TWI449535B - 針對類澱粉- β肽之抗體於治療年齡相關黃班退化之用途 - Google Patents

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Description

針對類澱粉-β肽之抗體於治療年齡相關黃班退化之用途
本發明係關於針對類澱粉－β肽之抗體的使用方法，其係用於治療及/或預防諸如年齡相關黃斑退化之眼科疾病，而且用於其他眼病理學中，諸如青光眼、糖尿病性視網膜病變(包括糖尿病性黃斑水腫)、脈絡膜新生血管膜(CNV)、葡萄膜炎、近視退化、眼腫瘤、視網膜中央靜脈阻塞(central retinal vein occlusion)、虹膜紅變、眼新血管生成、中心漿液性視網膜病變(central serous retinopathy)、諸如乾眼之眼表面問題(ocular surface discus)、視網膜中央動脈阻塞、囊樣黃斑部水腫及任何其他視網膜退化性疾病。
本申請案主張2008年3月3日申請之美國專利申請案第12/041,581號之權利，該案主張2007年3月9日申請之美國臨時專利申請案第60/894,181號之權利，該案之全文以引用的方式併入本文中。
在美國，65歲以上個體中減小之最佳矯正視力之最常見起因為稱為年齡相關黃斑退化(AMD)之視網膜病症。隨著AMD進展，疾病特徵在於敏銳、中心視力之損失。受AMD影響之眼睛區域為黃斑－視網膜中心之小區域，其主要由感光細胞組成。佔AMD患者之約85%－90%之所謂"乾型"AMD(亦稱為"地圖狀萎縮(geographic atrophy)")涉及由細胞總體萎縮造成之眼睛色素分布改變、感光體損失及視 網膜功能減少。所謂"濕型"AMD涉及引起視網膜下空間中凝血或傷痕之異常脈絡膜血管增生。因此，濕型AMD之發作由於在神經視網膜下形成異常脈絡膜新生血管網路(脈絡膜新血管生成，CNV)而發生。新形成之血管為過度滲漏。此引起視網膜下流體及血液積累，引起視敏度損失。最終，當涉及脈絡膜及視網膜之大的盤狀傷痕形成時，在所涉及區域中存在功能性視網膜之全損失。儘管乾型AMD患者可保持減小品質之視力，但濕型AMD經常導致失明。(Hamdi及Kenney,Age－related Macular degeneration－a new viewpoint,Frontiers in Bioscience ,e305－314,2003年5月)。CNV不僅在濕型AMD中而且在其他眼病理學中發生，該等其他眼病理學諸如青光眼、糖尿病性視網膜病變(包括糖尿病性黃斑水腫)、布魯赫膜(Bruch's membrane)破裂、近視退化、眼腫瘤及其他相關視網膜退化性疾病。
AMD係發病機制為明顯多因性之常見病症，其中遺傳及環境因素在其發作及進展中起作用。各種所進行之研究已確定對於AMD之若干風險因素，諸如吸煙、衰老、家族史(Milton,Am J Ophthalmol 88,269(1979)；Mitchell等人，Ophthalmology 102,1450－1460(1995)；Smith等人，Ophthalmology 108,697－704(2001))、性別(女性中7倍較高可能性：Klein等人，Ophthalmology 99,933－943(1992))及種族(白種人最易受影響)。其他風險因素可包括眼睛特徵，諸如遠視(farsightedness、hyperopia)及淺色眼睛，以及心血管疾病及高血壓。疾病發作進展中之遺傳涉入的證 據亦已由文獻證明(參見上文Hamdi及Kenney)。
目前，不存在用於研究AMD之普遍接受之動物模型。Malek等人(PNAS 102,11900－5(2005))之初始研究已產生具有當組合時近似人類AMD之形態特徵的三個風險因素之動物模型。值得注意的是此小鼠模型之發展已提供為AMD測試新穎分子機制及治療目標之機會。仍存在對鑑定新穎目標及能夠治療及/或預防以下眼科疾病之治療劑之需要：諸如年齡相關黃斑退化(濕型及乾型)、青光眼、糖尿病性視網膜病變(包括糖尿病性黃斑水腫)、脈絡膜新生血管膜(CNV)、葡萄膜炎、近視退化、眼腫瘤、視網膜中央靜脈阻塞、虹膜紅變、眼新血管生成、中心漿液性視網膜病變、諸如乾眼之眼表面問題、視網膜中央動脈阻塞、囊樣黃斑部水腫及其他視網膜退化性疾病。
本發明揭示與眼科疾病之發病機制有關聯之新穎治療目標。詳言之，本發明揭示治療眼科疾病之方法，其包含向個體投與有效量之抑制劑β－類澱粉(Aβ)肽。可將Aβ抑制劑投藥於患有以下眼科疾病之個體：諸如年齡相關黃斑退化(濕型及乾型'AMD')、青光眼、糖尿病性視網膜病變(包括糖尿病性黃斑水腫)、脈絡膜新生血管膜(CNV)、葡萄膜炎、近視退化、眼腫瘤、視網膜中央靜脈阻塞、虹膜紅變、眼新血管生成、中心漿液性視網膜病變、諸如乾眼之眼表面問題、視網膜中央動脈阻塞、囊樣黃斑部水腫及其他視網膜退化性疾病。在一實施例中，抑制劑為抗體、反 義分子、siRNA分子、核糖核酸酶或小分子化合物。
在一實施例中，本發明提供一種治療患有年齡相關黃斑退化之個體的方法，其包含向個體投與包含治療有效量之β－類澱粉(Aβ)肽之抑制劑的醫藥組合物。本發明之另一實施例係關於一種治療患有年齡相關黃斑退化(AMD)之個體的方法，其包含向個體投與包含治療有效量之Aβ抑制劑的醫藥組合物。
本發明之另一實施例提供一種治療有效量之Aβ抑制劑的用途，其係用於製備供促進患有AMD之患者康復用的藥物。在此實施例之一態樣中，抗體包含具有削弱效應功能之Fc區。在此實施例之另一態樣中，疾病為AMD，包括濕型及乾型AMD。
本發明亦提供治療或預防與Aβ之類澱粉沈積相關之疾病的方法，其包含向個體投與有效劑量之醫藥組合物，該醫藥組合物包含與Aβ肽或Aβ肽聚集形式特異性結合之抗體。在此實施例之另一態樣中，抗體包含與天然存在之Fc區具有變異之Fc區，其中該變異引起削弱效應功能。在一些實施例中，投與該抗體產生比投與無變異之抗體小之腦微出血。
用於本發明之方法的抗體及多肽與Aβ肽或Aβ肽之聚集形式特異性結合。在一實施例中，抗體或多肽具有削弱效應功能。在一些實施例中，抗體或多肽不為F(ab')2 片段。在一些實施例中，抗體或多肽不為Fab片段。在一些實施例中，抗體或多肽不為單鏈抗體scFv。
與Aβ肽或Aβ肽之聚集形式特異性結合且包含具有削弱效應功能之重鏈恆定區的多肽亦可用於本文所述之方法中之任一者。在一些實施例中，多肽包含衍生自抗體9TL、6G或表3或表8中所示之其變異體之序列(例如一或多個CDR)。
在一些實施例中，抗體或多肽包含具有削弱效應功能之重鏈恆定區，其中重鏈恆定區包含Fc區。在一些實施例中，Fc區中之N－糖基化經移除。在一些實施例中，Fc區包含在N－糖基化識別序列內之突變，藉此使抗體或多肽之Fc區未經N－糖基化。在一些實施例中，Fc區係經聚乙二醇化。在一些實施例中，抗體或多肽之重鏈恆定區為人類重鏈IgG2a恆定區，該恆定區含有以下突變：A330P331至S330S331(參考野生型IgG2a序列之胺基酸編號)。在一些實施例中，抗體或多肽包含IgG4之恆定區，該恆定區包含以下突變：E233F234L235至P233V234A235。
在一些實施例中，抗體或多肽與Aβ肽之殘基1－16內之抗原決定基特異性結合。在一些實施例中，抗體或多肽與Aβ肽之N末端特異性結合。在一些實施例中，抗體或多肽與Aβ肽之殘基16－28內之抗原決定基特異性結合。在一些實施例中，抗體與Aβ肽之C末端側上之抗原決定基特異性結合，諸如由胺基酸25或之後胺基酸起始之抗原決定基。抗體可與Aβ肽1－37、1－38、1－39、1－40、1－41、1－42、1－43中之任一者特異性結合。在一些實施例中，抗體可與C末端截短Aβ肽之游離C末端胺基酸特異性結合，例如Aβ 1－37、 1－38、1－39、1－40、1－41、1－42、1－43。在一實施例中，抗體或多肽與Aβ1－40 肽上之抗原決定基特異性結合。在此實施例之另一態樣中，抗體或多肽與Aβ1－42 肽上之抗原決定基特異性結合。在此實施例之再一態樣中，抗體或多肽與Aβ1－43 肽上之抗原決定基特異性結合。在一些實施例中，抗體或多肽與Aβ1－40 肽之殘基28－40內之抗原決定基特異性結合。在一些實施例中，抗體或多肽與Aβ1－42 肽之殘基28－42內之抗原決定基特異性結合。在一些實施例中，抗體或多肽與Aβ1－43 肽之殘基28－43內之抗原決定基特異性結合。在一些實施例中，抗體或多肽與Aβ肽特異性結合，而未與全長類澱粉前驅蛋白質(APP)結合。在一些實施例中，抗體或多肽與Aβ之聚集形式特異性結合，而未與可溶形式結合。在一些實施例中，抗體或多肽與Aβ之可溶形式特異性結合，而未與聚集形式結合。在一些實施例中，抗體或多肽與Aβ之聚集形式及可溶形式特異性結合。
在一些實施例中，抗體或多肽與Aβ1－40 之C末端肽33－40特異性結合。在一些實施例中，抗體或多肽與包括胺基酸35－40之Aβ1－40 上之抗原決定基特異性結合。在一些實施例中，抗體或多肽與包括胺基酸36－40之Aβ1－40 上之抗原決定基特異性結合。在一些實施例中，抗體或多肽與包括胺基酸39及/或40之Aβ1－40 上之抗原決定基特異性結合。在一些實施例中，抗體或多肽與Aβ1－40 特異性結合，但並不與Aβ1－42 及/或Aβ1－43 特異性結合。在一些實施例中，抗體包含本文所述之抗體9TL或衍生自9TL之抗體的可變區。在 一些實施例中，抗體或多肽競爭地抑制抗體9TL、6G及/或衍生自9TL或6G之抗體或多肽與各別Aβ肽之結合。
在一些實施例中，抗體或多肽以高於其與Aβ1－42 及Aβ1－43 結合之親和性與Aβ1－40 結合。在此實施例之另一態樣中，抗體不為抗體2294。在一些實施例中，抗體與包括胺基酸25－34及40之Aβ1－40 上之抗原決定基結合。在一些實施例中，抗體包含本文所述之抗體6G或衍生自6G之抗體的可變區。在一些實施例中，抗體或多肽競爭地抑制抗體6G及/或衍生自6G之抗體或多肽與Aβ之結合。
在一些實施例中，抗體或多肽以約100 nM或以下、或20 nM或以下，或2 nM或以下之結合親和性(KD )與Aβ肽結合。在此實施例之一態樣中，抗體或多肽以約100 nM或以下、50 nM或以下，或2 nM或以下之KD 與Aβ1－40 肽結合。在此實施例之另一態樣中，抗體或多肽亦以約100 nM或以下，50 nM或以下，或2 nM或以下之KD 與Aβ1－42 肽結合。
可以此項技術中已知之任何方法投與與Aβ肽特異性結合之抗體或多肽，包括：靜脈內、皮下、經由吸入、動脈內、肌肉內、心內、心室內、非經腸、鞘內及腹膜內。投藥可藉由注射及/或可為全身性(例如靜脈內)或局部投藥。此亦一般適用於本發明之多肽及聚核苷酸。
本發明亦提供藉由投與醫藥組合物來治療眼科疾病之方法，該等醫藥組合物包含有效量之與Aβ肽或Aβ肽之聚集形式特異性結合且具有削弱效應功能之抗體或多肽中之任一者，或編碼該等抗體或多肽之聚核苷酸，及醫藥學上可 接受之賦形劑。
本發明亦提供包含組合物中之任何一或多者之套組及組合物，該等組合物包含有效量之與Aβ肽或Aβ肽之聚集形式特異性結合之抗體或多肽中之任一者，或編碼該等抗體或多肽之聚核苷酸。一般在合適包裝中且具備適當說明書之此等套組適用於本文所述之方法中之任一者。
本發明亦提供一種製造治療性人化抗體之方法，該治療性人化抗體用於治療與人類個體腦中之Aβ肽之類澱粉沈積相關之疾病，該方法包含選擇與Aβ肽特異性結合之第一人化抗體；及改變該抗體之Fc區以提供相對於該第一人化抗體具有削弱效應功能之治療性人化抗體。
本發明之另一實施例係針對一種保護或恢復個體視網膜功能之方法，其包含向該個體投與包含治療有效量之Aβ抑制劑的醫藥組合物。在一實施例中，抑制劑為抗體、反義分子、siRNA分子、核糖核酸酶或小分子化合物。
本發明之另一實施例係針對一種保持或復原個體視敏度之方法，其包含治療有效量之Aβ抑制劑。
在上文實施例之一態樣中，上文方法係用於並不正亦因阿茲海默氏症(Alzheimer's disease)、唐氏症候群(Down's syndrome)或腦類澱粉血管病變而受治療之個體中。
本發明之上述方法包括作為抗體之Aβ抑制劑。在一態樣中，本文中所揭示之本發明係關於與Aβ1－40 肽(表4中所示之SEQ ID NO：15)之C末端結合的抗體。因此在一態樣中，該方法包含用抗體9TL(可互換稱為"9TL")之治療，該抗體 9TL係藉由具有ATCC寄存號PTA－6124及PTA－6125之表現載體來產生。圖1中展示9TL之重鏈及輕鏈可變區之胺基酸序列。圖1中亦展示抗體9TL(包括Chothia及Kabat CDR)之互補判定區(CDR)部分。應瞭解對9TL區域之任何部分或整體的提及涵蓋由具有ATCC寄存號PTA－6124及PTA－6125之表現載體產生的序列，及/或圖1中所繪示之序列。
在另一態樣中，本發明包含投與具有表3中繪示之胺基酸序列的9TL之抗體變異體。
在另一態樣中，本發明包含投與包含抗體9TL或表3中所示之其變異體之片段或區域的抗體。在一實施例中，片段為抗體9TL之輕鏈。在另一實施例中，片段為抗體9TL之重鏈。在又一實施例中，片段含有來自抗體9TL之輕鏈及/或重鏈之一或多個可變區。在又一實施例中，片段含有來自圖1中所示之輕鏈及/或重鏈之一或多個可變區。在又一實施例中，片段含有來自抗體9TL之輕鏈及/或重鏈之一或多個CDR。
在另一態樣中，本發明包含投與多肽(其可為或可不為抗體)，其包含以下各物中之任何一或多者：a)抗體9TL或表3中所示之其變異體之一或多個CDR；b)來自抗體9TL或表3中所示之其變異體之重鏈的CDR H3；c)來自抗體9TL或表3中所示之其變異體之輕鏈的CDR L3；d)來自抗體9TL或表3中所示之其變異體之輕鏈的三個CDR；e)來自抗體9TL或表3中所示之其變異體之重鏈的三個CDR；f)來自抗體9TL或表3中所示之其變異體之輕鏈的三個CDR及來自 抗體9TL或表3中所示之其變異體之重鏈的三個CDR。本發明另外提供投與多肽(其可為或可不為抗體)，其包含以下各物中之任何一或多者：a)衍生自抗體9TL或表3中所示之其變異體之一或多個(一、二、三、四、五或六個)CDR；b)衍生自來自抗體9TL之重鏈的CDR H3之CDR；及/或c)衍生自來自抗體9TL之輕鏈的CDR L3之CDR。在一些實施例中，CDR為圖1中所示之CDR。在一些實施例中，衍生自抗體9TL或表3中所示之其變異體之該或該等CDR至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%與9TL或其變異體之至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個或至少六個CDR一致。
在另一態樣中，本發明包含投與抗體6G(可互換稱為"6G")。圖8中展示6G之重鏈及輕鏈可變區之胺基酸序列。圖8中亦展示抗體6G(包括Chothia及Kabat CDR)之互補判定區(CDR)部分。
在另一態樣中，本發明包含投與具有表8中繪示之胺基酸序列的6G之抗體變異體。
在另一態樣中，本發明包含投與包含抗體6G或表8中所示之其變異體之片段或區域的抗體。在一實施例中，片段為抗體6G之輕鏈。在另一實施例中，片段為抗體6G之重鏈。在又一實施例中，片段含有來自抗體6G之輕鏈及/或 重鏈之一或多個可變區。在又一實施例中，片段含有來自圖8中所示之輕鏈及/或重鏈之一或多個可變區。在又一實施例中，片段含有來自抗體6G之輕鏈及/或重鏈之一或多個CDR。
在另一態樣中，本發明包含投與多肽(其可為或可不為抗體)，其包含以下各物中之任何一或多者：a)抗體6G或表8中所示之其變異體之一或多個CDR；b)來自抗體6G或表8中所示之其變異體之重鏈的CDR H3；c)來自抗體6G或表8中所示之其變異體之輕鏈的CDR L3；d)來自抗體6G或表8中所示之其變異體之輕鏈的三個CDR；e)來自抗體6G或表8中所示之其變異體之重鏈的三個CDR；f)來自抗體6G或表8中所示之其變異體之輕鏈的三個CDR及來自抗體6G或表8中所示之其變異體之重鏈的三個CDR。本發明另外包含投與多肽(其可為或可不為抗體)，其包含以下各物中之任何一或多者：a)衍生自抗體6G或表8中所示之其變異體之一或多個(一、二、三、四、五或六個)CDR；b)衍生自來自抗體6G之重鏈的CDR H3之CDR；及/或c)衍生自來自抗體6G之輕鏈的CDR L3之CDR。在一些實施例中，CDR為圖8中所示之CDR。在一些實施例中，衍生自抗體6G或表8中所示之其變異體之該或該等CDR至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%與6G或其變異體之至少一個、至少兩個、至 少三個、至少四個、至少五個或至少六個CDR一致。
在另一態樣中，本發明包含投與包含重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體，該重鏈可變區包含來自SEQ ID NO：26中所示之抗體6G重鏈可變區之三個CDR，該輕鏈可變區包含來自SEQ ID NO：27中所示之抗體6G輕鏈可變區之三個CDR。在另一態樣中，本發明包含投與包含重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：30中所示之三個CDR，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：33中所示之三個CDR。在再一態樣中，本發明包含含有SEQ ID NO：26中所示之胺基酸序列的重鏈可變區及含有SEQ ID NO：27中所示之胺基酸序列的輕鏈可變區。在再一態樣中，本發明包含SEQ ID NO：36中所示之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：37中所示之輕鏈胺基酸序列。
在一些實施例中，CDR為Kabat CDR。在其他實施例中，CDR為Chothia CDR。在其他實施例中，CDR為Kabat與Chothia CDR之組合(亦稱為"組合CDR"或"擴展CDR")。換言之，對於含有一種以上CDR之任何給定實施例而言，CDR可為Kabat、Chothia及/或組合CDR中之任一者。
在一些實施例中，多肽(諸如抗體)包含SEQ ID NO：5中所示之胺基酸序列，其中L1為L、V或I；其中Y2為Y或W；其中S3為S、T或G；其中L4為L、R、A、V、S、T、Q或E；其中V6為V、I、T、P、C、Q、S、N或F；且其中Y7 為Y、H、F、W、S、I、V或A。在一些實施例中，胺基酸序列為重鏈可變區中之CDR3。在本文中為方便起見，在此上下文中之"為(is)"或對胺基酸之提及係指參考在SEQ ID中之位置來選擇給定位置之胺基酸。舉例而言，"L1為L、V或I"係指在SEQ ID NO：5中位置1之胺基酸L可經V或I取代。
在一些實施例中，多肽(諸如抗體)包含SEQ ID NO：6中所示之胺基酸序列，其中Y8為Y、A或H；且其中A11為A或S；且其中K12為K或A。在一些實施例中，胺基酸序列為輕鏈可變區中之CDR1。
在一些實施例中，多肽(諸如抗體)包含SEQ ID NO：8中所示之胺基酸序列，其中L1為L、M、N、C、F、V、K、S、Q、G、S；其中G3為G、S或T；其中T4為T或S；其中H5為H或L；其中Y6為Y、P、A、W、Q、M、S或E；其中V8為V、L、K、H、T、A、E、或M；且其中L9為L、I、T、S或V。在一些實施例中，胺基酸序列為輕鏈可變區中之CDR3。
在一些實施例中，多肽(諸如抗體)包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含：(a)SEQ ID NO：3中所示之CDR1區域；(b)SEQ ID NO：4中所示之CDR2區域；及(c)SEQ ID NO：5中所示之CDR3區域，其中L1為L、V或I；其中Y2為Y或W；其中S3為S、T或G；其中L4為L、R、A、V、S、T、Q或E；其中V6為V、I、T、P、C、Q、S、N或F；且其中Y7為Y、H、F、W、S、I、V或A。
在一些實施例中，多肽(諸如抗體)包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含：(a)SEQ ID NO：6中所示之CDR1區域，其中Y8為Y、A或H；且其中A11為A或S；且其中K12為K或A；(b)SEQ ID NO：7中所示之CDR2區域；及(c)SEQ ID NO：8中所示之CDR3區域，其中L1為L、M、N、C、F、V、K、S、Q、G、S；其中G3為G、S或T；其中T4為T或S；其中H5為H或L；其中Y6為Y、P、A、W、Q、M、S或E；其中V8為V、L、K、H、T、A、E或M；且其中L9為L、I、T、S或V。
在一些實施例中，本發明之抗體為人類抗體。在其他實施例中，本發明之抗體為人化抗體。在一些實施例中，抗體為單株抗體。在一些實施例中，抗體(或多肽)係經分離。在一些實施例中，抗體(或多肽)為大體上純的。
抗體之重鏈恆定區可來自任何類型之恆定區，諸如1gG、IgM、IgD、IgA及IgE；及任何同型，諸如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。
在一些實施例中，抗體包含經修飾恆定區，諸如免疫上惰性(其包括部分免疫上惰性，且可與術語"具有削弱效應功能"互換使用)之恆定區，其例如並不觸發補體介導溶胞、並不刺激抗體依賴細胞介導細胞毒性(ADCC)或並不活化微神經膠質細胞。在一些實施例中，如Eur.J.Immunol.(1999)29：2613－2624；PCT申請案第PCT/GB99/01441號；及/或英國專利申請案第9809951.8號中所述來修飾恆定區。在其他實施例中，抗體包含人類重 鏈IgG2a恆定區，該恆定區包含以下突變：A330P331至S330S331(參考野生型IgG2a序列之胺基酸編號)。Eur.J.Immunol.(1999)29：2613－2624。在一些實施例中，抗體包含IgG4之恆定區，該恆定區包含以下突變：E233F234L235至P233V234A235。在再其他實施例中，恆定區係針對N連接糖基化而去糖基化(aglycosylated)。在一些實施例中，藉由使寡醣附接殘基(諸如Asn297)突變及/或側接作為恆定區中N－糖基化識別序列之部分的殘基，從而使恆定區針對N連接糖基化而去糖基化。在一些實施例中，恆定區係針對N連接糖基化而去糖基化。以酶促方式或藉由表現於糖基化缺乏宿主細胞中，從而可使恆定區針對N連接糖基化而去糖基化。
在另一態樣中，本發明提供一種聚核苷酸(其可經分離)，其包含編碼抗體9TL或6G或表3及表8中所示之其變異體之片段或區域的聚核苷酸。在一實施例中，片段為抗體9TL或6G之輕鏈。在另一實施例中，片段為抗體9TL或6G之重鏈。在又一實施例中，片段含有來自抗體9TL或6G之輕鏈及/或重鏈之一或多個可變區。在又一實施例中，片段含有來自抗體9TL或6G之輕鏈及/或重鏈之一或多個(亦即一、二、三、四、五、六個)互補判定區(CDR)。
AMD之小鼠模型已有助於測試如下假設：不受理論限制，脂質輸送調節異常及類澱粉沈積可促進見於年齡相關黃斑退化、青光眼、糖尿病性視網膜病變(包括黃斑水腫) 及其他相關視網膜退化性疾病中所觀察到視網膜變化的發病機制。在阿茲海默氏症中已廣泛研究Aβ沈積，且先前研究已表明Aβ在年齡相關黃斑退化(Yoshida,T.等人，J.of Clin.Invest.,115(10)：2793－2800(2005)；Anderson,D.等人，Experimental Eye Research 78：243－256(2004)；Johnson,L.等人，PNAS,99(18)：11820－11835(2002))及青光眼(McKinnon SJ,Front Biosci 8：1140－56(2003)；Tatton等人，Surv Ophthalmol.48：S25－37(2003))中之潛在作用。然而，迄今尚未存在關於Aβ抑制劑是否可藉由實現視網膜保護及/或恢復而在治療黃斑退化中提供治療性益處之討論。此外，尚未存在關於Aβ同功異型物中之任一者是否可有差異地促進AMD發病機制之討論。
如上文所討論，Aβ為見於阿茲海默氏症中之神經炎斑的主要成份。Aβ為β類澱粉前驅蛋白質(βAPP或APP)之分裂產物。APP為一種含有大異位N末端域、跨膜域及小細胞質C末端尾部之I型跨膜醣蛋白。染色體21上單一APP基因轉錄之替代性拼接產生胺基酸數目不同之若干同功異型物。阿茲海默氏症中之先前研究已確定Aβ1－42 同功異型物對類澱粉沈積必不可少，且Aβ1－42 與Aβ1－40 相反可為阿茲海默氏症之發病機制中的引發分子(McGowan,E.等人，Neuron 47：191－199(2005))。阿茲海默氏症中之其他研究而且表明Aβ1-40 同功異型物可實際上抑制類澱粉沈積，且Aβ1－40 抑制劑可惡化阿茲海默氏症進程(Kim,J.等人，Neurobiology of Disease.27(3)：627－632(2007))。
本文中所揭示之本發明提供藉由投與治療有效量之抗體9TL或6G或由其衍生之抗體或多肽來預防及/或治療個體中眼科疾病之方法，該等眼科疾病諸如年齡相關黃斑退化(濕型及乾型)、青光眼、糖尿病性視網膜病變(包括糖尿病性黃斑水腫)、布魯赫膜破裂、近視退化、眼腫瘤及其他相關視網膜退化性疾病。抗體9TL及其衍生物已描述於WO 2006036291中，其揭示內容係以全文引用的方式併入本文中。用於所揭示方法中之抗體及多肽與Aβ1－40 之C末端結合。抗體6G及其衍生物已描述於WO 2006036291及WO 2006118959中，其揭示內容係以全文引用的方式併入本文中。本發明之方法意欲包括Aβ之所有抑制劑，其包括(但不限於)小分子化合物及生物製劑，諸如抗體、反義分子、siRNA分子及核糖核酸酶。
通用技術
除非另作說明，否則本發明之實施將採用在此項技術內之分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學之習知技術。此等技術係經充分解釋於諸如以下之文獻中：Molecular Cloning：A Laboratory Manual,second edition(Sambrook等人，1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編，1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology：A Laboratory Notebook(J.E.Cellis編，1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney編，1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather 及P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths及D.G.Newell編，1993－1998)J.Wiley and Sons；Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir及C.C.Blackwell編)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller及M.P.Calos編，1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人編，1987)；PCR：The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人編，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人編，1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway及P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies：a practical approach(D.Catty.編，IRL Press,1988－1989)；Monoclonal antibodies：a practical approach(P.Shepherd及C.Dean編，Oxford University Press,2000)；Using antibodies：a laboratory manual(E.Harlow及D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti及J.D.Capra編，Harwood Academic Publishers,1995)。
