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg 3600
gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa 3660
gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat 3720
gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg 3780
cgcatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg acccatggcg atgcctgctt gccgaatatc 3840
atggtggaaa atggccgctt ttctggattc atcgactgtg gccggctggg tgtggcggac 3900
cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg 3960
gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc 4020
tatcgccttc ttgacgagtt cttctgaggg gatccgctgt aagtctgcag aaattgatga 4080
tctattaaac aataaagatg tccactaaaa tggaagtttt tcctgtcata ctttgttaag 4140
aagggtgaga acagagtacc tacattttga atggaaggat tggagctacg ggggtggggg 4200
tggggtggga ttagataaat gcctgctctt tactgaaggc tctttactat tgctttatga 4260
taatgtttca tagttggata tcataattta aacaagcaaa accaaattaa gggccagctc 4320
attcctccca ctcatgatct atagatccct cgatcgagat ccggaaccct taatataact 4380
tcgtataatg tatgctatac gaagttatta ggtccctcga agaggttcac tagttctaga 4440
gcatttaaat acgtgctagc 4460
<210> 46
<211> 5003
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Nucleotide sequence of the 5'-arm of targeting vector, synthetic
sequence
<400> 46
aaagacattc ccagggtccc taagggctcc atctgggagc gcgctatctg tagtcctgtt 60
gtggtttaag ataccactct ctttgttatt tgtaaattta ccacaggctg ggcagtaaag 120
tacagatagg aagaaaagag tgtgaacgtt tgcagtttta acagaactcc ttttatttgc 180
tatgcattgc aacaaccctc taaaagcaat aatggcgata aacatgcaag ttaatctaca 240
actttatcac cctagtaaat cattggttcc tatttccctt ccataggctg aacatagtga 300
gcactggtag ctctttgctt ggcttaagcg ctgcttgtta aaatctaaaa aaaaaaaaaa 360
aaaagatttg cagttttgct ttaaagtttt tcctttaaag catctctgag ctgcaaaaac 420
tcgtctttag gatatggttt tggcggagac ctaagcctgc aagtaggaat attttaaaga 480
gtaaaggctg atactttcga acttgcaccg cagggttggg tgtcggtcaa ggttaggcgg 540
agggcgacag gccaactcca aagacacggc gggggagggg tgcggtggag aaagcgagcc 600
gcagccaatc gcacgcgctc tcccgacacc tgccgccttg gcgccttttc taggctactc 660
cgcgcacgca ctggctgcgc gcgcagttcg cctccagcgg tcttggggga gcacctcggt 720
aggtgtacgt gcggaaggaa gtgacgtaga tccagagggc cggccggggg gtggggccga 780
gctataagct ttgggtggga ggcagcgctg ccttcagaag gcgtgcggag cgcgggctgc 840
tgcattgcgg actgtagagg cgcttcctag tgagtgactc ccttgtcagc ggcacggccc 900
atcgtggtcc tcgcgtggcg ggcggaccag agcgagacgc cagggcctgg gtggtgcggg 960
cggggaggcg gaggggtgtc gcggagtccg gggctgagga gcgcgggttg caggtgcagc 1020
gcggtgggtg tggggagccg ctgtaccctg cgcccctcgg gtcctccggg ccttcgcagg 1080
ccagtgctag gccgcgggtt cgagagtcac cacgctgagg cgcaggcttg ttccgccggg 1140
agcacgtggt ggcggctgga ggaagtcgcc ccagggaacg gctgtcgggg tacgtgggtg 1200
accttggggc ccctcgcagg agggcgtcac agctgaaaag gacaaagctg ttttctattc 1260
ggttactagt gtcacggaca tttagagggg cggggggagc ttccaataac tgcacgttgg 1320
aacttcggca ccacctggtc ggtttttttg ccagtctctc cctcttggcc cagcgtgtgg 1380
aatctcattt ttctagggca gaataggtct gaacgctgca ggtaatacta agaacgtctc 1440
tagcatctcc taagatggga gaacgtagaa atacgacctc tttgtacgag ctcttttaga 1500
actagctgta gagaaccagc gtgcaccctg gtgttggaca gctctctaaa atggtgtttg 1560
agggtaagaa aactgcattt gcaaattttt cagttagcac actttgtccc gagcgtaaaa 1620
tgaaatgatc tccttatact taggcagaag actggactgg attgctgttc agtttctgtg 1680
ctattttttt aaaataggat ttaagtggga aatagttgtg ttacagaaat tctcggctat 1740
tctgtgctat ttttttttaa ataggattta agtgggaaat agttgtgtta cagaaattct 1800
cggctacctg atacttttat tctaagatta gatgagttgg ctctgagctg tgaaatatga 1860
cctctttgac aaagacattt aagctgattc aggatgttat ctacaaagaa aacgggattt 1920
agcttgtgtg ggtccacttg catttatttt ctgttaagga ttataataaa ctgctttata 1980
caggaatcca atatcagctg ttttttatat agagagcata atacttttta ctttgagaga 2040
ggatgttgtc aaggaatggt ggctgtgaac ctggcctgtg ttgactggtt agatctgtct 2100
gcctaacccc accctaaggc taagtagtta tatgcttgtg gcaatgtgct tatttataat 2160
agggcaagat tatgggctaa atttgggtta gacaacaatg aaagttaatt aaacgaccct 2220
caggccttgg gtctactatg tgtaagtgat ttccttctct cccagatgag tgctatacaa 2280
aataaacttc agtgacctca agtggttttg accttttggt tgctattcag aaaactatgg 2340
aaatgaaaac ctgctaccta tttcctattg ccttttcaat ttcccaaaga aggtctcccc 2400
tatgaatcca tgggtagcct tgaactcaga tccacctgct tctgtttgga gagtgataag 2460
attaaaggca agtgccacca cacccagcaa agtaggctct taaaactaaa acctttgcag 2520
tcgggcatgg tgccacacac ctttggtccc agcactgggg ggtaaggcag aggcaggtgg 2580
atcactgagt ttgaggtcag ctagtgctga agagtaagag cctgtcttta aaacatctca 2640
acagctgggc agtcgtggtc cattccttta atcccagcac ttgggaggca gaggcaagtg 2700
gatttttgag ttcgaggcca gcctggtcta cagagtgagt tccaggacag ccagggatac 2760
acagagaaac cctgtctcaa aaaaccaaaa tataaataaa taaataaaga ttgggagaga 2820
agtcaaggat ctcataggtg gtcagggagc tacaactgca gtagtaaaga agtaggactt 2880
aaaagaacag ggccggcact aattttgagg atctagatcg ggccctcaat taaggaactt 2940
ccttttgtgt gaactcagaa tttgaaatga aatgtgcttg tcagaaccat tgcatggctt 3000
attttttaat gaaaagtctg gctagtatct gcttatcttc cagcttccag ctcaaagtta 3060
aggtcataga tcaaaagaac tatgtcttta tcttagttgt atcttaattt ttattagaat 3120
tgaatggttt tcctaatgtt tggtaacatc aaaggtgtgt aagtaaaagt gagaaatcaa 3180
gattaacttt ctcttggcaa agattgttga cattggtgac atcttggacc aaatgagaat 3240
tgttttactt ttaaatgtcc catcaacagc tctcagttag gctgttctat ctggtttgtc 3300
ttgccatgct tgcagagtat agatttgaca atttgaaaat tcaaaaagct atataaatag 3360
gtatgttgct atatgtaaga ttttaaatga gtcagttaag acttaaagaa taactgggtt 3420
tattttatct tgtcaggtta tcactgtgta gaccaggttg accttgaaaa caaattctct 3480
gcttcccaag tgctgggatt aaaggcgtgt gtcactagct ctgacactgg ctactttgga 3540
actactatgg tgttcacaaa tgcagagttg agtgttggga ttaaatggaa atttcatgtc 3600
ttttttttta actttccctt ctacacaggg cttctctgtg tagtcctggc tgtccttgta 3660
gctctagact aggctgaatt caaactcaga tccacccacc taagtgctga gattaaaggc 3720
atgtgccacc actgcccagt tctgaattgt tggggttttt tttttgttgt tattcttaat 3780
tttagttcga tgaattaaaa tcgaaataac ttgtttctta gaaaaataag gtgtaattgg 3840
gttataaagc caaatttaga cattaatacc aacagcctgt ttaggctcaa aattgttcaa 3900
tcattttatt agtattatta ttaatcatat caacttgaga cctgtttggg aaagcagaat 3960
attttaggga tagctatttc agacaagcat taatgtgtta gctgtttttt tccccctaga 4020
atatgattaa aattggctca gggtggggcc ttctagttct ggctctagcg attgggtctg 4080
tttctggtga ggtggtagtg ataaactgta acagaaggga caagagattg ggcttctgag 4140
aacatgtatg atctggtatg tgactttaat cattaaagca tggggattca aaaatactaa 4200
tgaataggcc ttagaactag tcctgagtgt tttgtaaaat aacagtctta attctcctag 4260
tttctggatt tttttctttg tctttggata ctaagtttaa gcatttattt ggacagagtg 4320
gtgcccacta gctgttctat tctagtactt gggaggcaag aggcagaacg aacatggcca 4380
gcttggacaa cttaagaaaa ctgaaaggct tgccatccta gtttttcttt tgattaaaca 4440
cacttatatt ctaactagtt ttctctatcc tttgggtttt gttttgtttt ttatttgttt 4500
tgtagctcta gctggctggc ttcggaattg cctgcctccc aagtgctagg attaaaggca 4560
tcacagtcac tacccaattg atatcatgat tcttaattca acttctaaga acaaattatc 4620
acactctgaa tctaacatgg aatagcatta tccatgttca gatatctttg tctcaaggct 4680
caggtttatc ctttgtagct ttctttttgc tatcccacct ctattcagca tccagtcaag 4740
gatcactgag ttggttatca gtaaattaaa cattttaatt aatgtctagg agacaggtta 4800
tggtatagtt ctcagtgctg ggaagttgac atggtaggat ctcagttcat ggccagccag 4860
aactttctgg tgagatcctg gttcaagcac tacagagctt ttctagaaaa gtaactatat 4920
ttaggagtaa gtttgatata atgacaatcc catcgtaagc cttcagtaac ctgatgcatt 4980
ggtctctgtt ttaatatcag gta 5003
<210> 47
<211> 2604
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Nucleotide sequence of the 3'-arm of targeting vector, synthetic
sequence
<400> 47
gcattctcta acttggtaag gtactttcat ctatctgaaa aaatgttcag taaaaaacaa 60
aacaaaaaca tgacttcacc cagtgagtac aagatgatac ccccaatttt tttttttttt 120
attatatgta tgtacactgt agctgtcttc agacacacca gaagagggcg tcagatctca 180
tcagatggtt gtgagccacc atgtggttgc tgggacttga acactggacc tttggaaaag 240
cagttgggta ctcttaccca ctgagctatc acaccagccc caatacccca aattttgacc 300
agcctttttt tttttttttt tttttttttt aaatctgaac taatggtatt aaggtgaaac 360
agattgcaca aaagaggtac taggtttttc tttgaggcaa ggtctttcta tattgcctca 420
ggttgacctt aaactccaac ttcctttttt tccccaagtg ctggagattg tagacagata 480
tatacaacac cccaaaacaa atatgtttag tttcgattaa gattcattat gtggggctag 540
agggatgact tagaggttaa gaacactgcc tgctcttcca gaggtcctga gttcaattcc 600
cagcaaccac gtggtggctc acaaccatct gtaatgggat ccgatgccct ctttctggtg 660
tgtttgaaga cagctacagt gtcctcatac ataaaaaaaa taaacaaaca gatcttttaa 720
aaaaaaaggt acagtgtact tatacattat ataaatgaat gattctttaa aaaattaatt 780
atgggaaata cttatgaaga atagggtagc tttggctgtt ttggaaacgt tatataacaa 840
ggtagaacta aaatgtatgc cagtaatccc agaggaatca ttagccagtc agggctagtc 900
tgagcaatgt ggcaagataa acccatctct ttaaaaaaaa aaaaaagtat tataaataga 960
aatgttatag gaaacaggaa atagaaaccc tcgaaaggct gaatgaaaga gtattagtgg 1020
gctggagaga tggttcagcg gttaagagca ctatctcctg agttcagttc ccagtgacca 1080
catggtggct cacagccatc tgtaatgaga tctgacgccc tcttctgggg tgtctgaaga 1140
cagcgacagt gtactcacat aaaataaata cataaagact gttagttagc cttcatctac 1200
catttacaga actgggcaca gaaaggagtt catcagttat aaagggtaac tttccatatg 1260
