KR20190097217A - Bdnf를 포함하는 융합 단백질 - Google Patents

Bdnf를 포함하는 융합 단백질 Download PDF

Info

Publication number
KR20190097217A
KR20190097217A KR1020197021119A KR20197021119A KR20190097217A KR 20190097217 A KR20190097217 A KR 20190097217A KR 1020197021119 A KR1020197021119 A KR 1020197021119A KR 20197021119 A KR20197021119 A KR 20197021119A KR 20190097217 A KR20190097217 A KR 20190097217A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
amino acid
acid sequence
seq
antibody
fusion protein
Prior art date
Application number
KR1020197021119A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102573622B1 (ko
Inventor
히로유키 소노다
겐이치 다카하시
Original Assignee
제이씨알 파마 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 제이씨알 파마 가부시키가이샤 filed Critical 제이씨알 파마 가부시키가이샤
Publication of KR20190097217A publication Critical patent/KR20190097217A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102573622B1 publication Critical patent/KR102573622B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/01—Hydrolysed proteins; Derivatives thereof
    • A61K38/012—Hydrolysed proteins; Derivatives thereof from animals
    • A61K38/017—Hydrolysed proteins; Derivatives thereof from animals from blood
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/185—Nerve growth factor [NGF]; Brain derived neurotrophic factor [BDNF]; Ciliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins, e.g. NT-3
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/22—Anxiolytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2881—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD71
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)

Abstract

본 발명은, BDNF와 항인간 트랜스페린 수용체 항체의 융합 단백질로서, 해당 항체가 중쇄의 가변 영역에 있어서, (a) CDR1이 서열 번호 66 또는 서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, (b) CDR2가 서열 번호 13 또는 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한 (c) CDR3이 서열 번호 15 또는 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질을 제공한다.

