JP2003513016A - レセプタータンパク質チロシンキナーゼのドメイン、およびそのリガンドの結晶構造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 レセプタータンパク質チロシンキナーゼおよび／またはそのリガンドの３次元構造の決定と使用が報告される。この様な構造の特別なグループの１つはＲＰＴＫの細胞外ドメインの３次元構造が含まれる。ＲＰＴＫの３次元構造は、ＲＰＴＫ機能の調節因子の設計と同定を促進することができる。他のこの様な構造には幹細胞因子またはその断片等のＲＰＴＫリガンドが含まれる。ＲＰＴＫ機能の調節因子は、不適切なＲＰＴＫ活性で媒介される疾病の治療に使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】背景 本発明の背景の以下の説明は、単に本発明の理解の助けとして提供されるもの
であり、本発明に先行技術を記載または取り入れるために受け入れたものではな
い。

【０００２】 レセプタータンパク質であるチロシンキナーゼ（ＲＰＴＫ）には酵素の多くの
多様なファミリーが含まれる。ＲＰＴＫファミリーは複数のサブファミリーを含
み、その一つは繊維芽細胞成長因子レセプター（ＦＧＦＲ）サブファミリーであ
る。他のサブファミリーはタイプIIIレセプターであるチロシンキナーゼ（ＲＴ
Ｋ）サブファミリーであり、そのメンバーには血小板由来成長因子レセプターα
およびβ（ＰＤＧＦＲαおよびＰＤＧＦＲβ）、マクロファージコロニー刺激因
子レセプター（Ｍ−ＣＳＦＲ）、ｃ−ｋｉｔ（ＳＣＦレセプター（ＳＣＦＲ）と
も呼ばれる）、およびｆｌｔ３レセプターが含まれる。このＲＴＫサブファミリ
ーのメンバーは、その細胞外リガンド結合ドメイン中に５個の免疫グロブリン様
（Ｉｇ）ドメイン含み、さらに1個の膜横断ドメインと、大きなキナーゼ挿入部
で遮られた細胞質チロシンキナーゼドメインを含む。ＲＰＴＫのレビューとして
、シュレシンガー（Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ）およびウルリッヒ（Ｕｌｌｒｉ
ｃｈ）、１９９２、Ｎｅｕｒｏｎ９：３８３−３９１；ＦＧＦＲファミリーの結
合のレビューとしてギボル（Ｇｉｖｏｌ）およびヤーヨン（Ｙａｙｏｎ）、ＦＡ
ＳＥＢ Ｊ．，６（１５）：３３２６−３３６９参照。

【０００３】 全てのＲＰＴＫは高エネルギーホスフェートをアデノシントリホスフェートか
ら標的タンパク質中のチロシン残基に転移する。これらの燐酸化過程は信号伝達
プロセスにおいていくつかの細胞現象を制御する。細胞信号伝達プロセスには、
細胞外信号を細胞内信号に変換する複数の段階が含まれる。次いで細胞内信号が
細胞の反応に変換される。ＲＰＴＫは多くの信号伝達プロセスにおける構成要素
である。例えば、ＲＰＴＫは下流の分子を燐酸化することによプロセス内の特定
の段階で信号の流れを制御する。この燐酸化は、オンまたはオフすることにより
下流の分子の活性を変調し、下流分子による信号発生の過不足を生じる。過剰の
信号発生は細胞増殖の制御不能等の異常を生じるが、これは癌、様々な腫瘍で誘
発する血管形成、アテローム性動脈硬化症、および関節炎等の疾病に特徴的であ
る。また、治療目的で細胞増殖を誘発することも可能であるが、例えば副側血管
新生により冠状動脈疾患を緩和するために血管新生を用いることができる。

【０００４】 ＲＰＴＫのリガンド誘発二量体化はＲＰＴＫ媒介信号伝達プロセスの重要な段
階である。ＲＰＴＫの二量体化の重要性のレビューとして、レモン（Ｌｅｍｍｏ
ｎ）およびシュレセンガー（Ｓｃｈｌｅｓｓｅｎｇｅｒ）、１９９４、Ｔｒｅｎ
ｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ．，１９：４５９−４６３；ウルリッヒお
よびシュレセンガー、１９９０、Ｃｅｌｌ６１：２０３−２１２参照。例えばい
くつかの血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）および幹細胞因子（ＳＣＦ）等の成長
因子は、その特定のレセプターの二量体化をそれ自身で誘導する二量体分子であ
る。対照的に、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）等の他の成長因子は、他の分子と
協調して機能してその特定のレセプターの二量体化を誘発する単量体である。シ
ュレシンガーら、１９９５、Ｃｅｌｌ８３：３５７−３６０：スピバック−クロ
イツマン（Ｓｐｉｖａｌ−Ｋｒｏｉｚｍａｎ）ら、１９９４、Ｃｅｌｌ７９；１
０１５−１０２４：オルニッツ（Ｏｒｎｉｔｚ）ら、１９９２、Ｍｏｌ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｌ．１２；２４０−２４７参照。特に、ＦＧＦは例えば可溶性または
細胞表面結合ヘパリン硫酸塩含有プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）と協調して機能
する。

【０００５】 ＦＧＦＲサブファミリーは少なくとも２１個の構造的に関連する、ＦＧＦＲ１
からＦＧＦＲ２１で表されるポリペプチドで構成され、それらは胎児、幼児およ
び成体脊椎動物で発現する。ＦＧＦＲ１からＦＧＦＲ４は、その適当な繊維芽細
胞成長因子と高い親和性で結合する能力のため、“高親和性ＦＧＦＲ”として知
られる。これらの高親和性ＦＧＦＲは、３個の免疫グロブリン様ドメイン（Ｄ１
、Ｄ２およびＤ３として知られる）でなる細胞外リガンド結合ドメイン、１個の
膜横断ヘリックス、およびチロシンキナーゼ活性を含む細胞質ドメインが特徴で
ある。リー（Ｌｅｅ）ら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４５；５７−６０：ジャ
イ（Ｊａｙｅ）ら、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：８４０−８５１
；ジョンソン＆ウイリアム（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｗｉｌｌｉａｍｓ）、１９９３
、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０；１−４１参照。４個の高親和性ＦＧＦ
ＲのそれぞれはＦＧＦの特定のサブセットと結合する。オルニッツら、１９９６
、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１；１５２９２−１５２９７。

【０００６】 Ｄ１またはＤ２、および“アシッドボックス”として知られるリンカー領域が
欠失した高親和性ＦＧＦＲの天然起源変異体が同定されている。これらの変異体
ＦＧＦＲは適当なＦＧＦと高い親和性で結合する能力を維持し、Ｄ２およびＤ３
領域がＦＧＦ結合能と特異性を与えるに十分な領域であることを示唆している。
クルムレー（Ｃｒｕｍｌｅｙ）ら、１９９１、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ６；２２５５−
２２６２：ディオン（Ｄｉｏｎｎｅ）ら、１９９０、ＥＭＢＯ Ｊ．９：２６８
５−２６９２；ジョンソン＆ウイリアム、１９９３、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒ
ｅｓ．６０：１−４１参照。特に、Ｄ３はＦＧＦＲの結合特異性に重要な役割を
果たす。ボッタロ（Ｂｏｔｔａｒｏ）ら、１９９０、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６５：１２７６７−１２７７０；ミキ（Ｍｉｋｉ）ら、１９９２、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：２４６−２５０；デル（Ｄｅｌｌ）ら、１
９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２１２２５−２１２２９；ヤノン（
Ｙａｎｏｎ）ら、１９９２、ＥＭＢＯ Ｊ．１１：１８８５−１８９０参照。

【０００７】 最近、様々なＰＴＫの細胞間触媒ドメインの３次元構造が国際特許公報ＷＯ９
８／０７８３５、１９９６年１２月１９日出願ＵＳ特許出願番号６０／０３４，
１６８、および１９９９年８月２４日公開ＵＳ特許番号５，９４２，４２８に報
告され、それらのクレーム、図表を含めてその内容が本明細書に含まれている。

【０００８】 ＰＴＫとそのリガンドの信号伝達と機能の理解が最近進歩しているが、この様
な分子の原子レベルでの特徴付けと解析の必要性が、特に新規の改善された治療
用分子の設計と合成に関して残されている。

【０００９】発明の概要 本発明はレセプタータンパク質チロシンキナーゼおよび／またはそのリガンド
の３次元構造に関する。これらの分子構造にはＲＰＴＫまたはそのリガンドが、
単独または少なくとも１個のリガンドを含む複合体として含まれる。特に、本発
明はレセプタータンパク質チロシンキナーゼの細胞外ドメインを含む、単独また
は少なくとも１個のリガンドで成るポリペプチドでなる分子構造に関する。他の
態様では、本出願は幹細胞因子等の成長因子のレセプター結合コアを含むポリペ
プチドでなる、単独またはレセプタータンパク質チロシンキナーゼ等の少なくと
も１個のリガンドとの複合体としての分子構造を記載する。

【００１０】 本発明はレセプタータンパク質チロシンキナーゼの３次元構造の解析および使
用に関し、特にレセプタータンパク質チロシンキナーゼの細胞外ドメインを含む
、単独または少なくとも１個のリガンドでなる複合体中の構造に関する。例とし
て、ＦＧＦ分子またはＳＣＦ分子等の、ある種のリガンドに結合したいくつかの
ＲＰＴＫ細胞外ドメインの、原子レベルの解像度の３次元構造を決定するための
Ｘ線結晶学技術が本明細書に用いられる。本出願はまた、幹細胞因子の３次元構
造を解析し使用することに関し、特に幹細胞因子のレセプター結合コアを含む、
単独または少なくとも１個のリガンドでなる複合体の構造に関する。

【００１１】 本明細書に報告する３次元構造はレセプタータンパク質チロシンキナーゼおよ
び／またはそれに結合したリガンドとの間の特異的相互作用を説明する。レセプ
タータンパク質チロシンキナーゼの３次元構造を決める座標は、未知の構造を有
するレセプターＲＰＴＫの３次元構造を決定するために有用である。さらに、そ
の座標はレセプタータンパク質チロシンキナーゼの修飾物質を設計し同定するた
めに有用である。これらの修飾物質は癌、腫瘍発生性血管形成、アテローム硬化
症、および関節炎等の細胞増殖病を含む（しかしそれらに限定されない）疾病の
治療または予防用の治療薬として潜在的に有用である。また、治療目的で細胞を
増殖させることも可能であり、例えば副側血管形成を誘起して血管形成を環状動
脈疾患の緩和に使用し得る。従って、第１の態様では、本発明はＲＰＴＫの細胞
外ドメインの全てまたは一部のポリペプチドの結晶形を特徴とする。アルゴリズ
ム実施態様では、本発明はリガンドまたはリガンドアナログに結合したＲＰＴＫ
の結晶形を特徴とする。具体的な実施態様では、ＲＰＴＫはＦＧＦＲ１またはＦ
ＧＦＲ２等のＦＧＦＲであり、リガンドはＦＧＦ１またはＦＧＦ２等のＦＧＦで
ある。特に適した実施態様では、ポリペプチドはＦＧＦＲ１の残基１５０−３６
０、またはＦＧＦＲ２の残基１５０−３６０でなり、その配列は図４に示される
。リガンドは図１７に示す様なアミノ酸配列を含むＦＧＦ１、または図１７に示
す様なアミノ酸配列を含むＦＧＦ２等の繊維芽細胞成長因子であることもできる
。

【００１２】 “結晶形”という用語は、生成されたポリペプチドでなる水溶液から生成した
結晶を言う。ある実施態様では、結晶はＲＰＴＫの細胞外ドメインの全部または
一部でなる水溶液から生成する。ポリペプチドの結晶形の特徴は、ブルンデル（
Ｂｌｕｎｄｅｌ）ら、１９７６、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐ
ｈｙ、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉ Ｐｒｅｓｓ）、およびハーン（Ｈ
ａｈｎ）、Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｔａｂｌｅｓ ｆｏｒ Ｃｒｙｓ
ｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ、刊Ａ、第４版、クルーワーアカデミックプレス（Ｋｌ
ｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）に示された結晶形の一つで定義される
パターンでＸ線を回折し得ることである。好ましい実施態様では、本明細書で定
義された様なリガンドまたはリガンドアナログの少なくとも１個との複合体中の
ＲＰＴＫの細胞外ドメインの全部または一部に対応する、精製されたポリペプチ
ドから結晶形が生成する。

【００１３】 ＲＰＴＫの結晶形はまた、ＲＰＴＫの細胞外ドメインの全部または一部に対応
する、複合体化したリガンドまたはリガンドアナログを有する、または有さない
、少なくとも１個の重金属を導入した精製ポリペプチドでなる水溶液から精製し
た結晶が含まれる。重金属の導入により最初の結晶構造の変化が最小になること
が好ましい。重金属をタンパク質結晶中に公知の技術で導入することができる。
重金属を導入するための好ましい試薬は四塩化プラチニウム、酢酸水銀、エチル
水銀チオサリチル酸、六塩化インジュウム、硫酸ガドリニウム、塩化金、酢酸ウ
ラニウム、塩化水銀およびエチル塩化水銀である。

【００１４】 本明細書で用いる“レセプタータンパク質チロシンキナーゼ”、または“ＲＰ
ＴＫ”と言う用語は、アデノシン三燐酸の高エネルギー燐酸を、特定のリガンド
またはリガンドセットに対するレセプターとして働く細胞外ドメインであり、細
胞内および細胞外ドメインを連結する膜拡張ドメインであるタンパク質標的上に
あるチロシン残基に転送し得る細胞間触媒ドメインを有する酵素を言う。生体内
では、リガンドとそのレセプターとの結合により、レセプターの二量体化と細胞
間触媒ドメインの活性化が行われる。本発明の好ましいＲＰＴＫはＰＦＧＦＲ、
ＳＣＦＲ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＨＧＦＲ、ニューロトロピンＲ、ＨＥＲ２、
ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、インスリンＲ、ＩＧＦＲ、ＣＳＦＩＲ、ＦＫＬ、ＫＤＲ、
ＶＥＧＦＲ２、ＣＣＫ４、ＭＥＴ、ＴＲＫＡ、ＡＸＬ、ＴＩＥ、ＥＰＨ、ＲＹＬ
Ｋ、ＤＤＲ、ＲＯＳ、ＲＥＴ、ＬＴＫ、ＲＯＲＩ、またはＭＵＳＫである。より
好ましくは、本発明のレセプターＰＴＫは、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ
３、ＦＧＦＲ４等のＦＧＦＲファミリーのメンバーである。ある種のレセプター
ＰＴＫは既知のリガンドを持たず、“オーファン（希少）レセプターＰＴＫ”と
呼ばれる。

【００１５】 “ＦＧＦＲ１”と言う用語は、相互に相同であり、ＦＧＦに結合する複数のレ
セプターＰＴＫの１メンバーを言う。この文で、“相同”とはＦＧＦＲファミリ
ーの２つのメンバー間で約７０％以上のアミノ酸が同じであることが好ましく、
少なくとも約８０％のアミノ酸が同一であることがより好ましく、少なくとも約
９０％のアミノ酸が同一であることが最も好ましい。“ＦＧＦＲ１”という用語
には、図４で示される様な、ＦＧＦＲ１の１５０−３６０残基のアミノ酸配列を
包含する、またはそのアミノ酸配列でなるヒトＦＧＦＲ１が含まれる。この文章
、または他の文章でいう“相同”には、共通の起源または原型による関係を示す
に十分な類似性の分子も含む。

【００１６】 本明細書で用いる“細胞外ドメイン”という用語は、細胞の原形質膜の外側に
存在するＲＰＴＫの全てまたは一部の領域を言う。細胞外ドメインは好ましくは
原形質膜と結合したポリペプチド領域により、最も好ましくは原形質膜に埋め込
まれた、または原形質膜と交差するポリペプチド領域により、原形質膜に碇止め
されている。細胞外ドメインは細胞の原形質膜に碇止めされていない可溶性ドメ
インでも有り得る。最も好ましくは、細胞外ドメインは少なくとも１個のリガン
ドに対する少なくとも１個の結合部位でなる。

【００１７】 ＲＰＴＫ細胞外ドメインは少なくとも１個の既知の構造モチーフであることも
できる。これらの構造モチーフはシステインの多い領域、ヒブロネクチンIII様
ドメイン、Ｉｇ様ドメイン、ＥＧＦ様ドメイン、第VIII因子様ドメイン、および
クリングル（Ｋｒｉｎｇｌｅ）ドメインの少なくとも一つで有り得る。最も好ま
しいものは少なくとも１個のＩＧ様ドメインでなるＲＰＴＫである。例えば、Ｆ
ＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３およびＦＧＦＲ４のそれぞれは３個のＩＧ様
ドメイン、標識Ｄ１、Ｄ２およびＤ３を含む。ＩＧ様ドメインでなる他の好まし
いＲＰＴＫにはＰＤＧＦＲ、ｃ−Ｋｉｔ、Ｆｌｋ１、Ｆｌｋ２、Ｆｌｋ４、ＫＬ
Ｇ、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣ、Ａｘｌ、Ｔｉｅ、ｃ−Ｅｙｋ、およびＥｌ
ｋが含まれる。

【００１８】 本明細書で用いる“リガンド”と言う用語は、レセプターに特異的に結合する
分子を言う。様々な実施態様中で、リガンドは成長因子、サイトカイン、リンホ
カイン、またはホルモンである。好ましいリガンドには表皮成長因子、インスリ
ン、血小板由来成長因子、幹細胞因子、血管内皮成長因子、肝細胞成長因子、お
よびニューロトロフィンが含まれるが、がそれに限定されない。特に好ましいリ
ガンドは繊維芽細胞成長因子である。

【００１９】 本明細書で用いる“繊維芽細胞成長因子”という用語は、全体の配列の相同性
と共通の褶曲構造を共有するポリペプチド成長因子のファミリーを言う。本発明
の時点で、ＦＧＦファミリーはＦＧＦ１からＦＧＦ２１と名づけられた約２１個
の既知のメンバーを含む。当業者はＦＧＦファミリーの他のメンバーも後に同定
され、本発明の実施態様に用いられることを理解し得ると考えられる。ＦＧＦは
ＦＧＦｒおよびＨＳＰＧに結合する。好ましいＦＧＦはＦＧＦ１、ＦＧＦ２、Ｆ
ＧＦ３およびＦＧＦ４である。

【００２０】 本明細書で用いる“リガンドアナログ”と言う用語は、構造的または機能的に
リガンドに類似で、ポリペプチド上のリガンド結合部位に結合する分子を言う。
リガンドアナログがリガンドの少なくとも１個の原子、官能基、またはアミノ酸
残基の置換、付加、または欠失に由来する場合、リガンドアナログはあるリガン
ドに構造的に類似であると言うことができる。リガンドアナログがリガンドレセ
プターのリガンド結合部位に結合する場合、またはリガンドアナログのリガンド
レセプターへの結合の結果、リガンド結合に由来するものと類似の生化学的効果
をもたらす場合、リガンドアナログはあるリガンドに機能的に類似である。

【００２１】 リガンドアナログの結合は、リガンド結合に由来する少なくとも一つの生化学
効果を阻害するか、またはリガンド結合の競合者となる。この様なリガンドアナ
ログは“阻害剤”と呼ばれる。リガンドアナログはまた、オーファンレセプター
ＰＴＫの推定リガンド結合部位と結合する。

【００２２】 リガンドアナログは対応するリガンドより低い、同等またはより高い親和性で
そのリガンドレセプターと結合することが好ましい。ある実施態様では、リガン
ドアナログは突然変異リガンドでもあり得る。“突然変異体”という用語は、本
明細書で定義される。

【００２３】 本明細書で用いる“結合”と言う用語は、複数の分子の特異的相互作用を言う
。結合は１値結合であることが好ましい。この様な結合は例えば少なくとも１個
の水素結合、ファンデルワールス相互作用、芳香族相互作用、静電相互作用、お
よび疎水性相互作用で媒介される。ある実施態様では、結合は複数の分子の共有
結合を言う。

【００２４】 “触媒ドメイン”と言う用語は、タンパク質から離れた存在であるが、完全な
、または部分的な触媒機能を有するタンパク質領域を言う。あるタンパク質チロ
シンキナーゼの触媒ドメインのアミノ酸は、他のタンパク質チロシンキナーゼの
触媒ドメインのアミノ酸とほとんど同一であることが特徴である。タンパク質チ
ロシンキナーゼの触媒ドメインはまた、溶液に可溶なポリペプチドであることが
特徴である。

【００２５】 “アミノ酸がほとんど同一”という用語は、少なくとも約３０％、より好まし
くは少なくとも約３５％、最も好ましくは少なくとも約４０％が同一であること
を言う。これらのアミノ同一度は、異なったチロシンキナーゼファミリー間の同
一性を言う。あるチロシンキナーゼファミリーのメンバーに対するアミノ酸の同
一性は、約５５％から約９０％の間の範囲である。

【００２６】 本明細書で言う“同一性”という用語は、その類似性または関係の目安となる
配列の性質を言う。同一性は２つの配列における同じ残基の数を残基の全数で割
り、その値に１００を掛けて測定される。従って、まったく同じ２つコピーは１
００％の同一性を有するが、保存性がより少なく、欠失、付加または置換を有す
る配列はより低い同一度を有する。二つの配列が相互に相同であることもある。
“相同”という用語は、本明細書では共通の起源または原型による関係を示すに
充分である分子（例えばタンパク質）の類似性で定義され、それらを含むが、そ
れに限られるものではない。当業者が認める様に、配列の同一性および類似性を
決定するためにＢＬＡＳＴ（アルツシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、１９９０
、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１４：４０３−４１０）およびＦＡＳＴＡ（ピアー
ソン（Ｐｅａｒｓｎ）およびリップマン（Ｌｉｐｍａｎ）、１９８８、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４−２４４８）を含むい
くつかのコンピュータープログラムを使用し得る。

【００２７】 “機能性”という用語は、タンパク質の一部が無傷のタンパク質の機能の全て
または一部を維持する能力を言う。例えば、機能性ＰＲＴＫ触媒ドメインは基質
を燐酸化することにより基質を生成物に変換する能力を維持し、一方、機能性Ｒ
ＰＴＫ細胞外ドメインはそのリガンドを結合する能力を維持し得る。

【００２８】 ある実施態様では、ポリペプチドは機能性ではないが細胞外ドメインとして存
在することができる。例えば、細胞外ドメインに対応するポリペプチドはリガン
ドまたはリガンドアナログを結合するに必要な全ての構造を持たない。この実施
態様では、ＲＰＴＫ細胞外ドメインの目安は他のＲＰＴＫ細胞外ドメインと相同
であるポリペプチドである。

【００２９】 他の実施態様では、結晶はレセプタータンパク質チロシンキナーゼの細胞外ド
メインであるポリペプチドと、細胞外ドメインに結合したリガンドでなる。例え
ば、レセプタータンパク質チロシンキナーゼはＦＧＦＲ１またはＦＧＦＲ２等の
繊維芽細胞成長因子であり、リガンドはＦＧＦ１またはＦＧＦ２等の繊維芽細胞
成長因子である。結晶にはレセプタータンパク質キナーゼに結合した硫酸化オリ
ゴサッカライド、および／またはそれに結合したリガンドを含むこともできる。
硫酸化オリゴサッカライドの大きさ（分子量）は変化し得る。結晶に含み得る適
当な硫酸化オリゴサッカライドの例には硫酸化ジサッカライド、ヘキササッカラ
イド、オクタサッカライド、デカサッカライド、ドデカサッカライドが含まれる
。硫酸化オリゴサッカライドがヘパリン等の硫酸化ムコオリゴサッカライドであ
ることが好ましい。本実施態様の特定の態様では、結晶はＦＧＲ：ＦＧＦＲ：ヘ
パリン３成分複合体を含む。例えば、結晶はＦＧＦ１：ＦＧＦＲ１：ヘパリン３
成分複合体、ＦＧＦ２：ＦＧＦＲ１：ヘパリン３成分複合体、ＦＲＦ１：ＦＧＦ
Ｒ２：ヘパリン３成分複合体、またはＦＧＦ２：ＦＧＦＲ２：ヘパリン３成分複
合体等のＦＧＦ：ＦＧＦＲ：ヘパリン複合体でを含むことができる。

【００３０】 他の態様では、結晶は幹細胞因子のレセプター結合コアを含むポリペプチドを
包含し得る。レセプター結合コアは一般に４個のヘリックス帯と２個のβ鎖を含
む３次元構造を有する。幹細胞因子とレセプター結合コアを含むフラグメントは
、例えばポリペプチドのホモ二量体を含む形で結晶化する。ホモ二量体を構成す
るモノマーは共有結合、例えば少なくとも１つの分子間ジスルフィド結合で結合
しているが、本明細書に述べるＳＣＦの結晶には非共有結合ホモ二量体が含まれ
る。ＳＣＦホモ二量体は単位格子がａ＝７２．４７Å、ｂ＝８３．４５Å、ｃ＝
８９．１５Åの大きさの斜方晶結晶を形成する。ＳＣＦホモ二量体はまた、例え
ば単斜晶結晶として結晶化する。非共有結合ホモ二量体の単斜晶結晶を表４に示
す原子構造座標を得るために用いた。これらの原子座標は、幹細胞因子のアミノ
酸残基１−１４１を含むホモ二量体から生成した結晶のためのものである。これ
らの結晶はＣ２対照を有する。このタイプの結晶は、幹細胞因子またはそのフラ
グメントに結合したｃ−ｋｉｔ（ＳＣＦＲ）等のＰＲＴＫを含むこともある。結
晶は幹細胞因子のレセプター結合コアに結合したｃ−ｋｉｔを含むことが好まし
い。

【００３１】 “ポリペプチド”と言う用語は、タンパク質を構成する一部または前配列を表
すアミノ酸鎖を言う。

【００３２】 “会合”とは、化学的存在または化合物、または一部またはそのフラグメント
と、ＲＰＴＫ、またはその一部またはフラグメントとの間の近接した条件を言う
。会合はすなわち並列位置が例えば水素結合、ファンデルワールス、静電または
疎水的相互作用でエネルギー的に有利である非共有結合であるか、または共有結
合である。

【００３３】 “重金属”と言う用語は、遷移元素、ランタナイド金属、またはアクチニド金
属である原子を言う。ランタナイド金属は原子番号５７および７１の間の元素の
全てを言う。アクチニド金属は原子番号８９と１０３のあいだの元素の全てを言
う。好ましい実施態様では、本発明発明の結晶は少なくとも１個の金属原子を含
有し得る。この様な結晶を本明細書では“誘導体結晶”と言う。

【００３４】 他の実施態様では、本発明はＲＰＴＫ細胞外ドメインのＤ２−Ｄ３領域に対応
するポリペプチドの結晶形が特徴である。好ましい実施態様では、本発明はリガ
ンドまたはリガンドアナログに結合したレセプターＰＴＫ細胞外ドメインの結晶
形が特徴である。好ましい実施態様では、ＲＴＰＫはＦＧＦＲ１またはＦＧＦＲ
２、等のＲＰＴＫはＦＧＦＲであり、リガンドはＦＧＦ、好ましくはＦＧＦ１ま
たはＦＧＦ２である。特に好ましい実施態様では、ポリペプチドはＦＧＦＲ１の
残基１５０−３６０、またはＦＧＦＲ２の残基１５０−３６０であり、その配列
は図４に示される。リガンドはその相手方タンパク質またはその類似物である。
例えば、ＲＰＴＫがＦＧＦＲ１またはＦＧＦＲ２の細胞外結合ドメインを含む場
合、リガンドは図１７で示される様なアミノ酸配列を含むＦＧＦ１、または図１
７で示される様なアミノ酸配列を含むＦＧＦ２等の繊維芽細胞因子であり得る。

【００３５】 本明細書で用いる“Ｄ２−Ｄ３領域”と言う用語は、ＦＧＦＲの第二および第
三Ｉｇ様ドメインを言う。“ＩＧ様ドメイン”と言う用語は当業者に公知である
。ある実施態様では、本発明のＤ２−Ｄ３領域は第二および第三Ｉｇ様ドメイン
を含まず、ＦＧＦＲのリガンドに結合部位を提供するに十分な残基を含む。最も
好ましくは、“ Ｄ２−Ｄ３領域”と言う用語はヒトＦＧＦＲ１の１５０−３６
０残基を含むタンパク質を言う。

【００３６】 “突然変異体”と言う用語は、天然ＲＰＴＫまたはポリペプチドリガンド中の
少なくとも１個のアミノ酸残基を、異なったアミノ酸残基で置換して得られるポ
リペプチドを言う。突然変異はアミノ酸残基を、天然ポリペプチド内、またはポ
リペプチドのＮ−および／またはＣ−末端に付加または削除して行うことができ
る。突然変異ポリペプチドは天然ポリペプチドと実質的に同じ３次元構造を有す
ることが好ましい。

【００３７】 本明細書で用いる“実質的に同じ３次元構造を有する”という用語は、突然変
異体が由来する天然型ポリペプチドの原子構造因子と重ね合わせ、少なくとも５
０％から１００％の天然型チロシンキナーゼのＣα原子が重ね合わせに含まれる
場合、Ｃα原子２A以下の根平均二乗偏差を有する原子構造座標のセットを言う
。

【００３８】 他の態様では、本発明は表１および２に示された構造座標で定義された、リガ
ンドに結合したＲＰＴＫ細胞外ドメインの結晶形に関する。

【００３９】 本明細書で用いる“原子構造座標”という用語は、１個または複数の分子の３
次元構造を定義するデータセットを言う。構造座標を若干修飾しても、ほとんど
同等な３次元構造が得られる。構造座標の独自のセットの目安は、得られる構造
の根平均2乗偏差である。約１．５Åの根平均2乗偏差により相互に異なった３次
元構造を与える構造座標は、通常の技術を有する当業者により同一であると見な
される。従って、表１−４、および６に示される構造座標は、そこに定義される
値に限られない。

【００４０】 Ｘ線結晶学を用いることにより、本発明の結晶形の３次元構造を説明すること
ができる。例えば、Ｘ線結晶学による結晶形の最初の特徴描写では、単位格子の
形と、その結晶中での配向を決定することができる。“単位格子”という用語は
、結晶のパターン単位を完全に代表する結晶の最小かつ最も簡単な容積単位を言
う。単位格子の寸法は、長さａ、ｂおよびｃ、および角度α、βおよびγの６つ
の数で定義される。結晶は複数の単位格子の効率的に詰め込まれた配列として観
察される。結晶学用語の詳細な説明は、ハーン（Ｈａｈｎ）、１９９６、Ｔｈｅ
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｔａｂｌｅｓ ｆｏｒ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａ
ｐｈｙ、Ｖｏｌｕｍｅ Ａ、第４版、クルーワーアカデミックプレスパブリシャ
ーズ（Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）；
およびシュムエリ（Ｓｈｍｕｅｌｉ）、Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｔ
ａｂｌｅｓ ｆｏｒ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ、Ｖｏｌｕｍｅ Ｂ、第１
版、クルーワーアカデミックプレスに記載されている。

【００４１】 他の態様で、本発明はリガンドまたはリガンドアナログに結合した、レセプタ
ー細胞外ドメインのＤ２−Ｄ３領域に対応するポリペプチドの結晶形が特徴であ
り、結晶は正方晶系単位格子と空間群対称Ｐ４₁２₁２を有することで特徴付けら
れる。好ましい実施態様では、ＲＰＴＫはＦＧＦＲ、好ましくはＦＧＦＲ１であ
り、リガンドはＦＧＦ、好ましくはＦＧＦ２である。特に好ましい実施態様では
、ポリペプチドはその配列が図４に示されるＦＧＦＲ１の残基１５０−３６０ま
たはＦＧＦＲ２の残基１５０−３６０を含む。最も好ましくは、本発明の特徴は
ＦＧＦ２に結合したＦＧＦＲ１ Ｄ２−Ｄ３の結晶形であり、結晶の正方晶系単
位格子の寸法は約ａ＝９８．５Å、ｂ＝９８．５Å、ｃ＝１９７．０Å、β＝９
０°である。

【００４２】 また別な態様では、本発明の特徴はリガンドまたはリガンドアナログに結合し
たレセプターＰＴＫ細胞外ドメインのＤ２−Ｄ３領域に対応するポリペプチドの
結晶形であり、結晶は正方晶系単位格子と空間群対称Ｐ１を有することが特徴で
ある。好ましい実施態様では、ＲＰＴＫはＦＧＦＲ、好ましくはＦＧＦＲ１であ
り、リガンドはＦＧＦ、好ましくはＦＧＦ１である。特に好ましい実施態様では
、ポリペプチドはその配列が図４に示されるＦＧＦＲ１の残基１５０−３６０、
またはＦＧＦＲ２の残基１５０−３６０でなる。最も好ましくは、本発明の特徴
はＦＧＦ１に結合したＦＧＦＲ１ Ｄ２−Ｄ３の結晶形であり、結晶の正方晶系
単位格子の寸法は約ａ＝６２．５５Å、ｂ＝６４．０６Å、ｃ＝６４．１４Å、
α＝９３．４０°、β＝１１１．１７°、γ＝９７．１８°である。

【００４３】 また別な実施態様では、本発明の特徴はリガンドまたはリガンドアナログに結
合した、レセプターＰＴＫ細胞外ドメインのＤ２−Ｄ３領域に対応するポリペプ
チドの結晶形であり、結晶は三斜単位格子と空間群対称Ｐ１を有することが特徴
である。好ましい実施態様では、ＲＰＴＫはＦＧＦＲ２等のＦＧＦＲであり、リ
ガンドはＦＧＦ２等のＦＧＦである。特に好ましい実施態様では、ポリペプチド
は図４に示されるＦＧＦＲ２の残基１５０−３６０でなり、ＦＧＦ２は図１７で
示される配列を有する。例えば、ＦＧＦ２に結合したＦＧＦＲ２ Ｄ２−Ｄ３の
結晶形は三斜晶系単位格子を有し、その寸法は約あ＝７２．２０Å、ｂ＝７１．
６８Å、ｃ＝９０．９２Å、α＝９０．５３°、β＝８９．９８°、γ＝８９．
９９°である。

【００４４】 “空間群”と言う用語は単位格子の対称を言う。単位格子の記載（例えばＰ４ ₁ ２₁２またはＰ１）では、大文字は格子型を示し、他の記号はその外観を変えず
に単位格子で行われる対称操作を示す。

【００４５】 結晶構造に関する“格子”という用語は、詰め込まれた単位格子の頂点で定義
される点の配列を言う。

【００４６】 “対称操作”と言う用語は、単位格子の等価な部分を交換する、または二つの
異なった単位格子間で等価な分子を交換する、幾何学的に定義された方法を言う
。対称照査の例はスクリュー軸、反転中心および鏡面である。

【００４７】 ポリペプチドに関連する“単離された”とは、例えば相互に化学結合（例えば
ペプチド結合）で連結した６、１２、１８またはそれ以上のアミノ酸を意味し、
天然または組み替え起源から単離された、または化学的に合成されたポリペプチ
ドを含む。本発明の単離されたポリペプチドは、それらが純粋または分離された
状態で天然に見出されない点で独自のものである。“単離された”と言う用語を
使用することは、天然起源の配列、またはそのアナログがその正常な細胞環境か
ら移動されたことを示す。従って、配列は無細胞溶液中にあるか、または異なっ
た細胞環境中に置かれる。その用語は配列が存在するアミノ酸鎖のみであるので
はなく、他の物質が本質的にない（少なくとも約９０−９５％純度）であること
を意味する。

【００４８】 ポリペプチドに関連して、本明細書で用いる“濃縮された”と言う用語は、関
連する細胞または溶液中に存在するポリペプチドの全量が、配列を取り出した細
胞または溶液中よりかなり高い割合である特定のアミノ酸配列を言う。ポリペプ
チドが約２倍、約３倍、約５倍、約１０倍約２０倍、約５０倍、または約１００
倍濃縮されていることが好ましい。濃縮は他のポリペプチドの量を優先的に減少
させる、または関連する特定のポリペプチドの量を優先的に増加させる、または
この二つの組み合わせで行われる。しかしながら、“濃縮された”と言うことは
他のポリペプチドが存在しないことを意味せず、関連するポリペプチドの相対量
が有意に増加しただけであることに注意しなければならない。“有意に”という
用語は、本明細書では増加のレベルがこの様な増加を行っている作業者に有用で
あることを示し、一般的に他のアミノ酸に対し約２倍、約３倍、約５倍、約１０
倍約２０倍、約５０倍、または約１００倍の増加を意味する。

【００４９】 ある目的では、アミノ酸配列が精製された形であることが有利である。ポリペ
プチドに関し本明細書で用いる“精製された”と言う用語は、絶対的に純粋であ
る（均一な調製物等）ことを意味せず、天然環境中より相対的に純粋なポリペプ
チドを言う。ポリペプチドは約２倍、約３倍、約５倍、約１０倍約２０倍、約５
０倍、または約１００倍精製されていることが好ましい。最も好ましくは、少な
くとも１桁、好ましくは２桁以上、より好ましくは４または５桁の精製倍率が明
らかに期待される。好ましい実施態様では、機能的に有意なレベルで汚染がない
。

【００５０】 他の態様では、本発明の特徴は本明細書に報告される結晶形の生成法である。
その方法では、結晶を生成するために本明細書に報告のポリペプチドを利用する
。その方法は以下の工程でなる： （ａ）一定容積のポリペプチド溶液を保存溶液と混合する工程；および （ｂ）工程（ａ）で得られた混合液を保存溶液上で、密封容器中、結晶化に適
した条件でインキュベートする工程。

【００５１】 ポリペプチド溶液が約１ｍｇ／ｍｌから約５０ｍｇ／ｍｌの結晶化ポリペプチ
ドでなることが好ましく、約１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０
ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍ
ｌ、３５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、４５ｍｇ／ｍｌおよび５０ｍｇ／ｍｌで
あることが最も好ましい。ポリペプチド溶液が約ｐＨ６．５から約９．５で緩衝
されていることが好ましく、約ｐＨ８．５で緩衝されていることが最も好ましい
。好ましい実施態様では、溶液は、約１ｍＭから約５００ｍＭ、最も好ましくは
約１５０ｍＭの塩、好ましくはＫＣｌまたはＮａＣｌの形の塩を含む。ある実施
態様では、保存溶液は約０．５から約３Ｍの間、好ましくは約１．６Ｍの硫酸ア
ンモニウムと、約５％から約５０％の間、最も好ましくは２０％のグリセロール
を含む。他の実施態様では、保存溶液は好ましくは約５％から約５０％の間、最
も好ましくは約２０％のポリエチレングリコールと、０．０５から０．５Ｍの間
、最も好ましくは約０．２ＭのＬｉ₂ＳＯ₄を含む。保存溶液は好ましくは約ｐＨ
６．５から約ｐＨ９．５の間、最も好ましくは約ｐＨ８．５で緩衝されている。
これらのプロセスは、“発明の実施の形態”の節に詳細に説明されている。

【００５２】 他の態様では、本発明の特徴は単独、またはリガンドまたはリガンドアナログ
と結合した複合体のＲＰＴＫ細胞外ドメインの構造の３次元表示である。好まし
い実施態様では、本発明の特徴はリガンドまたはリガンドアナログと結合した、
レセプターＰＴＫ細胞外ドメインのＤ２−Ｄ３領域の構造の３次元表示である。
好ましい実施態様では、ＲＰＴＫはＦＧＦＲ１またはＦＧＦＲ２等のＦＧＦＲで
あり、リガンドはＦＧＦ、好ましくはＦＧＦ１またはＦＧＦ２である。好ましい
実施態様のグループでは、ポリペプチドはＦＧＦＲ１の配列１５０−３６０、ま
たはＦＧＦＲ２の配列１５０−３６０でなり、その配列が表４に示される。リガ
ンドは図１７に示されるアミノ酸配列を含むＦＧＦ１等の繊維芽細胞成長因子、
または図１７に示されるアミノ酸配列を含むＦＧＦ２である。

【００５３】 本明細書で用いる“３次元表示”という用語は、３次元座標空間を利用する少
なくとも１個の分子の任意の非天然表現を言う。当業者は、例えば表１−４およ
び６の原子構造座標が３次元座標空間を使用し、従って３次元表示であることを
理解し得ると考えられる。好ましい実施態様では、３次元表示は少なくとも１個
の分子の原子座標から作成されたモデルである。特に好ましい実施態様では、３
次元表示はコンピューターメモリ内に存在する、および／またはコンピューター
のスクリーンに表示された、少なくとも１個の分子の原子座標から作成されたモ
デルである。本明細書に開示された座標は、当業者に分子構造および相互作用を
研究するに必用な情報を提供する。本明細書に含まれる知見の観点から分子を結
晶化し、本明細書に含まれる知見に従ってＸ線解析を行うことにより、比較デー
タを得ることができる。さらに、本明細書に含まれるデータの変更も本発明の範
囲内である。

【００５４】 他の態様では、本発明の特徴はＲＰＴＫ細胞外ドメインをコードするＤＮＡで
ある。例えば、組み替えＤＮＡはＦＧＦＲ１のアミノ酸残基１５０−３６０また
はＦＧＦＲ２のアミノ酸残基１５０−３６０をコードする、図４に示されている
ヌクレオチド配列を含むコード鎖を含むことができる。

【００５５】 また別な態様では、ＲＰＴＫ細胞外ドメインの既知の原子座標を利用する、本
発明は未知の構造のＲＰＴＫ細胞外ドメインの３次元構造の決定法に関する。こ
れらの方法を相同性モデル化、分子置換、および各磁気共鳴法と関連させること
ができる。