定義
"Aβ肽抑制劑"為能夠減少Aβ肽產生及/或沈積之任何藥劑。Aβ肽抑制劑包括(但不限於)抗體、反義分子、siRNA分子、核糖核酸酶或小分子化合物。此外，Aβ肽抑制劑為 能夠結合Aβ肽且減少Aβ斑沈積之任何藥劑，其包括能夠中斷類澱粉前驅蛋白質蛋白質裂解為產物Aβ肽之任何藥劑。抑制Aβ肽產生及沈積之其他目標包括(但不限於)例如能夠抑制或壓制β分泌酶(亦稱為BACE1或memapsin－2)或γ分泌酶複合物(其最低限度由四種個別蛋白質組成：早老素(presenilin)、尼卡斯群(nicastrin)、前咽缺陷1(APH－1)及早老素強化子2(PEN－2))的小分子治療劑或siRNA。
"抗體"為免疫球蛋白分子，其能夠經由至少一個位於免疫球蛋白分子之可變區的抗原識別位點來與諸如碳水化合物、聚核苷酸、脂質、多肽等之標靶特異性結合。如本文中所用，該術語不僅涵蓋完整多株或單株抗體，而且涵蓋其片段(諸如Fab、Fab'、F(ab')2 、Fv)、單鏈(ScFv)、其突變體、包含抗體部分之融合蛋白，及包含抗原識別位點之免疫球蛋白分子的任何其他修飾構型。抗體包括任何類別之抗體，諸如IgG、IgA或IgM(或其亞類)，且抗體不需屬於任何特定類別。視其重鏈之恆定域的抗體胺基酸序列而定，免疫球蛋白可歸於不同類別。存在五個主要類別之免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等者中之若干者可進一步分成亞類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。將對應於不同類別免疫球蛋白之重鏈恆定域分別稱作α、δ、ε、γ及μ。不同類別免疫球蛋白之次單位結構及三維構型係熟知的。
如本文中所用，"單株抗體"係指由大體上同類之抗體群體獲得之抗體，亦即包含該群體之個別抗體除可微量存在 之可能天然存在之突變外均相同。單株抗體為高度特異性的，其係針對單一抗原位點。而且，與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑相反，各單株抗體針對抗原上之單一決定子。修飾語"單株"表明抗體之特徵在於由抗體之大體上同類群體獲得，且不應理解為需要藉由任何特定方法來產生抗體。舉例而言，根據本發明欲使用之單株抗體可藉由首先由Kohler及Milstein,1975,Nature,256：495所述之融合瘤方法來製得，或可藉由諸如美國專利第4,816,567號中所述之重組DNA方法製得。單株抗體亦可自使用(例如)McCafferty等人，1990,Nature,348：552－554中所述技術產生之噬菌體庫分離。
如本文中所用，"人化"抗體係指非人類(例如鼠類)抗體形式，其為含有衍生自非人類免疫球蛋白之最小序列的特異性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2 或抗體之其他抗原結合子序列)。在極大程度上，人化抗體為其中來自接受者之互補決定區(CDR)之殘基係經來自非人類物種(供體抗體)之CDR之殘基置換的人類免疫球蛋白(接受者抗體)，該等非人類物種諸如具有所需特異性、親和性及能力之小鼠、大鼠或兔。在一些情況下，人類免疫球蛋白之Fv框架區(FR)殘基係經相應非人類殘基置換。此外，人化抗體可包含既未在接受者抗體中亦未在輸入CDR或框架序列中發現之殘基，但將其包括以進一步改善及優化抗體效能。一般而言，人化抗體將包含大體上所有之至少一個且通常二個可變域，其中 所有或大體上所有CDR區域均對應於非人類免疫球蛋白之彼等者且所有或大體上所有FR區域均為人類免疫球蛋白一致序列之彼等者。人化抗體最佳亦將包含至少一部分免疫球蛋白恆定區或域(Fc)，通常為人類免疫球蛋白之彼者。抗體可具有如WO 99/58572中所述經修飾之Fc區。其他形式之人化抗體具有一或多個相對於原始抗體係經改變之CDR(一、二、三、四、五、六個)，其亦稱為一或多個"衍生自"一或多個來自原始抗體之CDR的CDR。
如本文中所用，"人類抗體"意謂具有相應於由人類產生之抗體之胺基酸序列的胺基酸序及/或已使用此項技術中已知或本文中所揭示之製造人類抗體之技術中之任一者製得的抗體。人類抗體之此定義包括包含至少一個人類重鏈多肽或至少一個人類輕鏈多肽之抗體。一個如此之實例為包含鼠類輕鏈及人類重鏈多肽之抗體。可使用各種此項技術中已知之技術來製造人類抗體。在一實施例中，人類抗體係選自噬菌體庫，其中該噬菌體庫表現人類抗體(Vaughan等人，1996,Nature Biotechnology,14：309－314；Sheets等人，1998,PNAS,(USA)95：6157－6162；Hoogenboom及Winter,1991,J.Mol.Biol.,227：381；Marks等人，1991,J.Mol.Biol.,222：581)。人類抗體亦可藉由將人類免疫球蛋白基因座引入內源免疫球蛋白基因已部分或完全失活之轉殖基因動物(例如小鼠)中來製造。在美國專利第5,545,807號；第5,545,806號；第5,569,825號；第5,625,126號；第5,633,425號；及第5,661,016號中描述此 方法。或者，人類抗體可藉由永生化產生針對標靶抗原之抗體的人類B淋巴細胞來製備(此B淋巴細胞可自個體中回收或可經活體外免疫)。例如參見Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss，第77頁(1985)；Boerner等人，1991,J.Immunol.,147(1)：86－95；及美國專利第5,750,373號。
如本文中所用，術語"9TL"及"抗體9TL"可互換使用以指藉由保存號為ATCC PTA－6124及ATCC PTA－6125之表現載體產生之抗體。圖1中展示重鏈及輕鏈可變區之胺基酸序列。圖1中圖解地繪示抗體9TL(包括Chothia及Kabat CDR)之CDR部分。編碼重鏈及輕鏈可變區之聚核苷酸展示於SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10中。在實例中描述9TL之表微。
如本文中所用，術語"6G"及"抗體6G"可互換使用以指具有SEQ ID NO：36中所示之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：37中所示之輕鏈胺基酸序列的抗體。圖8中展示重鏈及輕鏈可變區之胺基酸序列。圖8中以圖解地繪示抗體6G(包括Chothia及Kabat CDR)之CDR部分。編碼重鏈及輕鏈之聚核苷酸展示於SEQ ID NO：38及SEQ ID NO：39中。在實例中描述6G之表徵。
術語"多肽"、"寡肽"、"肽"及"蛋白質"本文中可互換使用以指任何長度之胺基酸的聚合物。聚合物可為線性或支鏈，其可包含修飾胺基酸且其可雜有非胺基酸。該等術語亦涵蓋已經天然修飾或藉由干預來修飾之胺基酸聚合物； 例如雙硫鍵形成、糖基化、脂化、乙醯化、磷酸化或任何其他操作或修飾，諸如與標記組份接合。亦包括於定義內者例如為含有一或多個胺基酸類似物(例如包括非天然胺基酸等)之多肽以及此項技術中已知之其他修飾。應瞭解因為本發明之多肽係基於抗體，所以多肽可呈單鏈或相關鏈之形式出現。
如本文中可互換使用之"聚核苷酸"或"核酸"係指任何長度之核苷酸的聚合物，且包括DNA及RNA。核苷酸可為脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾核苷酸或鹼基及/或其類似物，或可藉由DNA或RNA聚合酶來併入聚合物中之任何受質。聚核苷酸可包含經修飾核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其類似物。若存在，則可在聚合物組裝之前或之後對核苷酸結構進行修飾。核苷酸之序列可雜有非核苷酸組份。在聚合之後可進一步修飾聚核苷酸，諸如藉由與標記組份接合來修飾。其他類型之修飾包括(例如)"蓋子(cap)"、以類似物取代天然存在之核苷酸中之一或多者、核苷酸間修飾，諸如具有不帶電鍵之修飾(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷醯胺酸酯、胺基甲酸酯等)及具有帶電鍵之修飾(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、含有側位部分之修飾(諸如蛋白質，例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚－L－離胺酸等)、具有嵌入劑之修飾(例如吖啶、補骨脂素等)、含有螯合劑之修飾(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化金屬等)、含有烷化劑之修飾、具有經修飾鍵之修飾(例如α－變旋異構核酸等)，以及聚核苷酸之未經修飾 形式。另外，通常存在於糖中之任何羥基可(例如)經膦酸酯基、磷酸酯基置換，經標準保護基保護，或經活化以製備與其他核苷酸之其他鍵，或可與固體支撐物接合。5'及3'末端OH可經磷酸化或經胺或具有1至20個碳原子之有機封端基團部分取代。其他羥基亦可衍生至標準保護基。聚核苷酸亦可含有此項技術中一般已知之類似形式之核糖或脫氧核糖，包括(例如)2'－O－甲基－、2'－O－烯丙基、2'－氟－或2'－疊氮基－核糖、碳環糖類似物、α－變旋異構糖、差向異構糖(諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖(sedoheptulose))、非環狀類似物及脫鹼基核苷類似物，諸如甲基核糖苷。一或多個磷酸二酯鍵可經替代性鍵聯基團置換。此等替代性鍵聯基團包括(但不限於)其中磷酸根經P(O)S("硫代酯")、P(S)S("二硫代酯")、(O)NR2 ("醯胺酸酯")、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2 ("甲縮醛")置換之實施例，其中R或R'各自獨立地為H或經取代或未經取代之視情況含有醚（－O－)鍵的烷基(1－20個C)、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烷基。聚核苷酸中並非所有鍵均需相同。先前描述適用於本文中所提及之所有聚核苷酸，包括RNA及DNA。
抗體之"可變區"係指單獨或呈組合形式之抗體輕鏈之可變區或抗體重鏈之可變區。重鏈及輕鏈之可變區各由四個藉由三個亦稱為高變區之互補判定區(CDR)連接之框架區(FR)組成。各鏈中之CDR由FR緊密保持在一起，且與來自其他鏈之CDR一起促成抗體之抗原結合位點之形成。存在 至少兩種測定CDR之技術：(1)基於交叉物種序列可變性之方法(亦即，Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，(第五版，1991,National Institutes of Health,Bethesda MD))；及(2)基於抗原抗體複合物之結晶學研究之方法(Al－lazikani等人(1997)J.Molec.Biol.273：927－948))。如本文中所用，CDR可係指由任一方法或由兩方法之組合界定之CDR。
抗體之"恆定區"係指單獨或呈組合形式之抗體輕鏈之恆定區或抗體重鏈之恆定區。
與抗體或多肽"優先結合"或"特異性結合"(本文中可互換使用)之抗原決定基為此項技術中充分瞭解之術語，且在此項技術中亦熟知測定此特異性或優先結合之方法。與分子與替代性細胞或物質之反應或締合相比，若分子更頻繁、更迅速、以更大持續時間及/或更大親和性與特定細胞或物質反應或締合，則將該分子稱為展現"特異性結合"或"優先結合"。與抗體與其他物質之結合相比，若抗體以更大親和性、親和力、更容易及/或以更大持續時間與標靶結合，則抗體與標靶"特異性結合"或"優先結合"。舉例而言，與Aβ1－40 抗原決定基特異性或優先結合之抗體為與其與其他Aβ1－40 抗原決定基或非Aβ1－40 抗原決定基之結合相比，其以更大親和性、親和力、更容易及/或更大持續時間與此抗原決定基結合之抗體。藉由閱讀此定義亦應瞭解(例如)與第一標靶特異性或優先結合之抗體(或部分或抗原決定基)可與或可不與第二標靶特異性或優先結合。因 此，"特異性結合"或"優先結合"未必需要(儘管其可包括)獨佔結合。大體而言，(但並非一定)提及結合意謂優先結合。
如本文中所用，"大體上純"係指至少50%純(亦即無污染物)、更佳至少90%純、更佳至少95%純、更佳至少98%純、更佳至少99%純之物質。
"宿主細胞"包括可為或已為用於併入聚核苷酸插入物之載體接受者的個別細胞或細胞培養物。宿主細胞包括單一宿主細胞之子代，且由於天然、偶然或故意突變，子代可不必完全與原始親本細胞相同(在形態學或染色體組DNA補體方面)。宿主細胞包括以本發明之聚核苷酸活體內轉染之細胞。
術語"Fc區"用以定義免疫球蛋白重鏈之C末端區域。"Fc區"可為天然序列Fc區或變異Fc區。儘管免疫球蛋白重鏈之Fc區的邊界可改變，但人類IgG重鏈Fc區通常定義為自位置Cys226之胺基酸殘基或自Pro230至其羧基末端之伸展。Fc區中之殘基編號為如在Kabat中EU指數之編號。Kabat等人，Sequences of Proteins of Imunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991。免疫球蛋白之Fc區一般包含兩個恆定域：CH2及CH3。
如本文中所用，"Fc受體"及"FcR"描述與抗體之Fc區結合的受體。較佳FcR為天然序列人類FcR。此外，較佳FcR為結合IgG抗體之FcR(γ受體)且包括FcγRI、FcγRII及 FcγRIII亞類受體，包括此等受體之對偶基因變異體及替代性拼接形式。FcγRII受體包括FcγRHA("活化受體")及FcγRIIB("抑制受體")，其具有主要在其細胞質域中存在不同之類似胺基酸序列。FcR係綜述於Ravetch及Kinet,1991,Ann.Rev.Immunol.,9：457－92；Capel等人，1994,Immunomethods,4：25－34；及de Haas等人，1995,J.Lab.Clin.Med.,126：330－41中。"FcR''亦包括新生兒受體FcRn，其負責將母體IgG轉移至胎兒(Guyer等人，1976,J.Immunol.,117：587；及Kim等人，1994,J.Immunol.,24：249)。
"補體依賴細胞毒性"及"CDC"係指在補體存在下將標靶溶胞。藉由將補體系統之第一組份(C1q)結合於與同源抗原複合之分子(例如抗體)來引發補體活化路徑。為評定補體活化，可進行CDC檢定，例如，如Gazzano－Santoro等人，J.Immunol.Methods,202：163(1996)中所述進行。
"功能性Fc區"具有天然序列Fc區之至少一種效應功能。例示性"效應功能"包括C1q結合；補體依賴細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴細胞介導細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體；BCR)之調降等。此等效應功能一般需要Fc區與結合域(例如抗體可變域)組合且可使用各種此項技術中已知用以評估此等抗體效應功能之檢定來評定。
"天然序列Fc區"包含與自然界中發現之Fc區之胺基酸序列一致之胺基酸序列。"變異Fc區"包含由於至少一個胺基 酸修飾而不同於天然序列Fc區之胺基酸序列、然而保持天然序列Fc區之至少一種效應功能的胺基酸序列。與天然序列Fc區相比或與親本多肽之Fc區相比，變異Fc區在天然序列Fc區中或在親本多肽之Fc區中較佳具有至少一個胺基酸取代，例如約一至約十個胺基酸取代，且較佳約一至約五個胺基酸取代。本文中變異Fc區將與天然序列Fc區及/或與親本多肽之Fc區較佳具有至少約80%序列一致性，且最佳與其具有至少約90%序列一致性，更佳與其具有至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%序列一致性。
如本文中所用，"抗體依賴細胞介導細胞毒性"及"ADCC"係指細胞介導反應，其中表現Fc受體(FcR)之非特異性細胞毒性細胞(例如自然殺手(NK)細胞、嗜中性白血球及巨噬細胞)識別標靶細胞上之結合抗體且隨後引起標靶細胞之溶胞。可使用活體外ADCC檢定來評定所關注分子的ADCC活性，諸如美國專利第5,500,362號或第5,821,337號中所述之檢定。用於此等檢定之適用效應細胞包括周圍血液單核細胞(PBMC)及NK細胞。或者或另外，例如在動物模型中可活體內評定所關注分子的ADCC活性，諸如Clynes等人，1998,PNAS(USA),95：652－656中所揭示之動物模型。
如本文中所用，"有效劑量"或"有效量"之藥物、化合物或醫藥組合物為足以實現有利或所需結果之量。對於預防性用途而言，有利或所需結果包括諸如消除或減小風險、 減輕嚴重程度或延遲疾病發作之結果，該發作包括疾病之生物化學、組織及/或行為症狀，在疾病發展期間呈現之其併發症及中間病理學表型。對於治療性用途而言，有利或所需結果包括(但不限於)諸如保護或恢復視網膜功能或保持或復原視敏度之臨床結果。有效劑量可以一或多個投藥來投與。為達成本發明之目的，有效劑量之藥物、化合物或醫藥組合物為足以直接或間接地實現預防性或治療性治療之量。如在臨床情形中瞭解，有效劑量之藥物、化合物或醫藥組合物可與或可不與另一藥物、化合物或醫藥組合物聯合來達成。因此，在投與一或多種治療劑之情形下可考慮"有效劑量"，且若與一或多種其他藥劑聯合，所需結果可達成或已達成，則可視為單一藥劑係以有效量給出。
如本文中所用，"治療"為獲得有利或所需結果(包括臨床結果)之方法。為達成本發明之目的，有利或所需臨床結果包括(但不限於)復原、預防或保護視網膜功能。
"Aβ肽之生物作用"或"Aβ生物活性"意謂Aβ在眼科疾病中之作用，其可為直接或間接作用，且不受理論限制包括Aβ在脂質輸送調節異常中之涉入。間接作用包括(但不限於)Aβ對視網膜功能及視敏度起作用。
如本文中所用，"延遲"眼科疾病之發展意謂推遲、阻礙、減緩、推延、穩定及/或延期疾病之發展。視疾病史及/或所治療之個體而定，此延遲可具有變化之時間長度。如對熟習此項技術者而言顯而易見，足夠或顯著延遲 可實際上涵蓋預防，因為個體並不發展該疾病。"延遲"眼科疾病發展之方法為當與不使用該方法相比時，在給定時間框架內減小疾病發展機率及/或在給定時間框架內減小疾病程度之方法。此等比較通常係基於臨床研究，使用統計上顯著數目之個體。
眼科疾病之"發展"意謂個體中眼科疾病之發作及/或進展。使用如本文所述之標準臨床技術可偵測眼科疾病之發展。然而，發展亦係指最初可能不可偵測之疾病進展。為達成本發明之目的，在此情況下，進展係指如由標準眼科檢查(ophthalmogical examination)或藉由較專業化測試來測定之疾病病況的生物學過程。多種診斷性測試包括(但不限於)視野、視敏度、螢光血管攝影術(fluorescein angiography)、視網膜電圖、光學同步斷層攝影法(OCT)、視覺誘發電位(VEP)、靛氰綠、色彩視覺、阿姆斯勒方格表(Amsler grid)、眼內壓及熟習此項技術者已知之其他診斷工具。AMD之診斷性測試尤其包括(但不限於)視敏度、眼底檢查(fundoscopic examination)、螢光血管攝影術、靛氰綠及眼同步斷層攝影法(OCT)。"發展"包括出現、復發及發作。如本文中所用，眼科疾病之"發作"或"出現"包括初始發作及/或復發。
如本文中所用，"保護"視網膜功能係指穩定或保持視網膜功能。如本文中所用，"恢復"視網膜功能係指在先前損害之後復原視網膜功能。視網膜功能之保護或恢復可藉由量測統計上顯著結果(亦即p<0.05)來測定，如藉由上述眼 科診斷工具中之任一者來量測，尤其諸如視敏度、視網膜電圖、視野、眼底檢查、螢光血管攝影術、靛氰綠及眼同步斷層攝影法(OCT)。舉例而言，如下文實例4中所示，統計上顯著之視網膜功能保護或恢復係由視網膜電圖中b波振幅恢復來展示(p＝0.008)。
視敏度之"保持"或"復原"可藉由標準視力表以及此項技術中熟知之多種眼科診斷工具來量測。
如本文中所用，"聯合"投藥包括同時投藥及/或在不同時間投藥。聯合投藥亦涵蓋以共調配物來投藥或以獨立組合物來投藥。如本文中所用，聯合投藥意謂涵蓋向個體投與抗Aβ抗體與另一藥劑之任何狀況，其可同時及/或獨立發生。如本文中進一步討論，應瞭解可以不同給藥頻率或間隔來投與抗Aβ抗體及其他藥劑。舉例而言，抗Aβ抗體可每週投與，而其他藥劑可較不頻繁地投與。應瞭解可使用同一投藥途徑或不同投藥途徑來投與抗Aβ抗體及其他藥劑。
"生物試樣"涵蓋多種自個體獲得之試樣類型且可用於診斷或監測檢定。該定義涵蓋生物源之血液及其他液體試樣、固體組織試樣，諸如活組織檢查樣品或組織培養物或由此衍生之細胞及其子代。該定義亦包括在取得其之後以任何方式操作之試樣，諸如藉由以試劑處理、溶解或某些組份(諸如蛋白質或聚核苷酸)之富集或包埋於半固體或固體基質中以達成切片目的。術語"生物試樣"涵蓋臨床試樣，且亦包括培養物中之細胞、細胞上澄液、細胞溶胞 物、血清、血漿、生物流體，及組織試樣。
"個體"(或者稱為"受檢者")為哺乳動物，更佳為人類。哺乳動物亦包括(但不限於)農畜(諸如牛)、體育動物、寵物(諸如貓、狗、馬)、靈長類動物、小鼠及大鼠。
如本文中所用，"載體"意謂一種構築物，其能夠在宿主細胞中傳遞且較佳能夠表現一或多種所關注基因或序列。載體之實例包括(但不限於)病毒載體、裸DNA或RNA表現載體、質體、黏質體或噬菌體載體、與陽離子縮合劑相關之DNA或RNA表現載體、囊封於脂質體中之DNA或RNA表現載體，及某些真核細胞，諸如生產細胞。
如本文中所用，"表現控制序列"意謂指引核酸轉錄之核酸序列。表現控制序列可為諸如組成性或誘導性啟動子之啟動子，或強化子。表現控制序列係與待轉錄之核酸序列可操作地連接。
如本文中所用，"醫藥學上可接受之載劑"包括當與活性成份組合時使該成份保持生物活性且對個體之免疫系統為非反應性的任何物質。實例包括(但不限於)標準醫藥載劑中之任一者，諸如磷酸鹽緩衝生理食鹽水溶液、水、諸如油/水乳液之乳液及多種類型之濕潤劑。用於噴霧劑或非經腸投藥之較佳稀釋劑為磷酸鹽緩衝生理食鹽水或生理(0.9%)食鹽水。包含此等載劑之組合物係藉由熟知習知方法來調配(例如參見Remington's Pharmaceutical Sciences ，第18版，A.Gennaro編，Mack publishing Co.,Easton,PA,1990；及Remington,The Science and Practice of Phαrmαcy 第20版，Mack Publishing,2000)。
如本文中所用之術語"kon "意欲指抗體與抗原締合之締合速率常數(on rate constant)。
如本文中所用之術語"koff "意欲指抗體自抗體/抗原複合物解離之解離速率常數(off rate constant)。
如本文中所用之術語"KD "意欲指抗體－抗原相互作用之平衡解離常數。
組合物及組合物之製造方法
抗Aβ抗體及多肽： I.抗體9TL及9TL衍生抗體及多肽 本發明涵蓋組合物，包括醫藥組合物，其包含抗體9TL及表3中所示之其變異體或衍生自抗體9TL及表3中所示之其變異體的多肽；及包含編碼9TL抗體及其變異體或多肽之序列的聚核苷酸。如本文中所用，組合物包含一或多種與Aβ1－40 之C末端結合的抗體或多肽(其可為或可不為抗體)及/或一或多種包含編碼一或多種與Aβ1－40 之C末端結合的抗體或多肽之序列的聚核苷酸。此等組合物可另外包含合適賦形劑，諸如醫藥學上可接受之賦形劑，包括緩衝劑，其在此項技術中係熟知的。
本發明之抗體及多肽特徵在於以下特徵中之任一者(一或多者)：(a)與Aβ1－40 之C末端肽28－40結合，但並不顯著與Aβ1－42 或Aβ1－43 結合；(b)與Aβ1－40 之C末端肽33－40結合；(c)抑制在個體中形成類澱粉斑；(d)減少個體眼睛中之類澱粉斑；(e)治療、預防、改善一或多種眼科疾病症狀，該眼科 疾病包括(但不限於)年齡相關黃斑退化(乾型及濕型)、青光眼、糖尿病性視網膜病變(包括黃斑水腫)及其他相關視網膜退化性疾病；(f)產生視網膜功能之顯著保護或恢復；及(g)產生視敏度之顯著保持或復原。
與其他所報導抗Aβ抗體相比，本發明之抗體及多肽亦可展現所需安全概況。
因此，本發明提供以下各物中之任一者，或包含以下各物中之任一者之組合物(包括醫藥組合物)：(a)抗體9TL或表3中所示之其變異體；(b)抗體9TL或表3中所示之其變異體的片段或區域；(c)抗體9TL或表3中所示之其變異體的輕鏈；(d)抗體9TL或表3中所示之其變異體的重鏈；(e)來自抗體9TL或表3中所示之其變異體的輕鏈及/或重鏈之一或多個可變區；(f)抗體9TL或表3中所示之其變異體的一或多個CDR(一、二、三、四、五或六個CDR)；(g)來自抗體9TL之重鏈的CDR H3；(h)來自抗體9TL或表3中所示之其變異體的輕鏈之CDR L3；(i)來自抗體9TL或表3中所示之其變異體的輕鏈之三個CDR；(j)來自抗體9TL或表3中所示之其變異體的重鏈之三個CDR；(k)來自抗體9TL或表3中所示之其變異體的輕鏈之三個CDR及來自抗體9TL或表3中所示之其變異體的重鏈之三個CDR；及(l)包含(b)至(k)中之任一者之抗體。本發明亦提供包含以上各物中之任何一或多者之多肽。
圖1中圖解地繪示抗體9TL(包括Chothia及Kabat CDR)之CDR部分。CDR區域之測定係充分在此項技術內。應瞭解 在一些實施例中，CDR可為Kabat與Chothia CDR之組合(亦稱為"組合CDR"或"擴展CDR")。在一些實施例中，CDR為Kabat CDR。在其他實施例中，CDR為Chothia CDR。換言之，在具有一種以上CDR之實施例中，CDR可為Kabat、Chothia、組合CDR或其組合中之任一者。
