KR20160037173A

KR20160037173A - 치료학적 융합 단백질

Info

Publication number: KR20160037173A
Application number: KR1020167002488A
Authority: KR
Inventors: 베른트 보르만; 페르-올라 프레스크가르트; 헨드릭 뇌트겐; 옌스 니뵈너
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2013-08-02
Filing date: 2014-07-30
Publication date: 2016-04-05
Also published as: HK1216159A1; SG11201600807YA; MX2016001145A; AU2014298519A1; CA2919325A1; US20160168253A1; JP2016527260A; CL2016000219A1; EA201600141A1; ZA201600086B; PH12016500123A1; PE20160720A1; CR20160041A; BR112016001782A2; EP3027280A1; WO2015014884A1; MA38797A1; IL243353A0; CN105431203A

Abstract

본 발명은 Aβ에 대한 항체, 혈액 뇌 장벽 수용체에 결합하는 1가 결합 개체 및 네프릴리신을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다.

Description

치료학적 융합 단백질{THERAPEUTIC FUSION PROTEIN}

본 발명은 Aβ에 대한 항체, 혈액 뇌 장벽 수용체에 결합하는 1가 결합 개체(binding entity) 및 네프릴리신 모이어티(neprilysin moiety)를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다.

전체 치매 사례의 약 70%는 인지에 중요한 뇌 영역 및 신경 회로의 선택적인 손상과 관련된 알쯔하이머병에 기인한다. 알쯔하이머병은 특히 해마의 피라미드 뉴런 중의 신경섬유매듭, 및 대개 아밀로이드 침착물 및 해융합된(defused) 무리(halo)의 치밀한 코어를 함유하는 다수의 아밀로이드 플라크를 특징으로 한다.

세포외 신경염성 플라크는 "아밀로이드 β", "A-베타", "Aβ4", "β-A4" 또는 "Aβ"라 칭하는 우세한 섬유성 펩타이드를 다량으로 함유한다(문헌[Selkoe (1994), Ann. Rev. Cell Bio.10, 373-403], 문헌[Koo (1999), PNAS Vol. 96, pp. 9989-9990], 미국특허 제 4,666,829 호 또는 문헌[Glenner (1984), BBRC 12, 1131]을 참조하시오). 상기 아밀로이드는 "알쯔하이머 전구체 단백질/P-아밀로이드 전구체 단백질"(APP)로부터 유래한다. APP는 내재성 막 당단백질이며(문헌[Sisodia (1992), PNAS Vol. 89, pp. 6075]을 참조하시오) 원형질막 프로테아제, α-세크레타제에 의해 상기 AP 서열내에서 단백질내 분해에 의해 절단된다(문헌[Sisodia (1992), Joe. cit.]을 참조하시오). 더욱 또한, 추가의 세크레타제 활성, 특히 β-세크레타제 및 γ-세크레타제 활성은 39 아미노산(Aβ39), 40 아미노산(Aβ40), 42 아미노산(Aβ42) 또는 43 아미노산(Aβ43)을 포함하는 아밀로이드-β(Aβ)의 세포외 방출을 유도한다(문헌[Sinha (1999), PNAS 96, 11094-1053]; 문헌[Price (1998), Science 282, 1078 to 1083]; WO 00/72880 또는 문헌[Hardy (1997), TINS 20, 154]을 참조하시오).

Aβ는 다수의 천연 형태를 가짐에 유의하며, 이때 인간 형태를 상기 언급한 Aβ39, Aβ40, Aβ41, Aβ42 및 Aβ43으로서 지칭한다. 가장 현저한 형태인 Aβ42는 아미노산 서열(N-말단으로부터 시작하여) DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(서열번호 1)를 갖는다. Aβ41, Aβ40, Aβ39에서, 각각 C-말단 아미노산 A, IA 및 VIA가 누락되어 있다. 상기 Aβ43-형태에서 추가적인 쓰레오닌 잔기가 상기 묘사된 서열(서열번호 1)의 C-말단에 포함된다.

Aβ40 피브릴의 핵형성에 필요한 시간은 Aβ42 피브릴의 핵형성에 필요한 시간보다 현저하게 더 긴 것으로 나타났다(문헌[P. T. Lansbury, Jr. and J.D. Harper (1997), Ann. Rev. Biochem. 66, 385-407]을 참조하시오). 문헌[Wagner (1999), J. Clin. Invest. 104, 1239-1332]에 재고찰된 바와 같이, 상기 Aβ42는 신경염성 플라크와 관련하여 보다 빈번히 발견되며 시험관내에서 보다 섬유원성(fibrillogenic)인 것으로 간주된다. 또한 Aβ42는 정렬된 비-결정성 Aβ 펩타이드의 핵형성-의존성 중합에서 "시드"로서 작용함이 시사되었다(문헌[Jarrett(1993), Cell 93, 1055-1058]). 변형된 APP 가공 및/또는 단백질성 침착을 함유하는 세포외 플라크의 생성은 알쯔하이머 병리학으로부터 뿐만 아니라 다른 신경학적 및/또는 신경퇴행성 질환을 앓고 있는 환자로부터 공지되어 있다. 이러한 질환은 특히 다운 증후군, 네덜란드형 아밀로이드증이 있는 유전성 뇌출혈, 파킨슨병, ALS(근위축성 측삭 경화증), 크로이펠츠 야콥병, HIV-관련된 치매 및 운동 신경병증을 포함한다.

지금까지, 아밀로이드-관련된 질병에 대해서 단지 제한된 의학적 중재안만이 개시되었다. 예를 들어, 갈란타민, 리바스티그민 또는 도네페질과 같은 콜린에스테라제 억제제가 단지 순하거나 보통인 질병을 갖는 알쯔하이머 환자들에서 이로운 것으로 논의되었다. 그러나, 이들 약물의 콜린성 작용으로 인한 부작용이 또한 보고되었다. 상기 콜린성-증대 치료가 약간의 증상성 이득을 생성시키는 반면, 치료 환자 대부분은 치료 반응이 만족스럽지 못하다. 상당한 인지 개선은 치료 환자의 단지 약 5%에서만 발생하는 것으로 추정되었으며, 치료가 상기 진행성 질병의 과정을 현저하게 변경시킨다는 증거는 거의 없다.

결과적으로, 보다 유효한 치료 및 특히 상기 질병의 진행을 정지시키거나 지연시킬 수 있는 치료에 대한 임상적 필요성이 여전히 엄청나다. 또한, 보다 최근에는 메만틴과 같은 NMDA-수용체 길항물질들이 사용되었다.

그러나, 약물학적 활성으로 인한 부작용들이 또한 보고되었다. 더욱이, 상기 NMDA-수용체 길항물질에 의한 상기와 같은 치료는 단지 증상적 접근법으로서 간주될 수 있을 뿐이며 질병-개질 접근법은 아니다.

또한, 아밀로이드-관련된 질환의 치료를 위한 면역조절성 접근법이 제안되었다. WO 99/27944는 Aβ 펩타이드 부분 및 담체 분자를 포함하는 접합체를 개시하며, 이때 상기 담체 분자는 면역 반응을 증대시킬 것이다. 또 다른 능동 면역화 접근법이 WO 00/172880에 언급되어 있는데, 여기에서 또한 Aβ 단편을 사용하여 면역 반응을 유도한다.

또한 일반적인 항-Aβ 항체에 의한 수동 면역화 접근법이 WO 99/27944 또는 WO 01/62801에 제안되었으며 Aβ 부분에 대한 특이적인 인간화된 항체들이 WO 02/46237, WO 02/088306 및 WO 02/088307에 개시되었다. WO 00/177178은 가수분해 중 β-아밀로이드에 의해 채용된 항체 결합 전이 상태를 개시한다. WO 03/070760은 상기 Aβ 펩타이드상의 2개의 불연속 아미노산 서열을 인식하는 항체 분자를 개시한다.

본 발명에 근원적인 기술적 문제는 아밀로이드 질환의 의학적 관리에 유효한 수단 및 방법, 특히 의학적 중재가 필요한 환자들에서 유해 아밀로이드 플라크의 감소를 위한 수단 및 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 ELISA에 의한 시험관내 Aβ1-40 섬유에 대한 mAb31 및 삼작용성 폴리펩타이드 TriGant의 결합을 도시한다. 대조용 항체는 마우스 트랜스페린 수용체 항체(마우스 TfR)이다.
도 2는 FACS 분석에 의한 시험관내 쥐 트랜스페린 수용체에 대한 mAb31 및 삼작용성 폴리펩타이드 TriGant의 결합을 도시한다.
도 3은 시험관내 네프릴리신[알앤디 시스템스(R&D Systems), 카탈로그 번호 1182-ZNC] 및 삼작용성 폴리펩타이드의 효소 활성을 도시한다.
도 4는 알쯔하이머병 환자의 뇌 절편으로부터의 고유의 인간 β-아밀로이드 플라크에 결합된 mAb31 및 삼작용성 폴리펩타이드 TriGant의 면역조직화학적 염색을 도시한다.
도 5는 알쯔하이머병의 마우스 모델에서 mAb31 및 삼작용성 폴리펩타이드 TriGant에 의한 생체내 β-아밀로이드 플라크 장식을 도시한다. GAH555 = 알렉사(Alexa)555 염료[몰레큘라 프로브스(Molecular Probes)]에 접합된 염소 항-인간 IgG(H+L). BAP-2 = 알렉사 488에 접합된 Aβ에 대한 마우스 단클론 항체.

첫 번째 태양에서, 본 발명은 Aβ에 대한 항체, 혈액 뇌 장벽 수용체에 결합하는 1가 결합 개체 및 네프릴리신 모이어티를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.

본 발명의 특정한 실시태양에서, 상기 혈액 뇌 수용체는 트랜스페린 수용체, 인슐린 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 수용체, 저밀도 지단백질 수용체-관련된 단백질 8, 저밀도 지단백질 수용체-관련된 단백질 1 및 헤파린-결합 표피 성장 인자-유사 성장 인자로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명의 특정한 실시태양에서, 상기 융합 단백질의 1가 결합 개체는 혈액 뇌 장벽 리간드 또는 1가 항체 단편이고, 바람직하게는 scFv, Fv, scFab, Fab 및 VHH로부터 선택된다.