Description

BDNF를 포함하는 융합 단백질
본 발명은, 혈액뇌관문의 통과를 가능하게 한 BDNF에 관한 것이고, 보다 상세하게는 신규한 항인간 트랜스페린 수용체 항체와 BDNF의 융합 단백질, 그의 제조법 및 그의 사용법에 관한 것이다.
뇌실 주위 기관(송과체, 뇌하수체, 최후야 등)을 포함하는 몇 개의 영역을 제외하고 뇌의 대부분의 조직에 혈액을 공급하는 모세혈관은, 근육 등 그 외의 조직에 존재하는 모세혈관과 달리, 그 내피를 형성하고 있는 내피 세포끼리가 강고한 세포간 접합에 의해 서로 밀착하고 있다. 그 때문에, 혈액으로부터 뇌로의 물질의 수동 수송이 방해되어, 예외는 있지만, 지용성이 높은 물질, 또는 분자량이 작고(200∼500돌턴 이하) 또한 생리 pH 부근에 있어서 전기적으로 중성인 물질 이외, 모세혈관으로부터 뇌로 이행하기 어렵다. 이와 같은, 뇌내의 모세혈관 내피를 개재시킨, 혈액과 뇌의 조직액 사이에서의 물질 교환을 제한하는 기구는, 혈액뇌관문(Blood-BrainBarrier, BBB)으로 불리고 있다. 또한, 혈액뇌관문은, 뇌뿐만 아니라, 뇌 및 척수를 포함하는 중추 신경계의 조직액과 혈액 사이의 물질 교환도 제한하고 있다.
혈액뇌관문의 존재에 의해, 중추 신경계의 세포의 대부분은, 혈중의 호르몬, 림포카인 등의 물질의 농도의 변동 등의 영향을 받지 않고, 그 생화학적인 항상성이 유지된다.
그렇지만, 혈액뇌관문의 존재는, 약제 개발에 있어서 문제를 제기한다. 예를 들어, 뇌유래 신경 영양 인자(BDNF; Brain-derived neurotrophic factor)는, 뉴로트로핀 패밀리의 하나이며, 그 2량체가 표적 세포 표면 상에 있는 고친화성 BDNF 수용체(TrkB; Tyrosine receptor kinase B, Tropomyosin receptor kinase B, 또는 Tropomyosin-related Kinase B라고도 불린다)에 특이적으로 결합하여, 중추 및 말초신경계의 세포의 분화, 기능 유지, 시냅스 형성, 및 손상 시의 재생 및 수복 등에 중요한 역할을 함이 알려져 있다(비특허문헌 1 및 2). 이러하므로, BDNF는 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 등의 신경 변성 질환, 근위축성 측책경화증 등의 척수 변성 질환, 이 외, 당뇨병성 신경 장애, 뇌허혈성 질환, Rett 증후군 등의 발달 장애, 통합 실조증, 울병 등, 다양한 질환의 치료제로서의 개발이 기대되고 있다.(비특허문헌 3∼8). 그렇지만 고분자 단백질은 일반적으로 혈액뇌관문을 극히 통과하기 어렵기 때문에, BDNF 자신을 중추 신경계의 질환 치료약 또는 중추 신경계에 작용하는 질환 치료약으로서 말초 투여에 의해 이용하기에는 큰 장벽이 있었다.
중추 신경계에 있어서 작용시켜야 할 그와 같은 단백질 등의 고분자 물질에 혈액뇌관문을 통과시키기 위한 방법이, 여러 가지 개발되고 있다. 예를 들어, 신경 성장 인자의 경우, 이것을 내포시킨 리포솜을 뇌내 모세혈관의 내피 세포의 세포막과 융합시키는 것에 의해, 혈액뇌관문을 통과시키는 방법이 시도되고 있지만, 실용화에 이르지 않았다(비특허문헌 9). α-L-이두로니다제의 경우, 1회당에 투여되는 효소의 양을 증가시켜 그 혈중 농도를 높이는 것에 의해, 혈액뇌관문에 있어서의 효소의 수동 수송을 높이는 시도가 행해지고, 헐러 증후군의 동물 모델을 이용하여, 이 수법에 의해 중추 신경계(CNS)의 이상이 완해됨이 나타나고 있다(비특허문헌 10).
또한, 혈액뇌관문을 회피하여, 고분자 물질을 수강내 또는 뇌내에 직접 투여하는 시도도 행해지고 있다. 예를 들어, 헐러 증후군(뮤코다당증 I형)의 환자의 수강 내에 인간 α-L-이두로니다제를 투여하는 방법(특허문헌 1), 니만-픽병의 환자의 뇌실 내에 인간 산 스핑고미엘리나제를 투여하는 방법(특허문헌 2), 헌터 증후군의 모델 동물의 뇌실 내에 이두론산 2-설파타제(I2S)를 투여하는 방법(특허문헌 3)이 보고되어 있다. 이와 같은 수법에 의하면, 확실히 중추 신경계에 약제를 작용시킬 수 있다고 생각되는 한편, 침습성이 극도로 높다고 하는 문제가 있다.
혈액뇌관문을 통과하여 고분자 물질을 뇌내에 도달시키는 방법으로서, 뇌내 모세혈관의 내피 세포 상에 존재하는 막단백질과의 친화성을 가지도록 고분자 물질을 수식하는 방법이 여러 가지 보고되어 있다. 뇌내 모세혈관의 내피 세포 상에 존재하는 막단백질로서는, 인슐린, 트랜스페린, 인슐린양(樣) 성장 인자(IGF-I, IGF-II), LDL, 렙틴 등의 화합물에 대한 수용체를 들 수 있다.
예를 들어, 신경 성장 인자(NGF)를 인슐린과의 융합 단백질의 형태로 합성하고, 인슐린 수용체와의 결합을 개재시켜 이 융합 단백질에 혈액뇌관문을 통과시키는 기술이 보고되어 있다(특허문헌 4∼6). 또한, 신경 성장 인자(NGF)를 항인슐린 수용체 항체와의 융합 단백질의 형태로 합성하고, 인슐린 수용체와의 결합을 개재시켜 이 융합 단백질에 혈액뇌관문을 통과시키는 기술이 보고되어 있다(특허문헌 4 및 7).
뇌유래 신경 영양 인자(BDNF)를 항인슐린 수용체 항체와의 융합 단백질의 형태로 합성하고, 이 융합 단백질을 인슐린 수용체와의 결합을 개재시켜 혈액뇌관문을 통과시키는 기술이 보고되어 있다(비특허문헌 11). 신경 성장 인자(NGF)를 트랜스페린과의 융합 단백질의 형태로 합성하고, 트랜스페린 수용체(TfR)와의 결합을 개재시켜 이 융합 단백질에 혈액뇌관문을 통과시키는 기술이 보고되어 있다(특허문헌 8). 또한, 신경 성장 인자(NGF)를 항트랜스페린 수용체 항체(항TfR 항체)와의 융합 단백질의 형태로 합성하고, TfR과의 결합을 개재시켜 이 융합 단백질에 혈액뇌관문을 통과시키는 기술이 보고되어 있다(특허문헌 4 및 9). 또한, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 부가한 뇌유래 신경 영양 인자(BDNF)를 마우스 항래트 트랜스페린 수용체 항체(항TfR 항체)와 스트렙트아비딘-비오틴 링커를 개재시켜 화학적으로 결합한 컨주게이트의 형태로 합성하고, 래트에 있어서, 이 컨주게이트를 TfR과의 결합을 개재시켜 혈액뇌관문을 통과시키는 기술이 보고되어 있다(비특허문헌 12).
항TfR 항체를 이용한 기술에 대해 더 보면, 항TfR 항체와 결합시키는 것에 의해 약제에 혈액뇌관문을 통과시키는 기술에 있어서, 스트렙트아비딘을 이용했을 경우는 1본쇄 항체를 사용할 수 있음이 보고되어 있다(비특허문헌 13). 또한, 인간 TfR(hTfR)과의 해리 상수가 비교적 큰 항hTfR 항체(저친화성 항hTfR 항체)가, 약제로 하여금 혈액뇌관문을 통과시키는 기술에 있어서 적합하게 이용할 수 있음이 보고되어 있다(특허문헌 10 및 11, 비특허문헌 14). 더욱이, hTfR과의 친화성이 pH 의존적으로 변화하는 항TfR 항체가, 약제에 혈액뇌관문을 통과시키기 위한 캐리어로서 사용할 수 있음이 보고되어 있다(특허문헌 12, 비특허문헌 15).
일본 특허공표 2007-504166호 공보 일본 특허공표 2009-525963호 공보 일본 특허공개 2012-62312호 공보 미국 특허 5154924호 공보 일본 특허공개 2011-144178호 공보 미국 특허 2004/0101904호 공보 일본 특허공표 2006-511516호 공보 일본 특허공개 H06-228199호 공보 미국 특허 5977307호 공보 WO2012/075037 WO2013/177062 WO2012/143379
Moses V. Chao. Nature Reviews Neuroscience. 4. 299-309 (2003) Tabakman R. Progress in Brain Research. 146. 387-401 (2004) Bollen E. Behavioural Brain Research. 257C. 8-12 (2013) Altar C. Anthony. Journal of Neurochemistry. 63. 1021-32 (1994) Zuccato C. Progress in Neurobiology. 81. 294-330 (2007) Dafang Wu. The Journal of the American Society for Experimental Neurotherapeutics. 2. 120-8 (2005) David M. Katz. The Handbook of Experimental Pharmacology. 220. 481-95 (2014) E. Castren. The Handbook of Experimental Pharmacology. 220. 461-79 (2014) Xie Y. J Control Release. 105. 106-19 (2005) Ou L. Mol Genet Metab. 111. 116-22 (2014) Ruben J. B. Biotechnology Bioengineering, 97. 1376-1386 (2007) Dafang W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96. 254-259 (1999) Li J Y. Protein Engineering. 12. 787-96 (1999) Bien-Ly N. J Exp Med. 211. 233-44 (2014) Sada H. PLoS ONE. 9. E96340 (2014)
상기 배경하에서, 본 발명의 목적은, 혈중에 투여한 BDNF가 뇌내에서 작용할 수 있도록, 혈액뇌관문을 통과 가능하게 한 것인, 신규한 항TfR 항체와 BDNF의 융합 단백질, 그의 제조 방법, 사용 방법, 및 당해 융합 단백질을 투여하는 것에 의한, 소정 범위의 질환의 예방 및/또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 위한 연구에 있어서, 본 발명자들은, 예의 검토를 거듭한 결과, 본 명세서에 있어서 상술하는 항체 제작법에 의해 얻어지는, hTfR의 세포외 영역을 인식하는 항인간 트랜스페린 수용체 항체(항hTfR 항체) 중에서 어느 특정한 것, 특히, 중쇄의 CDR1이 서열 번호 66 또는 서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것이, 더욱이, 그것에 더하여 중쇄의 프레임워크 영역 3이 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것이, 혈중에 투여했을 때 현저하게 효율 좋게 혈액뇌관문을 통과함을 발견하고, 게다가 당해 항체와 BDNF를 융합시킨 것도 혈액뇌관문을 통과함도 발견하여, 본 발명을 완성했다. 즉, 본 발명은 이하를 제공한다.
1. 뇌유래 신경 영양 인자(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)와 항인간 트랜스페린 수용체 항체의 융합 단백질로서, 해당 항체가 중쇄의 가변 영역에 있어서,
(a) CDR1이 서열 번호 66 또는 서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고,
(b) CDR2가 서열 번호 13 또는 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한
(c) CDR3이 서열 번호 15 또는 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인,
융합 단백질.
2. 상기 1의 융합 단백질로서, 중쇄의 프레임워크 영역 3이 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
3. 상기 1 또는 2의 융합 단백질로서, 단, 해당 중쇄의 가변 영역에 있어서,
CDR2의 서열 번호 13 또는 서열 번호 14의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한
CDR3의 서열 번호 15 또는 서열 번호 16의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인,
융합 단백질.
4. 상기 1 또는 2의 융합 단백질로서, 단, 해당 중쇄의 가변 영역에 있어서,
CDR2의 서열 번호 13 또는 서열 번호 14의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한
CDR3의 서열 번호 15 또는 서열 번호 16의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인,
융합 단백질.
5. 상기 1 또는 2의 융합 단백질로서, 단, 해당 중쇄의 가변 영역에 있어서,
(a) CDR1에 대해서는 서열 번호 66 또는 서열 번호 67,
(b) CDR2에 대해서는 서열 번호 13 또는 서열 번호 14,
(c) CDR3에 대해서는 서열 번호 15 또는 서열 번호 16, 및
(d) 프레임워크 영역 3에 대해서는 서열 번호 68
중 적어도 1개의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 1∼5개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것이고,
여기서, CDR1에 대해서는, 서열 번호 66 또는 서열 번호 67의 아미노산 서열의 N말단측으로부터 5번째에 위치하는 메티오닌이, 개변 후의 아미노산 서열에 있어서도 동일한 위치에 있고, 또한
프레임워크 영역 3에 대해서는, 서열 번호 68의 N말단측으로부터 17번째에 위치하는 류신이, 개변 후의 아미노산 서열에 있어서도 동일한 위치에 있는 것인,
융합 단백질.
6. 상기 1 또는 2의 융합 단백질로서, 단, 해당 중쇄의 가변 영역에 있어서,
(a) CDR1에 대해서는 서열 번호 66 또는 서열 번호 67,
(b) CDR2에 대해서는 서열 번호 13 또는 서열 번호 14,
(c) CDR3에 대해서는 서열 번호 15 또는 서열 번호 16, 및
(d) 프레임워크 영역 3에 대해서는 서열 번호 68
중 적어도 1개의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 1∼3개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것이고,
여기서, CDR1에 대해서는, 서열 번호 66 또는 서열 번호 67의 아미노산 서열의 N말단측으로부터 5번째에 위치하는 메티오닌이, 개변 후의 아미노산 서열에 있어서도 동일한 위치에 있고, 또한 프레임워크 영역 3에 대해서는, 서열 번호 68의 N말단측으로부터 17번째에 위치하는 류신이, 개변 후의 아미노산 서열에 있어서도 동일한 위치에 있는 것인, 융합 단백질.
7. 상기 2의 융합 단백질로서, 해당 중쇄의 가변 영역이 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 상기 1의 융합 단백질.
8. 상기 7의 융합 단백질로서, 단, 해당 중쇄의 가변 영역 중, CDR1의 서열 번호 66 또는 서열 번호 67 및 프레임워크 영역 3의 서열 번호 68의 각 아미노산 서열 이외의 부분에 있어서, 해당 부분 대신에 해당 부분과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
9. 상기 7의 융합 단백질로서, 단, 해당 중쇄의 가변 영역 중, CDR1의 서열 번호 66 또는 서열 번호 67 및 프레임워크 영역 3의 서열 번호 68의 각 아미노산 서열 이외의 부분에 있어서, 해당 부분 대신에 해당 부분과 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
10. 상기 7의 융합 단백질로서, 단, 해당 중쇄의 가변 영역을 구성하는 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 1∼5개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것이고,
여기서, CDR1에 대해서는, 서열 번호 67의 아미노산 서열의 N말단으로부터 5번째에 위치하는 메티오닌이, 개변 후의 아미노산 서열에 있어서도 동일한 위치에 있고, 또한 프레임워크 영역 3에 대해서는, 서열 번호 68의 N말단측으로부터 17번째에 위치하는 류신이, 개변 후의 아미노산 서열에 있어서도 동일한 위치에 있는 것인, 융합 단백질.
11. 상기 7의 융합 단백질로서, 단, 해당 중쇄의 가변 영역을 구성하는 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 1∼3개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것이고,
여기서, CDR1에 대해서는, 서열 번호 67의 아미노산 서열의 N말단으로부터 5번째에 위치하는 메티오닌이, 개변 후의 아미노산 서열에 있어서도 동일한 위치에 있고, 또한 프레임워크 영역 3에 대해서는, 서열 번호 68의 N말단측으로부터 17번째에 위치하는 류신이, 개변 후의 아미노산 서열에 있어서도 동일한 위치에 있는 것인, 융합 단백질.
12. 상기 7의 융합 단백질로서, 해당 중쇄의 아미노산 서열이, 서열 번호 70 또는 서열 번호 72의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
13. 상기 12의 융합 단백질로서, 단, 해당 중쇄 중, CDR1의 서열 번호 66 또는 서열 번호 67 및 프레임워크 영역 3의 서열 번호 68의 각 아미노산 서열 이외의 부분 대신에 해당 부분에 대해 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
14. 상기 12의 융합 단백질로서, 단, 해당 중쇄 중, CDR1의 서열 번호 66 또는 서열 번호 67 및 프레임워크 영역 3의 서열 번호 68의 각 아미노산 서열 이외의 부분 대신에 당해 부분에 대해 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
15. 상기 12의 융합 단백질로서, 단, 해당 중쇄를 구성하는 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 1∼5개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것이고,
여기서, CDR1에 대해서는, 서열 번호 67의 아미노산 서열의 N말단으로부터 5번째에 위치하는 메티오닌이, 개변 후의 아미노산 서열에 있어서도 동일한 위치에 있고, 또한 프레임워크 영역 3에 대해서는, 서열 번호 68의 N말단측으로부터 17번째에 위치하는 류신이, 개변 후의 아미노산 서열에 있어서도 동일한 위치에 있는 것인, 융합 단백질.
16. 상기 12의 융합 단백질로서, 단, 해당 중쇄를 구성하는 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 1∼3개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것이고,
여기서, CDR1에 대해서는, 서열 번호 67의 아미노산 서열의 N말단으로부터 5번째에 위치하는 메티오닌이, 개변 후의 아미노산 서열에 있어서도 동일한 위치에 있고, 또한 프레임워크 영역 3에 대해서는, 서열 번호 68의 N말단측으로부터 17번째에 위치하는 류신이, 개변 후의 아미노산 서열에 있어서도 동일한 위치에 있는 것인, 융합 단백질.
17. 상기 1∼16 중 어느 하나의 융합 단백질로서, 해당 항체의 경쇄의 가변 영역에 있어서,
(a) CDR1이 서열 번호 6 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고,
(b) CDR2가 서열 번호 8 혹은 서열 번호 9의 아미노산 서열, 또는 아미노산 서열 Lys-Val-Ser을 포함하여 이루어지고, 또한
(c) CDR3이 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인,
융합 단백질.
18. 상기 17의 융합 단백질로서, 단, 해당 경쇄의 가변 영역에 있어서,
(a) CDR1의 서열 번호 6 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고,
(b) CDR2의 서열 번호 8 혹은 서열 번호 9의 아미노산 서열, 또는 아미노산 서열 Lys-Val-Ser 대신에 이것에 대해 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한
(c) CDR3의 서열 번호 10의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인,
융합 단백질.
19. 상기 17의 융합 단백질로서, 단, 해당 경쇄의 가변 영역에 있어서,
(a) CDR1의 서열 번호 6 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고,
(b) CDR2의 서열 번호 8 혹은 서열 번호 9의 아미노산 서열, 또는 아미노산 서열 Lys-Val-Ser 대신에 이것에 대해 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한
(c) CDR3의 서열 번호 10의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인,
융합 단백질.
20. 상기 17의 융합 단백질로서, 단, 해당 경쇄의 가변 영역에 있어서,
(a) CDR1에 대해서는 서열 번호 6 또는 서열 번호 7,
(b) CDR2에 대해서는 서열 번호 8 혹은 서열 번호 9, 또는 아미노산 서열 Lys-Val-Ser, 및
(c) CDR3에 대해서는 서열 번호 10
중 적어도 1개의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 1∼5개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
21. 상기 17의 융합 단백질로서, 단, 해당 경쇄의 가변 영역에 있어서,
(a) CDR1에 대해서는 서열 번호 6 또는 서열 번호 7,
(b) CDR2에 대해서는 서열 번호 8 혹은 서열 번호 9, 또는 아미노산 서열 Lys-Val-Ser, 및
(c) CDR3에 대해서는 서열 번호 10
중 적어도 1개의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 1∼3개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
22. 상기 1∼16 중 어느 하나의 융합 단백질로서, 해당 항체의 경쇄의 가변 영역이, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21 또는 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
23. 상기 22의 융합 단백질로서, 단, 해당 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
24. 상기 22의 융합 단백질로서, 단, 해당 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
25. 상기 22의 융합 단백질로서, 단, 해당 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 1∼5개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
26. 상기 22의 융합 단백질로서, 단, 해당 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 1∼3개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
27. 상기 1∼16 중 어느 하나의 융합 단백질로서, 해당 항체의 경쇄가, 서열 번호 23, 서열 번호 25, 서열 번호 27 또는 서열 번호 29의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
28. 상기 27의 융합 단백질로서, 단, 해당 경쇄의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
29. 상기 27의 융합 단백질로서, 단, 해당 경쇄의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
30. 상기 27의 융합 단백질로서, 단, 해당 경쇄의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 1∼5개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
31. 상기 27의 융합 단백질로서, 단, 해당 경쇄의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 1∼3개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
32. 상기 1∼31 중 어느 하나의 융합 단백질로서, 해당 항체가, Fab 항체, F(ab')2 항체, 또는 F(ab') 항체인, 융합 단백질.
33. 상기 1∼31 중 어느 하나의 융합 단백질로서, 해당 항체가, scFab, scF(ab'), scF(ab')2 및 scFv로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1본쇄 항체인, 융합 단백질.
34. 상기 33의 융합 단백질로서, 해당 항체의 경쇄와 중쇄가 링커 서열을 개재시켜 결합하고 있는 것인, 융합 단백질.
35. 상기 34의 융합 단백질로서, 해당 경쇄의 C말단측에 있어서, 링커 서열을 개재시켜 해당 중쇄가 결합하고 있는 것인, 융합 단백질.
36. 상기 34의 융합 단백질로서, 해당 중쇄의 C말단측에 있어서, 링커 서열을 개재시켜 해당 경쇄가 결합하고 있는 것인, 융합 단백질.
37. 상기 34∼36 중 어느 하나의 융합 단백질로서, 해당 링커 서열이, 8∼50개의 아미노산 잔기로 이루어지는 것인, 융합 단백질.
38. 상기 37의 융합 단백질로서, 해당 링커 서열이, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 및 서열 번호 5의 각 아미노산 서열, 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3개가 연속한 것에 상당하는 아미노산 서열, 및 이들 아미노산 서열의 10개 이하가 연속하여 이루어지는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 융합 단백질.
39. 상기 1∼38 중 어느 하나의 융합 단백질로서, 해당 BDNF가, 해당 항체의 경쇄 또는 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에 결합한 것인, 융합 단백질.
40. 상기 39의 융합 단백질로서, 해당 BDNF가, 해당 항체의 경쇄 또는 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에, 직접 또는 링커를 개재시켜 결합한 것인, 융합 단백질.
41. 해당 링커가, 1∼50개의 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드인, 상기 40의 융합 단백질.
42. 해당 링커가, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 및 서열 번호 5로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 펩티드인, 상기 41의 융합 단백질.
43. 해당 BDNF가 인간 BDNF인, 상기 1∼42 중 어느 하나의 융합 단백질.
44. 해당 인간 BDNF가, 서열 번호 51의 아미노산 서열 또는 이것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것이거나, 또는 서열 번호 51로 표시되는 단백질과 동질의 기능을 갖는 것인, 상기 43의 융합 단백질.
45. 상기 1∼44 중 어느 하나의 융합 단백질로서, 인간 트랜스페린 수용체의 세포외 영역 및 원숭이 트랜스페린 수용체의 세포외 영역의 쌍방에 대해서 친화성을 갖는 것인, 융합 단백질.
46. 상기 45의 융합 단백질로서, 해당 항트랜스페린 수용체 항체가, 인간 트랜스페린 수용체의 세포외 영역과의 해리 상수가 1×10-10M 이하이고, 원숭이 트랜스페린 수용체의 세포외 영역과의 해리 상수가 1×10-9M 이하인 것인, 융합 단백질.
47. 상기 43의 융합 단백질로서,
해당 경쇄가, 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한
(a) 해당 중쇄가, 그 C말단측에서 아미노산 서열 Gly-Ser로 이루어지는 링커를 개재시켜, 인간 BDNF와 결합하고, 그것에 의해 서열 번호 52의 아미노산 서열을 형성하고 있는 것이거나, 또는
(b) 해당 중쇄가, 그 C말단측에서 아미노산 서열 Gly-Ser에 이어 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 3)가 5개 연속하여 이루어지는 합계 27개의 아미노산 서열로 이루어지는 링커를 개재시켜, 인간 BDNF와 결합하고, 그것에 의해 서열 번호 54의 아미노산 서열을 형성하고 있는 것인,
융합 단백질.
48. 해당 항체가 항원 결합성 단편인, 상기 1∼31 중 어느 1항의 융합 단백질.
49. 해당 항원 결합성 단편의 N말단측에, 직접 또는 링커를 개재시켜, 인간 BDNF가 결합하여 이루어지는 것인, 상기 48의 융합 단백질.
50. 해당 항원 결합성 단편이 1본쇄 항체인, 상기 48 또는 49의 융합 단백질.
51. 상기 50의 융합 단백질로서, 해당 항체의 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역이 링커 서열을 개재시켜 결합하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
52. 상기 51의 융합 단백질로서, 해당 경쇄 가변 영역의 C말단측에, 해당 링커 서열을 개재시켜, 해당 중쇄 가변 영역이 결합하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
53. 상기 51의 융합 단백질로서, 해당 중쇄 가변 영역의 C말단측에, 해당 링커 서열을 개재시켜, 해당 경쇄 가변 영역이 결합하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
54. 상기 51∼53 중 어느 하나의 융합 단백질로서, 해당 링커 서열이, 8∼50개의 아미노산 잔기로 이루어지는 것인, 융합 단백질.
55. 상기 54의 융합 단백질로서, 해당 링커 서열이, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 및 서열 번호 5의 각 아미노산 서열, 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3개가 연속한 것에 상당하는 아미노산 서열, 및 이들 아미노산 서열의 10개 이하가 연속하여 이루어지는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 융합 단백질.
56. 상기 50∼55 중 어느 하나의 융합 단백질로서, 해당 항체가, 서열 번호 69의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역과, 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
57. 상기 56의 융합 단백질로서, 해당 항체가, 서열 번호 57의 아미노산 서열로 이루어지고, 그 N말단측에, 직접 또는 링커를 개재시켜, 인간 BDNF가 결합하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
58. 상기 57의 융합 단백질로서, 해당 항체가 서열 번호 57의 아미노산 서열로 이루어지고, 그 N말단측에, 링커를 개재시켜, 인간 프로BDNF가 결합하여 이루어지는, 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
59. 상기 57의 융합 단백질로서, 해당 항체가 서열 번호 57의 아미노산 서열로 이루어지고, 그 N말단측에, 링커를 개재시켜, 인간 BDNF가 결합하여 이루어지는, 서열 번호 60의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
60. 해당 항원 결합성 단편이, Fab, F(ab')2, 또는 F(ab')의 어느 하나인, 상기 48 또는 49의 융합 단백질.
61. 상기 60의 융합 단백질로서, Fab, F(ab')2, 또는 F(ab')의 어느 하나의 경쇄 또는 중쇄의 N말단측에, 직접 또는 링커를 개재시켜, 인간 BDNF가 결합하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
62. 상기 61의 융합 단백질로서, 해당 항체의 경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 해당 항체의 중쇄가 서열 번호 61의 아미노산 서열로 이루어지는 Fab 중쇄이며, 해당 중쇄의 N말단측에, 직접 또는 링커를 개재시켜 인간 BDNF가 결합하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
63. 상기 62의 융합 단백질로서, 해당 링커가, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 서열 번호 3의 아미노산 서열, 서열 번호 4의 아미노산 서열, 및 서열 번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 펩티드인, 융합 단백질.
64. 상기 62의 융합 단백질로서,
해당 경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한
해당 Fab 중쇄와 그 N말단측에, 직접 또는 링커를 개재시켜, 결합한 인간 프로BDNF로 이루어지는 부분이 서열 번호 63의 아미노산 서열을 형성하고 있는 것인, 융합 단백질.
65. 상기 62의 융합 단백질로서,
해당 경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한
Fab 중쇄와 그 N말단측에, 직접 또는 링커를 개재시켜, 결합한 인간 BDNF로 이루어지는 부분이 서열 번호 65의 아미노산 서열을 형성하고 있는 것인, 융합 단백질.
66. 상기 48∼62 중 어느 하나의 융합 단백질로서, 인간 IgG Fc 영역 또는 그 일부가, 인간 BDNF와 해당 항체의 사이에 도입되어 이루어지는 것인, 융합 단백질.
67. 상기 66의 융합 단백질로서, 인간 BDNF의 C말단측에, 직접 또는 링커 서열을 개재시켜, 인간 IgG Fc 영역이 결합하여 이루어지고, 또한, 해당 인간 IgG Fc 영역의 C말단측에 직접 또는 링커 서열을 개재시켜 해당 항체가 결합하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
68. 상기 66 또는 67의 융합 단백질로서, 인간 IgG Fc 영역이 서열 번호 75로 나타나는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
69. 상기 68의 융합 단백질로서,
해당 중쇄가, 인간 BDNF의 C말단측에, 직접 또는 링커 서열을 개재시켜, 해당 인간 IgG Fc 영역이 결합하여 이루어지고, 또한, 해당 인간 IgG Fc 영역의 C말단측에 직접 또는 링커 서열을 개재시켜 해당 중쇄가 결합한 것인, 융합 단백질.
70. 상기 69의 융합 단백질로서,
해당 경쇄가, 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한
해당 중쇄가, 인간 BDNF의 C말단측에, 링커 서열을 개재시켜, 인간 IgG Fc 영역이 결합하여 이루어지고, 또한, 해당 인간 IgG Fc 영역의 C말단측에 링커 서열을 개재시켜 해당 중쇄가 결합한 것이고, 그것에 의해 서열 번호 74의 아미노산 서열을 형성하고 있는 것인, 융합 단백질.
71. 상기 48∼62 중 어느 하나의 융합 단백질로서, 추가로 알부민 친화성 펩티드가 도입되어 이루어지는 것인, 융합 단백질.
72. 상기 71의 융합 단백질로서, 해당 항체의 C말단측에, 직접 또는 링커 서열을 개재시켜, 알부민 친화성 펩티드가 결합하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
73. 상기 71 또는 72의 융합 단백질로서, 알부민 친화성 펩티드가 서열 번호 85로 나타나는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
74. 상기 73의 융합 단백질로서,
해당 중쇄가, 인간 BDNF의 C말단측에, 직접 또는 링커 서열을 개재시켜 결합하여 이루어지고, 또한, 해당 중쇄의 C말단측에 직접 또는 링커 서열을 개재시켜 알부민 친화성 펩티드가 결합한 것인, 융합 단백질.
75. 상기 74의 융합 단백질로서,
해당 경쇄가, 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한
해당 중쇄가, 인간 프로BDNF의 C말단측에, 직접 또는 링커 서열을 개재시켜 결합하여 이루어지고, 또한, 해당 중쇄의 C말단측에 직접 또는 링커 서열을 개재시켜 알부민 친화성 펩티드가 결합한 것이고, 그것에 의해 서열 번호 87의 아미노산 서열을 형성하고 있는 것인, 융합 단백질.
76. 상기 74의 융합 단백질로서,
해당 경쇄가, 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한
해당 중쇄가, 인간 BDNF의 C말단측에, 직접 또는 링커 서열을 개재시켜 결합하여 이루어지고, 또한, 해당 중쇄의 C말단측에 직접 또는 링커 서열을 개재시켜 알부민 친화성 펩티드가 결합한 것이고, 그것에 의해 서열 번호 88의 아미노산 서열을 형성하고 있는 것인, 융합 단백질.
77. 상기 1∼76 중 어느 하나의 융합 단백질을 코딩하는, DNA 단편.
78. 상기 77의 DNA 단편을 짜넣어 이루어지는, 발현 벡터.
79. 상기 78의 발현 벡터로 형질 전환된 포유동물 세포.
80. BDNF에 대한 폭로에 의해 이익을 얻을 수 있는 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 약제로서, 상기 1∼76 중 어느 하나의 융합 단백질을 유효 성분으로서 포함하여 이루어지는, 약제.
81. 해당 질환 또는 장애가, 신경계의 질환 또는 장애인 상기 80의 약제.
82. 해당 신경계의 질환 또는 장애가, 신경 변성 질환, 울병, 통합 실조증, 간질, 자폐증, Rett 증후군, West 증후군, 신생아 경련, 인지증에 수반하는 문제 행동, 불안증, 동통, 히르슈스프룽병 또는 렘수면 행동 장애인, 상기 81의 약제.
83. 해당 신경 변성 질환이, 뇌신경 변성 질환, 척수 변성 질환, 망막 변성 질환 또는 말초 신경 변성 질환인, 상기 82의 약제.
84. 해당 뇌신경 변성 질환이, 뇌신경계의 신경 변성 질환, 뇌허혈성 질환, 외상성 뇌손상, 백질뇌증 또는 다발성 경화증인, 상기 83의 약제.
85. 해당 뇌신경계의 신경 변성 질환이, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 레비소체형 인지증, 픽병, 다계통 위축증, 진행성 상행성 마비 또는 다운 증후군인, 상기 84의 약제.
86. BDNF에 대한 폭로에 의해 이익을 얻을 수 있는 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료를 위한, 상기 1∼76 중 어느 하나의 융합 단백질의 사용.
87. BDNF에 대한 폭로에 의해 이익을 얻을 수 있는 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료용의 의약의 제조를 위한, 상기 1∼76 중 어느 하나의 융합 단백질의 사용.
88. BDNF에 대한 폭로에 의해 이익을 얻을 수 있는 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료의 방법으로서, 해당 질환 또는 상해를 갖는 환자의 혈중에, 상기 1∼76 중 어느 하나의 융합 단백질의 치료상 유효량을 함유하는 의약 조성물을 투여하는 것을 포함하는 것인, 방법.
본 발명은, 혈액뇌관문을 통과할 수 없는 것인 뇌유래 신경 영양 인자(BDNF)에 대해, 이것을 특정한 항hTfR 항체와의 융합 단백질의 형태로 하는 것에 의해, 혈액뇌관문을 통과 가능하게 한다. 따라서, BDNF를, 그와 같은 융합 단백질의 형태로 정맥 주사 등에 의해 혈중에 투여하는 것에 의해 중추 신경계에 작용시키는 것을 가능하게 한다.
도 1은 항hTfR 항체를 단회 정맥내 투여한 후의, 필리핀원숭이의 대뇌피질의, 항hTfR 항체에 대한 면역 조직화학 염색의 결과를 나타내는 도면 대용 사진. (a) 항hTfR 항체를 비투여, (b) 항hTfR 항체 번호 3을 투여. 각 사진의 우하의 바는 50μm를 나타내는 게이지이다.
도 2는 항hTfR 항체를 단회 정맥내 투여한 후의, 필리핀원숭이의 해마의, 항hTfR 항체에 대한 면역 조직화학 염색의 결과를 나타내는 도면. (a) 항hTfR 항체를 비투여, (b) 항hTfR 항체 번호 3을 투여. 각 사진의 우하의 바는 50μm를 나타내는 게이지이다.
도 3은 항hTfR 항체를 단회 정맥내 투여한 후의, 필리핀원숭이의 소뇌의, 항hTfR 항체에 대한 면역 조직화학 염색의 결과를 나타내는 도면 대용 사진. (a) 항hTfR 항체를 비투여, (b) 항hTfR 항체 번호 3을 투여. 각 사진의 우하의 바는 50μm를 나타내는 게이지이다.
도 4는 단회 정맥내 투여한 후의, 필리핀원숭이의 뇌 이외의 각종 장기에의 인간화 항hTfR 항체의 축적량을 나타내는 도면. 세로축은, 각 장기의 습중량당의 인간화 항hTfR 항체의 양(μg/g 습중량)을 나타낸다. 백색 바는 왼쪽으로부터 순차로, 인간화 항hTfR 항체 번호 3, 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2, 인간화 항hTfR 항체 번호 3(IgG4), 및 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2(IgG4)를, 각각 투여, 흑색 바는, 트라스투주맙(허셉틴TM)을 투여한 원숭이의 각 장기에서의 축적량을 나타낸다. ND는 미측정을 의미한다.
도 5는 단회 정맥내 투여한 후의, 필리핀원숭이의 대뇌피질의, 인간화 항hTfR 항체에 대한 면역 조직화학 염색의 결과를 나타내는 도면 대용 사진. (a) 허셉틴을 투여, (b) 인간화 항hTfR 항체 번호 3을 투여, (c) 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2를 투여, (d) 인간화 항hTfR 항체 번호 3(IgG4)를 투여, (e) 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2(IgG4)를 투여. 각 사진의 우하의 바는 20μm를 나타내는 게이지이다.
도 6은 단회 정맥내 투여한 후의, 필리핀원숭이의 해마의, 인간화 항hTfR 항체에 대한 면역 조직화학 염색의 결과를 나타내는 도면. (a) 허셉틴을 투여, (b) 인간화 항hTfR 항체 번호 3을 투여, (c) 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2를 투여, (d) 인간화 항hTfR 항체 번호 3(IgG4)를 투여, (e) 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2(IgG4)를 투여. 각 사진의 우하의 바는 20μm를 나타내는 게이지이다.
도 7은 단회 정맥내 투여한 후의, 필리핀원숭이의 소뇌의 인간화 항hTfR 항체에 대한 면역 조직화학 염색의 결과를 나타내는 도면. (a) 허셉틴을 투여, (b) 인간화 항hTfR 항체 번호 3을 투여, (c) 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2를 투여, (d) 인간화 항hTfR 항체 번호 3(IgG4)를 투여, (e) 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2(IgG4)를 투여. 각 사진의 우하의 바는 20μm를 나타내는 게이지이다.
도 8은 단회 정맥내 투여한 후의, 필리핀원숭이의 연수의, 인간화 항hTfR 항체에 대한 면역 조직화학 염색의 결과를 나타내는 도면. (a) 허셉틴을 투여, (b) 인간화 항hTfR 항체 번호 3을 투여, (c) 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2를 투여, (d) 인간화 항hTfR 항체 번호 3(IgG4)를 투여, (e) 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2(IgG4)를 투여. 각 사진의 우하의 바는 20μm를 나타내는 게이지이다.
도 9는 BDNF-항hTfR 항체 융합 단백질을 단회 정맥내 투여한 후의, hTfR-KI 마우스의 뇌내 농도 추이를 나타내는 도면. 가로축은 투여 후의 시간(시간), 세로축은 뇌의 그램중량(습중량)당의 BDNF-항hTfR 항체 융합 단백질의 농도(nM, 2량체 환산)를 나타낸다.
도 10은 BDNF-항hTfR 항체 융합 단백질을 단회 정맥내 투여한 후의, 투여 후 3시간에 있어서의 필리핀원숭이의 뇌내의 각 부위에 있어서의 BDNF-항hTfR 항체 융합 단백질의 농도(nM, 2량체 환산)를 나타내는 도면.
도 11은 BDNF-항hTfR 항체 융합 단백질(hBDNF-항hTfR 항체(3N) ABD)을 단회 정맥내 투여한 후의, hTfR-KI 마우스의 뇌내 농도 추이를 나타내는 도면. 가로축은 투여 후의 시간(시간), 세로축은 뇌의 그램중량(습중량)당의 BDNF-항hTfR 항체 융합 단백질의 농도(nM, 2량체 환산)를 나타낸다.
본 발명에 있어서, 「항체」란 말은, 주로 인간 항체, 마우스 항체, 인간화 항체, 인간 항체와 다른 포유동물의 항체의 키메라 항체, 및 마우스 항체와 다른 포유동물의 항체의 키메라 항체의 어느 것인가를 말하지만, 특정한 항원에 특이적으로 결합하는 성질을 갖는 것인 한, 이들로 한정되는 것은 아니고, 또한, 항체의 동물종에도 특별히 제한은 없다. 단, 바람직한 것은, 인간화 항체이다.
본 발명에 있어서, 「인간 항체」란 말은, 그 단백질 전체가 인간 유래의 유전자로 코딩되어 있는 항체를 말한다. 단, 유전자의 발현 효율을 상승시키는 등의 목적으로, 원래의 인간의 유전자에, 원래의 아미노산 서열에 변화를 주지 않고서 변이를 가한 유전자로 코딩되는 항체도, 「인간 항체」에 포함된다. 또한, 인간 항체를 코딩하는 2개 이상의 유전자를 조합하여, 어느 인간 항체의 일부를 다른 인간 항체의 일부로 치환하여 제작한 항체도, 「인간 항체」이다. 인간 항체는, 면역글로불린 경쇄의 3개소의 상보성 결정 영역(CDR)과 면역글로불린 중쇄의 3개소의 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는다. 면역글로불린 경쇄의 3개소의 CDR은, N말단측에 있는 것부터 순차로 CDR1, CDR2 및 CDR3이라고 한다. 면역글로불린 중쇄의 3개소의 CDR도, N말단측에 있는 것부터 순차로 CDR1, CDR2 및 CDR3이라고 한다. 어느 인간 항체의 CDR을, 그 외의 인간 항체의 CDR로 치환하는 것에 의해, 인간 항체의 항원 특이성, 친화성 등을 개변한 항체도, 인간 항체에 포함된다.
본 발명에 있어서, 원래의 인간 항체의 유전자를 개변하는 것에 의해, 원래의 항체의 아미노산 서열에 치환, 결실, 부가 등의 변이를 가한 항체도, 「인간 항체」에 포함된다. 원래의 항체의 아미노산 서열 중의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하는 경우, 치환하는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼20개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개이다. 원래의 항체의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼20개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가한 항체도, 인간 항체이다. 아미노산을 부가하는 경우, 원래의 항체의 아미노산 서열 중 혹은 N말단 또는 C말단에, 바람직하게는 1∼20개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개의 아미노산을 부가한다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가한 항체도, 인간 항체이다. 변이를 가한 항체의 아미노산 서열은, 원래의 항체의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 나타내고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 바람직하게는, 95% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 보다 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 나타낸다. 즉, 본 발명에 있어서 「인간 유래의 유전자」라고 할 때는, 인간 유래의 원래의 유전자에 더하여, 이것에 개변을 가하는 것에 의해 얻어지는 유전자도 포함된다.
본 발명에 있어서, 「마우스 항체」라고 할 때는, 그 단백질 전체가 마우스 유래의 유전자로 코딩되는 항체를 말한다. 단, 유전자의 발현 효율을 상승시키는 등의 목적으로, 원래의 마우스의 유전자에, 원래의 아미노산 서열에 변화를 주지 않고서 변이를 가한 유전자로 코딩되는 항체도, 「마우스 항체」에 포함된다. 또한, 마우스 항체를 코딩하는 2개 이상의 유전자를 조합하여, 어느 마우스 항체의 일부를 다른 마우스 항체의 일부로 치환한 항체도, 마우스 항체에 포함된다. 마우스 항체는, 면역글로불린 경쇄의 3개소의 상보성 결정 영역(CDR)과 면역글로불린 중쇄의 3개소의 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는다. 면역글로불린 경쇄의 3개소의 CDR은, N말단측에 있는 것부터 순차로 CDR1, CDR2 및 CDR3이라고 한다. 면역글로불린 중쇄의 3개소의 CDR은, N말단측에 있는 것부터 순차로 CDR1, CDR2 및 CDR3이라고 한다. 예를 들어, 어느 마우스 항체의 CDR을, 다른 마우스 항체의 CDR로 치환하는 것에 의해, 마우스 항체의 항원 특이성, 친화성 등을 개변한 항체도, 마우스 항체에 포함된다.
본 발명에 있어서, 원래의 마우스 항체의 유전자를 개변하는 것에 의해, 원래의 항체의 아미노산 서열에 치환, 결실, 부가 등의 변이를 가한 항체도, 「마우스 항체」에 포함된다. 원래의 항체의 아미노산 서열 중의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하는 경우, 치환하는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼20개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개이다. 원래의 항체의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼20개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가한 항체도, 「마우스 항체」에 포함된다. 아미노산을 부가하는 경우, 원래의 항체의 아미노산 서열 중 혹은 N말단측 또는 C말단측에, 바람직하게는 1∼20개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개의 아미노산을 부가한다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가한 항체도, 「마우스 항체」에 포함된다. 변이를 가한 항체의 아미노산 서열은, 원래의 항체의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 나타내고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 바람직하게는, 95% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 보다 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 나타낸다. 즉, 본 발명에 있어서 「마우스 유래의 유전자」라고 할 때는, 마우스 유래의 원래의 유전자에 더하여, 이것에 개변을 가하는 것에 의해 얻어지는 유전자도 포함된다.
본 발명에 있어서, 「인간화 항체」란 말은, 가변 영역의 일부(예를 들어, 특히 CDR의 전부 또는 일부)의 아미노산 서열이 인간 이외의 포유동물 유래이며, 그 이외의 영역이 인간 유래인 항체를 말한다. 예를 들어, 인간화 항체로서 인간 항체를 구성하는 면역글로불린 경쇄의 3개소의 상보성 결정 영역(CDR)과 면역글로불린 중쇄의 3개소의 상보성 결정 영역(CDR)을, 다른 포유동물의 CDR로 치환하는 것에 의해 제작된 항체를 들 수 있다. 인간 항체의 적절한 위치에 이식되는 CDR의 유래가 되는 다른 포유동물의 생물종은, 인간 이외의 포유동물인 한 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는, 마우스, 래트, 토끼, 말, 또는 인간 이외의 영장류이고, 보다 바람직하게는 마우스 및 래트이며, 더욱 바람직하게는 마우스이다.
본 발명에 있어서, 「키메라 항체」란 말은, 2개 이상의 상이한 종에서 유래하는, 2개 이상의 상이한 항체의 단편이 연결되어 이루어지는 항체를 말한다.
인간 항체와 다른 포유동물의 항체의 키메라 항체란, 인간 항체의 일부가 인간 이외의 포유동물의 항체의 일부에 의해 치환된 항체이다. 항체는, 이하에 설명하는 Fc 영역, Fab 영역 및 힌지부로 이루어진다. 이와 같은 키메라 항체의 구체예로서, Fc 영역이 인간 항체에서 유래하는 한편으로 Fab 영역이 다른 포유동물의 항체에서 유래하는 키메라 항체를 들 수 있다. 힌지부는, 인간 항체 또는 다른 포유동물의 항체의 어느 것인가에서 유래한다. 반대로, Fc 영역이 다른 포유동물에서 유래하는 한편으로 Fab 영역이 인간 항체에서 유래하는 키메라 항체를 들 수 있다. 힌지부는, 인간 항체 또는 다른 포유동물의 항체의 어느 것인가에서 유래한다.
또한, 항체는, 가변 영역과 정상 영역으로 이루어진다고 할 수도 있다. 키메라 항체의 다른 구체예로서, 중쇄의 정상 영역(CH)과 경쇄의 정상 영역(CL)이 인간 항체에서 유래하는 한편으로, 중쇄의 가변 영역(VH) 및 경쇄의 가변 영역(VL)이 다른 포유동물의 항체에서 유래하는 것, 반대로, 중쇄의 정상 영역(CH)과 경쇄의 정상 영역(CL)이 다른 포유동물의 항체에서 유래하는 한편으로, 중쇄의 가변 영역(VH) 및 경쇄의 가변 영역(VL)이 인간 항체에서 유래하는 것도 들 수 있다. 여기에서, 다른 포유동물의 생물종은, 인간 이외의 포유동물인 한 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는, 마우스, 래트, 토끼, 말, 또는 인간 이외의 영장류이며, 예를 들어 마우스이다.
마우스 항체와 다른 포유동물의 항체의 키메라 항체란, 마우스 항체의 일부가 마우스 이외의 포유동물의 항체의 일부로 치환된 항체이다. 이와 같은 키메라 항체의 구체예로서, Fc 영역이 마우스 항체에서 유래하는 한편으로 Fab 영역이 다른 포유동물의 항체에서 유래하는 키메라 항체나, 반대로, Fc 영역이 다른 포유동물에서 유래하는 한편으로 Fab 영역이 마우스 항체에서 유래하는 키메라 항체를 들 수 있다. 여기에서, 다른 포유동물의 생물종은, 바람직하게는 인간이다.
인간 항체와 마우스 항체의 키메라 항체는, 특히, 「인간/마우스 키메라 항체」라고 한다. 인간/마우스 키메라 항체에는, Fc 영역이 인간 항체에서 유래하는 한편으로 Fab 영역이 마우스 항체에서 유래하는 키메라 항체나, 반대로, Fc 영역이 마우스 항체에서 유래하는 한편으로 Fab 영역이 인간 항체에서 유래하는 키메라 항체를 들 수 있다. 힌지부는, 인간 항체 또는 마우스 항체의 어느 것인가에서 유래한다. 인간/마우스 키메라 항체의 다른 구체예로서, 중쇄의 정상 영역(CH)과 경쇄의 정상 영역(CL)이 인간 항체에서 유래하는 한편으로, 중쇄의 가변 영역(VH) 및 경쇄의 가변 영역(VL)이 마우스 항체에서 유래하는 것, 반대로, 중쇄의 정상 영역(CH)과 경쇄의 정상 영역(CL)이 마우스 항체에서 유래하는 한편으로, 중쇄의 가변 영역(VH) 및 경쇄의 가변 영역(VL)이 인간 항체에서 유래하는 것도 들 수 있다.
항체는, 본래, 2개의 면역글로불린 경쇄와 2개의 면역글로불린 중쇄의 합계 4개의 폴리펩티드쇄로 이루어지는 기본 구조를 갖는다. 단, 본 발명에 있어서, 「항체」라고 할 때는, 이 기본 구조를 갖는 것에 더하여,
(1) 1개의 면역글로불린 경쇄와 1개의 면역글로불린 중쇄의 합계 2개의 폴리펩티드쇄로 이루어지는 것이나, 이하에 상술하듯이,
(2) 면역글로불린 경쇄의 C말단측에 링커 서열을, 그리고 추가로 그 C말단측에 면역글로불린 중쇄를 결합시켜 이루어지는 것인 1본쇄 항체, 및
(3) 면역글로불린 중쇄의 C말단측에 링커 서열을, 그리고 추가로 그 C말단측에 면역글로불린 경쇄를 결합시켜 이루어지는 것인 1본쇄 항체도 포함된다. 또한,
(4) 본래의 의미에서의 항체의 기본 구조로부터 Fc 영역이 결실된 것인 Fab 영역으로 이루어지는 것 및 Fab 영역과 힌지부의 전부 혹은 일부로 이루어지는 것(Fab, F(ab') 및 F(ab')2를 포함한다)도, 본 발명에 있어서의 「항체」에 포함된다.
여기에서 Fab란, 가변 영역과 CL영역(경쇄의 정상 영역)을 포함하는 경쇄와, 가변 영역과 CH1 영역(중쇄의 정상 영역의 부분 1)을 포함하는 중쇄가, 각각 존재하는 시스테인 잔기끼리로 다이설파이드 결합에 의해 결합한 분자를 말한다. Fab에 있어서, 중쇄는, 가변 영역과 CH1 영역(중쇄의 정상 영역의 부분 1)에 더하여, 추가로 힌지부의 일부를 포함해도 되지만, 이 경우의 힌지부는, 힌지부에 존재하여 항체의 중쇄끼리를 결합하는 시스테인 잔기를 결여하는 것이다. Fab에 있어서, 경쇄와 중쇄란, 경쇄의 정상 영역(CL영역)에 존재하는 시스테인 잔기와, 중쇄의 CH1 영역 또는 힌지부에 존재하는 시스테인 잔기의 사이에 형성되는 다이설파이드 결합에 의해 결합한다. Fab를 형성하는 중쇄를, 본 명세서에 있어서 「Fab 중쇄」라고 한다. Fab는, 힌지부에 존재하여 항체의 중쇄 끼리를 결합하는 시스테인 잔기를 결여하고 있고, 1개의 경쇄와 1개의 중쇄로 이루어진다. F(ab')에 있어서는, 그 중쇄는 가변 영역과 CH1 영역에 더하여, 중쇄끼리를 결합하는 시스테인 잔기를 포함하는 힌지부의 전부 또는 일부를 포함한다. F(ab')2는 2개의 F(ab')가 서로의 힌지부에 존재하는 시스테인 잔기끼리로 다이설파이드 결합에 의해 결합한 분자를 말한다. F(ab') 또는 F(ab')2를 형성하는 중쇄를, 본 명세서에 있어서 「Fab' 중쇄」라고 한다. 또한, 복수의 항체가 직접 또는 링커를 개재시켜 결합한 것인, 2량체, 3량체 등의 중합체도 항체이다. 더욱이, 이들에 한정하지 않고, 면역글로불린 분자의 일부를 포함하고, 또한, 항원에 특이적으로 결합하는 성질을 갖는 것은 어느 것도, 본 발명에서 말하는 「항체」에 포함된다. 즉, 본 발명에 있어서 면역글로불린 경쇄라고 할 때는, 면역글로불린 경쇄에서 유래하고, 그 가변 영역의 모두 또는 일부의 아미노산 서열을 갖는 것이 포함된다. 또한, 면역글로불린 중쇄라고 할 때는, 면역글로불린 중쇄에서 유래하고, 그 가변 영역의 모두 또는 일부의 아미노산 서열을 갖는 것이 포함된다. 따라서, 가변 영역의 모두 또는 일부의 아미노산 서열을 갖는 한, 예를 들어, Fc 영역이 결실된 것도, 면역글로불린 중쇄이다.
또한, 여기에서 Fc 또는 Fc 영역이란, 항체 분자 중의, CH2 영역(중쇄의 정상 영역의 부분 2), 및 CH3 영역(중쇄의 정상 영역의 부분 3)으로 이루어지는 단편을 포함하는 영역을 말한다. Fc 또는 Fc 영역은, CH2 영역과 CH3 영역에 더하여, 힌지부의 일부를 포함해도 된다.
더욱이, 본 발명에 있어서, 「항체」라고 할 때는,
(5) 상기 (4)에서 나타낸 Fab, F(ab') 또는 F(ab')2를 구성하는 경쇄와 중쇄를, 링커 서열을 개재시켜 결합시켜, 각각 1본쇄 항체로 한 scFab, scF(ab'), 및 scF(ab')2도 포함된다. 여기에서, scFab, scF(ab'), 및 scF(ab')2에 있어서는, 경쇄의 C말단측에 링커 서열을, 그리고 추가로 그 C말단측에 중쇄를 결합시켜 이루어지는 것이어도 되고, 또한, 중쇄의 C말단측에 링커 서열을, 그리고 추가로 그 C말단측에 경쇄를 결합시켜 이루어지는 것이어도 된다. 더욱이, 경쇄의 가변 영역과 중쇄의 가변 영역을 링커 서열을 개재시켜 결합시켜 1본쇄 항체로 한 scFv도, 본 발명에 있어서의 항체에 포함된다. scFv에 있어서는, 경쇄의 가변 영역의 C말단측에 링커 서열을, 그리고 추가로 그 C말단측에 중쇄의 가변 영역을 결합시켜 이루어지는 것이어도 되고, 또한, 중쇄의 가변 영역의 C말단측에 링커 서열을, 그리고 추가로 그 C말단측에 경쇄의 가변 영역을 결합시켜 이루어지는 것이어도 된다.
더욱이, 본 명세서에서 말하는 「항체」에는, 완전장 항체, 상기 (1)∼(3)에 나타나는 것에 더하여, 상기 (4) 및 (5)을 포함하는 개념인 완전장 항체의 일부가 결손하고 있는 항원 결합성 단편(항체 프래그먼트)의 어느 것의 형태도 포함된다.
「항원 결합성 단편」이라고 하는 용어는, 항원과의 특이적 결합 활성의 적어도 일부를 유지하고 있는 항체의 단편을 말한다. 결합성 단편의 예로서는, 예를 들어 상기 (4) 및 (5)에 나타나는 것에 더하여, 가변 영역(Fv), 중쇄 가변 영역(VH)과 경쇄 가변 영역(VL)을 적당한 링커로 연결시킨 1본쇄 항체(scFv), 중쇄 가변 영역(VH)과 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 폴리펩티드의 2량체인 다이아보디, scFv의 중쇄(H쇄)에 정상 영역의 일부(CH3)가 결합한 것의 2량체인 미니보디, 그 외의 저분자화 항체 등을 포함한다. 단, 항원과의 결합능을 갖고 있는 한 이들 분자로 한정되지 않는다. 또한, 이들 결합성 단편에는, 항체 단백질의 전장 분자를 적당한 효소로 처리한 것뿐만 아니라, 유전자 공학적으로 개변된 항체 유전자를 이용하여 적당한 숙주 세포에 있어서 산생된 단백질도 포함된다.
본 발명에 있어서, 「1본쇄 항체」라고 할 때는, 면역글로불린 경쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열의 C말단측에 링커 서열이 결합하고, 추가로 그 C말단측에 면역글로불린 중쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열이 결합하여 이루어지고, 특정한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질을 말한다. 예를 들어, 상기 (2), (3) 및 (5)에 나타나는 것은 1본쇄 항체에 포함된다. 또한, 면역글로불린 중쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열의 C말단측에 링커 서열이 결합하고, 더욱 그 C말단측에 면역글로불린 경쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열이 결합하여 이루어지고, 특정한 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질도, 본 발명에 있어서의 「1본쇄 항체」이다. 면역글로불린 중쇄의 C말단측에 링커 서열을 개재시켜 면역글로불린 경쇄가 결합한 1본쇄 항체에 있어서는, 통상, 면역글로불린 중쇄는, Fc 영역이 결실되어 있다. 면역글로불린 경쇄의 가변 영역은, 항체의 항원 특이성에 관여하는 상보성 결정 영역(CDR)을 3개 갖고 있다. 마찬가지로, 면역글로불린 중쇄의 가변 영역도, CDR을 3개 갖고 있다. 이들 CDR은, 항체의 항원 특이성을 결정하는 주된 영역이다. 따라서, 1본쇄 항체에는, 면역글로불린 중쇄의 3개의 CDR의 모두와, 면역글로불린 경쇄의 3개의 CDR의 모두가 포함되는 것이 바람직하다. 단, 항체의 항원 특이적인 친화성이 유지되는 한, CDR의 1개 또는 복수개를 결실시킨 1본쇄 항체로 할 수도 있다.
1본쇄 항체에 있어서, 면역글로불린의 경쇄와 중쇄의 사이에 배치되는 링커 서열은, 바람직하게는 2∼50개, 보다 바람직하게는 8∼50개, 더욱 바람직하게는 10∼30개, 더욱 보다 바람직하게는 12∼18개 또는 15∼25개, 예를 들어 15개 혹은 25개의 아미노산 잔기로부터 구성되는 펩티드쇄이다. 그와 같은 링커 서열은, 이것에 의해 양 쇄가 연결되어 이루어지는 항hTfR 항체가 hTfR에 대한 친화성을 유지하는 한, 그 아미노산 서열에 한정은 없지만, 바람직하게는, 글리신만 또는 글리신과 세린으로부터 구성되는 것이다. 예를 들어, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 3), 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 4), 아미노산 서열 Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(서열 번호 5), 또는 이들 아미노산 서열의 2∼10개 혹은 2∼5개가 연속한 것에 상당하는 서열을 포함하는 것을 들 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린 중쇄의 가변 영역의 전 영역으로 이루어지는 아미노산 서열의 C말단측에 링커 서열을 개재시켜 면역글로불린 경쇄의 가변 영역을 결합시키는 경우, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 3)의 3개가 연속한 것에 상당하는 합계 15개의 아미노산으로 이루어지는 링커 서열을 포함하는 것이 적합하다.
본 발명에 있어서, 「인간 트랜스페린 수용체」 또는 「hTfR」이란 말은, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 막단백질이다. 본 발명의 일 실시태양에 있어서, BDNF와 융합시켜야 할 항hTfR 항체는, 서열 번호 1의 아미노산 서열 중 N말단으로부터 89번째의 시스테인 잔기로부터 C말단의 페닐알라닌까지의 부분(hTfR의 세포외 영역)에 대해서 특이적으로 결합하는 것이지만, 이것으로 한정되지 않는다. 또한, 본 발명에 있어서 「원숭이 트랜스페린 수용체」 또는 「원숭이 TfR」이란 말은, 특히, 필리핀원숭이(Macaca fascicularis) 유래의, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 막단백질이다. 본 발명의 항hTfR 항체는, 그 일 실시태양에 있어서, 서열 번호 2의 아미노산 서열 중에서, N말단으로부터 89번째의 시스테인 잔기로부터 C말단의 페닐알라닌까지의 부분(원숭이 TfR의 세포외 영역)에 대해서도 결합하는 것이지만, 이것으로 한정되지 않는다.
hTfR에 대한 항체의 제작 방법으로서는, hTfR 유전자를 짜넣은 발현 벡터를 도입한 세포를 이용하여, 재조합 인간 트랜스페린 수용체(rhTfR)를 제작하고, 이 rhTfR을 이용하여 마우스 등의 동물을 면역하여 얻는 방법이 일반적이다. 면역 후의 동물로부터 hTfR에 대한 항체 산생 세포를 취출하고, 이것과 미엘로마 세포를 융합시키는 것에 의해, 항hTfR 항체 산생능을 갖는 하이브리도마 세포를 제작할 수 있다.
또한, 마우스 등의 동물로부터 얻은 면역계 세포를 체외 면역법에 의해 rhTfR로 면역하는 것에 의해서도, hTfR에 대한 항체를 산생하는 세포를 취득할 수 있다. 체외 면역법을 이용하는 경우, 그 면역계 세포가 유래하는 동물종에 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는, 마우스, 래트, 토끼, 모르모트, 개, 고양이, 말, 및 인간을 포함하는 영장류이며, 보다 바람직하게는, 마우스, 래트 및 인간이며, 더욱 바람직하게는 마우스 및 인간이다. 마우스의 면역계 세포로서는, 예를 들어, 마우스의 비장으로부터 조제한 비세포를 이용할 수 있다. 인간의 면역계 세포로서는, 인간의 말초혈, 골수, 비장 등으로부터 조제한 세포를 이용할 수 있다. 인간의 면역계 세포를 체외 면역법에 의해 면역했을 경우, hTfR에 대한 인간 항체를 얻을 수 있다.
체외 면역법에 의해 면역계 세포를 면역한 후, 세포를 미엘로마 세포와 융합시키는 것에 의해, 항체 산생능을 갖는 하이브리도마 세포를 제작할 수 있다. 또한, 면역 후의 세포로부터 mRNA를 추출하여 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 주형으로 하여 PCR 반응에 의해 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편을 증폭하고, 이들을 이용하여 인공적으로 항체 유전자를 재구축할 수도 있다.
상기 방법에 의해 얻어진 그대로의 하이브리도마 세포에는, hTfR 이외의 단백질을 항원으로서 인식하는 항체를 산생하는 세포도 포함된다. 또한, 항hTfR 항체를 산생하는 하이브리도마 세포의 모두가, hTfR에 대해서 고친화성을 나타내는 항hTfR 항체를 산생한다고도 할 수 없다.
마찬가지로, 인공적으로 재구축한 항체 유전자에는, hTfR 이외의 단백질을 항원으로서 인식하는 항체를 코딩하는 유전자도 포함된다. 또한, 항hTfR 항체를 코딩하는 유전자의 모두가, hTfR에 대해서 고친화성을 나타내는 항hTfR 항체를 코딩하는 등의 원하는 특성을 구비한다고도 할 수 없다.
따라서, 상기에서 얻어진 그대로의 하이브리도마 세포로부터, 원하는 특성(hTfR에 대한 고친화성 등)을 갖는 항체를 산생하는 하이브리도마 세포를 선택하는 스텝이 필요하다. 또한, 인공적으로 재구축한 항체 유전자에 있어서는, 당해 항체 유전자로부터, 원하는 특성(hTfR에 대한 고친화성 등)을 갖는 항체를 코딩하는 유전자를 선택하는 스텝이 필요하다. hTfR에 대해서 고친화성을 나타내는 항체(고친화성 항체)를 산생하는 하이브리도마 세포, 또는 고친화성 항체를 코딩하는 유전자를 선택하는 방법으로서, 이하에 상술하는 방법이 유효하다. 한편, hTfR에 대해서 고친화성을 나타내는 항체란, 실시예 7에 기재된 방법에 의해 측정되는 hTfR과의 해리 상수(KD)가, 바람직하게는 1×10-8M 이하인 것이고, 보다 바람직하게는 1×10-9M 이하인 것이며, 더욱 바람직하게는 1×10-10 이하인 것이고, 더욱더 바람직하게는 1×10-11 이하인 것이다. 예를 들어 적합한 것으로서, 해리 상수가 1×10-13M∼1×10-9M인 것, 1×10-13M∼1×10-10M인 것을 들 수 있다.
예를 들어, 항hTfR 항체에 대해서 고친화성의 항체를 산생하는 하이브리도마 세포를 선택하는 경우, 재조합 hTfR을 플레이트에 첨가하여 이것에 보지시킨 후, 하이브리도마 세포의 배양 상청을 첨가하고, 그 다음에 재조합 hTfR과 결합하고 있지 않는 항체를 플레이트로부터 제거하고, 플레이트에 보지된 항체의 양을 측정하는 방법이 이용된다. 이 방법에 의하면, 플레이트에 첨가한 하이브리도마 세포의 배양 상청에 포함되는 항체의 hTfR에 대한 친화성이 높을수록, 플레이트에 보지되는 항체의 양이 많아진다. 따라서, 플레이트에 보지된 항체의 양을 측정하여, 보다 많은 항체가 보지된 플레이트에 대응하는 하이브리도마 세포를, hTfR에 대해서 상대적으로 높은 친화성을 갖는 항hTfR 항체를 산생하는 세포주로서 선택할 수 있다. 이와 같게 하여 선택된 세포주로부터, mRNA를 추출하여 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 주형으로 하여 항hTfR 항체를 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편을 PCR법을 이용하여 증폭하는 것에 의해, 고친화성 항체를 코딩하는 유전자를 단리할 수도 있다.
상기의 인공적으로 재구축한 항체 유전자로부터, 고친화성을 갖는 항hTfR 항체를 코딩하는 유전자를 선택하는 경우는, 일단, 인공적으로 재구축한 항체 유전자를 발현 벡터에 짜넣어, 이 발현 벡터를 호스트 세포에 도입한다. 이 때, 호스트 세포로서 이용하는 세포로서는, 인공적으로 재구축한 항체 유전자를 짜넣은 발현 벡터를 도입하는 것에 의해 항체 유전자를 발현시킬 수 있는 세포이면 원핵세포, 진핵세포를 불문하고 특별히 한정은 없지만, 인간, 마우스, 차이니즈 햄스터 등의 포유동물 유래의 세포가 바람직하고, 특히 차이니즈 햄스터 난소 유래의 CHO 세포, 또는 마우스 골수종에서 유래하는 NS/0 세포가 바람직하다. 또한, 항체 유전자를 코딩하는 유전자를 짜넣어 발현시키기 위해서 이용하는 발현 벡터는, 포유동물 세포 내에 도입시켰을 때에, 해당 유전자를 발현시키는 것이면 특별히 한정 없이 이용할 수 있다. 발현 벡터에 짜넣어진 해당 유전자는, 포유동물 세포 내에서 유전자의 전사의 빈도를 조절할 수 있는 DNA 서열(유전자 발현 제어 부위)의 하류에 배치된다. 본 발명에 있어서 이용할 수 있는 유전자 발현 제어 부위로서는, 예를 들어, 사이토메갈로바이러스 유래의 프로모터, SV40 초기 프로모터, 인간 신장 인자-1 알파(EF-1α) 프로모터, 인간 유비키틴 C 프로모터 등을 들 수 있다.
이와 같은 발현 벡터가 도입된 포유동물 세포는, 발현 벡터에 짜넣어진 전술한 인공적으로 재구축한 항체를 발현하게 된다. 이와 같이 하여 얻은, 인공적으로 재구축한 항체를 발현하는 세포로부터, 항hTfR 항체에 대해서 고친화성을 갖는 항체를 산생하는 세포를 선택하는 경우, 재조합 hTfR을 플레이트에 첨가하여 이것에 보지시킨 후, 재조합 hTfR에 세포의 배양 상청을 접촉시키고, 그 다음에, 재조합 hTfR과 결합하고 있지 않는 항체를 플레이트로부터 제거하고, 플레이트에 보지된 항체의 양을 측정하는 방법이 이용된다. 이 방법에 의하면, 세포의 배양 상청에 포함되는 항체의 hTfR에 대한 친화성이 높을수록, 플레이트에 보지된 항체의 양이 많아진다. 따라서, 플레이트에 보지된 항체의 양을 측정하여, 보다 많은 항체가 보지된 플레이트에 대응하는 세포를, hTfR에 대해서 상대적으로 높은 친화성을 갖는 항hTfR 항체를 산생하는 세포주로서 선택할 수 있고, 나아가서는, hTfR에 대해서 고친화성을 갖는 항hTfR 항체를 코딩하는 유전자를 선택할 수 있다. 이와 같이 하여 선택된 세포주로부터, 항hTfR 항체를 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편을, PCR법을 이용하여 증폭하는 것에 의해, 고친화성 항체를 코딩하는 유전자를 단리할 수 있다.
상기의 인공적으로 재구축한 항체 유전자로부터의, 고친화성을 갖는 항hTfR 항체를 코딩하는 유전자의 선택은, 인공적으로 재구축한 항체 유전자를 발현 벡터에 짜넣고, 이 발현 벡터를 대장균에 도입하고, 이 대장균을 배양하여 얻은 배양 상청 또는 대장균을 용해시켜 얻은 항체를 포함하는 용액을 이용하여, 전술한 하이브리도마 세포를 선택하는 경우와 마찬가지의 방법으로, 원하는 유전자를 갖는 대장균을 선택하는 것에 의해서도 할 수 있다. 선택된 대장균주는, hTfR에 대해서 상대적으로 높은 친화성을 갖는 항hTfR 항체를 코딩하는 유전자를 발현하는 것이다. 이 세포주로부터, hTfR에 대해서 상대적으로 높은 친화성을 갖는 항hTfR 항체를 코딩하는 유전자를 선택할 수 있다. 대장균의 배양 상청 중에 항체를 분비시키는 경우에는, N말단측에 분비 시그널 서열이 결합하도록 항체 유전자를 발현 벡터에 짜넣으면 된다.
고친화성을 갖는 항hTfR 항체를 코딩하는 유전자를 선택하는 다른 방법으로서, 전술한 인공적으로 재구축한 항체 유전자로 코딩된 항체를 파지 입자 상에 보지시켜 발현시키는 방법이 있다. 이 때, 항체 유전자는, 1본쇄 항체를 코딩하는 유전자로서 재구축된다. 항체를 파지 입자 상에서 보지하는 방법은, 국제 공개 공보(WO1997/09436, WO1995/11317) 등에 기재되어 있어 주지이다. 인공적으로 재구축한 항체 유전자로 코딩된 항체를 보지하는 파지로부터, 항hTfR 항체에 대해서 고친화성을 갖는 항체를 보지하는 파지를 선택하는 경우, 재조합 hTfR을, 플레이트에 첨가하여 보지시킨 후, 파지를 접촉시키고, 그 다음에 플레이트로부터 재조합 hTfR과 결합하고 있지 않는 파지를 제거하고, 플레이트에 보지된 파지의 양을 측정하는 방법이 이용된다. 이 방법에 의하면, 파지 입자 상에 보지된 항체의 hTfR에 대한 친화성이 높을수록, 플레이트에 보지된 파지의 양이 많아진다. 따라서, 플레이트에 보지된 파지의 양을 측정하여, 보다 많은 파지가 보지된 플레이트에 대응하는 파지 입자를, hTfR에 대해서 상대적으로 높은 친화성을 갖는 항hTfR 항체를 산생하는 파지 입자로서 선택할 수 있고, 나아가서는, hTfR에 대해서 고친화성을 갖는 항hTfR 항체를 코딩하는 유전자를 선택할 수 있다. 이와 같이 하여 선택된 파지 입자로부터, 항hTfR 항체를 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편을, PCR법을 이용하여 증폭하는 것에 의해, 고친화성 항체를 코딩하는 유전자를 단리할 수 있다.
효소 면역 측정법(EIA, ELISA)을 이용한 직접 및 간접 샌드위치 어세이, 플로사이토메트리, 표면 플라즈몬 공명법(이하 「SPR법」이라고 한다), 바이오레이어 간섭법(이하 「BLI법」이라고 한다), 또는 면역 침강 어세이 등의 주지된 결합 어세이를 이용하여, hTfR에 대해서 고친화성을 갖는 항체를 산생하는 하이브리도마 세포를 선택할 수 있다. 당해 고친화성 항체 산생 세포로부터 cDNA를 조제하고, 이것을 주형으로 하여 항hTfR 항체의 경쇄, 항hTfR 항체의 중쇄, 또는 항hTfR 항체인 1본쇄 항체의, 모두 또는 그 일부를 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편을, PCR법 등에 의해 증폭하여 단리할 수 있다. 마찬가지로 하여, 항hTfR 항체의 경쇄의 가변 영역의 모두 또는 그 일부를 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편, 항hTfR 항체의 중쇄의 가변 영역의 모두 또는 그 일부를 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편을, PCR법 등에 의해 증폭하여 단리할 수도 있다.
이 고친화성을 갖는 항hTfR 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 유전자의 모두 또는 그 일부를, 발현 벡터에 짜넣고, 이 발현 벡터를 이용하여 포유동물 세포 등의 호스트 세포를 형질 전환하고, 얻어진 형질 전환 세포를 배양하는 것에 의해, 고친화성을 갖는 항hTfR 항체를 산생시킬 수 있다. 단리된 항hTfR 항체를 코딩하는 유전자의 염기 서열로부터 항hTfR 항체의 아미노산 서열을 번역하여, 이 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 단편을 인공적으로 합성할 수도 있다. DNA 단편을 인공적으로 합성하는 경우, 적절한 코돈을 선택하는 것에 의해, 호스트 세포에 있어서의 항hTfR 항체의 발현량을 증가시킬 수도 있다.
원래의 항hTfR 항체에 아미노산 서열에 치환, 결실, 부가 등의 변이를 가하기 위해서, 단리된 DNA 단편에 포함되는 항hTfR 항체를 코딩하는 유전자에, 적절히 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 후의 항hTfR 항체를 코딩하는 유전자는, 원래의 유전자와 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖는 것이고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 갖는 것이지만, 상동성에 특별히 제한은 없다. 아미노산 서열에 변이를 가하는 것에 의해, 항hTfR 항체와 결합하는 당쇄의 수, 당쇄의 종류를 개변하여, 생체 내에 있어서의 항hTfR 항체의 안정성을 증가시킬 수도 있다.
항hTfR 항체의 경쇄의 가변 영역의 모두 또는 그 일부를 코딩하는 유전자에 변이를 가하는 경우에 있어서는, 변이를 가한 후의 유전자는, 원래의 유전자와 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖는 것이고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 갖는 것이지만, 상동성에 특별히 제한은 없다. 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하는 경우, 치환하는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 경쇄의 가변 영역에 아미노산을 부가하는 경우, 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 중 혹은 N말단 또는 C말단에, 바람직하게는 1∼10개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개 아미노산을 부가한다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열은, 원래의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 바람직하게는, 95% 이상의 상동성을 나타낸다. 특히, CDR의 아미노산 서열의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하는 경우, 치환하는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼5개, 보다 바람직하게는 1∼3개, 더욱 바람직하게는 1∼2개이며, 더욱 보다 바람직하게는 1개이다. CDR의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼5개이고, 보다 바람직하게는 1∼3개이며, 더욱 바람직하게는 1∼2개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 아미노산을 부가하는 경우, 당해 아미노산 서열 중 혹은 N말단 또는 C말단에, 바람직하게는 1∼5개, 보다 바람직하게는 1∼3개, 더욱 바람직하게는 1∼2개, 더욱 보다 바람직하게는 1개의 아미노산을 부가한다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 각 CDR의 아미노산 서열은, 원래의 각 CDR의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 바람직하게는, 95% 이상의 상동성을 나타낸다.
항hTfR 항체의 중쇄의 가변 영역의 모두 또는 그 일부를 코딩하는 유전자에 변이를 가하는 경우에 있어서는, 변이를 가한 후의 유전자는, 원래의 유전자와 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖는 것이고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 갖는 것이지만, 상동성에 특별히 제한은 없다. 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하는 경우, 치환하는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개, 더욱더 바람직하게는 1∼2개이다. 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개, 더욱더 바람직하게는 1∼2개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 중쇄의 가변 영역에 아미노산을 부가하는 경우, 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 중 혹은 N말단 또는 C말단에, 바람직하게는 1∼10개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개 아미노산을 부가한다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열은, 원래의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 바람직하게는, 95% 이상의 상동성을 나타낸다. 특히, CDR의 아미노산 서열의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하는 경우, 치환하는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼5개이고, 보다 바람직하게는 1∼3개이며, 더욱 바람직하게는 1∼2개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1개이다. CDR의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼5개이고, 보다 바람직하게는 1∼3개이며, 더욱 바람직하게는 1∼2개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 아미노산을 부가하는 경우, 당해 아미노산 서열 중 혹은 N말단 또는 C말단에, 바람직하게는 1∼5개, 보다 바람직하게는 1∼3개, 더욱 바람직하게는 1∼2개, 더욱 보다 바람직하게는 1개의 아미노산을 부가한다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 각 CDR의 아미노산 서열은, 원래의 각 CDR의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 바람직하게는, 95% 이상의 상동성을 나타낸다.
상기의 항hTfR 항체의 경쇄의 가변 영역에 대한 변이와,상기의 항hTfR 항체의 중쇄의 가변 영역에 대한 변이를 조합하여, 항hTfR 항체의 경쇄와 중쇄의 가변 영역의 양방에 변이를 가할 수도 있다.
상기의 항hTfR 항체의 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열 중의 아미노산의 다른 아미노산에 의한 치환으로서는, 예를 들어, 방향족 아미노산(Phe, Trp, Tyr), 지방족 아미노산(Ala, Leu, Ile, Val), 극성 아미노산(Gln, Asn), 염기성 아미노산(Lys, Arg, His), 산성 아미노산(Glu, Asp), 수산기를 갖는 아미노산(Ser, Thr) 등의 동일 그룹으로 분류되는 아미노산간의 치환을 들 수 있다. 이와 같은 유사 아미노산에 의한 치환은, 단백질의 표현형에 변화를 가져오지 않을(즉, 보존적 아미노산 치환일) 것이 예측된다.
한편, 항hTfR 항체에 변이를 가하여 C말단 또는 N말단에 아미노산을 부가했을 경우에 있어서, 그 부가한 아미노산이, 항hTfR 항체를 BDNF와 융합시켰을 때에 항hTfR 항체와 BDNF의 사이에 위치하게 되었을 경우, 당해 부가한 아미노산은, 링커의 일부를 구성한다. 항hTfR 항체와 BDNF의 융합 단백질에 있어서, 항hTfR 항체와 BDNF의 사이에 배치되는 링커 서열에 대해서는 후에 상술한다.
상기의 방법 등에 의해 선택된 hTfR에 대해서 비교적 높은 친화성을 갖는 항hTfR 항체를 산생하는 세포를 배양하여 얻어지는 항hTfR 항체, 및, 고친화성을 갖는 항hTfR 항체를 코딩하는 유전자를 발현시켜 얻어지는 항hTfR 항체는, 그 아미노산 서열에 치환, 결실, 부가 등의 변이를 도입하는 것에 의해 원하는 특성을 갖는 항체로 개변시킬 수도 있다. 항hTfR 항체의 아미노산 서열에 대한 변이의 도입은, 그 아미노산 서열에 대응하는 유전자에 변이를 가하는 것에 의해 행해진다.
항hTfR 항체는, 그 항체의 가변 영역의 아미노산 서열에 치환, 결실, 부가 등의 변이를 가하는 것에 의해, 항체의 hTfR에 대한 친화성을 적절히 조정할 수 있다. 예를 들어, 항체와 항원의 친화성이 높고, 수성액 중에서의 해리 상수가 현저하게 낮은 경우, 이것을 생체 내에 투여했을 때에, 항체가 항원과 해리되지 않고, 그 결과, 기능상의 문제가 생길 가능성이 있다. 이와 같은 경우에, 항체의 가변 영역에 변이를 도입하는 것에 의해, 해리 상수를, 원래의 항체의 2∼5배, 5∼10배, 10∼100배 등으로 단계적으로 조정하여, 목적에 합치한 가장 바람직한 항체를 획득할 수 있다. 반대로, 당해 변이의 도입에 의해, 해리 상수를, 원래의 항체의 1/2∼1/5배, 1/5∼1/10배, 1/10∼1/100배 등으로 단계적으로 조정할 수도 있다.
항hTfR 항체의 아미노산 서열에 대한 치환, 결실, 부가 등의 변이의 도입은, 예를 들어, 항hTfR 항체를 코딩하는 유전자를 주형으로 하여, PCR 등의 방법에 의해, 유전자의 염기 서열의 특정한 부위에 변이를 도입하거나, 또는 랜덤으로 변이를 도입하는 것에 의해 행한다.
항체와 hTfR의 친화성의 조정을 목적으로 한, 항hTfR 항체의 아미노산 서열에 대한 변이의 도입은, 예를 들어, 1본쇄 항체인 항hTfR 항체를 코딩하는 유전자를 파지미드에 짜넣고, 이 파지미드를 이용하여 캡시드 표면 상에 1본쇄 항체를 발현시킨 파지를 제작하고, 변이원 등을 작용시키는 것에 의해 1본쇄 항체를 코딩하는 유전자 상에 변이를 도입시키면서 파지를 증식시키고, 증식시킨 파지로부터, 원하는 해리 상수를 갖는 1본쇄 항체를 발현하는 파지를, 전술한 방법에 의해 선택하거나, 또는 일정 조건하에서 항원 컬럼을 이용하여 정제하는 것에 의해, 얻을 수 있다.
상기 하이브리도마 세포에 의해 산생 되는 항체는, 실시예 7에 기재된 방법에 의해 측정되는 hTfR과의 해리 상수(KD)가, 바람직하게는 1×10-8M 이하인 것이고, 보다 바람직하게는 1×10-9M 이하인 것이고, 더욱 바람직하게는 1×10-10M 이하인 것이며, 더욱더 바람직하게는 1×10-11M 이하인 것이다. 예를 들어 적합한 것으로서, 해리 상수가 1×10-13M∼1×10-9M인 것, 1×10-13M∼1×10-10M인 것을 들 수 있다. 항체가 1본쇄 항체여도 마찬가지이다. 일단 얻어진 항체는, 그 항체를 코딩하는 유전자에 변이를 도입하는 등을 하여, 원하는 특성을 갖도록 적절히 개변할 수 있다.
상기와 같이 하여 얻어지는 항hTfR 항체로부터, 원숭이 TfR에 대한 친화성을 갖는 항체를 선택하는 것에 의해, 인간 및 원숭이의 TfR의 어느 것에도 친화성을 갖는 항체를 얻을 수 있다. 원숭이 TfR에 대한 친화성을 갖는 항체는, 예를 들어, 유전자 재조합 기술을 이용하여 제작한 재조합 원숭이 TfR을 이용한 ELISA법 등에 의해 선택할 수 있다. 이 ELISA법에서는, 재조합 원숭이 TfR을 플레이트에 첨가하여 이것에 보지시킨 후, 항hTfR 항체를 접촉시키고, 그 다음에 재조합 원숭이 TfR과 결합하고 있지 않은 항체를 플레이트로부터 제거하고, 플레이트에 보지된 항체의 양을 측정한다. 재조합 원숭이 TfR에 대한 친화성이 높을수록 플레이트에 보지되는 항체의 양이 많아지므로, 보다 많은 항체가 보지된 플레이트에 대응하는 항체를, 원숭이 TfR에 친화성을 갖는 항체로서 선택할 수 있다. 한편, 여기에서 말하는 「원숭이」란, 바람직하게는 인간을 제외한 유인원으로 분류되는 것이고, 보다 바람직하게는 긴꼬리원숭이과로 분류되는 것이고, 더욱 바람직하게는 마카크속으로 분류되는 것이고, 예를 들어, 필리핀원숭이 또는 히말라야원숭이이며, 특히 필리핀원숭이는, 평가에 이용하는데 있어서 편의성이 좋다.
인간 및 원숭이의 hTfR의 어느 것인가에도 친화성을 갖는 항체는, 이 항체와 BDNF의 융합 단백질을 투여했을 때의 생체 내에서의 동태를, 원숭이를 이용하여 관찰할 수 있다고 하는 유리한 효과를 갖는다. 예를 들어, 본 발명의 항hTfR 항체와 BDNF의 융합 단백질을 의약 개발하는 경우, 당해 의약의 약물 동태 시험을 원숭이로 실시할 수 있기 때문에, 당해 의약의 개발을 현저하게 촉진할 수 있다.
본 발명에 있어서, hTfR에 대해서 상대적으로 높은 친화성을 갖고 또한 원숭이 TfR에 대해서도 친화성을 갖는 항체는, 특히, 실시예 7에 기재된 방법에 의해 측정했을 때, 인간 및 원숭이의 TfR과의 해리 상수가 다음의 것이다:
(a) hTfR과의 해리 상수: 바람직하게는 1×10-10M 이하, 보다 바람직하게는 2.5×10-11M 이하, 더욱 바람직하게는 5×10-12M 이하, 더욱 보다 바람직하게는 1×10-12M 이하,
(b) 원숭이 TfR과의 해리 상수: 바람직하게는 1×10-9M 이하, 보다 바람직하게는 5×10-10M 이하, 더욱 바람직하게는 1×10-10M 이하, 예를 들어 7.5×10-11M 이하.
예를 들어, hTfR 및 원숭이 TfR과의 해리 상수가, 각각, 1×10-10M 이하와 1×10-9M 이하, 1×10-11M 이하와 5×10-10M 이하, 5×10-12M 이하와 1×10-10M 이하, 5×10-12M 이하와 7.5×10-11M 이하, 1×10-12M 이하와 1×10-10M 이하, 1×10-12M 이하와 7.5×10-11M 이하인 것을 들 수 있다. 여기에 있어서, 인간의 TfR과의 해리 상수에 특단의 명확한 하한은 없지만, 예를 들어, 5×10-13M, 1×10-13M 등으로 할 수 있다. 또한, 원숭이의 TfR과의 해리 상수에도 특단의 명확한 하한은 없지만, 예를 들어, 1×10-11M, 1×10-12M 등으로 할 수 있다. 항체가 1본쇄 항체여도 마찬가지이다.
상기의 고친화성 항체를 산생하는 세포를 선택하는 방법에 의해 얻어진, hTfR에 대해서 상대적으로 높은 친화성을 갖는 항체는, 인간 이외의 동물의 항체인 경우, 인간화 항체로 할 수 있다. 인간화 항체란, 항원에 대한 특이성을 유지하면서, 인간 이외의 동물의 항체의 가변 영역의 일부(예를 들어, 특히 CDR의 전부 또는 일부)의 아미노산 서열을 이용하여 인간 항체의 적절한 영역을, 당해 서열로 치환하는 것(인간 항체로의 당해 서열의 이식)에 의해 얻어지는 항체이다. 예를 들어, 인간화 항체로서 인간 항체를 구성하는 면역글로불린 경쇄의 3개소의 상보성 결정 영역(CDR)과 면역글로불린 중쇄의 3개소의 상보성 결정 영역(CDR)을, 다른 포유동물의 CDR로 치환한 항체를 들 수 있다. 인간 항체에 짜넣어지는 CDR이 유래하는 생물종은, 인간 이외의 포유동물인 한 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는, 마우스, 래트, 토끼, 말, 인간 이외의 영장류이고, 보다 바람직하게는 마우스 및 래트이며, 더욱 바람직하게는 마우스이다. 단, 인간 항체의 일부를 다른 인간 항체의 일부로 치환한 항체로 할 수도 있다.
인간화 항체의 제작법은, 당해 기술 분야에서 주지이며, 윈터(Winter) 등이 고안한, 인간 항체의 가변 영역에 있는 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산 서열을, 비인간 포유동물의 항체의 CDR로 치환하는 방법(Verhoeyen M. Science. 239. 1534-1536 (1988))에 기초하는 것이, 가장 일반적이다. 여기에서, 비인간 포유동물의 항체의 CDR뿐만 아니라, CDR의 구조 보지 혹은 항원과의 결합에 관여하고 있는 CDR 외의 영역의 아미노산 서열에 의해, 억셉터가 되는 인간 항체의 대응하는 개소를 치환하는 것이, 도너 항체가 가지는 본래의 활성을 재현하기 위해서 필요한 경우가 있음도 주지이다(Queen C. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86. 10029-10033 (1989)). 여기에서, CDR 외의 영역은, 프레임워크 영역(FR)이라고도 한다.
항체의 중쇄와 경쇄의 가변 영역은 모두, 4개의 프레임워크 영역 1∼4(FR1∼4)를 포함한다. FR1은, CDR1에 그 N말단측에서 인접하는 영역이며, 중쇄 및 경쇄를 구성하는 각 펩티드에 있어서, 그 N말단으로부터 CDR1의 N말단에 인접하는 아미노산까지의 아미노산 서열로 이루어진다. FR2는, 중쇄 및 경쇄를 구성하는 각 펩티드에 있어서, CDR1와 CDR2의 사이의 아미노산 서열로 이루어진다. FR3은, 중쇄 및 경쇄를 구성하는 각 펩티드에 있어서, CDR2와 CDR3의 사이의 아미노산 서열로 이루어진다. FR4는, CDR3의 C말단에 인접하는 아미노산으로부터 가변 영역의 C말단까지의 아미노산 서열로 이루어진다. 단, 이것에 한정하지 않고, 본 발명에 있어서는, 상기의 각 FR 영역에 있어서, 그 N말단측의 1∼5개의 아미노산 및/또는 C말단측의 1∼5개의 아미노산을 제외한 영역을, 프레임워크 영역으로 할 수도 있다.
인간화 항체의 제작은, 인간 항체의 가변 영역 CDR(과 경우에 따라 그 주변의 FR) 대신에, 비인간 포유동물의 항체의 CDR(과 경우에 따라 그 주변의 FR)을 이식하는 작업을 포함한다. 이 작업에 있어서, 바탕이 되는 인간 항체의 가변 영역의 프레임워크 영역은, 생식 세포 계열 항체 유전자 서열을 포함하는 공공의 DNA 데이터베이스 등으로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자의 생식 세포 계열 DNA 서열 및 아미노산 서열은, 「VBase」 인간 생식 세포계 서열 데이터베이스(인터넷에 있어서 www.mrc-cpe.cam.ac.uk/base에서 입수 가능)로부터 선택할 수 있다. 이 외, 공표된 문헌, 예를 들어 「Kabat EA. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판, 미국 보건복지성, NIH Publication No. 91-3242 (1991)」, 「Tomlinson IM. J. Mol. Biol. 227. 776-98 (1992)」, 「Cox JPL. Eur. J Immunol. 24: 827-836 (1994)」 등에 기재된 DNA 서열 및 아미노산 서열로부터 선택할 수도 있다.
이상과 같이, 인간화 항체에 있어서, 원래의 인간 항체의 가변 영역에 이식되는 비인간 포유동물의 항체는 영역은, 일반적으로, CDR 그 자체, 또는 CDR과의 주변의 FR을 포함한다. 단, CDR과 함께 이식되는 FR도, CDR의 구조 보지 혹은 항원과의 결합에 관여하고 있어, 실질적으로 항체의 상보성을 결정하는 기능을 갖는다고 생각되므로, 본 발명에 있어서 「CDR」이란 말은, 인간화 항체를 제작하는 경우에, 비인간 포유동물의 항체로부터 인간화 항체에 이식되는 영역, 또는 이식될 수 있는 영역을 말한다. 즉, CDR에는, 일반적으로 FR로 여겨지는 영역이어도, 그것이 CDR의 구조 보지 혹은 항원과의 결합에 관여하고 있어, 실질적으로 항체의 상보성을 결정하는 기능을 갖고 있다고 생각되는 것인 한, 본 발명에 있어서는 CDR에 포함된다.
본 발명에 있어서의 항hTfR 항체는, 이것을 정맥 주사 등에 의해 생체내에 투여했을 경우, 뇌내의 모세혈관의 내피 세포 상에 존재하는 hTfR에 효율 좋게 결합할 수 있다. 또한, hTfR과 결합한 항체는, 엔도사이토시스, 트랜스사이토시스 등의 기구에 의해 혈액뇌관문을 통과하여 뇌내에 받아들여진다. 따라서, BDNF를 본 발명의 항hTfR 항체와 결합시켜 두는 것에 의해, BDNF에 효율 좋게 혈액뇌관문을 통과시켜 뇌내에 도달시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 항hTfR 항체는, 혈액뇌관문을 통과한 후에, 대뇌의 뇌실질, 해마의 신경양 세포, 소뇌의 푸르킨예 세포 등에, 또는 적어도 이들의 어느 것인가에 도달할 수 있다. 그리고, 대뇌의 선조체의 신경양 세포 및 중뇌의 흑질의 신경양 세포에 도달할 것도 예상된다. 따라서, BDNF를, 본 발명의 항hTfR 항체와 결합시키는 것에 의해, 이들 조직 또는 세포에 도달시킬 수 있다.
통상이면 혈액뇌관문을 통과할 수 없고, 그 때문에 정맥내 투여로는 뇌내에서 기능시킬 수 없는 BDNF를, 혈중에서 뇌내로 도달시켜 뇌내에서 기능을 발휘시키는데 있어서, 항hTfR 항체와 BDNF의 융합 단백질을 이용하는 것은 유효한 수단이 될 수 있다. 특히, 본 발명의 항hTfR 항체와 BDNF의 융합 단백질은, 혈액뇌관문을 통과한 후에, 대뇌의 뇌실질, 해마의 신경양 세포, 소뇌의 푸르킨예 세포 등에, 또는 적어도 이들의 어느 것인가에 도달한다. 그리고, 대뇌의 선조체의 신경양 세포 및 중뇌의 흑질의 신경양 세포에 도달할 것도 예상된다. 따라서, BDNF를 본 발명의 항hTfR 항체 분자와 결합한 형태로서 정맥내 투여 등에 의해 혈중 투여하는 것에 의해, 이들 뇌의 조직 또는 세포에 있어서 BDNF의 기능을 발휘시키거나 또는 강화하는 것이 가능해진다.
본 명세서에 있어서, BDNF는 1982년에 Barde 등에 의해 발견되어 1990년에 Jones 등에 의해 클로닝된 공지된 단백질이며(EMBO J, (1982) 1: 549-553, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87: 8060-8064), 일례로서, 서열 번호 51의 인간 성숙 BDNF의 아미노산 서열을 나타내지만, 이것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단백질이나, 다른 온혈동물(예를 들어, 모르모트, 래트, 마우스, 닭, 토끼, 개, 돼지, 양, 소, 원숭이 등) 유래의 BDNF여도 된다.
또한, 본 명세서에 있어서, BDNF란, 인간 성숙 BDNF를 나타내는 특정한 아미노산 서열(서열 번호 51)로 표시되는 「단백질」 또는 「(폴리)펩티드」뿐만이 아니라, 이들과 동질의 기능을 갖는 것을 한도로 하여, 그의 동족체(호몰로그나 스플라이스 배리언트), 변이체, 유도체 및 아미노산 수식체 등도 포함된다.
여기에서 「동질의 기능」이란, 예를 들어 생리학적으로, 혹은 약리학적으로 봐서, 그 성질이 정성적으로 동일한 것을 의미하고, 기능의 정도(예, 약 0.1∼약 10배, 바람직하게는 0.5∼2배)나, 단백질의 분자량 등의 양적 요소는 상이해도 된다. 또한, 천연의 BDNF가 갖고 있는 기능, 예를 들어, (1) BDNF 수용체(TrkB)에 대한 결합 친화성, (2) BDNF 수용체의 인산화 활성, (3) 신경세포에 대한 증식 촉진 작용, (4) 신경세포에 대한 생존 유지 작용, (5) 신경세포에 대한 신경돌기 신전 작용을 갖거나, 또는 (6) 서열 번호 51의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 특이적으로 인식하는 항체에 의해 인식될 수 있는 단백질을, BDNF와 「동질의 기능을 갖는 단백질」이라고 본다.
전술한 BDNF의 기능은, 후술의 「(2) BDNF의 기능의 평가 방법」의 항에 기재한 바와 같은 공지된 여러 가지 평가 방법이나, 본 명세서의 실시예 23 이후에 기재한 방법을 이용하여 조사할 수 있다.
여기에서 호몰로그로서는, 인간의 단백질에 대응하는 마우스나 래트 등 다른 생물종의 단백질을 예시할 수 있고, 이들은 Maisonpierre 등(Genomics(1991) 10: 558-568)에 의해 보고되어 있는 것 외에, UniProt에 게재된 단백질의 아미노산 서열(P21237-1, P23363-1, P25429-1, Q7YRB4-1, P14082-1, Q5IS78-1, Q95106-1) 등으로부터 연역적으로 동정할 수 있다. 또한 변이체에는, 천연에 존재하는 아렐 변이체, 천연에 존재하지 않는 변이체, 및 인위적으로 결실, 치환, 부가 또는 삽입되는 것에 의해 개변된 아미노산 서열을 갖는 변이체가 포함된다. 한편, 상기 변이체로서는, 변이가 없는 단백질 또는 (폴리)펩티드와 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 보다 바람직하게는 90%, 더욱 보다 바람직하게는 95%, 한층 더 바람직하게는 97%, 특히 바람직하게는 98%, 가장 바람직하게는 99% 상동인 것을 들 수 있다. 또한 아미노산 수식체에는, 천연에 존재하는 아미노산 수식체, 천연에 존재하지 않는 아미노산 수식체가 포함되고, 구체적으로는 아미노산의 인산화체를 들 수 있다.
더욱이, 본 명세서에 있어서, 「BDNF」란, BDNF와 동질의 기능을 발휘할 수 있는 상기 BDNF의 전구체(프리프로체) 또는 당해 전구체로부터 시그널 서열이 절단된 프로체여도 되고, 인간 BDNF 전구체를 나타내는 특정한 아미노산 서열(UniProt ID No. P23560-1)로 나타나는 「단백질」 또는 「(폴리)펩티드」뿐만 아니라, 이들과 동질의 기능을 갖는 것을 한도로 하여, 그의 동족체(호몰로그나 스플라이스 배리언트), 변이체, 유도체, 프로체 및 아미노산 수식체 등이 포함된다. 인간 BDNF의 프로체(프로BDNF)로서는, 서열 번호 56의 아미노산 서열을 들 수 있다.
여기에서 BDNF 전구체와 동질의 기능이란, BDNF 전구체가 갖는 기능, 예를 들어 BDNF의 프로체(프로BDNF) 또는 성숙 BDNF를 생성할 수 있는 것을 의미하고, BDNF의 프로체와 동질의 기능이란, BDNF의 프로체가 갖는 기능, 예를 들어 p75 수용체에 대한 결합 친화성을 의미한다.
여기에서 인간 BDNF 전구체의 스플라이스 배리언트로서는, UniProt에 게재된 단백질의 아미노산 서열(P23560-2, P23560-3, P23560-4, P23560-5) 등을 들 수 있다. 또한, 이들 인간 BDNF 전구체 단백질을 코딩하는 유전자도 공지이며, 예를 들어, http:／/www.ncbi.nlm.nih.gov에 게재된 유전자의 염기 서열(NM＿001143805.1, NM＿001143806.1, NM＿001143807.1, NM＿001143808.1, NM＿001143809.1, NM＿001143810.1, NM＿001143811.1, NM＿001143812.1, NM＿001143813.1, NM＿001143814.1, NM＿001143816.1, NM＿001709.4, NM＿170731.4, NM＿170732.4, NM＿170733.3, NM＿170734.3, NM＿170735.5) 등을 들 수 있다.
BDNF 전구체의 호몰로그 및 그의 스플라이스 배리언트로서는, 인간의 단백질에 대응하는 마우스나 래트 등 다른 생물종의 단백질 및 그의 스플라이스 배리언트를 예시할 수 있고, 이들은 http:／／www.ncbi.nlm.nih.gov에 게재된 유전자의 염기 서열(NM＿001048139.1, NM＿001048141.1, NM＿001048142.1, NM＿001285416.1, NM＿001285417.1, NM＿001285418.1, NM＿001285419.1, NM＿001285420.1, NM＿001285421.1, NM＿001285422.1, NM＿007540.4 등의 마우스 BDNF 유전자의 염기 서열, NM＿001270630.1, NM＿001270631.1, NM＿001270632.1, NM＿001270633.1, NM＿001270634.1, NM＿001270635.1, NM＿001270636.1, NM＿001270637.1, NM＿001270638.1, NM＿012513.4 등의 래트 BDNF 유전자의 염기 서열) 등으로부터 연역적으로 동정할 수 있다.
또한 BDNF 전구체의 변이체에는, 천연에 존재하는 아렐 변이체, 천연에 존재하지 않는 변이체, 및 인위적으로 결실, 치환, 부가 또는 삽입되는 것에 의해 개변된 아미노산 서열을 갖는 변이체가 포함된다. 한편, 상기 변이체로서는, 변이가 없는 단백질 또는 (폴리)펩티드와 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 보다 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95%, 더욱더 바람직하게는 97%, 특히 바람직하게는 98%, 가장 바람직하게는 99% 상동인 것을 들 수 있다. 또한 아미노산 수식체에는, 천연에 존재하는 아미노산 수식체, 천연에 존재하지 않는 아미노산 수식체가 포함되고, 구체적으로는 아미노산의 인산화체를 들 수 있다.
서열 번호 51의 아미노산 서열 또는 이것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로서는, 이하의 (A)∼(E)를 들 수 있다:
(A) 서열 번호 51의 아미노산 서열,
(B) 서열 번호 51의 아미노산 서열에 있어서, 1 혹은 복수의 아미노산이 결실, 부가, 삽입 혹은 치환되고, 또한 서열 번호 51의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동질의 기능을 갖거나 또는 서열 번호 51의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 특이적으로 인식하는 항체에 의해 인식될 수 있는, 아미노산 서열,