在一些實施例中，本發明提供一種多肽(其可為或可不為抗體)，其包含大體上與9TL或表3中所示之其變異體的至少一個CDR、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個或所有六個CDR一致之至少一個CDR、至少兩個、至少三個或至少四個、至少五個或所有六個CDR。其他實施例包括具有大體上與9TL之至少兩個、三個、四個、五個或六個CDR一致或衍生自9TL之至少兩個、三個、四個、五個或六個CDR的抗體。在一些實施例中，該至少一個、二個、三個、四個、五個或六個CDR與9TL或表3中所示之其變異體的至少一個、二個、三個、四個、五個或六個CDR至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。應瞭解，為達成本發明之目的，儘管活性程度與9TL或表3中所示之其變異體相比可改變(可更大或更小)，但一般保持結合特異性及/或總體活性。
本發明亦提供一種多肽(其可為或可不為抗體)，其包含9TL或表3中所示之其變異體的胺基酸序列，該胺基酸序列具有以下各物中之任一者：9TL或表3中所示之其變異體之序列的至少5個鄰接胺基酸、至少8個鄰接胺基酸、至少約10個鄰接胺基酸、至少約15個鄰接胺基酸、至少約20個鄰 接胺基酸、至少約25個鄰接胺基酸、至少約30個鄰接胺基酸，其中該等胺基酸中之至少3者係來自9TL(圖1)或表3中所示之其變異體的可變區。在一實施例中，可變區係來自9TL之輕鏈。在另一實施例中，可變區係來自9TL之重鏈。例示性多肽具有來自9TL之重鏈及輕鏈可變區之鄰接胺基酸(上述長度)。在另一實施例中，5個(或5個以上)鄰接胺基酸係來自圖1中所示之9TL的互補判定區(CDR)。在一些實施例中，鄰接胺基酸係來自9TL之可變區。
II.抗體6G及6G衍生抗體及多肽 本發明另外提供治療眼科疾病之方法，其包含投與與Aβ1－40 、Aβ1－42 及Aβ1－43 結合之抗體或多肽。在一些實施例中，抗體或多肽以比其與Aβ1－42 及Aβ1－43 結合更高之親和性與Aβ1－40 結合。在一些實施例中，抗體與Aβ1－36 、Aβ1－37 、Aβ1－38 及Aβ1－39 結合。在一些實施例中，抗體與Aβ22－35 結合。在一些實施例中，抗體與Aβ28－40 結合。在一些實施例中，抗體或多肽與包括胺基酸25－34及40之Aβ1－40 上之抗原決定基結合。
本發明亦提供治療眼科疾病之方法，其包含投與醫藥組合物，該等醫藥組合物包含本文所述之抗體或多肽中之任一者(諸如抗體6G及表8中所示之其變異體或衍生自抗體6G及表8中所示之其變異體的多肽)；或本文所述之聚核苷酸。如本文中所用，組合物包含一或多種與Aβ1－40 之C末端結合的抗體或多肽(其可為或可不為抗體)及/或一或多種包含編碼一或多種與Aβ1－40 之C末端結合的抗體或多肽之序列 的聚核苷酸。此等組合物可另外包含合適賦形劑，諸如醫藥學上可接受之賦形劑，包括緩衝劑，其在此項技術中係熟知的。
本發明之抗體及多肽特徵在於以下特徵中之任一者(一或多者)：(a)與Aβ1－40 、Aβ1－42 及Aβ1－43 結合；(b)與Aβ1－40 、Aβ1－42 及Aβ1－43 結合，其中與Aβ1－40 結合之親和性高於與Aβ1－42 及Aβ1－43 結合之親和性；(c)與包括胺基酸25－34及40之Aβ1－40 上之抗原決定基結合；(d)與Aβ1－36 、Aβ1－37 、Aβ1－38 及Aβ1－39 結合，但與其與Aβ1－40 之結合相比具有較低親和性；(e)以小於約1 μM之KD 與Aβ22－37 結合；(f)與Aβ22－35 結合；(g)與Aβ28－40 結合；(h)並不與表現於細胞中之APP結合；(i)減少個體眼睛中之類澱粉斑；(j)治療、預防、改善一或多種眼科疾病症狀，該眼科疾病包括(但不限於)年齡相關黃斑退化(乾型及濕型)、青光眼、糖尿病性視網膜病變(包括黃斑水腫)及其他相關視網膜退化性疾病；(k)產生視網膜功能之顯著保護或恢復；及(l)產生視敏度之顯著保持或復原。本發明之抗體及多肽亦可具有本文所述之削弱效應功能。與其他所報導抗Aβ抗體相比，具有削弱效應功能之抗體及多肽可展現所需安全概況。舉例而言，本發明之組合物可能不引起顯著或不可接受水率之以下各項中之任何一或多者：腦維管結構中出血(腦出血)；腦膜腦炎(包括變換磁共振掃描)；腦脊髓液中白血球計數升高；中樞神經系統炎症。
因此，本發明提供以下各物中之任一者，或包含以下各 物中之任一者之組合物(包括醫藥組合物)：(a)抗體6G或表8中所示之其變異體；(b)抗體6G或表8中所示之其變異體的片段或區域；(c)抗體6G或表8中所示之其變異體的輕鏈；(d)抗體6G或表8中所示之其變異體的重鏈；(e)來自抗體6G或表8中所示之其變異體的輕鏈及/或重鏈之一或多個可變區；(f)抗體6G或表8中所示之其變異體的一或多個CDR(一、二、三、四、五或六個CDR)；(g)來自抗體6G之重鏈的CDR H3；(h)來自抗體6G或表8中所示之其變異體的輕鏈之CDR L3；(i)來自抗體6G或表8中所示之其變異體的輕鏈之三個CDR；(j)來自抗體6G或表8中所示之其變異體的重鏈之三個CDR；(k)來自抗體6G或表8中所示之其變異體的輕鏈之三個CDR及來自抗體6G或表8中所示之其變異體的重鏈之三個CDR；及(l)包含(b)至(k)中之任一者之抗體。本發明亦提供包含以上各物中之任何一或多者之多肽。
圖8中圖解地繪示抗體6G(包括Chothia及Kabat CDR)之CDR部分。CDR區域之測定係充分在此項技術內。
在一些實施例中，本發明提供一種多肽(其可為或可不為抗體)，其包含大體上與6G或表8中所示之其變異體的至少一個CDR、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個或所有六個CDR一致之至少一個CDR、至少兩個、至少三個或至少四個、至少五個或所有六個CDR。其他實施例包括具有大體上與6G之至少兩個、三個、四個、五個或六個CDR一致或衍生自6G之至少兩個、三個、四個、五個或六 個CDR的抗體。在一些實施例中，該至少一個、二個、三個、四個、五個或六個CDR與6G或表8中所示之其變異體的至少一個、二個、三個、四個、五個或六個CDR至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。應瞭解，為達成本發明之目的，儘管活性程度與6G或表8中所示之其變異體相比可改變(可更大或更小)，但一般保持結合特異性及/或總體活性。
本發明亦提供一種多肽(其可為或可不為抗體)，其包含6G或表8中所示之其變異體的胺基酸序列，該胺基酸序列具有以下各物中之任一者：6G或表8中所示之其變異體之序列的至少5個鄰接胺基酸、至少8個鄰接胺基酸、至少約10個鄰接胺基酸、至少約15個鄰接胺基酸、至少約20個鄰接胺基酸、至少約25個鄰接胺基酸、至少約30個鄰接胺基酸，其中該等胺基酸中之至少3者係來自6G(圖8)或表8中所示之其變異體的可變區。在一實施例中，可變區係來自6G之輕鏈。在另一實施例中，可變區係來自6G之重鏈。例示性多肽具有來自6G之重鏈及輕鏈可變區之鄰接胺基酸(上述長度)。在另一實施例中，5個(或5個以上)鄰接胺基酸係來自圖8中所示之6G的互補判定區(CDR)。在一些實施例中，鄰接胺基酸係來自6G之可變區。
如下文所述之例示性實施例，本發明之抗體及多肽的結合親和性可變化且不需為(但可為)一個特定值或範圍。本發明之抗體及多肽對Aβ肽(包括或Aβ1－40 、Aβ1－42 或Aβ1－43 肽)之結合親和性(KD )可為約0.10 nM至約0.80 nM，約0.15 nM至約0.75 nM及約0.18 nM至約0.72 nM。在一些實施例中，結合親和性為約2 pM、約5 pM、約10 pM、約15 pM、約20 pM、約40 pM或大於約40 pM。在一個實施例中，結合親和性在約2 pM與22 pM之間。在其他實施例中，結合親和性小於約10 nM、約5 nM、約1 nM、約900 pM、約800 pM、約700 pM、約600 pM、約500 pM、約400 pM、約300 pM、約200 pM、約150 pM、約100 pM、約90 pM、約80 pM、約70 pM、約60 pM、約50 pM、約40 pM、約30 pM、約10 pM。在一些實施例中，結合親和性為約10 nM。在其他實施例中，結合親和性小於約10 nM、小於約50 nM、小於約100 nM、小於約150 nM、小於約200 nM、小於約250 nM、小於約500 nM或小於約1000 nM。在其他實施例中，結合親和性小於約5 nM。在其他實施例中，結合親和性小於約1 nM。在其他實施例中，結合親和性為約0.1 nM或約0.07 nM。在其他實施例中，結合親和性小於約0.1 nM或小於約0.07 nM。在其他實施例中，結合親和性為約10 nM、約5 nM、約1 nM、約900 pM、約800 pM、約700 pM、約600 pM、約500 pM、約400 pM、約300 pM、約200 pM、約150 pM、約100 pM、約90 pM、約80 pM、約70 pM、約60 pM、約50 pM、約40 pM、約30 pM、約10 pM中之任一者至約2 pM、約5 pM、約10 pM、約15 pM、約20 pM或約40 pM中之任一者。在一些實施例中，結合親和性為約10 nM、約5 nM、約1 nM、約900 pM、約800 pM、約700 pM、約600 pM、約 500 pM、約400 pM、約300 pM、約200 pM、約150 pM、約100 pM、約90 pM、約80 pM、約70 pM、約60 pM、約50 pM、約40 pM、約30 pM、約10 pM中之任一者。在其他實施例中，結合親和性為約2 pM、約5 pM、約10 pM、約15 pM、約20 pM、約40 pM或大於約40 pM。本發明之抗體或多肽可與Aβ1－40 、Aβ1－42 及/或Aβ1－42 肽之組合結合。在一個實施例中，抗體或多肽與至少Aβ1－40 及Aβ1－42 肽結合。
本發明之抗體及多肽亦可與Aβ1－36 、Aβ1－37 、Aβ1－38 、Aβ1－39 、Aβ1－42 及Aβ1－43 中之任何一或多者結合，但在一些實施例中，對此等肽中之任何一或多者之結合親和性小於其對Aβ1－40 之結合親和性。在一些實施例中，抗體或多肽與Aβ1－36 、Aβ1－37 、Aβ1－38 、Aβ1－39 、Aβ1－42 及Aβ1－43 中之任何一或多者之KD 為與Aβ1－40 之KD 之至少約5倍、至少約10倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約80倍、至少約100倍、至少約150倍、至少約200倍或至少約250倍。
本發明亦提供製造此等抗體或多肽中之任一者之方法。本發明之抗體可藉由此項技術中已知之程序來製造。多肽可藉由抗體之蛋白水解或其他降解、藉由如上所述之重組方法(亦即單一或融合多肽)或藉由化學合成來製造。藉由化學合成便利地製得抗體之多肽，尤其至多約50個胺基酸之較短多肽。化學合成方法係在此項技術中已知且可購得。舉例而言，藉由採用固相方法之自動化多肽合成器可 製造抗體。亦參見美國專利第5,807,715號；第4,816,567號；及第6,331,415號。
在另一替代方法中，可使用此項技術中熟知之程序以重組方式製得抗體。在一實施例中，聚核苷酸包含編碼抗體之重鏈及/或輕鏈可變區之序列。在另一實施例中，將包含核苷酸序列之聚核苷酸選殖入一或多個用於表現或繁殖之載體中。可將編碼所關注抗體之序列保持於宿主細胞中之載體中且可接著將宿主細胞擴增且冷凍以備後用。本文進一步描述載體(包括表現載體)及宿主細胞。
本發明亦涵蓋本發明之抗體(諸如9TL及6G)的單鏈可變區片段("scFv")。藉由使用短連接肽來連接輕鏈及/或重鏈可變區，從而製得單鏈可變區片段。Bird等人(1988)Science 242：423－426。連接肽之實例為(GGGGS)3 ，其橋接一可變區之羧基末端與另一可變區之胺基末端之間約3.5 nm。已設計且使用其他序列之連接子。Bird等人(1988)。連接子可又經修飾以獲其他功能，諸如藥物附接或附接於固體支撐物。可以重組或合成方式製造單鏈變異體。為合成式製造scFv，可使用自動化合成器。為重組製造scFv，可將含有編碼scFv之聚核苷酸的合適質體引入合適宿主細胞中，該宿主細胞可為真核的，諸如酵母、植物、昆蟲或哺乳動物細胞；或為原核的，諸如大腸桿菌(E.coli)。編碼所關注scFv之聚核苷酸可藉由諸如聚核苷酸連接反應之常規操作來製得。使用此項技術中已知之標準蛋白質純化技術可分離所得scFv。
亦涵蓋其他形式之單鏈抗體，諸如雙功能抗體。雙功能抗體為二價、雙特異性抗體，其中VH及VL域係表現於單一多肽鏈上，但使用過短而無法使同一鏈上之兩個域之間成對的連接子，藉此迫使該等域與另一鏈之互補域成對且產生兩個抗原結合位點(例如參見Holliger,P.等人(1993)Proc.Natl.Acad Sci.USA 90：6444－6448；Poljak,R.J.等人(1994)Structure 2：1121－1123)。
舉例而言，可使用本文中所揭示之抗體來製備雙特異性抗體(對至少兩種不同抗原(亦即Aβ1－40 及Aβ1－42 )具有結合特異性之單株抗體)。此項技術中已知製造雙特異性抗體之方法(例如參加Suresh等人，1986,Methods in Enzymology 121：210)。傳統上，重組製造雙特異性抗體係基於兩個免疫球蛋白重鏈－輕鏈對(其中兩個重鏈具有不同特異性)的共表現(Millstein及Cuello,1983,Nature 305,537－539)。
根據一種製得雙特異性抗體之方法，將具有所需結合特異性(抗體－抗原組合位點)之抗體可變域與免疫球蛋白恆定域序列融合。較佳與包含鉸鏈區、CH2及CH3區中之至少部分之免疫球蛋白重鏈恆定域融合。其較佳具有含有輕鏈結合所必需之位點(存在於融合中之至少一者中)的第一重鏈恆定區(CH1)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合及(若需要)免疫球蛋白輕鏈之DNA插入獨立表現載體中且共轉染於合適宿主生物體中。在該構築中所使用之三個多肽鏈之不等比率提供最適產率的實施例中，此舉提供調節三個多肽片段之相互比例的高靈活性。然而，當等比率之至少兩個多 肽鏈之表現產生高產率時或當比率不具有特定重要性時，可能在一表現載體中插入兩個或所有三個多肽鏈之編碼序列。
在一方法中，雙特異性抗體包含在一臂中具有第一結合特異性之雜合免疫球蛋白重鏈，及在另一臂中之雜合免疫球蛋白重鏈－輕鏈對(提供第二結合特異性)。在僅一半雙特異性分子中具有免疫球蛋白輕鏈之此不對稱結構促進所需雙特異性化合物與非所需免疫球蛋白鏈組合之分離。在1994年3月3日公開之PCT公開案第WO 94/04690號中描述此方法。
包含兩個共價連接抗體之異源接合抗體亦在本發明之範疇內。此等抗體已用以使免疫系統細胞靶向非所需細胞(美國專利第4,676,980號)且用於治療HIV感染(PCT申請公開案第WO 91/00360號及第WO 92/200373號；EP 03089)。可使用任何便利交聯方法來製得異源接合抗體。合適交聯劑及技術在此項技術中係熟知的且描述於美國專利第4,676,980號中。
亦可使用合成蛋白質化學之已知方法(包括涉及交聯劑之方法)來活體外製備嵌合或雜合抗體。舉例而言，使用二硫化物交換反應或藉由形成硫醚鍵可構築免疫毒素。用於此目的之合適試劑的實例包括亞胺基硫醇鹽及甲基－4－巰基丁酸醯亞胺酯。
可使用此項技術中已知之任何方法來製得包含抗體9TL之一或多個CDR或衍生自抗體9TL之一或多個CDR的人化 抗體。舉例而言，四個通用步驟可用以將單株抗體人化。該等步驟為：(1)測定起始抗體輕鏈及重鏈可變域之核苷酸及預測胺基酸序列，(2)設計人化抗體，亦即決定在人化過程期間使用何種抗體框架區，(3)實際人化方法/技術，及(4)人化抗體之轉染及表現。例如參見美國專利第4,816,567號；第5,807,715號；第5,866,692號；第6,331,415號；第5,530,101號；第5,693,761號；第5,693,762號；第5,585,089號；第6,180,370號；第5,225,539號；第6,548,640號。
在重組人化抗體中，可修飾Fc部分以避免與Fcγ受體及補體免疫系統相互作用。此類型之修飾係由Cambridge University之Department of Pathology的Mike Clark博士設計，且在1999年11月18日公開之WO 99/58572中描述製備此等抗體之技術。
舉例而言，若將抗體用於人類之臨床試驗及治療，則可將恆定區設計為更類似於人類恆定區以避免免疫反應。例如參見美國專利第5,997,867號及第5,866,692號。
本發明涵蓋對抗體9TL及6G之修飾，包括並不顯著影響其特性之功能等效抗體及具有增強或減小活性及/或親和性之變異體。舉例而言，抗體9TL或6G之胺基酸序列可經突變以獲得對標靶Aβ肽具有所需結合親和性之抗體。多肽修飾為此項技術中之常規實踐且無需在本文中詳細描述。將多肽修飾例示於實例中。經修飾多肽之實例包括具有胺基酸殘基保守性取代之多肽、並不顯著不利地改變功能活 性之一或多個缺失或添加胺基酸或使用化學類似物。
胺基酸序列插入包括長度範圍介於一個殘基至含有一百個或更多殘基之多肽之間的胺基末端及/或羧基末端融合以及單一或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N末端甲硫胺醯基殘基之抗體或與抗原決定基標籤融合之抗體。抗體分子之其他插入變異體包括抗體之N末端或C末端與酶或多肽的融合，其增大抗體之血清半衰期。
取代變異體具有至少一個在所移除抗體分子中之胺基酸殘基及插入其位置中之不同殘基。雖然最關注之用於取代性突變誘發的位點包括高變區，但亦涵蓋FR改變。表1中在標題"保守性取代"下展示保守性取代。若此等取代引起生物活性改變，則可引入在表1中稱為"例示性取代"或如下文參考胺基酸類進一步描述之更實質性變化且篩檢產物。
藉由選擇對維持以下各者之作用顯著不同之取代來實現抗體之生物特性之實質性修飾：(a)取代區域內之多肽主鏈結構，例如呈片狀或螺旋構形，(b)標靶位點處之分子之電荷或疏水性，或(c)側鏈之堆積。基於常見側鏈特性，將天然存在之殘基分組：(1)非極性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)不帶電之極性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性(帶負電荷)：Asp、Glu；(4)鹼性(帶正電荷)：Lys、Arg；(5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；及(6)芳族：Trp、Tyr、Phe、His。
藉由將此等類別中一者之成員交換為另一類別來達成非保守性取代。
任何不涉及保持抗體之適當構形之半胱胺酸殘基通常亦可經絲胺酸取代以改良分子之氧化穩定性且防止異常交聯。相反地，可將半胱胺酸鍵添加至抗體中以改良其穩定性，尤其當抗體為諸如Fv片段之抗體片段時。
胺基酸修飾可介於改變或修飾一或多種胺基酸至完全重 設計諸如可變區之區域之間。可變區之改變可改變結合親和性及/或特異性。在一些實施例中，不多於一至五個保守性胺基酸取代係在CDR域內達成。在其他實施例中，不多於一至三個保守性胺基酸取代係在CDR域內達成。在再其他實施例中，CDR域為CDR H3及/或CDR L3。
修飾亦包括糖基化及非糖基化多肽以及具有其他轉譯後修飾之多肽，該等轉譯後修飾諸如用不同糖之糖基化、乙醯化及磷酸化。抗體係在其恆定區中之保守位置處糖基化(Jefferis及Lund,1997,Chem.Immunol.65：111－128；Wright及Morrison,1997,TibTECH 15：26－32)。免疫球蛋白之寡醣側鏈影響蛋白質之功能(Boyd等人，1996,Mol.Immunol.32：1311－1318；Wittwe及Howard,1990,Biochem.29：4175－4180)及在醣蛋白部分之間的分子內相互作用(其可影響醣蛋白之構形及所呈現之三維表面)(Hefferis及Lund，同上；Wyss及Wagner,1996,Current Opin.Biotech.7：409－416)。寡醣亦可用以使給定醣蛋白基於特異性識別結構靶向某些分子。亦已報導抗體之糖基化影響抗體依賴細胞毒性(ADCC)。詳言之，已報導具有β(1,4)－N－乙醯基葡糖胺基轉移酶III(GnTIII)(催化對分GlcNAc之形成的糖基轉移酶)之四環素調節表現的CHO細胞改良ADCC活性(Umana等人，1999,Mature Biotech.17：176－180)。
抗體之糖基化通常為N連接型或O連接型。N連接型係指將碳水化合物部分附接於天冬醯胺酸殘基之側鏈。三肽序列天冬醯胺酸－X－絲胺酸、天冬醯胺酸－X－蘇胺酸及天冬醯 胺酸－X－半胱胺酸(其中X為除脯胺酸外之任何胺基酸)為用於碳水化合物部分酶促附接於天冬醯胺酸側鏈之識別序列。因此，在多肽中存在此等三肽序列中之任一者產生潛在糖基化位點。O－連接型糖基化係指糖N－乙醯基半乳胺糖、半乳糖或木糖中之一者附接於羥基胺基酸，最常見為絲胺酸或蘇胺酸，儘管亦可使用5－羥基脯胺酸或5－羥基離胺酸。
藉由改變胺基酸序列使得其含有上述三肽序列中之一或多者來便利地實現添加糖基化位點至抗體(針對N連接型糖基化位點)。該改變亦可藉由向原始抗體之序列添加一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基或用一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基取代來達成(針對O連接型糖基化位點)。
亦可在不改變根本核苷酸序列的情況下改變抗體之糖基化模式。糖基化很大程度上係視用以表現抗體之宿主細胞而定。儘管細胞類型用於表現重組醣蛋白(例如抗體)，但因為潛在治療劑很少為天然細胞，所以可預期抗體之糖基化模式變化(例如參見Hse等人，1997,J.Biol.Chem.272：9062－9070)。
除宿主細胞選擇之外，在抗體重組製造期間影響糖基化之因素包括生長模式、培養基調配物、培養物密度、氧合作用、pH值、純化方案及其類似因素。已提出各種方法來改變在特定宿主生物體中達成之糖基化模式，其包括引入或過度表現涉入寡醣產生之某些酶(美國專利第5,047,335號；第5,510,261號及第5,278,299號)。可以酶促方式自醣 蛋白中移除糖基化或某些類型之糖基化，例如使用內切糖苷酶H(Endo H)、如實例3中所述之N－糖苷酶F、內切糖苷酶F1、內切糖苷酶F2、內切糖苷酶F3來移除。另外，重組宿主細胞可經遺傳設計以在加工某些類型之多醣中為有缺陷的。在此項技術中熟知此等及類似技術。
其他修飾方法包括使用此項技術中已知之偶合技術，其包括(但不限於)酶促方式、氧化取代及螯合。可(例如)針對免疫檢定之附接標記使用修飾。經修飾9TL多肽係使用此項技術中之已建立程序製得且可使用此項技術中已知之標準檢定來篩檢，其中一些在下文及實例中描述。
在本發明之一些實施例中，抗體包含經修飾恆定區，諸如免疫上惰性或部分惰性之恆定區，例如並不觸發補體介導溶胞、並不刺激抗體依賴細胞介導細胞毒性(ADCC)或並不活化微神經膠質細胞；或在以下各項中之任何一或多者中具有減小之活性(與未修飾抗體相比)：觸發補體介導溶胞、刺激抗體依賴細胞介導細胞毒性(ADCC)或活化微神經膠質細胞。恆定區之不同修飾可用以達成效應功能之最佳水準及/或組合。例如參見Morgan等人，Immunology 86：319－324(1995)；Lund等人，J .Immunology 157：4963－9157：4963－4969(1996)；Idusogie等人，J .Immunology 164：4178－4184(2000)；Tao等人，J .Immunology 143：2595－2601(1989)；及Jefferis等人，Immunological Reviews 163：59－76(1998)。在一些實施例中，如Eur.J.Immunol.(1999)29：2613－2624；PCT申請案第 PCT/GB99/01441號；及/或英國專利申請案第9809951.8號中所述來修飾恆定區。在其他實施例中，抗體包含人類重鏈IgG2a恆定區，該恆定區包含以下突變：A330P331至S330S331(參考野生型IgG2a序列之胺基酸編號)。Eur.J.Immunol.(1999)29：2613－2624。在再其他實施例中，恆定區係針對N連接糖基化而去糖基化。在一些實施例中，藉由使糖基化胺基酸殘基突變或側接作為恆定區中N－糖基化識別序列之部分的殘基，從而使恆定區針對N連接糖基化而去糖基化。舉例而言，N－糖基化位點N297可突變至A、Q、K或H。參見Tao等人，J .Immunology 143：2595－2601(1989)；及Jefferis等人，Immunologicαl Reviews 163：59－76(1998)。在一些實施例中，恆定區係針對N連接糖基化而去糖基化。以酶促方式(諸如藉由酶PNGase來移除碳水化合物)或藉由表現於糖基化缺乏宿主細胞中，從而可使恆定區針對N連接糖基化而去糖基化。
其他抗體修飾包括已如1999年11月18日公開之PCT公開案第WO 99/58572號中所述來修飾之抗體。除針對標靶分子之結合域外，此等抗體包含具有大體上與人類免疫球蛋白重鏈之恆定域的全部或部分同源之胺基酸序列的效應域。此等抗體能夠結合標靶分子，而不觸發顯著補體依賴溶胞，或標靶之細胞介導破壞。在一些實施例中，效應域能夠特異性結合FcRn及/或FcγRIIb。此等者通常係基於衍生自兩個或兩個以上人類免疫球蛋白重鏈CH 2域之嵌合域。以此方式修飾之抗體尤其適用於慢性抗體療法以避免 對習知抗體療法之發炎性及其他不利反應。
本發明包括親和性成熟實施例。舉例而言，可藉由此項技術中已知之程序來製造親和性成熟抗體(Marks等人，1992,Bio/Technology,10：779－783；Barbas等人，1994,Proc Nat.Acad.Sci,USA 91：3809－3813；Schier等人，1995,Gene,169：147－155；Yelton等人，1995,J.Immunol.,155：1994－2004；Jackson等人，1995,J.Immunol.,154(7)：3310－9；Hawkins等人，1992,J.Mol.Biol.,226：889－896；及WO 2004/058184)。
以下方法可用於調節抗體之親和性且用於表徵CDR。一種表徵抗體之CDR及/或改變(諸如改良)諸如抗體之多肽之結合親和性的方法稱為"庫掃描突變誘發(library scanning mutagenesis)"。大體而言，庫掃描突變誘發如下工作。使用此項技術認可之方法，將CDR中之一或多個胺基酸位置經兩個或兩個以上(諸如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個)胺基酸置換。藉此產生小型純系庫(在一些實施例中，對於每個經分析之胺基酸位置為一個)，其各具有兩個或兩個以上成員之複雜性(complexity)(若兩個或兩個以上胺基酸在每個位置經取代)。大體而言，該庫亦包括包含天然(未經取代)胺基酸之純系。將來自各庫之少量純系(例如約20－80個純系(視庫之複雜性而定))針對對標靶多肽(或其他結合標靶)之結合親和性篩檢，且鑑定具有增大、相同、減小或無結合之候選物。在此項技術中熟知測定結合親和性之方法。可使 用BIAcore表面電漿共振分析來測定結合親和性，該分析偵測約2倍或更大之結合親和性差異。當起始抗體已以相對較高親和性結合時，例如約10 nM或10 nM以下之KD ，BIAcore尤其適用。在本文實例中描述使用BIAcore表面電漿共振之篩檢。