본 발명의 특정한 실시태양에서, 상기 융합 단백질은

- 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 Aβ에 대한 항체;

- 제 1 링커에 의해 Aβ에 대한 항체의 제 1 중쇄의 C-말단 부분에 커플링된, 혈액 뇌 장벽 수용체에 결합하는 1가 결합 개체; 및

- 제 2 링커에 의해 Aβ에 대한 항체의 제 2 중쇄의 C-말단 부분에 커플링된 네프릴리신 모이어티

를 포함한다.

본 발명의 특정한 실시태양에서, 상기 융합 단백질은

- 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 Aβ에 대한 항체;

- 제 1 링커에 의해 Aβ에 대한 항체의 제 1 중쇄의 Fc 부분의 C-말단 단부에 커플링된, 혈액 뇌 장벽 수용체에 결합하는 1가 결합 개체; 및

- 제 2 링커에 의해 Aβ에 대한 항체의 제 2 중쇄의 Fc 부분의 C-말단 단부에 커플링된 네프릴리신 모이어티

를 포함한다.

본 발명의 특정한 실시태양에서, 상기 융합 단백질의 제 1 및 제 2 링커는 펩타이드 또는 화학적 링커이다.

본 발명의 특정한 실시태양에서, 상기 융합 단백질의 1가 결합 개체는 트랜스페린 수용체에 대한 scFab이다.

본 발명의 특정한 실시태양에서, Aβ에 대한 융합 단백질의 항체는 (a) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1, (b) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR2, (c) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR3, (d) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 L-CDR1, (e) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 L-CDR2, 및 (f) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 L-CDR3을 포함한다.

본 발명의 특정한 실시태양에서, Aβ에 대한 융합 단백질의 항체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 V_H 도메인 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 V_L 도메인을 포함한다.

본 발명의 특정한 실시태양에서, Aβ에 대한 융합 단백질의 항체의 제 1 중쇄는 제 1 이량체화 모듈을 포함하고 Aβ에 대한 융합 단백질의 항체의 제 2 중쇄는 제 2 이량체화 모듈을 포함하여, 상기 두 중쇄의 이종이량체화를 허용한다.

본 발명의 특정한 실시태양에서, 노브-인투-홀(knob-into-hole) 전략에 따라 Aβ에 대한 융합 단백질의 항체의 제 1 중쇄의 제 1 이량체화 모듈은 노브를 포함하고 Aβ에 대한 융합 단백질의 항체의 제 2 중쇄의 제 2 이량체화 모듈은 홀을 포함한다.

본 발명의 특정한 실시태양에서, 상기 융합 단백질은 혈액 뇌 장벽 수용체에 결합하는 1가 결합 개체의 하나의 단일 단위의 개체를 특징으로 하며, 바람직하게 상기 융합 단백질은 트랜스페린 수용체에 대한 하나의 단일 scFab의 존재를 특징으로 한다.

본 발명의 특정한 실시태양에서, 상기 융합 단백질은

- 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 Aβ에 대한 항체;

- 제 1 링커에 의해 Aβ에 대한 항체의 제 1 중쇄의 Fc 부분의 C-말단 단부에 커플링된, 혈액 뇌 장벽 수용체에 결합하는 단일 단위의 1가 결합 개체, 바람직하게는 트랜스페린 수용체에 대한 단일 단위의 scFab; 및

- 제 2 링커에 의해 Aβ에 대한 항체의 제 2 중쇄의 Fc 부분의 C-말단 단부에 커플링된 단일 단위의 네프릴리신 모이어티

를 포함한다.

본 발명의 특정한 실시태양에서, 상기 네프릴리신 모이어티는 인간 네프릴리신(서열번호 2)으로부터 유래하고, 보다 특히 상기 네프릴리신 모이어티는 인간 네프릴리신의 아미노산 52 내지 750, 즉 서열번호 2의 아미노산 52 내지 750을 포함한다.

두 번째 태양에서, 본 발명은 본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 단리된 핵산에 관한 것이다.

세 번째 태양에서, 본 발명은 본 발명의 단리된 핵산을 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.

네 번째 태양에서, 본 발명은 본 발명의 융합 단백질 및 약학 담체를 포함하는 약학 제형에 관한 것이다.

본 발명의 융합 단백질을 약제로서, 특히 아밀로이드 질환의 치료, 특히 알쯔하이머병의 치료를 위한 약제로서 사용할 수 있다.

정의

노브-인투-홀 이량체화 모듈 및 항체 공학에서 그의 용도는 문헌[Carter P.;　Ridgway J.B.B.;　Presta L.G.: Immunotechnology, Volume 2,　Number 1, February 1996 , pp. 73-73(1)]에 개시되어 있다.

"혈액-뇌 장벽" 또는 "BBB"는, 뇌 모세관 내피 원형질막 내에서 밀착 연접에 의해 형성되어 상기 뇌로의 분자, 심지어 매우 작은 분자, 예를 들어 유레아(60 달톤)의 수송을 제한하는 단단한 장벽을 생성시키는, 말초 순환과 뇌 및 척수간의 생리학적 장벽을 지칭한다. 뇌 내의 BBB, 척수 내의 혈액-척수 장벽, 및 망막 내의 혈액-망막 장벽은 CNS 내의 연속된 모세관 장벽이며, 이들을 본 발명에서 집합적으로 혈액-뇌 장벽 또는 BBB라 칭한다. 상기 BBB는 또한 상기 장벽이 모세관 내피 세포보다는 상의세포로 구성된 혈액-CSF 장벽(맥락총)을 포함한다.

"Aβ에 대한 항체"란 용어는 항체가 Aβ 펩타이드의 표적화에 진단제 및/또는 치료제로서 유용하기에 충분한 친화성으로 Aβ 펩타이드와 결합할 수 있는 항체를 지칭한다.

Aβ가 다수의 천연 형태를 가짐에 유의하며, 이때 상기 인간 형태는 상기 언급된 Aβ39, Aβ40, Aβ41, Aβ42 및 Aβ43이라 지칭된다. 가장 우세한 형태인 Aβ42는 아미노산 서열(N-말단으로부터 시작하여) DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(서열번호 1)를 갖는다. Aβ41, Aβ40, Aβ39에서, 각각 C-말단 아미노산 A, IA 및 VIA가 누락되어 있다. 상기 Aβ43-형태에서 추가적인 쓰레오닌 잔기가 상기 묘사된 서열(서열번호 1)의 C-말단에 포함된다.

"중추 신경계" 또는 "CNS"는 신체 기능을 조절하고, 뇌 및 척수를 포함하는 신경 조직의 복합체를 지칭한다.

"혈액-뇌 장벽에서의 수용체"(본 발명에서 "R/BBB"라 약기한다)는 뇌 내피세포상에서 발현되는 세포외 막-결합된 수용체 단백질이며 상기 BBB를 가로질러 분자를 수송하거나 외부 투여된 분자를 수송하는데 사용될 수 있다. 본 발명에서 R/BBB의 예는 트랜스페린 수용체(TfR), 인슐린 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 수용체(IGF-R), 저밀도 지단백질 수용체, 예를 들어 비제한적으로 저밀도 지단백질 수용체-관련된 단백질 1(LRP1) 및 저밀도 지단백질 수용체-관련된 단백질 8(LRP8), 및 헤파린-결합 표피 성장 인자-유사 성장 인자(HB-EGF)를 포함한다. 본 발명에서 예시적인 R/BBB는 트랜스페린 수용체(TfR)이다.

"효과기 개체"는 상기 BBB를 가로질러 뇌로 수송되는 분자를 지칭한다. 상기 효과기 개체는 전형적으로 상기 뇌로 전달하고자 하는 특징적인 치료 활성을 갖는다. 효과기 개체는 신경질환 약물 및 세포독성제, 예를 들어 펩타이드, 단백질 및 항체, 특히 단클론 항체를 포함한다.

"1가 결합 개체"는 R/BBB에 특이적으로 및 1가 결합 방식으로 결합할 수 있는 분자를 지칭한다. 상기 1가 결합 개체는, 예를 들어 IgG의 일부, 예를 들어 단일 scFab 단편일 수 있다. 상기 1가 결합 개체는, 예를 들어 파지 디스플레이 또는 면역화와 같은 최첨단 기술을 사용하여 가공된 스캐폴드 단백질일 수 있다. 상기 1가 결합 개체는 또한 펩타이드일 수 있다.

"1가 결합 방식"은 상기 1가 결합 개체와 상기 R/BBB 간의 상호작용이 하나의 단일 에피토프를 통해 발생하는 상기 R/BBB에 대한 특이적인 결합을 지칭한다. 상기 1가 결합 방식은 단일의 에피토프 상호작용점으로 인해 상기 R/BBB의 임의의 이량체화/다량체화를 방지한다. 상기 1가 결합 방식은 상기 R/BBB의 세포내 분류가 변하는 것을 방지한다.

"트랜스페린 수용체"("TfR")는 척추동물에서 철 흡수에 관련된 2개의 다이설파이드-결합된 서브유닛(각각 약 90,000의 겉보기 분자량을 갖는다)으로 구성된 막관통 당단백질(약 180,000의 분자량을 갖는다)이다. 하나의 실시태양에서, 상기 TfR은 본 발명에서, 예를 들어 문헌[Schneider et al. Nature 311:675-678(1984)]에서와 같은 아미노산 서열을 포함하는 인간 TfR이다.

본 발명에서 "항체"란 용어는 가장 넓은 의미로 사용되며 구체적으로 단클론 항체, 다클론 항체, 적어도 2개의 완전 항체로부터 형성된 다중특이성 항체(예를 들어, 이중특이성 항체), 및 항체 단편(상기 단편이 목적하는 생물 활성을 나타내는 한)을 포함한다.

본 발명에서 "항체 단편"은 항원에 결합하는 능력을 유지하는 완전 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')₂ 및 Fv 단편; 다이아바디; 선형 항체; 단쇄 항체 분자, 예를 들어 scFv 및 scFab; 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이성 항체를 포함한다.