【００５６】 好ましい実施態様では、本発明は構造未知のＲＰＴＫ細胞外ドメインの、相同
モデル化による３次元構造の決定法に関する。これらの方法は、ＲＰＴＫ細胞外
ドメインの既知の原子構造座標を、未知の３次元構造を有するレセプターＰＴＫ
のアミノ酸配列と組み合わせて使用する。その方法は、（ａ）構造未知のＲＰＴ
Ｋのアミノ酸配列を、既知の原子構造座標を有するＲＰＴＫのアミノ酸配列と並
べて整列する工程であって、整列はアミノ酸配列の相同領域を合わせることで行
われる工程；（ｂ）相同アミノ酸のそれぞれの座標を、既知の原子構造座標から
構造未知のＲＰＴＫ配列中の対応するアミノ酸の構造のコンピューター表示へ移
す工程；および（ｃ）得られたＲＰＴＫ構造の低エネルギーコンフォーメーショ
ンを決定する工程でなる。

【００５７】 既知の原子構造座標は、リガンドまたはリガンドアナログに結合したＲＰＴＫ
細胞外ドメインの原子構造座標であることが好ましい。より好ましくは、既知の
原子構造座標はＦＧＦＲ、好ましくはＦＧＦ、好ましくはＦＧＦ１またはＦＧＦ
２に結合したＦＧＦＲ１の原子構造座標である。既知の原子構造座標が表１また
は２に示す座標であることが最も好ましい。

【００５８】 “アミノ酸配列”と言う用語は、ＲＰＴＫの全てまたは一部に対応するポリペ
プチドでなるアミノ酸鎖中のアミノ酸の順番を記述するものである。好ましい実
施態様では、アミノ酸配列はＲＰＴＫの細胞外ドメインの全てまたは一部のアミ
ノ酸の順番を記述する。

【００５９】 “並べて整列する”と言う用語は、複数のアミノ酸配列の先頭および末端を合
わせる意味である。相同アミノ酸配列が整列プロセス中に相互の先頭に置かれる
。

【００６０】 タンパク質配列に関連して本明細書で用いる“相同”と言う用語は、同一の配
列、または類似の側鎖化学基（例えば脂肪族、芳香族、極性、負電荷または性電
荷）を有する配列中のアミノ酸を記述するものである。従って、共通の起源また
は原型による関係を示すに十分な類似のタンパク質配列は、例えば相同性を有す
ると考えられる。相同アミノ酸の例を以下に示す。

【００６１】 “対応する”という用語は、上記の配列中で相互に並べられたアミノ酸を言う
。

【００６２】 “低エネルギーコンホメーションの決定”とい言う用語は、ＲＰＴＫの構造の
コンホメーションを構造の自由エネルギーが低い様に変えるプロセスを言う。Ｒ
ＰＴＫ構造はそれに結合したリガンドまたはリガンドアナログ等の分子を有して
いても、有していなくてもよい。

【００６３】 “低自由エネルギー”という用語は、分子がプロセスで測定して安定状態にあ
る常態を言う。安定状態は複合体内で有利な相互作用を形成した場合に達成され
る。

【００６４】 “有利な相互作用”という用語は、とりわけ疎水性、芳香性、およびイオン力
、および水素結合を言う。

【００６５】 “化合物”と言う用語は、有機分子を言う。“有機分子”という用語は、構造
内に少なくとも１個の炭素を有する分子を言う。その化合物は６ｋＤａ以下の分
子量を有する。化合物の幾何学構造と、化合物とポリペプチドの間に生成する相
互作用が、２つの分子間の高親和性結合を支配することが好ましい。高親和性結
合は、１０^-6モル以下のオーダーの解離平衡定数で支配されることが好ましい。

【００６６】 “結合部位”と言う用語は、少なくとも１個の分子が結合し得る酵素またはポ
リペプチド上の位置を言う。好ましい実施態様では、結合部位はリガンド結合部
位、ＨＳＰＧ結合部位、またはリガンド結合により二量体を生成する２個のレセ
プター間の相互作用表面を言う。

【００６７】 “相互作用”と言う用語は、疎水性、芳香性およびイオン力、および原子間に
形成される水素結合を言う。この様な相互作用は“分子間”であるか、同一分子
内であるか、“分子間”であるか、離れた分子間である。

【００６８】 “共因子（コファクター）”という用語は、基質のに加えてタンパク質に結合
し、化学反応を行う化合物を言う。複数のコファクターがヌクレオチドまたはア
デノシンの燐酸化物およびニコチンアミド誘導体等のヌクレオチド誘導体である
。

【００６９】 “基質”と言う用語は、酵素と反応する化合物を言う。酵素は特定に基質上で
特定の反応を触媒することができる。例えば、ＲＰＴＫは特定のタンパク質およ
びペプチド基質上でチロシン残基を燐酸化することができる。さらに、ヌクレオ
チドがタンパク質キナーゼに対する基質として作用し得る。

【００７０】 “基質アナログ”と言う用語は、基質と構造的に類似しているが同一でない化
合物を言う。基質アナログはヌクレオチドアナログである場合もある。ヌクレオ
チドアナログの例は以下に報告される。

【００７１】 “アロステリックエフェクター”という用語は、タンパク質中でアロステリッ
ク相互作用を生じる化合物を言う。“アロステリック相互作用”とは、タンパク
質上で離れた部位間の相互作用を言う。アロステリックエフェクターは、活性部
位とは異なった部位に結合して触媒活性を増進または阻害することができる。

【００７２】 “共結晶”と言う用語は、ポリペプチドが少なくとも１個の化合物と会合して
いる結晶を言う。

【００７３】 “ＡＴＰ”という用語は、化合物アデノシン三燐酸を言う。

【００７４】 “非加水分解性”と言う用語は、水と容易には反応しない共有結合を有する化
合物を言う。ＡＴＰの非加水分解性アナログの例は、その構造が当業者に公知の
ＡＭＰ−ＰＮＰおよびＡＭＰ−ＰＣＰである。

【００７５】 “ＡＭＰ−ＰＮＰ”とは、ＡＴＰの非加水分解性アナログであるアデニリルイ
ミドジホスフェートのことである。

【００７６】 “ＡＭＰ−ＰＣＰ”とは、ＡＴＰの非加水分解性アナログであるアデニリルジ
ホスフェートのことである。

【００７７】 “アルキル”とは、直鎖、分枝または環状飽和脂肪族炭化水素のことである。
アルキル基が１から１２個の炭素原子を有することが好ましい。より好ましくは
１〜７個の炭素原子、より好ましくは１〜４個の炭素原子である。アルキル基の
例にはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、３級ブ
チル、ペンチル、ヘキシル等が含まれる。アルキル基は随意には水酸基、シアノ
基、アルコキシ、＝Ｏ、＝Ｓ、ＮＯ₂、ハロゲン、Ｎ（ＣＨ₃）₂アミノ基、およ
びＳＨ基でなる群から選ばれた少なくとも１個の置換基で置換されていることが
好ましい。

【００７８】 “アルケニル”とは、少なくとも１個の二重結合を含む直鎖、分枝または環状
不飽和炭化水素基のことである。アルケニル基が２から１２個の炭素原子を含む
ことが好ましい。より好ましくは２から７個、より好ましくは２から４個の炭素
原子の低級アルケニルである。アルケニル基は随意には水酸基、シアノ基、アル
コキシ、＝Ｏ、＝Ｓ、ＮＯ₂、ハロゲン、Ｎ（ＣＨ₃）₂アミノ基、およびＳＨ基
でなる群から選ばれた少なくとも１個の置換基で置換されていることが好ましい
。

【００７９】 “アルキニル”とは、少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を含む直鎖、分枝
または環状不飽和炭化水素基のことである。アルキニル基が２から１２個の炭素
原子を含むことが好ましい。より好ましくは２から７個、より好ましくは２から
４個の炭素原子の低級アルキニルである。アルキニル基は随意には水酸基、シア
ノ基、アルコキシ、＝Ｏ、＝Ｓ、ＮＯ₂、ハロゲン、Ｎ（ＣＨ₃）₂アミノ基、お
よびＳＨ基でなる群から選ばれた少なくとも１個の置換基で置換されていること
が好ましい。

【００８０】 “アルコキシ”とは“Ｏ−アルキル基”のことである。

【００８１】 “アリール”とは、共役二重結合を有する少なくとも１個の環を有する芳香族
基であり、カルボキシアリール、ヘテロサイクリックアリールおよびビアリール
基を含む。アリール基は随意には随意にはハロゲン、トリハロメチル基、水酸基
、ＳＨ、ＯＨ、ＮＯ₂、アミン、チオエーテル、シアノ、アルコキシ、アルキル
およびアミノ基から選ばれた少なくとも１個の置換基で置換されていることが好
ましい。

【００８２】 “アルカリール”とは、アリール基に共有結合したアルキルのことである。ア
ルキルが低級アルキルであることが好ましい。

【００８３】 “カルボキシアリール”とは、環原子が炭素であるアリール基のことである。

【００８４】 “ヘテロサイクリックアリール”とは、環、原子として１〜３個のヘテロ原子
を有し、環の残りが炭素であるアリール基のことである。ヘテロ原子には酸素、
硫黄および窒素が含まれる。従って、ヘテロサイクリックアリール基にはフラニ
ル、チエニル、ピリジル、ピロリル、Ｎ−低級アルキルピロロ、ピリミジル、ピ
ラジニル、イミダゾリル等が含まれる。

【００８５】 “アミド”とはＲがアルキル、アリール、アラルキル、または水素である−Ｃ
（Ｏ）−ＮＨ−Ｒである。

【００８６】 “チオアミド”とは、 Ｒがアルキル、アリール、アラルキル、または水素で
ある−Ｃ（Ｓ）−ＮＨ−Ｒである。

【００８７】 “アミン”とは、Ｒ'およびR"が独立にアルキル、アリールおよびアルキルア
リールでなる群より選ばれ−Ｎ（Ｒ'）Ｒ"基である。

【００８８】 “チオエーテル”とは、Ｒがアルキル、アリールまたはアルキルアリールであ
る−Ｓ−Ｒである。

【００８９】 “スルホニル”とは、Ｒがアリール、Ｃ（ＣＮ）＝Ｃ−アリール、ＣＨ₂ＣＮ
、アルキルアリール、スルホンアミド、ＮＨ−アルキル、ＮＨ−アルキルアリー
ル、またはＮＨ−アリールである−Ｓ（ＳＯ₂）−Ｒである。

【００９０】 “アシル”という用語は、Ｒが上記に定義されたアルキルである、ホルミル、
アセチル、プロピオニルまたはブチリル等の−Ｃ（Ｏ）Ｒを表す。

【００９１】 他の好ましい実施態様では、ＲＰＴＫ細胞外ドメインの既知の原子構造座標を
、未知の３次元構造を有するＲＰＴＫ細胞外ドメインに対する不完全Ｘ線結晶学
データセットに当てはめることによる、本発明は構造未知のＲＰＴＫ細胞外ドメ
インの３次元構造の決定法に関する。その方法は（ａ）２つの結晶からの回折デ
ータを合わせて単位格子内の原子の位置を決定する工程であって、１つのデータ
セットは構造未知のＲＰＴＫでなる結晶由来であり、もう一方のデータセットは
既知の原子構造座標を有するＲＰＴＫでなる結晶由来である工程；および（ｂ）
得られたＲＰＴＫ構造の低エネルギーコンフォーメーションを決定する工程でな
る。

【００９２】 完全な回折データは、リガンドまたはリガンドアナログに結合したＲＰＴＫ細
胞外ドメインの結晶由来であることが好ましい。より好ましくは、完全な回折デ
ータはＦＧＦ、好ましくはＦＧＦ１またはＦＧＦ２に結合した、ＦＧＦＲ細胞外
ドメイン、好ましくはＦＧＦＲ１の結晶由来である。

【００９３】 構造未知のＲＰＴＫでなる結晶由来の回折データセットは、完全データセット
であっても、不完全データセット出会っても良い。本明細書で用いる“不完全デ
ータセット”という用語は、３次元構造を与えるに十分な情報を持たないＸ線結
晶学データセットに関する。

【００９４】 他の好ましい実施態様では、本発明は構造未知のレセプターＰＴＫ細胞外ドメ
インの３次元構造の決定法であって、ＲＰＴＫ細胞外ドメインの既知の原子構造
座標を未知の３次元構造を有するＲＰＴＫ細胞外ドメインの核磁気共鳴（ＮＭＲ
）データに適用する方法に関する。その方法は、（ａ）構造未知のＲＰＴＫ細胞
外ドメインの２次構造をＮＭＲデータを用いて決定する工程；および（ｂ）アミ
ノ酸の空間を通る相互作用の割り当てを、ＲＰＴＫの既知の原子構造座標を用い
て簡略化する工程でなる。未知の３次元構造のＲＰＴＫ細胞外ドメインは、化合
物、リガンドまたは調節因子と複合体を形成していても、していなくても良い。

【００９５】 既知の原子構造座標はリガンドまたはリガンドアナログに結合したＲＰＴＫ細
胞外ドメインの座標であることが好ましい。既知の原子構造座標がＦＧＦ、好ま
しくはＦＧＦＲ１またはＦＧＦ２に結合した、ＦＧＦＲ細胞外ドメインであるこ
とがより好ましい。既知の原子構造座標が表１または２に示した座標であること
が最も好ましい。

【００９６】 “２次構造”と言う用語は、α−ヘリックスまたはβ−シート要素等の３次元
構造中のアミノ酸の配列である。

【００９７】 “空間を通じる相互作用”と言う用語は、２次構造要素の３次元構造中の配向
と、アミノ酸配列の異なった部分由来のアミノ酸間の距離を規定するものである
。

【００９８】 “割り当て”と言う用語は、ＮＭＲを解析する方法と、どのアミノ酸がＮＭＲ
スペクトル中の信号を生じるかを同定する方法を規定するものである。

【００９９】 他の態様で、本発明の特徴はＰＴＫ機能の潜在的調節因子を同定する方法であ
る。分子のより大きい群から少なくとも１個の潜在的調節因子を同定することに
より、費用と時間のがかる生物分析を用いて試験しなければならない分子の数を
減らすことが可能である。従って、本明細書に報告されたＰＴＫ機能の潜在的調
節因子の同定法により、ＰＴＫ機能の実際の調節因子を同定する効率が向上する
。

【０１００】 潜在的調節因子を化合物の構造の３次元表示と、ＲＰＴＫ細胞外ドメインの３
次元構造をドッキングして同定することが好ましい。ＲＰＴＫ細胞外ドメインの
コンピューター表示を、原子構造座標で定義することができる。ある実施態様で
は、少なくとも１個の調節因子がＲＰＴＫ細胞外ドメインのリガンド結合部位お
よび／またはＲＰＴＫ細胞外ドメインのヘパリン硫酸塩含有糖タンパク質に対す
る結合部位とドッキングされる。

【０１０１】 好ましい実施態様では、ＲＰＴＫ機能の潜在的調節因子を同定する方法は（ａ
）ＲＰＴＫの原子構造座標の３次元表示を提供し、コンピューターデータベース
由来の化合物の３次元表示と、ＲＰＴＫの３次元表示をドッキングする工程；（
ｂ）有利な幾何学的フィットと有利な相補相互作用を有する得られた複合体のコ
ンフォーメーションを決定する工程；および（ｃ）ＲＰＴＫ機能の潜在的調節因
子としてのＲＰＴＫと最も良くフィットする化合物を同定する工程でなる。最初
のＲＰＴＫの構造は少なくとも１個の化合物、リガンドまたはそれに結合した調
節因子を持っていても、いなくても良い。

【０１０２】 原子構造座標はリガンドまたはリガンドアナログに結合したＲＰＴＫ細胞外ド
メインの座標であることが好ましい。原子構造座標はＦＧＦ、好ましくはＦＧＦ
１またはＦＧＦ２に結合した、ＦＧＦＲ細胞外ドメイン，好ましくはＦＧＦＲ１
細胞外ドメインの原子構造座標であることがより好ましい。原子構造座標は表１
または２に示された座標であることが最も好ましい。

【０１０３】 本明細書で用いる“ＲＰＴＫ機能の調節因子”という用語は、ＲＰＴＫの触媒
活性を変化させる化合物またはリガンドアナログを言う。ＲＰＴＫ基の調節因子
は、ＲＰＴＫ触媒活性を刺激するか阻害することができる。例えば、阻害的調節
因子は、ＲＰＴＫの二量体化を妨害、ＲＰＴＫの二量体化を阻害剤、またはＲＰ
ＴＫのそのリガンドまたはＨＳＰＧへの結合を阻害する、少なくとも１個の化合
物またはリガンドアナログである。または、刺激的調節因子は二量体生成を安定
化する、ＲＰＴＫのリガンドの活性を模倣する、またはＨＳＰＧの活性を模倣す
る、少なくとも１個の化合物またはリガンドアナログである。

【０１０４】 “化学基”と言う用語は、水素結合、疎水性、芳香族性、またはイオン性相互
作用を形成する分子の部分を言う。

【０１０５】 “ドッキング”という用語は、化合物、リガンドまたはリガンドアナログをＲ
ＰＴＫの近傍に置くプロセスを言う。ある実施態様では、ドッキングは化合物、
リガンドまたはリガンドアナログを、ＲＰＴＫの３次元表示３次元表示の近傍に
置くことを言う。その用語はまた、得られた化合物／ＲＰＴＫ、リガンド／ＲＰ
ＴＫまたはリガンドアナログ／ＲＰＴＫの低エネルギーコンフォーメーションを
見出すプロセスを言う。

【０１０６】 “有利な幾何学的フィット”という用語は、化合物／ＲＰＴＫ、リガンド／Ｒ
ＰＴＫまたはリガンドアナログ／ＲＰＴＫのコンフォーメーションであって、化
合物、リガンドまたはリガンドアナログの表面積が不利な相互作用を生じずにＲ
ＰＴＫ部位の表面の近傍にあることを言う。不利な相互作用とは結合した分子中
の原子とＲＰＴＫ中の原子の間の立体障害である。

【０１０７】 “有利な相補的相互作用”と言う用語は、化合物、リガンドまたはリガンドア
ナログと、ＲＰＴＫの間にに生成する疎水性、芳香族性、イオン性、および水素
結合授受力に関連する。

【０１０８】 “潜在的”と言う用語は“ＲＰＴＫ機能の調節因子”と言う用語を制限するが
、その理由はＲＰＴＫ機能の潜在的調節因子が生体外または生体内で試験されて
いないからである。

【０１０９】 “最良のフィット”と言う用語は、ある実験でレセプターＰＴＫとほとんどの
表面積と複合体を形成する、および／または最も有利な相補的相互作用を行う化
合物、リガンドまたはリガンドアナログの意味である。“最良のフィット”と言
う用語はまた、ほとんどの表面積で複合体を形成する、および／またはレセプタ
ーＰＴＫと最も有利な相補的相互作用を行う化合物、リガンドまたはリガンドア
ナログのとりわけ大きい群由来の化合物、リガンドまたはリガンドアナログのサ
ブセットを言う。好ましい実施態様では、最良のフィットを示す分子は、ほとん
どの表面積での複合体形成に関して試験された分子の内の、７０番目の百分位数
以上にあるか、および／または最も有利な相補的相互作用を行う分子であり、よ
り好ましくは最良のフィットを示す分子は試験された分子の内の第８０番目の百
分位数以上にある分子であり、最も好ましくは最良のフィットを示す分子は試験
された分子の内の第９０番目の百分位数以上にある分子である。

【０１１０】 本発明の他の好ましい実施態様は、レセプターＰＴＫ機能の潜在的調節因子を
同定する方法である。その方法にはレセプターＰＴＫの３次元構造の利用が含ま
れる。その方法は（ａ）それに結合した少なくとも１個の化合物、リガンドまた
はリガンドアナログを有する レセプターＰＴＫの３次元表示を修飾する工程で
あって、化合物、リガンドまたはリガンドアナログの３次元表示が原子構造座標
で定義される工程；（ｂ）有利な幾何学的フィットと有利な相補的相互作用を有
する、得られた複合体のコンフォーメーションを決定する工程；および（ｃ）レ
セプターＰＴＫ機能の潜在的調節因子としてレセプターＰＴＫ活性部位と最良の
フィットをする化合物、リガンドまたはリガンドアナログを同定する工程でなる
。

【０１１１】 原子構造座標がリガンドまたはリガンドアナログに結合したＲＰＴＫ細胞外ド
メインの座標であることが好ましい。原子構造座標が、ＦＧＦ、好ましくはＦＧ
Ｆ１またはＦＧＦ２に結合したＲＰＴＫ細胞外ドメイン、好ましくはＦＧＦＲ１
細胞外ドメインの座標であることがより好ましい。原子構造座標が表１または２
に示された座標であることが最も好ましい。

【０１１２】 “修飾する”と言う用語は、少なくとも１個の化学基を置換、欠失または付加
することを言う。化学基のコンピューター表示をコンピューターデータベースか
ら選ぶことができる。

【０１１３】 本発明のまた別な実施態様は、調節因子構築または調節因子検索コンピュータ
ープログラムを、ＲＰＴＫと複合体を形成した化合物、リガンドまたはリガンド
アナログ上で操作することにより、ＲＰＴＫ機能の潜在的調節因子を同定する方
法である。その方法は（ａ）ＲＰＴＫと複合体を形成した少なくとも１個の化合
物、リガンドまたはリガンドアナログの３次元表示を提供する工程であって、化
合物、リガンドまたはリガンドアナログおよびレセプターＰＴＫの３次元表示が
原子構造座標で定義される工程；および（ｂ）化合物、リガンドまたはリガンド
アナログに類似した化合物、リガンドまたはリガンドアナログに対するデータベ
ースを、化合物検索コンピュータープログラムを用いて検索する工程、またはＲ
ＰＴＫと複合体を形成した化合物、リガンドまたはリガンドアナログを、化合物
構築コンピュータープログラムを用いてデータベース由来の類似の構造で置換す
る工程であって、化合物の表示が構造座標で定義される工程でなる。ＵＮＩＴＹ
（商標）（Ｔｒｉｐｏｓ、Ｉｎｃ．）およびＣＡＴＡＬＹＳＴ（商標）（ＭＳＩ
、Ｉｎｃ．）を含め、化合物検索および構築のために数多くの適当なコンピュー
タープログラムが使用できることを、当業者が理解し得ると思われる。

【０１１４】 原子構造座標がリガンドまたはリガンドアナログに結合したＲＰＴＫ細胞外ド
メインの座標であることが好ましい。原子構造座標がＦＧＦ、好ましくはＦＧＦ
１またはＦＧＦ２に結合した、ＦＧＦＲ、好ましくはＦＧＦＲ１細胞外ドメイン
の座標であることがより好ましい。既知の原子構造座標が表１または表２に示さ
れた座標であることが最も好ましい。

【０１１５】 本明細書で用いる“作動する”という用語は、様々なコンピュータープログラ
ムで本明細書に定義された分子の３次元コンフォーメーションを利用することを
言う。

【０１１６】 “類似の化合物”、“類似のリガンド”および“類似のリガンドアナログ”と
いう用語は、レセプターＰＴＫに結合し得る化合物、リガンド、リガンドアナロ
グと類似の幾何学的構造を有する化合物、リガンド、リガンドアナログを言う。
類似の分子は、ＲＰＴＫに結合した、または一度ＲＰＴＫに結合した分子と類似
の化学基を有することができる。類似の化学基はＲＰＴＫと相補性相互作用を行
うことができる。

【０１１７】 “化合物検索コンピュータープログラム”と言う用語は、化合物、リガンドま
たはリガンドアナログのコンピューター表示を、関連する化合物と類似の３次元
構造と類似の化学基を有するコンピューターデータベースから検索するコンピュ
ータープログラムのことである。

【０１１８】 本明細書で用いる“類似の化学構造”と言う用語は、他の分子の少なくとも一
個所と類似の幾何学的構造を共有する、少なくとも１個の化学基を言う。好まし
い実施態様では、類似の化学構造はＲＰＴＫと複合体を形成する分子と類似の幾
何学的構造を共有するか、ＲＰＴＫ構造から取り除かれた分子と類似の化学構造
を共有する。類似の化学構造とは、ＲＰＴＫと複合体を形成した分子との間で行
われる相互作用と類似の、少なくとも１個の相補的相互作用をＲＰＴＫと行う化
学基を言うこともある。

【０１１９】 “構造を置換する”という用語は、ＲＰＴＫと複合体を形成する分子の少なく
とも一部を取り除く、またはＲＰＴＫから取り除かれた分子の一部を取り除き、
破壊された結合を繋いで類似の分子を生成することを言う。

【０１２０】 “化合物構築コンピュータープログラム”と言う用語は、化合物、リガンドま
たはリガンドアナログ中の化学基のコンピューター表示を、コンピューターデー
タベース由来の基に置換するコンピュータープログラムを言う。

【０１２１】 “類似の３次元構造”と言う用語は、ほぼ同等の形状と容積を有する２つの分
子を言う。

【０１２２】 本発明の結晶形と３次元構造を使用する方法は、広い範囲のタンパク質キナー
ゼに関連し得る。従って、好ましい実施態様では、本発明はＲＰＴＫに関する。
ＲＰＴＫはＰＤＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＳＣＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＨＧＦＲ、ニューロ
トロピンＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、インスリンＲ、ＩＧＦＲ、ＳＣＦ
ＩＲ、ＦＬＫ、ＫＤＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＣＣＫ４、ＭＥＴ、ＴＲＫＡ、ＡＸＬ、
ＴＩＥ、ＥＰＨ、ＲＹＫ、ＤＤＲ、ＲＯＳ、ＲＥＴ、ＬＴＫ、ＲＯＲ１、ＭＵＳ
Ｋ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３およびＦＧＦＲ４等のＦＧＦＲファミ
リーのメンバー、またはオルファンレセプターＰＴＫであることが好ましい。

【０１２３】 他の態様では、本発明の特徴は、本発明で開示された方法により同定されたＲ
ＰＴＫ機能の潜在的調節因子である。

【０１２４】 本発明の他の態様は、ＥＰＴＫ機能の潜在的調節因子またはその薬学的に許容
し得る塩、同族体、代謝物、エステル、アミドまたは公知の標準合成法によるプ
ロドラッグである。合成手順は以下に議論される。

【０１２５】 他の実施態様で、本発明の特徴はＲＰＴＫ機能の調節因子を同定する方法であ
る。その方法は（ａ）細胞にＲＰＴＫ機能の潜在的調節因子、リガンド、リガン
ドアナログ、または化合物を投与する工程；（ｂ）ＲＰＴＫの燐酸化のレベルを
潜在的調節因子、リガンド、リガンドアナログまたは化合物を投与しない細胞と
、潜在的調節因子を投与した細胞の間で比較する工程；および（ｃ）レセプター
ＰＴＫ燐酸化のレベルの差に基づき、潜在的調節因子、リガンド、リガンドアナ
ログ、または化合物をＲＰＴＫ機能の調節因子として同定する工程でなる。ＲＰ
ＴＫ機能の調節因子として同定される潜在的調節因子、リガンド、リガンドアナ
ログまたは化合物に必要なＰＴＫ燐酸化の差が、特定のＲＰＴＫ、調節因子の特
異性、ＲＰＴＫ機能と関連する疾患の性質等に依存することを、当業者は理解し
得ると考えられる。

【０１２６】 “細胞”と言う用語は、１次または培養細胞の任意のタイプの細胞を言う。１
次細胞は生物から直接分離されるが、培養細胞は迅速に分裂し、何回も継続して
培養することができる。細胞はフラスコ、皿、ウエルプレートを含むがそれに限
定されない、様々な容器で生育することができる。

【０１２７】 細胞に関連して用いられる“投与する”と言う用語は、潜在的調節因子、リガ
ンド、リガンドアナログまたは化合物を細胞に配送する方法を言う。化合物をジ
メチルスルホキサイド（ＤＭＳＯ）等のキャリアを用いて水溶液中で調製するこ
とができる。化合物を含む水溶液−“水性調製液”とも言う−を細胞層を浸す培
地中に単に混合するか、または細胞自体の中にミクロインジェクトすることがで
きる。化合物を適当な緩衝溶液を用いて細胞に投与してもよい。

【０１２８】 “適当な緩衝溶液”と言う用語は、低濃度で溶液のｐＨを調節することのでき
る塩でなる、化合物の水性調製液を言う。塩が低濃度で存在するので、塩が細胞
の機能を変えないことが好ましい。

【０１２９】 “ＲＰＴＫの燐酸化”と言う用語は、ＲＰＴＫ上に燐酸基が存在することを言
う。ＲＰＴＫ上の燐酸基は、高い親和性で結合する抗体で同定することができる
。

【０１３０】 他の態様では、本発明の特徴はＲＰＴＫ機能の調節因子としてのＲＰＴＫ機能
の潜在的調節因子を同定する方法である。その方法は（ａ）ＲＰＴＫの潜在的調
節因子を細胞に投与する工程；（ｂ）潜在的調節因子を投与していない細胞と、
潜在的調節因子を投与した細胞の間で細胞生育のレベルを比較する工程；および
（ｃ）細胞生育の差に基づいてＲＰＴＫ機能の調節因子としての潜在的調節因子
を同定する工程でなる。

【０１３１】 “細胞の生育”とは、一群の細胞が分裂する速度を言う。細胞分裂速度は当業
者が使用する方法で容易に測定することができる。

【０１３２】 本発明の他の態様はの特徴は、不適切な活性を有するＲＰＴＫを含有する細胞
を同定することによる、病気の診断法である。その方法は（ａ）ＲＰＴＫの調節
因子を細胞に投与する工程；（ｂ）調節因子を投与した細胞と、調節因子を投与
ない細胞との間で細胞生育速度を比較する工程；および（ｃ）細胞生育速度の差
に対する調節因子の効果から、不適切な活性を有するＲＰＴＫを含む細胞を特定
して、病気を診断する工程でなる。調節因子を本発明の方法で同定することがで
きる。

【０１３３】 “不適切な活性”と言う用語は、正常細胞より高い、または低い速度で信号伝
達プロセス中のある段階を調節するＲＰＴＫを言う。信号伝達速度の混乱は、成
長因子によるＲＰＴＫの刺激の変化、ＲＰＴＫ特異性ホスファターゼ活性の変化
、細胞中のＲＰＴＫの過剰発現、またはＲＰＴＫ自体の触媒領域の突然変異で生
じ得る。

【０１３４】 “信号伝達プロセス”と言う用語は、細胞外信号が細胞内信号に伝達される反
応カスケードの段階を言う。

【０１３５】 “ＲＴＰＫ特異性ホスファターゼ”という用語は、特定のＲＰＴＫを脱燐酸化
し、ＲＰＴＫの活性を制御する酵素を言う。

【０１３６】 本発明の他の態様は、有機体細胞中に不適切な活性を有するＲＴＰＫと関連す
る病気を治療する方法である、その方法は（ａ）有機体にＲＴＰＫ機能の調節因
子を投与する工程であって、調節因子は許容し得る医薬製剤である工程；および
（ｂ）ＲＰＴＫの機能を活性化または阻害して病気を治療する工程でなる。

【０１３７】 “有機体”と言う用語は、少なくとも１個の細胞でなる生物を言う。有機体は
真核細胞の様な単純なものから、哺乳動物の様な複雑なものまである。

【０１３８】 ある有機体に関連して“投与する”と言う用語は、化合物を有機体中に導入す
る方法を言う。有機体の細胞または組織が有機体の内部または外部に存在する場
合、その化合物を投与することができる。有機体の外部に存在する細胞を、細胞
培養皿中に維持、またはその中で生育することができる。有機体内部に含まれる
細胞に対しては、経口、皮膚、眼球、皮下および直腸投与を含め（それに限定さ
れないが）、化合物を投与する多くの公知の技術がある。患者の外側の細胞に対
しては、細胞ミクロインジェクション技術、形質転換技術およびキャリア技術を
含め（それに限定されないが）、化合物を投与する多くの公知の技術がある。

【０１３９】 “薬学的に許容し得る組成物”と言う用語は、ＲＰＴＫ活性の調節因子でなる
製剤を言う。化合物を投与した有機体が刺激をほとんど受けない場合、その化合
物は許容し得る。

【０１４０】 本発明の好ましい実施態様では、レセプターＰＴＫはＰＤＧＦＲ、ＳＣＦＲ、
ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＨＧＦＲ、ニューロトロピンＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、
ＨＥＲ４、インスリンＲ、ＩＧＦＲ、ＣＳＦＩＲ、ＦＬＫ、ＫＤＲ、ＶＥＧＦＲ
２、ＣＣＫ４、ＭＥＴ、ＴＲＫＡ、ＡＸＬ、ＴＩＥ、ＥＰＨ、ＲＹＫ、ＤＤＲ、
ＲＯＳ、ＲＥＴ、ＬＴＫ、ＲＯＲＩ、ＭＵＳＫ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２，ＦＧ
ＦＲ３およびＦＧＦＲ４等のＦＧＦＲファミリーのメンバー、およびオルファン
レセプターＰＴＫでなる群から選ばれる。

【０１４１】 上記の問題を解決する手段は非限定的であり、本発明のその他の特徴と利点は
以下の発明の実施の形態、およびクレームで明らかとなる。

【０１４２】図面の簡単な説明 図１はＦＧＦ２と複合体を形成したＦＧＦＲ１ Ｄ２−Ｄ３二量体のリボンダ
イアグラムである。２つの図は垂直軸の回りの約９０°回転で関係付けられる。
Ｄ２およびＤ３ドメインはそれぞれ緑と青で示され、Ｄ２とＤ３を結合する短い
リンカーは灰色で示され、ＦＧＦ２はオレンジで示されている。

【０１４３】 図２はＦＧＦ１と複合体を形成したＦＧＦＲ１ Ｄ２−Ｄ３二量体のリボンダ
イアグラムである。Ｄ２およびＤ３ドメインはそれぞれ緑と青で示され、Ｄ２と
Ｄ３を結合する短いリンカーは灰色で示され、ＦＧＦ１はオレンジで示されてい
る。

【０１４４】 図３はテロキンのＩＧの褶曲と比較した、ＦＧＦＲ１ Ｄ２およびＤ３のＩｇ
の褶曲のトポロジーダイアグラムである。

【０１４５】 図４はヒトＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３およびＦＧＦ４のＤ２−Ｄ３領域の
配列である。

【０１４６】 図５はＦＧＦ１−ＦＧＦ２複合体のリボンダイアグラムを示し、Ｉｇ様ドメイ
ン２（Ｄ２）および３（Ｄ３）はそれぞれ緑とシアンで示される。Ｄ２とＤ３を
結合する短いリンカーはグレーに色付けられている。ＦＧＦ１とＦＧＦ２はオレ
ンジで示される。ＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ２の２次構造配列は、プログラムＰ
ＲＯＣＨＥＣＫ（ラスコウスキ（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ）ら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒ
ｙｓｔ．、２６、２８３−２９１、１９９３）で得られた。Ｄ２およびＤ３のβ
鎖は、カノニカルＩ−セットメンバーであるテロキンに対する分子鎖命名法に従
ってラベルされている。βＡおよびβＡ'、ｇＡ間のヘリックスは３₁₀ヘリック
スである。ＦＧＦ１−ＦＧＦＲ１およびＦＧＦ２−ＦＧＦＲ２の構造の双方では
、Ｄ３中のβＣ−βＣ'ループは無秩序である。さらに、ＦＧＦ１−ＦＧＦＲ１
のＤ３中のβＣ'とβＥ間のほとんどのセグメントも無秩序である。ＦＧＦ２−
ＦＧＦＲ２構造中では、このセグメントの規則性は高く、紫で色付けられている
。アミノおよびカルボキシ末端はＮＴおよびＣＴで示される。Ｄ２およびＤ３中
のジスルフィド結合は、硫黄原子を黄色にして球と棒で示される。ＦＧＦ１のβ
鎖は、公表された命名法に従って１から１２のラベルが付けられている（ファハ
ム（Ｆａｈａｍ）ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ，Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．８、５７
８−５８６、１９９８）。この図はＭｏｌｓｃｒｉｐｔ（クラウリス（Ｋｒａｕ
ｌｉｓ）、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２４、９４６−９５０、１
９９１）およびＲａｓｔｅｒ（メリト（Ｍｅｒｒｉｔ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ．２７７、５０５−５２４、１９９７）プログラムを用いて作成さ
れた。

【０１４７】 図６はＦＧＦ１−ＦＧＦＲ１およびＦＧＦ２−ＦＧＦＲ２複合体の空間充填モ
デルである。Ｄ２、Ｄ３、リンカーおよびＦＧＦの外観と色は図５と同じである
。ＦＧＦおよびＦＧＦＲ上の結合インターフェースを良く見せるため、図の様に
分子を相互に引き離し、垂直軸の回りに９０°回転させた（右と左のパネル）。
残基ＦＧＦ１とＦＧＦ２は、それらが相互作用するＦＧＦＲ領域に関して色が付
けられている。Ｄ２と相互作用するＦＧＦ１およびＦＧＦ２残基は緑、リンカー
領域と相互作用する残基は灰色、Ｄ３と相互作用する領域はシアン色である。β
Ｃ'−βＥと相互作用するＦＧＦＲ２のＦＧＦ２領域（紫で示される）は赤色で
ある。ＦＧＦ１およびＦＧＦ２それぞれと相互作用する残基ＦＧＦＲ１およびＦ
ＧＦＲ２はオレンジ色である。さらに、ＦＧＦ２と接触するβＣ'−βＥセグメ
ント中のレセプター残基であるＦＧＦ２−ＦＧＦＲ２構造は赤色である。少なく
とも１対の原子（側鎖または主鎖）が原子間距離３．８Åを有する場合、リガン
ドとレセプター残基はＦＧＦ−ＦＧＦＲインターフェースにアルト考えられる。
この図はＭｏｌｓｃｒｉｐｔおよびＲａｓｔｅｒ３Ｄプログラムを用いて作成さ
れた。

【０１４８】 図７はＦＧＦ２とＦＧＦＲ２の間の疎水性インターフェース中の詳細な相互作
用の立体図を示す。

【０１４９】 図８はＦＧＦ１とＦＧＦＲ１の間の疎水性インターフェース中の詳細な相互作
用の立体図を示す。

【０１５０】 図９はＤ２−Ｄ３リンカー中のＡｒｇ２５１の近傍のＦＧＦ２とＦＧＦＲ２の
間の保存水素結合ネットワークの詳細な相互作用の立体図を示す。

【０１５１】 図１０はＤ２−Ｄ３リンカー中のＡｒｇ２５０の近傍のＦＧＦ１とＦＧＦＲ１
の間の水素結合ネットワークの詳細な相互作用の立体図を示す。

【０１５２】 図１１はＦＧＦ２−ＦＧＦＲ２構造中のＦＧＦ２とＤ３のβＦ−βＧループ間
のインターフェース中の詳細な相互作用の立体図を示す。各立体図の対の右側に
、立体図中と同じ正確な方位での構造全体の図が示され、関連する領域が強調さ
れている。相互作用する残基の側鎖のみが示される。色付けは図７と同じである
。点線は水素結合を示す。

【０１５３】 図１２はＦＧＦ２−ＦＧＦＲ２構造中の、ＦＧＦ２のＮ−末端配列（β１の前
）とＤ３間のインターフェース中の詳細な相互作用の立体図を示す。図とコード
は図１１と同じである。

【０１５４】 図１３はＦＧＦ２−ＦＧＦＲ２構造中のＦＧＦ２と、βＣ'−βＥセグメント
（紫で示される）の間のインターフェース中の詳細な相互作用の立体図を示す。
図とコードは図１１と同じである。

【０１５５】 図１４はＦＧＦ１−ＦＧＦＲ１構造中のＦＧＦ１とＤ３の間のインターフェー
ス中の詳細な相互作用の立体図を示す。

【０１５６】 図１５はヒトＦＧＦレセプターのＤ２およびＤ２−Ｄ３リンカーのリガンド結
合ドメインの構造に基づく配列を示す。

【０１５７】 図１６はヒトＦＧＦレセプターのＤ３のリガンド結合ドメインの構造に基づく
配列を示す。

【０１５８】 図１７はＣＬＵＳＲＡＬＷプログラム（トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）ら、
Ｎｕｃｌｅｉ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２２、４６７３−４６８０、１９９４）を用い
て行ったＦＧＦの構造に基づく配列を示す。この配列に用いられたＦＧＦの全て
は、ニワトリの配列のみが利用し得るＦＧＦ１５を除いて、ヒト由来である。２
次構造の割り当ては公表された命名法に従い、β鎖は１〜１２にラベルされてい
る（ファハムら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．８、５７８−
５８６、１９９８）。β鎖の位置と長さは配列の一番上に示される。ＦＧＦ残基
は、それらが相互作用するＦＧＦＲ上の領域に関して色が付けられている。Ｄ２
と相互作用するＦＧＦ残基は緑色であり、隣家領域と相互作用する残基はグレー
であり、Ｄ３と相互作用する領域はシアン色である。Ｄ３中のβＣ'−βＥと相
互作用するＦＧＦ残基は赤色である。ピリオドはＦＧＦ２と配列が同じであるこ
とを示す。ダッシュは配列を最適化するために導入されたギャップを示す。ＦＧ
ＦのＣ末端の“ティルディ”は、示された最後のアミノ酸の下流にさらに配列が
あることを示す。星印は番号付けが開始メチオニンから出発しないことを示す。
ＦＧＦ２に対する残基の番号付けはスプリンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）ら、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９、２６８７８−２６８８４（１９９４）に従ってい
る。ＦＧＦ１に対する番号付けはツー（Ｚｈｕ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５１、９
０−９３、１９９１に従っている。チェックマークは、突然変異誘発によりレセ
プター結合が重要であることが示されているＦＧＦ残基を示す。

【０１５９】 図１８は骨格の乱れを引き起こすヒトＦＧＦＲ２遺伝子における突然変異の位
置を示し、ＦＧＦ２−ＦＧＦＲ２構造のリボン表示上にマッピングされている。
残基の側鎖は、置換の形に従って色付けされている。黄色はシスチンを他のアミ
ノ酸で置換、またはその逆であり、対にならないシステインを生じる。赤はＤ３
の３次構造を不安定にすると考えられる突然変異であり、ドメイン間ジスルフィ
ド架橋生成に不都合である。緑はリガンド結合親和性または特異性に影響すると
考えられる突然変異である。