可使用Kinexa Biocensor、閃爍鄰近檢定(scintillation proximity assay)、ELISA、ORIGEN免疫檢定(IGEN)、螢光猝減、螢光轉移及/或酵母呈現來測定結合親和性。亦可使用合適生物檢定來篩檢結合親和性。
在一些實施例中，使用此項技術認可之突變誘發方法(其中一些在本文中描述)，將CDR中之每個胺基酸位置經所有20種天然胺基酸置換(在一些實施例中一次一種)。藉此產生小型純系庫(在一些實施例中，對於每個經分析之胺基酸位置為一個)，其各具有20成員之雜性(若所有20個胺基酸均在每個位置經取代)。
在一些實施例中，待篩檢之庫包含在兩個或兩個以上位置之取代，其可在同一CDR中或在兩個或兩個以上CDR中。因此，庫可包含在一個CDR中之兩個或兩個以上位置之取代。庫可包含在兩個或兩個以上CDR中之兩個或兩個以上位置之取代。庫可包含在3、4、5個或5個以上位置之取代，該等位置見於二、三、四、五或六個CDR中。可使用低冗餘密碼子來製備取代。例如參見Balint等人，(1993)Gene 137(1)：109－18)之表2。
CDR可為CDRH3及/或CDRL3。CDR可為CDRL1、 CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2及/或CDRH3中一或多者。CDR可為Kabat CDR、Chothia CDR或擴展CDR。
可為具有改良結合之候選物定序，藉此鑑定引起改良親和性(亦稱為"改良"取代)之CDR取代突變體。亦可為結合之候選物定序，藉此鑑定保持結合之CDR取代。
可進行多輪篩檢。舉例而言，具有改良結合之候選物(各包含在一或多個CDR之一或多個位置的胺基酸取代)亦適用於設計在各改良CDR位置(亦即，CDR中之胺基酸位置，於此處取代突變體展示改良之結合)含有至少原始及經取代胺基酸的第二庫。下文進一步討論此庫之製備及篩檢或選擇。
庫掃描突變誘發亦提供表徵CDR之方式，至於具有改良結合、相同結合、減小結合或無結合之純系的頻率亦提供與各胺基酸位置對抗體－抗原複合物穩定性之重要性有關之資訊。舉例而言，若CDR之位置在改變為所有20個胺基酸時保持結合，則將該位置鑑定為不太可能為抗原結合所需之位置。相反地，若CDR之位置在僅小百分比之取代中保持結合，則將該位置鑑定為對CDR功能重要之位置。因此，庫掃描突變誘發方法產生關於CDR中可改變為多種不同胺基酸(包括所有20種胺基酸)之位置及CDR中不能改變或僅能改變為少數胺基酸之位置的資訊。
具有改良親和性之候選物可在第二庫中組合，視所需庫之複雜性而定，其包括在該位置之改良胺基酸、原始胺基酸，且可另外包括在該位置之其他取代，或允許使用所需 篩檢或選擇方法。另外，若需要，則相鄰胺基酸位置可對至少兩種或兩種以上胺基酸隨機化。相鄰胺基酸之隨機化可允許突變CDR中之額外構形靈活性，其可又允許或促進引入較大數目之改良突變。庫亦可包含在第一輪篩檢中並不展示改良親和性之位置的取代。
使用此項技術中已知之任何方法，包括使用BIAcore表面電漿共振分析之篩檢及使用在選擇技術中已知之任何方法(包括噬菌體呈現、酵母呈現及核糖體呈現)的選擇來針對具有改良及/或改變結合親和性之庫成員篩檢或選擇第二庫。
本發明亦涵蓋包含來自本發明之抗體(諸如9TL及6G)或多肽之一或多個片段或區域的融合蛋白。在一實施例中，提供一種融合多肽，其包含可變輕鏈區之至少10個鄰接胺基酸及/或所示可變重鏈區之至少10個胺基酸。在其他實施例中，提供一種融合多肽，其包含可變輕鏈區之至少約10個、至少約15個、至少約20個、至少約25個或至少約30個鄰接胺基酸；及/或可變重鏈區之至少約10個、至少約15個、至少約20個、至少約25個或至少約30個鄰接胺基酸。在另一實施例中，融合多肽包含9TL或6G之輕鏈可變區及/或重鏈可變區。在另一實施例中，融合多肽包含9TL或6G之一或多個CDR。在再其他實施例中，融合多肽包含抗體9TL或6G之CDR H3及/或CDR L3。為達成本發明之目的，9TL或6G融合蛋白分別含有一或多個9TL或6G抗體，及在天然分子中不附接於其之另一胺基酸序列，例如來自 另一區域之異源序列或同源序列。例示性異源序列包括(但不限於)"標籤"，諸如FLAG標籤或6His標籤。標籤在此項技術中係熟知的。
可藉由此項技術中已知之方法，例如以合成或重組方式來產生融合多肽。儘管本發明之融合蛋白亦可藉由此項技術中已知之其他方式來製備，例如包括化學合成，但通常使用本文所述之重組方法，藉由製備表現編碼其之聚核苷酸來製造本發明之融合蛋白。
本發明亦提供包含與促進與固體支撐物偶合之藥劑(諸如生物素或抗生物素蛋白)接合(例如連接)的抗體或多肽之組合物。為簡單起見，通常將針對抗體而提及，然應瞭解此等方法適用於本文所述之Aβ結合實施例中之任一者。接合通常係指如本文中所述連接此等組份。可在任何多種方法中達成連接(其一般為以鄰近締合方式將此等組份固定至少以便投藥)。舉例而言，當各具有能夠與其他者反應之取代基時，在藥劑與抗體之間的直接反應為可能的。舉例而言，諸如胺基或硫氫基之親核基團一方面可能夠與諸如酐或醯基鹵之含羰基基團反應或另一方面可能夠與含有良好脫離基(例如鹵基)之烷基反應。
本發明之抗體或多肽可與標記劑(或者稱為"標記")連接，該等標記諸如螢光分子、放射性分子之或此項技術中已知之任何其他標記。標記在此項技術中係已知的，其一般(直接或間接)提供信號。
本發明亦提供組合物(包括醫藥組合物)及套組，其包含 抗體9TL或6G，及如本揭示案所闡明，本文所述之任何或所有抗體及/或多肽。
具有削弱效應功能之抗Aβ肽抗體及多肽 本發明之方法使用與β－類澱粉(Aβ)肽特異性結合且具有削弱效應功能之抗體或多肽(包括包含該等抗體或多肽之醫藥組合物)。該等抗體及多肽之其他特徵在於以下特徵中之任一者(一或多者)：(a)抑制在個體中形成類澱粉斑；(b)減少個體眼睛中之類澱粉斑；(c)治療、預防、改善一或多種眼科疾病症狀，該眼科疾病包括(但不限於)年齡相關黃斑退化(乾型及濕型)、青光眼、糖尿病性視網膜病變(包括黃斑水腫)及其他相關視網膜退化性疾病；(d)產生視網膜功能之顯著保護或恢復；及(e)產生視敏度之顯著保持或復原。
本文所述之抗體及多肽可展現所需安全概況，舉例而言，本發明之組合物並不引起顯著或不可接受水準或具有減小水準之以下各項中之任何一或多者：腦維管結構中出血(腦出血)；腦膜腦炎(包括變換磁共振掃描)；腦脊髓液中白血球計數升高；中樞神經系統炎症。
如本文中所用，具有"削弱效應功能"(與"免疫上惰性"或"部分免疫上惰性"可互換使用)之抗體或多肽係指並不具有任何效應功能或具有減小效應功能活性(與具有未修飾或天然存在恆定區之抗體或多肽相比)之抗體或多肽，例如其在以下各項之任何一或多者中不具有活性或具有減小之活性：a)觸發補體介導溶胞；b)刺激抗體依賴細胞介導細 胞毒性(ADCC)；及c)活化微神經膠質細胞。效應功能活性可減少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%及100%中之任一者。在一些實施例中，抗體與β－類澱粉肽結合，而不觸發顯著補體依賴溶胞，或標靶之細胞介導破壞。舉例而言，恆定區上之Fc受體結合位點可經修飾或突變以移除或減小對某些Fc受體(諸如cγRI、FcγRII及/或FcγRIII)之結合親和性。為簡單起見，將針對抗體而提及，然應瞭解實施例亦適用於多肽。將EU編號系統(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest；第5版，Public Health Service,National Institutes of Healthy,Bethesda,Md.,1991)用以指示(例如IgG抗體之)恆定區之哪個胺基酸殘基係經改變或突變。該編號可用於特定類型之抗體(例如IgG1)或物種(例如人類)，然應瞭解可橫跨各類型之抗體及物種達成類似改變。
在一些實施例中，與Aβ肽特異性結合之抗體包含具有削弱效應功能之重鏈恆定區。重鏈恆定區可具有天然存在之序列或為變異體。在一些實施例中，天然存在之重鏈恆定區的胺基酸序列係經突變，例如藉由胺基酸取代、插入及/或缺失來突變，藉此削弱恆定區之效應功能。在一些實施例中，重鏈恆定區之Fc區的N－糖基化亦可改變，例如可完全或部分移除，藉此削弱恆定區之效應功能。
在一些實施例中，藉由移除抗Aβ肽之Fc區(例如在IgG之CH 2域中)之N－糖基化來削弱效應功能。在一些實施例 中，藉由使糖基化胺基酸殘基突變或側接作為恆定區中糖基化識別序列之部分的殘基來移除Fc區之N－糖基化。三肽序列天冬醯胺酸－X－絲胺酸(N－X－S)、天冬醯胺酸－X－蘇胺酸(N－X－T)及天冬醯胺酸－X－半胱胺酸(N－X－C)(其中X為除脯胺酸外之任何胺基酸)為用於碳水化合物部分酶促附接於天冬醯胺酸側鏈以達成N－糖基化之識別序列。恆定區中三肽序列中胺基酸中之任一者的突變產生糖基化IgG。舉例而言，人類IgG1及IgG3之N－糖基化位點N297可突變為A、D、Q、K或H。參見Tao等人，J .Immunoloｇｙ 143：2595－2601(1989)；及Jefferis等人，Immunological Reviews 163：59－76(1998)。已報導具有以Gln、His或Lys取代Asn－297之人類IgG1及IgG3並不與人類FcγRI結合且並不活化補體，其中C1q結合能力對IgG1而言完全喪失且對於IgG3而言顯著減小。在一些實施例中，三肽序列中胺基酸N突變為以下胺基酸中之任一者：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、Y。在一些實施例中，三肽序列中胺基酸N突變為保守性取代。在一些實施例中，三肽序列中胺基酸X突變為脯胺酸。在一些實施例中，三肽序列中胺基酸S突變為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、V、W、Y。在一些實施例中，三肽序列中胺基酸T突變為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、V、W、Y。在一些實施例中，三肽序列中胺基酸C突變為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、V、W、Y。在一些實施例中，三肽後 之胺基酸突變為P。在一些實施例中，以酶促方式(諸如，如實例3中所述之N－糖苷酶F、內切糖苷酶F1、內切糖苷酶F2、內切糖苷酶F3及內切糖苷酶H)移除恆定區中之N－糖基化。亦可藉由在具有N－糖基化缺乏之細胞株中產生抗體來達成N－糖基化之移除。Wright等人，J Immunol.160(7)：3393－402(1998)。
在一些實施例中，與附接於恆定區之N－糖基化位點的寡醣相互作用之胺基酸殘基係經突變以減小對FcγRI之結合親和性。舉例而言，可將人類IgG3之F241、V264、D265突變。參見Lund等人，J .Immunology 157：4963－4969(1996)。
在一些實施例中，藉由如PCT WO 99/58572及Armour等人，Molecular Immunology 40：585－593(2003)；Reddy等人，J .Immunology 164：1925－1933(2000)中所述修飾區域(諸如人類IgG之233－236、297及/或327－331)來削弱效應功能。除針對標靶分子之結合域外，PCT WO 99/58572及Armour等人所述之抗體包含具有大體上與人類免疫球蛋白重鏈之恆定區的全部或部分同源之胺基酸序列的效應域。此等抗體能夠結合標靶分子，而不觸發顯著補體依賴溶胞，或標靶之細胞介導破壞。在一些實施例中，效應域對FcγRI、FcγRIIa及FcγRIII具有減小之親和性。在一些實施例中，效應域能夠特異性結合FcRn及/或FcγRIIb。此等者通常係基於衍生自兩個或兩個以上人類免疫球蛋白重鏈CH 2域之嵌合域。以此方式修飾之抗體尤其適用於慢性抗 體療法以避免對習知抗體療法之發炎性及其他不利反應。在一些實施例中，抗體之重鏈恆定區為具有以下突變中之任一者之人類重鏈IgG1：1)A327A330P331至G327S330S331；2)E233L234L235G236至P233V234A235，其中G236缺失；3)E233L234L235至P233V234A235；4)E233L234L235G236A327A330p331至P233V234A235G327S330S331，其中G236缺失；5)E233L234L235A327A330P331至P233V234A235G327S330S331；及6)N297至A297或除N外之任何其他胺基酸。在一些實施例中，抗體之重鏈恆定區為具有以下突變之人類重鏈IgG2：A330P331至S330S331。在一些實施例中，抗體之重鏈恆定區為具有以下突變中之任一者之人類重鏈IgG4：E233F234L235G236至P233V234A235，其中G236缺失；E233F234L235至P233V234A235；及S228L235至P228E235。
抗體之恆定區亦可經修飾以削弱補體活化。舉例而言，藉由使C1結合基元(例如，C1q結合基元)中恆定區中之胺基酸殘基突變，在補體之C1組份之結合之後，IgG抗體之補體活化可減少。已報導人類IgG1之D270、K322、P329、P331中之每一者之Ala突變顯著減小抗體與C1q結合及活化補體之能力。對於鼠類IgG2b而言，C1q結合基元構成殘基E318、K320及K322。Idusogie等人，J .Immunology 164：4178－4184(2000)；Duncan等人，Nature 322：738－740(1988)。
成信針對鼠類IgG2b而鑑定之C1q結合基元E318、K320 及K322對於其他抗體同型而言為常見的。Duncan等人，Nature 322：738－740(1988)。藉由以在其側鏈上具有不當言能基之殘基置換三個指定殘基中之任一者，可消除對IgG2b之C1q結合活性。不必需僅以Ala置換離子殘基來消除C1q結合。亦可能使用其他經烷基取代之非離子殘基(諸如Gly、Ile、Leu或Val)或諸如Phe、Tyr、Trp及Pro之芳族非極性殘基來代替三個殘基中之任一者以消除C1q結合。另外，亦可能使用諸如Ser、Thr、Cys及Met之極性非離子殘基來代替殘基320及322(但不代替318)以消除Clq結合活性。
本發明亦提供具有削弱效應功能之抗體，其中該抗體具有經修飾鉸鏈區。藉由修飾鉸鏈區可調節人類IgG對其Fc受體之結合親和性。Canfield等人，J .ExP .Med .173：1483－1491(1991)；Hezareh等人，J .Virol .75：12161－12168(2001)；Redpath等人，Human Immunology 59：720－727(1998)。特異性胺基酸殘基可突變或缺失。經修飾鉸鏈區可包含衍生自與CH1域之類別或亞類不同之抗體類別或亞類的抗體之完整鉸鏈區。舉例而言，IgG抗體類別之恆定域(CH1)可附接於IgG4抗體類別之鉸鏈區。或者，新鉸鏈區可包含部分天然鉸鏈或重複單元，其中重複之各單元係衍生自天然鉸鏈區。在一些實施例中，藉由將一或多個半胱胺酸殘基轉化為諸如丙胺酸之中性殘基或藉由將適當置放之殘基轉化為半胱胺酸殘基來改變天然鉸鏈區。美國專利第5,677,425號。使用此項技術認可之蛋白質化學且 較佳使用遺傳工程技術及如本文中所述來進行此等改變。
與Aβ肽特異性結合且與具有削弱效應功能之重鏈恆定區融合的多肽亦可用於本文所述之方法。在一些實施例中，多肽包含衍生自抗體9TL或表3中所示之其變異體的序列。在一些實施例中，多肽衍生自與Aβ肽結合之單域抗體。單域抗體可使用此項技術中已知之方法產生。Omidfar等人，Tumour Biol .25：296－305(2004)；Herring等人，Trends in Biotechnology 21：484－489(2003)。
在一些實施例中，抗體或多肽不為F(ab')2 片段。在一些實施例中，抗體或多肽不為Fab片段。在一些實施例中，抗體或多肽不為單鏈抗體scFv。在一些實施例中，抗體或多肽為聚乙二醇化F(ab')2 片段。在一些實施例中，抗體或多肽為聚乙二醇化Fab片段。在一些實施例中，抗體或多肽為聚乙二醇化單鏈抗體scFv。
亦可使用此項技術中已知之製造具有削弱效應功能之抗體的其他方法。
具有經修飾恆定區之抗體及多肽可在一或多個檢定中測試以評估與起始抗體相比生物活性之效應功能減小水準。舉例而言，具有經改變Fc區之抗體或多肽結合補體或Fc受體(例如微神經膠質細胞上之Fc受體)或經改變鉸鏈區之能力可使用本文中所揭示之檢定以及任何此項技術認可之檢定來評定。PCT WO 99/58572；Armour等人，Molecular Immunology 40：585－593(2003)；Reddy等人，J.Immunology 164：1925－1933(2000)；Song等人，Infecrion and Immunity 70：5177－5184(2002)。
在一些實施例中，與β類澱粉特異性結合之抗體為多株抗體。在一些實施例中，抗體為單株抗體。在一些實施例中，抗體為人類抗體。在一些實施例中，抗體為嵌合抗體。在一些實施例中，抗體為人化抗體。在一些實施例中，抗體為靈長化抗體。例如參見Yocum等人，J .Rheumatol .25：1257－62(1998)；Bugelski等人，Human & Experimental Toxicoloy 19：230－243(2000)。在一些實施例中，藉由突變將抗體去免疫化以使抗體並不活化人類免疫系統。例如參見Nanus等人，J .Urology 170：S84－S89(2003)。
如本文中所用，Aβ肽包括類澱粉前驅蛋白質之酶促分裂產物之任何片段。舉例而言，Aβ肽包括Aβ1－40 、Aβ1－42 或Aβ1－43 之任何片段；及經各種數目之胺基酸在Aβ1－40 、Aβ1－42 或Aβ1－43 之N末端或C末端截短之肽。本文中所用之胺基酸編號係基於對Aβ1－43 (SEQ ID NO：17)之編號。
在一些實施例中，抗體或多肽與Aβ肽之殘基1－16內之抗原決定基特異性結合。在一些實施例中，抗體或多肽與Aβ肽之殘基16－28內之抗原決定基特異性結合。在一些實施例中，抗體或多肽與Aβ1－40 肽之殘基28－40內之抗原決定基特異性結合。在一些實施例中，抗體或多肽與Aβ1－42 肽之殘基28－42內之抗原決定基特異性結合。在一些實施例中，抗體或多肽與Aβ1－43 肽之殘基28－43內之抗原決定基特異性結合。在一些實施例中，抗體或多肽與Aβ肽特異性結 合，而未與全長類澱粉前驅蛋白質(APP)結合。在一些實施例中，抗體或多肽與Aβ之聚集形式特異性結合，而未與可溶形式結合。在一些實施例中，抗體或多肽與Aβ之可溶形式特異性結合，而未與聚集形式結合。在一些實施例中，抗體或多肽與Aβ之聚集形式及可溶形式特異性結合。在此項技術中已知與Aβ之各種聚集形式結合之抗體，例如，與類澱粉β衍生可擴散配位體(ADDL)結合之抗體；與類澱粉原纖維及/或沈積物結合之抗體。WO 03/104437；美國公開案第2003/0147887號；美國公開案第2004/0219146號。
在一些實施例中，抗體或多肽包含一、二或三個來自3D6免疫球蛋白輕鏈(美國公開案第2003/0165496號或第2004/0087777號中之SEQ ID NO：2)之CDR及/或一、二或三個來自3D6免疫球蛋白重鏈(美國公開案第2003/0165496號或第2004/0087777號中之SEQ ID NO：4)之CDR。在一些實施例中，抗體或多肽包含如美國公開案第2003/0165496號中SEQ ID NO：8中闡明之可變重鏈區及如美國公開案第2003/0165496號中SEQ ID NO：5中闡明之可變輕鏈區。在一些實施例中，抗體或多肽包含如美國公開案第2003/0165496號中SEQ ID NO：12中闡明之可變重鏈區及如美國公開案第2003/0165496號中SEQ ID NO：11中闡明之可變輕鏈區。在一些實施例中，抗體或多肽包含一、二或三個來自10D5免疫球蛋白輕鏈(在美國公開案第2003/0165496號或第2004/0087777號中之SEQ ID NO：14)之 CDR及/或一、二或三個來自10D5免疫球蛋白重鏈(在美國公開案第2003/0165496號或第2004/0087777號中之SEQ ID NO：16)之CDR。
在一些實施例中，抗體或多肽與Aβ1－40 之殘基33－40內之抗原決定基特異性結合。在一些實施例中，抗體或多肽與包括胺基酸35－40之Aβ1－40 上之抗原決定基特異性結合。在一些實施例中，抗體或多肽與包括胺基酸36－40之Aβ1－40 上之抗原決定基特異性結合。在一些實施例中，抗體或多肽與包括胺基酸39及/或40之Aβ1－40 上之抗原決定基特異性結合。在一些實施例中，抗體或多肽與Aβ1－40 特異性結合，但並不與Aβ1－42 及/或Aβ1－43 特異性結合。在一些實施例中，抗體或多肽為本文所述之抗體9TL或衍生自9TL的抗體或多肽。在一些實施例中，抗體或多肽競爭地抑制抗體9TL及/或衍生自9TL之抗體或多肽與Aβ1－40 之結合。在一些實施例中，抗體不為PCT WO 2004/032868中所述之抗體2286。在其他實施例中，抗體或多肽為本文所述之抗體6G或衍生自6G的抗體或多肽。在一些實施例中，抗體或多肽競爭地抑制抗體6G及/或衍生自6G之抗體或多肽與Aβ1－40 及Aβ1－42 之結合。在一些實施例中，抗體不為US 2004/0146512及WO 04/032868中所述之抗體2294。如WO 2006118959中所述，抗體2294與極類似於抗體6G之抗原決定基結合。
在此項技術中已知且在本文中描述製造抗體及多肽之方法。
藉由識別相同或空間上疊蓋之抗原決定基，可將競爭檢定用以測定兩個抗體是否結合同一抗原決定基，或一抗體競爭地抑制另一抗體與抗原之結合。此等檢定在此項技術中係已知的。通常將抗原固定於多孔板上且量測未標記抗體阻斷標記抗體結合之能力。此等競爭檢定之常見標記為放射性標記或酶標記。
聚核苷酸、載體及宿主細胞
本發明亦提供編碼本發明之抗體及多肽(包括包含圖1及圖8中所示之輕鏈及重鏈可變區的多肽序列之抗體)的分離聚核苷酸，及包含該聚核苷酸之載體及宿主細胞。
因此，本發明提供聚核苷酸(或組合物，包括醫藥組合物)，其包含編碼以下各物中之任一者之聚核苷酸：(a)抗體9TL或6G或表3及表8中所示之其變異體；(b)抗體9TL或6G或表3及表8中所示之其變異體的片段或區域；(c)抗體9TL或6G或表3及表8中所示之其變異體的輕鏈；(d)抗體9TL或6G或表3及表8中所示之其變異體的重鏈；(e)來自抗體9TL或6G或表3及表8中所示之其變異體的輕鏈及/或重鏈之一或多個可變區；(f)抗體9TL或6G或表3及表8中所示之其變異體的一或多個CDR(一、二、三、四、五或六個CDR)；(g)來自抗體9TL或6G之重鏈的CDR H3；(h)來自抗體9TL或6G或表3及表8中所示之其變異體的輕鏈CDR L3；(i)來自抗體9TL或6G或表3及表8中所示之其變異體的輕鏈之三個CDR；(j)來自抗體9TL或6G或表3及表8中所示之其變異體的重鏈之三個CDR；(k)夾自抗體9TL或6G或表3及 表8中所示之其變異體的輕鏈之三個CDR及來自抗體9TL或6G或表3及表8中所示之其變異體的重鏈之三個CDR；及(l)包含(b)至(k)中之任一者之抗體。在一些實施例中，聚核苷酸包含SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：35中所示之聚核苷酸中之任一者或兩者。
在另一態樣中，本發明提供編碼本文所述之抗體(包括抗體片斷)及多肽(諸如具有削弱效應功能之抗體及多肽)中之任一者之聚核苷酸。可藉由此項技術中已知之程序製得聚核苷酸。
在另一態樣中，本發明提供組合物(諸如醫藥組合物)，其包含本發明之聚核苷酸中之任一者。在一些實施例中，組合物包含表現載體，該表現載體包含編碼如本文中所述之9TL抗體的聚核苷酸。在其他實施例中，組合物包含表現載體，該表現載體包含編碼本文所述之抗體或多肽中之任一者的聚核苷酸。在再其他實施例中，組合物包含SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10中所示之聚核苷酸中之任一者或兩者。本文進一步描述表現載體，及聚核苷酸組合物之投藥。
在另一態樣中，本發明提供一種製造本文所述之聚核苷酸中之任一者的方法。
本發明亦涵蓋與任何此等序列互補之聚核苷酸。聚核苷酸可為單鏈(編碼或反義)或雙鏈且可為DNA(染色體組DNA、cDNA或合成DNA)或RNA分子。RNA分子包括含有內含子且以一對一方式對應於DNA分子之HnRNA分子及不 含有內含子之mRNA分子。其他編碼或非編碼序列可(但不必需)存在於本發明之聚核苷酸內，且聚核苷酸可(但不必需)與其他分子及/或支撐材料連接。
聚核苷酸可包含天然序列(亦即編碼抗體或其部分之內源序列)或可包含此序列之變異體。聚核苷酸變異體含有一或多個取代、添加、缺失及/或插入，使得經編碼多肽之免疫反應性相對於天然免疫反應性分子並不減小。一般可如本文中所述來評定對經編碼多肽之免疫反應性的影響。變異體較佳展現與編碼天然抗體或其部分之聚核苷酸序列至少約70%一致性，更佳至少約80%一致性且最佳至少約90%一致性。
若在如下所述針對最大對應性對準時，在兩個序列中之核苷酸或胺基酸之序列相同，則將兩個聚核苷酸或多肽序列稱為"一致"。通常藉由在比較視窗上比較序列以鑑定且比較序列相似性之局部區域，從而進行兩個序列之間的比較。如本文中所用之"比較視窗"係指至少約20個鄰接位置之區段(通常30至約75個，40至約50個)，其中兩個序列經最佳對準之後，序列可與具有相同數目之鄰接位置的參考序列相比。
用於比較之序列的最佳對準可使用生物資訊學軟體(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)之Lasergene套裝中之Megalign程式，使用預設參數來進行。此程式體現以下參考文獻中所述之若干對準方案：Dayhoff,M.O.(1978)A model of evolutionary change in proteins－Matrices for detecting distant relationships。在Dayhoff,M.O.(編)Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical Research Foundation,Washington DC第5卷，Suppl.3，第345－358頁；Hein J.,1990,Unified Approach to Alignment and Phylogenes，第626－645頁；Methods in Enzymology，第183卷，Academic Press,Inc.,San Diego,CA；Higgins,D.G.及Sharp,P.M.,1989,CABIOS 5：151－153；Myers,E.W.及Muller W.,1988,CABIOS 4：11－17；Robinson,E.D.,1971,Comb.Theor.11：105；Santou,N.,Nes,M.,1987,Mol.Biol.Evol.4：406－425；Sneath,P.H.A.及Sokal,R.R.,1973,Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy,Freeman Press,San Francisco,CA；Wilbur,W.J.及Lipman,D.J.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：726－730中。