본 발명에 사용되는 바와 같은 "단클론 항체"란 용어는 실질적으로 동종인 항체들의 집단으로부터 획득되는 항체를 지칭하고, 즉 상기 집단을 포함하는 개별적인 항체들은 동일하고/하거나, 상기 단클론 항체의 생산 중 발생할 수 있는 가능한 변이체(상기와 같은 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다)를 제외하고 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체 제제와 대조적으로, 각각의 단클론 항체는 상기 항원상의 단일 결정인자에 대한 것이다. 상기 단클론 항체는 그의 특이성 외에, 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에서 유리하다. "단클론"이라는 수식어구는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 획득된다는 항체의 특징을 가리키며, 임의의 특정한 방법에 의한 상기 항체의 생산을 필요로 하는 것으로서 해석해서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단클론 항체는 문헌[Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 개시된 하이브리도마 방법에 의해 제조되거나, 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국특허 제 4,816,567 호를 참조하시오)에 의해 제조될 수 있다. 상기 "단클론 항체"를 또한, 예를 들어 문헌[Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)] 및 문헌[Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에 개시된 기법을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리시킬 수 있다. 본 발명에서 단클론 항체의 구체적인 예는 항원-결합 단편들을 포함하여, 키메릭 항체, 인간화된 항체, 및 인간 항체를 포함한다. 본 발명에서 단클론 항체는 구체적으로, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정한 종으로부터 유래하거나 특정한 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체 중의 상응하는 서열과 일치하거나 상기 서열에 상동성이지만, 상기 쇄의 나머지는 또 다른 종으로부터 유래하거나 또 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체뿐만 아니라 상기와 같은 항체의 단편(상기 단편이 목적하는 생물 활성을 나타내는 한) 중의 상응하는 서열과 일치하거나 상기 서열에 상동성인 "키메릭" 항체(면역글로불린)를 포함한다(미국특허 제 4,816,567 호; 문헌[Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 :6851-6855 (1984)]). 본 발명에서 관심 키메릭 항체는 비-인간 영장류(예를 들어, 긴꼬리 원숭이, 예를 들어 개코 원숭이, 붉은털 원숭이 또는 키노몰구스 원숭이)로부터 유래된 가변 도메인 항원-결합 서열 및 인간 불변 영역 서열(미국특허 제 5,693,780 호)을 포함하는 "영장류화된(primatized)" 항체를 포함한다.

비-인간(예를 들어, 쥐) 항체의 "인간화된" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메릭 항체이다. 대개, 인간화된 항체는 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 비-인간 종(공여자 항체), 예를 들어 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류의 초가변 영역으로부터의 잔기에 의해 치환된 인간 면역글로불린(수용자 항체)이다. 일부의 경우에, 상기 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 치환된다. 더욱 또한, 인간화된 항체는 상기 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 더욱 세밀히 구분하기 위해서 이루어진다. 일반적으로, 상기 인간화된 항체는 적어도 하나, 및 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 전부 포함할 것이며, 여기에서 상기 초가변 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 비-인간 면역글로불린의 영역에 상응하고 상기 FR의 전부 또는 실질적으로 전부는, 상기 나타낸 바와 같은 FR 치환을 제외하고, 인간 면역글로불린 서열의 영역들이다. 상기 인간화된 항체는 또한 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 영역을 포함할 것이다. 추가의 상세한 내용에 대해서, 문헌[Jones et al, Nature 321 :522-525 (1986)]; 문헌[Riechmann et al, Nature 332:323-329 (1988)]; 및 문헌[Presta, Curr. Op. Struct. Biol 2:593-596 (1992)]을 참조하시오.

본 발명에서 "인간 항체"는 인간 B-세포로부터 획득할 수 있는 항체의 아미노산 서열 구조와 상응하고 인간 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 아미노산 서열 구조를 포함하는 것이다. 상기와 같은 항체들을 다양한 기법, 예를 들어 비제한적으로, 면역시 내인성 면역글로불린 생산의 부재하에서 인간 항체를 생산할 수 있는 유전자이식 동물(예를 들어, 마우스)에 의한 생산(예를 들어, 문헌[Jakobovits et al, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)]; 문헌[Jakobovits et al, Nature, 362:255-258 (1993)]; 문헌[Bruggermann et al, Year in Immuno., 7:33 (1993)]; 및 미국특허 제 5,591,669 호, 미국특허 제 5,589,369 호 및 미국특허 제 5,545,807 호를 참조하시오); 인간 항체 또는 인간 항체 단편을 발현하는 파지 디스플레이 라이브러리로부터의 선택(예를 들어, 문헌[McCafferty et al, Nature 348:552-553 (1990)]; 문헌[Johnson et al, Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)]; 문헌[Clackson et al, Nature, 352:624-628 (1991)]; 문헌[Marks et al, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)]; 문헌[Griffith et al, EMBO J. 12:725-734 (1993)]; 미국특허 제 5,565,332 호 및 미국특허 제 5,573,905 호를 참조하시오); 시험관내 활성화된 B 세포를 통한 생성(미국특허 제 5,567,610 호 및 미국특허 제 5,229,275 호를 참조하시오); 및 인간 항체 생산 하이브리도마로부터의 단리에 의해 동정하거나 제조할 수 있다.

본 발명에서 "다중특이성 항체"는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성들을 갖는 항체이다. 예시적인 다중특이성 항체는 R/BBB 및 뇌 항원 모두와 결합할 수 있다. 다중특이성 항체를 전장 항체 또는 항체 단편(예를 들어, F(ab')₂ 이중특이성 항체)으로서 제조할 수 있다. 2, 3 또는 그 이상(예를 들어, 4)의 기능성 항원 결합 부위를 갖는 가공된 항체가 또한 고려된다(예를 들어, 미국특허출원공개 제 2002/0004587 A1 호, 밀러(Miller) 등). 다중특이성 항체를 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조할 수 있다.

본 발명에서 항체는 변경된 항원-결합 또는 생물 활성을 갖는 "아미노산 서열 변이체"를 포함한다. 상기와 같은 아미노산 변경의 예는 항원에 대해 증대된 친화성을 갖는 항체(예를 들어, "친화성 성숙한" 항체), 및 변경된 Fc 영역(존재하는 경우), 예를 들어 변경된(증가되거나 감소된) 항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC)(예를 들어, WO 00/42072, 프레스타 엘(Presta, L.) 및 WO 99/51642, 이두오소기(Iduosogie) 등을 참조하시오); 및/또는 증가되거나 감소된 혈청 반감기(예를 들어, WO 00/42072, 프레스타 엘을 참조하시오)를 갖는 항체를 포함한다.

본 발명에 사용되는 바와 같은 "가변 도메인"(경쇄의 가변 도메인(V_L), 중쇄의 가변 도메인(V_H))은 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관련된 각각의 경쇄 및 중쇄 도메인의 쌍을 나타낸다. 상기 가변 경쇄 및 중쇄 도메인은 동일한 일반적인 구조를 가지며 각각의 도메인은, 서열이 광범위하게 보존되고 3개의 "초가변 영역"(또는 상보성 결정 영역, CDR)에 의해 연결된 4개의 프레임워크(FR) 영역을 포함한다. 상기 프레임워크 영역은 β-시트 배치를 채용하고 상기 CDR은 상기 β-시트 구조를 연결하는 고리(loop)를 형성할 수 있다. 각 쇄 중 CDR은 상기 프레임워크 영역에 의해 그의 3-차원 구조를 유지하며 다른 쇄로부터의 CDR과 함께 항원 결합 부위를 형성한다. 상기 항체의 중쇄 및 경쇄 CDR3 영역은 본 발명에 따른 항체의 결합 특이성/친화성에서 특히 중요한 역할을 하며, 따라서 본 발명의 추가의 목적을 제공한다.

"항체의 항원-결합 부분"이란 용어는 본 발명에서 사용될 때 항원-결합을 맡고 있는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 항체의 항원-결합 부분은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 영역은 본 발명에 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 영역들이다. 따라서, 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인은 N-에서부터 C-말단으로 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 특히, 중쇄의 CDR3은 항원 결합에 가장 기여하고 항체의 성질을 한정하는 영역이다. CDR 및 FR 영역은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]의 표준 정의에 따라 결정되고/되거나 "초가변 고리"로부터의 잔기들이다.

본 발명의 항체는 Fc 영역에 부착된 임의의 탄수화물(존재하는 경우)이 변경되도록 하는 "글리코실화 변이체"일 수 있다. 예를 들어, 상기 항체의 Fc 영역에 부착된 퓨코스가 없는 성숙한 탄수화물 구조를 갖는 항체가 미국특허출원공개 제 2003/0157108 호(프레스타 엘)에 개시되어 있다. 또한, 미국특허출원공개 제 2004/0093621 호(쿄와 하코 코교 캄파니 리미티드(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd))를 참조하시오. 상기 항체의 Fc 영역에 부착된 탄수화물 중에 등분된 N-아세틸글루코스아민(GlcNAc)을 갖는 항체가 WO 2003/011878(장 메레(Jean-Mairet) 등) 및 미국특허 제 6,602,684 호(우마나(Umana) 등)에 언급되어 있다. 상기 항체의 Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드 중의 적어도 하나의 갈락토스 잔기를 갖는 항체가 WO 1997/30087(파텔(Patel) 등)에 보고되어 있다. 또한, Fc 영역에 부착된 변경된 탄수화물을 갖는 항체에 관한 WO 1998/58964(라주 에스(Raju S.)) 및 WO 1999/22764(라주 에스)를 참조하시오. 또한, 변형된 글리코실화를 갖는 항체를 개시하는 미국특허출원공개 제 2005/0123546 호(우마나 등)를 참조하시오. "초가변 영역"이란 용어는 본 발명에서 사용될 때 항원 결합을 맡고 있는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 상기 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기(예를 들어, 경쇄 가변 도메인 중의 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3) 및 중쇄 가변 도메인 중의 31-35(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3); 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]) 및/또는 "초가변 고리"로부터의 상기 잔기(예를 들어, 경쇄 가변 도메인 중의 잔기 26-32(L1), 50-52(L2) 및 91-96(L3) 및 중쇄 가변 도메인 중의 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3); 문헌[Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901- 917 (1987)])를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본 발명에 정의된 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 상기 가변 도메인 잔기들이다.