【０１６０】 図１９はＳＣＦの全体構造を示し（クラウリス（Ｋｒａｕｌｉｓ）、Ｊ．Ａｐ
ｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２４、９４６−９５０、１９９１；メリトら、
Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７７、５０５−５２４、１９９１）、他の
サイトカイン殿関係がＳＣＦ構造のリボン表示で示され、二つの図は約９０°の
回転で関係付けられている。末端と２次構造がラベルされ、分子鎖は矢印で、ヘ
リックスはリボンで、ループはチューブで示されている。二回回転軸はダイアモ
ンド印が付けられている。

【０１６１】 図２０はＳＣＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびＩＬ−５の２次構造に基づく配列を示す。
Ｍ−ＳＣＦとＩＬ−５に対する２次構造の割り当てはデータバンク由来である。
β鎖は黄色、ヘリックスは明るい緑で印されている。

【０１６２】 図２１は、モルスクリプト（Ｍｏｌｓｃｒｉｐｔ）およびラスター ３Ｄ（ク
ラウリス、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２４、９４６−９５０、１
９９１；メリトら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７７、５０５−５２４
、１９９１）により作成されたＳＣＦの二量体インターフェースの立体図である
。簡単のため、インターフェースのコアの残基の側鎖のみが示される。２次構造
のコード付けは図１９に用いられたものと同じであり、分子鎖は矢印、ヘリック
スはリボン、ループはチューブで表されている。

【０１６３】 図２２は、二量体インターフェースのＴｙｒ２６およびＡｓｐ２５'の水素結
合サークルに対し、１．２で等高線を描き、Ｏ（ジョーンズら、Ａｃｔａ Ｃｒ
ｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ａ４７，１１０―１１９、１９９１）で作成された２Ｆｏ
−Ｆｃ電子密度を示す。

【０１６４】 図２３はモルスクリプトおよびラスター３Ｄ（クラウリス、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃ
ｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２４、９４６−９５０、１９９１；メリトら、Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７７、５０５−５２４、１９９１）で作成した共有
結合ＳＣＦ二量体のモデルを示す。非共有結合（天然）二量体が左側、共有結合
ＳＣＧに対するモデルが右側である。各プロモーターはオレンジまたは緑色であ
る。ジスルフィド結合は、硫黄原子を黄色にして球と棒で示される。

【０１６５】 図２４はＧＲＡＳＰ（ニコールス（Ｎｉｃｏｌｌｓ）ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ１１
、２８１−２９６、１９９１）で作成された、ｃ−ｋｉｔおよびＳＣＦ：ＳＣＦ
Ｒ複合体に対するＳＣＦ上の潜在的結合部位を示す。２つの図で約９０°の回転
で関係付けられたＳＣＦの分子表面、および提案されたｃ−ｋｉｔ結合領域が示
される。双方の末尾の疎水性裂け目は黄色になっている。２つの塩基性パッチは
青色、酸性パッチは赤色である。

【０１６６】 図２５はヒト、ラット、マウス、イヌおよびブタＳＣＦの配列を示す。酸性パ
ッチの残基は赤色、２つの塩基性パッチの残基は青色である。星印はげっ歯類で
変化するアミノ酸残基を印すものである。２次構造は配列の下にヘリックスを示
す‘Ｈ’、およびβ鎖を示す‘Ｅ’で印が付けられている。

【０１６７】 図２６はＧＲＡＳＰ（ニコールスら、Ｐｒｏｔｅｉｎ １１、２８１−２９６
、１９９１）で作成した、ｃ−ｋｉｔの細胞外ドメインのＩｇ様ドメインを有す
る複合体中の、ＳＣＦの提案されたモデルを示す（Ｄ２からＤ５で印される）。
ＳＣＦ二量体はウォームモデルで表され、ｃ−ｋｉｔモデルは分子表面で表され
ている。

【０１６８】 図２７はＦＧＦ２−ＦＧＦＲ１複合体の前もって生成した結晶中へ浸透したジ
サッカライドの電子密度マップを示し、二量体集合中のデカサッカライドの位置
を示す。Ｄ２ｓ（シアン色）およびＦＧＦ（オレンジ色）のＣαトレースのみが
示される。セカサッカライドは白い棒で示される。

【０１６９】 図２８は原子モデルから除かれたデカサッカライドによる仮想アニーリング後
に計算された、図２７に示されたＦＧＦ２−ＦＧＦＲ１複合体のＦｏＦｃ電子密
度マップの立体図を示す。マップは３．０Åの解像度で計算され、１．８σで等
高線を引いた。糖リングはデカサッカライドの非還元末端〜出発して、ＡからＨ
で印されている。原子の色は以下の通りである：酸素−赤、硫黄−黄色、窒素−
青、炭素−グレー。この図はボブスクリプト（Ｂｏｂｓｃｒｉｐｔ：エスナウフ
（Ｅｓｎｏｕｆ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈ．Ｍｏｄｅｌ．１５、１３２−１３
４、１９９７）を用いて作成された。

【０１７０】 図２９は規則的なデカサッカライドリング（Ａ−Ｆ）、ＦＧＦおよびＦＧＦＲ
間の詳細な相互作用の立体図を示す。相互作用する残基の側鎖のみが示されてい
る。隣り合ったＦＧＦＲの２個のＤ２はそれぞれシアンと緑で色付けられている
。原子の色付けは図２７と同じである。ＦＧＦＲ中の炭素原子はそれが属するＤ
２と同じ色である。点線は水素結合を表す。

【０１７１】 図３０は３成分複合体中の、デカサッカライド（ヘパリン）と、ＦＧＦおよび
ＦＧＦＲの間の相互作用を示す概略図である。関係する官能基と、相互作用する
アミノ酸の骨格のみが示されている。ダッシュ付き線は水素結合を表す。ヘパリ
ンの糖リングは、非還元末端から出発してＡからＦで印されている。ヘパリンの
骨格炭素原子はＩＵＰＡＣ命名法に従って番号が付けられている。相互作用する
残基のタイプと番号は、それが属する分子を基に色が付けられている。

【０１７２】 図３１はセファデックス２００カラム（ファルマシア）による、様々な比率で
均一に硫酸化されたヘキササッカライドと精製１：１ＦＧＦ１−ＦＧＦＲ２複合
体の１組の混合物に対する、二量体生成の分離の結果を示す。以下の反応混合物
が用いられた：Ａ、対照（ヘキササッカライドを加えず）；Ｂ、モル比０．５：
１のヘキササッカライド：ＦＧＦ１−ＦＧＦＲ２複合体；Ｃ、モル比１：１のヘ
キササッカライド：ＦＧＦ１−ＦＧＦＲ２複合体；Ｄ、モル比２．８５：１のヘ
キササッカライド：ＦＧＦ１−ＦＧＦＲ２複合体。モノマーと二量体の位置はそ
れぞれ“Ｍ”および“Ｄ”で示されている。“Ｔ”はモノマー２成分複合体（ヘ
キササッカライド：ＣＧＦ１：ＣＧＦＲ２＝１：１：１）の位置を示す。“Ｌ”
は遊離ＦＧＦ１の位置を示す。

【０１７３】 図３２は二量体ＦＧＦ２−ＦＧＦＲ１−ヘパリン３成分複合体の“２末端”モ
デルの分子表面の表現を示す。図は先端（図２７と同じ図）からヘパリン結合峡
谷を見下ろしている。ＦＧＦ２表面はオレンジ、Ｄ２は緑で示される。デカサッ
カライドの最初の６個の糖リングのみが球と棒で示され、非還元および還元末端
がラベルされている。

【０１７４】 図３３はコンピューターに基づくシステムの概略図であり、ＲＰＴＫ、そのリ
ガンドおよび関連する複合体等の表示、研究、比較、扱い、分子構造の結晶学解
析由来のデータの解釈および／または外插に用いることができる。

【０１７５】座標の簡単な説明 結晶構造の座標が“実施例”の最後、クレームの前に置かれている。表１はＸ
線結晶学で決定した、本発明のＦＧＦ２と複合体を形成したＦＧＦＲ１−Ｄ２−
Ｄ３の結晶の原子構造座標を提供する。表２はＸ線結晶学で決定した、本発明の
ＦＧＦ１と複合体を形成したＦＧＦＲ１−Ｄ２−Ｄ３の結晶の原子構造座標を提
供する。表４はＳＣＦ（１−１４１）非共有結合ホモ二量体の結晶の原子構造座
標を提供する。表６は二量体ＦＧＦ２：ＦＧＦＲ１：ヘパリン＝２：２：２の３
成分複合体の結晶の原子構造座標を提供する。 表中のカラム（左から右）は番号と数による原子、アミノ酸と原子を含む数、
ｘ座標、ｙ座標、ｚ座標、結合性、および温度因子を記す。これらのパラメータ
ーは全て、当業界で十分に定義されている。

【０１７６】発明の詳細な説明 本発明の目的はレセプタータンパク質チロシンキナーゼの３次元構造の決定と
使用である。レセプターＰＴＫの３次元構造はレセプターＰＴＫの機能の設計と
調節を促進することができる。

【０１７７】 タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）は大きい様々なクラスの酵素を含む（
シュレシンガーおよびウルリッヒ、Ｎｅｕｒｏｎ９：３８３−３９１）。ＰＴＫ
ファミリーはレセプターであるメンバーと、レセプターでないメンバーに小分類
することができる。レセプターＰＴＫ（ＲＰＴＫ）ファミリーは複数のサブファ
ミリーを含み、その一つは、血管形成得の他、増殖と分化に関係する繊維芽細胞
成長因子レセプター（ＦＧＦＲ）ＰＴＫである。ギボル（Ｇｉｖｏｌ）およびヤ
ヨン（Ｙａｙｏｎ）、１９９２、ＦＡＳＥＢ Ｊ．６（１５）：３３６２−３３
６９。

【０１７８】 ＦＧＦＲ１からＦＧＦＲ４は、高い親和性で繊維芽細胞成長因子と結合する能
力のため、“高親和性ＦＧＦＲ”として知らている。これらの高親和性ＦＧＦＲ
は、１個の膜横断ヘリックスと、チロシンキナーゼ活性を含む細胞質ドメインで
ある３個の免疫グロブリン（ＩＧ）様ドメイン（Ｄ１からＤ３）でなる細胞外リ
ガンド結合ドメインが特徴である。リー（Ｌｅｅ）ら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ、２４５：５７−６０；ジャイ（Ｊａｙｅ）ら、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．２２７：８４０−８５１；ジョンソンおよびウィリアム、１９９３、Ａｄ
ｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６０：１−４１参照。ＦＧＦＲはその少なくとも１
個の信号伝達プロセスにおける役割により、細胞機能を媒介することができる。
細胞信号伝達プロセスは、細胞外信号を細胞内信号に変換する複数の工程のカス
ケードでなる。

【０１７９】 ＲＰＴＫ媒介信号伝達は、特定の細胞外リガンドが細胞外ドメインに結合する
ことで開始され、次いでレセプターの二量体化、ＲＰＴＫの自己燐酸化が行われ
る。好ましいリガンドは表皮成長因子、インスリン、血小板由来成長因子、血管
内皮成長因子、繊維芽成長因子、血液細胞成長因子、およびニューロトロピンで
ある。ＦＧＦサブファミリーはＦＧＦＲおよびＨＳＰＧに結合する約１８のメン
バー、すなわちＦＧＦ１からＦＧＦ１８を含む。当業者は現在未知のＦＧＦサブ
ファミリーのメンバーを、既知のサブファミリーメンバーと相同の配列により、
および／または共通のタンパク質の褶曲部の存在により同定することができる。
４個の高親和性ＦＧＦＲがＦＧＦの特定のサブセットに結合する。オルニッツら
、１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１５２９２−１５２９７。

【０１８０】 一度ＲＰＴＫが自己燐酸化されると、燐酸基が細胞間信号伝達分子の結合部位
となり、それが細胞膜でのタンパク質複合体の生成を引き起こす。これらの複合
体は、反応の、カスケードを開始するリガンドに応答して適当な細胞効果（例え
ば細胞分裂、細胞外ミクロ環境への代謝効果）を促進する。

【０１８１】 ＲＰＴＫはいくつかの細胞内タンパク質の結合部位として機能する。細胞内Ｒ
ＰＴＫ結合タンパク質は（１）商売ドメインに含まれるタンパク質と（２）この
様なドメインはないが、アダプターとして働き、触媒的に活性名分子と会合する
タンパク質の２つの主なグループに分けられる。ソンヤング（Ｓｏｎｇｙａｎｇ
）ら、１９９３、Ｃｅｌｌ ７２：７６７−７７８。ＳＨ２（ｓｒｃ同族体）ド
メインは、ＲＰＴＫに結合するタンパク質に見出される普通のアダプターである
。ＳＨ２ドメインは上記の二つのグループのＲＰＴＫ結合タンパク質を含んでい
る。ファントル（Ｆａｎｔｌ）ら、１９９２、Ｃｅｌｌ６９：４１３−４２３；
ソンヤングら、１９９４、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４：２７７７−２７
８５；ソンヤングら、１９９３、Ｃｅｌｌ ７２：７６７−７７８；コッホら、
１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：６６８−６７８。

【０１８２】 ＲＰＴＫとその結合タンパク質のＳＨ２ドメインの間の相互作用の特異性は、
燐酸化チロシン残基を直接取り囲むアミノ酸残基で決められる。ＳＨ２ドメイン
の結合親和性の差は、信号伝達プロセスにおける下流分子の基質燐酸化能におけ
る観測される差と関連付けられる。ソンヤングら、Ｃｅｌｌ ７２：７６７−７
７８。これらの観察は、各ＲＰＴＫの機能がその発現と利用できるリガンドばか
りでなく、特定のレセプターで活性化される下流信号伝達経路の配列によっても
決定されることを示唆している。従って、ＲＰＴＫは自己燐酸化の結果として信
号伝達プロセスで制御規制の法則を提供する。

【０１８３】 ＲＰＴＫ媒介信号伝達は細胞における細胞増殖、分化および代謝反応を制御す
る。従って、不適切なＲＰＴＫ活性は広範囲の不調と疾病を生じる結果となる。
いかに説明するこれらの疾病は、本明細書に開示された方法により指定されるか
同定されるＲＰＴＫ機能の調節因子で治療し得る。

【０１８４】 本発明はまた、レセプターチロシンキナーゼの細胞外ドメインに対応する結晶
性ポリペプチドに関する。この様なレセプターチロシンキナーゼは共有結合で架
橋されず、リガンド誘発二量体化を行うと理解されている。結晶性細胞外ドメイ
ンは約１．５Åから約３．０Å、最も好ましくは約２．８Åの３次元Ｘ線回折構
造が可能であるに十分な品質せあることが好ましい。本発明はまた、ポリペプチ
ドを調製し結晶化する方法を提供する。ポリペプチド自体、およびその結晶構造
から導かれる情報を、チロシンキナーゼ活性を解析し修飾すると同時に、細胞外
ドメインと相互作用する化合物を同定するために用いることができる。

【０１８５】 本発明のポリペプチドは、リガンド結合ドメインを含むＲＰＴＫの細胞外ドメ
イン中の領域の構造に基づいて設計されることが最も好ましい。図４は、ヒトＦ
ＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３およびＦＧＦＲ４のリガンド結合Ｄ２−Ｄ３
ドメインのアミノ酸配列を示す。出願人らは、得られるポリペプチドの結晶化に
必用な細胞外ドメインの境界を発見し決定した。驚くべきことに、境界は全リガ
ンド結合能と特性をほぼ維持するＦＧＦＲ１の天然起源突然変異体にきわめて類
似している。ジョンソンら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９０、１０：
４７２８−４７３６参照。

【０１８６】 得られた結晶構造は、２個のＦＧＦＲ１ Ｄ２−Ｄ３ドメインでなり、それぞ
れがＦＧＦ分子に結合した単位格子で構成される。二量体構造は２個のドメイン
間の相互作用と、二量体の一方のメンバー中のＦＧＦ分子と、二量体の他のメン
バーのＤ２ドメイン間尾相互作用で安定化される。結晶中の二量体構造を安定化
するこれらの接触は、生体内でＦＧＦＲ１の二量体化と活性化をもたらす接触と
類似しているか同一であると信じられている。従って、本発明の結晶構造は、リ
ガンドで誘起されるＲＰＴＫの二量体化と活性化に導く反応の詳細な観点を初め
て提供するものである。

【０１８７】 結晶構造はまた、二量体化と活性化における細胞外ドメインのアシッドボック
ス領域に対する可能な役割を開示する。アシッドボックスはＤ１とＤ２の間のリ
ンカー中の酸性残基が連続的に伸びている部分である。本発明の結晶構造から推
論されるモデルは、アシッドボックスが、結合のためにＤ２のヘパリン結合部位
領域と相互作用し得ることをほのめかしている。驚くべきことに、これらのモデ
ルは、アシッドボックス／Ｄ２相互作用により、ＦＧＦがなくてもヘパリン誘起
二量体化とＦＧＦＲ１の活性化を可能にすることを暗示している。

【０１８８】 原子レベルで二量体化と活性化を理解することは、ＲＰＴＫ機能の調節因子、
例えばレセプター／リガンド結合または二量体間の接触を妨害に寄与する分子の
設計を可能にする。この様な調節因子は、様々なＲＰＴＫ疾患に対する有用な治
療を提供すると考えられる。

【０１８９】 Ｉ．ＰＴＫ関連疾病 ＰＴＫ関連疾病には血管増殖疾患、繊維症、および糸球体間質細胞増殖疾患が
あるが、それに限られるものではない。血管増殖疾患とは、 一般的に血管の異
常増殖を伴う脈管形成および小脈管形成病を言う。血管の生成と広がりは、胚発
育、黄体生成、外傷回復、および器官再生等の様々な生理学的過程に重要な役割
を演じる。それらはまた、癌、例えばカポシ肉腫の発達に中心的な役割を果たす
。血管増殖疾患の他の例には新しい毛細血管が間接に侵入し、軟骨を破壊する関
節炎、網膜中の新しい毛細血管が水晶体に侵入し、出血し失明を引き起こす糖尿
性網膜症等の眼病、および中枢神経系の網膜血管腫、血管芽細胞腫になり易い形
質が特徴であるホンヒッペルリンダウ病（ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ
Ｄｉｓｅａｓｅ：ＶＨＬ）、網膜細胞肉腫、褐色細胞腫、および膵臓の小島細胞
腫瘍が含まれる。反対に、血管の収縮、縮小または閉塞に関連する疾病は、最狭
窄等の疾病に関連している。

【０１９０】 繊維症とは、細胞外マトリックスの異常形成を言う。繊維症の例には肝硬変お
よび糸球体間質細胞増殖疾患が含まれる。肝硬変は肝臓に障害を残す細胞外マト
リックスの形成が特徴である。肝硬変は肝臓の硬化等の病気を引き起こす。肝臓
に障害を生じる結果となる細胞外マトリックスの増加は、肝炎等のウイルス感染
でも引き起こされる。

【０１９１】 糸球体間質細胞増殖疾患は糸球体間質細胞の異常増殖で生じる病気である。糸
球体間質増殖病には糸球体腎炎、糖尿病ネフロパシー、悪性腎硬、血栓性微少血
管障害症候群、移植拒絶、および糸球体症等の様々なヒトの腎臓病が含まれる。
ＰＤＧＦ−Ｒが糸球体間質細胞増殖の維持に関係してる。フロージ（Ｆｌｏｅｇ
ｅ）ら、１９９３、Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ４３：４７Ｓ−
５４Ｓ。

【０１９２】 ＲＰＴＫは上記の細胞増殖疾患と関連している。例えば、 ＥＧＦＲ（ツジ（
Ｔｓｕｚｉ）ら、１９９１、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６３：２２７−２３３；
トープ（Ｔｏｒｐ）ら、１９９２、ＡＰＭＩＳ １００；７１３―７１９）、Ｈ
ＥＲ２／ｎｅｕ（スラモン（Ｓｌａｍｏｎ）ら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
４４：７０７−７１２）およびＰＤＦＧＦ（クマベ（Ｋｕｍａｂｅ）ら、１９９
２、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ７：６２７−６３３）等のＲＰＴＫファミリーのあるメ
ンバーは多くのの腫瘍で過剰発現する、および／またはオートクラインループで
継続的に活性化される。事実、ＲＰＴＫ過剰発現（アクバサク（Ａｋｂａｓａｋ
）およびスーナー−アクバサク（Ｓｕｎｅｒ−Ａｋｂａｓａｋ）ら、Ｊ．Ｎｅｕ
ｒｏｌ．Ｓｃｉ．１１１：１１９−１３３；ディクソン（Ｄｉｃｋｓｏｎ）ら、
１９９２、Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｒｅｓ．６１：２４９−２７３；
コーク（Ｋｏｒｃ）ら、１９９２、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：１３５
２−１３６０）およびオートクラインループの刺激（リー（Ｌｅｅ）およびドノ
グー（Ｄｏｎｏｇｈｕｅ）、１９９２、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１８：１０
５７−１０７０；コークら、上記；アクバサクおよびスーナーアクバサクら、上
記）は最も普通で重症の癌の原因である。例えば、ＥＧＤＲは偏平細胞癌腫、星
状細胞腫、グリア芽細胞腫、頭部および頚部癌、肺癌および膀胱癌に関係してい
る。ＨＥＲ２は乳癌、卵巣癌、胃癌、肺癌、腎臓癌および膀胱癌に関係してる。
ＰＤＧＦＲはグリア芽細胞腫、肺癌、卵巣癌および前立腺癌に関係している。Ｒ
ＰＴＫｃ−ｍｅｔは一般に肝臓癌発生に関係し、従って肝細胞癌腫に関係してい
る。さらに、ｃ−ｍｅｔは悪性腫瘍生成とリンクしている。特に、ｃ−ｍｅｔは
とりわけ甲状腺癌、膵臓癌および胃癌、白血病およびリンパ腫と関係づけられて
いる。さらに、ｃ−ｍｅｔ遺伝子の過剰発現はホジキン病、バーキット病および
リンパ腫細胞株中で検出されている。

【０１９３】 ＩＧＦ−Ｉ ＲＰＴＫは、栄養補給とＩＩ型糖尿病に関連するに加えて、いく
つかのタイプの癌と関係している。例えば、ＩＧＦ−Ｉはいくつかの腫瘍タイプ
、例えばヒト乳癌細胞（アルテアガ（Ａｒｔｅａｇａ）ら、１９８９、Ｊ．Ｃｌ
ｉｎ．Ｉｎｖｅｔｓ．８４：１４１８−１４２３）および小肺腫瘍細胞（マッコ
ーレー（Ｍａｃａｕｌｅｙ）ら、１９９０、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：２５
１１−１５１７）に対するオートクライン成長刺激因子と考えられている。さら
に、神経系の正常な生育と分化に密接に関連するＩＧＦ−Ｉはヒト神経膠腫のオ
ートクライン刺激因子であると思われる。サンドベルグ−ノルトクビスト（Ｓａ
ｎｄｂｅｒｇ−Ｎｏｒｄｑｖｉｓｔ）ら、１９９３、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５
３：２４７５―２４７８。細胞増殖におけるＩＧＦ−ＩＲとその調節因子の重要
性は、培養中の多くの細胞（繊維芽細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、Ｔ−リンパ球
、骨髄球、軟骨細胞、骨芽細胞、骨髄の幹細胞）がＩＧＦ−Ｉで刺激されて生育
すると言う事実でさらに支持される。ゴールドリング（Ｇｏｌｄｒｉｎｇ）およ
びゴールドリング、１９９１、Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ
ｉｏｎ Ｉ：３０１―３２６。一連の最近の文献は、ＩＧＦ−ＩＲが形質転換の
機構に中心的な役割を果たし、このため、広い範囲のヒトの悪性疾患の治療介在
の好ましい標的となり得る。バーセルガ（Ｂｅｒｓｅｒｇａ）、１９９５、Ｃａ
ｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：２４９―２５２；バーセルガ、１９９４、Ｃｅｌｌ ７
９：９２７−９３０；コッポラ（Ｃｏｐｐｏｌａ）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉ
ｏｌ．１４：４５８８―４５５９。

【０１９４】 しかしながら、ＲＰＴＫの異常と病気の関わり合いは癌に限られない。例えば
、ＲＰＴＫは乾せん、真性糖尿病、傷の治療、炎症および神経縮退疾患等の代謝
病と関係している。ＥＧＦＲは角膜および傷の治療で示される。インスリンＲお
よびＩＧＦＩＲの欠陥は、II型真性糖尿病で示される。特定のＲＰＴＫとその治
療効果の間のより完全な相関は、プロウマン（Ｐｌａｕｍａｎ）ら、１９９４、
ＤＮ＆Ｐ ７：３３４−３３９に示されている。

【０１９５】 本発明の目的の一部は、栄養源を切り離すことにより腫瘍を直接殺すことので
きるＲＰＴＫ機能の調節因子を設計することである。正常な血管形成および脈管
形成は、芽細胞発育、傷の治療、器官再生、および排卵および妊娠後の子宮発育
中の黄体中の卵胞発育等の女性の再生プロセス等の様々な生理プロセスに重要な
役割を果たす。フォルクマン（Ｆｏｌｋｍａｎ）およびシン（Ｓｈｉｎｇ）、１
９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．２６７：１０９３１−３４。し
かしながら、多くの疾病は持続的な規制されない、または不適切な管脈形成で促
進される。例えば、関節炎では、新しい毛細血管が間接に侵入し、軟骨を破壊す
る。糖尿病では、網膜中の新しい毛細血管が水晶体に侵入し、出血し失明させる
。フォルクマン、１９８７、Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｆ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａ
ｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ （フェルストレーテ（Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ）ら
編集）、Ｌｅｕｖｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｅｕｖｅｎ、５８
３−５９６頁。眼球の管脈新生は失明の最も普通の原因であり、約２０種の眼病
で見られる。

【０１９６】 さらに、血管形成および／または管脈形成は悪性固形癌および転移に関係し得
る。腫瘍自体が成長するためには、腫瘍は新しい毛細血管の成長を刺激し続けな
ければならない。その上、腫瘍に埋め込まれた新しい血管は腫瘍細胞が循環系に
入り、体の中の離れた部位に転移する通路となる。フォルクマン、１９９０、Ｊ
．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８２：４−６；クラグスブルン（Ｋｌａ
ｇｓｂｒｕｎ）およびソーカー（Ｓｏｋｅｒ）、１９９３、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ３：６９９−７０２；フォルクマン、１９９１、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８２：４―６；ヴァイドナー（Ｗｅｉｄｎｅｒ）ら、１
９９１、Ｎｅｗ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２４：１−５。

【０１９７】 生体外で上皮細胞成長促進活性を有するいくつかのポリペプチドが同定されて
いる。それらの例には酸性および塩基性繊維芽成長因子（αＦＧＦ、βＦＧＦ）
、血管上皮成長因子（ＶＥＧＦ）および子宮成長因子が含まれる。αＦＧＦおよ
びβＦＧＦと異なり、ＶＥＧＦは最近、上皮細胞特異性細胞分裂誘起物質である
ことが報告されている。フェララ（Ｆｅｒｒａｒａ）およびヘンツェル（Ｈｅｎ
ｚｅｌ）、１９８９、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ
．１６１：８５１−８５８；ヴァイスマン（Ｖａｉｓｍａｎ）ら、１９９０、Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１９４６１−１９５６６。

【０１９８】 従って、ＦＧＦまたはＶＥＧＦに結合する特異的レセプターの同定は、上皮細
胞増殖制御の理解に重要である。ｆｌｔ−１レセプター（シブヤ（Ｓｈｉｂｕｙ
ａ）ら、１９９０、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ５：５１９−５２４；ドフリース（Ｄｅ
Ｆｒｉｅｓ）ら、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５５：９８９−９９１）およびＵ
Ｓ特許番号０８／１１９３、８２９で議論されたＫＤＲ／ＦＬＫ−Ｉレセプター
ＶＥＧＦＲ２の、高い親和性でＶＥＧＦを結合する２つの関連するレセプターＰ
ＴＫが同定されている。さらに、ＦＧＦに結合するレセプターが同定されている
（ジャイら、１９９２、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｃｔａ １１３５：１８５−１９９
）。従って、これらのＲＰＴＫは上皮細胞増殖を制御する可能性が高い。

【０１９９】 ＦＧＦＲは脈管形成、傷の治療、芽細胞発育および悪性形質転換に重要な役割
を果たす。バシリコ（Ｂａｓｉｌｉｃｏ）およびモスカテリ（Ｍｏｓｃａｔｅｌ
ｌｉ）、１９９２、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：１１５−１６５。４
種の高親和性哺乳動物ＦＧＦＲ（ＦＧＦＲ１−４）が記述され、細胞外ドメイン
内の別なＲＮＡスプライシングによりさらに多様性を生じる。ジャイら、１９９
２、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１３５：１８５−１９９。
他のＰＲＴＫと同様、ＦＧＦレセプターの二量体化がその活性かに必須である。
可溶性または細胞表面結合ヘパリン硫酸プロテオグリカンはＦＧＦと協調して機
能し、細胞質ドメイン内の特異性チロシン残基の自己燐酸化をもたらす二量体化
を誘発する（シュレシンガーら、１９９５、Ｃｅｌｌ ８３：３５７−３６０）
。モハマディ（Ｍｏｈａｍｍａｄｉ）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１６：
９７７−９８９。

【０２００】 ３種のヒトＦＧＦレセプター遺伝子ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２およびＦＧＦＲ３
の突然変異が、様々なヒト遺伝骨格不全に関係している。ＦＧＦＲ１およびＦＧ
ＦＲ２の突然変異は、頭蓋平坦骨の早期融合を招き、アペルト（Ａｐｅｒｔ：Ｆ
ＧＦＲ２）（ウィルキー（Ｗｉｌｋｉｅ）ら、１９９４、Ｎａｔ．Ｇｎｅｎｅｔ
。８：２６９−２７４）、ファイファー（Ｐｆｅｉｆｅｒ：ＦＧＦＲ１およびＦ
ＧＦＲ２）（ミュエンケ（Ｍｕｅｎｋｅ）ら、１９９４、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ。
８：２６９−２７４）、ジャクソン−ワイス（Ｊａｃｋｓｏｎ−Ｗｅｉｓｓ；Ｆ
ＧＦＲ２）（ヤブス（Ｊａｂｓ）ら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．８：２７５−２７９
）およびグローゾン（Ｇｒｏｕｚｏｎ：ＦＧＦＲ２）（ヤブスら、１９９４、Ｎ
ａｔ．Ｇｅｎｅｔ．８：２７５―２７９）症候群等の頭蓋骨融合症候群を引き起
こす。対照的に、ＦＧＦＲ３の突然変異は長骨不全と関係し、軟骨形成不全（シ
ャン（Ｓｈｉａｎｇ）ら、１９９４、Ｃｅｌｌ ７８：３３５−３４２）、低軟
骨形成症（ベルス（Ｂｅｌｌｉｓ）ら、１９９５、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１０：
３５７−３５９）および新生児致死恐怖異形成症（タボルミナ（Ｔａｖｏｒｍｉ
ｎａ）ら、１９９５、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．９：３２１−３２８）を含む小人症
のいくつかの臨床的に関連する形態を生じる。これらの突然変異がＦＧＦＲ３の
チロシンキナーゼ活性の構成活性化をもたらすことが示されている（ウエブスタ
ー（Ｗｅｂｓｔｅｒ）ら、１９９６、ＥＭＢＯ Ｊ．１５：５２０−５２７）。
さらに、マウスにおける遺伝子を標的にした実験から、ＦＧＦＲ３の骨の発育生
成に対する基本的な役割が明らかにされた（デング（Ｄｅｎｇ）ら、１９９６、
Ｃｅｌｌ ８４：９１１−９２１）。

【０２０１】 生体外でＦＧＦに対し提案された他の主な役割は、脈管形成の誘導である（フ
ォルクマンおよびクラーグスブルン（Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ）、１９８７、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２３６：４４２）である。従って、ＦＧＦの不適切な発現、またはチ
ロシンキナーゼ活性の異常機能は、糖尿性網膜症、リューマチ性関節炎、アテロ
ーム性硬化症および管脈新生等のいくつかのヒト管脈形成病理に寄与すると考え
られる（クラーグスブルンおよびエーデルマン（Ｅｄｅｌｍａｎ）、１９８９、
Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｒｏｓｉｓ）９：２６９。さらに、ＦＧＦは悪性形質転換
に関与していると考えられている。実際、ｉｎｔ−２、ＦＧＦ５およびｈｓｔ−
１／ｋ−ｆｇｆの３種のＦＧＦ相同体をコードする遺伝子が最初に癌遺伝子とし
て単離された。さらに、ＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ２をコードするｃＤＮＡがい
くつかの乳癌で増幅される（アドナン（Ａｄｎａｎｅ）ら、１９９１、Ｏｎｃｏ
ｇｅｎｅ ６：６５９−６６３）。ＦＧＦレセプターの過剰発現もヒト膵臓癌、
星状細胞腫、唾液腺アデノ肉腫、カポシ肉腫、卵巣癌および前立腺癌で検出され
ている。

【０２０２】 米国同時係属出願番号０８／１９３、８２９に示された開示等の事実は、ＶＥ
ＧＦが上皮細胞増殖に関わるばかりでなく、正常および病的脈管形成の主要な調
節因子であることを強く示唆している。一般論としてクラグスブルンおよびソー
カー、１９９３、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：６９９−７０３；フック
（Ｈｏｕｃｋ）ら、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２６０３１−
２６０３７参照。さらに、ＫＤＲ／ＦＬＫ−１およびｆｌｔ−１が成長しつつあ
る腫瘍の増殖中の上皮細胞で多量に発現するが、周囲の休止中の上皮細胞中では
発現しないことが示されている。プレート（Ｐｌａｔｅ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３
５９：８４５−８４８；スベイキ（Ｓｗｅｉｋｉ）ら、１９９２、Ｎａｔｕｒｅ
３５９：８４３−８４５。

【０２０３】 本発明の目的は、臨床疾患と関係するＲＰＴＫの不適切な活性を変化させ得る
ＲＰＴＫ機能の調節因子を設計し同定することである。 ＲＰＴＫ機能の調節因
子の合理的な設計と同定は、ＲＰＴＫ３次元構造を定義する構造座標を利用して
達成される。

【０２０４】 II．疾病の治療薬としてのＰＴＫ機能調節因子 上で議論した疾病の結果、生物医学界の科学者は不適切なＲＰＴＫ活性に関連
する信号伝達経路を調節するＲＰＴＫ機能の調節因子を探索している。

【０２０５】 細胞膜を横断し、酸性の環境内で加水分解しないＲＰＴＫ機能の小分子調節因
子のいくつかが同定されている。例えば、ビス単環式、二環式およびアリール化
合物（ＰＣＴ ＷＯ９２／２０６４２）、ビニレンアザインドール誘導体（ＰＣ
Ｔ ＷＯ９４／１４８０８）、１−シクロプロピル−４−ピリジルキノン（US特
許Ｎｏ．５、３３０、９９２）、スチリル化合物（ＵＳ特許Ｎｏ．５、２１７、
９９９）、スチリル置換ピリジル化合物（ＵＳ特許Ｎｏ．５、３０２、６０６）
、いくつかのキナゾリン結う動体（ＥＰ出願Ｎｏ．０５６６２６６Ａ１）、セレ
オインドールおよびセレナイド（ＰＣＴ ＷＯ９４／０３４２７）、トリサイク
リックポリヒドロキシ化合物（ＰＣＴ ＷＯ９２／２１６６０）およびベンジル
ホスホン酸化合物（ＰＣＴ ＷＯ９１／１５４９５）がＲＰＴＫ阻害剤として記
載されている。

【０２０６】 いくつかのＲＰＴＫ機能調節因子が知られているが、これらの多くはＲＰＴＫ
サブファミリーに特異的でなく、従って治療薬として様々な副作用を引き起こす
。しかしながら、オキシインドリノン／チオインドリノンファミリーのいくつか
の化合物はＦＧＦレセプターサブファミリーに特異的であると信じられている（
ＵＳ特許出願番号０８／７０２、２３２、１９９６年８月２３日出願、発明者タ
ン（Ｔａｎｇ）ら、“インドリノンコンビネーショナルライブラリーおよび関連
化合物、および疾病治療法”）。さらに、オキシインドリノン／チオインドリノ
ンファミリーの化合物は酸性条件で非加水分解性であり、生体適合性が高い。し
かしながらＲＰＴＫ機能のこれらの調節因子はＦＧＦＲサブファミリーの触媒ド
メインを標的にしており、従って細胞外ドメイン中の相互作用によるレセプター
ＲＰＴＫ二量体化および活性化に直接影響することを目的としていない。

【０２０７】 III．結晶性チロシンキナーゼ 本発明の結晶性ＲＰＴＫには天然型の結晶、誘導体結晶および共結晶が含まれ
る。本発明の天然型結晶は一般に実質的に純粋な、結晶形中のＲＰＴＫの細胞外
ドメインに対応するポリペプチドでなる。好ましい実施態様では、本発明の結晶
はリガンドとの複合体中のＲＰＴＫの細胞外ドメインに対応するポリペプチドで
なる。

【０２０８】 本発明の結晶性細胞外ドメインは天然起源または天然型の細胞外ドメインに限
定されないことを理解する必要がある。実際、本発明の結晶には天然型細胞外ド
メインの突然変異体も含まれる。天然型細胞外ドメインの突然変異体は、天然型
細胞外ドメインの少なくとも１個のアミノ酸残基を異なったアミノ酸残基で置換
する、または天然型ポリペプチド中のアミノ酸残基またはＮ−またはＣ−末端を
取り除くことで得られ、実質的に突然変異体が誘導された天然型細胞外ドメイン
と同じ３次元構造をを有する。

【０２０９】 同様に、細胞外ドメインがリガンドに結合しているある実施態様では、本発明
の結晶は天然型細胞外ドメインの突然変異体と突然変異リガンドを含む。上で議
論した様に、ポリペプチドリガンド中の少なくとも１個のアミノ酸残基を異なっ
たアミノ酸残基で置換するか、天然型ポリペプチド中または天然型ポリペプチド
のＮ−またはＣ−末端のアミノ酸残基を付加または取り除くことで、突然変異リ
ガンドを得られ、実質的に突然変異体が誘導された天然型細胞外ドメインと同じ
３次元構造をを有する。

【０２１０】 実質的に同じ３次元構造を有するということは、突然変異体が由来する天然型
細胞外ドメインおよび／またはリガンドの原子構造座標と重ね合わせ、少なくと
も約５０％〜１００％のポリペプチドのＣα原子が重ね合わせに含まれる場合、
約２Å以下の根平均二乗偏差（ｒｍｓｄ）を有する１組の原子構造座標を有する
ことを意味する。例えば、図３はＦＧＦＲ１およびカノニカルＩＧ褶曲ポリペプ
チドであるテロキンのＤ２およびＤ３領域中の６８個の共通Ｃα原子がｒｍｓ偏
差０．８Åで重ね合わせられることを示している。

【０２１１】 ポリペプチドの３次元構造をそれほど乱さないアミノ酸の置換、欠失および付
加は、一部には置換、付加または欠失を生じるポリペプチドの領域に依存する。
分子の可変どの高い領域では、非保存性置換と共に保存性置換が分子の３次元構
造を有意に乱さずに許容される。保存どの高い領域、または重要な２次構造を含
む領域では、保存性アミノ酸置換が好ましいと考えられる。

【０２１２】 保存性アミノ酸置換は公知であり、アミノ酸残基の極性、荷電、溶解性、疎水
性、親水性および／または両電解質性に基づいて行われる置換が含まれる。例え
ば、負電荷アミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ、正電荷ア
ミノ酸にはリジンおよびアルギニンが含まれ、電荷を持たない類似の疎水性値を
有する極性ヘッドグループを持つアミノ酸にはロイシン、イソロイシン、バリン
、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェ
ニルアラニン、チロシンが含まれる。その他の保存性アミノ酸置換は公知である
。

【０２１３】 残体または一部が化学合成で得られるＲＰＴＫ細胞外ドメインでは、置換また
は付加に用いられるアミノ酸は遺伝的にコードされたアミノ酸に限定されない。
実際、本明細書に報告される突然変異体は遺伝的にコードされないアミノ酸も含
み得る。通常の既知の遺伝的にコードされない多くのアミノ酸に対する保存性ア
ミノ酸置換は公知である。他のアミノ酸に対する保存性置換を、遺伝的にコード
されたアミノ酸の性質と比較したその物理的性質に基づいて決定することができ
る。

【０２１４】 ある場合は、ポリペプチドの精製またはポリペプチドの結晶化を容易にする、
ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ等のＤＮＡ中に便利なクローニング部位を提
供するために、天然型細胞外ドメインのアミノ酸残基を置換する、および／また
は付加することが特に遊離または便利である場合がある。天然型チロシンキナー
ゼドメインの３次元構造を実質的に変化させないこの様な置換、欠失および／ま
たは付加は、通常の技能を有する当業者に明らかであると思われる。

【０２１５】 本明細書で検討する突然変異体はリガンド結合活性を示す必要がないことに注
意する必要がある。実際、ＲＰＴＫ細胞外ドメインのリガンド結合活性を妨害す
るが、ドメインの３次元構造をさほど変えないアミノ酸の置換、付加または欠失
を、本発明で特に検討する。この様な結晶性ポリペプチド、またはそれから得ら
れた原子構造座標を、天然型のドメインに結合する化合物または分子を同定する
ために用いることができる。これらの化合物または分子は、天然型ドメインの活
性に影響すると考えられる。

【０２１６】 本発明の結う動体結晶は一般に、少なくとも１個の重金属原子と共有結合した
結晶性ＲＰＴＫ細胞外ドメインポリペプチドでなる。ポリペプチドは天然型また
は突然変異チロシンキナーゼドメインに対応する。誘導体結晶を提供するに有用
な金属原子には金、水銀等がふくまれるが、これらは例であり、それに限られる
ものではない。