較佳藉由在具有至少20個位置之比較視窗上比較兩個經最佳對準之序列來測定"序列一致性百分比"，其中在兩個序列最佳對準下與參考序列(其並不包含添加或缺失)相比，比較視窗中之聚核苷酸或多肽序列之部分可包含20%或以下、通常5%至15%或10%至12%之添加或缺失(亦即缺口)。該百分比係如下計算：測定相同核酸鹼或胺基酸殘基在兩個序列中均存在之位置數目以產生匹配位置之數目，用匹配位置之數目除以參考序列中位置總數(亦即視窗尺寸)且將結果乘以100以產生序列一致性百分比。
變異體亦可(或者)大體上與天然基因或其部分或補體同 源。此等聚核苷酸變異體能夠在適度嚴格條件下與編碼天然抗體(或互補序列)之天然存在DNA序列雜交。
合適之"適度嚴格條件"包括在5×SSC、0.5% SDS、1.0 mM EDTA(pH 8.0)之溶液中預洗；在50℃－65℃、5×SSC下雜交隔夜；接著在65℃下洗滌兩次歷時20分鐘，每次2×、0.5×及0.2×SSC(含有0.1% SDS)。
如本文中所用，"高度嚴格條件"或"高嚴格性條件"為如下條件：(1)採用低離子強度及高溫進行洗滌，例如在50℃下用0.015 M氯化鈉/0.0015 M檸檬酸鈉/0.1%十二烷基硫酸鈉；(2)雜交期間採用變性劑，諸如甲醯胺，例如在42℃下用50%(v/v)甲醯胺與0.1%牛血清白蛋白/0.1%聚蔗糖(Ficoll)/0.1%聚乙烯吡咯啶酮/50 mM磷酸鈉緩衝劑(pH 6.5)，以及750 mM氯化鈉、75 mM檸檬酸鈉，；或(3)在42℃下採用50%甲醯胺、5×SSC(0.75 M NaCl、0.075 M檸檬酸鈉)、50 mM磷酸鈉(pH 6.8)、0.1%焦磷酸鈉、5×丹哈德溶液(Denhardt's solution)、超音波處理之鮭魚精子DNA(50 μg/ml)、0.1% SDS及10%硫酸葡聚糖，在42℃下以0.2×SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)洗滌及在55℃下以50%甲醯胺洗滌，接著進行由在55℃下含有EDTA之0.1×SSC組成之高嚴格性洗滌。熟習此項技術者將認識到如何調節適應諸如探針長度及其類似因素之因素所必需之溫度、離子強度等。
一般技術者應瞭解由於遺傳密碼子之簡幷，因此存在多種編碼如本文中所述之多肽的核苷酸序列。一些此等聚核 苷酸帶有與任何天然基因之核苷酸序列的最小同源性。然而，本發明特定涵蓋由密碼子用途差異造成變化之聚核苷酸。另外，包含本文中所提供之聚核苷酸序列的基因之等位基因係在本發明之範疇內。等位基因為內源基因，其由於一或多種突變(諸如核苷酸之缺失、添加及/或取代)而改變。所得mRNA及蛋白質可(但不必需)具有改變之結構或功能。可使用標準技術(諸如雜交、擴增及/或資料庫序列比較)來鑑定等位基因。
使用化學合成、重組方法或PCR可獲得本發明之聚核苷酸。在此項技術中熟知化學聚核苷酸合成之方法且無需在本文中詳細描述。熟習此項技術者可使用本文中所提供之序列及商業DNA合成器以製造所需DNA序列。
藉由使用在適當載體中之分離DNA且將其插入合適宿主細胞中來獲得RNA。當將細胞複製物及DNA轉錄於RNA中時，可接著使用熟習此項技術者所熟知之方法分離RNA，例如，如Sambrook等人，(1989)所闡明。
合適選殖載體可根據標準技術來構築或可選自大量此項技術中可得之選殖載體。
表現載體一般為含有根據本發明之聚核苷酸的可複製聚核苷酸構築物。其表明表現載體必須在宿主細胞中可複製為離合染色小體或染色體DNA之不可分割部分。合適表現載體包括(但不限於)質體、包括腺病毒、腺聯病毒、反轉錄病毒之病毒載體、黏質體及PCT公開案第WO 87/04462號中揭示之表現載體。
藉由大量適當方式中之任一者，包括電穿孔、採用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE－葡聚糖或其他物質之轉染；微彈轟擊；脂質轉染(lipofection)；及感染(例如，其中載體為諸如牛痘病毒之成染劑)，可將含有所關注聚核苷酸的載體引入宿主細胞中。
本發明亦提供包含本文所述之聚核苷酸中之任一者的宿主細胞。為達成分離編碼所關注抗體、多肽或蛋白質的基因之目的，任何能夠過度表現異源DNA之宿主細胞均可使用。哺乳動物宿主細胞之非限制性實例包括(但不限於)COS、HeLa及CHO細胞。亦參見PCT公開案第WO 87/04462號。合適非哺乳動物宿主細胞包括原核生物(諸如大腸桿菌或枯草芽孢桿菌(B.subtilli ))及酵母(諸如釀酒酵母(S.cerevisae )、粟酒裂殖酵母(S.pombe )；或乳酸刻克魯維酵母(K.lαctis ))。宿主細胞較佳以比宿主細胞中相應所關注內源抗體或蛋白質(若存在)之水準高約5倍、更佳高10倍、甚至更佳高20倍之水準來表現cDNA。藉由免疫檢定或FACS實現與Aβ1－40 特異性結合之宿主細胞的篩檢。可鑑定過度表現所關注抗體或蛋白質之細胞。
具有削弱或應功點之9TL或6G行至抗體及抗Aβ抗體之診斷用途
與一或多個Aβ肽之C末端結合的抗體9TL或6G可用以鑑定或偵測眼睛中標靶Aβ之存在或不存在。為簡單起見，通常將針對9TL或6G抗體而提及，然應瞭解此等方法適用於本文所述之Aβ結合實施例(諸如多肽)中之任一者。偵測一 般包括使生物試樣與結合於Aβ1－40 之本文所述之抗體接觸，及在Aβ1－40 與特異性結合於Aβ1－40 之抗體(例如9TL)之間形成複合物。此複合物之形成可為活體外或活體內的。如本文中所用之術語"偵測"包括在有或無參考對照的情況下之定性及/或定量偵測(量測水率)。
多種已知方法中之任一者均可用於偵測，包括(但不限於)免疫檢定，其使用結合多肽之抗體，例如藉由酶聯結免疫吸附劑分析法(ELISA)、放射免疫檢定(RIA)及其類似方法；及用於經編碼多肽之功能性檢定，例如結合活性或酶促檢定。在一些實施例中，抗體係經可偵測標記。在此項技術中已知且在本文中描述其他實施例。
本發明之抗體及多肽可用於偵測、診斷及監測具有改變或異常Aβ或βAPP表現之眼科疾病、病狀或病症。因此在一些實施例中，本發明提供方法，其包含使疑似在眼睛中具有改變或異常Aβ表現之個體的樣品(試樣)與本發明之抗體或多肽接觸，及測定Aβ肽之水準是否不同於對照或比較樣品之Aβ肽水準。在其他實施例中，本發明提供方法，其包含接觸個體之樣品(試樣)及測定Aβ表現水準。
對於診斷應用而言，抗體可以可偵測部分標記，該可偵測部分包括(但不限於)放射性同位素、螢光標記及各種酶－受質標記。在此項技術中已知使標記與抗體接合之方法。在本發明之其他實施例中，本發明之抗體不需要標記且其存在可使用與本發明之抗體結合的經標記抗體來偵測。
本發明之抗體可用於任何已知檢定法中，諸如競爭性結 合檢定、直接及間接夾心式檢定及免疫沈澱檢定。Zola,Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques，第147－158頁(CRC Press,Inc.1987)。
抗體亦可用於活體內診斷檢定，諸如活體內成像。一般以放射核素(諸如111 In、99 Tc、14 C、131 I、125 I或3 H)標記抗體以便所關注細胞或組織可使用免疫閃爍掃描法來局部化。遵照此項技術中熟知之技術，抗體亦可用作病理學中之染色劑。
具有削弱效應功能之抗Aβ抗體可用於量測視網膜功能以診斷處於視網膜相關退化性眼科疾病風險中或經診斷患有視網膜相關退化性眼科疾病之個體，及評定任何治療及疾病階段之進展。在一些實施例中，向個體投與具有削弱效應功能之抗Aβ抗體，且量測血漿中之Aβ水準，藉此而得之血漿Aβ之增加表明個體中之腦部類澱粉負荷之存在及/或水準。此等方法可用以監測治療之有效性及疾病階段且用以確定未來給藥及頻率。具有削弱效應功能之抗體可具有較佳安全概況且提供針對此等診斷用途之優勢。
為治療目的使用抗 Aβ抗體之方法
本文所述之抗體(包括多肽)、聚核苷酸及醫藥組合物可用於治療、預防及抑制特徵在於視網膜相關退化之眼科疾病發展之方法中。該等方法包含向個體投與有效量之與蛋白質或蛋白質沈積物特異性結合的抗體或編碼該抗體之聚核苷酸，其中該抗體具有削弱效應功能。
本文所述之抗體(包括多肽)、聚核苷酸及醫藥組合物可 用於治療、預防及抑制年齡相關黃斑退化及其他眼科疾病之發展的方法中，該等其他眼科疾病諸如年齡相關黃斑退化(濕型及乾型)、青光眼、糖尿病性視網膜病變(包括糖尿病性黃斑水腫)、布魯赫膜破裂、近視退化、眼腫瘤及其他相關視網膜退化性疾病。此等方法包含向個體投與抗體、多肽或聚核苷酸或醫藥組合物。在預防性應用中，以足以消除或減小風險、減輕嚴重程度或延遲疾病發作之量向易患眼科疾病或另外處於眼科疾病風險中之患者投與醫藥組合物或藥物，該發作包括疾病之生物化學、組織及/或行為症狀，在疾病發展期間呈現之其併發症及中間病理學表型。在治療性應用中，以足以治癒或至少部分停滯疾病症狀(生物化學、組織及/或行為症狀)的量向疑似患有或已患有此疾病之患者投與組合物或藥物，該等症狀包括疾病發展中之其併發症及中間病理學表型。
年齡相關黃斑退化之併發症及中間病理學表型包括厚擴散視網膜下色素上皮細胞(RPE)沈積、唇富脈絡膜小疣狀沈積(lip－rich drusen－like deposit)、布魯赫膜增厚、RPE萎縮之斑點區域及脈絡膜新血管生成。
本發明亦提供延遲個體之視網膜退化及/或其症狀之發展的方法，其包含向個體投與有效劑量之包含本文所述之抗體、多肽或聚核苷酸之醫藥組合物。
本發明亦提供恢復或保護個體視網膜功能之方法，其包含向個體投與有效劑量之包含本文所述之抗體、多肽或聚核苷酸之醫藥組合物。
本發明亦提供在個體視網膜中減少類澱粉斑及/或減少或減緩Aβ積累之方法，其包含向個體投與有效劑量之包含本文所述之抗體、多肽或聚核苷酸之醫藥組合物。
本發明亦提供在個體視網膜中移除或清除類澱粉斑及/或Aβ積累之方法，其包含向個體投與有效劑量之包含本文所述之抗體、多肽或聚核苷酸之醫藥組合物。在一些實施例中，類澱粉斑係在個體之腦中。
本發明亦提供減少視網膜組織中之Aβ肽、抑制及/或減少視網膜組織中之Aβ肽積累的方法，其包含向個體投與有效劑量之包含本文所述之抗體、多肽或聚核苷酸之醫藥組合物。Aβ多肽可呈可溶、寡聚或沈積形式。寡聚形式之Aβ包含2－50個Aβ多肽，其可為全長1－40及1－42肽及/或此等肽之任何截短型式的混合物。
本發明亦提供改良或逆轉眼科疾病中視網膜退化之方法，其包含向個體投與有效劑量之包含本文所述之抗體、多肽或聚核苷酸之醫藥組合物。
本發明亦提供治療或預防與視網膜退化相關之疾病的方法，其包含向個體投與有效劑量之醫藥組合物，該醫藥組合物包含與β類澱粉肽或β類澱粉肽之聚集形式特異性結合之抗體，其中該抗體包含與天然存在之Fc區具有變異之Fc區，其中該變異引起削弱效應功能，藉此使投與該抗體產生比投與無變異抗體小之腦微出血。
藉由在單一時間點或多個時間點單一直接注射至單一或多個部位，可實現本文所述之方法(包括預防方法或療 法)。亦可幾乎同時投藥於多個部位。投藥頻率可在療法過程期間確定及調節，且投藥頻率係基於實現所需結果。在一些情況下，持續連續釋放抗體(包括多肽)、聚核苷酸之調配物及本發明之醫藥組合物可為適當的。在此項技術中已知用於達成持續釋放之各種調配物及設備。
患者、個體或個體包括哺乳動物，諸如人類、牛、馬、犬、貓、豬及綿羊動物。個體較佳為人類且可罹患或可未罹患疾病或本文所示症狀。本發明之方法可預防地投與一般人群，而不需對個體患者進行任何風險評定。本發明之方法適用於確實具有年齡相關黃斑退化之已知遺傳風險的個體。此等個體包括具有已經歷該疾病之親戚的個體及藉由分析遺傳或生物化學標記物確定風險之個體。
可用於上文方法之醫藥組合物包括本文所述之抗體、多肽及/或聚核苷酸中之任一者。在一些實施例中，抗體為抗體9TL或6G或表3及8中所示之其變異體。在一些實施例中，抗體為與Aβ肽特異性結合且包含具有削弱效應功能之恆定區的抗體。
投藥及劑量 抗體較佳在載劑、較佳醫藥學上可接受之載劑中向哺乳動物投藥。合適載劑及其調配物描述於：Remington's Pharmaceutical Sciences ，第18版，A.Gennaro編，Mack Publishing Co.,Easton,PA,1990；及Remington,The Science and Practice of Pharmacy ，第20版，Mack Publishing,2000。通常將適當量之醫藥學上可接受之鹽用 於調配物中以使調配物等張。載劑之實例包括鹽水、林葛爾氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。溶液之pH值較佳為約5至約8，且更佳約7至約7.5。其他載劑包括持續釋放製劑，諸如含有抗體之固體疏水聚合物之半透性基質，該等基質係呈成形物件之形式，例如膜、脂質體或微粒。熟習此項技術者應瞭解，視(例如)投藥途徑及投與抗體之濃度而定，某些載劑可為更佳的。
藉由注射(例如全身性、靜脈內、腹膜內、皮下、肌肉內、門靜脈內(intraportal)、腦內、腦心室內(intracerebralventricular)及鼻內)或藉由其他方法(諸如輸注，其確保其以有效形式傳遞至血流)，可向哺乳動物投與抗體。亦可藉由隔離灌注(isolated perfusion)技術，諸如隔離組織灌注來投與抗體以發揮局部治療作用。另外，本發明之抗體可局部地或以諸如玻璃體內注射、視網膜下注射或雙面注射之注射形式向眼睛投藥。關於將化合物向眼睛投藥之其他資訊可見於Tolentino等人，Retina 24(2004)132－138；Reich等人，Molecular vision 9(2003)210－216中。
可憑經驗決定投與抗體之有效劑量及進度，且進行此等決定係在此項技術之技巧之內。熟習此項技術者應瞭解必須投與之抗體的劑量將視(例如)將接受抗體之哺乳動物、投藥途徑、特定類型之所用抗體及其他向哺乳動物投與之藥物而改變。為抗體選擇適當劑量之指導見於關於抗體治療性用途之文獻中，例如Handbook of Monoclonal Antibodies ,Ferrone等人編，Noges Publications,Park Ridge,N.J.,1985,第22章及第303－357頁；Smith等人，Antibodies in Human Diagnosis and Therapy ,Haber等人編，Raven Press,New York,1977，第365－389頁。視上文提及之因素而定，單獨使用之抗體的典型日劑量範圍可介於每天1 μg/kg至至多100 mg/kg體重或更多。大體而言，可使用以下劑量中之任一者：投與至少約50 mg/kg體重；至少約10 mg/kg體重；至少約3 mg/kg體重；至少約1 mg/kg體重；至少約750 μg/kg體重；至少約500 μg/kg體重；至少約250 μg/kg體重；至少約100 μg/kg體重；至少約50 μg/kg體重；至少約10 μg/kg體重；至少約1 μg/kg體重或更多之劑量。在治療開始時，可以較低劑量或較小頻率投與抗體以避免潛在副作用，諸如暫時性腦類澱粉血管病變(CAA)。
在一些實施例中，可存在一個以上抗體。此等組合物可含有至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個本發明之不同抗體(包括多肽)。
抗體亦可與有效量之一或多種其他治療劑組合向哺乳動物投藥。抗體可與該或該等其他治療劑依次或同時投與。抗體及治療劑之量係視(例如)使用何類型藥物、所治療之病理學病狀及投藥進度及途程而定，但若個別地使用每一者，則該量將一般較小。
向哺乳動物投與抗體之後，可以熟習此項技術者所熟知之多種方式監測哺乳動物之生理條件。
可使以上投藥原理及劑量適合於本文所述之多肽。
編碼本文所述之抗體或多肽的聚核苷酸亦可用於在所需細胞中傳遞及表現抗體或多肽。顯然，表現載體可用以直接表現抗體。可全身地、腹膜內、靜脈內、肌肉內、皮下、鞘內、心室內、經口、經腸、非經腸、經鼻內、經皮或藉由吸入來投與表現載體。舉例而言，表現載體投藥包括局部(local)或全身性投藥，包括注射、口服、顆粒槍或插入導管投藥及局部(topical)投藥。熟習此項技術者熟悉表現載體之投藥來獲得外源蛋白質活體內表現。例如參見美國專利第6,436,908號；第6,413,942號；及第6,376,471號。
亦可使用包含編碼本發明之抗體的聚核苷酸之治療組合物的靶向傳遞。受體介導DNA傳遞技術描述於(例如)Findeis等人，Trends Biotechnol. (1993)11：202；Chiou等人，Gene Therapeutics：Methods And Applications Of Direct Gene Transfer (J.A.Wolff編)(1994)；Wu等人，J.Biol.Chem. (1988)263：621；Wu等人，J.Biol.Chem. (1994)269：542；Zenke等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA) (1990)87：3655；Wu等人，J.Biol.Chem. (1991)266：338中。在基因療法方案中，以約100 ng至約200 mg DNA之範圍投與含有聚核苷酸之治療組合物以局部投藥。在基因療法方案期間亦可使用約500 ng至約50 mg、約1 μg至約2 mg、約5 μg至約500 μg及約20 μg至約100 μg DNA之濃度範圍。使用基因傳遞媒劑，可傳遞本發明之治療性聚核苷 酸及多肽。基因傳遞媒劑可具有病毒或非病毒來源(一般參見Jolly,Cancer Gene Therapy (1994)1：51；Kimura,Human Gene Therapy (1994)5：845；Connelly,Human Gene Therapy (1995)1：185；及Kaplitt,Nature Genetics (1994)6：148)。使用內源哺乳動物啟動子或異源啟動子可誘導此等編碼序列之表現。編碼序列之表現可為組成性的或經調節。
在此項技術中熟知用於傳遞所需聚核苷酸及在所需細胞中表現之病毒基載體。例示性病毒基媒劑包括(但不限於)重組反轉錄病毒(例如參見PCT公開案第WO 90/07936號；第WO 94/03622號；第WO 93/25698號；第WO 93/25234號；第WO 93/11230號；第WO 93/10218號；第WO 91/02805號；美國專利第5,219,740號；第4,777,127號；英國專利第2,200,651號；及EP 0 345 242)、α病毒基載體(例如辛德畢斯病毒(Sindbis virus)載體、勝利基森林病毒(Semliki forest virus)(ATCC VR－67；ATCC VR－1247)、羅斯河病毒(Ross River virus)(ATCC VR－373；ATCC VR－1246)及委內端拉馬腦炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)(ATCC VR－923；ATCC VR－1250；ATCC VR 1249；ATCC VR－532))，及腺聯病毒(AAV)載體(例如參見PCT公開案第WO 94/12649號；第WO 93/03769號；第WO 93/19191號；第WO 94/28938號；第WO 95/11984號及第WO 95/00655號)。亦可採用如Curiel,Hum .Gene Ther .(1992)3：147中所述之與殺死腺病毒連接之DNA投 藥。
亦可採用非病毒傳遞媒劑及方法，其包括(但不限於)與單獨殺死腺病毒連接或不連接之多價陽離子縮合DNA(例如參見Curiel,Hum .Gene Ther .(1992)3：147)；配位體連接DNA(例如參見Wu,J .Biol .Chem .(1989)264：16985)；真核細胞傳遞媒劑細胞(例如參見美國專利第5,814,482號；PCT公開案第WO 95/07994號；第WO 96/17072號；第WO 95/30763號及第WO 97/42338號)及核電荷中和或與細胞膜融合。亦可採用裸DNA。在PCT公開案第WO 90/11092號及美國專利第5,580,859號中描述例示性裸DNA引入法。在美國專利第5,422,120號；PCT公開案第WO 95/13796號；第WO 94/23697號；第WO 91/14445號；及EP 0 524 968中描述可充當基因傳遞媒劑之脂質體。在Philip,Mol .Cell Biol .(1994)14：2411中且在Woffendin,Proc .Natl .Acad .Sci .(1994)91：1581中描述其他方法。
套組
本發明亦提供含有本文所述之適用於治療眼科疾病的物質之製品及套組，該等眼科疾病諸如年齡相關黃斑退化(濕型及乾型)、青光眼、糖尿病性視網膜病變(包括糖尿病性黃斑水腫)、布魯赫膜破裂、近視退化、眼腫瘤及其他相關視網膜退化性疾病。該製品包含具有標記之容器。合適容器包括(例如)瓶、小瓶及試管。容器可由諸如玻璃或塑膠之多種材料形成。容器持有具有活性劑之組合物，該活性劑對於治療病理學眼科病狀或對於偵測或純化Aβ或 βAPP為有效的。組合物中之活性劑為抗體且較佳包含對Aβ或βAPP具特異性之單株抗體。在一些實施例中，活性劑包含抗體9TL或6G或由此衍生之任何抗體或多肽。在一些實施例中，活性劑包含具有削弱效應功能之抗Aβ抗體或多肽。在一些實施例中，抗Aβ抗體或多肽包含重鏈恆定區，其中該恆定區具有削弱效應功能。容器上之標記指示組合物係用於治療諸如AMD之病理學眼科病狀且亦可指示對活體內或活體外用途之指導，諸如上述彼等者。
本發明亦提供包含本文所述之抗體(諸如9TL或6G)、多肽、聚核苷酸中任一者之套組。在一些實施例中，本發明之套組包含上述容器。在其他實施例中，本發明之套組包含上述容器及包含緩衝劑之第二容器。其可另外包括其他自商業及使用者觀點來看所需之物質，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針、注射器及包裝插頁，該等包裝插頁具有進行本文所述之任何方法(諸如用於治療AMD之方法及用於抑制或減小腦中Aβ肽堆積之方法)的說明書。在欲用於偵測或純化Aβ或βAPP之套組中，抗體通常以一種可偵測標記物諸如放射性同位素、螢光化合物、生物發光化合物、化學發光化合物、金屬螯合劑或酶標記。
在一些實施例中，本發明提供用於本文所述之方法中任一者的組合物(本文所述)，無論是用作藥物及/或用於藥物之製造。
提供以下實例以說明但非限制本發明。
實例 實例1. 抗體9TL及其變異體之結合親和性測定
A.通用方法 以下通用方法用於此實例中。
用於純系(clone)表徵之表現載體 抗體之Fab片段之表現係在類似於Barbas(2001)Phage display：a laboratory manual ,Cold SPring Harbor,NY,Cold Spring Harbor Laboratory Press Pg 2.10.Vector pComb3X)中所述啟動子的IPTG誘導性lacZ啟動子控制下，然而修飾包括添加及表現以下其他域：IgG2a人類免疫球蛋白之人類輕鏈恆定域及CHI恆定域、Ig γ－2鏈C區、蛋白質寄存號P01859；免疫球蛋白輕鏈(智人(homosapiens))、蛋白質寄存號CAA09181。
小規模Fab製備 如下進行96孔板中之Fab小規模表現。自以Fab庫轉型之大腸桿菌起始，挑選菌落以接種母板(瓊脂LB＋胺苄青黴素(Ampicillin)(50 μg/ml)＋2%葡萄糖)及工作板(2毫升/孔，96孔/板，含有1.5 mL LB＋胺苄青黴素(50 μg/ml)＋2%蔔萄糖)。兩板均在30℃下生長8－12小時。將母板儲存在4℃下且使來自工作板之細胞在5000 rpm下粒化且以1 mL LB＋胺苄青黴素(50 μg/ml)＋1 mM IPTG將其再懸浮以誘導Fab表現。在30℃下5 h之表現時間後藉由離心來收集細胞，接著將細胞再懸浮於500 μL緩衝液HBS－P(10 mM HEPES緩衝液(pH 7.4)，150 mM NaCl，0.005% P20)中。藉由冷凍(－80℃)接著在37℃下融化之一個循環來達成HBS－P再懸浮細 胞之溶胞。以5000 rpm將細胞溶胞物離心30 min以自含有Fab之上澄液分離細胞碎片。接著將上澄液注入BIAcore電漿共振裝置中以獲得各Fab之親和性資訊。自母板救出表現Fab之純系以將DNA定序且用於如下所述之大規模Fab製造及詳細表徵。
大規模Fab製備 為獲得詳細動力學參數，表現Fab且將其自大培養物純化。以來自所選Fab表現大腸桿菌純系之5 mL隔夜培養物接種含有200 mL LB＋胺苄青黴素(50 μg/ml)＋2%葡萄糖之錐形瓶。在30℃下培育純系直至達成1.0之OD550nm ，且接著藉由將培養基置換為200 ml LB＋胺苄青黴素(50 μg/ml)＋1 mM IPTG來將其誘導。在30℃下5 h之表現時間後，藉由離心使細胞粒化，接著將其再懸浮於10 mL PBS(pH 8)中。藉由冷凍/融化(分別在－80℃及37℃下)之兩個循環獲得細胞之溶胞。將細胞溶胞物之上澄液負載於以PBS(pH 8)平衡之Ni－NTA超流瓊脂糖(Qiagen,Valencia.CA)管柱上，接著以5管柱體積之PBS(pH 8)洗滌。以PBS(pH 8)＋300 mM咪唑使個別Fab溶離於不同溶離份中。將含有Fab之溶離份彙集且於PBS中滲析(dialized)，接著藉由ELISA定量，隨後進行親和性表徵。
全抗體製備 為表現全抗體，將重鏈及輕鏈可變區選殖於哺乳動物表現載體中且使用脂質轉染胺(lipofectamine)將其轉染於HEK 293細胞中以瞬間表現。使用標準方法，使用蛋白質 A來純化抗體。載體pDb.9TL.hFc2a為包含9TL抗體之重鏈的表現載體且適用於重鏈之瞬間或穩定表現。載體pDb.9TL.hFc2a具有對應於以下區域之核苷酸序列：鼠類細胞巨大病毒啟動子區(核苷酸1－612)；合成內含子(核苷酸619－1507)；DHFR編碼區(核苷酸707－1267)；人類生長激素信號肽(核苷酸1525－1602)；9TL之重鏈可變區(核苷酸1603－1951)；含有以下突變之人類重鏈IgG2a恆定區：A330P331至S330S331(參考野生型IgG2a序列之胺基酸編號；參見Eur.J.Immunol.(1999)29：2613－2624)；SV40晚期多聚腺嘌呤信號(核苷酸2960－3203)；SV40強化子區(核苷酸3204－3449)；噬菌體f1區(核苷酸3537－4992)及β內醯胺酶(AmpR)編碼區(核苷酸4429－5286)。2004年7月20日將載體pDb.9TL.hFc2a保存於ATCC且指定為ATCC寄存號PTA－6124。