"전장 항체"는 항원-결합 가변 영역뿐만 아니라 경쇄 불변 도메인(CL) 및 중쇄 불변 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 것이다. 상기 불변 도메인은 고유의 서열 불변 도메인(예를 들어, 인간 고유 서열 불변 도메인) 또는 그의 아미노산 서열 변이체일 수 있다.

항체 "효과기 기능"은 항체의 Fc 영역(고유 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변형 Fc 영역)에 기여할 수 있는 생물 활성들을 지칭한다. 항체 효과기 기능의 예는 Clq 결합, 보체 의존성 세포독성(CDC), Fc 수용체 결합, 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC) 등을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명에서 항체는 효과기 기능이 필수적으로 없다.

중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 전장 항체를 상이한 "부류"들로 할당할 수 있다. 전장 항체의 5개의 주요 부류, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하며, 이들 중 다수를 "하위부류"(이소타입), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 추가로 분할할 수 있다. 항체의 상이한 부류들에 상응하는 중쇄 불변 도메인을 각각 알파, 델타, 입실론, 감마 및 뮤라 칭한다. 면역글로불린의 상이한 부류의 서브유닛 구조 및 3-차원 배열은 충분히 공지되어 있다. 본 발명에 사용되는 바와 같은 "재조합 항체"란 용어는 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 숙주 세포에 의해 발현되는 항체(예를 들어, 키메릭, 인간화된, 또는 인간 항체 또는 그의 항원-결합 단편)를 지칭한다. 재조합 항체의 생산을 위한 "숙주 세포"의 예는 (1) 포유동물 세포, 예를 들어 중국 햄스터 난소(CHO), COS, 골수종 세포(Y0 및 NSO 세포 포함), 아기 햄스터 신장(BHK), Hela 및 Vero 세포; (2) 곤충 세포, 예를 들어 sf9, sf21 및 Tn5; (3) 식물 세포, 예를 들어 니코티아나 속(예를 들어, 니코티아나 타바쿰)에 속하는 식물; (4) 효모 세포, 예를 들어 사카로마이세스 속(예를 들어, 사카로마이세스 세레비지아에) 또는 아스퍼질러스 속(예를 들어, 아스퍼질러스 니거)에 속하는 것들; (5) 세균 세포, 예를 들어 에스케리키아 콜라이 세포 또는 바실러스 서브틸리스 세포 등을 포함한다.

본 발명에 사용되는 바와 같이, "특이적으로 결합하는" 또는 "에 특이적으로 결합한다"는 항원에 선택적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체를 지칭한다. 상기 결합 친화성을 일반적으로는 표준 분석, 예를 들어 ELISA 또는 표면 플라스몬 공명 기법[예를 들어, 바이아코어(BIACORE)(등록상표)]을 사용하여 측정한다.

기준 항체로서 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 경쟁 분석에서 상기 기준 항체의 그의 항원에의 결합을 50% 이상까지 차단하는 항체를 지칭하고, 환언하면 상기 기준 항체는 경쟁 분석에서 상기 항체의 그의 항원에 대한 결합을 50% 이상까지 차단한다.

본 발명에서 "Fc 영역"이란 용어는 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 한정하는데 사용된다. 상기 용어는 고유 서열 Fc 영역 및 변형 Fc 영역을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226으로부터 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카복시-말단까지 연장된다. 그러나, 상기 Fc 영역의 C-말단 리신(Lys447)은 존재할 수도, 또는 존재하지 않을 수도 있다. 본 발명에서 달리 명시하지 않는 한, 상기 Fc 영역 또는 불변 영역 중의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 개시된 바와 같은 EU 넘버링 시스템(또한 EU 지수라 칭한다)에 따른다.

"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역(HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인, 즉 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 이루어진다. 상응하게, 상기 HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL) 중에 하기의 서열로 존재한다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

본 발명에 사용되는 바와 같은 "링커"는 상기 효과기 개체를 상기 1가 결합 개체에 공유적으로 또는 비-공유적으로 연결하는 구조이다. 몇몇 실시태양에서, 링커는 펩타이드이다. 다른 실시태양에서, 링커는 화학적 링커이다.

"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 것이다. 일부 실시태양에서, 항체를, 예를 들어 전기영동(예를 들어, SDS-PAGE, 등전점 전기영동(IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정되는 바와 같이 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제시킨다. 항체 순도의 평가 방법에 대한 재고찰을 위해서, 예를 들어 문헌[Flatman et al, J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)]을 참조하시오.

"약학 제형"이란 용어는, 상기 제형 중에 함유된 활성 성분의 생물 활성을 유효하게 하는 바와 같은 형태로 존재하고 상기 제형이 투여되는 환자에게 허용될 수 없게 독성인 추가의 성분들을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.

"약학적으로 허용되는 담체"는 환자에게 무독성인, 활성 성분 이외의 약학 제형 중의 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용되는 담체는 비제한적으로 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함한다.

본 발명에 사용되는 바와 같이, "치료"(및 그의 문법적 변형, 예를 들어 "치료하다" 또는 "치료하는")는 치료되는 개인의 자연 과정을 변경시키고자 하는 임상적 중재를 지칭하며, 예방학적으로 또는 임상 병리학의 과정 동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 비제한적으로 질병의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 경감, 질병의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이의 예방, 질병 진행 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 완화, 및 진정 또는 개선된 예후를 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 항체를 사용하여 질병의 발생을 지연시키거나 질병의 진행을 늦춘다.

약학 제형

본 발명에 따라 사용되는 융합 단백질의 치료학적 제형을 임의의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제(문헌[Remington 's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 혼합하여, 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 보관을 위해 제조한다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며, 완충제, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 산화방지제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제(예를 들어, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라진, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 모노사카라이드, 다이사카라이드; 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이트제, 예를 들어 EDTA; 당, 예를 들어 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-형성 대이온, 예를 들어 나트륨; 금속 착체(예를 들어, Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어 트윈(TWEEN)(상표), 플루로닉스(PLURONICS)(상표) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.

본 발명에서 상기 제형은 또한 필요한 경우 하나보다 많은 활성 화합물, 임의로 서로 불리한 영향을 미치지 않는 보완 활성을 갖는 것들을 함유할 수 있다. 상기와 같은 약제의 유형 및 유효량은, 예를 들어 상기 제형 중에 존재하는 융합 단백질의 양, 및 환자의 임상적 매개변수에 따라 변한다. 예시적인 상기와 같은 약제는 하기에서 논의된다.

상기 활성 성분을 또한, 예를 들어 코아세르베이션 기법에 의해서 또는 계면 중합에 의해서 제조된 미세캡슐, 예를 들어 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미세캡슐 및 폴리-(메틸메트아크릴레이트) 미세캡슐 중에, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 미소구, 미세유화액, 나노입자 및 나노캡슐) 중에 또는 마크로유화액 중에 포착시킬 수 있다. 상기와 같은 기법은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.

서방성 제제를 제조할 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반-투과성 매트릭스를 포함하며, 상기 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 미세캡슐의 형태이다. 서방성 매트릭스의 예는 폴리에스터, 하이드로젤(예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메트아크릴레이트), 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락타이드(미국특허 제 3,773,919 호), L-글루탐산 및 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 루프론 데포(LUPRON DEPOT)(상표)(락트산-글리콜산 공중합체 및 류프로리드 아세테이트로 구성된 주사성 미소구), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다.

생체내 투여에 사용되는 제형은 멸균성이어야 한다. 이는 멸균 여과 멤브레인을 통한 여과에 의해 쉽게 수행된다. 하나의 실시태양에서, 상기 제형은 등장성이다.

하나의 태양에서, 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 융합 단백질을 제공한다. 추가의 태양에서, 신경학적 질병 또는 질환, 예를 들어 아밀로이드 질환, 특히 알쯔하이머병의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 융합 단백질을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명의 융합 단백질을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명은 신경학적 질병 또는 질환이 있는 개인에게 유효량의 본 발명의 융합 단백질을 투여함을 포함하는, 상기 개인의 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명의 융합 단백질을 제공한다. 상기 실시태양들 중 임의의 실시태양에 따른 "개인"은 임의로 인간이다.

본 발명의 융합 단백질을 치료법에서 단독으로 또는 다른 작용제들과 함께 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 융합 단백질을 적어도 하나의 추가적인 치료제와 함께 투여할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 추가적인 치료제는 본 발명의 융합 단백질이 치료에 사용되는 바와 동일하거나 상이한 신경학적 질환의 치료에 유효한 치료제이다. 예시적인 추가적인 치료제는 비제한적으로, 상술한 다양한 신경학적 약물, 콜린에스테라제 억제제(예를 들어, 도네페질, 갈란타민, 로바스티그민, 및 타크린), NMDA 수용체 길항물질(예를 들어, 메만틴), 아밀로이드 베타 펩타이드 응집 억제제, 산화방지제, γ-세크레타제 조절제, 신경 성장 인자(NGF) 모방물질 또는 NGF 유전자 요법, PPARy 작용물질, HMS-CoA 리덕타제 억제제(스타틴), 암파킨, 칼슘 채널 차단제, GABA 수용체 길항물질, 글리코겐 신타제 키나제 억제제, 정맥내 면역글로불린, 무스카린 수용체 작용물질, 니코틴 수용체 조절제, 능동 또는 수동 아밀로이드 베타 펩타이드 면역화, 포스포다이에스테라제 억제제, 세로토닌 수용체 길항물질 및 항-아밀로이드 베타 펩타이드 항체를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 적어도 하나의 추가적인 치료제는 상기 신경학적 약물의 하나 이상의 부작용을 경감시키는 능력을 이유로 선택된다.