aatgtttgtc atattattat gcatatagta taatgaccaa actactgtaa tgtcttaata 1320
tttgtatctc ttttctcttt tttaaaaata tcagtttggt ggggaaccat tgtcatacac 1380
ccggtttagc cttgctcggc aagtagatgg agataacagt catgtggaga tgaaactggc 1440
tgcagatgaa gaagaaaatg ccgacaataa catgaaggct agtgtcagaa aacccaagag 1500
gtttaatgga agactctgct ttgcagctat tgcactagtc attttcttct tgattggtaa 1560
gaatgagtgg ccattcagaa ggatttctta tgactaacta gttcttagac tagctagttc 1620
ttagactagc tagttcttgt ttcttttgga tgaggagatg ctttgtactt taaatggcac 1680
tggggctccc tacctgccgg cagattaggt cctgcaagat gggaaacgtt tacattatgg 1740
atgttttatt agagatatgc aggacatttg gaatagtact aagaaaggct tccagtaaga 1800
caaggtgtgc acccatgtct taaacaggtc actgtaaaat atgacttagt tgtggtaatt 1860
taaattccat taaactcagg ttcataattt tctattagat tctcatagtt taattaaaag 1920
ttttcaggga taagttaaaa atgagttctg tgagtttagc tctaaaactt cctgttttta 1980
ggattcatga gtggctacct gggctattgt aagcgtgtag aacaaaaaga ggagtgtgtg 2040
aaactggctg aaacggagga gacagacaag tcagaaacca tggaaacaga ggatgttcct 2100
acatcatctc gcttatattg ggcagacctc aaaacactgt tgtcagagaa gttgaactcc 2160
atagagtttg ctgacaccat caagtaagct caacttccca agttcagtcc tgatggaaac 2220
gtttttgttg ggggggtagg gagacttgaa aggctttcag agggtcctcc tgacaatgtg 2280
gaactatgct gacaggaaat taggacttac ctggagagcc tcatagcctc ctttttcttc 2340
agaatcgttt tatcagttgt agtttagtgt gggatgtcag attttcttct gttctaatat 2400
tccttttaaa aattttttaa aattaaaatt actttttatg tattatgagt atagcctgca 2460
tatatgaatg aatgtgcatt actaattaca cttatctcct agtgcctaca taagccttat 2520
agatggttgt gagccagcat gtgggtgctg gaatccaaaa tggttcttgc aagaccaaat 2580
atgttacatc ccagagccat taca 2604
<210> 48
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence of the variable region of the light chain of
mouse anti-hTfR antibody No.3
<400> 48
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Phe Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 49
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence of the variable region of the heavy chain of
mouse anti-hTfR antibody No.3
<400> 49
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Val Lys Ala Ile Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Ser Val Tyr
65 70 75 80
Leu His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Thr
115
<210> 50
<211> 357
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(357)
<400> 50
cac tct gac cct gcc cgc cga ggg gag ctg agc gtg tgt gac agt att 48
His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile
1 5 10 15
agt gag tgg gta acg gcg gca gac aaa aag act gca gtg gac atg tcg 96
Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser
20 25 30
ggc ggg acg gtc aca gtc ctt gaa aag gtc cct gta tca aaa ggc caa 144
Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln
35 40 45
ctg aag caa tac ttc tac gag acc aag tgc aat ccc atg ggt tac aca 192
Leu Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr
50 55 60
aaa gaa ggc tgc agg ggc ata gac aaa agg cat tgg aac tcc cag tgc 240
Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gln Cys
65 70 75 80
cga act acc cag tcg tac gtg cgg gcc ctt acc atg gat agc aaa aag 288
Arg Thr Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys
85 90 95
aga att ggc tgg cga ttc ata agg ata gac act tct tgt gta tgt aca 336
Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr
100 105 110
ttg acc att aaa agg gga aga 357
Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg
115
<210> 51
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人
<400> 51
His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile
1 5 10 15
Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser
20 25 30
Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln
35 40 45
Leu Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr
50 55 60
Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gln Cys
65 70 75 80
Arg Thr Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys
85 90 95
Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr
100 105 110
Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg
115
<210> 52
<211> 569
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence of fusion protein of the heavy chain of
humanized anti-hTfR antibody 3N and hBDNF (1)
<400> 52
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
Gly Ser His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp
450 455 460
Ser Ile Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp
465 470 475 480
Met Ser Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys
485 490 495
Gly Gln Leu Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly
500 505 510
Tyr Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser
515 520 525
Gln Cys Arg Thr Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser
530 535 540
Lys Lys Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val
545 550 555 560
Cys Thr Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg
565
<210> 53
<211> 1790
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Nucleotide seuquence encoding the amino acid sequence of fusion
protein of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody 3N and
hBDNF (1), synthetic sequence
<400> 53
acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60
ggagtgcaca gcgaggtgca actagtgcag tctggagcag aggtgaaaaa gcccggggag 120
tctctgaaga tttcctgtaa gggttctgga tacagcttta tgaactactg gctgggatgg 180
gtgcgccaga tgcccgggaa aggcctggag tggatggggg acatctaccc cggcggagac 240
taccctacat acagcgagaa gttcaaggtc caggtcacca tctcagccga caagtccatc 300
agcaccgcct acctgcagtt gagcagcctg aaggcctcgg acaccgccat gtattactgt 360
gcgagatcag gcaattacga cgaagtggcc tactggggcc aaggaaccct ggtcaccgtc 420
tcctcagcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 480
tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 540
gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 600
tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 660
cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 720
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacacg tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 780
ggaggtccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 840
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 900
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 960
tacaacagca cgtaccgggt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1020
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1080
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1140
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1200
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1260
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1320
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1380
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaaggat ctcactctga ccctgcccgc 1440
cgaggggagc tgagcgtgtg tgacagtatt agtgagtggg taacggcggc agacaaaaag 1500
actgcagtgg acatgtcggg cgggacggtc acagtccttg aaaaggtccc tgtatcaaaa 1560
ggccaactga agcaatactt ctacgagacc aagtgcaatc ccatgggtta cacaaaagaa 1620
ggctgcaggg gcatagacaa aaggcattgg aactcccagt gccgaactac ccagtcgtac 1680
gtgcgggccc ttaccatgga tagcaaaaag agaattggct ggcgattcat aaggatagac 1740
acttcttgtg tatgtacatt gaccattaaa aggggaagat aagcggccgc 1790
<210> 54
<211> 594
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence of fusion protein of the heavy chain of
humanized anti-hTfR antibody 3N and hBDNF (2)
<400> 54
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Ser Asp Pro Ala
465 470 475 480
Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile Ser Glu Trp Val Thr
485 490 495
Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly Thr Val Thr
500 505 510
Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln Leu Lys Gln Tyr Phe
515 520 525
Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu Gly Cys Arg
530 535 540
Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gln Cys Arg Thr Thr Gln Ser
545 550 555 560
Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile Gly Trp Arg
565 570 575
Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr Ile Lys Arg
580 585 590
Gly Arg
<210> 55
<211> 1865
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Nucleotide seuquence encoding the amino acid sequence of fusion
protein of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody 3N and
hBDNF (2), synthetic sequence
<400> 55
acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60
ggagtgcaca gcgaggtgca actagtgcag tctggagcag aggtgaaaaa gcccggggag 120
tctctgaaga tttcctgtaa gggttctgga tacagcttta tgaactactg gctgggatgg 180
gtgcgccaga tgcccgggaa aggcctggag tggatggggg acatctaccc cggcggagac 240
taccctacat acagcgagaa gttcaaggtc caggtcacca tctcagccga caagtccatc 300
agcaccgcct acctgcagtt gagcagcctg aaggcctcgg acaccgccat gtattactgt 360
gcgagatcag gcaattacga cgaagtggcc tactggggcc aaggaaccct ggtcaccgtc 420
tcctcagcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 480
tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 540
gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 600
tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 660
cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 720
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacacg tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 780
ggaggtccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 840
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 900
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 960
tacaacagca cgtaccgggt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1020
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1080
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1140
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1200
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1260
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1320
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1380
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaaggat ctggtggcgg agggtctgga 1440
ggtggcggat caggcggagg aggttccggg ggcggtggaa gcggaggcgg tggaagccac 1500
tctgaccctg cccgccgagg ggagctgagc gtgtgtgaca gtattagtga gtgggtaacg 1560
gcggcagaca aaaagactgc agtggacatg tcgggcggga cggtcacagt ccttgaaaag 1620
gtccctgtat caaaaggcca actgaagcaa tacttctacg agaccaagtg caatcccatg 1680
ggttacacaa aagaaggctg caggggcata gacaaaaggc attggaactc ccagtgccga 1740
actacccagt cgtacgtgcg ggcccttacc atggatagca aaaagagaat tggctggcga 1800
ttcataagga tagacacttc ttgtgtatgt acattgacca ttaaaagggg aagataagcg 1860
gccgc 1865
<210> 56
<211> 229
<212> PRT
<213> 智人
<400> 56
Ala Pro Met Lys Glu Ala Asn Ile Arg Gly Gln Gly Gly Leu Ala Tyr
1 5 10 15
Pro Gly Val Arg Thr His Gly Thr Leu Glu Ser Val Asn Gly Pro Lys
20 25 30
Ala Gly Ser Arg Gly Leu Thr Ser Leu Ala Asp Thr Phe Glu His Val
35 40 45
Ile Glu Glu Leu Leu Asp Glu Asp Gln Lys Val Arg Pro Asn Glu Glu
50 55 60
Asn Asn Lys Asp Ala Asp Leu Tyr Thr Ser Arg Val Met Leu Ser Ser
65 70 75 80
Gln Val Pro Leu Glu Pro Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Glu Tyr Lys
85 90 95
Asn Tyr Leu Asp Ala Ala Asn Met Ser Met Arg Val Arg Arg His Ser
100 105 110
Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile Ser Glu
115 120 125
Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln Leu Lys
145 150 155 160
Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu
165 170 175
Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gln Cys Arg Thr
180 185 190
Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile
195 200 205
Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr
210 215 220
Ile Lys Arg Gly Arg
225
<210> 57
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence of single-chain humanized anti-hTfR antibody
No. 3N
<400> 57
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu
130 135 140
Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln
145 150 155 160
Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln
165 170 175
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg
180 185 190
Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
195 200 205
Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr
210 215 220
Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Lys Val Glu Ile Lys
245
<210> 58
<211> 1583
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Nucleotide seuquence encoding the amino acid sequence of the
fusion protein of the single-chain humanized anti-hTfR antibody
3N and pro-hBDNF, synthetic sequence
<400> 58
acgcgtgccg ccaccatgac catccttttc cttactatgg ttatttcata ctttggttgc 60
atgaaggctg cccccatgaa agaagcaaac atccgaggac aaggtggctt ggcctaccca 120
ggtgtgcgga cccatgggac tctggagagc gtgaatgggc ccaaggcagg ttcaagaggc 180
ttgacatcat tggctgacac tttcgaacac gtgatagaag agctgttgga tgaggaccag 240
aaagttcggc ccaatgaaga aaacaataag gacgcagact tgtacacgtc cagggtgatg 300
ctcagtagtc aagtgccttt ggagcctcct cttctctttc tgctggagga atacaaaaat 360
tacctagatg ctgcaaacat gtccatgagg gtccggcgcc actctgaccc tgcccgccga 420
ggggagctga gcgtgtgtga cagtattagt gagtgggtaa cggcggcaga caaaaagact 480
gcagtggaca tgtcgggcgg gacggtcaca gtccttgaaa aggtccctgt atcaaaaggc 540
caactgaagc aatacttcta cgagaccaag tgcaatccca tgggttacac aaaagaaggc 600
tgcaggggca tagacaaaag gcattggaac tcccagtgcc gaactaccca gtcgtacgtg 660
cgggccctta ccatggatag caagaagaga attggctggc gattcataag gatagacact 720
tcttgtgtat gtacattgac cattaaaagg ggaagaggat ctggtggcgg agggtctgga 780
ggtggcggat caggcggagg aggttccggg ggcggtggaa gcggaggcgg tggaagtgag 840
gtgcaactag tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaagatttcc 900
tgtaagggtt ctggatacag ctttatgaac tactggctgg gatgggtgcg ccagatgccc 960
gggaaaggcc tggagtggat gggggacatc taccccggcg gagactaccc tacatacagc 1020
gagaagttca aggtccaggt caccatctca gccgacaagt ccatcagcac cgcctacctg 1080
cagttgagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag atcaggcaat 1140
tacgacgaag tggcctactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc aggcggtggt 1200
ggaagtggag gcggtgggtc gggaggaggt ggcagcgaca tcgtgatgac ccagactccc 1260
ctgagcctga gcgtgacacc tggccagcct gccagcatca gctgcagaag ctctcagagc 1320
ctggtgcaca gcaacggcaa cacctacctg cactggtatc tgcagaagcc cggccagagc 1380
cctcagctgc tgatctacaa ggtgtccaac agattcagcg gcgtgcccga cagattctcc 1440
ggcagcggct ctggcaccga cttcaccctg aagatttcca gagtggaagc cgaggacgtg 1500
ggcgtgtact actgcagcca gagcacccac gtgccctgga cattcggcca gggcaccaag 1560
gtggaaatca agtaagcggc cgc 1583
<210> 59
<211> 501
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence of the fusion protein of the single-chain
humanized anti-hTfR antibody 3N and pro-hBDNF
<400> 59
Ala Pro Met Lys Glu Ala Asn Ile Arg Gly Gln Gly Gly Leu Ala Tyr
1 5 10 15
Pro Gly Val Arg Thr His Gly Thr Leu Glu Ser Val Asn Gly Pro Lys
20 25 30
Ala Gly Ser Arg Gly Leu Thr Ser Leu Ala Asp Thr Phe Glu His Val
35 40 45
Ile Glu Glu Leu Leu Asp Glu Asp Gln Lys Val Arg Pro Asn Glu Glu
50 55 60
Asn Asn Lys Asp Ala Asp Leu Tyr Thr Ser Arg Val Met Leu Ser Ser
65 70 75 80
Gln Val Pro Leu Glu Pro Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Glu Tyr Lys
85 90 95
Asn Tyr Leu Asp Ala Ala Asn Met Ser Met Arg Val Arg Arg His Ser
100 105 110
Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile Ser Glu
115 120 125
Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln Leu Lys
145 150 155 160
Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu
165 170 175
Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gln Cys Arg Thr
180 185 190
Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile
195 200 205
Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr
210 215 220
Ile Lys Arg Gly Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
260 265 270
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr
275 280 285
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
290 295 300
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe
305 310 315 320
Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
325 330 335
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
340 345 350
Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
355 360 365
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
370 375 380
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu
385 390 395 400
Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln
405 410 415
Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln
420 425 430
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg
435 440 445
Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
450 455 460
Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr
465 470 475 480
Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr
485 490 495
Lys Val Glu Ile Lys
500
<210> 60
<211> 391
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence of the fusion protein of the single-chain
humanized anti-hTfR antibody 3N and hBDNF
<400> 60
His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile
1 5 10 15
Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser
20 25 30
Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln
35 40 45
Leu Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr
50 55 60
Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gln Cys
65 70 75 80
Arg Thr Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys
85 90 95
Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr
100 105 110
Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro
145 150 155 160
Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met
165 170 175
Asn Tyr Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu
180 185 190
Trp Met Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu
195 200 205
Lys Phe Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr
210 215 220
Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln
245 250 255
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
260 265 270
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu
275 280 285
Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser
290 295 300
Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr
305 310 315 320
Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser
325 330 335
Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
340 345 350
Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly
355 360 365
Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln
370 375 380
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
385 390
<210> 61
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence of the Fab heavy chain of humanized anti-hTfR
antibody No. 3N
<400> 61
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr
225
<210> 62
<211> 1524
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Nucleotide seuquence encoding the amino acid sequence of the
fusion protein of the Fab heavy chain of humanized anti-hTfR
antibody 3N and pro-hBDNF, synthetic sequence
<400> 62
acgcgtcgcc accatgggtt ggagcctcat cttgctcttc cttgtcgctg ttgctacgcg 60
agtcggcagc gcccccatga aagaagcaaa catccgagga caaggtggct tggcctaccc 120
aggtgtgcgg acccatggga ctctggagag cgtgaatggg cccaaggcag gttcaagagg 180
cttgacatca ttggctgaca ctttcgaaca cgtgatagaa gagctgttgg atgaggacca 240
gaaagttcgg cccaatgaag aaaacaataa ggacgcagac ttgtacacgt ccagggtgat 300
gctcagtagt caagtgcctt tggagcctcc tcttctcttt ctgctggagg aatacaaaaa 360
ttacctagat gctgcaaaca tgtccatgag ggtccggcgc cactctgacc ctgcccgccg 420
aggggagctg agcgtgtgtg acagtattag tgagtgggta acggcggcag acaaaaagac 480
tgcagtggac atgtcgggcg ggacggtcac agtccttgaa aaggtccctg tatcaaaagg 540
ccaactgaag caatacttct acgagaccaa gtgcaatccc atgggttaca caaaagaagg 600
ctgcaggggc atagacaaaa ggcattggaa ctcccagtgc cgaactaccc agtcgtacgt 660
gcgggccctt accatggata gcaagaagag aattggctgg cgattcataa ggatagacac 720
ttcttgtgta tgtacattga ccattaaaag gggaagaggt ggcggagggt ctggaggtgg 780
cggatcaggc ggaggaggtt ccgggggcgg tggaagcgga ggcggtggat ccgaggtgca 840
actagtgcag tctggagcag aggtgaaaaa gcccggggag tctctgaaga tttcctgtaa 900
gggttctgga tacagcttta tgaactactg gctgggatgg gtgcgccaga tgcccgggaa 960
aggcctggag tggatggggg acatctaccc cggcggagac taccctacat acagcgagaa 1020
gttcaaggtc caggtcacca tctcagccga caagtccatc agcaccgcct acctgcagtt 1080
gagcagcctg aaggcctcgg acaccgccat gtattactgt gcgagatcag gcaattacga 1140
cgaagtggcc tactggggcc aaggaaccct ggtcaccgtc tcctcagcta gcaccaaggg 1200
cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca cagcggccct 1260
gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc 1320
cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct 1380
cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca tctgcaacgt 1440
gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt gagccgaaga gctgtgataa 1500
gacgcatacg taataagcgg ccgc 1524
<210> 63
<211> 480
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence of the fusion protein of the Fab heavy chain
of humanized anti-hTfR antibody 3N and pro-hBDNF
<400> 63
Ala Pro Met Lys Glu Ala Asn Ile Arg Gly Gln Gly Gly Leu Ala Tyr
1 5 10 15
Pro Gly Val Arg Thr His Gly Thr Leu Glu Ser Val Asn Gly Pro Lys
20 25 30
Ala Gly Ser Arg Gly Leu Thr Ser Leu Ala Asp Thr Phe Glu His Val
35 40 45
Ile Glu Glu Leu Leu Asp Glu Asp Gln Lys Val Arg Pro Asn Glu Glu
50 55 60
Asn Asn Lys Asp Ala Asp Leu Tyr Thr Ser Arg Val Met Leu Ser Ser
65 70 75 80
Gln Val Pro Leu Glu Pro Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Glu Tyr Lys
85 90 95
Asn Tyr Leu Asp Ala Ala Asn Met Ser Met Arg Val Arg Arg His Ser
100 105 110
Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile Ser Glu
115 120 125
Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln Leu Lys
145 150 155 160
Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu
165 170 175
Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gln Cys Arg Thr
180 185 190
Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile
195 200 205
Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr
210 215 220
Ile Lys Arg Gly Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
225 230 235 240
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
245 250 255
Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu
260 265 270
Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr Trp Leu
275 280 285
Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Asp
290 295 300
Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe Lys Val
305 310 315 320
Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln
325 330 335
Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg
340 345 350
Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
355 360 365
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
370 375 380
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
385 390 395 400
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
405 410 415
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
420 425 430
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
435 440 445
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
450 455 460
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
465 470 475 480
<210> 64
<211> 1196
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Nucleotide seuquence encoding the amino acid sequence of the
fusion protein of the Fab heavy chain of humanized anti-hTfR
antibody 3N and hBDNF, synthetic sequence
<400> 64
acgcgtgccg ccaccatgac catccttttc cttactatgg ttatttcata ctttggttgc 60
atgaaggctc actctgaccc tgcccgccga ggggagctga gcgtgtgtga cagtattagt 120
gagtgggtaa cggcggcaga caaaaagact gcagtggaca tgtcgggcgg gacggtcaca 180
gtccttgaaa aggtccctgt atcaaaaggc caactgaagc aatacttcta cgagaccaag 240
tgcaatccca tgggttacac aaaagaaggc tgcaggggca tagacaaaag gcattggaac 300
tcccagtgcc gaactaccca gtcgtacgtg cgggccctta ccatggatag caaaaagaga 360
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ggaagaggat ctggtggcgg agggtctgga ggtggcggat caggcggagg aggttccggg 480
ggcggtggaa gcggaggcgg tggaagtgag gtgcaactag tgcagtctgg agcagaggtg 540
aaaaagcccg gggagtctct gaagatttcc tgtaagggtt ctggatacag ctttatgaac 600
tactggctgg gatgggtgcg ccagatgccc gggaaaggcc tggagtggat gggggacatc 660
taccccggcg gagactaccc tacatacagc gagaagttca aggtccaggt caccatctca 720
gccgacaagt ccatcagcac cgcctacctg cagttgagca gcctgaaggc ctcggacacc 780
gccatgtatt actgtgcgag atcaggcaat tacgacgaag tggcctactg gggccaagga 840
accctggtca ccgtctcctc agctagcacc aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc 900
tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc 960
cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc 1020
ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc 1080
agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag 1140
gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt gacaaaactc acacgtaagc ggccgc 1196
<210> 65
<211> 370
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence of the fusion protein of the Fab heavy chain
of humanized anti-hTfR antibody 3N and hBDNF
<400> 65
His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile
1 5 10 15
Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser
20 25 30
Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln
35 40 45
Leu Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr
50 55 60
Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gln Cys
65 70 75 80
Arg Thr Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys
85 90 95
Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr
100 105 110
Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
145 150 155 160
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr
165 170 175
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
180 185 190
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe
195 200 205
Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
210 215 220
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
225 230 235 240
Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
245 250 255
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
260 265 270
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
275 280 285
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
290 295 300
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
305 310 315 320
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
325 330 335
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
340 345 350
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
355 360 365
His Thr
370
<210> 66
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence 1 of CDR1 in the heavy chain of humanized
anti-hTfR antibody No. 3N
<400> 66
Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr Trp
1 5
<210> 67
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence 2 of CDR1 in the heavy chain of humanized
anti-hTfR antibody No. 3N
<400> 67
Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr Trp Leu Gly
1 5 10
<210> 68
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence of framework region 3 in the heavy chain of
humanized anti-hTfR antibody No. 3N
<400> 68
Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 69