載體pEb.9TL.hK為包含9TL抗體之輕鏈的表現載體且適用於輕鏈之瞬間表現。載體pEb.9TL.hK具有對應於以下區域之核苷酸序列：鼠類細胞巨大病毒啟動子區(核苷酸1－612)；人類EF－1內含子(核苷酸619－1142)；人類生長激素信號肽(核苷酸1173－1150)；抗體9TL輕鏈可變區(核苷酸1251－1593)；人類鏈恆定區(核苷酸1594－1914)；SV40晚期多聚腺嘌呤信號(核苷酸1932－2175)；SV40強化子區(核苷酸2176－2421)；噬菌體f1區(核苷酸2509－2964)及β內醯胺酶(AmpR)編碼區(核苷酸3401－4258)。2004年7月20日將載體pEb.9TL.hK保存於ATCC且指定為ATCC寄存號PTA－ 6125。
Biacore檢定 使用BlAcore3000TM 表面電漿共振(SPR)系統(BIAcore,INC,Piscaway NJ)來測定9TL單株抗體之親和性。測定親和性之一方法為將9TL固定於CM5晶片上且量測Aβ1－40 肽對抗體之結合動力學。根據供應商之說明書以N－乙基－N'－(3－二甲胺基丙基)－碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N－羥基琥珀醯亞胺(NHS)活化CM5晶片。將抗體9TL或其變異體稀釋於10 mM乙酸鈉(pH 4.0或5.0)中且以0.005 mg/mL之濃度注射於活化晶片上。使用穿過個別晶片通道之可變流動時間，達成如下範圍之抗體密度：1000－2000反應單位(RU)或2000－3000反應單位(RU)。以乙醇胺阻斷晶片。再生研究展示含有2體積PIERCE溶離緩衝液及1體積4 M NaCl之溶液有效移除所結合之Aβ1－40 肽同時保持晶片上9TL之活性歷時200次以上之注射。將HBS－EP緩衝液(0.01 M HEPES(pH 7.4)，0.15 M NaCl，3 mM EDTA，0.005%界面活性劑P20)用作所有BIAcore檢定之電泳緩衝液。將經純化Aβ1－40 合成肽試樣之連續稀釋物(0.1－10×估計KD )以100 μL/min注射1 min且允許10 min之解離時間。藉由將資料擬合為1：1朗繆爾(Langmuir)結合模型(Karlsson,R.Roos,H.Fagerstam,L.Petersson,B.(1994).Methods Enzymology 6.99－110)使用BIAevaluation程式來同時獲得動力學締合速率(kon )及解離速率(koff )。平衡解離常數(KD )值係計算為koff /kon 。
或者，親和性係藉由將Aβ1－40 肽固定於SA晶片上且量測 9TL Fab及9TL變異體之Fab對固定Aβ1－40 肽之結合動力學來測定。藉由表面電漿共振(SPR)系統(BIAcore 3000TM ,BIAcore,Inc.,Piscaway,NJ)來測定9TL Fab片段及其變異體Fab片段之親和性。根據供應商之說明書來使用SA晶片(抗生蛋白鏈菌素(streptavidin))。將生物素標記Aβ肽1－40稀釋於HBS－EP(10 mM HEPES(pH 7.4)，150 mM NaCl，3 mM EDTA，0.005% P20)中且以0.005 mg/mL之濃度注射於晶片上。使用穿過個別晶片通道之可變流動時間，達成兩個範圍之抗原密度：對於詳細動力學研究而言為10－200反應單位(RU)，且對於濃度研究及篩檢而言為500－600 RU。再生研究展示100 mM磷酸(亦可接著用含有2體積50 mM NaOH及1體積70%乙醇之溶液)有效移除所結合之Fab同時保持晶片上Aβ肽之活性歷時200次以上之注射。將HBS－EP緩衝液用作所有BIAcore檢定之電泳緩衝液。將經純化Fab試樣之連續稀釋物(0.1－10×估計KD )以100 μL/min注射2 min且允許10 min之解離時間。藉由ELISA及/或SDS－PAGE電泳使用已知濃度(藉由胺基酸分析測定)之標準Fab來測定Fab蛋白質之濃度。藉由將資料擬合為1：1朗繆爾結合模型(Karlsson,R.Roos,H.Fagerstam,L.Petersson,B.(1994).Methods Enzymology 6.99－110)使用BIAevaluation程式來同時獲得動力學締合速率(kon )及解離速率(koff )。平衡解離常數(KD )值係計算為koff /kon 。
B.抗體9TL及其變異體對Aβ 1－40 之結合親和性 圖1中展示抗體9TL之重鏈及輕鏈可變區之胺基酸序列。 下表2中展示使用上述兩種Biacore方法測定之9TL抗體對Aβ1－40 之結合親和性。
下表3中展示9TL之變異體的胺基酸序列。表3中所示之變異體的所有胺基酸取代均係相對於9TL序列來描述。表3中亦展示9TL變異體之Fab片段的結合親和性。藉由上述BIAcore分析以固定於SA晶片上之Aβ1－40 來測定KD 及其他動力學參數。
實例2：抗體9TL所結合之Aβ 1－40 肽上之抗原決定基之表徵
為測定由抗體9TL識別之Aβ多肽上之抗原決定基，使用表面電漿共振(SPR,Biacore 3000)結合分析。將與生物素(Global Peptide Services,CO)偶合之Aβ1－40 多肽固定於抗生蛋白鏈菌素塗佈晶片(SA晶片)上。在不存在或存在Aβ肽之不同可溶片段(10 mM，來自American Peptide Company Inc.,CA)的情況下使Aβ抗體Fab片段(50 nM)與固定Aβ1－40 結合。下表4中展示Aβ1－40 、Aβ1－42 及Aβ1－43 之胺基酸序列。替換抗體9TL Fab片段與Aβ1－40 之結合的Aβ肽分別為Aβ28－40 、 Aβ1－40 、Aβ33－40 及Aβ17－40 (圖2)。因此，抗體9TL與Aβ1－40 之C末端肽(33－40)結合。如圖2中所示，Aβ1－28 、Aβ28－42 、Aβ22－35 、Aβ1－16 、Aβ1－43 及Aβ1－38 肽並不抑制抗體9TL Fab片段之結合，表明抗體9TL與Aβ1－40 肽之C末端結合。
另外，Aβ28－42 及Aβ1－43 肽並不抑制抗體9TL與Aβ1－40 之結合，儘管其可易於抑制Aβ1－40 與對照抗體(抗體2289，在美國申請公開案第2004/0146512號及第WO 04/032868號中描述此抗體)結合，該對照抗體與Aβ1－40 之16－28結合。此等結果展示抗體9TL與Aβ1－40 優先結合，但不與Aβ1－42 及Aβ1－43 結合。
實例3.單株抗體2H6及去糖基化2H6之產生
A.單株抗體2H6之產至及表徵 以約16個連續周間隔以25－100 μg在佐劑(每腳墊(footpad)50 μl，每小鼠總共100 μl)中與KLH接合之肽(Aβ1－40 之胺基酸28－40)使小鼠免疫，如以下文獻中所述：Geerligs HJ等人，1989,J.Immunol.Methods 124：95－102；Kenney JS等人，1989,J.Immunol.Methods 121：157－166；及Wicher K等人，1989,Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.89：128－135。首先以CFA(傅氏完全佐劑(complete Freud's adjuvant))中之50 μg肽使小鼠免疫。21天之後，以IFA(傅氏不完全佐劑)中之25 μg肽使小鼠第二次免疫。第二次免疫二十三天之後，以IFA中之25 μg肽進行第二次免疫。十天之後，使用ELISA來測試抗體力價。第三次免疫34天之後，以IFA中之25 μg肽進行第四次免疫。在第四次免疫32天之後，以100 μg可溶肽進行最終加強免疫。
自經免疫小鼠獲得脾細胞且用聚乙二醇1500使其以10：1之比率與NSO骨髓瘤細胞融合。析出(plated out)雜合物於DMEM中之96孔板中，該DMEM含有20%馬血清及2－草醯乙酸鹽/丙酮酸鹽/胰島素(Sigma)，且開始進行次黃嘌呤/胺基蝶呤/胸苷選擇。在第8天，添加含有20%馬血清之100 μl DMEM至所有孔中。藉由使用抗體捕獲免疫檢定來篩檢雜合物之上澄液。以類別特異性第二抗體執行抗體類別之測定。選擇一系列單株抗體產生細胞株以用於表徵。一種所選細胞株產生如指定為2H6之抗體。此抗體經測定具有IgG2b重鏈。
測定抗體2H6與Aβ1－40 之親和性。使用蛋白質A親和性層析法自融合瘤培養物之上澄液純化單株抗體2H6。使上澄液平衡為pH 8。接著將上澄液負載於以PBS平衡至pH 8之蛋白質A管柱MabSelect(Amersham Biosciences # 17－5199－02)。以5管柱體積之PBS(pH 8)洗滌管柱。以50 mM檸檬酸鹽－磷酸鹽緩衝液(pH 3)溶離抗體。以1 M磷酸鹽緩衝液(pH 8)中和經溶離抗體。以PBS滲析經純化抗體。藉由SDS－PAGE，使用鼠類mAb標準曲線來測定抗體濃度。
2H6 Fab係藉由使用Immunopure Fab套組(pierce # 44885)之2H6全抗體之木瓜酶蛋白質分解來製備且藉由遵照製造商之說明書流經蛋白質A層析法來純化。藉由SDS－PAGE及A280使用1OD=0.6 mg/ml來測定濃度。
使用BlAcore3000TM 表面電漿共振(SPR)系統(BIAcore,INC,Piscaway NJ)來測定2H6單株抗體之親和性。測定親和性之一方法為將2H6抗體固定於CM5晶片上且量測Aβ1－40 肽對抗體之結合動力學。根據供應商之說明書以N－乙基－N'－(3－二甲胺基丙基)－碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N－羥基琥珀醯亞胺(NHS)活化CM5晶片。將2H6單株抗體稀釋於10 mM乙酸鈉(pH 4.0或5.0)中且以0.005 mg/mL之濃度注射於活化晶片上。使用穿過個別晶片通道之可變流動時間，達成如下範圍之抗體密度：1000－2000反應單位(RU)或2000－3000反應單位(RU)。以乙醇胺阻斷晶片。再生研究展示Pierce溶離緩衝液(產品號21004，Pierce Biotechnology,Rockford,IL)與4 M NACL(2：1)之混合物有效移除所結合之Aβ1－40 肽同時保持晶片上之2H6抗體活性歷時200次以上之注射。將HBS－EP緩衝液(0.01 M HEPES(pH 7.4)，0.15 M NaCl，3 mM EDTA，0.005%界面活性劑P20)用作所有BIAcore檢定之電泳緩衝液。將經純化Aβ1－40 合成肽試樣之連續稀釋物(0.1－10×估計KD )以100 μL/min注射1 min且允許10 min之解離時間。藉由將資料擬合為1：1朗繆爾結合模型(Karlsson,R.Roos,H.Fagerstam,L.Petersson,B.(1994).Methods Enzymology 6.99－110)使用BIAevaluation程式來 同時獲得動力學締合速率(kon )及解離速率(koff )。平衡解離常數(KD )值係計算為koff /kon 。
或者，親和性係藉由將Aβ1－40 肽固定於SA晶片上且量測2H6 Fab對固定Aβ1－40 肽之結合動力學來測定。藉由表面電漿共振(SPR)系統(BIAcore 3000TM ,BIAcore,Inc.,Piscaway,NJ)來測定2H6 Fab片段之親和性。根據供應商之說明書來使用SA晶片(抗生蛋白鏈菌素)。將生物素標記Aβ肽1－40(SEQ ID NO：15)稀釋於HBS－EP(10 mM HEPES(pH 7.4)，150 mM NaCl，3 mM EDTA，0.005% P20)中且以0.005 mg/mL之濃度注射於晶片上。使用穿過個別晶片通道之可變流動時間，達成兩個範圍之抗原密度：對於詳細動力學研究而言為10－200反應單位(RU)，且對於濃度研究而言為500－600 RU。再生研究展示Pierce溶離緩衝液與4 M NaCl(2：1)之混合物有效移除所結合之Fab同時保持晶片上之Aβ肽活性歷時200次以上之注射。將HBS－EP緩衝液用作所有BIAcore檢定之電泳緩衝液。將經純化Fab試樣之連續稀釋物(0.1－10×估計KD )以100 μL/min注射2 min且允許10 min之解離時間。藉由ELISA及/或SDS－PAGE電泳使用已知濃度(藉由胺基酸分析測定)之標準Fab來測定Fab蛋白質之濃度。藉由將資料擬合為1：1朗繆爾結合模型(Karlsson,R.Roos,H.Fagerstam,L.Petersson,B.(1994).Methods Enzymology 6.99－110)使用BIAevaluation程式來同時獲得動力學締合速率(kon )及解離速率(koff )。平衡解離常數(KD )值係計算為koff /kon 。下表5 中展示使用上述兩種方法測定之2H6抗體的親和性。
如上所述來測試與Aβ1－40 之胺基酸28－40之肽結合的鼠類抗體2286之親和性。在美國申請案第10/683,815號及PCT/US03/32080中描述抗體2286。
為測定由抗體2H6識別之Aβ多肽上之抗原決定基，使用表面電漿共振(SPR,Biacore 3000)結合分析。將與生物素(Global Peptide Services,CO)偶合之Aβ1－40 多肽(SEQ ID NO：15)固定於抗生蛋白鏈菌素塗佈晶片(SA晶片)上。在不存在或存在Aβ肽之不同可溶片段(16 μM，來自American Peptide Company Inc.,CA)的情況下使Aβ抗體(100 nM)與固定Aβ1－40 結合。替換抗體2H6與Aβ1－40 之結合的Aβ肽分別為Aβ17－40 、Aβ33－40 及Aβ1－40 (圖3)。因此，抗體2H6與Aβ1－40 之C末端肽(33－40)結合。然而，Aβ1－40 之此C末端肽(33－40)在測試濃度下並不替換抗體2286與Aβ1－40 之結合。如圖3中所示，Aβ1－38 肽並不抑制抗體2H6或抗體2286與Aβ1－40 之結合，表明類似於抗體2286，抗體2H6所結合之抗原決定基包括Aβ1－40 肽之胺基酸39及/或40(圖3)。
另外，Aβ1－42 及Aβ1－43 肽並不抑制抗體2H6與Aβ1－40 之結合，儘管其可易於抑制Aβ1－40 與對照抗體(抗體2289，在美國申請案第10/683,815號及PCT/US03/32080中描述此抗體) 結合，該對照抗體與Aβ1－40 之16－28結合(圖3)。此等結果展示抗體2H6與Aβ1－40 優先結合，但不與Aβ1－42 及Aβ1－43 結合。
為進一步評定抗體2H6所結合之β－類澱粉肽之離散胺基酸殘基的涉入，藉由定點突變誘發產生不同Aβ1－40 變異體，其中最後6個胺基酸(Aβ1－40 胺基酸殘基35－40)中之每一者個別地經丙胺酸置換(丙胺酸掃描突變誘發)。將此等Aβ1－40 變異體(表6中所示之序列)在大腸桿菌中表現為麩胱甘肽－S－轉移酶(GST)融合蛋白(Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ USA)，接著在麩胱甘肽－瓊脂糖珠粒(Sigma－Aldrich Corp.,St.Louis,MO,USA)上進行親和性純化。作為對照，野生型(WT)Aβ1－40 以及Aβ1－41 、Aβ1－42 及Aβ1－39 亦表現為GST融合蛋白。接著將Aβ1－40 、Aβ1－41 、Aβ1－42, 、Aβ1－39 以及六個不同變異體(表6中所示之M35A(1－40)、V36A(1－40)、G37A(1－40)、G38A(1－40)、V39A(1－40)、V40A(1－40))固定(100 μl 0.025 μg/ml之GST肽/孔)於ELISA檢定板上，且以在自0.3 nM向下(使用0.3 nM mAb之資料展示於圖4中)之連續稀釋物中之mAb 2286、2289及2H6中之任一者培育。10次連續洗滌之後，檢定板係依次經每孔100 μl 0.03 μg/ml之生物素接合山羊抗小鼠(H＋L)抗體(Vector Laboratories，載體#BA－9200,Burllingame CA,USA)、每孔100μl 0.025 μg/ml之HRP接合抗生蛋白鏈菌素(Amersham Biosciences Corp.,#RPN4401V,NJ,USA)培育。在450 nm處讀取板之吸光度。
如圖4中所示，針對Aβ之胺基酸16至28的Mab 2289以相同強度識別所有變異體且充當板上蛋白質濃度及蛋白質完整性之內部正對照。如圖4中所示，抗體2H6並不識別Aβ1－41 、Aβ1－39 或Aβ1－42 。Aβ1－40 變異體V40A、V39A、G38A、G37A、V36A及M35A展示與抗體2h6減小之結合，證明抗體2H6抗原決定基在Aβ1－40 之C末端處擴展至少6個胺基酸。V及G至A之突變為極保守突變且不太可能在蛋白質中產生重要構形變化，因此，此等突變對抗體2H6結合之較大作用可歸因於抗體在Aβ 範圍內區分所提及胺基酸之能力，且此等資料證明此抗體之極高程度之特異性。
為測定2H6及9TL是否為與Aβ1－40 結合而競爭，使用Biacore檢定來進行競爭實驗。將抗體2H6、9TL及2289固 定於CM5晶片之不同通道上。根據供應商之說明書以N－乙基－N'－(3－二甲胺基丙基)－碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N－羥基琥珀醯亞胺(NHS)活化CM5晶片通道。將抗體2H6、9TL及2289各稀釋於10 mM乙酸鈉(pH 4.0)中且以0.005 mg/mL之濃度注射於活化晶片上。抗體密度對於2H6而言為1625反應單位(RU)；對於9TL而言為4000 RU；且對於2289而言為2200 RU。以乙醇胺阻斷各通道。使Aβ1－40 肽(150 μM)流動於晶片上歷時2 min。接著使0.6 μM之抗體2H6(待針對結合競爭進行測試)流動於晶片上歷時1 min。將HBS－EP緩衝液(0.01 M HEPES(pH 7.4)，0.15 M NaCl，3 mM EDTA，0.005%界面活性劑P20)用作所有BIAcore檢定之電泳緩衝液。量測Aβ1－40 之結合後，藉由以Pierce溶離緩衝液(產品號21004，Pierce Biotechnology,Rockford,IL)與4 M NaCl(2：1)之混合物洗滌兩次歷時6 sec來再生晶片之所有通道。接著對抗體9TL且接著對抗體2289進行競爭結合。觀察到9TL與2H6之間對與Aβ1－40 結合之競爭，但在9TL與2289之間或在2H6與2289之間未觀察到競爭。對在固定抗體與流動於晶片上之相同抗體之間競爭的觀察結果充當正對照。
B.抗體2H6並不與APP結合 為測定2H6是否與類澱粉前驅蛋白質(APP)結合，測定2H6與以野生型APP轉染之細胞的結合。以編碼野生型人類類澱粉前驅蛋白質之cDNA轉染293細胞。轉染四十八小時之後，在冰上以單株抗體抗Aβ1－16 、抗Aβ16－28 或2H6(5 μg/ml，在具有10% FCS之DMEM中)將細胞培育45分鐘。接著在PBS中將細胞洗滌三次歷時5分鐘，以4% PFA固定。在PBS中將細胞再洗滌三次，且在螢光顯微鏡下以來自Jackson Immunoresearch之二次Cy3接合山羊抗小鼠抗體(1：500之稀釋物)偵測抗體結合。
識別Aβ中N末端或中心抗原決定基之抗Aβ1－16 及抗Aβ16－28 抗體兩者均展示與表現於細胞上之APP前驅蛋白質之顯著結合。相反，2H6並不與APP表現細胞結合。
C.去糖基化抗體2H6之產生 為產生去糖基化抗體2H6，在37℃下以在20 mM Tris－HCl (pH 8.0)中之肽－N－糖苷酶F(Prozyme，0.05 U/ mg抗體)將經純化抗體2H6培育7天。藉由MALDI－TOF－MS及蛋白質凝膠電泳來檢驗去糖基化之完整性。藉由蛋白質A層析法純化去糖基化抗體且藉由Q－瓊脂糖移除內毒素。使用上述Biacore檢定來測試去糖基化2H6對Aβ1－40 之結合親和性，且發現去糖基化2H6對Aβ1－40 之結合親和性與完整抗體2H6一致。
實例4：去糖基化抗體2H6(2H6－D)在年齡相關黃斑退化之動物模型中保護及恢復視網膜功能中的作用
初始研究(Malek,G.等人，PNAS 102：11900－5(2005))證明以下三個風險因素之組合產生極近似人類AMD之臨床特徵的動物模型：(1)脂蛋白元同功異型物E4(APOE4)基因型、(2)老年(65週齡以上)及(3)高脂肪及膽固醇富含(HF－C)膳食。年老APOE4小鼠發展類似於在乾型及濕型人類AMD 中所觀察之形態學特點的病變，包括視網膜色素上皮(RPE)色素改變、厚擴散RPE下沈積、脂質富含脈絡膜小疣狀沈積、布魯赫膜增厚、上覆感光體退化之RPE萎縮之斑點區域及脈絡膜新血管生成(CNV)。與膳食方案無關，在對照人類APOE3 表現小鼠中之任一者中均未偵測到此等改變，亦未在年輕APOE4 動物中偵測到任何病理學。自全視野暗視視網膜電圖(full field scotopic electroretinogram)鑑定功能性不足。與對照相比，受影響之動物在a波振幅及b波振幅中具有顯著減小。重要的是此等組織病理學及功能性改變需要存在所有三個風險因素。自發出現CNV之此動物模型首先併有人類疾病之生理上相關風險因素。
A.實驗方案 抗體之投藥。 將表現人類ApoE4之年老(65週齡以上)標靶置換小鼠用於實驗。先前已揭示(Malek,G.等人，PNAS 102：11900－5(2005))存在於此等小鼠中之AMD狀表型。對於八週治療研究而言，將65週齡或65週齡以上之ApoE4轉殖基因小鼠分配至四組中之一者。連續保持第一組(E4－ND)處於正常膳食(n ＝2)。對第二組(E4－HFC－R1)餵食高脂肪、膽固醇富集(HF－C)膳食歷時8週(n ＝2)。對第三組(E4－HFC－R1)餵食HF－C膳食歷時8週且使其每週接受Rinat 1(3 mg/kg)之腹膜內注射(n =5)。對第四組(E4－HFC－R2)餵食HF－C膳食歷時8週且使其每週接受Rinat 2(3 mg/kg)之腹膜內注射(n =5)。研究完成之後，為各組去遮蔽(unmasked)：Rinat 1為PBS媒劑且Rinat 2為去糖基化抗Aβ抗體2H6(如實 例3中所述之小鼠單株抗人類Aβ28－40 IgG2b '2H6－D')。
活體內評定 。在第0週進行眼底檢查，而在第8週進行眼底及螢光素血管造影術。使用眼底相機(TRC－50EX視網膜相機)來拍攝照片。使用TOPCON IMAGEnetTM 系統來捕獲影像。經由血管出入孔(vascular access port)注射螢光素染料(10%螢光素鈉，約0.1 mL/kg)。染料注射之後，在若干時點拍攝照片以包括動脈相、早期動靜脈相及若干晚期動靜脈相，以便評估新血管生成且監測與CNV病變相關之螢光素滲漏。由眼科醫師獨立地進行螢光素血管造影術之解譯及分析。
在投與8週HF－C膳食前後，自小鼠(禁食5小時)收集全血中之總血漿膽固醇含量。
螢光血管攝影術(FA) 。一動物(E4－HFC－R2)在血管造影術之晚期框架中展示可能之滲漏。在FA之後但在視網膜電圖之前動物死亡且無組織可恢復。
視網膜電圖記錄 。在第九週期間，由暗適應至少12小時之動物獲得視網膜電圖(ERG)記錄。用氯胺酮/甲苯噻嗪混合物麻醉各動物，其瞳孔放大且在動物穩定於37℃溫暖墊上之後，使用置於與眼睛接觸之銀線測試電極連同一滴2.5%羥丙基甲基纖維素來記錄ERG示蹤。將小鼠置於適光刺激室中，在該室中將動物曝露於光閃(flashes of light)(最大強度1000 cd－s/m2 ，自0.0005起始，以1個對數步長衰減)。自基線至a波波谷量測a波振幅，且自a波波谷至b波波峰量測b波振幅。
組織分析 。在殺死之日，將小鼠稱重，以Avertin過度給藥(0.2 μl/10 gm體重)，且接著以20 mL鹽水心內灌注。迅速移除腦部，且在新鮮製備之用於組織病理學之10%福馬林(formalin)中將腦之左半邊浸漬固定16 h。以10% MeOH、1×PBS及2% H2 O2 預處理三十微米振動切片機切片(vibratome section)，將其以PBS洗滌，在88%甲酸中培育1分鐘以用於抗原恢復且以5%正常山羊血清(NGS)及PBS將其阻斷。以1% NGS/PBS中之生物素標記4G8一次抗體(針對β－類澱粉之胺基酸殘基17－24的Signet 4G8單株小鼠人類IgG2b)之1：1000稀釋物培育切片隔夜，且如製造商所述使用ABC Vectastain套組(Vector Labs)進行目測。
B..結果 藉由投與去糖基化抗體來恢復/保護視網膜功能。
如圖5中所示，相對於處於正常膳食之小鼠(E4－ND)，在餵食高脂肪及膽固醇富含膳食之ApoE4小鼠(E4－HFC)中，存在統計上顯著之a波振幅及b波振幅之減小(a波p＝0.0106，b波p＝0.008)。將由經注射動物獲得之ERG與ERG之基線組(baseline set)進行相比。與E4－HFC(未圖示)相比，在任一經注射組(E4－HFC－R1及E4－HFC－R2)之a波振幅中不存在顯著差異。相反地，在E4－HFC－R2組中，b波振幅展示視網膜功能之驚人恢復及/或保護(圖6)。
在處於HF－C膳食之經注射抗Aβ抗體2H6－D之APOE4小鼠中Aβ沈積之減少 。如圖7中所說明，8週用抗體2H6－D之免疫療法後，與對照媒劑組相比，E4－HFC小鼠中之總Aβ免 疫染色減小。
C..結論 以上資料證明：1)視網膜功能之恢復/保護，如由經注射抗Aβ抗體2H6－D之小鼠的ERG證明，及2)與未經治療之AMD小鼠組相比，當以抗體2H6－D在小鼠腦中治療時，類澱粉沈積減少。
實例5.抗體6G及其變異體之結合親和性測定
A.通用方法 將以下通用方法用於此實例及其他實例中。
用於純系表徵之表現載體 抗體之Fab片段表現係處於類似於Barbas(2001)Phage display： alaboratory manual ,Cold Spring Harbor,NY,Cold Spring Harbor Laboratory Press pg 2.10.Vector pComb3X)中所述啟動子的IPTG誘導性lacZ啟動子控制下，然而修飾包括添加及表現以下額外域：IgG2a人類免疫球蛋白之人類輕鏈恆定域及CHI恆定域、Ig γ－2鏈C區、蛋白質寄存號P01859；免疫球蛋白輕鏈(智人)、蛋白質寄存號CAA09181。
小規模Fab製備 如下進行96孔板中之Fab小規模表現。自以Fab庫轉型之大腸桿菌起始，挑選菌落以接種母板(瓊脂LB＋胺苄青黴素(50 μg/ml)＋2%葡萄糖)及工作板(2毫升/孔，96孔/板，含有1.5 mL LB＋胺苄青黴素(50 μg/mｌ)＋2%葡萄糖)。兩板均在30℃下生長8－12小時。將母板儲存在4℃下且使來自工作板 之細胞在5000 rpm下粒化且以1 mL LB＋胺苄青黴素(50 μg/ml)＋1 mM IPTG將其再懸浮以誘導Fab表現。在30℃下5 h之表現時間後藉由離心來收集細胞，接著將細胞再懸浮於500 μL緩衝液HBS－P(10 mM HEPES緩衝液(pH 7.4)，150 mM NaCl，0.005% P20)中。藉由冷凍(－80℃)接著在37℃下融化之一個循環來達成HBS－EP再懸浮細胞之溶胞。以5000 rpm將細胞溶胞物離心30 min以自含有Fab之上澄液分離細胞碎片。接著將上澄液注入BIAcore電漿共振裝置中以獲得各Fab之親和性資訊。自母板救出表現Fab之純系以將DNA定序且用於如下所述之大規模Fab製造及詳細表徵。