【０２１７】 本発明の共結晶は一般に、少なくとも１個の化合物または他の分子と会合した
結晶性細胞外ドメインポリペプチドでなる。会合は共有結合または非共有結合で
ある。この様な分子にはリガンド、リガンドアナログ、補助因子、基質、基質ア
ナログ、阻害剤、活性化剤、アロステリックエフェクター、ポリペプチド等が含
まれるが、それらに限られるものではない。

【０２１８】 IV．Ｘ線結晶学を用いる３次元構造決定 Ｘ線結晶学は分子の３次元構造を解く方法である。分子の構造は、結晶を回折
格子として用いてＸ線回折パターンから計算される。タンパク質分子の３次元構
造は、そのタンパク質の濃縮水溶液から成長した結晶で生じる。Ｘ線結晶学は（
ａ）ポリペプチドを合成し単離する工程；（ｂ）化合物、調節因子、リガンドま
たはリガンドアナログを含む、または含まないポリペプチドでなる適当な溶液か
ら結晶を成長させる工程；および（ｃ）結晶からＸ線回折パターンを収集し、単
位格子の寸法と対称を測定し、電子密度を測定し、ポリペプチドのアミノ酸配列
を電子密度に当てはめ、構造を修正する工程を含む。

【０２１９】 ポリペプチドの製造 本明細書に報告する天然型および突然変異チロシンキナーゼドメインポリペプ
チド全体または一部を、公知の技術を用いて化学的に合成し得る（例えばクレイ
トン（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ）１９８３年参照）。または、公知の方法を、天然型
または突然変異チロシンキナーゼドメインポリペプチドコード配列と、適当な転
写／翻訳制御信号を含む発現ベクターを構築するために使用することもできる。
その方法には生体外組み替えＤＮＡ技術、合成技術および生体内組み替え／遺伝
子組み替えが含まれる。例えばマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、１９８９年
、およびアウスベルら、１９８９年に報告された技術参照。

【０２２０】 様々なホスト発現ベクター系をＲＰＴＫ細胞外ドメインコード配列を発現する
ために使用し得る。これらにはＲＰＴＫ細胞外ドメインコード配列を含む組み替
えバクテリオファージＤＮＡで形質転換した微生物；プラスミドＤＮＡまたはコ
スミドＤＮＡ発現ベクター；ＲＰＴＫ細胞外ドメインコード並列を含む組み替え
酵母発現ベクターで形質転換した酵母；ＲＴＰＫ細胞外ドメインコード配列を含
む組み替えウイルス（例えばバキュロウイルス）発現ベクターで感染した昆虫細
胞；ＲＰＴＫ細胞外ドメインコード配列を含む組み替えウイルス（例えばカリフ
ラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）発現ベ
クターで感染した、または組み替えプラスミド（例えばＴｉプラスミド）発現ベ
クターで感染した植物細胞外ドメイン系；または動物細胞系が含まれるが、それ
に限定されるものではない。これらの系の発現要素はその強度と特異性が異なる
。

【０２２１】 利用したホスト／ベクターによっては、構成および誘導プロモーターを含む数
多くの適当な転写および翻訳の任意のものを発現ベクターに用い得る。例えば、
バクテリア系でクローニングする場合、バクテリオファージλのｐＬ、ｐｌａｃ
、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター）等の誘導
プロモーターを使用し得る；昆虫細胞系でクローニングする場合、バキュロウイ
ルスポリヘドリンプロモーターを使用し得る；植物細胞系でクローニングする場
合、植物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば熱ショックプロモーター、Ｒ
ＵＢＩＳＣＯの小さいサブユニット用プロモーター、クロロフィルａ／ｂ結合タ
ンパク質用プロモーター）または植物ウイルス由来のプロモーター（例えばＣａ
ＭＶの３５Ｓ ＲＮＡプロモーター、ＴＭＶの被覆タンパク質プロモーター）を
使用し得る；哺乳動物細胞系でクローニングする場合、哺乳動物細胞のゲノム由
来のプロモーター（例えばメタロチオネンプロモーター）または哺乳動物由来の
プロモーター（例えばアデノウイルス後期発生プロモーター；ワクシニアウイル
ス７．５Ｋプロモーター）を使用し得る；レセプターＰＴＫ細胞外ドメインＤＮ
Ａの複数のコピーを含む再生細胞株を発生させる場合、ＳＶ４０−、ＢＰＶ−お
よびＥＢＶ−系ベクターを適当な選択マーカーと共に使用し得る。

【０２２２】 ＤＮＡの取り扱い法の記載方法、ベクター、様々なタイプの使用された細胞、
ベクターを細胞内に取り込ませる方法、発現技術、タンパク質の精製単離法、お
よびタンパク質の濃縮方法はタンパク質ＰＹＫ−２に関してＵＳ特許Ｎｏ．５８
３７５２４、５８３７８１５およびＰＣＴ公報ＷＯ９６／１８７３８に詳細に開
示され、クレーム、図面を含むそれぞれの全ての内容が本明細書に参考文献とし
て含まれている。当業者は、この様な報告が本発明に適用可能であり、本発明に
採用し得ることを理解し得ると思われる。

【０２２３】 結晶成長 結晶を精製され濃縮されたポリペプチド溶液から様々な技術で成長させる。こ
れらの技術にはバッチ、液体、ブリッジ、透析、蒸気拡散および液滴懸垂法が含
まれる。マックファーソン（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ）、１９８２、ジョンウィリー
（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ）、ニューヨーク；マックファーソン、１９９０、Ｅｕ
ｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ。１８９：１−２３；ウエバー（Ｗｅｂｂｅｒ）、１９
９１、Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ。４１：１−３６、クレーム、表、図
面を含むそれぞれの全ての内容が本明細書に参考文献として含まれている。

【０２２４】 一般に、結合した化合物、調節因子、リガンドまたはリガンドアナログを有す
る、またはそれらを持たないＲＰＴＫ細胞外ドメインに対応するポリペプチドの
濃縮溶液に沈殿剤を加えて本発明の結晶を成長させる。沈殿剤はタンパク質を沈
殿させるに必要な濃度のすぐ下の濃度で加えられる。蒸発を制御して水を除去し
て沈殿条件を作成し、その条件が結晶成長が停止するまで維持される。

【０２２５】 本発明の代表的な結晶の一つでは、約２．０μＬの結合したリガンドを有する
ＲＰＴＫ細胞外ドメインポリペプチドを含む懸垂液滴が、高分解能Ｘ線構造決定
に適した結晶を提供することが見出された。等容積のタンパク質溶液（２５ｍＭ
トリスＨＣｌ中１０ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ８．５、および１５０ｍＭ ＮａＣｌ）と
保存緩衝液（１．６Ｍ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、２０％ ｖ／ｖグリセロールおよび１０
０ｍＭトリスＨＣＬ、ｐＨ８．５）を混合し、得られた溶液の懸垂液滴を０．５
ｍＬの保存緩衝液上に２０℃でけん濁することで結晶は成長させることが好まし
い。好ましい実施態様では、タンパク質溶液は１０ｍｇ／ｍＬのＦＧＦ２分子に
結合したＦＧＦＲ１ Ｄ２−Ｄ３ドメインでなる。

【０２２６】 本発明の他の代表的な結晶では、１容積のタンパク質溶液（２５ｍＭトリスＨ
Ｃｌ中１ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ８．５、および１５０ｍＭ ＮａＣｌ）を４容積の保
存緩衝液（２０％ＰＥＧ４０００、０．２Ｍ Ｌｉ₂ＳＯ₄、および０．１Ｍトリ
スＨＣｌ，ｐＨ８．５）と混合し、得られた溶液の懸垂液滴を２０℃で０．５ｍ
Ｌの保存緩衝液上にけん濁して結晶を成長させた。好ましい実施態様では、タン
パク質溶液は１ｍｇ／ｍＬのＦＧＦ１分子に結合したＦＧＦＲ１ Ｄ２−Ｄ３で
なる。

【０２２７】 当業者は、上記結晶化条件を変更し得ることを理解すると思われる。このよう
な変更は単独または組み合わせて使用することができ、それには約１ｍｇ／ｍＬ
から約５０ｍｇ／ｍＬのポリペプチド濃度、約１０ｍＭから約２００ｍＭのトリ
スＨＣｌ濃度、約０ｍＭから約２０ｍＭのジチオトレイトール濃度、約５．５か
ら約９．５のｐＨ範囲、および約１０％から約５０％（ｗ／ｖ）のポリエチレン
グリコール；および約１０００から約２０，０００の間のポリエチレングリコー
ル分子量、約０．１Ｍから約２．５Ｍの間の（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄濃度、約０％から
約２０％（ｖ／ｖ）の間のエチレングリコールまたはグリセロール濃度、約１０
ｍＭからやく２００ｍＭの間のビストリス濃度、約５．５から約９．５の間のｐ
Ｈ範囲、および約０℃から約２５℃の間の温度範囲を含む保存溶液が含まれる。
所定のｐＨ範囲が維持される限り、ＨＥＰＥＳ緩衝液等の他の緩衝液も使用し得
る。

【０２２８】 天然型結晶を重金属原子の塩を含む母液中に浸して本発明の誘導体結晶を得る
ことができる。天然型結晶を約０．１ｍＭから約５ｍＭのチメロサル、４−クロ
ロメルリ安息香酸またはＫＡｕ（ＣＮ）₂を含む溶液に約２時間から約７２時間
浸すと、ＲＰＴＫ細胞外ドメインポリペプチドのＸ線結晶構造の決定に適した同
形置換に使用するに適した誘導体結晶が得られる。

【０２２９】 天然型結晶をレセプターＰＴＫ細胞外ドメインに結合する少なくとも１種の化
合物、リガンドまたはリガンドアナログを含む母液に浸すか、ＲＰＴＫ細胞外ド
メインポリペプチドを少なくとも１種の結合化合物、リガンドまたはリガンドア
ナログの存在で共結晶化して、本発明の共結晶を得ることができる。

【０２３０】 化合物、リガンドまたはリガンドアナログと複合体を形成したＲＰＴＫ細胞外
ドメインに対応するポリペプチドでなる結晶を、二つの方法のいずれかで成長さ
せることができる。第１の方法では、化合物、リガンドまたはリガンドアナログ
をＲＰＴＫ細胞外ドメインに対応するポリペプチドを含む水溶液に、結晶成長の
前に添加する。第２の方法では、化合物、リガンドまたはリガンドアナログを、
ＲＰＴＫ細胞外ドメインに対応するポリペプチドの既存の結晶中に吸収させる。

【０２３１】 結晶性ＦＧＦＲ細胞外ドメイン／ＦＧＦ複合体 ＦＧＦ１−ＦＧＦＲ１およびＦＧＦ２／ＦＧＦＲ２複合体の全体構造は、先に
決定したＦＧＦ２−ＦＧＦＲ１の構造（図５：プロトニコフら、１９９９）と類
似している。ＦＧＦＲリガンド結合ドメインは、短いリンカーで結合した２個の
Ｉｇ様ドメインで構成される。ＦＧＦ１−ＦＧＦＲ１およびＦＧＦ２−ＦＧＦＲ
２構造中のＤ２およびＤ３の３次元褶曲構造は、Ｉ−セットプロトタイプメンバ
ーであるテロキンの構造に類似し、その中ではβサンドイッチがβシートの２層
で形成されている（ホールデンら、１９９２）。高度に保存されたジスルフィド
結合がＤ２およびＤ３の疎水性コアに埋め込まれ、２つのβシートを架橋してい
る。双方の構造で、Ｄ３中のβＣ−βＣ'は無秩序になっている（図５）。

【０２３２】 ＦＧＦ１−ＦＧＦＲ１とＦＧＦ２−ＦＧＦＲ２の構造間の主な差は、βＣ'と
βＥを繋ぐセグメントのコンフォーメーションである（図５）。ＦＧＦ２−ＦＧ
ＦＲ２構造では、このセグメントは規則性が高くＦＧＦ２と相互作用するが、Ｆ
ＧＦ１−ＦＧＦＲ１構造では個のセグメントは無秩序であり、原子モデルには含
まれていない。先に決定したＦＧＦ２−ＦＧＦＲ２の構造では、このセグメント
も規則性が高く、リガンドと相互作用している（プロトニコフら、１９９９）。
ＦＧＦ２−ＦＧＦＲ１構造中のこのセグメントのＣ−末端では、短いαヘリック
ス（αＤ）がＰＲＯＣＨＥＣＫＥＲにより同定されている（ラスコフスキら、１
９９３）。本発明のＦＧＦ２−ＦＧＦＲ２構造では、Ｃ−末端のポリペプチド鎖
は極めてよく似たコンフォーメーションをとるが、αヘリックスとは同定されて
いない。

【０２３３】 ＦＧＦ１およびＦＧＦ２の双方は、４本鎖逆平行βシートの３個のコピーで構
成される三花弁褶曲構造を取ると以前に報告されている（図５）。レセプターに
結合したＦＧＦ１およびＦＧＦ２を遊離のＦＧＦ１およびＦＧＦ２と重ね合わせ
ると、レセプター結合によりＦＧＦ１およびＦＧＦ２に何らのコンフォーメーシ
ョン変化が生じていないことが示される。さらに、遊離のＦＧＦ１およびＦＧＦ
２の結晶構造と同様、ＦＧＦ１およびＦＧＦ２双方のヘパリン結合部位に規則的
な硫酸イオンが見られる。ＦＧＦ２−ＦＧＦＲ１の構造決定された結晶中と同じ
く、ＦＧＦ１−ＦＧＦＲ１およびＦＧＦ２−ＦＧＦＲ２構造中のリガンドはＤ２
、Ｄ３およびＤ２とＤ３を繋ぐリンカー中のレセプターの残基と相互作用する（
図６）。

【０２３４】 ある説明的な実施態様では、本発明はＦＧＦ２分子に結合したＦＧＦＲ１ Ｄ
２−Ｄ３ドメインを提供する。本実施態様のＤ２−Ｄ３ドメインは残基１４２−
３６５で構成され、従ってＤ１ドメイン、アシッドボックスおよびＤ３と膜横断
ヘリックスがない。各Ｄ２−Ｄ３ドメインは１個のＦＧＦ２分子と結合している
。実施例に示す方法で結晶が得られた。天然型結晶、誘導体結晶または共結晶い
ずれかであるＦＧＦＲ１ Ｄ２−Ｄ３／ＦＧＦ２結晶は、正方晶単位格子（即ち
ａ＝ｂ≠ｃ）と空間群Ｐ４₁２₁２を有する。非対称ユニット中にほぼ２回転軸で
関係付けられる２個のＦＧＦＲ１ Ｄ２−Ｄ３／ＦＧＦ２複合体がある。単位格
子の大きさはａ＝ｂ＝９８．５Å、ｃ＝１９７．０Å、β＝９０°である。

【０２３５】 ＦＧＦ−Ｄ２インターフェース 二つの複合体中の中のＦＧＦとＤ２間のインターフェースは主として疎水性で
ある（図７および８）。ＦＧＦ中の溶剤に晒された疎水性表面は、ＦＧＦＲ中の
底にある保存性の高い疎水性表面に対して詰め込まれている。ＦＧＦ２−ＦＧＦ
Ｒ２構造では、ＦＧＦ２中のＴｙｒ２４、Ｌｅｕ１４０およびＭｅｔ１４２がＦ
ＧＦＲ２中のＡｌａ１６８と疎水性接触し、ＦＧＦ２中のＬｅｕ１４０、Ｔｙｒ
１０３およびＡｓｎ１０２側鎖の脂肪族部分がＦＧＦＲ２中のＰｒｏ１７０と疎
水性接触している。ＦＧＦ２のＰｈｅ３１はＦＧＦＲ２のＬｅｕ１６６との疎水
性相互作用に組み込まれている。ＦＧＦＲ２のＬｅｕ１６６、Ａｌａ１６８およ
びＰｒｏ１７０はＤ２の底のβＡ'中に位置する。Ｄ２中のβＧのＣ−末端に位
置するＶａｌ１４９も、ＦＧＦ２−Ｄ２インキュベート他０フェース中にあり、
ＦＧＦ２中のＬｅｕ１４０およびＭｅｔ１４２と相互作用している。数個の水素
結合が主として疎水性であるＦＧＦ２−Ｄ２インターフェースをさらに強化して
いる。すなわち、ＦＧＦ２中のＴｙｒ２４の水酸基がＦＧＦＲ２中のＬｅｕ１６
６とＡｌａ６８の骨格原子と２本の水素結合を形成し、Ｔｙｒ１０３がＡｌａ１
６８の骨格と水分子を経由して水素結合を形成している。

【０２３６】 ＦＧＦ２−Ｄ２インターフェース中のＦＧＦ２とＦＧＦＲ２の間に観測される
相互作用は、ＦＧＦ２に関する突然変異誘発と完全に符合している。すべてＦＧ
Ｆ２−Ｄ２インターフェースに位置するＴｙｒ２４、Ｔｙｒ１０３、Ｌｅｕ１４
０およびＭｅｔ１４０をアラニンで個別に置換すると（図７）、ＦＧＦＲ１の結
合親和性が大幅に減少することが示されている（スプリンガーら、１９９４）。

【０２３７】 説明のための実施態様のＤ２−Ｄ３／ＦＧＦ２複合体のそれぞれ内で、ＦＧＦ
２はＤ２、Ｄ３および２つのドメイン間のリンカーと強く相互作用する。ＦＧＦ
Ｒ２中のＴｙｒ２４とＦＧＦＲ１中のＬｅｕ１６５の間にはには１本の水素結合
が認められるが、Ｄ２とＦＧＦ２の間の相互作用の主体は疎水性である。例えば
、ＦＧＦ２のＴｙｒ２４およびＭｅｔ１４２とＤ２のＡｋａ１６７、ＦＧＦ２の
Ａｓｎ１０２、Ｔｙｒ１０３およびＬｅｕ１４０とＤ２のＰｒｏ１６９，および
ＦＧＦ２のＬｅｕ１４０とＦＧＦＲ１のＶａｌ２４８の間に疎水性接触が見られ
る。Ａｌａ１６７、Ｐｒｏ１６９およびＶａｌ２４８はＦＧＦＲ１−４の間で保
存され、従ってＦＧＦＲサブファミリーのメンバー中で治療上重要な部位である
ことは、注目すべきことである。

【０２３８】 ＦＧＦ２−ＦＧＦＲ２とＦＧＦ１−ＦＧＦＲ１の構造中のＦＧＦ−Ｄ２インタ
ーフェースを比較すると良く似ている（図７および８）。ＦＧＦ２とＦＧＦ１は
ＦＧＦ−Ｄ２中の２個所でのみ異なる：すなわち、ＦＧＦ２中のＭｅｔ１４２が
ＦＧＦ１中では相同疎水性残基Ｌｅｕ１３５で置換され、ＦＧＦ２中のＡｓｎ１
１０２はＦＧＦ１中ではＨｉｓ９３で置換されている。しかしながら、個の残基
の脂肪族部分のみがＦＧＦＲと相互作用し、実際の官能基ではないので、この後
者の置換はＦＧＦ１のＤ２への結合に影響しないと考えられる。

【０２３９】 ＦＧＦ−リンカーインターフェース Ｄ２−Ｄ３リンカーはＦＧＦＲ中で保存性が高い（図１５）。ＦＧＦとリンカ
ー領域の間の水素結合は、ＦＧＦのＦＧＦＲ経の結合に重要な役割を果たす（図
９および１０）。ＦＧＦ２−ＦＧＦＲ２構造中で、Ｄ２−Ｄ３リンカーに位置す
る不変アルギニンＡｒｇ２５１（ＦＧＦＲ２中）はＡｓｎ１０４の側鎖およびＡ
ｓｎ１０２の骨格カルボニル酸素と水素結合を形成する（図９）。実際、ＦＧＦ
２中のＡｓｎ１０４をアラニンで置換すると、ＦＧＦＲ１に対するＦＧＦ２の結
合親和性が４００倍減少し（チューら、１９９７）、Ａｓｎ１０４とＦＧＦＲ間
の相互作用の重要性を示している。

【０２４０】 １９個の入手可能なＦＧＦの配列は、ＦＧＦの大部分がＦＧＦ２のＡｓｎ１０
４に対応する位置にアスパラギンを有することを示している（図１７）。しかし
ながら、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１７およびＦＧＦ１８はこの位置にその側鎖がアスパ
ラギンより短いトレオニンを有する。これらのＦＧＦはキーとなるリンカーであ
るアルギニン残基と直接水素結合を形成しないと予想され、従ってＦＧＦＲに対
してより低い結合親和性を示すと思われる。興味あることに、ＦＧＦ１１、ＦＧ
Ｆ１２、ＦＧＦ１３およびＦＧＦ１４はＦＧＦ２のＡｓｎ１０４の代わりにバリ
ンを有する（図１７）。この置換はＦＧＦＲ結合の大きな減少を生じると考えら
れる。

【０２４１】 Ａｒｇ２５１とＦＧＦ２の間の水素結合は、保存性の高いＦＧＦＲ２中のＶａ
ｌ２４９およびＰｒｏ２５３、およびＦＧＦＲ２中のＬｅｕ９８とＰｒｏ１４１
で構成される疎水性ポケット中で行われる（図９）。この疎水性環境の近傍は、
この水素結合を安定化する可能性が高い。その上、ＦＧＦＲ２中のＡｒｇ２５１
とＡｓｐ２８３、およびＦＧＦ２中のＡｓｎ１０４とＴｙｒ１０６の間の分子間
水素結合は、Ａｒｇ１５１のグアニジウム基とＡｓｎ１０４のアミド基の回転自
由度を制限する役割を果たす（図９）。これらの相互作用は、ＦＧＦ−ＦＧＦＲ
複合体生成のエントロピーを低下させることにより、リガンド結合親和性を増加
させると思われる。実際、ＦＧＦ２中のＴｙｒ１０６をフェニルアラニンで置換
すると、レセプター結合が５倍減少する結果となった（チューら、１９９５）。

【０２４２】 ＦＧＦ１−ＦＧＦＲ１およびＦＧＦ２−ＦＧＦＲ２構造中のＦＧＦ−リンカー
インターフェースの保存性は高い（図９および１０）。その上、ＦＧＦＲ−不変
リンカーアルギニンとＦＧＦの間の重要な水素結合を囲む疎水性環境は、双方の
構造でほぼ同一である（図９および／または図１０）。ＦＧＦとＦＧＦＲファミ
リーの既知のメンバーの配列は、ＦＧＦ−Ｄ２およびＦＧＦリンカーインターフ
ェースを構成するＦＧＦおよびＦＧＦＲ中の残基が４種の哺乳動物ＦＧＦＲ（図
１５）および１９個の入手可能なＦＧＦ（図１７）間で保存されていることを示
している。構造および／または配列決定に基づいて、我々は上記のＦＧＦ−Ｄ２
およびＦＧＦ−リンカーインターフェースが全てのＦＧＦ−ＦＧＦＲ複合体に対
する一般的な保存性結合インターフェースを表していると考えている。

【０２４３】 説明のための実施態様におけるＦＧＦ２とＤ２−Ｄ３間リンカーとの間の相互
作用はには、ＦＧＦ２のＡｓｎ１０２とＡｓｎ１０４とＦＧＦＲ１のＡｒｇ２５
０との水素結合、およびＦＧＦ２のＬｅｕ９８とＦＧＦＲ１のＶａｌ２４８の間
の疎水性相互作用が含まれる。Ａｒｇ２５０はＦＧＦＲサブファミリー間では不
変であり、従って治療上重要な部位を表すと考えられる。

【０２４４】 ＦＧＦ−Ｄ３インターフェース ＦＧＦ−Ｄ２およびＦＧＦ―リンカーインターフェースがＦＧＦ−ＦＧＦＲ複
合体中で保存されるが、ＦＧＦ−Ｄ３インターフェースの大部分は分散性が高く
、ＦＧＦ結合特異性の決定因子になる。図１１〜１４はＦＧＦとＤ３モジュール
の上部の間の相互作用を示す。これらの相互作用は主としてＦＧＦＲのβＢ'−
βＣ、βＢ'−βＥおよびβＦ−βＧループで媒介される。βＢ'−βＣ中の残基
の保存性は高いが、βＢ'−βＥおよびβＦ−βＧループのアミノ酸配列はＦＧ
ＦＲ間でかなり分散している。特に、βＣ'とβＣ'−βＥループ間の接合部で別
なスプライシングを生じる（図１６）。従って、βＢ'−βＥおよびβＦ−βＧ
ループはＤ３の後半部に位置し、別なスプライシングを受ける。Ｄ３とＦＧＦの
相互作用には、β三花弁（β１の前）の外側のＮ−末端セグメントと、β４およ
びβ４−β５ループで構成される中心セグメントの最も分散性の高い領域を含む
ＦＧＦのいくつかの領域が含まれる。疎水性相互作用が優先するＦＧＦ−Ｄ２イ
ンターフェースとは対照的に、ＦＧＦ−Ｄ３インターフェース中のほとんどの相
互作用は水素結合で媒介される。さらに、ＦＧＦとＤ３の間の水素結合の多くは
水分子を経由している。ＦＧＦ−Ｄ３インターフェースの極性は、このインター
フェースがＦＧＦ−ＦＧＦＲ結合特異性に重要な役割を果たすという知見と一致
している。

【０２４５】 ＦＧＦ２とＤ３中のβＢ'−βＣ間の保存性相互作用は、ＦＧＦ不変グルタミ
ン酸残基であるＦＧＦ２中のＧｌｕ９６とＤ３のβＢ'−βＣ中のＦＧＦＲ不変
Ｇｌｎ２８５の間の４個の水素結合で媒介される（図９および１１）。Ａｓｎ１
０４の側鎖とＡｓｐ２８３の骨格カルボニル酸素との間の水が媒介する水素結合
も、このインターフェース中で生成する。ＦＧＦＲ結合に対するＦＧＦ２中のＧ
ｌｕ９６の重要性が、Ｇｌｕ９６の代わりにアラニンを含むＦＧＦ２突然変異体
のレセプター結合親和性が１０００倍減少していることで確認された（チューら
、１９９５）。

【０２４６】 ＦＧＦとβＢ'−βＣループ間のインターフェースとは対照的に、ＦＧＦとβ
Ｃ'−βＥループ間の相互作用は可変性が高い。ＦＧＦ２−ＦＧＦＲ２とＦＧＦ
１−ＦＧＦＲ１の結晶構造間の主な差は、βＣ'−βＥセグメントのコンフォー
メーションである（図５）。ＦＧＦ２−ＦＧＦＲ２構造では、βＣ'−βＥルー
プの規則性が高く、ＦＧＦ２のβ４中のいくつかと特異的に接触している（図１
３）。一方、このループはＦＧＦ１−ＦＧＦＲ１の結晶構造中では無秩序である
（図５）。この差は、このループとＦＧＦ１の間の相互作用がないことに反映し
、結晶の詰め込みの結果ではない。すなわち、このセグメントは単位格子中の４
個の全てのＦＧＦ２−ＦＧＦＲ２複合体中で規則性であり、単位格子中の２つの
ＦＧＦ１−ＦＧＦＲ１複合体中では無秩序である。この差の結果、 ＦＧＦ２−
ＦＧＦＲ２複合体中の表面積２７００Ųと比較するとＦＧＦ１−ＦＧＦＲ１複
合体中に埋め込まれた接近し得る全表面積は２２００Ųである。

【０２４７】 全部で５個の水素結合がＦＧＦ２−ＦＧＦＲ２構造中のＦＧＦ２とβＣ'−β
Ｅセグメント間のインターフェースに形成される（図１３）。２つの水素結合は
ＦＧＦ２のＧｌｎ５６の側鎖とＦＧＦＲ２のＡｓｐ３２１との間に形成され、２
個の水素結合がＦＧＦ２のＧｌｕ５８の側鎖とＦＧＦＲ２中のＶａｌ３１７とＡ
ｓｎ３１８の骨格原子間に形成される。５番目の水素結合が、ＦＧＦ２中のＡｌ
ａ５７の骨格とＡｓｐ３２１の側鎖との間に規則的な水分子を経由して形成され
る。ＦＧＦＲ２中のＶａｌ３１７の側鎖と、ＦＧＦ２中のＴｙｒ７３、Ｖａｌ８
８およびＰｈｅ９３の側鎖との間の疎水性接触がこのインターフェースを強化す
る（図１３）。突然変異誘発実験は、レセプター結合へのＶａｌ８８とＰｈｅ９
３の両者の関与を支持している。ＦＧＦ２中でＶａｌ８８とＰｈｅ９３をアラニ
ンで置換すると、レセプター結合親和性がそれぞれ１０倍および８０倍減少する
結果となる（チューら、１９９８）。

【０２４８】 βＣ'−βＥループが数種の異なったコンフォーメーションで存在し、異なっ
たＦＧＦとの相互作用がその２次構造を調節することが可能である。ＦＧＦ２−
ＦＧＦＲ２およびＦＧＦ２−ＦＧＦＲ１の結晶構造中では、この領域中の３つの
残基（Ａｌａ３１５、Ｔｈｅ３１９およびＩｌｅ３２４）間およびＤ３中のβＣ
中に位置するＩｌｅ２８８間の相互作用によりセグメントは小さな疎水性プラグ
を形成する。占有されていないレセプターでは、これらの残差の側鎖は安定なコ
アを形成するほど十分に疎水性ではない。一方、占有されたレセプターではＦＧ
Ｆ２との相互作用がこれらの疎水性残基の位置決めを促進し、より安定な構造を
生成する結果となる。ＦＧＦ１では、ＦＧＦ２のＧｌｎ５６に相当する残基はセ
リンであり（図１７）、その側鎖はＦＧＦＲ１中のＡｓｐ３２０と水素結合を形
成するに十分な長さではない。この水素結合の欠如がβＣ'−βＥセグメントの
柔軟性を増加させると考えられる。この領域はＦＧＦ１−ＦＧＦＲ１構造中では
無秩序である（図５および１０）。

【０２４９】 上記の構造解析に基づき、ＦＧＦ１はβＣ'−βＥループとの特異的接触に何
ら関与していないことが提案され、ＦＧＦ１が様々な違った方法でスプライスさ
れた形を含むほとんどのＦＧＦＲと無差別に結合し、全ての既知のＦＧＦＲに対
する汎用的なリガンドとして機能する理由の可能な説明となっている。

【０２５０】 ＦＧＦ１−ＦＧＦＲ２複合体の結晶構造が最近報告された（スチュアートら、
２０００）。本明細書で説明するＦＧＦ１−ＦＧＦＲ１の構造とは対照的に、Ｆ
ＧＦ１−ＦＧＦＲ２の構造ではβＣ'−βＥループは規則的であり、ＦＧＦ１と
数点で接触している。この構造に基づき、βＣ'−βＥループの１次配列におけ
る変化（異なったスプライシングの結果として）が明らかにＦＧＦ１結合に影響
すると考えられる。しかしながら、この構造的な特徴は、ＦＧＦ１の十分に報告
された汎用的な結合特性と一致しない。

【０２５１】 既知の全てのＦＧＦＲのβＣ'−βＥループは、エクソンIIIｂまたはIIIｃと
は関わりなく、保存性の高い潜在的なＮ−グルコシル化部位を含む（ＦＧＦＲ２
中のＡｓｎ３１８）。本明細書に報告の結果は、昆虫細胞中で発現した場合、Ａ
ｓｎ３１８がＦＧＦＲ２の細胞外ドメイン中でグリコシル化されることを確認す
るものである。ＦＧＦ１−ＦＧＦＲ２の結晶構造中（スタウバーら、２０００）
では、Ａｓｎ３１８の側鎖がＦＧＦ１と２個の水素結合を形成する。特異性と共
にこの特性の問題が、この構造中で観測されたβＣ'−βＥとＦＧＦ１間の相互
作用が結晶の詰め込みのためであり、生体内での状況を反映していないのではな
いかということを考えさせる。

【０２５２】 全てのＦＧＦ−ＦＧＦＲ構造中のＤ２およびＤ３の相対的配置の解析は、Ｄ２
とＤ３間の結合が柔軟であり、２つのドメイン間の角度が２つのドメインとリガ
ンド間の接触のみでは説明されないことを明らかにしている。すなわち、結晶の
詰め込みも２つのドメインの相対的配置に影響する。ＦＧＦ１−ＦＧＦＲ１（本
明細書に報告）およびＦＧＦ１−ＦＧＦＲ２（スタウバーら、２０００）の構造
は共通のリガンドが特徴であるが、２つの構造間のＤ２のＣα原子の重ね合わせ
から、Ｄ２とＤ３の相対的な方向が７．８°異なっていることを示している。そ
の結果、ＦＧＦ１−ＦＧＦＲ２構造中のβＣ'−βＥループはリガンドにより近
く、この構造中のβＣ'−βＥループとＦＧＦ１の間の相互作用は結晶の詰め込
みの結果であることが理解される。ＦＧＦ１−ＦＧＦＲ１構造中では、βＣ'−
βＥループは非対称単位格子中の双方の複合体中で無秩序であり、βＣ'−βEが
ＦＧＦ１と組み合わされない２つの独立な場合を生じる。

【０２５３】 ＦＧＦ１−ＦＧＦＲ２構造の格子定数の解析から、結晶の詰め込みがβＣ'−
βＥループとＦＧＦ１間の観察された相互作用に寄与していると考えられる信頼
し得る機構が得られる。この構造では、２つの対称組みのＤ２が１次二量体の２
つのＤ３間の空間に挿入され、Ｄ３をＦＧＦ１分子により近く押しやる様に思わ
れる。

【０２５４】 二量体化を安定するＦＧＦＲとＦＧＦ間の相互作用 説明のための実施態様の結晶構造中で観察されたＤ２−Ｄ３／ＦＧＦ２二量体
は、二量体中の各ＦＧＦＲ間の相互作用と、ＦＧＦＲに結合したＦＧＦと二量体
中の他のレセプター間の相互作用によって安定化される。二量体化を安定化する
リガンド−レセプター間の接触は、ＦＧＦ２の残基Ａｓｐ９９、Ｓｅｒ１００、
Ａｓｎ１０１、Ｐｅｏ１３２、Ｇｌｙ１３３およびＬｅｕ１３８、およびＦＧＦ
Ｒ１のＰｒｏ１９９、Ａｓｐ２００、Ｉｌｅ２０３、Ｇｌｙ２０４、Ｇｌｕ２０
５、Ｓｅｒ２１９およびＶａｌ２２１間の弱いファンデルワールス相互作用によ
ることが多い。また、ＦＧＦ２のＰｒｏ１３２とＦＧＦＲ１のＧｌｙ２０４，お
よびＦＧＦ２のＬｙｓ２６とＦＧＦＲ１のＡｓｐ２１８間の水素結合も重要であ
る。

【０２５５】 対照的に、二量体化を安定にするレセプター−レセプター相互作用には各レセ
プターのＡｌａ１７１残基間の疎水性接触、各レセプターのＬｙｓ１７２、Ｔｈ
ｒ１７３およびＡｓｐ２１８間の水素結合、および書くレセプターのＡｌａ１７
１とＬｙｓ１７２間のファンデルワールス相互作用が含まれる。本発明は、ＦＧ
ＦＲサブファミリー中で保存される残基を含め、今までに仮定されなかったレセ
プター−レセプターインターフェースを説明する。

【０２５６】 例えば少なくとも１個所の接触を阻止する分子による二量体化を安定にする接
触の乱れは、ＲＰＴＫ機能を阻害する手段を提供すると考えられる。また、二量
体生成をさらに安定にする分子は、ＲＰＴＫ機能を刺激する手段を提供すると考
えられる。

【０２５７】 βＣ'−βＥセグメントのＦＧＦ結合特異性の役割における別なスプライシン
グの役割に対する構造的基礎 βＣ'−βＥループとＦＧＦ間のインターフェースにおけるＦＧＦおよびＦＧ
ＦＲのアミノ酸配列の比較は、かなりの多様性を示している（図１６および１７
）。さらに、βＣ'の末端で別なスプライシングを生じ、βC'−βＥループの１
次配列と長さに差を生じる主な原因となっている。例えば、ＫＧＦＲ／ＦＧＦＲ
２（IIIｂ）中のβＣ'−βＥのアミノ酸配列は７個所の置換位置を有し、ＦＧＦ
Ｒ２（IIIｃ）の対応する領域よりアミノ酸が２個短くなっている（図１６）。
特に、βＣ'−βE疎水性プラグの生成に関わるＦＧＦＲ２（IIIｃ）中の３個の
残基（Ａｌａ３１５、Ｔｈｒ３１９およびＩｌｅ３２４）が、疎水性プラグを生
成する可能性の少ないＫＧＦＲ／ＦＧＦＲ２（IIIｂ）中の残基（Ｓｅｒ３１５
、Ｓｅｒ３１９およびＡｌａ３２２）で置換されている（図１６）。これらの変
化の結果であるＫＧＦＲ中のβＣ'−βＥループは、ＦＧＦ２の効果的な相互作
用が不可能であると思われる。この提案は、βＣ'−βＥループがＫＦＧＲ由来
の対応する領域で置換されているＦＧＦ２の突然変異体ＦＧＦＲ２への結合の実
験で支持される。この突然変異体に対するＦＧＦ２の親和性は、１桁の大きさで
減少する（グレーら、１９９５）。逆に、２つの残基の挿入、および／またはＫ
ＦＧＲのβＣ'−βＥ中のアミノ酸置換はＦＧＦ１結合に影響せず、ＫＧＦ／Ｆ
ＧＦ７の結合を失った（ワン（Ｗａｎｇ）ら、１９９５ｂ）。さらに、ＦＧＦＲ
１（IIIｃ）中の対応する領域の置換は、突然変異レセプターにＫＧＦに結合す
る能力を与え（ワンら、１９９９）、一方、野生型ＦＧＦＲ１（IIIｃ）はＫＦ
Ｇ／ＦＧＦ７に結合しない。これらのデータは、ＦＤＦＲ２（IIIｃ）中のＫＧ
Ｆ／ＫＧＦ７とβＣ'−βＥセグメントの間に立体障害が存在し、ＫＧＦ／ＦＧ
Ｆ７のＦＧＦＲ２（IIIｃ）経の親和性が減少する結果となったことを示してい
る。反対に、ＫＧＦＲ／ＦＧＦＲ２（IIIｂ）のβＣ'−βＥセグメントはＫＧＦ
／ＫＧＦ７とより効率的に相互作用すると考えられる。後者の仮説は、βＣ'−
βＥセグメントを含むＫＧＦＲ／ＫＧＦＲ２（IIIｂ）由来の合成ペプチドがＫ
ＧＦ／ＫＧＦＲ７のＫＧＦＲ／ＫＧＦＲ２（IIIｂ）経の結合と特異的に競合す
るという発見で支持される（ボッタロ（Ｂｏｔｔａｒｏ）ら、１９９３）。しか
しながら、これらの提案の最終的な検証は、ＫＧＦＲ／ＦＧＦＲ２（IIIｂ）と
の複合体中のＫＧＦ／ＦＧＦ７の結晶構造を待つものである。

【０２５８】 本明細書で説明した構造上の知見はまた、ＫＧＦＲの特異的認識と活性化に必
要なＫＦＧ／ＦＧＦ７の中心セグメント（残基９１−１１０）の同定と一致して
いる（ライヒ−シロットスキ（Ｒｅｉｃｈ−Ｓｌｏｔｓｋｙ）、１９９５）。こ
の領域は主として、ＦＧＦ２−ＦＧＦＲ２の結晶構造中でβＣ'−βEおよびβＦ
−βＧループとそれぞれ特異的折衝をするＦＧＦ２中のβ４およびβ４−β５ル
ープに対応している（それぞれ図１３および１１）。それらを一緒にして、構造
データは別なスプライシングが如何にＦＧＦＲ２／ＫＦＧＲ系における特異性を
切り替えるかの分子的な説明を提供する。

【０２５９】 別なスプライシングが特異性に主な役割を果たすが、同様にスプライスされた
ＦＧＦＲの突然変異体も異なった結合特異性を示す（オルニッツら、１９９６）
。ＦＧＦ２はＦＧＦＲ１（IIIｃ）およびＦＧＦＲ２（IIIｃ）に強く結合するが
、ＦＧＦＲ３（IIIｃ）およびＦＧＦＲ４にはほとんど結合しないことが示され
た（チェライア（Ｃｈｅｌｌａｉａｈ）ら、１９９９；ワイニッカ（Ｖａｉｎｉ
ｋｋａ）ら、１９９２）。これらのレセプターのβＣ'−βＥループのアミノ酸
配列の研究から、ＦＧＦＲ４のβＣ'−βＥループはＫＦＧＲ／ＦＧＦＲ２（III
ｂ）と同様、ＦＧＦＲ１−３中の対応するループよりアミノ酸２個分短いことが
示された（図１６）。本明細書に報告する結果に基づき、ＦＧＦＲ４中のこのル
ープはＦＧＦ２と効率的に相互作用できないことが予想される。このことはＦＧ
ＦＲ１と比較してＦＧＦ２のＦＧＦＲ４に対する結合親和性が減少する結果とな
る。ＦＧＦＲ３のβＣ'−βＥループはＦＧＦＲ１のものとアミノ酸残基２個分
だけ異なる（図１６）。重要なことは、ＦＧＦＲ３中でＦＧＦＲ２のＶａｌ３１
７に対応する残基がバリンより小さい側鎖を有するアミノ酸であるアラニンであ
ることである（図１６）。このことはＦＧＦ２との疎水性相互作用がより弱い結
果となり、ＦＧＦＲ３に対するＦＧＦ２の親和性に影響する。実際、ＦＧＦＲ３
中のこれらの残基がＦＧＦＲ１中の対応する残基で置換された場合、得られたＦ
ＧＦＲ３突然変異体はＦＧＦ２に対し同等の結合親和性を示した（チェライアら
、１９９９）。結晶構造中のＦＧＦとβＣ'−βＥループ間の相互作用（図１３
）は、βＣ'−βＥループの１次配列組成によりどの様に特異性が制御されるか
の分子的説明を提供する。