상기에 나타낸 상기와 같은 복합 요법은 병행 투여(2개 이상의 치료제가 동일하거나 상이한 제형 중에 포함된다), 및 별도 투여(이 경우에 본 발명의 융합 구조물의 투여는 상기 추가적인 치료제 및/또는 보조제의 투여 전, 투여와 동시에, 및/또는 투여에 이어서 발생할 수 있다)를 포함한다. 본 발명의 융합 단백질을 또한 다른 중재 요법들, 예를 들어 비제한적으로 방사선 요법, 행동 요법, 또는 당해 분야에 공지되고 치료 또는 예방하고자 하는 신경학적 질환에 적합한 다른 요법들과 함께 사용할 수 있다. 본 발명의 R/BBB에 대한 1가 결합 개체(및 임의의 추가적인 치료제)를 임의의 적합한 수단, 예를 들어 비경구, 폐내 및 비내, 및 국소 치료를 목적하는 경우, 병변내 투여에 의해 투여할 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다.

투여는 부분적으로 상기 투여가 단시간인지 또는 만성적인지에 따라, 임의의 적합한 경로, 예를 들어 주사, 예를 들어 정맥내 또는 피하 주사에 의할 수 있다. 다양한 투여 스케줄, 예를 들어 비제한적으로 다양한 시점들에 걸친 1가 또는 다중 투여, 일시 투여, 및 펄스 주입이 본 발명에서 고려된다.

BBB를 가로지르는 상기 융합 구조물 또는 화합물의 지질-기재 수송 방법은 비제한적으로 상기 융합 구조물 또는 화합물을, 상기 BBB의 혈관 내피상의 수용체들에 결합하는 1가 결합 개체에 커플링되는 리포솜 중에 캡슐화하고(예를 들어, 미국특허출원공개 제 2002/0025313 호를 참조하시오), 상기 1가 결합 개체를 저-밀도 지단백질 입자(예를 들어, 미국특허출원공개 제 2004/0204354 호를 참조하시오) 또는 아포지단백질 E(예를 들어, 미국특허출원공개 제 2004/0131692 호를 참조하시오) 중에 코팅시킴을 포함한다.

질병의 예방 또는 치료를 위해서, 본 발명의 융합 단백질의 적합한 투여량(단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가적인 치료제와 함께 사용될 때)은 치료되는 질병의 유형, 융합 구조물의 유형, 상기 질병의 중증도 및 과정, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 상기 융합 구조물에 대한 반응, 및 주치의의 판단에 따를 것이다. 상기 융합 단백질을 적합하게는 환자에게 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 투여한다. 상기 질병의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 ㎍/㎏ 내지 15 ㎎/㎏(예를 들어, 0.1 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏)의 융합 구조물이, 예를 들어 하나 이상의 별도 투여에 의해서인지 또는 연속 주입에 의해서인지에 따라, 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 하나의 전형적인 1일 투여량 범위는 상기 언급한 인자들에 따라 약 1 ㎍/㎏ 내지 100 ㎎/㎏ 또는 그 이상일 수 있다. 수일 또는 그 이상에 걸친 반복된 투여의 경우, 상기 조건에 따라, 질병 증상의 목적하는 억제가 발생할 때까지 상기 치료가 일반적으로 지속될 것이다. 상기 항체의 하나의 예시적인 투여량은 약 0.05 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏의 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 ㎎/㎏, 2.0 ㎎/㎏, 4.0 ㎎/㎏ 또는 10 ㎎/㎏(또는 이들의 임의의 조합)의 하나 이상의 용량을 환자에게 투여할 수 있다. 상기와 같은 용량을 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3주마다(예를 들어, 환자가 약 2 내지 약 24회, 또는 예를 들어 약 6회 용량의 항체를 수령하도록) 투여할 수도 있다. 초기의 보다 높은 부하 용량에 이어서 1회 이상의 보다 낮은 용량을 투여할 수도 있다. 그러나, 다른 투여량 섭생이 유용할 수도 있다. 상기 요법의 진행은 통상적인 기법 및 분석에 의해 용이하게 모니터링된다.

실시예

실시예에 사용되는 융합 폴리펩타이드

실시예에서 추가로 특성화된 삼작용성 폴리펩타이드(TriGant)는 Aβ에 대한 전장 항체(MAB31), 트랜스페린 수용체에 대한 단일의 Fab 및 네프릴리신을 포함한다.

항 Aβ 항체: Mab 31 = 간테네루맵(Gantenerumab)(INN). 트랜스페린 수용체에 대한 단일 Fab(scFab): 마우스 8D3 항-트랜스페린 항체(문헌[Boado, R.J. Zhang, Y. Wang, Y and Pardridge, W.M., Biotechnology and Bioengineering (2009) 102, 1251-1258]).

실시예의 삼작용성 폴리펩타이드의 중쇄 및 가변쇄의 서열은 하기와 같다:

Mab 31 중쇄 노브 - sFab 8 D3: MAB31-IgG1-KNOB-SS_G4S-4_VL-8D3-CK_G4S-6-GG_VH-8D3-CH1(서열번호 11)

서열번호 11의 조성:

· C-말단 Lys가 없는 Mab31 인간 IgG1 중쇄

· 글리신 세린-링커

· 마우스 8D3 항-트랜스페린 항체의 가변 경쇄 도메인(VL) 변이체(L596V 및 L598I)(문헌[Boado, R.J. Zhang, Y. Wang, Y and Pardridge, W.M., Biotechnology and Bioengineering (2009) 102, 1251-1258])

· 인간 C-카파 경쇄

· 글리신 세린-링커

· 마우스 8D3 항-트랜스페린 항체의 가변 중쇄 도메인(VH)(문헌[Boado, R.J. Zhang, Y. Wang, Y and Pardridge, W.M., Biotechnology and Bioengineering (2009) 102, 1251-1258])

· 인간 IgG1 CH3 중쇄 도메인

Mab 31 중쇄 홀 - 네프릴리신 : MAB31_8D3_HC-HOLE_NEPRI(서열번호 12)

서열번호 12의 조성:

· C-말단 Lys가 없는 Mab31 인간 IgG1 중쇄

· 글리신 세린-링커

· 서열번호 2의 아미노산 52 내지 750(인간 네프릴리신)

Mab 31 경쇄 : TPIP:5170_MAB31-LC(서열번호 13)

실시예 1: ELISA 에 의해 시험관내에서 Aβ1 -40 섬유에의 결합의 측정

섬유성 Aβ에의 융합 폴리펩타이드의 결합을 ELISA 분석에 의해 측정하였다. 간단히, Aβ(1-40)를 37 ℃에서 3일 동안 맥시솝(Maxisorp) 플레이트상에 PBS 중 7 ㎍/㎖로 코팅하여 섬유성 Aβ를 생성시키고, 이어서 실온(RT)에서 3시간 동안 건조시켰다. 상기 플레이트를 실온에서 1시간 동안 PBS(차단 완충제) 중의 1% 크로테인(Crotein) C 및 0.1% RSA로 차단하고, 이어서 세척 완충제로 1회 세척하였다. 융합 폴리펩타이드 또는 대조군을 차단 완충제 중의 100 nM 이하의 농도로 가하고 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 4회의 세척 단계 후에, 구조물을 차단 완충제(1 RT) 중의 1:10,000 희석비로 항-인간-IgG-HRP(잭슨 임뮤노리써치(Jackson Immunoresearch))를 첨가한 다음 6회 세척하고 TMB(시그마) 중에서 배양하여 검출하였다. 흡광도를 1N HCl에 의한 발색 중지 후에 450 ㎚에서 판독하였다(도 1을 참조하시오).

실시예 2: 시험관내에서 쥐 트랜스페린 수용체에의 결합의 측정

쥐 트랜스페린 수용체에의 융합 폴리펩타이드의 결합을 마우스 X63.AG8-563 골수종 세포상에서 FACS 분석에 의해 시험하였다. Aβ 항체 mAb31(HEK)은 Ag8 세포에 비특이적으로 결합하는 일정한 성향을 나타내었기 때문에, 20배 과잉의 항-마우스-TfR 항체와의 공-배양에 의해 특이적인 결합을 정량분석하였다. 세포를 원심분리에 의해 수확하고, PBS로 1회 세척하고 5 x 10⁴ 세포를 얼음상에서 1.5시간 동안 100 ㎕ RPMI/10% FCS 중의 200 nM 항-마우스 TfR 항체의 첨가와 함께 또는 상기 첨가 없이 폴리펩타이드 융합물의 1.5 pM 내지 10 nM의 일련의 희석물과 배양하였다. RPMI/10% FCS에 의해 2회 세척 후, 세포를 얼음상에서 1.5시간 동안 RPMI/19% FCS 중의 1:600 희석비의 피코에리쓰린(잭슨 임뮤노리써치)에 커플링된 염소-항-인간 IgG와 함께 배양하였다. 세포를 다시 세척하고, RPMI/10% FCS 중에 재현탁하고, FACS-배열 장비(벡톤-디킨슨(Becton-Dickinson))상에서 피코에리쓰린 형광을 측정하였다(도 2를 참조하시오).

실시예 3: 시험관내에서 네프릴리신의 효소 활성의 측정(겉보기 Km )

25 ℃에서 저-부피 블랙 코스타(Costar) 384-웰 플레이트상에서 20 ㎕ 분석을 수행하였다. 160 μM 펩타이드 기질 MCA-RPPGFSAFK(Dnp)-OH(알앤디 시스템스, 카탈로그 번호 ES005)의 실행 용액을 50 mM 트리스-HCl pH 7.8, 25 mM NaCl 및 5 mM ZnCl₂ 중에서 제조하였다. 분석 완충제 중에 1 nM로 희석된, 10 ㎕의 네프릴리신(알앤디 시스템스, 카탈로그 번호 1182-ZNC) 또는 네프릴리신 융합 폴리펩타이드를 플레이트로 옮겼다. 겉보기 Km 값을 측정하기 위해서, 다양한 농도의 기질(2배 희석액 중의 0.078 내지 80 nM)을 가하고 효소 반응을 개시시켰다. 형광 증가를 엔비젼 리더(Envision Reader)상에서 320 ㎚에서의 여기 및 405 ㎚에서의 방출로 모니터링하였다. 가수분해 속도 및 겉보기 Km 값을 XLFit(등록상표) 소프트웨어(IDBS)를 사용하여 계산하였다(도 3 및 표 1을 참조하시오).