大規模Fab製備 為獲得詳細動力學參數，表現Fab且將其自大培養物純化。以來自所選Fab表現大腸桿菌純系之5 mL隔夜培養物接種含有200 mL LB＋胺苄青黴素(50 μg/ml)＋2%葡萄糖之錐形瓶。在30℃下培育純系直至達成1.0之OD550nm ，且接著藉由將培養基置換為200 ml LB＋胺苄青黴素(50 μg/ml)＋1 mM IPTG來將其誘導。在30℃下5 h之表現時間後，藉由離心使細胞粒化，接著將其再懸浮於10 mL PBS(pH 8)中。藉由冷凍/融化(分別在－80℃及37℃下)之兩個循環獲得細胞之溶胞。將細胞溶胞物之上澄液負載於以PBS(pH 8)平衡之Ni－NTA超流瓊脂糖(Qiagen,Valencia.CA)管柱上，接著以5管柱體積之PBS(pH 8)洗滌。以PBS(pH 8)＋300 mM咪唑使個別Fab溶離於不同溶離份中。將含 有Fab之溶離份彙集且於PBS中滲析，接著藉由ELISA定量，隨後進行親和性表徵。
全抗體製備 為表現全抗體，將重鏈及輕鏈可變區選殖於哺乳動物表現載體中且使用脂質轉染胺將其轉染於HEK 293細胞中以瞬間表現。使用標準方法，使用蛋白質A來純化抗體。
載體pDb.6G.hFc2a為包含6G抗體之重鏈的表現載體且適用於重鏈之瞬間或穩定表現。載體pDb.6G.hFc2a具有對應於以下區域之核苷酸序列：鼠類細胞巨大病毒啟動子區(核苷酸1－612)；合成內含子(核苷酸619－1507)；DHFR編碼區(核苷酸707－1267)；人類生長激素信號肽(核苷酸1525－1602)；6G之重鏈可變區；含有以下突變之人類重鏈IgG2a恆定區：A330P331至S330S331(參考野生型IgG2a序列之胺基酸編號；參見Eur.J.Immunol.(1999)29：2613－2624)；SV40晚期多聚腺嘌呤信號；SV40強化子區；噬菌體f1區及β內醯胺酶(AmpR)編碼區。
載體pEb.6G.hK為包含6G抗體之輕鏈的表現載體且適用於輕鏈之瞬間表現。載體pEb.6G.hK具有對應於以下區域之核苷酸序列：鼠類細胞巨大病毒啟動子區(核苷酸1－612)；人類EF－1內含子(核苷酸619－1142)；人類生長激素信號肽(核苷酸1173－1150)；抗體6G輕鏈可變區；人類鏈恆定區；SV40晚期多聚腺嘌呤信號；SV40強化子區；噬菌體f1區及β內醯胺酶(AmpR)編碼區。
Biacore檢定 使用BlAcore3000TM 表面電漿共振(SPR)系統(BIAcore,INC,Piscaway NJ)使用上文實例1中所述之方法來測定6G單株抗體之親和性。
ELISA檢定 將ELISA用於量測抗體6G及變異體與非生物素標記Aβ肽之結合。在4℃下以在PBS(pH 7.4)中之2.5 μg/ml Aβ肽塗佈NUNC maxisorp板歷時多於1小時。以PBS緩衝液(pH 7.4)中之1% BSA來阻斷板。在室溫下使一次抗體(來自細胞上澄液、含抗Aβ抗體之血清或處於所需稀釋度之經純化全抗體或Fab)與固定Aβ肽培育1 h。洗滌之復，用二次抗體(以1：5000稀釋之HRP接合山羊抗人類鏈抗體(MP Biomedicals,55233))培育板。洗滌之後，藉由添加TMB受質(KPL,50－76－02,50－65－02)來量測所結合之二次抗體。藉由添加1 M磷酸來終止HRP反應且量測在450 nm處之吸光度。
將ELISA用於量測抗體6G及變異體與生物素標記Aβ肽之結合。在4℃下以在PBS(pH 7.4)中之6 μg/ml抗生蛋白鏈菌素(Pierce,21122)塗佈NUNC maxisorp板歷時多於1小時。以PBS緩衝液(pH 7.4)中之1% BSA來阻斷板。洗滌之後，在室溫下將PBS(pH 7.4)中之生物素標記Aβ肽培育1小時。在室溫下使一次抗體(來自細胞上澄液、含抗Aβ抗體之血清或處於所需稀釋度之經純化全抗體或Fab)與固定Aβ肽培育1 h。洗滌之後，用二次抗體(以1：5000稀釋之HRP接合山羊抗人類鏈抗體(MP Biomedicals,55233))培育板。洗 滌之後，藉由添加TMB受質(KPL,50－76－02,50－65－02)來量測所結合之二次抗體。藉由添加1 M磷酸來終止HRP反應且量測在450 nm處之吸光度。
B.抗體6G及變異體對Aβ 1－40 、Aβ 1－42 及其他Aβ肽之結合親和性 圖8中展示抗體6G之重鏈及輕鏈可變區之胺基酸序列。下表7中展示使用上述Biacore測定之6G抗體對Aβ1－40 、Aβ1－42 及Aβ22－37 之結合親和性。
下表8中展示6G之變異體的胺基酸序列。表8中所示之變異體的所有胺基酸取代均係相對於6G之序列來描述。6G變異體之相對結合亦展示於表8中。藉由上述ELISA以固定於ELISA板表面上之非生物素標記Aβ1－40 或Aβ1－42 來測定結合。
實例6：抗體6G所結合之Aβ肽上之抗原決定基之表徵
為測定由抗體6G識別之Aβ肽上之抗原決定基，使用ELISA結合分析。將各種Aβ肽(Global Peptide Services,CO)固定於ELISA板上。藉由如上所述之ELISA來測定6G全抗體(20 nM)與固定Aβ之結合。下表9中展示Aβ1－40 、Aβ1－42 及Aβ1－43 之胺基酸序列。如圖9中所示，抗體6G與Aβ 肽17－40、17－42、22－35、28－40、1－38、1－40、1－42、1－43及28－42結合；但與28－42之結合較比與其他Aβ肽之結合弱得多。抗體6G並不與Aβ肽1－16、1－28及33－40結合。因此，抗體6G與例如42－35、1－38、1－40、1－42及1－43之各種截短Aβ肽之C末端結合。
下表9展示如使用Biacore檢定藉由koff (1/s)量測之6G對Aβ1－40 與對其他Aβ肽之結合親和性比較。抗體6G以與其他肽相比最高之親和性與Aβ1－40 結合，其中對截短Aβ1－40 (諸如1－36、1－37、1－38及1－39)、Aβ1－42 及Aβ1－43 具有顯著較低親和性。此表明Aβ之胺基酸40(纈胺酸)之側鏈或主鏈係與6G與Aβ1－40 之結合有關；且當不存在此胺基酸時結合顯著減小(例如約10至約50－250倍之親和性損失)。以較低親和性與羧基末端醯胺化Aβ1－40 之結合表明6G與Aβ1－40 之結合涉及(但不取決於)Aβ1－40 之游離C末端。與Aβ1－42 及Aβ1－43 之較低親和性結合可歸因於在Aβ1－40 與Aβ1－42 或Aβ1－43 之單體形式間的構形差異。已展示Aβ1－42 之單體具有不同於溶液中Aβ1－40 單體之構形。參見蛋白質資料庫(Protein Data Bank)(pdb檔案)中所示具有寄存號1IYT之Aβ1－42 的單體結構同等物；及蛋白質資料庫(pdb檔案)中所示具有寄存號1BA6及1BA4之Aβ1－40 的單體結構同等物。
作為分析物，肽流動於具有藉由胺化學固定之6G單株抗體(配位體)的CM5晶片上 #羧基端醯胺化之肽
藉由ELISA檢定進行抗體6G之抗原決定基定位。將各種Aβ肽(此等肽具有添加至C末端之甘胺酸)之生物素標記15聚體(15－mer)或10聚體(10－mer)固定於抗生蛋白鏈菌素塗佈板上。以固定肽培育抗體6G(2.5 μg/ml至10 μg/ml)且如上所述量測結合。如圖10中所示，抗體6G與具有胺基酸20－34、21－35、22－36、23－37、24－38、25－39及25－34之Aβ肽(在C末端具有甘胺酸)結合；但並不與具有胺基酸19－33、26－40、27－41、24－33及26－35之Aβ肽(在此等肽之C末端具有甘胺酸)結合。此表明抗體6G所結合之抗原決定基包括胺基酸25至34。
基於上文所示資料，抗體所6G結合之抗原決定基似乎包 括胺基酸25－34及40。圖11為展示抗體6G之抗原決定基的示意圖。
B.抗體6G並不與APP結合 為測定6G是否與類澱粉前驅蛋白質(APP)結合，測定6G與以野生型APP轉染之細胞的結合。以編碼野生型人類類澱粉前驅蛋白質之cDNA轉染HEK293細胞。轉染四十八小時之後，在冰上以單株抗體抗Aβ1－16 、(m2324)或6G(5 μg/ml，在具有10% FCS之DMEM中)將細胞培育45分鐘。接著在PBS中將細胞洗滌三次歷時5分鐘，以4% PFA固定。在PBS中將細胞再洗滌三次，且在螢光顯微鏡下以來自Jackson Immunoresearch之二次Cy3接合山羊抗小鼠抗體(1：500之稀釋物)偵測抗體結合。
如圖12中所示，識別Aβ中N末端抗原決定基之抗Aβ1－16 抗體展示與表現於細胞上之APP前驅蛋白質之顯著結合。相反，6G並不與APP表現細胞結合。
實例7：鼠類抗體7G10(抗Aβ 1－42 /Aβ 1－43 )之製造及表徵。
以~100 μg在佐劑中與KLH接合之肽使小鼠免疫，如Konig,G.等人，Annals New York Academy of Sciences.777：344－55(1996)中所述。因為BA4肽之位置29－42完全處於APP推定跨膜區域內且本質上為疏水性的，所以KLH肽與親水性間隔基接合。KLH－HDGDGD －MVGGVVIA係在Anaspec下合成，且5個殘基間隔基足以克服不溶性問題且將C末端擴展遠離載劑。在第一天，以具有CFA(傅氏完全佐劑)之100 μg 35－42/KLH肽以皮下方式使小鼠免疫。在第 15天，以100 μg肽/KLH Ribi/礬使小鼠免疫。在第55天，如第15天般使小鼠免疫。在第95天，以100 μg肽/KLH以靜脈內方式對小鼠進行加強免疫。
自經免疫小鼠獲得脾細胞，且在第99天用聚乙二醇1500融合使其以10：1之比率與P3×63Ag8.653骨髓瘤細胞(ATCC CRL 1580)融合。將融合細胞接種於(plated into)DMEM中之96孔板中，該DMEM含有20%馬血清及2－草醯乙酸鹽/丙酮酸鹽/胰島素(Sigma)，且上澄液在融合之後第10天使用Elisa檢定開始檢定，且以2 μg/ml Aβ1－42 (Anaspec)塗佈。選擇及擴增陽性物及進一步對其加以表徵。
當測試Aβ1－42 游離肽時，融合之日的小鼠血清力價為1/9000。由Biacore分析7G10與Aβ1－40、1－42及1－43之親和性結合。
Biacore檢定 如實例1中先前所述使用BIAcore3000來測定7G10抗體之親和性。將N－生物素標記Aβ1－40、1－42及1－43捕獲於SA晶片上。以上列7G10備料之1/6稀釋物起始，分別注射抗Aβ1－40 Fab、抗Aβ1－42 Fab及抗Aβ1－43 Fab之三倍稀釋物系列。以6% EtOH＋6 mM NaOH之18 sec脈衝使晶片再生。
如上所指出，7G10對Aβ1－42 肽具有37.6 nM之KD 且對Aβ1－43 肽具有41 nM之KD 。對Aβ1－40 肽未偵測到可量測之結合。
實例10：抗體9TL、6G及7G10在年齡相關黃斑退化動物模型中保護及恢復視網膜功能中的比較作用
A.實驗方案 抗體之投藥 。重複如上文實例4中所述之方案。將65週齡或65週齡以上之ApoE4轉殖基因小鼠分配至5組中之一者歷時八週。連續保持第一組(E4－ND)處於正常膳食(n ＝6)。對第二組(E4－HFC－R1)餵食高脂肪、膽固醇富集(HF－C)膳食歷時8週(n ＝12)。對第三組(E4－HFC－R1)餵食HF－C膳食歷時8週且使其每週接受Rinat3(3 mg/kg)之腹膜內注射(n ＝12)。對第四組(E4－HFC－R2)餵食HF－C膳食歷時8週且使其每週接受Rinat 4(3 mg/kg)之腹膜內注射(n ＝12)。對第五組(E4－HFC－R)餵食HF－C膳食歷時8週且使其每週接受Rinat 5(3 mg/kg)之腹膜內注射(n＝12)。研究完成之後，為各組去遮蔽：Rinat 3為7G10；Rinat 4為去糖基化抗Aβ抗體2H6；且Rinat 5為6G。
如上文實例4中先前所述來進行眼底檢查及螢光素血管造影術。第八週之後，如上文實例4中先前所述來獲得ERG記錄。
結果 藉由投與去糖基化抗體來恢復/保護視網膜功能。
如圖13中所示，b波振幅證實在以2H6(E4－HFC抗Aβ1－40 )治療之組中顯著恢復及/或保護視網膜功能。b波振幅表明以7G10(E4－HFC抗Aβ1－42 /Aβ1－43 )治療之組幾乎無恢復。令人驚訝地，b波振幅表明在6G(E4－HFC抗Aβ1－40 /Aβ1－42 )治療 之組中甚至更大地恢復及/或保護視網膜功能。如圖14中所示，以6G治療之組的b波振幅可與正常小鼠之對照組相當，表明視網膜功能之完全恢復及/或保護。
結論 以上資料證明：1)RPE下類澱粉在AMD中為病原性及/或毒性的；2)顯著恢復/保護視網膜功能，如由經抗Aβ抗體2H6－D注射之小鼠的ERG證明；及3)完全恢復/保護視網膜功能，如由經雙特異性抗Aβ1－40 /Aβ1－42 6G注射之小鼠的ERG證明。
應瞭解本文所述之實例及實施例係僅出於說明性目的，且熟習此項技術者將提出各種根據其之修改或改變將且其係包括於本申請案之精神及範圍內。本文中所引用之所有公開案、專利及專利申請案係出於所有目的而以全文引用的方式併入本文中，該引用的程度就如同已特定地及個別地表明將各個別公開案、專利或專利申請案以引用的方式併入一般。
生物材料之保存 已由American Type Culture Collection,10801 University Boulevard,Manassas,Virginia 20110－2209,USA(ATCC)保存以下物質。
載體pEb.9TL.hK為編碼9TL輕鏈可變區及輕鏈恆定區 之聚核苷酸；且載體pDb.9TL.hFc2a為編碼9TL重鏈可變區及重鏈IgG2a恆定區之聚核苷酸，該重鏈IgG2a恆定區含有以下突變：A330P331至S330S331(參考野生型IgG2a序列之胺基酸編號；參見Eur .J .Immunol .(1999)29：2613－2624)。
載體pEb.6G.hK為編碼6G輕鏈可變區及輕鏈恆定區之聚核苷酸；且載體pDb.6G.hFc2a為編碼6G重鏈可變區及重鏈IgG2a恆定區之聚核苷酸，該重鏈IgG2a恆定區含有以下突變：A330P331至S330S331(參考野生型IgG2a序列之胺基酸編號；參見Eur .J .Immunol. (1999)29：2613－2624)。
在國際承認用於專利程序的微生物保存布達佩斯條約(Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure)及其下(布達佩斯條約)條例之條款下執行此等保存。此舉確保自保存之日起保持保存物之可存活行培養物歷時30年。該保存物將藉由ATCC在布達佩斯條約款項下而可獲得，且服從在Rinat Neuroscience Corp.與ATCC之間的協議，其確保一旦相關美國專利公布或一旦使任何美國或國外專利申請案(無論何者首先出現)變得公諸於眾，公眾即可獲得保存物之培養物的子代永久及無限制利用性，且確保對根據35 USC Section 122及依照其之委員細則(包括37 CFR Section 1.14，其特定參考886 OG 638)，由美國專利與商標委員對其授權所確定者可獲得子代之利用性。
本申請案之受讓人已同意若保存中材料之培養物在合適 條件下培養時死亡或損失或破壞，則將通知立即以另一相同物替換該等材料。不應將保存材料之利用性理解為在違背任何政府當局根據其專利法授予之權利的情況下實踐本發明之許可。
抗體序列
9TL重鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：1) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYYTEAYYIHWVRQAPGQGLEWMGRIDPATGNTKYAPRLQDRVTMTRDTSTSTVYMELSSSRSEDTAVYYCASLYSLPVYWGQGTTVTVSS
9TL輕鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：2) DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDAKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYQISRLDPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGTHYPVLFGQGTRLEIKRT
9TL CDR H1(擴展CDR)(SEQ ID NO：3) GYYTEAYYIH
9TL CDR H2(擴展CDR)(SEQ ID NO：4) RIDPATGNTKYAPRLQD
9TL CDR H3(擴展CDR)(SEQ ID NO：5) LYSLPVY
9TL CDR L1(擴展CDR)(SEQ ID NO：6) KSSQSLLYSDAKTYLN
9TL CDR L2(擴展CDR)(SEQ ID NO：7) QISRLDP
9TL CDR L3(擴展CDR)(SEQ ID NO：8) LQGTHYPVL
9TL重鏈可變區核苷酸序列(SEQ ID NO：9) CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGTGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCTTCCGTGAAGGTTTCCTGCAAAGCATCTGGTTACTATACGGAGGCTTACTATATCCACTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGTCAAGGCCTGGAGTGGATGGGCAGGATTGATCCTGCGACTGGTAATACTAAATATGCCCCGAGGTTACAGGACCGGGTGACCATGACTCGCGATACCTCCACCAGCACTGTCTACATGGAACTGAGCTCTCTGCGCTCTGAGGACACTGCTGTGTATTACTGTGCCTCCCTTTATAGTCTCCCTGTCTACTGGGGCCAGGGTACCACTGTTACCGTGTCCTCT
9TL輕鏈可變區核苷酸序列(SEQ ID NO：10) GATGTTGTGATGACCCAGTCCCCACTGTCTTTGCCAGTTACCCTGGGACAACCAGCCTCCATATCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTATATAGTGATGCCAAGACATATTTGAATTGGTTCCAACAGAGGCCTGGCCAGTCTCCACGCCGCCTAATCTATCAGATTTCCCGGCTGGACCCTGGCGTGCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACA GATTTTACACTTAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATGTGGGAGTTTATTACTGCTTACAAGGTACACATTATCCGGTGCTCTTCGGTCAAGGGACCCGCCTGGAGATCAAACGCACT
9TL重鏈全抗體胺基酸序列(包括如本文所述之經修飾IgG2a)(SEQ ID NO：11) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYYTEAYYIHWVRQAPGQGLEWMGRIDPATGNTKYAPRLQDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCASLYSLPVYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
9TL輕鏈全抗體胺基酸序列(SEQ ID NO：12) DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDAKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYQISRLDPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGTHYPVLFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
9TL重鏈全抗體核苷酸序列(包括如本文所述之經修飾IgG2a)(SEQ ID NO：13) CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGTGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCTTCCGTGAAGGTTTCCTGCAAAGCATCTGGTTACTATACGGAGGCTTACTATATCCACTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGTCAAGGCCTGGAGTGGATGGGCAGGATTGATCCTGCGACTGGTAATACTAAATATGCCCCGAGGTTACAGGACCGGGTGACCATGACTCGCGATACCTCCACCAGCACTGTCTACATGGAACTGAGCTCTCTGCGCTCTGAGGACACTGCTGTGTATTACTGTGCCTCCCTTTATAGTCTCCCTGTCTACTGGGGCCAGGGTACCACTGTTACCGTGTCCTCTGCCTCCACCAAGGGCCCATCTGTCTTCCCACTGGCCCCATGCTCCCGCAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCAGAACCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCCTCAGGTCTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCATCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCAAGCAACACCAAGGTCGACAAGACCGTGGAGAGAAAGTGTTGTGTGGAGTGTCCACCTTGTCCAGCCCCTCCAGTGGCCGGACCATCCGTGTTCCTGTTCCCTCCAAAGCCAAAGGACACCCTGATGATCTCCAGAACCCCAGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGCAGTTCAACTGGTATGTGGACGGAGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCAAGAGAGGAGCAGTTCAACTCCACCTTCAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGAAAGGAGTATAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGACTGCCATCCAGCATCGAGAAGACCATCTCCAAGACCAAGGGACAGCCAAGAGAGCCACAGGTGTATACCCTGCCCCCATCCAGAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGATTCTATCCATCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGACAGCCAGAGAACAACTATAAGACCACCCCTCCAATGCTGGACTCCGACGGATCCTTCTTCCTGTATTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAGCAGGGAAACGTGTTCTCTTGTTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTATACCCAGAAGAGCCTGTCCCTGTCTCCAGGAAAGTAATTCTAGA
9TL輕鏈全抗體核苷酸序列(SEQ ID NO：14) GATGTTGTGATGACCCAGTCCCCACTGTCTTTGCCAGTTACCCTGGGACAACCAGCCTCCATATCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTATATAGTGATGCCAAGACATATTTGAATTGGTTCCAACAGAGGCCTGGCCAGTCTCCACGCCGCCTAATCTATCAGATTTCCCGGCTGGACCCTGGCGTGCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTTAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATGTGGGAGTTTATTACTGCTTACAAGGTACACATTATCCGGTGCTCTTCGGTCAAGGGACCCGCCTGGAGATCAAACGCACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCTCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCCGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCACGCGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGTTCTCCAGTCACAAAGAGCTTCAACCGCGGTGAGTGCTAATTCTAG
6G重鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：26) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYAIHWVRQAPGQGLEWMGFTSPYSGVSNYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARFDNYDRGYVRDYWGQGTLVTVS
6G輕鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：27) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNDRISFLNWYQQKPGQPPKLLIYAATKQGTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQOSKEFPWSFGGGTKVEIKRTV
6G CDR H1(擴展CDR)(SEQ ID NO：28) GYTFTTYAIH
6G CDR H2(振展CDR)(SEQ ID NO：29) FTSPYSGVSNYNQKFKG