(C) 서열 번호 51의 아미노산 서열과 적어도 80% 이상의 상동성을 갖고, 또한 서열 번호 51의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동질의 기능을 갖거나 또는 서열 번호 51의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 특이적으로 인식하는 항체에 의해 인식될 수 있는, 아미노산 서열,
(D) 서열 번호 50의 염기 서열을 갖는 DNA에 의해 코딩되는 아미노산 서열, 또는
(E) 서열 번호 50의 염기 서열을 갖는 DNA에 대해 상보성을 갖는 DNA와 스트린전트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA에 의해 코딩되고, 또한 서열 번호 51의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동질의 기능을 갖거나 또는 서열 번호 51의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 특이적으로 인식하는 항체에 의해 인식 될 수 있는, 아미노산 서열.
구체적으로는, 서열 번호 51의 아미노산 서열로 이루어지는 인간 단백질의 다른 포유동물에 있어서의 오쏘로그(ortholog)의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 51의 아미노산 서열로 이루어지는 인간 단백질 혹은 그 오쏘로그의 스플라이스 배리언트, 아렐 변이체 혹은 다형 배리언트에 있어서의 아미노산 서열을 들 수 있다.
여기에서 「상동성」이란, 당해 기술 분야에 있어서 공지된 수학적 알고리즘을 이용하여 2개의 아미노산 서열을 얼라인시켰을 경우의, 최적인 얼라인먼트(바람직하게는, 해당 알고리즘은 최적인 얼라인먼트를 위해서 서열의 한쪽 혹은 양쪽으로의 갭의 도입을 고려할 수 있는 것이다)에 있어서의, 오버랩하는 전체 아미노산 잔기에 대한 동일 아미노산 및 유사 아미노산 잔기의 비율(%)을 의미한다. 「유사 아미노산」이란 물리화학적 성질에 있어서 유사한 아미노산을 의미하고, 예를 들어, 방향족 아미노산(Phe, Trp, Tyr), 지방족 아미노산(Ala, Leu, Ile, Val), 극성 아미노산(Gln, Asn), 염기성 아미노산(Lys, Arg, His), 산성 아미노산(Glu, Asp), 수산기를 갖는 아미노산(Ser, Thr) 등의 동일 그룹으로 분류되는 아미노산을 들 수 있다. 이와 같은 유사 아미노산에 의한 치환은, 단백질의 표현형에 변화를 가져오지 않을(즉, 보존적 아미노산 치환일) 것이 예측된다.
본 명세서에 있어서의 아미노산 서열의 상동성은, 상동성 계산 알고리즘 NCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)를 이용하여 이하의 조건(기대치=10; 갭을 허용; 매트릭스=BLOSUM62; 필터링=OFF)에서 계산할 수 있다. 아미노산 서열의 상동성을 결정하기 위한 다른 알고리즘으로서는, 예를 들어, Karlin 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877 (1993)에 기재된 알고리즘[해당 알고리즘은 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(version 2.0)에 짜넣어져 있다(Altschul 등, Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997))], Needleman 등, J. Mol. Biol., 48: 444-453(1970)에 기재된 알고리즘[해당 알고리즘은 GCG 소프트웨어 패키지 중의 GAP 프로그램에 짜넣어져 있다], Myers 및 Miller, CABIOS, 4: 11-17 (1988)에 기재된 알고리즘[해당 알고리즘은 CGC 서열 얼라인먼트 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램(version 2.0)에 짜넣어져 있다], Pearson 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988)에 기재된 알고리즘[해당 알고리즘은 GCG 소프트웨어 패키지중의 FASTA 프로그램에 짜넣어져 있다] 등을 들 수 있고, 그들도 마찬가지로 바람직하게 이용될 수 있다.
상기 (E)에 있어서의 스트린전트한 조건이란, 예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley＆Sons, 6. 3. 1-6. 3. 6, 1999에 기재되는 조건, 예를 들어, 6×SSC(sodium chloride/sodium citrate)/45℃에서의 하이브리다이제이션, 그 다음에 0.2×SSC/0.1% SDS/50∼65℃에서의 1회 이상의 세정 등을 들 수 있지만, 당업자이면, 이것과 동등한 스트린전시를 제공하는 하이브리다이제이션의 조건을 적절히 선택할 수 있다.
보다 바람직하게는, 「서열 번호 51의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열」로서, 서열 번호 51의 아미노산 서열과 약 70% 이상, 바람직하게는 약 80% 이상, 보다 바람직하게는 약 90% 이상, 더욱 바람직하게는 약 95% 이상, 더욱더 바람직하게는 약 97% 이상, 특히 바람직하게는 약 98% 이상, 가장 바람직하게는 약 99% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 단백질:BDNF로서, 예를 들어,
(i) 서열 번호 51의 아미노산 서열 중의 1∼30개, 바람직하게는 1∼20개, 보다 바람직하게는 1∼10개, 더욱 바람직하게는 1∼수(6, 5, 4, 3 혹은 2)개의 아미노산이 결실된 아미노산 서열,
(ii) 서열 번호 51의 아미노산 서열에 1∼30개, 바람직하게는 1∼20개, 보다 바람직하게는 1∼10개, 더욱 바람직하게는 1∼수(6, 5, 4, 3 혹은 2)개의 아미노산이 부가된 아미노산 서열,
(iii) 서열 번호 51의 아미노산 서열에 1∼30개, 바람직하게는 1∼20개, 보다 바람직하게는 1∼10개, 더욱 바람직하게는 1∼수(6, 5, 4, 3 혹은 2)개의 아미노산이 삽입된 아미노산 서열,
(iv) 서열 번호 51의 아미노산 서열 중의 1∼30개, 바람직하게는 1∼20개, 보다 바람직하게는 1∼10개, 더욱 바람직하게는 1∼수(6, 5, 4, 3 혹은 2)개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열,
또는
(v) 그들을 조합한 아미노산 서열을 함유하는 단백질 등의 이른바 변이체도 포함된다.
상기와 같이 아미노산 서열이 삽입, 결실, 부가 또는 치환되어 있는 경우, 그 삽입, 결실, 부가 또는 치환의 위치는, 그와 같은 변경이 가해진 단백질이, 서열 번호 51의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동질의 기능을 갖거나, 혹은 서열 번호 51의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 특이적으로 인식하는 항체에 의해 인식될 수 있는 한, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 서열 번호 51의 아미노산 서열로 이루어지는 성숙 BDNF 외에, 그 N말단에 메티오닌이 부가된 Met-BDNF 등도, 서열 번호 51의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동질의 기능을 갖는 한, BDNF로서 본 발명의 융합 단백질에 사용할 수 있다.
여기에서 아미노산의 결실, 부가, 삽입 또는 치환을 인위적으로 행하는 경우의 수법으로서는, 예를 들어, 서열 번호 51의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA에 대해서 관용의 부위 특이적 변이 도입을 실시하고, 그 후 이 DNA를 통상적 방법에 의해 발현시키는 수법을 들 수 있다. 여기에서 부위 특이적 변이 도입법으로서는, 예를 들어, 앰버 변이를 이용하는 방법(갭드 듀플렉스법, Nucleic Acids Res., 12, 9441-9456 (1984)), 변이 도입용 프라이머를 이용한 PCR에 의한 방법 등을 들 수 있다.
BDNF의 바람직한 예로서는, 예를 들어, 서열 번호 51의 아미노산 서열로 이루어지는 인간 단백질, 또는 그 아렐 변이체 혹은 다형 배리언트 등을 들 수 있다.
「BDNF를 코딩하는 유전자」는, 상기 (A)∼(E)로 나타나는, 서열 번호 51의 아미노산 서열 또는 이것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 갖는 유전자를 나타낸다. 구체적으로는, 이하의 (F)∼(J):
(F) 서열 번호 51의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열,
(G) 서열 번호 51의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산이 결실, 부가, 삽입 혹은 치환되고, 또한 서열 번호 51의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동질의 기능을 갖거나 또는 서열 번호 51의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 특이적으로 인식하는 항체에 의해 인식 될 수 있는 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열,
(H) 서열 번호 51의 아미노산 서열과 적어도 80% 이상의 상동성을 갖고, 또한, 서열 번호 51의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동질의 기능을 갖거나 또는 서열 번호 51의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 특이적으로 인식하는 항체에 의해 인식될 수 있는 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열,
(I) 서열 번호 50의 염기 서열을 갖는 DNA에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열, 또는
(J) 서열 번호 50의 염기 서열을 갖는 DNA에 대해 상보성을 갖는 DNA와 스트린전트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA에 의해 코딩되고, 또한 서열 번호 51의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동질의 기능을 갖거나 또는 서열 번호 51의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 특이적으로 인식하는 항체에 의해 인식될 수 있는 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 갖는 유전자를 들 수 있다.
한편, 여기에서 유전자란, cDNA 혹은 게놈 DNA 등의 DNA, 또는 mRNA 등의 RNA의 어느 것이어도 되고, 또한 1본쇄의 핵산 서열 및 2본쇄의 핵산 서열을 모두 포함하는 개념이다. 또한, 본 명세서에 있어서, 서열 번호 2, 서열 번호 24, 서열 번호 26, 서열 번호 28, 서열 번호 30, 서열 번호 38, 서열 번호 40, 서열 번호 50, 서열 번호 53, 서열 번호 55, 서열 번호 58, 서열 번호 64 등에 나타나는 핵산 서열은, 편의적으로 DNA 서열의 형태로 기재되어 있지만, mRNA 등 RNA 서열을 나타내는 경우에는, 티민(T)을 우라실(U)이라고 바꿔 읽을 수 있다.
또한, 본 발명에 사용되는 BDNF로서는, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 등의 단백질 안정화 작용을 갖는 분자 등으로 수식된 유도체 등이어도 된다(Drug Delivery System (1998); 13: 173-178).
본 발명에 있어서의 항hTfR 항체와 인간 BDNF의 융합 단백질의 일례로서, 항hTfR 항체를 구성하는 「중쇄」의 C말단측에, 링커 서열을 개재시켜, 인간 BDNF가 융합하고 있는 타입의 것을 들 수 있다. 이와 같은 융합 단백질로서,
(1) 인간화 항hTfR 항체의 경쇄가, 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한
인간화 항hTfR 항체의 중쇄가, 그 C말단측에서, 아미노산 서열 Gly-Ser로 이루어지는 링커를 개재시켜, 인간 BDNF와 결합하고 있고, 그것에 의해 서열 번호 52의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인,
융합 단백질; 및
(2) 인간화 항hTfR 항체의 경쇄가, 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한 인간화 항hTfR 항체의 중쇄가, 그 C말단측에서, 아미노산 서열 Gly-Ser에 이어 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 3)가 5개 연속하여 이루어지는 합계 27개의 아미노산 서열로 이루어지는 링커를 개재시켜, 인간 BDNF와 결합하고 있고, 그것에 의해 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인,
융합 단백질
을 예시할 수 있다.
상기의 (1) 및 (2)에 기재된 융합 단백질은,
(1) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체의 경쇄와, 서열 번호 70의 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체의 중쇄의 C말단측에, 아미노산 서열 Gly-Ser로 이루어지는 링커를 개재시켜, 서열 번호 51의 아미노산 서열을 갖는 인간 BDNF가 결합한 것을 포함하는, 융합 단백질; 및
(2) 서열 번호 23의 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체의 경쇄와, 서열 번호 70의 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체의 중쇄의 C말단측에, 아미노산 서열 Gly-Ser에 이어 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 3)가 5개 연속하여 이루어지는 합계 27개의 아미노산으로 이루어지는 링커를 개재시켜, 서열 번호 51의 아미노산 서열을 갖는 인간 BDNF가 결합한 것을 포함하는, 융합 단백질
이다.
한편, 상기 (1) 및 (2)에 있어서, 인간화 항hTfR 항체의 중쇄를, 서열 번호 70의 아미노산 서열을 갖는 것으로부터 서열 번호 72의 아미노산 서열을 갖는 것으로 치환할 수 있다. 서열 번호 70과 72의 아미노산 서열을 갖는 것은, 각각 IgG1 타입과 IgG4 타입의 항체이다. 서열 번호 70의 아미노산 서열을 갖는 것을 코딩하는 염기 서열로서는 서열 번호 71로 나타나는 것을, 서열 번호 72의 아미노산 서열을 갖는 것을 코딩하는 염기 서열로서는 서열 번호 76으로 나타나는 것을 예시할 수 있다.
이와 같은 융합 단백질은, 예를 들어, 서열 번호 52의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열(서열 번호 53)을 갖는 DNA 단편을 짜넣은 발현 벡터와, 서열 번호 23의 아미노산 서열을 갖는 항hTfR 항체 경쇄를 코딩하는 염기 서열(서열 번호 24)을 갖는 DNA 단편을 짜넣은 발현 벡터로, 포유동물 세포 등의 호스트 세포를 형질 전환시키고, 이 호스트 세포를 배양하는 것에 의해 제조할 수 있다. 또는, 서열 번호 54의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열(서열 번호 55)을 갖는 DNA 단편을 짜넣은 발현 벡터와, 서열 번호 23의 아미노산 서열을 갖는 항hTfR 항체 경쇄를 코딩하는 염기 서열(서열 번호 24)을 갖는 DNA 단편을 짜넣은 발현 벡터로, 포유동물 세포 등의 호스트 세포를 형질 전환시키고, 이 호스트 세포를 배양하는 것에 의해 제조할 수 있다.
인간 BDNF를 결합시키는 항hTfR 항체의 하나의 바람직한 태양으로서는, 해당 항체의 항원 결합성 단편, 구체적으로는, 1본쇄 항체, Fab, F(ab') 및 F(ab')2 등을 들 수 있다.
항hTfR 항체가 1본쇄 항체인 경우의, 본 발명에 있어서의 인간화 항hTfR 항체와 인간 BDNF의 융합 단백질의 구체적인 태양의 일례로서, 인간 BDNF의 C말단측에, 아미노산 서열 Gly-Ser에 이어 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 3)가 5개 연속하여 이루어지는 합계 27개의 아미노산으로 이루어지는 제 1 링커 서열을 개재시켜, 1본쇄 항체가 결합한 것인, 서열 번호 59 또는 60의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 예시할 수 있다. 여기서, 해당 1본쇄 항체는, 서열 번호 69의 아미노산 서열을 갖는 중쇄의 가변 영역의 C말단에, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 3)가 3개 연속하여 이루어지는 합계 15개의 아미노산으로 이루어지는 제 2 링커 서열을 개재시켜, 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 경쇄의 가변 영역이 결합한 것이고, 서열 번호 57의 아미노산 서열을 갖는 것이다. 따라서, 항hTfR 항체가 1본쇄 항체인 경우에 있어서의, 본 발명의 인간화 항hTfR 항체와 인간 BDNF의 융합 단백질의 구체적인 태양의 일례로서, 서열 번호 69의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 1본쇄 항체의 N말단측에, 직접 또는 링커를 개재시켜, 인간 BDNF가 결합한 것인, 융합 단백질을 들 수 있다.
항hTfR 항체가 1본쇄 항체인 이와 같은 융합 단백질은, 예를 들어, 서열 번호 59의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열(서열 번호 58)을 갖는 DNA 단편을 짜넣은 발현 벡터로 포유동물 세포 등의 호스트 세포를 형질 전환시키고, 이 호스트 세포를 배양하는 것에 의해 제조할 수 있다.
항hTfR 항체가 1본쇄 항체인 경우의, 본 발명에 있어서의 인간화 항hTfR 항체와 인간 BDNF의 융합 단백질의 다른 구체적인 태양의 일례로서, 서열 번호 61에 기재된 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄의 C말단측에, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열이 6회 연속하는 아미노산 서열에 아미노산 서열 Gly-Gly가 계속되는 32개의 아미노산으로 이루어지는 링커를 개재시켜, 서열 번호 23에 기재된 아미노산 서열을 갖는 항hTfR 항체 경쇄가 결합한 것인, 서열 번호 90에 기재된 아미노산 서열을 갖는 1본쇄 항체에, 인간 BDNF를 결합한 것을 들 수 있다. 인간 BDNF는, 이 1본쇄 항체의 C말단측 또는 N말단측의 어느 쪽에 결합시켜도 되지만, 바람직하게는 N말단측이다. 또한, 인간 BDNF는, 이 1본쇄 항체에 직접 또는 링커를 개재시켜 결합시킬 수 있다.
한편, 본 발명에 있어서, 1개의 펩티드쇄에 복수의 링커 서열이 포함되는 경우, 편의상, 각 링커 서열은 N말단측으로부터 순차로, 제 1 링커 서열, 제 2 링커 서열이라고 한다.
항hTfR 항체가 Fab인 경우에 있어서의, 본 발명의 인간화 항hTfR 항체와 인간 BDNF의 융합 단백질의 구체적인 태양의 일례로서, 인간 BDNF의 C말단측에, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 3)가 5개 연속하여 이루어지는 합계 25개의 아미노산으로 이루어지는 링커 서열을 개재시켜, 항hTfR 항체 중쇄의 가변 영역과 CH1 영역을 포함하는 영역을 융합시킨 것을 들 수 있다. 이 때 CH1 영역에 더하여 힌지부의 일부가 포함되어도 되지만, 당해 힌지부는 중쇄 사이의 다이설파이드 결합을 형성하는 시스테인 잔기를 포함하지 않는다. 서열 번호 63 및 65로 나타나는 것은, 그 적합한 일례이다. 서열 번호 63으로 나타나는 것은, 서열 번호 56으로 나타나는 인간의 프로BDNF의 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 65로 나타나는 것은, 서열 번호 51로 나타나는 인간 성숙 BDNF의 아미노산 서열을 포함한다.
서열 번호 63 및 65 내의 항hTfR 항체 Fab 중쇄의 아미노산 서열은, 서열 번호 70으로 나타나는 인간화 항hTfR 항체의 중쇄의 아미노산 서열의 N말단으로부터 1번째∼226번째의 부분에 상당하고, 서열 번호 61의 아미노산 서열로 이루어진다. 한편, 서열 번호 61의 N말단으로부터 1번째∼118번째의 부분이, 가변 영역(서열 번호 69)에 상당하고, 119번째∼216번째의 부분이 CH1 영역에 상당하고, 217번째∼226번째의 부분이 힌지부에 상당한다. 항hTfR 항체가 Fab인 경우의, 본 발명에 있어서의 인간화 항hTfR 항체와 인간 BDNF의 융합 단백질의 구체적인 태양의 일례로서, 인간화 항hTfR 항체의 Fab, F(ab')2 또는 F(ab')의 어느 것인가의 중쇄의 N말단측에, 직접 또는 링커를 개재시켜 인간 BDNF가 결합한 것인, 융합 단백질을 적합한 일 태양으로서 들 수 있다.
항hTfR 항체가 Fab인 경우의, 본 발명에 있어서의 인간화 항hTfR 항체와 인간 BDNF의 융합 단백질의 구체적인 태양의 일례로서, 경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 중쇄가 서열 번호 61의 아미노산 서열로 이루어지는 Fab 중쇄이며, 해당 중쇄의 N말단측에, 직접 또는 링커를 개재시켜, 인간 BDNF가 결합하여 이루어지는 것인, 융합 단백질을 들 수 있다. 보다 구체적으로는:
(1) 경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 Fab 중쇄와 그 N말단측에, 직접 또는 링커를 개재시켜, 결합한 인간 프로BDNF로 이루어지는 부분이, 서열 번호 63의 아미노산 서열로 이루어지는 것인, 융합 단백질; 및,
(2) 경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 Fab 중쇄와 그 N말단측에, 직접 또는 링커를 개재시켜, 결합한 인간 BDNF로 이루어지는 부분이, 서열 번호 65의 아미노산 서열로 이루어지는 것인, 융합 단백질
을 들 수 있다.
항hTfR 항체가 Fab인 이와 같은 융합 단백질은, 예를 들어, 서열 번호 63의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열(서열 번호 62)을 갖는 DNA 단편을 짜넣은 발현 벡터와, 서열 번호 23의 아미노산 서열을 갖는 항hTfR 항체 경쇄를 코딩하는 염기 서열(서열 번호 24)을 가지는 DNA 단편을 짜넣은 발현 벡터로, 포유동물 세포 등의 호스트 세포를 형질 전환시키고, 이 호스트 세포를 배양하는 것에 의해서도 제조할 수 있다.
항hTfR 항체가 Fab인 이와 같은 융합 단백질은, 예를 들어, 서열 번호 65의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열(서열 번호 64)을 갖는 DNA 단편을 짜넣은 발현 벡터와, 서열 번호 23의 아미노산 서열을 갖는 항hTfR 항체 경쇄를 코딩하는 염기 서열(서열 번호 24)을 가지는 DNA 단편을 짜넣은 발현 벡터로, 포유동물 세포 등의 호스트 세포를 형질 전환시키고, 이 호스트 세포를 배양하는 것에 의해서도 제조할 수 있다.
한편, 인간 BDNF(hBDNF)에 변이를 가하여 C말단 또는 N말단에 아미노산을 부가했을 경우에 있어서, 그 부가한 아미노산이, hBDNF를 항hTfR 항체와 융합시켰을 때에 hBDNF와 항hTfR 항체의 사이에 위치하게 되었을 경우, 당해 부가한 아미노산은, 링커의 일부를 구성한다.
항hTfR 항체와 BDNF를 결합시키는 방법으로서는, 비펩티드 링커 또는 펩티드 링커를 개재시켜 결합시키는 방법이 있다. 비펩티드 링커로서는, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리바이닐 알코올, 다당류, 덱스트란, 폴리바이닐 에터, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 및 히알루론산, 또는 이들의 유도체, 혹은 이들을 조합한 것을 이용할 수 있다. 펩티드 링커는, 펩티드 결합한 1∼50개의 아미노산으로부터 구성되는 펩티드쇄 혹은 그의 유도체이며, 그 N말단과 C말단이, 각각 항hTfR 항체 또는 BDNF의 어느 것과 공유 결합을 형성하는 것에 의해, 항hTfR 항체와 BDNF를 결합시키는 것이다.
비펩티드 링커로서 PEG를 이용하여 본 발명의 항hTfR 항체와 BDNF를 결합시킨 것은, 특히, 항hTfR 항체-PEG-BDNF라고 한다. 항hTfR 항체-PEG-BDNF는, 항hTfR 항체와 PEG를 결합시켜 항hTfR 항체-PEG를 제작하고, 그 다음에 항hTfR 항체-PEG와 BDNF를 결합시키는 것에 의해 제조할 수 있다. 또는, 항hTfR 항체-PEG-BDNF는, BDNF와 PEG를 결합시켜 BDNF-PEG를 제작하고, 그 다음에 BDNF-PEG와 항hTfR 항체를 결합시키는 것에 의해서도 제조할 수 있다. PEG를 항hTfR 항체 및 BDNF와 결합시키려면, 카보네이트, 카보닐이미다졸, 카복실산의 활성 에스터, 아즈락톤, 환상 이미드싸이온, 아이소사이아네이트, 아이소싸이오사이아네이트, 이미데이트, 또는 알데하이드 등의 작용기로 수식된 PEG가 이용된다. 이들 PEG에 도입된 작용기가, 주로 항hTfR 항체 및 BDNF 분자 내의 아미노기와 반응하는 것에 의해, PEG와 hTfR 항체 및 BDNF가 공유 결합한다. 이 때 이용되는 PEG의 분자량 및 형상에 특별히 한정은 없지만, 그 평균 분자량(MW)은, 바람직하게는 MW=500∼60000이며, 보다 바람직하게는 MW=500∼20000이다. 예를 들어, 평균 분자량이 약 300, 약 500, 약 1000, 약 2000, 약 4000, 약 10000, 약 20000 등인 PEG는, 비펩티드 링커로서 적합하게 사용할 수 있다.
예를 들어, 항hTfR 항체-PEG는, 항hTfR 항체와 알데하이드기 변성 PEG(ALD-PEG-ALD)를, 해당 항체에 대한 해당 변성 PEG의 몰비가 11, 12.5, 15, 110, 120 등이 되도록 혼합하고, 이것에 NaCNBH3 등의 환원제를 첨가하여 반응시키는 것에 의해 얻어진다. 그 다음에, 항hTfR 항체-PEG를, NaCNBH3 등의 환원제의 존재하에서, BDNF와 반응시키는 것에 의해, 항hTfR 항체-PEG-BDNF가 얻어진다. 반대로, 먼저 BDNF와 ALD-PEG-ALD를 결합시켜 BDNF-PEG를 제작하고, 그 다음에 BDNF-PEG와 항hTfR 항체를 결합시키는 것에 의해서도, 항hTfR 항체-PEG-BDNF를 얻을 수 있다.
BDNF는, 그 2량체가 표적 세포 표면 상에 있는 고친화성 BDNF 수용체에 결합하기 때문에, 2량체로 작용한다고 생각되지만, 항hTfR 항체와 결합하는 BDNF는, 1분자여도, 2분자여도 된다. 예를 들어, 항hTfR 항체에 1분자의 BDNF가 결합하여 이루어지는 융합 단백질과 BDNF를 반응시켜, 2량체로 해도 되고, 항hTfR 항체에 BDNF가 2분자 결합한 융합 단백질로 해도 된다. 또한, 그 결합은, 이하에 나타내듯이 항hTfR 항체와 BDNF를 코딩하는 DNA를 발현 벡터에 짜넣어 얻는 것도 가능하고, 항hTfR 항체와 BDNF를 각각 제조한 후에 화학적으로 결합시킴으로써 제작해도 된다. 구체적으로는, 항hTfR 항체와 BDNF는, 항hTfR 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C말단측 또는 N말단측에, 링커 서열을 개재시켜 또는 직접, 각각 BDNF의 N말단 또는 C말단을 펩티드 결합에 의해 결합시키는 것에 의해, 일체화시킬 수 있다. BDNF와 항hTfR 항체의 융합 단백질의 하나의 바람직한 태양으로서는, 항hTfR 항체의 중쇄 또는 경쇄의 N말단측에, 링커 서열을 개재시켜 또는 직접, BDNF의 C말단을 결합시킨 융합 단백질을 들 수 있다.
전술대로, 인간 BDNF를 결합시키는 항hTfR 항체의 하나의 바람직한 태양으로서는, 해당 항체의 항원 결합성 단편, 구체적으로는, 1본쇄 항체, Fab, F(ab') 및 F(ab')2를 들 수 있다. 따라서, BDNF와 항hTfR 항체의 융합 단백질의 하나의 바람직한 태양으로서, 이하와 같은 것을 예시할 수 있다.
(1) BDNF와 항hTfR 항체의 융합 단백질로서, 해당 항hTfR 항체가 항원 결합성 단편이며, 이 항원 결합성 단편의 N말단측에, 직접 또는 링커를 개재시켜 인간 BDNF가 결합한 것인, 융합 단백질.
(2) BDNF와 항hTfR 항체의 융합 단백질로서, 해당 항hTfR 항체가 1본쇄 항체이며, 이 1본쇄 항체의 N말단측에, 직접 또는 링커를 개재시켜 인간 BDNF가 결합한 것인, 융합 단백질.
(3) BDNF와 항hTfR 항체의 융합 단백질로서, 해당 항hTfR 항체가 Fab, F(ab')2, 또는 F(ab')의 어느 하나이고, 이들 Fab, F(ab')2, 또는 F(ab')의 중쇄 또는 경쇄의 N말단측에, 직접 또는 링커를 개재시켜 인간 BDNF가 결합한 것인, 융합 단백질.
여기에서, 상기 (3)의 경우는, 인간 BDNF는, 항hTfR 항체의 Fab, F(ab')2, 또는 F(ab')의 어느 것인가의 중쇄의 N말단측과 특히 적합하게 결합시킬 수 있다. 따라서, 보다 구체적으로는, 이하와 같은 것을 예시할 수 있다.
(4) BDNF와 항hTfR 항체의 융합 단백질로서, 해당 항hTfR 항체가 Fab, F(ab')2, 또는 F(ab')의 어느 하나이고, 이들 Fab, F(ab')2, 또는 F(ab')의 중쇄의 N말단측에, 직접 또는 링커를 개재시켜 인간 BDNF가 결합한 것인, 융합 단백질.
융합 단백질 중의 항hTfR 항체가 Fab의 형태인 경우는, 이것에 추가로 다른 IgG의 Fc 영역을 도입한 형태의 새로운 융합 단백질을 제작할 수도 있다. 그것에 의해, 원래의 융합 단백질에 비해 혈중 등의 생체내에서의 안정성을 높일 수 있다. Fc 영역을 포함하는 그와 같은 융합 단백질로서는, 예를 들어, 인간 BDNF의 C말단측에, 직접 또는 링커 서열을 개재시켜, 인간 IgG Fc 영역이 결합하고, 그 다음에 그 C말단측에, 직접 또는 링커 서열을 개재시켜, 해당 항hTfR 항체의 Fab 중쇄가 결합하여 이루어지는 것을 들 수 있다.
인간 BDNF와 인간 IgG Fc 영역의 사이의 링커 서열은, 바람직하게는 1∼50개의 아미노산으로부터 구성된다. 여기서, 아미노산의 개수는, 1∼17개, 1∼10개, 10∼40개, 20∼34개, 23∼31개, 25∼29개, 27개 등으로 적절히 조정된다. 이와 같은 링커 서열은, 그 아미노산 서열에 한정은 없지만, 바람직하게는, 글리신과 세린으로부터 구성되는 것이다. 예를 들어, 글리신 또는 세린의 어느 1개의 아미노산으로 이루어지는 것, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 3), 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 4), 아미노산 서열 Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(서열 번호 5), 또는 이들 아미노산 서열이 1∼10개, 혹은 2∼5개 연결하여 이루어지는, 50개 이하의 아미노산으로 이루어지는 서열, 2∼17개, 2∼10개, 10∼40개, 20∼34개, 23∼31개, 25∼29개, 또는 25개의 아미노산으로 이루어지는 서열 등을 포함하는 것을 들 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 3)가 5개 연속하여 이루어지는 합계 25개의 아미노산 서열을 포함하는 것은, 링커 서열로서 적합하게 이용할 수 있다. 인간 IgG Fc 영역과 Fab 중쇄의 사이의 링커 서열에 대해서도 마찬가지이다.
한편, 인간 IgG Fc 영역을 포함하는 융합 단백질을 제작하는 경우, 인간 IgG Fc 영역은 원래의 항hTfR 항체의 중쇄와 경쇄의 어느 것에 결합시켜도 된다. 또한, 원래의 항체는, Fab, F(ab')2, F(ab'), 및 1본쇄 항체를 포함하는, 어느 항원 결합성 단편이어도 된다.
도입되는 인간 IgG Fc 영역의 IgG의 타입에는 특별히 한정은 없고, IgG1∼IgG5의 어느 것이어도 된다. 또한, 도입되는 인간 IgG Fc 영역은, Fc 영역의 전체여도 되고 그 일부여도 된다. 이러한 인간 IgG Fc 영역의 바람직한 일 실시형태로서, 인간 IgG1의 Fc의 전 영역인, 서열 번호 75로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 것을 들 수 있다. Fc 영역은, 바람직하게는, BDNF와 Fc 영역과 Fab 중쇄가, N말단측으로부터 이 순서로 위치하도록 도입된다. 예를 들어, Fc 영역을 도입한 융합 단백질로서, BDNF의 C말단측에 Fc 영역의 전체, 그 C말단측에 항hTfR 항체의 중쇄 Fab가, 각각 링커 서열을 개재시켜 결합한 서열 번호 74로 나타나는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것을, 일례로서 들 수 있다.
항hTfR 항체와 hBDNF의 융합 단백질(항hTfR 항체-hBDNF 융합 단백질)은, 알부민에 대한 친화성을 갖도록 개변할 수도 있다. 당해 개변은, 예를 들어, 항hTfR 항체-hBDNF 융합 단백질에, 알부민에 대해서 친화성을 갖는 물질(예를 들어, 알부민에 대해서 친화성을 갖는 화합물, 펩티드 및 단백질 등)을 도입하는 것에 의해 행할 수 있다. 당해 개변을 실시한 항hTfR 항체-hBDNF 융합 단백질(개변 융합 단백질)은, 알부민과 결합하여 혈중을 순환한다. 알부민은, 이것과 결합한 단백질을 안정화시키는 기능을 갖는다. 따라서, 개변 융합 단백질은, 생체내에 투여했을 때, 혈중에서의 반감기가 길어지므로, 그 약효를 강화할 수 있다. 알부민에 대한 친화성을 갖도록 개변하는 것은, 항hTfR 항체-hBDNF 융합 단백질 중의 항hTfR 항체가, 항체의 안정성에 기여하는 Fc 영역을 결여하는 것인 경우, 예를 들어, Fab인 경우에 보다 효과적이다.
또한, 항hTfR 항체-hBDNF 융합 단백질이, 생체내에 투여했을 때에, 면역원성을 나타내는 경우에도, 알부민에 대한 친화성을 갖도록 개변하는 것은 효과적이다. 개변 융합 단백질이 알부민과 결합하는 것에 의해, 항hTfR 항체-hBDNF 융합 단백질 중의 면역원성을 나타내는 부위가, 면역 세포에 제시되는 것이 저해되므로, 면역원성이 경감된다.
항hTfR 항체-hBDNF 융합 단백질에, 알부민에 대한 친화성을 갖는 물질을 도입하는 경우, 당해 물질을 도입하는 부분은, 항hTfR 항체의 경쇄, 항hTfR 항체의 중쇄, hBDNF, 및 링커 부분의 어느 것이어도 되고, 이들의 2 이상의 부분에 도입해도 된다.
알부민에 대해서 친화성을 갖는 펩티드 또는 단백질로서는, 예를 들어, 서열 번호 85로 나타나는 아미노산 서열을 갖는, Streptococcus strain G418 유래의 단백질의 알부민 결합 도메인(Alm T. Biotechnol J. 5. 605-17 (2010))을, 알칼리 내성을 나타내도록 개변한 펩티드를 이용할 수 있지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 알부민에 대해서 친화성을 갖는 펩티드 또는 단백질(알부민 친화성 펩티드)을, 항hTfR 항체-hBDNF 융합 단백질과 결합시키는 방법으로서는, 비펩티드 링커 또는 펩티드 링커를 개재시켜 결합시키는 방법이 있다. 비펩티드 링커로서는, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올, 폴리바이닐 알코올, 다당류, 덱스트란, 폴리바이닐 에터, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 및 히알루론산, 또는 이들의 유도체, 혹은 이들을 조합한 것을 이용할 수 있다. 펩티드 링커는, 펩티드 결합한 1∼50개의 아미노산으로부터 구성되는 펩티드쇄 혹은 그의 유도체이며, 그 N말단과 C말단이, 각각 알부민 친화성 펩티드 또는 융합 단백질의 어느 것과 공유 결합을 형성하는 것에 의해, 알부민 친화성 펩티드와 융합 단백질을 결합시키는 것이다.
비펩티드 링커로서 PEG를 이용하여 알부민 친화성 펩티드와 항hTfR 항체-hBDNF 융합 단백질을 결합시킨 것은, 특히, 알부민 친화성 펩티드-PEG-융합 단백질이라고 한다. 알부민 친화성 펩티드-PEG-융합 단백질은, 알부민 친화성 펩티드와 PEG를 결합시켜 알부민 친화성 펩티드-PEG를 제작하고, 그 다음에 알부민 친화성 펩티드-PEG와 항hTfR 항체-hBDNF 융합 단백질을 결합시키는 것에 의해 제조할 수 있다. 또는, 알부민 친화성 펩티드-PEG-융합 단백질은, 항hTfR 항체-hBDNF 융합 단백질과 PEG를 결합시켜 항hTfR 항체-hBDNF 융합 단백질-PEG를 제작하고, 그 다음에 항hTfR 항체-hBDNF 융합 단백질-PEG와 알부민 친화성 펩티드를 결합시키는 것에 의해서도 제조할 수 있다. PEG를 알부민 친화성 펩티드 및 항hTfR 항체-hBDNF 융합 단백질과 결합시키려면, 카보네이트, 카보닐이미다졸, 카복실산의 활성 에스터, 아즈락톤, 환상 이미드싸이온, 아이소사이아네이트, 아이소싸이오사이아네이트, 이미데이트, 또는 알데하이드 등의 작용기로 수식된 PEG가 이용된다. 이들 PEG에 도입된 작용기가, 주로 알부민 친화성 펩티드 및 항hTfR 항체-hBDNF 융합 단백질 분자 내의 아미노기와 반응하는 것에 의해, PEG와 알부민 친화성 펩티드 및 항hTfR 항체-hBDNF 융합 단백질이 공유 결합한다. 이 때 이용되는 PEG의 분자량 및 형상에 특별히 한정은 없지만, 그 평균 분자량(MW)은, 바람직하게는 MW=500∼60000이며, 보다 바람직하게는 MW=500∼20000이다. 예를 들어, 평균 분자량이 약 300, 약 500, 약 1000, 약 2000, 약 4000, 약 10000, 약 20000 등인 PEG는, 비펩티드 링커로서 적합하게 사용할 수 있다.
예를 들어, 알부민 친화성 펩티드-PEG는, 알부민 친화성 펩티드와 알데하이드기 변성 PEG(ALD-PEG-ALD)를, 해당 알부민 친화성 펩티드에 대한 해당 변성 PEG의 몰비가 11, 12.5, 15, 110, 120 등이 되도록 혼합하고, 이것에 NaCNBH3 등의 환원제를 첨가하여 반응시키는 것에 의해 얻어진다. 그 다음에, 알부민 친화성 펩티드-PEG를, NaCNBH3 등의 환원제의 존재하에서, 항hTfR 항체-hBDNF 융합 단백질과 반응시키는 것에 의해, 알부민 친화성 펩티드-PEG-융합 단백질이 얻어진다. 반대로, 먼저 항hTfR 항체-hBDNF 융합 단백질과 ALD-PEG-ALD를 결합시켜 항hTfR 항체-hBDNF 융합 단백질-PEG를 제작하고, 그 다음에 항hTfR 항체-hBDNF 융합 단백질-PEG와 알부민 친화성 펩티드를 결합시키는 것에 의해서도, 알부민 친화성 펩티드-PEG-융합 단백질을 얻을 수 있다.
항hTfR 항체-hBDNF 융합 단백질을, 알부민 친화성 펩티드와 융합시킬 수도 있다. 이러한 융합 단백질(항hTfR 항체-hBDNF-알부민 친화성 펩티드)은, 항hTfR 항체-hBDNF 융합 단백질의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 cDNA의 3'말단측 또는 5'말단측에, 직접 또는 링커 서열을 코딩하는 DNA 단편을 개재시켜, 알부민 친화성 펩티드를 코딩하는 cDNA가 인프레임으로 배치되는 DNA 단편을, 포유동물 세포용 발현 벡터에 짜넣고, 이 발현 벡터를 도입한 포유동물 세포를 배양하는 것에 의해 얻을 수 있다. 알부민 친화성 펩티드를 코딩하는 DNA 단편을 중쇄(또는 중쇄와 hBDNF의 융합 단백질)와 결합시키는 경우에 있어서는, 항hTfR 항체를 구성하고 있는 경쇄와 hBDNF의 융합 단백질 경쇄(또는 경쇄)를 코딩하는 cDNA 단편을 짜넣은 포유동물 세포용 발현 벡터도 동일 호스트 세포에 아울러 도입되고, 또한 알부민 친화성 펩티드를 코딩하는 DNA 단편을 경쇄(또는 경쇄와 hBDNF의 융합 단백질)와 결합시키는 경우에 있어서는, 항hTfR 항체의 중쇄와 hBDNF의 융합 단백질(또는 중쇄)을 코딩하는 cDNA 단편을 짜넣은 포유동물 세포용의 발현 벡터도 동일 호스트 세포에 아울러 도입된다. 즉, 알부민 친화성 펩티드는, 항hTfR 항체-hBDNF 융합 단백질의 중쇄(중쇄와 hBDNF의 융합 단백질을 포함한다) 또는 경쇄(경쇄와 hBDNF의 융합 단백질을 포함한다)의 N말단측 또는 C말단측의 어느 것에 결합시켜도 되지만, hBDNF를 항hTfR 항체의 중쇄의 N말단측에 결합시키는 경우에 있어서는, 항hTfR 항체의 C말단측에 결합시키는 것이 바람직하고, 특히 중쇄의 C말단측에 결합시키는 것이 바람직하다. 예를 들어, 알부민 친화성 펩티드를 도입한 융합 단백질로서, 인간 BDNF의 C말단측에, 직접 또는 링커 서열을 개재시켜 항체의 중쇄가 결합하고, 또한, 해당 중쇄의 C말단측에 직접 또는 링커 서열을 개재시켜 알부민 친화성 펩티드가 결합한 것을, 일례로서 들 수 있다.
항hTfR 항체-hBDNF 융합 단백질을 알부민 친화성 펩티드와 융합시키는 경우, 직접 또는 링커 서열을 개재시켜 융합시킬 수 있다. 여기에서 링커 서열은, 바람직하게는 1∼50개의 아미노산으로부터 구성된다. 여기서, 아미노산의 개수는, 1∼17개, 1∼10개, 10∼40개, 20∼34개, 23∼31개, 25∼29개, 27개 등으로 적절히 조정된다. 이와 같은 링커 서열은, 그 아미노산 서열에 한정은 없지만, 바람직하게는, 글리신과 세린으로부터 구성되는 것이다. 예를 들어, 글리신 또는 세린의 어느 1개의 아미노산으로 이루어지는 것, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 3), 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 4), 아미노산 서열 Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(서열 번호 5), 또는 이들 아미노산 서열이 1∼10개, 혹은 2∼5개 연결하여 이루어지는, 50개 이하의 아미노산으로 이루어지는 서열, 2∼17개, 2∼10개, 10∼40개, 20∼34개, 23∼31개, 25∼29개, 또는 25개의 아미노산으로 이루어지는 서열 등을 포함하는 것을 들 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 3)가 3개 연속하여 이루어지는 합계 15개의 아미노산 서열을 포함하는 것은, 링커 서열로서 적합하게 이용할 수 있다.
알부민 친화성 펩티드를 도입한 항hTfR 항체-hBDNF 융합 단백질의 일례로서, 서열 번호 56으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 hBDNF의 프로체의 C말단측에, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser이 5회 반복되는 합계 25개의 아미노산으로 이루어지는 링커 서열을 개재시켜, 서열 번호 61로 나타나는 아미노산 서열의 제1번째로부터 제216번째에 대응하는 아미노산 서열(서열 번호 84)을 갖는 인간화 항hTfR 항체 3NFab 중쇄를 융합시키고, 추가로, 그 C말단측에, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser이 3회 반복되는 합계 15개의 아미노산으로 이루어지는 링커 서열을 개재시켜, 서열 번호 85로 나타나는 알부민 결합 도메인(ABD)을 융합시킨 융합 단백질이 있다.
알부민 친화성 펩티드를 도입한 항hTfR 항체-hBDNF 융합 단백질의 알부민과의 결합 친화성은, 실시예 7에 기재된 바이오레이어 간섭법에 의해 측정했을 때, 바람직하게는 1×10-7M 이하, 보다 바람직하게는 5×10-7M 이하, 더욱 바람직하게는 1×10-8M 이하, 더욱 보다 바람직하게는 1×10-9M 이하이다.
Fab 항체는, Fc 영역 또는 알부민 친화성 펩티드의 도입 이외의 방법으로도 혈중에서 안정화시킬 수 있다. 예를 들어, Fab 항체는, Fab 항체 자체, 또는 Fab 항체와 다른 단백질의 융합체를 PEG 수식시키는 것에 의해 안정화시킬 수 있다. 이러한 수법은, 단백질 의약의 분야에서 일반적으로 실시되고 있고, PEG화된 에리트로포이에틴, 인터페론 등이 의약품으로서 실용화되고 있다. 또한, Fab 항체는, 이것에 변이를 도입하는 것에 의해서도 안정화시킬 수 있다. 예를 들어, 경쇄의 N말단측으로부터 4번째의 메티오닌을 류신으로 치환하는 것에 의해 Fab 항체를 안정화시킬 수 있다. 단, 변이의 도입 방법은 이것으로 한정되지 않고, 중쇄에 변이를 도입해도 된다. 또한, Fab 항체의 안정화 방법은 이들의 것에 한정되지 않고, 주지된 수법은 모두 이용 가능하다.
항hTfR 항체를 구성하고 있는 「경쇄」의 N말단측에 BDNF를 결합시킨 타입의 융합 단백질은, 항인간 트랜스페린 수용체 항체가, 경쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열과, 중쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것이고, BDNF가, 경쇄의 N말단측에 결합한 것이다. 여기에서 항hTfR 항체의 경쇄와 BDNF는, 직접 결합해도 되고, 링커를 개재시켜 결합해도 된다.
항hTfR 항체를 구성하고 있는 「중쇄」의 N말단측에 BDNF를 결합시킨 타입의 융합 단백질은, 항인간 트랜스페린 수용체 항체가, 경쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열과, 중쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것이고, BDNF가, 중쇄의 N말단측에 결합한 것이다. 여기에서 항hTfR 항체의 중쇄와 BDNF는, 직접 결합해도 되고, 링커를 개재시켜 결합해도 된다.
항hTfR 항체를 구성하고 있는 「경쇄」의 C말단측에 BDNF를 결합시킨 타입의 융합 단백질은, 항인간 트랜스페린 수용체 항체가, 경쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열과, 중쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것이고, BDNF가, 경쇄의 C말단측에 결합한 것이다. 여기에서 항hTfR 항체의 경쇄와 BDNF는, 직접 결합해도 되고, 링커를 개재시켜 결합해도 된다.
항hTfR 항체를 구성하고 있는 「중쇄」의 C말단측에 BDNF를 결합시킨 타입의 융합 단백질은, 항인간 트랜스페린 수용체 항체가, 경쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열과, 중쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것이고, BDNF가, 중쇄의 C말단측에 결합한 것이다. 여기에서 항hTfR 항체의 중쇄와 BDNF는, 직접 결합해도 되고, 링커를 개재시켜 결합해도 된다.
이와 같은 항hTfR 항체와 BDNF의 융합 단백질은, 항hTfR 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 cDNA의 3'말단측 또는 5'말단측에, 직접 또는 링커 서열을 코딩하는 DNA 단편을 개재시켜, BDNF를 코딩하는 cDNA(서열 번호 50)가 인프레임으로 배치되는 DNA 단편을, 포유동물 세포용 발현 벡터에 짜넣고, 이 발현 벡터를 도입한 포유동물 세포를 배양하는 것에 의해 얻을 수 있다. BDNF를 코딩하는 DNA 단편을 중쇄와 결합시키는 경우에 있어서는, 항hTfR 항체를 구성하고 있는 경쇄를 코딩하는 cDNA 단편을 짜넣은 포유동물 세포용 발현 벡터도 동일 호스트 세포에 아울러 도입되고, 또한 BDNF를 코딩하는 DNA 단편을 경쇄와 결합시키는 경우에 있어서는, 항hTfR 항체의 중쇄를 코딩하는 cDNA 단편을 짜넣은 포유동물 세포용의 발현 벡터도 동일 호스트 세포에 아울러 도입된다.
여기에서, 포유동물 세포에는, 항hTfR 항체의 중쇄(또는 경쇄)의 C말단에 직접 또는 링커 서열을 개재시켜 BDNF를 결합하여 이루어지는 융합 단백질을 코딩하는 cDNA 단편을 짜넣은 포유동물 세포용 발현 벡터와, 항hTfR 항체의 경쇄(또는 중쇄)를 코딩하는 cDNA 단편을 짜넣은 포유동물 세포용 발현 벡터를, 동일 호스트 세포에 아울러 도입하는 것에 의해, 항hTfR 항체의 중쇄(또는 경쇄)의 C말단측에 BDNF가 결합한 융합 단백질과, 항hTfR 항체의 중쇄(또는 경쇄)로 이루어지는, 융합 단백질을 제작할 수 있다.
또한, 항hTfR 항체의 중쇄(또는 경쇄)의 N말단에 직접 또는 링커 서열을 개재시켜 BDNF를 결합하여 이루어지는 융합 단백질을 코딩하는 cDNA 단편을 짜넣은 포유동물 세포용 발현 벡터와, 항hTfR 항체의 경쇄(또는 중쇄)를 코딩하는 cDNA 단편을 짜넣은 포유동물 세포용 발현 벡터를, 동일 호스트 세포에 도입하는 것에 의해, 항hTfR 항체의 중쇄(또는 경쇄)의 N말단측에 BDNF가 결합하여 이루어지는 융합 단백질과, 항hTfR 항체의 경쇄(중쇄)로 이루어지는 융합 단백질을 제작할 수도 있다.
항hTfR 항체가 1본쇄 항체인 경우, 항hTfR 항체와 BDNF를 결합시켜 이루어지는 융합 단백질은, BDNF를 코딩하는 cDNA의 5'말단 또는 3'말단에, 직접 또는 링커 서열을 코딩하는 DNA 단편을 개재시켜, 1본쇄 항hTfR 항체를 코딩하는 cDNA를 연결한 DNA 단편을, 포유동물 세포, 효모 등의 진핵생물 또는 대장균 등의 원핵생물 세포용의 발현 벡터에 짜넣고, 이 발현 벡터를 도입한 그들 대응하는 세포 중에서 발현시키는 것에 의해, 얻을 수 있다.
항hTfR 항체가 Fab인 경우, 항hTfR 항체와 BDNF를 결합시킨 융합 단백질은, BDNF를 코딩하는 cDNA의 5'말단 또는 3'말단에 직접 또는 링커 서열을 코딩하는 DNA 단편을 개재시켜 당해 Fab의 중쇄와 경쇄의 어느 한쪽을 코딩하는 cDNA 단편을 연결하여 이루어지는 DNA 단편을 짜넣은 발현 벡터(포유동물 세포, 효모 등의 진핵생물 또는 대장균 등의 원핵생물 세포용)와, 당해 Fab 중쇄와 경쇄의 다른 쪽을 코딩하는 cDNA 단편을 짜넣은 발현 벡터를, 동일 호스트 세포에 도입하고, 세포 중에서 발현시키는 것에 의해, 얻을 수 있다.
항hTfR 항체와 BDNF의 사이에 링커 서열을 배치하는 경우, 링커 서열은, 바람직하게는 1∼50개의 아미노산으로부터 구성된다. 여기서, 아미노산의 개수는, 1∼17개, 1∼10개, 10∼40개, 20∼34개, 23∼31개, 25∼29개, 27개 등으로 적절히 조정된다. 그와 같은 링커 서열은, 이것에 의해 연결된 항hTfR 항체가 hTfR과 친화성을 유지하고, 또한 연결된 BDNF가, 생리적 조건하에서 그 생리 활성을 발휘할 수 있는 한, 그 아미노산 서열에 한정은 없지만, 바람직하게는, 글리신과 세린으로부터 구성되는 것이다. 예를 들어, 글리신 또는 세린의 어느 1개의 아미노산으로 이루어지는 것, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 3), 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 4), 아미노산 서열 Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(서열 번호 5), 또는 이들 아미노산 서열이 1∼10개, 혹은 2∼5개 연결하여 이루어지는, 50개 이하의 아미노산으로 이루어지는 서열, 2∼17개, 2∼10개, 10∼40개, 20∼34개, 23∼31개, 25∼29개, 또는 25개의 아미노산으로 이루어지는 서열 등을 포함하는 것을 들 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 3)가 5개 연속하여 이루어지는 합계 25개의 아미노산 서열을 포함하는 것은, 링커 서열로서 적합하게 이용할 수 있다.
항hTfR 항체와 BDNF의 융합 단백질에 있어서, 항hTfR 항체가 1본쇄 항체인 경우, 면역글로불린 경쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열과 면역글로불린 중쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열은, 일반적으로 링커 서열을 개재시켜 결합된다. 이 때, 항hTfR 항체의 hTfR에 대한 친화성이 유지되는 한, 면역글로불린 경쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열의 C말단측에 링커 서열이 결합하고, 추가로 그 C말단측에 면역글로불린 중쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열이 결합한 것이어도 되고, 또한 면역글로불린 중쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열의 C말단측에 링커 서열이 결합하고, 추가로 그 C말단측에 면역글로불린 경쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열이 결합한 것이어도 된다.
면역글로불린의 경쇄와 중쇄의 사이에 배치되는 링커 서열은, 바람직하게는 2∼50개, 보다 바람직하게는 8∼50개, 더욱 바람직하게는 10∼30개, 더욱 보다 바람직하게는 12∼18개 또는 15∼25개, 예를 들어 15개 혹은 25개의 아미노산으로부터 구성된다. 그와 같은 링커 서열은, 이것에 의해 양 쇄가 연결되어 이루어지는 항hTfR 항체가 hTfR과 친화성을 유지하고, 또한 당해 항체에 결합한 BDNF가, 생리적 조건하에서 그 생리 활성을 발휘할 수 있는 한, 아미노산 서열에 한정은 없지만, 바람직하게는, 글리신만 또는 글리신과 세린으로부터 구성되는 것이다. 예를 들어, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 3), 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 4), 아미노산 서열 Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(서열 번호 5), 또는 이들 아미노산 서열이 2∼10개, 혹은 2∼5개 연속하여 이루어지는 서열을 포함하는 것을 들 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린 중쇄의 가변 영역의 전 영역으로 이루어지는 아미노산 서열의 C말단측에 링커 서열을 개재시켜 면역글로불린 경쇄의 가변 영역을 결합시키는 경우, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 3)가 3개 연속하여 이루어지는 합계 15개의 아미노산을 포함하는 것이 링커 서열로서 적합하다.
항hTfR 항체와 BDNF의 융합 단백질의 구체적인 태양의 일례로서, 항hTfR 항체 중쇄의 C말단에 링커 서열로서 아미노산 서열 Gly-Ser을 개재시켜 인간 BDNF를 융합시켜 이루어지는, 서열 번호 52의 아미노산 서열을 갖는 것을 들 수 있다. 이 융합 단백질을 코딩하는 서열 번호 53의 염기 서열을 갖는 DNA 단편을 짜넣은 발현 벡터와, 서열 번호 23의 아미노산 서열을 갖는 항hTfR 항체 경쇄를 코딩하는 서열 번호 24의 염기 서열을 갖는 DNA 단편을 짜넣은 발현 벡터를 합해서 도입하여 형질 전환한 호스트 세포를 이용하는 것에 의해, 항hTfR 항체와 인간 BDNF의 융합 단백질을 제작할 수 있다.
항hTfR 항체가, 인간 이외의 동물의 것인 경우, 이것을 인간에게 투여했을 때에, 당해 항체에 대한 항원 항체 반응을 야기하여, 바람직하지 않은 부작용이 생길 우려가 높다. 인간 이외의 동물의 항체는, 인간화 항체로 하는 것에 의해, 그와 같은 항원성을 감소시킬 수 있어, 인간에게 투여했을 때의 항원 항체 반응에 기인하는 부작용의 발생을 억제할 수 있다. 또한, 원숭이를 이용한 실험에 의하면, 인간화 항체는, 마우스 항체와 비교하여, 혈중에서 보다 안정됨이 보고되어 있어, 치료 효과를 그만큼 장기간 지속시킬 수 있다고 생각된다. 항원 항체 반응에 기인하는 부작용의 발생은, 항hTfR 항체로서 인간 항체를 이용하는 것에 의해서도 억제할 수 있다.
항hTfR 항체가, 인간화 항체 또는 인간 항체인 경우에 대해, 이하에 더욱 상세하게 설명한다. 인간 항체의 경쇄에는, λ쇄와 κ쇄가 있다. 항hTfR 항체를 구성하는 경쇄는, λ쇄와 κ쇄의 어느 것이어도 된다. 또한, 인간의 중쇄에는, γ쇄, μ쇄, α쇄, σ쇄 및 ε쇄가 있고, 각각, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE에 대응하고 있다. 항hTfR 항체를 구성하는 중쇄는, γ쇄, μ쇄, α쇄, σ쇄 및 ε쇄의 어느 것이어도 되지만, 바람직하게는 γ쇄이다. 더욱이, 인간의 중쇄의 γ쇄에는, γ1쇄, γ2쇄, γ3쇄 및 γ4쇄가 있고, 각각, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4에 대응하고 있다. 항hTfR 항체를 구성하는 중쇄가 γ쇄인 경우, 그γ쇄는, γ1쇄, γ2쇄, γ3쇄 및 γ4쇄의 어느 것이어도 되지만, 바람직하게는, γ1쇄 또는 γ4쇄이다. 항hTfR 항체가, 인간화 항체 또는 인간 항체이며, 또한 IgG인 경우, 인간 항체의 경쇄는 λ쇄와 κ쇄의 어느 것이어도 되고, 인간 항체의 중쇄는, γ1쇄, γ2쇄, γ3쇄 및 γ4쇄의 어느 것이어도 되지만, 바람직하게는, γ1쇄 또는 γ4쇄이다. 예를 들어, 바람직한 항hTfR 항체의 하나의 태양으로서, 경쇄가 λ쇄이며 중쇄가 γ1쇄인 항hTfR 항체를 들 수 있다.
항hTfR 항체가 인간화 항체 또는 인간 항체인 경우, 항hTfR 항체와 BDNF는, 항hTfR 항체의 중쇄 또는 경쇄의 N말단(또는 C말단)에, 링커 서열을 개재시켜 또는 직접, BDNF의 C말단(또는 N말단)을 각각 펩티드 결합에 의해 결합시키는 것에 의해, 연결할 수 있다. BDNF를 항hTfR 항체의 중쇄의 N말단측(또는 C말단측)에 결합시키는 경우, 항hTfR 항체의 γ쇄, μ쇄, α쇄, σ쇄 또는 ε쇄의 N말단(또는 C말단)에, 링커 서열을 개재시켜 또는 직접, BDNF의 C말단(또는 N말단)이 펩티드 결합에 의해 각각 결합된다. 항hTfR 항체의 경쇄의 N말단측(또는 C말단측)에 BDNF를 결합시키는 경우, 항hTfR 항체의 λ쇄와 κ쇄의 N말단(또는 C말단)에, 링커 서열을 개재시켜 또는 직접, BDNF의 C말단(또는 N말단)이 펩티드 결합에 의해 각각 결합된다. 단, 항hTfR 항체가, Fc 영역을 결실한 것인 Fab 영역으로 이루어지는 것 또는 Fab 영역과 힌지부의 전부 혹은 일부로 이루어지는 것(Fab, F(ab') 및 F(ab')2)인 경우, BDNF는, Fab, F(ab')2 및 F(ab')를 구성하는 중쇄 또는 경쇄의 N말단(또는 C말단)에, 링커 서열을 개재시켜 또는 직접, 그 C말단 또는 N말단을 펩티드 결합에 의해 각각 결합시킬 수 있다.
항hTfR 항체(인간화 항체 또는 인간 항체이다)의 「경쇄」의 C말단측 또는 N말단측에 BDNF를 결합시킨 타입의 융합 단백질에 있어서, 항hTfR 항체는, 경쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열과, 중쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것이고, BDNF가, 이 경쇄의 C말단측 또는 N말단측에 결합한 것이다. 여기에서 항hTfR 항체의 경쇄와 BDNF는, 직접 결합해도 되고, 링커를 개재시켜 결합해도 된다.
항hTfR 항체(인간화 항체 또는 인간 항체이다)의 「중쇄」의 C말단측 또는 N말단측에 BDNF를 결합시킨 타입의 융합 단백질에 있어서, 항인간 트랜스페린 수용체 항체는, 경쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열과, 중쇄의 가변 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것이고, BDNF가, 이 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에 결합한 것이다. 여기에서 항hTfR 항체의 중쇄와 BDNF는, 직접 결합해도 되고, 링커를 개재시켜 결합해도 된다.
항hTfR 항체와 BDNF의 사이에 링커 서열을 배치하는 경우, 링커 서열은, 바람직하게는 1∼50개, 보다 바람직하게는 10∼40개, 더욱 바람직하게는 20∼34개, 예를 들어 27개의 아미노산으로부터 구성된다. 링커 서열을 구성하는 아미노산의 개수는, 1∼17개, 1∼10개, 10∼40개, 20∼34개, 23∼31개, 25∼29개, 27개 등으로 적절히 조정된다. 그와 같은 링커 서열은, 이것에 의해 연결된 항hTfR 항체가 hTfR에 대한 친화성을 유지하고, 연결된 BDNF가, 생리적 조건하에서 그 생리 활성을 발휘할 수 있는 한, 아미노산 서열에 한정은 없지만, 바람직하게는, 글리신과 세린으로부터 구성되는 것이다. 예를 들어, 글리신 또는 세린의 어느 1개의 아미노산으로 이루어지는 것, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 3), 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 4), 아미노산 서열 Ser-Gly-Gly-Gly-Gly(서열 번호 5), 또는 이들 아미노산 서열이 1∼10개, 혹은 2∼5개 연속하여 이루어지는, 50개 이하의 아미노산으로 이루어지는 서열, 2∼17개, 2∼10개, 10∼40개, 20∼34개, 23∼31개, 25∼29개, 또는 25개의 아미노산으로 이루어지는 서열 등을 포함하는 것을 들 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 3)가 5개 연속하여 이루어지는 합계 25개의 아미노산 서열을 포함하는 것은, 링커 서열로서 적합하게 이용할 수 있다.
항hTfR 항체의 hTfR에 대한 특이적 친화성은, 주로 항hTfR 항체의 중쇄 및 경쇄의 CDR의 아미노산 서열에 의존한다. 그들 CDR의 아미노산 서열은, 항hTfR 항체가 hTfR에 더하여 원숭이 hTfR에 대한 특이적인 친화성을 갖는 것인 한, 특별히 제한은 없다.
본 발명에 있어서, 항hTfR 항체가 인간화 항체 또는 인간 항체인 경우에 있어서, hTfR에 대해서 상대적으로 높은 친화성을 갖고 또한 원숭이 TfR에 대해서도 친화성을 갖는 항체는, 특히, 실시예 7에 기재된 방법에 의해 측정했을 때, 인간 및 원숭이의 TfR과의 해리 상수가 다음의 것이다:
(a) hTfR과의 해리 상수: 바람직하게는 1×10-10M 이하, 보다 바람직하게는 2.5×10-11M 이하, 더욱 바람직하게는 5×10-12M 이하, 더욱 보다 바람직하게는 1×10-12M 이하
(b) 원숭이 TfR과의 해리 상수: 바람직하게는 1×10-9M 이하, 보다 바람직하게는 5×10-10M 이하, 더욱 바람직하게는 1×10-10M 이하, 예를 들어 7.5×10-11M 이하.
예를 들어, hTfR 및 원숭이 TfR과의 해리 상수가, 각각, 1×10-10M 이하와 1×10-9M 이하, 1×10-11M 이하와 5×10-10M 이하, 5×10-12M 이하와 1×10-10M 이하, 5×10-12M 이하와 7.5×10-11M 이하, 1×10-12M 이하와 1×10-10M 이하, 1×10-12M 이하와 7.5×10-11M 이하인 것을 들 수 있다. 여기에 있어서, 인간의 TfR과의 해리 상수에 특단의 명확한 하한은 없지만, 예를 들어, 5×10-13M, 1×10-13M 등으로 할 수 있다. 또한, 원숭이의 TfR과의 해리 상수에도 특단의 명확한 하한은 없지만, 예를 들어, 5×10-11M, 1×10-11M, 1×10-12M 등으로 할 수 있다. 항체가 1본쇄 항체여도 마찬가지이다.
BDNF와 융합시켜야 할, hTfR에 친화성을 갖는 항체의 바람직한 실시형태로서, 항체의 중쇄의 CDR가 이하에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 것을 예시할 수 있다. 즉:
CDR1이 서열 번호 66 또는 서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, CDR2가 서열 번호 13 또는 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한 CDR3이 서열 번호 15 또는 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것으로.
hTfR에 친화성을 갖는 항체의 보다 구체적인 실시형태로서, 항체의 중쇄의 CDR가 이하에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 것을 예시할 수 있다. 즉:
CDR1이 서열 번호 66의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, CDR2가 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 및 CDR3이 서열 번호 15에 기재된 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것.
상기의 바람직한 실시형태에 있어서, 항체의 중쇄의 프레임워크 영역 3의 아미노산 서열로서 적합한 것으로, 서열 번호 68의 아미노산 서열을 갖는 것을 들 수 있다.
hTfR에 친화성을 갖는 항체의 바람직한 경쇄와 중쇄의 조합으로서는, CDR이 이하에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 것을 예시할 수 있다. 즉:
CDR1이 서열 번호 6 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, CDR2가 서열 번호 8 혹은 서열 번호 9의 아미노산 서열, 또는 아미노산 서열 Lys-Val-Ser, 및 CDR3으로서 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인 경쇄와, CDR1이 서열 번호 66 또는 서열 번호 67의 아미노산 서열, CDR2가 서열 번호 13 또는 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 및 CDR3으로서 서열 번호 15 또는 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인 중쇄의 조합.
hTfR에 친화성을 갖는 항체의 경쇄와 중쇄의 조합의 구체적 태양으로서는, CDR가 이하에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 것을 예시할 수 있다. 즉:
CDR1이 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, CDR2가 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 및 CDR3이 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인 경쇄와, CDR1이 서열 번호 66의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, CDR2가 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 및 CDR3이 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인 중쇄의 조합.
hTfR에 친화성을 갖는 인간화 항체의 바람직한 실시형태로서는, 이하에 나타내는 아미노산 서열을 갖는 것을 예시할 수 있다. 즉:
항hTfR 항체로서, 경쇄의 가변 영역이, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 및 서열 번호 22로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 중쇄의 가변 영역이, 서열 번호 69로 나타나는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 항hTfR 항체.
서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21, 및 서열 번호 22로 나타나는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은, CDR1이 서열 번호 6 또는 7, CDR2가 서열 번호 8 또는 서열 번호 9, 및 CDR3이 서열 번호 10의 아미노산 서열을, 각각 포함하는 것이다. 단, 서열 번호 17∼22의 아미노산 서열에 있어서, CDR의 아미노산 서열은 이들로 한정되는 것은 아니고, 이들 CDR의 아미노산 서열을 포함하는 영역, 이들 CDR의 아미노산 서열의 임의의 연속한 3개 이상의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열도 CDR로 할 수 있다.
서열 번호 69로 나타나는 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은, CDR1이 서열 번호 66 또는 서열 번호 67, CDR2가 서열 번호 13 또는 서열 번호 14, 및 CDR3이 서열 번호 15 또는 서열 번호 16의 아미노산 서열을, 각각 포함하는 것이다. 단, 서열 번호 69의 아미노산 서열에 있어서, CDR의 아미노산 서열은 이들로 한정되는 것은 아니고, 이들 CDR의 아미노산 서열을 포함하는 영역, 이들 CDR의 아미노산 서열의 임의의 연속한 3개 이상의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열도 CDR로 할 수 있다.
hTfR에 친화성을 갖는 인간화 항체의 보다 구체적인 실시형태의 예로서는,
(1a) 경쇄의 가변 영역이 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄의 가변 영역이 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 것,
(1b) 경쇄의 가변 영역이 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄의 가변 영역이 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 것,
(1c) 경쇄의 가변 영역이 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄의 가변 영역이 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 것, 및
(1d) 경쇄의 가변 영역이 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄의 가변 영역이 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 것을 들 수 있다.
hTfR에 친화성을 갖는 인간화 항체의 보다 구체적인 실시형태의 예로서는,
(2a) 경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄가 서열 번호 70 또는 72의 아미노산 서열을 포함하는 것,
(2b) 경쇄가 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄가 서열 번호 70 또는 72의 아미노산 서열을 포함하는 것,
(2c) 경쇄가 서열 번호 27의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄가 서열 번호 70 또는 72의 아미노산 서열을 포함하는 것,
(2d) 경쇄가 서열 번호 29의 아미노산 서열을 포함하고 또한 중쇄가 서열 번호 70 또는 72의 아미노산 서열을 포함하는 것을 들 수 있다.
hTfR에 친화성을 갖는 Fab인 인간화 항체의 보다 구체적인 실시형태의 예로서는,
(3a) 경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고 또한 Fab 중쇄가 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 것,
(3b) 경쇄가 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함하고 또한 Fab 중쇄가 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 것,
(3c) 경쇄가 서열 번호 27의 아미노산 서열을 포함하고 또한 Fab 중쇄가 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 것,
(3d) 경쇄가 서열 번호 29의 아미노산 서열을 포함하고 또한 Fab 중쇄가 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하는 것을 들 수 있다.
항hTfR 항체가 Fab인 경우에 있어서, 다른 Fc 영역을 융합 단백질에 도입한 것의 구체적인 실시형태의 예로서는,
(4a) 경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고 또한 Fc 영역을 도입한 Fab 중쇄가 서열 번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 것,
(4b) 경쇄가 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함하고 또한 Fc 영역을 도입한 Fab 중쇄가 서열 번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 것,
(4c) 경쇄가 서열 번호 27의 아미노산 서열을 포함하고 또한 Fc 영역을 도입한 Fab 중쇄가 서열 번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 것,
(4d) 경쇄가 서열 번호 29의 아미노산 서열을 포함하고 또한 Fc 영역을 도입한 Fab 중쇄가 서열 번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 것을 들 수 있다.
한편, 서열 번호 81로 나타나는 아미노산 서열은, 인간화 항hTfR 항체 3N의 Fab 중쇄의 아미노산 서열(아미노산 서열 61)의 N말단측에, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 3)가 5개 연속하여 이루어지는 합계 25개의 아미노산 서열을 포함하는 링커 서열을 개재시켜, 서열 번호 75로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간 IgG Fc 영역을 결합시킨 것이다.
상기 (4a)∼(4d)에 있어서, 예를 들어, 인간 BDNF의 C말단측에 직접 또는 링커 서열을 개재시켜 인간 IgG Fc 영역이 결합되고, 추가로, 해당 인간 IgG Fc 영역의 C말단측에 직접 또는 링커 서열을 개재시켜 항인간 트랜스페린 수용체 항체가 결합된다.
인간 IgG Fc 영역의 바람직한 일 실시형태로서, 서열 번호 75의 아미노산 서열을 갖는 것을 들 수 있다. 또한, 인간 IgG Fc 영역을 도입한 융합 단백질로서, BDNF의 C말단측에 Fc 영역, 그 C말단측에 항hTfR 항체의 중쇄 Fab가, 각각 링커 서열을 개재시켜 결합한 서열 번호 74의 아미노산 서열을 갖는 것을 일례로서 들 수 있다.
항hTfR 항체가 Fab인 경우에 있어서, 알부민 친화성 펩티드를 융합 단백질에 도입한 것의 구체적인 실시형태의 예로서는,
알부민 친화성 펩티드가 서열 번호 85로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 알부민 결합 도메인이며,
(5a) 경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고, 또한 알부민 친화성 펩티드를 도입한 Fab 중쇄가 서열 번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 것,
(5b) 경쇄가 서열 번호 25의 아미노산 서열을 포함하고, 또한 알부민 친화성 펩티드를 도입한 Fab 중쇄가 서열 번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 것,
(5c) 경쇄가 서열 번호 27의 아미노산 서열을 포함하고, 또한 알부민 친화성 펩티드를 도입한 Fab 중쇄가 서열 번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 것,
(5d) 경쇄가 서열 번호 29의 아미노산 서열을 포함하고, 또한 알부민 친화성 펩티드를 도입한 Fab 중쇄가 서열 번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 것을 들 수 있다.
한편, 서열 번호 89로 나타나는 아미노산 서열은, 인간화 항hTfR 항체 3N의 Fab 중쇄의 아미노산 서열(아미노산 서열 61)의 C말단측에, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 3)가 3개 연속하여 이루어지는 합계 15개의 아미노산 서열을 포함하는 링커 서열을 개재시켜, 서열 번호 85로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 알부민 친화성 펩티드를 결합시킨 것이다.
상기 (5a)∼(5d)에 있어서, 예를 들어, 인간 BDNF의 C말단측에 직접 또는 링커 서열을 개재시켜 항인간 트랜스페린 수용체 항체가 결합되고, 추가로, 해당 항인간 트랜스페린 수용체 항체의 C말단측에 직접 또는 링커 서열을 개재시켜 알부민 친화성 펩티드가 결합된다.
알부민 친화성 펩티드의 바람직한 일 실시형태로서, 서열 번호 85의 아미노산 서열을 갖는 것을 들 수 있다. 또한, 알부민 친화성 펩티드를 도입한 융합 단백질로서, 인간 프로BDNF 또는 인간 BDNF의 C말단측에 Fab 중쇄, 그 C말단측에 알부민 친화성 펩티드가, 각각 직접 또는 링커 서열을 개재시켜 결합한 서열 번호 87 또는 서열 번호 88의 아미노산 서열을 갖는 것을 일례로서 들 수 있다.
hTfR에 친화성을 갖는 인간화 항체의 바람직한 실시형태를 상기와 같이 예시했다. 이들 항hTfR 항체의 경쇄 및 중쇄는, 그 가변 영역의 아미노산 서열에, 항hTfR 항체와 hTfR의 친화성을 원하는 것으로 조정 등을 할 목적으로, 적절히, 치환, 결실, 부가 등의 변이를 가할 수 있다. 또한, hBDNF의 기능 등을 원하는 것으로 조정할 목적으로, hBDNF에 적절히, 치환, 결실, 부가 등의 변이를 가할 수도 있다.
경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하는 경우, 치환하는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개, 더욱더 바람직하게는 1∼2개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다.
경쇄의 가변 영역에 아미노산을 부가하는 경우, 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 중 혹은 N말단측 또는 C말단측에, 바람직하게는 1∼10개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개의 아미노산이 부가된다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열은, 원래의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 바람직하게는, 95% 이상의 상동성을 나타낸다.
특히, 경쇄의 각 CDR 또는 각 프레임워크 영역의 각각의 아미노산 서열 중의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하는 경우, 치환하는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼5개이고, 보다 바람직하게는 1∼3개이며, 더욱 바람직하게는 1∼2개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1개이다. 각 CDR 또는 각 프레임워크 영역의 각각의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼5개이고, 보다 바람직하게는 1∼3개이며, 더욱 바람직하게는 1∼2개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다.
경쇄의 각 CDR 또는 각 프레임워크 영역의 각각의 아미노산 서열 중에 아미노산을 부가시키는 경우, 당해 아미노산 서열 중 혹은 N말단측 또는 C말단측에, 바람직하게는 1∼5개, 보다 바람직하게는 1∼3개, 더욱 바람직하게는 1∼2개, 더욱 보다 바람직하게는 1개의 아미노산이 부가된다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 각 CDR 또는 각 프레임워크 영역의 각각의 아미노산 서열은, 원래의 각 CDR의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 바람직하게는, 95% 이상의 상동성을 나타낸다.
중쇄의 가변 영역인 서열 번호 69로 나타나는 아미노산 서열의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 경우, 치환시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼10개이고, 보다 바람직하게는 1∼5개이며, 더욱 바람직하게는 1∼3개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다.
중쇄의 가변 영역인 서열 번호 69로 나타나는 아미노산 서열에 아미노산을 부가시키는 경우, 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 중 혹은 N말단측 또는 C말단측에, 바람직하게는 1∼10개, 보다 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1∼3개, 더욱 보다 바람직하게는 1∼2개 아미노산이 부가된다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열은, 원래의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 바람직하게는, 95% 이상의 상동성을 나타낸다.
특히, 서열 번호 69로 나타나는 아미노산 서열 중의, 각 CDR 또는 각 프레임워크 영역의 각각의 아미노산 서열 중의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 경우, 치환시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼5개이고, 보다 바람직하게는 1∼3개이며, 더욱 바람직하게는 1∼2개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1개이다. 각 CDR의 각각의 아미노산 서열 중의 아미노산을 결실시키는 경우, 결실시키는 아미노산의 개수는, 바람직하게는 1∼5개이고, 보다 바람직하게는 1∼3개이며, 더욱 바람직하게는 1∼2개이고, 더욱 보다 바람직하게는 1개이다. 또한, 이들 아미노산의 치환과 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다.
서열 번호 69로 나타나는 아미노산 서열 중의, 각 CDR 또는 각 프레임워크 영역의 각각의 아미노산 서열 중에 아미노산을 부가시키는 경우, 당해 아미노산 서열 중 혹은 N말단측 또는 C말단측에, 바람직하게는 1∼5개, 보다 바람직하게는 1∼3개, 더욱 바람직하게는 1∼2개, 더욱 보다 바람직하게는 1개의 아미노산이 부가된다. 이들 아미노산의 부가, 치환 및 결실을 조합한 변이를 가할 수도 있다. 변이를 가한 각 CDR의 각각의 아미노산 서열은, 원래의 각 CDR의 아미노산 서열과 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖고, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내고, 더욱 바람직하게는, 95% 이상의 상동성을 나타낸다.
한편, 상기와 같이 항hTfR 항체의 중쇄의 가변 영역인 서열 번호 69로 나타나는 아미노산 서열에, 치환, 결실, 부가 등의 변이를 가하는 경우에 있어서, 바탕이 되는 CDR1의 N말단측으로부터 5번째의 아미노산인 메티오닌과, 프레임워크 영역 3의 N말단측으로부터 17번째의 아미노산인 류신은, 변이 전과 동 위치에 보존된다. 또한, 중쇄의 CDR1 및 프레임워크 영역 3의 아미노산 서열은 보존되는 것이 바람직하다.
상기의 항hTfR 항체의 경쇄의 가변 영역에 대한 변이와, 상기의 항hTfR 항체의 중쇄의 가변 영역에 대한 변이를 조합하여, 항hTfR 항체의 경쇄와 중쇄의 가변 영역의 양방에 변이를 가할 수도 있다.
상기의 항hTfR 항체의 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열 중의 아미노산의 다른 아미노산에 의한 치환으로서는, 예를 들어, 방향족 아미노산(Phe, Trp, Tyr), 지방족 아미노산(Ala, Leu, Ile, Val), 극성 아미노산(Gln, Asn), 염기성 아미노산(Lys, Arg, His), 산성 아미노산(Glu, Asp), 수산기를 갖는 아미노산(Ser, Thr) 등의 동일 그룹으로 분류되는 아미노산간의 치환을 들 수 있다. 이와 같은 유사 아미노산에 의한 치환은, 단백질의 표현형에 변화를 가져오지 않을(즉, 보존적 아미노산 치환일) 것이 예측된다. 단, 본 발명자가 먼저 발견하여 본원 발명과 동종의 효과를 가짐을 확인하고 있는 항체 번호 3(본원 출원 시점에 있어서 미공개)의 hTfR의 프레임워크 영역 3의 아미노산 서열인 서열 번호 83은, 그 제17번째가 Trp이며, 이에 대해 본원 발명에 있어서의 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄의 프레임워크 영역 3은 서열 번호 68의 아미노산 서열을 갖고, 그 N말단측으로부터 제17번째가 Leu로 치환된 것이다. 또한, CDR1의 아미노산 서열에 있어서는, 서열 번호 12의 제5번째의 Thr이, 서열 번호 66으로 나타나듯이 Met로 치환된 것이다. Trp와 Leu는 상기의 유사 관계에는 없고, 그리고 Thr와 Met도 상기의 유사 관계에는 없다. 그런데 후술하듯이, 당해 치환을 포함하는 항체 번호 3N은, 예상외로도, 항체 번호 3과 효과의 점에서 동종이며, 게다가 한층 우수한 효과를 나타낸다.
한편, 항hTfR 항체 또는 hBDNF에 변이를 가하여 C말단 또는 N말단에 아미노산을 부가했을 경우에 있어서, 그 부가한 아미노산이, 항hTfR 항체를 BDNF와 융합시켰을 때에 항hTfR 항체와 BDNF의 사이에 위치하게 되었을 경우, 당해 부가한 아미노산은, 링커의 일부를 구성한다.
(1) 융합 단백질의 제조 방법
본 발명의 융합 단백질은, 후술하는 실시예에 기재된 방법 또는 본 분야에서 주지된 방법에 의해 제조할 수 있다.
예를 들어, 본 명세서의 실시예 16 및 17에 기재한 바와 같이 취득한 항인간 트랜스페린 항체의 중쇄의 N말단에, 직접 또는 링커(예를 들어, 서열 번호 3이 5회 반복되는 25개의 아미노산으로 이루어지는 것)를 개재시켜, BDNF의 C말단을 융합시킨 것인 융합 단백질을 코딩하는 DNA를 갖는 발현용 벡터와, 당해 항체의 경쇄를 코딩하는 DNA를 갖는 동식물 세포 발현용 벡터를 각각 구축하고, 적당한 호스트 세포에 아울러 도입하는 것에 의해, 본 발명의 융합 단백질을 산생하는 세포 혹은 트랜스제닉 동식물을 얻을 수 있다. 혹은, 취득한 항인간 트랜스페린 항체의 경쇄의 N말단에, 직접 또는 링커(예를 들어, 서열 번호 3이 5회 반복되는 25개의 아미노산으로 이루어지는 것)를 개재시켜 BDNF의 C말단을 융합시킨 것인 융합 단백질을 코딩하는 DNA를 갖는 발현용 벡터와, 당해 항체의 중쇄를 코딩하는 DNA를 갖는 발현용 벡터를 각각 구축하고, 적당한 호스트 세포에 아울러 도입하는 것에 의해, 본 발명의 융합 단백질을 산생하는 세포 혹은 트랜스제닉 동식물을 얻을 수 있다.
상기와 같이 구축한 융합 단백질 유전자는, 공지된 방법에 의해 발현시켜, 취득할 수 있다. 융합 단백질의 발현량을 최대화하기 위해, 융합 단백질 유전자의 염기 서열은, 융합 단백질의 발현에 사용되는 세포 또는 동물종의 코돈 사용 빈도에 맞추어, 최적화해도 된다. 포유류 세포의 경우, 상용되는 유용한 프로모터, 발현되는 항체 유전자, 그 3'측 하류에 폴리 A 시그널을 기능적으로 결합시킨 DNA 또는 그것을 포함하는 벡터에 의해 발현시킬 수 있다. 예를 들어 프로모터/인핸서로서는, 인간 사이토메갈로바이러스 전기 프로모터/인핸서(human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer)를 들 수 있다.
또한, 그 외에 본 발명으로 사용되는 항체 발현에 사용할 수 있는 프로모터/인핸서로서, 레트로바이러스, 폴리오마바이러스, 아데노바이러스, 시미안바이러스 40(SV40) 등의 바이러스 프로모터/인핸서나 인간 엘롱게이션 팩터 1α(hEF1α) 등의 포유류 세포 유래의 프로모터/인핸서를 이용하면 된다.
예를 들어, SV40 프로모터/인핸서를 사용하는 경우, Mulligan 등의 방법(Mulligan, R. C. et al., Nature (1979) 277, 108-114), 또한, hEF1α 프로모터/인핸서를 사용하는 경우, Mizushima 등의 방법(Mizushima, S. and Nagata, S. Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322)에 따르면, 용이하게 실시할 수 있다.
대장균의 경우, 상용되는 유용한 프로모터, 항체 분비를 위한 시그널 서열, 발현시켜야 할 항체 유전자를 기능적으로 결합시켜 발현시킬 수 있다. 예를 들어 프로모터로서는, lacZ 프로모터, araB 프로모터를 들 수 있다. lacZ 프로모터를 사용하는 경우, Ward 등의 방법(Ward, E. S. et al., Nature (1989) 341, 544-546; Ward, E. S. et al., FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), araB 프로모터를 사용하는 경우, Better 등의 방법(Better, M. et al., Science (1988) 240, 1041-1043)에 따르면 된다.
항체 분비를 위한 시그널 서열로서는, 대장균의 페리플라즘에 산생시키는 경우, pelB 시그널 서열(Lei, S. P. et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383)을 사용하면 된다. (예를 들어, 국제 공개 제96/30394호를 참조).
복제 기원으로서는, SV40, 폴리오마바이러스, 아데노바이러스, 소 파필로마바이러스(BPV) 등의 유래의 것을 이용할 수 있고, 더욱이, 호스트 세포계에서 유전자 카피수 증폭을 위해, 발현 벡터는 선택 마커로서, 아미노글리코사이드 포스포트랜스페라제(APH) 유전자, 티미딘 키나제(TK) 유전자, 대장균 잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스페라제(Ecogpt) 유전자, 다이하이드로엽산 환원 효소(dhfr) 유전자 등을 포함할 수 있다.
진핵세포를 사용하는 경우, 동물 세포, 식물 세포, 또는 진균류 세포를 이용하는 산생계가 있다. 동물 세포로서는, (1) 포유류 세포, 예를 들어, CHO, HEK293, COS, 미엘로마, BHK(baby hamster kidney), HeLa, Vero 등, (2) 양서류 세포, 예를 들어, 아프리카발톱개구리 난모세포, 또는 (3) 곤충 세포, 예를 들어, sf9, sf21, Tn5 등이 알려져 있다. 식물 세포로서는, 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 유래의 세포가 알려져 있고, 이것을 캘러스 배양하면 된다. 진균류 세포로서는, 효모, 예를 들어, 사카로미세스(Saccharomyces)속, 예를 들어 사카로미세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 사상균, 예를 들어 아스페르길루스속(Aspergillus)속, 예를 들어 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger) 등이 알려져 있다.
원핵세포를 사용하는 경우, 세균 세포를 이용하는 산생계가 있다. 세균 세포로서는, 대장균(E. coli), 고초균이 알려져 있다.
이들 세포에, 목적으로 하는 항체 유전자를 형질 전환에 의해 도입하고, 형질 전환된 세포를 in vitro로 배양하는 것에 의해 항체가 얻어진다. 배양은, 공지된 방법에 따라 행한다. 예를 들어, 배양액으로서, DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM를 사용할 수 있고, 소 태아 혈청(FCS) 등의 혈청보액을 병용할 수도 있다. 또한, 항체 유전자를 도입한 세포를 동물의 복강 등으로 옮기는 것에 의해, in vivo로 항체를 산생해도 된다.
in vivo의 산생계로서는, 동물을 사용하는 산생계나 식물을 사용하는 산생계를 들 수 있다. 동물을 사용하는 경우, 포유류 동물, 곤충을 이용하는 산생계 등이 있다.
포유류 동물로서는, 염소, 돼지, 양, 마우스, 소 등을 이용할 수 있다(Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). 또한, 곤충으로서는, 누에를 이용할 수 있다. 식물을 사용하는 경우, 예를 들어 담배를 이용할 수 있다.
이들 동물 또는 식물에 융합 단백질 유전자를 도입하고, 동물 또는 식물의 체내에서 융합 단백질을 산생시켜, 회수한다. 예를 들어, 융합 단백질 유전자를 염소 β-카제인과 같은 유즙 중에 고유하게 산생되는 단백질을 코딩하는 유전자의 도중에 삽입하여 융합 유전자로서 조제한다. 항체 유전자가 삽입된 융합 유전자를 포함하는 DNA 단편을 염소의 배(胚)에 주입하고, 이 배를 암컷 염소에게 도입한다. 배를 수용한 염소로부터 태어나는 트랜스제닉 염소 또는 그 자손이 산생하는 유즙으로부터 원하는 융합 단백질을 얻는다. 트랜스제닉 염소로부터 산생되는 원하는 융합 단백질을 포함하는 유즙량을 증가시키기 위해서, 적절히 호르몬을 트랜스제닉 염소에게 사용해도 된다(Ebert, K. M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).
또한, 누에를 이용하는 경우, 목적하는 융합 단백질 유전자를 삽입한 바큐로바이러스를 누에에게 감염시키고, 이 누에의 체액으로부터 원하는 항체를 얻는다(Maeda, S. et al., Nature (1985) 315, 592-594). 더욱이, 담배를 이용하는 경우, 목적하는 융합 단백질 유전자를 식물 발현용 벡터, 예를 들어 pMON530에 삽입하고, 이 벡터를 Agrobacterium tumefaciens와 같은 박테리아에 도입한다. 이 박테리아를 담배, 예를 들어 Nicotiana tabacum에 감염시키고, 본 담배의 잎으로부터 원하는 융합 단백질을 얻는다(Julian, K. -C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).
상기와 같이 산생, 발현된 융합 단백질은, 세포 내외, 호스트 세포로부터 분리하여 균일할 때까지 정제할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 융합 단백질의 분리, 정제는 어피니티 크로마토그래피에 의해 행할 수 있다. 어피니티 크로마토그래피에 이용하는 컬럼으로서는, 예를 들어, 프로테인 A 컬럼, 프로테인 G 컬럼, 프로테인 L 컬럼을 들 수 있다. 프로테인 A 컬럼에 이용하는 담체로서, 예를 들어, Hyper D, POROS, Sepharose F. F. 등을 들 수 있다. 그 외, 통상의 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제 방법을 사용하면 되고, 전혀 한정되는 것은 아니다. 필요에 따라서, 상기 어피니티 크로마토그래피 이외의 크로마토그래피, 여과, 한외 여과, 염석, 투석 등을 조합하는 것에 의해, 본 발명에 사용되는 항체를 분리, 정제 할 수도 있다. 크로마토그래피로서는, 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과 등을 들 수 있다. 이들 크로마토그래피는 HPLC(High performance liquid chromatography)에 적용할 수 있다. 또한, 역상 HPLC(reverse phase HPLC)를 이용해도 된다.
BDNF는, 그 호모 2량체가 표적 세포 표면 상에 있는 BDNF 수용체(TrkB)에 특이적으로 결합하여, 중추 및 말초신경계의 세포의 분화, 기능 유지, 시냅스 형성, 및 손상 시의 재생 및 수복 등에 중요한 역할을 한다(비특허문헌 1, 비특허문헌 2). 이와 같은 작용으로부터, BDNF는, 중추 및 말초의 신경에 장애를 갖는 질환의 치료에 널리 응용 가능한 단백질로서 주목받고 있다.
또한, 헌팅턴병, 파킨슨병, 알츠하이머병 등, 여러 가지 신경계의 질환에 있어서 BDNF의 발현 저하나 양의 저하가 보고되어 있고(Nuerosci. Lett. (1999) 270: 45-48), 침투압 펌프 등을 이용하고 이들 질환 모델 동물의 뇌내 또는 수강내에 BDNF를 지속적으로 주입하면 선조체의 신경세포 죽음의 억제, 운동장애의 개선, 기억능력의 개선 등의 효과를 나타냄이 알려져 있다(J. Nuerosci. (2004) 24: 7727-7739, Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1992) 89: 11347-11351, Nat. Med. (2009) 15: 331-337).
더욱이, BDNF는 치아의 관련 세포나 혈관 내피 세포의 증식, 분화 촉진, 섭식 조절, 당대사 등, 다양한 작용을 가짐도 알려져 있다(Tissue Eng. (2005) 11: 1618-629, 비만 연구 (2009) 15: 97-99).
이러하므로, BDNF는, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 등의 신경 변성 질환, 근위축성 측책경화증 등의 척수 변성 질환, 이 외, 당뇨병성 신경 장애, 뇌허혈성 질환, Rett 증후군 등의 발달 장애, 통합 실조증, 울병 등, 다양한 질환의 치료제로서의 개발이 기대되고 있다(비특허문헌 3, 비특허문헌 4, 비특허문헌 5, 비특허문헌 6, 비특허문헌 7, 비특허문헌 8, WO91/03568).
BDNF는 혈액뇌관문(BBB; Blood-Brain Barrier)을 통과할 수 없지만, 본 발명의 융합 단백질(hBDNF-항hTfR 항체 융합 단백질)은 BBB를 통과하는 것이 가능하기 때문에, 말초 투여한 본 발명의 융합 단백질이 뇌내로 이행하여, BDNF가 본래 갖는 효과를 발휘할 수 있다. 이와 같은 BDNF의 기능은, 이하와 같은 방법으로 확인할 수 있다.
(2) BDNF의 기능의 평가 방법
BDNF의 기능은, BDNF 수용체(TrkB)에 대한 결합 친화성(Eur J Neurosci (1994) 6: 1389-1405), BDNF 수용체의 인산화를 지표로 한 BDNF 수용체의 활성화(Biochim Biophys Acta (2015) 1852: 862-872), BDNF 수용체의 활성화에 수반하는 세포내 칼슘 증가 등의 세포내 시그널 전달 증강 활성(Nature Reviews Neuroscience (2009) 10: 850-860), TrkB 발현 신경세포에 대한 증식 촉진 작용(기후 약과대학 기요(2006) 55: 53-54), 생존 유지 작용(Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry (2015) 60: 11-17), 신경돌기 신전 작용(J Biol Chem (2007) 282: 34525-34534) 등을 조사하는 것에 의해 인비트로로 평가할 수 있다. 인비트로에서 이용하는 세포로서는, TrkB를 내재성으로 발현하는 세포여도 외래성으로 강제 발현시킨 세포여도 된다. 예를 들어, BAF 세포, CHO 세포, PC-12 세포 등에 TrkB 유전자를 도입하여 강제 발현시킨 세포나, 해마나 선조체 등의 초대 배양 신경세포를 이용할 수 있다.
또한, BDNF의 기능은, 파킨슨병, 헌팅턴병, 알츠하이머병 등의 질환 모델 동물에 대한 치료 효과(Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1994) 91: 8920-8924)를 조사하는 것에 의해 인비보로 평가할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 융합 단백질(TfR 항체-BDNF 융합 단백질)의 in vivo에서의 BDNF 생물 활성은, 실시예 2∼5에 기재하는 바와 같은 방법을 이용하여 파킨슨병 모델 동물에 있어서의 운동 기능 장애 개선 작용, 선조체 도파민량 회복 효과, 선조체 도파민 신경 재생 효과 등을 조사하는 것에 의해 평가할 수 있다. 파킨슨병 모델로서는, 도파민 신경을 특이적으로 파괴함이 알려져 있는 MPTP 처치를 행한 마우스 및 원숭이를 이용할 수 있다.
(3) 융합 단백질의 용도
한편, 어떤 질환 모델 동물, 예를 들어 파킨슨병 모델 동물에 있어서 본 발명의 융합 단백질(hBDNF-항hTfR 항체 융합 단백질)을 말초로부터 투여하는 것에 의해 당해 질환 또는 장애가 개선되었다고 하는 것은, BDNF가 본래 갖는 효과를 발휘할 수 있을 정도로 본 발명의 융합 단백질이 필요 부위(예를 들어 뇌내)에 도달했음을 나타내고 있고, 이것은, 본 발명의 융합 단백질은, 당해 질환에 한정하지 않고, BDNF에 대한 폭로에 의해 이익을 얻을 수 있는 질환 및 장애를 치료하는 데 널리 사용할 수 있음을 의미한다.
본 발명은, 본 발명의 융합 단백질의 치료 유효량을 유효 성분으로서 함유하는 의약 조성물을 투여하는 것에 의해, BDNF의 폭로에 의해 이익을 얻을 수 있는 질환 또는 장애를 치료하는 데 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한, 본 발명의 융합 단백질을 유효 성분으로서 함유하여 이루어지는 BDNF의 폭로에 의해 이익을 얻을 수 있는 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료제를 제공한다. 여기에서 「치료」라는 용어는, 완전 치유뿐만 아니라 증상의 개선도 포함하는 의미이다.
본 발명의 융합 단백질에 대한 폭로에 의해 이익을 얻을 수 있는 질환 또는 장애로서는, BDNF의 발현 혹은 양이 저하하는 것에 의해 일어나는 질환 또는 장애뿐만 아니라, BDNF가 작용하는 것에 의해 치료 가능한 질환 또는 장애도 포함되고, 예를 들어, 신경계의 질환 또는 장애(신경 변성 질환, 울병, 통합 실조증, 간질, 자폐증, Rett 증후군, West 증후군, 신생아 경련, 인지증에 수반하는 문제 행동(예, 배회, 공격적 행위 등), 불안증, 동통, 히르슈스프룽병, 렘수면 행동 장애 등) 및 그 외의 질환 또는 장애를 들 수 있다. 신경 변성 질환으로서는, 이하의 뇌신경 변성 질환, 척수 변성 질환, 망막 변성 질환, 말초 신경 변성 질환 등을 들 수 있다.
뇌신경 변성 질환으로서는, 예를 들어, 뇌신경계의 신경 변성 질환(알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 레비소체형 인지증, 픽병, 다계통 위축증, 진행성 상행성 마비, 다운 증후군 등), 뇌허혈성 질환(뇌졸중, 뇌경색, 일과성 뇌허혈발작, 지주막하출혈, 허혈성 뇌증, 뇌경색(라크나 경색, 아테로마 혈전성 뇌경색, 심원성 뇌경색증, 출혈성 뇌경색, 그 외의 경색) 등), 외상성 뇌손상, 백질뇌증, 및 다발성 경화증 등을 들 수 있다.
척수 변성 질환으로서는, 예를 들어, 근위축성 측색경화증(ALS), 척수 손상, 여러 가지 원인에 의한 척수 장애, 척수성 진행성 근위축증, 및 척수소뇌 변성증 등을 들 수 있다. 망막 변성 질환으로서는, 예를 들어, 가령황반변성증(AMD), 당뇨병성 망막증, 망막 색소 변성증, 고혈압성 망막증, 및 녹내증 등을 들 수 있다.
말초 신경 변성 질환으로서는, 예를 들어, 당뇨병성 신경 장애, 말초 신경 손상, 외상성 말초 신경 장애, 중독, 다른 독성 물질에 의한 말초 신경 장애, 암화학 치료법에 의한 말초 신경 장애, Guillain-Barre 증후군, 비타민 등의 결핍에 의한 말초 신경 장애, 아밀로이드 말초 신경 장애, 허혈성 말초 신경 장애, 악성 종양에 수반하는 말초 신경 장애, 요독증성 말초 신경 장애, 물리적 원인에 의한 말초 신경 장애, Charcot-Marie-Tooth병, 알코올성 말초 신경 장애, 자율 신경 이상(무자각성 저혈당, 위부전 마비, 신경인성 설사 및 변비, 발기부전, 기립성 저혈압, 부정맥, 심부전, 무통성 심근경색, 발한 이상, 신경인성 방광 등), 방광 기능 장애(예, 무억제 방광, 반사성 방광, 자율성 방광, 지각 마비성 방광, 운동 마비성 방광 등) 등을 들 수 있다.
그 외의 질환 또는 장애로서는, 예를 들어, 치주병, 당뇨병, 당뇨병성 심근증, 당뇨병성 족병변, 염증성 장질환(예, 궤양성 대장염, 크론병 등), 청각 장애, 골질환(예, 골조송증 등), 관절 질환(예, 샤르코 관절, 변형성 관절증, 류머티즘 등) 등을 들 수 있다.
본 발명의 융합 단백질은, 혈중에 투여하여 중추 신경계(CNS)에 있어서 약효를 발휘시켜야 할 약제로서 사용할 수 있다. 이러한 약제는, 대체로 점적 정맥 주사 등에 의한 정맥 주사, 피하 주사, 근육 주사에 의해 환자에게 투여되지만, 투여 경로에는 특별히 한정은 없다.
(4) 투여 형태, 투여량, 투여 방법
본 발명의 융합 단백질은, 약제로서, 동결건조품, 또는 수성 액제 등의 형태로 의료 기관에 공급할 수 있다. 수성 액제의 경우, 약제를, 안정화제, 완충제, 등장화제를 함유하는 용액에 미리 용해한 것을, 바이알 또는 주사기에 봉입한 제제로서 공급할 수 있다. 주사기에 봉입된 제제는, 일반적으로 프리필드 시린지 제제라고 호칭된다. 프리필드 시린지 제제로 하는 것에 의해, 환자 자신에 의한 약제의 투여를 간이하게 할 수 있다.
수성 액제로서 공급되는 경우, 수성 액제에 함유되는 항hTfR 항체와 결합시킨 BDNF의 농도는, 용법 용량에 따라 적절히 조정되어야 할 것이지만, 예를 들어 0.01∼5mg/mL이다. 또한, 수성 액제에 함유되는 안정화제는, 약제학적으로 허용 할 수 있는 것인 한 특별히 한정은 없지만, 비이온성 계면활성제를 적합하게 사용할 수 있다. 이와 같은 비이온성 계면활성제로서는, 폴리소르베이트, 폴록사머 등을 단독으로 또는 이들을 조합하여 사용할 수 있다. 폴리소르베이트로서는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80이, 폴록사머로서는 폴록사머 188(폴리옥시에틸렌(160) 폴리옥시프로필렌(30) 글리콜)이 특히 적합하다. 또한, 수성 액제에 함유 되는 비이온성 계면활성제의 농도는, 0.01∼1mg/mL인 것이 바람직하고, 0.01∼0.5mg/mL인 것이 보다 바람직하고, 0.1∼0.5mg/mL인 것이 더욱 바람직하다. 안정화제로서, 히스티딘, 아르기닌, 메티오닌, 글리신 등의 아미노산을 사용할 수도 있다. 안정화제로서 사용하는 경우의, 수성 액제에 함유되는 아미노산의 농도는, 0.1∼40mg/mL인 것이 바람직하고, 0.2∼5mg/mL인 것이 보다 바람직하고, 0.5∼4mg/mL인 것이 더욱 바람직하다. 수성 액제에 함유되는 완충제는, 약제학적으로 허용할 수 있는 것인 한 특별히 한정은 없지만, 인산염 완충제가 바람직하고, 특히 인산 나트륨 완충제가 바람직하다. 완충제로서 인산 나트륨 완충제를 사용하는 경우의, 인산 나트륨의 농도는, 바람직하게는 0.01∼0.04M이다. 또한, 완충제에 의해 조정되는 수성 액제의 pH는, 바람직하게는 5.5∼7.2이다. 수성 액제에 함유되는 등장화제는, 약제학적으로 허용할 수 있는 것인 한 특별히 한정은 없지만, 염화 나트륨, 만니톨을 단독으로 또는 조합하여 등장화제로서 적합하게 사용할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질을 함유하는 상기 의약의 투여량은, 투여 대상, 대상 질환, 증상, 투여 루트 등에 따라서도 상이하지만, 예를 들어, 신경 변성 질환의 치료·예방을 위해서 사용하는 경우에는, 투여량은, 유효량, 예를 들어, 치료 유효량으로서 뇌내의 BDNF로서의 농도가, 적어도 약 0.001ng/g 이상, 바람직하게는 0.01, 0.1, 1, 10 또는 100ng/g 뇌를 상회하도록 한다. 또한, 1회 투여하고 나서 수일간(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일간), 2주간, 더욱이는 1개월간을 경과해도 BDNF의 뇌내 레벨이 상승한 채로 유지되는 것이 바람직하고, 뇌내 유지 농도로서 예를 들어, 약 1ng/g 뇌, 약 10ng/g 뇌, 약 100ng/g 뇌, 또는 약 100ng/g 뇌를 상회한 채로 유지되는 것이 바람직하다.