【０２６０】 βＦ−βＧループの役割 Ｄ３中のβＦ−βＧループもまた、ＦＧＦ結合特異性の調節に重要な役割を果
たす。ＦＧＦ２−ＦＧＦＲ２構造中で、βＦ−βＧループ中に位置するＦＧＦＲ
２のＳｅｒ３４７はＦＧＦ２のＧｌｕ９６およびＬｅｕ９８と水を媒介する２個
の水素結合を形成する。ＦＧＦＲ２のＧｋｙ３４５とＦＧＦ２のＧｌｙ６１の間
の水を媒介する水素結合、およびＦＧＦＲ２中のＡｓｎ３４６の骨格とＦＧＦ２
中のＡｒｇ６０の側鎖との間の直接水素結合は、この領域でさらに別な接触を提
供する（図１１）。残基Ａｒｇ６０とＧｌｙ６１はＦＧＦ２中のβ４−β５ルー
プ中に位置する（図１７）。アミノ酸配列の比較から、ＦＧＦがＦＧＦ２のＡｒ
ｇ６０の位置で配列をかなり変化することが示される。一方、 ＦＧＦ中で残基
Ｇｌｙ６１の保存性は高い（図１７）。βＦ−βＧループはＦＧＦＲのIIIｂお
よびIIIｃ型中で不変である（図１６）。しかしながら、ＦＧＦＲ１（IIIｃ）の
Ｇｌｙ３４５とＳｅｒ３４７はＫＦＧＲ／ＫＦＧＲ２（IIIｂ）中のＳｅｒ３４
２とＴｙｒ３４５で置換されている。ＦＧＦＲ２中のＳｅｒ３４７のＫＧＦＲ／
ＦＧＦＲ２（IIIｂ）による置換は、ＦＧＦ２と立体障害を起し、ＫＧＦＲ／Ｆ
ＧＦＲ２（IIIｂ）に対する結合親和性が減少する結果となる。この提案は、Ｋ
ＧＦＲ中のＴｙｒ３４５とＧｌｎ３４８がＦＧＦＲ２中と同様にセリンで置換さ
れている２重突然変異体ＫＧＦＲのリガンド結合性と一致している。この突然変
異体レセプターは、母体となる分子（グレイら、１９５５）と比較してＦＧＦ２
に対するかなりの結合親和性を獲得している。興味のあることに、βＦ−βＧ中
に位置する不変アスパラギン（ＫＧＦＲ中のＡｓｐ３４４）のアラニンへの突然
変異は、試験した全てのＦＧＦに対するＫＧＦＲ／ＫＧＦＲ２（IIIｂ）の結合
能を消失させた。これらの結果は我々のＦＧＦ−ＦＧＦＲに基づいて期待された
ことである：ＦＧＦ２−ＦＧＦＲ２の構造中では、対応するアスパラギン（Ａｓ
ｎ３４６）がＦＧＦＲ２中のＩｌｅ３４８およびＧｌｙ３４９の骨格原子と２個
の原子間水素結合を形成する。これらの水素結合は、βＦ−βＧループの局所褶
曲構造を維持する上で重要な役割を果たす。Ａｓｎ３４６をＡｌａ残基で置換す
ると、このループの褶曲を妨害し、全てのＦＧＦと立体障害を生じる可能性があ
る。総合して、Ｄ３中の別なスプライシングが異なったレセプターアイソフォー
ムに対するＦＧＦ結合特異性をどの様に制御するかの合理的な分子レベルの説明
を、構造データが提供する。

【０２６１】 ＦＧＦのＮ−末端セグメントの役割 遊離ＦＧＦ１およびＦＧＦ２の結晶構造中で、β１の上流の残基が無秩序であ
ることが見出されている（エリクソン（Ｅｒｉｋｓｓｏｎ）ら、１９９１；ブレ
ーバー（Ｂｌａｂｅｒ）ら、１９９６；チューら、１９９１）。しかしながら、
レセプターに結合したＦＧＦ１およびＦＧＦ２の結晶構造中では、これらの残基
は規則性であり、ＦＧＦＲのＤ３の近傍にある（図１２および１４）。ＦＧＦ２
−ＦＧＦＲ２の構造中では、Ｐｈｅ１７の側鎖はＰｒｏ２８６、Ｉｌｅ２８８お
よびＶａｌ２８０で形成するＤ３の浅い疎水性ポケット中に位置している（図１
２）。さらに、Ｐｈｅ１７は骨格原子を経由してＤ３中のＳｅｒ２８２とＧｌｎ
２８５と数個の水素結合を形成している。Ｌｙｓ１８もＤ３中のＬｙｓ２７９と
Ｇｌｕ３２５、およびＦＧＦ３中のＶａｌ２８０の骨格と数個の水素結合を形成
している（図１２）。これらの構造の観察と一致して、ＦＧＦ２（β１の前）の
残基１３−１８で構成される合成ペプチドがＦＧＦ２のＦＧＦＲへの結合と競合
する（ヤヨンら、１９９３）。ＦＧＦ１中のｎ−末端セグメントとβ１の間の接
合部に位置するアミノ酸⁷ＮＹＫＫＰＫＬ¹³は、細胞をＦＧＦ１に暴露し続ける
間に生じるＦＧＦ１の核凝集信号を発すると提案されている（イマムラ（Ｉｍａ
ｍｕｒａ）ら、１９９０）。ＦＧＦ１−ＦＧＦＲ１構造では、このアミノ酸延伸
部に位置するＴｙｒ８がＶａｌ２７９、Ｐｒｏ２８５およびＩｌｅ２８７の側鎖
で形成する浅い疎水性ポケット内に挿入される。本明細書に説明した構造データ
は、この領域にレセプター結合における直接の役割を提供する。欠失突然変異誘
発実験は我々の構造上の知見を支持する。アミノ酸延伸部を欠くＦＧＦ１分子は
ＦＧＦＲ結合能力が２５０倍減少している（イマムラら、１９９０）。ＦＧＦの
構造に基づく配列決定により、ＦＧＦ中のβ１の上流のセグメント中の配列のか
なりの多様性が明らかとなり、この領域もＦＧＦ特異性決定に重要な役割を果た
すことを示唆している（図１７）。

【０２６２】 ＦＧＦのβ１前の残基とＦＧＦＲのＤ３中の残基との間の相互作用の観点では
、現在解析されているＦＧＦ１またはＦＧＦ２中に含まれない別なＮ−末端残基
も特異性決定に役割を果たすことが可能である。この仮説を試験するため、ＦＧ
ＦＲ２と複合体を形成する全長ＦＧＦ２の結晶構造が決定された（データを示さ
ず）。しかしながらこの結晶構造中では、Ｎ−末端からＰｈｅ１７までの全ての
残基が無秩序であり、この領域がＦＧＦＲ結合の主要な役割を果たさないことを
示唆している。ＦＧＦ２のＮ−末端残基の意味は不明のままである。

【０２６３】 ヒト骨格病に関与するＦＧＦＲ突然変異体 ＦＧＦＲ１とＦＧＦＲ２の細胞外ドメインが、ファイファー、クラウゾン、ジ
ャクソン−ワイスおよびアペルト症候群等の頭蓋骨融合症（頭蓋骨縫合の早期融
着）を含む出産異常患者で同定された（ナスキ（Ｎａｓｋｉ）およびオルニッツ
（Ｏｒｎｉｔｚ）、１９８８；ブルケ（Ｂｕｒｋｅ）ら、１９９８）。これらの
突然変異は３つの領域Ｄ２−Ｄ３リンカー、Ｄ３およびＤ３を膜横断ヘリックス
へ繋ぐリンカー中に集合している。これらの突然変異は２つの群に分類される：
（１）ほとんどの突然変異がシステインの他のアミノ酸への置換、またはその逆
であり、不対システインを生成する結果になる。これはリガンドに依存しない二
量体化と、レセプター分子間の分子間ジスルフィド結合の生成による活性化をも
たらす。（２）システイン置換を含まない突然変異がある。それにも拘わらず、
これらの突然変異も影響を受けたレセプターの構造的活性化（リガンドに依存し
ない）を伴わなければならないが、その理由は遊離システインを生成するこれら
の突然変異と同様な疾病表現型を引き起こすからである。これらの突然変異がレ
セプターの活性化を生じる正確な分子機構はあまり明瞭でない。

【０２６４】 これらの突然変異のＦＧＦＲ機能に対する効果の分子的な基礎を理解するため
、我々はこれらの突然変異をＦＧＦ２−ＦＧＦＲ２の３次元構造上にマッピング
した（図１８）。我々の構造データに基づき、システインと直接関係しないが、
我々はＤ３における多くの突然変異がＤ３の３次元構造を不安定化し、ドメイン
内ジスルフィド結合の生成を不利にし、従ってレセプター分子間のジスルフィド
間のジスルフィド架橋の可能性を増すと予想する（図１８）。多分、この記述は
Ｔｒｐ２９０をグリシンまたはアラニンで置換することにより最も良く例示され
ると考えられる。残基Ｔｒｐ２９０はジスルフィド架橋に隣接したＣＤ３のコア
に位置し、この残基を２つのアミノ酸のいずれかで置換することはＤ３の安定性
を減少させると思われる（図１８）。

【０２６５】 ＦＧＦＲ２のＤ２−Ｄ３リンカー内の２個の保存性の高い残基Ｓｅｒ２５２お
よびＰｒｏ２５３の突然変異は、アペルト症候群の全ての既知の症例の原因とな
る。ＦＧＦＲ１中の等価なプロリン（Ｐｒｏ２５２）の突然変異が、ファイファ
ー症候群のある症例で報告されている。我々の構造データに基づき、我々はこれ
らの突然変異がＦＧＦＲとＦＧＦの間の特異的相互作用を導入すると予想する。
実際、アンダーソンら（１９９８）は、野生型ＦＧＦＲ２と比較して、アペルト
突然変異を有する突然変異ＦＧＦＲ２分子がＦＧＦ２に対する親和性の選択的増
加を示し、リガンドの供給が限られる場合、シグナル発生を増進する結果となる
（アンダーソンら、１９９８）。

【０２６６】 上記の様に、βＣ'とβＥ間のアミノ酸延伸部は特性を決定する上で重要な役
割を果たす。残基Ａｓｐ３２１はＦＧＦ２と３個の水素結合を形成する（図１３
）。従って、ファイファー症候群のある症例で検出されるＡｓｐ３２１のアラニ
ンによる置換は、ＦＧＦ２のＦＧＦＲ２に対する親和性を減少させると思われる
。このアミノ酸置換がＦＧＦＲ２のＦＧＦファミリーの他のメンバーに対する親
和性を増加させることが考えられる。βＣ'−βＥループに位置するＡｌａ３１
５のセリンによる置換も、ファイファー症候群と関連している。残基Ａｌａ３１
５は疎水性βＣ'−βＥプラグの生成に関与している。個の置換は疎水性プラグ
を不安定化し、リガンド結合特異性に影響し得る。

【０２６７】 ヘパリン結合峡谷 説明のための実施態様の結晶構造では、二つのリガンドの頂上側上に続く高い
正電荷を有する“峡谷”が二量体中の２個のD２領域の相互作用により形成する
。峡谷はその正電位をＦＧＦＲ１のリジン１６０、１６３、１１７２、１７５お
よび１７７から受け取る。この峡谷はヘパリン結合部位を表すと考えられる。Ｆ
ＧＦ２もＡｓｎ２７、Ｌｙｓ１２５、Ｇｌｎ１３４、およびＡｒｇ１２０で構成
される高親和性ヘパリン結合部位を含み、ヘパリンはＦＧＦＲ２のＦＧＦＲ１に
対する見かけの親和性を増加させる。従って、これらの残基は、例えばそのリガ
ンドに対するレセプターＰＴＫの親和性に影響する分子を用いる有用な治療の標
的であると考えられる。

【０２６８】 ヘパリンがこの渓谷を横断し、ＦＧＦ：ＦＧＦＲが１：１の２個の複合体を架
橋すると考えられている。最近報告された２個のＦＧＦ：ＦＧＦＲ複合体の他の
二量体集合の結晶構造が個のモデルをさらに支持する（スタウバーら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：４９−５４、２０００）。

【０２６９】 二量体構造に基づき、活性が最も高いドデカサッカライドが渓谷を横断し、リ
ガンドの高および低親和性ヘパリン結合部位を組み合わせることが、手動ドッキ
ング実験から示された。対照的に、渓谷の中心に置かれたオクタサッカライドは
、リガンドの低親和性ヘパリン結合部位とのみ相互作用可能である。渓谷にドッ
キングしたヘキササッカライドはリガンドのヘパリン結合部位のいずれとも相互
作用できず、オクタサッカライドより小さいオリゴサッカライドは生物活性を持
たないことを暗示している。しかしながら、ＦＧＦ信号発信に必要なヘパリンの
最小の長さの決定には議論の余地がある。最も短い生物活性ヘパリンオリゴサッ
カライドはオクタサッカライドであり、ヘパリンの長さの増加はドデカサッカラ
イドまでは生物活性の増加と平行する。しかしながら、ヘキササッカライドが生
物活性であり、ジサッカライドでも生物活性を有することが他の研究で報告され
ている。

【０２７０】 このモデルが今までの文献の全てを完全に折り合いを付けることができないた
め、我々はＦＧＦの信号発信における役割をさらに特徴付けることにした。ＦＧ
Ｆ２−ＦＧＦＲ１−ヘパリン３成分複合体の結晶構造決定を本明細書に報告する
。ヘパリン、ＦＧＦおよびＦＧＦＲ間の相互作用は、１：１のＦＧＦ：ＦＧＦＲ
親和性を増大し、２個のＦＧＦ−ＦＧＦＲ複合体の二量体化を促進する上でのヘ
パリンの２重の役割に対する分子的な基礎を与える。さらに、構造中で観察され
たＦＧＦ：ＦＧＦＲ：ヘパリンの２：２：２の予期しない化学量比のため、我々
は短いヘパリンアナログによるＦＧＦ依存性ＦＧＦＲ活性化を説明する新しいモ
デルを提案することにした。

【０２７１】 ＦＧＦＲのＤ２中のヘパリン結合残基の保存性は高いが、ＦＧＦファミリーの
ヘパリン結合残基はかなりの多様性を示すことが知られている（ファハムら、Ｃ
ｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．８：５７８−５８６、１９９８；
ベンカタラマン（Ｖｅｎｋａｔａｒａｍａｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６：３６５６−３６６３、１９９９）。さらに、β１−
β２ヘパリン結合ループの長さは異なったＦＧＦで変化する。この不均一性の結
果、異なったＦＧＦがその最適生物活性を発揮するためには、それぞれ固有の硫
酸基および／または長さを必要とすることが考えられる。事実、ＦＧＦ２はヘパ
リン結合のために２−Ｏ硫酸基を必要とするが、６−Ｏ硫酸基を必要としない。
対照的に、ＦＧＦ１はヘパリンに結合するために双方の硫酸基を必要とする（イ
シハラ、１９９４）。異なった細胞由来の細胞周辺ＨＳＰＧは硫酸化パターン、
炭水化物含有量および長さにかなりの不均一性を示す。これれの変化はＦＧＦ−
ＦＧＦＲ相互作用に重大な効果を有する。さらに、発育中の細胞外マトリックス
の改造が、ＦＧＦの生物活性を制御する手段であると考えられる。

【０２７２】 本発明の構造のヘパリン結合モードは、ヘパリンがＦＧＦ−ＦＧＦＲ二量体化
するに必要な最小の長さの他、ＦＧＦ：ＦＧＦＲ：ヘパリン相互作用の化学量比
に関する従来の知見に議論を呼ぶものである。結晶構造中で観測されたＦＧＦ，
ＦＧＦＲおよびヘパリン間の三者相互作用は、ヘキササッカライドがレセプター
の二量体化を促進するに充分であることを示唆している。従って、我々はヘキサ
サッカライドがＦＧＦ−ＦＧＦＲ複合体の二量体化を生体外で促進する能力を試
験することにした。均一に硫酸化されたヘキササッカライドを様々なモル比で生
成された１：１のＦＧＦ１：ＦＧＦＲ２複合体と混合し、反応混合物をサイズ排
除クロマトグラフィーで分析して二量体化を定量した（図３１）。ヘキササッカ
ライドをヘキササッカライド：複合体のモル比０．５：１で添加すると、ＦＧＦ
１−ＦＧＦＲ２複合体の半分を二量体化した（図３１、パネルＢ）。ヘキササッ
カライド：複合体のモル比１：１のヘキササッカライドは、全てのＦＧＦ１−Ｆ
ＧＦＲ２複合体を定量的に二量体化させた（図３１、パネルＣ）。過剰のヘキサ
サッカライドは二量体化を減少させ、対照より若干早く溶出するピークが現れる
結果となった（図３１、パネルＤ）。このピークはヘキササッカライド：ＦＧＦ
１：ＦＧＦＲ２＝１：１：１三成分複合体に相当する。ヘパリンがない場合は、
サイズ排除クロマトグラフィー条件下でＦＧＦ−ＦＧＦＲ複合体が解離する傾向
を示したことは注目に値し、ヘパリンがＦＧＦのＦＧＦＲに対する親和性を増加
し、二量体生成を安定化することを示している。従って、図３１似示した生物化
学実験は、結晶中のヘパリン結合モードを支持するものである。

【０２７３】 本明細書で説明した結晶構造とそれを支持する生物化学実験に基づき、ヘパリ
ンがＦＧＦ依存性ＦＧＦＲ二量体化を誘発する新しい“２末端モデル”を提案す
る（図３２参照）。このモデルによれば、ヘパリンはその非還元末端を経由して
ＦＧＦとＦＧＦＲの両者と相互作用し、安定な１：１：１のＦＧＲ：ＦＧＦＲ：
ヘパリン複合体の生成を促進する。次いで第２の１：１：１のＦＧＦ：ＦＧＦＲ
：ヘパリン複合体がＦＧＦＲ：ＦＧＦＲの直接の接触、１つの３成分複合体中の
ＦＧＦと他の３成分複合体間の２次相互作用、および間接的ヘパリン媒介ＦＧＦ
Ｒ−ＦＧＦＲ接触により第１の複合体に補充される。ヘパリンがない場合は、レ
セプター−レセプター直接接触および２次リガンド−レセプター相互作用は十分
に二量体化するに十分でない。明らかに、ヘパリンは直接ＦＧＦＲ−ＦＧＦＲ相
互作用とＦＧＦ−ＦＧＦＲ相互作用を増加させる。

【０２７４】 本報告で提示する“２末端”モデルは、還元末端（Ｏ１）でタンパク質コアＨ
ＳＰＧに結合するヘパリン硫酸鎖の化学的構造と一致している。さらに、ヘパリ
ン硫酸は低および高硫酸基領域に大別することができる（ガンバリニ（Ｇａｍｂ
ａｒｉｎｉ）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２４：１２１―１２９
、１９９３）。低硫酸基領域はタンパク質コアに近い。高硫酸基領域は、我々の
構造で峡谷の中心にあるデカサッカライド結合の非還元末端に対応する非還元末
端（Ｏ４）の方向に位置している。さらに、硫酸化度の高い非還元末端の化学的
性質はヘパリンに似ており、ＨＳＰＧの構築ブロックであると考えられる３硫酸
化ジサッカライドユニット（ＩｄｏＡ、２Ｓ−ＧｌｃＮＳ、６Ｓ）で構成されて
いる（ガンバリニら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２４：１２１―１
２９、１９９３）。事実、これらのヘパリン硫酸の硫酸化度の高い領域は、ＦＧ
Ｆ１の細胞分裂誘起活性に対するヘパリン硫酸の相乗効果の主な決定因子である
ことが示されている（ガンバリニら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２
４：１２１―１２９、１９９３）。

【０２７５】 ＦＧＦ，ＦＧＦＲおよびヘパリン間の３成分相互作用の性質の研究から、これ
らの相互作用の約半分がカルボキシレート、リンカーおよびヘパリンの環酸素で
媒介されることが示されている。従って、本明細書に提示される結果は、ある種
の合成非硫酸化ヘパリン由来ジ−およびトリ−サッカライドが生体内でＦＧＦ依
存性ＦＧＦＲ活性化する、報告された能力に対する構造的基盤を与える（オルニ
ッツら、１９９５）。均一な硫酸化パターンを有するヘパリンの合成は困難であ
る。本明細書で提示する構造に基づき、硫酸基が類似の官能基で置換された小分
子ヘパリンアナログを設計することが可能である。従って、我々の構造研究は、
ＦＧＦ活性を調節し得るヘパリン類似体の合理的な設計に対する骨格を確立する
ものである。ＦＧＦが脈管形成に果たす重要な役割、およびその生物学プロセス
が与えられると、合成ヘパリン作動剤および拮抗剤は潜在的な治療上の価値を有
すると思われる。

【０２７６】 結晶性ＦＧＦＲ細胞外ドメイン／ＦＧＦ１複合体 第２の説明のための実施態様において、本発明はＦＧＦ１分子に結合したＦＧ
ＦＲ１ Ｄ２−Ｄ３ドメインの結晶を提供する。本実施態様のＤ２−Ｄ３ドメイ
ンも、残基１４２−３６５で構成され、各Ｄ２−Ｄ３ドメインは１個のＦＧＦ１
分子に結合している。結晶は実施例に示す方法で得られた。天然型結晶、誘導体
結晶または共結晶のいずれでもよいＦＧＦＲ１ Ｄ２−Ｄ３／ＦＧＦ１結晶は、
三斜晶単位格子と空間群対称Ｐ１を有する。非対称単位中に２個のＦＧＦＲ１
Ｄ２−Ｄ３／ＦＧＦ１複合体が存在し、ほぼ２回転軸で関連付けられている。単
位格子の寸法はは約ａ＝６２．５５Å、ｂ＝６４．０６Å、Ｃ＝６４．１４Å、
α＝９３．４０°、β＝１１１．１７°、γ＝９７．１８°である。

【０２７７】 ＦＧＦＲとＦＧＦ１間の結合相互作用 説明のための実施態様のＤ２−Ｄ３／ＦＧＦ１複合体中で、ＦＧＦ１はＤ２，
Ｄ３および２つのドメイン間のリンカーと強く相互作用する。１個の水素結合が
ＦＧＦ１のＴｙｒ１５とＦＧＦＲ１のＬｅｕ１６５の間に見られるが、Ｄ２とＦ
ＧＦ１の間の相互作用の主体は疎水性である。例えば、疎水性接触がＦＧＦ１の
Ｔｙｒ１５、Ｌｅｕ１３３およびＬｅｕ１３５とＤ２のＡｌａ１６７の間、 Ｆ
ＧＦ１Ｔｙｒ９４、Ｌｅｕ１３３およびのＨｉｓ９３とＤ２のＰｒｏ１６９の間
、およびＦＧＦ１のＰｈｅ２２とＦＧＦＲ１のＶａｌ２４８の間に見られる。こ
れらの接触は、Ｄ２−Ｄ３／ＦＧＦ２結晶に対し本明細書に報告した接触と同様
である。

【０２７８】 説明のための実施態様におけるＦＧＦ１とＤ２およびＤ３間のリンカーの間の
相互作用には、ＦＧＦ１のＨｉｓ９３およびＡｓｎ９５とＦＧＦＲ１のＡｒｇ２
５０間の水素結合が含まれる。これらの接触も、Ｄ２−Ｄ３／ＦＧＦ２結晶で本
明細書に報告した接触と同様である。

【０２７９】 さらに、ＦＧＦ１のいくつかの領域が、Ｖａｌ２７９、Ｐｒｏ２８５およびＩ
ｌｅ２８７で形成されたＤ３中の疎水性ポケット中に挿入されたＴｙｒ８を含め
、Ｄ３と相互作用する。さらに、Ｔｙｒ８はＦＧＦＲ１のＧｌｎ２８４との水素
結合に関与する。ＦＧＦファミリーのメンバー間で様々である領域内で、ＦＧＦ
１の残基４６、４８−５１および５４はＦＧＦＲ１のＧｌｎ２８４、Ｐｒｏ２８
５、Ｈｉｓ２８６、Ｇｌｙ３４４およびＡｓｎ３４５とファンデルワールス接触
を行う。ＦＧＦ２のＡｌａ５７、およびＦＧＦ１のＧｌｕ４９はＦＧＦＲ１のＨ
ｉｓ２８６と水素結合を形成する。Ｄ２−Ｄ３／ＦＧＦ２結晶について本明細書
に報告した様に、この後者の領域はＦＧＦＲの結合特異性を決定する上で重要で
あり、従って治療上重要な部位であると考えられる。

【０２８０】 ポリペプチドまたはポリペプチド複合体の単位格子寸法および３次元構造の決 定 結晶が成長するとガラスキャピラリーに入れ、Ｘ線発生装置およびＸ線検出装
置に接続した保持具上に搭載する。Ｘ線回折パターンの収集は文献に十分報告さ
れている。ジュクリュー（Ｄｕｃｒｕｉｘ）およびガイゲ（Ｇｅｉｇｅ）、１９
９２、ＩＲＬ プレス、英国オックスフォード、およびその引用文献。Ｘ線ビー
ムが結晶に入り、そこから回折する。Ｘ線検出装置を結晶から発散する回折パタ
ーンを記録するために用いられる。これらの装置の古いモデル上のＸ線検出装置
はフィルムであるが、近代の装置はＸ線回折散乱をデジタルで記録する。

【０２８１】 ペプチド分子またはペプチド複合体の結晶形の３次元構造を得る方法は公知で
ある。ジュクリュー（Ｄｕｃｒｕｉｘ）およびガイゲ（Ｇｅｉｇｅ）、１９９２
、ＩＲＬ プレス、英国オックスフォード、およびその引用文献。以下にＸ線解
説データから分子または複合体の３次元構造を決定するプロセスを記す。

【０２８２】 結晶からＸ線回折パターンを収集後、単位格子の寸法および結晶中の配向を決
定する。それらは回折放射光からの距離、およびこれらの放射光がつくるパター
ンから決定できる。単位格子の寸法は、オングストローム単位（１Å＝１０^-10
メートル）と各頂点での角度で特徴付けられる。結晶中の単位格子の対称もこの
段階で特徴付けられる。結晶中の単位格子の対称は、繰り返しパターンを同定す
ることで収集したデータの複雑さを簡略にする。対称と単位格子の寸法の応用を
以下に記す。

【０２８３】 各回折放射はベクターとして特徴付けられ、この方法のこの段階で収集された
データが各ベクターの振幅を決定する。ベクターの位相は複数の方法で決定し得
る。一つの方法では、結晶中に重原子を吸収させるが、この方法は同形置換と呼
ばれる。ベクターの位相はこれらの重金属をＸ線解析の参照点として用いて決定
される。オトウィノウスキー（Ｏｔｏｗｉｎｏｗｓｋｉ）、１９９１、ダレスブ
リー（Ｄａｒｅｓｂｕｒｙ）、英国、８０−８６。同形置換法には通常、１個以
上の重原子誘導体が必要である。別な方法では、既に決定された構造を有する結
晶性ポリペプチドからのベクターの振幅と位相を、構造未知の結晶性ポリペプチ
ドからの振幅に適用し、その結果からこれらのベクターの位相を決定する。個の
２番目の方法は分子置換として知られ、参照として用いられるタンパク質の構造
は問題のタンパク質と近似した構造を持つ必要がある。ナザラ（Ｎａｚａｒａ）
、１９９４、Ｐｒｏｔｅｉｎ １１：２８１−２９６。従って、本明細書に報告
する様な既知の構造のレセプターＰＴＫからのベクター情報は、構造未知の他の
レセプターＰＴＫの分子置換解析に有用である。

【０２８４】 結晶の単位格子を記載するベクターの位相が決定されると、ベクター振幅およ
び位相、単位格子の寸法、および単位格子の対称をフーリエ変換関数の項として
使用できる。フーリエ変換関数がこれらの測定から単位格子内の電子密度を計算
する。単位格子内で分子または分子複合体の一つを記載する電子密度は、電子密
度マップと呼ばれる。配列のアミノ酸構造、または結晶性ポリペプチドと複合体
を形成した化合物の分子構造を、次に様々なコンピュータープログラムを用いて
電子密度に当てはめる。プロセスのこの工程は時にはモデル構築と呼ばれ、ＴＯ
Ｍ／ＦＲＯＤＯ等のコンピュータープログラムを用いて行われる。ジョーンズ（
Ｊｏｎｅｓ）、１９８５、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １１５：
１５７−１７１。

【０２８５】 次に理論的な電子密度マップを、実験的に決定した電子密度に合うアミノ酸構
造から計算する。理論的および実験的電子密度マップを相互に比較し、これらの
２つのマップ間の一致をＲ−因子と呼ばれるパラメーターで記載する。Ｒ−因子
が低い値であることは、理論的および実験的電子密度マップ間の電子密度の重な
り度が高いことを意味する。

【０２８６】 次にＲ−因子を、理論的電子密度マップを精密化するコンピュータープログラ
ムを用いて最小にする。Ｘ−ＰＬＯＲ等のコンピュータープログラムが当業者に
よりモデルの精密化に用いられる。ブリュンガー（Ｂｒｕｎｇｅｒ）ら、１９９
２、Ｎａｔｕｒｅ ３５５：４７２−４７５。精密化は反復法により行われる。
最初の工程では電子密度マップで定義された原子のコンフォーメーションを変化
させる。原子のコンフォーメーションを、結合の振動周期を増加させ、構造中の
原子の位置を変化させる温度上昇をシミュレートすることにより変化させる。電
子動揺プロセスにおける特定の点で、可能な結合角と結合長さ、ファンデルワー
ルス相互作用、水素結合、イオン性相互作用および疎水性相互作用に換算して原
子間の相互作用を定義する力の場を原子系に適用する。有利な相互作用を自由エ
ネルギーに換算して記載し、自由エネルギーの最小値が得られるまで原子を何回
も反復して移動させる。この精密化プロセスをR値が最小値に達するまで反復す
る。

【０２８７】 分子または分子複合体の３次元構造は、最小R値で特徴付けられる理論的電子
密度に当てはまる原子で記載される。各原子を３次元中の座標で定義する３次元
構造に対しファイルを作成する。この様な構造座標ファイルの例が表１−４およ
び６に定義される。

【０２８８】 Ｖ．幹細胞因子 幹細胞因子（ＳＣＦ）は、造血細胞の生存、増殖および分化に関係する成長因
子である。ＳＣＦはまた、肥満細胞成長因子（ＭＣＧＦ）、スチール（Ｓｌ）細
胞因子（ＳＬＦ）またはｋｉｔリガンド（ＫＬ）として知られている。ＳＣＦは
肥満細胞生産および機能に重要であり、メラノサイト、生殖細胞および腸ペース
メーカー細胞の発育に重要な役割を果たす。ＳＣＦは、ｃ−ｋｉｔと命名される
レセプタータンパク質チロシンキナーゼに結合し活性化することにより、その生
物的効果を媒介すると信じられている。他のＲＰＴＫリガンドと同様、ＳＣＦは
ｃ−ｋｉｔの二量体化と、その後の細胞質タンパク質チロシンキナーゼドメイン
のトランス自己燐酸化を誘発し、信号発信タンパク質、基質のチロシン燐酸化お
よび複数の信号発信経路の補強を導く。

【０２８９】 幹細胞因子（ＳＣＦ）は肥満細胞、メラノサイトおよび生殖細胞の生存、増殖
および分化を刺激することにより、造血に重要な役割を果たし得ると信じられて
いる。その造血回復促進能のため、ＳＣＦは動物およびヒトの双方で十分に試験
されている。ＳＣＦ処理により末梢血好中球および造血先祖細胞の数を増加させ
、血小板およびリンパ球の数を適度に増加させることが示されている。ＳＣＦは
単独、または他のサイトカインと組み合わせて、化学療法の血液損傷を減らすた
めに用いられる。別な臨床試験では、ＳＣＦはＧ−ＣＳＦの能力を増進し、末梢
血造血先祖細胞および幹細胞を運動させるのに有効であることも証明されている
。骨髄除去治療を受けた患者にこれらの細胞を移植して造血系を再構成すること
も可能と信じられている（ニコラ（Ｎｉｃｏｌａ）ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅ
ｍ．５２，１−６５（１９９８））。

【０２９０】 ＳＣＦは天然では膜固定で存在し、可溶性同形は別なＲＮＡスプライシングと
プロテアーゼ処理により得られる。ＳＣＦの可溶形は１６５個のアミノ酸を有す
るが、そのレセプター結合コアは最初の１４１残基にマッピングされている（ラ
ングレイ（Ｌａｎｇｌｅｔ）ら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．
３１１：５５−６１、１９９４）。ＳＣＦは非共有結合ホモ二量体として機能す
るが、瀬入り条件下ではＳＣＦの大部分は単量体として存在すると報告されてい
る。ＳＣＦの二量体化は動的なプロセスであり、ＳＣＦＲ結合親和性と炉瀬ぷた
ー活性化の制御に調節的役割を果たすと考えられる。

【０２９１】 ＳＣＦと他の成長因子との比較 ＳＣＦは短鎖ラセン状サイトカインファミリーに属する（バザン（Ｂａｚａｎ
）、１９９１；ロツバルスキ（Ｒｏｚｗａｒｓｋｉ）ら、１９９４）が、他のサ
イトカインとの類似性はその全体としての褶曲構造に限られている。１次構造は
極めて弱い類似性を示し、配列は２次構造の比較でのみ決定される（図２０）。
ＳＣＦの構造はＭ−ＣＦＳの構造に最も似ている（パンディット（Ｐａｎｄｉｔ
）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８：１３５８−１３６２、１９９２）。２つのタン
パク質のコアである４本のヘリックス束は比較的良く重なり合い、αＣ原子でｒ
ｍｓ偏差は１．９８Åである。しかしながら、ヘリックスを重ね合わせると、２
本のβ鎖はかなり外れる。残基２９から４１および残基９０から９８のＳＣＦの
２本のループはＭ−ＳＣＦのものより突き出している。二量体のインターフェー
スで、残基６１から７２由来のＳＣＦループもコアから遠くに突き出し、第２の
プロトマー由来の同じループと詰め合っている。本明細書に報告するＸ線結晶学
の研究では、２個のＭ−ＣＳＦプロモーター間の接触に比べてＳＣＦの２個のプ
ロモーター間がより接触している。さらに、Ｍ−ＣＳＦは分子間ジスルフィド結
合で繋がれた共有結合ホモ二量体であるが、ＳＣＦは非共有結合ホモ二量体であ
る。Ｒｌｔ３リガンドも非共有結合ホモ二量体であるが、Ｍ−ＣＳＦと同様に余
分な分子間ジスルフィド結合を有する。それにも拘わらず、ｆｌｔ３リガンドの
構造（ハナム（Ｈａｎｎｕｍ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３６８：６４３−６４８、１
９９４）は、以前に報告されたＭ−ＣＳＦの結晶構造（パンディットら、Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２５８：１３５８−１３６２、１９９２）と共に、本明細書に報告す
る結晶構造に基づき妥当な確信をもって予見し得る。

【０２９２】 ジスルフィドで結合した、レセプターチロシンキナーゼの他の２つレセプター
チロシンキナーゼであるのＰＤＦＧおよびＭ−ＣＳＦホモ二量体とは対照的に、
ＳＣＦは非共有結合ホモ二量体として機能する（パンディットら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２５８：１３５８−１３６２、１９９２）。ＳＣＦの２価結合性がｃ−ｋｉ
ｔの細胞外リガンド結合ドメインの二量体化に寄与する原動力である。従って、
ＳＣＦ二量体生成を制御する分子相互作用の解析が、ｃ−ｋｉｔの活性化機構を
理解する上で重要である。

【０２９３】 ＳＣＦの二量体化はｐＨおよび塩濃度の変化に敏感であることが知られている
。この性質は、インターフェースが部分的には周辺での塩架橋を経由する極性相
互作用と、インターフェースのコアに埋め込まれた極性残基間の水分子を媒介と
する水素結合で生成するという事実によると考えられる。ＳＣＦの二量体化に関
与する残基を同定する試みで、Ｐｈｅ６３Ｃｙｓ突然変異体が発生し、レセプタ
ー結合活性が検討された（フュー（Ｈｓｕ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７
１：６４０６−６４１５、１９９７）。この突然変異により共有結合ＳＣＦ二量
体が生成することが示された。しかしながら、突然変異ＳＣＦ二量体は生物学的
には不活性であった。本明細書で報告するＳＣＦインターフェースの構造は、こ
の突然変異体の活性の欠如がうまく説明されている（図２１参照）。この構造で
は、２個の対称的に関係したＰｈｅ６３の側鎖間の最短距離は８Åであり、十分
に配位した水分子がその間を占める。ＳＣＦ二量体の２次および３次構造を乱さ
ずにこれらの２個の残基間にジスルフィド結合を生成することは不可能である。

【０２９４】 ＳＣＦのドメインの交換および共有結合二量体 組み替えＳＣＦは、Ｅ．ｃｏｌｉ中に変性形で抱合体として発現し、再褶曲お
よび酸化を含むプロセスで活性ＳＣＦが生成する。再褶曲−酸化タンパク質のご
く一部がＳＣＦの共有結合ジスルフィド結合型であることが以前に報告されてい
る。興味のあることに、共有結合ＳＣＦ二量体は若干親和性が低下してｃ−ｋｉ
ｔと結合するが、造血細胞の刺激にはより強力である。分光学的方法により２次
および３次構造を比較すると、共有結合二量体は非共有結合二量体と区別できな
いことが示された（ルー（Ｌｕ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１１３
０９−１１３１６、１９９６）。驚くべきことに、共有結合二量体のジスルフィ
ド結合は、突然変異タンパク質中のジスルフィド結合が分子間であること以外は
非共有結合二量体のジスルフィド結合と同じであることが見出された。すなわち
、１つのプロモーター由来のＣｙｓ４およびＣｙｓ４３は、第２のプロモーター
のＣｙｓ８９およびＣｙｓ１３８それぞれとジスルフィド結合を形成している。
従って、共有結合二量体は、２つのモノマー間のヘリックスαＡおよびαＤの３
次元ドメインの交換で生成し得ることが提案された（ルーら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２７１：１１３０９−１１３１６、１９９６）。本明細書に報告される
ＳＣＦの３次元構造を詳細に調べると、二量体のＣ２対称によりこれらのヘリッ
クスがプロモータ間で交換されるが、全体の構造と各プロモーターの尾部での表
面は同じに保たれることが示される。図２３はヘリックスαＡとαＤを２つのプ
ロモーター間で交換することにより作成したモデルを示す。興味のあることに、
最初の二量体由来のヘリックス間のコア似おける相互作用は、交換されたモデル
中でも保存されるが、Ｃ２軸周りのループと分子鎖の配向は調節される必要があ
る。ジスルフィドペアは、それらが非共有結合二量体では分子間であり、共有結
合二量体では分子内であること以外は両者の形で同一である。ＩＬ−５、ＩＬ−
１０およびＩＦＮ等の他のヘリックス束サイトカインは類似の共有結合で組み合
わされた二量体を自然に形成すると報告されていることは注目に値する。一方の
のプロモーター由来のＩＬ−５、ヘリックスαＤおよび鎖２では、他方のプロモ
ーター由来のヘリックスαＡ、αＢ，αＣおよび鎖１と共に２ドメイン二量体の
１角ドメインを形成する。実際、構造の対称性のために、単量体ＩＬ５突然変異
体を生成することが可能であった（ディカソン（Ｄｉｃｋａｓｏｎ）ら、Ｎａｔ
ｕｒｅ ３７９：６５２−６５５、１９９６；ディカソンら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅ
ｄ．７４：５３５−５４６、１９９６；エドガートン（Ｅｄｇｅｒｔｏｎ）ら、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２０６１１−２０６１８）。同じ証拠により
、新しいタイプの組み込まれた共有結合ＳＣＦ二量体を、ヘリックスαＡと鎖１
、および鎖２とヘリックスαＤの間に共有結合二量体構造に有利である突然変異
を導入することにより形成することも可能であった。ヘリックス状サイトカイン
間の尾と畳構造と二量体対称の類似性は、それらの共通の起源を反映していると
考えられる。

【０２９５】 ３次元ドメイン交換はオリゴマー集合の一般的規制機構であると考えられてい
る。即ち、オリゴマーは、進化の間、または制御された実験室条件下でドメイン
を交換することにより安定な単量体から生成する（ベネット（Ｂｅｎｅｔｔ）ら
、１９９５）。正常な生理条件下では、可溶性ＳＣＦの大部分は単量体として存
在することが示唆されている。ＳＣＦの単量体と二量体間のバランスは、生体内
の標的細胞上でｃ−ｋｉｔを活性化する生理的要請と結びついていると思われる
。しかしながら、治療上の目的では、造血の回復を刺激する一方で肥満細胞の有
意な活性化を避けるため低用量で投与し得るため、より強力なジスルフィド結合
が一般に好ましい（ノッカ（Ｎｏｃｋａ）ら、Ｂｌｏｏｄ ９０：３８７４−３
８８３、１９９７）。

【０２９６】 ＳＣＦのレセプター結合領域 ＳＣＦ二量体は可溶性または膜結合型のｃ−ｋｉｔと高い親和性と特異性で結
合することが知られている。ＳＣＦのｃ−ｋｉｔへの結合を、部位指向突然変異
誘発と、部位特異性抗ｃ−ｋｉｔ抗体によるエピトープマッピングによる生化学
的方法で解析した。Ｎ−末端からの残基１から３の欠失が、ＳＣＦのｃ−ｋｉｔ
への結合を約５０％減少させることが報告された。Ｃｙｓ４の欠失はＳＣＦを不
活性化するが、Ｃｙｓ１３８の欠失とＣ−末端からの追加残基はＳＣＦ活性を変
えただけであった。その上、１対のジスルフィド結合を除去するＳＣＦのＣｙｓ
４３ＡｌａおよびＣｙｓ１３８ＡＬａの二重突然変異も、部分的に活性なＳＣＦ
を与える結果となった。これらの実験は、ＳＣＦのＮ−末端、およびＣｙｓ４−
Ｃｙｓ８９ジスルフィド結合の完全さが完全なＣＳＦ活性に重要であることを示
した。