	Vmax	Km
	[1/s]	[μM]
TriGant 0001-0012	5169	3.8
네프릴리신(RnD)	2926	3.2

실시예 4: 간접 면역형광에 의한 알쯔하이머병 환자의 뇌 절편으로부터의 고유 인간 β-아밀로이드 플라크에의 융합 폴리펩타이드의 염색

융합 폴리펩타이드를 간접 면역형광을 사용하여 면역조직화학 분석에 의해 고유 인간 β-아밀로이드 플라크를 염색하는 능력에 대해 시험하였다. 진짜 인간 β-아밀로이드 플라크의 특이적이고 민감한 염색을 입증하였다. 알쯔하이머병에 대해 양성으로 진단된 환자로부터 검시 후 수득된 측두엽으로부터의 고정되지 않은 조직의 동결조직 절편을 간접 면역 형광에 의해 표지하였다. 2-단계 배양을 사용하여 결합된 융합 폴리펩타이드를 검출하였으며, 이는 알렉사 555 염료(몰레큘라 프로브스(Molecular Probes))에 접합된 친화성-정제된 염소 항-인간(GAH555) IgG(H+L)에 의해 드러났다. 대조군은 관련되지 않은 인간 IgG1 항체(시그마) 및 2차 항체 단독을 포함하였으며, 이들은 모두 음성 결과를 제공하였다. 모든 유형의 β-아밀로이드 플라크는 10 ng/㎖ 내지 5 ㎍/㎖로 시험된 융합 폴리펩타이드 농도에서 뚜렷하고 일관되게 드러났다. 진짜 인간 아밀로이드-β 플라크의 특이적이고 민감한 염색은 0.95 ㎍/㎖ 및 1.9 ㎍/㎖의 농도에서 융합 폴리펩타이드에 대해서 나타난다(도 4를 참조하시오).

실시예 5: 알쯔하이머병의 마우스 모델에서 융합 폴리펩타이드에 의한 생체 내 β-아밀로이드 플라크 장식

융합 폴리펩타이드를 생체내에서 β-아밀로이드 플라크를 면역-장식하는 그의 능력에 대해서, AD-관련된 아밀로이드증에 대한 마우스 모델(문헌[Richards (2003), J. Neuroscience, 23, 8989-9003])인 APP/PS2 이중 유전자이식 마우스에서 시험하였다. 이는 아밀로이드-β 플라크에의 결합 및 뇌 침투 정도를 평가할 수 있게 하였다. 상기 융합 폴리펩타이드를 네이키드 항-Aβ 단클론 항체와 비교하여 상이한 용량으로 투여하였으며, 6일 후에 동물들을 포스페이트-완충된 염수로 관류시키고 뇌를 드라이 아이스상에서 동결시키고 동결절편화를 위해 준비하였다. 상기 융합 폴리펩타이드는 생체내에서 실질적으로 개선되고 매우 유효한 뇌 침투(상기 네이키드 항-Aβ 단클론 항체에 비해)를 나타내었다.

β-아밀로이드 플라크에 결합된 항체의 존재를 실온에서 1시간 동안 15 ㎍/㎖의 농도로 알렉사555 염료(GAH555)(몰레큘라 프로브스)에 접합된 염소 항-인간 IgG(H+L)에 의해 단일-표지된 간접 면역형광에 의해 고정되지 않은 동결조직 절편을 사용하여 평가하였다. 아밀로이드 플라크에 대한 대조염색을, 실온에서 1시간 동안 0.5 ㎍/㎕의 농도로 알렉사 488에 접합된 Aβ에 대한 마우스 단클론 항체인 BAP-2와의 배양에 의해 수행하였다. 슬라이드를 형광 봉입제(S3023 다코(Dako))와 함께 끼워넣고 공초점 레이저 현미경검사에 의해 영상화를 수행하였다.

등몰 용량(2 및 3.8 ㎎/㎏)에서 융합 폴리펩타이드는 혈액 뇌 장벽을 실질적으로 보다 양호하게 가로지르고 생체내에서 모든 β-아밀로이드 플라크를 강하게 면역-장식하는 것으로 밝혀졌다. 도 5에 나타낸 전형적인 상들은 훨씬 더 낮은 정도로 상기 혈액-뇌 경계를 가로지르는 네이키드 단클론 항체에 비해, 상기 융합 폴리펩타이드의 개선된 결합 능력을 입증한다.

실시예 6: 융합 폴리펩타이드의 재조합 생산

DNA 제조:

500 ㎖ 또는 5 L의 밤새 세균 LB 배양물을 수확하고 플라스미드 DNA를 제조사의 프로토콜(하이 스피드 맥시 키트(High speed Maxi kit), 퀴아겐(Qiagen), 카탈로그 번호 12663)에 따라 추출하였다. 생성된 플라스미드 DNA를 1 ㎖의 TE 완충제 중에서 용리시키고 DNA 농도를 분광광도측정(이포크(Epoch), 바이오텍(BioTek))에 의해 측정하였다.

발현 플라스미드:

중쇄 및 경쇄의 발현을 위한 발현 카세트를 포함하는 발현 플라스미드를 포유동물 세포 발현 벡터 중에서 별도로 조립하였다.

코돈 사용을 추론할 수 있는 인간 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오타이드 서열에 관한 일반적인 정보가 문헌[Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication No 91-3242]에 제공되어 있다.

a) 네프릴리신이 없는 항체:

κ-경쇄의 전사 단위는 하기의 요소들로 구성된다:

- 인간 경쇄 생식계통 유전자의 5'UTR을 포함한 인간 거대세포바이러스(hCMV)로부터의 극초기 인헨서 및 프로모터,

- 인간 생식계통 유전자의 게놈 DNA 분절(L1, 신호-서열-인트론, L2)을 암호화하는 신호 펩타이드 서열을 포함한 경쇄 가변 영역,

- 마우스 κ-경쇄 유전자 인트론 2를 포함한 인간 κ-경쇄 유전자 불변 영역, 및

- SV40 폴리아데닐화("폴리A") 신호 서열.

γ1-중쇄의 전사 단위는 하기의 요소들로 구성된다:

- 인간 중쇄 생식계통 유전자의 5'UTR을 포함한 인간 거대세포바이러스(HCMV)로부터의 극초기 인헨서 및 프로모터,

- 인간 생식계통 유전자의 게놈 DNA 분절(L1, 신호-서열-인트론, L2)을 암호화하는 신호 펩타이드 서열을 포함한 γ1-쇄 가변 영역,

- 마우스 중쇄 인트론 2를 포함한 게놈 인간 γ1-중쇄 유전자 불변 영역,

- SV40 폴리아데닐화("폴리A") 신호 서열.

추가로 상기 플라스미드는

- 네오마이신 내성 유전자,

- 에스케리키아 콜라이에서 상기 플라스미드의 복제를 허용하는 벡터 pUC18로부터의 복제 기원, 및

- 에스케리키아 콜라이에서 암피실린 내성을 부여하는 β-락타마제 유전자

를 함유한다.

b) 중쇄의 C-말단에 융합된 네프릴리신을 갖는 항체:

상기 경쇄의 발현 플라스미드는 하기를 포함한다:

- κ-경쇄의 전사 단위는 하기의 요소들로 구성된다:

- 마우스 κ-경쇄 유전자 인트론 2를 포함한 인간 κ-경쇄 유전자 불변 영역,

- BGH 폴리아데닐화("폴리A") 신호 서열,

- 네오마이신 내성 유전자,

- 에스케리키아 콜라이에서 암피실린 내성을 부여하는 β-락타마제 유전자.

상기 중쇄의 발현 플라스미드는 하기를 포함한다:

- 하기의 요소들로 구성된 γ1-중쇄의 전사 단위:

- 네프릴리신 암호화 핵산,

- BGH 폴리아데닐화("폴리A") 신호 서열,

형질감염:

HEK293 세포를 형질감염 전날 8 x 10⁵ 세포/㎖로 희석하였다. 약 1 내지 1.6 x 10⁶ 세포/㎖를 제조사의 프로토콜에 따라 형질감염시켰다. 1000 ㎖의 최종 형질감염 부피를 위해서, 1000 ㎍의 DNA를 Opti-MEM(등록상표) I 환원 혈청 배지(깁코(Gibco), 카탈로그 번호 31985070)로 50 ㎖의 최종 부피로 희석하였다. DNA 1 ㎍당 2 ㎕의 293펙틴(fectin)(상표) 시약(인비트로젠(Invitrogen), 카탈로그 번호 12347019)을 Opti-MEM(등록상표) 배지로 1 ㎖의 최종 부피로 동등하게 희석하고 5분 동안 배양하였다. 배양 후에 희석된 DNA를 상기 희석된 293펙틴(상표) 시약에 가하고, 서서히 혼합하고, 추가로 20 내지 30분 동안 배양하고 그 후에 950 ㎖의 HEK293 세포 현탁액에 한 방울씩 피펫팅하여 1000 ㎖의 최종 부피를 획득하였다. 상기 세포를 125 rpm으로 회전하는 궤도 진탕기상에서 세포 배양 조건(37 ℃, 8% CO₂, 80% 습도)하에서 배양하고 72시간 후에 수확하였다. 상기 수확물을 1000 rpm에서 10분 동안 원심분리시킨 다음 3000 rpm에서 10분 동안 원심분리시키고 22 ㎛ 멸균 필터(밀리포어(Millipore), 카탈로그 번호 SCGPU05RE)를 통해 여과하였다.

정제:

세포를 원심분리에 의해 배양 배지로부터 제거하였다. 복합체를 단백질 A 친화성 크로마토그래피(AKTA-Avant상의 맵셀랙트-세파로스(MabSelect-Sepharose))에 의해 상등액으로부터 정제하였다. 용리된 복합체를 아미콘(Amicon) 원심분리 튜브에 의해 3 ㎎/㎖의 단백질 농도로 농축시켰다. 하나의 분액을 크기 배제 크로마토그래피(HPLC TSKgel GFC300 Sys89)상에서 분석하였다. 슈퍼덱스(Superdex) 200상에서의 예비 SEC를 수행하여 응집체를 제거하고 상기 융합 단백질을 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0에서 완충시켰다. 용리된 복합체를 아미콘(Amicon) 원심분리 튜브로 1 ㎎/㎖의 단백질 농도로 농축시키고 멸균 여과하였다(0.2 ㎛ 기공 크기).