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence of the variable region of the heavy chain of
humanized anti-hTfR antibody No. 3N
<400> 69
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 70
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence of the heavy chain of humanized anti-hTfR
antibody No. 3N
<400> 70
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 71
<211> 1427
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Nucleotide seuquence encoding the amino acid sequence of the
heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3N, synthetic
sequence
<400> 71
acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60
ggagtgcaca gcgaggtgca actagtgcag tctggagcag aggtgaaaaa gcccggggag 120
tctctgaaga tttcctgtaa gggttctgga tacagcttta tgaactactg gctgggatgg 180
gtgcgccaga tgcccgggaa aggcctggag tggatggggg acatctaccc cggcggagac 240
taccctacat acagcgagaa gttcaaggtc caggtcacca tctcagccga caagtccatc 300
agcaccgcct acctgcagtt gagcagcctg aaggcctcgg acaccgccat gtattactgt 360
gcgagatcag gcaattacga cgaagtggcc tactggggcc aaggaaccct ggtcaccgtc 420
tcctcagcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 480
tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 540
gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 600
tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 660
cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 720
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacacg tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 780
ggaggtccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 840
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 900
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 960
tacaacagca cgtaccgggt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1020
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1080
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1140
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1200
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1260
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1320
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1380
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaataag cggccgc 1427
<210> 72
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence of the heavy chain of humanized anti-hTfR
antibody No. 3N (IgG4)
<400> 72
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 73
<211> 2253
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Nucleotide seuquence encoding the amino acid sequence of the
fusion protein of the Fab heavy chain of humanized anti-hTfR
antibody 3N and pro-hBDNF, further introduced with Fc region of
human IgG, synthetic sequence
<400> 73
acgcgtcgcc accatgggtt ggagcctcat cttgctcttc cttgtcgctg ttgctacgcg 60
agtcggcagc gcccccatga aagaagcaaa catccgagga caaggtggct tggcctaccc 120
aggtgtgcgg acccatggga ctctggagag cgtgaatggg cccaaggcag gttcaagagg 180
cttgacatca ttggctgaca ctttcgaaca cgtgatagaa gagctgttgg atgaggacca 240
gaaagttcgg cccaatgaag aaaacaataa ggacgcagac ttgtacacgt ccagggtgat 300
gctcagtagt caagtgcctt tggagcctcc tcttctcttt ctgctggagg aatacaaaaa 360
ttacctagat gctgcaaaca tgtccatgag ggtccggcgc cactctgacc ctgcccgccg 420
aggggagctg agcgtgtgtg acagtattag tgagtgggta acggcggcag acaaaaagac 480
tgcagtggac atgtcgggcg ggacggtcac agtccttgaa aaggtccctg tatcaaaagg 540
ccaactgaag caatacttct acgagaccaa gtgcaatccc atgggttaca caaaagaagg 600
ctgcaggggc atagacaaaa ggcattggaa ctcccagtgc cgaactaccc agtcgtacgt 660
gcgggccctt accatggata gcaagaagag aattggctgg cgattcataa ggatagacac 720
ttcttgtgta tgtacattga ccattaaaag gggaagaggc ggtggtggaa gtggaggcgg 780
tgggtcggga ggaggtggca gcggtggagg cggatcaggc ggtggtggca gtccagcacc 840
tgaactcctg ggaggtccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat 900
gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga 960
ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg 1020
ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga 1080
ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat 1140
cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc 1200
cccatcccgg gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt 1260
ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa 1320
gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt 1380
ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc acgaggctct 1440
gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaaggtg gcggagggtc 1500
tggaggaggc ggtagcggcg gaggaggttc cgggggcggt ggaagcggag gcggtggatc 1560
cgaggtgcaa ctagtgcagt ctggagcaga ggtgaaaaag cccggggagt ctctgaagat 1620
ttcctgtaag ggttctggat acagctttat gaactactgg ctgggatggg tgcgccagat 1680
gcccgggaaa ggcctggagt ggatggggga catctacccc ggcggagact accctacata 1740
cagcgagaag ttcaaggtcc aggtcaccat ctcagccgac aagtccatca gcaccgccta 1800
cctgcagttg agcagcctga aggcctcgga caccgccatg tattactgtg cgagatcagg 1860
caattacgac gaagtggcct actggggcca aggaaccctg gtcaccgtct cctcagctag 1920
caccaagggc ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac 1980
agcggccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa 2040
ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact 2100
ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat 2160
ctgcaacgtg aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agccgaagag 2220
ctgtgataag acgcatacgt aataagcggc cgc 2253
<210> 74
<211> 723
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence of the fusion protein of the Fab heavy chain
of humanized anti-hTfR antibody 3N and pro-hBDNF, further
introduced with Fc region of human IgG
<400> 74
Ala Pro Met Lys Glu Ala Asn Ile Arg Gly Gln Gly Gly Leu Ala Tyr
1 5 10 15
Pro Gly Val Arg Thr His Gly Thr Leu Glu Ser Val Asn Gly Pro Lys
20 25 30
Ala Gly Ser Arg Gly Leu Thr Ser Leu Ala Asp Thr Phe Glu His Val
35 40 45
Ile Glu Glu Leu Leu Asp Glu Asp Gln Lys Val Arg Pro Asn Glu Glu
50 55 60
Asn Asn Lys Asp Ala Asp Leu Tyr Thr Ser Arg Val Met Leu Ser Ser
65 70 75 80
Gln Val Pro Leu Glu Pro Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Glu Tyr Lys
85 90 95
Asn Tyr Leu Asp Ala Ala Asn Met Ser Met Arg Val Arg Arg His Ser
100 105 110
Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile Ser Glu
115 120 125
Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln Leu Lys
145 150 155 160
Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu
165 170 175
Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gln Cys Arg Thr
180 185 190
Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile
195 200 205
Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr
210 215 220
Ile Lys Arg Gly Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
225 230 235 240
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala
245 250 255
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
260 265 270
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
275 280 285
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
290 295 300
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
305 310 315 320
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
325 330 335
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
340 345 350
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
355 360 365
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
370 375 380
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
385 390 395 400
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
405 410 415
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
420 425 430
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
435 440 445
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
450 455 460
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
465 470 475 480
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
485 490 495
Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly
500 505 510
Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn
515 520 525
Tyr Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
530 535 540
Met Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys
545 550 555 560
Phe Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala
565 570 575
Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr
580 585 590
Cys Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
595 600 605
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
610 615 620
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
625 630 635 640
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
645 650 655
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
660 665 670
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
675 680 685
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
690 695 700
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
705 710 715 720
Thr His Thr
<210> 75
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence of an exemplified Fc region of human IgG
<400> 75
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
1 5 10 15