【０２９７】 様々なＳＣＦ／Ｍ−ＣＳＦキメラタンパク質の活性を解析することにより、Ａ
ｒｇ１２１、Ａｓｐ１２４、Ｌｙｓ１２７およびＡｓｐ１２８がＳＣＦ活性に必
須であることが示された（マトウス（Ｍａｔｏｕｓ）ら、Ｂｌｏｏｄ ８８：４
３７−４４４、１９９６）。その上、ＳＣＦ上の異なったエピトープを中和する
抗体を使用することにより、アミノ酸６１から６５、および９１から９５の両側
に位置する領域もＳＣＦ活性に必須であることが示された（メンジアズ（Ｍｅｎ
ｄｉａｚ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３９：８４２−８４９、１９９
６）。一般に生化学的方法でマップされた領域は、各ＳＣＦの尾の領域のごく近
傍に位置する。この領域はαＣの末端に疎水性残基Ｐｈｅ１０２、Ｌｅｕ９８、
Ｐｒｏ３４、Ｔｙｒ３２、およびＣｙｓ４３−Ｃｙｓ１３８ジスルフィド架橋で
つくられた深い割れ目を含む（図２４参照）。割れ目に続いて、３個の荷電パッ
チ、すなわち正荷電パッチ（Ａｒｇ５、Ａｒｇ７およびＬｙｓ１２７）と、その
後の負荷電パッチ（Ａｓｐ８４、Ａｓｐ８５、Ｇｌｕ８８およびＧｌｕ９２）、
さらに正荷電パッチ（Ｌｙｓ９１、Ｌｙｓ９９、Ｌｙｓ１００およびＫｙｓ１０
３）がある。図２４は正荷電パッチと負荷電パッチと共に、疎水性割れ目を示す
。この表面はリガンド／レセプター相互作用に対すしアンカーおよび特異性を提
供する荷電した相互作用、および複合体形成のためのエンタルピーを提供する疎
水性相互作用を有するレセプター結合部位として機能する。

【０２９８】 ヒトおよびげっ歯類のＳＣＦの保存性は高いが、レセプター結合領域の一部と
して機能する荷電パッチは極めて多様である（図２５参照）。げっ歯類ではヒト
ＳＣＦの第１の正荷電パッチ中の残基Ａｒｇ５とＡｒｇ７がグリシンおよびプロ
リン残基それぞれで置換される。第２の正荷電パッチでは、マウスとラットで残
基Ｌｙｓ１００とＬｙｓ９１がグルタメート残基で置換される。これらの荷電は
、報告されたヒトｃ−ｋｉｔに対するヒトおよびマウスＳＣＦの結合親和性にお
ける差の理由である。

【０２９９】 天然およびＣＨＯ細胞由来の組み替えＳＣＦを複数のアスパラギン、セリンお
よびトレオニン残基でグリコシル化する。グリコシル化ＳＣＦのレセプター結合
性は、図２４で示したＳＣＦＲ結合領域の割り当てと一致している。ＳＣＦの機
能性コア中に４つの推定アスパラギングリコシル化部位−Ａｓｎ６５、Ａｓｎ７
２、Ａｓｎ９３およびＡｓｎ１２０−がある。Ａｓｎ７２はグリコシル化されて
いないが、その理由はおそらく、その側鎖が二量体インターフェース中に埋め込
まれているためと思われる。しかしながら、Ａｓｎ１２０、Ａｓｎ６５およびＡ
ｓｎ９３の側鎖は構造中で溶媒に接近可能なままであり、実際、異なった程度で
グリコシル化されている。Ａｓｎ１２０は常にグリコシル化されるが、これはＳ
ＣＦのｃ−ｋｉｔに対する結合に影響しない。対照的に、Ａｓｎ６５とＡｓｎ９
３はすべてではなく、いくつかのＳＣＦ分子でグリコシル化されている。重要な
ことは、これらのアスパラギン残基のグリコシル化がＳＣＦのＳＣＦＲに対する
結合に悪影響を及ぼすことである。本明細書で報告した構造は、これらの残基の
グリコシル化のＳＣＦ活性に対する悪影響の説明を提供する。Ａｓｎ９３のグリ
コシル化は、この残基が酸性パッチと疎水性割れ目のごく近くに位置しているの
で、ＳＣＦのｃ−ｋｉｔへの結合を妨げると思われる。一方、Ａｓｎ６５は二量
体インターフェースの近くに位置し、この残基のグリコシル化はＳＣＦの二量体
化を妨害すると考えられる。

【０３００】 ＳＣＦ：ＳＣＦＲ複合体のモデル いくつかのレセプターチロシンキナーゼの細胞外リガンド結合ドメインは複数
のＩｇ様ドメインを含む。例えば、ＦＧＦレセプターの細胞外ドメイン外ドメイ
ンは３個のＩｇ様ドメインを含むが、ｃ−ｋｉｔが属するＰＤＧＦレセプターフ
ァミリーの細胞外ドメイン外ドメインは５個のＩｇ様ドメインで構成される。同
様に、ＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメイン外ドメインは７個のＩｇ様ドメイン
を含むと報告されている。これらのレセプターのリガンドは極めて多様であるが
、レセプターの３種のファミリー中のリガンド結合領域がＩｇ様ドメイン２およ
び３にマッピングされている（例えばプロトニコフら、Ｃｅｌｌ ９８：６４１
−６５０、１９９９参照）。ＦＧＦおよびＶＥＧＦレセプターのリガンド結合ド
メインの構造決定は、ＦＧＦおよびＶＥＧＦがそれぞれのレセプターに異なった
方法で結合することを示した。ＦＧＦ：ＦＧＦＲ複合体では、２つのレセプター
は１つの面を向き合わせて詰め込まれ、リガンドが第２の面を占有している。一
方、２つのＶＥＧＦＲはＶＥＧＦ二量体の離れた末端に結合し、リガンドが大文
字Ａの横棒を表す反転“Ａ”形の複合体を生成する。ＳＣＦは二量体として機能
するので、ｃ−ｋｉｔに対するＳＣＦ結合はＶＥＤＦＧＦ：ＶＥＧＦＲ複合体に
対して報告された構造に類似すると期待される。

【０３０１】 ＳＣＦ二量体のＸ線結晶構造が、ＳＣＦ：ｃ−ｋｉｔ複合体形成および二量体
化のモデルを構築するために用いられた。ＦＧＦＲの構造を鋳型として用いて、
Ｉｇ様ドメイン２−３に対するモデルの他、ｃ−ｋｉｔの４−５に対するモデル
が開発された。次いでＩｇ様ドメイン２−３を、ＦＧＦ２に対するＦＧＦＲ結合
様式をとる提案されたＳＣＦ結合表面とドッキングした（プロトニコフら、Ｃｅ
ｌｌ ９８：６４１−６５０、１９９９）。さらに、Ｉｇ様ドメイン４および５
の配向を調節して、先の生化学研究で示唆された様なドメイン４間の相互作用を
可能にした（ブレヒマン（Ｂｌｅｃｈｍａｎ）ら、Ｃｅｌｌ ８０：１０３−１
１３、１９９５；図２６参照）。

【０３０２】 ｃ−ｋｉｔはＭ−ＳＣＦＲ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲαおよびｆｌｔ３も含
むＲＴＫのあるファミリーに属する。それらの１次構造を比較すると、これらの
ＲＴＫはそのリガンドよりはるかに保存されていることが示される。実際、ＰＦ
ＧＦ−ＡおよびＰＤＧＦ−Ｂの構造は、Ｍ−ＣＳＦおよびＳＣＦ、多分ｆｌｔリ
ガンドの構造とも劇的に異なっている。ＲＴＫの類似性はまた、そのヒトおよび
マウス遺伝子の染色体の局在化に反映している（コンドー（Ｋｏｎｄｏ）ら、Ｇ
ｅｎｅ ２０８：２９７−３０５、１９９８）。このＲＴＫのファミリーは、い
くつかの遺伝子複製を行った共通の祖先遺伝子から進化したと考えられる。４束
ヘリックス構造を有するリガンド（すなわちＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ）に結合し活性
化されるＲＴＫは、まず造血に関与するが、ＲＴＫの個のファミリーの他のメン
バーはより広い発現パターンを示し、成長の制御といくつかの組織および器官の
発育に関与している。

【０３０３】 ＳＣＦの３次元構造の決定は、ｃ−ｋｉｔの細胞外ドメインを有する複合体中
のＳＣＦの構造決定を促進し、治療用ＳＣＦアナログのより強力な形の設計と生
産を可能にする。本明細書に報告した詳細な構造で、治療の可能性の高い新規Ｓ
ＣＦ突然変異体の設計が今や可能である。

【０３０４】 VI．結晶および原子構造座標の使用 本発明の結晶、特にそれから得られた原子構造座標は、多様な用途を有する。
例えば、本明細書に報告された結晶を公知の任意の方法でＲＰＴＫに対する出発
原料として使用し得る。この様な使用法には、例えばＲＰＴＫの天然または突然
変異細胞外ドメインに結合する分子の同定が含まれる。結晶と構造座標は、新し
い治療薬の開発に向けたアプローチとして、ＲＰＴＫ機能の調節因子である化合
物を同定するのに特に有用である（例えばレビッツキ（Ｌｅｖｉｔｚｋｉ）およ
びガーツィット（Ｇａｚｉｔ）m１９５５、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：１７８２−
８）。

【０３０５】 本明細書に報告した構造座標を、別な天然型または突然変異レセプターＰＴＫ
細胞外ドメインの結晶の他、リガンド、リガンドアナログ、阻害剤、活性化剤、
拮抗剤、作動剤、ポリペプチド、および他の分子と複合体を形成したドメインの
共結晶の構造決定の位相決定モデルとして使用し得る。構造座標と、それから得
られた３次元構造のモデルを、ＮＭＲで得られる構造等の天然型または突然変異
レセプターＰＴＫの溶液系構造の解明の一助として使用できる。従って、本発明
の結晶および構造座標は、レセプターチロシンキナーゼの構造と機能を解明する
ための便利な手段を提供する。

【０３０６】 簡便化と議論の目的で、本発明の結晶を特定のＦＧＦＲ１ Ｄ２−Ｄ３／ＦＧ
Ｆ２およびＦＧＦＲ１ Ｄ２−Ｄ３／ＦＧＦ１の結晶例を参照して説明する。当
業者は、本明細書に記載された原理は、ＰＦＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、Ｈ
ＧＦＲ、ニューロトロピンＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、インスリンＲ、
ＩＧＦＲ、ＣＳＦＩＲ、ＦＬＫ、ＫＤＲ、ＶＥＧＧＦＲ２、ＣＣＫ４、ＭＥＴ、
ＴＲＫＡ、ＡＸＬ、ＴＩＥ、ＥＰＨ、ＲＹＫ、ＤＤＲ、ＲＯＳ、ＲＥＴ、ＬＴＫ
、ＲＯＲＩ、ＭＵＳＫ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３およびＦＧＦＲ４
等のＦＧＦＲファミリーのメンバー、およびオルファンレセプターＰＴＫを含む
がそれに限定されない、任意のレセプターチロシンキナーゼの細胞外ドメインの
結晶に一般的に適用し得ることを理解すると考えられる。

【０３０７】 VII．構造座標を用いる構造未知のＰＴＫの構造決定 表１−４および６に示した構造座標を、構造未知のＲＰＴＫの３次元構造決定
に使用することができる。以下に記す方法は、構造既知のポリペプチドの構造座
標を、アミノ酸配列、Ｘ線結晶学回折データ、または各磁気共鳴（ＮＭＲ）デー
タ等の他のデータセットに適用することができる。本発明の好ましい実施態様は
、レセプターＰＴＫと関連するポリペプチドの３次元構造決定に関する。これら
にはＰＦＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＨＧＦＲ、ニューロトロピンＲ、ＨＥ
Ｒ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、インスリンＲ、ＩＧＦＲ、ＣＳＦＩＲ、ＦＬＫ、Ｋ
ＤＲ、ＶＥＧＧＦＲ２、ＣＣＫ４、ＭＥＴ、ＴＲＫＡ、ＡＸＬ、ＴＩＥ、ＥＰＨ
、ＲＹＫ、ＤＤＲ、ＲＯＳ、ＲＥＴ、ＬＴＫ、ＲＯＲＩ、ＭＵＳＫ、ＦＧＦＲ１
、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３およびＦＧＦＲ４、およびオルファンレセプターＰＴ
Ｋ等のレセプターＰＴＫが含まれる。

【０３０８】 アミノ酸の相同を用いる構造 相同モデル化は、構造既知のポリペプチドの構造座標を構造未知のポリペプチ
ドのアミノ酸配列に適用する方法である。この方法は、ポリペプチドまたはポリ
ペプチド複合体の３次元構造のコンピューター表示、構造既知および未知のポリ
ペプチドのコンピューター表示、およびアミノ酸の構造の標準コンピューター表
示を用いて行われる。相同モデル化は（ａ）構造既知および未知のポリペプチド
のアミノ酸配列を決定する工程；（ｂ）既知の構造中の保存性アミノ酸の座標を
、構造未知のポリペプチドの対応するアミノ酸に移す工程；（ｃ）ポリペプチド
の残りの構造を構築する工程；および（ｄ）サブセット３次元構造を精密化する
工程でなる。当業者は、２つのタンパク質間の保存性アミノ酸を配列決定工程（
ａ）で決定し得ることを理解すると考えられる。

【０３０９】 上記の方法は当業者に公知である。グリール（Ｇｒｅｅｒ）、１９８５、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２２８：１０５５；ブルンデルら、１９８８、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．１１７２：５１３。当業者により相同モデル化に現在利用されている
コンピュータープログラムは、モレキュラーシミュレーション社（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ Ｉｎｃ）によるＩｎｓｉｇｈｔIIモデル化パッケ
ージ中の相同モジュールである。

【０３１０】 アミノ酸配列決定は、まず構造既知のポリペプチドのアミノ酸配列のコンピュ
ーター表示を構造未知のポリペプチドのアミノ酸配列上に置くことで行われる。
次に配列中のアミノ酸を比較し、相同であるアミノ酸のグループ（例えば脂肪族
、芳香族、極性または荷電等の化学的性質で類似のアミノ酸側鎖）を一緒にグル
ープ分けする。この方法により、ポリペプチドの保存性領域を検出し、アミノ酸
の挿入または欠失を明らかにする。

【０３１１】 構造既知および未知のポリペプチドのアミノ酸配列が決定されると、既知の構
造のポリペプチドのコンピューター表示中の保存性アミノ酸の構造がその構造が
未知のポリペプチドの対応するアミノ酸に移される。例えば、構造既知のアミノ
酸配列中のチロシンが、構造未知のアミノ酸配列中の対応する相同アミノ酸であ
るフェニルアラニンで置換される。

【０３１２】 非保存性領域に位置するアミノ酸の構造は、標準のペプチド立体配置または分
子動力学等の分子シミュレーション法を用いて指定される。この方法の最終工程
は、分子動力学および／またはエネルギー最少化を用いて全構造を精密化して行
われる。

【０３１３】 相同モデル化法は公知であり、異なったタンパク質分子を用いて実行されてき
た。例えば、セリン／トレオニンタンパク質キナーゼ、ミオシン軽鎖タンパク質
キナーゼの触媒ドメインに対応するポリペプチドの３次元構造がｃＡＭＰ依存性
タンパク質キナーゼ触媒サブユニットから相同モデル化された。キングトン（Ｋ
ｉｎｇｈｔｏｎ）ら、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８：１３０−１３５。

【０３１４】 分子置換を用いる構造 分子置換は、構造既知のポリペプチドのＸ線回折データを構造未知のポリペプ
チドのＸ線回折データに適用する方法である。この方法は、振幅のみが知られて
いる構造未知のポリペプチドのＸ線回折データを記述する位相を決定するために
用いられる。Ｘ−ＰＬＯＲが、一般的に利用される分子置換に用いられるコンピ
ューターソフトウエアパッケージである。ブルンガー（Ｂｒｕｎｇｅｒ）、１９
９２、Ｎａｔｕｒｅ ３５５：４７２−４７５。ＡＭＯＲＥは分子置換に用いら
れる他のプログラムである。ナバザ（Ｎａｖａｚａ）、１９９４、Ａｃｔａ Ｃ
ｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ａ５０：１５７−１６３。得られた構造が３Å以上の根
平均二乗偏差を示さないことが好ましい。

【０３１５】 分子置換のゴールは、２つの結晶からの電子回折データを一致させることによ
り、単位格子内で原子の位置を決定することである。Ｘ−ＰＬＯＲ等のプログラ
ムは４つの工程を含む。最初の工程は単位格子内の分子の数を決定し、分子間の
角度を決めることである。第２の工程は回折データを回転して、単位格子内で分
子の配向を決めることである。題３の工程は、分子の位置を単位格子内で正しく
置くため、電子密度を３次元に翻訳することである。Ｘ線回折データの振幅と位
相が決まると、参照データセットから実験的に計算された電子回折マップと、新
しいデータセットから計算された電子回折マップを比較してＲ因子が計算される
。３０−５０％のＲ因子は、単位格子内の原子の配向がこの方法で合理的に決定
されたことを示す。プロセスの第４の工程は、本明細書似記載され公知である繰
り返し精密化法を用いて、新しい電子密度マップを精密化してＲ因子をほぼ２０
％に減らすことである。

【０３１６】 ＮＭＲデータを用いる構造 Ｘ線結晶学技術由来のポリペプチドまたはポリペプチド複合体の構造座標を、
核磁気共鳴（ＮＭＲ）データ由来のポリペプチドの３次元構造の解釈に利用でき
る。この方法は当業者に使用されている。ウスリッヒ（Ｗｕｔｈｒｉｃｈ）、１
９８６、ジョンワイリーアンドサンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ
）、ニューヨーク：１７６−１９９；フルグラス（Ｐｆｌｕｇｒａｔｈ）ら、１
９８６、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １８９：３８３−３８６；ク
ライン（Ｋｌｉｎｅ）ら、１９８６、Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
１８９：３７７−３８２。ポリペプチドの２次構造は２次元ＮＭＲデータを利用
して容易に決められることが多いが、２次構造の個々の断片間の空間関係決定は
容易ではない。Ｘ線結晶学技術由来のポリペプチドの３次元構造を定義する座標
は、ＮＭＲスペクトル学者を関連する構造のポリペプチド中の２次構造要素間の
空間的相互作用の理解に導くことができる。

【０３１７】 ２次構造要素間の空か相互作用の知識は、２次元ＮＭＲ実験からの核オーバハ
ウザー効果（ＮＯＥ）データを大いに簡略化することがでいる。さらに、ＮＭＲ
技術による２次構造決定後に結晶学座標を適用することは、ポリペプチド配列中
の特定のアミノ酸に関連するＮＯＥの割り当てを簡略化するのみであって、ポリ
ペプチド構造のＮＭＲ解析に大きな偏見を抱かせるものではない。逆に言えば、
ポリペプチドの２次構造を決定する一方でＮＯＥデータを簡略化するために結晶
学座標を使用することは、タンパク質構造のＮＭＲ解析に偏見を持たせる。

【０３１８】 ＮＭＲ法によるポリペプチドの構造の解析は比較的新しい技術であり、ＲＰＴ
Ｋの構造を定義する構造座標の使用は近い将来より頻繁に用いられる可能性が高
い。方法が進歩すると、ＲＰＴＫ細胞外ドメインと同じ大きさのポリペプチドの
３次元構造解析がより頻繁になると考えられる。

【０３１９】 VIII．構造座標を利用するＰＴＫ機能調節因子の構造に基づく設計 構造に基づく調節因子の設計および同定法は、多様な潜在的調節因子と化学官
能基基を含むコンピューターデータベースの検索を含む強力な技術である。調節
因子のコンピューター化設計および同定は、化学ライブラリーより多くの、しば
しば２桁台の大きさで、化合物を含むコンピューターデータベースとして有用で
ある。構造に基づく薬剤設計および同定のレビューとしては、クンツ（Ｋｕｎｔ
ｚ）ら、１９９４、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２７：１１７；グイダ（Ｇｕｉ
ｄａ）、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏ
ｌ．４：７７７；コールマン（Ｃｏｌｍａｎ）、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏ
ｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．４：８６８参照。

【０３２０】 構造座標で定義されるポリペプチドの３次元構造をこの様な設計法で利用する
ことができる。表１または表２の構造座標を個の方法で利用できることが好まし
い。さらに、本明細書似報告した相同性、分子置換およびＮＭＲ技術で決定され
たＲＰＴＫの３次元構造を、調節因子設計および同定法に応用することもできる
。従って、ＰＤＦＧＲ、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＨＧＦＲ、ニューロトロピンＲ
、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、インスリンＲ、ＩＧＦＲ、ＣＳＦＩＲ、ＦＬ
Ｋ、ＫＤＲ、ＶＥＧＦＲ２、ＣＣＫ４、ＭＥＴ、ＴＲＫＡ、ＡＸＬ、ＴＩＥ、Ｅ
ＰＨ、ＲＹＫ、ＤＤＲ、ＲＯＳ、ＲＥＴ、ＬＴＫ、ＲＯＲ１、ＭＵＳＫ、ＦＧＦ
Ｒ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、およびＦＧＦＲ３等のＦＧＦＲファミリーのメ
ンバー、およびオルファンレセプターＰＴＫ等のレセプターＰＴＫの構造を、本
明細書に記載の方法で利用することができる。

【０３２１】 分子データベース検索による設計 合理的な調節因子設計検索の１つの方法は、分子のデータベースから化合物の
コンピューター表示との突き合わせにより調節因子を検索することである。一般
に利用できるデータベースは： ａ）モレキュラーデザイン社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｓｉｎ Ｌｉｍｉｔｅ
ｄ）のＡＣＤ ｂ）国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の
ＮＣＩ ｃ）ケンブリッジ結晶学データセンター（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｃｒｙｓｔａ
ｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ Ｄａｔａ Ｃｅｎｔｅｒ）のＣＣＤＣ ｄ）ケミカルアブストラクトサービス（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔ
Ｓｅｒｖｉｃｅ）のＣＡＳＴ ｅ）デルベントインフォメーション社（Ｄｅｒｗｅｎｔ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉ
ｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ）のＤｅｒｗｅｎｔ ｆ）メイブリッジケミカル社（Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍ
ｐａｎｙ ＬＴＤ）のＭａｙｂｒｉｄｇｅ ｇ）アルドリッチケミカル社（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｇｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐ
ａｎｙ）のＡｌｄｒｉｃｈ ｈ）チャップマン＆ホール（Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ）の天然物ディレク
トリー

【０３２２】 この様なデータベースの１つ（モレキュラーデザイン社インフォーメーション
システムが配布するＡＣＤ）は例えば、合成由来または天然物である２００，０
００種の化合物を含んでいる。当業者が利用できる方法は、２次元で表されるデ
ータを３次元で表されるデータに変換することができる。これらの方法は、トリ
ポスアソシエート（Ｔｒｉｐｏｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅ）のＣＯＮＣＯＲＤ、ま
たはモレキュラーシミュレーション社のＤＢ−コンバーターで可能である。

【０３２３】 構造に基づく調節因子設計のいくつかの方法が当業者に公知である。クンツら
、１１９８２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６２：２６９；クンツら、１９９４、
Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２７：１１７；メング（Ｍｅｎｇ）ら、１９９２、
Ｊ．Ｃｏｍｐｔ．Ｃｈｅｍ．１３：５０５；ボーム（Ｂｏｈｍ）、１９９４、Ｊ
．Ｃｏｍｐ．Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌｅｃ Ｄｅｓｉｇｎ ８：６２３。

【０３２４】 合理的な調節剤設計の当業者に広く利用されるコンピュータープログラムは、
カリフォルニア大学サンフランシスコのＤＯＣＫである。このコンピュータープ
ログラムおよび同様なプログラムを利用する一般的な方法は、以下の３つの出願
に記載されている。これらの技術のいくつかのより詳細な情報は、分子シミュレ
ーションユーザーガイド、１９９５、に見出される。

【０３２５】 この目的に使用される典型的なコンピュータープログラムは、以下の工程でな
る： （ａ）タンパク質から既存の化合物、リガンドまたはリガンドアナログを除去
する工程； （ｂ）他の化合物、リガンドまたはリガンドアナログを、コンピュータープロ
グラム（ＤＯＣＫ等）を用い、または化合物を活性部位中に繰り返し動かすこと
による、化合物結合部位中にドッキングさせる工程； （ｃ）化合物と結合部位原子の間の空間を特徴付ける工程； （ｄ）（ｉ）化合物と活性部位の間の空の空間に当てはめ得る、および（ｉｉ
）化合物とリンクし得る分子フラグメントについてライブラリーを検索する工程
；および （ｅ）上記で見出したフラグメントを化合物にリンクさせ、新しい修飾化合物
を評価する工程。

【０３２６】 パート（ｃ）は、ＲＰＴＫの原子と化合物、リガンドまたはリガンドアナログ
間の立体関係と相補的相互作用を特徴付ける工程である。不利な立体的相互作用
がなく化合物とＲＰＴＫ原子の間に十分な表面積を共有している場合、有利な幾
何学的フィットが達成される。

【０３２７】 当業者は、パート（ｄ）および（ｅ）を飛ばし、多くの化合物のデータベース
をスクリーニングすることによりこの方法を実行できることに注意しなければな
らない。

【０３２８】 ＲＰＴＫ機能の調節因子の構造に基づく設計および同定を、アッセイスクリー
ニングと組み合わせて使用することができる。化合物の大きいデータベース（約
１０、０００種の化合物）を時間単位で検索することができるので、コンピュー
ターに基づく方法は細胞分析において潜在的なＲＰＴＫ機能の潜在的調節因子と
して試験される化合物の範囲を狭くし得る。

【０３２９】 構造に基づく調節因子設計の上記説明は全てを包括するものではなく、文献に
は他の方法も報告されている： （１）ＣＡＶＥＴ：バートレット（Ｂａｒｔｌｅｔ）ら、１９８９、Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｂｌｅｍ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ、ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ、 Ｓ．Ｍ．）、レイ
（Ｌｅｙ、Ｓ．Ｖ．）、カンベル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ｍ．Ｍ．）編集、Ｒｏｙ
ａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｇｅｍｉｓｔｒｙ、ケンブリッジ、１８２−１
９６頁 （２）ＦＬＯＧ：ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら、１９９４、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ａｉ
ｄｅｄ Ｍｏｌｅｃ． Ｄｅｓｉｇｎ ８：１５３ （３）ＰＲＯ調節因子：クラークら、１９９５、 Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ａｉｄｅｄ
Ｍｏｌｅｃ． Ｄｅｓｉｇｎ ９：１３ （４）ＭＣＳＳ：ミランカー（Ｍｉｒａｎｋｅｒ）およびカープラス（Ｋａｒ
ｐｌｕｓ）、１９９１、Ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｆｕｎｃｔｉｏ
ｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１：２９ （５）ＡＵＴＯＤＯＣＫ：グッドセール（Ｇｏｏｄｓｅｌｌ）およびオルソン
（Ｏｌｓｏｎ）、１９９０、 Ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｆｕｎｃ
ｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８：１９５ （６）ＧＲＩＤ：グッドフォード（Ｇｏｏｄｆｏｒｄ）、１９８５、Ｊ．Ｍｅ
ｄ．Ｃｈｅｍ．２８：８４９

【０３３０】 ＲＰＴＫとの複合体中の化合物の修飾による設計 潜在的調節因子としての化合物、リガンドおよびリガンドアナログを同定する
別な方法は、ポリペプチド活性部位に存在する調節因子を修飾することである。
例えば、調節因子のコンピューター表示をＲＰＴＫリガンド結合部位のコンピュ
ーター表示内で修飾することができる。この技術の詳細な指針は、ＬＵＤＩのモ
レキュラーシミュレーションユーザーマニュアル、１９９５に見出される。調節
因子のコンピューター表示を少なくとも１個の化学基を変化、除去または追加し
て修飾する。

【０３３１】 化合物、リガンドまたはリガンドアナログに対する個々の修飾で、修飾された
化合物、リガンドまたはリガンドアナログ、およびＲＰＴＫはコンフォーメーシ
ョンが変化し、化合物、リガンドまたはリガンドアナログ、およびＲＰＴＫ原子
が２つの分子間に形成した任意の相補的相互作用と共に成績が評価される。有利
な幾何学的フィットと有利な相補的相互作用を達成すると、成績評価が完了する
。有利な成績を有する化合物はＲＰＴＫ機能の潜在的な調節因子である。

【０３３２】 レセプターＰＴＫを結合する化合物の構造修飾による設計 構造に基づく調節因子設計の第３の方法は、調節因子構築または調節因子検索
コンピュータープログラムにより設計された化合物をスクリーニングすることで
ある。この様なタイプのプログラムの例は、モレキュラーシミュレーションパッ
ケージ、カタリストに見られる。このプログラムの使用法の説明は、モレキュラ
ーシミュレーションユーザーガイド（１９９５）に記載されている。この出願に
用いられた他のコンピュータープログラムはモレキュラーデザイン社のＩＳＩＳ
／ＨＯＳＴ、ＩＳＩＳ／ＢＡＳＥ，ＩＳＩＳ／ＤＲＡＷ、およびトリポスアソシ
エーツのＵＮＩＴＹである。

【０３３３】 これらのプログラムは、化合物、リガンドおよびリガンドアナログと複合体を
形成したＲＰＴＫ複合体の３次元構造の活性部位から除去された化合物、リガン
ドおよびリガンドアナログの構造上で作動させることができる。この様な化合物
、リガンドおよびリガンドアナログは生物活性コンフォーメーションであるので
それらの構造上でプログラムを作動させることが好ましい。

【０３３４】 調節因子構築コンピュータープログラムは、ＲＰＴＫと複合体を形成した化合
物、リガンドおよびリガンドアナログ中の化学基のコンピューター表示をコンピ
ューターデータベースで置換するために使用し得るコンピュータープログラムで
ある。調節因子検索コンピュータープログラムは、レセプターＰＴＫに結合した
化合物と類似の３次元構造および類似の化学基を有する、コンピューターデータ
ベース由来の化合物のコンピューター表示を検索するために使用し得るコンピュ
ータープログラムである。

【０３３５】 典型的なプログラムは以下の一般的な工程を用いて作動する： （ａ）水素結合のドナーまたはアクセプター、疎水性／親水性部位、性荷電部
位、または負荷電部位等の化学的特徴により化合物、リガンドまたはリガンドア
ナログをマッピングする工程； （ｂ）マッピングされた図形に立体的束縛を加える工程；および （ｃ）（ｂ）で作成したモデルでデータベースを検索する工程。

【０３３６】 当業者は、重要な化学的特性には水素結合ドナー、水素結合アクセプター、お
よび／または２つの疎水性接触点が含まれるが、それに限定されないことを理解
し得ると思われる。当業者はまた、可能な化合物の全てが必ずしも（ｂ）のモデ
ルに存在する必要がないことを理解し得ると思われる。データベース検索のため
の異なったモデルを作成するために、モデルの任意のサブセットを使用できる。

【０３３７】 XI．有機合成技術 コンピューターに基づく調節因子設計および同定の多様性は、コンピューター
プログラムでスクリーニングされる構造の多様性にある。コンピュータープログ
ラムは、多様な化学官能基を用いて２００，０００種の分子を含むデーターベー
スを検索し、ポリペプチドと既に複合体を形成した調節因子を修飾することがで
きる。この化学的な多様性の結果、ＲＰＴＫ機能の潜在的調節因子が予見し得な
い化学形をとることがある。この様なＲＰＴＫ機能の潜在的調節因子を構築する
試みに合致する技術には、広い範囲の有機合成技術がある。これらの有機合成技
術は、当業者が利用する標準の参照文献源に詳細に記述されている。この様な参
考文献の１例はＡｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；Ｒｅａ
ｃｔｉｏｎ、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、１９９４年３月
、ニューヨーク、マグローヒル（Ｍｃｇｒｏｗ Ｈｉｌｌ）である。従って、コ
ンピューターに基づく方法で同定されたＲＰＴＫ機能の潜在的調節因子を合成す
るに必要な技術は、有機合成技術の当業者が既に入手可能なものである。

【０３３８】 X．信号伝達経路におけるレセプターＰＴＫ調節因子の効果を測定する細胞分
析 ＲＰＴＫ機能の潜在的調節因子の活性を試験すると共に、不適切なＲＰＴＫ活
性と関連する病気を診断するために、細胞分析を使用することができる。ＲＰＴ
Ｋ機能の潜在的調節因子を、細胞株中で過剰発現した特定のＲＰＴＫの自己燐酸
化に対する潜在的調節因子の効果を測定する、潜在的調節因子の生体外分析で試
験することが可能である。従って、ＲＰＴＫに対応する細胞外ドメインに対する
リガンド結合の強力な阻害剤として働く調節因子は、ＲＰＴＫで触媒される自己
燐酸化の量を減少させると考えられる。潜在的調節因子の活性を生体外細胞生育
分析ばかりでなく、生体内動物モデル分析でも試験し得る。

【０３３９】 生体内分析は、本発明の方法で設計した潜在的調節因子の生物活性の試験にも
有用である。

【０３４０】 これらの分析の材料、方法および実験データは、“疾病治療用インドリン化合
物”と言う表題のＵＳ特許番号５，７９２，７８３および１９９６年１２月１９
日公開ＷＯ９６／４０１１６に完全に述べられており、そのそれぞれが図面およ
び表を含めてその内容が本明細書に取り入れられている。

【０３４１】 XI．レセプターＲＴＫ機能の調節因子の疾病治療薬としての投与 疾病治療薬として生物に化合物を投与する方法は、“疾病治療用インドリン化
合物”と言う表題のＵＳ特許番号５，７９２，７８３および１９９６年１２月１
９日公開ＷＯ９６／４０１１６に完全に述べられており、そのそれぞれが図面お
よび表を含めてその内容が本明細書に取り入れられている。

【０３４２】 XII．分子構造を決定、設計、モデル化および／または修飾するためのコンピ
ューターに基づく方法 分子構造の結晶学的解析由来のデータの表示、研究、比較、取扱、解釈および
／または外插のためのコンピューターに基づくシステム１０の概要が図３３に示
され、それには図１、２、５、１９、２６および２７に示されるＲＰＴＫ、その
リガンドおよび関連する複合体等の分子、分子の部分および／または分子相互作
用が含まれる。分子の例はタンパク質および／またはタンパク質とリガンドの複
合体である。分子部分の例はタンパク質の触媒ドメイン、タンパク質のリガンド
／レセプター結合部位、タンパク質の信号発生領域およびタンパク質の輸送部分
である。分子相互作用の例には酵素とその基質間の結合、因子／共因子の関係、
抗体／抗原結合、および信号伝達で生じるタンパク質／レセプター認識および結
合が含まれる。上記の研究の少なくとも１つは、天然の生化学プロセスを説明・
理解し、擬似薬、作用剤、阻害剤および拮抗剤を設計しスクリーニングするため
に有用である。従って、本発明のこの態様はとりわけ、当業者が分子モデル化プ
ロセスを実行することを可能にし、分子の多次元構造、分子部分または分子相互
作用を提示する画像を作成し表示するために必要なハードウエアおよびソフトウ
エアを、所望により当業者に提供する。従って、これらの実施はコンピューター
技術を採用して大いに促進される。

【０３４３】 システム１０には分子、分子部分および／または分子相互作用を表す情報を検
索可能に記憶するメモリ（例えばアーカイバルメモリおよび／またはビデオメモ
リおよびコンピューター読み取り可能媒体）等のデータ記憶実態２０が含まれる
。メモリは例えば第１タイプの記憶領域または記憶容量２２を有し、本発明で開
示されるか本明細書の知見に従って得られる３次元空間中の位置を特定する１組
の空間座標等の構造データがその上に記録されるか、その中に含まれる。メモリ
はまた、情報を含む第２のタイプの記憶領域または記憶容量２４を有する。この
情報は例えば複数のアミノ酸の１つの性質、特性または属性、または他の化学部
分を表す。第２のタイプの記憶領域または記憶容量は、記憶実態２０中の第１タ
イプの記憶領域と組み合わされて、好ましくは３次元空間の一つを表す分子、分
子部分または分子相互作用の特性、性質または属性の少なくとも１つの立体的ま
たは空間的配置を表す。メモリはＲＡＭおよびＲＯＭ、および磁気媒体、光学媒
体、磁気光学媒体、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードディスク、サーバ
ー、ウエブ系システム、ＣＤ、ＤＶＤ、テープ等のコンピューターで読み取り可
能な媒体等の当業者が認識し得る任意の形を取り得る。メモリ２２（記憶領域ま
たは記憶容量の１タイプ）には例えば、表１、２、３、４または６似示される座
標データ、または本発明の知見により得られた他の座標データを含むか内蔵し、
メモリ２４（記憶領域または記憶容量の１タイプ）は例えば会合する関連する電
荷または電子密度データを含むか内蔵し得る。最も普通には、システムは複数の
第１および第２タイプの記憶領域を含む。記憶実態２０、すなわち第１タイプの
記憶領域または記憶容量２２、および第２タイプの記憶領域または記憶容量２４
、または記憶装置または記憶容量３４は例えば、共有セミコンダクターメモリ、
キャッシュ、ＲＡＭ、ＲＯＭ、共有光学ディスク領域、共有磁気メモリ領域、お
よび／またはＷＷＷ（Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ）を含むイントラネットおよ
びインターネットでアクセス可能なサーバー系である。従って、本発明のシステ
ムにはユニタリーシステム、ネットワーク系システム、サテライト通信、および
インターネット系システムが含まれ、地理的条件に拘わらず対話形式で接続し得
る。

【０３４４】 システム１０にはプロセッサが含まれる、および／またはプロセッサと対話形
式で接続され、対話形式でデータ記憶装置と組み合わされ、第１タイプ記憶領域
２２、随意には第２タイプ記憶領域２４にアクセスし、記憶実態２０からのデー
タに基づいて分子、分子部分または分子相互作用の少なくとも１つの目にみえる
３次元画像を表すための画像信号を３次元空間に作成する。プロセッサはＣＰＵ
、レジスター、メモリ等を有する一般用または特殊用プロセッサである。ソフト
ウエアおよび論理アーキテクチャーおよび回路は所望のものを用いることができ
る。ひとつの実施態様によれば、とりわけプロセッサ２６と記憶実態２０はシリ
コングラフィックス（Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓ）、サンマイクロシス
テムズ（Ｓｕｎ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＩＢＭ等のＵＮＩＸ（登録
商標）またはＶＡＸコンピューターの形式である。しかしながら、本発明はこれ
らのタイプのハードウエアおよびソフトウエアシステムの使用に限られない。

【０３４５】 ディスプレイ２８は通常、ラインまたはワイヤレス結合でプロセッサ２６と対
話形式で結ばれ、データに基づく３次元空間内の分子、分子部分または分子相互
作用の少なくとも１つの目にみえる３次元画像を表すため、画像信号を受け取る
。システムに使用するに適したディスプレイにはコンピュータースクリーン３２
（例えばＣＲＴ、ＬＣＤおよび受動マトリックス等）、プリンター、プロッター
またはフィルムが含まれる。

【０３４６】 本発明の１つの実施態様では、画像データには図１、２、５、１９、２６およ
び２７似示される様な３次元空間の分子、分子部分または分子相互作用の構造の
目に見える３次元画像が含まれる。他の実施態様では、画像データには３次元空
間の分子、分子部分または分子相互作用の立体モデル表現の目にみえる３次元画
像を表すためのデータが含まれる。また別な実施態様では、画像データには３次
元空間の分子、分子部分または分子相互作用の静電表面電位の目にみえる３次元
画像を現すためのデータが含まれる。また別な実施態様では、画像データには３
次元空間の分子、分子部分または分子相互作用の３次元ステレオ画像を表すため
のデータが含まれる。

【０３４７】 本発明のシステム１０はさらに、図９、１０、２２および２４に示される組成
物の特性の他、分子、分子部分または分子相互作用の立体および／または空間配
置を表すデータを保存する記憶装置、記憶構造、記憶領域または記憶容量３４で
なる。記憶装置または記憶容量３４は例えば、比較の目的の他のタンパク質を含
む他の化学的内容に対する３次元Ｘ線座標データを含むか内蔵する。記憶装置お
よび記憶容量３４は、ＲＡＭおよびＲＯＭ、および磁気媒体、光学媒体、磁気光
学媒体、フロッピーディスク、ハードディスク、ミニディスク、サーバー、ＣＤ
、ＤＶＤ等の他のコンピューターで読み取り可能な媒体等、当業者が認識し得る
任意の形を取ることができる。プロセッサ２６は記憶装置または記憶容量３４、
およびディスプレイ２８と対話形式で組み合わされ、分子、分子部分または分子
相互作用の少なくとも１つの特性を、指示に基づいてスクリーン上に、目にみえ
る上記３次元画像の組成物の特性の立体配置を表すための別な画像データを作成
する。図３３の実施態様では、記憶措置または記憶容量３４が記憶実態２０の一
部として示されているが、他の配置も当業者に可能である。

【０３４８】 コンピューターシステムはソフトウエアまたはハードウエア系の命令を含むか
、命令を採用する。論理回路およびソフトウエアプログラム中の命令等はとりわ
け、コンピューターシステムがデータを入力、操作、解析および出力することを
可能にする。プログラムの例が本明細書に示されるが、当業者は本発明の実施に
この様なプログラムに限定されるものではない。

【０３４９】 特に、システム１０はマウス、トラッカーボール、タッチパッド、プロジェク
ター（多次元プロジェクターシステムを含む）、タッチスクリーン、ジョイステ
ィック、ポインター、キーボード、モデム、カードおよび／または音声認識シス
テム、またはオペレーターからの命令を受け取るためのドッキングシステム等の
オペレーターインターフェースも含み、ディスプレイ２８、プロセッサ２６およ
び記憶実体２０と対話形式で結ばれている。コンピューターおよびコンピュータ
ー部品の他の態様は公知であり、容易に入手できる。