분석:

복합체 샘플들을 UV 분광광도계를 사용하여 OD280에 의해 분석하여 용액 중 단백질 농도를 측정하였다. 상기 분석에 필요한 소광 계수를 문헌[Pace et al., Protein Science 4 (1995) 2411-2423]에 따라 아미노산 서열로부터 계산하였다. 크기 배제 크로마토그래피(SE-HPLC)를, 상기 샘플 중 단량체성, 응집된 및 분해된 종들의 함량을 측정하기 위해서 이동상으로서 0.25M KCl, pH 7.0을 포함하는, 0.2M 칼륨 포스페이트 완충제를 갖는 TSK-Gel300SWXL 또는 슈퍼덱스 200 컬럼상에서 수행하였다. 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 폴리아크릴아미드 젤 전기영동(환원 및 비환원)을 수행하여, 생성물-관련된 분해 산물 및 관련되지 않은 불순물에 관한 복합체 제제의 순도를 분석하였다. 전기분무 이온화 질량분석법(ESI-MS)을 환원된(TCEP) 및 탈글리코실화된(N-글리코시다제 F) 샘플로 수행하여 각 쇄의 정확한 질량/정체를 확인하고 화학적 변형을 검출하였다. 상기 탈글리코실화된 샘플의 ESI-MS를 수행하여 완전히 조립된 단백질의 성질 및 품질을 분석하고 잠재적인 생성물-관련된 부산물들을 검출하였다(표 2).

결과:

항체	네프릴리신	배양 부피 [l]	단백질 A 정제후 단백질 [㎎/l]	단량체 함량 [%]	응집체 함량 [%]	총 단량체성 단백질 [mg/l]
Mab 31	없음	2.4	9.5	> 98%	< 2%	9.3
Mab 31	있음	14	20.1	90.8	7.3	18.3

Mab31의 항체 중쇄 중 하나에 대한 네프릴리신 모이어티의 융합이 Mab31 항체의 수율에 비해 상기 융합 폴리펩타이드의 발현 수율을 증가시켰음을 알 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드 서열

SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Therapeutic fusion protein <130> 31238 WO <140> PCT/EP2014/066355 <141> 2014-07-30 <150> EP13179056.0 <151> 2013-08-02 <160> 13 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 2 <211> 750 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gly Lys Ser Glu Ser Gln Met Asp Ile Thr Asp Ile Asn Thr Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Lys Lys Gln Arg Trp Thr Pro Leu Glu Ile Ser Leu Ser 20 25 30 Val Leu Val Leu Leu Leu Thr Ile Ile Ala Val Thr Met Ile Ala Leu 35 40 45 Tyr Ala Thr Tyr Asp Asp Gly Ile Cys Lys Ser Ser Asp Cys Ile Lys 50 55 60 Ser Ala Ala Arg Leu Ile Gln Asn Met Asp Ala Thr Thr Glu Pro Cys 65 70 75 80 Thr Asp Phe Phe Lys Tyr Ala Cys Gly Gly Trp Leu Lys Arg Asn Val 85 90 95 Ile Pro Glu Thr Ser Ser Arg Tyr Gly Asn Phe Asp Ile Leu Arg Asp 100 105 110 Glu Leu Glu Val Val Leu Lys Asp Val Leu Gln Glu Pro Lys Thr Glu 115 120 125 Asp Ile Val Ala Val Gln Lys Ala Lys Ala Leu Tyr Arg Ser Cys Ile 130 135 140 Asn Glu Ser Ala Ile Asp Ser Arg Gly Gly Glu Pro Leu Leu Lys Leu 145 150 155 160 Leu Pro Asp Ile Tyr Gly Trp Pro Val Ala Thr Glu Asn Trp Glu Gln 165 170 175 Lys Tyr Gly Ala Ser Trp Thr Ala Glu Lys Ala Ile Ala Gln Leu Asn 180 185 190 Ser Lys Tyr Gly Lys Lys Val Leu Ile Asn Leu Phe Val Gly Thr Asp 195 200 205 Asp Lys Asn Ser Val Asn His Val Ile His Ile Asp Gln Pro Arg Leu 210 215 220 Gly Leu Pro Ser Arg Asp Tyr Tyr Glu Cys Thr Gly Ile Tyr Lys Glu 225 230 235 240 Ala Cys Thr Ala Tyr Val Asp Phe Met Ile Ser Val Ala Arg Leu Ile 245 250 255 Arg Gln Glu Glu Arg Leu Pro Ile Asp Glu Asn Gln Leu Ala Leu Glu 260 265 270 Met Asn Lys Val Met Glu Leu Glu Lys Glu Ile Ala Asn Ala Thr Ala 275 280 285 Lys Pro Glu Asp Arg Asn Asp Pro Met Leu Leu Tyr Asn Lys Met Thr 290 295 300 Leu Ala Gln Ile Gln Asn Asn Phe Ser Leu Glu Ile Asn Gly Lys Pro 305 310 315 320 Phe Ser Trp Leu Asn Phe Thr Asn Glu Ile Met Ser Thr Val Asn Ile 325 330 335 Ser Ile Thr Asn Glu Glu Asp Val Val Val Tyr Ala Pro Glu Tyr Leu 340 345 350 Thr Lys Leu Lys Pro Ile Leu Thr Lys Tyr Ser Ala Arg Asp Leu Gln 355 360 365 Asn Leu Met Ser Trp Arg Phe Ile Met Asp Leu Val Ser Ser Leu Ser 370 375 380 Arg Thr Tyr Lys Glu Ser Arg Asn Ala Phe Arg Lys Ala Leu Tyr Gly 385 390 395 400 Thr Thr Ser Glu Thr Ala Thr Trp Arg Arg Cys Ala Asn Tyr Val Asn 405 410 415 Gly Asn Met Glu Asn Ala Val Gly Arg Leu Tyr Val Glu Ala Ala Phe 420 425 430 Ala Gly Glu Ser Lys His Val Val Glu Asp Leu Ile Ala Gln Ile Arg 435 440 445 Glu Val Phe Ile Gln Thr Leu Asp Asp Leu Thr Trp Met Asp Ala Glu 450 455 460 Thr Lys Lys Arg Ala Glu Glu Lys Ala Leu Ala Ile Lys Glu Arg Ile 465 470 475 480 Gly Tyr Pro Asp Asp Ile Val Ser Asn Asp Asn Lys Leu Asn Asn Glu 485 490 495 Tyr Leu Glu Leu Asn Tyr Lys Glu Asp Glu Tyr Phe Glu Asn Ile Ile 500 505 510 Gln Asn Leu Lys Phe Ser Gln Ser Lys Gln Leu Lys Lys Leu Arg Glu 515 520 525 Lys Val Asp Lys Asp Glu Trp Ile Ser Gly Ala Ala Val Val Asn Ala 530 535 540 Phe Tyr Ser Ser Gly Arg Asn Gln Ile Val Phe Pro Ala Gly Ile Leu 545 550 555 560 Gln Pro Pro Phe Phe Ser Ala Gln Gln Ser Asn Ser Leu Asn Tyr Gly 565 570 575 Gly Ile Gly Met Val Ile Gly His Glu Ile Thr His Gly Phe Asp Asp 580 585 590 Asn Gly Arg Asn Phe Asn Lys Asp Gly Asp Leu Val Asp Trp Trp Thr 595 600 605 Gln Gln Ser Ala Ser Asn Phe Lys Glu Gln Ser Gln Cys Met Val Tyr 610 615 620 Gln Tyr Gly Asn Phe Ser Trp Asp Leu Ala Gly Gly Gln His Leu Asn 625 630 635 640 Gly Ile Asn Thr Leu Gly Glu Asn Ile Ala Asp Asn Gly Gly Leu Gly 645 650 655 Gln Ala Tyr Arg Ala Tyr Gln Asn Tyr Ile Lys Lys Asn Gly Glu Glu 660 665 670 Lys Leu Leu Pro Gly Leu Asp Leu Asn His Lys Gln Leu Phe Phe Leu 675 680 685 Asn Phe Ala Gln Val Trp Cys Gly Thr Tyr Arg Pro Glu Tyr Ala Val 690 695 700 Asn Ser Ile Lys Thr Asp Val His Ser Pro Gly Asn Phe Arg Ile Ile 705 710 715 720 Gly Thr Leu Gln Asn Ser Ala Glu Phe Ser Glu Ala Phe His Cys Arg 725 730 735 Lys Asn Ser Tyr Met Asn Pro Glu Lys Lys Cys Arg Val Trp 740 745 750 <210> 3 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Ala Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr 100 105 110 Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 4 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ile Tyr Asn Met Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 10 <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ala Ile Asn Ala Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr Phe Asp 1 5 10 15 Val <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Leu Gln Ile Tyr Asn Met Pro Ile 1 5 <210> 11 <211> 940 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain antibody construct <400> 11 Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Ala Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr 100 105 110 Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 145 150 155 160 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile 195 200 205 Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 210 215 220 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 225 230 235 240 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 245 250 255 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 260 265 270 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 275 280 285 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 290 295 300 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 305 310 315 320 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 325 330 335 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 340 345 350 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr 355 360 365 Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 370 375 380 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 385 390 395 400 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 405 410 415 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 420 425 430 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 435 440 445 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 450 455 460 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser 465 470 475 480 Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Glu Glu Ile Val Thr Ile Thr Cys 485 490 495 Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys 500 505 510 Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Thr Ser Leu Ala 515 520 525 Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Gln Phe 530 535 540 Ser Leu Lys Ile Ser Arg Val Gln Val Glu Asp Ile Gly Ile Tyr Tyr 545 550 555 560 Cys Leu Gln Ala Tyr Asn Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 565 570 575 Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 580 585 590 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 595 600 605 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 610 615 620 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 625 630 635 640 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 645 650 655 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 660 665 670 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly 675 680 685 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 690 695 700 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Glu 705 710 715 720 Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser 725 730 735 Leu Thr Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly 740 745 750 Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Lys Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ala 755 760 765 Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Lys Met Asn Tyr Ala Asp Thr Val Lys 770 775 780 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 785 790 795 800 Glu Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 805 810 815 Val Pro Thr Ser His Tyr Val Val Asp Val Trp Gly Gln Gly Val Ser 820 825 830 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 835 840 845 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 850 855 860 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 865 870 875 880 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 885 890 895 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 900 905 910 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 915 920 925 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 930 935 940 <210> 12 <211> 1168 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain antibody construct <400> 12 Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Ala Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr 100 105 110 Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 145 150 155 160 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile 195 200 205 Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 210 215 220 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 225 230 235 240 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 245 250 255 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 260 265 270 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 275 280 285 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 290 295 300 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 305 310 315 320 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 325 330 335 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 340 345 350 Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 355 360 365 Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 370 375 380 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 385 390 395 400 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val 405 410 415 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 420 425 430 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 435 440 445 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 450 455 460 Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Asp Asp Gly Ile Cys Lys Ser Ser Asp Cys 465 470 475 480 Ile Lys Ser Ala Ala Arg Leu Ile Gln Asn Met Asp Ala Thr Thr Glu 485 490 495 Pro Cys Thr Asp Phe Phe Lys Tyr Ala Cys Gly Gly Trp Leu Lys Arg 500 505 510 Asn Val Ile Pro Glu Thr Ser Ser Arg Tyr Gly Asn Phe Asp Ile Leu 515 520 525 Arg Asp Glu Leu Glu Val Val Leu Lys Asp Val Leu Gln Glu Pro Lys 530 535 540 Thr Glu Asp Ile Val Ala Val Gln Lys Ala Lys Ala Leu Tyr Arg Ser 545 550 555 560 Cys Ile Asn Glu Ser Ala Ile Asp Ser Arg Gly Gly Glu Pro Leu Leu 565 570 575 Lys Leu Leu Pro Asp Ile Tyr Gly Trp Pro Val Ala Thr Glu Asn Trp 580 585 590 Glu Gln Lys Tyr Gly Ala Ser Trp Thr Ala Glu Lys Ala Ile Ala Gln 595 600 605 Leu Asn Ser Lys Tyr Gly Lys Lys Val Leu Ile Asn Leu Phe Val Gly 610 615 620 Thr Asp Asp Lys Asn Ser Val Asn His Val Ile His Ile Asp Gln Pro 625 630 635 640 Arg Leu Gly Leu Pro Ser Arg Asp Tyr Tyr Glu Cys Thr Gly Ile Tyr 645 650 655 Lys Glu Ala Cys Thr Ala Tyr Val Asp Phe Met Ile Ser Val Ala Arg 660 665 670 Leu Ile Arg Gln Glu Glu Arg Leu Pro Ile Asp Glu Asn Gln Leu Ala 675 680 685 Leu Glu Met Asn Lys Val Met Glu Leu Glu Lys Glu Ile Ala Asn Ala 690 695 700 Thr Ala Lys Pro Glu Asp Arg Asn Asp Pro Met Leu Leu Tyr Asn Lys 705 710 715 720 Met Thr Leu Ala Gln Ile Gln Asn Asn Phe Ser Leu Glu Ile Asn Gly 725 730 735 Lys Pro Phe Ser Trp Leu Asn Phe Thr Asn Glu Ile Met Ser Thr Val 740 745 750 Asn Ile Ser Ile Thr Asn Glu Glu Asp Val Val Val Tyr Ala Pro Glu 755 760 765 Tyr Leu Thr Lys Leu Lys Pro Ile Leu Thr Lys Tyr Ser Ala Arg Asp 770 775 780 Leu Gln Asn Leu Met Ser Trp Arg Phe Ile Met Asp Leu Val Ser Ser 785 790 795 800 Leu Ser Arg Thr Tyr Lys Glu Ser Arg Asn Ala Phe Arg Lys Ala Leu 805 810 815 Tyr Gly Thr Thr Ser Glu Thr Ala Thr Trp Arg Arg Cys Ala Asn Tyr 820 825 830 Val Asn Gly Asn Met Glu Asn Ala Val Gly Arg Leu Tyr Val Glu Ala 835 840 845 Ala Phe Ala Gly Glu Ser Lys His Val Val Glu Asp Leu Ile Ala Gln 850 855 860 Ile Arg Glu Val Phe Ile Gln Thr Leu Asp Asp Leu Thr Trp Met Asp 865 870 875 880 Ala Glu Thr Lys Lys Arg Ala Glu Glu Lys Ala Leu Ala Ile Lys Glu 885 890 895 Arg Ile Gly Tyr Pro Asp Asp Ile Val Ser Asn Asp Asn Lys Leu Asn 900 905 910 Asn Glu Tyr Leu Glu Leu Asn Tyr Lys Glu Asp Glu Tyr Phe Glu Asn 915 920 925 Ile Ile Gln Asn Leu Lys Phe Ser Gln Ser Lys Gln Leu Lys Lys Leu 930 935 940 Arg Glu Lys Val Asp Lys Asp Glu Trp Ile Ser Gly Ala Ala Val Val 945 950 955 960 Asn Ala Phe Tyr Ser Ser Gly Arg Asn Gln Ile Val Phe Pro Ala Gly 965 970 975 Ile Leu Gln Pro Pro Phe Phe Ser Ala Gln Gln Ser Asn Ser Leu Asn 980 985 990 Tyr Gly Gly Ile Gly Met Val Ile Gly His Glu Ile Thr His Gly Phe 995 1000 1005 Asp Asp Asn Gly Arg Asn Phe Asn Lys Asp Gly Asp Leu Val Asp 1010 1015 1020 Trp Trp Thr Gln Gln Ser Ala Ser Asn Phe Lys Glu Gln Ser Gln 1025 1030 1035 Cys Met Val Tyr Gln Tyr Gly Asn Phe Ser Trp Asp Leu Ala Gly 1040 1045 1050 Gly Gln His Leu Asn Gly Ile Asn Thr Leu Gly Glu Asn Ile Ala 1055 1060 1065 Asp Asn Gly Gly Leu Gly Gln Ala Tyr Arg Ala Tyr Gln Asn Tyr 1070 1075 1080 Ile Lys Lys Asn Gly Glu Glu Lys Leu Leu Pro Gly Leu Asp Leu 1085 1090 1095 Asn His Lys Gln Leu Phe Phe Leu Asn Phe Ala Gln Val Trp Cys 1100 1105 1110 Gly Thr Tyr Arg Pro Glu Tyr Ala Val Asn Ser Ile Lys Thr Asp 1115 1120 1125 Val His Ser Pro Gly Asn Phe Arg Ile Ile Gly Thr Leu Gln Asn 1130 1135 1140 Ser Ala Glu Phe Ser Glu Ala Phe His Cys Arg Lys Asn Ser Tyr 1145 1150 1155 Met Asn Pro Glu Lys Lys Cys Arg Val Trp 1160 1165 <210> 13 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain antibody construct <400> 13 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ile Tyr Asn Met Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