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
20 25 30
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
35 40 45
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
50 55 60
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
65 70 75 80
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
85 90 95
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
100 105 110
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
115 120 125
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
130 135 140
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
145 150 155 160
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
165 170 175
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
180 185 190
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
195 200 205
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 76
<211> 1418
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Nucleotide seuquence encoding the amino acid sequence of the
heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3N (IgG4),
synthetic sequence
<400> 76
acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60
ggagtgcaca gcgaggtgca actagtgcag tctggagcag aggtgaaaaa gcccggggag 120
tctctgaaga tttcctgtaa gggttctgga tacagcttta tgaactactg gctgggatgg 180
gtgcgccaga tgcccgggaa aggcctggag tggatggggg acatctaccc cggcggagac 240
taccctacat acagcgagaa gttcaaggtc caggtcacca tctcagccga caagtccatc 300
agcaccgcct acctgcagtt gagcagcctg aaggcctcgg acaccgccat gtattactgt 360
gcgagatcag gcaattacga cgaagtggcc tactggggcc aaggaaccct ggtcaccgtc 420
tcctcagcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg cgccctgctc caggagcacc 480
tccgagagca cagccgccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 540
gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 600
tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacg 660
aagacctaca cctgcaacgt agatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 720
gagtccaaat atggtccccc atgcccacca tgcccagcac ctgagttcct ggggggtcca 780
tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag gacactctca tgatctcccg gacccctgag 840
gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 900
gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc 960
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 1020
tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa 1080
gccaaagggc agccccgaga gccacaggtg tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg 1140
accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 1200
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1260
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aggctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320
gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacacag 1380
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaataa gcggccgc 1418
<210> 77
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence of the Fab heavy chain of humanized
anti-hTfR antibody No. 3
<400> 77
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr
225
<210> 78
<211> 1526
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Nucleotide seuquence encoding the amino acid sequence of the
fusion protein of the Fab heavy chain of humanized anti-hTfR
antibody 3 and pro-hBDNF, synthetic sequence
<400> 78
acgcgtgccg ccaccatgac catccttttc cttactatgg ttatttcata ctttggttgc 60
atgaaggctg cccccatgaa agaagcaaac atccgaggac aaggtggctt ggcctaccca 120
ggtgtgcgga cccatgggac tctggagagc gtgaatgggc ccaaggcagg ttcaagaggc 180
ttgacatcat tggctgacac tttcgaacac gtgatagaag agctgttgga tgaggaccag 240
aaagttcggc ccaatgaaga aaacaataag gacgcagact tgtacacgtc cagggtgatg 300
ctcagtagtc aagtgccttt ggagcctcct cttctctttc tgctggagga atacaaaaat 360
tacctagatg ctgcaaacat gtccatgagg gtccggcgcc actctgaccc tgcccgccga 420
ggggagctga gcgtgtgtga cagtattagt gagtgggtaa cggcggcaga caaaaagact 480
gcagtggaca tgtcgggcgg gacggtcaca gtccttgaaa aggtccctgt atcaaaaggc 540
caactgaagc aatacttcta cgagaccaag tgcaatccca tgggttacac aaaagaaggc 600
tgcaggggca tagacaaaag gcattggaac tcccagtgcc gaactaccca gtcgtacgtg 660
cgggccctta ccatggatag caagaagaga attggctggc gattcataag gatagacact 720
tcttgtgtat gtacattgac cattaaaagg ggaagaggat ctggtggcgg agggtctgga 780
ggtggcggat caggcggagg aggttccggg ggcggtggaa gcggaggcgg tggaagtgag 840
gtgcaactag tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaagatttcc 900
tgtaagggtt ctggatacag ctttaccaac tactggctgg gatgggtgcg ccagatgccc 960
gggaaaggcc tggagtggat gggggacatc taccccggcg gagactaccc tacatacagc 1020
gagaagttca aggtccaggt caccatctca gccgacaagt ccatcagcac cgcctacctg 1080
cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag atcaggcaat 1140
tacgacgaag tggcctactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc agctagcacc 1200
aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 1260
gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 1320
ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 1380
tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 1440
aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 1500
gacaaaactc acacgtaagc ggccgc 1526
<210> 79
<211> 482
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence of the fusion protein of the Fab heavy chain
of humanized anti-hTfR antibody 3 and pro-hBDNF
<400> 79
Ala Pro Met Lys Glu Ala Asn Ile Arg Gly Gln Gly Gly Leu Ala Tyr
1 5 10 15
Pro Gly Val Arg Thr His Gly Thr Leu Glu Ser Val Asn Gly Pro Lys
20 25 30
Ala Gly Ser Arg Gly Leu Thr Ser Leu Ala Asp Thr Phe Glu His Val
35 40 45
Ile Glu Glu Leu Leu Asp Glu Asp Gln Lys Val Arg Pro Asn Glu Glu
50 55 60
Asn Asn Lys Asp Ala Asp Leu Tyr Thr Ser Arg Val Met Leu Ser Ser
65 70 75 80
Gln Val Pro Leu Glu Pro Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Glu Tyr Lys
85 90 95
Asn Tyr Leu Asp Ala Ala Asn Met Ser Met Arg Val Arg Arg His Ser
100 105 110
Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile Ser Glu
115 120 125
Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln Leu Lys
145 150 155 160
Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu
165 170 175
Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gln Cys Arg Thr
180 185 190
Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile
195 200 205
Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr
210 215 220
Ile Lys Arg Gly Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
260 265 270
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr
275 280 285
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
290 295 300
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe
305 310 315 320
Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
325 330 335
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
340 345 350
Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
355 360 365
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
370 375 380
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
385 390 395 400
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
405 410 415
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
420 425 430
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
435 440 445
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
450 455 460
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
465 470 475 480
His Thr
<210> 80
<211> 372
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence of the fusion protein of the Fab heavy chain
of humanized anti-hTfR antibody 3 and hBDNF
<400> 80
His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile
1 5 10 15
Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser
20 25 30
Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln
35 40 45
Leu Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr
50 55 60
Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gln Cys
65 70 75 80
Arg Thr Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys
85 90 95
Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr
100 105 110
Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro
145 150 155 160
Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr
165 170 175
Asn Tyr Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu
180 185 190
Trp Met Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu
195 200 205
Lys Phe Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr
210 215 220
Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln
245 250 255
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
260 265 270
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
275 280 285
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
290 295 300
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
305 310 315 320
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
325 330 335
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
340 345 350
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
355 360 365
Lys Thr His Thr
370
<210> 81
<211> 469
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence of the Fab heavy chain of humanized anti-hTfR