【０３５０】 記憶実体２０（２２、２４、３４および他のもの）を含む本発明によるコンピ
ューターシステムをプログラムし、ＮＭＲ等の他の解析技術と組み合わせるＸ線
結晶学データの使用を含む、第VI−IX節で議論した解析を行うためのデータを含
むことができる

【０３５１】 本発明はまた、本明細書で開示した様々なデータ構造および情報を含む、コン
ピューターで読み取り可能な媒体を含む。例えば、付属の表および図面似示した
座標データを含む磁気媒体、光学媒体、磁気光学媒体、フロッピーディスク、ハ
ードディスク、ミニディスク、サーバー、ＣＤ、ＤＶＤ、テープ等は、ハードウ
エアおよび／またはソフトウエアが提供するコンピューターが命令と規則のセッ
トに従って解析する場合、分子、分子部分および分子相互作用の３次元構造を確
認する上で有用である。

【０３５２】 （実施例） 以下の実施例は非限定的であり、本発明の様々な態様および特徴を単に代表す
るものである。実施例はタンパク質キナーゼポリペプチドの結晶形を得る説明の
ための方法、これらのタンパク質キナーゼポリペプチドの３次元構造、およびタ
ンパク質キナーゼの３次元構造を用いるタンパク質キナーゼの調節因子を同定す
る方法を提供する。

【０３５３】 原子構造座標 表１−３はいくつかのリガンド／ＦＣＦＲ複合体二量体の原子構造座標を提供
する。表５はＳＣＦ二量体の原子構造座標を提供する。表６はＦＧＦ２−ＦＧＦ
Ｒ１−ヘパリン３成分複合体の原子構造座標を提供する。表中で以下の略号が使
用されている。

【０３５４】 “原子タイプ”は、その座標が提供される元素を言う。カラム内の最初の文字
は元素を定義する。 “Ａ．Ａ．”はアミノ酸を言う。 “Ｘ、ＹおよびＺ”は元素のカーテシアン座標である。 “Ｂ”は原子中心の周りの原子の運動の目安である熱因子である。 “ＯＣＣ”は占有率を言い、原子が特定の座標を占有する時間割合を表す。Ｏ
ＣＣ値は０から１の範囲であり、１は１００％である。 “ＰＲＴ１”または“ＰＲＴ２”はあ占有率に関係し、ＰＲＴ１は第１座標中
にある場合の原子の座標を表し、ＰＲＴ２は第２または別な座標中にある場合の
原子の座標を表す。

【０３５５】 二量体の構造座標は数学的取扱で変化させ得る。この様な取扱には生構造座標
の結晶学的置換、新しい生構造座標の１次微分、生構造座標への整数の加算また
は減算、生構造座標の反転および上記の任意の組み合わせが含まれるが、それに
限定されるものではない。

【０３５６】 さらに、構造座標を若干変更し、なおほとんど同じ３次元構造を与えることが
できる。従って、構造座標の独自のセットの目安は、得られた構造の根平均平方
偏差である。１．５Å以下の根平均平方偏差で相互に隔たる３次元構造を与える
構造座標は同一と見なすことができる。

【０３５７】 実施例１−ＦＧＦＲ１ Ｄ２−Ｄ３／ＦＧＦ２複合体のＸ線結晶学構造決定 ポリペプチドの合成と単離 ヒトＦＧＦＲ１（Ｄ２−Ｄ３）のＤＮＡ断片をコードする残基１４２−３６５
をＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を用い、当業者に公知の技術を用いて
バクテリア発現ベクターぺＴ−２３ａ中にサブクローニングした。バクテリア株
ＢＬ２１（ＤＥ３）をＤ３−Ｄ３の発現に使用し、ＩＰＴＧで５時間誘導した。
発現誘導体後、細胞を遠心で集め、フレンチプレスを用いて２５ｍＭ燐酸カリウ
ム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡおよび１０％グリセリンを含む緩衝
液中で溶菌した。

【０３５８】 Ｄ２−Ｄ３を含むペレットを遠心で集め、６Ｍ塩酸グアニジウム、１００ｍＭ
トリスＨＣｌ、ｐＨ８．０中で溶解した。５０ｍＭ トリスＨＣｌ、ｐＨ８．０
、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、および１ｍＭ Ｌ−システインを
含む緩衝液に対して透析してＤ２−Ｄ３を再褶曲した。再褶曲Ｄ２−Ｄ３を、Ｆ
ＧＦ２があらかじめ固定化されたヘパリンセファローズカラムでクロマトグラフ
ィーを行った。得られたＤ２−Ｄ３／ＦＧＦ２複合体をヘパリンセファロースカ
ラムから、２５ｍＭ トリスＨＣｌ、ｐＨ７．５および１．５Ｍ ＮａＣｌで溶出
した。

【０３５９】 Ｄ２−Ｄ３／ＦＧＦ２複合体をセントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（商標））
遠心濃縮装置を用いるを限外濾過で濃縮し、２５ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ５．８
、および１．５Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液を用い、スーパーデックス（Ｓｕｐｅ
ｒｄｅｘ（商標））２００カラム（ファルマシア）上のサイズ排除クロマトグラ
フィーでさらに精製した。結晶化前に、Ｄ２−Ｄ３／ＦＧＦ２複合体を２５ｍＭ
トリス、ｐＨ７．５、および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液中で濃縮した。

【０３６０】 結晶成長 精製Ｄ２−Ｄ３／ＦＧＦ２複合体の結晶を、懸垂液滴中で等容積のタンパク質
溶液（１０ｍｇ／ｍＬ Ｄ２−Ｄ３／ＦＧＦ２複合体、２５ｍＭ トリスＨＣｌ、
ｐＨ８．５、および１５０ｍＭ ＮａＣｌ）と保存溶液（１．６Ｍ（ＮＨ₄）₂Ｓ
Ｏ₄、２０％ ｖ／ｖグリセロールおよび１００ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．５）
を混合し、２．０μｌの得られた溶液の懸濁液滴を０．５ｍＬの保存緩衝液上に
２０℃で懸濁させて、２０℃で蒸気拡散で成長させた。

【０３６１】 データ収集および構造決定 回折データを、乾燥窒素気流中で瞬間冷凍した結晶試料から、ブルックヘブン
国立研究所（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）
のナショナルシンクロトロン光源のビームラインＸ４Ａで収集した。シンクロト
ロンデータをＣＣＤ検出器で収集した。全てのデータはＤＥＮＺＯおよびＣＳＡ
ＬＥＰＡＣＫを用いて処理した。オトヴィノウスキ（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ）、
１９９３、“振動データ換算プログラム”、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ
ＣＣＰ４ Ｓｔｕｄｙ Ｗｅｅｋｅｎｄ、サウヤー（Ｓａｗｙｅｒ）ら編集（ダ
レスブーリ（Ｄａｒｅｓｂｕｒｙ）、英国：ＳＥＲＣダレスブーリ研究所）、５
６−６２。

【０３６２】 Ｄ２−Ｄ３／ＦＧＦ２複合体の構造を、プログラムＡｍｏＲｅを用い（ナバザ
、１９９４、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．Ａ５０：１５７−１６３）、ＦＧＦ２（２
ＦＧＦ、ツァン（Ｚａｎｇ）ら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．８８：３４４６−３４５０）およびテロキン（ＩＴＬＫ、ホールデン（Ｈ
ｏｌｄｅｎ）ら、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：８４０−８５１）
の構造を検索モデルとして用いてて分子置換法で決定した。相同モデルをテロキ
ンの構造からＦＧＦ２ Ｄ２およびＤ３ドメインの両者に対して構築した。分子
置換の解答を２つのＦＧＦ２分子と、二量体中のＤ２およびＤ３の１つのコピー
似対して決定し、Ｄ２およびＤ３の第２のコピーを、Ｄ２およびＤ３の第１のコ
ピーの第２ＦＧＦ２分子上への剛体回転および移動で決定した。Ｄ２およびＤ３
の第２コピーの位置をＣＮＳ（ブリュンガー（Ｂｒｕｎｇｅｒ）ら、１９９８、
Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．Ｄ５４：９０５−９２１）を用いる剛体精密化法で確認
した。

【０３６３】 シミュレーションアニーリングおよび位置のＢ因子精密化をＣＮＳを用いて行
い、バルク溶媒と異方性Ｂ因子補正を加えた。さらに、固定した非結晶学対称束
縛をＦＧＦ２，Ｄ２およびＤ３の骨格原子の精密化中に行った。二量体中のＦＧ
Ｆ２、Ｄ２およびＤ３の２つのコピー間のＣα原子に対するＲＭＳ偏差は０．０
４Åであった。

【０３６４】 電子密度マップ中へのモデル構築をプログラムＯ（ジョーンズら、１９９１、
Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．Ａ４７：１１０−１１９）を用いて行った。Ｄ２−Ｄ３
／ＦＧＦ２複合体の原子モデルにはＦＧＦ２残基１６−１４４とＦＧＦ１残基１
４９−３５９が含まれるが、二量体中のＦＧＦＲ１レセプターの１つでは残基２
９３−３０７は無秩序である。全ての原子に対する平均Ｂ因子は３８．７Å、Ｆ
ＧＦ２に対し３７．６／３８．９Å、ＦＧＦＲ１に対し３８．３／３９．１Å
である。

【０３６５】 原子構造座標 表１はＦＧＦＲ１（Ｄ２−Ｄ３）／ＦＧＦ２複合体二量体の原子構造座標を提
供する。 ＦＧＦＲ１（Ｄ２−Ｄ３）／ＦＧＦ２複合体の構造はプロトニコフら
、Ｃｅｌｌ ９８：６４１−６５０（１９９９）に報告され、 ＦＧＦＲ１（Ｄ２
−Ｄ３）／ＦＧＦ２複合体に対する座標はインターネット上でプロテインデータ
バンク（プロテインデータバンクＩＤコード１ＣＶＳで指定）から入手でき、そ
の開示は本明細書に参考文献として含まれる。

【０３６６】 実施例２−ＦＧＦＲ１ Ｄ２−Ｄ３／ＦＧＦ１複合体のＸ線結晶学構造決定 ポリペプチド合成および単離 ヒトＦＧＦＲ１（Ｄ２−Ｄ３）の残基１４２−３６５をコードするＤＮＡ断片
を、ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を用い、当業者に公知の技術を用い
てバクテリア発現ベクターｐＥＴ−２３ａ中にサブクローニングした。バクテリ
ア株ＢＬ２１（ＤＥ３）をＤ２−Ｄ３の発現に用い、ＩＰＴＧで５時間誘導した
。発現誘導体後、細胞を遠心で集め、２５ｍＭ燐酸カリウム、１５０ｍＭＮａＣ
ｌ、２ｍＭＥＤＴＡおよび１０％グリセロールを含む緩衝液中でフレンチプレス
を用いて溶菌した。

【０３６７】 Ｄ２−Ｄ３を含むペレットを遠心で集め、６Ｍ塩酸グアニジウム、１００ｍＭ
トリスＨＣｌ、ｐＨ８．０中に溶解した。５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、
１５０ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセロールおよび１ｍＭ Ｌ−システインを含む
緩衝液に対し透析してＤ２−Ｄ３を再褶曲させた。ＦＧＦ１をあらかじめ固定化
したヘパリンセファロースカラム上で再褶曲Ｄ２Ｄ３のクロマトグラフィーを行
った。得られたＤ２−Ｄ３／ＦＧＦ１複合体を２５ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．
５および１．５ＭＮａＣｌを含む緩衝液でヘパリンセファロースカラムから溶出
した。

【０３６８】 Ｄ２−Ｄ３／ＦＧＦ１複合体をセントリコン１０（商標）（アミコン（Ａｍｉ
ｃｏｎ））遠心濃縮装置を用いて濃縮し、スーパーデックス（商標）２００カラ
ム（ファルマシア）上で２５ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、および１．５Ｍ
ＮａＣｌを含む緩衝液を用い、サイズ排除クロマトグラフィーでさらに精製した
。結晶化前に、Ｄ２−Ｄ３／ＦＧＦ１複合体を２５ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．
５、および１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液中で１ｍｇ／ｍＬに濃縮した。

【０３６９】 結晶成長 精製Ｄ２−Ｄ３／ＦＧＦ１複合体の結晶を、懸垂液滴中で１容積のタンパク質
溶液（２５ｍＭ トリスＨＣｌ、ｐＨ８．５、および１５０ｍＭ ＮａＣｌ中１ｍ
ｇ／ｍＬ）と４容積の保存溶液（２０％ＰＥＧ４０００、０．２Ｍ Ｌｉ₂ＳＯ₄
および０．１ＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．５）を混合し、２．０μｌの得られた溶
液の懸濁液滴を０．５ｍＬの保存緩衝液上に２０℃で懸濁させて、２０℃で蒸気
拡散で成長させた。

【０３７０】 データ収集および構造決定 １０％グリセロールを含む母液中で乾燥窒素気流を用いて瞬間冷凍した結晶試
料から、ブルックヘブン国立研究所のナショナルシンクロトロン光源のビームラ
イン４Ａで回折データを収集した。シンクロトロンデータをＣＣＤ検出器で収集
した。全てのデータはＤＥＮＺＯおよびＣＳＡＬＥＰＡＣＫを用いて処理した。
オトヴィノウスキ、１９９３、“振動データ換算プログラム”、Ｐｒｏｃｅｅｄ
ｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ＣＣＰ４ Ｓｔｕｄｙ Ｗｅｅｋｅｎｄ、サウヤーら編集（
ダレスブーリ、英国：ＳＥＲＣダレスブーリ研究所）、５６−６２。

【０３７１】 Ｄ２−Ｄ３／ＦＧＦ２複合体の構造を、プログラムＡｍｏＲｅを用い（ナバザ
、１９９４、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．Ａ５０：１５７−１６３）、ＦＧＦ１（２
ＡＧＦ、ブラバー（Ｂｌａｂｅｒ）ら、１９９６、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
３５：２０８６−２０９４）およびテロキン（ＩＴＬＫ、ホールデン（Ｈｏｌｄ
ｅｎ）ら、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：８４０−８５１）の構造
を検索モデルとして用いてて分子置換法で決定した。相同モデルをテロキンの構
造からＦＧＦ１ Ｄ２およびＤ３ドメインに対して構築した。分子置換の解答を
ＦＧＦ１、Ｄ２およびＤ３の２つのコピーのそれぞれに対して決定した。

【０３７２】 シミュレーションアニーリングおよび位置のＢ因子精密化をＣＮＳを用いて行
い、バルク溶媒と異方性Ｂ因子補正を加えた。さらに、固定した非結晶学対称束
縛をＦＧＦ１、Ｄ２およびＤ３の骨格原子の精密化中に行った。二量体中のＦＧ
Ｆ１、Ｄ２およびＤ３の２つのコピー間のＣα原子に対するＲＭＳ偏差は０．０
１Åであった。

【０３７３】 電子密度マップ中へのモデル構築をプログラムＯ（ジョーンズら、１９９１、
Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．Ａ４７：１１０−１１９）を用いて行った。 Ｄ２−Ｄ３
／ＦＧＦ１複合体の原子モデルにはＦＧＦ１残基８−１３８とＦＧＦＲ１残基１
４９−３５９が含まれるが、残基２９４−３０５および３１５−３２３は無秩序
である。全ての原子に対する平均Ｂ因子は３０．４Å、ＦＧＦ１に対し３１．２
／３３．０Å、ＦＧＦＲ１に対し２９．１／２８．７Å である。

【０３７４】 原子構造座標 表２はＦＧＦＲ１（Ｄ２−Ｄ３）／ＦＧＦ１複合体二量体の原子構造座標を提
供する。二量体の第１のＦＧＦＲ１分子では、残基番号の前には１が付けられて
いる。即ち、二量体の第１ＦＧＦＲ１分子の残基番号４６４は“１４６４”で示
される。 ＦＧＦＲ１（Ｄ２−Ｄ３）／ＦＧＦ１複合体の構造はプロトニコフら
、Ｃｅｌｌ １０１：４１３−４２４（２０００）に報告され、 ＦＧＦＲ１（Ｄ
２−Ｄ３）／ＦＧＦ１複合体に対する座標はインターネット上でプロテインデー
タバンク（プロテインデータバンクＩＤコード１ＥＶＴで指定）から入手でき、
その開示は本明細書に参考文献として含まれる。

【０３７５】 実施例３−ＦＧＦ２−ＦＧＦＲ２の構造 結晶化とデータ収集 ＦＧＦＲ２の残基１４７から３６６をコードするＤＮＡ断片をポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）で増幅し、ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いてバクテリア
発現ベクターｐＥＴ−２８ａ中にサブクローニングし、バクテリア株ＢＬ２１（
ＤＥ３）中へ形質移入した。細胞をＩＰＴＧで５時間誘導し、遠心しバクテリア
細胞ペレットを１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡおよび１０％グリセロー
ルを含む２５ｍＭ Ｋ−Ｎａ燐酸緩衝液ｐＨ７．５中でフレンチプレスを用いて
溶菌した。遠心後、１次ＦＧＦＲ２を含むペレットを１００ｍＭトリスＨＣｌ緩
衝液（ｐＨ８．０）中の６Ｍ塩酸グアニジウムと１０ｍＭ ＤＴＴ中に溶解した
。１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロールおよび１ｍＭ Ｌ−システインを含
む２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析して可溶化ＦＧＦＲ
２タンパク質を再褶曲した。再褶曲ＦＧＦＲ２タンパク質を、ＦＧＦ２（塩基性
ＦＧＦ）をあらかじめ固定化したヘパリンセファロースカラムに負荷した。次い
でＦＧＦ２−ＦＧＦＲ２複合体をヘパリンセファロースカラムから、２５ｍｍト
リスＨＣｌ（ｐＨ７．５）および１．５Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液で溶出した。
ＦＧＦ２−ＦＧＦＲ２複合体をセントリコン１０（アミコン）フィルターで濃縮
し、サイズ排除クロマトグラフィー（ファルマシア、スーパーデックス２００）
で、２５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）と１．５Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液を
用いてさらに精製した。複合体は１：１のＦＧＦ：ＦＧＦＲ複合体形成に対応す
る位置に溶出した。

【０３７６】 結晶を懸垂液滴法を用いて２０℃の蒸気拡散で成長させた。ＦＧＦ２−ＦＧＦ
Ｒ２複合体の結晶成長では、２マイクロリッターのタンパク質溶液（１０ｍｇ／
ｍＬ）、２５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭＮａＣｌを、１０−
１５％ＰＥＧ４０００、１０％イソプロパノールおよび０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ−
ＮａＯＨを含む２マイクロリッターの結晶化緩衝液と混合した。ＦＧＦ２−ＦＧ
ＦＲ２の結晶は三斜空間群Ｐ１に属し、単位格子寸法はａ＝７２．２０Å、ｂ＝
７１．６８Å、Ｃ＝９０．９２Å、α＝９０．５３°、β＝８９．９８°、γ＝
８９．９９°であった。単位格子内に４分子のＦＧＦ２と４分子のＦＧＦＲ２が
あり、溶媒含有量は約５８％である。回折データを瞬間冷凍（１０％グリセロー
ルを低温保護剤として用いる乾燥窒素気流中）結晶から、ＣＣＤ検出器（ＦＧＦ
２−ＦＧＦＲ２）で、ブルックヘブン国立研究所のナショナルシンクロトロン光
源のＸ４Ａビームラインで収集した。全てのデータをＤＥＮＺＯおよびＳＣＡＬ
ＥＰＡＣＫ（オトウィノウスキら、Ｍｅｔｈｏｄ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７６：３
０７−３２６、１９９７）を用いて処理した。

【０３７７】 構造決定およびＦＧＦ２−ＦＧＦＲ２構造の精密化 ＦＧＦ２−ＦＧＦＲ２複合体の構造をプログラムＡｍｏＲｅ（ナバザ、Ａｃｔ
ａ Ｃｒｙｓｔ．Ａ５０：１５７−１６３、１９９４）と検索モデルとしてＦＧ
ＦＲ２−ＦＧＦＲ１の構造（ＩＣＶＳ；プロトニコフら、Ｃｅｌｌ ９８：６４
１−６５０、１９９９）を用いる分子置換法で決定した。分子置換の解答をＦＧ
Ｆ２−ＦＧＦＲ２複合体の４個のコピーに対して見出した。モデル構築と精密化
を、プログラムＯ（ジョーンズら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ａ４７
、１１０−１１９、１９９１）およびＣＮＳ（ブリュンガーら、Ａｃｔａ Ｃｒ
ｕｕｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５４：９０５−９２１、１９９８）それぞれを用いて
行った。精密化の間、固定非結晶学束縛をＦＧＦ２、Ｄ２およびＤ３の骨格原子
に対して加えた。ＦＧＦ２−ＦＧＦＲ２および関連するＦＧＦ１−ＦＧＦＲ１の
構造は、対応するＸ線座標と共にプロトニコフら、Ｃｅｌｌ １０１：４１３−
２４（２０００）に報告され、その開示は本明細書に参考文献として含まれてい
る。

【０３７８】 ＦＧＦ２−ＦＧＦＲ２の原子モデルは４個のＦＧＦ２分子、４個のＦＧＦＲ２
分子、４個の硫酸イオン、および２６３個の水分子で構成される。ＦＧＦ２−Ｆ
ＧＦＲ２の構造を２．２Å、Ｒ値２４．８％（遊離Ｒ値２７．３％）で精密化し
た。データ収集と精密化統計は表７に示される。原子モデルはＦＧＦ２残基１６
−１４５とＦＧＦＲ２残基１４８−３６５、４個の硫酸イオン、および２６３個
の水分子を含む。全てのＦＧＦＲ２分子で残基２９５−３０６（Ｄ３中のｂＣ−
ｂＣ'）は無秩序である。平均Ｂ因子はＦＧＦ２分子に対し４０．５Ų、ＦＧＦ
Ｒ２分子に対し７３Ų、硫酸イオンに対し７３Ų、および水分子に対し３２．
６Ųである。

【０３７９】 原子構造座標 表３はＦＧＦ２／ＦＧＦＲ２複合体の原子構造座標を提供する。 ＦＧＦ２／
ＦＧＦＲ２複合体の構造はプロトニコフら、Ｃｅｌｌ １０１：４１３−４２４
（２０００）に報告され、インターネット上でプロテインデータバンクにより入
手可能である（プロテインデータバンクコード１ＥＶ２が割り当てられている）
。その開示は本明細書に参考資料として含まれる。

【０３８０】

【化１】

【０３８１】 実施例４−ＳＣＦの製造および構造決定 タンパク質の発現、再褶曲および精製 ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）の残基１−１４１を、先に報告された様に（ラング
レイら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２９５：２１−２８、１
９９２）Ｅ．ｃｏｌｉ中で抱合体として発現した、１リッターの微生物培養由来
の抱合体を２５から３０ｍｌの６Ｍグアニジン塩酸塩溶液に溶解した。溶液が透
明になった後、ＤＤＴを最終濃度４０ｍＭで加え、３７℃で３０分間インキュベ
ートした。得られた溶液を４リッターの緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ８．５）
中に希釈し、終夜放置した。再褶曲タンパク質をイオン交換クロマトグラフィー
で精製した。タンパク質純度、電気泳動移動度および生物活性を、確立した方法
（ラングレイら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２９５：２１−
２８、１９９２）で調製したSCF、および市販のＳＣＦと比較した。非還元ゲル
電気泳動で調べたが、ジスルフィド結合ＳＣＦ二量体はこの調製物中に検出され
なかった（ラングレイら、 Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２９
５：２１−２８、１９９２）。

【０３８２】 結晶化およびデータ収集 ＳＣＦの結晶を懸垂液滴法を用い、蒸気拡散法で２０℃で成長させた。２つの
結晶形が生成した。単位格子寸法ａ＝７２．４７Å、ｂ＝８３．４５Å、ｃ＝８
９．１５Å の斜方結晶は、２マイクロリッターのタンパク質試料（１５−２０
ｍｇ／ｍｌ）を１５−３０％ＰＥＧ、０．２５Ｍ ＣａＣｌ₂および０．１Ｍ Ｈ
ＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）でなる２マイクロリッターの保存液と混合することによ
り成長した。１ｍＭのＳｍＣｌ₃をタンパク質溶液に添加すると、構造決定に使
用した単斜結晶が生成した（表４参照）。単斜結晶はセットアップから数時間で
現れた。

【０３８３】 データ収集用結晶を、液体プロパン中で結晶化液滴から直接瞬間凍結した。Ｃ
ＳＦ結晶の最初の特徴付けを、ブルックヘブン国立研究所のナショナルシンクロ
トロン光源のシンクロトロンビームラインＸ２６Ｃで行い、最終データ収集をア
ルゴン研究所構造生物学センターアドバンスドフォトン光源のビームライン１９
―ＩＤで行った。全てのデータをＤＥＮＺＯで処理し、強度をＳＣＡＬＥＰＡＣ
Ｋ（オトウィノウスキら、Ｍｅｔｈｏｄ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７６：３０７−３
２６、１９９７）を用いて減衰しスケール合わせを行った。

【０３８４】 構造決定 ヒトコロニー刺激因子のαＣ原子の位置から構築したモデルを用いる、斜方結
晶から集めたデータによる分子置換の試みは成功しなかった。構造決定に用いた
データは、Ｓｍの吸収端でない１．０１Åおよび１．５Å の波長で三斜結晶か
ら収集した。異常な信号はパターソン（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ）差マップから明瞭
であった。重金属の位置の精密化と位相決定はＰＨＡＳＥ（フーレイ（Ｆｕｒｅ
ｙ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７７：５９０−６２０、１９９７
）で行った。位相決定のために全部で３個のＳｍの位置を使用したが、４個のＳ
ｍ原子は最終モデル中に置かれた。最初の溶媒平坦化電子密度マップからは、短
いヘリックス片のみが見え、それらをプログラムＯ（ジョーンズら、Ａｃｔａ
Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ａ４７：１１０−１１９、１９９１）で密度中に組み
込んだ。部分構造と組み合わせてモデル構築と溶媒平坦化のサイクルの繰り返し
を、非対称単位中に４個の分子のほとんどが構築されるまで行った。その後、精
密化を結晶学およびＮＭＲシステム（ＣＮＳ；ブルグナー（Ｂｒｕｇｎｅｒ）ら
、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５４：９０５−９２１、１９９８）で
低エネルギー（波長１．０１Å ）回折データに対して行った。１０％の無差別
に選んだ試験データセットと２Ｆｏ−Ｆｃ電子密度マップで調節した残基の位置
を用い、精密化の進行をＲ_free値を用いてモニターした。

【０３８５】 結晶中のサマリウムイオンの２つの波長の異常散乱の差を用いて構造を決定し
、２．３Å に精密化した（表４）。各非対称単位中に４個の分子があり、最初
の実験的電子密度は分子中の４個のヘリックス束と、２つのβ鎖を明瞭に示した
。結合ループと共にN−末端およびＣ−末端領域が２Ｆｏ−Ｆｃマップから作成
された。表４は最終モデルの統計を示し、１２０個の溶媒分子、４個のサマリウ
ムイオン、２個のカルシウムイオンおよび１個のトリス分子が含まれる。ヒト幹
細胞因子ホモ二量体の構造は、ツァンら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．９７（１４）：７７３２−７７３７、２０００に報告され、ヒトＳＣＦ二量体
の座標はインターネット上でプロテインデータバンクから入手できる（プロテイ
ンデータバンクＩＤコード１ＥＸＺ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ
／ｐｄｂ／ｃｇｉ／ｅｘｐｌｏｒｅ．ｃｇｉ？ｐｉｄ＝１７８２５５９６７２３
１７４３＆ｐｄｂｌｄ＝１ＥＸＺ）。その開示は本明細書に参考資料として含ま
れる。

【０３８６】 構造の一般的な特徴 結晶学的非対称単位中に４個のＳＣＦプロモーターが存在するが、生物学的二
量体は明らかに区別できる。 ４個のプロモーターはＮ−末端およびＣ−末端ル
ープ領域を除いて重ね合わせ可能である。これらのループは柔軟で、非対称単位
中の４この分子中で複数のコンフォーメーションをとる。生物二量体中のプロモ
ーターは先頭と先頭を突き合わせて、ほぼ完全なＣ２対称で詰め込まれている（
図１９参照）。二量体はβ鎖の側方へ約３０°曲がっており、約８７Å×３２Å
×２５Åの寸法で伸長した形になっている。

【０３８７】 ＳＣＦは２個の若干楔形の非共有ホモ二量体である。ＳＣＦの全体的なトポロ
ジーは、他の短鎖ヘリックスサイトカインと類似の逆平行４ヘリックス束褶曲で
ある（図１９参照；ロスワルスキ（Ｒｏｓｗａｒｓｋｉ）ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒ
ｅ ２：１５９−１７３、９９４）。ヘリックスは上−上−下−下に走り、一方
の端が２枚の交差するβ鎖で包まれている。二量体インターフェースの構造は、
二量体インターフェースの構造は、二量体が大きい埋め込み表面積を有する２個
のプロトマー間の広範囲の極性および無極性相互作用で媒介されることを示して
いる。その構造には疎水性割れ目と、潜在的レセプター結合部位として作用する
各プロトマーの尾部の荷電領域が含まれる。ＳＣＦのＸ線構造は、二量体化で埋
め込まれる約１７００Ųの表面積（半径１．４Åの探針で計算）を有する２個
のＳＣＦプロトマー間に、遠距離相互作用が存在することを示してる。この埋め
込まれた表面積は、個々のプロモーターの全表面の約２０％に達し、ジスルフィ
ド結合Ｍ−ＳＣＦ二量体の埋め込み表面積８５０Ųの２倍である。

【０３８８】 ４個のヘリックスの疎水性残基の側鎖が各単量体のコアを埋めている。Ｃｙｓ
４とＣｙｓ８４も他、Ｃｙｓ４３とＣｙｓ１３８も２つの分子間ジスルフィド対
を形成している。２つのジスルフィド結合は、二量体インターフェースから離れ
た各プロトマーの１端（尾部）に位置している。Ｃｙｓ４−Ｃｙｓ８９ジスルフ
ィド結合は、 Ｖａｌ３９、Ｌｅｕ９８、Ｐｒｏ４０およびＨｉｓ４２の側鎖で
包み込まれたジスルフィド結合であるＣｙｓ４３−Ｃｙｓ１３８より露出してい
る。このことが、Ｃｙｓ４−Ｃｙｓ８９結合がＣｙｓ４３−Ｃｙｓ１３８ジスル
フィド結合より化学的還元に鋭敏である理由を説明すると考えられる（ル（Ｌｕ
）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１１３０９−１１３１、１９９６）。

【０３８９】 ＳＣＦ二量体インターフェースはαＡおよびβ１、αＢおよびαＣ間のループ
で構成され、３枚の層に分けられる（図２１参照）。β鎖側の底の層は疎水性相
互作用で構成される。１つのプロモーター由来のＴｙｒ２６、Ｐｒｏ２３、Ｐｈ
ｅ６３およびＬｅｕ２２の側鎖は他のプロモーター由来の対応する側鎖と詰め合
わされ、Ｔｙｒ２６−Ａｓｐ２５'およびＴｙｒ２６'−Ａｓｐ２５がカーペット
状に水素結合環を形成している（図２Ｂ参照）。これらの分子間水素結合対は、
２個のプロモーター間の分子間ジスルフィド結合を置き換えている（バザンら、
Ｃｅｌｌ ６５：９−１０、１９９１；ブロウディ（Ｂｒｏｕｄｙ）、Ｂｌｏｏ
ｄ ９０：１３４５−１３６４、１９９７）。配列決定から、このＴｙｒ−Ａｓ
ｐ対が、非共有結合相互作用により二量体を生成するサイトカインの第３のメン
バーであるｆｔｌ３リガンドで保存されていることを示している（ハヌム（Ｈａ
ｎｎｕｍ）ら、Ｎａｔｕｒｅ３６８：６４３−６４８、１９９４）。インターフ
ェースのコアで、４個のアスパラギン残基（双方のプロモーター由来のＡｓｎ７
２およびＡｓｎ２１）の側鎖がそれ自身の間、および水分子と水素結合を形成し
ている（図２１参照）。個の十分に配位した水分子は、２つの対称関係にあるＡ
ｓｎ２１残基の２個のカルボニル酸素原子と平均結合長２．７Åで水素結合を形
成している。上層は１個のプロモーターのループαＢ−αＣと他のプロモーター
のループαＢ−αＣとの間の相互作用を含んでいる。２つのプロモーター間で形
成した多くの水素結合に加えて、Ｌｙｓ１７−Ｇｌｕ６８'、Ｌｙｓ２４−Ａｓ
ｐ６１'、およびその対称関係にある同じ残基間に４つの塩架橋が存在する可能
性がある。

【０３９０】 実施例５−ＦＧＦ２−ＦＧＦＲ１−ヘパリン３成分複合体の構造決定 ＦＧＦ２−ＦＧＦＲ１複合体の発現、生成および結晶化は先の報告通りに行わ
れた（プロトニコフら、Ｃｅｌｌ ９８：６４１−６５０、１９９９）。天然型
ＦＧＦ２−ＦＧＦＲ１複合体の結晶を１ｍＭのデカサッカライドを含む１０μｌ
の安定化溶液（４０％ＰＥＧ８０００、０．２５Ｍ硫酸アンモニウム、０．１Ｍ
トリスＨＣｌ、ｐＨ８．５）中、２０℃で１週間インキュベートした。データを
瞬間冷凍結晶（１０％グリセロールを低温保護剤として用いる乾燥窒素気流中）
でＣＣＤ検出器により、ブルックヘブン国立研究所のナショナルシンクロトロン
光源のビームラインＸ４Ａで収集した。データをＤＥＮＺＯおよびＳＣＡＬＥＰ
ＡＣＫ（オトウィノウスキら、振動データ換算プログラム、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ
ｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＣＣＰ４ Ｗｅｅｋｅｎｄ、サウヤーら編集、ＳＥＲＣダレス
ブリー研究所、ダレスブリー、英国、１１９９３）を用いて処理した。差フーリ
エ電子密度マップをＦＧＦ２−ＦＧＦＲ１構造（プロトニコフら、１９９９）を
用いて計算した。オリゴサッカライドに対する最初のモデルをヘキササッカライ
ド（１ＢＦＣ）と複合体を形成したＦＧＦ２の結晶構造から取った（ファーマン
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７１：１１１６−１１２０、１９９６）。オリゴサッカ
ライド似対するパラメーターをＨＩＣ−Ｕｐサーバーを用いて作成した（クレイ
ヴェグト（Ｋｌｅｙｗｅｇｔ）ら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５４
：１１１９−１１３１、１９９８）。シミュレーションアニーリングと位置Ｂ因
子の精密化をＣＮＳを用いて行った（ブルエンガー（Ｂｒｕｅｎｇｅｒ）ら、Ａ
ｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５４：９０５−９２１、１９９８）。２Ｆ
ｏ−Ｆｃ電子密度マップ中へのモデル構築をプログラムＯで行った（ジョーンズ
ら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ａ４７：１１０−１１９、１９９１）
。平均Ｂ因子は全原子に対し３６．９Ų、ＦＧＦ２に対し３５．０Ų、ＦＧＦ
Ｒ１に対し３５．３Ųおよびデカサッカライド分子に対し７２．４Ųである。

【０３９１】 構造決定 ヘパリン結合峡谷がＦＧＦ２−ＦＧＦＲ１結晶に存在するので、これらの結晶
をデカサッカライドとインキュベートするとＦＧＦ２−ＦＧＦＲ１−ヘパリン３
成分複合体の生成が促進される。 ＦＧＦ２−ＦＧＦＲ１−ヘパリン３成分複合
体の結晶構造をＦＧＦ２−ＦＧＦＲ１構造から得られた位相を用いて解析した。
データ収集および精密化統計は表５に与えられる。峡谷を横断し、リガンドを架
橋するデカサッカライド（ヘパリン）が発見されることが予想された。しかしな
がら、差フーリエ電子密度マップは峡谷内の２個のデカサッカライド分子を明ら
かに示している（図２７および２８参照）。最初の６個の糖リング（Ａ−Ｆ）の
みがタンパク質と相互作用していることが観察される。従って、電子密度はこれ
らのリングについては良く分かる。さらに、格子定数が都合が良いため、２個の
別な糖（リングＧおよびＨ）が１個のデカサッカライドでモデル化される。

【０３９２】 原子構造座標 表６はＦＧＦ２−ＦＧＦＲ１−ヘパリン３成分複合体の原子構造座標を提供す
る。

【０３９３】 ヘパリンの構造 ヘパリンは、α１−４結合で接続したＤ−グルコサミン（ＧｌｎＮ）とＬ−ユ
ーロニック酸（ＩｄｏＡ）の繰り返しジサッカライド単位によるヘリックスで近
似することができる。各ジサッカライド単位は、ＩｄｏＡの１個の２−ヒドロキ
シル基と、２個のＧｌｃＮの２−アミノおよび６−ヒドロキシル基の３個所で硫
酸化されている。硫酸基とカルボキシル基がヘパリンヘリックスの負荷電エッジ
を形成し、平均１７−１９Å毎にヘリックスの一定の側鎖上に現れる。これらの
ヘリックスパラメーターは８．７Å と１８０°のX線繊維回折値と一致している
（ニードスチンスキ（Ｎｉｅｄｕｓｚｙｎｓｋｉ）ら、Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ
．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．４８：７３、１９７７）。ヘパリンポリサッカライドは非
還元末端（Ｏ４）および還元末端（Ｏ１）を有する極性化合物である。結晶構造
中では、デカサッカライドは峡谷の中心でその非還元末端と結合し、リガンドの
高親和性ヘパリン結合部位上へ伸びている。従って、二量体集合の対称が保たれ
る。１個の極性ヘパリン分子が峡谷を横切ることは、系の２回対称を乱す。

【０３９４】 数個の分子間水素結合がデカサッカライドのヘリックスコンフォーメーション
を安定化する（データは示さず）。ＧｌｎＮリングは全てそのコンフォーメーシ
ョンである。ＩｄｏＡループは、デカサッカライドの溶液構造で以前に観察され
た様に、イス型または歪んだボートコンフォーメーションであり（ムーロイ（Ｍ
ｕｌｌｏｙ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２９３：８４９−８５８、１９９３）、
ＩｄｏＡがＦＧＦまたはＦＧＦＲとの接触によって複数のコンフォーメーション
を取ることを示唆している。ＩｄｏＡのコンフォーメーションの柔軟性が様々な
ＦＧＦまたはＦＧＦＲの認識に役割を果たしていることが考えられる。

【０３９５】 ヘパリン−ＦＧＦおよびヘパリン−ＦＧＦＲ相互作用 各デカサッカライドはＦＧＦおよび２つのＦＧＦＲと全体で３０個の水素結合
を形成する（図２９および３０参照）。１個のＦＧＦ：ＦＧＦＲ＝１：１複合体
内で、ヘパリンと２５個の水素結合を形成している。残りの５個のヘパリンとの
水素結合は隣り合った１；１のＦＧＲ：ＦＧＦＲ複合体由来である。Ｄ２のヘパ
リン結合表面に位置するリジン１６０、１６３、１７２、１７５および１７７は
、１：１のＦＧＦ：ＦＧＦＲ複合体中のＦＧＦＲとヘパリン間に７個の水素結合
を形成する。ヘパリンのリング酸素（リングＡ）で媒介されるＬｙｓ１７５とヘ
パリン間の水素結合を除いて、これらの水素結合の残りは硫酸基で媒介されてい
る。３つのタイプのヘパリン硫酸基の全て（Ｎ−硫酸基、２−Ｏ−硫酸基および
６−Ｏ−硫酸基）がこれらの相互作用に用いられる（図２９および３０）。

【０３９６】 ＦＧＦ−ヘパリンインターフェースで全部で１８個の水素結合を形成し、その
半分が硫酸基で媒介される（図２９および３０）。残りの半分はカルボキシル基
、リンカーまたはヘパリンのリング酸素で媒介される。表面残基Ａｓｎ２７（β
１−β２ループ中に所在）、Ａｒｇ１２０、およびＴｈｒ２１２（β９−β１０
ループ中に所在）、Ｌｙｓ１２５、Ｌｙｓ１２９、Ｇｌｎ１３４、Ｌｙｓ１３５
およびＡｌａ１３６（β１１−β１２ループに所在）はＦＧＦ上のヘパリン結合
部位を形成する。これらの残基はＦＧＦ２−ヘキササッカライド構造中でヘパリ
ンと相互作用するものと同じである（ファーマンら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７１：１
１１６−１１２０）。しかしながら、ＦＧＦに対するヘパリンヘリックスの配向
はこれらの２つの構造間で若干異なっているので、水素結合対は同じでない。

【０３９７】 ＦＧＦ２のＬｙｓ１３５とヘパリンの６−Ｏ−硫酸基（リングＢ）間の１本の
水素結合を別として、硫酸基媒介相互作用の残りはＮ−硫酸基および２−Ｏ−硫
酸基を含む。これにより、ＦＧＦ２が６−Ｏ−脱硫酸ヘパリンとの結合能を維持
すると報告されている理由の説明が可能である。それにもかかわらず、６−Ｏ−
脱硫酸ヘパリンオリゴサッカライドはＦＧＦ２−ＦＧＦＲ相互作用の促進に有効
ではない。本発明の結晶構造では、リングＢの６−Ｏ−硫酸基（図２９および３
０）はＦＧＦおよびＦＧＦＲ双方のヘパリン結合残基と水素結合を形成する。Ｆ
ＧＦとＦＧＦＲの双方がヘパリンの同じ硫酸基と同時に結合することは、明らか
にＦＧＦのＦＧＦＲに対する見かけの親和性を増加させる。従って、本発明の構
造も十分に報告されたヘパリン依存性１：１ＦＧＦ−０ＦＧＦＲ相互作用に対す
る分子的な基盤を与えるものである。

【０３９８】 ＦＧＦ−ＦＧＦＲの１：１複合体内でＦＧＦ−ＦＧＦＲ相互作用を増進する他
に、ヘパリンはまた２回対称二量体を横切って隣り合うレセプターと相互作用す
る。合計５個の水素結合が、ＦＧＦＲ残基Ｌｙｓ２０７およびＡｒｇ２０９、お
よびヘパリンの糖リングＡ−Ｄ間のこのインターフェースに形成する（図２９お
よび３０）。Ｉｌｅ２１６とヘパリンの非還元性リングＡ間の疎水性接触がこの
インターフェースをさらに強化する。Ｌｙｓ２０７とヘパリン間の水素結合はカ
ルボキシル基、リンカーおよびヘパリンのリング酸素で媒介される。対照的に、
Ａｒｇ２０９はリングＤの６−Ｏ−硫酸基と水素結合を形成し、ＦＧＦ２−ＦＧ
ＦＲの１：１相互作用を促進しＦＧＦ−ＦＧＦＲの２：２二量体形成を誘発する
６−Ｏ−硫酸基の重要な役割を強調する。結晶構造は、しばしば報告されている
様に、レセプター二量体化を誘発できず、６−Ｏ−脱硫酸ヘパリンオリゴサッカ
ライドが細胞分裂誘発活性を促進することができないことに対する合理的な説明
を提供するものである。

【０３９９】

【化２】

【０４００】 説明のため本明細書に記載された本発明は、本明細書に特に記載されない要素
および制約がなくても実行し得る。使用された用語および表現は、用語として用
いられたものであり、制約的ではなく、この様な用語と表現の使用は図示し記載
され特徴の等価物、またはその一部を排除するものではなく、様々な変更がクレ
ームされた本発明の範囲内で可能である。従って、本発明は好ましい実施態様お
よび任意の特徴で特に開示されているが、本明細書に開示された内容の変更また
は変法は当業者に依存するものであり、この様な変更または変法は付随するクレ
ームに定義された様に本発明の範囲内である。

【０４０１】 本明細書で言及または引用した文献、特許および特許出願の内容、および他の
文書および電子的に入手し得る情報は、個々の文書が特別かつ個別に参考のため
取り入れることを指示されたと同程度にその実体が参考資料として取り入れられ
ている。出願人は本明細書出願に、この様な文献、特許、特許出願または他の文
書を物理的に取り入れる権利を保有する。

【０４０２】 本明細書で使用された用語と表現は、記述の用語として使用されたものであり
、限定的ではなく、この様な用語および表現の使用に、図示され記載された特徴
の等価物またはその一部を除外する意図はなく、様々な変更はクレームされた本
発明の範囲内である。従って、本発明は好ましい実施態様およびその任意の特徴
で開示されているが、本明細書に具象化され開示された本発明の変更および変法
は当業者に依存するものであり、この様な変更および変法は本発明の範囲内であ
ることを理解しなければならない。

【０４０３】 ＦＧＦＲ１（Ｄ２−Ｄ３）／ＦＧＦ２複合体の構造はプロトニコフら、Ｃｅｌ
ｌ ９８：６４１−６５０（１９９９）に報告されている。ＦＧＦＲ１（Ｄ２−
Ｄ３）／ＦＧＦ１複合体、およびＦＧＦＲ２／ＦＧＦ２複合体の構造はプロトニ
コフら、Ｃｅｌｌ １０１：４１３−４２４（２０００）に報告されている。ヒ
ト幹細胞因子はツァンら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７（１４）
：７７３２−７７３７に報告されている。これら３つの参考文献の開示は本明細
書に参考文献として取り入れられている。

【０４０４】 以下の文献は本明細書で報告したＲＰＴＫおよび特にＦＧＦ−ＦＧＦＲヘパリ
ン３成分複合体に関する一般的参考文献を含む。 Basilico, C., and Moscatelli, D. (1992). The FGF family of growth factor
s and oncogenes. Adv. Cancer Res. 59,115-165. Bruenger, A. T., Adams, P. D., Clore, G. M., DeLano, W. L., Gros, P., Gr
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liferation. Cell 79,1015-1024. Zhou, F. Y. et al.. Eur. J. Cell Biol. 73,71-80.