예를 들어, 투여량은, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 몇가지 실시형태에서는, 1회 투여량으로서 0.0001∼1,000mg/kg 체중의 범위 내에서 선택할 수 있다. 혹은, 환자당, 0.001∼100,000mg의 범위 내에서 선택할 수도 있다. 통상, 약 0.01∼1000mg, 약 0.1∼100mg, 약 1∼100mg, 약 0.05∼500mg, 약 0.5∼50mg, 또는 약 5mg∼50mg의 투여량으로, 예를 들어, 정맥내 투여로 투여된다. 증상이 특히 무거운 경우에는, 그 증상에 따라서 증량해도 된다.
본 발명의 조성물, 예를 들어, 본 발명의 융합 단백질은, 단독으로 이용해도 되고, 또는, 본 발명의 효과를 해치지 않는 범위에 있어서, 필요에 따라서 다른 의약품 또는 다른 치료법과 함께, 동일한 제제 내 또는 별도의 조성물로서, 환자에게 투여된다. 예를 들어, 알츠하이머형 인지증에 있어서 본 발명의 의약 조성물과 병용되는 의약으로서는, 알츠하이머병 치료약, 예를 들어, 염산 도네페질, 리바스티그민, 가란타민 브로민화 수소 염산 등의 아세틸콜린에스테라제 저해약, 혹은 메만틴 염산염을 들 수 있다. 또한, 현재 임상 개발 단계에 있는 솔라네주맙(N Engl J Med. (2014) 370: 311-21)이나 간테네루맙(Arch Neurol. (2012) 69: 198-207) 등의 항Aβ 항체나, 베루베세스타트(AAIC 2013, Boston:Abs 01-06-05, Jul 2013)나 AZD-3293(AAIC 2014, Copenhargen:AbsP1-363, Jul 2014) 등의 β아밀로이드 산생 저해제 등도 들 수 있다. 알츠하이머형 인지증에 있어서 본 발명의 의약 조성물과 병용되는 치료법으로서는, 뇌활성형 리허빌리테이션 요법 등을 들 수 있다. 파킨슨병에 있어서 본 발명의 의약 조성물과 병용되는 의약으로서는, 파킨슨병 치료약, 예를 들어, 레보도파 등의 도파민 보충요법약, 타리펙솔, 프라미펙솔, 브로모크립틴 등의 도파민 수용체 작동약, MAO-B 저해제나 COMT 저해제 등의 도파민 분해 효소 저해약, 아만타딘이나 노우리아스트 등의 도파민 유리 촉진약을 들 수 있다. 파킨슨병에 있어서 본 발명의 의약 조성물과 병용되는 치료법으로서는, 시상 자극술, 담창구 자극술, 시상하핵 자극술 등을 들 수 있다. 헌팅턴병에 있어서 본 발명의 의약 조성물과 병용되는 의약으로서는, 헌팅턴병 치료약, 예를 들어, 테트라베나진 등의 모노아민 소포 트랜스포터 2 저해약을 들 수 있다. 뇌허혈성 질환에 있어서 본 발명의 의약 조성물과 병용되는 의약으로서는, 라디컷 등의 뇌보호약을 들 수 있다. 뇌허혈성 질환에 있어서 본 발명의 의약 조성물과 병용되는 치료법으로서는, 혈전 용해 요법, 리허빌리테이션 요법 등을 들 수 있다.
본 발명의 의약 조성물을 투여하는 타이밍은 특별히 한정은 없고, 적절히 다른 의약의 투여 혹은 치료의 전후 혹은 동시여도 된다.
실시예
이하, 실시예를 참조하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명이 실시예로 한정되는 것은 의도하지 않는다. 한편, 실시예 1∼15-3은, 참고예(항체 번호 3)에 대한 것이다.
〔실시예 1〕 hTfR 발현용 벡터의 구축
인간 비장 Quick Clone cDNA(Clontech사)를 주형으로 하여, 프라이머 hTfR5'(서열 번호 41) 및 프라이머 hTfR3'(서열 번호 42)를 이용하여, PCR에 의해 인간 트랜스페린 수용체(hTfR)를 코딩하는 유전자 단편을 증폭시켰다. 증폭시킨 hTfR을 코딩하는 유전자 단편을, MluI와 NotI로 소화하고, pCI-neo 벡터(Promega사)의 MluI와 NotI의 사이에 삽입했다. 얻어진 벡터를, pCI-neo(hTfR)라고 이름 붙였다. 그 다음에, 이 벡터를, MluI와 NotI로 소화하여, hTfR을 코딩하는 유전자 단편을 잘라내고, 국제 공개 공보(WO2012/063799)에 기재된 발현 벡터인 pE-mIRES-GS-puro의 MluI와 NotI의 사이에 짜넣는 것에 의해, hTfR 발현용 벡터인 pE-mIRES-GS-puro(hTfR)를 구축했다.
〔실시예 2〕 재조합 hTfR의 제작
일렉트로포레이션법에 의해, CHO-K1 세포에 pE-mIRES-GS-puro(hTfR)를 도입한 후, 메티오닌설폭시민(MSX) 및 퓨로마이신을 포함하는 CD OptiCHOTM 배지(Invitrogen사)를 이용하여 세포의 선택 배양을 행하여, 재조합 hTfR 발현 세포를 얻었다. 이 재조합 hTfR 발현 세포를 배양하여, 재조합 hTfR을 조제했다.
〔실시예 3〕 재조합 hTfR을 이용한 마우스의 면역
실시예 2에서 조제한 재조합 hTfR을 항원으로서 이용하여 마우스를 면역했다. 면역은, 마우스에 항원을 정맥내 투여 또는 복강내 투여하여 행했다.
〔실시예 4〕 하이브리도마의 제작
마지막에 세포를 투여한 날의 약 1주일 후에 마우스의 비장을 적출하여 호모지나이즈하고, 비세포를 분리했다. 얻어진 비세포를 마우스 미엘로마 세포주(P3.X63.Ag8.653)와 폴리에틸렌 글리콜법을 이용하여 세포 융합시켰다. 세포 융합 종료 후, (1X) HAT 서플리멘트(Life Technologies사) 및 10% Ultra low IgG 소 태아 혈청(Life Technologies사)을 포함하는 RPMI1640 배지에 세포를 현탁시키고, 세포 현탁액을 96웰 플레이트 20매에 200μL/웰씩 분주했다. 탄산 가스 배양기(37℃, 5% CO2)에서 세포를 10일간 배양한 후, 각 웰을 현미경하에서 관찰하여, 단일의 콜로니가 존재하는 웰을 선택했다.
각 웰의 세포가 거의 컨플루언트가 된 시점에서 배양 상청을 회수하고, 이것을 하이브리도마의 배양 상청으로서 이하의 스크리닝에 제공했다.
〔실시예 5〕 고친화성 항체 산생 세포주의 스크리닝
재조합 hTfR 용액(Sino Biologics사)을 50mM 탄산 나트륨 완충액(pH 9.5∼9.6)으로 희석하여 5μg/mL의 농도로 조정하여, 이것을 고상 용액으로 했다. 고상 용액을, Nunc MaxiSorpTM flat-bottom 96웰 플레이트(기재: 폴리스타이렌, Nunc사제)의 각 웰에 50μL씩 첨가한 후, 플레이트를 실온에서 1시간 정치하여, 재조합 hTfR을 플레이트에 흡착시켜 고정했다. 고상 용액을 버리고, 각 웰을 250μL의 세정액(PBS-T: 0.05% Tween20을 함유하는 PBS)으로 3회 세정한 후, 각 웰에 블로킹액(1% BSA를 함유하는 PBS)을 200μL씩 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 정치했다.
블로킹액을 버리고, 각 웰을 250μL의 PBS-T로 3회 세정한 후, 각 웰에 하이브리도마의 배양 상청을 50μL씩 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 정치하여, 배양 상청에 포함되는 마우스 항hTfR 항체를 재조합 hTfR에 결합시켰다. 이 때, 컨트롤로서 마우스 항hTfR 항체를 산생하지 않는 하이브리도마의 배양 상청을 웰에 50μL 첨가한 것을 두었다. 또한, 각 배양 상청을 가한 웰의 옆의 웰에, 하이브리도마의 배양용 배지를 50μL 첨가한 것을 두어, 이것을 모크 웰로 했다. 측정은 n=2로 실시했다. 그 다음에, 용액을 버리고, 각 웰을 250μL의 PBS-T로 3회 세정했다.
상기의 각 웰에 100μL의 HRP 표지 염소 항마우스 이뮤노글로불린 항체 용액(프로메가사)을 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1분간 정치했다. 그 다음에, 용액을 버리고, 각 웰을 250μL의 PBS-T로 3회 세정했다. 그 다음에, 각 웰에 50μL의 발색용 기질액 TMB Stabilized Substrate for Horseradish Peroxidase(프로메가사)를 첨가하고, 실온에서 10∼20분간 정치했다. 그 다음에, 각 웰에 100μL의 정지액(2N 황산)을 첨가한 후, 플레이트 리더를 이용하여 각 웰의 450nm에 있어서의 흡광도를 측정했다. 각 배양 상청 및 컨트롤의 2개의 웰의 평균치를 취하고, 이들 평균치로부터, 각 배양 상청 및 컨트롤마다 둔 2개의 모크 웰의 평균치를 각각 뺀 것을 측정치로 했다.
높은 측정치를 나타낸 웰에 첨가한 배양 상청에 대응하는 14종류의 하이브리도마 세포를, hTfR에 대해서 고친화성을 나타내는 항체(고친화성 항hTfR 항체)를 산생하는 세포주(고친화성 항체 산생 세포주)로서 선택했다. 이들 14종의 세포주를, 클론 1주∼클론 14주로 번호 붙였다. 이들 세포주로부터 클론 3주를 선택하여, 이하의 실험에 이용했다. 또한, 클론 3주가 산생하는 항hTfR 항체를, 항hTfR 항체 번호 3으로 했다.
〔실시예 6〕 고친화성 항hTfR 항체의 가변 영역의 아미노산 서열의 해석
실시예 5에서 선택한 클론 3주로부터 cDNA를 조제하고, 이 cDNA를 주형으로 하여 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 유전자를 증폭시켰다. 증폭시킨 유전자의 염기 서열을 번역하여, 이 세포주가 산생하는 항hTfR 항체 번호 3의 항체에 대해, 경쇄 및 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열을 결정했다.
항hTfR 항체 번호 3은, 경쇄의 가변 영역에 서열 번호 48에 기재된 아미노산 서열과, 중쇄의 가변 영역에 서열 번호 49에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것이었다. 또한, 그 경쇄의 가변 영역은, CDR1에 서열 번호 6 또는 7, CDR2에 서열 번호 8 또는 9, 및 CDR3에 서열 번호 10에 기재된 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 그 중쇄의 가변 영역은, CDR1에 서열 번호 11 또는 12, CDR2에 서열 번호 13 또는 14, 및 CDR3에 서열 번호 15 또는 16에 기재된 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것이었다. 단, CDR은 상기의 아미노산 서열에 한정되지 않고, 이들 아미노산 서열을 포함하는 영역, 이들 아미노산 서열의 일부를 포함하는 연속한 3개 이상의 아미노산으로 이루어지는 아미노산 서열도 CDR로 할 수 있다고 생각되었다.
항hTfR 항체 번호 3의, 경쇄의 가변 영역의 CDR1∼3과 중쇄의 가변 영역의 CDR1∼3에 포함되는 아미노산 서열의 서열 번호를, 표 1에 정리해 나타낸다. 단, 표 1은 각 CDR의 아미노산 서열을 예시하는 것이고, 각 CDR의 아미노산 서열은 표 1에 기재된 아미노산 서열에 한정되는 것은 아니고, 이들 아미노산 서열을 포함하는 영역의 아미노산 서열, 이들 아미노산 서열의 일부를 포함하는 연속한 3개 이상의 아미노산으로 이루어지는 아미노산 서열도 CDR로 할 수 있다고 생각된다.
Figure pct00001
〔실시예 7〕 항hTfR 항체의 인간 TfR 및 원숭이 TfR에 대한 친화성의 측정
항hTfR 항체와 인간 TfR 및 원숭이 TfR에 대한 친화성의 측정은, 바이오레이어 간섭법(BioLayer Interferometry: BLI)을 이용한 생체 분자 상호작용 해석 시스템인 OctetRED96(ForteBio사, a division of Pall Corporation)을 이용하여 실시했다. 바이오레이어 간섭법의 기본 원리에 대해 간단하게 설명한다. 센서 칩 표면에 고정된 생체 분자의 층(레이어)에 특정 파장의 광을 투사했을 때, 생체 분자의 레이어와 내부의 참조가 되는 레이어의 2개의 표면에서 광이 반사되어 광의 간섭파가 생긴다. 측정 시료 중의 분자가 센서 칩 표면의 생체 분자에 결합하는 것에 의해, 센서 선단의 층의 두께가 증가하여, 간섭파에 파장 시프트가 생긴다. 이 파장 시프트의 변화를 측정하는 것에 의해, 센서 칩 표면에 고정된 생체 분자에 결합하는 분자수의 정량 및 속도론적 해석을 리얼타임으로 행할 수 있다. 측정은, 대체로 OctetRED96에 첨부된 조작 메뉴얼에 따라 실시했다. 인간 TfR로서는, N말단에 히스티딘 태그가 부가된, 서열 번호 1에 나타나는 아미노산 서열 중에서 N말단측으로부터 89번째의 시스테인 잔기로부터 C말단의 페닐알라닌까지의, hTfR의 세포외 영역의 아미노산 서열을 갖는 재조합 인간 TfR(r인간 TfR: SinoBiological사)을 이용했다. 원숭이 TfR로서는, N말단에 히스티딘 태그가 부가된, 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열 중에서 N말단측으로부터 89번째의 시스테인 잔기로부터 C말단의 페닐알라닌까지의, 필리핀원숭이의 TfR의 세포외 영역의 아미노산 서열을 갖는 재조합 원숭이 TfR(r원숭이 TfR: SinoBiological사)을 이용했다.
실시예 5에서 선택한 클론 3주를, 세포 농도가 약 2×105개/mL가 되도록, (1X) HAT 서플리멘트(Life Technologies사) 및 10% Ultra low IgG 소 태아 혈청(Life Technologies사)을 포함하는 RPMI1640 배지로 희석하고, 1L의 삼각 플라스크에 200mL의 세포 현탁액을 가하고, 37℃에서, 5% CO2와 95% 공기로 이루어지는 습윤 환경에서 약 70rpm의 교반 속도로 6∼7일간 배양했다. 배양액을 원심 조작한 후에, 0.22μm 필터(Millipore사)로 여과하고, 배양 상청을 회수했다. 회수한 배양 상청을, 미리 150mM NaCl을 포함하는 컬럼 체적 3배용의 20mM Tris 완충액(pH 8.0)으로 평형화해 둔 Protein G 컬럼(컬럼 체적: 1mL, GE헬스케어사)에 부하했다. 그 다음에, 컬럼 체적의 5배용의 동 완충액에 의해 컬럼을 세정한 후, 150mM NaCl을 포함하는 컬럼 체적의 4배용의 50mM 글리신 완충액(pH 2.8)으로, 흡착한 항체를 용출시켜, 용출 획분을 채취했다. 용출 획분을 1M Tris 완충액(pH 8.0)을 첨가하여 pH 7.0으로 조정했다. 이것을 항hTfR 항체 번호 3의 정제품으로서 이하의 실험에 이용했다.
항hTfR 항체 번호 3의 정제품을, HBS-P＋(150mM NaCl, 50μM EDTA 및 0.05% Surfactant P20을 포함하는 10mM HEPES)로 2단계 희석하여, 0.78125∼50nM(0.117∼7.5μg/mL)의 7단계의 농도의 항체 용액을 조제했다. 이 항체 용액을 샘플 용액으로 했다. r인간 TfR과 r원숭이 TfR을, 각각 HBS-P＋로 희석하여, 25μg/mL의 용액을 조제하여, 각각 r인간 TfR-ECD(Histag) 용액 및 r원숭이 TfR-ECD(Histag) 용액으로 했다.
상기 2단계 희석하여 조제한 샘플 용액을, 96 well plate, black(greinerbioone사)에 200μL/웰씩 첨가했다. 또한, 상기 조제한 r인간 TfR-ECD(Histag) 용액 및 r원숭이 TfR-ECD(Histag) 용액을, 소정의 웰에 각각 200μL/웰씩 첨가했다. 베이스라인, 해리용 및 세정용의 웰에는, HBS-P＋를 200μL/웰씩 첨가했다. 재생용의 웰에는, 10mM Glycine-HCl, pH 1.7을 200μL/웰씩 첨가했다. 활성화용의 웰에는, 0.5mM NiCl2 용액을 200μL/웰씩 첨가했다. 이 플레이트와 바이오센서(Biosensor/Ni-NTA: ForteBio사, a division of Pall Corporation)를, OctetRED96의 소정의 위치에 설치했다.
OctetRED96을 하기의 표 2에 나타내는 조건에서 작동시켜 데이터를 취득 후, OctetRED96 부속의 해석 소프트웨어를 이용하여, 결합 반응 곡선을 1:1 결합 모델 혹은 2:1 결합 모델에 피팅하고, 항hTfR 항체와 r인간 TfR 및 r원숭이 TfR에 대한 회합 속도 상수(kon) 및 해리 속도 상수(koff)를 측정하여, 해리 상수(KD)를 산출했다. 한편, 측정은 25∼30℃의 온도하에서 실시했다.
Figure pct00002
표 3에 항hTfR 항체 번호 3의 인간 TfR 및 원숭이 TfR에 대한 회합 속도 상수(kon) 및 해리 속도 상수(koff)의 측정 결과, 및 해리 상수(KD)를 나타낸다.
Figure pct00003
항hTfR 항체의 인간 TfR에 대한 친화성의 측정의 결과, 항hTfR 항체 번호 3의 인간 TfR과의 해리 상수는 1×10-12M 이하이며, 원숭이 TfR과의 해리 상수도 1×10-12M 이하였다. 이들 결과는, 항hTfR 항체 번호 3이 인간 TfR뿐만 아니라 원숭이 TfR과도 높은 친화성을 갖는 항체임을 나타낸다.
〔실시예 7-2〕 항hTfR 항체의 마우스를 이용한 뇌이행 평가
그 다음에, 항hTfR 항체 번호 3에 대해, 각 항체가 BBB를 통과하여 뇌내로 이행하는 것을, 마우스 트랜스페린 수용체의 세포외 영역을 코딩하는 유전자를 인간 트랜스페린 수용체 유전자의 세포외 영역을 코딩하는 유전자로 치환한 hTfR 노크인 마우스(hTfR-KI 마우스)를 이용하여 평가했다. hTfR-KI 마우스는, 대체로 하기의 방법으로 제작했다. 또한, 항hTfR 항체 번호 3으로서는, 실시예 7에서 조제한 정제품을 이용했다.
세포내 영역이 마우스 TfR의 아미노산 서열이며, 세포외 영역이 인간 TfR의 아미노산 서열인 키메라 hTfR을 코딩하는 cDNA의 3'측에, loxP 서열로 끼워 넣은 네오마이신 내성 유전자를 배치한, 서열 번호 45로 나타나는 염기 서열을 갖는 DNA 단편을 화학적으로 합성했다. 이 DNA 단편을, 5'암 서열로서 서열 번호 46으로 나타나는 염기 서열, 3'암 서열로서 서열 번호 47로 나타나는 염기 서열을 갖는 타게팅 벡터에, 통상적 방법에 의해 짜넣고, 이것을 마우스 ES 세포에 일렉트로포레이션법에 의해 도입했다. 유전자 도입 후의 마우스 ES 세포를, 네오마이신 존재하에서 선택 배양하여, 타게팅 벡터가 상동 재조합에 의해 염색체에 짜넣어진 마우스 ES 세포를 선택했다. 얻어진 유전자 재조합 마우스 ES 세포를, ICR 마우스의 8세포기배(숙주배)에 주입하고, 정관 결찰을 실시한 마우스와의 교배에 의해 얻어진 위(僞)임신 마우스(레시피언트 마우스)에 이식했다. 얻어진 산자(産仔)(키메라 마우스)에 대해 모색 판정을 행하여, ES 세포가 생체의 형성에 고효율로 기여한 개체, 즉 전체 모에 대한 백색모가 차지하는 비율이 높은 개체를 선별했다. 이 키메라 마우스 개체를 ICR 마우스와 교배하여 F1 마우스를 얻었다. 백색의 F1 마우스를 선별하고, 꼬리의 조직으로부터 추출한 DNA를 해석하여, 염색체 상에서 마우스 트랜스페린 수용체 유전자가 키메라 hTfR로 치환되어 있는 마우스를 hTfR-KI 마우스로 했다.
항hTfR 항체 번호 3의 정제품을, Fluorescein Labeling Kit-NH2(도진화학연구소)를 이용하여, 첨부된 조작 메뉴얼에 따라 플루오레세인 아이소싸이오사이아네이트(FITC)에 의해 형광 표지했다. 이 FITC 형광 표지한 항체를 포함하는 PBS 용액을 조제했다. 이 항체 용액을, 투여되는 항hTfR 항체의 용량이 3mg/kg이 되도록, 1마리의 hTfR-KI 마우스(수컷, 10∼12주령)에게 정맥 주사했다. 또한, 컨트롤로서, 마찬가지로 하여 조제한 FITC 형광 표지한 마우스 IgG1(시그마사)을 포함하는 PBS 용액을, 3mg/kg의 용량으로 1마리의 hTfR-KI 마우스(수컷, 10∼12주령)에게 정맥 주사했다. 정맥 주사하고 나서 약 8시간 후에 생리 식염액으로 전신 관류하고, 뇌(대뇌와 소뇌를 포함하는 부분)를 채취했다. 적출한 뇌의 중량(습중량)을 측정한 후, Protease Inhibitor Cocktail(시그마사)을 포함하는 T-PER(Thermo Fisher Scientific사)을 첨가하고 뇌조직을 호모지네이트했다. 호모지네이트를 원심하고 상청을 회수하여, 상청 중에 포함되는 FITC 형광 표지한 항체의 양을 이하의 방법으로 측정했다. 우선, 항FITC 항체(Bethyl사)를 High Bind Plate(Meso Scale Diagnostics사)의 각 웰에 10μL씩 첨가하고, 1시간 정치하여 플레이트에 고정시켰다. 그 다음에, 각 웰에 SuperBlock Blocking buffer in PBS(Thermo Fisher Scientific사)를 150μL씩 첨가하고, 1시간 진탕하여 플레이트를 블로킹했다. 그 다음에, 각 웰에 뇌조직의 호모지네이트 상청을 25μL씩 첨가하고, 1시간 진탕했다. 그 다음에, 각 웰에 SULFO-TAG Anti-Mouse 항체(Goat)(Meso Scale Diagnostics사)를 25μL씩 첨가하고, 1시간 진탕했다. 그 다음에, 각 웰에 Read buffer T(Meso Scale Diagnostics사)를 150μL씩 첨가하고, SectorTM Imager 6000 reader을 이용하여 각 웰로부터의 발광량을 측정했다. 농도 기지의 FITC 형광 표지한 항hTfR 항체의 표준 시료의 측정치로부터 검량선을 작성하고, 이것에 각 검체의 측정치를 내삽하는 것에 의해, 뇌의 그램중량(습중량)당에 포함되는 항체의 양(뇌조직 중의 항hTfR 항체의 농도)을 산출했다. 그 결과를 표 4에 나타낸다.
컨트롤과 비교하여, 항hTfR 항체 번호 3의 뇌조직 중의 농도는, 약 27.8배였다. 이 결과는, 항hTfR 항체 번호 3이, BBB를 적극적으로 통과하여 뇌내로 이행하는 성질을 가짐을 나타내는 것이다.
Figure pct00004
〔실시예 8〕 항hTfR 항체의 원숭이를 이용한 약물 동태 해석
항hTfR 항체 번호 3을, 5.0mg/kg의 용량으로 웅성 필리핀원숭이에 단회 정맥내 투여하고, 투여 8시간 후에 생리 식염액으로 전신 관류를 실시했다. 또한, 음성 대조로서 항hTfR 항체를 비투여한 1마리의 개체를 마찬가지로 전신 관류했다. 관류 후, 연수를 포함하는 뇌조직을 적출했다. 이 뇌조직을 이용하여, 이하의 항hTfR 항체의 농도 측정 및 면역 조직화학 염색을 행했다. 항hTfR 항체 번호 3으로서는, 실시예 7에 기재된 항체의 정제품을 이용했다.
뇌조직 중의 항hTfR 항체의 농도 측정은, 대체로 이하의 순서로 행했다. 채취한 조직을, 뇌조직을 대뇌, 소뇌, 해마 및 연수로 나누고 나서, 각각 Protease Inhibitor Cocktail(Sigma-Aldrich사)을 포함하는 RIPA Buffer(와코순약공업주식회사)로 호모지네이트하고 원심하여 상청을 회수했다. Affinipure Goat Antimouse IgG Fcγ pAb(Jackson ImmunoResearch사)를 High Bind Plate(Meso Scale Diagnostics사)의 각 웰에 10μL씩 첨가하고, 1시간 정치하여 플레이트에 고정했다. 그 다음에, 각 웰에 SuperBlock blocking buffer in PBS(Thermo Fisher Scientific사)를 150μL씩 첨가하고, 1시간 진탕하여, 플레이트를 블로킹했다. 그 다음에, 각 웰에 뇌조직의 호모지네이트 상청을 25μL씩 첨가하고, 1시간 진탕했다. 그 다음에, 각 웰에 Affinipure Goat Antimouse IgG Fab-Biotin(Jackson ImmunoResearch사)를 25μL씩 첨가하고, 1시간 진탕했다. 그 다음에, 각 웰에 SULFO-Tag-Streptavidin(Meso Scale Diagnostics사)을 25μL씩 첨가하고, 0.5시간 진탕했다. 각 웰에 Read buffer T(Meso Scale Diagnostics사)를 150μL씩 첨가하고, SectorTM Imager 6000 reader(Meso Scale Diagnostics사)를 이용하여 각 웰로부터의 발광량을 측정했다. 농도 기지의 항hTfR 항체의 표준 시료의 측정치로부터 검량선을 작성하고, 이것에 각 검체의 측정치를 내삽하는 것에 의해, 각 뇌조직의 그램중량(습중량)당에 포함되는 항체의 양(뇌조직 중의 항hTfR 항체의 농도)을 산출했다.
뇌조직 중의 항hTfR 항체의 농도 측정의 결과를 표 5에 나타낸다. 대뇌, 소뇌, 해마 및 경수의 모두에 있어서, 항hTfR 항체 번호 3의 축적이 확인되었다. 이들 결과는, 항hTfR 항체 번호 3이 혈액뇌관문을 통과하여 뇌조직에 축적되는 성질을 가짐을 나타내는 것이고, 뇌조직내에서 기능시켜야 할 약제를 이들 항체와 결합시키는 것에 의해, 그 약제를 효율 좋게 뇌조직에 축적시킬 수 있음을 나타내는 것이다.
Figure pct00005
뇌조직 중의 항hTfR 항체의 면역 조직화학 염색은, 대체로 이하의 순서로 행했다. 티슈텍 크라이오 3 DM(사쿠라파인텍주식회사)을 이용하여, 채취한 조직을 -80℃까지 급속 냉동하여, 조직의 동결 블록을 제작했다. 이 동결 블록을 4μm로 박절 후, MAS 코트 슬라이드 글라스(마쓰나미유리주식회사)에 첩부했다. 조직 박편에 4% 파라폼알데하이드(와코순약공업주식회사)를 4℃에서 5분간 반응시켜, 조직 박편을 슬라이드 글라스 상에 고정했다. 계속하여, 조직 박편에 0.3% 과산화 수소수를 포함하는 메탄올 용액(와코순약공업주식회사)을 30분간 반응시켜, 내인성 퍼옥시다제를 실활시켰다. 그 다음에 슬라이드 글라스를 SuperBlock blocking buffer in PBS에 30분간 실온에서 반응시켜 블로킹했다. 그 다음에, 조직 박편에 Mouse IgG-heavy and light chain Antibody(Bethyl Laboratories사)를 1시간 실온에서 반응시켰다. 조직 박편을, DAB 기질(3,3'-다이아미노벤지딘, Vector Laboratories사)로 발색시키고, 마이어 헤마톡실린(Merck사)으로 대비 염색을 행하고, 탈수, 투철한 후에 봉입하고, 광학 현미경으로 관찰했다.
도 1에 대뇌피질의 항hTfR 항체의 면역 조직화학 염색의 결과를 나타낸다. 항hTfR 항체 번호 3을 투여한 원숭이의 대뇌피질에서는, 혈관의 특이적인 염색이 확인되었다(도 1b). 더욱이, 뇌혈관 외의 뇌실질 영역에도 광범위하게 특이적인 염색이 확인되었다. 한편, 컨트롤로 해둔 항hTfR 항체를 비투여한 원숭이의 대뇌피질에서는 염색은 확인되지 않아, 백그라운드의 염색은 거의 없음이 나타났다(도 1a).
도 2에 해마의 항hTfR 항체의 면역 조직화학 염색의 결과를 나타낸다. 항hTfR 항체 번호 3을 투여한 원숭이의 대뇌피질에서는, 혈관의 특이적인 염색이 확인되었다(도 2b). 더욱이, 신경양 세포에도 특이적인 염색이 확인되고, 또한, 뇌혈관 외의 뇌실질 영역에도 광범위하게 특이적인 염색이 확인되었다. 한편, 컨트롤로 해둔 항hTfR 항체를 비투여한 원숭이의 해마에서는 염색은 확인되지 않아, 백그라운드의 염색은 거의 없음이 나타났다(도 2a).
도 3에 소뇌의 항hTfR 항체의 면역 조직화학 염색의 결과를 나타낸다. 항hTfR 항체 번호 3을 투여한 원숭이의 대뇌피질에서는, 혈관의 특이적인 염색이 확인되었다(도 3b). 더욱이, 푸르킨예 세포에도 특이적인 염색이 확인되었다. 한편, 컨트롤로 해둔 항hTfR 항체를 비투여한 원숭이의 소뇌에서는 염색은 확인되지 않아, 백그라운드의 염색은 거의 없음이 나타났다(도 3a).
이상의 대뇌, 해마 및 소뇌의 면역 조직화학 염색의 결과로부터, 항hTfR 항체 번호 3은, 뇌혈관 내피 표면에 존재하는 hTfR에 결합할 수 있고, 또한, hTfR에의 결합 후, 혈액뇌관문을 통과하여 뇌실질 내로 이행하고, 추가로 해마에 있어서는 뇌실질 내로부터 신경양 세포에까지, 소뇌에 있어서는 푸르킨예 세포에까지 받아들여짐을 알 수 있었다.
〔실시예 9〕 인간화 항hTfR 항체의 제작
항hTfR 항체 번호 3의 경쇄 및 중쇄의 가변 영역에 포함되는 아미노산 서열의 인간화를 시도했다. 그렇게 해서, 서열 번호 17∼서열 번호 22에 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화된 경쇄의 가변 영역과 서열 번호 31∼서열 번호 36에 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화된 중쇄의 가변 영역을 얻었다(인간화 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 1∼6, 및 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 1∼6).
〔실시예 10〕 인간화 항hTfR 항체를 코딩하는 유전자의 구축
상기의 항hTfR 항체 번호 3에 대해, 각각 인간화 항hTfR 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변 영역을 포함하는, 경쇄 및 중쇄의 전장을 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편을 인공적으로 합성했다. 이 때, 경쇄의 전장을 코딩하는 유전자의 5'측에는, 5'단으로부터 순차로 MluI 서열과 리더 펩티드를 코딩하는 서열을, 3'측에는 NotI 서열을 도입했다. 또한, 중쇄의 전장을 코딩하는 유전자의 5'측에는, 5'단으로부터 순차로 MluI 서열과 리더 펩티드를 코딩하는 서열을, 3'측에는 NotI 서열을 도입했다. 한편, 여기에서 도입한 리더 펩티드는, 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄를 호스트 세포인 포유동물 세포에서 발현시켰을 때에, 경쇄 및 중쇄가 세포외로 분비되도록, 분비 시그널로서 기능하는 것이다.
항hTfR 항체 번호 3의 경쇄에 대해서는, 가변 영역에 서열 번호 18로 나타나는 아미노산 서열을 갖는, 서열 번호 23으로 나타나는 아미노산 서열의 경쇄(이하, 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄)의 전장을 코딩하는 DNA 단편(서열 번호 24)을 합성했다. 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄에 대해서는, 가변 영역에 서열 번호 32로 나타나는 아미노산 서열을 갖는, 서열 번호 37로 나타나는 아미노산 서열의 중쇄(이하, 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄)의 전장을 코딩하는 DNA 단편(서열 번호 38)을 합성했다. 서열 번호 38로 나타나는 DNA 단편에 코딩되는 인간화 항hTfR 항체의 중쇄는 IgG1이다.
항hTfR 항체 번호 3의 경쇄에 대해서는, 가변 영역에 서열 번호 20으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는, 서열 번호 25로 나타나는 아미노산 서열의 경쇄(이하, 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2의 경쇄)의 전장을 코딩하는 DNA 단편(서열 번호 26)과, 가변 영역에 서열 번호 21로 나타나는 아미노산 서열을 갖는, 서열 번호 27로 나타나는 아미노산 서열의 경쇄(이하, 인간화 항hTfR 항체 번호 3-3의 경쇄)의 전장을 코딩하는 DNA 단편(서열 번호 28)과, 가변 영역에 서열 번호 22로 나타나는 아미노산 서열을 갖는, 서열 번호 29로 나타나는 아미노산 서열의 경쇄(이하, 인간화 항hTfR 항체 번호 3-4의 경쇄)의 전장을 코딩하는 DNA 단편(서열 번호 30)도 합성했다.
더욱이, 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄에 대해서는, 가변 영역에 서열 번호 32로 나타나는 아미노산 서열을 갖는, 서열 번호 39로 나타나는 아미노산 서열의 중쇄(이하, 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄 IgG4)의 전장을 코딩하는 DNA 단편(서열 번호 40)을 합성했다. 이 서열 번호 40으로 나타나는 DNA 단편에 코딩되는 인간화 항hTfR 항체의 중쇄는 IgG4이다.
〔실시예 11〕 인간화 항hTfR 항체 발현 벡터의 구축
pEF/myc/nuc 벡터(인비트로젠사)를, KpnI와 NcoI로 소화하여, EF-1α 프로모터 및 그의 제 1 인트론을 포함하는 영역을 잘라내고, 이것을 T4DNA 폴리메라제로 평활 말단화 처리했다. pCI-neo(인비트로젠사)를, BglII 및 EcoRI로 소화하여, CMV의 인핸서/프로모터 및 인트론을 포함하는 영역을 절제한 후에, T4DNA 폴리메라제로 평활 말단화 처리했다. 이것에, 상기의 EF-1α 프로모터 및 그의 제 1 인트론을 포함하는 영역을 삽입하여, pE-neo 벡터를 구축했다. pE-neo 벡터를, SfiI 및 BstXI로 소화하여, 네오마이신 내성 유전자를 포함하는 약 1kbp의 영역을 절제했다. pcDNA3.1/Hygro(＋)(인비트로젠사)를 주형으로 하여 프라이머 Hyg-Sfi5'(서열 번호 43) 및 프라이머 Hyg-BstX3'(서열 번호 44)를 이용하여, PCR 반응에 의해 하이그로마이신 유전자를 증폭했다. 증폭한 하이그로마이신 유전자를, SfiI 및 BstXI로 소화하여, 상기의 네오마이신 내성 유전자를 절제한 pE-neo 벡터에 삽입하여, pE-hygr 벡터를 구축했다.
pE-hygr 벡터 및 pE-neo 벡터를 각각 MluI와 NotI로 소화했다. 실시예 10에서 합성한 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄를 코딩하는 DNA 단편(서열 번호 24)과 중쇄를 코딩하는 DNA 단편(서열 번호 38)을 MluI와 NotI로 소화하고, 각각 pE-hygr 벡터와 pE-neo 벡터의 MluI-NotI 사이에 삽입했다. 얻어진 벡터를, 각각 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄 발현용 벡터의 pE-hygr(LC3), 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄 발현용 벡터의 pE-neo(HC3)로서 이하의 실험에 이용했다.
더욱이, 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄에 대해서는, 실시예 10에서 합성한 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2의 경쇄를 코딩하는 DNA 단편(서열 번호 26), 인간화 항hTfR 항체 번호 3-3의 경쇄를 코딩하는 DNA 단편(서열 번호 28), 및 인간화 항hTfR 항체 번호 3-4의 경쇄를 코딩하는 DNA 단편(서열 번호 30)을 MluI와 NotI로 소화하고, pE-hygr 벡터의 MluI-NotI 사이에 삽입하여, 각각 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2의 경쇄 발현용 벡터의 pE-hygr(LC3-2), 인간화 항hTfR 항체 번호 3-3의 경쇄 발현용 벡터의 pE-hygr(LC3-3), 및 인간화 항hTfR 항체 번호 3-4의 경쇄 발현용 벡터의 pE-hygr(LC3-4)을 구축했다.
더욱이 마찬가지로, 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄에 대해서는, 실시예 10에서 합성한 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄 IgG4를 코딩하는 DNA 단편(서열 번호 40)을 MluI와 NotI로 소화하고, pE-neo 벡터의 MluI-NotI 사이에 삽입하여, 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄 IgG4 발현용 벡터의 pE-neo(HC3-IgG4)를 구축했다.
〔실시예 12〕 인간화 항hTfR 항체 발현용 세포의 구축
CHO 세포(CHO-K1: American Type Culture Collection으로부터 입수)를, 하기의 방법에 의해, GenePulser(Bio-Rad사)를 이용하여, 실시예 11에서 구축한 경쇄 발현용 벡터 pE-hygr(LC3) 및 중쇄 발현용 벡터 pE-neo(HC3)로 형질 전환했다. 세포의 형질 전환은 대체로 이하의 방법으로 행했다. 5×105개의 CHO-K1 세포를 CD OptiCHOTM 배지(라이프 테크놀로지사)를 첨가한 3.5cm 배양 디쉬에 파종하고, 37℃, 5% CO2의 조건하에서 하룻밤 배양했다. 배지를 Opti-MEMTM I 배지(라이프 테크놀로지사)로 교환하고, 세포를 5×106세포/mL의 밀도가 되도록 현탁했다. 세포 현탁액 100μL를 채취하고, 이것에 Opti-MEMTM I 배지로 100μg/mL로 희석한 pE-hygr(LC3) 및 pE-neo(HC3) 플라스미드 DNA 용액을 5μL씩 첨가했다. GenePulser(Bio-Rad사)를 이용하여, 일렉트로포레이션을 실시하여, 세포에 플라스미드를 도입했다. 세포를, 37℃, 5% CO2의 조건하에서 하룻밤 배양한 후, 0.5mg/mL의 하이그로마이신 및 0.8mg/mL의 G418을 첨가한 CD OptiCHOTM 배지로 선택 배양했다.
그 다음에, 한계 희석법에 의해, 1웰당 1개 이하의 세포가 파종되도록, 96 웰 플레이트 상에 선택 배양으로 선택된 세포를 파종하고, 각 세포가 단클론 콜로니를 형성하도록 약 10일간 배양했다. 단클론 콜로니가 형성된 웰의 배양 상청을 채취하고, 배양 상청 중의 인간화 항체 함량을 ELISA법으로 조사하여 인간화 항체 고발현 세포주를 선택했다.
이 때의 ELISA법은 대체로 이하의 방법으로 실시했다. 96웰 마이크로타이터 플레이트(Nunc사)의 각 웰에, 염소 항인간 IgG 폴리클로날 항체 용액을 0.05M 탄산 수소염 완충액(pH 9.6)으로 4μg/mL로 희석한 것을 100μL씩 가하고 실온에서 적어도 1시간 정치하여 항체를 플레이트에 흡착시켰다. 그 다음에, PBS-T로 각 웰을 3회 세정 후, Starting Block(PBS) Blocking Buffer(Thermo Fisher Scientific사)를 각 웰에 200μL씩 가하고 플레이트를 실온에서 30분 정치했다. 각 웰을 PBS-T로 3회 세정한 후, PBS에 0.5% BSA 및 0.05% Tween20을 첨가한 것(PBS-BT)으로 적당한 농도로 희석한 배양 상청 또는 인간 IgG 표준품을, 각 웰에 100μL씩 가하고, 플레이트를 실온에서 적어도 1시간 정치했다. 플레이트를 PBS-T로 3회 세정한 후, PBS-BT로 희석한 HRP 표지 항인간 IgG 폴리클로날 항체 용액을, 각 웰에 100μL씩 가하고, 플레이트를 실온에서 적어도 1시간 정치했다. PBS-T로 각 웰을 3회 세정 후, 인산-시트르산 완충액(pH 5.0)을 포함하는 0.4mg/mL o-페닐렌다이아민을 100μL씩 각 웰에 가하고, 실온에서 8∼20분간 정치했다. 그 다음에, 1mol/L 황산을 100μL씩 각 웰에 가하여 반응을 정지시키고, 96웰 플레이트 리더를 이용하여, 각 웰의 490nm에 있어서의 흡광도를 측정했다. 높은 측정치를 나타낸 웰에 대응하는 세포를, 인간화 항hTfR 항체 번호 1의 고발현 세포주로 했다. 이것을 항체 번호 3 발현주로 했다.
더욱이 마찬가지로 하여, 실시예 11에서 구축한 경쇄 발현용 벡터 pE-hygr(LC3-2) 및 중쇄 발현용 벡터 pE-neo(HC3)를 이용하여 CHO 세포를 형질 전환시켜, 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2의 고발현 세포주를 얻었다. 이것을 항체 번호 3-2 발현주로 했다.
더욱이 마찬가지로 하여, 실시예 11에서 구축한 경쇄 발현용 벡터 pE-hygr(LC3-3) 및 중쇄 발현용 벡터 pE-neo(HC3)를 이용하여 CHO 세포를 형질 전환시켜, 인간화 항hTfR 항체 번호 3-3의 고발현 세포주를 얻었다. 이것을 항체 번호 3-3 발현주로 했다.
더욱이 마찬가지로 하여, 실시예 11에서 구축한 경쇄 발현용 벡터 pE-hygr(LC3-4) 및 중쇄 발현용 벡터 pE-neo(HC3)를 이용하여 CHO 세포를 형질 전환시켜, 인간화 항hTfR 항체 번호 3-4의 고발현 세포주를 얻었다. 이것을 항체 번호 3-4 발현주로 했다.
더욱이 마찬가지로 하여, 실시예 11에서 구축한 경쇄 발현용 벡터 pE-hygr(LC3) 및 중쇄 발현용 벡터 pE-neo(HC3-IgG4)를 이용하여 CHO 세포를 형질 전환시켜, 인간화 항hTfR 항체 번호 3(IgG4)의 고발현 세포주를 얻었다. 이것을 항체 번호 3(IgG4) 발현주로 했다.
더욱이 마찬가지로 하여, 실시예 11에서 구축한 경쇄 발현용 벡터 pE-hygr(LC3-2) 및 중쇄 발현용 벡터 pE-neo(HC3-IgG4)를 이용하여 CHO 세포를 형질 전환시켜, 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2(IgG4)의 고발현 세포주를 얻었다. 이것을 항체 번호 3-2(IgG4) 발현주로 했다.
〔실시예 13〕 인간화 항hTfR 항체의 정제
실시예 12에서 얻어진 항체 번호 3 발현주, 항체 번호 3-2 발현주, 항체 번호 3-3 발현주 및 항체 번호 3-4 발현주를, 각각 세포 농도가 약 2×105개/mL가 되도록, CD OptiCHOTM 배지로 희석하고, 1L의 삼각 플라스크에 200mL의 세포 현탁액을 가하고, 37℃에서, 5% CO2와 95% 공기로 이루어지는 습윤 환경에서 약 70rpm의 교반 속도로 6∼7일간 배양했다. 배양 상청을 원심 조작에 의해 회수하고, 0.22μm 필터(Millipore사)로 여과하여, 배양 상청으로 했다. 회수한 배양 상청에, 150mM NaCl을 포함하는 5배용의 20mM Tris 완충액(pH 8.0)을 첨가하고, 미리 150mM NaCl을 포함하는 컬럼 체적 3배용의 20mM Tris 완충액(pH 8.0)으로 평형화해 둔 Protein A 컬럼(컬럼 체적: 1mL, Bio-Rad사)에 부하했다. 그 다음에, 컬럼 체적의 5배용의 동 완충액에 의해 컬럼을 세정한 후, 150mM NaCl을 포함하는 컬럼 체적의 4배용의 50mM 글리신 완충액(pH 2.8)으로, 흡착된 인간화 항체를 용출시키고, 용출 획분을 채취했다. 용출 획분에 1M Tris 완충액(pH 8.0)을 첨가하여 중화하여, 이것을 항체의 정제품으로 했다.
여기에서, 항체 번호 3 발현주의 배양 상청으로부터 정제된 항체는, 인간화 항hTfR 항체 번호 3으로 했다. 항체 번호 3-2 발현주의 배양 상청으로부터 정제된 항체는, 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2로 했다. 항체 번호 3-3 발현주의 배양 상청으로부터 정제된 항체는, 인간화 항hTfR 항체 번호 3-3으로 했다. 또한, 항체 번호 3-4 발현주의 배양 상청으로부터 정제된 항체는, 인간화 항hTfR 항체 번호 3-4로 했다.
또한, 실시예 12에서 얻어진 항체 번호 3(IgG4) 발현주, 및 항체 번호 3-2(IgG4) 발현주에 대해서도 상기와 마찬가지로 배양하고, 그 배양 상청으로부터, 각각 정제된 인간화 항hTfR 항체 번호 3(IgG4) 및 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2(IgG4)를 얻었다. 이들 2종의 항체는, 실시예 15에 기재된 원숭이를 이용한 약물 동태 해석에 이용했다.
〔실시예 14〕 인간화 항hTfR 항체의 인간 TfR 및 원숭이 TfR에 대한 친화성의 측정
실시예 13에서 얻은 인간화 항hTfR 항체의 인간 TfR 및 원숭이 TfR에 대한 친화성을, 실시예 7에 기재된 방법으로 측정했다. 표 6에 인간화 항hTfR 항체 번호 3∼3-4(표 중, No. 3∼3-4에 각각 대응)의 인간 TfR에 대한 회합 속도 상수(kon) 및 해리 속도 상수(koff)의 측정 결과, 및 해리 상수(KD)를 나타낸다.
Figure pct00006
표 7에 인간화 항hTfR 항체 번호 3∼3-4(표 중, 항체 번호 3∼3-4에 각각 대응)의 원숭이 TfR에 대한 회합 속도 상수(kon) 및 해리 속도 상수(koff)의 측정 결과, 및 해리 상수(KD)를 나타낸다.
Figure pct00007
인간화 항hTfR 항체 번호 3∼3-4의 인간 TfR에 대한 친화성의 측정의 결과, 인간화 항hTfR 항체 번호 3 및 3-4 항체에서, 인간 TfR과의 해리 상수는 1×10-12M 미만이었다(표 6). 또한, 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2 및 3-3의 인간 TfR과의 해리 상수는, 각각 2.39×10-11M과 2.09×10-11M이었다. 한편, 이들 항체에 대응하는 인간화 전의 항hTfR 항체(항체 번호 3)의 인간 TfR과의 해리 상수는, 1×10-12M 미만이었다(표 3). 이들 결과는, 항hTfR 항체의 인간 TfR에 대한 높은 친화성이, 항체를 인간화하는 전후에서 유지됨을 나타내는 것이다.
그 다음에, 인간화 항hTfR 항체의 원숭이 TfR에 대한 친화성의 측정의 결과를 보면, 인간화 항hTfR 항체 번호 3∼3-4는, 인간화 전의 이들 항체에 대응하는 항hTfR 항체 번호 3의 원숭이 TfR과의 해리 상수가 1×10-12M 미만이었던 것이, 인간화 후는 2.60×10-10M∼1.91×10-9M로 원숭이 TfR에 대한 친화성의 저하가 관찰되었다(표 3, 표 7). 인간화 항hTfR 항체 번호 3에서는, 원숭이 TfR에 대한 친화성의 저하가 관찰되었지만, 이들 결과는, 항hTfR 항체의 원숭이 TfR에 대한 높은 친화성은, 항체를 인간화하는 전후에서 상실되지 않고 대체로 유지됨을 나타내는 것이다.
〔실시예 15〕 인간화 항hTfR 항체의 원숭이를 이용한 약물 동태 해석
인간화 항hTfR 항체 번호 3, 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2, 인간화 항hTfR 항체 번호 3(IgG4) 및 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2(IgG4)의 4종의 항체를 이용하여, 원숭이를 이용한 약물 동태 해석을 행했다. 한편, 인간화 항hTfR 항체 번호 3은 중쇄가 IgG1이며, 인간화 항hTfR 항체 번호 3(IgG4)은 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄를 가변 영역은 그대로 하여 IgG4로 한 것이다. 또한, 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2는 중쇄가 IgG1이며, 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2(IgG4)는 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2의 중쇄를 가변 영역은 그대로 하여 IgG4로 한 것이다. 이들 4종의 항체를, 각각, 5.0mg/kg의 용량으로 각각 웅성 필리핀원숭이에 단회 정맥내 투여하고, 투여 전, 투여 후 2분, 30분, 2시간, 4시간 및 8시간 후에 말초혈을 채취하고, 채혈 후에 전신 관류를 실시했다. 또한, 음성 대조로서 HER2 단백에 대한 인간화 항체인 트라스투주맙(허셉틴TM, 추가이제약)을, 마찬가지로 하여 한마리의 개체에게 투여하고, 투여 전, 투여 후 2분, 30분, 2시간, 4시간 및 8시간 후에 말초혈을 채취하고, 채혈 후에 전신 관류를 실시했다. 관류 후, 연수를 포함하는 뇌조직, 척수 조직 및 그 외의 조직(간장, 심장, 비장 및 골수를 포함한다)을 적출했다. 이 뇌조직, 척수 조직 및 그 외의 조직을 이용하여, 이하의 인간화 항hTfR 항체의 농도 측정 및 면역 조직화학 염색을 행했다.
조직 중 및 말초혈 중의 인간화 항hTfR 항체의 농도 측정은, 대체로 이하의 순서로 행했다. 한편, 뇌에 대해서는 채취한 조직을, 대뇌피질, 소뇌, 해마 및 연수로 나누고 나서 인간화 항hTfR 항체의 농도 측정을 행했다. 채취한 조직을, 각각 Protease Inhibitor Cocktail(Sigma-Aldrich사)을 포함하는 RIPA Buffer(와코순약공업주식회사)로 호모지네이트하고 원심하여 상청을 회수했다. 말초혈에 대해서는 혈청을 분리했다. Anti-Human Kappa Light Chain Goat IgG Biotin(주식회사면역생물연구소), Sulfo-tag anti-human IgG(H＋L) antibody(Bethyl사) 및 뇌조직 호모지네이트를 SuperBlock blocking buffer in PBS(Thermo Fisher Scientific사)로 블로킹을 실시한 스트렙트아비딘 플레이트(Meso Scale Diagnostics사)에 첨가하고, 1시간 진탕하여 플레이트에 고정했다. 그 다음에, 각 웰에 Read buffer T(Meso Scale Diagnostics사)를 150μL씩 첨가하고, SectorTM Imager 6000 reader를 이용하여 각 웰로부터의 발광량을 측정했다. 농도 기지의 항hTfR 항체의 표준 시료의 측정치로부터 검량선을 작성하고, 이것에 각 검체의 측정치를 내삽하는 것에 의해, 각 조직 중 및 말초혈 중에 포함되는 항체의 양을 산출했다. 농도의 측정은 각 샘플에 대해 3회 반복하여 행했다.
뇌조직 및 척수 조직 중의 인간화 항hTfR 항체의 농도 측정의 결과를 표 8에 나타낸다.
Figure pct00008
인간화 항hTfR 항체 번호 3, 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2, 인간화 항hTfR 항체 번호 3(IgG4) 및 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2(IgG4)의 항체 모두, 대뇌피질, 소뇌, 해마, 연수 및 척수에서의 축적이 확인되었다(표 8). 그 양은, 인간화 항hTfR 항체 번호 3에서는, 음성 대조의 트라스투주맙(허셉틴TM)과 비교하여, 대뇌피질에서 약 82배, 소뇌에서 약 68배, 해마에서 약 92배, 연수에서 약 54배, 척수에서 약 3.1배이고, 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2에서는, 음성 대조의 트라스투주맙과 비교하여, 대뇌피질에서 약 128배, 소뇌에서 약 80배, 해마에서 약 136배, 연수에서 약 63배, 척수에서 약 3.1배이며, 인간화 항hTfR 항체 번호 3(IgG4)에서는, 음성 대조의 트라스투주맙과 비교하여, 대뇌피질에서 약 79배, 소뇌에서 약 66배, 해마에서 약 106배, 연수에서 약 54배, 척수에서 약 3.1배이고, 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2(IgG4)에서는, 음성 대조의 트라스투주맙과 비교하여, 대뇌피질에서 약 93배, 소뇌에서 약 63배, 해마에서 약 117배, 연수에서 약 66배, 척수에서 약 3.2배였다(표 9). 이들 결과는, 이들 4종의 인간화 항hTfR 항체가, 혈액뇌관문을 통과하여 뇌조직에 축적되는 성질을 가짐을 나타내는 것이고, 뇌조직 내에서 기능시켜야 할 약제를 이들 항체와 결합시키는 것에 의해, 그 약제를 효율 좋게 뇌조직에 축적시킬 수 있음을 나타내는 것이다.
Figure pct00009
그 다음에, 간장, 심장, 비장 및 골수의 각 조직 중의 인간화 항hTfR 항체의 농도 측정의 결과를 도 4에 나타낸다. 간장, 및 비장에서는, 4종류의 인간화 항hTfR 항체 및 음성 대조의 트라스투주맙의 어느 것에 있어서도 축적이 확인되었지만, 그 양은 인간화 항hTfR 항체와 트라스투주맙에서 동등했다. 심장에서는, 인간화 항hTfR 항체가 음성 대조의 트라스투주맙과 비교하여, 축적량이 많은 경향이 있었지만, 그 양은 음성 대조의 1.5배∼2.8배 정도에 머물렀다. 골수에서는, 인간화 항hTfR 항체가, 음성 대조의 트라스투주맙과 비교하여, 현저하게 축적량이 많은 경향이 있고, 그 양은 음성 대조의 3.5∼16배였다. 골수에의 인간화 항hTfR 항체의 축적은, 조혈 기관인 골수에서는 TfR의 발현량이 많아, TfR과 결합하는 것에 의해 많은 인간화 항hTfR 항체가 음성 대조와 비교하여 축적되었기 때문이라고 생각된다. 이들 데이터는, 이들 4종의 인간화 항hTfR 항체가, 중추 신경계인 대뇌, 소뇌, 해마 및 연수에 특이적으로 축적되는 성질을 가짐을 나타내는 것이고, 뇌조직 내에서 기능시켜야 할 약제를 이들 항체와 결합시키는 것에 의해, 그 약제를 효율 좋게 뇌조직에 축적시킬 수 있음을 나타내는 것이다.
그 다음에, 인간화 항hTfR 항체의 혈중 동태의 측정 결과를 표 9-2에 나타낸다. 4종류의 인간화 항hTfR 항체는, 음성 대조의 트라스투주맙과 마찬가지로, 투여 후 8시간에 있어서도 혈중 농도가 60μg/mL 이상의 높은 값을 나타내어, 혈중에서 안정됨이 나타났다(표 9-2).
[표 9-2]
Figure pct00010
뇌조직 중의 인간화 항hTfR 항체의 면역 조직화학 염색은, 실시예 8에 기재된 방법으로 행했다. 단, 이 때, Mouse IgG-heavy and light chain Antibody(Bethyl Laboratories사) 대신에 Human IgG-heavy and light chain Antibody(Bethyl Laboratories사)를 이용했다.
도 5에 대뇌피질의 인간화 항hTfR 항체의 면역 조직화학 염색의 결과를 나타낸다. 인간화 항hTfR 항체 번호 3, 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2, 인간화 항hTfR 항체 번호 3(IgG4) 및 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2(IgG4)를 투여한 원숭이의 대뇌피질에서는, 혈관 및 신경양 세포의 특이적인 염색이 확인되었다(각각 도 5b∼e). 특히, 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2를 투여한 원숭이의 대뇌피질(도 5c)에서는, 뇌혈관 외의 뇌실질 영역에도 광범위하게 특이적인 염색이 확인되었다. 한편, 컨트롤로 해둔 허셉틴을 투여한 원숭이의 대뇌피질에서는 염색은 확인되지 않아, 도 5b∼e에서 관찰된 조직 염색이, 인간화 항hTfR 항체에 특이적인 것임이 나타났다(도 5a).
도 6에 해마의 인간화 항hTfR 항체의 면역 조직화학 염색의 결과를 나타낸다. 인간화 항hTfR 항체 번호 3, 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2, 인간화 항hTfR 항체 번호 3(IgG4) 및 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2(IgG4)를 투여한 원숭이의 해마에서는, 혈관 및 신경양 세포의 특이적인 염색이 확인되었다(각각 도 6b∼e). 한편, 컨트롤로 해둔 허셉틴을 투여한 원숭이의 해마에서는 염색은 확인되지 않아, 도 6b∼e에서 관찰된 조직 염색이, 인간화 항hTfR 항체에 특이적인 것임이 나타났다(도 6a).
도 7에 소뇌의 인간화 항hTfR 항체의 면역 조직화학 염색의 결과를 나타낸다. 인간화 항hTfR 항체 번호 3, 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2, 인간화 항hTfR 항체 번호 3(IgG4) 및 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2(IgG4)를 투여한 원숭이의 소뇌에서는, 혈관 및 푸르킨예 세포의 특이적인 염색이 확인되었다(각각 도 7b∼e). 한편, 컨트롤로 해둔 허셉틴을 투여한 원숭이의 소뇌에서는 염색은 확인되지 않아, 도 7b∼e에서 관찰된 조직 염색이, 인간화 항hTfR 항체에 특이적인 것임이 나타났다(도 7a).
도 8에 연수의 인간화 항hTfR 항체의 면역 조직화학 염색의 결과를 나타낸다. 인간화 항hTfR 항체 번호 3, 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2, 인간화 항hTfR 항체 번호 3(IgG4) 및 인간화 항hTfR 항체 번호 3-2(IgG4)를 투여한 원숭이의 연수에서는, 혈관 및 신경양 세포의 특이적인 염색이 확인되었다(각각 도 8b∼e). 한편, 컨트롤로 해둔 허셉틴을 투여한 원숭이의 연수에서는 염색은 확인되지 않아, 도 8b∼e에서 관찰된 조직 염색이, 인간화 항hTfR 항체에 특이적인 것임이 나타났다(도 8a).
상기 실시예 8의 대뇌 및 소뇌의 면역 조직화학 염색의 결과로부터는, 인간화 전의 마우스 항체인 항hTfR 항체 번호 3은, 뇌혈관 내피 표면에 존재하는 hTfR에 결합할 수 있고, 또한, hTfR에의 결합 후, 혈액뇌관문을 통과하여 뇌실질 내로 이행하고, 추가로 해마에 있어서는 뇌실질 내로부터 신경양 세포에까지, 소뇌에 있어서는 푸르킨예 세포에까지, 받아들여짐을 나타내는 것이었다.
실시예 15의 대뇌, 해마, 소뇌 및 연수의 면역 조직화학 염색의 결과로부터는, 실험에 제공한 항hTfR 항체 번호 3을 인간화하여 얻어진 4종류의 인간화 항hTfR 항체는, 뇌혈관 내피 표면에 존재하는 hTfR에 결합하고, 또한, hTfR에의 결합 후, 혈액뇌관문을 통과하여 뇌실질 내로 이행하고, 추가로 대뇌피질에 있어서는 신경양 세포에까지, 해마에 있어서는 뇌실질 내로부터 신경양 세포에까지, 소뇌에 있어서는 푸르킨예 세포에까지, 연수에 있어서는 신경양 세포에 받아들여짐을 알 수 있었다.
〔실시예 15-2〕 hBDNF-인간화 항hTfR 항체 융합 단백질(hBDNF-항hTfR 항체 융합 단백질) 발현용 세포의 제작
서열 번호 56으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 hBDNF의 프로체의 C말단측에, Gly-Ser에 이어 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser이 5회 반복되는 합계 27개의 아미노산으로 이루어지는 링커 서열을 개재시켜, 서열 번호 77로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체 Fab 중쇄를 융합시킨 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 서열 번호 78로 나타나는 염기 서열을 갖는 DNA 단편을 인공적으로 합성했다. 여기에서, 서열 번호 77로 나타나는 아미노산 서열은, 서열 번호 37로 나타나는 아미노산 서열의 N말단측으로부터 1번째∼226번째에 상당한다. 여기에서 N말단측으로부터 1번째∼118번째의 아미노산 서열이 서열 번호 32(인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 2)에 상당하고, 119번째∼216번째의 아미노산 서열이 CH1 영역에 상당하고, 217번째∼226번째의 아미노산 서열이 힌지부에 상당한다.
이 DNA 단편은, 서열 번호 79로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 hBDNF의 프로체와 인간화 항hTfR 항체 Fab 중쇄의 융합 단백질을 코딩한다. 서열 번호 79로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질은, 발현 후에 프로세싱을 받아, 서열 번호 80으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 hBDNF와 인간화 항hTfR 항체 Fab 중쇄의 융합 단백질이 된다. 서열 번호 79로 나타나는 아미노산 서열에 있어서, N말단측으로부터 1번째∼110번째의 아미노산 서열이, hBDNF가 프로체로부터 성숙형으로 프로세싱될 때에 제거되는 부분이다. 이 DNA 단편을 MluI와 NotI로 소화하고, pE-neo 벡터의 MluI와 NotI의 사이에 짜넣어, pE-neo(BDNF-Fab HC-1)를 구축했다.
CHO 세포(CHO-K1: American Type Culture Collection으로부터 입수)를, 실시예 12에 기재된 방법에 의해, pE-neo(BDNF-Fab HC-1)와 실시예 11에서 구축한 pE-hygr(LC3)로 형질 전환하여, hBDNF와 인간화 항hTfR 항체의 융합 단백질을 발현하는 세포주를 얻었다. 이 세포주를, hBDNF-항hTfR 항체(3) 1 발현주로 했다. 이 세포주가 발현하는 hBDNF와 인간화 항hTfR 항체의 융합 단백질을 hBDNF-항hTfR 항체(3) 1로 했다.
〔실시예 15-3〕 hBDNF-항hTfR 항체(3) 1의 제작
실시예 15-2에서 얻어진 hBDNF-항hTfR 항체(3) 1 발현주를 이용하여, 실시예 13에 기재된 방법으로, hBDNF-항hTfR 항체(3) 1의 정제품을 얻었다.
〔실시예 16〕 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄에의 변이 도입
서열 번호 37로 나타나는 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄의 가변 영역에 있어서, CDR1를 서열 번호 12로 나타나는 것으로 했을 때의, 당해 CDR1의 아미노산 서열을 1개 치환함과 함께, 프레임워크 영역 3의 아미노산 서열을 1개 치환하는 인간화 항체의 중쇄를 작성했다. 이 새로운 항체의 중쇄는, CDR1에 서열 번호 66(또는 이것을 포함하는 서열 번호 67)의 아미노산 서열을 포함하고, 프레임워크 영역 3에 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하는 것이고, 따라서, 서열 번호 37로 나타나는 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄의 아미노산 서열을 구성하는 아미노산을 2개 치환한 것이다. 이 새로운 항체(인간화 항hTfR 항체 번호 3N)의 중쇄는, 서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하고, 그 가변 영역은 서열 번호 69로 나타나는 아미노산 서열을 포함하여 이루어진다.
표 10에 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄에 있어서의 서열 번호 12의 CDR1과 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄에 있어서의 서열 번호 66의 CDR1의 얼라인먼트를 나타냈다. 당해 얼라인먼트에 있어서, N말단측으로부터 5번째의 아미노산이, 트레오닌으로부터 메티오닌으로 치환되어 있다.
표 11에는, 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄에 있어서의 프레임워크 영역 3(서열 번호 83)과 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄에 있어서의 프레임워크 영역 3(서열 번호 68)의 아미노산 서열의 얼라인먼트를 나타낸다. 당해 얼라인먼트 에 있어서, N말단측으로부터 17번째의 아미노산이, 트립토판으로부터 류신으로 치환되어 있다.
Figure pct00011
Figure pct00012
〔실시예 17〕 인간화 항hTfR 항체 번호 3N 발현용 세포의 구축
서열 번호 70으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 항체의 중쇄를 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편(서열 번호 71)을 인공적으로 합성했다. 이 DNA 단편의 5'측에는, 5'단으로부터 순차로 MluI 서열과 리더 펩티드를 코딩하는 서열을, 3'측에는 NotI 서열을 도입했다. 이렇게 하여 합성한 DNA를 실시예 11에 기재된 방법으로 pE-neo 벡터에 짜넣고, 얻어진 벡터를, 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄 발현용 벡터의 pE-neo(HC3)N으로 했다. 이 pE-neo(HC3)N과 실시예 11에서 구축한 경쇄 발현용 벡터 pE-hygr(LC3)을 이용하여, 실시예 12에 기재된 방법으로 CHO 세포를 형질 전환시켜, 인간화 항hTfR 항체 번호 3N 발현주를 얻었다.
〔실시예 18〕 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 정제
실시예 17에서 얻어진 인간화 항hTfR 항체 번호 3N 발현주를 이용하여, 실시예 13에 기재된 방법으로, 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 정제품을 얻었다. 한편, 인간화 항hTfR 항체 번호 3N은, 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄의 아미노산 서열 중, 표 10 및 표 11로 나타나는 2개소의 아미노산을 치환한 것이다. 한편, 인간화 항hTfR 항체 번호 3N과 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄의 아미노산 서열은 동일하다.
〔실시예 19〕 인간화 항hTfR 항체 번호 3과 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 인간 TfR 및 원숭이 TfR에 대한 친화성의 비교
실시예 13에서 얻은 인간화 항hTfR 항체 번호 3과 실시예 17에서 얻은 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 인간 TfR 및 인간 TfR에 대한 친화성을, 실시예 7에 기재된 방법으로 측정했다. 표 12에 각각의 항체의 인간 TfR에 대한 회합 속도 상수(kon) 및 해리 속도 상수(koff)의 측정 결과, 및 해리 상수(KD)를 나타낸다. 한편, 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 인간 TfR에 대한 친화성을 나타내는 측정치는, 표 6에 나타난 것과 상이하지만, 실험 오차이다.
Figure pct00013
실시예 13에서 얻은 인간화 항hTfR 항체 번호 3과 실시예 17에서 얻은 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 인간 TfR 및 원숭이 TfR에 대한 친화성을, 실시예 7에 기재된 방법으로 측정했다. 표 13에 각각의 항체의 원숭이 TfR에 대한 회합 속도 상수(kon) 및 해리 속도 상수(koff)의 측정 결과, 및 해리 상수(KD)를 나타낸다. 한편, 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 원숭이 TfR에 대한 친화성을 나타내는 측정치는, 표 7에 나타난 것과 상이하지만, 실험 오차이다.
Figure pct00014
인간화 항hTfR 항체 번호 3N 및 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 원숭이 TfR과의 KD치를 비교하면, 전자가 5.07×10-11M이고 후자가 1.32×10-9M이며, 인간화 항hTfR 항체 번호 3N과 원숭이 TfR의 KD치는, 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 그것과 비교하여, 약 30분의 1이었다. 한편, 인간화 항hTfR 항체 번호 3N 및 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 인간 TfR과의 KD치를 비교하면, 모두 1×10-12M 미만으로, 어느 항체도 인간 TfR에 높은 친화성을 갖는 것이었다. 또한, 어느 항체도 원숭이 TfR에 대한 친화성보다 인간 TfR에 높은 친화성을 갖는다.
인간화 항hTfR 항체를 약제로서 개발할 때에 실시하는 비임상 시험의 일환으로서, 원숭이를 이용한 약리 시험을 실시하는 경우가 많다. 여기에서, 원숭이를 이용한 약리 시험의 결과는, 인간을 이용한 임상 시험을 실시할 타당성을 판단하기 위해서 이용되므로, 원숭이 체내에서의 거동이, 인간에게 투여했을 때의 거동과 보다 근사한 것인 것이 바람직하다. 상기의 결과와 같이, 인간화 항hTfR 항체 번호 3N은, 원숭이 TfR에 대한 친화성이 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 약 30배의 높은 값을 나타내므로, 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 원숭이 체내에서의 거동은, 인간에게 투여했을 때의 거동과 보다 근사하다고 말할 수 있다. 따라서, 인간화 항hTfR 항체 번호 3N을 이용하는 것에 의해, 원숭이를 이용한 시험으로, 보다 인간에게 투여했을 때의 거동을 반영한 결과가 얻어진다. 따라서, 원숭이를 이용한 시험에 의해, 인간을 이용한 임상 시험을 실시할 때의 판단 재료로서 보다 유익한 결과가 얻어지게 된다.
〔실시예 20〕 인간화 항hTfR 항체 번호 3과 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 원숭이를 이용한 뇌조직에의 이행성의 비교
실시예 13에서 얻은 인간화 항hTfR 항체 번호 3과 실시예 17에서 얻은 인간화 항hTfR 항체 번호 3N을, 각각, 5.0mg/kg의 용량으로 각각 웅성 필리핀원숭이에 단회 정맥내 투여하고, 투여 8시간 후에 전신 관류를 실시했다. 관류 후, 연수를 포함하는 뇌조직 및 척수 조직을 적출했다. 뇌조직에 대해서는, 적출 후에 대뇌피질, 소뇌, 해마 및 연수로 나누었다.
각 조직에 포함되는 인간화 항hTfR 항체의 농도 측정은, 실시예 15에 기재된 측정법에 준하여 행했다.
뇌조직 중의 항hTfR 항체의 농도 측정의 결과를 표 14에 나타낸다. 인간화 항hTfR 항체 번호 3N과 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 대뇌, 소뇌, 해마에 있어서의 농도를 비교하면, 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 농도는, 대뇌에 있어서는 약 1.42배, 소뇌에 있어서는 약 1.56배, 해마에 있어서는 약 1.29배로 인간화 항hTfR 항체 번호 3보다 높은 값을 나타냈다. 연수에 있어서는 양자의 농도는 거의 동등했다. 경추에 있어서도, 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 농도는, 약 1.47배로 인간화 항hTfR 항체 번호 3보다 높은 값을 나타냈다. 이들 결과는, 인간화 항hTfR 항체 번호 3N이 인간화 항hTfR 항체 번호 3과 비교하여, 보다 효율 좋게 혈액뇌관문을 통과하여 대뇌, 소뇌, 해마 등의 뇌조직에 축적되는 성질을 가짐을 나타내는 것이다. 즉, 인간화 항hTfR 항체 번호 3N은, 뇌조직 내에서 기능시켜야 할 약제를 이들 항체와 결합시키는 것에 의해, 그 약제를 효율 좋게 뇌조직에 축적시킬 수 있는 성질을 가짐을 나타내는 것이다.
Figure pct00015
〔실시예 20-2〕 hFc-인간화 항hTfR 항체 발현용 세포의 제작
서열 번호 81로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 인간 IgG Fc 영역이 도입된 인간화 항hTfR 항체 3N의 Fab 중쇄의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 단편(서열 번호 82)을 인공적으로 합성했다. 이 DNA 단편의 5'측에는, 5'단으로부터 순차로 MluI 서열과 리더 펩티드를 코딩하는 서열이, 3'측에는 NotI 서열이 도입되어 있다. 이렇게 하여 합성한 DNA를 실시예 11에 기재된 방법으로 pE-neo 벡터에 짜넣고, 얻어진 벡터를 pE-neo(Fc-Fab HC(3N))로 했다. 이 pE-neo(Fc-Fab HC(3N))와 실시예 11에서 구축한 경쇄 발현용 벡터 pE-hygr(LC3)을 이용하여, 실시예 12에 기재된 방법으로 CHO 세포를 형질 전환시켜, Fc-Fab(3N) 발현주를 얻었다.
〔실시예 20-3〕 hFc-인간화 항hTfR 항체의 제작
Fc-Fab(3N) 발현주를 이용하여, 실시예 13에 기재된 방법으로, Fc-Fab(3N)의 정제품을 얻었다.
〔실시예 20-4〕 hFc-인간화 항hTfR 항체의 인간 TfR 및 원숭이 TfR에 대한 친화성의 비교
실시예 20-3에서 얻어진 Fc-Fab(3N)의 정제품의 인간 TfR 및 원숭이 TfR에 대한 친화성을, 실시예 7에 기재된 방법으로 측정했다. 결과를 표 14-2에 나타낸다. 이 결과는, Fc-Fab(3N)는, 뇌조직 내에서 기능시켜야 할 약제를 이들 항체와 결합시키는 것에 의해, 그 약제를 효율 좋게 뇌조직에 축적시킬 수 있는 성질을 가짐을 나타내는 것이다.
[표 14-2]
Figure pct00016
〔실시예 20-5〕 hFc-인간화 항hTfR 항체의 원숭이를 이용한 뇌조직에의 이행성의 측정
실시예 20-3에서 얻어진 Fc-Fab(3N)를, 5.0mg/kg의 용량으로 웅성 필리핀원숭이에 단회 정맥내 투여하고, 투여 8시간 후에 전신 관류를 실시했다. 관류 후, 연수를 포함하는 뇌조직 및 척수 조직을 적출했다. 뇌조직에 대해서는, 적출 후에 대뇌피질, 소뇌, 해마 및 연수로 나누었다.
각 조직에 포함되는 인간화 항hTfR 항체의 농도 측정은, 실시예 15에 기재된 측정법에 준하여 행했다.
뇌조직 중의 항hTfR 항체의 농도 측정의 결과를 표 14-3에 나타낸다. Fc-Fab(3N)의 대뇌, 소뇌, 해마에 있어서의 농도는, 각각, 0.80μg/g 습중량, 0.80μg/g 습중량, 및 1.05μg/g이었다. 또한, 연수 및 경수에 있어서의 농도는, 각각, 0.67μg/g 습중량 및 0.68μg/g 습중량이었다. 이들 결과는, Fab인 인간화 항hTfR 항체의 N말단측에 Fc 영역을 결합시켰을 경우에도, 항hTfR 항체가 BBB를 통과할 수 있음을 나타내는 것이다. 따라서, Fab에 BDNF를 결합시킨 결합체가, 생체 내에 투여했을 때에 불안정한 경우에, Fab의 N말단측에 Fc 영역에 결합시키는 것에 의해, BBB를 통과하는 특성을 유지시키면서, 이러한 결합체를 생체 내에서 안정화, 예를 들어, 당해 결합체의 혈중반감기를 증가시킬 수 있다.
[표 14-3]
Figure pct00017
〔실시예 21〕 hBDNF-인간화 항hTfR 항체 융합 단백질(hBDNF-항hTfR 항체 융합 단백질) 발현용 세포의 제작
(1) 서열 번호 56으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 hBDNF의 프로체의 C말단측에, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser이 5회 반복되는 합계 25개의 아미노산으로 이루어지는 링커 서열을 개재시켜, 서열 번호 61로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체 3NFab 중쇄를 융합시킨 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 서열 번호 62로 나타나는 염기 서열을 갖는 DNA 단편을 인공적으로 합성했다. 여기에서, 서열 번호 61로 나타나는 아미노산 서열은, 서열 번호 70으로 나타나는 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄의 아미노산 서열의 N말단측으로부터 1번째∼226번째에 상당한다. 여기에서 N말단측으로부터 1번째∼118번째의 아미노산 서열이 서열 번호 69(인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열)에 상당하고, 119번째∼216번째의 아미노산 서열이 CH1 영역에 상당하고, 217번째∼226번째의 아미노산 서열이 힌지부에 상당한다.
이 DNA 단편은, 서열 번호 63으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는, hBDNF의 프로체와 인간화 항hTfR 항체 3NFab 중쇄의 융합 단백질을 코딩한다. 서열 번호 63으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질은, 발현 후에 프로세싱을 받아, 서열 번호 65로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 hBDNF와 인간화 항hTfR 항체 Fab 중쇄의 융합 단백질이 된다. 서열 번호 63으로 나타나는 아미노산 서열에 있어서, N말단측으로부터 1번째∼110번째의 아미노산 서열이, hBDNF가 프로체로부터 성숙형으로 프로세싱될 때에 제거되는 부분이다. 이 DNA 단편을 MluI와 NotI로 소화하고, pE-neo 벡터의 MluI와 NotI의 사이에 짜넣어, pE-neo(BDNF-Fab HC(3N))를 구축했다.
(2) 또한, 서열 번호 56으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 hBDNF의 프로체의 C말단측에, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser이 5회 반복되는 합계 25개의 아미노산으로 이루어지는 링커 서열을 개재시켜, 서열 번호 75의 Fc 영역의 서열, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser이 5회 반복되는 합계 25개의 아미노산으로 이루어지는 링커 서열, 및, 서열 번호 61로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 인간화 항hTfR 항체 3NFab 중쇄를, N말단측으로부터 C말단측에 이 순서로 융합시킨 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 서열 번호 73으로 나타나는 염기 서열을 갖는 DNA 단편을 인공적으로 합성했다.
이 DNA 단편은, 서열 번호 74로 나타나는 융합 단백질을 코딩한다. 서열 번호 74로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질은, 발현 후에 프로세싱을 받아, hBDNF의 프로체 부분이 hBDNF가 된다. 서열 번호 74로 나타나는 아미노산 서열에 있어서, N말단측으로부터 1번째∼110번째의 아미노산 서열이, hBDNF가 프로체로부터 성숙형으로 프로세싱될 때에 제거되는 부분이다. 이 DNA 단편을 MluI와 NotI로 소화하고, pE-neo 벡터의 MluI와 NotI의 사이에 짜넣어, pE-neo(BDNF-Fc-Fab HC(3N))를 구축했다.
CHO 세포(CHO-K1: American Type Culture Collection으로부터 입수)를, pE-neo(BDNF-Fab HC(3N))와 실시예 11에서 구축한 pE-hygr(LC3)에 의해 형질 전환하여, hBDNF와 인간화 항hTfR 항체 3N의 융합 단백질을 발현하는 세포주를 얻었다. 이 세포주를, hBDNF-항hTfR 항체(3N) 1 발현주로 했다. 이 세포주가 발현하는 hBDNF와 인간화 항hTfR 항체의 융합 단백질을 hBDNF-항hTfR 항체(3N) 1로 했다. 또한, CHO 세포를, pE-neo(BDNF-Fc-Fab HC(3N))와 실시예 11에서 구축한 pE-hygr(LC3)에 의해 형질 전환하여, 다른 hBDNF와 인간화 항hTfR 항체 3N의 융합 단백질을 발현하는 세포주를 얻었다. 이 세포주를, hBDNF-항hTfR 항체(3N) 2 발현주로 했다. 이 세포주가 발현하는 hBDNF와 인간화 항hTfR 항체의 융합 단백질을 hBDNF-항hTfR 항체(3N) 2로 했다.
〔실시예 21-2〕 알부민 결합 도메인(ABD) 부가형 hBDNF-인간화 항hTfR 항체 융합 단백질의 발현용 세포의 제작
서열 번호 56으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 hBDNF의 프로체의 C말단측에, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser이 5회 반복되는 합계 25개의 아미노산으로 이루어지는 링커 서열을 개재시켜, 서열 번호 61로 나타나는 아미노산 서열의 제1번째로부터 제216번째에 대응하는 아미노산 서열(서열 번호 84)을 갖는 인간화 항hTfR 항체 3NFab 중쇄를 융합시키고, 추가로, 그 C말단측에, 서열 번호 3으로 나타나는 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser이 3회 반복되는 합계 15개의 아미노산으로 이루어지는 링커 서열을 개재시켜, 서열 번호 85로 나타나는 ABD를 융합시킨 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는, 서열 번호 86으로 나타나는 염기 서열을 갖는 DNA 단편을 인공적으로 합성했다. 여기에서, 서열 번호 84로 나타나는 아미노산 서열은, 서열 번호 70으로 나타나는 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄의 아미노산 서열의 N말단측으로부터 1번째∼216번째에 상당한다. 여기에서 N말단측으로부터 1번째∼118번째의 아미노산 서열이 서열 번호 69(인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열)에 상당하고, 119번째∼216번째의 아미노산 서열이 CH1 영역에 상당한다.
이 DNA 단편은, 서열 번호 87로 나타나는 아미노산 서열을 갖는, hBDNF의 프로체와 인간화 항hTfR 항체 3NFab 중쇄의 융합 단백질의 C말단측에 ABD가 부가한 융합 단백질을 코딩한다. 서열 번호 87로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 융합 단백질은, 발현 후에 프로세싱을 받아, 서열 번호 88로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 hBDNF와 인간화 항hTfR 항체 Fab 중쇄의 융합 단백질의 C말단측에 ABD가 부가된 융합 단백질이 된다. 서열 번호 87로 나타나는 아미노산 서열에 있어서, N말단측으로부터 1번째∼110번째의 아미노산 서열이, hBDNF가 프로체로부터 성숙형으로 프로세싱될 때에 제거되는 부분이다. 이 DNA 단편을 MluI와 NotI로 소화하고, pE-neo 벡터의 MluI와 NotI의 사이에 짜넣어, pE-neo(BDNF-Fab HC(3N)) ABD를 구축했다.
CHO 세포(CHO-K1: American Type Culture Collection으로부터 입수)를, pE-neo(BDNF-Fab HC(3N)) ABD와 실시예 11에서 구축한 pE-hygr(LC3)에 의해 형질 전환하여, hBDNF와 인간화 항hTfR 항체 3N의 융합 단백질의 C말단측에 ABD가 부가된 융합 단백질을 발현하는 세포주를 얻었다. 이 세포주를, hBDNF-항hTfR 항체(3N) ABD 발현주로 했다. 이 세포주가 발현하는 hBDNF와 인간화 항hTfR 항체의 융합 단백질의 C말단측에 ABD가 부가된 융합 단백질을 hBDNF-항hTfR 항체(3N) ABD로 했다.
〔실시예 22〕 hBDNF-인간화 항hTfR 항체 융합 단백질의 제조
hBDNF-인간화 항hTfR 항체 융합 단백질은, 이하의 방법으로 제조했다. 실시예 21에서 얻은 hBDNF-항hTfR 항체(3N) 1 발현주를, 세포 농도가 약 2×105개/mL가 되도록, CD OptiCHOTM 배지로 희석하고, 1L의 삼각 플라스크에 200mL의 세포 현탁액을 가하고, 37℃에서, 5% CO2와 95% 공기로 이루어지는 습윤 환경에서 약 70rpm의 교반 속도로 6∼7일간 배양했다. 배양 상청을 원심 조작에 의해 회수하고, 0.22μm 필터(Millipore사)로 여과하여, 배양 상청으로 했다. 상기의 회수한 배양 상청에, 컬럼 체적의 5배용의 150mL NaCl을 포함하는 20mM Tris 완충액(pH 8.0)을 첨가하고, 컬럼 체적 3배용의 150mM NaCl을 포함하는 20mM Tris 완충액(pH 8.0)으로 미리 평형화해 둔 Protein L 컬럼(컬럼 체적: 1mL, GE헬스케어사)에 부하했다. 그 다음에, 컬럼 체적의 5배용의 동 완충액을 공급하여 컬럼을 세정한 후, 150mM NaCl을 포함하는 컬럼 체적의 4배용의 50mM 글리신 완충액(pH 2.8)으로, 흡착된 hBDNF-항hTfR 항체(3N) 1을 용출시켰다. 용출 후 즉시 1M Tris 완충액(pH 8.0)을 이용하여 pH 7.0으로 조정했다. 이것을 hBDNF-항hTfR 항체(3N) 1의 정제품으로서 이하의 시험에 이용했다.
hBDNF-항hTfR 항체(3N) 2에 대해서도 hBDNF-항hTfR 항체(3N) 1과 마찬가지의 수법으로 정제품을 얻었다.
〔실시예 22-2〕 hBDNF-항hTfR 항체(3N) ABD의 제조
hBDNF-항hTfR 항체 융합 단백질은, 이하의 방법으로 제조했다. 실시예 21-2에서 얻은 hBDNF-항hTfR 항체(3N) ABD 발현주를, 세포 농도가 약 2×105개/mL가 되도록, CD OptiCHOTM 배지로 희석하고, 1L의 삼각 플라스크에 200mL의 세포 현탁액을 가하고, 37℃에서, 5% CO2와 95% 공기로 이루어지는 습윤 환경에서 약 70rpm의 교반 속도로 6∼7일간 배양했다. 배양 상청을 원심 조작에 의해 회수하고, 0.22μm 필터(Millipore사)로 여과하여, 배양 상청으로 했다.
회수한 배양 상청을, 컬럼 체적의 5배용의 50mM의 NaCl을 포함하는 10mM HEPES 완충액(pH 7.0)으로 평형화한 HR-S 컬럼(컬럼 체적: 5mL, BioRad사)에 부하했다. 그 다음에, 컬럼 체적의 5배용의 동 완충액을 공급하여 컬럼을 세정한 후, 컬럼 체적의 15배용의 1M의 NaCl을 포함하는 10mM HEPES 완충액(pH 8.2)으로, 흡착된 hBDNF-항hTfR 항체(3N) ABD를 용출시켜, hBDNF-항hTfR 항체(3N) ABD를 포함하는 획분을 회수했다. 이 공정을 4회 실시했다.
상기의 용출 획분을 4배용의 10mM HEPES 완충액(pH 7.0)을 가하여 희석했다. 이 희석한 용출 획분을, 컬럼 체적의 5배용의 50mM의 NaCl을 포함하는 10mM HEPES 완충액(pH 7.0)으로 평형화한 Nuvia cPrime 컬럼(컬럼 체적: 5mL, BioRad사)에 부하했다. 컬럼 체적의 25배용의 1M NaCl을 포함하는 10mM HEPES 완충액(pH 8.2)을 공급하여 컬럼을 세정한 후, 15배용의 2M의 NaCl, 0.4M 아르기닌을 포함하는 10mM HEPES 완충액(pH 8.5)으로, 흡착된 hBDNF-항hTfR 항체(3N) ABD를 용출시켜, hBDNF-항hTfR 항체(3N) ABD를 포함하는 획분을 회수했다. 이렇게 하여 회수한 것을, hBDNF-항hTfR 항체(3N) ABD의 정제품으로서 이하의 실험에 이용했다.
〔실시예 23〕 BDNF 수용체(TrkB) 발현 세포를 이용한 hBDNF-항hTfR 항체 융합 단백질의 BDNF 활성의 평가
실시예 16, 실시예 22 및 실시예 22-2에서 제조한 hBDNF-항hTfR 항체 융합 단백질이 갖는 BDNF 생물 활성은, TrkB 유전자를 차이니즈 햄스터 난소 유래 세포(CHO 세포)에 도입한 CHO-TrkB 세포에 있어서의 Ca 농도 변화를 지표로 한 세포내 시그널 전달 증강 활성의 측정에 의해 평가했다.
CHO 세포를 계대용 배지(Nutrient Mixture F-12 Ham, 10% 소 태아 혈청)에서 배양했다. 그 후, 평가용 배지(Nutrient Mixture F-12 Ham, 3% 소 태아 혈청, 10mM Hepes(pH 7.4))로 교환하여, 세포 현탁액을 제작했다. 세포에 아포에쿠오린 및 인간 TrkB(GenBank Acc. No. NP＿001018074.1)를 발현하는 바이러스를 도입하고, 2×103세포/웰이 되도록 흑색 384 세포 배양용 bottom clear plate에 파종 후, CO2 인큐베이터(37℃, 95% Air, 5% CO2) 내에서 하룻밤 정치 배양했다.
1μM의 Viviren(프로메가)을 포함하는 HHBS액(1×Hanks' Balanced Salt Solution, 20mM HEPES(pH 7.4))을 20μL/well로 첨가하고, 실온에서 4시간 정치했다. 0.1%의 Bovine serum albumin을 포함하는 HHBS액으로, BDNF 및 hBDNF-항hTfR 항체 융합 단백질(hBDNF-항hTfR 항체(3N) 1 및 2, 및 hBDNF-항hTfR 항체(3N) ABD)을, 각각 목적하는 농도로 희석하여, 첨가 후, FDSS7000(하마마츠포토닉스)으로 경시적으로 발광 강도를 측정했다. 111ng/mL의 BDNF(#450-02, Peprotech사)가 나타내는 발광 강도를 100%로 하여 얻어진 발광 강도로부터 상대적인 TrkB 작동 활성을 계산하고, 그 용량 반응 곡선으로부터 EC50을 산출하여 BDNF 활성으로 했다. 표 15에 hBDNF-항hTfR 항체 융합 단백질의 평가 결과를 나타낸다.
Figure pct00018
〔실시예 24〕 래트 초대 배양 신경세포를 이용한 hBDNF-항hTfR 항체 융합 단백질의 TrkB 수용체 시그널 증강 작용의 평가
실시예 22 및 실시예 22-2에서 제조한 hBDNF-항hTfR 항체 융합 단백질이 갖는 BDNF 생물 활성을, 래트 초대 배양 신경세포에 있어서의 Erk의 인산화 작용을 지표로 한 세포내 시그널 전달 증강 활성의 측정에 의해 평가했다. 초대 배양 신경세포는, 마우스 혹은 래트 태아의 뇌의 각 부위, 예를 들어 선조체, 피질, 혹은 해마 등으로부터 조제하거나, 혹은 판매되고 있는 초대 배양 신경세포를 구입하여 사용하지만, 이번에는 래트 태아의 선조체로부터 조제했다.
태생 15-19일의 새끼 래트 뇌로부터 선조체를 채취하고, 빙랭 cHBSS액(1mM 피루브산, 0.5% D(＋)글루코스 및 10mM HEPES 함유 Hanks' Balanced Salt Solution)에 침지했다. cHBSS액을 제거하고, 0.1mg/mL DNase I, 5mM MgCl2 및 0.3mg/mL 파파인을 포함하는 cHBSS액(효소 반응액)을 첨가하고, 37℃에서 1-5분간 인큐베이션했다. 효소 반응액을 제거하고, 빙랭 10% FBS 함유 NGPS액(0.5mML-글루타민산 및 페니실린 스트렙토마이신액(DS파마바이오메디칼)을 포함하는 Neurobasal Medium)을 첨가하여, 효소 반응을 정지시켰다. 10% FBS 함유 NGPS액을 제거하고, 빙랭 cHBSS액으로 3회 세정했다. 계속하여 빙랭 cHBSS액 중에서 신경세포를 분산시켜, 70μm 셀 스트레이너(Falcon 2350)에 첨가하고, 더욱 cHBSS액을 추가하여 여과했다. 여과액을 원심(1000rpm, 4분간, 실온)하여 침사(沈渣)를 모으고, cHBSS액에 재현탁하고, 현탁액 중의 세포수를 카운트했다. 1×106세포/mL가 되도록 B-27TM(Serum-Free Supplement(50X), 인비트로젠)을 포함하는 NGPS액으로 희석하고, Poly-D-Lysine 플레이트에 파종 후, CO2 인큐베이터(37℃, 95% Air, 5% CO2) 내에서 1주간 정치 배양했다.
각 웰로부터 배양액을 제거하고, NGPS액으로 세포를 세정 후, NGPS액을 첨가하고 CO2 인큐베이터(37℃, 95% Air, 5% CO2) 내에서 2시간 정치했다. NGPS액으로 BDNF 및 hBDNF-항hTfR 항체 융합 단백질을 각각 목적하는 농도로 희석하여, 첨가 후, CO2 인큐베이터(37℃, 95% Air, 5% CO2) 내에서 30분간 정치했다. 반응 후, 플레이트를 빙상에 두고, 빙랭 Phosphate Buffered Saline으로 세정했다. 세정 후, Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail(써모 피셔 사이언티픽)을 포함하는 RIPA 버퍼(Pierce)를 첨가하고 10분간 빙상에 정치했다. 셀 스크레이퍼를 이용하여 세포를 긁어내어, 튜브에 회수하고, 볼텍스로 교반 후 10분간 빙상에 정치했다. 원심(13,500rpm, 10분간, 4℃)하고 상청을 채취하여, Erk 인산화 어세이까지 -80℃에서 동결 보존했다(일부를 이용하여 단백 정량을 행했다).
단백 정량은, Pierce BCA Protein Assay Kit(써모 피셔 사이언티픽)를 이용하여 행했다. 상기 채취 샘플을 단백 농도가 검출 범위 내가 되도록 증류수로 희석하고, 96구멍 플레이트에 10μL/well씩 분주했다. 또한, Protein assay solution(Reagent A:Reagent B=50:1 혼합액)을 200μL/well씩 첨가했다. 37℃에서 30분간 인큐베이트 후, 플레이트 리더를 이용하여 흡광도(562nm)를 측정하고, 동시에 측정한 Bovine Serum Albumin 표준액의 흡광도부터 제작한 검량선으로부터 단백 농도를 산출했다.
Erk 인산화 어세이는, Erk 1/2 ELISA Kit Simple Step(pT202/Y204＋Total)(압캠)을 이용하여 행했다. 상기 채취 샘플을 Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail(Thermo)을 포함하는 RIPA 버퍼(Pierce)로 0.5mg/mL가 되도록 희석하고, 어세이 키트에 부속되어 있는 Simple Step Pre-Coated 96구멍 플레이트에 50μL/well씩 분주했다. Antibody Cocktail을 50μL/well씩 첨가하고 교반하면서 실온에서 1시간 인큐베이트했다. Wash Buffer(350μL/well)로 well 내를 세정 후, TMB substrate를 100μL/well씩 첨가하고, 교반하면서 실온 차광하에서 15분간 인큐베이트했다. Stop Solution(100μL/well)을 100μL/well씩 첨가하여 반응을 정지시키고, 플레이트 리더를 이용하여 흡광도를 측정했다(450nm). 용매 처치에서 확인되는 인산화 Erk 레벨에 대해서, BDNF 혹은 hBDNF-항hTfR 항체 융합 단백질에 의한 인산화 Erk 레벨의 상대적인 증가량을 평가하는 것에 의해 hBDNF-항hTfR 항체 융합 단백질이 갖는 BDNF 생물 활성을 평가했다. 표 15-2에 Erk 인산화 활성의 평가 결과를 나타낸다.
[표 15-2]
Figure pct00019
〔실시예 25〕 hBDNF-항hTfR 항체(3N) 1의 인간 TfR 및 원숭이 TfR에 대한 친화성의 측정
실시예 22에서 제조한 hBDNF-항hTfR 항체(3N) 1의 인간 TfR 및 원숭이 TfR에 대한 친화성을 측정했다. 측정은 대체로 하기의 방법으로 행했다.
비오틴 표지된 토끼 항인간 BDNF 폴리클로날 항체(항인간 BDNF 항체: PeproTech사)를 HBS-P＋(1% BSA)(150mM NaCl, 50μM EDTA, 0.05% Surfactant P20 및 1% BSA를 포함하는 10mM HEPES)로 희석하여, 15μg/mL의 용액을 조제하고, 이 용액을 리간드 용액 1로 했다. 항hTfR 항체 융합 BDNF(hBDNF-항hTfR 항체(3N) 1)의 정제품을, HBS-P＋(1%BSA)로 희석하여, 이 용액을 리간드 용액 2로 했다. 또한, 대조 물질로서 실시예 15-3에서 얻은 hBDNF-항hTfR 항체(3) 1의 정제품에 대해서도 HBS-P＋(1%BSA)로 희석한 리간드 용액 3을 조제했다. r인간 TfR과 r원숭이 TfR을, 각각 HBS-P＋(1%BSA)로 2단계 희석하여, 0.78125∼50nM(0.585∼3.74μg/mL)의 7단계의 농도의 용액을 조제했다. 이 TfR 용액을 샘플 용액으로 했다.
상기 2단계 희석하여 조제한 샘플 용액을, 96 well plate, black(greinerbioone사)에 200μL/웰씩 첨가했다. 또한, 상기 조제한 리간드 용액 1, 리간드 용액 2 및 리간드 용액 3을, 소정의 웰에 각각 200μL/웰씩 첨가했다. 베이스라인, 해리용 및 세정용의 웰에는, HBS-P＋(1%BSA)를 200μL/웰씩 첨가했다. 이 플레이트와 바이오센서(Biosensor/SA: ForteBio사, a division of Pall Corporation)를, OctetRED96의 소정의 위치에 설치했다.
OctetRED96을 하기의 표 15-3에 나타내는 조건에서 작동시켜 항인간 BDNF 항체를 센서에 고상화했다. 계속하여, OctetRED96을 하기의 표 15-4에 나타내는 조건에서 작동시켜 데이터를 취득 후, OctetRED96 부속의 해석 소프트웨어를 이용하여, 결합 반응 곡선을 1:1 결합 모델 혹은 2:1 결합 모델에 피팅하여, 항hTfR 항체 융합 BDNF와 r인간 TfR 및 r원숭이 TfR에 대한 회합 속도 상수(kon) 및 해리 속도 상수(koff)를 측정하여, 해리 상수(KD)를 산출했다. 한편, 측정은 25∼30℃의 온도하에서 실시했다.
[표 15-3]
Figure pct00020
[표 15-4]
Figure pct00021
표 16에 hBDNF-항hTfR 항체(3N) 1의 인간 TfR 및 원숭이 TfR에 대한 회합 속도 상수(kon) 및 해리 속도 상수(koff)의 측정 결과, 및 해리 상수(KD)를 나타낸다. hBDNF-항hTfR 항체(3N) 1의 인간 TfR과의 해리 상수는 7.42×10-12M이며, 원숭이 TfR과의 해리 상수는 7.94×10-10M이었다. 이들 결과는, hBDNF-항hTfR 항체(3N) 1이, 인간 TfR 및 원숭이 TfR에 대해 높은 친화성을 갖는 것임을 나타낸다. 또한, hBDNF-항hTfR 항체(3) 1의 인간 TfR 및 원숭이 TfR에 대한 해리 상수는, 각각 2.51×10-10M과 3.94×10-8M이었다. 즉, hBDNF-항hTfR 항체(3N) 1은, hBDNF-항hTfR 항체(3) 1과 비교하여, 인간 TfR 및 원숭이 TfR에 대해서 극히 높은 친화성을 가짐을 이해할 수 있다.
Figure pct00022
〔실시예 25-2〕 hBDNF-항hTfR 항체(3N) ABD의 인간 TfR, 원숭이 TfR 및 HSA에 대한 친화성의 측정
hBDNF-항hTfR 항체(3N) ABD와 인간 TfR, 원숭이 TfR 및 인간 혈청알부민(HSA)에 대한 친화성의 측정은, 실시예 25와 마찬가지로, 바이오레이어 간섭법(BioLayer Interferometry: BLI)을 이용한 생체 분자 상호작용 해석 시스템인 OctetRED96(ForteBio사, a division of Pall Corporation)을 이용하여 실시했다. 측정은, 대체로 OctetRED96에 첨부된 조작 메뉴얼에 따라 실시했다. 이하에 상술한다.
비오틴 표지된 토끼 항인간 BDNF 폴리클로날 항체(항인간 BDNF 항체: PeproTech사)를 HBS-P＋(1% BSA)(150mM NaCl, 50μM EDTA, 0.05% Surfactant P20 및 1% BSA를 포함하는 10mM HEPES)로 희석하여, 25μg/mL의 용액을 조제하고, 이 용액을 리간드 용액 1로 했다. hBDNF-항hTfR 항체(3N) ABD의 정제품을, HBS-P＋로 희석하여, 이 용액을 리간드 용액 2로 했다. r인간 TfR과 r원숭이 TfR을, 각각 HBS-P＋로 2단계 희석하여, 0.78125∼50nM(0.0585∼3.74μg/mL)의 7단계의 농도의 용액을 조제했다. 이 TfR 용액을 TfR 샘플 용액으로 했다. 한편, r인간 TfR과 r원숭이 TfR은 실시예 7에 기재된 것을 이용했다. 또한, HSA(인간 혈청 알부민 제제(헌혈 알부민 25-니치야쿠, 닛폰제약주식회사)를, HBS-P＋로 2단계 희석하여, 3.13∼200nM(0.208∼13.3μg/mL)의 7단계의 농도의 용액을 조제했다. 이 HSA 용액을 HSA 샘플 용액으로 했다.
상기 2단계 희석하여 조제한 TfR 샘플 용액 및 HSA 샘플 용액을, 각각 96 well plate, black(greinerbio-one사)에 200μL/웰씩 첨가했다. 또한, 상기 조제한 리간드 용액 1 및 리간드 용액 2를, 소정의 웰에 각각 200μL/웰씩 첨가했다. 베이스라인, 해리용 및 세정용의 웰에는, HBS-P＋를 200μL/웰씩 첨가했다. 이 플레이트와 바이오센서(Biosensor/SA: ForteBio사, a division of Pall Corporation)를, OctetRED96의 소정의 위치에 설치했다.
OctetRED96을 실시예 25에 기재된 표 15-3에 나타내는 조건에서 작동시켜 항인간 BDNF 항체를 센서에 고상화했다. 그 다음에, OctetRED96을 표 16-2에 나타내는 조건에서 작동시켜 데이터를 취득 후, OctetRED96 부속의 해석 소프트웨어를 이용하여, 결합 반응 곡선을 1:1 결합 모델에 피팅하여, hBDNF-항hTfR 항체(3N) ABD와 r인간 TfR, r원숭이 TfR 및 HSA에 대한 회합 속도 상수(kon) 및 해리 속도 상수(koff)를 측정하여, 해리 상수(KD)를 산출했다. 한편, 측정은 25∼30℃의 온도하에서 실시했다.
[표 16-2]
Figure pct00023
표 16-3에 hBDNF-항hTfR 항체(3N) ABD의 인간 TfR, 원숭이 TfR 및 HSA에 대한 회합 속도 상수(kon) 및 해리 속도 상수(koff)의 측정 결과, 및 해리 상수(KD)를 나타낸다.
[표 16-3]
Figure pct00024
hBDNF-항hTfR 항체(3N) ABD의, 인간 TfR 및 원숭이 TfR과의 해리 상수는, 각각 5.66×10-11M 및 6.26×10-10M이었다. 이들 결과는, hBDNF와 항hTfR 항체의 융합 단백질의 C말단측에 ABD를 부가시켜도, 당해 융합 단백질의 인간 TfR 및 원숭이 TfR에 대한 고친화성이 유지됨을 나타낸다. 또한, hBDNF-항hTfR 항체(3N) ABD의, 의, HSA와의 해리 상수는, 1.35×10-8M이었다. 이들 결과는, hBDNF-항hTfR 항체(3N) ABD가, TfR(인간 및 원숭이)와 ABD의 어느 것에도 고친화성을 가짐을 나타내는 것이다. 즉, hBDNF-항hTfR 항체(3N) ABD를, 인간의 혈중에 투여했을 때에, ABD를 개재시켜 혈중에 존재하는 알부민과 결합하는 것에 의해 혈중반감기가 상승하는 것, 및 TfR을 개재시켜 BBB를 통과하는 것의 모두가 달성됨을 나타낸다. 더욱이, 알부민과 결합하는 것에 의해, hBDNF-항hTfR 항체(3N)의 면역원성을 저하시킬 수도 있음을 나타낸다.
〔실시예 26〕 hBDNF-항hTfR 항체(3N) 1의 마우스를 이용한 뇌이행 평가
hBDNF-항hTfR 항체(3N) 1에 대해, BBB를 통과하여 뇌내로 이행하는 것을, 마우스 트랜스페린 수용체의 세포외 영역을 코딩하는 유전자를 인간 트랜스페린 수용체 유전자의 세포외 영역을 코딩하는 유전자로 치환한 hTfR 노크인 마우스(hTfR-KI 마우스)를 이용하여 평가했다. hTfR-KI 마우스는, 대체로 하기의 방법으로 제작했다. 또한, hBDNF-항hTfR 항체(3N) 1로서는, 실시예 22에 기재된 정제품을 이용했다.
세포내 영역이 마우스 hTfR의 아미노산 서열이며, 세포외 영역이 인간 hTfR의 아미노산 서열인 키메라 hTfR을 코딩하는 cDNA의 3'측에, loxP 서열로 끼워 넣은 네오마이신 내성 유전자를 배치한, 서열 번호 45로 나타나는 염기 서열을 갖는 DNA 단편을 화학적으로 합성했다. 이 DNA 단편을, 5'암 서열로서 서열 번호 46으로 나타나는 염기 서열, 3'암 서열로서 서열 번호 47로 나타나는 염기 서열을 갖는 타게팅 벡터에, 통상적 방법에 의해 짜넣고, 이것을 마우스 ES 세포에 일렉트로포레이션법에 의해 도입했다. 유전자 도입 후의 마우스 ES 세포를, 네오마이신 존재하에서 선택 배양하고, 타게팅 벡터가 상동 재조합에 의해 염색체에 짜넣어진 마우스 ES 세포를 선택했다. 얻어진 유전자 재조합 마우스 ES 세포를, ICR 마우스의 8세포기배(숙주배)에 주입하고, 정관 결찰을 실시한 마우스와의 교배에 의해 얻어진 위임신 마우스(레시피언트 마우스)에게 이식했다. 얻어진 산자(키메라 마우스)에 대해 모색 판정을 행하여, ES 세포가 생체의 형성에 고효율로 기여한 개체, 즉 전체 모에 대한 백색모가 차지하는 비율이 높은 개체를 선별했다. 이 키메라 마우스 개체를 ICR 마우스와 교배하여 F1 마우스를 얻었다. 백색의 F1 마우스를 선별하고, 꼬리의 조직으로부터 추출한 DNA를 해석하여, 염색체 상에서 마우스 트랜스페린 수용체 유전자가 키메라 hTfR로 치환되어 있는 마우스를 hTfR-KI 마우스로 했다.
hBDNF-항hTfR 항체(3N) 1 용액을, 투여되는 용량이 5mg/kg이 되도록, 각 시점 3마리의 hTfR-KI 마우스(수컷, 21∼28주령)에게 정맥내 투여했다. 정맥내 투여하고 나서 투여 후 0.17, 1, 3, 8, 24, 48시간 후에 말초혈을 채취하고, 채취 후에 생리 식염액으로 전신 관류하고, 뇌(대뇌와 소뇌를 포함하는 부분)를 채취했다. 적출한 뇌의 중량(습중량)을 측정한 후, Protease Inhibitor Cocktail을 포함하는 RIPA 버퍼(나카라이테스크)를 첨가하고 뇌조직을 호모지네이트했다. 호모지네이트를 원심하여 상청을 회수하고, 상청 중에 포함되는 hBDNF-항hTfR 항체(3N) 1의 양을 이하의 방법으로 측정했다.
우선, Rabbit Anti-Human IgG H＆L pre-adsorbed(Abcam사)를 Standard Plate(Meso Scale Diagnostics사)의 각 웰에 25μL씩 첨가하고, 1시간 정치하여 플레이트에 고정시켰다. 그 다음에, 각 웰에 SuperBlock(PBS) Blocking Buffer을 150μL씩 첨가하고, 1시간 진탕하여 플레이트를 블로킹했다. 그 다음에, 각 웰을 Tris Buffered Saline with Tween20으로 세정하고, 뇌조직의 호모지네이트 상청을 50μL씩 첨가하고, 1시간 진탕했다. 그 다음에, 각 웰에 Sulfo-tag 표지된 Anti-BDNF 항체［35928.11］(ab10505)(압캠사)를 50μL씩 첨가하고, 1시간 진탕했다. 그 다음에, 각 웰에 Read buffer T(Meso Scale Diagnostics사)를 150μL씩 첨가하고, SectorTM Imager 6000 reader로 각 웰로부터의 발광량을 측정했다. 농도 기지의 표준 시료의 측정치로부터 검량선을 작성하고, 이것에 각 검체의 측정치를 내삽하는 것에 의해, 뇌의 그램중량(습중량)당에 포함되는 융합 단백질의 양을 산출했다.
뇌조직 중의 hBDNF-항hTfR 항체(3N) 1의 농도 측정의 결과를 도 9에 나타낸다. 한편, hBDNF-항hTfR 항체(3N) 1은 2량체를 형성하여 생체 내에서 그 기능을 발휘하므로, 도 9에 있어서, 2량체로 환산한 값을 hBDNF-항hTfR 항체(3N) 1의 농도(몰농도)로 했다. 이하, 도 10, 표 17, 및 표 18에 나타나는 hBDNF-항hTfR 항체(3N) 1의 농도에 대해서도 마찬가지이다. hBDNF-항hTfR 항체(3N) 1은, 투여 후 24시간에 있어서도 뇌내 농도가 5.7nM로 높은 값을 나타냈다. 또한, 뇌내 농도의 반감기는 29시간이었다. 본 결과는, hBDNF-항hTfR 항체(3N) 1이 혈액뇌관문을 통과하여 뇌조직에 축적되는 성질을 가짐을 나타내는 것이고, 뇌조직 내에서 기능시켜야 할 약제인 BDNF를 항hTfR 항체(3N) 1 또는 그 항원 결합성 단편(항체 프래그먼트)과 결합시키는 것에 의해, 그 약제를 효율 좋게 뇌조직에 축적시킬 수 있음을 나타내는 것이다.