antibody 3N , further introduced with Fc region of human IgG
<400> 81
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
1 5 10 15
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
20 25 30
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
35 40 45
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
50 55 60
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
65 70 75 80
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
85 90 95
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
100 105 110
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
115 120 125
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
130 135 140
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
145 150 155 160
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
165 170 175
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
180 185 190
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
195 200 205
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
245 250 255
Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe
260 265 270
Met Asn Tyr Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu
275 280 285
Glu Trp Met Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser
290 295 300
Glu Lys Phe Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser
305 310 315 320
Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met
325 330 335
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly
340 345 350
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
355 360 365
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
370 375 380
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
385 390 395 400
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
405 410 415
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
420 425 430
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
435 440 445
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
450 455 460
Asp Lys Thr His Thr
465
<210> 82
<211> 1491
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Nucleotide seuquence encoding the amino acid sequence of the Fab
heavy chain of humanized anti-hTfR antibody 3N , further
introduced with Fc region of human IgG
<400> 82
acgcgtcgcc accatgggtt ggagcctcat cttgctcttc cttgtcgctg ttgctacgcg 60
agtcggcagc ccagcacctg aactcctggg aggtccgtca gtcttcctct tccccccaaa 120
acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt 180
gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa 240
tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct 300
caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa 360
agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc 420
acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgac 480
ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca 540
gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct 600
ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc 660
cgtgatgcac gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg 720
taaaggtggc ggagggtctg gaggaggcgg tagcggcgga ggaggttccg ggggcggtgg 780
aagcggaggc ggtggatccg aggtgcaact agtgcagtct ggagcagagg tgaaaaagcc 840
cggggagtct ctgaagattt cctgtaaggg ttctggatac agctttatga actactggct 900
gggatgggtg cgccagatgc ccgggaaagg cctggagtgg atgggggaca tctaccccgg 960
cggagactac cctacataca gcgagaagtt caaggtccag gtcaccatct cagccgacaa 1020
gtccatcagc accgcctacc tgcagttgag cagcctgaag gcctcggaca ccgccatgta 1080
ttactgtgcg agatcaggca attacgacga agtggcctac tggggccaag gaaccctggt 1140
caccgtctcc tcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa 1200
gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc 1260
ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt 1320
cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt 1380
gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa 1440
gaaagttgag ccgaagagct gtgataagac gcatacgtaa taagcggccg c 1491
<210> 83
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence of framework region 3 in the heavy chain of
humanized anti-hTfR antibody No. 3
<400> 83
Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 84
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence of the Fab heavy chain of humanized anti-hTfR
antibody No. 3N (2)
<400> 84
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
210 215
<210> 85
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence of albumin binding domain
<400> 85
Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Leu Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asp Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu
20 25 30
Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 86
<211> 1674
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Nucleotide seuquence encoding the amino acid sequence of the
fusion protein of the Fab heavy chain of humanized anti-hTfR
antibody 3N, pro-hBDNF, and ABD, synthetic sequence
<400> 86
acgcgtcgcc accatgggtt ggagcctcat cttgctcttc cttgtcgctg ttgctacgcg 60
agtcggcagc gcccccatga aagaagcaaa catccgagga caaggtggct tggcctaccc 120
aggtgtgcgg acccatggga ctctggagag cgtgaatggg cccaaggcag gttcaagagg 180
cttgacatca ttggctgaca ctttcgaaca cgtgatagaa gagctgttgg atgaggacca 240
gaaagttcgg cccaatgaag aaaacaataa ggacgcagac ttgtacacgt ccagggtgat 300
gctcagtagt caagtgcctt tggagcctcc tcttctcttt ctgctggagg aatacaaaaa 360
ttacctagat gctgcaaaca tgtccatgag ggtccggcgc cactctgacc ctgcccgccg 420
aggggagctg agcgtgtgtg acagtattag tgagtgggta acggcggcag acaaaaagac 480
tgcagtggac atgtcgggcg ggacggtcac agtccttgaa aaggtccctg tatcaaaagg 540
ccaactgaag caatacttct acgagaccaa gtgcaatccc atgggttaca caaaagaagg 600
ctgcaggggc atagacaaaa ggcattggaa ctcccagtgc cgaactaccc agtcgtacgt 660
gcgggccctt accatggata gcaagaagag aattggctgg cgattcataa ggatagacac 720
ttcttgtgta tgtacattga ccattaaaag gggaagaggt ggcggagggt ctggaggtgg 780
cggatcaggc ggaggaggtt ccgggggcgg tggaagcgga ggcggtggat ccgaggtgca 840
actagtgcag tctggagcag aggtgaaaaa gcccggggag tctctgaaga tttcctgtaa 900
gggttctgga tacagcttta tgaactactg gctgggatgg gtgcgccaga tgcccgggaa 960
aggcctggag tggatggggg acatctaccc cggcggagac taccctacat acagcgagaa 1020
gttcaaggtc caggtcacca tctcagccga caagtccatc agcaccgcct acctgcagtt 1080
gagcagcctg aaggcctcgg acaccgccat gtattactgt gcgagatcag gcaattacga 1140
cgaagtggcc tactggggcc aaggaaccct ggtcaccgtc tcctcagcta gcaccaaggg 1200
cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca cagcggccct 1260
gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc 1320
cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct 1380
cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca tctgcaacgt 1440
gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt ggaggtggcg gatcaggcgg 1500
aggaggttcc gggggcggtg gaagcctggc tgaggccaag gtgctggccc tgagggagct 1560
ggacaagtac ggcgtgtccg actactacaa ggacctgatc gacaaggcca agaccgtgga 1620
gggcgtgaag gccctgatcg acgagatcct ggccgccctg ccctaagcgg ccgc 1674
<210> 87
<211> 531
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence of the fusion protein of the Fab heavy chain
of humanized anti-hTfR antibody 3N, pro-hBDNF, and ABD
<400> 87
Ala Pro Met Lys Glu Ala Asn Ile Arg Gly Gln Gly Gly Leu Ala Tyr
1 5 10 15
Pro Gly Val Arg Thr His Gly Thr Leu Glu Ser Val Asn Gly Pro Lys
20 25 30
Ala Gly Ser Arg Gly Leu Thr Ser Leu Ala Asp Thr Phe Glu His Val
35 40 45
Ile Glu Glu Leu Leu Asp Glu Asp Gln Lys Val Arg Pro Asn Glu Glu
50 55 60
Asn Asn Lys Asp Ala Asp Leu Tyr Thr Ser Arg Val Met Leu Ser Ser
65 70 75 80
Gln Val Pro Leu Glu Pro Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Glu Tyr Lys
85 90 95
Asn Tyr Leu Asp Ala Ala Asn Met Ser Met Arg Val Arg Arg His Ser
100 105 110
Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile Ser Glu
115 120 125
Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln Leu Lys
145 150 155 160
Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu
165 170 175
Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gln Cys Arg Thr
180 185 190
Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile
195 200 205
Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr
210 215 220
Ile Lys Arg Gly Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
225 230 235 240
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val
245 250 255
Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu
260 265 270
Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr Trp Leu
275 280 285
Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Asp
290 295 300
Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe Lys Val
305 310 315 320
Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln
325 330 335
Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg
340 345 350
Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
355 360 365
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
370 375 380
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
385 390 395 400
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
405 410 415
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
420 425 430
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
435 440 445
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
450 455 460
Lys Val Asp Lys Lys Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
465 470 475 480
Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Leu Arg Glu
485 490 495
Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asp Leu Ile Asp Lys
500 505 510
Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala
515 520 525
Ala Leu Pro
530
<210> 88
<211> 421
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence of the fusion protein of the Fab heavy chain
of humanized anti-hTfR antibody 3N, hBDNF, and ABD
<400> 88
His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile
1 5 10 15
Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser
20 25 30
Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln
35 40 45
Leu Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr
50 55 60
Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gln Cys
65 70 75 80
Arg Thr Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys
85 90 95
Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr
100 105 110
Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
145 150 155 160
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr
165 170 175
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
180 185 190
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe
195 200 205
Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
210 215 220
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
225 230 235 240
Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
245 250 255
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
260 265 270
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
275 280 285
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
290 295 300
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
305 310 315 320
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
325 330 335
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
340 345 350
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
355 360 365
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Leu
370 375 380
Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asp Leu Ile
385 390 395 400
Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile
405 410 415
Leu Ala Ala Leu Pro
420
<210> 89
<211> 277
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence of the Fab heavy chain of humanized anti-hTfR
antibody 3N introduced with ABD
<400> 89
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Leu
225 230 235 240
Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asp Leu Ile
245 250 255
Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile
260 265 270
Leu Ala Ala Leu Pro
275
<210> 90
<211> 477
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Amino acid sequence of single-chain humanized anti-hTfR antibody
No. 3N (2)
<400> 90
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr
260 265 270
Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val
275 280 285
His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly
290 295 300
Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly
305 310 315 320
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
325 330 335
Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser
340 345 350
Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
355 360 365
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
370 375 380
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
385 390 395 400
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
405 410 415
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
420 425 430
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
435 440 445
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
450 455 460
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
465 470 475

Claims (64)

1.一种融合蛋白，其为脑源性神经营养因子BDNF与抗人转铁蛋白受体抗体的融合蛋白，其中，
在该抗体的重链的可变区中，
(a)CDR1由序列号67的氨基酸序列构成，
(b)CDR2由序列号14的氨基酸序列构成，并且
(c)CDR3由序列号16的氨基酸序列构成，
在该抗体的轻链的可变区中，
(a)CDR1由序列号7的氨基酸序列构成，
(b)CDR2由序列号9的氨基酸序列构成，并且
(c)CDR3由序列号10的氨基酸序列构成。
2.根据权利要求1的融合蛋白，其中，重链的框架区3含有序列号68的氨基酸序列。
3.根据权利要求2的融合蛋白，其中，该重链的可变区含有序列号69的氨基酸序列。
4.根据权利要求3的融合蛋白，其中，该重链的氨基酸序列含有序列号70或序列号72的氨基酸序列。
5.根据权利要求1～4中任一项的融合蛋白，其中，该抗体的轻链的可变区含有序列号17、序列号18、序列号19、序列号20、序列号21或序列号22的氨基酸序列。
6.根据权利要求1～4中任一项的融合蛋白，其中，该抗体的轻链含有序列号23、序列号25、序列号27或序列号29的氨基酸序列。
7.根据权利要求1～4中任一项的融合蛋白，其中，该抗体为Fab抗体、F(ab’)2抗体或F(ab’)抗体。
8.根据权利要求1～4中任一项的融合蛋白，其中，该抗体为选自由scFab、scF(ab’)、scF(ab’)2和scFv组成的组中的单链抗体。
9.根据权利要求8的融合蛋白，其中，该抗体的轻链和重链通过接头序列而结合。
10.根据权利要求9的融合蛋白，其中，在该轻链的C末端侧通过接头序列结合该重链。
11.根据权利要求9的融合蛋白，其中，在该重链的C末端侧通过接头序列结合该轻链。
12.根据权利要求9～11中任一项的融合蛋白，其中，该接头序列由8～50个氨基酸残基构成。
13.根据权利要求12的融合蛋白，其中，该接头序列选自由氨基酸序列Gly-Ser、氨基酸序列Gly-Gly-Ser、氨基酸序列Gly-Gly-Gly、序列号3、序列号4和序列号5的各氨基酸序列、相当于3个序列号3的氨基酸序列连接而成的氨基酸序列的氨基酸序列、以及10个以下的这些氨基酸序列连接而成的序列组成的组。
14.根据权利要求1～4、9～11和13中任一项的融合蛋白，其中，该BDNF结合于该抗体的轻链或重链的C末端侧或N末端侧。
15.根据权利要求14的融合蛋白，其中，该BDNF直接或通过接头结合于该抗体的轻链或重链的C末端侧或N末端侧。
16.根据权利要求15的融合蛋白，其中，该接头为由1～50个氨基酸残基构成的肽。
17.根据权利要求16的融合蛋白，其中，该接头为含有选自由氨基酸序列Gly-Ser、氨基酸序列Gly-Gly-Ser、序列号3、序列号4、以及序列号5组成的组的氨基酸序列的肽。
18.根据权利要求1～4、9～11、13和15～17中任一项的融合蛋白，其中，该BDNF为人BDNF。
19.根据权利要求18的融合蛋白，其中，该人BDNF含有序列号51的氨基酸序列，或者该人BDNF具有与序列号51所示的蛋白质同一性质的功能。
20.根据权利要求1～4、9～11、13、15～17和19中任一项的融合蛋白，其对于人转铁蛋白受体的胞外区和猴转铁蛋白受体的胞外区这两者具有亲和性。
21.根据权利要求20的融合蛋白，其中，该抗人转铁蛋白受体抗体与人转铁蛋白受体的胞外区的解离常数为1×10-10M以下，与猴转铁蛋白受体的胞外区的解离常数为1×10-9M以下。
22.根据权利要求18的融合蛋白，其中
该轻链含有序列号23的氨基酸序列，并且
(a)该重链在其C末端侧通过由氨基酸序列Gly-Ser构成的接头与人BDNF结合，由此形成有序列号52的氨基酸序列，或者
(b)该重链在其C末端侧通过如下接头与人BDNF结合，由此形成有序列号54的氨基酸序列，该接头为由继氨基酸序列Gly-Ser之后连接5个氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列号3)而成的共计27个氨基酸构成的接头。
23.根据权利要求1～4、9～11、13、15～17、19、21和22中任一项的融合蛋白，其中，该抗体为抗原结合性片段。
24.根据权利要求23的融合蛋白，其为在该抗原结合性片段的N末端侧直接或通过接头结合人BDNF而成的融合蛋白。
25.根据权利要求23的融合蛋白，其中，该抗原结合性片段为单链抗体。
26.根据权利要求25的融合蛋白，其通过接头序列将该抗体的轻链可变区与重链可变区结合而成。
27.根据权利要求26的融合蛋白，其为在该轻链可变区的C末端侧通过该接头序列结合该重链可变区而成的融合蛋白。
28.根据权利要求26的融合蛋白，其为在该重链可变区的C末端侧通过该接头序列结合该轻链可变区而成的融合蛋白。
29.根据权利要求26～28中任一项的融合蛋白，其中，该接头序列由8～50个氨基酸残基构成。
30.根据权利要求29的融合蛋白，其中，该接头序列选自由氨基酸序列Gly-Ser、氨基酸序列Gly-Gly-Ser、氨基酸序列Gly-Gly-Gly、序列号3、序列号4和序列号5的各氨基酸序列、相当于3个序列号3的氨基酸序列连接而成的氨基酸序列的氨基酸序列、以及10个以下的这些氨基酸序列接连而成的序列组成的组。
31.根据权利要求25～28和30中任一项的融合蛋白，其中，该抗体包含具有序列号69的氨基酸序列的重链可变区、以及具有序列号18的氨基酸序列的轻链可变区。
32.根据权利要求31的融合蛋白，其中，该抗体由序列号57的氨基酸序列构成，该融合蛋白通过在该抗体的N末端侧直接或通过接头结合人BDNF而成。
33.根据权利要求32的融合蛋白，其中，该抗体由序列号57的氨基酸序列构成，该融合蛋白通过在该抗体的N末端侧通过接头结合人BDNF前体而成、且包含序列号59的氨基酸序列。
34.根据权利要求32的融合蛋白，其中，该抗体由序列号57的氨基酸序列构成，该融合蛋白通过在该抗体的N末端侧通过接头结合人BDNF而成、且包含序列号60的氨基酸序列。
35.根据权利要求23的融合蛋白，其中，该抗原结合性片段为Fab、F(ab')2、或F(ab')中的任意一者。
36.根据权利要求35的融合蛋白，其在Fab、F(ab')2、或F(ab')中的任意一者的轻链或重链的N末端侧直接或通过接头结合人BDNF而成。
37.根据权利要求36的融合蛋白，其中，该抗体的轻链由序列号23的氨基酸序列构成，且该抗体的重链为由序列号61的氨基酸序列构成的Fab重链，在该重链的N末端侧直接或通过接头结合人BDNF。
38.根据权利要求37的融合蛋白，其中，该接头为包含选自由氨基酸序列Gly-Ser、氨基酸序列Gly-Gly-Ser、序列号3的氨基酸序列、序列号4的氨基酸序列、以及序列号5的氨基酸序列组成的组中的氨基酸序列的肽。
39.根据权利要求37的融合蛋白，其中，
该轻链含有序列号23的氨基酸序列，且
由该Fab重链与在其N末端侧通过接头结合的人BDNF前体构成的部分形成有序列号63的氨基酸序列。
40.根据权利要求37的融合蛋白，其中，
该轻链含有序列号23的氨基酸序列，且
于由Fab重链与在其N末端侧通过接头结合的人BDNF构成的部分形成有序列号65的氨基酸序列。
41.根据权利要求23的融合蛋白，其中，人IgG Fc区或其一部分被导入至人BDNF与该抗体之间。
42.根据权利要求41的融合蛋白，其中，在人BDNF的C末端侧直接或通过接头序列结合人IgG Fc区，而且，在该人IgG Fc区的C末端侧直接或通过接头序列结合该抗体。
43.根据权利要求41或42的融合蛋白，其中，人IgG Fc区含有序列号75所示的氨基酸序列。
44.根据权利要求43的融合蛋白，其中，
该重链在人BDNF的C末端侧直接或通过接头序列结合该人IgG Fc区，并且在该人IgGFc区的C末端侧直接或通过接头序列结合该重链。
45.根据权利要求44的融合蛋白，其中，
该轻链含有序列号23的氨基酸序列，并且
该重链在人BDNF的C末端侧通过接头序列结合人IgG Fc区，并且在该人IgG Fc区的C末端侧通过接头序列结合该重链，由此形成有序列号74的氨基酸序列。
46.根据权利要求23的融合蛋白，其中，进一步导入有白蛋白亲和性肽。
47.根据权利要求46的融合蛋白，其中，在该抗体的C末端侧直接或通过接头序列而结合有白蛋白亲和性肽。
48.根据权利要求46或47的融合蛋白，其中，白蛋白亲和性肽包含序列号85所示的氨基酸序列。
49.根据权利要求48的融合蛋白，其中，
该重链直接或通过接头序列结合于人BDNF的C末端侧，并且在该重链的C末端侧直接或通过接头序列结合有白蛋白亲和性肽。
50.根据权利要求49的融合蛋白，其中，
该轻链含有序列号23的氨基酸序列，并且
该重链通过接头序列结合于人BDNF前体的C末端侧，并且在该重链的C末端侧通过接头序列结合有白蛋白亲和性肽，由此形成有序列号87的氨基酸序列。
51.根据权利要求49的融合蛋白，其中，
该轻链含有序列号23的氨基酸序列，并且
该重链通过接头序列结合于人BDNF的C末端侧，并且在该重链的C末端侧通过接头序列结合有白蛋白亲和性肽，由此形成有序列号88的氨基酸序列。
52.一种DNA片段，其编码权利要求1～51中任一项的融合蛋白。
53.一种表达载体，其整合有权利要求52的DNA片段。
54.一种哺乳动物细胞，其用权利要求53的表达载体进行了转化。
55.一种药剂，其为用于预防和/或治疗能通过暴露于BDNF而受益的神经系统的疾病或障碍的药剂，其含有权利要求1～51中任一项的融合蛋白作为有效成分。
56.根据权利要求55的药剂，其中，该神经系统的疾病或障碍为神经退行性疾病、抑郁症、精神分裂症、癫痫、自闭症、Rett综合征、West综合征、新生儿惊厥、痴呆伴发问题行为、焦虑症、疼痛、赫希施普龙病或快速眼动睡眠行为障碍。
57.根据权利要求56的药剂，其中，该神经退行性疾病为脑神经退行性疾病、脊髓退行性疾病、视网膜退行性疾病或周围神经退行性疾病。
58.根据权利要求57的药剂，其中，该脑神经退行性疾病为脑神经系统的神经退行性疾病、脑缺血性疾病、创伤性脑损伤、白质脑病或多发性硬化症。
59.根据权利要求58的药剂，其中，该脑神经系统的神经退行性疾病为阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈症、路易体痴呆、匹克氏病、多系统萎缩症、进行性上行性麻痹或唐氏综合征。
60.权利要求1～51中任一项的融合蛋白在制造用于预防和/或治疗能通过暴露于BDNF而受益的神经系统的疾病或障碍的药物中的应用。
61.根据权利要求60的应用，其中，该神经系统的疾病或障碍为神经退行性疾病、抑郁症、精神分裂症、癫痫、自闭症、Rett综合征、West综合征、新生儿惊厥、痴呆伴发问题行为、焦虑症、疼痛、赫希施普龙病或快速眼动睡眠行为障碍。
62.根据权利要求61的应用，其中，该神经退行性疾病为脑神经退行性疾病、脊髓退行性疾病、视网膜退行性疾病或周围神经退行性疾病。
63.根据权利要求62的应用，其中，该脑神经退行性疾病为脑神经系统的神经退行性疾病、脑缺血性疾病、创伤性脑损伤、白质脑病或多发性硬化症。
64.根据权利要求63的应用，其中，该脑神经系统的神经退行性疾病为阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈症、路易体痴呆、匹克氏病、多系统萎缩症、进行性上行性麻痹或唐氏综合征。
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