【０４０５】関連出願のクロスリファレンス 本出願は１９９年８月３０日受理Ｕ．Ｓ．仮出願番号６０／１５１、８１０の
３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づき優先権を主張する。その開示は本明細
書にその実体が参考資料として取り入れられている。

【０４０６】

【表１】

【０４０７】

【表２】

【０４０８】

【表３】

【０４０９】

【表４】

【０４１０】

【表５】

【０４１１】

【表６】

【０４１２】

【表７】

【０４１３】

【表８】

【０４１４】

【表９】

【０４１５】

【表１０】

【０４１６】

【表１１】

【０４１７】

【表１２】

【０４１８】

【表１３】

【０４１９】

【表１４】

【０４２０】

【表１５】

【０４２１】

【表１６】

【０４２２】

【表１７】

【０４２３】

【表１８】

【０４２４】

【表１９】

【０４２５】

【表２０】

【０４２６】

【表２１】

【０４２７】

【表２２】

【０４２８】

【表２３】

【０４２９】

【表２４】

【０４３０】

【表２５】

【０４３１】

【表２６】

【０４３２】

【表２７】

【０４３３】

【表２８】

【０４３４】

【表２９】

【０４３５】

【表３０】

【０４３６】

【表３１】

【０４３７】

【表３２】

【０４３８】

【表３３】

【０４３９】

【表３４】

【０４４０】

【表３５】

【０４４１】

【表３６】

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【表３７】

【０４４３】

【表３８】

【０４４４】

【表３９】

【０４４５】

【表４０】

【０４４６】

【表４１】

【０４４７】

【表４２】

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【表４３】

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【表４４】

【０４５０】

【表４５】

【０４５１】

【表４６】

【０４５２】

【表４７】

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【表４９】

【０４５５】

【表５０】

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【表５１】

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【表５５】

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【表５７】

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【表６０】

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【表８７】

【０４９３】

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【０４９５】

【表９０】

【０４９６】

【表９１】

【０４９７】

【表９２】

【０４９８】

【表９３】

【０４９９】

【表９４】

【０５００】

【表９５】

【０５０１】

【表９６】

【０５０２】

【表９７】

【０５０３】

【表９８】

【０５０４】

【表９９】

【０５０５】

【表１００】

【０５０６】

【表１０１】

【０５０７】

【表１０２】

【０５０８】

【表１０３】

【０５０９】

【表１０４】

【０５１０】

【表１０５】

【０５１１】

【表１０６】

【０５１２】

【表１０７】

【０５１３】

【表１０８】

【０５１４】

【表１０９】

【０５１５】

【表１１０】

【０５１６】

【表１１１】

【０５１７】

【表１１２】

【０５１８】

【表１１３】

【０５１９】

【表１１４】

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【表５２１】

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【表５２２】

【０９２８】

【表５２３】

【０９２９】

【表５２４】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１はＦＧＦ２と複合体を形成したＦＧＦＲ１ Ｄ２−Ｄ３二量体
のリボンダイアグラムである。

【図２】 図２はＦＧＦ１と複合体を形成したＦＧＦＲ１ Ｄ２−Ｄ３二量体
のリボンダイアグラムである。

【図３】 図３はテロキンのＩＧの褶曲と比較した、ＦＧＦＲ１ Ｄ２および
Ｄ３のＩｇの褶曲のトポロジーダイアグラムである。

【図４】 図４はヒトＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３およびＦＧＦ４のＤ２−
Ｄ３領域の配列である。

【図５】 図５はＦＧＦ１−ＦＧＦ２複合体のリボンダイアグラムを示し、Ｉ
ｇ様ドメイン２（Ｄ２）および３（Ｄ３）はそれぞれ緑とシアンで示される。

【図６】 図６はＦＧＦ１−ＦＧＦＲ１およびＦＧＦ２−ＦＧＦＲ２複合体の
空間充填モデルである。

【図７】 図７はＦＧＦ２とＦＧＦＲ２の間の疎水性インターフェース中の詳
細な相互作用の立体図を示す。

【図８】 図８はＦＧＦ１とＦＧＦＲ１の間の疎水性インターフェース中の詳
細な相互作用の立体図を示す。

【図９】 図９はＤ２−Ｄ３リンカー中のＡｒｇ２５１の近傍のＦＧＦ２とＦ
ＧＦＲ２の間の保存水素結合ネットワークの詳細な相互作用の立体図を示す。

【図１０】 図１０はＤ２−Ｄ３リンカー中のＡｒｇ２５０の近傍のＦＧＦ１
とＦＧＦＲ１の間の水素結合ネットワークの詳細な相互作用の立体図を示す。

【図１１】 図１１はＦＧＦ２−ＦＧＦＲ２構造中のＦＧＦ２とＤ３のβＦ−
βＧループ間のインターフェース中の詳細な相互作用の立体図を示す。

【図１２】 図１２はＦＧＦ２−ＦＧＦＲ２構造中の、ＦＧＦ２のＮ−末端配
列（β１の前）とＤ３間のインターフェース中の詳細な相互作用の立体図を示す
。図とコードは図１１と同じである。

【図１３】 図１３はＦＧＦ２−ＦＧＦＲ２構造中のＦＧＦ２と、βＣ'−β
Ｅセグメント（紫で示される）の間のインターフェース中の詳細な相互作用の立
体図を示す。図とコードは図１１と同じである。

【図１４】 図１４はＦＧＦ１−ＦＧＦＲ１構造中のＦＧＦ１とＤ３の間のイ
ンターフェース中の詳細な相互作用の立体図を示す。

【図１５】 図１５はヒトＦＧＦレセプターのＤ２およびＤ２−Ｄ３リンカー
のリガンド結合ドメインの構造に基づく配列を示す。

【図１６】 図１６はヒトＦＧＦレセプターのＤ３のリガンド結合ドメインの
構造に基づく配列を示す。

【図１７】 図１７はＣＬＵＳＲＡＬＷプログラムを用いて行ったＦＧＦの構
造に基づく配列を示す。

【図１８】 図１８は骨格の乱れを引き起こすヒトＦＧＦＲ２遺伝子における
突然変異の位置を示す。

【図１９】 図１９はＳＣＦの全体構造を示す。

【図２０】 図２０はＳＣＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびＩＬ−５の２次構造に基づく
配列を示す。

【図２１】 図２１は、モルスクリプトおよびラスター ３Ｄにより作成され
たＳＣＦの二量体インターフェースの立体図である。

【図２２】 図２２は、二量体インターフェースのＴｙｒ２６およびＡｓｐ２
５'の水素結合サークルに対し、１．２で等高線を描き、Ｏで作成された２Ｆｏ
−Ｆｃ電子密度を示す。

【図２３】 図２３はモルスクリプトおよびラスター３Ｄで作成した共有結合
ＳＣＦ二量体のモデルを示す。

【図２４】 図２４はＧＲＡＳＰで作成された、ｃ−ｋｉｔおよびＳＣＦ：Ｓ
ＣＦＲ複合体に対するＳＣＦ上の潜在的結合部位を示す。

【図２５】 図２５はヒト、ラット、マウス、イヌおよびブタＳＣＦの配列を
示す。

【図２６】 図２６はＧＲＡＳＰで作成した、ｃ−ｋｉｔの細胞外ドメインの
Ｉｇ様ドメインを有する複合体中の、ＳＣＦの提案されたモデルを示す。

【図２７】 図２７はＦＧＦ２−ＦＧＦＲ１複合体の前もって生成した結晶中
へ浸透したジサッカライドの電子密度マップを示し、二量体集合中のデカサッカ
ライドの位置を示す。

【図２８】 図２８は原子モデルから除かれたデカサッカライドによる仮想ア
ニーリング後に計算された、図２７に示されたＦＧＦ２−ＦＧＦＲ１複合体のＦ
ｏＦｃ電子密度マップの立体図を示す。

【図２９】 図２９は規則的なデカサッカライドリング（Ａ−Ｆ）、ＦＧＦお
よびＦＧＦＲ間の詳細な相互作用の立体図を示す。

【図３０】 図３０は３成分複合体中の、デカサッカライド（ヘパリン）と、
ＦＧＦおよびＦＧＦＲの間の相互作用を示す概略図である。

【図３１】 図３１はセファデックス２００カラム（ファルマシア）による、
様々な比率で均一に硫酸化されたヘキササッカライドと精製１：１ＦＧＦ１−Ｆ
ＧＦＲ２複合体の１組の混合物に対する、二量体生成の分離の結果を示す。

【図３２】 図３２は二量体ＦＧＦ２−ＦＧＦＲ１−ヘパリン３成分複合体の
“２末端”モデルの分子表面の表現を示す。

【図３３】 図３３はコンピューターに基づくシステムの概略図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 モハンマディ，ムーサ アメリカ合衆国ニューヨーク州10016 ニ ューヨーク，ファースト アベニュー 564，アパートメント 12エフ Ｆターム(参考） 2G045 AA34 DA36 FB01 JA01 4B063 QA08 QQ05 QQ79 QR33 QR77 QR80 QS05 QS36 QX01 4H045 AA30 BA10 CA40 DA01 DA51 EA50 FA72 FA74

Claims (89)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 レセプター蛋白質チロシンキナーゼの細胞外ドメインを含む
   ポリペプチドを含む結晶。
2. 【請求項２】 細胞外ドメインが１またはそれ以上のＩｇ様ドメインを含む
   ，請求項１記載の結晶。
3. 【請求項３】 レセプター蛋白質チロシンキナーゼが繊維芽細胞成長因子レ
   セプターである，請求項２記載の結晶。
4. 【請求項４】 細胞外ドメインが，Ｉｇ様ドメイン２およびＩｇ様ドメイン
   ３を含み，Ｉｇ様ドメイン１を含まない，請求項３記載の結晶。
5. 【請求項５】 繊維芽細胞成長因子レセプターが繊維芽細胞成長因子レセプ
   ター１である，請求項１記載の結晶。
6. 【請求項６】 ポリペプチドが繊維芽細胞成長因子レセプター１のアミノ酸
   残基１４２−３６５を含む，請求項１記載の結晶。
7. 【請求項７】 ポリペプチドが，図４に示される配列を有するＦＧＦＲ１の
   アミノ酸残基１５０−３６０を含む，請求項１記載の結晶。
8. 【請求項８】 レセプター蛋白質チロシンキナーゼに結合したリガンドをさ
   らに含む，請求項１記載の結晶。
9. 【請求項９】 レセプター蛋白質チロシンキナーゼが繊維芽細胞成長因子レ
   セプター１であり，リガンドがＦＧＦ１である，請求項８記載の結晶。
10. 【請求項１０】 ＦＧＦ１が，図１７に示されるアミノ酸配列を有する，請
    求項９記載の結晶。
11. 【請求項１１】 表２の原子構造座標により定義される，請求項９記載の結
    晶。
12. 【請求項１２】 正方晶系空間群Ｐ１に属し，かつａ＝ｂ＝９８．５Å，ｃ
    ＝１９７．０Åの単位格子寸法を有する，請求項１１記載の結晶。
13. 【請求項１３】 レセプター蛋白質チロシンキナーゼが繊維芽細胞成長因子
    レセプター１であり，リガンドがＦＧＦ２である，請求項８記載の結晶。
14. 【請求項１４】 ＦＧＦ２が図１７に示されるアミノ酸配列を有する，請求
    項１３記載の結晶。
15. 【請求項１５】 表１の原子構造座標により定義される，請求項１３記載の
    結晶。
16. 【請求項１６】 正方晶系空間群Ｐ４１２１２に属し，かつａ＝６２．５５
    Å，ｂ＝６４．０６Å，ｃ＝６４．１４Å，α＝９３．４０°，β＝１１１．１
    ７°，およびγ＝９７．１８°の単位格子寸法を有する，請求項１３記載の結晶
    。
17. 【請求項１７】 少なくとも１つの重原子をさらに含む，請求項１記載の結
    晶。
18. 【請求項１８】 請求項１または８に記載の細胞外ドメインの構造の三次元
    表示。
19. 【請求項１９】 レセプター蛋白質チロシンキナーゼが変異体レセプター蛋
    白質チロシンキナーゼである，請求項１または８に記載の結晶。
20. 【請求項２０】 リガンドが変異体リガンドである，請求項８記載の結晶。
21. 【請求項２１】 繊維芽細胞成長因子レセプターが繊維芽細胞成長因子レセ
    プター２である，請求項１記載の結晶。
22. 【請求項２２】 ポリペプチドが，繊維芽細胞成長因子レセプター２のアミ
    ノ酸残基１４７−３６６を含む，請求項２１記載の結晶。
23. 【請求項２３】 ポリペプチドが，図４に示される繊維芽細胞成長因子レセ
    プター２の残基１５０−３６０のアミノ酸配列を含む，請求項２２記載の結晶。
24. 【請求項２４】 レセプター蛋白質チロシンキナーゼが繊維芽細胞成長因子
    レセプター２であり，リガンドがＦＧＦ２である，請求項８記載の結晶。
25. 【請求項２５】 ＦＧＦ２が，図１７に示されるアミノ酸配列を有する，請
    求項２４記載の結晶。
26. 【請求項２６】 表３の原子構造座標により定義される，請求項２４記載の
    結晶。
27. 【請求項２７】 三斜晶系空間群Ｐ１に属し，かつａ＝７２．２０Å，ｂ＝
    ７１．６８Å，ｃ＝９０．９２Å，α＝９０．５３°，β＝８９．９８°，およ
    びγ＝８９．９９°の単位格子寸法を有する，請求項２４記載の結晶。
28. 【請求項２８】 幹細胞因子のレセプター結合コアを含むポリペプチドを含
    む結晶。
29. 【請求項２９】 ポリペプチドのレセプター結合コアが４ヘリックス束を含
    む，請求項２８記載の結晶。
30. 【請求項３０】 ポリペプチドのレセプター結合コアが２つのβ鎖をさらに
    含む，請求項２９記載の結晶。
31. 【請求項３１】 ポリペプチドのホモ二量体を含む，請求項３０記載の結晶
    。
32. 【請求項３２】 ポリペプチドの非共有結合性ホモ二量体を含む，請求項３
    １記載の結晶。
33. 【請求項３３】 前記結晶が斜方晶系であり，ａ＝７２．４７Ａ，ｂ＝８３
    ．４５Ａおよびｃ＝８９．１５Ａの単位格子寸法を有する，請求項３２記載の結
    晶。
34. 【請求項３４】 前記結晶が単斜晶系である，請求項３３記載の結晶。
35. 【請求項３５】 表４の原子構造座標により定義される，請求項３４記載の
    結晶。
36. 【請求項３６】 幹細胞因子のアミノ酸残基１−１４１を含むポリペプチド
    の非共有結合性ホモ二量体を含む，請求項３２記載の結晶。
37. 【請求項３７】 非共有結合ホモ二量体がＣ２対称を有する，請求項３２記
    載の結晶。
38. 【請求項３８】 レセプター結合コアに結合したリガンドをさらに含む，請
    求項２９記載の結晶。
39. 【請求項３９】 リガンドがレセプター蛋白質チロシンキナーゼである，請
    求項３８記載の結晶。
40. 【請求項４０】 レセプター蛋白質チロシンキナーゼがｃ−ｋｉｔポリペプ
    チドである，請求項３９記載の結晶。
41. 【請求項４１】 幹細胞因子のレセプター結合コアを含むポリペプチドの構
    造の三次元表示。
42. 【請求項４２】 コンピュータ読み出し可能な形態である，請求項４１記載
    の三次元表示。
43. 【請求項４３】 レセプター蛋白質チロシンキナーゼの細胞外ドメインを含
    むポリペプチドを含む分子構造を描写し分析するためのコンピュータに基づくシ
    ステムであって， （ａ）分子構造からの構造データを記憶するデータ記憶装置； （ｂ）前記メモリと接続されたコンピュータプロセッサであって，１組のプログ
    ラムされた指令を用いて，処理された前記データの出力を発生するプロセッサ；
    および （ｃ）前記プロセッサと接続されたディスプレイ装置であって，前記処理された
    出力にしたがって分子構造を多次元画像とするディスプレイ を含むことを特徴とするシステム。
44. 【請求項４４】 前記データ記憶装置が， （ｉ）多次元空間における分子構造の１組の空間座標を含む少なくとも１つの第
    １のタイプの記憶領域；および （ｉｉ）分子構造の複数のアミノ酸の特徴の表示を含む少なくとも１つの第２の
    タイプの記憶領域 を含み，ここで，前記第２のタイプの記憶領域は前記第１のタイプの記憶領域と
    論理的に連結して前記プロセッサにおけるデータ処理を行わせることを特徴とす
    る，請求項４３記載のシステム。
45. 【請求項４５】 前記プロセッサが， （ｉ）前記メモリ中の構造データにアクセスし，そして （ｉｉ）前記データ記憶装置における１組の構造データポイントに対応する，多
    次元空間における分子構造の可視画像を描写するための画像信号を発生し，ここ
    で，前記画像信号は処理された出力である，請求項４３記載のシステム。
46. 【請求項４６】 前記ディスプレイが， （ｉ）前記処理された出力を受け取り，そして （ｉｉ）前記処理された出力にしたがって，コンピュータスクリーン上で前記分
    子構造を可視画像とする，請求項４３記載のシステム。
47. 【請求項４７】 （ｉ）分子構造以外の組成物の特徴の幾何学的配置のデー
    タを記憶するための記憶装置であって，前記プロセッサに接続された記憶装置；
    および （ｉｉ）オペレータからの指令を受け取るためのオペレータインターフェースで
    あって，前記プロセッサに接続されたインターフェース をさらに含み，ここで，前記プロセッサは，オペレータインターフェースからの
    前記指令にしたがって，前記組成物の可視表示を描写するための，前記ポリペプ
    チドの可視画像と相対的な追加の画像信号を発生し，前記追加の画像信号は追加
    の処理された出力であることを特徴とする，請求項４３記載のシステム。
48. 【請求項４８】 構造データが表１，２，３または６に記載されるものであ
    る，請求項４３記載のシステム。
49. 【請求項４９】 レセプター蛋白質チロシンキナーゼの細胞外ドメインを含
    むポリペプチドを含む分子構造の可視ディスプレイを発生するための情報を記憶
    するメモリであって， （ｉ）多次元空間における分子構造の１組の空間座標を含む少なくとも１つの第
    １のタイプの記憶領域；および （ｉｉ）分子構造の複数のアミノ酸の特徴の表示を含む少なくとも１つの第２の
    タイプの記憶領域； を含み，ここで，前記第２のタイプの記憶領域は多次元空間における分子構造の
    幾何学的配置を表示するよう前記第１のタイプの記憶領域と接続されていること
    を特徴とするメモリ。
50. 【請求項５０】 前記第２のタイプの記憶領域は，前記第１のタイプの記憶
    領域と論理的に連結して，多次元空間における分子構造の細胞外ドメインの少な
    くとも１つの特徴の幾何学的配置を表示する，請求項４９記載のメモリ。
51. 【請求項５１】 空間座標が表１，２，３または６に記載されるものである
    ，請求項５０記載のメモリ。
52. 【請求項５２】 幹細胞因子またはその一部を含む分子構造を描写し分析す
    るためのコンピュータに基づくシステムであって， （ａ）分子構造からの構造データを記憶するデータ記憶装置； （ｂ）前記メモリと接続されたコンピュータプロセッサであって，１組のプログ
    ラムされた指令を用いて処理された前記データの出力を発生するプロセッサ；お
    よび （ｃ）前記プロセッサと接続されたディスプレイ装置であって，前記処理された
    出力にしたがって分子構造を多次元画像とするディスプレイ を含むことを特徴とするシステム。
53. 【請求項５３】 分子構造が，幹細胞因子レセプター結合コアを含むポリペ
    プチドを含む，請求項５２記載のシステム。
54. 【請求項５４】 構造未知のレセプター蛋白質チロシンキナーゼ細胞外ドメ
    インの三次元構造を決定する方法であって， （ａ）構造未知のレセプター蛋白質チロシンキナーゼ細胞外ドメインのアミノ酸
    配列を既知の原子構造座標を有するレセプター蛋白質チロシンキナーゼ細胞外ド
    メインのアミノ酸配列とアラインメントさせ，ここで，アラインメントは，アミ
    ノ酸配列の相同領域をマッチングさせることにより行われ； （ｂ）既知の原子構造座標からの相同のアミノ酸のそれぞれのコンピュータ表示
    を，構造未知のレセプター蛋白質チロシンキナーゼ細胞外ドメイン中の対応する
    アミノ酸の構造のコンピュータ表示に移して，レセプター蛋白質チロシンキナー
    ゼ細胞外ドメイン構造を提供し；そして （ｃ）得られるレセプター蛋白質チロシンキナーゼ細胞外ドメイン構造の低エネ
    ルギーコンフォメーションを決定することにより，構造未知のレセプター蛋白質
    チロシンキナーゼ細胞外ドメインの三次元構造を決定する ことを含む方法。
55. 【請求項５５】 構造未知のレセプター蛋白質チロシンキナーゼ細胞外ドメ
    インの三次元構造を決定する方法であって， （ａ）結晶から得られる回折データセットと既知の原子構造座標を有するレセプ
    ター蛋白質チロシンキナーゼ細胞外ドメインを含む結晶から得られる回折データ
    セットとをマッチングさせることにより，構造未知のレセプター蛋白質チロシン
    キナーゼ細胞外ドメインを含む結晶の単位格子中の原子の位置を決定して，レセ
    プター蛋白質チロシンキナーゼ細胞外ドメイン構造を提供し；そして （ｂ）得られたレセプター蛋白質チロシンキナーゼ細胞外ドメイン構造の低エネ
    ルギーコンフォメーションを決定することにより，構造未知のレセプター蛋白質
    チロシンキナーゼ細胞外ドメインの三次元構造を決定する ことを含む方法。
56. 【請求項５６】 構造未知のレセプター蛋白質チロシンキナーゼ細胞外ドメ
    インの三次元構造を決定する方法であって， （ａ）ＮＭＲデータを用いて構造未知のレセプター蛋白質チロシンキナーゼ細胞
    外ドメインの二次構造を決定し；そして （ｂ）既知の原子構造座標を有するレセプター蛋白質チロシンキナーゼ細胞外ド
    メインの原子構造座標を用いて，アミノ酸の空間相互作用によるアラインメント
    を単純化することにより，構造未知のレセプター蛋白質チロシンキナーゼ細胞外
    ドメインの三次元構造を決定する ことを含む方法。
57. 【請求項５７】 請求項５４−５６のいずれかに記載の方法を用いて決定さ
    れた，レセプター蛋白質チロシンキナーゼ細胞外ドメインの三次元構造。
58. 【請求項５８】 レセプター蛋白質チロシンキナーゼ機能の調節剤を同定す
    る方法であって， （ａ）レセプター蛋白質チロシンキナーゼの原子構造座標の三次元表示を提供し
    ，コンピュータデータベースからの化合物，リガンド，またはリガンド類似体の
    コンピュータ表示をレセプター蛋白質チロシンキナーゼ上の結合部位とドッキン
    グさせて複合体を提供し； （ｂ）望ましい幾何学的フィットおよび１またはそれ以上の望ましい相補的相互
    作用を有する複合体のコンフォメーションを決定し； （ｃ）レセプター蛋白質チロシンキナーゼ結合部位と最もよくフィットする化合
    物，リガンド，またはリガンド類似体をレセプター蛋白質チロシンキナーゼ機能
    の潜在的調節剤として同定し； （ｄ）潜在的調節剤を細胞に投与し； （ｅ）潜在的調節剤を投与していない細胞と潜在的調節剤を投与した細胞との間
    のレセプター蛋白質チロシンキナーゼリン酸化のレベルを比較し；そして （ｆ）レセプター蛋白質チロシンキナーゼリン酸化のレベルの相違に基づいて，
    潜在的調節剤をレセプター蛋白質チロシンキナーゼ機能の調節剤として同定する
    ことを含む方法。
59. 【請求項５９】 レセプター蛋白質チロシンキナーゼ機能の調節剤を同定す
    る方法であって， （ａ）化合物，リガンド，またはリガンド類似体が結合したレセプター蛋白質チ
    ロシンキナーゼの三次元表示を改変して複合体を提供し，ここで，化合物，リガ
    ンド，またはリガンド類似体およびレセプター蛋白質チロシンキナーゼの三次元
    表示は原子構造座標により定義され； （ｂ）望ましい幾何学的フィットおよび１またはそれ以上の望ましい相補的相互
    作用を有する複合体のコンフォメーションを決定し； （ｃ）レセプター蛋白質チロシンキナーゼと最もよくフィットする改変された化
    合物，リガンド，またはリガンド類似体をレセプター蛋白質チロシンキナーゼ機
    能の潜在的調節剤として同定し； （ｄ）潜在的調節剤を細胞に投与し； （ｅ）潜在的調節剤を投与していない細胞と潜在的調節剤を投与した細胞との間
    のレセプター蛋白質チロシンキナーゼリン酸化のレベルを比較し；そして （ｆ）レセプター蛋白質チロシンキナーゼリン酸化のレベルに基づいて，潜在的
    調節剤をレセプター蛋白質チロシンキナーゼ機能の調節剤として同定する ことを含む方法。
60. 【請求項６０】 レセプター蛋白質チロシンキナーゼ機能の調節剤を同定す
    る方法であって， （ａ）レセプター蛋白質チロシンキナーゼと複合体化した化合物，リガンド，ま
    たはリガンド類似体の三次元表示を提供し，ここで，化合物，リガンド，または
    リガンド類似体およびレセプターＰＴＫの三次元表示は原子構造座標により定義
    され； （ｂ）化合物検索コンピュータプログラムを用いて，複合体化した化合物，リガ
    ンド，またはリガンド類似体と類似する化合物，リガンド，またはリガンド類似
    体についてデータベースを検索し； （ｃ）複合体化した化合物，リガンド，またはリガンド類似体と類似する化合物
    ，リガンド，またはリガンド類似体をレセプター蛋白質チロシンキナーゼ機能の
    潜在的調節剤として同定し； （ｄ）潜在的調節剤を細胞に投与し； （ｅ）潜在的調節剤を投与していない細胞と潜在的調節剤を投与した細胞との間
    のレセプター蛋白質チロシンキナーゼリン酸化のレベルを比較し；そして （ｆ）レセプター蛋白質チロシンキナーゼリン酸化のレベルの相違に基づいて，
    潜在的調節剤をレセプター蛋白質チロシンキナーゼ機能の調節剤として同定する
    ことを含む方法。
61. 【請求項６１】 レセプター蛋白質チロシンキナーゼ機能の調節剤を同定す
    る方法であって， （ａ）レセプター蛋白質チロシンキナーゼと複合体化した化合物，リガンド，ま
    たはリガンド類似体の三次元表示を提供し，ここで，化合物，リガンド，または
    リガンド類似体およびレセプター蛋白質チロシンキナーゼの三次元表示は原子構
    造座標により定義され； （ｂ）化合物構築コンピュータプログラムを用いて，レセプター蛋白質チロシン
    キナーゼと複合体化した化合物，リガンド，またはリガンド類似体の一部をデー
    タベースからの類似する化学構造で置き換えることにより，化合物，リガンド，
    またはリガンド類似体を潜在的調節剤として同定し，ここで，化合物の表示は構
    造座標により定義され； （ｃ）潜在的調節剤を細胞に投与し； （ｄ）潜在的調節剤を投与していない細胞と潜在的調節剤を投与した細胞との間
    のレセプター蛋白質チロシンキナーゼリン酸化のレベルを比較し；そして （ｅ）レセプター蛋白質チロシンキナーゼリン酸化のレベルの相違に基づいて，
    潜在的調節剤をレセプター蛋白質チロシンキナーゼ機能の調節剤として同定する
    ことを含む方法。
62. 【請求項６２】 レセプター蛋白質チロシンキナーゼ機能の調節剤を同定す
    る方法であって， （ａ）レセプター蛋白質チロシンキナーゼの原子構造座標の三次元表示を提供し
    ，コンピュータデータベースからの化合物，リガンド，またはリガンド類似体の
    コンピュータ表示を，レセプター蛋白質チロシンキナーゼ上の結合部位とドッキ
    ングさせて複合体を提供し； （ｂ）望ましい幾何学的フィットおよび１またはそれ以上の望ましい相補的相互
    作用を有する複合体のコンフォメーションを決定し； （ｃ）レセプター蛋白質チロシンキナーゼ結合部位と最もよくフィットする化合
    物，リガンド，またはリガンド類似体をレセプター蛋白質チロシンキナーゼ機能
    の潜在的調節剤として同定し； （ｄ）潜在的調節剤を細胞に投与し； （ｅ）潜在的調節剤を投与していない細胞と潜在的調節剤を投与した細胞との間
    の細胞成長のレベルを比較し；そして （ｆ）細胞成長の相違に基づいて，潜在的調節剤をレセプター蛋白質チロシンキ
    ナーゼ機能の調節剤として同定する ことを含む方法。
63. 【請求項６３】 レセプター蛋白質チロシンキナーゼ機能の調節剤を同定す
    る方法であって， （ａ）化合物，リガンド，またはリガンド類似体が結合しているレセプター蛋白
    質チロシンキナーゼの三次元表示を改変して複合体を提供し，ここで，化合物，
    リガンド，またはリガンド類似体およびレセプター蛋白質チロシンキナーゼの三
    次元表示は原子構造座標により定義され； （ｂ）望ましい幾何学的フィットおよび１またはそれ以上の望ましい相補的相互
    作用を有する複合体のコンフォメーションを決定し； （ｃ）レセプター蛋白質チロシンキナーゼと最もよくフィットする改変された化
    合物，リガンド，またはリガンド類似体をレセプター蛋白質チロシンキナーゼ機
    能の潜在的調節剤として同定し； （ｄ）潜在的調節剤を細胞に投与し； （ｅ）潜在的調節剤を投与していない細胞と潜在的調節剤を投与した細胞との間
    の細胞成長のレベルを比較し；そして （ｆ）細胞成長の相違に基づいて，潜在的調節剤をレセプター蛋白質チロシンキ
    ナーゼ機能の調節剤として同定する ことを含む方法。
64. 【請求項６４】 レセプター蛋白質チロシンキナーゼ機能の調節剤を同定す
    る方法であって， （ａ）レセプター蛋白質チロシンキナーゼと複合体化した化合物，リガンド，ま
    たはリガンド類似体の三次元表示を提供し，ここで，化合物，リガンド，または
    リガンド類似体およびレセプターＰＴＫの三次元表示は原子構造座標により定義
    され； （ｂ）化合物検索コンピュータプログラムを用いて，複合体化した化合物，リガ
    ンド，またはリガンド類似体と類似する化合物，リガンド，またはリガンド類似
    体についてデータベースを検索し； （ｃ）複合体化した化合物，リガンド，またはリガンド類似体と類似する化合物
    ，リガンド，またはリガンド類似体を，レセプター蛋白質チロシンキナーゼ機能
    の潜在的調節剤として同定し； （ｄ）潜在的調節剤を細胞に投与し； （ｅ）潜在的調節剤を投与していない細胞と潜在的調節剤を投与した細胞との間
    の細胞成長のレベルを比較し；そして （ｆ）細胞成長の相違に基づいて，潜在的調節剤をレセプター蛋白質チロシンキ
    ナーゼ機能の調節剤として同定する ことを含む方法。
65. 【請求項６５】 レセプター蛋白質チロシンキナーゼ機能の調節剤を同定す
    る方法であって， （ａ）レセプター蛋白質チロシンキナーゼと複合体化した化合物，リガンド，ま
    たはリガンド類似体の三次元表示を提供し，ここで，化合物，リガンド，または
    リガンド類似体およびレセプター蛋白質チロシンキナーゼの三次元表示は原子構
    造座標により定義され； （ｂ）化合物構築コンピュータプログラムを用いて，レセプター蛋白質チロシン
    キナーゼと複合体化した化合物，リガンド，またはリガンド類似体の一部をデー
    タベースからの類似する化学構造で置き換えることにより，化合物，リガンド，
    またはリガンド類似体を潜在的調節剤として同定し，ここで，化合物の表示は構
    造座標により定義され； （ｃ）潜在的調節剤を細胞に投与し； （ｄ）潜在的調節剤を投与していない細胞と潜在的調節剤を投与した細胞との間
    の細胞成長のレベルを比較し；そして （ｅ）細胞成長の相違に基づいて，潜在的調節剤をレセプター蛋白質チロシンキ
    ナーゼ機能の調節剤として同定する ことを含む方法。
66. 【請求項６６】 請求項５８−６５のいずれかに記載の方法により同定され
    る，レセプター蛋白質チロシンキナーゼ機能の調節剤。
67. 【請求項６７】 不適切な活性を有するレセプター蛋白質チロシンキナーゼ
    を有する細胞を同定することにより疾病を診断する方法であって， （ａ）レセプター蛋白質チロシンキナーゼ機能の調節剤を細胞に投与し； （ｂ）調節剤を投与しない細胞の細胞成長速度と調節剤を投与した細胞の細胞成
    長速度とを比較し；そして （ｃ）調節剤を投与していない細胞の細胞成長の速度とは異なる細胞成長速度を
    示す，調節剤を投与した細胞を同定することによって，不適切な活性を有するレ
    セプター蛋白質チロシンキナーゼを有する細胞を特徴づけることにより疾病を診
    断する ことを含む方法。
68. 【請求項６８】 細胞性生物において不適切な活性を有するレセプター蛋白
    質チロシンキナーゼに関連する疾病を治療する方法であって， （ａ）レセプター蛋白質チロシンキナーゼ機能の調節剤を生物に投与し，ここで
    ，調節剤は，許容しうる医薬製剤中にあり；そして （ｂ）レセプター蛋白質チロシンキナーゼ機能を活性化または阻害して疾病を治
    療する ことを含む方法。
69. 【請求項６９】 レセプター蛋白質チロシンキナーゼの細胞外ドメインおよ
    び細胞外ドメインに結合したリガンドを含むポリペプチドを含む結晶。
70. 【請求項７０】 レセプター蛋白質チロシンキナーゼに結合したリガンドの
    少なくとも１つに結合した硫酸化オリゴサッカライドをさらに含む，請求項６９
    記載の結晶。
71. 【請求項７１】 硫酸化オリゴサッカライドが，硫酸化ジサッカライド，ヘ
    キササッカライド，オクタサッカライド，デカサッカライド，またはドデカサッ
    カライドである，請求項７０記載の結晶。
72. 【請求項７２】 硫酸化オリゴサッカライドが硫酸化ムコオリゴサッカライ
    ドである，請求項７０記載の結晶。
73. 【請求項７３】 硫酸化ムコオリゴサッカライドがヘパリンである，請求項
    ７２記載の結晶。
74. 【請求項７４】 ＦＧＦ：ＦＧＦＲ：ヘパリン三成分複合体を含む，請求項
    ７０記載の結晶。
75. 【請求項７５】 ＦＧＦ：ＦＧＦＲ：ヘパリン三成分複合体が，ＦＧＦ２：
    ＦＧＦＲ１：ヘパリン三成分複合体である，請求項７４記載の結晶。
76. 【請求項７６】 レセプター蛋白質チロシンキナーゼが繊維芽細胞成長因子
    レセプターであり，リガンドが繊維芽細胞成長因子である，請求項６９記載の結
    晶。
77. 【請求項７７】 レセプター蛋白質チロシンキナーゼが繊維芽細胞成長因子
    レセプター１であり，リガンドがＦＧＦ２である，請求項７６記載の結晶。
78. 【請求項７８】 請求項１，８，６９，７０または７３に記載のポリペプチ
    ドの構造の三次元表示。
79. 【請求項７９】 コンピュータ読み出し可能な形態である，請求項７８記載
    の三次元表示。
80. 【請求項８０】 レセプター蛋白質チロシンキナーゼの細胞外ドメインを含
    むポリペプチドを含む結晶のＸ線座標データが記録されている，コンピュータ読
    み出し可能な媒体。
81. 【請求項８１】 Ｘ線座標データが表１，２，３または６に記載されている
    ものである，請求項８０記載のコンピュータ−読み出し可能な媒体。
82. 【請求項８２】 媒体が，ＲＡＭ，ＲＯＭ，磁気媒体，光学媒体，磁気光学
    媒体，フロッピーディスク，ハードディスク，ミニディスク，サーバ，ＣＤ，お
    よびＤＶＤからなる群より選択される，請求項８０記載のコンピュータ−読み出
    し可能な媒体。
83. 【請求項８３】 前記媒体が，データを使用するための指令がプログラムさ
    れている機械により読まれるときに，機械が分子相互作用を分析するための信号
    を発生することができる，請求項８０記載のコンピュータ−読み出し可能な媒体
    。
84. 【請求項８４】 信号が，ポリペプチドまたはその一部の三次元表示を描写
    しうる画像信号である，請求項８３記載のコンピュータ−読み出し可能な媒体。
85. 【請求項８５】 レセプター蛋白質チロシンキナーゼが繊維芽細胞成長因子
    レセプターであり；結晶が繊維芽細胞成長因子レセプターの細胞外ドメインに結
    合した繊維芽細胞成長因子またはその一部をさらに含み，かつ，画像信号が，繊
    維芽細胞成長因子レセプターと繊維芽細胞成長因子との間の界面を含む構造の三
    次元表示を描写することができる，請求項８３記載のコンピュータ−読み出し可
    能な媒体。
86. 【請求項８６】 繊維芽細胞成長因子および繊維芽細胞成長因子レセプター
    の少なくとも１つに結合した硫酸化ムコサッカライドをさらに含む，請求項８７
    記載のコンピュータ−読み出し可能な媒体。
87. 【請求項８７】 幹細胞因子のレセプター結合コアを含むポリペプチドを含
    む結晶のＸ線座標データが記録されている，コンピュータ−読み出し可能な媒体
    。
88. 【請求項８８】 Ｘ線座標データが表４に記載されているものである，請求
    項８７記載のコンピュータ−読み出し可能な媒体。
89. 【請求項８９】 結晶が，幹細胞因子のレセプター結合コアに結合したｃ−
    ｋｉｔまたはその一部をさらに含む，請求項８７記載のコンピュータ−読み出し
    可能な媒体。