6G CDR H3(擴展CDR)(SEQ ID NO：30) FDNYDRGYVRDY
6G CDR L1(擴展CDR)(SEQ ID NO：31) RASESVDNDRISFLN
6G CDR L2(振展CDR)(SEQ ID NO：32) AATKQGT
6G CDR L3(擴展CDR)(SEQ ID NO：33) QQSKEFPWS
6G重鏈可變區核苷酸序列(SEQ ID NO：34) CAGGTGCAACTGGTGCAATCCGGTGCCGAGGTGAAAAAGCCAGGCGCCTCCGTGAAAGTGTCCTGCAAAGCCTCCGGTTACACCTTTACCACCTATGCCATCCATTGGGTGCGCCAGGCCCCAGGCCAGGGTCTGGAGTGGATGGGCTTTACTTCCCCCTACTCCGGGGTGTCGAATTACAATCAGAAGTTCAAAGGCCGCGTCACCATGACCCGCGACACCTCCACCTCCACAGTGTATATGGAGCTGTCCTCTCTGCGCTCCGAAGACACCGCCGTGTATTACTGTGCCCGCTTCGACAATTACGATCGCGGCTATGTGCGTGACTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCC
6G輕鏈可變區核苷酸序列(SEQ ID NO：35) GACATCGTGATGACCCAGTCCCCAGACTCCCTGGCCGTGTCCCTGGGCGAGCGCGCCACCATCAACTGCCGCGCCAGCGAATCCGTGGATAACGATCGTATTTCCTTTCTGAACTGGTACCAGCAGAAACCAGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACGCCGCCACCAAACAGGGTACCGGCGTGCCTGACCGCTTCTCCGGCAGCGGTTCCGGCACCGATTTCACTCTGACCATCTCCTCCCTGCAGGCCGAAGATGTGGCAGTGTATTACTG TCAGCAGTCCAAAGAGTTTCCCTGGTCCTTTGGCGGTGGCACCAAGGTGGAGATCAAACGCACTGTG
6G重鏈全抗體胺基酸序列(包括如本文所述之經修飾IgG2a)(SEQ ID NO：36) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYAIHWVRQAPGQGLEWMGFTSPYSGVSNYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARFDNYDRGYVRDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKFKPREEQFNSTFRVVSVLAVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
6G輕鏈全抗體胺基酸序列(SEQ ID NO：37) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNDRISFLNWYQQKPGQPPKLLIYAATKQGTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEFPWSFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
6G重鏈全抗體核苷酸序列(包括如本文所述之經修飾IgG2a)(SEQ ID NO：38) CAGGTGCAACTGGTGCAATCCGGTGCCGAGGTGAAAAAGCCAGGCGCCTCCGTGAAAGTGTCCTGCAAAGCCTCCGGTTACACCTTTACCACCTATGCCATCCATTGGGTGCGCCAGGCCCCAGGCCAGGGTCTGGAGTGGATGGGCTTTACTTCCCCCTACTCCGGGGTGTCGAATTACAATCAGAAGTTCAAAGGCCGCGTCACCATGACCCGCGACACCTCCACCTCCACAGTGTATATGGAGCTGTCCTCTCTGCGCTCCGAAGACACCGCCGTGTATTACTGTGCCCGCTTCGACAATTACGATCGCGGCTATGTGCGTGACTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCTGTCTTCCCACTGGCCCCATGCTCCCGCAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCAGAACCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCCTCAGGTCTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCATCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCAAGCAACACCAAGGTCGACAAGACCGTGGAGAGAAAGTGTTGTGTGGAGTGTCCACCTTGTCCAGCCCCTCCAGTGGCCGGACCATCCGTGTTCCTGTTCCCTCCAAAGCCAAAGGACACCCTGATGATCTCCAGAACCCCAGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGCAGTTCAACTGGTATGTGGACGGAGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCAAGAGAGGAGCAGTTCAACTCCACCTTCAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGAAAGGAGTATAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGACTGCCATCCAGCATCGAGAAGACCATCTCCAAGACCAAGGGACAGCCAAGAGAGCCACAGGTGTATACCCTGCCCCCATCCAGAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGATTCTATCCATCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGACAGCCAGAGAACAACTATAAGACCACCCCTCCAATGCTGGACTCCGACGGATCCTTCTTCCTGTATTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAGCAGGGAAACGTGTTCTCTTGTTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTATACCCAGAAGAGCCTGTCCCTGTCTCCAGGAAAG
6G輕鏈全抗體核苷酸序列(SEQ ID NO：39) GACATCGTGATGACCCAGTCCCCAGACTCCCTGGCCGTGTCCCTGGGCGAGCGCGCCACCATCAACTGCCGCGCCAGCGAATCCGTGGATAACGATCGTATTTCCTTTCTGAACTGGTACCAGCAGAAACCAGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACGCCGCCACCAAACAGGGTACCGGCGTGCCTGACCGCTTCTCCGGCAGCGGTTCCGGCACCGATTTCACTCTGACCATCTCCTCCCTGCAGGCCGAAGATGTGGCAGTGTATTACTG TCAGCAGTCCAAAGAGTTTCCCTGGTCCTTTGGCGGTGGCACCAAGGTGGAGATCAAACGCACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCTCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCCGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCACGCGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGTTCTCCAGTCACAAAGAGCTTCAACCGCGGTGAGTGC
m7G10重鏈胺基酸序列(SEQ ID NO：40) EVKLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSTYAMSWlRQTPEKRLEWVASIGNSSRTYYPDSVKGRFTISRDNAGSILYLQMSSLRSEDTAIYYCARGEDGNYAWFTYWGQGTQVTVS
m7G10輕鏈胺基酸序列(SEQIDNO：41) DlVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSVKNNLHWYQQKSHESPRLLlKYTFQSMSGlPSRFSGSGSGTDFTLllNSVETEDFGMYFCQQSNRWPLTFGAGTKLEL
m7G10 HI CDR胺基酸序列(SEQ ID NO：42) TYAMS
m7G10 H2 CDR胺基酸序列(SEQ ID NO：43) SIGNSSRTYYPDSVKG
m7G10 H3 CDR胺基酸序列(SEQ ID NO：44) GEDGNYAWFTY
m7G10 L1胺基酸序列(SEQ ID NO：45) RASQSVKNNLH
m7G10 L2胺基酸序列(SEQ ID NO：46) YTFQSMS
m7G10 L3胺基發序列(SEQ ID NO：47) QQSNRWPLT
m7G10HC重鏈核苷酸序列(SEQ ID NO：48) GAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTACCTATGCCATGTCTTGGATTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCCTCCATTGGTAATAGTAGTAwGGACTTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCCGGGAGCATCCTGTACCTCCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATTTATTATTGTGCAAGAGGGGAAGATGGTAACTACGCCTGGTTTACTTACTGGGGCCAAGGGACTCAGGTCACCGTCTCC
M7G10HC輕鏈核苷酸序列(SEQ ID NO：49) GATATTGTGCTAACTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGACTCCAGGAGATAGCGTCAGTCTTTCCTGCAGGGCCAGCCAAAGTGTTAAGAACAACCTACACTGGTATCAACAAAAGTCACATGAGTCTCCAAGGCTTCTCATCAAGTATACTTTCCAGTCCATGTCTGGGATCCCCTCCAGGTTCAGTGGCAGTGGCTCAGGGACAGATTTCACTCTCATTATCAACAGTGTGGAGACTGAAGATTTTGGAATGTAETCTGTCAACAGAGTAACCGTTGGCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTG
圖1展示9TL抗體之重鏈可變區(SEQ ID NO：1)及輕鏈可變區(SEQ ID NO：2)之胺基酸序列。Kabat CDR係呈粗體文且Chothia CDR係經加下劃線。對重鏈及輕鏈可變區之胺 基酸殘基依次編號。
圖2展示藉由肽競爭進行之抗體9TL之抗原決定基定位。將Aβ1－40 肽固定於SA晶片上。且接著使各與10 μM各種肽(Aβ之胺基酸28－40、1－40、1－28、28－42、22－35、1－16、1－43、33－40、1－38或17－40)或無肽預培育1 h之單株抗體2289及9TL Fab片段(各50 nM)流動於該晶片上。量測抗體Fab片段對固定Aβ1－40 肽之結合。
圖3為展示藉由肽競爭進行抗體2H6之抗原決定基定位之圖。將Aβ1－40 肽固定於SA晶片上。使各與16 μM各種肽(Aβ之胺基酸1－16、1－28、1－38、1－40、1－42、1－43、17－40、17－42、22－35、25－35或33－40)或無肽預培育1 h之單株抗體2289、2286或2H6(各100 nM)流動於該晶片上。量測抗體與固定Aβ1－40 肽之結合。
圖4為展示抗體2H6、2286及2289與不同Aβ肽C末端變異體之結合之圖。將GST－Aβ變異體(M35A、V36A、G37A、G38A、V39A或V40A)或GST－Aβ肽1－39、1－41、1－40、1－42固定於ELISA板上。以各固定肽培育單株抗體2286、2H6或2289(各mAb 0.3 nM)，且藉由進一步依次以生物素標記抗小鼠IgG(H＋L)及Sterptavidin－HRP培育來偵測其結合。
圖5為來自老化脂蛋白元同功異型物E4(APOE4)小鼠在正常膳食相對於高脂肪及膽固醇膳食下之a波及b波(A)及試樣視網膜電圖(B)之強度圖。
圖6為對比正常膳食動物之先前研究所繪之僅APOE4小 鼠b波的強度圖。R2迹線展示當AMD狀小鼠(E4－HFC－R2)以抗Aβ抗體治療時之視網膜功能的保護或恢復。
圖7展示AMD狀(APOE4)小鼠腦部之全Aβ免疫組織化學。載片A(以抗Aβ抗體治療之AMD狀小鼠)展示陰性類澱粉偵測。載片B、C及D(以媒劑注射治療之AMD狀小鼠)展示陽性類澱粉偵測。載片E係取自陽性對照且係取自血小板衍生APP小鼠模型(pdAPP，在血小板衍生生長因子啟動子控制下之突變(V717F)人類APP(Games,D.等人，Nature 373：523－527(1995))之腦。
圖8展示6G抗體之重鏈可變區(SEQ ID NO：1)及輕鏈可變區(SEQ ID NO：27)之胺基酸序列。Kabat CDR係呈粗體文且Chothia CDR係經加下劃線。對重鏈及輕鏈可變區之胺基酸殘基依次編號。
圖9展示藉由ELISA進行之抗體6G的抗原決定基定位。將Aβ肽(1－16、1－28、17－40、17－42、22－35、28－40、28－42、1－38、1－40、1－42、1－43及33－40)固定於ELISA板上。以各種固定肽將單株抗體6G(20 nM)培育1 h。使用山羊抗人類HRP接合二次抗體來量測與固定Aβ肽結合之抗體6G。
圖10展示藉由ELISA進行之抗體6G的抗原決定基定位。將各種Aβ肽固定於ELISA板上。以各種固定肽將抗體6G培育1 h。使用山羊抗人類HRP接合二次抗體來量測與固定Aβ肽結合之抗體6G。"NB"係指未偵測到結合。
圖11為展示Aβ上抗體6G結合之抗原決定基的示意圖。 展示Aβ在類澱粉前驅蛋白質(APP)中及APP之部分在細胞膜中之相對位置。"CT99"係指APP之C末端99個胺基酸。
圖12為展示針對Aβ1－16 (m2324)及抗體6G以單株抗體免疫染色APP表現細胞之照片。頂排展示細胞在以m2324或6G(各5 μg/ml)培育且藉由二次Cy3接合山羊抗小鼠或抗人類抗體來偵測結合之後在螢光顯微鏡下之細胞。底排展示在顯微鏡下所觀察之細胞。
圖13為僅五個研究組之APOE4小鼠之b波強度圖：正常膳食之對照APOE4小鼠；高脂肪及膽固醇膳食('HFC')之對照APOE4小鼠(AMD狀模型)；以7G10治療之APOE4－HFC小鼠；以2H6治療之APOE4－HFC小鼠；及以6G治療之APOE4－HFC小鼠。
圖14為僅三個研究組之APOE4小鼠之b波強度圖：正常膳食之對照APOE4小鼠：對照APOE4 HFC小鼠；及以6G治療之APOE4－HFC小鼠。
<110> 美商雷那特神經科學股份有限公司<120> 治療眼科疾病的方法<130> PC33563A <140> 097108208 <141> 2008－03－07 <50> LS 60/894,181 <151> 2007－03－09 <160> 49 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 116 <212> PRT <213> 人造序列<240> <223> 合成構築<400> 1<210> 2 <211> 114 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 合成構築<400> 2 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 合成構築<400> 3<210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 合成構築<400> 4<210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 合成構築<400> 5<210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 合成構築<400> 6<210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 合成構築<400> 7<210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 合成構築<400> 8<210> 9 <211> 348 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 合成構築<400> 9<210> 10 <211> 342 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 合成構築<4()0> 10 <210> 11 <211> 442 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 合成構築<400> 11 <210> 12 <211> 219 <212> PRT <213> 人造序列<320> <223> 合成構築<400> 12 <210> 13 <211> 1336 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 合成構築<400> 13 <210> 14 <211> 666 >212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 合成構築<400> 14<210> 15 <211> 40 <212> PRT <213> 智人<400> 15 <210> 16 <211> 42 <212> PRT <213> 智人<400> 16<210> 17 <211> 43 <212> PRT <213> 智人<400> 17<210> 18 <211> 41 <212> PRT <213> 智人<400> 18<210> 19 <211> 39 <212> PRT <213> 智人<400> 19 <210> 20 <211> 40 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 合成構築<400> 20<210> 21 <211> 40 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 合成構築<400> 21<210> 22 <211> 40 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 合成構築<400> 22<210> 23 <211> 40 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 合成構築<400> 23<210> 24 <211> 40 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 合成構系<400> 24<210> 25 <211> 40 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 合成構築<400> 25<210> 26 <211> 120 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 合成構築<400> 26 <210> 27 <211> 114 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 合成構築<400> 27<210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> 智人<400> 28<210> 29 <211> 17 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 合成構築<400> 29<210> 30 <211> 12 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 合成構築<400> 30<210> 31 <211> 15 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 合成構築<400> 31<210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 合成構築<400> 32<210> 33 <211> 9 <213> PRT <213> 人造序列<220> <223> 合成構築<400> 33<210> 34 <211> 360 <212> DNA <213> 人進序列<220> <223> 合成構築<400> 34<210> 35 <211> 342 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 合成構築<400> 35<210> 36 <211> 447 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 合成構築<400> 36 <210> 37 <211> 218 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 合成構築<400> 37 <210> 38 <211> 1341 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 合成構築<400> 38<210> 39 <211> 654 <212> DNA <213> 人造序列 <220> <223> 合成構築<400> 39<210> 40 <211> 118 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 合成構築<400> 40<210> 41 <211> 106 <212> PRT <213> 人造序列 <220> <223> 合成構築<400> 41<210> 42 <211> 5 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 合成構築<400> 42<210> 43 <211> 16 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 合成構築<400> 43<210> 44 <211> 11 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 合成構築<400> 44<210> 45 <211> 11 <212> PRT <213> 人選序列<220> <223> 合成構築<400> 45<210> 46 <211> 7 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 合成構築<400> 46<210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> 人造序列<220> <223> 合成構築<400> 47<210> 48 <211> 354 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 合成構築<400> 48<210> 49 <211> 318 <212> DNA <213> 人造序列<220> <223> 合成構築<400> 49
(無元件符號說明)

Claims (12)

  1. 一種與Aβ1-40 之C端特異性結合的抗體的用途，其係用於製造供治療患有年齡相關黃斑退化之個體的藥物，其中該抗體與Aβ1-40 上包括胺基酸25-34及40之抗原決定基結合。
  2. 如請求項1之用途，其中該抗體亦與Aβ1-42 特異性結合。
  3. 如請求項1之用途，其中該抗體以約100nM或以下之KD 與該Aβ1-40 肽結合。
  4. 如請求項2之用途，其中該抗體亦以約100nM或以下之KD 與該Aβ1-42 肽結合。
  5. 如請求項2之用途，其中該抗體與Aβ1-40 上包括胺基酸33-40之抗原決定基結合。
  6. 如請求項1之用途，其中該抗體與Aβ1-40 結合之親和性高於其與Aβ1-42 及Aβ1-43 結合之親和性，且其中該抗體不為抗體2294。
  7. 如請求項1之用途，其中該抗體之Fc區未經N-糖基化或具有相對於天然Fc區經改變之N-糖基化模式。
  8. 如請求項1之用途，其中該抗體包含一個重鏈可變區，其包含SEQ ID NO：26中所示之抗體6G重鏈可變區之三個CDRs，及一個輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO：27中所示之抗體6G輕鏈可變區之三個CDRs。
  9. 如請求項1之用途，其中該抗體包含一個重鏈可變區，其包含SEQ ID NO：26中所示之胺基酸序列，及一個輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO：27中所示之胺基酸序列。
  10. 如請求項1之用途，其中該抗體包含SEQ ID NO：36所示的重鏈胺基酸序列，及SEQ ID NO：37所示的輕鏈胺基酸序列。
  11. 一種與Aβ1-40 及Aβ1-42 之C端特異性結合的抗體之用途，其係用於製造供治療患有年齡相關黃斑退化之個體的藥物，其中該抗體與Aβ1-40上包括胺基酸25-34及40之抗原決定基結合。
  12. 如請求項11之用途，其中該抗體之投予可使視網膜功能顯著恢復。
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