그 다음에, hBDNF-항hTfR 항체(3N) 1의 혈중 동태의 측정 결과를 표 17에 나타낸다. hBDNF-항hTfR 항체(3N) 1은, 투여 후 1시간에 있어서도 혈중 농도가 15nM로 높은 값을 나타내어, 혈중에서 안정됨이 나타났다(표 17). 또한, 혈중 농도의 반감기는 0.4시간이었다. 이 결과는, 뇌내 농도의 반감기는, 혈중 농도의 반감기보다 현저하게 긴 것을 나타내는 것이다. 또한, Fc-Fab(3N)에 대해서도 마찬가지의 시험으로 hTfR-KI 마우스에 있어서의 혈중 동태를 측정했는데, 혈중 농도의 반감기는 5.3시간이었다. 이 결과는, 인간 IgG Fc 영역을 도입하는 것에 의해 혈중 농도의 반감기가 현저하게 연장될 수 있음을 나타내는 것이다.
Figure pct00025
〔실시예 27〕 hBDNF-항hTfR 항체(3N) 1의 필리핀원숭이를 이용한 뇌이행 평가
hBDNF-항hTfR 항체(3N) 1을, 5.0mg/kg의 용량으로 각각 웅성 필리핀원숭이에 단회 정맥내 투여하고, 투여 후 0.083, 0.5, 1, 3, 24, 72시간 후에 말초혈을 채취하고, 채취 후에 생리 식염액으로 뇌 관류를 실시했다. 관류 후, 뇌조직을 적출했다.
이 뇌조직을 이용하여, 이하의 hBDNF-항hTfR 항체(3N) 1의 농도 측정 및 면역 조직화학 염색을 행했다. 또한, hBDNF-항hTfR 항체(3N) 1로서는, 실시예 22에 기재된 정제품을 이용했다.
뇌조직 중의 hBDNF-항hTfR 항체(3N) 1의 농도 측정은, 대체로 이하의 순서로 행했다. 채취한 조직을, 뇌조직을 대뇌피질, 소뇌, 해마 및 선조체 등으로 나누고 나서, 각각 Protease Inhibitor Cocktail(Sigma-Aldrich사)을 포함하는 RIPA Buffer(나카라이테스크사)로 호모지네이트하고 원심하여 상청을 회수했다. Anti-Human Kappa Light Chain Goat IgG Biotin(주식회사면역생물연구소), Sulfotag anti-BDNF antibody(압캠사) 및 뇌조직 호모지네이트를 SuperBlock blocking buffer in PBS(Thermo Fisher Scientific사)로 블로킹을 실시한 스트렙트아비딘 플레이트(Meso Scale Diagnostics사)에 첨가하고, 1시간 정치하여 플레이트에 고정했다. 그 다음에, 각 웰에 Read buffer T(Meso Scale Diagnostics사)를 150μL씩 첨가하고, SectorTM Imager 6000 reader(Meso Scale Diagnostics사)를 이용하여 각 웰로부터의 발광량을 측정했다. 농도 기지의 표준 시료의 측정치로부터 검량선을 작성하고, 이것에 각 검체의 측정치를 내삽하는 것에 의해, 각 뇌조직의 그램중량(습중량)당에 포함되는 융합 단백질의 양(뇌조직 중 농도)을 산출했다.
뇌조직 중의 hBDNF-항hTfR 항체(3N) 1의 농도 측정의 결과를 도 10에 나타낸다. 본 결과는, hBDNF-항hTfR 항체(3N) 1이 혈액뇌관문을 통과하여 뇌조직에 축적되는 성질을 가짐을 나타내는 것이고, 뇌조직 내에서 기능시켜야 할 약제인 BDNF를 항hTfR 항체(3N) 1 또는 그 항원 결합성 단편(항체 프래그먼트)과 결합시키는 것에 의해, 그 약제를 효율 좋게 뇌조직에 축적시킬 수 있음을 나타내는 것이다.
그 다음에, hBDNF-항hTfR 항체(3N) 1의 혈중 동태의 측정 결과를 표 18에 나타낸다. hBDNF-항hTfR 항체(3N) 1은, 투여 후 1시간에 있어서도 혈중 농도가 30nM로 높은 값을 나타내어, 혈중에서 안정됨이 나타났다(표 18).
Figure pct00026
뇌조직 중의 hBDNF-인간화 항hTfR 항체 융합 단백질의 면역 조직화학 염색은, 실시예 15에 기재된 방법으로 행할 수 있다.
〔실시예 28〕 hBDNF-항hTfR 항체(3N) ABD의 마우스를 이용한 뇌이행 평가
hBDNF-항hTfR 항체(3N) ABD에 대해, BBB를 통과하여 뇌내로 이행하는 것을, 마우스 트랜스페린 수용체의 세포외 영역을 코딩하는 유전자를 인간 트랜스페린 수용체 유전자의 세포외 영역을 코딩하는 유전자로 치환한 hTfR 노크인 마우스(hTfR-KI 마우스)를 이용하여 평가했다. hTfR-KI 마우스는, 대체로 실시예 7-2에 기재된 방법으로 제작했다. 또한, hBDNF-항hTfR 항체(3N) ABD로서는, 실시예 22-2에 기재된 정제품을 이용했다.
hBDNF-항hTfR 항체(3N) ABD 용액을, 투여되는 용량이 2.15mg/kg이 되도록, 각 시점 3마리의 hTfR-KI 마우스(수컷, 19∼21주령)에게 정맥내 투여했다. 정맥내 투여하고 나서 투여 후 0.167, 1, 3, 8, 24, 48, 72시간 후에 생리 식염액으로 전신 관류하고, 뇌(대뇌와 소뇌를 포함하는 부분)를 채취했다. 적출한 뇌의 중량(습중량)을 측정한 후, Protease Inhibitor Cocktail을 포함하는 RIPA 버퍼(나카라이테스크)를 첨가하고 뇌조직을 호모지네이트했다. 호모지네이트를 원심하고 상청을 회수하여, 상청 중에 포함되는 hBDNF-항hTfR 항체(3N) ABD의 양을 이하의 방법으로 측정했다.
우선, Rabbit Anti-Human IgG H＆L pre-adsorbed(Abcam사)를 Standard Plate(Meso Scale Diagnostics사)의 각 웰에 25μL씩 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 정치하여 플레이트에 고정시켰다. 그 다음에, 각 웰에 SuperBlock(PBS) Blocking Buffer을 150μL씩 첨가하고, 1시간 진탕하여 플레이트를 블로킹했다. 그 다음에, 각 웰을 Tris Buffered Saline with Tween20으로 세정하고, 뇌조직의 호모지네이트 상청을 50μL씩 첨가하고, 1시간 진탕했다. 그 다음에, 각 웰에 Sulfo-tag 표지 한 Anti-BDNF 항체［35928.11］(ab10505)(Abcam사)를 50μL씩 첨가하고, 1시간 진탕했다. 그 다음에, 각 웰에 Read buffer T(Meso Scale Diagnostics사)를 150μL씩 첨가하고, SectorTM Imager 6000 reader로 각 웰로부터의 발광량을 측정했다. 농도 기지의 표준 시료의 측정치로부터 검량선을 작성하고, 이것에 각 검체의 측정치를 내삽하는 것에 의해, 뇌의 그램중량(습중량)당에 포함되는 항체의 양을 산출했다.
뇌조직 중의 hBDNF-항hTfR 항체(3N) ABD의 농도 측정의 결과를 도 11에 나타낸다. hBDNF-항hTfR 항체(3N) ABD의 뇌내 농도는, 투여 8시간 후에 2.98nM의 Cmax를 나타내고, 투여 72시간에 0.7nM이었다.
본 결과는, hBDNF-항hTfR 항체(3N) ABD가 혈액뇌관문을 통과하여 뇌조직에 축적되는 성질을 가짐을 나타내는 것이고, 뇌조직 내에서 기능시켜야 할 약제인 BDNF를 이들 항체와 결합시키는 것에 의해, 그 약제를 효율 좋게 뇌조직에 축적시킬 수 있음을 나타내는 것이다.
그 다음에, hBDNF-항hTfR 항체(3N) ABD의 혈중 동태의 측정 결과를 표 19에 나타낸다. hBDNF-항hTfR 항체(3N) ABD의 혈중 농도는, 투여 1시간 후에 179.8nM, 3시간 후에 있어서도 53.4nM로 높은 값을 나타내어, 혈중에서 안정됨이 나타났다(표 19). 이 결과는, 알부민 친화성 펩티드를 도입하는 것에 의해 혈중의 안정성이 향상되어, 혈중반감기가 현저하게 연장될 수 있음을 나타내는 것이다.
Figure pct00027
〔실시예 29〕 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘(MPTP) 처치 파킨슨병 모델 마우스를 이용한 본 발명의 융합 단백질에 의한 운동 기능 개선 작용의 검토
실시예 22에서 제조한 hBDNF-항hTfR 항체 융합 단백질의 in vivo에서의 BDNF 생물 활성은, 예를 들어, 이하에 기재하는 바와 같은 방법을 이용하여 MPTP 처치한 hTfR-KI 마우스에 있어서의 파킨슨병 증상 개선 효과에 의해 평가할 수 있다.
(1) 파킨슨병 모델 마우스의 작성
실시예 26에 기재한 hTfR-KI 마우스(모두 8-15주령)를 이용한다. 검역·순화가 종료된 마우스에 대해, 생리적 식염액 혹은 생리적 식염액에 용해시킨 MPTP(25 혹은 30mg/kg)를, 1일 1회, 5일간 복강내 투여, 혹은 20mg/kg을 1일 중에 2시간 간격으로 4회 복강내 투여한다.
최종 투여의 3일 이후에, Pole 시험에 의해 브라디키네시아 증상을, 또는 로타로드(Rota-rod) 시험에 의해 협조 운동능의 저하를 평가한다.
(2) Pole 시험
MPTP 처치 마우스를, 수직으로 세운 목제 봉의 상부 5cm 부근에 두부(頭部)를 상향으로 잡히게 한다. 마우스가 봉에 잡히고 나서 하향으로 방향을 바꿀 때까지의 시간(Tturn), 및 잡히고 나서 마루면으로 내려갈 때까지의 시간(TLA)을 측정한다. 더하여, 마우스의 움직임을 관찰하여, 그 증상을 이하와 같이 스코어 붙이기한다.
0: 사지를 능숙하게 사용하여 내려간다/정상적인 움직임.
1: 봉의 상부에서 방향을 바꿀 때에 어색함이 보인다.
2: 봉을 넘지 못하고 옆미끄러짐과 같은 행동을 취한다.
3: 낙하한다.
처음에 1회 트레이닝을 행한 후, 5분마다 1회, 시험을 3회 반복하여 행한다. 3회의 평균 시간을 군나누기용 데이터에 이용한다. 체중과 Pole 시험의 데이터를 바탕으로, 다변수 완전 무작위화 할당에 의해 MPTP 처치 마우스를 3 또는 4군으로 나눈다.
생리적 식염액 처치 마우스(용매 처치군), MPTP 처치 마우스(용매 처치군, 본 발명의 융합 단백질 처치군)의 합계 4∼5군에 있어서, 1주간에 1∼2회, 4∼8주간, 반복 정맥내 투여를 행한다. 최종 투여로부터 1주일 후에 다시 Pole 시험(상기의 군나누기용 데이터를 취할 때와 동일 프로토콜)을 행하여, 브라디키네시아 증상의 개선 작용을 평가한다. 정맥내에 투여한 본 발명의 융합 단백질이 뇌내로 이행하여, 뇌내에서 BDNF 활성을 발휘하는 것에 의해, 파킨슨병 모델 동물에 있어서의 브라디키네시아 등의 운동 기능의 장애를 개선할 수 있다.
이와 같이 하여 정맥내에 투여한 본 발명의 융합 단백질이 질환 모델 동물의 뇌내로 이행하여 BDNF 활성을 발휘할 수 있음을 확인할 수 있다.
(3) 로타로드(Rota-rod) 시험
마우스를 Rota-rod 장치(MK-610A, 무로마치기계)의 회전축에 1레인마다 1마리씩 놓고, 30초간 정치한 후 1분간 8rpm으로 축의 회전에 순화시키고, 그 후, 3분간으로 25rpm까지 회전수가 높아지는 조건에서 트레이닝을 행한다. 트레이닝의 1시간 후에 이하의 평가 시험을 행한다.
본 시험에서는, 8rpm으로 회전하는 축의 움직임에 30초간 마우스를 순화시킨 후, 5분간으로 40rpm까지 회전수가 높아지는 조건에서 축으로부터 마우스가 낙하할 때까지의 시간을 측정한다. 1시간의 간격을 두고 본 시험을 3회 반복하여, 3회의 평균 시간을 군나누기용 데이터에 이용한다. 체중과 Rota-rod 시험의 데이터를 바탕으로, 다변수 완전 무작위화 할당에 의해 MPTP 처치 마우스를 3 또는 4군으로 나눈다.
생리적 식염액 처치 마우스(용매 처치군), MPTP 처치 마우스(용매 처치군, 본 발명의 융합 단백질 처치군)의 합계 4∼5군에 있어서, 1주간에 1∼2회, 4∼8주간, 반복 정맥내 투여를 행한다. 최종 투여로부터 1주일 후에 다시 Rota-Rod 시험(상기의 군나누기용 데이터를 취할 때와 동일 프로토콜)을 행하여, 협조 운동 능력의 개선 작용을 평가한다. 정맥내에 투여한 본 발명의 융합 단백질이 뇌내로 이행하여, 뇌내에서 BDNF 활성을 발휘하는 것에 의해, 파킨슨병 모델 동물에 있어서의 협조 운동 능력 등의 운동 기능의 장애를 개선할 수 있다.
이와 같이 하여 정맥내에 투여한 본 발명의 융합 단백질이 질환 모델 동물의 뇌내로 이행하여 BDNF 활성을 발휘할 수 있음을 확인할 수 있다.
〔실시예 30〕 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘(MPTP) 처치 파킨슨병 모델 원숭이를 이용한 본 발명의 융합 단백질에 의한 운동 기능 개선 효과의 검토
실시예 22에서 제조한 hBDNF-항hTfR 항체 융합 단백질의 in vivo에서의 BDNF 생물 활성은, 예를 들어, 이하에 기재하는 바와 같은 방법을 이용하여 MPTP 처치한 원숭이에 있어서의 파킨슨병양 증상 개선 효과에 의해 평가할 수 있다.
MPTP 처치 전의 5일간, 정상적인 행동을 미리 평가한 웅성 히말라야원숭이(5∼8세) 혹은 필리핀원숭이(4∼8세)에게 MPTP(0.2mg/kg 혹은 그 이상으로, 2mg/kg을 상한으로 한다)를 1주간에 최대 연속 5일간, 4주간 이상의 정맥내 투여, 혹은 근육내 투여, 혹은 피하 투여를 행하여, UPDRS의 스코어의 저하 혹은 운동량의 저하를 확인한다. 혹은, 내경동맥의 편측에만 MPTP(0.2mg/kg 혹은 그 이상으로, 2mg/kg을 상한으로 한다)를 1회 혹은 투여 간격을 5∼10일간 띄워 2회 투여하고, UPDRS 스코어(J Neurosci Methods. 2000; 96: 71-76), 운동량, 더욱이 선회 운동량을 지표로 하여, 파킨슨병양 증상을 확인하고, MPTP의 처치를 종료한다.
MPTP의 최종 투여로부터 1주일 후 이후에 파킨슨병양 증상이 안정된 것을 확인한 후, 1주간에 1회 혹은 2회, hBDNF-항hTfR 항체 융합 단백질(0.03∼10mg/kg)을 정맥내 혹은 피하 투여하고, UPDRS, 운동량, 혹은 선회 운동의 평가에 의해 운동 기능의 개선도를 평가한다. 정맥내 또는 피하에 투여한 hBDNF-항hTfR 항체 융합 단백질이 뇌내로 이행하여, 뇌내에서 BDNF 활성을 발휘하는 것에 의해, 파킨슨병 모델 동물에 있어서의 운동 기능의 장애를 개선할 수 있다.
이와 같이 하여 정맥내에 투여한 본 발명의 융합 단백질이 질환 모델 동물(원숭이)의 뇌내로 이행하여 BDNF 활성을 발휘할 수 있음을 확인할 수 있다.
본 발명의 hBDNF와 항hTfR 항체의 융합 단백질은, 혈액뇌관문을 효율적으로 통과시킬 수 있으므로, hBDNF를 중추 신경계에 있어서 작용시키는 개량된 수단을 제공하는 것으로서 유용성이 높다.
서열 번호 3: 링커예 1의 아미노산 서열
서열 번호 4: 링커예 2의 아미노산 서열
서열 번호 5: 링커예 3의 아미노산 서열
서열 번호 6: 마우스 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄 CDR1의 아미노산 서열 1
서열 번호 7: 마우스 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄 CDR1의 아미노산 서열 2
서열 번호 8: 마우스 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄 CDR2의 아미노산 서열 1
서열 번호 9: 마우스 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄 CDR2의 아미노산 서열 2
서열 번호 10: 마우스 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄 CDR3의 아미노산 서열
서열 번호 11: 마우스 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄 CDR1의 아미노산 서열 1
서열 번호 12: 마우스 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄 CDR1의 아미노산 서열 2
서열 번호 13: 마우스 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄 CDR2의 아미노산 서열 1
서열 번호 14: 마우스 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄 CDR2의 아미노산 서열 2
서열 번호 15: 마우스 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄 CDR3의 아미노산 서열 1
서열 번호 16: 마우스 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄 CDR3의 아미노산 서열 2
서열 번호 17: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 1
서열 번호 18: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 2
서열 번호 19: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 3
서열 번호 20: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 4
서열 번호 21: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 5
서열 번호 22: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 6
서열 번호 23: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의, 가변 영역으로서 아미노산 서열 2를 포함하는 경쇄의 아미노산 서열
서열 번호 24: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의, 가변 영역으로서 아미노산 서열 2를 포함하는 경쇄의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 25: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의, 가변 영역으로서 아미노산 서열 4를 포함하는 경쇄의 아미노산 서열
서열 번호 26: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의, 가변 영역으로서 아미노산 서열 4를 포함하는 경쇄의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 27: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의, 가변 영역으로서 아미노산 서열 5를 포함하는 경쇄의 아미노산 서열
서열 번호 28: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의, 가변 영역으로서 아미노산 서열 5를 포함하는 경쇄의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 29: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의, 가변 영역으로서 아미노산 서열 6을 포함하는 경쇄의 아미노산 서열
서열 번호 30: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의, 가변 영역으로서 아미노산 서열 6을 포함하는 경쇄의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 31: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 1
서열 번호 32: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 2
서열 번호 33: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 3
서열 번호 34: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 4
서열 번호 35: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 5
서열 번호 36: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 6
서열 번호 37: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의, 가변 영역으로서 아미노산 서열 2를 포함하는 중쇄의 아미노산 서열
서열 번호 38: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의, 가변 영역으로서 아미노산 서열 2를 포함하는 중쇄의 아미노산 서열 코딩하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 39: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의, 가변 영역으로서 아미노산 서열 2를 포함하는 중쇄(IgG4)의 아미노산 서열
서열 번호 40: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의, 가변 영역으로서 아미노산 서열 2를 포함하는 중쇄(IgG4)의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 41: 프라이머 hTfR5', 합성 서열
서열 번호 42: 프라이머 hTfR3', 합성 서열
서열 번호 43: 프라이머 Hyg-Sfi5', 합성 서열
서열 번호 44: 프라이머 Hyg-BstX3', 합성 서열
서열 번호 45: 키메라 hTfR을 코딩하는 cDNA의 3'측에 loxP 서열로 끼워 넣은 네오마이신 내성 유전자를 배치한 DNA의 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 46: 타게팅 벡터의 5'암 서열, 합성 서열
서열 번호 47: 타게팅 벡터의 3'암 서열, 합성 서열
서열 번호 48: 마우스 항hTfR 항체 번호 3의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 49: 마우스 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 52: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄와 hBDNF의 융합 단백질(1)의 아미노산 서열
서열 번호 53: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄와 hBDNF의 융합 단백질(1)의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 54: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄와 hBDNF의 융합 단백질(2)의 아미노산 서열
서열 번호 55: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄와 hBDNF의 융합 단백질(2)의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 57: 1본쇄 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 아미노산 서열
서열 번호 58: hBDNF의 프로체와 1본쇄 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 융합 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 59: hBDNF의 프로체와 1본쇄 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 융합 단백질의 아미노산 서열
서열 번호 60: hBDNF와 1본쇄 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 융합 단백질의 아미노산 서열
서열 번호 61: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄의 아미노산 서열
서열 번호 62: hBDNF의 프로체와 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄의 융합 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 63: hBDNF의 프로체와 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄의 융합 단백질의 아미노산 서열
서열 번호 64: hBDNF와 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄의 융합 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 65: hBDNF와 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄의 융합 단백질의 아미노산 서열
서열 번호 66: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄 CDR1의 아미노산 서열 1
서열 번호 67: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄 CDR1의 아미노산 서열 2
서열 번호 68: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄 프레임워크 영역 3의 아미노산 서열
서열 번호 69: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열
서열 번호 70: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄의 아미노산 서열
서열 번호 71: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 72: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)의 아미노산 서열
서열 번호 73: 인간 IgG Fc 영역을 도입한 hBDNF의 프로체와 인간화 항hTfR 항체 3N의 Fab 중쇄의 융합 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 74: 인간 IgG Fc 영역을 도입한 hBDNF의 프로체와 인간화 항hTfR 항체 3N의 Fab 중쇄의 융합 단백질의 아미노산 서열
서열 번호 75: 인간 IgG의 Fc 영역의 아미노산 서열의 일례
서열 번호 76: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 중쇄(IgG4)의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 77: 인간화 항hTfR 항체 3의 Fab 중쇄의 아미노산 서열
서열 번호 78: hBDNF의 프로체와 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 Fab 중쇄의 융합 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 79: hBDNF의 프로체와 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 Fab 중쇄의 융합 단백질의 아미노산 서열
서열 번호 80: hBDNF와 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 Fab 중쇄의 융합 단백질의 아미노산 서열
서열 번호 81: 인간 IgG Fc 영역을 도입한 인간화 항hTfR 항체 3N의 Fab 중쇄의 아미노산 서열
서열 번호 82: 인간 IgG Fc 영역을 도입한 인간화 항hTfR 항체 3N의 Fab 중쇄의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 83: 인간화 항hTfR 항체 번호 3의 중쇄 프레임워크 영역 3의 아미노산 서열
서열 번호 84: 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄의 아미노산 서열(2)
서열 번호 85: 알부민 결합 도메인의 아미노산 서열
서열 번호 86: hBDNF의 프로체, 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄, 및 ABD의 융합 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열, 합성 서열
서열 번호 87: hBDNF의 프로체, 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄, 및 ABD의 융합 단백질의 아미노산 서열
서열 번호 88: hBDNF의 프로체, 인간화 항hTfR 항체 번호 3N의 Fab 중쇄, 및 ABD의 융합 단백질의 아미노산 서열
서열 번호 89: 알부민 친화성 펩티드를 도입한 Fab 중쇄의 아미노산 서열
서열 번호 90: 1본쇄 인간화 항hTfR 항체 번호 3N(2)의 아미노산 서열
SEQUENCE LISTING <110> JCR PHARMACEUTICALS CO., LTD. <120> FUSION PROTEIN CONTAINING BDNF <130> FP17-0781-00 <150> JP2016-252147 <151> 2016-12-26 <160> 90 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 760 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Met Asp Gln Ala Arg Ser Ala Phe Ser Asn Leu Phe Gly Gly Glu 1 5 10 15 Pro Leu Ser Tyr Thr Arg Phe Ser Leu Ala Arg Gln Val Asp Gly Asp 20 25 30 Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Val Asp Glu Glu Glu Asn Ala 35 40 45 Asp Asn Asn Thr Lys Ala Asn Val Thr Lys Pro Lys Arg Cys Ser Gly 50 55 60 Ser Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val Ile Val Phe Phe Leu Ile Gly 65 70 75 80 Phe Met Ile Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys Gly Val Glu Pro Lys Thr 85 90 95 Glu Cys Glu Arg Leu Ala Gly Thr Glu Ser Pro Val Arg Glu Glu Pro 100 105 110 Gly Glu Asp Phe Pro Ala Ala Arg Arg Leu Tyr Trp Asp Asp Leu Lys 115 120 125 Arg Lys Leu Ser Glu Lys Leu Asp Ser Thr Asp Phe Thr Gly Thr Ile 130 135 140 Lys Leu Leu Asn Glu Asn Ser Tyr Val Pro Arg Glu Ala Gly Ser Gln 145 150 155 160 Lys Asp Glu Asn Leu Ala Leu Tyr Val Glu Asn Gln Phe Arg Glu Phe 165 170 175 Lys Leu Ser Lys Val Trp Arg Asp Gln His Phe Val Lys Ile Gln Val 180 185 190 Lys Asp Ser Ala Gln Asn Ser Val Ile Ile Val Asp Lys Asn Gly Arg 195 200 205 Leu Val Tyr Leu Val Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Val Ala Tyr Ser Lys 210 215 220 Ala Ala Thr Val Thr Gly Lys Leu Val His Ala Asn Phe Gly Thr Lys 225 230 235 240 Lys Asp Phe Glu Asp Leu Tyr Thr Pro Val Asn Gly Ser Ile Val Ile 245 250 255 Val Arg Ala Gly Lys Ile Thr Phe Ala Glu Lys Val Ala Asn Ala Glu 260 265 270 Ser Leu Asn Ala Ile Gly Val Leu Ile Tyr Met Asp Gln Thr Lys Phe 275 280 285 Pro Ile Val Asn Ala Glu Leu Ser Phe Phe Gly His Ala His Leu Gly 290 295 300 Thr Gly Asp Pro Tyr Thr Pro Gly Phe Pro Ser Phe Asn His Thr Gln 305 310 315 320 Phe Pro Pro Ser Arg Ser Ser Gly Leu Pro Asn Ile Pro Val Gln Thr 325 330 335 Ile Ser Arg Ala Ala Ala Glu Lys Leu Phe Gly Asn Met Glu Gly Asp 340 345 350 Cys Pro Ser Asp Trp Lys Thr Asp Ser Thr Cys Arg Met Val Thr Ser 355 360 365 Glu Ser Lys Asn Val Lys Leu Thr Val Ser Asn Val Leu Lys Glu Ile 370 375 380 Lys Ile Leu Asn Ile Phe Gly Val Ile Lys Gly Phe Val Glu Pro Asp 385 390 395 400 His Tyr Val Val Val Gly Ala Gln Arg Asp Ala Trp Gly Pro Gly Ala 405 410 415 Ala Lys Ser Gly Val Gly Thr Ala Leu Leu Leu Lys Leu Ala Gln Met 420 425 430 Phe Ser Asp Met Val Leu Lys Asp Gly Phe Gln Pro Ser Arg Ser Ile 435 440 445 Ile Phe Ala Ser Trp Ser Ala Gly Asp Phe Gly Ser Val Gly Ala Thr 450 455 460 Glu Trp Leu Glu Gly Tyr Leu Ser Ser Leu His Leu Lys Ala Phe Thr 465 470 475 480 Tyr Ile Asn Leu Asp Lys Ala Val Leu Gly Thr Ser Asn Phe Lys Val 485 490 495 Ser Ala Ser Pro Leu Leu Tyr Thr Leu Ile Glu Lys Thr Met Gln Asn 500 505 510 Val Lys His Pro Val Thr Gly Gln Phe Leu Tyr Gln Asp Ser Asn Trp 515 520 525 Ala Ser Lys Val Glu Lys Leu Thr Leu Asp Asn Ala Ala Phe Pro Phe 530 535 540 Leu Ala Tyr Ser Gly Ile Pro Ala Val Ser Phe Cys Phe Cys Glu Asp 545 550 555 560 Thr Asp Tyr Pro Tyr Leu Gly Thr Thr Met Asp Thr Tyr Lys Glu Leu 565 570 575 Ile Glu Arg Ile Pro Glu Leu Asn Lys Val Ala Arg Ala Ala Ala Glu 580 585 590 Val Ala Gly Gln Phe Val Ile Lys Leu Thr His Asp Val Glu Leu Asn 595 600 605 Leu Asp Tyr Glu Arg Tyr Asn Ser Gln Leu Leu Ser Phe Val Arg Asp 610 615 620 Leu Asn Gln Tyr Arg Ala Asp Ile Lys Glu Met Gly Leu Ser Leu Gln 625 630 635 640 Trp Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Asp Phe Phe Arg Ala Thr Ser Arg Leu 645 650 655 Thr Thr Asp Phe Gly Asn Ala Glu Lys Thr Asp Arg Phe Val Met Lys 660 665 670 Lys Leu Asn Asp Arg Val Met Arg Val Glu Tyr His Phe Leu Ser Pro 675 680 685 Tyr Val Ser Pro Lys Glu Ser Pro Phe Arg His Val Phe Trp Gly Ser 690 695 700 Gly Ser His Thr Leu Pro Ala Leu Leu Glu Asn Leu Lys Leu Arg Lys 705 710 715 720 Gln Asn Asn Gly Ala Phe Asn Glu Thr Leu Phe Arg Asn Gln Leu Ala 725 730 735 Leu Ala Thr Trp Thr Ile Gln Gly Ala Ala Asn Ala Leu Ser Gly Asp 740 745 750 Val Trp Asp Ile Asp Asn Glu Phe 755 760 <210> 2 <211> 760 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 2 Met Met Asp Gln Ala Arg Ser Ala Phe Ser Asn Leu Phe Gly Gly Glu 1 5 10 15 Pro Leu Ser Tyr Thr Arg Phe Ser Leu Ala Arg Gln Val Asp Gly Asp 20 25 30 Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Val Asp Asp Glu Glu Asn Ala 35 40 45 Asp Asn Asn Thr Lys Ala Asn Gly Thr Lys Pro Lys Arg Cys Gly Gly 50 55 60 Asn Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val Ile Ile Phe Phe Leu Ile Gly 65 70 75 80 Phe Met Ile Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys Gly Val Glu Pro Lys Thr 85 90 95 Glu Cys Glu Arg Leu Ala Gly Thr Glu Ser Pro Ala Arg Glu Glu Pro 100 105 110 Glu Glu Asp Phe Pro Ala Ala Pro Arg Leu Tyr Trp Asp Asp Leu Lys 115 120 125 Arg Lys Leu Ser Glu Lys Leu Asp Thr Thr Asp Phe Thr Ser Thr Ile 130 135 140 Lys Leu Leu Asn Glu Asn Leu Tyr Val Pro Arg Glu Ala Gly Ser Gln 145 150 155 160 Lys Asp Glu Asn Leu Ala Leu Tyr Ile Glu Asn Gln Phe Arg Glu Phe 165 170 175 Lys Leu Ser Lys Val Trp Arg Asp Gln His Phe Val Lys Ile Gln Val 180 185 190 Lys Asp Ser Ala Gln Asn Ser Val Ile Ile Val Asp Lys Asn Gly Gly 195 200 205 Leu Val Tyr Leu Val Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Val Ala Tyr Ser Lys 210 215 220 Ala Ala Thr Val Thr Gly Lys Leu Val His Ala Asn Phe Gly Thr Lys 225 230 235 240 Lys Asp Phe Glu Asp Leu Asp Ser Pro Val Asn Gly Ser Ile Val Ile 245 250 255 Val Arg Ala Gly Lys Ile Thr Phe Ala Glu Lys Val Ala Asn Ala Glu 260 265 270 Ser Leu Asn Ala Ile Gly Val Leu Ile Tyr Met Asp Gln Thr Lys Phe 275 280 285 Pro Ile Val Lys Ala Asp Leu Ser Phe Phe Gly His Ala His Leu Gly 290 295 300 Thr Gly Asp Pro Tyr Thr Pro Gly Phe Pro Ser Phe Asn His Thr Gln 305 310 315 320 Phe Pro Pro Ser Gln Ser Ser Gly Leu Pro Asn Ile Pro Val Gln Thr 325 330 335 Ile Ser Arg Ala Ala Ala Glu Lys Leu Phe Gly Asn Met Glu Gly Asp 340 345 350 Cys Pro Ser Asp Trp Lys Thr Asp Ser Thr Cys Lys Met Val Thr Ser 355 360 365 Glu Asn Lys Ser Val Lys Leu Thr Val Ser Asn Val Leu Lys Glu Thr 370 375 380 Lys Ile Leu Asn Ile Phe Gly Val Ile Lys Gly Phe Val Glu Pro Asp 385 390 395 400 His Tyr Val Val Val Gly Ala Gln Arg Asp Ala Trp Gly Pro Gly Ala 405 410 415 Ala Lys Ser Ser Val Gly Thr Ala Leu Leu Leu Lys Leu Ala Gln Met 420 425 430 Phe Ser Asp Met Val Leu Lys Asp Gly Phe Gln Pro Ser Arg Ser Ile 435 440 445 Ile Phe Ala Ser Trp Ser Ala Gly Asp Phe Gly Ser Val Gly Ala Thr 450 455 460 Glu Trp Leu Glu Gly Tyr Leu Ser Ser Leu His Leu Lys Ala Phe Thr 465 470 475 480 Tyr Ile Asn Leu Asp Lys Ala Val Leu Gly Thr Ser Asn Phe Lys Val 485 490 495 Ser Ala Ser Pro Leu Leu Tyr Thr Leu Ile Glu Lys Thr Met Gln Asp 500 505 510 Val Lys His Pro Val Thr Gly Arg Ser Leu Tyr Gln Asp Ser Asn Trp 515 520 525 Ala Ser Lys Val Glu Lys Leu Thr Leu Asp Asn Ala Ala Phe Pro Phe 530 535 540 Leu Ala Tyr Ser Gly Ile Pro Ala Val Ser Phe Cys Phe Cys Glu Asp 545 550 555 560 Thr Asp Tyr Pro Tyr Leu Gly Thr Thr Met Asp Thr Tyr Lys Glu Leu 565 570 575 Val Glu Arg Ile Pro Glu Leu Asn Lys Val Ala Arg Ala Ala Ala Glu 580 585 590 Val Ala Gly Gln Phe Val Ile Lys Leu Thr His Asp Thr Glu Leu Asn 595 600 605 Leu Asp Tyr Glu Arg Tyr Asn Ser Gln Leu Leu Leu Phe Leu Arg Asp 610 615 620 Leu Asn Gln Tyr Arg Ala Asp Val Lys Glu Met Gly Leu Ser Leu Gln 625 630 635 640 Trp Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Asp Phe Phe Arg Ala Thr Ser Arg Leu 645 650 655 Thr Thr Asp Phe Arg Asn Ala Glu Lys Arg Asp Lys Phe Val Met Lys 660 665 670 Lys Leu Asn Asp Arg Val Met Arg Val Glu Tyr Tyr Phe Leu Ser Pro 675 680 685 Tyr Val Ser Pro Lys Glu Ser Pro Phe Arg His Val Phe Trp Gly Ser 690 695 700 Gly Ser His Thr Leu Ser Ala Leu Leu Glu Ser Leu Lys Leu Arg Arg 705 710 715 720 Gln Asn Asn Ser Ala Phe Asn Glu Thr Leu Phe Arg Asn Gln Leu Ala 725 730 735 Leu Ala Thr Trp Thr Ile Gln Gly Ala Ala Asn Ala Leu Ser Gly Asp 740 745 750 Val Trp Asp Ile Asp Asn Glu Phe 755 760 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of exemplified linker 1 <400> 3 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of exemplified linker 2 <400> 4 Gly Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of exemplified linker 3 <400> 5 Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 1 of CDR 1 in the light chain of mouse anti-hTfR antibody No.3 <400> 6 Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr 1 5 10 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 2 of CDR 1 in the light chain of mouse anti-hTfR antibody No.3 <400> 7 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 1 of CDR 2 in the light chain of mouse anti-hTfR antibody No.3 <400> 8 Lys Val Ser Asn Arg Phe 1 5 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 2 of CDR 2 in the light chain of mouse anti-hTfR antibody No.3 <400> 9 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of CDR 3 in the light chain of mouse anti-hTfR antibody No. 3 <400> 10 Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 1 of CDR 1 in the heavy chain of mouse anti-hTfR antibody No.3 <400> 11 Asn Tyr Trp Leu Gly 1 5 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 2 of CDR 1 in the heavy chain of mouse anti-hTfR antibody No.3 <400> 12 Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr Trp 1 5 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 1 of CDR 2 in the heavy chain of mouse anti-hTfR antibody No.3 <400> 13 Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro 1 5 <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 2 of CDR 2 in the heavy chain of mouse anti-hTfR antibody No.3 <400> 14 Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Val <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 1 of CDR 3 in the heavy chain of mouse anti-hTfR antibody No.3 <400> 15 Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr 1 5 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 2 of CDR 3 in the heavy chain of mouse anti-hTfR antibody No.3 <400> 16 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr 1 5 10 <210> 17 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 1 of the variable region of the light chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 <400> 17 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 18 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 2 of the variable region of the light chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 <400> 18 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 19 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 3 of the variable region of the light chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 <400> 19 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 20 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 4 of the variable region of the light chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 <400> 20 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 21 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 5 of the variable region of the light chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 <400> 21 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 22 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 6 of the variable region of the light chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 <400> 22 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Phe Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 23 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the light chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 containing amino acid sequence 2 as the variable region <400> 23 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 24 <211> 740 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the light chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 containing amino acid sequence 2 as the variable region, synthetic sequence <400> 24 acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60 ggagtgcaca gcgacatcgt gatgacccag actcccctga gcctgagcgt gacacctggc 120 cagcctgcca gcatcagctg cagaagctct cagagcctgg tgcacagcaa cggcaacacc 180 tacctgcact ggtatctgca gaagcccggc cagagccctc agctgctgat ctacaaggtg 240 tccaacagat tcagcggcgt gcccgacaga ttctccggca gcggctctgg caccgacttc 300 accctgaaga tttccagagt ggaagccgag gacgtgggcg tgtactactg cagccagagc 360 acccacgtgc cctggacatt cggccagggc accaaggtgg aaatcaagag aaccgtggcc 420 gctcccagcg tgttcatctt cccacctagc gacgagcagc tgaagtccgg cacagcctct 480 gtcgtgtgcc tgctgaacaa cttctacccc cgcgaggcca aggtgcagtg gaaggtggac 540 aacgccctgc agagcggcaa cagccaggaa agcgtgaccg agcaggactc caaggacagc 600 acctacagcc tgagcagcac cctgaccctg agcaaggccg actacgagaa gcacaaggtg 660 tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctg tctagccccg tgaccaagag cttcaacaga 720 ggcgagtgct aagcggccgc 740 <210> 25 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the light chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 containing amino acid sequence 4 as the variable region <400> 25 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 26 <211> 740 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the light chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 containing amino acid sequence 4 as the variable region, synthetic sequence <400> 26 acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60 ggagtgcaca gcgacatcgt gatgacccag agccccctga gcctgcctgt gacacctggc 120 gagcctgcca gcatcagctg cagatctagc cagagcctgg tgcacagcaa cggcaacacc 180 tacctgcact ggtatctgca gaagcccggc cagagccctc agctgctgat ctacaaggtg 240 tccaacagat tcagcggcgt gcccgacaga ttctccggca gcggctctgg caccgacttc 300 accctgaaga tctccagagt ggaagccgag gacgtgggcg tgtactactg cagccagagc 360 acccacgtgc cctggacatt cggccagggc accaaggtgg aaatcaagag aaccgtggcc 420 gctcccagcg tgttcatctt cccacctagc gacgagcagc tgaagtccgg cacagcctct 480 gtcgtgtgcc tgctgaacaa cttctacccc cgcgaggcca aggtgcagtg gaaggtggac 540 aacgccctgc agagcggcaa cagccaggaa agcgtgaccg agcaggactc caaggacagc 600 acctacagcc tgagcagcac cctgaccctg agcaaggccg actacgagaa gcacaaggtg 660 tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctg tctagccccg tgaccaagag cttcaacaga 720 ggcgagtgct aagcggccgc 740 <210> 27 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the light chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 containing amino acid sequence 5 as the variable region <400> 27 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 28 <211> 740 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the light chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 containing amino acid sequence 5 as the variable region, synthetic sequence <400> 28 acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60 ggagtgcaca gcgacatcgt gatgacccag acacccctga gcctgcctgt gacacctggc 120 gagcctgcca gcatcagctg cagatctagc cagagcctgg tgcacagcaa cggcaacacc 180 tacctgcact ggtatctgca gaagcccggc cagagccctc agctgctgat ctacaaggtg 240 tccaacagat tcagcggcgt gcccgacaga ttctccggca gcggctctgg caccgacttc 300 accctgaaga tctccagagt ggaagccgag gacgtgggcg tgtactactg cagccagagc 360 acccacgtgc cctggacatt cggccagggc accaggctgg aaatcaagag aaccgtggcc 420 gctcccagcg tgttcatctt cccacctagc gacgagcagc tgaagtccgg cacagcctct 480 gtcgtgtgcc tgctgaacaa cttctacccc cgcgaggcca aggtgcagtg gaaggtggac 540 aacgccctgc agagcggcaa cagccaggaa agcgtgaccg agcaggactc caaggacagc 600 acctacagcc tgagcagcac cctgaccctg agcaaggccg actacgagaa gcacaaggtg 660 tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctg tctagccccg tgaccaagag cttcaacaga 720 ggcgagtgct aagcggccgc 740 <210> 29 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the light chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 containing amino acid sequence 6 as the variable region <400> 29 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Phe Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 30 <211> 740 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the light chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 containing amino acid sequence 6 as the variable region, synthetic sequence <400> 30 acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60 ggagtgcaca gcgacatcgt gatgacccag actcccctga gcctgagcgt gacacctggc 120 cagcctgcca gcatcagctg cagatccagc cagagcctgg tgcacagcaa cggcaacacc 180 tacctgcact ggtatctgca gaagcccggc cagagccctc agctgctgat ctacaaggtg 240 tccaacagat tcagcggcgt gcccgacaga ttctccggca gcggctctgg caccgacttc 300 accctgaaga tttccagagt ggaagccgag gacgtgggcg tgttcttctg cagccagagc 360 acccacgtgc cctggacatt cggccagggc accaaggtgg aaatcaagag aaccgtggcc 420 gctcccagcg tgttcatctt cccacctagc gacgagcagc tgaagtccgg cacagcctct 480 gtcgtgtgcc tgctgaacaa cttctacccc cgcgaggcca aggtgcagtg gaaggtggac 540 aacgccctgc agagcggcaa cagccaggaa agcgtgaccg agcaggactc caaggacagc 600 acctacagcc tgagcagcac cctgaccctg agcaaggccg actacgagaa gcacaaggtg 660 tacgcctgcg aagtgaccca ccagggcctg tctagccccg tgaccaagag cttcaacaga 720 ggcgagtgct aagcggccgc 740 <210> 31 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 1 of the variable region of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 <400> 31 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 32 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 2 of the variable region of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 <400> 32 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 33 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 3 of the variable region of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 <400> 33 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 34 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 4 of the variable region of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 <400> 34 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 35 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 5 of the variable region of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 <400> 35 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Val Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 36 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 6 of the variable region of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 <400> 36 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Lys Ala Ile Ile Ser Ala Asp Thr Ser Ile Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 37 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 containing amino acid sequence 2 as the variable region <400> 37 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 38 <211> 1427 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No.3 containing amino acid sequence 2 as the variable region, synthetic sequence <400> 38 acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60 ggagtgcaca gcgaggtgca actagtgcag tctggagcag aggtgaaaaa gcccggggag 120 tctctgaaga tttcctgtaa gggttctgga tacagcttta ccaactactg gctgggatgg 180 gtgcgccaga tgcccgggaa aggcctggag tggatggggg acatctaccc cggcggagac 240 taccctacat acagcgagaa gttcaaggtc caggtcacca tctcagccga caagtccatc 300 agcaccgcct acctgcagtg gagcagcctg aaggcctcgg acaccgccat gtattactgt 360 gcgagatcag gcaattacga cgaagtggcc tactggggcc aaggaaccct ggtcaccgtc 420 tcctcagcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 480 tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 540 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 600 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 660 cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 720 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacacg tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 780 ggaggtccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 840 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 900 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 960 tacaacagca cgtaccgggt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1020 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1080 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1140 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1200 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1260 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1320 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1380 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaataag cggccgc 1427 <210> 39 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the heavy chain (IgG4) of humanized anti-hTfR antibody No.3 containing amino acid sequence 2 as the variable region <400> 39 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 40 <211> 1418 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the heavy chain (IgG4) of humanized anti-hTfR antibody No.3 containing amino acid sequence 2 as the variable region, synthetic sequence <400> 40 acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60 ggagtgcaca gcgaggtgca actagtgcag tctggagcag aggtgaaaaa gcccggggag 120 tctctgaaga tttcctgtaa gggttctgga tacagcttta ccaactactg gctgggatgg 180 gtgcgccaga tgcccgggaa aggcctggag tggatggggg acatctaccc cggcggagac 240 taccctacat acagcgagaa gttcaaggtc caggtcacca tctcagccga caagtccatc 300 agcaccgcct acctgcagtg gagcagcctg aaggcctcgg acaccgccat gtattactgt 360 gcgagatcag gcaattacga cgaagtggcc tactggggcc aaggaaccct ggtcaccgtc 420 tcctcagcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg cgccctgctc caggagcacc 480 tccgagagca cagccgccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 540 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 600 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacg 660 aagacctaca cctgcaacgt agatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 720 gagtccaaat atggtccccc atgcccacca tgcccagcac ctgagttcct ggggggtcca 780 tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag gacactctca tgatctcccg gacccctgag 840 gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 900 gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc 960 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 1020 tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa 1080 gccaaagggc agccccgaga gccacaggtg tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg 1140 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 1200 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1260 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aggctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320 gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacacag 1380 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaataa gcggccgc 1418 <210> 41 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer hTfR5', synthetic sequence <400> 41 ccgacgcgtc gccaccatga tggatcaagc tagatcagca ttc 43 <210> 42 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer hTfR3', synthetic sequence <400> 42 ataatgcggc cgcttaatga tgatgatgat gatgaaactc attgtcaatg tcccaaacg 59 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Hyg-Sfi5', synthetic sequence <400> 43 gaggccgcct cggcctctga 20 <210> 44 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Hyg-BstX3', synthetic sequence <400> 44 aaccatcgtg atgggtgcta ttcctttgc 29 <210> 45 <211> 4460 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> "Nucleotide sequence of the DNA formed of a cDNA encoding chimeric hTfR and a loxP-flanked neomycin resistance gene placed on the cDNA's 3' side, synthetic sequence " <400> 45 gtttatcctc ccttgtagca gctgagaatg atggatcaag ccagatcagc attctctaac 60 ttgtttggtg gggaaccatt gtcatacacc cggtttagcc ttgctcggca agtagatgga 120 gataacagtc atgtggagat gaaactggct gcagatgaag aagaaaatgc cgacaataac 180 atgaaggcta gtgtcagaaa acccaagagg tttaatggaa gactctgctt tgcagctatt 240 gcactagtca ttttcttctt gattggattc atgagtggct acctgggcta ttgtaaaggg 300 gtagaaccaa aaactgagtg tgagagactg gcaggaaccg agtctccagt gagggaggag 360 ccaggagagg acttccctgc agcacgtcgc ttatattggg atgacctgaa gagaaagttg 420 tcggagaaac tggacagcac agacttcacc ggcaccatca agctgctgaa tgaaaattca 480 tatgtccctc gtgaggctgg atctcaaaaa gatgaaaatc ttgcgttgta tgttgaaaat 540 caatttcgtg aatttaaact cagcaaagtc tggcgtgatc aacattttgt taagattcag 600 gtcaaagaca gcgctcaaaa ctcggtgatc atagttgata agaacggtag acttgtttac 660 ctggtggaga atcctggggg ttatgtggcg tatagtaagg ctgcaacagt tactggtaaa 720 ctggtccatg ctaattttgg tactaaaaaa gattttgagg atttatacac tcctgtgaat 780 ggatctatag tgattgtcag agcagggaaa atcacctttg cagaaaaggt tgcaaatgct 840 gaaagcttaa atgcaattgg tgtgttgata tacatggacc agactaaatt tcccattgtt 900 aacgcagaac tttcattctt tggacatgct catctgggga caggtgaccc ttacacacct 960 ggattccctt ccttcaatca cactcagttt ccaccatctc ggtcatcagg attgcctaat 1020 atacctgtcc agacaatctc cagagctgct gcagaaaagc tgtttgggaa tatggaagga 1080 gactgtccct ctgactggaa aacagactct acatgtagga tggtaacctc agaaagcaag 1140 aatgtgaagc tcactgtgag caatgtgctg aaagagataa aaattcttaa catctttgga 1200 gttattaaag gctttgtaga accagatcac tatgttgtag ttggggccca gagagatgca 1260 tggggccctg gagctgcaaa atccggtgta ggcacagctc tcctattgaa acttgcccag 1320 atgttctcag atatggtctt aaaagatggg tttcagccca gcagaagcat tatctttgcc 1380 agttggagtg ctggagactt tggatcggtt ggtgccactg aatggctaga gggatacctt 1440 tcgtccctgc atttaaaggc tttcacttat attaatctgg ataaagcggt tcttggtacc 1500 agcaacttca aggtttctgc cagcccactg ttgtatacgc ttattgagaa aacaatgcaa 1560 aatgtgaagc atccggttac tgggcaattt ctatatcagg acagcaactg ggccagcaaa 1620 gttgagaaac tcactttaga caatgctgct ttccctttcc ttgcatattc tggaatccca 1680 gcagtttctt tctgtttttg cgaggacaca gattatcctt atttgggtac caccatggac 1740 acctataagg aactgattga gaggattcct gagttgaaca aagtggcacg agcagctgca 1800 gaggtcgctg gtcagttcgt gattaaacta acccatgatg ttgaattgaa cctggactat 1860 gagaggtaca acagccaact gctttcattt gtgagggatc tgaaccaata cagagcagac 1920 ataaaggaaa tgggcctgag tttacagtgg ctgtattctg ctcgtggaga cttcttccgt 1980 gctacttcca gactaacaac agatttcggg aatgctgaga aaacagacag atttgtcatg 2040 aagaaactca atgatcgtgt catgagagtg gagtatcact tcctctctcc ctacgtatct 2100 ccaaaagagt ctcctttccg acatgtcttc tggggctccg gctctcacac gctgccagct 2160 ttactggaga acttgaaact gcgtaaacaa aataacggtg cttttaatga aacgctgttc 2220 agaaaccagt tggctctagc tacttggact attcagggag ctgcaaatgc cctctctggt 2280 gacgtttggg acattgacaa tgagttttaa cgtggctcgc tgatcagcct cgactgtgcc 2340 ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg 2400 tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag 2460 gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga 2520 caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctatggct tctgaggcgg aaagaaccag 2580 ctggggctcg atcctctagt taagcttccc agcggccgct atcgaattcc gatcatattc 2640 aataaccctt aatataactt cgtataatgt atgctatacg aagttattag gtctgaagag 2700 gagtttacgt ccagccaagc taattctacc gggtagggga ggcgcttttc ccaaggcagt 2760 ctggagcatg cgctttagca gccccgctgg gcacttggcg ctacacaagt ggcctctggc 2820 ctcgcacaca ttccacatcc accggtaggc gccaaccggc tccgttcttt ggtggcccct 2880 tcgcgccacc ttctactcct cccctagtca ggaagttccc ccccgccccg cagctcgcgt 2940 cgtgcaggac gtgacaaatg gaagtagcac gtctcactag tctcgtgcag atggacagca 3000 ccgctgagca atggaagcgg gtaggccttt ggggcagcgg ccaatagcag ctttgctcct 3060 tcgctttctg ggctcagagg ctgggaaggg gtgggtccgg gggcgggctc aggggcgggc 3120 tcaggggcgg ggcgggcgcc cgaaggtcct ccggaggccc ggcattctgc acgcttcaaa 3180 agcgcacgtc tgccgcgctg ttctcctctt cctcatctcc gggcctttcg acctgcagcc 3240 aatatgggat cggccattga acaagatgga ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg 3300 gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg 3360 ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc 3420 ctgaatgaac tgcaggacga ggcagcgcgg ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct 3480 tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa 3540 gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg 3600 gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa 3660 gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat 3720 gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg 3780 cgcatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg acccatggcg atgcctgctt gccgaatatc 3840 atggtggaaa atggccgctt ttctggattc atcgactgtg gccggctggg tgtggcggac 3900 cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg 3960 gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc 4020 tatcgccttc ttgacgagtt cttctgaggg gatccgctgt aagtctgcag aaattgatga 4080 tctattaaac aataaagatg tccactaaaa tggaagtttt tcctgtcata ctttgttaag 4140 aagggtgaga acagagtacc tacattttga atggaaggat tggagctacg ggggtggggg 4200 tggggtggga ttagataaat gcctgctctt tactgaaggc tctttactat tgctttatga 4260 taatgtttca tagttggata tcataattta aacaagcaaa accaaattaa gggccagctc 4320 attcctccca ctcatgatct atagatccct cgatcgagat ccggaaccct taatataact 4380 tcgtataatg tatgctatac gaagttatta ggtccctcga agaggttcac tagttctaga 4440 gcatttaaat acgtgctagc 4460 <210> 46 <211> 5003 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of the 5'-arm of targeting vector, synthetic sequence <400> 46 aaagacattc ccagggtccc taagggctcc atctgggagc gcgctatctg tagtcctgtt 60 gtggtttaag ataccactct ctttgttatt tgtaaattta ccacaggctg ggcagtaaag 120 tacagatagg aagaaaagag tgtgaacgtt tgcagtttta acagaactcc ttttatttgc 180 tatgcattgc aacaaccctc taaaagcaat aatggcgata aacatgcaag ttaatctaca 240 actttatcac cctagtaaat cattggttcc tatttccctt ccataggctg aacatagtga 300 gcactggtag ctctttgctt ggcttaagcg ctgcttgtta aaatctaaaa aaaaaaaaaa 360 aaaagatttg cagttttgct ttaaagtttt tcctttaaag catctctgag ctgcaaaaac 420 tcgtctttag gatatggttt tggcggagac ctaagcctgc aagtaggaat attttaaaga 480 gtaaaggctg atactttcga acttgcaccg cagggttggg tgtcggtcaa ggttaggcgg 540 agggcgacag gccaactcca aagacacggc gggggagggg tgcggtggag aaagcgagcc 600 gcagccaatc gcacgcgctc tcccgacacc tgccgccttg gcgccttttc taggctactc 660 cgcgcacgca ctggctgcgc gcgcagttcg cctccagcgg tcttggggga gcacctcggt 720 aggtgtacgt gcggaaggaa gtgacgtaga tccagagggc cggccggggg gtggggccga 780 gctataagct ttgggtggga ggcagcgctg ccttcagaag gcgtgcggag cgcgggctgc 840 tgcattgcgg actgtagagg cgcttcctag tgagtgactc ccttgtcagc ggcacggccc 900 atcgtggtcc tcgcgtggcg ggcggaccag agcgagacgc cagggcctgg gtggtgcggg 960 cggggaggcg gaggggtgtc gcggagtccg gggctgagga gcgcgggttg caggtgcagc 1020 gcggtgggtg tggggagccg ctgtaccctg cgcccctcgg gtcctccggg ccttcgcagg 1080 ccagtgctag gccgcgggtt cgagagtcac cacgctgagg cgcaggcttg ttccgccggg 1140 agcacgtggt ggcggctgga ggaagtcgcc ccagggaacg gctgtcgggg tacgtgggtg 1200 accttggggc ccctcgcagg agggcgtcac agctgaaaag gacaaagctg ttttctattc 1260 ggttactagt gtcacggaca tttagagggg cggggggagc ttccaataac tgcacgttgg 1320 aacttcggca ccacctggtc ggtttttttg ccagtctctc cctcttggcc cagcgtgtgg 1380 aatctcattt ttctagggca gaataggtct gaacgctgca ggtaatacta agaacgtctc 1440 tagcatctcc taagatggga gaacgtagaa atacgacctc tttgtacgag ctcttttaga 1500 actagctgta gagaaccagc gtgcaccctg gtgttggaca gctctctaaa atggtgtttg 1560 agggtaagaa aactgcattt gcaaattttt cagttagcac actttgtccc gagcgtaaaa 1620 tgaaatgatc tccttatact taggcagaag actggactgg attgctgttc agtttctgtg 1680 ctattttttt aaaataggat ttaagtggga aatagttgtg ttacagaaat tctcggctat 1740 tctgtgctat ttttttttaa ataggattta agtgggaaat agttgtgtta cagaaattct 1800 cggctacctg atacttttat tctaagatta gatgagttgg ctctgagctg tgaaatatga 1860 cctctttgac aaagacattt aagctgattc aggatgttat ctacaaagaa aacgggattt 1920 agcttgtgtg ggtccacttg catttatttt ctgttaagga ttataataaa ctgctttata 1980 caggaatcca atatcagctg ttttttatat agagagcata atacttttta ctttgagaga 2040 ggatgttgtc aaggaatggt ggctgtgaac ctggcctgtg ttgactggtt agatctgtct 2100 gcctaacccc accctaaggc taagtagtta tatgcttgtg gcaatgtgct tatttataat 2160 agggcaagat tatgggctaa atttgggtta gacaacaatg aaagttaatt aaacgaccct 2220 caggccttgg gtctactatg tgtaagtgat ttccttctct cccagatgag tgctatacaa 2280 aataaacttc agtgacctca agtggttttg accttttggt tgctattcag aaaactatgg 2340 aaatgaaaac ctgctaccta tttcctattg ccttttcaat ttcccaaaga aggtctcccc 2400 tatgaatcca tgggtagcct tgaactcaga tccacctgct tctgtttgga gagtgataag 2460 attaaaggca agtgccacca cacccagcaa agtaggctct taaaactaaa acctttgcag 2520 tcgggcatgg tgccacacac ctttggtccc agcactgggg ggtaaggcag aggcaggtgg 2580 atcactgagt ttgaggtcag ctagtgctga agagtaagag cctgtcttta aaacatctca 2640 acagctgggc agtcgtggtc cattccttta atcccagcac ttgggaggca gaggcaagtg 2700 gatttttgag ttcgaggcca gcctggtcta cagagtgagt tccaggacag ccagggatac 2760 acagagaaac cctgtctcaa aaaaccaaaa tataaataaa taaataaaga ttgggagaga 2820 agtcaaggat ctcataggtg gtcagggagc tacaactgca gtagtaaaga agtaggactt 2880 aaaagaacag ggccggcact aattttgagg atctagatcg ggccctcaat taaggaactt 2940 ccttttgtgt gaactcagaa tttgaaatga aatgtgcttg tcagaaccat tgcatggctt 3000 attttttaat gaaaagtctg gctagtatct gcttatcttc cagcttccag ctcaaagtta 3060 aggtcataga tcaaaagaac tatgtcttta tcttagttgt atcttaattt ttattagaat 3120 tgaatggttt tcctaatgtt tggtaacatc aaaggtgtgt aagtaaaagt gagaaatcaa 3180 gattaacttt ctcttggcaa agattgttga cattggtgac atcttggacc aaatgagaat 3240 tgttttactt ttaaatgtcc catcaacagc tctcagttag gctgttctat ctggtttgtc 3300 ttgccatgct tgcagagtat agatttgaca atttgaaaat tcaaaaagct atataaatag 3360 gtatgttgct atatgtaaga ttttaaatga gtcagttaag acttaaagaa taactgggtt 3420 tattttatct tgtcaggtta tcactgtgta gaccaggttg accttgaaaa caaattctct 3480 gcttcccaag tgctgggatt aaaggcgtgt gtcactagct ctgacactgg ctactttgga 3540 actactatgg tgttcacaaa tgcagagttg agtgttggga ttaaatggaa atttcatgtc 3600 ttttttttta actttccctt ctacacaggg cttctctgtg tagtcctggc tgtccttgta 3660 gctctagact aggctgaatt caaactcaga tccacccacc taagtgctga gattaaaggc 3720 atgtgccacc actgcccagt tctgaattgt tggggttttt tttttgttgt tattcttaat 3780 tttagttcga tgaattaaaa tcgaaataac ttgtttctta gaaaaataag gtgtaattgg 3840 gttataaagc caaatttaga cattaatacc aacagcctgt ttaggctcaa aattgttcaa 3900 tcattttatt agtattatta ttaatcatat caacttgaga cctgtttggg aaagcagaat 3960 attttaggga tagctatttc agacaagcat taatgtgtta gctgtttttt tccccctaga 4020 atatgattaa aattggctca gggtggggcc ttctagttct ggctctagcg attgggtctg 4080 tttctggtga ggtggtagtg ataaactgta acagaaggga caagagattg ggcttctgag 4140 aacatgtatg atctggtatg tgactttaat cattaaagca tggggattca aaaatactaa 4200 tgaataggcc ttagaactag tcctgagtgt tttgtaaaat aacagtctta attctcctag 4260 tttctggatt tttttctttg tctttggata ctaagtttaa gcatttattt ggacagagtg 4320 gtgcccacta gctgttctat tctagtactt gggaggcaag aggcagaacg aacatggcca 4380 gcttggacaa cttaagaaaa ctgaaaggct tgccatccta gtttttcttt tgattaaaca 4440 cacttatatt ctaactagtt ttctctatcc tttgggtttt gttttgtttt ttatttgttt 4500 tgtagctcta gctggctggc ttcggaattg cctgcctccc aagtgctagg attaaaggca 4560 tcacagtcac tacccaattg atatcatgat tcttaattca acttctaaga acaaattatc 4620 acactctgaa tctaacatgg aatagcatta tccatgttca gatatctttg tctcaaggct 4680 caggtttatc ctttgtagct ttctttttgc tatcccacct ctattcagca tccagtcaag 4740 gatcactgag ttggttatca gtaaattaaa cattttaatt aatgtctagg agacaggtta 4800 tggtatagtt ctcagtgctg ggaagttgac atggtaggat ctcagttcat ggccagccag 4860 aactttctgg tgagatcctg gttcaagcac tacagagctt ttctagaaaa gtaactatat 4920 ttaggagtaa gtttgatata atgacaatcc catcgtaagc cttcagtaac ctgatgcatt 4980 ggtctctgtt ttaatatcag gta 5003 <210> 47 <211> 2604 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of the 3'-arm of targeting vector, synthetic sequence <400> 47 gcattctcta acttggtaag gtactttcat ctatctgaaa aaatgttcag taaaaaacaa 60 aacaaaaaca tgacttcacc cagtgagtac aagatgatac ccccaatttt tttttttttt 120 attatatgta tgtacactgt agctgtcttc agacacacca gaagagggcg tcagatctca 180 tcagatggtt gtgagccacc atgtggttgc tgggacttga acactggacc tttggaaaag 240 cagttgggta ctcttaccca ctgagctatc acaccagccc caatacccca aattttgacc 300 agcctttttt tttttttttt tttttttttt aaatctgaac taatggtatt aaggtgaaac 360 agattgcaca aaagaggtac taggtttttc tttgaggcaa ggtctttcta tattgcctca 420 ggttgacctt aaactccaac ttcctttttt tccccaagtg ctggagattg tagacagata 480 tatacaacac cccaaaacaa atatgtttag tttcgattaa gattcattat gtggggctag 540 agggatgact tagaggttaa gaacactgcc tgctcttcca gaggtcctga gttcaattcc 600 cagcaaccac gtggtggctc acaaccatct gtaatgggat ccgatgccct ctttctggtg 660 tgtttgaaga cagctacagt gtcctcatac ataaaaaaaa taaacaaaca gatcttttaa 720 aaaaaaaggt acagtgtact tatacattat ataaatgaat gattctttaa aaaattaatt 780 atgggaaata cttatgaaga atagggtagc tttggctgtt ttggaaacgt tatataacaa 840 ggtagaacta aaatgtatgc cagtaatccc agaggaatca ttagccagtc agggctagtc 900 tgagcaatgt ggcaagataa acccatctct ttaaaaaaaa aaaaaagtat tataaataga 960 aatgttatag gaaacaggaa atagaaaccc tcgaaaggct gaatgaaaga gtattagtgg 1020 gctggagaga tggttcagcg gttaagagca ctatctcctg agttcagttc ccagtgacca 1080 catggtggct cacagccatc tgtaatgaga tctgacgccc tcttctgggg tgtctgaaga 1140 cagcgacagt gtactcacat aaaataaata cataaagact gttagttagc cttcatctac 1200 catttacaga actgggcaca gaaaggagtt catcagttat aaagggtaac tttccatatg 1260 aatgtttgtc atattattat gcatatagta taatgaccaa actactgtaa tgtcttaata 1320 tttgtatctc ttttctcttt tttaaaaata tcagtttggt ggggaaccat tgtcatacac 1380 ccggtttagc cttgctcggc aagtagatgg agataacagt catgtggaga tgaaactggc 1440 tgcagatgaa gaagaaaatg ccgacaataa catgaaggct agtgtcagaa aacccaagag 1500 gtttaatgga agactctgct ttgcagctat tgcactagtc attttcttct tgattggtaa 1560 gaatgagtgg ccattcagaa ggatttctta tgactaacta gttcttagac tagctagttc 1620 ttagactagc tagttcttgt ttcttttgga tgaggagatg ctttgtactt taaatggcac 1680 tggggctccc tacctgccgg cagattaggt cctgcaagat gggaaacgtt tacattatgg 1740 atgttttatt agagatatgc aggacatttg gaatagtact aagaaaggct tccagtaaga 1800 caaggtgtgc acccatgtct taaacaggtc actgtaaaat atgacttagt tgtggtaatt 1860 taaattccat taaactcagg ttcataattt tctattagat tctcatagtt taattaaaag 1920 ttttcaggga taagttaaaa atgagttctg tgagtttagc tctaaaactt cctgttttta 1980 ggattcatga gtggctacct gggctattgt aagcgtgtag aacaaaaaga ggagtgtgtg 2040 aaactggctg aaacggagga gacagacaag tcagaaacca tggaaacaga ggatgttcct 2100 acatcatctc gcttatattg ggcagacctc aaaacactgt tgtcagagaa gttgaactcc 2160 atagagtttg ctgacaccat caagtaagct caacttccca agttcagtcc tgatggaaac 2220 gtttttgttg ggggggtagg gagacttgaa aggctttcag agggtcctcc tgacaatgtg 2280 gaactatgct gacaggaaat taggacttac ctggagagcc tcatagcctc ctttttcttc 2340 agaatcgttt tatcagttgt agtttagtgt gggatgtcag attttcttct gttctaatat 2400 tccttttaaa aattttttaa aattaaaatt actttttatg tattatgagt atagcctgca 2460 tatatgaatg aatgtgcatt actaattaca cttatctcct agtgcctaca taagccttat 2520 agatggttgt gagccagcat gtgggtgctg gaatccaaaa tggttcttgc aagaccaaat 2580 atgttacatc ccagagccat taca 2604 <210> 48 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the variable region of the light chain of mouse anti-hTfR antibody No.3 <400> 48 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Phe Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 49 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the variable region of the heavy chain of mouse anti-hTfR antibody No.3 <400> 49 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Lys Ala Ile Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Ser Val Tyr 65 70 75 80 Leu His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Thr 115 <210> 50 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(357) <400> 50 cac tct gac cct gcc cgc cga ggg gag ctg agc gtg tgt gac agt att 48 His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile 1 5 10 15 agt gag tgg gta acg gcg gca gac aaa aag act gca gtg gac atg tcg 96 Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser 20 25 30 ggc ggg acg gtc aca gtc ctt gaa aag gtc cct gta tca aaa ggc caa 144 Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln 35 40 45 ctg aag caa tac ttc tac gag acc aag tgc aat ccc atg ggt tac aca 192 Leu Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr 50 55 60 aaa gaa ggc tgc agg ggc ata gac aaa agg cat tgg aac tcc cag tgc 240 Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gln Cys 65 70 75 80 cga act acc cag tcg tac gtg cgg gcc ctt acc atg gat agc aaa aag 288 Arg Thr Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys 85 90 95 aga att ggc tgg cga ttc ata agg ata gac act tct tgt gta tgt aca 336 Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr 100 105 110 ttg acc att aaa agg gga aga 357 Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg 115 <210> 51 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile 1 5 10 15 Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser 20 25 30 Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln 35 40 45 Leu Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr 50 55 60 Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gln Cys 65 70 75 80 Arg Thr Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys 85 90 95 Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr 100 105 110 Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg 115 <210> 52 <211> 569 