Claims

Aβ에 대한 항체, 혈액 뇌 장벽 수용체에 결합하는 1가 결합 개체(binding entity) 및 네프릴리신 모이어티(moiety)를 포함하는 융합 단백질.
제 1 항에 있어서,
혈액 뇌 수용체가 트랜스페린 수용체, 인슐린 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 수용체, 저밀도 지단백질 수용체-관련된 단백질 8, 저밀도 지단백질 수용체-관련된 단백질 1 및 헤파린-결합 표피 성장 인자-유사 성장 인자로 이루어진 군으로부터 선택되는, 융합 단백질.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
1가 결합 개체가 혈액 뇌 장벽 리간드 또는 1가 항체 단편이고, 바람직하게는 scFv, Fv, scFab, Fab 및 VHH로부터 선택되는, 융합 단백질.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 Aβ에 대한 항체;
제 1 링커에 의해 Aβ에 대한 항체의 제 1 중쇄의 C-말단 부분에 커플링된, 혈액 뇌 수용체에 결합하는 1가 결합 개체; 및
제 2 링커에 의해 Aβ에 대한 항체의 제 2 중쇄의 C-말단 부분에 커플링된 네프릴리신 모이어티
를 포함하는 융합 단백질.
제 4 항에 있어서,
혈액 뇌 수용체에 결합하는 1가 결합 개체가 제 1 링커에 의해 Aβ에 대한 전장 항체의 제 1 중쇄의 Fc 부분의 C-말단 단부에 커플링되고,
네프릴리신 모이어티가 제 2 링커에 의해 Aβ에 대한 전장 항체의 제 2 중쇄의 Fc 부분의 C-말단 단부에 커플링되는,
융합 단백질.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
제 1 및 제 2 링커가 펩타이드 또는 화학적 링커, 바람직하게는 펩타이드 링커인, 융합 단백질.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
혈액 뇌 장벽 수용체에 결합하는 1가 결합 개체가 트랜스페린 수용체에 대한 scFab인, 융합 단백질.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
Aβ에 대한 항체가 (a) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR1, (b) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR2, (c) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 H-CDR3, (d) 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 L-CDR1, (e) 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 L-CDR2, 및 (f) 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 L-CDR3을 포함하는, 융합 단백질.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
Aβ에 대한 항체가 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 V_H 도메인 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 V_L 도메인을 포함하는, 융합 단백질.
제 4 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
Aβ에 대한 항체의 중쇄 중 하나가 제 1 이량체화 모듈을 포함하고 Aβ에 대한 항체의 제 2 중쇄가 제 2 이량체화 모듈을 포함하여, 상기 두 중쇄의 이종이량체화를 허용하는, 융합 단백질.
제 10 항에 있어서,
노브-인투-홀(knob-into-hole) 전략에 따라 제 1 이량체화 모듈이 노브를 포함하고 제 2 이량체화 모듈이 홀을 포함하는, 융합 단백질.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
혈액 뇌 장벽 수용체에 결합하는 하나의 1가 결합 개체, 바람직하게는 트랜스페린 수용체에 대한 하나의 scFab를 포함하는 융합 단백질.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 암호화하는 단리된 핵산.
제 13 항에 따른 핵산을 포함하는 숙주 세포.
제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질 및 약학 담체를 포함하는 약학 제형.
약제로서 사용하기 위한, 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질.
약제의 제조에서, 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질의 용도.