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of fusion protein of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody 3N and hBDNF (1) <400> 52 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 Gly Ser His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp 450 455 460 Ser Ile Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp 465 470 475 480 Met Ser Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys 485 490 495 Gly Gln Leu Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly 500 505 510 Tyr Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser 515 520 525 Gln Cys Arg Thr Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser 530 535 540 Lys Lys Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val 545 550 555 560 Cys Thr Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg 565 <210> 53 <211> 1790 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide seuquence encoding the amino acid sequence of fusion protein of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody 3N and hBDNF (1), synthetic sequence <400> 53 acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60 ggagtgcaca gcgaggtgca actagtgcag tctggagcag aggtgaaaaa gcccggggag 120 tctctgaaga tttcctgtaa gggttctgga tacagcttta tgaactactg gctgggatgg 180 gtgcgccaga tgcccgggaa aggcctggag tggatggggg acatctaccc cggcggagac 240 taccctacat acagcgagaa gttcaaggtc caggtcacca tctcagccga caagtccatc 300 agcaccgcct acctgcagtt gagcagcctg aaggcctcgg acaccgccat gtattactgt 360 gcgagatcag gcaattacga cgaagtggcc tactggggcc aaggaaccct ggtcaccgtc 420 tcctcagcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 480 tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 540 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 600 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 660 cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 720 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacacg tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 780 ggaggtccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 840 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 900 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 960 tacaacagca cgtaccgggt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1020 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1080 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1140 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1200 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1260 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1320 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1380 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaaggat ctcactctga ccctgcccgc 1440 cgaggggagc tgagcgtgtg tgacagtatt agtgagtggg taacggcggc agacaaaaag 1500 actgcagtgg acatgtcggg cgggacggtc acagtccttg aaaaggtccc tgtatcaaaa 1560 ggccaactga agcaatactt ctacgagacc aagtgcaatc ccatgggtta cacaaaagaa 1620 ggctgcaggg gcatagacaa aaggcattgg aactcccagt gccgaactac ccagtcgtac 1680 gtgcgggccc ttaccatgga tagcaaaaag agaattggct ggcgattcat aaggatagac 1740 acttcttgtg tatgtacatt gaccattaaa aggggaagat aagcggccgc 1790 <210> 54 <211> 594 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of fusion protein of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody 3N and hBDNF (2) <400> 54 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 450 455 460 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Ser Asp Pro Ala 465 470 475 480 Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile Ser Glu Trp Val Thr 485 490 495 Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly Thr Val Thr 500 505 510 Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln Leu Lys Gln Tyr Phe 515 520 525 Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu Gly Cys Arg 530 535 540 Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gln Cys Arg Thr Thr Gln Ser 545 550 555 560 Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile Gly Trp Arg 565 570 575 Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr Ile Lys Arg 580 585 590 Gly Arg <210> 55 <211> 1865 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide seuquence encoding the amino acid sequence of fusion protein of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody 3N and hBDNF (2), synthetic sequence <400> 55 acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60 ggagtgcaca gcgaggtgca actagtgcag tctggagcag aggtgaaaaa gcccggggag 120 tctctgaaga tttcctgtaa gggttctgga tacagcttta tgaactactg gctgggatgg 180 gtgcgccaga tgcccgggaa aggcctggag tggatggggg acatctaccc cggcggagac 240 taccctacat acagcgagaa gttcaaggtc caggtcacca tctcagccga caagtccatc 300 agcaccgcct acctgcagtt gagcagcctg aaggcctcgg acaccgccat gtattactgt 360 gcgagatcag gcaattacga cgaagtggcc tactggggcc aaggaaccct ggtcaccgtc 420 tcctcagcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 480 tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 540 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 600 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 660 cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 720 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacacg tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 780 ggaggtccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 840 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 900 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 960 tacaacagca cgtaccgggt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1020 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1080 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1140 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1200 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1260 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1320 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1380 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaaggat ctggtggcgg agggtctgga 1440 ggtggcggat caggcggagg aggttccggg ggcggtggaa gcggaggcgg tggaagccac 1500 tctgaccctg cccgccgagg ggagctgagc gtgtgtgaca gtattagtga gtgggtaacg 1560 gcggcagaca aaaagactgc agtggacatg tcgggcggga cggtcacagt ccttgaaaag 1620 gtccctgtat caaaaggcca actgaagcaa tacttctacg agaccaagtg caatcccatg 1680 ggttacacaa aagaaggctg caggggcata gacaaaaggc attggaactc ccagtgccga 1740 actacccagt cgtacgtgcg ggcccttacc atggatagca aaaagagaat tggctggcga 1800 ttcataagga tagacacttc ttgtgtatgt acattgacca ttaaaagggg aagataagcg 1860 gccgc 1865 <210> 56 <211> 229 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Ala Pro Met Lys Glu Ala Asn Ile Arg Gly Gln Gly Gly Leu Ala Tyr 1 5 10 15 Pro Gly Val Arg Thr His Gly Thr Leu Glu Ser Val Asn Gly Pro Lys 20 25 30 Ala Gly Ser Arg Gly Leu Thr Ser Leu Ala Asp Thr Phe Glu His Val 35 40 45 Ile Glu Glu Leu Leu Asp Glu Asp Gln Lys Val Arg Pro Asn Glu Glu 50 55 60 Asn Asn Lys Asp Ala Asp Leu Tyr Thr Ser Arg Val Met Leu Ser Ser 65 70 75 80 Gln Val Pro Leu Glu Pro Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Glu Tyr Lys 85 90 95 Asn Tyr Leu Asp Ala Ala Asn Met Ser Met Arg Val Arg Arg His Ser 100 105 110 Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile Ser Glu 115 120 125 Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly 130 135 140 Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln Leu Lys 145 150 155 160 Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu 165 170 175 Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gln Cys Arg Thr 180 185 190 Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile 195 200 205 Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr 210 215 220 Ile Lys Arg Gly Arg 225 <210> 57 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of single-chain humanized anti-hTfR antibody No. 3N <400> 57 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu 130 135 140 Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln 145 150 155 160 Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln 165 170 175 Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg 180 185 190 Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 195 200 205 Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr 210 215 220 Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr 225 230 235 240 Lys Val Glu Ile Lys 245 <210> 58 <211> 1583 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide seuquence encoding the amino acid sequence of the fusion protein of the single-chain humanized anti-hTfR antibody 3N and pro-hBDNF, synthetic sequence <400> 58 acgcgtgccg ccaccatgac catccttttc cttactatgg ttatttcata ctttggttgc 60 atgaaggctg cccccatgaa agaagcaaac atccgaggac aaggtggctt ggcctaccca 120 ggtgtgcgga cccatgggac tctggagagc gtgaatgggc ccaaggcagg ttcaagaggc 180 ttgacatcat tggctgacac tttcgaacac gtgatagaag agctgttgga tgaggaccag 240 aaagttcggc ccaatgaaga aaacaataag gacgcagact tgtacacgtc cagggtgatg 300 ctcagtagtc aagtgccttt ggagcctcct cttctctttc tgctggagga atacaaaaat 360 tacctagatg ctgcaaacat gtccatgagg gtccggcgcc actctgaccc tgcccgccga 420 ggggagctga gcgtgtgtga cagtattagt gagtgggtaa cggcggcaga caaaaagact 480 gcagtggaca tgtcgggcgg gacggtcaca gtccttgaaa aggtccctgt atcaaaaggc 540 caactgaagc aatacttcta cgagaccaag tgcaatccca tgggttacac aaaagaaggc 600 tgcaggggca tagacaaaag gcattggaac tcccagtgcc gaactaccca gtcgtacgtg 660 cgggccctta ccatggatag caagaagaga attggctggc gattcataag gatagacact 720 tcttgtgtat gtacattgac cattaaaagg ggaagaggat ctggtggcgg agggtctgga 780 ggtggcggat caggcggagg aggttccggg ggcggtggaa gcggaggcgg tggaagtgag 840 gtgcaactag tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaagatttcc 900 tgtaagggtt ctggatacag ctttatgaac tactggctgg gatgggtgcg ccagatgccc 960 gggaaaggcc tggagtggat gggggacatc taccccggcg gagactaccc tacatacagc 1020 gagaagttca aggtccaggt caccatctca gccgacaagt ccatcagcac cgcctacctg 1080 cagttgagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag atcaggcaat 1140 tacgacgaag tggcctactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc aggcggtggt 1200 ggaagtggag gcggtgggtc gggaggaggt ggcagcgaca tcgtgatgac ccagactccc 1260 ctgagcctga gcgtgacacc tggccagcct gccagcatca gctgcagaag ctctcagagc 1320 ctggtgcaca gcaacggcaa cacctacctg cactggtatc tgcagaagcc cggccagagc 1380 cctcagctgc tgatctacaa ggtgtccaac agattcagcg gcgtgcccga cagattctcc 1440 ggcagcggct ctggcaccga cttcaccctg aagatttcca gagtggaagc cgaggacgtg 1500 ggcgtgtact actgcagcca gagcacccac gtgccctgga cattcggcca gggcaccaag 1560 gtggaaatca agtaagcggc cgc 1583 <210> 59 <211> 501 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the fusion protein of the single-chain humanized anti-hTfR antibody 3N and pro-hBDNF <400> 59 Ala Pro Met Lys Glu Ala Asn Ile Arg Gly Gln Gly Gly Leu Ala Tyr 1 5 10 15 Pro Gly Val Arg Thr His Gly Thr Leu Glu Ser Val Asn Gly Pro Lys 20 25 30 Ala Gly Ser Arg Gly Leu Thr Ser Leu Ala Asp Thr Phe Glu His Val 35 40 45 Ile Glu Glu Leu Leu Asp Glu Asp Gln Lys Val Arg Pro Asn Glu Glu 50 55 60 Asn Asn Lys Asp Ala Asp Leu Tyr Thr Ser Arg Val Met Leu Ser Ser 65 70 75 80 Gln Val Pro Leu Glu Pro Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Glu Tyr Lys 85 90 95 Asn Tyr Leu Asp Ala Ala Asn Met Ser Met Arg Val Arg Arg His Ser 100 105 110 Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile Ser Glu 115 120 125 Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly 130 135 140 Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln Leu Lys 145 150 155 160 Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu 165 170 175 Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gln Cys Arg Thr 180 185 190 Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile 195 200 205 Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr 210 215 220 Ile Lys Arg Gly Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 225 230 235 240 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 245 250 255 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 260 265 270 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 275 280 285 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 290 295 300 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 305 310 315 320 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 325 330 335 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 340 345 350 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 355 360 365 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 370 375 380 Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu 385 390 395 400 Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln 405 410 415 Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln 420 425 430 Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg 435 440 445 Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 450 455 460 Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr 465 470 475 480 Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr 485 490 495 Lys Val Glu Ile Lys 500 <210> 60 <211> 391 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the fusion protein of the single-chain humanized anti-hTfR antibody 3N and hBDNF <400> 60 His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile 1 5 10 15 Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser 20 25 30 Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln 35 40 45 Leu Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr 50 55 60 Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gln Cys 65 70 75 80 Arg Thr Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys 85 90 95 Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr 100 105 110 Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro 145 150 155 160 Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met 165 170 175 Asn Tyr Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu 180 185 190 Trp Met Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu 195 200 205 Lys Phe Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr 210 215 220 Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr 225 230 235 240 Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln 245 250 255 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 260 265 270 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu 275 280 285 Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser 290 295 300 Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr 305 310 315 320 Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser 325 330 335 Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 340 345 350 Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly 355 360 365 Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln 370 375 380 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 385 390 <210> 61 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the Fab heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3N <400> 61 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr 225 <210> 62 <211> 1524 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide seuquence encoding the amino acid sequence of the fusion protein of the Fab heavy chain of humanized anti-hTfR antibody 3N and pro-hBDNF, synthetic sequence <400> 62 acgcgtcgcc accatgggtt ggagcctcat cttgctcttc cttgtcgctg ttgctacgcg 60 agtcggcagc gcccccatga aagaagcaaa catccgagga caaggtggct tggcctaccc 120 aggtgtgcgg acccatggga ctctggagag cgtgaatggg cccaaggcag gttcaagagg 180 cttgacatca ttggctgaca ctttcgaaca cgtgatagaa gagctgttgg atgaggacca 240 gaaagttcgg cccaatgaag aaaacaataa ggacgcagac ttgtacacgt ccagggtgat 300 gctcagtagt caagtgcctt tggagcctcc tcttctcttt ctgctggagg aatacaaaaa 360 ttacctagat gctgcaaaca tgtccatgag ggtccggcgc cactctgacc ctgcccgccg 420 aggggagctg agcgtgtgtg acagtattag tgagtgggta acggcggcag acaaaaagac 480 tgcagtggac atgtcgggcg ggacggtcac agtccttgaa aaggtccctg tatcaaaagg 540 ccaactgaag caatacttct acgagaccaa gtgcaatccc atgggttaca caaaagaagg 600 ctgcaggggc atagacaaaa ggcattggaa ctcccagtgc cgaactaccc agtcgtacgt 660 gcgggccctt accatggata gcaagaagag aattggctgg cgattcataa ggatagacac 720 ttcttgtgta tgtacattga ccattaaaag gggaagaggt ggcggagggt ctggaggtgg 780 cggatcaggc ggaggaggtt ccgggggcgg tggaagcgga ggcggtggat ccgaggtgca 840 actagtgcag tctggagcag aggtgaaaaa gcccggggag tctctgaaga tttcctgtaa 900 gggttctgga tacagcttta tgaactactg gctgggatgg gtgcgccaga tgcccgggaa 960 aggcctggag tggatggggg acatctaccc cggcggagac taccctacat acagcgagaa 1020 gttcaaggtc caggtcacca tctcagccga caagtccatc agcaccgcct acctgcagtt 1080 gagcagcctg aaggcctcgg acaccgccat gtattactgt gcgagatcag gcaattacga 1140 cgaagtggcc tactggggcc aaggaaccct ggtcaccgtc tcctcagcta gcaccaaggg 1200 cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca cagcggccct 1260 gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc 1320 cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct 1380 cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca tctgcaacgt 1440 gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt gagccgaaga gctgtgataa 1500 gacgcatacg taataagcgg ccgc 1524 <210> 63 <211> 480 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the fusion protein of the Fab heavy chain of humanized anti-hTfR antibody 3N and pro-hBDNF <400> 63 Ala Pro Met Lys Glu Ala Asn Ile Arg Gly Gln Gly Gly Leu Ala Tyr 1 5 10 15 Pro Gly Val Arg Thr His Gly Thr Leu Glu Ser Val Asn Gly Pro Lys 20 25 30 Ala Gly Ser Arg Gly Leu Thr Ser Leu Ala Asp Thr Phe Glu His Val 35 40 45 Ile Glu Glu Leu Leu Asp Glu Asp Gln Lys Val Arg Pro Asn Glu Glu 50 55 60 Asn Asn Lys Asp Ala Asp Leu Tyr Thr Ser Arg Val Met Leu Ser Ser 65 70 75 80 Gln Val Pro Leu Glu Pro Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Glu Tyr Lys 85 90 95 Asn Tyr Leu Asp Ala Ala Asn Met Ser Met Arg Val Arg Arg His Ser 100 105 110 Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile Ser Glu 115 120 125 Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly 130 135 140 Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln Leu Lys 145 150 155 160 Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu 165 170 175 Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gln Cys Arg Thr 180 185 190 Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile 195 200 205 Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr 210 215 220 Ile Lys Arg Gly Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 225 230 235 240 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val 245 250 255 Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu 260 265 270 Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr Trp Leu 275 280 285 Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Asp 290 295 300 Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe Lys Val 305 310 315 320 Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln 325 330 335 Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg 340 345 350 Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 355 360 365 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 370 375 380 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 385 390 395 400 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 405 410 415 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 420 425 430 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 435 440 445 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 450 455 460 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 465 470 475 480 <210> 64 <211> 1196 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide seuquence encoding the amino acid sequence of the fusion protein of the Fab heavy chain of humanized anti-hTfR antibody 3N and hBDNF, synthetic sequence <400> 64 acgcgtgccg ccaccatgac catccttttc cttactatgg ttatttcata ctttggttgc 60 atgaaggctc actctgaccc tgcccgccga ggggagctga gcgtgtgtga cagtattagt 120 gagtgggtaa cggcggcaga caaaaagact gcagtggaca tgtcgggcgg gacggtcaca 180 gtccttgaaa aggtccctgt atcaaaaggc caactgaagc aatacttcta cgagaccaag 240 tgcaatccca tgggttacac aaaagaaggc tgcaggggca tagacaaaag gcattggaac 300 tcccagtgcc gaactaccca gtcgtacgtg cgggccctta ccatggatag caaaaagaga 360 attggctggc gattcataag gatagacact tcttgtgtat gtacattgac cattaaaagg 420 ggaagaggat ctggtggcgg agggtctgga ggtggcggat caggcggagg aggttccggg 480 ggcggtggaa gcggaggcgg tggaagtgag gtgcaactag tgcagtctgg agcagaggtg 540 aaaaagcccg gggagtctct gaagatttcc tgtaagggtt ctggatacag ctttatgaac 600 tactggctgg gatgggtgcg ccagatgccc gggaaaggcc tggagtggat gggggacatc 660 taccccggcg gagactaccc tacatacagc gagaagttca aggtccaggt caccatctca 720 gccgacaagt ccatcagcac cgcctacctg cagttgagca gcctgaaggc ctcggacacc 780 gccatgtatt actgtgcgag atcaggcaat tacgacgaag tggcctactg gggccaagga 840 accctggtca ccgtctcctc agctagcacc aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc 900 tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc 960 cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc 1020 ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc 1080 agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag 1140 gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt gacaaaactc acacgtaagc ggccgc 1196 <210> 65 <211> 370 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the fusion protein of the Fab heavy chain of humanized anti-hTfR antibody 3N and hBDNF <400> 65 His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile 1 5 10 15 Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser 20 25 30 Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln 35 40 45 Leu Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr 50 55 60 Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gln Cys 65 70 75 80 Arg Thr Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys 85 90 95 Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr 100 105 110 Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 145 150 155 160 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 165 170 175 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 180 185 190 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 195 200 205 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 210 215 220 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 225 230 235 240 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 245 250 255 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 260 265 270 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 275 280 285 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 290 295 300 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 305 310 315 320 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 325 330 335 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 340 345 350 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 355 360 365 His Thr 370 <210> 66 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 1 of CDR1 in the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3N <400> 66 Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr Trp 1 5 <210> 67 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence 2 of CDR1 in the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3N <400> 67 Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr Trp Leu Gly 1 5 10 <210> 68 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of framework region 3 in the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3N <400> 68 Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 69 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the variable region of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3N <400> 69 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 70 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3N <400> 70 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 71 <211> 1427 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide seuquence encoding the amino acid sequence of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3N, synthetic sequence <400> 71 acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60 ggagtgcaca gcgaggtgca actagtgcag tctggagcag aggtgaaaaa gcccggggag 120 tctctgaaga tttcctgtaa gggttctgga tacagcttta tgaactactg gctgggatgg 180 gtgcgccaga tgcccgggaa aggcctggag tggatggggg acatctaccc cggcggagac 240 taccctacat acagcgagaa gttcaaggtc caggtcacca tctcagccga caagtccatc 300 agcaccgcct acctgcagtt gagcagcctg aaggcctcgg acaccgccat gtattactgt 360 gcgagatcag gcaattacga cgaagtggcc tactggggcc aaggaaccct ggtcaccgtc 420 tcctcagcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 480 tctgggggca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 540 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 600 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc 660 cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 720 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacacg tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 780 ggaggtccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 840 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 900 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 960 tacaacagca cgtaccgggt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 1020 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1080 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1140 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1200 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1260 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1320 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1380 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaataag cggccgc 1427 <210> 72 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3N (IgG4) <400> 72 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 73 <211> 2253 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide seuquence encoding the amino acid sequence of the fusion protein of the Fab heavy chain of humanized anti-hTfR antibody 3N and pro-hBDNF, further introduced with Fc region of human IgG, synthetic sequence <400> 73 acgcgtcgcc accatgggtt ggagcctcat cttgctcttc cttgtcgctg ttgctacgcg 60 agtcggcagc gcccccatga aagaagcaaa catccgagga caaggtggct tggcctaccc 120 aggtgtgcgg acccatggga ctctggagag cgtgaatggg cccaaggcag gttcaagagg 180 cttgacatca ttggctgaca ctttcgaaca cgtgatagaa gagctgttgg atgaggacca 240 gaaagttcgg cccaatgaag aaaacaataa ggacgcagac ttgtacacgt ccagggtgat 300 gctcagtagt caagtgcctt tggagcctcc tcttctcttt ctgctggagg aatacaaaaa 360 ttacctagat gctgcaaaca tgtccatgag ggtccggcgc cactctgacc ctgcccgccg 420 aggggagctg agcgtgtgtg acagtattag tgagtgggta acggcggcag acaaaaagac 480 tgcagtggac atgtcgggcg ggacggtcac agtccttgaa aaggtccctg tatcaaaagg 540 ccaactgaag caatacttct acgagaccaa gtgcaatccc atgggttaca caaaagaagg 600 ctgcaggggc atagacaaaa ggcattggaa ctcccagtgc cgaactaccc agtcgtacgt 660 gcgggccctt accatggata gcaagaagag aattggctgg cgattcataa ggatagacac 720 ttcttgtgta tgtacattga ccattaaaag gggaagaggc ggtggtggaa gtggaggcgg 780 tgggtcggga ggaggtggca gcggtggagg cggatcaggc ggtggtggca gtccagcacc 840 tgaactcctg ggaggtccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat 900 gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga 960 ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg 1020 ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga 1080 ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat 1140 cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc 1200 cccatcccgg gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt 1260 ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa 1320 gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt 1380 ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc acgaggctct 1440 gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaaggtg gcggagggtc 1500 tggaggaggc ggtagcggcg gaggaggttc cgggggcggt ggaagcggag gcggtggatc 1560 cgaggtgcaa ctagtgcagt ctggagcaga ggtgaaaaag cccggggagt ctctgaagat 1620 ttcctgtaag ggttctggat acagctttat gaactactgg ctgggatggg tgcgccagat 1680 gcccgggaaa ggcctggagt ggatggggga catctacccc ggcggagact accctacata 1740 cagcgagaag ttcaaggtcc aggtcaccat ctcagccgac aagtccatca gcaccgccta 1800 cctgcagttg agcagcctga aggcctcgga caccgccatg tattactgtg cgagatcagg 1860 caattacgac gaagtggcct actggggcca aggaaccctg gtcaccgtct cctcagctag 1920 caccaagggc ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac 1980 agcggccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa 2040 ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact 2100 ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat 2160 ctgcaacgtg aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagaaagttg agccgaagag 2220 ctgtgataag acgcatacgt aataagcggc cgc 2253 <210> 74 <211> 723 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the fusion protein of the Fab heavy chain of humanized anti-hTfR antibody 3N and pro-hBDNF, further introduced with Fc region of human IgG <400> 74 Ala Pro Met Lys Glu Ala Asn Ile Arg Gly Gln Gly Gly Leu Ala Tyr 1 5 10 15 Pro Gly Val Arg Thr His Gly Thr Leu Glu Ser Val Asn Gly Pro Lys 20 25 30 Ala Gly Ser Arg Gly Leu Thr Ser Leu Ala Asp Thr Phe Glu His Val 35 40 45 Ile Glu Glu Leu Leu Asp Glu Asp Gln Lys Val Arg Pro Asn Glu Glu 50 55 60 Asn Asn Lys Asp Ala Asp Leu Tyr Thr Ser Arg Val Met Leu Ser Ser 65 70 75 80 Gln Val Pro Leu Glu Pro Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Glu Tyr Lys 85 90 95 Asn Tyr Leu Asp Ala Ala Asn Met Ser Met Arg Val Arg Arg His Ser 100 105 110 Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile Ser Glu 115 120 125 Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly 130 135 140 Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln Leu Lys 145 150 155 160 Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu 165 170 175 Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gln Cys Arg Thr 180 185 190 Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile 195 200 205 Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr 210 215 220 Ile Lys Arg Gly Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 225 230 235 240 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala 245 250 255 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 260 265 270 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 275 280 285 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 290 295 300 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 305 310 315 320 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 325 330 335 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 340 345 350 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 355 360 365 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 370 375 380 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 385 390 395 400 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 405 410 415 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 420 425 430 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 435 440 445 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 450 455 460 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 465 470 475 480 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 485 490 495 Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly 500 505 510 Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn 515 520 525 Tyr Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 530 535 540 Met Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys 545 550 555 560 Phe Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala 565 570 575 Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr 580 585 590 Cys Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 595 600 605 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 610 615 620 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 625 630 635 640 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 645 650 655 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 660 665 670 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 675 680 685 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 690 695 700 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 705 710 715 720 Thr His Thr <210> 75 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of an exemplified Fc region of human IgG <400> 75 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 35 40 45 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 85 90 95 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 100 105 110 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 115 120 125 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 130 135 140 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 145 150 155 160 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 165 170 175 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 180 185 190 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 195 200 205 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 76 <211> 1418 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide seuquence encoding the amino acid sequence of the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3N (IgG4), synthetic sequence <400> 76 acgcgtgccg ccaccatggg ctggagctgg attctgctgt tcctcctgag cgtgacagca 60 ggagtgcaca gcgaggtgca actagtgcag tctggagcag aggtgaaaaa gcccggggag 120 tctctgaaga tttcctgtaa gggttctgga tacagcttta tgaactactg gctgggatgg 180 gtgcgccaga tgcccgggaa aggcctggag tggatggggg acatctaccc cggcggagac 240 taccctacat acagcgagaa gttcaaggtc caggtcacca tctcagccga caagtccatc 300 agcaccgcct acctgcagtt gagcagcctg aaggcctcgg acaccgccat gtattactgt 360 gcgagatcag gcaattacga cgaagtggcc tactggggcc aaggaaccct ggtcaccgtc 420 tcctcagcta gcaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg cgccctgctc caggagcacc 480 tccgagagca cagccgccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 540 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 600 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacg 660 aagacctaca cctgcaacgt agatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 720 gagtccaaat atggtccccc atgcccacca tgcccagcac ctgagttcct ggggggtcca 780 tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag gacactctca tgatctcccg gacccctgag 840 gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 900 gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc 960 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 1020 tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa 1080 gccaaagggc agccccgaga gccacaggtg tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg 1140 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 1200 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1260 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aggctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320 gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacacag 1380 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaataa gcggccgc 1418 <210> 77 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the Fab heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3 <400> 77 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr 225 <210> 78 <211> 1526 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide seuquence encoding the amino acid sequence of the fusion protein of the Fab heavy chain of humanized anti-hTfR antibody 3 and pro-hBDNF, synthetic sequence <400> 78 acgcgtgccg ccaccatgac catccttttc cttactatgg ttatttcata ctttggttgc 60 atgaaggctg cccccatgaa agaagcaaac atccgaggac aaggtggctt ggcctaccca 120 ggtgtgcgga cccatgggac tctggagagc gtgaatgggc ccaaggcagg ttcaagaggc 180 ttgacatcat tggctgacac tttcgaacac gtgatagaag agctgttgga tgaggaccag 240 aaagttcggc ccaatgaaga aaacaataag gacgcagact tgtacacgtc cagggtgatg 300 ctcagtagtc aagtgccttt ggagcctcct cttctctttc tgctggagga atacaaaaat 360 tacctagatg ctgcaaacat gtccatgagg gtccggcgcc actctgaccc tgcccgccga 420 ggggagctga gcgtgtgtga cagtattagt gagtgggtaa cggcggcaga caaaaagact 480 gcagtggaca tgtcgggcgg gacggtcaca gtccttgaaa aggtccctgt atcaaaaggc 540 caactgaagc aatacttcta cgagaccaag tgcaatccca tgggttacac aaaagaaggc 600 tgcaggggca tagacaaaag gcattggaac tcccagtgcc gaactaccca gtcgtacgtg 660 cgggccctta ccatggatag caagaagaga attggctggc gattcataag gatagacact 720 tcttgtgtat gtacattgac cattaaaagg ggaagaggat ctggtggcgg agggtctgga 780 ggtggcggat caggcggagg aggttccggg ggcggtggaa gcggaggcgg tggaagtgag 840 gtgcaactag tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtctct gaagatttcc 900 tgtaagggtt ctggatacag ctttaccaac tactggctgg gatgggtgcg ccagatgccc 960 gggaaaggcc tggagtggat gggggacatc taccccggcg gagactaccc tacatacagc 1020 gagaagttca aggtccaggt caccatctca gccgacaagt ccatcagcac cgcctacctg 1080 cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag atcaggcaat 1140 tacgacgaag tggcctactg gggccaagga accctggtca ccgtctcctc agctagcacc 1200 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 1260 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 1320 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 1380 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 1440 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 1500 gacaaaactc acacgtaagc ggccgc 1526 <210> 79 <211> 482 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the fusion protein of the Fab heavy chain of humanized anti-hTfR antibody 3 and pro-hBDNF <400> 79 Ala Pro Met Lys Glu Ala Asn Ile Arg Gly Gln Gly Gly Leu Ala Tyr 1 5 10 15 Pro Gly Val Arg Thr His Gly Thr Leu Glu Ser Val Asn Gly Pro Lys 20 25 30 Ala Gly Ser Arg Gly Leu Thr Ser Leu Ala Asp Thr Phe Glu His Val 35 40 45 Ile Glu Glu Leu Leu Asp Glu Asp Gln Lys Val Arg Pro Asn Glu Glu 50 55 60 Asn Asn Lys Asp Ala Asp Leu Tyr Thr Ser Arg Val Met Leu Ser Ser 65 70 75 80 Gln Val Pro Leu Glu Pro Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Glu Tyr Lys 85 90 95 Asn Tyr Leu Asp Ala Ala Asn Met Ser Met Arg Val Arg Arg His Ser 100 105 110 Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile Ser Glu 115 120 125 Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly 130 135 140 Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln Leu Lys 145 150 155 160 Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu 165 170 175 Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gln Cys Arg Thr 180 185 190 Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile 195 200 205 Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr 210 215 220 Ile Lys Arg Gly Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 225 230 235 240 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 245 250 255 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 260 265 270 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr 275 280 285 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 290 295 300 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 305 310 315 320 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 325 330 335 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 340 345 350 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 355 360 365 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 370 375 380 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 385 390 395 400 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 405 410 415 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 420 425 430 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 435 440 445 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 450 455 460 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 465 470 475 480 His Thr <210> 80 <211> 372 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the fusion protein of the Fab heavy chain of humanized anti-hTfR antibody 3 and hBDNF <400> 80 His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile 1 5 10 15 Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser 20 25 30 Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln 35 40 45 Leu Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr 50 55 60 Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gln Cys 65 70 75 80 Arg Thr Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys 85 90 95 Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr 100 105 110 Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro 145 150 155 160 Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr 165 170 175 Asn Tyr Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu 180 185 190 Trp Met Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu 195 200 205 Lys Phe Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr 210 215 220 Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr 225 230 235 240 Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln 245 250 255 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 260 265 270 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 275 280 285 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 290 295 300 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 305 310 315 320 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 325 330 335 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 340 345 350 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 355 360 365 Lys Thr His Thr 370 <210> 81 <211> 469 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the Fab heavy chain of humanized anti-hTfR antibody 3N , further introduced with Fc region of human IgG <400> 81 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 20 25 30 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 35 40 45 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 50 55 60 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 65 70 75 80 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 85 90 95 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 100 105 110 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 115 120 125 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 130 135 140 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 145 150 155 160 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 165 170 175 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 180 185 190 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 195 200 205 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly 210 215 220 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 225 230 235 240 Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 245 250 255 Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe 260 265 270 Met Asn Tyr Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu 275 280 285 Glu Trp Met Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser 290 295 300 Glu Lys Phe Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser 305 310 315 320 Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met 325 330 335 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly 340 345 350 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 355 360 365 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 370 375 380 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 385 390 395 400 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 405 410 415 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 420 425 430 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 435 440 445 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 450 455 460 Asp Lys Thr His Thr 465 <210> 82 <211> 1491 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide seuquence encoding the amino acid sequence of the Fab heavy chain of humanized anti-hTfR antibody 3N , further introduced with Fc region of human IgG <400> 82 acgcgtcgcc accatgggtt ggagcctcat cttgctcttc cttgtcgctg ttgctacgcg 60 agtcggcagc ccagcacctg aactcctggg aggtccgtca gtcttcctct tccccccaaa 120 acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt 180 gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa 240 tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct 300 caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa 360 agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc 420 acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgac 480 ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca 540 gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct 600 ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc 660 cgtgatgcac gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg 720 taaaggtggc ggagggtctg gaggaggcgg tagcggcgga ggaggttccg ggggcggtgg 780 aagcggaggc ggtggatccg aggtgcaact agtgcagtct ggagcagagg tgaaaaagcc 840 cggggagtct ctgaagattt cctgtaaggg ttctggatac agctttatga actactggct 900 gggatgggtg cgccagatgc ccgggaaagg cctggagtgg atgggggaca tctaccccgg 960 cggagactac cctacataca gcgagaagtt caaggtccag gtcaccatct cagccgacaa 1020 gtccatcagc accgcctacc tgcagttgag cagcctgaag gcctcggaca ccgccatgta 1080 ttactgtgcg agatcaggca attacgacga agtggcctac tggggccaag gaaccctggt 1140 caccgtctcc tcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa 1200 gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc 1260 ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt 1320 cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt 1380 gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa 1440 gaaagttgag ccgaagagct gtgataagac gcatacgtaa taagcggccg c 1491 <210> 83 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of framework region 3 in the heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3 <400> 83 Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 84 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the Fab heavy chain of humanized anti-hTfR antibody No. 3N (2) <400> 84 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 210 215 <210> 85 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of albumin binding domain <400> 85 Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Leu Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly 1 5 10 15 Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asp Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu 20 25 30 Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro 35 40 45 <210> 86 <211> 1674 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide seuquence encoding the amino acid sequence of the fusion protein of the Fab heavy chain of humanized anti-hTfR antibody 3N, pro-hBDNF, and ABD, synthetic sequence <400> 86 acgcgtcgcc accatgggtt ggagcctcat cttgctcttc cttgtcgctg ttgctacgcg 60 agtcggcagc gcccccatga aagaagcaaa catccgagga caaggtggct tggcctaccc 120 aggtgtgcgg acccatggga ctctggagag cgtgaatggg cccaaggcag gttcaagagg 180 cttgacatca ttggctgaca ctttcgaaca cgtgatagaa gagctgttgg atgaggacca 240 gaaagttcgg cccaatgaag aaaacaataa ggacgcagac ttgtacacgt ccagggtgat 300 gctcagtagt caagtgcctt tggagcctcc tcttctcttt ctgctggagg aatacaaaaa 360 ttacctagat gctgcaaaca tgtccatgag ggtccggcgc cactctgacc ctgcccgccg 420 aggggagctg agcgtgtgtg acagtattag tgagtgggta acggcggcag acaaaaagac 480 tgcagtggac atgtcgggcg ggacggtcac agtccttgaa aaggtccctg tatcaaaagg 540 ccaactgaag caatacttct acgagaccaa gtgcaatccc atgggttaca caaaagaagg 600 ctgcaggggc atagacaaaa ggcattggaa ctcccagtgc cgaactaccc agtcgtacgt 660 gcgggccctt accatggata gcaagaagag aattggctgg cgattcataa ggatagacac 720 ttcttgtgta tgtacattga ccattaaaag gggaagaggt ggcggagggt ctggaggtgg 780 cggatcaggc ggaggaggtt ccgggggcgg tggaagcgga ggcggtggat ccgaggtgca 840 actagtgcag tctggagcag aggtgaaaaa gcccggggag tctctgaaga tttcctgtaa 900 gggttctgga tacagcttta tgaactactg gctgggatgg gtgcgccaga tgcccgggaa 960 aggcctggag tggatggggg acatctaccc cggcggagac taccctacat acagcgagaa 1020 gttcaaggtc caggtcacca tctcagccga caagtccatc agcaccgcct acctgcagtt 1080 gagcagcctg aaggcctcgg acaccgccat gtattactgt gcgagatcag gcaattacga 1140 cgaagtggcc tactggggcc aaggaaccct ggtcaccgtc tcctcagcta gcaccaaggg 1200 cccatcggtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctgggggca cagcggccct 1260 gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc 1320 cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag tcctcaggac tctactccct 1380 cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca tctgcaacgt 1440 gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt ggaggtggcg gatcaggcgg 1500 aggaggttcc gggggcggtg gaagcctggc tgaggccaag gtgctggccc tgagggagct 1560 ggacaagtac ggcgtgtccg actactacaa ggacctgatc gacaaggcca agaccgtgga 1620 gggcgtgaag gccctgatcg acgagatcct ggccgccctg ccctaagcgg ccgc 1674 <210> 87 <211> 531 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the fusion protein of the Fab heavy chain of humanized anti-hTfR antibody 3N, pro-hBDNF, and ABD <400> 87 Ala Pro Met Lys Glu Ala Asn Ile Arg Gly Gln Gly Gly Leu Ala Tyr 1 5 10 15 Pro Gly Val Arg Thr His Gly Thr Leu Glu Ser Val Asn Gly Pro Lys 20 25 30 Ala Gly Ser Arg Gly Leu Thr Ser Leu Ala Asp Thr Phe Glu His Val 35 40 45 Ile Glu Glu Leu Leu Asp Glu Asp Gln Lys Val Arg Pro Asn Glu Glu 50 55 60 Asn Asn Lys Asp Ala Asp Leu Tyr Thr Ser Arg Val Met Leu Ser Ser 65 70 75 80 Gln Val Pro Leu Glu Pro Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Glu Tyr Lys 85 90 95 Asn Tyr Leu Asp Ala Ala Asn Met Ser Met Arg Val Arg Arg His Ser 100 105 110 Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile Ser Glu 115 120 125 Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly 130 135 140 Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln Leu Lys 145 150 155 160 Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu 165 170 175 Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gln Cys Arg Thr 180 185 190 Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile 195 200 205 Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr 210 215 220 Ile Lys Arg Gly Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 225 230 235 240 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val 245 250 255 Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu 260 265 270 Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr Trp Leu 275 280 285 Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Asp 290 295 300 Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe Lys Val 305 310 315 320 Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln 325 330 335 Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg 340 345 350 Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 355 360 365 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 370 375 380 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 385 390 395 400 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 405 410 415 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 420 425 430 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 435 440 445 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 450 455 460 Lys Val Asp Lys Lys Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 465 470 475 480 Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Leu Arg Glu 485 490 495 Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asp Leu Ile Asp Lys 500 505 510 Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala 515 520 525 Ala Leu Pro 530 <210> 88 <211> 421 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the fusion protein of the Fab heavy chain of humanized anti-hTfR antibody 3N, hBDNF, and ABD <400> 88 His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile 1 5 10 15 Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp Met Ser 20 25 30 Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys Gly Gln 35 40 45 Leu Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr 50 55 60 Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gln Cys 65 70 75 80 Arg Thr Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys 85 90 95 Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr 100 105 110 Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 145 150 155 160 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 165 170 175 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 180 185 190 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 195 200 205 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 210 215 220 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 225 230 235 240 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 245 250 255 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 260 265 270 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 275 280 285 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 290 295 300 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 305 310 315 320 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 325 330 335 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 340 345 350 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 355 360 365 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Leu 370 375 380 Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asp Leu Ile 385 390 395 400 Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile 405 410 415 Leu Ala Ala Leu Pro 420 <210> 89 <211> 277 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the Fab heavy chain of humanized anti-hTfR antibody 3N introduced with ABD <400> 89 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 210 215 220 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Leu 225 230 235 240 Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asp Leu Ile 245 250 255 Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile 260 265 270 Leu Ala Ala Leu Pro 275 <210> 90 <211> 477 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of single-chain humanized anti-hTfR antibody No. 3N (2) <400> 90 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Met Asn Tyr 20 25 30 Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asp Ile Tyr Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Thr Tyr Ser Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Val Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Asn Tyr Asp Glu Val Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 225 230 235 240 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 245 250 255 Gly Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr 260 265 270 Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val 275 280 285 His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly 290 295 300 Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly 305 310 315 320 Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 325 330 335 Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser 340 345 350 Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 355 360 365 Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser 370 375 380 Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn 385 390 395 400 Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala 405 410 415 Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys 420 425 430 Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp 435 440 445 Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu 450 455 460 Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 465 470 475

Claims (88)

  1. 뇌유래 신경 영양 인자(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)와 항인간 트랜스페린 수용체 항체의 융합 단백질로서, 해당 항체가 중쇄의 가변 영역에 있어서,
    (a) CDR1이 서열 번호 66 또는 서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고,
    (b) CDR2가 서열 번호 13 또는 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한
    (c) CDR3이 서열 번호 15 또는 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인,
    융합 단백질.
  2. 제 1 항에 있어서,
    중쇄의 프레임워크 영역 3이 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    단, 해당 중쇄의 가변 영역에 있어서,
    CDR2의 서열 번호 13 또는 서열 번호 14의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한
    CDR3의 서열 번호 15 또는 서열 번호 16의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인,
    융합 단백질.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    단, 해당 중쇄의 가변 영역에 있어서,
    CDR2의 서열 번호 13 또는 서열 번호 14의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한
    CDR3의 서열 번호 15 또는 서열 번호 16의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인,
    융합 단백질.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    단, 해당 중쇄의 가변 영역에 있어서,
    (a) CDR1에 대해서는 서열 번호 66 또는 서열 번호 67,
    (b) CDR2에 대해서는 서열 번호 13 또는 서열 번호 14,
    (c) CDR3에 대해서는 서열 번호 15 또는 서열 번호 16, 및
    (d) 프레임워크 영역 3에 대해서는 서열 번호 68
    중 적어도 1개의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 1∼5개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것이고,
    여기서, CDR1에 대해서는, 서열 번호 66 또는 서열 번호 67의 아미노산 서열의 N말단측으로부터 5번째에 위치하는 메티오닌이, 개변 후의 아미노산 서열에 있어서도 동일한 위치에 있고, 또한
    프레임워크 영역 3에 대해서는, 서열 번호 68의 N말단측으로부터 17번째에 위치하는 류신이, 개변 후의 아미노산 서열에 있어서도 동일한 위치에 있는 것인,
    융합 단백질.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    단, 해당 중쇄의 가변 영역에 있어서,
    (a) CDR1에 대해서는 서열 번호 66 또는 서열 번호 67,
    (b) CDR2에 대해서는 서열 번호 13 또는 서열 번호 14,
    (c) CDR3에 대해서는 서열 번호 15 또는 서열 번호 16, 및
    (d) 프레임워크 영역 3에 대해서는 서열 번호 68
    중 적어도 1개의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 1∼3개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것이고,
    여기서, CDR1에 대해서는, 서열 번호 66 또는 서열 번호 67의 아미노산 서열의 N말단측으로부터 5번째에 위치하는 메티오닌이, 개변 후의 아미노산 서열에 있어서도 동일한 위치에 있고, 또한 프레임워크 영역 3에 대해서는, 서열 번호 68의 N말단측으로부터 17번째에 위치하는 류신이, 개변 후의 아미노산 서열에 있어서도 동일한 위치에 있는 것인, 융합 단백질.
  7. 제 2 항에 있어서,
    해당 중쇄의 가변 영역이 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 제 1 항의 융합 단백질.
  8. 제 7 항에 있어서,
    단, 해당 중쇄의 가변 영역 중, CDR1의 서열 번호 66 또는 서열 번호 67 및 프레임워크 영역 3의 서열 번호 68의 각 아미노산 서열 이외의 부분에 있어서, 해당 부분 대신에 해당 부분과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
  9. 제 7 항에 있어서,
    단, 해당 중쇄의 가변 영역 중, CDR1의 서열 번호 66 또는 서열 번호 67 및 프레임워크 영역 3의 서열 번호 68의 각 아미노산 서열 이외의 부분에 있어서, 해당 부분 대신에 해당 부분과 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
  10. 제 7 항에 있어서,
    단, 해당 중쇄의 가변 영역을 구성하는 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 1∼5개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것이고,
    여기서, CDR1에 대해서는, 서열 번호 67의 아미노산 서열의 N말단으로부터 5번째에 위치하는 메티오닌이, 개변 후의 아미노산 서열에 있어서도 동일한 위치에 있고, 또한 프레임워크 영역 3에 대해서는, 서열 번호 68의 N말단측으로부터 17번째에 위치하는 류신이, 개변 후의 아미노산 서열에 있어서도 동일한 위치에 있는 것인, 융합 단백질.
  11. 제 7 항에 있어서,
    단, 해당 중쇄의 가변 영역을 구성하는 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 1∼3개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것이고,
    여기서, CDR1에 대해서는, 서열 번호 67의 아미노산 서열의 N말단으로부터 5번째에 위치하는 메티오닌이, 개변 후의 아미노산 서열에 있어서도 동일한 위치에 있고, 또한 프레임워크 영역 3에 대해서는, 서열 번호 68의 N말단측으로부터 17번째에 위치하는 류신이, 개변 후의 아미노산 서열에 있어서도 동일한 위치에 있는 것인, 융합 단백질.
  12. 제 7 항에 있어서,
    해당 중쇄의 아미노산 서열이, 서열 번호 70 또는 서열 번호 72의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
  13. 제 12 항에 있어서,
    단, 해당 중쇄 중, CDR1의 서열 번호 66 또는 서열 번호 67 및 프레임워크 영역 3의 서열 번호 68의 각 아미노산 서열 이외의 부분 대신에 해당 부분에 대해 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
  14. 제 12 항에 있어서,
    단, 해당 중쇄 중, CDR1의 서열 번호 66 또는 서열 번호 67 및 프레임워크 영역 3의 서열 번호 68의 각 아미노산 서열 이외의 부분 대신에 당해 부분에 대해 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
  15. 제 12 항에 있어서,
    단, 해당 중쇄를 구성하는 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 1∼5개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것이고,
    여기서, CDR1에 대해서는, 서열 번호 67의 아미노산 서열의 N말단으로부터 5번째에 위치하는 메티오닌이, 개변 후의 아미노산 서열에 있어서도 동일한 위치에 있고, 또한 프레임워크 영역 3에 대해서는, 서열 번호 68의 N말단측으로부터 17번째에 위치하는 류신이, 개변 후의 아미노산 서열에 있어서도 동일한 위치에 있는 것인, 융합 단백질.
  16. 제 12 항에 있어서,
    단, 해당 중쇄를 구성하는 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 1∼3개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것이고,
    여기서, CDR1에 대해서는, 서열 번호 67의 아미노산 서열의 N말단으로부터 5번째에 위치하는 메티오닌이, 개변 후의 아미노산 서열에 있어서도 동일한 위치에 있고, 또한 프레임워크 영역 3에 대해서는, 서열 번호 68의 N말단측으로부터 17번째에 위치하는 류신이, 개변 후의 아미노산 서열에 있어서도 동일한 위치에 있는 것인, 융합 단백질.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    해당 항체의 경쇄의 가변 영역에 있어서,
    (a) CDR1이 서열 번호 6 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고,
    (b) CDR2가 서열 번호 8 혹은 서열 번호 9의 아미노산 서열, 또는 아미노산 서열 Lys-Val-Ser을 포함하여 이루어지고, 또한
    (c) CDR3이 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인,
    융합 단백질.
  18. 제 17 항에 있어서,
    단, 해당 경쇄의 가변 영역에 있어서,
    (a) CDR1의 서열 번호 6 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고,
    (b) CDR2의 서열 번호 8 혹은 서열 번호 9의 아미노산 서열, 또는 아미노산 서열 Lys-Val-Ser 대신에 이것에 대해 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고,
    또한
    (c) CDR3의 서열 번호 10의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인,
    융합 단백질.
  19. 제 17 항에 있어서,
    단, 해당 경쇄의 가변 영역에 있어서,
    (a) CDR1의 서열 번호 6 또는 서열 번호 7의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고,
    (b) CDR2의 서열 번호 8 혹은 서열 번호 9의 아미노산 서열, 또는 아미노산 서열 Lys-Val-Ser 대신에 이것에 대해 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고,
    또한
    (c) CDR3의 서열 번호 10의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인,
    융합 단백질.
  20. 제 17 항에 있어서,
    단, 해당 경쇄의 가변 영역에 있어서,
    (a) CDR1에 대해서는 서열 번호 6 또는 서열 번호 7,
    (b) CDR2에 대해서는 서열 번호 8 혹은 서열 번호 9, 또는 아미노산 서열 Lys-Val-Ser, 및
    (c) CDR3에 대해서는 서열 번호 10
    중 적어도 1개의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 1∼5개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
  21. 제 17 항에 있어서,
    단, 해당 경쇄의 가변 영역에 있어서,
    (a) CDR1에 대해서는 서열 번호 6 또는 서열 번호 7,
    (b) CDR2에 대해서는 서열 번호 8 혹은 서열 번호 9, 또는 아미노산 서열 Lys-Val-Ser, 및
    (c) CDR3에 대해서는 서열 번호 10
    중 적어도 1개의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 1∼3개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
  22. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    해당 항체의 경쇄의 가변 영역이, 서열 번호 17, 서열 번호 18, 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 21 또는 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
  23. 제 22 항에 있어서,
    단, 해당 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
  24. 제 22 항에 있어서,
    단, 해당 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
  25. 제 22 항에 있어서,
    단, 해당 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 1∼5개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
  26. 제 22 항에 있어서,
    단, 해당 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 1∼3개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
  27. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    해당 항체의 경쇄가, 서열 번호 23, 서열 번호 25, 서열 번호 27 또는 서열 번호 29의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
  28. 제 27 항에 있어서,
    단, 해당 경쇄의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
  29. 제 27 항에 있어서,
    단, 해당 경쇄의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
  30. 제 27 항에 있어서,
    단, 해당 경쇄의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 1∼5개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
  31. 제 27 항에 있어서,
    단, 해당 경쇄의 아미노산 서열 대신에 이것에 대해 1∼3개의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의한 개변이 이루어진 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
  32. 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서,
    해당 항체가, Fab 항체, F(ab')2 항체, 또는 F(ab') 항체인, 융합 단백질.
  33. 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서,
    해당 항체가, scFab, scF(ab'), scF(ab')2 및 scFv로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1본쇄 항체인, 융합 단백질.
  34. 제 33 항에 있어서,
    해당 항체의 경쇄와 중쇄가 링커 서열을 개재시켜 결합하고 있는 것인, 융합 단백질.
  35. 제 34 항에 있어서,
    해당 경쇄의 C말단측에 있어서, 링커 서열을 개재시켜 해당 중쇄가 결합하고 있는 것인, 융합 단백질.
  36. 제 34 항에 있어서,
    해당 중쇄의 C말단측에 있어서, 링커 서열을 개재시켜 해당 경쇄가 결합하고 있는 것인, 융합 단백질.
  37. 제 34 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서,
    해당 링커 서열이, 8∼50개의 아미노산 잔기로 이루어지는 것인, 융합 단백질.
  38. 제 37 항에 있어서,
    해당 링커 서열이, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 및 서열 번호 5의 각 아미노산 서열, 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3개가 연속한 것에 상당하는 아미노산 서열, 및 이들 아미노산 서열의 10개 이하가 연속하여 이루어지는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 융합 단백질.
  39. 제 1 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서,
    해당 BDNF가, 해당 항체의 경쇄 또는 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에 결합한 것인, 융합 단백질.
  40. 제 39 항에 있어서,
    해당 BDNF가, 해당 항체의 경쇄 또는 중쇄의 C말단측 또는 N말단측에, 직접 또는 링커를 개재시켜 결합한 것인, 융합 단백질.
  41. 제 40 항에 있어서,
    해당 링커가, 1∼50개의 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드인, 융합 단백질.
  42. 제 41 항에 있어서,
    해당 링커가, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 및 서열 번호 5로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 펩티드인, 융합 단백질.
  43. 제 1 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서,
    해당 BDNF가 인간 BDNF인, 융합 단백질.
  44. 제 43 항에 있어서,
    해당 인간 BDNF가, 서열 번호 51의 아미노산 서열 또는 이것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것이거나, 또는 서열 번호 51로 표시되는 단백질과 동질의 기능을 갖는 것인, 융합 단백질.
  45. 제 1 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 트랜스페린 수용체의 세포외 영역 및 원숭이 트랜스페린 수용체의 세포외 영역의 쌍방에 대해서 친화성을 갖는 것인, 융합 단백질.
  46. 제 45 항에 있어서,
    해당 항트랜스페린 수용체 항체가, 인간 트랜스페린 수용체의 세포외 영역과의 해리 상수가 1×10-10M 이하이며, 원숭이 트랜스페린 수용체의 세포외 영역과의 해리 상수가 1×10-9M 이하인 것인, 융합 단백질.
  47. 제 43 항에 있어서,
    해당 경쇄가, 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한
    (a) 해당 중쇄가, 그 C말단측에서 아미노산 서열 Gly-Ser로 이루어지는 링커를 개재시켜, 인간 BDNF와 결합하고, 그것에 의해 서열 번호 52의 아미노산 서열을 형성하고 있는 것이거나, 또는
    (b) 해당 중쇄가, 그 C말단측에서 아미노산 서열 Gly-Ser에 이어 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열 번호 3)가 5개 연속하여 이루어지는 합계 27개의 아미노산 서열로 이루어지는 링커를 개재시켜, 인간 BDNF와 결합하고, 그것에 의해 서열 번호 54의 아미노산 서열을 형성하고 있는 것인,
    융합 단백질.
  48. 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서,
    해당 항체가 항원 결합성 단편인, 융합 단백질.
  49. 제 48 항에 있어서,
    해당 항원 결합성 단편의 N말단측에, 직접 또는 링커를 개재시켜, 인간 BDNF가 결합하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
  50. 제 48 항 또는 제 49 항에 있어서,
    해당 항원 결합성 단편이 1본쇄 항체인, 융합 단백질.
  51. 제 50 항에 있어서,
    해당 항체의 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역이 링커 서열을 개재시켜 결합하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
  52. 제 51 항에 있어서,
    해당 경쇄 가변 영역의 C말단측에, 해당 링커 서열을 개재시켜, 해당 중쇄 가변 영역이 결합하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
  53. 제 51 항에 있어서,
    해당 중쇄 가변 영역의 C말단측에, 해당 링커 서열을 개재시켜, 해당 경쇄 가변 영역이 결합하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
  54. 제 51 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항에 있어서,
    해당 링커 서열이, 8∼50개의 아미노산 잔기로 이루어지는 것인, 융합 단백질.
  55. 제 54 항에 있어서,
    해당 링커 서열이, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Gly, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 및 서열 번호 5의 각 아미노산 서열, 서열 번호 3의 아미노산 서열의 3개가 연속한 것에 상당하는 아미노산 서열, 및 이들 아미노산 서열의 10개 이하가 연속하여 이루어지는 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, 융합 단백질.
  56. 제 50 항 내지 제 55 항 중 어느 한 항에 있어서,
    해당 항체가, 서열 번호 69의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역과, 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
  57. 제 56 항에 있어서,
    해당 항체가, 서열 번호 57의 아미노산 서열로 이루어지고, 그 N말단측에, 직접 또는 링커를 개재시켜, 인간 BDNF가 결합하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
  58. 제 57 항에 있어서
    해당 항체가 서열 번호 57의 아미노산 서열로 이루어지고, 그 N말단측에, 링커를 개재시켜, 인간 프로BDNF가 결합하여 이루어지는, 서열 번호 59의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
  59. 제 57 항에 있어서,
    해당 항체가 서열 번호 57의 아미노산 서열로 이루어지고, 그 N말단측에, 링커를 개재시켜, 인간 BDNF가 결합하여 이루어지는, 서열 번호 60의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
  60. 제 48 항 또는 제 49 항에 있어서,
    해당 항원 결합성 단편이, Fab, F(ab')2, 또는 F(ab')의 어느 하나인, 융합 단백질.
  61. 제 60 항에 있어서,
    Fab, F(ab')2, 또는 F(ab')의 어느 하나의 경쇄 또는 중쇄의 N말단측에, 직접 또는 링커를 개재시켜, 인간 BDNF가 결합하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
  62. 제 61 항에 있어서,
    해당 항체의 경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 해당 항체의 중쇄가 서열 번호 61의 아미노산 서열로 이루어지는 Fab 중쇄이며, 해당 중쇄의 N말단측에, 직접 또는 링커를 개재시켜 인간 BDNF가 결합하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
  63. 제 62 항에 있어서,
    해당 링커가, 아미노산 서열 Gly-Ser, 아미노산 서열 Gly-Gly-Ser, 서열 번호 3의 아미노산 서열, 서열 번호 4의 아미노산 서열, 및 서열 번호 5의 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 펩티드인, 융합 단백질.
  64. 제 62 항에 있어서,
    해당 경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한
    해당 Fab 중쇄와 그 N말단측에, 직접 또는 링커를 개재시켜, 결합한 인간 프로BDNF로 이루어지는 부분이 서열 번호 63의 아미노산 서열을 형성하고 있는 것인, 융합 단백질.
  65. 제 62 항에 있어서,
    해당 경쇄가 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한
    Fab 중쇄와 그 N말단측에, 직접 또는 링커를 개재시켜, 결합한 인간 BDNF로 이루어지는 부분이 서열 번호 65의 아미노산 서열을 형성하고 있는 것인, 융합 단백질.
  66. 제 48 항 내지 제 62 항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 IgG Fc 영역 또는 그 일부가, 인간 BDNF와 해당 항체의 사이에 도입되어 이루어지는 것인, 융합 단백질.
  67. 제 66 항에 있어서,
    인간 BDNF의 C말단측에, 직접 또는 링커 서열을 개재시켜, 인간 IgG Fc 영역이 결합하여 이루어지고, 또한, 해당 인간 IgG Fc 영역의 C말단측에 직접 또는 링커 서열을 개재시켜 해당 항체가 결합하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
  68. 제 66 항 또는 제 67 항에 있어서
    인간 IgG Fc 영역이 서열 번호 75로 나타나는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
  69. 제 68 항에 있어서,
    해당 중쇄가, 인간 BDNF의 C말단측에, 직접 또는 링커 서열을 개재시켜, 해당 인간 IgG Fc 영역이 결합하여 이루어지고, 또한, 해당 인간 IgG Fc 영역의 C말단측에 직접 또는 링커 서열을 개재시켜 해당 중쇄가 결합한 것인, 융합 단백질.
  70. 제 69 항에 있어서,
    해당 경쇄가, 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한
    해당 중쇄가, 인간 BDNF의 C말단측에, 링커 서열을 개재시켜, 인간 IgG Fc 영역이 결합하여 이루어지고, 또한, 해당 인간 IgG Fc 영역의 C말단측에 링커 서열을 개재시켜 해당 중쇄가 결합한 것이고, 그것에 의해 서열 번호 74의 아미노산 서열을 형성하고 있는 것인, 융합 단백질.
  71. 제 48 항 내지 제 62 항 중 어느 한 항에 있어서,
    추가로 알부민 친화성 펩티드가 도입되어 이루어지는 것인, 융합 단백질.
  72. 제 71 항에 있어서,
    해당 항체의 C말단측에, 직접 또는 링커 서열을 개재시켜, 알부민 친화성 펩티드가 결합하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
  73. 제 71 항 또는 제 72 항에 있어서,
    알부민 친화성 펩티드가 서열 번호 85로 나타나는 아미노산 서열을 포함하여 이루어지는 것인, 융합 단백질.
  74. 제 73 항에 있어서,
    해당 중쇄가, 인간 BDNF의 C말단측에, 직접 또는 링커 서열을 개재시켜 결합하여 이루어지고, 또한, 해당 중쇄의 C말단측에 직접 또는 링커 서열을 개재시켜 알부민 친화성 펩티드가 결합한 것인, 융합 단백질.
  75. 제 74 항에 있어서,
    해당 경쇄가, 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한
    해당 중쇄가, 인간 프로BDNF의 C말단측에, 직접 또는 링커 서열을 개재시켜 결합하여 이루어지고, 또한, 해당 중쇄의 C말단측에 직접 또는 링커 서열을 개재시켜 알부민 친화성 펩티드가 결합한 것이고, 그것에 의해 서열 번호 87의 아미노산 서열을 형성하고 있는 것인, 융합 단백질.
  76. 제 74 항에 있어서,
    해당 경쇄가, 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하여 이루어지고, 또한
    해당 중쇄가, 인간 BDNF의 C말단측에, 직접 또는 링커 서열을 개재시켜 결합하여 이루어지고, 또한, 해당 중쇄의 C말단측에 직접 또는 링커 서열을 개재시켜 알부민 친화성 펩티드가 결합한 것이고, 그것에 의해 서열 번호 88의 아미노산 서열을 형성하고 있는 것인, 융합 단백질.
  77. 제 1 항 내지 제 76 항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 코딩하는, DNA 단편.
  78. 제 77 항의 DNA 단편을 짜넣어 이루어지는, 발현 벡터.
  79. 제 78 항의 발현 벡터로 형질 전환된 포유동물 세포.
  80. BDNF에 대한 폭로에 의해 이익을 얻을 수 있는 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 약제로서, 제 1 항 내지 제 76 항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 유효 성분으로서 포함하여 이루어지는, 약제.
  81. 제 80 항에 있어서,
    해당 질환 또는 장애가, 신경계의 질환 또는 장애인, 약제.
  82. 제 81 항에 있어서,
    해당 신경계의 질환 또는 장애가, 신경 변성 질환, 울병, 통합 실조증, 간질, 자폐증, Rett 증후군, West 증후군, 신생아 경련, 인지증에 수반하는 문제 행동, 불안증, 동통, 히르슈스프룽병 또는 렘수면 행동 장애인, 약제.
  83. 제 82 항에 있어서,
    해당 신경 변성 질환이, 뇌신경 변성 질환, 척수 변성 질환, 망막 변성 질환 또는 말초 신경 변성 질환인, 약제.
  84. 제 83 항에 있어서,
    해당 뇌신경 변성 질환이, 뇌신경계의 신경 변성 질환, 뇌허혈성 질환, 외상성 뇌손상, 백질뇌증 또는 다발성 경화증인, 약제.
  85. 제 84 항에 있어서,
    해당 뇌신경계의 신경 변성 질환이, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 레비소체형 인지증, 픽병, 다계통 위축증, 진행성 상행성 마비 또는 다운 증후군인, 약제.
  86. BDNF에 대한 폭로에 의해 이익을 얻을 수 있는 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료를 위한, 제 1 항 내지 제 76 항 중 어느 한 항의 융합 단백질의 사용.
  87. BDNF에 대한 폭로에 의해 이익을 얻을 수 있는 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료용의 의약의 제조를 위한, 제 1 항 내지 제 76 항 중 어느 한 항의 융합 단백질의 사용.
  88. BDNF에 대한 폭로에 의해 이익을 얻을 수 있는 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료의 방법으로서, 해당 질환 또는 상해를 갖는 환자의 혈중에, 제 1 항 내지 제 76 항 중 어느 한 항의 융합 단백질의 치료상 유효량을 함유하는 의약 조성물을 투여하는 것을 포함하는 것인, 방법.
KR1020197021119A 2016-12-26 2017-12-26 Bdnf를 포함하는 융합 단백질 KR102573622B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016252147 2016-12-26
JPJP-P-2016-252147 2016-12-26
PCT/JP2017/046735 WO2018124107A1 (ja) 2016-12-26 2017-12-26 Ｂｄｎｆを含む融合蛋白質

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190097217A true KR20190097217A (ko) 2019-08-20
KR102573622B1 KR102573622B1 (ko) 2023-08-31

Family

ID=62709408

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020197021119A KR102573622B1 (ko) 2016-12-26 2017-12-26 Bdnf를 포함하는 융합 단백질

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20200384061A1 (ko)
EP (1) EP3561058A4 (ko)
JP (3) JP7072524B2 (ko)
KR (1) KR102573622B1 (ko)
CN (1) CN110100000B (ko)
AU (1) AU2017385274B2 (ko)
CA (1) CA3052936A1 (ko)
TW (1) TWI791006B (ko)
WO (1) WO2018124107A1 (ko)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016208696A1 (ja) 2015-06-24 2016-12-29 Ｊｃｒファーマ株式会社 Ｂｄｎｆを含む融合蛋白質
KR102497564B1 (ko) * 2016-12-26 2023-02-07 제이씨알 파마 가부시키가이샤 혈액뇌관문을 통과하는 신규한 항인간 트랜스페린 수용체 항체
ES2932759T3 (es) 2017-02-17 2023-01-25 Denali Therapeutics Inc Polipéptidos de unión al receptor de transferrina diseñados
US10143187B2 (en) * 2017-02-17 2018-12-04 Denali Therapeutics Inc. Transferrin receptor transgenic models
US10457717B2 (en) 2017-02-17 2019-10-29 Denali Therapeutics Inc. Engineered polypeptides
JP7102790B2 (ja) * 2018-03-07 2022-07-20 富士通株式会社 データ生成方法、データ生成プログラム及び情報処理装置
US20240166704A1 (en) 2021-03-10 2024-05-23 Sumitomo Pharma Co., Ltd. Method for Producing Fusion Protein
WO2022239817A1 (ja) * 2021-05-12 2022-11-17 Ｊｃｒファーマ株式会社 ムコ多糖症ｉ型の治療用医薬組成物
CA3238914A1 (en) 2021-11-19 2023-05-25 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Peptide having affinity for human transferrin receptor

Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5154924A (en) 1989-09-07 1992-10-13 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical agent conjugates
JPH06228199A (ja) 1992-11-27 1994-08-16 Takeda Chem Ind Ltd 血液脳関門通過可能なペプチド結合体
US5977307A (en) 1989-09-07 1999-11-02 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific ligand-neuropharmaceutical agent fusion proteins
US20040101904A1 (en) 2002-11-27 2004-05-27 The Regents Of The University Of California Delivery of pharmaceutical agents via the human insulin receptor
JP2007504166A (ja) 2003-08-29 2007-03-01 バイオマリン ファーマシューティカル インコーポレイテッド 脳およびその他の組織への治療用化合物の送達
JP2009525963A (ja) 2006-01-20 2009-07-16 ジェンザイム・コーポレーション リソソーム蓄積症のための脳室内酵素の輸送
US20100077498A1 (en) * 2008-09-11 2010-03-25 Pardridge William M Compositions and methods for blood-brain barrier delivery in the mouse
JP2012062312A (ja) 2010-08-19 2012-03-29 Yoshikatsu Eto ハンター症候群の治療剤
WO2012075037A1 (en) 2010-11-30 2012-06-07 Genentech, Inc. Low affinity blood brain barrier receptor antibodies and uses therefor
WO2012143379A1 (en) 2011-04-20 2012-10-26 Roche Glycart Ag Method and constructs for the ph dependent passage of the blood-brain-barrier
WO2013177062A2 (en) 2012-05-21 2013-11-28 Genentech, Inc. Methods for improving safety of blood-brain barrier transport
WO2015098989A1 (ja) * 2013-12-25 2015-07-02 Ｊｃｒファーマ株式会社 血液脳関門を通過する新規抗トランスフェリン受容体抗体
WO2016208696A1 (ja) * 2015-06-24 2016-12-29 Ｊｃｒファーマ株式会社 Ｂｄｎｆを含む融合蛋白質

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5229500A (en) 1989-08-30 1993-07-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Brain derived neurotrophic factor
US5672683A (en) * 1989-09-07 1997-09-30 Alkermes, Inc. Transferrin neuropharmaceutical agent fusion protein
WO1995011317A1 (en) 1993-10-19 1995-04-27 The Scripps Research Institute Synthetic human neutralizing monoclonal antibodies to human immunodeficiency virus
WO1996030394A1 (en) 1995-03-31 1996-10-03 Jakob Bohr Method for protein folding
AUPN523995A0 (en) 1995-09-05 1995-09-28 Crc For Biopharmaceutical Research Pty Ltd Method for producing phage display vectors
CN102268094A (zh) * 2002-08-30 2011-12-07 比奥雷克西斯药物公司 被修饰的转铁蛋白抗体的融合蛋白
CN101495141B (zh) * 2005-12-13 2015-10-07 阿斯利康(瑞典)有限公司 胰岛素样生长因子特异性结合蛋白及其用途
JP2012034668A (ja) * 2010-08-12 2012-02-23 Tohoku Univ ヒト型化抗ｅｇｆｒ抗体リジン置換可変領域断片及びその利用
US20130244231A1 (en) 2010-11-08 2013-09-19 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Novel expression vector

Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5977307A (en) 1989-09-07 1999-11-02 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific ligand-neuropharmaceutical agent fusion proteins
US5154924A (en) 1989-09-07 1992-10-13 Alkermes, Inc. Transferrin receptor specific antibody-neuropharmaceutical agent conjugates
JPH06228199A (ja) 1992-11-27 1994-08-16 Takeda Chem Ind Ltd 血液脳関門通過可能なペプチド結合体
JP2011144178A (ja) 2002-11-27 2011-07-28 Regents Of The Univ Of California ヒトインスリン受容体を介する医薬品の送達
US20040101904A1 (en) 2002-11-27 2004-05-27 The Regents Of The University Of California Delivery of pharmaceutical agents via the human insulin receptor
JP2006511516A (ja) 2002-11-27 2006-04-06 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア ヒトインスリン受容体を介する医薬品の送達
JP2007504166A (ja) 2003-08-29 2007-03-01 バイオマリン ファーマシューティカル インコーポレイテッド 脳およびその他の組織への治療用化合物の送達
JP2009525963A (ja) 2006-01-20 2009-07-16 ジェンザイム・コーポレーション リソソーム蓄積症のための脳室内酵素の輸送
US20100077498A1 (en) * 2008-09-11 2010-03-25 Pardridge William M Compositions and methods for blood-brain barrier delivery in the mouse
JP2012062312A (ja) 2010-08-19 2012-03-29 Yoshikatsu Eto ハンター症候群の治療剤
WO2012075037A1 (en) 2010-11-30 2012-06-07 Genentech, Inc. Low affinity blood brain barrier receptor antibodies and uses therefor
WO2012143379A1 (en) 2011-04-20 2012-10-26 Roche Glycart Ag Method and constructs for the ph dependent passage of the blood-brain-barrier
WO2013177062A2 (en) 2012-05-21 2013-11-28 Genentech, Inc. Methods for improving safety of blood-brain barrier transport
WO2015098989A1 (ja) * 2013-12-25 2015-07-02 Ｊｃｒファーマ株式会社 血液脳関門を通過する新規抗トランスフェリン受容体抗体
WO2016208696A1 (ja) * 2015-06-24 2016-12-29 Ｊｃｒファーマ株式会社 Ｂｄｎｆを含む融合蛋白質

Non-Patent Citations (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Altar C. Anthony. Journal of Neurochemistry. 63. 1021-32 (1994)
Bien-Ly N. J Exp Med. 211. 233-44 (2014)
Bollen E. Behavioural Brain Research. 257C. 8-12 (2013)
Dafang W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96. 254-259 (1999)
Dafang Wu. The Journal of the American Society for Experimental Neurotherapeutics. 2. 120-8 (2005)
David M. Katz. The Handbook of Experimental Pharmacology. 220. 481-95 (2014)
Drug Metabolism and Disposition 38(4):566-572(2010) *
E. Castren. The Handbook of Experimental Pharmacology. 220. 461-79 (2014)
Expert Opinion on Drug Delivery 12(2):207-222(2015.02.01.) *
Li J Y. Protein Engineering. 12. 787-96 (1999)
Moses V. Chao. Nature Reviews Neuroscience. 4. 299-309 (2003)
Ou L. Mol Genet Metab. 111. 116-22 (2014)
Proceedings of the National Academy of Sciences of USA 96:254-259(1990.01.) *
Ruben J. B. Biotechnology Bioengineering, 97. 1376-1386 (2007)
Sada H. PLoS ONE. 9. E96340 (2014)
Tabakman R. Progress in Brain Research. 146. 387-401 (2004)
Xie Y. J Control Release. 105. 106-19 (2005)
Zuccato C. Progress in Neurobiology. 81. 294-330 (2007)

Also Published As

Publication number Publication date
JP2022110056A (ja) 2022-07-28
JP7072524B2 (ja) 2022-05-20
WO2018124107A1 (ja) 2018-07-05
KR102573622B1 (ko) 2023-08-31
TWI791006B (zh) 2023-02-01
EP3561058A1 (en) 2019-10-30
TW201829471A (zh) 2018-08-16
CN110100000B (zh) 2023-06-20
AU2017385274B2 (en) 2024-02-22
US20200384061A1 (en) 2020-12-10
AU2017385274A1 (en) 2019-08-08
CN110100000A (zh) 2019-08-06
CA3052936A1 (en) 2018-07-05
JP2024001350A (ja) 2024-01-09
JP7427046B2 (ja) 2024-02-02
JPWO2018124107A1 (ja) 2019-10-31
EP3561058A4 (en) 2020-07-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102573622B1 (ko) Bdnf를 포함하는 융합 단백질
KR102466248B1 (ko) 혈액뇌관문을 통과하는 신규한 항인간 트랜스페린 수용체 항체
CN107849555B (zh) 通过血脑屏障的抗人转铁蛋白受体抗体
CN107880136B (zh) 多聚体il-15可溶性融合分子与其制造与使用方法
RU2747011C2 (ru) Общие легкие цепи и способы их применения
KR101833602B1 (ko) 이중특이적 t 세포 활성화 항원 결합 분자
AU2016283344B2 (en) Fusion protein containing BDNF
KR101963923B1 (ko) 이중특이적 t 세포 활성화 항원 결합 분자
KR20220167273A (ko) 항-코로나바이러스 항체 및 사용 방법
KR20180053674A (ko) 공자극 tnf 수용체에 특이적인 이중특이성 항체
AU2016334623A1 (en) Bispecific antibodies with tetravalency for a costimulatory TNF receptor
KR20170081188A (ko) Folr1 및 cd3에 대한 t 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자
KR20150122203A (ko) T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자
KR20150041626A (ko) 아시알로당단백질 수용체 항체 및 이의 용도
KR20140114833A (ko) 신생아 Fc 수용체에 대해 향상된 결합을 지니는 변이체 Fc-폴리펩타이드
CN113234168B (zh) 一种融合蛋白、基因及应用
KR20230105972A (ko) 혈관신생 억제제가 결합된 항-C3b 항체 또는 항-C5 항체 및 이의 용도
KR20230123923A (ko) 항-EphA4 항체

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant