BRPI0808711A2 - Métodos de tratamento de doenças oftálmicas - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS DE TRATAMENTO DE DOENÇAS OFTÁLMICAS".

Esse pedido reivindica o benefício do Pedido U.S N0 12/041.581 depositado em 3 de março de 2008, que reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. N0 60/894.181 depositado em 9 de março de 2007, cujos conteúdos estão incorporados por meio desse por referência em suas totalidades.

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção refere-se a métodos para usar anticorpos para o peptídeo beta-amiloide no tratamento e/ou prevenção de doenças oftálmicas, tais como a degeneração macular relacionada à idade, mas também em outras patologias oculares, tais como glaucoma, retinopatia diabética (incluindo edema macular diabético), membrana neovascular coroidal (CNV), uveíte, degeneração miópica, tumores oculares, oclusão da veia central da retina, rubeosis, neovascularização ocular, retinopatia serosa central, discos da superfície ocular tais como olho seco, oclusão da artéria central da retina, edema macular cistoideo e qualquer outra doença degenerativa da retina. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A causa mais comum da diminuição da visão corrigida em indivíduos acima de 65 anos de idade nos Estados Unidos é a disfunção retiniana conhecida como degeneração macular relacionada com a idade (AMD). Conforme a AMD progride, a doença é caracterizada pela perda da visão central nítida. A área do olho afetada pela AMD é a Mácula - uma pequena área no centro da retina, composta primariamente por células fotorreceptoras. A assim chamada AMD "atrófica" (também chamada de "atrofia geográfica"), responsável por cerca de 85% a 90% de pacientes com AMD, envolve alterações na distribuição da pigmentação do olho, perda de fotorreceptores e função retiniana diminuída devido à atrofia global das células. A assim chamada AMD "exsudativa" envolve a proliferação de vasos coroidais anormais que levam a coágulos ou cicatrizes no espaço sub-retiniano. Assim, o aparecimento de AMD exsudativa ocorre devido à formação de uma rede neovascular coroidal anormal (neovascularização coroidal, CNV) abaixo da retina neural. Os vasos sanguíneos recém-formados vazam excessivamente. Isso leva ao acúmulo de fluido e sangue sub-retiniano levando à perda da acuidade visual. Eventualmente, há perda total da retina funcional na região envolvida, enquanto se forma uma grande cicatriz discoide envolvendo a 5 coroide e a retina. Apesar de pacientes com AMD atrófica poderem manter uma visão com qualidade diminuída, a AMD exsudativa geralmente resulta em cegueira. (Hamdi & Kenney, Age-related Macular degeneration-a new viewpoint, Frontiers in Bioscience, e305-314, maio de 2003). A CNV ocorre não apenas na AMD exsudativa, mas também em outras patologias oculares 10 tais como o glaucoma, a retinopatia diabética (incluindo o edema macular diabético), nas rupturas da membrana de Bruch1 na degeneração miópica, em tumores oculares e outras doenças retinianas relacionadas.

AMD é uma disfunção comum, para a qual a patogênese é claramente multifatorial, com fatores genéticos e ambientais desenvolvendo papéis em seu aparecimento e progressão. Vários estudos conduzidos determinaram vários fatores de risco para AMD, tais como tabagismo, envelhecimento, história familiar (Milton, Am J Ophthalmol 88, 269 (1979); Mitchell e outros, Ophthalmology 102, 1450-1460 (1995); Smith e outros, OphthalmoIogy 108, 697-704 (2001)), sexo (probabilidade 7 vezes maior em mulheres: Klein e outros, Ophthalmology 99, 933-943 (1992) e raça (brancos são mais suscetíveis). Fatores de risco adicionais podem incluir características do oIho, tais como hipermetropia (hiperopia) e olhos de cor clara, assim como a doença cardiovascular e a hipertensão. A evidência de envolvimento genético no aparecimento e progressão da doença também foi documentada (veja Hamdi $ Kenney, acima).

Atualmente, não existem modelos animais para estudo de AMD comumente aceitos. Os estudos iniciais de Malek et al (PNAS 102, 11900-5 (2005)) produziram um modelo animal que tinha três fatores de risco que, quando combinados, se aproximavam das características morfológicas da 30 AMD humana. Significativamente, o desenvolvimento desse modelo em camundongo forneceu a oportunidade para testar novos mecanismos moleculares e alvos terapêuticos para AMD. Permanece a necessidade de identificar novos alvos e agentes terapêuticos capazes de tratar e/ou prevenir as doenças oftálmicas, tais como a degeneração macular relacionada à idade (ambas, úmida e seca), glaucoma, retinopatia diabética (incluindo edema macular diabético), membrana neovascular coroidal (CNV), uveíte, degene5 ração miópica, tumores oculares, oclusão da veia central da retina, rubeosis, neovascularização ocular, retinopatia serosa central, discos da superfície ocular tais como olho seco, oclusão da artéria central da retina, edema macular cistoide e outras doenças retinianas degenerativas.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção descreve novos alvos terapêuticos implica

dos na patogênese das doenças oftálmicas. Em particular, a presente invenção descreve métodos para tratar a doença oftálmica que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um inibidor do peptídeo βamiloide (Αβ). O inibidor de Αβ pode ser administrado em indivíduos que so15 frem com doenças oftálmicas tais como a degeneração macular relacionada à idade (ambas, "AMD" úmida e seca), glaucoma, retinopatia diabética (incluindo edema macular diabético), membrana neovascular coroidal (CNV), uveíte, degeneração miópica, tumores oculares, oclusão da veia central da retina, rubeosis, neovascularização ocular, retinopatia serosa central, discos 20 da superfície ocular tais como olho seco, oclusão da artéria central da retina, edema macular cistoide e outras doenças retinianas degenerativas. Em uma modalidade, o inibidor é um anticorpo, uma molécula antissenso, uma molécula de siRNA, uma ribozima ou um composto de molécula pequena.

Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método 25 para tratar um indivíduo que sofre com a degeneração macular relacionada à idade, compreendendo administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor do peptídeo β-amiloide (Αβ). Outra modalidade da invenção diz respeito a um método para tratar um indivíduo que sofre com a degeneração macular 30 relacionada à idade (AMD), compreendendo administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de Αβ. Uma modalidade adicional da presente invenção fornece o uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de Αβ para a preparação de um medicamento que promova a recuperação de um paciente que sofre de AMD. Em um aspecto dessa modalidade, o anticorpo com5 preende uma região Fc que tem função efetora deficiente. Em um aspecto adicional, a doença é AMD, incluindo ambas AMD úmida e seca.

A invenção também fornece métodos para tratar ou prevenir doenças associadas com o depósito amiloide de Αβ, compreendendo administrar ao indivíduo uma dosagem eficaz de uma composição farmacêutica que 10 compreende um anticorpo que se ligue especificamente a um peptídeo Αβ ou uma forma agregada de um peptídeo Αβ. Em um aspecto adicional dessa modalidade, o anticorpo compreende uma região Fc com uma variação de uma região Fc que ocorre naturalmente, cuja variação resulta em função efetora deficiente. Em algumas modalidades, a administração do anticorpo 15 causa menos anticorpo sem a variação.

O anticorpo e o polipeptídeo usados nos métodos da invenção se ligam, especificamente, a um peptídeo Αβ ou a uma forma agregada de peptídeo Αβ. Em uma modalidade, o anticorpo ou o polipeptídeo têm função efetora deficiente. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o polipeptídeo 20 não é um fragmento F(ab')2- Em algumas modalidades, o anticorpo ou o polipeptídeo não são um fragmento Fab. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o polipeptídeo não são uma cadeia simples de anticorpo scFv.

Polipeptídeos que se ligam especificamente a um peptídeo Αβ ou a uma forma agregada de peptídeo Αβ e compreendem uma região cons25 tante de cadeia pesada que tenha função efetora deficiente podem, também ser usados para quaisquer dos métodos aqui descritos. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende uma seqüência (por exemplo, uma ou mais CDRs) derivada do anticorpo 9TL, 6G ou suas variantes mostradas na Tabela 3 ou Tabela 8.

Em algumas modalidades, o anticorpo ou o polipeptídeo com

preendem uma região constante de cadeia pesada que tem função efetora deficiente, em que a região constante de cadeia pesada compreende uma região Fe. Em algumas modalidades, a N-glicosilação na região Fc é removida. Em algumas modalidades, a região Fc compreende uma mutação dentro da seqüência de reconhecimento da N-glicosilação, através do que a região Fc do anticorpo ou do polipeptídeo não é N-glicosilada. Em algumas 5 modalidades, a região Fc é PEGuilada. Em algumas modalidades, a região constante da cadeia pesada do anticorpo ou do polipeptídeo é uma região constante da cadeia pesada de lgG2a humana contendo as seguintes mutações: A330P331 para S330S331 (numeração de aminoácidos com referência à seqüência de lgG2a de tipo selvagem). Em algumas modalidades, o 10 anticorpo ou o polipeptídeo compreendem uma região constante de lgG4 que compreende as seguintes mutações: E223F234L235 para P233V234A235.

Em algumas modalidades, o anticorpo ou o polipeptídeo se ligam, especificamente, a um epitopo dentro dos resíduos 1 a 16 do peptídeo Αβ. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o polipeptídeo se ligam, especificamente à terminação N do peptídeo Αβ. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o polipeptídeo se ligam, especificamente, a um epitopo dentro dos resíduos 16 a 28 do peptídeo Αβ. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o polipeptídeo se ligam, especificamente, a um epitopo sobre o lado Cterminal de um peptídeo Αβ, tal como um epitopo que começa a partir do aminoácido 25 ou depois. O anticorpo pode se ligar, especificamente, a qualquer um dos peptídeos Αβ 1-37, 1-38, 1-39, 1-40, 1-41, 1-42, 1-43. Em algumas modalidades, o anticorpo pode se ligar, especificamente, ao aminoácido livre C-terminal do peptídeo Αβ truncado na terminação C, por exempio, Αβ 1-37, 1-38, 1-39, 1-40, 1-41, 1-42, 1-43. Em uma modalidade, o anticorpo ou o polipeptídeo se ligam, especificamente, a um epitopo sobre o peptídeo Αβι.40. Em um aspecto adicional dessa modalidade, o anticorpo ou o polipeptídeo se ligam, especificamente, a um epitopo sobre o peptídeo Αβι-42. Em um outro aspecto adicional dessa modalidade, o anticorpo ou o polipeptídeo se ligam, especificamente, a um epitopo sobre o peptídeo Αβ-ι. 43. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o peptídeo se ligam, especificamene, a um epitopo dentro dos resíduos 28-40 do peptídeo Αβ-Μο- Em algumas modalidades, o anticorpo ou o polipeptídeo se ligam, especificamente, a um epitopo dentro dos resíduos 28 a 42 do peptídeo Αβι-42. Em algumas modalidades, 0 anticorpo ou o polipeptídeo se ligam, especificamente, a um epitopo dentro dos resíduos 28 a 43 do peptídeo Αβι-43. Em 5 algumas modalidades, o anticorpo ou o polipeptídeo se ligam, especificamente, ao peptídeo Αβ sem ligação com a proteína precursora de amiloide (APP). Em algumas modalidades, o anticorpo ou o polipeptídeo se ligam, especificamente, a forma agregada de Αβ sem ligação com a forma solúvel. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o polipeptídeo se ligam, especial10 mente, à forma solúvel de Αβ sem ligação com a forma agregada. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o polipeptídeo se ligam, especificamente, a ambas as formas agregadas e formas solúveis de Αβ.

Em algumas modalidades, o anticorpo ou o polipeptídeo se ligam, especificamente, a um peptídeo 33-40 C-terminal de Αβ-ι-40. Em algumas modalidades, 0 anticorpo ou o polipeptídeo se ligam, especificamente, a um epitopo sobre Αβ-ι-40 que inclui os aminoácidos 35 a 40. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o polipeptídeo se ligam, especificamente, a um epitopo sobre Αβ1.40 que inclui os aminoácidos 36 a 40. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o polipeptídeo se ligam, especificamente, a um epitopo sobre Αβ^ο que inclui os aminoácidos 39 e/ou 40. Em algumas modalidades, o anticorpo ou 0 polipeptídeo se ligam, especificamente, a Αβι-40 mas não se ligam especificamente a Αβ1.42 e/ou Αβι-43. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a região variável do anticorpo 9TL ou um anticorpo derivado de 9TL aqui descrito. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o polipeptídeo inibem competitivamente a ligação do anticorpo 9TL, 6G e/ou do anticorpo ou polipeptídeo derivados de 9TL ou 6G ao respectivo peptídeo Αβ.

Em algumas modalidades, o anticorpo ou o polipeptídeo se ligam a Αβι-40 com uma afinidade maior do que sua ligação com Αβι_42 e Αβι. 43. Em um aspecto adicional dessa modalidade, o anticorpo não é o anticorpo 2294. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga a um epitopo sobre Αβι-40 que inclui os aminoácidos 25 a 34 e 40. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende a região variável do anticorpo 6G ou de um anticorpo derivado de 6G aqui descrito. Em algumas modalidades, o anticorpo ou o polipeptídeo inibem competitivamente a ligação do anticorpo 6G e/ou anticorpo ou polipeptídeo derivado de 6G a Αβ.

5 Em algumas modalidades, o anticorpo ou o polipeptídeo se li

gam ao peptídeo Αβ com uma afinidade de ligação (K0) de cerca de 100 nM ou menos, ou 20 nM ou menos ou 2 nM ou menos. Em um aspecto dessa modalidade, o anticorpo ou o polipeptídeo se ligam ao peptídeo Αβ^ο com uma Kd de cerca de 100 nM ou menos, 50 nM ou menos ou 2 nM ou menos. 10 Em um aspecto adicional dessa modalidade, o anticorpo ou o polipeptídeo se ligam ao peptídeo Αβ^2 com uma K0 de cerca de 100 nM ou menos, 50 nM ou menos ou 2 nM ou menos.

A administração de um anticorpo ou de um polipeptídeo que se liguem especificamente a um peptídeo Αβ pode ser por qualquer um dos 15 meios conhecidos na técnica, incluindo: intravenosamente, subcutaneamente, por via inalatória, intra-arterial, intramuscularmente, intracardiacamente, intraventricularmente, parenteral, intratecal e intraperitoneal. A administração pode ser por injeção e/ou sistêmica, por exemplo, intravenosamente ou localizada. Isso também se aplica, geralmente, aos polipeptídeos e polinucleotí20 deos da invenção.

A invenção também fornece métodos para tratar uma doença oftálmica pela administração de uma composição que compreende uma quantidade eficaz de qualquer um dos anticorpos ou polipeptídeos que se liguem, especificamente, a um peptídeo Αβ ou a uma forma agregada de 25 peptídeo Αβ e que têm função efetora deficiente, ou polinucleotídeos que codificam os anticorpos ou polipeptídeos e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

A invenção também fornece kits e composições que compreendem qualquer uma ou mais das composições que compreendem uma quantidade eficaz de qualquer um dos anticorpos ou polipeptídeos que se liguem, especificamente, a um peptídeo Αβ ou a uma forma agregada de peptídeo Αβ ou polinucleotídeos que codificam os anticorpos ou polipeptídeos. Esses kits, geralmente em embalagens adequadas e fornecidos com as instruções apropriadas, são úteis para qualquer um dos métodos aqui descritos.

A invenção também fornece um método de produção de um anticorpo terapêutico humanizado para tratamento de uma doença associada a 5 depósitos amiloides de peptídeo Αβ no cérebro de um indivíduo humano, compreendendo selecionar um primeiro anticorpo humanizado que se ligue especificamente ao peptídeo Αβ ; e alterar a região Fc do anticorpo para fornecer um anticorpo terapêutico humanizado que tem função efetora deficiente em relação ao primeiro anticorpo humanizado.

Outra modalidade da presente invenção é dirigida para um mé

todo de proteger ou recuperar a função retiniana em um indivíduo, compreendendo administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de Αβ. Em uma modalidade, o inibidor é um anticorpo, uma molécula antissenso, uma molécula de siRNA, uma ribozima ou um composto de molécula pequena.

Outra modalidade da presente invenção é dirigida para um método de conservar ou restaurar a acuidade visual em um indivíduo, compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um inibidor de Αβ.

Em um aspecto das modalidades acima, os métodos acima são usados em indivíduos que também não estão sendo tratados de mal de Alzheimer, síndrome de Down ou angiopatia amiloide cerebral.

Os métodos da invenção acima mencionados, incluem um inibidor de Αβ, que é um anticorpo. Em um aspecto, a invenção aqui descrita refere-se a anticorpos que se ligam à terminação C de um peptídeo Αβι-40 25 (SEQ ID N0 15 mostrada na Tabela 4). Consequentemente, em um aspecto, os métodos compreendem o tratamento com um anticorpo 9TL (alternativamente denominado "9TL") que é produzido por vetores de expressão que têm os números de Acesso da ATCC PTA-6124 e PTA-6125. As seqüências de aminoácidos das regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve de 30 9TL são mostradas na Figura 1. As porções da região determinante de complementaridade (CDR) do anticorpo 9TL (incluindo as CDRs de Chothia e Kabat) também são mostradas na Fiqura 1. Entende-se que a referência a qualquer parte ou a região inteira de 9TL abrange as seqüências produzidas pelos vetores de expressão que têm os números de Acesso da ATCC PTA6124 e PTA-6125 e/ou as seqüências descritas na Figura 1.

Em outro aspecto, a invenção compreende a administração de 5 variantes do anticorpo 9TL com as seqüências de aminoácidos descritas na Tabela 3.

Em outro aspecto, a invenção compreende a administração de um anticorpo que compreende um fragmento ou uma região do anticorpo 9TL ou sua variante mostrada na Tabela 3. Em uma modalidade, o fragmen10 to é a cadeia leve do anticorpo 9TL. Em outra modalidade ainda, o fragmento é a cadeia pesada do anticorpo 9TL. Em outra modalidade ainda, o fragmento contém uma ou mais regiões variáveis de uma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada do anticorpo 9TL. Em outra modalidade, o fragmento contém uma ou mais regiões variáveis de uma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada 15 mostradas na Figura 1. Em outra modalidade ainda, o fragmento contém uma ou mais CDRs de uma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada do anticorpo 9TL.

Em outro aspecto, a invenção compreende a administração de polipeptídeos (que podem ou não ser um anticorpo) que compreendem um ou mais dos seguintes: a) uma ou mais CDRs do anticorpo 9TL ou sua variante mostrada na Tabela 3; b) CDR H3 da cadeia pesada do anticorpo 9TL ou sua variante mostrada na Tabela 3; c) CDR L3 da cadeia leve do anticorpo 9TL ou sua variante mostrada na Tabela 3; d) três CDRs da cadeia leve do anticorpo 9TL ou suas variantes mostradas na Tabela 3; e) três CDRs da cadeia pesada do anticorpo 9TL ou suas variantes mostradas na Tabela 3; f) três CDRs da cadeia leve e três CDRs da cadeia pesada do anticorpo 9TL ou suas variantes mostradas na Tabela 3. A invenção fornece ainda a administração de polipeptídeos (que podem ou não ser um anticorpo) compreendendo qualquer um ou mais dos seguintes: a) uma ou mais (uma, duas, três, quatro, cinco ou seis) CDRs derivadas do anticorpo 9TL ou suas variantes mostradas na Tabela 3; b) uma CDR derivada de CDR H3 da cadeia pesada do anticorpo 9TL; e/ou c) uma CDR derivada de CDR L3 da cadeia leve do anticorpo 9TL. Em algumas modalidades, a CDR é uma CDR mostrada na Figura 1. Em algumas modalidades, a uma ou mais CDRs derivadas do anticorpo 9TL ou suas variantes mostradas na Tabela 3 são pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos 5 cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% idênticas a pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos 10 três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, ou pelo menos seis CDRs de 9TL ou suas variantes.

Em outro aspecto, a invenção compreende a administração de um anticorpo 6G (alternativamente denominado "6G"). As seqüências de aminoácidos das regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve de 6G 15 são mostradas na Figura 8. As porções da região determinante de complementaridade (CDR) do anticorpo 6G (incluindo as CDRs de Chothia e Kabat) também são mostradas na Figura 8.

Em outro aspecto, a invenção compreende a administração de variantes do anticorpo 6G com as seqüências de aminoácidos descritas na Tabela 8.

Em outro aspecto, a invenção compreende a administração de um anticorpo que compreende um fragmento ou uma região do anticorpo 6G ou sua variante mostrada na Tabela 8. Em uma modalidade, o fragmento é a cadeia leve do anticorpo 6G. Em outra modalidade, o fragmento é a cadeia 25 pesada do anticorpo 6G. Em outra modalidade ainda, o fragmento contém uma ou mais regiões variáveis de uma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada do anticorpo 6G. Em outra modalidade, o fragmento contém uma ou mais regiões variáveis de uma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada mostradas na Figura 8. Em outra modalidade, o fragmento contém uma ou mais CDRs de 30 uma cadeia leve e/ou de uma cadeia pesada do anticorpo 6G.

Em outro aspecto, a invenção compreende a administração de polipeptídeos (que podem ou não ser um anticorpo) que compreendem um ou mais dos seguintes: a) uma ou mais CDRs do anticorpo 6G ou sua variante mostrada na Tabela 8; b) CDR H3 da cadeia pesada do anticorpo 6G ou sua variante mostrada na Tabela 8; c) CDR L3 da cadeia leve do anticorpo 6G ou sua variante mostrada na Tabela 8; d) três CDRs da cadeia leve 5 do anticorpo 6G ou suas variantes mostradas na Tabela 8; e) três CDRs da cadeia pesada do anticorpo 6G ou suas variantes mostradas na Tabela 8; f) três CDRs da cadeia leve e três CDRs da cadeia pesada do anticorpo 6G ou suas variantes mostradas na Tabela 8. A invenção fornece ainda a administração de polipeptídeos (que podem ou não ser um anticorpo) compreen10 dendo qualquer um ou mais dos seguintes: a) uma ou mais (uma, duas, três, quatro, cinco ou seis) CDRs derivadas do anticorpo 6G ou suas variantes mostradas na Tabela 8; b) uma CDR derivada de CDR H3 da cadeia pesada do anticorpo 6G; e/ou c) uma CDR derivada de CDR L3 da cadeia leve do anticorpo 6G. Em algumas modalidades, a CDR é uma CDR mostrada na 15 Figura 8. Em algumas modalidades, a uma ou mais CDRs derivadas do anticorpo 6G ou suas variantes mostradas na Tabela 8 são pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, 20 pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% idênticas a pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, ou pelo menos seis CDRs de 6G ou suas variantes.

Em um aspecto adicional, a invenção compreende a administra

ção de um anticorpo que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende três CDRs da região variável da cadeia pesada de 6G mostrada na SEQ ID N0 26 e uma região variável de cadeia leve compreendendo três CDRs da região variável da cadeia leve de 6G mostrada na SEQ ID N0 30 27. Em outro aspecto, a invenção compreende a administração de um anticorpo que compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende três CDRs mostradas na SEQ ID N0 28, SEQ ID N°29 e SEQ ID N0 30 e uma região variável de cadeia leve compreendendo três CDRs mostradas na SEQ ID N0 31, SEQ ID N°32 e SEQ ID N°33. Em outro aspecto ainda, a invenção compreende uma região variável da cadeia pesada que compreende a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°26 e uma região va5 riável da cadeia leve que compreende a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°27. Em outro aspecto ainda, a invenção compreende a seqüência de aminoácidos de cadeia pesada mostrada na SEQ ID N°36 e a seqüência de aminoácidos de cadeia leve mostrada na SEQ ID N°37.

Em algumas modalidades, a CDR é a CDR de Kabat. Em outras 10 modalidades, a CDR é a CDR de Chothia. Em outras modalidades, a CDR é uma combinação de CDR de Kabat e uma de Chothia (também denominada "CDR combinada" ou "CDR estendida"). Em outras palavras, para qualquer dada modalidade que contém mais do que uma CDR, as CDRs podem ser de Kabat, Chothia e/ou combinadas.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo (tal como um anticor

po) compreende uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N0 5, em que L1 é L, V, ou I; em que Y2 é Y ou W; em que S3 é S, T, ou G; em que L4 é L, R, A, V, S, T, Q, ou E; em que V6 é V, I, T, P, C, Q, S, N, ou F; e em que Y7 é Y, H, F, W, S, I, V, ou A. Em algumas modalidades, a sequên20 cia de aminoácidos é uma CDR3 em uma região variável de cadeia pesada. Por conveniência, "é" nesse contexto ou em referência a um aminoácido refere-se a escolhas de aminoácido(s) para uma dada posição com referência à posição na SEQ ID. Por exemplo, "L1 é L, V ou I", refere-se ao aminoácido L na posição 1 na SEQ ID N°5 que pode ser substituído por V ou I.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo (tal como um anticor

po) compreende uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°6, em que Y8 é Y, A, ou H; e em que A11 é A ou S; e em que K12 é K ou A. Em algumas modalidades, a seqüência de aminoácidos é uma CDR1 em uma região variável de cadeia leve.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo (tal como um anticor

po) compreende uma seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°8 em que L1 é L, Μ, N, C, F, V, K, S, Q, G, S; em que G3 é G, S1 ou T; em que Τ4 é T ou S; em que H5 é H ou L; em que Y6 é Y1 P, A, W, Q, M, S, ou E; em que V8 é V, L1 K1 Η, T, A, E, ou M; e em que L9 é L1 I, T, S, ou V. Em algumas modalidades, a seqüência de aminoácidos é uma CDR3 em uma região variável de cadeia leve.

5 Em algumas modalidades, o polipeptídeo (tal como um anticor

po) compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende (a) uma região de CDR1 mostrada na SEQ ID N0 3; (b) uma região de CDR2 mostrada na SEQ ID N0 4; e (c) uma região de CDR3 mostrada na SEQ ID N0 5, em que L1 é L, V, ou I; em que Y2 é Y ou W; em que S3 é S1 T, ou G; 10 em que L4 é L, R, A, V, S, T, Q, ou E; em que V6 é V, I, T, P, C1 Q, S, N, ou F; e em que Y7 é Y, H, F, W, S, I, V, ou A.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo (tal como um anticorpo) compreende uma região variável de cadeia leve que compreende (a) uma região de CDR1 mostrada na SEQ ID N0 6, em que Y8 é Y, A ou H; e 15 em que A11 é A ou S; e em que K12 é K ou A; (b) uma região de CDR2 mostrada na SEQ ID N0 7; e (c) uma região de CDR3 mostrada na SEQ ID N0 8, em que L1 é L1 Μ, N, C, F, V, K, S, Q, G1 S; em que G3 é G, S1 ou T; em que T4 é T ou S; em que H5 é H ou L; em que Y6 é Y, P, A, W1 Q, M, S, ou E; em que V8 é V, L, K, H, T1 A, E, ou M; e em que L9 é L1 I, T1 S1 ou V.

Em algumas modalidades, o anticorpo da invenção é um anti

corpo humano. Em outras modalidades, o anticorpo da invenção é um anticorpo humanizado. Em algumas modalidades, o anticorpo é monoclonal. Em algumas modalidades, o anticorpo (ou o polipeptídeo) é isolado. Em algumas modalidades, o anticorpo (ou o polipeptídeo) é substancialmente puro.

A região constante da cadeia pesada dos anticorpos pode ser de

qualquer tipo de região constante, tal como IgG, IgM1 IgD1 IgA e IgE; e de quaisquer isotipos, tais como IgGI, lgG2, lgG3 e lgG4.

Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região constante modificada, tal como uma região constante que é imunologicamente inerte (que inclui parcial e imunologicamente inerte e é usado alternativamente com a expressão "que tem a função efetora deficiente"), por exemplo, não desencadeia a Iise mediada pelo complemento, não estimula a citotoxicidade celular mediada por anticorpo (ADCC) ou não ativa a microglia. Em algumas modalidades, a região constante é modificada como descrito em Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624; Pedido PCT No. PCT/GB99/01441; e/ou Pedido de Patente UK No. 9809951.8. Em outras 5 modalidades, o anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada de lgG2 humana, compreendendo as seguintes mutações: A330P331 para S330S331 (numeração de aminoácidos com referência à seqüência de lgG2 de tipo selvagem). Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624. Em algumas modalidades, o anticorpo compreende uma região constante de lgG4 com10 preendendo as seguintes mutações: E233F234L235 para P233V234A235. Em outras modalidades ainda, a região constante é aglicosilada para glicosilação ligada a N. Em outras modalidades ainda, a região constante é aglicosilada para glicosilação ligada a N pela mutação do acoplamento do resíduo de oligossacarídeo (tal como Asn297) e/ou resíduos flanqueadores que são 15 parte da seqüência de reconhecimento de N-glicosilação na região constante. Em algumas modalidades, a região constante é aglicosilada para glicosilação ligada a N. A região constante é aglicosilada para glicosilação ligada a N enzimaticamente ou pela expressão em uma célula hospedeira deficiente para glicosilação.

Em outro aspecto, a invenção fornece um polinucleotídeo (que

pode ser isolado) compreendendo um polinucleotídeo que codifica um fragmento ou uma região do anticorpo 9TL ou 6G ou suas variantes mostradas na Tabela 3 e Tabela 8. Em uma modalidade, o fragmento é uma cadeia leve do anticorpo 9TL ou 6G. Em outra modalidade, o fragmento é uma cadeia 25 pesada do anticorpo 9TL ou 6G. Em outra modalidade ainda, o fragmento contém uma ou mais regiões variáveis de uma cadeia leve e/ou uma cadeia pesada do anticorpo 9TL ou 6G. Em outra modalidade ainda, o fragmento contém uma ou mais (isto é, um, dois, três, quatro, cinco, seis) regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de uma cadeia leve e/ou cadeia 30 pesada do anticorpo 9TL ou 6G.

BREVE DESCRIÇÃO DAS VÁRIAS APRESENTAÇÕES DAS FIGURAS

Figura 1 mostra a seqüência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada (SEQ ID N0 1) e da região variável de cadeia leve (SEQ ID N0 2) do anticorpo 9TL. As CDRs de Kabat estão em negrito e as CDRs de Chothia estão sublinhadas. Os resíduos de aminoácidos para a região variável de cadeia pesada e região variável de cadeia leve estão numerados se5 quêncialmente.

Figura 2 mostra o mapeamento do epitopo do anticorpo 9TL pela competição com peptídeo. O peptídeo Αβι-40 foi imobilizado sobre o chip SA. O anticorpo monoclonal 2289 e o fragmento Fab de 9TL (50 nM de cada), cada um dos quais foi pré-incubado por 1 h com 10 μΜ de vários peptídeos 10 (aminoácidos 28-40, 1-40, 1-28, 28-42, 22-35, 1-16, 1-43, 33-40, 1-38 ou 17- 40 de Αβ) ou sem peptídeo, e então colocados sobre o chip. A ligação do fragmento Fab do anticorpo ao peptídeo Αβι.40 foi medida.

Figura 3 é um gráfico que mostra o mapeamento do epitopo do anticorpo 2H6 pela competição com peptídeo. O peptídeo Αβ-Mo foi imobili15 zado sobre o chip SA. O anticorpo monoclonal 2289, 2286 ou 2H6 (100 nM de cada), cada um dos quais foi pré-incubado por 1 h com 16 μΜ de vários peptídeos (aminoácidos 1-16, 1-28, 1-38, 1-40, 1-42, 1-43, 17-40, 17-42, 22- 35, 25-35 ou 33-40 de Αβ) ou sem peptídeo, e então colocados sobre o chip. A ligação do anticorpo ao peptídeo Αβι.40 foi medida.

Figura 4 é um gráfico que mostra a ligação do anticorpo 2H6,

2286 e 2289 a diferentes variantes C-terminais do peptídeo Αβ. As variantes GST-Αβ (M35A, V36A, G37A, G38A, V39A ou V40A) ou do peptídeo GSTΑβ 1-39, 1-41, 1-40, 1-42 foram imobilizadas sobre uma placa de ELISA. Os anticorpos monoclonais 2286, 2H6 ou 2289 (0,3 nM de cada) foram incuba25 dos com cada um dos peptídeos imobilizados e sua ligação foi detectada pela incubação posterior com IgG anticamundongo biotinilada (H+L) e seguida por Estreptavidina-HRP.

Figura 5 é um gráfico da intensidade de ondas a e b (A) e eletrorretinogramas de amostra (B) da isoforma E4 de apoliproteína (APOE4) de camundongos idosos com dieta normal versus dieta rica em gordura e colesterol.

Figura 6 é um gráfico de intensidade de ondas b apenas de camundongos ΑΡΟΕ4 plotadas contra estudos prévios de animais com dieta normal. O traçado R2 mostra a proteção ou a recuperação da função retiniana quando camundongos com características similares a AMD (E4-HFC-R2) foram tratados com anticorpo anti-Αβ.

5 Figura 7 mostra a imuno-histoquímica total de Αβ de cérebro de

camundongos com características similares a AMD (APOE4). Lâmina A (camundongos com características similares a AMD tratados com anticorpo anti-Αβ) mostra detecção negativa para amiloide. As lâminas B1 C e D (camundongos com características similares a AMD tratados com injeção de 10 veículo) mostram detecção positiva de amiloide. Lâmina E é retirada de um controle positivo e é retirada do cérebro de um modelo de camundongo APP derivada de plaqueta (pdAPP, APP humana mutada (V717F) sob o controle do promotor do fator de crescimento derivado de plaqueta (Garnes, D. e outros, Nature 373:523-527 (1995)).

Figura 8 mostra a seqüência de aminoácidos da região variável

de cadeia pesada (SEQ ID N0 1) e da região variável de cadeia leve (SEQ ID N0 27) do anticorpo 6G. As CDRs de Kabat estão em negrito e as CDRs de Chothia estão sublinhadas. Os resíduos de aminoácidos para a região variável de cadeia pesada e região variável de cadeia leve estão numerados sequêncialmente.

Figura 9 mostra o mapeamento do epitopo do anticorpo 6G por ELISA. Os peptídeos Αβ (1-16, 1-28, 17-40, 17-42, 22-35, 28-40, 28-42, 1- 38, 1-40, 1-42, 1-43 e 33-40) foram imobilizados sobre placas de ELISA. O anticorpo monoclonal 6G (20 nM) foi incubado por 1 h com vários peptídeos 25 imobilizados. O anticorpo G6 ligado a vários peptídeos Αβ foi medido usando anticorpo secundário de cabra anti-kappa humana conjugado com HRP.

Figura 10 mostra o mapeamento do epitopo do anticorpo 6G por ELISA. Vários peptídeos Αβ foram imobilizados sobre placas de ELISA. O anticorpo 6G foi incubado por 1 h com vários peptídeos imobilizados. O anti30 corpo G6 ligado aos peptídeos Αβ imobilizados foi medido usando anticorpo secundário de cabra anti-kappa humana conjugado com HRP. "NB" referese a nenhuma liqação detectada. Figura 11 é um gráfico esquemático que mostra o epitopo que o anticorpo 6G liga sobre Αβ. As posições relativas de Αβ na proteína precursora de amiloide (APP) e a porção de APP na membrana celular são mostradas. "CT99" refere-se ao aminoácido 99 C-terminal de APP.

5 Figura 12 é uma fotografia que mostra a imuno-coloração de cé

lulas que expressam APP com anticorpo monoclonal dirigido contra Αβι-ιβ (m2324) e anticorpo 6. Os painéis superiores mostram as células sob microscopia de fluorescência após as células serem incubadas com m2324 ou 6G (5 ug/ml de cada) e a ligação ter sido detectada por anticorpo secundário 10 de cabra anticamundongo conjugado com Cy3 ou anticorpo anti-humano. Os painéis inferiores mostram células observadas sob o microscópio.

Figura 13 é um gráfico da intensidade de ondas b apenas de cinco grupos de estudo de camundongos APOE4: camundongos APOE4 de controle com dieta normal; camundongos APOE4 de controle com dieta rica 15 em gordura e colesterol ('HFC') (o modelo com características similares a AMD); camundongos APOE4-HFC tratados com 7G10; camundongos APOE4-HFC tratados com 2H6; e camundongos APOE4-HFC tratados com 6G.

Figura 14 é um gráfico de intensidade de ondas b apenas de três grupos de estudo de camundongos APOE4: camundongos APOE4 de controle com dieta normal; camundongos APOE4-HFC de controle; e camundongos APOE4-HFC tratados com 6G.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

O modelo de AMD em camundongo tem sido importante para testar a hipótese de que, sem estar restrito pela teoria, a desregulação do 25 transporte de lipídeo e a deposição de amiloide podem contribuir para a patogênese das alterações retinianas observadas, vistas na degeneração macular relacionada à idade, glaucoma, retinopatia diabética (incluindo e edema macular) e outras doenças retinianas relacionadas. A deposição de Αβ tem sido intensamente estudada no mal de Alzheimer e estudos anteriores 30 indicaram um papel potencial de Αβ na degeneração macular relacionada à idade (Yoshida, T., et al, J. of Clin. Invest., 115(10): 2793-2800 (2005); Anderson, D. et al, Experimental Eye Research 78: 243-256 (2004); Johnson, L. et al, PNAS, 99(18): 11820-11835(2002)) and glaucoma (McKinnon SJ1 Front Biosci 8: 1140-56 (2003); Tatton et al, Surv Ophthalmol. 48: S25-37 (2003)). Entretanto, não cabe mais discussão com relação a se um inibidor de Αβ pode fornecer benefício terapêutico no tratamento da degeneração macular 5 pela efeito de proteção e/ou recuperação retiniana. Além disso, não se discute mais que quaisquer das isoformas de Αβ pode contribuir diversamente para a patogênese de AMD.

Como discutido acima, Αβ é o principal constituinte das placas neuríticas encontradas no mal de Alzheimer. Αβ é o produto de clivagem da proteína precursora de beta amiloide (βΑΡΡ ou APP). APP é uma glicoproteína transmembrana tipo I que contém um grande domínio ectópico Nterminal, um domínio transmembrana e uma pequena cauda terminal citoplasmática. O splicing alternativo do transcrito do gene único de APP sobre o cromossomo 21 resulta em várias isoformas que diferem no número de aminoácidos. Estudos prévios no mal de Alzheimer estabeleceram que a isoforma Αβι-42 é essencial para a deposição de amiloide e que Αβι.42 ao contrário de Αβι-40 pode ser a molécula iniciadora da patogênese no mal de Alzheimer (McGowan, E. et al, Neuron 47: 191-199 (2005). Estudos adicionais da mal de Alzheimer sugeriram, além disso, que a isoforma Αβ^ο poderia realmente inibir a deposição de amiloide e que um inibidor de Αβ-Mo poderia piorar o curso do mal de Alzheimer (Kim, J. et al, Neurobiology of Disease, 27(3): 627-633 (2007).

A invenção aqui descrita fornece métodos para prevenir e/ou tratar doenças oftálmicas, tais como a degeneração macular relacionada à 25 idade (ambas, úmida e seca), glaucoma. retinopatia diabética (incluindo edema macular diabético), ruptura da membrana de Bruch, degeneração miópica, tumores oculares e outras doenças degenerativas retinianas relacionadas, em um indivíduo pela administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo 9TL ou 6G ou de um anticorpo ou polipeptídeo 30 derivados deles. O anticorpo 9TL e seus derivados foram descritos na W02006036291, cuja descrição está incorporada aqui por referência em sua totalidade. Os anticorpos e polipeptídeos usados nos métodos se ligam a terminação C de Αβι-40· O anticorpo 6G e seus derivados foram descritos nas W02006036291 e WO 2006118959, cujas descrições estão incorporadas aqui por referência em suas totalidades. Os métodos da invenção pretendem incluir todos os inibidores de Αβ incluindo, mas não limitados a com5 postos de moléculas pequenas e biológicos tais como anticorpos, moléculas antissenso, moléculas de siRNA e ribozimas.

Técnicas Gerais

A prática da presente invenção empregará, a menos que indicado de outra maneira, as técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunologia, que estão dentro do conhecimento profissional da técnica. Tais técnicas estão completamente explicadas na literatura, tais como, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook e outros, 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.l. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts1 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths1 and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel e outros, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis e outros, eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan e outros, eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a Iaboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995). Definições

Um "inibidor de peptídeo Αβ" é qualquer agente capaz de diminuir a produção e/ou deposição de peptídeo Αβ. Um inibidor de peptídeo Αβ inclui, mas não está limitado a um anticorpo, uma molécula antissenso, uma molécula de siRNA, uma ribozima ou um composto de molécula pequena. Além disso, um inibidor de peptídeo Αβ é qualquer agente capaz de se ligar ao peptídeo Αβ e diminuir a deposição da placa de Αβ, incluindo quaisquer agentes capazes de romper a clivagem proteolítica da proteína precursora de amiloide nos produtos de peptídeo Αβ. Alvos adicionais para a inibição da produção e deposição de peptídeo Αβ incluem, mas não são limitados a, por exemplo, terapêuticos de molécula pequena ou de siRNA capazes de inibir ou silenciar a β-secretase (também chamada de BACE1 ou memapsina-2) ou o complexo de gama secretase (que consiste, minimamente, em quatro proteínas individuais: presenilina, nicastrina, parte anterior defectiva-1 da faringe (APH-1) e intensificadora de presenilina 2 (PEN-2).

Um "anticorpo" é uma molécula de imunoglobulina capaz de se ligar especificamente a um alvo, tal como um carboidrato, polinucleotídeo, lipídeo, polipeptídeo, etc., através de pelo menos um sítio de reconhecimento de antígeno, localizado na região variável da molécula de imunoglobulina. 20 Como usado aqui, a expressão abrange não apenas anticorpos policlonais ou monoclonais intactos, mas também seus fragmentos (tais como Fab, Fab', F(ab')2, Fv), cadeia simples (scFv), seus mutantes, proteínas de fusão que compreendem uma porção de anticorpo e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreenda um sítio de re25 conhecimento de antígeno. Um anticorpo inclui um anticorpo de qualquer classe, tal como IgG, IgA ou IgM (ou suas subclasses) e o anticorpo não precisa ser de nenhuma classe em particular. Dependendo do anticorpo, da seqüência de aminoácidos do domínio constante de suas cadeias pesadas, as imunoglobulinas podem ser classificadas em classes diferentes. Há cinco 30 classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM e várias dessas podem ainda ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo: IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgAI e lgA2. Os domínios constantes da cadeia pesada que correspondem as diferentes classes de imunoglobulinas são chamados de alfa, delta, épsilon, gama e mu, respectivamente. As estruturas das subunidades e as configurações tridimensionais das diferentes classes de imunoglobulinas são bem-conhecidas.

5 Como usado aqui, "anticorpo monoclonal" refere-se a um anti

corpo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos exceto pelas possíveis mutações que ocorrem naturalmente que podem estar presentes em pequenas quantidades. Anticorpos monoclonais são al10 tamente específicos, sendo dirigidos contra um único sítio antigênico. Além disso, em contraste com as preparações de anticorpo policlonal, que tipicamente incluem anticorpos diferentes dirigidos contra determinantes (epitopos) diferentes, cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante sobre o antígeno. O modificador "monoclonal" indica o caráter do 15 anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos e não é para ser interpretado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método em particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser feitos pelo método do hibridoma descrito primeiro por Kohler e 20 Milstein, 1975, Nature, 256:495 ou podem ser feitos pelos métodos de DNA recombinante tais como descritos na Patente U.S. N0 4.816.567. Os anticorpos monoclonais também podem ser isolados de bibliotecas de fagos geradas usando as técnicas descritas em McCafferty e outros, 1990, Nature, 348:552-554, por exemplo.

Como usado aqui, anticorpos "humanizados" referem-se a for

mas não-humanas de anticorpo (por exemplo, murino) que são imunoglobulinas quiméricas específicas, cadeias de imunoglobulinas ou seus fragmentos (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequências específicas que se liguem ao antígeno) que contém a seqüência mínima derivada de 30 imunoglobulina não-humana. Na maioria dos casos, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) nas quais resíduos de uma região determinante de complementaridade (CDR) são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não-humana (anticorpo doador), tal como um camundongo, rato ou coelho, que tem a especificidade, afinidade e capacidades desejadas. Em alguns casos, resíduos Fv da região estrutural (FR) da imunoglobulina humana são substituídos pelos correspondentes resíduos não-humanos. Além disso, o anticorpo humanizado pode compreender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo receptor nem na CDR ou seqüências estruturais importadas, mas são incluídas para refinar e otimizar o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá, substancialmente, todos ou pelo menos um e tipicamente dois domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões de CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não-humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma seqüência consenso de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também compreenderá, otimamente, pelo menos uma porção de uma região ou domínio constante (Fe) de imunoglobulina, tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Anticorpos podem ter regiões Fc modificadas como descrito em WO 99/58572. Outras formas de anticorpos humanizados têm uma ou mais CDRs (uma, duas, três, quatro, cinco, seis) que são alteradas com relação ao anticorpo original, que também são denominadas uma ou mais CDRs "derivadas de" uma ou mais CDRs do anticorpo original.

Como usado aqui, "anticorpo humano" significa um anticorpo que tem uma seqüência de aminoácidos que corresponde àquela de um anticorpo produzido por um ser humano e/ou que tenha sido feito usando quaisquer técnicas para fazer anticorpos humanos conhecidas na técnica ou 25 aqui descritas. Essa definição de um anticorpo humano inclui anticorpos que compreendem pelo menos um polipeptídeo de cadeia pesada humana ou pelo menos um polipeptídeo de cadeia leve humana. Um exemplo é um anticorpo que compreende polipeptídeos da cadeia leve de murino e da cadeia pesada humana. Anticorpos humanos podem ser produzidos usando várias 30 técnicas conhecidas. Em uma modalidade, o anticorpo humano é selecionado de uma biblioteca de fagos, onde aquela biblioteca de fagos expressa anticorpos humanos ((Vaughan e outros, 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets e outros, 1998, PNAS, (USA) 95:6157-6162; Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks e outros, 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Anticorpos humanos também podem ser feitos pela introdução de Ioci de imunoglobulina humana em animais transgênicos, por exem5 pio, camundongos nos quais os genes endógenos de imunoglobulina tenham sido parcialmente ou completamente inativados. Essa abordagem é descrita nas Patentes U.S. N0 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425 e 5.661.016. Alternativamente, o anticorpo humano pode ser preparado pela imortalização de linfócitos B humanos que produzem um anti10 corpo dirigido contra um antígeno-alvo (tais linfócitos B podem ser recuperados de um indivíduo ou podem ser imunizados in vitro). Veja, por exemplo, Cole e outros, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner e outros, 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95; e Patente U.S. No. 5.750.373.

Como usadas aqui, as expressões "9TL" e "anticorpo 9TL" são

usadas alternadamente para referir-se a um anticorpo produzido por vetores de expressão que têm os números de depósito da ATCC PTA-6124 e ATCC PTA-6125. As seqüências de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve são mostradas na Figura 1. As porções de CDR do 20 anticorpo 9TL (incluindo as CDRs de Chothia e Kabat) estão diagramaticamente descritas na Figura 1. Os polinucleotídeos que codificam as regiões variáveis das cadeias pesada e leve são mostrados na SEQ ID N0 9 e SEQ ID N0 10. A caracterização de 9TL está descrita nos Exemplos.

Como usadas aqui, as expressões "6G" e "anticorpo 6G" são 25 usadas alternadamente para referir-se a um anticorpo que tem a seqüência de aminoácidos da cadeia pesada mostrada na SEQ ID N°36 e a seqüência de aminoácidos da cadeia leve mostrada na SEQ ID N°37. As seqüências de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve são mostradas na Figura 8. As porções de CDR do anticorpo 6G (incluindo as 30 CDRs de Chothia e Kabat) estão diagramaticamente descritas na Figura 8. Os polinucleotídeos que codificam as regiões variáveis das cadeias pesada e leve são mostrados na SEQ ID N0 38 e SEQ ID N0 39. A caracterização de 9TL está descrita nos Exemplos.

As expressões "polipeptídeo", "oligopeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são usadas aqui alternadamente para referir-se a polímeros de aminoácidos de qualquer extensão. O polímero pode ser linear ou ramificado, ele pode compreender aminoácidos modificados e ele pode ser interrompido por não-aminoácidos. As expressões também abrangem um polímero de aminoácidos que tenha sido naturalmente modificado ou por intervenção; por exemplo, formação de ligação dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como a conjugação com um componente marcador. Também estão incluídos dentro dessa definição, por exemplo, polipeptídeos que contêm um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não-naturais, etc.), assim como outras modificações conhecidas na técnica. É entendido que, como os polipeptídeos dessa invenção são baseados em anticorpos, os polipeptídeos podem ocorrer como cadeias simples ou cadeias associadas.

"Polinucleotídeo" ou "ácido nucleico", como aqui usados alternadamente, referem-se a polímeros de nucleotídeos de qualquer extensão, e incluem DNA e RNA. Os nucleotídeos podem ser desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, nucleotídeos ou bases modificadas e/ou seus análogos ou qualquer substrato que possa ser incorporado em um polímero por uma DNA ou RNA polimerase. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e seus análogos. Se presente, a modificação na estrutura do nucleotídeo pode ser transmitida antes ou depois da união de um polímero. A seqüência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não-nucleotídeos. Um polinucleotídeo pode ser ainda modificado após a polimerização, tal como por conjugação com um componente marcador. Outros tipos de modificações incluem, por exemplo, "caps", substituição de um ou mais nucleotídeos que ocorrem naturalmente por um análogo, modificações internucleotídeo tais como, por exemplo, aquelas com ligações não carregadas (por exemplo, fosfonatos de metila, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) e com ligações carregadas (por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquelas que contêm porções pendentes, tais como, por exemplo, proteínas (por exemplo, nucleases, toxinas, anticorpos, peptídeos de sinal, poli-L-lisina, etc.), aquelas com intercaladores (por exemplo, acridina, psoralen, etc.), aquelas que contêm queIantes (por exemplo, metais radioativos, boro, metais oxidativos, etc.), aqueIas que contêm alquilantes, aquelas que contêm ligações modificadas (por exemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), assim como formas nãomodificadas dos polinucleotídeos. Adicionalmente, quaisquer dos grupos hidroxila comumente presentes nos açúcares pode ser substituído, por exemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos protetores padronizados ou ativados para preparar ligações adicionais para nucleotídeos adicionais ou podem ser conjugados com suportes sólidos. A OH 5' e 3' terminal pode ser fosforilada ou substituída por aminas ou porções de grupos de revestimento orgânico entre 1 a 20 átomos de carbono. Outras hidroxílas também podem ser derivatizadas para grupos protetores padronizados. Polinucleotídeos também podem conter formas análogas de açúcares de ribose ou desoxiribose que são comumente conhecidas na técnica, incluindo, por exemplo, 2'-0-metiI-, 2-O-alila, 2'-fluoro- ou 2'-azido-ribose, análogos de açúcares carbocíclicos, açúcares α-anoméricos, açúcares epiméricos tais como arabinose, xiloses ou lixoses, açúcares de piranose, açúcares de furanose, sedo-heptuloses, análogos acíclicos e análogos de nucleosídeos abásicos tais como metil ribosideo. Uma ou mais ligações de fosfodiéster podem ser substituídas por grupos Iigantes alternativos. Esses grupos Iigantes alternativos incluem, mas não são limitados a modalidades nas quais o fosfato é substituído por P(O)Sftioato"), P(S)S ("ditioato"), "(O)NR2 ("amidato"), P(O)R, P(O)OR', CO ou CH2 ("formacetal"), em que cada R ou R' é independentemente H ou alquila (1-20 C) substituída ou não-substituída, opcionalmente contendo uma ligação éter (-0-), arila, alquenila, cicloalquila, cicloalquenila ou araldila. Nem todas as ligações em um polinucleotídeo precisam ser idênticas. A descrição precedente aplica-se a todos os polinucleotídeos aqui referidos, incluindo DNA e RNA.

Uma "região variável" de um anticorpo refere-se a uma região variável da cadeia leve do anticorpo ou a região variável da cadeia pesada do anticorpo, tanto sozinha quanto em combinação. As regiões variáveis de cada cadeia pesada e leve consiste em quatro regiões estruturais (FR) conectadas por três regiões determinantes de complementaridade (CDRs) também conhecidas como regiões hipervariáveis. As CDRs de cada cadeia 5 são mantidas em estreita proximidade pelas FRs e, com as CDRs de outra cadeia, contribuem para a formação dos sítios de ligação ao antígeno de anticorpos. Há pelo menos duas técnicas para determinação de CDRs: (1) uma abordagem baseada na variabilidade de seqüência espécies cruzadas (isto é, Kabat e outros Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5a 10 ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD));e (2) uma abordagem baseada em estudos cristalográficos de complexos antígeno-anticorpo (AlIazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)). Como usada aqui, uma CDR pode referir-se a CDRs definidas por qualquer abordagem ou pela combinação de ambas as abordagens.

Uma "região constante" de um anticorpo refere-se à região cons

tante da cadeia leve do anticorpo ou à região constante da cadeia pesada do anticorpo, tanto sozinhas quanto em combinação.

Um epitopo que "se liga preferencialmente" ou "se liga especificamente" (usado alternadamente aqui) a um anticorpo ou a um polipeptídeo é uma expressão bem-conhecida na técnica e métodos para determinar tal ligação específica ou preferencial também são bem-conhecidos na técnica. Uma molécula é dita exibir "ligação específica" ou "ligação preferencial" se ela reage ou se associa mais frequentemente, mais rapidamente, com maior duração e/ou com maior afinidade com uma célula ou substrato particular do que com células ou substâncias alternativas. Um anticorpo "se liga especificamente" ou "se liga preferencialmente" a um alvo se ele se liga com maior afinidade, avidez, mais rapidamente e/ou com maior duração do que ele se liga a outras substâncias. Por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente ou preferencialmente a um epitopo de Αβ-Mo é um anticorpo que se liga a esse epitopo com maior afinidade, avidez, mais rapidamente e/ou com maior duração do que se ligaria a outros epitopos de Αβι-40 ou não-epitopos de Αβι-40- Também é compreendido pela leitura dessa definição que, por exemplo, um anticorpo (ou porção ou epitopo) que se ligue especificamente ou preferencialmente a um primeiro alvo pode ou não se ligar especificamente ou preferencialmente a um segundo alvo. Como tal, "ligação específica" ou "ligação preferencial" não requer necessariamente (embora possa ser 5 incluída) ligação exclusiva. Geralmente, mas não necessariamente, a referência à ligação significa ligação preferencial.

Como usada aqui, "substancialmente puro" refere-se a um material que é pelo menos 50% puro (isto é, livre de contaminantes), mais preferivelmente pelo menos 90% puro, mais preferivelmente pelo menos 95% puro, mais preferivelmente pelo menos 98% puro, mais preferivelmente pelo menos 99% puro.

Uma "célula hospedeira" inclui uma célula individual ou uma cultura celular que pode ser ou que foi um recipiente para vetores para incorporação de insertos de polinucleotídeos. As células hospedeiras incluem a pro15 gênie de uma única célula hospedeira e a progênie pode não ser necessariamente completamente idêntica (em morfologia ou em complemento de DNA genômico) à célula parental original devido à mutação natural, acidental ou deliberada. Uma célula hospedeira inclui células transfectadas in vivo com o(s) polinucleotídeo(s) dessa invenção.

A expressão "região Fe" é usada para definir uma região C

terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina. A "região Fe" pode ser uma região Fc da seqüência nativa ou uma região Fc variante. Embora as fronteiras da região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina possam variar, a região Fc da cadeia pesada de IgG humana é geralmente definida 25 pela fita entre um resíduo de aminoácido na posição Cys226, ou Pro230, até a terminação carboxila dessa. A numeração dos resíduos da região Fc é aquela do índice EU como em Kabat. Kabat e outros, Sequences of Proteins of Imunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991. A região Fc de uma imunoglobulina geralmente 30 compreende dois domínios constantes, CH2 e CH3.

Como usados aqui, "receptor de Fe" e "FcR" descrevem um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é uma sequência humana nativa de FcR. Além disso, um FcR preferido é aquele que se liga a um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui os receptores das subclasses FcyRI, FcyRII e FcyRIII, incluindo variantes alélicas e formas unidas alternativamente desses receptores. Receptores FcyRI I incluem 5 FcyRIIA (um "receptor de ativação") e FcyRIIB (um "receptor de inibição"), que têm seqüências de aminoácidos similares que diferem primariamente nos seus domínios citoplasmáticos. FcRs são revistos em Ravetch and Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92; Capel e outros, 1994, Immunomethods, 4:25-34; and de Haas e outros, 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41. 10 "FcR" também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs maternas para o feto (Guyer e outros, 1976, J. Immunol., 117:587; e Kim e outros, 1994, J. Immunol., 24:249).

"Citotoxicidade dependente de complemento" e "CDC" referemse à Iise de um alvo na presença do complemento. A via de ativação do 15 complemento é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema do complemento (C1q) a uma molécula (por exemplo, um anticorpo) complexada com um antígeno cognato. Para avaliar a ativação do complemento, um ensaio de CDC, por exemplo como descrito em Gazzano-Santoro e outros, J. Immunol. Methods, 202:163(1996), pode ser realizado.

Uma "região Fc funcional" possui pelo menos uma função efeto

ra de uma seqüência nativa da região Fe. "Funções efetoras" exemplares incluem ligação a C1q; citotoxicidade dependente de complemento (CDC); ligação ao receptor Fe; citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose; regulação negativa de receptores da superfície 25 celular (por exemplo, receptor de célula B, BCR), etc. Tais funções efetoras geralmente requerem uma região Fc a ser combinada com um domínio de ligação (por exemplo, um domínio variável de anticorpo) e podem ser avaliadas usando vários ensaios conhecidos na técnica para avaliação de tais funções efetoras de anticorpo.

Uma "região Fc de seqüência nativa" compreende uma seqüên

cia de aminoácidos idêntica a seqüência de aminoácidos de uma região Fc encontrada na natureza. Uma "região Fc variante" compreende uma sequência de aminoácidos que difere daquela de uma região Fc de seqüência nativa em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido, ainda retém pelo menos uma função efetora da região Fc de seqüência nativa. Preferivelmente, a região Fc variante tem pelo menos uma substituição de ami5 noácido comparada com uma região Fc de seqüência nativa ou com a região Fc de um polipeptídeo parental, por exemplo, entre cerca de uma a cerca de dez substituições de aminoácidos em uma região Fc de seqüência nativa e, preferivelmente, entre cerca de uma a cerca de cinco substituições de aminoácidos em uma região Fc de seqüência nativa ou na região Fc do polipep10 tídeo parental. A região Fc variante desse preferivelmente possuirá pelo menos cerca de 80% de identidade com uma região Fc de seqüência nativa e/ou com uma região Fc de um polipeptídeo parental e, mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% de identidade de seqüência com ela, mais preferivelmente pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos 15 cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99% de identidade com ela.

Como usada aqui, "citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo" e "ADCC" referem-se a uma reação mediada por célula em que células citotóxicas não-específicas que expressam receptores Fe (FcRs) 20 (por exemplo, células exterminadoras naturais (NK), neutrófilos e macrófagos) reconhecem o anticorpo ligado sobre uma célula-alvo e subsequentemente causam a Iise da célula-alvo. A atividade ADCC de uma molécula de interesse pode ser avaliada usando um ensaio ADCC in vitro, tal como aquele descrito na Patente U.S. N0 5.500.362 ou 5.821.337. Células efetoras ú25 teis para tais ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células NK. Alternativamente ou adicionalmente, a atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como aquele descrito em Clynes e outros, 1998, PNAS (USA), 95:652-656.

Como usada aqui, uma "dosagem eficaz" ou "quantidade eficaz"

de um fármaco, composto ou composição farmacêutica é uma quantidade suficiente para efetuar resultados benéficos ou desejados. Para uso profilático, resultados benéficos ou desejados incluem resultados tais como a eliminação ou a redução do risco, a diminuição da severidade ou o retardamento do aparecimento da doença, incluindo sintomas bioquímicos, histológicos e/ou comportamentais da doença, suas complicações e fenótipos patológi5 cos intermediários que se apresentam durante o desenvolvimento da doença. Para uso terapêutico, resultados benéficos ou desejados incluem mas não estão limitados a resultados clínicos tais como recuperação ou proteção de função retiniana ou conservação ou restauração de acuidade visual. Uma dosagem eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações. Pa10 ra os propósitos dessa invenção, uma dosagem eficaz de um fármaco, composto ou composição farmacêutica é uma quantidade suficiente para se obter tratamento profilático ou terapêutico, tanto diretamente quanto indiretamente. Como é compreendido no contexto clínico, uma dosagem eficaz de um fármaco, composto ou composição farmacêutica pode ou não ser obtida 15 em conjunto com outro fármaco, composto ou composição farmacêutica. Assim, uma "dosagem eficaz” pode ser considerada no contexto de administrar um ou mais agentes terapêuticos e um único agente pode ser considerado ser utilizado em uma quantidade eficaz se, em conjunto com um ou mais outros agentes, um resultado eficaz pode ser ou é alcançado.

Como usado aqui, "tratamento" ou "tratar" é uma abordagem

para a obtenção de resultados benéficos ou desejados, incluindo resultados clínicos. Para os propósitos dessa invenção, resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não se limitam à restauração, à prevenção ou à proteção da função retiniana.

Por "efeitos biológicos de peptídeo Αβ" ou "atividade biológica de

Αβ” é entendido o efeito de Αβ em doenças oftálmicas, que pode ser direto ou indireto e inclui, sem ser limitado pela teoria, o envolvimento de Αβ na desregulação do transporte de lipídeo. O efeito indireto inclui, mas não é limitado a Αβ tendo um efeito sobre a função da retina e acuidade visual.

Como usado aqui, "retardar" o desenvolvimento de doenças of

tálmicas significa adiar, impedir, lentificar, retardar, estabilizar e/ou postergar

o desenvolvimento da doença. Esse retardo pode ser de várias extensões de tempo, dependendo da história da doença e/ou do indivíduo a ser tratado. Como é evidente para aquele versado na técnica, um retardo suficiente ou significativo pode, com efeito, abranger a prevenção, na qual o indivíduo não desenvolve a doença. Um método que "retarde" o desenvolvimento da do5 ença oftálmica é um método que reduz a probabilidade do desenvolvimento da doença em um dado espaço de tempo e/ou que reduz a extensão da doença em um dado espaço de tempo, quando comparado com a nãoutilização do método. Tais comparações são tipicamente baseadas em estudos clínicos, usando um número estatisticamente significativo de indivíduos. 10 O "desenvolvimento" de doenças oftálmicas significa o início

e/ou a progressão da doença oftálmica dentro de um indivíduo. O desenvolvimento da doença oftálmica pode ser detectável utilizando técnicas clínicas padronizadas como aqui descritas. Entretanto, o desenvolvimento também refere-se à progressão da doença que pode ser inicialmente indetectável. Para os propósitos dessa invenção, progressão refere-se ao curso biológico do estado de doença, nesse caso, como determinado pelo exame oftalmológico padronizado ou por mais testes especializados. Uma variedade de testes diagnósticos incluem, mas não são limitados a campo visual, acuidade visual, angiografia com fluoresceína, eletrorretinogramas, tomografia de coerência ótica (OCT), potenciais evocados visuais (VEP), verde de indocianina, visão colorida, grade de Amsler, pressão intraocular e outras ferramentas diagnosticas conhecidas por uma pessoa com experiência na técnica. Testes diagnósticos para AMD incluem, mas não são limitados a, acuidade visual, exame fundoscópico, angiografia com fluoresceína, verde de indocianina e tomografia de coerência ótica (OCT), entre outros.

"Desenvolvimento" inclui a ocorrência, a recorrência e o início. Como usado aqui, "início" ou "ocorrência" de doença oftálmica inclui o aparecimento inicial e/ou a recorrência.

Como usado aqui, "proteger" ou "proteção" da função retiniana refere-se a estabilizar ou conservar a função retiniana. Como usada aqui, "recuperação" da função retiniana refere-se à restauração da função retiniana após uma disfunção prévia. A proteção ou a recuperação da função retiniana pode ser determinada pela medida de resultados estatisticamente significativos (isto é, p<0,05), como medidos por quaisquer das ferramentas de diagnóstico oftalmológico mencionadas acima tais como, acuidade visual, eletrorretinogramas, campo visual,exame fundoscópico, angiografia com flu5 oresceína, verde de indocianina e tomografia de coerência ótica (OCT), entre outros. Por exemplo, como mostrado no Exemplo 4 abaixo, a proteção ou a recuperação estatisticamente significativas da função retiniana foi mostrada pela recuperação da amplitude de onda b em eletrorretinogramas (p=0,008).

"Conservação" ou "restauração" da acuidade visual podem ser

medidas pelas fichas oculares padronizadas assim como por uma variedade de ferramentas de diagnóstico bem-conhecidas na técnica.

Como usada aqui, administração "em conjunto" inclui a administração simultânea e/ou administração em períodos diferentes. A administração em conjunto também abrange a administração como uma coformulação ou a administração como composições separadas. Como usada aqui, a administração em conjunto significa abranger qualquer circunstancia na qual um anticorpo anti-Αβ e o outro agente são administrados a um indivíduo, o que pode ocorrer simultaneamente e/ou separadamente. Como discutido mais tarde aqui, entende-se que um anticorpo anti-Αβ e o outro agente podem ser administrados em diferentes frequências ou intervalos de dosagem. Por exemplo, um anticorpo anti-Αβ pode ser administrado semanalmente, enquanto que o outro agente pode ser administrado menos frequentemente. Entende-se que o anticorpo anti-Αβ e o outro agente podem ser administrados usando a mesma via de administração ou vias de administração diferentes.

Uma "amostra biológica" abrange uma variedade de tipos de amostras obtidas de um indivíduo e que pode ser usada em um ensaio diagnóstico ou de monitorização. A definição abrange sangue e outras amostras 30 de líquidos de origem biológica, amostras sólidas de tecido tais como espécimes de biópsia ou culturas de tecidos e células derivadas deles e sua proqênie. A definição também inclui amostras que tenham sido manipuladas de qualquer modo após sua obtenção, tais como pelo tratamento com reagentes, solubilização ou enriquecimento para certos componentes, tais como proteínas ou polinucleotídeos, ou embebidas em uma matriz semissólida ou sólida com propósito de seccionamento. A expressão "amostra biológica" 5 abrange uma amostra clínica, e também inclui células em cultura, células sobrenadantes, Iisados celulares, soro, plasma, fluido biológico e amostras de tecido.

Um "indivíduo" (alternativamente referido como um "sujeito") é um mamífero, mais preferivelmente um humano. Mamíferos também incluem, mas não são limitados a animais domésticos (tais como vacas), animais esportivos, animais de estimação (tais como gatos, cães, cavalos), primatas, camundongos e ratos.

Como usado aqui, "vetor" significa um construto que é capaz de liberar, e preferivelmente expressar, um ou mais genes ou seqüências de 15 interesse em uma célula hospedeira. Exemplos de vetores incluem, mas não são limitados a vetores virais, vetores de expressão de DNA nu ou RNA, plasmídeos, cosmídeos ou vetores de fago, vetores de expressão de DNA ou RNA associados a agentes condensadores catiônicos, vetores de expressão de DNA ou RNA encapsulados em Iipossomos e certas células eu20 carióticas tais como células produtoras.

Como usada aqui, "seqüência de controle de expressão" significa uma seqüência de ácido nucleico que dirige a transcrição de um ácido nucleico. Uma seqüência de controle da expressão pode ser um promotor, tal como um promotor constitutivo ou um induzível, ou um intensificador. A 25 seqüência de controle da expressão é operativamente ligada a uma seqüência de ácido nucleico a ser transcrita.

Como usado aqui, "veículo farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer material que, quando combinado com um ingrediente ativo, permite que o ingrediente ativo retenha a atividade biológica e que é não-reativo com 30 o sistema imune do indivíduo. Exemplos incluem, mas não são limitados a qualquer um dos veículos farmacêuticos padronizados tais como uma solução salina tamponada com fosfato, água, emulsões tais como emulsão de óleo/água e vários tipos de agentes umedecedores. Os diluentes preferidos para administração em aerossol ou parenteral são solução salina tamponada com fosfato ou solução salina normal (0,9%). As composições que compreendem tais veículos são formuladas por métodos convencionais bem5 conhecidos (veja, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; e Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000).

A expressão "kon", como usada aqui, pretende referir-se a constante de associação ("on rate") para a associação de um anticorpo a um antígeno.

A expressão "W, como usada aqui, pretende referir-se a constante de dissociação ("off rate") para a dissociação de um anticorpo do complexo anticorpo/antígeno.

A expressão "Kd", como usada aqui, pretende referir-se a constante de equilíbrio de dissociação de um anticorpo do complexo anticorpo/antígeno.

Composições e Métodos para Fazer as Composições Anticorpos e Polipeptídeos Anti-AB:

I. Anticorpo 9TL e anticorpos e polipeptídeos derivados de 9TL Essa invenção abrange composições, incluindo composições

farmacêuticas, que compreendem o anticorpo 9TL e suas variantes mostradas na Tabela 3 ou polipeptídeos derivados do anticorpo 9TL e suas variantes mostradas na Tabela 3; e polinucleotídeos que compreendem seqüências que codificam o anticorpo 9TL e suas variantes ou o polipeptídeo. Como 25 usadas aqui, as composições compreendem um ou mais anticorpos ou polipeptídeos (que podem ser ou não um anticorpo) que se ligam a terminação C de Αβι-40 e/ou um ou mais polinucleotídeos que se ligam a terminação C de Αβ-Mo. Essas composições podem compreender ainda excipientes adequados, tais como excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluindo tam30 pões, que são bem-conhecidos na técnica.

Os anticorpos e polipeptídeos da invenção são caracterizados por quaisquer (uma ou mais) das seguintes características: (a) se liga ao peptídeo 28-40 C-terminal de Αβι.40, mas não se liga significativamente a Αβ1-42 ou Αβ1-43; (b) se liga ao peptídeo 33-40 C-terminal de Αβ-Μο! (c) suprime a formação de placas amiloides em um indivíduo; (d) reduz as placas amiloides no olho de um indivíduo; (e) trata, previne ou melhora um ou 5 mais sintomas de doença oftálmica, incluindo mas não limitado a degeneração macular relacionada à idade (ambas, atrófica e exsudativa), glaucoma, retinopatia diabética (incluindo edema macular) e outras doenças degenerativas retinianas relacionadas; (f) causa proteção significativa ou recuperação da função retiniana; e (g) causa preservação ou restauração significativas da 10 acuidade visual.

Os anticorpos e polipeptídeos da invenção também podem exibir um perfil de segurança desejável em contraste com outros anticorpos antiΑβ descritos.

Consequentemente, a invenção fornece qualquer um dos seguintes ou composições (incluindo composições farmacêuticas) que compreendem qualquer um dos seguintes: (a) anticorpo 9TL ou suas variantes mostradas na Tabela 3; (b) um fragmento ou uma região do anticorpo 9TL ou suas variantes mostradas na Tabela 3; (c) uma cadeia leve do anticorpo 9TL ou suas variantes mostradas na Tabela 3; (d) uma cadeia pesada do anticorpo 9TL ou suas variantes mostradas na Tabela 3; (e) uma ou mais regiões variáveis de uma cadeia leve e/ou de uma cadeia pesada do anticorpo 9TL ou suas variantes mostradas na Tabela 3; (f) uma ou mais CDRs (uma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs) do anticorpo 9TL ou suas variantes mostradas na Tabela 3; (g) CDR H3 da cadeia pesada do anticorpo 9TL; (h) CDR L3 da cadeia leve do anticorpo 9TL ou suas variantes mostradas na Tabela 3; (i) três CDRs das cadeia leve do anticorpo 9TL ou suas variantes mostradas na Tabela 3; (j) três CDRs da cadeia pesada do anticorpo 9TL ou suas variantes mostradas na Tabela 3; (k) três CDRs da cadeia leve e três CDRs da cadeia pesada do anticorpo 9TL ou suas variantes mostradas na Tabela 3; e (I) um anticorpo que compreenda qualquer um de

(b) até (k). A invenção também fornece polipeptídeos que compreendem qualquer um ou mais dos acima. As porções de CDR do anticorpo 9TL (incluindo as CDRs de Chothia e Kabat) estão diagramaticamente ilustradas na Figura 1. A determinação de regiões de CDR está dentro da experiência na técnica. Entendese que em algumas modalidades, as CDRs podem ser uma combinação da 5 CDR de Kabat e de Chothia (também denominadas "CDRs combinadas" ou "CDRs estendidas"). Em algumas modalidades, as CDRs são as CDRs de Kabat. Em outras modalidades, as CDRs são as CDRs de Chothia. Em outras palavras, em modalidades com mais do que uma CDR, as CDRs podem ser de Kabat, Chothia, combinações de CDRs ou sua combinações.

Em algumas modalidades, a invenção fornece um polipeptídeo

(que pode ser ou não um anticorpo) que compreende pelo menos uma CDR, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro, pelo menos cinco ou todas as seis CDRs que são substancialmente idênticas a pelo menos uma CDR, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo me15 nos cinco ou a todas as seis CDRs de 9TL ou suas variantes mostradas na Tabela 3. Outras modalidades incluem anticorpos que têm pelo menos duas, três, quatro, cinco ou seis CDR(s) que são substancialmente idênticas a pelo menos duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs de 9TL ou de derivados de 9TL. Em algumas modalidades, pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco 20 ou seis CDR(s) são pelo menos cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idênticas a pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs de 9TL ou suas variantes mostradas na Tabela 3. Entende-se que, para os propósitos dessa invenção, a especificidade de ligação e;ou a atividade global sejam geralmente retidas, embora a extensão 25 da atividade possa variar comparada a 9TL ou suas variantes mostradas na Tabela 3 (pode ser maior ou menor).

A invenção também fornece um polipeptídeo (que pode ser ou não um anticorpo) que compreende uma seqüência de aminoácidos de 9TL ou suas variantes mostradas na Tabela 3, que tem qualquer um dos seguin30 tes: pelo menos 5 aminoácidos contíguos, pelo menos 8 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 10 aminoácidos contíguos, pelo menos 15 cerca de aminoácidos contíguos, pelo menos 20 cerca de aminoácidos contíguos, pelo menos 25 cerca de aminoácidos contíguos, pelo menos 30 cerca de aminoácidos contíguos de uma seqüência de 9TL ou de suas variantes mostradas na Tabela 3, em que pelo menos três aminoácidos são de uma região variável de 9TL (Figura 1) ou de suas variantes mostradas na Tabela 3. Em 5 uma modalidade, a região variável é de uma cadeia pesada de 9TL. Um polipeptídeo exemplar tem aminoácidos contíguos (extensões descritas acima) de ambas as regiões variáveis das cadeias pesada e leve de 9TL. Em outra modalidade, os 5 (ou mais) aminoácidos contíguos são de uma região determinante de complementaridade (CDR) de 9TL mostrada na Figura 1. Em 10 algumas modalidades, os aminoácidos contíguos são de uma região variável de 9TL.

II. Anticorpo 6G e anticorpos e polipeptídeos derivados de 6G

A presente invenção fornece métodos para tratar uma doença oftálmica compreendendo administrar um anticorpo ou polipeptídeo que se 15 ligue a Αβ-Μο, Ap^42 e Αβι_43· Em algumas modalidades, o anticorpo ou polipeptídeo se liga a Αβ-^ο com maior afinidade do que sua ligação com Αβι-42 e Αβι.43. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga a Αβι_36, Αβι_37, Αβι-38 e Αβι-39. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga a Αβ22.35. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga a Αβ28-4ο· Em algumas modalidades, o 20 anticorpo ou o polipeptídeo se liga a um epitopo sobre Αβι-4ο que inclui os aminoácidos 25-34 e 40.

Essa invenção também fornece métodos para tratar uma doença oftálmica que compreende a administração de composições farmacêuticas, compreendendo quaisquer dos anticorpos ou polipeptídeos aqui descritos 25 (tais como o anticorpo 6G e suas variantes mostradas na Tabela 8 ou um polipeptídeo derivado do anticorpo 6G e suas variantes mostradas na Tabela 8); ou polinucleotídeos aqui descritos. Como usadas aqui, as composições compreendem um ou mais anticorpos ou polipeptídeos (que podem ou não ser um anticorpo) que se ligam a terminação C de Αβι.40, e/ou um ou mais 30 polinucleotídeos que compreendem seqüências que codificam um ou mais anticorpos ou polipeptídeos que se ligam a terminação C de Αβ-ι_40. Essas composições podem compreender ainda excipientes adequados, tais como excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluindo tampões, que são bemconhecidos na técnica.

Os anticorpos e polipeptídeos da invenção são caracterizados por quaisquer (uma ou mais) das seguintes características: (a) se ligam a Αβ-Mo, Αβι-42 e Αβι-43; (b) se ligam a Αβι-40, Αβι-42 e Αβι.43 com maior afinidade de ligação a Αβι.40 do que a Αβ-ι-42 e Αβι-43; (c) se ligam a um epitopo sobre Αβι-4ο que inclui os aminoácidos 25-34 e 40; (d) se ligam a Αβι_36, Αβ·ι-37, Αβι-38 e Αβι-39, mas com uma afinidade menor quando comparada a sua ligação a Αβι.40; (e) se ligam a Αβ22-37 com um K0 menor do que cerca de 1 μΜ; (f) se ligam a Αβ22-35! (g) se ligam a Αβ28-4οΙ (h) não se ligam a APP expressa em uma célula; (i) reduzem placas amiloides no olho de um indivíduo; (j) tratam, previnem, melhoram um ou mais sintomas de doença oftálmica, incluindo mas não se limitando a degeneração macular relacionada à idade (ambas, atrófica e exsudativa), glaucoma, retinopatia diabética (incluindo edema macular) e outras doenças degenerativas retinianas relacionadas; (k) causam proteção significativa ou recuperação da função retiniana; e (I) causam preservação ou restauração significativas da acuidade visual. Os anticorpos e polipeptídeos da invenção também podem ter função efetora deficiente como aqui descrito. Os anticorpos e polipeptídeos que têm função efetora deficiente podem exibir um perfil de segurança desejável em contraste com outros anticorpos anti-Αβ descritos. Por exemplo, as composições da invenção podem não causar níveis significativos ou inaceitáveis de qualquer um ou mais de: hemorragia na vascularização cerebral (hemorragia cerebral); meningoencefalite (incluindo alteração de ressonância magnética; contagem elevada de células brancas no líquido cérebro-espinhal; inflamação do sistema nervosos central.

Consequentemente, a invenção fornece qualquer um dos seguintes ou composições (incluindo composições farmacêuticas) que compreendem qualquer um dos seguintes: (a) anticorpo 6G ou suas variantes 30 mostradas na Tabela 8; (b) um fragmento ou uma região do anticorpo 6G ou suas variantes mostradas na Tabela 8; (c) uma cadeia leve do anticorpo 6G ou suas variantes mostradas na Tabela 8; (d) uma cadeia pesada do anticorpo 6G ou suas variantes mostradas na Tabela 8; (e) uma ou mais regiões variáveis de uma cadeia leve e/ou de uma cadeia pesada do anticorpo 6G ou suas variantes mostradas na Tabela 8; (f) uma ou mais CDRs (uma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs) do anticorpo 6G ou suas variantes 5 mostradas na Tabela 8; (g) CDR H3 da cadeia pesada do anticorpo 6G; (h) CDR L3 da cadeia leve do anticorpo 6G ou suas variantes mostradas na Tabela 3; (i) três CDRs das cadeia leve do anticorpo 9TL ou suas variantes mostradas na Tabela 8; (j) três CDRs da cadeia pesada do anticorpo 6G ou suas variantes mostradas na Tabela 8; (k) três CDRs da cadeia leve e três 10 CDRs da cadeia pesada do anticorpo 6G ou suas variantes mostradas na Tabela 8; e (I) um anticorpo que compreenda qualquer um de (b) até (k). A invenção também fornece polipeptídeos compreendendo qualquer um ou mais dos acima.

As porções de CDR do anticorpo 6g (incluindo as CDRs de Chothia e Kabat) estão diagramaticamente ilustradas na Figura 8. A determinação de regiões de CDR está dentro da experiência na técnica.

Em algumas modalidades, a invenção fornece um polipeptídeo (que pode ser ou não um anticorpo) que compreende pelo menos uma CDR, pelo menos duas, pelo menos três ou pelo menos quatro, pelo menos cinco 20 ou todas as seis CDRs que são substancialmente idênticas a pelo menos uma CDR, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou a todas as seis CDRs de 6G ou suas variantes mostradas na Tabela 8. Outras modalidades incluem anticorpos que têm pelo menos duas, três, quatro, cinco ou seis CDR(s) que são substancialmente idênticas a pelo 25 menos duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs de 6G ou de derivados de 6G. Em algumas modalidades, pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDR(s) são pelo menos cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idênticas a pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs de 6G ou suas variantes mostradas na Tabela 8. Enten30 de-se que, para os propósitos dessa invenção, a especificidade de ligação e;ou a atividade global sejam geralmente retidas, embora a extensão da atividade possa variar comparada a 6G ou suas variantes mostradas na Tabela 8 (pode ser maior ou menor).

A invenção também fornece um polipeptídeo (que pode ser ou não um anticorpo) que compreende uma seqüência de aminoácidos de 6G ou suas variantes mostradas na Tabela 8, que tem qualquer um dos seguin5 tes: pelo menos 5 aminoácidos contíguos, pelo menos 8 aminoácidos contíguos, pelo menos cerca de 10 aminoácidos contíguos, pelo menos 15 cerca de aminoácidos contíguos, pelo menos 20 cerca de aminoácidos contíguos, pelo menos 25 cerca de aminoácidos contíguos, pelo menos 30 cerca de aminoácidos contíguos de uma seqüência de 6G ou de suas variantes mos10 tradas na Tabela 8, em que pelo menos três aminoácidos são de uma região variável de 6G (Figura 8) ou de suas variantes mostradas na Tabela 8. Em uma modalidade, a região variável é de uma cadeia leve de 6G. Em outra modalidade, a região variável é de uma cadeia pesada de 6G. Um polipeptídeo exemplar tem aminoácidos contíguos (extensões descritas acima) de 15 ambas as regiões variáveis das cadeias pesada e leve de 6G. Em outra modalidade, os 5 (ou mais) aminoácidos contíguos são de uma região determinante de complementaridade (CDR) de 6G mostrada na Figura 8. Em algumas modalidades, os aminoácidos contíguos são de uma região variável de 6G.

As afinidades de ligação dos anticorpos e polipeptídeos da in

venção podem variar e não precisam ter (mas podem ter) um valor ou faixa em particular, como nas modalidades exemplares descritas abaixo. A afinidade de ligação (K0) dos anticorpos e polipeptídeos da invenção para o peptídeo Αβ (incluindo os peptídeos Αβι.40ι Αβι.42 e Αβ-ι-43) pode ser de cerca de 25 0,10 a cerca de 0,80 nM, de cerca de 0,15 a cerca de 0,75 nM e de cerca de 0,18 a cerca de 0,72 nM. Em algumas modalidades, a afinidade de ligação é de cerca de 2 pM, cerca de 5 pM, cerca de 10 pM, cerca de 15 pM, cerca de 20 pM, cerca de 40 pM ou maior do que cerca de 40 pM. Em uma modalidade, a afinidade de ligação está entre cerca de 2 pM e 22 pM. Em outras mo30 dalidades, a afinidade de ligação é menor do que cerca de 10 nM, cerca de 5 nM, cerca de 1 nM, cerca de 900 pM, cerca de 800 pM, cerca de 700 pM, cerca de 600 pM, cerca de 500 pM, cerca de 400 pM, cerca de 300 pM, cerca de 200 pM, cerca de 150 pM, cerca de 100 pM, cerca de 90 pM, cerca de 80 pM, cerca de 70 pM, cerca de 60 pM, cerca de 50 pM, cerca de 40 pM, cerca de 30 pM, cerca de 10 pM. Em algumas modalidades, a afinidade de ligação é de cerca de 10 nM. Em outras modalidades, a afinidade de ligação 5 é menor do que cerca de 10 nM, menor do que cerca de 50 nM, menor do que cerca de 100 nM, menor do que cerca de 150 nM, menor do que cerca de 200 nM, menor do que cerca de 250 nM, menor do que cerca de 500 nM, ou menor do que cerca de 1000 nM. Em outras modalidades, a afinidade de ligação é menor do que cerca de 5 nM. Em outras modalidades, a afinidade 10 de ligação é menor do que cerca de 1 nM. Em outras modalidades, a afinidade de ligação é cerca de 0,1 nM ou cerca de 0,07 nM. Em outras modalidades, a afinidade de ligação é menor do que cerca de 0,1 nM ou menor do que cerca de 0,07 nM. Em outras modalidades, a afinidade de ligação é qualquer uma de cerca de 10 nM, cerca de 5 nM, cerca de 1 nM, cerca de 15 900 pM, cerca de 800 pM, cerca de 700 pM, cerca de 600 pM, cerca de 500 pM, cerca de 400 pM, cerca de 300 pM, cerca de 200 pM, cerca de 150 pM, cerca de 100 pM, cerca de 90 pM, cerca de 80 pM, cerca de 70 pM, cerca de 60 pM, cerca de 50 pM, cerca de 40 pM, cerca de 30 pM, cerca de 10 pM a qualquer uma de cerca de 2 pM, cerca de 5 pM, cerca de 10 pM, cerca de 15 20 pM, cerca de 20 pM, ou cerca de 40 pM. Em algumas modalidades, a afinidade de ligação é qualquer uma de cerca de 10 nM, cerca de 5 nM, cerca de

1 nM, cerca de 900 pM, cerca de 800 pM, cerca de 700 pM, cerca de 600 pM, cerca de 500 pM, cerca de 400 pM, cerca de 300 pM, cerca de 200 pM, cerca de 150 pM, cerca de 100 pM, cerca de 90 pM, cerca de 80 pM, cerca 25 de 70 pM, cerca de 60 pM, cerca de 50 pM, cerca de 40 pM, cerca de 30 pM, cerca de 10 pM. Em outras modalidades ainda, a afinidade de ligação é de cerca de 2 pM, cerca de 5 pM, cerca de 10 pM, cerca de 15 pM, cerca de 20 pM, cerca de 40 pM ou maior do que cerca de 40 pM. O anticorpo ou polipeptídeos da invenção podem se ligar a uma combinação dos peptídeos 30 Αβι.40, Αβι-42 e/ou Αβ-ι_43. Em uma modalidade, o anticorpo ou os polipeptídeos se ligam pelo menos aos peptídeos Αβ-ι-40 e Αβι-42.

Os anticorpos e polipeptídeos da invenção também podem se ligar a qualquer um ou mais de Ap^36, Ap^37, Αβ^, Ap^39, APm2 e Ap^43, mas em algumas modalidades a afinidade de ligação a qualquer um ou mais desses polipeptídeos é menor do que suas afinidades de ligação a Api.40. Em algumas modalidades, o K0 dos anticorpos e polipeptídeos a qualquer 5 um ou mais de ΑΡι.36, Αβ-ι_37, Ap1-S8, APi.39i AP-M2 e Ap^3 é de pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de 30 vezes, pelo menos cerca de 40 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 80 vezes, pelo menos cerca de 100 vezes, pelo menos cerca de 150 vezes, pelo menos cerca de 200 10 vezes, ou pelo menos cerca de 250 vezes o K0 a Ap-M0.

A invenção também fornece métodos para fazer qualquer um desses anticorpos ou polipeptídeos. Os anticorpos da invenção podem ser feitos por procedimentos conhecidos na técnica. Os polipeptídeos podem ser produzidos por degradação proteolítica ou outra degradação dos anticorpos, 15 por métodos recombinantes (isto é, polipeptídeos isolados ou de fusão) como descrito acima ou por síntese química. Polipeptídeos dos anticorpos, especialmente polipeptídeos mais curtos do que cerca de 50 aminoácidos, são convenientemente feitos por síntese química. Métodos de síntese química são conhecidos na técnica e estão comercialmente disponíveis. Por exem20 pio, um anticorpo pode ser produzido por um sintetizador automatizado de polipeptídeo empregando o método da fase sólida. Veja também, Patentes U.S. N0 5.807.715; 4.816.567; e 6.331.415.

Em outra alternativa, os anticorpos podem ser feitos recombinantemente usando os procedimentos que são bem-conhecidos na técnica. 25 Em uma modalidade, um polinucleotídeo compreende uma seqüência que codifica as regiões variáveis da cadeia pesada e/ou da cadeia leve do anticorpo. Em outra modalidade, o polinucleotídeo que compreende a seqüência de nucleotídeos é clonado em um ou mais vetores para expressão ou propagação. A seqüência que codifica o anticorpo de interesse pode ser manti30 da em um vetor em uma célula hospedeira e a célula hospedeira pode, então, ser expandida e congelada para uso futuro. Os vetores (incluindo os vetores de expressão) e as células hospedeiras serão descritos aqui posteriormente.

A invenção também abrange fragmentos da região variável de cadeia simples ("scFv") de anticorpos dessa invenção, tais como 9TL e 6G. Os fragmentos da região variável de cadeia simples são feitos pela ligação de regiões variáveis da cadeia leve e/ou pesada usando um peptídeo Iigante curto. Bird et al (1988) Science 242:423-426. Um exemplo de peptídeo Iigante é (GGGGS)3 que une aproximadamente 3,5 nm entre a terminação carboxi de uma região variável e a terminação amino de outra região variável. Ligantes de outras seqüências também foram planejados e usados. Bird et al (1988). Os Iigantes podem, por sua vez, serem modificados para funções adicionais, tais como acoplamento de fármacos ou acoplamento a suportes sólidos. As variantes de cadeia simples podem ser produzidas tanto recombinantemente quanto sinteticamente. Para a produção sintética de scFv, pode ser usado um sintetizador automático. Para a produção recombinante de scFv, um plasmídeo adequado contendo os polinucleotídeos que codificam a scFv pode ser introduzido em uma célula hospedeira adequada, tanto eucariótica, tais como células de levedura, planta, inseto ou mamífero, quanto procariótica, tal como E. coli. Os polinucleotídeos que codificam a scFv de interesse podem ser feitos por manipulações rotineiras, tal como a ligação de polinucleotídeos. A scFv resultante pode ser isolada usando técnicas padronizadas de purificação de proteína conhecidas na técnica.

Outras formas de anticorpos de cadeia simples, tais como diabodies também são abrangidas. Diabodies são anticorpos bivalentes, biespecíficos nos quais os domínios VH e VL são expressos sobre uma única 25 cadeia de polipeptídeo, mas usando um Iigante que é curto o suficiente para impedir o pareamento entre os dois domínios sobre a mesma cadeia, forçando dessa maneira o pareamentos dos domínios com os domínios complementares de outra cadeia e criando dois sítios de ligação ao antígeno (veja, por exemplo, Holliger, P., e outros (1993) Proc. Natl. Acad Sei. USA 30 90:6444-6448; Poljak, R. J., e outros (1994) Structure 2:1121-1123).

Por exemplo, anticorpos biespecíficos, anticorpos que têm especificidades de ligação por pelo menos dois antígenos diferentes, isto é, Αβι.40 e Αβ-1-42, podem ser preparados usando os anticorpos aqui descritos. Métodos para fazer anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Suresh e outros, 1986, Methods in Enzymology 121:210). Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficos era baseada 5 na coexpressão de dois pares de cadeia leve e cadeia pesada de imunoglobulina, com as duas cadeias pesada tendo especificidades diferentes (Millstein e Cuello, 1983, Nature 305, 537-539).

De acordo com uma abordagem para fazer anticorpos biespecíficos, domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação desejada (sítios que combinam anticorpo-antígeno) são fundidos a seqüências de domínio constante de imunoglobulina. A fusão preferivelmente é com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, compreendendo pelo menos parte da dobradiça, regiões CH2 e CH3. É preferido ter a primeira região do domínio constante (CH1) de cadeia pesada, contendo o sítio necessário para a ligação com a cadeia leve, presente em pelo menos uma das fusões. DNAs que codificam fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão separados e são cotransfectados em um organismohospedeiro adequado. Isso fornece uma grande flexibilidade no ajuste de proporções mútuas dos três fragmentos de polipeptídeo em modalidades quando proporções desiguais das três cadeias de polipeptídeos usadas na construção fornecem rendimentos ótimos. Entretanto, é possível inserir as seqüências codificadoras para duas ou todas três cadeias de polipeptídeos em um vetor de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias de polipeptídeo em proporções iguais resultam em altos rendimentos ou quando as proporções não são de significância particular.

Em uma abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostos de um híbrido de cadeia pesada de imunoglobulina com uma primeira especificidade de ligação em um braço e um híbrido de um par de cadeia pesada30 cadeia leve de imunoglobulina (fornecendo uma segunda especificidade de ligação) em outro braço. Essa estrutura assimétrica, com uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas uma metade da molécula biespecífica, facilita a separação do composto biespecífico desejado de combinações indesejadas de cadeia de imunoglobulina. Essa abordagem está descrita na Publicação PCT N0 WO 94/04690, publicada em 3 de Março de 1994.

Anticorpos heteroconjugados, compreendendo dois anticorpos 5 covalentemente unidos, também estão dentro do escopo da invenção. Tais anticorpos foram usados para dirigir células do sistema imune contra células indesejadas (Patente U.S. N0 4.676.980) e para o tratamento de infecção por HIV (publicação de pedidos PCT N0 WO 91/00360 e WO 92/200373; EP 03089). Anticorpos heteroconjugados podem ser feitos usando quaisquer 10 métodos de reticulação cruzada convenientes. Agentes e técnicas para a reticulação cruzada adequados são bem-conhecidos e estão descritos na Patente U.S. N0 4.676.980.

Anticorpos quiméricos ou híbridos também podem ser preparados in vitro usando métodos conhecidos de química de síntese de proteína, 15 incluindo aqueles que envolvem agentes de reticulação cruzada. Por exemplo, imunotoxinas podem ser preparadas usando uma reação de troca de dissulfeto ou pela formação de uma ligação tioéter. Exemplos de reagentes adequados para esse propósito incluem iminotiolato e metil-4- mercaptobutirimidato.

Anticorpo humanizado compreendendo uma ou mais CDRs do

anticorpo 9TL ou uma ou mais CDRs derivadas do anticorpo 9TL podem ser feitas usando quaisquer métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, quatro etapas gerais podem ser usadas para humanizar um anticorpo monoclonal. São elas: (1) determinar a seqüência de nucleotídeos e a de amínoáci25 dos predita dos domínios variáveis de cadeia leve e pesada do anticorpo inicial; (2) planejar o anticorpo humanizado, isto é, decidir qual região estrutural do anticorpo usar durante o processo de humanização; (3) as metodologias/técnicas de humanização atuais e (4) a transfecção e a expressão do anticorpo humanizado. Veja, por exemplo, Patentes U.S. N0 4.816.567; 30 5.807.715; 5.866.692; 6.331.415; 5.530.101; 5.693.761; 5.693.762; 5.585.089; 6.180.370; 5.225.539; 6.548.640.

Nos anticorpos humanizados recombinantes, a porção Fc pode ser modificada para evitar a interação com o receptor Fcy e o complemento do sistema imune. Esse tipo de modificação foi planejada pelo Dr. Mike Clark do Departamento de Patologia da Universidade de Cambridge e as técnicas para a preparação de tais anticorpos estão descritas em WO 99/58572, pu5 blicada em 18 de Novembro de 1999.

Por exemplo, a região constante pode ser manipulada para se parecer mais com regiões constantes humanas para evitar a resposta imune se o anticorpo for usado para testes clínicos e tratamentos em seres humanos. Veja, por exemplo, Patentes U.S. N0 5.997.867 e 5.866.692.

A invenção abrange modificações no anticorpo 9TL e 6G, inclu

indo anticorpos funcionalmente equivalentes que não afetam significativamente suas propriedades e variantes que têm atividade e/ou afinidade aumentadas ou diminuídas. Por exemplo, a seqüência de aminoácidos do anticorpo 9TL ou 6G pode ser mutada para se obter um anticorpo com a afini15 dade de ligação desejada ao peptídeo Αβ-alvo. A modificação de polipeptídeos é prática de rotina na técnica e não necessita ser descrita em detalhes aqui. A modificação de polipeptídeos está exemplificada nos Exemplos. Exemplos de polipeptídeos modificados incluem polipeptídeos com substituições conservativas de resíduos de aminoácidos, uma ou mais deleções ou 20 adições de aminoácidos que não alteram significativamente de modo deletério a atividade funcional ou o uso de análogos químicos.

As inserções de seqüência de aminoácidos incluem fusões amino- e/ou carboxi-terminais, que variam em extensão de um resíduo a polipeptídeos que contêm uma centena ou mais de resíduos, assim como inser25 ções intrassequência de um único ou de múltiplos resíduos de aminoácidos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo metionil N-terminal ou um anticorpo fundido a um epitopo tag. Outras variantes insercionais da molécula de anticorpo incluem a fusão a terminação N ou C do anticorpo de uma enzima ou um polipeptídeo que aumente a meia-vida 30 sérica do anticorpo.

Variantes por substituição têm pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula de anticorpo removido e um resíduo diferente inserido em seu lugar. Os sítios de maior interesse para mutagênese por substituição incluem as regiões hipervariáveis, mas alterações em FR também são consideradas. As substituições conservativas são mostradas na Tabela 1 sob o título de "substituições conservativas". Se tais substituições resultam em 5 uma alteração da atividade biológica, então alterações mais substanciais, denominadas "substituições exemplares" na Tabela 1 ou como descrito posteriormente abaixo em referência a classes de aminoácidos, podem ser introduzidas e os produtos rastreados.

Tabela 1: Substituições de aminoácidos

Resíduo Original Substituições Conser¬ Substituições Exempla¬ vativas res Ala (A) Val Vai; Leu; Ile Arg (R) Lys Lys; Gin; Asn Asn (N) Gln Gin; His; Asp, Lys; Arg Asp (D) Glu Glu; Asn Cys (C) Ser Ser; Ala Gln (Q) Asn Asn; Glu Glu (E) Asp Asp; Gln Gly (G) Ala Ala His (H) Arg Asn; Gin; Lys; Arg He (I) Leu Leu; Vai; Met; Ala; Phe; Norleucina Leu (L) Ile Norleucina; lie; Vai; Met; Ala; Phe Lys (K) Arg Arg; Gin; Asn Met (M) Leu Leu; Phe; Ile Phe (F) Tyr Leu; Vai; lie; Ala; Tyr Pro (P) Ala Ala Ser(S) Thr Thr Thr(T) Ser Ser Trp (W) Tyr Tyr; Phe Tyr (Y) Phe Trp; Phe; Thr; Ser Val (V) Leu lie; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina 10

As modificações substanciais nas propriedades biológicas do anticorpo são obtidas pela seleção de substituições que diferem significativamente em seus efeitos sobre a manutenção (a) da estrutura do arcabouço do polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, como uma fita ou conformação helicoidal, (b) da carga ou da hidrofobicidade da molécula no sítio5 alvo ou (c) no volume da cadeia lateral. Resíduos que ocorrem naturalmente são divididos em grupos, baseados nas propriedades comuns da cadeia lateral:

(1) Não-polar: Norleucina, Met, Ala, Val1 Leu, lie;

(2) Polar sem carga: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin;

(3) Ácido (negativamente carregado): Asp, Glu;

(4) Básico (positivamente carregado): Lys, Arg;

(5) Resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; e

(6) Aromático: Trp, Tyr, Phe, His.

Substituições não-conservativas são feitas pela troca de um 15 membro de uma dessas classes por outra classe.

Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção da conformação apropriada do anticorpo também pode ser substituído, geralmente por serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e prevenir a reticulação cruzada aberrante. Inversamente, ligações de cisteína 20 podem ser adicionadas ao anticorpo para melhorar sua estabilidade, particularmente onde o anticorpo é um fragmento de anticorpo, tal como um fragmento Fv. As modificações de aminoácidos podem variar entre alterar ou modificar um ou mais resíduos de aminoácidos para redesenhar completamente uma região, tal como uma região variável. As alterações na região 25 variável podem alterar a afinidade e/ou especificidade de ligação. Em algumas modalidades, não mais do que uma a cinco substituições conservativas de aminoácidos são feitas dentro de um domínio de CDR. Em outras modalidades, não mais do que uma a três substituições conservativas de aminoácidos são feitas dentro de um domínio de CDR. Em outras modalidades, o 30 domínio de CDR é CDR H3 e/ou CDR L3.

As modificações também incluem polipeptídeos glicosilados e não-glicosilados, assim como polipeptídeos com outras modificações póstraducionais tais como, por exemplo, glicosilação com açúcares diferentes, acetilação e fosforilação. Anticorpos são glicosilados em posições conservadas nas suas regiões constantes (Jefferis and Lund, 1997, Chem. Immunol. 65:111-128; Wright and Morrison, 1997, TibTECH 15:26-32).As cadeias Iate5 rais de oligossacarídeos das imunoglobulinas afetam a função da proteína (Boyd e outros, 1996, Mol. Immunol. 32:1311-1318; Wittwe and Howard, 1990, Biochem. 29:4175-4180) e a interação intramolecular entre porções da glicoproteína, que podem afetar a conformação e a superfície tridimensional apresentada da glicoproteína (Hefferis and Lund, supra; Wyss and Wagner, 10 1996, Current Opin. Biotech. 7:409-416). Oligossacarídeos também servem para direcionar uma dada glicoproteína para certas moléculas baseado nas estruturas de reconhecimento específicas. A glicosilação de anticorpos também tem sido relatada como afetando a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Em particular, células CHO com expressão de β(1,4)-Ν15 acetilglicosaminaminiltransferase Ill (Gn Tlll) regulada por tetraciclina, uma glicosil transferase que catalisa a formação de GIcNAc biseccionada, foi relatada ter atividade ADCC melhorada (Umana e outros, 1999, Mature Biotech. 17:176:180).

A glicosilação de anticorpos é tipicamente ligada a N ou ligada a C. Ligada a N refere-se ao acoplamento da porção de carboidrato a cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As seqüências de tripeptídeos asparagina-X-serina, asparagina-X-treonina e asparagina-X-cisteína, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as seqüências de reconhecimento para o acoplamento enzimático da porção de carboidrato a cadeia lateral de asparagina. Assim, a presença de qualquer uma dessas seqüências de tripeptídeos em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação em potencial. Glicosilação ligada a O refere-se ao acoplamento de um dos açúcares Nacetilgalactosamina, galactose ou xilose a um ácido hidroxiamino, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxilisina ou 5-hidroxiprolina também possam ser usados.

A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo é convenientemente obtida pela alteração da seqüência de aminoácidos tal que ela contenha uma ou mais das seqüências de tripeptídeos acima descritas (para sítios de glicosilação ligada a N). A alteração também pode ser feita pela adição ou substituição de um ou mais resíduos de serina ou treonina na seqüência do anticorpo original (para sítios de glicosilação ligados a O). O padrão de 5 glicosilação de anticorpos também pode ser alterado sem alterar a seqüência de nucleotídeos subjacente. A glicosilação depende amplamente da célula hospedeira usada para expressar o anticorpo. Como o tipo de célula usado para a expressão recombinante de glicoproteínas, por exemplo, anticorpos, como terapêuticos em potencial raramente é a célula nativa, variações 10 nos padrões da glicosilação podem ser esperadas (veja, por exemplo, Hse e outros, 1997, J. Biol. Chem. 272:9062-9070).

Além da escolha das células hospedeiras, fatores que afetam a glicosilação durante a produção recombinante de anticorpos incluem o modo de incubação, formulação dos meios, densidade da cultura, oxigenação, pH, esquemas de purificação e similares. Vários métodos têm sido propostos para alterar o padrão de glicosilação obtido em um organismo hospedeiro particular incluindo a introdução ou superexpressão de certas enzimas envolvidas na produção de oligossacarídeo (Patentes U.S. N0 5.047.335; 5.510.261 e 5.278.299). Glicosilação ou certos tipos de glicosilação podem ser enzimaticamente removidas da glicoproteína usando, por exemplo, a endoglicosidase H (endo H), N-glicosidase F como descrito no Exemplo 3, endoglicosidase F1, endoglicosidase F2, endoglicosidase F3. Além disso, a célula hospedeira recombinante pode ser geneticamente manipulada para ser deficiente no processamento de certos tipos de polissacarídeos. Essas e técnicas similares são bem-conhecidas.

Outros métodos de modificação incluem o uso de métodos de acoplamento conhecido na técnica incluindo, mas não se limitando a meios enzimáticos, substituição oxidativa e quelação. As modificações podem ser usadas, por exemplo, para o acoplamento de marcadores para imunoensaio. 30 Polipeptídeos modificados de 9TL são feitos usando procedimentos estabelecidos na técnica e podem ser rastreados usando ensaios padronizados conhecidos na técnica, alquns dos quais estão descritos abaixo e nos Exemplos.

Em algumas modalidades da invenção, o anticorpo compreende uma região constante modificada, tal como uma região constante que é imunologicamente inerte ou parcialmente inerte, por exemplo, não desencadeia Iise mediada pelo complemento, não estimula a citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) ou não ativa a microglia; ou tem atividades reduzidas (comparado ao anticorpo não-modificado) em qualquer um ou mais dos seguintes: desencadeamento de Iise mediada pelo complemento, estimulação de citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) ou ativação da microglia. Modificações diferentes da região constante podem ser usadas para se obter um nível ótimo e/ou a combinação de funções efetoras. Veja, por exemplo, Morgan e outros, Immunology 86:319-324 (1995); Lund e outros, J. Immunology 157:4963-9 157:4963- 4969 (1996); Idusogie e outros, J. Immunology 164:4178-4184 (2000); Tao e outros, J. Immunology 143: 2595-2601 (1989); e Jefferis e outros, ImmunoIogical Reviews 163:59-76 (1998). Em algumas modalidades, a região constante é modificada como descrito em Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624; Pedido PCT No. PCT/GB99/01441; e/ou Pedido de Patente UK No. 9809951.8. Em outras modalidades, o anticorpo compreende uma região constante da cadeia pesada de lgG2 humana que compreende as seguintes mutações: A330P331 para S330S331 (numeração de aminoácido com referência a seqüência de lgG2 de tipo selvagem). Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624. Em outras modalidades, a região constante é aglicosilada para glicosilação ligada a N pela mutação do resíduo de aminoácido glicosilado ou resíduos flanqueadores que são parte da seqüência de reconhecimento de N-glicosilação na região constante. Por exemplo, o sítio de Nglicosilação N297 pode ser mutado para A, Q, K ou H. Veja, Tao e outros, J. Immunology 143: 2595-2601 (1989); e Jefferis e outros, Immunological Reviews 163:59-76 (1998). Em algumas modalidades, a região constante é aglicosilada para glicosilação ligada a N. A região constante pode ser aglicosilada para glicosilação ligada a N enzimaticamente (tal como removendo o carboidrato pela enzima PNGase), ou pela expressão em uma célula hospedeira deficiente em glicosilação.

Outras modificações de anticorpo incluem anticorpos que foram modificados como descrito na Publicação PCT N0 WO 99/58572, publicada em 18 de Novembro de 1999. Esses anticorpos compreendem, além de um domínio de ligação direcionado para a molécula-alvo, um domínio efetor que tem uma seqüência de aminoácidos substancialmente homóloga a todo ou parte de um domínio constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina humana. Esses anticorpos são capazes de se ligar a molécula-alvo sem desencadear Iise dependente de complemento significativa ou destruição do alvo mediada por célula. Em algumas modalidades, o domínio efetor é capaz de se ligar especificamente a FcRn e/ou FcYRIIb. Esses são tipicamente baseados em domínios quiméricos derivados de dois ou mais domínios CH2 de cadeia pesada de imunoglobulina humana. Anticorpos modificados dessa maneira são particularmente adequados para uso em terapia crônica com anticorpo, para evitar reações inflamatórias e outras reações adversas a terapia com anticorpo convencional.

A invenção inclui modalidades maturadas por afinidade. Por exemplo, anticorpos maturados por afinidade podem ser produzidos por procedimentos conhecidos na técnica (Marks e outros, 1992, Bio/Technology, 20 10:779-783; Barbas e outros, 1994, Proc Nat. Acad. Sei, USA 91:3809-3813; Schier e outros, 1995, Gene, 169:147-155; Yelton e outros, 1995, J. Immunol., 155:1994-2004; Jackson e outros, 1995, J. Immunol., 154(7):3310-9; Hawkins et al, 1992, J. Mol. Biol., 226:889-896; e W02004/058184).

Os seguintes métodos podem ser usados para ajustar a afinida25 de de um anticorpo e para caracterizar uma CDR. Uma maneira de caracterizar uma CDR de um anticorpo e/ou alterar (tal como melhorar) a afinidade de ligação de um polipeptídeo, tal como um anticorpo, denominada "mutagênese por rastreamento de biblioteca". Geralmente, a mutagênese por rastreamento de biblioteca funciona como se segue. Uma ou mais posições de 30 aminoácidos na CDR são substituídas por dois ou mais (tal como 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20) aminoácidos usando métodos reconhecidos na técnica. Isso qera pequenas bibliotecas de clones (em algumas modalidades, um para cada posição de aminoácido que é analisada), cada um com uma complexidade de dois ou mais membros (se dois ou mais aminoácidos são substituídos em cada posição). Geralmente, a biblioteca também inclui um clone que compreende o aminoácido nativo (não5 substituído). Um pequeno número de clones, por exemplo, cerca de 20 a 80 clones (dependendo da complexidade da biblioteca), de cada biblioteca são rastreados quanto a afinidade de ligação ao polipeptídeo-alvo (ou outro alvo de ligação) e os candidatos com ligação aumentada, igual, diminuída ou sem ligação são identificados. Métodos para determinar a afinidade de ligação 10 são bem-conhecidos na técnica. A afinidade de ligação pode ser determinada usando a análise de ressonância de plasma de superfície BIAcore, que detecta diferenças na afinidade de ligação de cerca de 2 vezes ou mais. BIAcore é particularmente útil quando o anticorpo inicial já se liga com uma afinidade relativamente alta, por exemplo um K0 de cerca de 10 nM ou me15 nos. O rastreamento usando a ressonância de plasma de superfície BIAcore é descrito aqui nos Exemplos.

A afinidade de ligação pode ser determinada usando Kinexa Biocensor, ensaios de proximidade de cintilação, ELISA, imunoensaio ORIGEN (IGEN), extinção de fluorescência, transferência de fluorescência e/ou apresentação em levedura. A afinidade de ligação também pode ser rastreada usando um bioensaio adequado.

Em algumas modalidades, cada posição de aminoácido em uma CDR é substituída (em algumas modalidades, uma por vez) por todos os 20 aminoácidos naturais usando métodos de mutagênese reconhecidos na téc25 nica (alguns dos quais estão aqui descritos). Isso gera pequenas bibliotecas de clones (em algumas modalidades, uma para cada posição de aminoácido que é analisada).

Em algumas modalidades, a biblioteca a ser rastreada compreende substituições em duas ou mais posições, que podem ser na mesma CDR ou em duas ou mais CDRs. Assim, a biblioteca pode compreender substituições em duas ou mais posições em uma CDR. A biblioteca pode compreender substituição em duas ou mais posições em duas ou mais CDRs. A biblioteca pode compreender substituição em 3, 4, 5 ou mais posições, as ditas posições encontradas em duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs. A substituição pode ser preparada usando códons de baixa redundância. Veja, por exemplo, a Tabela 2 de Balint e outros, (1993) Gene 5 137(1): 109-18.

A CDR pode ser CDRH3 e/ou CDRL3. A CDR pode ser uma ou mais de CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2 e/ou CDRH3. A CDR pode ser uma CDR de Kabat, uma CDR de Chothia ou uma CDR estendida. Candidatos com ligação melhorada podem ser sequênciados, identificando 10 dessa maneira uma CDR mutante por substituição que resulta em afinidade melhorada (também denominada uma substituição "melhorada"). Candidatos que se ligam também podem ser sequênciados, identificando dessa maneira uma CDR com substituição que retém a ligação.

Ciclos múltiplos de rastreamento podem ser conduzidos. Por 15 exemplo, candidatos (cada um compreendendo uma substituição de aminoácido em uma ou mais posições de uma ou mais CDRs) com ligação melhorada também são úteis na construção de uma segunda biblioteca contendo pelo menos o original e o aminoácido substituído de cada posição da CDR aperfeiçoada (isto é, a posição de aminoácido na CDR na qual um mutante 20 por substituição mostrou ligação melhorada). A preparação e o rastreamento ou seleção dessa biblioteca são discutidos mais abaixo.

A mutagênese por rastreamento de biblioteca também fornece um meio para caracterizar uma CDR, a medida que a frequência de clones com ligação melhorada, a mesma ligação, ligação diminuída ou sem ligação 25 também fornecem informação relacionada a importância de cada posição de aminoácido para a estabilidade do complexo antígeno-anticorpo. Por exemplo, se uma posição da CDR retém a ligação quando substituída por todos os 20 aminoácidos, aquela posição é identificada como uma posição que é importante para a função da CDR. Assim, os métodos de mutagênese por 30 rastreamento de biblioteca geram informações com relação às posições nas CDRs que podem ser substituídas por vários aminoácidos diferentes (incluindo todos os 20 aminoácidos) e posições nas CDRs que não podem ser substituídas ou que podem ser substituídas por alguns aminoácidos.

Candidatos com afinidade melhorada podem ser combinados com uma segunda biblioteca, que inclui o aminoácido melhorado, o aminoácido original naquela posição e pode incluir ainda substituições adicionais 5 naquela posição, dependendo da complexidade da biblioteca que é desejada ou que permita usar o método de rastreamento ou seleção desejados. Além disso, se desejado, a posição do aminoácido adjacente pode ser randomizada por pelo menos dois ou mais aminoácidos. A randomização de aminoácidos adjacentes pode permitir flexibilidade conformacional adicional na CDR 10 mutante que, por sua vez, permite ou facilita a introdução de um grande número de mutações aperfeiçoadas. A biblioteca também pode compreender uma substituição em posições que não mostram afinidade melhorada no primeiro ciclo de rastreamento.

A segunda biblioteca é rastreada ou selecionada quanto a mem15 bros da biblioteca com afinidade de ligação melhorada e/ou alterada usando qualquer método conhecido na técnica, incluindo o rastreamento com o uso da análise de ressonância de plasma de superfície BIAcore e a seleção usando qualquer método conhecido na técnica para seleção, incluindo apresentação em fago, apresentação em levedura e apresentação em ribosso20 mo.

A invenção também abrange proteínas de fusão que compreendem um ou mais fragmentos ou regiões dos anticorpos (tais como 9TL e 6G) ou polipeptídeos dessa invenção. Em uma modalidade, é fornecido um polipeptídeo de fusão que compreende pelo menos 10 aminoácidos contíguos da região variável da cadeia leve e/ou pelo menos 10 aminoácidos contíguos da região variável da cadeia pesada. Em outras modalidades, é fornecido um polipeptídeo de fusão que compreende pelo menos cerca de 10, pelo menos cerca de 15, pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de 25, pelo menos cerca de 30 aminoácidos contíguos da região variável da cadeia leve; e/ou pelo menos cerca de 10, pelo menos cerca de 15, pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de 25, pelo menos cerca de 30 aminoácidos contíguos da região variável da cadeia pesada. Em outra modalidade, o polipeptídeo de fusão compreende uma região variável da cadeia leve e/ou uma região variável da cadeia pesada de 9TL ou 6G. Em outra modalidade, o polipeptídeo de fusão compreende uma ou mais CDRs de 9TL ou 6G. Em outras modalidades ainda, o polipeptídeo de fusão compreende CDR H3 e/ou CDR 5 L3 do anticorpo 9TL ou 6G. Para os propósitos dessa invenção, uma proteína de fusão de 9TL ou 6G contém um ou mais anticorpos 9TL ou 6G, respectivamente e outra seqüência de aminoácidos a qual não está acoplada na molécula nativa, por exemplo, uma seqüência heteróloga ou uma seqüência homóloga de outra região. Seqüências heterólogas exemplares in10 cluem, mas não são limitadas a um "tag" tais como um tag FLAG ou um tag 6His. Tags são bem-conhecidos na técnica.

Um polipeptídeo de fusão pode ser criado por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, sinteticamente ou recombinantemente. Tipicamente, as proteínas de fusão dessa invenção são feitas preparando e ex15 pressando um polinucleotídeo que as codifique usando os métodos recombinantes aqui descritos, embora elas possam ser preparadas também por outros meios conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, síntese química.

A invenção também fornece composições que compreendem os anticorpos ou os polipeptídeos conjugados (por exemplo, ligados) a um agente que facilite o acoplamento a um suporte sólido (tal como biotina ou avidina). Para simplificação, será feita referência a anticorpos em geral, com o entendimento de que esses métodos se aplicam a quaisquer das modalidades de ligação a Αβ aqui descritos. A conjugação geralmente refere-se a ligação desses componentes como aqui descritos. A ligação (que é geralmente a fixação desses componentes em estreita associação pelo menos para administração) pode ser obtida por qualquer número de meios. Por exemplo, uma reação direta entre um agente e um anticorpo é possível quando cada um possui um substituinte capaz de reagir com o outro. Por exempio, um grupo nucleofílico, tal como um grupo amino ou sulfidrila, sobre um pode ser capaz de reagir com um grupo que contém carbonila, tal como um anidrido ou um ácido haleto, ou com um grupo alquila contendo um bom grupo de partida (por exemplo, um haleto) sobre o outro.

Um anticorpo ou polipeptídeo dessa invenção podem ser ligados a uma agente marcador (alternativamente denominado "marcador"), tais como uma molécula fluorescente, uma molécula radioativa ou quaisquer outros 5 marcadores conhecidos na técnica. Os marcadores que são conhecidos na técnica geralmente fornecem (diretamente ou indiretamente) um sinal. A invenção também fornece composições (incluindo composições farmacêuticas) e kits que compreendem o anticorpo 9TL ou 6G e, como essa descrição tornou claro, qualquer um ou todos os anticorpos e/ou polipeptídeos aqui 10 descritos.

Anticorpos e polipeptídeos anti-peptídeo Αβ que têm função efetora deficiente

Os métodos da invenção usam anticorpos ou polipeptídeos (incluindo as composições farmacêuticas que compreendem os anticorpos ou polipeptídeos) que se ligam especificamente a um peptídeo β-amiloide (Αβ) e que têm função efetora deficiente. Os anticorpos e polipeptídeos são caracterizados ainda por quaisquer (uma ou mais) das seguintes características: (a) suprimem a formação de placas amiloides em um indivíduo; (b) reduzem as placas amiloides no olho de um indivíduo; (c) tratam, previnem ou melhoram um ou mais sintomas de doença oftálmica, incluindo mas não limitado a degeneração macular relacionada à idade (ambas, atrófica e exsudativa), glaucoma, retinopatia diabética (incluindo edema macular) e outras doenças degenerativas retinianas relacionadas; (d) causam proteção significativa ou recuperação da função retiniana; e (e) causam preservação ou restauração significativas da acuidade visual.

Os anticorpos e polipeptídeos aqui descritos podem exibir um perfil de segurança desejável, por exemplo, as composições da invenção não causam níveis significativos ou inaceitáveis ou têm um nível reduzido de qualquer um ou mais de: sangramento da vascularização cerebral (hemorragia cerebral); meningoencefalite (incluindo alteração na ressonância magnética); contagem de células brancas elevada no líquido cérebro-espinhal; inflamação do sistema nervoso central. Como usado aqui, um anticorpo ou polipeptídeo que tem uma "função efetora deficiente" (usado alternadamente com "imunologicamente inerte" ou "parcialmente imunologicamente inerte") refere-se a anticorpos ou polipeptídeos que não têm qualquer função efetora ou que têm atividade ou 5 atividades reduzidas de função efetora (comparados ao anticorpo ou polipeptídeo que têm uma região constante não-modificada ou que ocorre naturalmente), por exemplo, que não têm atividade ou têm atividade reduzida em qualquer um ou mais do seguinte: a) desencadeamento de Iise mediada por complemento; b) estimulação de citotoxicidade mediada por célula depen10 dente de anticorpo (ADCC); e c) ativação da microglia. A atividade da função efetora pode estar reduzida em cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, e 100%. Em algumas modalidades, o anticorpo se liga ao peptídeo beta-amiloide sem desencadear Iise dependente do complemento ou destruição do alvo mediada por célula significativas. Por 15 exemplo, o sítio de ligação do receptor Fc sobre a região constante pode ser modificado ou mutado para remover ou reduzir a afinidade de ligação a certos receptores Fe, tais como FcyRI, FcyRII e/ou FcyRIII. Para simplificar, as referências serão feita aos anticorpos com o entendimento de que as modalidades também se aplica, aos polipeptídeos. O sistema de numeração EU 20 ((Kabat e outros, Sequences of Proteins of Immunological Interest; 5o ed. Public Health Service, National Institutes of Healthy, Bethesda, Md., 1991) é usado para indicar qual/quais resíduo(s) da região constante (por exemplo, de um anticorpo IgG) está/estão alterado(s) ou mutado(s). A numeração pode ser usada para um tipo específico de anticorpo (por exemplo, IgGI) ou 25 para uma espécie (por exemplo, ser humano) com o entendimento de que alterações similares podem ser feitas através de tipos de anticorpos e de espécies.

Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especificamente a um peptídeo Αβ compreende uma região constante de cadeia pesada que tem função efetora deficiente. A região constante da cadeia pesada pode ter uma seqüência que ocorre naturalmente ou ser uma variante. Em algumas modalidades, a seqüência de aminoácidos de uma região constante de cadeia pesada que ocorre naturalmente é mutada, por exemplo, por uma substituição, inserção e/ou deleção de aminoácido, de maneira que a função efetora da região constante torne-se deficiente. Em algumas modalidades, a N-glicosilação da região Fc de uma região constante de cadeia pe5 sada também pode ser alterada, por exemplo, pode ser removida completamente ou parcialmente, de maneira que a função efetora da região constante torne-se deficiente.

Em algumas modalidades, a função efetora é prejudicada pela remoção da N-glicosilação da região Fc (por exemplo no domínio CH2 de IgG) do anti-peptídeo Αβ. Em algumas modalidades, a N-glicosilação da região Fc é removida pela mutação do resíduo de aminoácido glicosilado ou resíduos flanqueadores que são parte da seqüência de reconhecimento de glicosilação na região constante. As seqüências de tripeptídeo asparagina-Xserina (N-X-S), asparagina-X-treonina (N-X-T) e asparagina-X-cisteína (N-XC), em que X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as seqüências de reconhecimento para acoplamento enzimático da porção carboidrato a cadeia lateral de asparagina para N-glicosilação. A mutação de qualquer um dos aminoácidos nas seqüências de tripeptídeos na região constante rende uma IgG aglicosilada. Por exemplo, o sítio de N-glicosilação N297 de IgGI e lgG3 humanas pode ser mutado para A, D, Q, K ou E. Veja, Tao e outros, J. Immunology 143: 2595-2601 (1989); e Jefferis e outros, Immunological Reviews 163:59-76 (1998). Foi relatado que IgGI e lgG3 humanas com substituição de Asn-297 por Gln1 His ou Lys não se ligam a FcyRI humano e não ativam o complemento com habilidade de ligação C1q completamente perdida para IgGI e dramaticamente diminuída para lgG3. Em algumas modalidades, o aminoácido N nas seqüências de tripeptídeo é mutado para qualquer um dos aminoácidos A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, P, Q, R, S, T, V, W, Y. Em algumas modalidades, o aminoácido N nas seqüências de tripeptídeo é mutado para uma substituição conservativa. Em algumas modalidades, o aminoácido X nas seqüências de tripeptídeo é mutado para prolina. Em algumas modalidades, o aminoácido S nas seqüências de tripeptídeo é mutado para A, D, E, F, G, Η, I, K, L, Μ, N, P, Q, R, V, W, Y. Em algumas modalidades, o aminoácido T nas seqüências de tripeptídeo é mutado para A, D, E, F1 G, H1 I, K1 L, M, N1 P, Q, R, V, W, Y. Em algumas modalidades, o aminoácido C nas seqüências de tripeptídeo é mutado para A, D, E, F1 G, H, I, K, L, Μ, N, P, Q, R1 V, W, Y. Em algumas modalidades, o aminoácido que acom5 panha o tripeptídeo é mutado para P. Em algumas modalidades, a região de N-glicosilação na região constante é removida enzimaticamente (tal como com a N-glicosidase F como descrito no Exemplo 3, endoglicosidase F1, endoglicosidase F2, endoglicosidase F3, e englicosidase H). A remoção da N-glicosilação também pode ser obtida pela produção do anticorpo em uma 10 linhagem celular que tem deficiência de N-glicosilação. Wright e outros, J Immunol. 160(7):3393-402 (1998).

Em algumas modalidades, o resíduo de aminoácido que interage com o oligossacarídeo acoplado no sítio de N-glicosilação da região constante é mutado para reduzir a afinidade de ligação a FcyRI. Por exemplo F241, V264, D265 de lgG3 humana podem ser mutados. Veja Lund e outros, J. Immunology 157:4963-4969 (1996).

Em algumas modalidades, a função efetora é prejudicada pela modificação de regiões tais como 233-236, 297 e/ou 327-331 de IgG humana como descrito por PCT WO 99/58572 e Armour e outros, Molecular Immunology 40: 585-593 (2003); Reddy e outros, J. Immunology 164:1925- 1933 (2000). Os anticorpos descritos no PCT WO 99/58572 e por Armour e outros, compreendem além de um domínio de ligação direcionado para a molécula-alvo, um domínio efetor que tem uma seqüência de aminoácidos substancialmente homóloga a toda ou parte de uma região constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina humana. Esses anticorpos são capazes de se ligar a uma molécula-alvo sem desencadear a Iise dependente de complemento ou a destruição do alvo mediada por célula significativas. Em algumas modalidades, o domínio efetor tem afinidade reduzida por FcyRI, FcyRII, e FcyRIII. Em algumas modalidades, o domínio efetor é capaz de se ligar especificamente a FcRn e/ou FcyRIIb. Esses são tipicamente baseados em domínios quiméricos derivados de dois ou mais domínios CH2 de cadeia pesada de imunoglobulina humana. Anticorpos modificados dessa maneira são particularmente adequados para uso em terapia crônica com anticorpo, para evitar as reações inflamatórias e outras reações adversas da terapia convencional com anticorpo. Em algumas modalidades, a região constante da cadeia pesada do anticorpo é uma cadeia pesada de IgGI humana com 5 qualquer uma das seguintes mutações: 1) A327A330P331 para G327S330S331; 2) E233L234L235G236 para P233V234A235 com G236 deletada; 3) E233L234L235 para P233V234A235; 4) E233L234L235G236A327A330P331 para P233V234A235G327S330S331 com G236 deletada; 5) E233L234L235A327A330P331 para 10 P233V234A235G327S330S331; e 6) N297 para A297 ou qualquer outro aminoácido exceto N. Em algumas modalidades, a região constante da cadeia pesada do anticorpo é uma cadeia pesada de lgG2 humana com as seguintes mutações: A330P331 para S330S331. Em algumas modalidades, a região constante da cadeia pesada do anticorpo é uma cadeia pesada de lgG4 15 humana com qualquer uma das seguintes mutações: E233F234L235G236 para P233V234A235 com G236 deletada; E233F234L235 para P233V234A235; e S228L235 para P228E235.

A região constante dos anticorpos também pode ser modificada para prejudicar a ativação do complemento. Por exemplo, a ativação do 20 complemento de anticorpos IgG que acompanha a ligação do componente C1 ao complemento pode ser reduzida pela mutação de resíduos de aminoácidos na região constante de um motivo de ligação a C1 (por exemplo, motivo de ligação C1q). Foi relatado que a mutação de Ala para cada um de D270, K322, P329, P331 de IgGI humana reduziu significativamente a habí25 Iidade do anticorpo de se ligar a C1q e ativar o complemento. Para lgG2b de murino, o motivo de ligação constitui-se dos resíduos E318, K320 e K322. Idusogie e outros, J. Immunology 164:4178-4184 (2000); Duncan e outros, Nature 322: 738-740 (1988).

O motivo de ligação a C1q E318, K320 e K322 identificado para a lgG2b de murino é considerado ser comum a outros isotipos de anticorpo. Duncan e outros, Nature 322: 738-740 (1988). A atividade de ligação a C1q por lgG2b pode ser abolida pela substituição de qualquer um dos três resíduos especificados por um resíduo que tem uma funcionalidade inapropriada sobre sua cadeia lateral. Não é necessário substituir os resíduos iônicos por Ala para abolir a ligação a C1q. Também é possível usar outros resíduos não-iônicos alquil-substituídos, tais como Gly1 He, Leu ou Val ou resíduos 5 não polares aromáticos tais como Phe, Tyr1 Trp e Pro no lugar de qualquer um dos três resíduos a fim de abolir a ligação a C1q. Além disso, também é possível usar tais resíduos não-iônicos polares como Ser, Thr, Cys e Met no lugar dos resíduos 320 e 322, mas não de 318, a fim de abolir a ligação a C1q.

A invenção também fornece anticorpos que têm função efetora

deficiente em que o anticorpo tem uma região de dobradiça modificada. A afinidade de ligação de IgG humana por seus receptores Fc pode ser modulada pela modificação da região de dobradiça. Canfield e outros, J. Exp. Med. 173:1483-1491 (1991); Hezareh e outros, J. Virol 75:12161-12168 (2001); Redpath e outros, Human Immunoiogy 59:720-727 (1998). Resíduos de aminoácidos específicos podem ser mutados ou deletados. A região de dobradiça modificada pode compreender uma região de dobradiça completa derivada de um anticorpo de classe ou subclasse de anticorpo diferentes daquela do domínio CH1. Por exemplo, o domínio constante (CH1) de um anticorpo da classe de IgG pode ser acoplado a uma região de dobradiça de um anticorpo da classe de lgG4. Alternativamente, uma região de dobradiça nova pode compreender parte de uma dobradiça natural ou uma unidade de repetição na qual cada unidade na repetição é derivada de uma região de dobradiça natural. Em algumas modalidades, a região de dobradiça natural é alterada pela conversão de um ou mais resíduos de cisteína em um resíduo neutro, tal como alanina, ou pela conversão de resíduos adequadamente colocados em resíduos de cisteína. Patente U.S. N0 5.677.425. Tais alterações são realizadas usando química de proteína reconhecida na técnica, técnicas de manipulação genética e como aqui descrito.

Polipeptídeos que se ligam especificamente a um peptídeo Αβ e

que estão fundidos a uma região constante de cadeia pesada que tem função efetora deficiente também podem ser usados para os métodos aqui descritos. Em algumas modalidades, o polipeptídeo compreende uma seqüência derivada do anticorpo 9TI ou suas variantes mostradas na Tabela 3. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é derivado de um domínio único de anticorpo que se liga a um peptídeo Αβ. Anticorpos com domínio único podem 5 ser gerados usando métodos conhecidos na técnica. . Omidfar e outros, Tumour Biol. 25:296-305 (2004); Herring e outros, Trends in Biotechnology 21:484-489 (2003).

Em algumas modalidades, o anticorpo ou polipeptídeo não é um fragmento F(ab')2. Em algumas modalidades, o anticorpo ou polipeptídeo 10 não é um fragmento Fab. Em algumas modalidades, o anticorpo ou polipeptídeo não é um anticorpo scFv de cadeia simples. Em algumas modalidades, o anticorpo ou polipeptídeo é um fragmento F(ab')2 PEGuilado. Em algumas modalidades, o anticorpo ou polipeptídeo é um fragmento Fab PEGuilado. Em algumas modalidades, o anticorpo ou polipeptídeo é um anticorpo scFv 15 de cadeia simples PEGuilado.

Outros métodos para fazer anticorpos que têm função efetora deficiente conhecidos na técnica podem ser usados.

Anticorpos e polipeptídeos com regiões constantes modificadas podem ser testados em um ou mais ensaios para avaliar o nível de redução 20 de função efetora na atividade biológica comparada com o anticorpo inicial. Por exemplo, a habilidade do anticorpo ou polipeptídeo com uma região Fc alterada de se ligar ao complemento ou receptores Fc (por exemplo, receptores Fc da microglia) ou a uma região de dobradiça alterada pode ser avaliada usando os ensaios descritos aqui assim como qualquer ensaio reconhe25 cido pela técnica. PCT WO 99/58572; Armour e outros, Molecular ImmunoIogy 40: 585-593 (2003); Reddy e outros, J. Immunology 164:1925-1933 (2000); Song e outros, Infection and Immunity 70:5177-5184 (2002).

Em algumas modalidades, o anticorpo que se liga especificamente ao peptídeo β-amiloide é um anticorpo policlonal. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo humano. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo quimérico. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo humanizado. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo primatizado. Veja, por exemplo, Yocum e outros, J. RheumatoL 25:1257-62

(1998); Bugelski e outros, Human & Experimental Toxicoloy 19:230-243 (2000). Em algumas modalidades, o anticorpo é desimunizado por mutação 5 tal que o anticorpo não ativa o sistema imune humano. Veja, por exemplo, Nanus, e outros, J. Urology 170:S84-S89 (2003).

Como usado aqui, o peptídeo Αβ inclui quaisquer fragmentos de produtos da clivagem enzimática da proteína precursora de amiloide. Por exemplo, peptídeos Αβ incluem quaisquer fragmentos de Αβι.40, Αβι.42 ou 10 Αβι-43; e peptídeos que são truncados com vários números de aminoácidos na terminação N ou na terminação C de Αβι.40, Αβ-ι-42 ou Αβι-43. A numeração de aminoácidos usada aqui é baseada na numeração de Αβι-43 (SEQ ID N0 17).

Em algumas modalidades, o anticorpo ou polipeptídeo ligam-se especificamente a um epitopo dentro dos resíduos 1-16 do peptídeo Αβ. Em algumas modalidades, o anticorpo ou polipeptídeo ligam-se especificamente a um epitopo dentro dos resíduos 16-28 do peptídeo Αβ. Em algumas modalidades, o anticorpo ou polipeptídeo ligam-se especificamente a um epitopo dentro dos resíduos 28-40 do peptídeo Αβι-40. Em algumas modalidades, o anticorpo ou polipeptídeo ligam-se especificamente a um epitopo dentro dos resíduos 28-42 do peptídeo Αβι-42. Em algumas modalidades, o anticorpo ou polipeptídeo ligam-se especificamente a um epitopo dentro dos resíduos 28- 43 do peptídeo Αβι-43. Em algumas modalidades, o anticorpo ou polipeptídeo ligam-se especificamente a um peptídeo Αβ sem ligação com a proteína precursora de amiloide de extensão completa (APP). Em algumas modalidades, o anticorpo ou polipeptídeo ligam-se especificamente a uma forma agregada de Αβ sem ligarem-se com a forma solúvel. Em algumas modalidades, o anticorpo ou polipeptídeo liga-se especificamente a ambas as formas agregada e solúvel de Αβ. Anticorpos que se ligam a várias formas agregadas de Αβ são conhecidos na técnica, por exemplo, anticorpos que se ligam a Iigantes difusíveis derivados de beta amiloide (ADDLs); anticorpos que se ligam a fibrilas e/ou depósito de amiloide. WO 03/104437; U.S. Pub. No. 2003/0147887; U.S. Pub. No. 2004/0219146.

Em algumas modalidades, o anticorpo ou polipeptídeo compreendem uma, duas ou três CDRs da cadeia leve da imunogobulina 3D6 (SEQ ID N°:2 na U.S. Pub. Nos. 2003/0165496, ou 2004/0087777), e/ou uma, du5 as ou três CDRs da cadeia leve da imunogobulina 3D6 (SEQ ID N°4 em U.S. Pub. Nos. 2003/0165496, ou 2004/0087777). Em algumas modalidades, o anticorpo ou polipeptídeo compreendem uma região variável de cadeia pesada como descrita na SEQ ID N°8 na U.S. Pub. No. 2003/0165496 e uma região variável de cadeia leve como descrita SEQ ID N°5 na U.S. Pub. No. 10 2003/0165496. Em algumas modalidades, o anticorpo ou polipeptídeo compreendem uma região variável de cadeia pesada como descrita na SEQ ID N0 12 na U.S. Pub. No. 2003/0165496 e uma região variável de cadeia leve como descrita SEQ ID N0 11 na U.S. Pub. No. 2003/0165496. Em algumas modalidades, o anticorpo ou polipeptídeo compreendem uma, duas ou três 15 CDRs da cadeia leve da imunogobulina 10D5 (SEQ ID N°14 na U.S. Pub. Nos. 2003/0165496, ou 2004/0087777), e/ou uma, duas ou três CDRs da cadeia pesada da imunogobulina (SEQ ID N°16 na U.S. Pub. Nos. 2003/0165496, ou 2004/0087777).

Em algumas modalidades, o anticorpo ou polipeptídeo liga-se especificamente a um epitopo dentro dos resíduos 33-40 do peptídeo Αβι-40. Em algumas modalidades, o anticorpo ou polipeptídeo se ligam especificamente a um epitopo sobre o peptídeo Αβι.40 que inclui os aminoácidos 35- 40. Em algumas modalidades, o anticorpo ou polipeptídeo se ligam especificamente a um epitopo sobre o peptídeo Αβι.40 que inclui os aminoácidos 36- 40. Em algumas modalidades, o anticorpo ou polipeptídeo liga-se especificamente a um epitopo sobre o peptídeo Αβι.40 que inclui os aminoácidos 39 e/ou 40. Em algumas modalidades, 0 anticorpo ou polipeptídeo liga-se especificamente ao peptídeo Αβι.4ο mas não se ligam especificamente a Αβι-42 e/ou Αβι-43. Em algumas modalidades, 0 anticorpo ou polipeptídeo é um anticorpo 9TL ou um anticorpo ou polipeptídeo derivado de 9TL aqui descrito. Em algumas modalidades, 0 anticorpo ou polipeptídeo inibem competitivamente a ligação do anticorpo 9TL e/ou do anticorpo ou polipeptídeo derivado de 9TL a Αβ^ο. Em algumas modalidades, o anticorpo não é o anticorpo 2286 descrito na PCT WO 2004/032868. Em algumas modalidades, o anticorpo ou polipeptídeo é um anticorpo 6G ou um anticorpo ou polipeptídeo derivado de 6G aqui descrito. Em algumas modalidades, o anticorpo ou poli5 peptídeo inibem competitiva mente a ligação do anticorpo 6G e/ou do anticorpo ou polipeptídeo derivado de 6G a Αβ-Μο e Αβ-ι-42. Em algumas modalidades, o anticorpo não é o anticorpo 2294 descrito em US 2004/0146512 e WO 04/032868. Como descrito em W02006118959, o anticorpo 2294 se liga a um epitopo muito similar ao anticorpo 6G.

Métodos para fazer anticorpos e polipeptídeos são conhecidos

na técnica e estão descritos aqui.

Ensaios de competição podem ser usados para determinar se dois anticorpos se ligam ao mesmo epitopo pelo reconhecimento de epitopos idênticos ou estericamente superpostos ou se um anticorpo inibe competiti15 vãmente a ligação de outro anticorpo ao antígeno. Esses ensaios são conhecidos na técnica. Tipicamente, o antígeno é imobilizado sobre uma placa de múltiplos poços e a habilidade de anticorpos não marcados de bloquear a ligação de anticorpos marcados é medida. Marcadores comuns para tais ensaios de competição são marcadores radioativos ou marcadores enzimáti20 cos.

Polinucleotídeos, vetores e células hospedeiras

A invenção também fornece polinucleotídeos isolados que codificam anticorpos e polipeptídeos da invenção (incluindo um anticorpo que compreende as seqüências das regiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada mostradas nas Figura 1 e 8) e vetores e células hospedeiras que compreendem o polinucleotídeo.

Consequentemente, a invenção fornece polinucleotídeos (ou composições, incluindo composições farmacêuticas) que compreendem polinucleotídeos que codificam qualquer um dos seguintes: (a) anticorpo 9TL 30 ou 6G ou suas variantes mostradas nas Tabelas 3 e 8; (b) um fragmento ou uma região do anticorpo 9TL ou 6G ou suas variantes mostradas nas Tabelas 3 e 8: (c) uma cadeia leve do anticorpo 9TL ou 6G ou suas variantes mostradas nas Tabelas 3 e 8; (d) uma cadeia pesada do anticorpo 9TL ou 6G ou suas variantes mostradas nas Tabelas 3 e 8; (e) uma ou mais regiões variáveis de uma cadeia leve e/ou de uma cadeia pesada do anticorpo 9TL ou 6G ou suas variantes mostradas nas Tabelas 3 e 8; (f) uma ou mais C5 DRs (uma, duas, três, quatro, cinco ou seis CDRs) do anticorpo 9TL ou 6G ou suas variantes mostradas nas Tabelas 3 e 8; (g) CDR H3 da cadeia pesada do anticorpo 9TL ou 6G; (h) CDR L3 da cadeia leve do anticorpo 9TL ou 6G ou suas variantes mostradas nas Tabelas 3 e 8; (i) três CDRs das cadeia leve do anticorpo 9TL ou 6G ou suas variantes mostradas nas Tabe10 Ias 3 e 8; (j) três CDRs da cadeia pesada do anticorpo 9TL ou 6G ou suas variantes mostradas nas Tabelas 3 e 8; (k) três CDRs da cadeia leve e três CDRs da cadeia pesada do anticorpo 9TL ou 6G ou suas variantes mostradas nas Tabelas 3 e 8; e (I) um anticorpo que compreenda qualquer um de (b) até (k). Em algumas modalidades, o polinucleotídeo compreende um ou 15 ambos os polinucleotídeos mostrados na SEQ ID N0 9, SEQ ID N°10, SEQ ID N0 34 e SEQ ID N0 35.

Em outro aspecto, a invenção fornece polinucleotídeos que codificam qualquer um dos anticorpos (incluindo fragmentos de anticorpo) e polipeptídeos aqui descrito, tais como anticorpos e polipeptídeos que têm função efetora deficiente. Polinucleotídeos podem ser feitos por procedimentos conhecidos na técnica.

Em outro aspecto, a invenção fornece composições (tais como composições farmacêuticas) que compreendem quaisquer polinucleotídeos da invenção. Em algumas modalidades, a composição compreende um vetor de expressão que compreende um polinucleotídeo que codifica o anticorpo 9TL aqui descrito. Em outra modalidade, a composição compreende um vetor de expressão que compreende um polinucleotídeo que codifica qualquer um dos anticorpos e polinucleotídeos descritos aqui. Em outras modalidades, a composição compreende um ou ambos os polinucleotídeos mostrados nas SEQ ID N0 9 ou SEQ ID N0 10. Vetores de expressão e a administração de composições de polinucleotídeos são descritos aqui posteriormente. Em outro aspecto, a invenção fornece um método para fazer qualquer um dos polinucleotídeos aqui descritos.

Polinucleotídeos complementares a qualquer uma de tais seqüências também são abrangidos pela presente invenção. Polinucleotídeos 5 podem ser de fita simples (codificadora ou antissenso) ou de fita dupla e podem ser moléculas de DNA (genômico, cDNA ou sintético) ou RNA. Moléculas de RNA incluem moléculas de HnRNA1 que contêm íntrons e correspondem a uma molécula de DNA de uma maneira um para um, e moléculas de mRNA que não contêm íntrons. Seqüências codificadoras ou não codificado10 ras podem, mas não necessariamente, estar presentes dentro de um polinucleotídeo da presente invenção e um polinucleotídeo pode, mas nãonecessariamente, estar ligado a outra moléculas e/ou materiais de suporte.

Polinucleotídeos podem compreender uma seqüência nativa (isto é, uma seqüência endógena que codifica um anticorpo ou uma porção 15 desse) ou podem compreender uma variante de tal seqüência. Variantes de polinucleotídeo contêm uma ou mais substituições, adições, deleções e/ou inserções tal que a imunorreatividade do polipeptídeo codificado não é diminuída, em relação a uma molécula imunorreativa. O efeito sobre a imunorreatividade do polipeptídeo codificado pode ser avaliada, comumente, como 20 aqui descrito. As variantes preferivelmente exibem pelo menos cerca de 70% de identidade, mais preferivelmente pelo menos cerca de 80% de identidade e o mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% de identidade a uma seqüência de polinucleotídeo que codifique um anticorpo nativo ou uma porção desse.

Duas seqüências de polinucleotídeo ou polipeptídeo são ditas

serem "idênticas" quando a seqüência de nucleotídeos ou aminoácidos nas duas seqüências é a mesma quando alinhadas para a correspondência máxima como descrito abaixo. As comparações entre duas seqüências são realizadas tipicamente pela comparação das seqüências sobre uma janela de 30 comparação para identificar e comparar regiões locais de similaridade de seqüência. Uma "janela de comparação" como usada aqui, refere-se a um seqmento de pelo menos cerca de 20 posições contíguas, geralmente de 30 a cerca de 75, 40 a cerca de 50, no qual uma seqüência pode ser comparada com uma seqüência de referencia com o mesmo número de posições contíguas após as duas seqüências serem otimamente alinhadas.

O alinhamento ótimo de seqüências para comparação pode ser 5 conduzido usando o programa Megalign no conjunto Lasergene de programas de bioinformática (DNASTAR, In., Madison1 Wl), usando parâmetros predeterminados. Esse programa incorpora vários esquemas de alinhamento descritos nas seguintes referencias: Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. Em 10 Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J., 1990, Unified Approaeh to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. and Mul15 IerW., 1988, CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principies and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730.

Preferivelmente, o "percentual de identidade de seqüência" é

determinado pela comparação de duas seqüências otimamente alinhadas sobre uma janela de comparação de pelo menos 20 posições, em que a porção da seqüência de polinucleotídeo ou de polipeptídeo na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, gaps) de 20 por cento 25 ou menos, geralmente 5 a 15 por cento ou 10 a 12 por cento, quando comparada com as seqüências de referencia (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ótimo das duas seqüências. O percentual é calculado pela determinação do número de posições nas quais bases de ácidos nucleicos ou resíduos de aminoácidos idênticos ocorrem em ambas as se30 quências para se obter o número de posições pareadas, dividindo o número de posições pareadas pelo número total de posições na seqüência de referência (isto é, o tamanho da janela) e multiplicando os resultados por 100 para se obter o percentual de identidade de seqüência.

As variantes também podem, ou alternativamente podem, ser substancialmente homólogas a um gene nativo, ou uma porção ou complemento desse. Tais variantes de polinucleotídeos são capazes de hibridizar 5 sob condições moderadamente estringentes a uma seqüência de DNA que ocorre naturalmente que codifica um anticorpo nativo (ou uma seqüência complementar).

"Condições moderadamente estringentes" adequadas incluem pré-lavagem em uma solução de 5 X SSC, SDS 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8.0); hibridização a 50°C-65°C, 5 X SSC durante a noite; seguido por lavagem duas vezes a 65°C por 20 minutos com cada um de 2X, 0,5X e 0,2X SSC contendo SDS 0,1%.

Como usadas aqui, "condições altamente estringentes" ou "condições de alta estringência" são aquelas que: (1) empregam baixa força iôni15 ca e alta temperatura para lavagem, por exemplo cloreto de sódio 0,015 M/citrato de sódio 0,0015 M/dodecil sulfato de sódio 0,1% a 50°C; (2) empregam durante a hibridização um agente desnaturante, tal como formamida, por exemplo, formamida 50% (v/v) com albumina sérica bovina 0,1 %/Ficoll 0,1%/polivinilpirrolidona 0,1%/tampão de fosfato de sódio 50 mM em pH 6,5 20 com cloreto de sódio 750 mM, citrato de sódio 75 mM a 42°C; ou (3) empregam formamida 50%, 5 X SSC (NaCI 0,75 M, citrato de sódio 0,075 M), fosfato de sódio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sódio 0,1%, 5 x solução de Denhardt, DNA de esperma de salmão sonicado (50pg/ml), SDS 0,1% e sulfato de dextran 10% a 42°C com lavagens a 42°C em 0,2 X SSC (cloreto de só25 dio/citrato de sódio) e formamida 50% a 55°C, seguido por uma lavagem de alta estringência que consiste em 0,1 X SSC contendo EDTA a 55°C. O versado na técnica reconhecerá como ajustar a temperatura, a força iônica, etc., como necessário para acomodar fatores tais como extensão da sonda e similares.

Será apreciado por aqueles versados na técnica, como resultado

da degeneração do código genético, que existem várias seqüências de nucleotídeos que codificam um polipeptídeo como aqui descrito. Alguns desses polinucleotídeos abrigam homologia mínima com a seqüência de nucleotídeos de qualquer gene nativo. Entretanto, polinucleotídeos que variam devido a diferenças de utilização de códon são especialmente considerados pela presente invenção. Além disso, alelos dos genes que compreendem as se5 quências de polinucleotídeos aqui fornecidas estão dentro do escopo da presente invenção. Alelos são genes endógenos que são alterados como resultado de uma ou mais mutações, tais como deleções, adições e/ou substituições de nucleotídeos. O mRNA e a proteína resultantes podem, mas não necessariamente, ter uma estrutura ou função alteradas. Alelos podem ser 10 identificados usando técnicas padronizadas (tais como hibridização, amplificação e/ou comparação de seqüência de banco de dados).

Os polinucleotídeos dessa invenção podem ser obtidos usando síntese química, métodos recombinantes ou PCR. Métodos de síntese química de polinucleotídeos são bem-conhecidos na técnica e não precisam ser 15 descritos em detalhes aqui. Aquele versado na técnica pode usar as seqüências aqui fornecidas e um sintetizador de DNA comercial para produzir uma seqüência de DNA desejada.

RNA pode ser obtido pelo uso de DNA isolado em um vetor apropriado e inserindo-o em uma célula hospedeira adequada. Quando a célula replica-se e o DNA é transcrito em RNA1 o RNA pode então ser isolado usando métodos bem-conhecidos por aqueles versados na técnica, como descrito em Sambrook e outros, (1989), por exemplo.

Vetores de clonagem adequados podem ser construídos de acordo com técnicas padronizadas ou podem ser selecionados a partir de um grande número de vetores de clonagem disponíveis na técnica.

Vetores de expressão geralmente são construtos de polinucleotídeos replicáveis que contêm um polinucleotídeo de acordo com a invenção. Está implicado que um vetor de expressão deve ser replicável nas células hospedeiras tanto como epissomas quanto como parte integrante do DNA 30 cromossômico. Vetores de expressão adequados incluem mas não são limitados a plasmídeos, vetores virais, incluindo adenovírus, vírus associados a adenovírus, retrovírus, cosmídeos e vetores de expressão descritos na Publicação PCT N0 WO 87/04462.

Os vetores que contêm os polinucleotídeos de interesse podem ser introduzidos na célula hospedeira por qualquer um de vários meios apropriados, incluindo eletroporação, transfecção empregando cloreto de cálcio, 5 cloreto de rubídio, fosfato de cálcio, DEAE-dextrano ou quaisquer outras substâncias; bombardeio com microprojéteis; lipofecção; e infecção (por exemplo, onde o vetor é um agente infeccioso tal como o vírus da varíola).

A invenção também fornece células hospedeiras que compreendem quaisquer polinucleotídeos aqui descritos. Qualquer célula hospedeira 10 capaz de superexpressar DNAs heterólogos podem ser usadas com o propósito de isolar os genes que codificam o anticorpo, polipeptídeo ou proteína de interesse. Exemplos não-limitantes de células hospedeiras de mamíferos incluem mas não são limitadas a células COS, HeLa e CHO. Veja também Publicação PCT N0 WO 87/04462. Células hospedeiras de não-mamíferos 15 incluem procariotos (tais como E. coli ou B. subtillis) e levedura (tais como S. cerevisae, S. pombe\ ou K. lactis). Preferivelmente, as células hospedeiras expressam os cDNAs em um nível de cerca de 5 vezes maior, mais preferivelmente 10 vezes maior, até mais preferivelmente 20 vezes maior do que o anticorpo endógeno correspondente ou proteína de interesse, se presente, 20 em células hospedeiras. O rastreamento de células hospedeiras para uma ligação específica a Αβι.40 é efetuado por um imunoensaio ou FACS. Uma célula que superexpressa o anticorpo ou proteína de interesse pode ser identificada.

Usos diagnósticos de anticorpos derivados de 9TL ou 6G e anticorpos antiAB que têm função efetora deficiente

O anticorpo 9TL ou 6G que se ligam a terminação C de um ou mais peptídeos Αβ podem ser usados para identificar ou detectar a presença ou a ausência do Αβ pretendido no olho. Para simplificar, será feita referencia a anticorpos 9TL ou 6G com a compreensão de que esses métodos apli30 cam-se a quaisquer modalidades de ligação a Αβ (tal como polipeptídeos) aqui descritas. A detecção envolve geralmente contatar uma amostra biológica com um anticorpo aqui descrito, que se ligue a Αβι.4ο· A formação de tal complexo pode ser in vitro ou in vivo. A expressão "detecção" como usada aqui inclui uma detecção qualitativa e/ou quantitativa (níveis mensuráveis) com ou sem referência a um controle.

Qualquer um de uma variedade de métodos conhecidos pode 5 ser usado para a detecção, incluindo, mas não limitado a imunoensaio, usando um anticorpo que se ligue ao polipeptídeo, por exemplo, por ensaio imunossorvente ligado à enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA) e similares; e um ensaio funcional para o polipeptídeo codificado, por exemplo, atividade de ligação ou ensaio enzimático. Em algumas modalidades, o anticor10 po é detectavelmente marcado. Outras modalidades são conhecidas na técnica e descritas aqui.

Anticorpos e polipeptídeos da invenção podem ser usados NE detecção, diagnóstico e monitorização de uma doença, condição ou disfunção oftálmica que tem expressão de Αβ ou βΑΡΡ alterada ou aberrante. As15 sim, em algumas modalidades, a invenção compreende contatar um espécime (amostra) de um indivíduo suspeito de ter expressão de Αβ alterada ou aberrante no olho com um anticorpo ou polipeptídeo da invenção e determinar se o nível do peptídeo Αβ difere daquele de um controle ou espécime de comparação. Em outras modalidades, a invenção fornece métodos compre20 endendo contatar um espécime (amostra) de um indivíduo e determinar o nível de expressão de Αβ.

Para aplicações diagnosticas, o anticorpo pode ser marcado com uma porção detectável incluindo mas não limitado a radioisótopos, marcadores fluorescentes e vários marcadores de substrato de enzima. Métodos 25 de conjugação de marcadores a um anticorpo são conhecidos na técnica. Em outra modalidade da invenção, anticorpos da invenção não precisam ser marcados e sua presença pode ser detectada usando um anticorpo marcado que se ligue aos anticorpos da invenção.

Os anticorpos da presente invenção podem ser empregados em qualquer método de ensaio conhecido, tais como ensaios de ligação competitiva, ensaios sanduíche direto e indireto e ensaios de imunoprecipitação. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc. 1987).

Os anticorpos também podem ser usados para ensaios de diagnóstico in vivo, tais como imagem in vivo. Geralmente, o anticorpo é marcado com um radionucleotídeo (tais como 111In, "Tc, 14C, 131I, 125I, ou 3H) tal 5 que as células ou tecido de interesse possam ser localizados usando imunocintilografia. O anticorpo também pode ser usado como reagente de coloração em patologia, seguindo técnicas bem-conhecidas.

Anticorpos anti-Αβ que têm função efetora deficiente podem ser usados para medir a função da retina para o diagnóstico de um indivíduo em 10 risco ou diagnosticado com uma doença oftálmica degenerativa relacionada a retina e avaliação do progresso de qualquer tratamento e do estágio da doença. Em algumas modalidades, um anticorpo anti-Αβ que tem função efetora deficiente é administrado a um indivíduo e o nível de Αβ no plasma é medido, de acordo com o que um aumento de Αβ no plasma indica a pre15 sença e/ou o nível de dano amiloide cerebral no indivíduo. Esses métodos podem ser usados para monitorizar a eficácia do tratamento e o estágio da doença e para determinar a dosagem e a frequência futuras. Anticorpos que têm função efetora deficiente podem ter um perfil de segurança melhor e fornecer vantagem para esses usos diagnósticos.

Métodos para usar o anticorpo anti- Αβ para propósitos terapêuticos

Os anticorpos (incluindo polipeptídeos), polinucleotídeos e composições farmacêuticas aqui descritos podem ser usados em métodos para tratar, prevenir e inibir o desenvolvimento de uma doença oftálmica caracterizada por degeneração relacionada à retina. Os métodos compreendem 25 administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo que se ligue especificamente a proteína ou ao depósito de proteína ou um polinucleotídeo que codifique o anticorpo, em que o anticorpo tem função efetora deficiente.

Os anticorpos (incluindo os polipeptídeos), polinucleotídeos e composições farmacêuticas aqui descritos podem ser usados em métodos para tratar, prevenir e inibir o desenvolvimento de degeneração macular relacionada à idade e outras doenças oftálmicas tais como degeneração macular relacionada à idade (ambas, atrófica e exsudativa), glaucoma, retinopatia diabética (incluindo edema macular diabético), rupturas na membrana de Bruch, degeneração miópica, tumores oculares e outras doenças degenerativas relacionadas à retina. Tais métodos compreendem administrar os anti5 corpos, polipeptídeos ou polinucleotídeos ou uma composição farmacêutica a um indivíduo. Em aplicações profiláticas, as composições farmacêuticas ou medicamentos são administrados a um paciente suscetível, ou em risco de outra maneira, a doença oftálmica em uma quantidade suficiente para eliminar ou reduzir o risco, diminuir a severidade ou retardar o aparecimento da 10 doença, incluindo sintomas bioquímicos, histológicos e/ou comportamentais da doença, suas complicações e fenótipos patológicos intermediários apresentados durante o desenvolvimento da doença. Em aplicações terapêuticas, composições ou medicamentos são administrados a um paciente suspeito ou que já sofre de tal doença em uma quantidade suficiente para curar 15 ou pelo menos paralisar parcialmente os sintomas da doença (bioquímicos, histológicos e/ou comportamentais), incluindo suas complicações e fenótipos patológicos intermediários apresentados durante o desenvolvimento da doença.

As complicações e fenótipos patológicos intermediários da degeneração macular relacionada a idade incluem depósitos espessos difusos no epitélio pigmentar sub-retiniano (RPE), depósitos ricos em lipídeos similares a drusas, espessamento da membrana de Bruch, regiões desiguais de atrofia de RPE e neovascularização coroidal.

A invenção fornece métodos para retardar o desenvolvimento da degeneração da retina e/ou seus sintomas em um indivíduo, compreendendo administrar uma dosagem eficaz de uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo, um polipeptídeo ou um polinucleotídeo aqui descritos ao indivíduo.

Essa invenção também fornece métodos para recuperar ou proteger a função retiniana em um indivíduo compreendendo administrar uma dosagem eficaz de uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo, um polipeptídeo ou um polinucleotídeo aqui descritos ao indivíduo. Essa invenção também fornece métodos para reduzir as placas amiloides e/ou reduzir ou Ientificar a acumulação de Αβ na retina de um indivíduo, compreendendo administrar uma dosagem eficaz de uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo, um polipeptídeo ou um polinu5 cleotídeo aqui descritos ao indivíduo.

Essa invenção também fornece métodos para remover ou limpar placas amiloides e/ou a acumulação de Αβ na retina de um indivíduo, compreendendo administrar uma dosagem eficaz de uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo, um polipeptídeo ou um polinucleotídeo 10 aqui descritos ao indivíduo. Em algumas modalidades, as placas amiloides estão no cérebro do indivíduo.

Essa invenção também fornece métodos para reduzir o peptídeo Αβ no tecido da retina, inibir e/ou reduzir a acumulação de peptídeo Αβ no tecido da retina, compreendendo administrar uma dosagem eficaz de uma 15 composição farmacêutica que compreende um anticorpo, um polipeptídeo ou um polinucleotídeo aqui descritos ao indivíduo. O polipeptídeo Αβ pode estar na forma solúvel, oligomérica ou de depósito. A forma oligomérica de Αβ pode ser composta por polipeptídeos Αβ 2-50, que pode ser uma mistura de peptídeos 1-40 e 1-42 de extensão completa e/ou qualquer versão truncada 20 desses peptídeos.

A invenção também fornece métodos para melhorar ou reverter a degeneração retiniana em doenças oftálmicas, compreendendo administrar uma dosagem eficaz de uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo, um polipeptídeo ou um polinucleotídeo aqui descritos ao indivíduo.

A invenção também fornece métodos para tratar ou prevenir doenças associadas com a degeneração da retina, compreendendo administrar ao indivíduo uma dosagem eficaz de uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo que se liga especificamente ao peptídeo beta30 amiloide ou a uma forma agregada de um peptídeo beta-amiloide, em que o anticorpo compreende uma região Fc com uma variação na região Fc que ocorre naturalmente, em que a variação resulta em função efetora deficiente, através do que a administração do anticorpo causa menos micro-hemorragia cerebral do que a administração de um anticorpo sem a variação.

Os métodos descritos aqui (incluindo a profilaxia ou terapia) podem ser realizados por uma única injeção direta em uma única vez ou em 5 múltiplas vezes em um único ou em vários locais. A administração também pode ser quase simultânea em múltiplos locais. A frequência da administração pode ser determinada e ajustada durante o curso da terapia e é baseada na obtenção dos resultados desejados. Em alguns casos, as formulações de liberação contínua sustentada de anticorpos (incluindo polipeptídeos), poli10 nucleotídeos e composições farmacêuticas da invenção podem ser apropriadas. Várias formulações e dispositivos para a obtenção de liberação sustentada são conhecidos na técnica.

Pacientes, sujeitos ou indivíduos incluem mamíferos, tais como seres humanos, bovino, eqüinos, caninos, felinos, porcinos e ovinos. O indi15 víduo é preferivelmente um ser humano e pode ou não estar sofrendo da doença ou mostrar sintomas a qualquer momento. Os presentes métodos podem ser administrados profilaticamente a uma população em geral sem a necessidade de qualquer avaliação do risco do paciente. Os presentes métodos são úteis para indivíduos que têm um risco genético conhecido de de20 generação macular relacionada à idade. Tais indivíduos incluem aqueles que têm parentes que experimentaram a doença e aqueles cujo risco é determinado pela análise de marcadores genéticos ou bioquímicos.

A composição farmacêutica que pode ser usada nos métodos acima incluem quaisquer anticorpos, polipeptídeos e/ou polinucleotídeos a25 qui descritos. Em algumas modalidades, o anticorpo é o anticorpo 9TL ou 6G ou suas variantes mostradas nas Tabelas 3 e 8. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo que se liga especificamente a um peptídeo Αβ e que compreende uma região constante que têm função efetora deficiente. Administração e Dosagem 30 O anticorpo é preferivelmente administrado ao mamífero em um

veículo, preferivelmente um veículo farmaceuticamente aceitável. Veículos adequados e suas formulações estão descritos em Remington1S Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro1 ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; and Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000. Tipicamente, uma quantidade apropriada de um sal farmaceuticamente aceitável é usada na formulação para se obter uma for5 mulação isotônica. Exemplos de veículo incluem solução salina, solução de Ringer e solução de dextrose. O pH da solução é preferivelmente entre cerca de 5 a cerca de 8 e mais preferivelmente entre cerca de 7 a cerca de 7.5. Veículos adicionais incluem preparações de liberação sustentada tais como matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contêm o 10 anticorpo, cujas matrizes estão na forma de produtos formatados, por exemplo, películas, Iipossomas ou micropartículas. Ficará evidente para aquelas pessoas versadas na técnica que certos veículos podem ser mais preferíveis dependendo, por exemplo, da via de administração e da concentração do anticorpo a ser administrado.

O anticorpo pode ser administrado ao mamífero por injeção (por

exemplo, sistêmica, intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular, intraportal, intracerebral, intra cérebroventricular e intranasal) ou por outros métodos tais como infusão, que assegura sua liberação na corrente sanguínea de uma forma eficaz. O anticorpo também pode ser administrado por 20 técnicas de perfusão isoladas, tais como perfusão tecidual isolada, para exercer efeitos terapêuticos localizados. Além disso, o anticorpo da presente invenção pode ser administrado topicamente no olho ou na forma de uma injeção, tal como uma injeção intra-vítreo, uma injeção sub-retiniana ou uma injeção bilateral. Informações adicionais sobre a administração dos compos25 tos no olho podem ser encontradas em Tolentino e outros, Retina 24 (2004) 132-138; Reich e outros, Molecular Vision 9 (2003) 210-216.

Dosagens eficazes e esquemas para administração do anticorpo podem ser determinadas empiricamente e a realização de tais determinações está dentro da experiência na técnica. Aqueles versados na técnica 30 compreenderão que a dosagem do anticorpo que deve ser administrado variará na dependência de, por exemplo, o mamífero que receberá o anticorpo, a via de administração, o tipo de anticorpo particular usado e outros fármacos a serem administrados ao mamífero. Regras para a seleção de doses apropriadas de anticorpo são encontradas na literatura sobre o uso terapêutico de anticorpos, por exemplo, Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone e outros, eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., 1985, ch. 22 and pp.

5 303-357; Smith e outros, Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber e outros, eds., Raven Press, New York, 1977, pp. 365-389. Uma dose diária típica usada sozinha pode variar entre cerca de 1 pg/kg até 100 mg/kg de peso corporal ou mais por dia, dependendo de fatores mencionados acima. Geralmente, qualquer uma das seguintes doses podem ser usada: uma 10 dose de pelo menos cerca de 50 mg/kg de peso corporal; pelo menos cerca de 10 mg/kg de peso corporal; pelo menos cerca de 3 mg/kg de peso corporal; pelo menos cerca de 1 mg/kg de peso corporal; pelo menos cerca de 750 pg/kg de peso corporal; pelo menos cerca de 500 pg/kg de peso corporal; pelo menos cerca de 250 ug/kg de peso corporal; pelo menos cerca de 15 100 pg /kg de peso corporal; pelo menos cerca de 50 pg /kg de peso corporal; pelo menos cerca de 10 ug /kg de peso corporal; pelo menos cerca de 1 pg/kg de peso corporal é administrada. Os anticorpos podem ser administrados em doses mais baixa ou menos freqüentes no início do tratamento para evitar efeitos colaterais potenciais, tais como angiopatia amiloide cerebral 20 temporária (CAA).

Em algumas modalidades, mais do que um anticorpo pode estar presente. Tais composições podem conter pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco anticorpos diferentes (incluindo polipeptídeos) da invenção.

O anticorpo também pode ser administrado a um mamífero em

combinação com quantidades eficazes de um ou mais outros agentes terapêuticos. O anticorpo pode ser administrado sequêncialmente ou concomitantemente com um ou mais outros agentes terapêuticos. As quantidades de anticorpo e agente terapêutico dependem, por exemplo, de que tipo de fár30 macos são usados, da condição patológica a ser tratada e da esquematização e das vias de administração, mas geralmente são menores do que se cada um fosse usado individualmente. Após a administração do anticorpo ao mamífero, a condição fisiológica do mamífero pode ser monitorizada de várias maneiras bemconhecidas do médico experiente.

Os princípios de administração e dosagem acima podem ser a5 daptados para os polipeptídeos aqui descritos.

Um polinucleotídeo que codifique um anticorpo ou polipeptídeo aqui descritos também pode ser usado para liberação e expressão do anticorpo ou do polipeptídeo em uma célula desejada. O vetor de expressão pode ser administrado sistemicamente, intraperitonealmente, intravenosa10 mente, intramuscularmente, subcutaneamente, intratecalmente, intraventricularmente, oralmente, enteralmente, parenteralmente, intranasalmente, dermicamente ou por inalação. Por exemplo, a administração de vetores de expressão inclui administração local ou sistêmica, incluindo injeção, administração oral, administração por "disparo de partículas" ou cateter e adminis15 tração tópica. Aquele versado na técnica está familiarizado com a administração de vetores de expressão para se obter a expressão de uma proteína exógena in vivo. Veja, por exemplo, Patentes U.S N0 6.436.908; 6.413.942 e 6.376.471.

A liberação direcionada de composições terapêuticas que compreendem um polinucleotídeo que codifica um anticorpo da invenção também pode ser usada. As técnicas de liberação de DNA mediadas por receptor estão descritas, por exemplo, em Findeis e outros, Trends Biotechnol. (1993) 11:202; Chiou e outros, Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer (J.A. Wolff, ed.) (1994); Wu e outros, J. Bioi. Chem. (1988) 263:621; Wu e outros, J. Biol. Chem. (1994) 269:542; Zenke e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) (1990) 87:3655; Wu e outros, J. BioL Chem. (1991) 266:338. As composições terapêuticas que contêm um polinucleotídeo são administradas na faixa de cerca de 100 ng a cerca de 200 mg de DNA por administração local em um protocolo de terapia com gene. Faixas de concentração de cerca de 500 ng a cerca de 50 mg, de cerca de 1 □g a cerca de 2 mg, de cerca de 5 Gg a cerca de 500 Dg e de cerca de 20 □g a cerca de 100 Gg de DNA também podem ser usadas durante um protocolo de terapia com gene. Os polinucleotídeos e polipeptídeos da presente invenção podem ser liberados usando veículos de liberação de gene. O veículo de liberação de gene pode ser de origem viral ou não-viral (veja, de modo geral, Jollyj Cancer Gene Therapy (1994) 1:51; Kimura, Human Gene 5 Therapy (1994) 5:845; Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1:185; e Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6:148). A expressão de seqüências codificadoras pode ser induzida usando promotores endógenos de mamífero ou promotores heterólogos. A expressão da seqüência codificadora pode ser tanto constitutiva quanto regulada.

Vetores baseados em vírus para a liberação de um polinucleotí

deo desejado e expressão em uma célula desejada são bem-conhecidos na técnica. Veículos baseados em vetores virais incluem, mas não são limitados a retrovírus recombinantes (veja, por exemplo, Publicação PCT N0 WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 15 93/10218; WO 91/02805; Patentes U.S. Nos. 5. 219.740; 4.777.127; Patente GB No. 2.200.651; e EP 0 345 242),vetores baseados em alfavírus (por exemplo, vetores de vírus Sindbis, vírus Semliki Forest (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), vírus de Ross River (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) e vírus da encefalite equina venezuelana (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 20 1249; ATCC VR-532)), e vetores de vírus associados ao adenovírus (AAV) (veja, por exemplo, Publicação PCT Publication Nos. WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 e WO 95/00655). A administração de DNA ligado a adenovírus mortos como descrita por Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147 também pode ser usada.

Veículos e métodos de liberação não-virais também podem ser

empregados incluindo, mas não limitados a DNA condensado policatiônico ligado ou não-ligado a adenovírus mortos isolados (veja, por exemplo, Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147); DNA ligado a ligante(veja, por exemplo, Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264:16985); células veiculadoras da liberação de 30 célula eucariótica (veja, por exemplo, Patente U.S. No. 5.814.482; Publicação PCT Nos. WO 95/07994; WO 96/17072; WO 95/30763; e WO 97/42338)e neutralização de caraa nucléica ou fusão com membranas celulares. DNA nu também pode ser empregado. Métodos de introdução de DNA nu exemplares estão descritos nas Publicação PCT N0 W090/11092 e Patente U.S. N0 5.580.859. Lipossomas que podem atuar como veículos de liberação de gene estão descritos em Patente U.S. N0 5.422.120; Publicação 5 PCT N0 WO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; e EP O 524 968. Abordagens adicionais estão descritas em Philip, MoL Cell BioL (1994) 14:2411, e em Woffendin, Proc. NatL Acad. Sei. (1994) 91:1581.

Kits

A invenção também fornece produtos fabricados e kits contendo materiais úteis para tratar as doenças oftálmicas aqui descritas, tais como a degeneração macular relacionada à idade (ambas, atrófica e exsudativa), glaucoma, retinopatia diabética (incluindo edema macular diabético), rupturas da membrana de Bruch, degeneração miópica, tumores oculares e outras doenças degenerativas retinianas relacionadas. O produto fabricado compreende um recipiente com uma bula. Recipientes adequados incluem, por exemplo, vidros, frascos e tubos de ensaio. Os recipientes podem ser feitos a partir de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. O recipiente acondiciona uma composição que tem um agente ativo que é eficaz para o tratamento de condições patológicas oftálmicas ou para detectar ou purificas Αβ ou βΑΡΡ. O agente ativo na composição é um anticorpo e preferivelmente, compreende anticorpos monoclonais específicos para Αβ ou βΑΡΡ. Em algumas modalidades, o agente ativo compreende o anticorpo 9TL ou 6G e anticorpos e polipeptídeos deles derivados. Em algumas modalidades, o agente ativo compreende um anticorpo anti-Αβ ou um polipeptídeo que tem função efetora deficiente. Em algumas modalidades, o anticorpo ou polipeptídeo anti-Αβ compreende uma região constante de cadeia pesada, em que a região constante tem função efetora deficiente. A bula do recipiente indica que a composição é usada para tratar condições patológicas oftálmicas tais como AMD e também pode indicar diretrizes para uso tanto in vivo quanto in vitro, tais como aquelas aqui descritas.

A invenção também fornece kits compreendendo qualquer um dos anticorpos (tais como 9TL ou 6G), polipeptídeos, polinucleotídeos aqui descritos. Em algumas modalidades, o kit da invenção compreende um recipiente descrito acima. Em outras modalidades, kit da invenção compreende um recipiente descrito acima e um segundo recipiente compreendendo um tampão. Ele também pode incluir outros materiais desejáveis do ponto de 5 vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e bulas com instruções para a realização de quaisquer métodos aqui descritos (tais como métodos para tratar AMD e métodos para inibir ou reduzir a acumulação de peptídeo Αβ no cérebro). Em kits a serem usados para detectar ou purificar Αβ ou βΑΡΡ, o anticorpo está tipicamente 10 marcado com um marcador detectável, tal como, por exemplo, um radioisótopo, um composto fluorescente, um composto bioluminescente, um composto quimioluminescente um quelante de metal ou enzima.

Em algumas modalidades, a invenção fornece composições (aqui descritas) para uso em quaisquer dos métodos aqui descritos, seja no contexto do uso como um medicamento e/ou no uso para a fabricação de um medicamento.

Os exemplos a seguir são fornecidos para ilustrar, mas não limitar, a invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Determinação da afinidade de ligação de anticorpo 9TL e suas variantes

A. Métodos Gerais

Os seguintes métodos gerais foram usados nesse exemplo.

Vetor de expressão usado na caracterização do clone A expressão do fragmento Fab dos anticorpos estava sob o con

trole de um promotor IacZ induzível por ITPG similar àquele descrito em Barbas (2001) Phage display: a Iaboratory manual, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press pg 2.10. Vector pComb3X), entretanto, as modificações incluíram a adição e a expressão dos seguintes domínios 30 adicionais: domínio constante da cadeia leve Kappa humana e o domínio constante CH1 de imunoglobulina lgG2 humana, região C da cadeia 2-gama de Ig, número de acesso de proteína P01859; cadeia leve kappa de imunoglobulina (Homo sapiens), número de acesso de proteína CAA09181. Preparação de Fab em pequena escala

A expressão em pequena escala de Fabs em placas de 96 poços foi realizada como se segue. Começando a partir de E. coli transformada 5 com uma biblioteca de Fab1 as colônias foram removidas para inocular uma placa de controle (agar LB + Ampicilina (50 pg/ml) + Glicose 2%) e uma placa de trabalho (2 ml/poço, placa de 96 poços contendo 1,5 ml de LB + Ampicilina (50 pg/ml) + Glicose 2%). Ambas as placas foram incubadas a 30°C pó 8 a 12 horas. A placa de controle foi armazenada a 4°C e as células da placa 10 de trabalho foram peletizadas a 5000 rpm e ressuspensas com 1 ml de LB + Ampicilina (50 pg/ml) + ITPG 1 mM para induzir a expressão de Fabs. As células foram coletadas por centrifugação após 5 h de tempo de expressão a 30°C, então ressuspensa em 500 μΙ de Tampão HBS-P (tampão HEPES 10 mM pH 7.4, NaCI 150 mM, P20 0,005%). A Iise das células ressuspensas 15 em HBS-P foi realizada por um ciclo de congelamento (-80°C) e então descongelamento a 37°C. Os Iisados celulares foram centrifugados a 5000 rpm por 30 min para separar os restos celulares dos sobrenadantes contendo Fabs. Os sobrenadantes foram então injetados em um equipamento de ressonância de plasma de superfície BIAcore para se obter a informação sobre 20 a afinidade para cada Fab. Os clones que expressavam Fabs foram resgatados da placa de controle para sequênciar o DNA e para a produção de Fab em grande escala e caracterização detalhada como descrito abaixo. Preparação de Fab em grande escala

Para se obter parâmetros cinéticos detalhados, Fabs foram ex25 pressos e purificados a partir de grandes culturas. Frascos de Erlenmeyer contendo 200 ml de LB + Ampicilina (50 pg/ml) + Glicose 2% foram inoculados com 5 ml de uma cultura feita durante a noite de um clone de E coli que expressa Fab selecionado. Os clones foram incubados até que uma OD5Sonm fosse atingida e então induzidos pela substituição dos meios por 200 ml de 30 LB + Ampicilina (50 pg/ml) + ITPG 1 mM. Após 5 h de tempo de expressão a 30]C, as células foram peletizadas por centrifugação, então ressuspensas em 10 ml de PBS (pH 8). A Iise das células foi obtida com dois ciclos de congelamento/descongelamento (-80°C e 37°C, respectivamente). O sobrenadante dos Iisados celulares foram carregados sobre colunas de superfluxo Ni-NTA sefarose (Qiagen, Valencia, CA) equilibradas com PBS1 pH 8, então lavadas com 5 volumes de coluna de PBS1 pH 8. Os Fabs individuais foram 5 eluídos em diferentes frações com PBS (pH 8) + imidazol 300 mM. As frações contendo Fabs foram agrupadas e dialisadas em PBS1 e então quantificadas por ELISA antes da caracterização da afinidade.

Preparação de anticorpo completo

Para a expressão de anticorpos completos, as regiões variáveis das cadeias leve e pesada foram clonadas em vetores de expressão de mamíferos. Os anticorpos foram purificados usando métodos padronizados com proteína A. O vetor pDb.9TL.hFc2a é um vetor de expressão que compreende a cadeia pesada do anticorpo 9TL e é adequado para a expressão transitória ou estável da cadeia pesada. O vetor pDb.9TL.hFc2a tem as sequências de nucleotídeos que correspondem as seguintes regiões: a região promotora de citomegalovírus humano (nucleotídeos 1-612); um íntron sintético (nucleotídeos 619-1507); a região codificadora de DHFR (nucleotídeos 707-1267); peptídeo de sinal do hormônio do crescimento humano (nucleotídeos 1525-1602); região variável de cadeia pesada de 9TL (nucleotídeos 1603-1951); região constante da cadeia pesada de lgG2 humana contendo as seguintes mutações: A330P331 to S330S331 (numeração de aminoácidos referente a seqüência de lgG2a de tipo selvagem; veja Eur. J. Immunol.

(1999) 29:2613-2624); sinal de poliadenilação tardia de SV40 (nucleotídeos 2960-3203); região intensificadora de SV40 (nucleotídeos 3204-3449); regi25 ão f1 de fago (nucleotídeos 3537-4992) e região codificadora de betaIactamase (AmpR) (nucleotídeos 4429-5286). Vetor pDb.9TL.hFc2a foi depositado na ATCC em 20 de Julho de 2004, e foi designado como ATCC No de Acesso PTA-6124.

O vetor pEb.9TL.hK é um vetor de expressão que compreende a cadeia leve do anticorpo 9TL e é adequado para a expressão transitória da cadeia leve. O vetor pEb.9TL.hK tem as seqüências de nucleotídeos que correspondem as seguintes regiões: a região promotora de citomegalovírus humano (nucleotídeos 1-612); um íntron EF-1 humano (nucleotídeos 619- 1142); peptídeo de sinal do hormônio do crescimento humano (nucleotídeos 1173-1150); região variável de cadeia pesada de 9TL (nucleotídeos 1251 1593); região constante da cadeia kappa humana (nucleotídeos 1594-1914);

5 sinal de poliadenilação tardia de SV40 (nucleotídeos 1932-2175); região intensificadora de SV40 (nucleotídeos 2176-2421); região f1 de fago (nucleotídeos 2509-2964) e região codificadora de beta Iactamase (AmpR) (nucleotídeos 3401-4258). O vetor pEb.9TL.hK foi depositado na ATCC em 20 de Julho de 2004, e foi designado como ATCC No de Acesso PTA-6125.

Ensaio Biacore

As afinidades do anticorpo monoclonal 9TL foram determinadas usando o sistema de ressonância de plasma de superfície (SPR) BIAcore3000™ (BIAcore, INC, Piscataway NJ). Uma maneira para determinar a afinidade foi pela imobilização de 9TL sobre um chip CM5 e medindo as ci15 néticas de ligação do peptídeo Αβ-|.40 ao anticorpo. Os chips CM5 foram ativados com cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodi-imida (EDC) e N-hidroxisuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. O anticorpo 9TL ou suas variantes foram diluídos em acetato de sódio 10 mM pH 4,0 ou 5,0 e injetados sobre o chip ativado em uma concentração de 20 0,005 mg/ml. Usando tempos de fluxo variáveis através de canais de .chip individuais, uma faixa de densidade de anticorpo foi obtida: 1000-2000 ou 2000-3000 unidades de resposta (RU). O chip foi bloqueado com etanolamina. Estudos de regeneração mostraram que uma solução contendo 2 volumes de tampão de eluição de Pierce e 1 volume de NaCI 4 M removia efi25 cazmente o peptídeo Αβι-4ο ligado enquanto mantinha a atividade de 9TL sobre o chip por mais de 200 injeções. O tampão HES-EP (tampão HEPES 0,01 mM pH 7.4, NaCI 0,15 M, Tensoativo P20 0,005%) foi usado como tampão de corrida para todos os ensaios BIAcore. Diluições seriadas (0,1 a 10 x a Kd estimada) de amostras de peptídeo Αβ-|.40 sintético ligado foram 30 injetadas por 1 min a 100 μΙ/min e tempos de dissociação de 10 minutos foram permitidos. As taxas de associação (kon) e as taxas de dissociação (k0ff) cinéticas foram obtidas simultaneamente pelo ajuste dos dados para um modelo de ligação de 1:1 de Langmuir (Karlsson, R. Roos1 H. Fagerstam1 L. Petersson1 B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110) usando o program BIAevaluation. Os valores da constante de equilíbrio de dissociação (Kd) foram calculados como Wkon5 Alternativamente, a afinidade foi determinada pela imobilização

do peptídeo Αβι_4ο sobre um chip SA e medindo as cinéticas de ligação de Fab de 9TL e seus fragmentos Fab variantes sobre o peptídeo Αβ-Mo imobilizado. As afinidades do fragmento Fab de 9TL e seus fragmentos Fab variantes foram determinadas pelo sistema de Ressonância de Plasma de Superfí10 cie (SPR) (BIAcore3000D, BIAcore, Inc1 Piscaway NJ). Os chips SA (estreptavidina) foram usados de acordo com as instruções do fornecedor. O peptídeo Αβ1.40 biotinilado foi diluído em HES-EP (HEPES 10 mM pH 7.4, NaCI 150 mM, EDTA 3 mM, P20 0,005%) e injetado sobre o chip em uma concentração de 0,005 mg/ml. Usando tempos de fluxo variáveis através dos canais 15 individuais do chip, duas faixas de densidade de antígeno forma obtidas: 10- 200 unidades de resposta (RU) para estudos cinéticos detalhados e 500-600 RU para estudos de concentração e rastreamento. Estudos de regeneração mostraram que ácido fosfórico 100 mM (também pode ser seguido por uma solução contendo 2 volumes de NaOH 50 mM e 1 volume de etanol 70%) 20 removia eficazmente Fab ligado enquanto mantinha a atividade do peptídeo Αβ sobre o chip por mais de 200 injeções. O tampão HES-EP foi usado como tampão de corrida para todos os ensaios BIAcore. Diluições seriadas (0,1 a 10 x a Kd estimada) de amostras de Fab purificado foram injetadas por 2 min a 100 μΙ/min e tempos de dissociação de 10 minutos foram permi25 tidos. As concentrações de proteínas de Fab foram determinadas por ELISA e/ou eletroforese em SDS-PAGE usando um Fab de modelo de concentração conhecida (determinada pela análise de aminoácidos). As taxas de associação (kon) e as taxas de dissociação (k0ff) cinéticas foram obtidas simultaneamente pelo ajuste dos dados para um modelo de ligação de 1:1 de 30 Langmuir (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110) usando o programa BIAevaluation. Os valores da constante de equilíbrio de dissociação (K0) foram calculados como koff/kon

B. Afinidade de ligação de anticorpo 9TL e suas variantes por Αβι.4η

As seqüências de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo 9TL estão mostradas na Figura 1. A afinidade de ligação do anticorpo 9TL por Αβι-40 determinada usando ambos os métodos BIAcore descritos acima está mostrada na Tabela 2 abaixo.

Tabela 2. Afinidade de ligação do anticorpo 9TL e do fragmento Fab

kon (1/Ms) Koff (1/s) KD(nM) mAb 9TL sobre chip CM5, 4,25 x 105 3,89x10'4 0,9 Αβ^ο fluindo sobre ele Αβι-40 sobre chip SA Fab de 3,18 x 105 3,59 x 10'4 1,13 9TL fluindo sobre ele A seqüência de aminoácidos das variantes de 9TL são mostra

das na Tabela 3 abaixo. Todas as substituições de aminoácidos das varian10 tes mostradas na Tabela 3 estão descritas em relação a seqüência de 9TL. A afinidade de ligação do fragmento Fab das variantes de 9TL também são mostradas na Tabela 3. K0 e outros parâmetros cinéticos foram determinados pela análise BIAcore descrita acima com Αβι-4ο imobilizado sobre chip SA. I Tabela 3. Seqüências de aminoácidos e dados cinéticos para variantes de anticorpo 9TL

Clone HH1 HH2 H3 LL1 LL2 L3 kon koff Kd ((1) (Ms'1) (s1) (nM) (2) (3) 9TL 3,18x105 3,59x10'4 1,13 22-T/l L102I 3,18x105 4,60x10’4 1,45 C6 new L102T 3,56x105 9,20x10‘4 2,58 W1 Y31A, L102T 3,18x105 9,00x10‘3 28,30 A34S W8 Y31H, L102T 3,18x105 3,80x10’3 11,95 A34S, K35A W5 Y31H, L102T 3,18x105 4,00x10‘3 12,58 K35A M1 L94M 3,18x105 8,60x10'4 2,70 M2 L94N 3,18x105 1,10x10'3 3,46 M3 L94C 3,18x105 1,30x1 O*3 4,09 M4 L94F 3,18x105 9,95x10’4 3,13 M5 L94V 3,18x105 1,65x10‘3 5,19 M6 L94K 3,18x105 4,10x10‘3 12,89 M7 L94S 3,18x105 6,00x10‘3 18,87 Continuação Clone HH1 HH2 H3 LL1 LL2 L3 kon koff KD ((1) (Ms-1) (s-1) (nM) (2) (3) M8 L94Q 3,18x105 6,80x10'3 21,38 M9 L94G 3,18x105 7,80x10'3 24,53 M10 L94S 3,18x105 8,30x103 26,10 M11 G96S 3,18x105 2,00x10'3 6,29 M12 G96T 3,18x105 3,30x10'3 10,38 M13 T97S 3,18x105 3,90x10’4 1,23 M14 H98L 3,18x105 1,60x10‘3 5,03 M15 Y99P 3,18x105 6,70x10'4 2,11 M16 Y99A 3,18x105 7,00x10'4 2,20 M17 Y99W 3,18x105 1,00x10'3 3,14 M18 Y99Q 3,18x105 1,50x10'3 4,72 M19 Y99M 3,18x105 1,70x103 5,35 M20 Y99S 3,18x105 2,00x10'3 6,29 M21 Y99E 3,18x105 5,00x10'3 15,72 M22 V101L 3,18x105 4,00x10'3 12,58 M23 V101K 3,18x105 5,00x10’3 15,72 M24 V101H 3,18x105 6,00x10’3 18,87 Continuação Clone HH1 HH2 H3 LL1 LL2 L3 kon koff KD ((1) (Ms-1) (S-1) (nM) (2) (3) M25 V101T 3,18x105 8,00x10'3 25,16 M26 V101A 3,18x105 9,00x10'3 28,30 M27 V101E 3,18x105 1,20x10'2 37,74 M28 V101M 3,18x105 1,40x10'2 44,03 M29 L102S 3,18x105 7,60x10'4 2,39 M30 L102V 3,18x105 6,80x10'4 2,14 M31 L99V 3,18x105 1,00x10'2 31,45 M32 L99I 3,18x105 2,00x10'2 62,89 M33 Y100W 3,18x105 6,30x10'4 1,98 M34 S101T 3,18x105 8,00x10‘4 2,52 M35 S101G 3,18x105 9,00x10'3 28,30 M36 L102R 3,18x105 9,00x10'4 2,83 M37 L102 A 3,18x105 9,20x10‘4 2,89 M38 L102 V 3,18x105 1,50x10'3 4,72 M39 L102S 3,18x105 2,30x10'3 7,23 M40 L102T 3,18x105 4,50x10'3 14,15 M41 L102Q 3,18x105 1,00x10'2 31,45 Continuação Clone HH1 HH2 H3 LL1 LL2 L3 kon koff KD ((1) (Ms-1) (s-1) (nM) (2) (3) M42 L102E 3,18x105 1,50x10'2 47,17 M43 V104I 3,18x105 3,00x10'4 0,94 M44 V104T 3,18x105 3,00x10'3 9,43 M45 V104P 3,18x105 1,50x10'2 47,17 M46 V104C 3,18x105 2,00x1 O*2 62,89 M47 V104Q 3,18x105 2,00x102 62,89 M48 V104S 3,18x105 2,60x10'2 81,76 M49 V104N 3,18x105 2,60x10'2 81,76 M50 V104F 3,18x105 2,70x10'2 84,91 M51 Y105H 3,18x105 8,60x104 2,70 M52 Y105F 3,18x105 1,30x10'3 4,09 M53 Y105W 3,18x105 1,30x10’3 4,09 M54 Y105S 3,18x105 2,40x103 7,55 M55 Y105I 3,18x105 3,00x103 9,43 M56 Y105V 3,18x105 3,50x10'3 11,01 M57 Y105A 3,18x105 3,90x10’3 12,26 1 = Todas CDRs são CDRs estendidas incluindo ambas as CDRs de Kabat e Chothia. Os resíduos de aminoácidos são numerados sequêncialmente.

2 = kon sublinhadas foram determinadas experimentalmente. Outras foram estimadas serem as mesmas de 9TL.

5 3 = Valores de Kd foram calculados como Kd = IWkon

Exemplo 2: Caracterização de epitopo sobre o peptídeo ABi.4nque se liga ao anticorpo 9TL

Para determinar o epitopo sobre o polipeptídeo Αβ que é reconhecido pelo anticorpo 9TL, a análise de ligação por Ressonância de Plasma de Superfície (SPR, Biacore 3000) foi usada. O polipeptídeo Αβι-40 acoplado a biotina (Global Peptide Services, CO) foi imobilizado sobre um chip coberto com estreptavidina (chip SA). A ligação de fragmentos Fab de anticorpos Αβ (a 50 mM) a Αβι^0 imobilizado na ausência e na presença de fragmentos solúveis diferentes do peptídeo Αβ (a 10 μΜ, da American Peptide Company Inc., CA). As seqüências de aminoácidos de Αβι-40, Αβι-42 e Αβι-43 são mostradas abaixo na Tabela 4. Os peptídeos Αβ que deslocam a ligação do fragmento Fab do anticorpo 9TL a Αβι.40 foram Αβ28-4ο> Αβι-4ο, Αβ33.40 e Αβΐ7- 40, respectivamente (Figura 2). Assim, o anticorpo 9TL liga-se a um peptídeo C-terminal (33-40) de Αβι^ο· Como mostrado na Figura 2, os peptídeos Αβ-ι. 28, Αβ28-42, Αβ22-35, Αβ^β, Αβ^ e Αβι-38 não inibem a ligação do fragmento Fab do anticorpo 9TL, sugerindo que o anticorpo 9TL liga-se a terminação C do peptídeo Αβ-ι-40.

Além disso, os peptídeos Αβ28.42 e Αβ-|.43 não inibem a ligação do anticorpo 9TL a Αβι.40, embora eles possam inibir rapidamente a ligação de 25 Αβ-Mo ao anticorpo de controle (anticorpo 2289, esse anticorpo está descrito em U.S. Appl. Pub. No. 2004/0146512 e W004/032868). Esses resultados mostram que 0 anticorpo 9TL liga-se preferencialmente a Αβ -mo, mas não a Αβ 1-42 β Αβ 1-43. Tabela 4. Seqüências de aminoácidos de peptídeos beta-amiloides

1 -40(WT) DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL MVGGW (SEQ ID NO:15) 1-42 (WT) DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL MVGGWIA (SEQ ID NO:16) 1-43 (WT) DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL MVGGWIAT (SEQ ID ΝΟ.Ί7) Exemplo 3. Geração de anticorpo monoclonal 2H6 e de 2H6 deqlicosilado

A. Geração e caracterização de anticorpo monoclonal 2H6

Camundongos foram imunizados com 25-100 pg de um peptídeo (aminoácidos 28-40 de Αβ-Μο) conjugado com KLH em um adjuvante (50 pl por pata, total de 100 μΙ por camundongo) em cerca de 16 intervalos semanais consecutivos como descrito por Geerligs HJ e outros, 1989, J. Immunol. Methods 124:95-102; Kenney JS e outros, 1989, J. Immunol. Methods 121:157-166; e Wicher K e outros, 1989, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 89:128-135. Os camundongos foram imunizados primeiro com 50 pg do peptídeo em CFA (adjuvante completo de Freund). Vinte e três dias mais tarde após a segunda imunização, a terceira imunização foi realizada com 25 pg do peptídeo em IFA. Dez dias mais tarde, os títulos de anticorpo foram testados usando ELISA. A quarta imunização foi realizada com 25 pg do peptídeo em IFA 34 dias após a terceira imunização. A inoculação final foi realizada com 100 pg do peptídeo solúvel após a quarta imunização.

Esplenócitos foram obtidos dos camundongos imunizados e fundidos com células NOS de mieloma em uma proporção de 10:1, com polietiIeno glicol 1500. Os híbridos foram plaqueados em placas de 96 poços em 20 DMEM contendo soro de cavalo 20% e 2-oxaloacetato/piruvato/insulina (Sigma) e a seleção com hipoxantina/aminopterina/timidina foi iniciada. No dia 8, 100 μΙ de DMEM contendo soro de cavalo 20% foram adicionados a todos os poços. Os sobrenadantes dos híbridos foram rastreados usando um imunoensaio de captura de anticorpo. A determinação da classe do anticor25 po foi feita com um segundo anticorpo específico para classe. Um painel de linhagens celulares que produzem anticorpos monoclonais foi selecionado para caractenzaçao. Uma Iinnagem celular selecionada produz o anticorpo designado 2H6. Esse anticorpo foi determinado ter a cadeia pesada de lgG2.

A afinidade do anticorpo 2H6 por Αβ·Μ0 foi determinada. O anticorpo monoclonal 2H6 foi purificado dos sobrenadantes de culturas de hibridoma usando a cromatografia de afinidade com proteína A. Os sobrenadan5 tes foram equilibrados para pH 8. Os sobrenadantes foram então carregados na coluna de proteína A MabSeIect (Amersham Biosciences # 17-5199-02) equilibrada com PBS para pH 8. A coluna foi lavada com 5 volumes de coluna de PBS, pH 8. O anticorpo foi eluído com tampão citrato-fosfato a 50 mM, pH 3. O anticorpo eluído foi neutralizado com Tampão Fosfato a 1 M, pH 8. 10 O anticorpo purificado foi dialisado com PBS. A concentração de anticorpo foi determinada por SDS-PAGE, usando uma curva padronizada de mAb de murino.

Fabs de 2H6 foram preparados por proteólise com papaína do anticorpo 2H6 completo usando o kit Immunopure Fab (Pierce # 44885) e purificados por fluxo através de cromatografia com proteína A seguindo as instruções do fabricante. A concentração foi determinada por SDS-PAGE e A280 usando 1 OD=O,6 mg/ml.

As afinidades do anticorpo monoclonal 2H6 foram determinadas usando o sistema de ressonância de plasma de superfície (SPR) BIAcore3000™ (BIAcore, INC., Piscaway, NJ). Um meio de determinar a afinidade foi imobilizando o anticorpo 2H6 sobre um chip CM5 e medindo a cinética de ligação do peptídeo Ap^40 ao anticorpo. Os chips CM5 foram ativados com cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodi-imida (EDC) e Nhidroxisuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. O anticorpo monoclonal 2H6 foi diluído em acetato de sódio a 10 mM pH 4.0 ou 5.0 e injetado sobre o chip em uma concentração de 0,005 mg/ml. Usando tempos de fluxo variáveis através de canais de chip individuais, uma faixa de densidade de anticorpo foi obtida: 1000-2000 ou 2000-3000 unidades de resposta (RU). O chip foi bloqueado com etanolamina. Estudos de regeneração mostraram que uma solução contendo 2 volumes de tampão de eluição de Pierce (Product No. 21004, Pierce Biotechnology, Rockford, IL) e NaCI 4 M (2:1) removia eficazmente o peptídeo A8i-4o ligado enquanto mantinha a atividade do anticorpo 2H6 sobre o chip por mais de 200 injeções. O tampão HBS-EP (HEPES a 0,01 mM pH 7.4, NaCI a 0,15 M, EDTA a 3 mM, Tensoativo P20 a 0,005%) foi usado como tampão de corrida para todos os ensaios BIAcore. Diluições seriadas (0,1 a 10 x a Kd estimada) de amostras de pep5 tídeo Αβι-4ο sintético purificado foram injetadas por 1 min a 100 μΙ/min e tempos de dissociação de 10 minutos foram permitidos. As taxas de associação (kon) e as taxas de dissociação (k0ff) cinéticas foram obtidas simultaneamente pelo ajuste dos dados para um modelo de ligação de 1:1 de Langmuir (KarIsson, R. Roos1 H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 10 6. 99-110) usando o program BIAevaluation. Os valores da constante de equilíbrio de dissociação (Kd) foram calculados como kotf/kon·

Alternativamente, a afinidade foi determinada pela imobilização do peptídeo Αβ-Μο sobre um chip SA e medindo as cinéticas de ligação de Fab de 2H6 com o peptídeo Ap^40 imobilizado. As afinidades do fragmento 15 Fab de 2H6 foram determinadas pelo sistema de Ressonância de Plasma de Superfície (SPR) (BIAcore3000™,BIAcore, Inc, Piscaway NJ). Os chips SA (estreptavidina) foram usados de acordo com as instruções do fornecedor. O peptídeo Αβι-40 biotinilado (SEQ ID N0 15) foi diluído em HBS-EP (HEPES a 10 mM pH 7.4, NaCI a 150 mM, EDTA a 3 mM, P20 a 0,005%) e injetado 20 sobre o chip em uma concentração de 0,005 mg/ml. Usando tempos de fluxo variáveis através dos canais individuais do chip, duas faixas de densidade de antígeno forma obtidas: 10-200 unidades de resposta (RU) para estudos cinéticos detalhados e 500-600 RU para estudos de concentração. Estudos de regeneração mostraram que uma mistura de tampão de eluição de Pierce 25 e NaCI a 4 M (2:1) removia eficazmente Fab ligado enquanto mantinha a atividade do peptídeo Αβ sobre o chip por mais de 200 injeções. O tampão HES-EP foi usado como tampão de corrida para todos os ensaios BIAcore. Diluições seriadas (0,1 a 10 x a K0 estimada) de amostras de Fab purificado foram injetadas por 2 min a 100 μΙ/min e tempos de dissociação de 10 minu30 tos foram permitidos. As concentrações de proteínas de Fab foram determinadas por ELISA e/ou eletroforese em SDS-PAGE usando um Fab de modelo de concentração conhecida (determinada pela análise de aminoácidos). As taxas de associação (Icon) e as taxas de dissociação (k0ff) cinéticas foram obtidas simultaneamente pelo ajuste dos dados para um modelo de ligação de 1:1 de Langmuir (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110) usando o programa BIAevaluation.

5 Os valores da constante de equilíbrio de dissociação (Kd) foram calculados como koff/kon. A afinidade do anticorpo 2H6 determinada usando ambos os métodos descritos acima é mostrada na Tabela 5 abaixo.

A afinidade pelo anticorpo 2286 de murino, que se liga a um peptídeo de aminoácidos 28-40 de Αβι-40 foi testada como descrito acima. O anticorpo 2286 está descrito na U.S. Appl. Ser. No. 10/683,815 e PCT/US03/32080.

Tabela 5. Afinidade de ligação do anticorpo 2H6 e 2286

kon (1/Ms) Koff (1/s) Kd (nM) mAb 2H6 sobre chip CM5, Ap^40 4,67 x 105 3,9 x 10'3 9 fluindo sobre ele Αβι-40 sobre chip SA, Fab de 6,3 x 105 3,0 x 10’3 4,7 2H6 fluindo sobre ele mAb 2286 sobre chip CM5 Αβι- 1,56 x 105 0,0419 269 40 fluindo sobre ele Αβι-40 sobre chip SA, Fab de 1,8 x105 0,044 245 2286 fluindo sobre ele Para determinar o epitopo sobre o polipeptídeo Αβ que é reco

nhecido pelo anticorpo 2H6, a análise de ligação por Ressonância de Plas15 ma de Superfície (SPR, Biacore 3000) foi usada. O polipeptídeo Αβι_40 (SEQ ID N0 15) acoplado a biotina (Global Peptide Services, CO) foi imobilizado sobre um chip coberto com estreptavidina (chip SA). A ligação de anticorpos Αβ (a 100 mM) a Αβ^ο imobilizado na ausência e na presença de fragmentos solúveis diferentes do peptídeo Αβ (a 16 μΜ, da American Peptide Com20 pany Inc., CA). Os peptídeos Αβ que deslocam a ligação do anticorpo 2H6 a Αβι-40 foram Αβι7-4ο, Αβ33-4ο, e Αβι.4ο, respectivamente (Figura 3). Assim, o anticorpo 2H6 se liga a um peptídeo C-terminal (33-40) de Αβι.40. Entretanto, esse peptídeo C-terminal (33-40) de Αβι-40 não desloca a ligação do anticorpo 2286 a Αβι-40 na concentração testada. Como mostrado na Figura 3, o peptídeo Ap1^8 não inibe a ligação do anticorpo 2H6 ou do anticorpo 2286 a Αβ-ι-40. sugerindo que, similar ao anticorpo 2286, o epitopo que o anticorpo 2H6 se liga inclui os aminoácidos 39 e/ou 40 do peptídeo Αβι-40. (Figura 3)

Além disso, os peptídeos Ap1^2 e Αβι-43 não inibem a ligação do 5 anticorpo 2H6 a Αβ-ι-40, embora eles possam inibir rapidamente a ligação de Αβ-ι-40 ao anticorpo de controle (anticorpo 2289, esse anticorpo está descrito em U.S. Appl. Pub. No. 10/683.815 e PCT/US03/32080) que se liga a 16-28 de Αβι-40 (Figura 3). Esses resultados mostram que o anticorpo 2H6 se liga preferencialmente a Αβ1.4ο> mas não a Αβ ^42 e Αβ 1.43.

Para avaliar o envolvimento de resíduos distintos de aminoáci

dos do peptídeo β-amiloide que se ligam a 2H6, variantes diferentes de Αβ-ι. 40, em cada qual os últimos 6 aminoácidos (resíduos de aminoácidos 35-40 de Αβι-w) foram substituídos individualmente por uma alanina (mutagênese por rastreamento de alanina), foram geradas por mutagênese direcionada ao 15 sítio. Essas variantes de Αβι.40 (seqüências mostradas na Tabela 6) foram expressas em E. coli como proteínas de fusão com Glutationa-S-Transferase (GST) (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, Nj, USA) seguida por purificação por afinidade sobre esferas de Glutationa-Agarose (SigmaAldrich Corp., St. Louis, Mo, USA). Como controle, Αβι.40 de Tipo Selvagem 20 (WT) assim como Ap^41, Αβι_42ι, e Αβ-ι.39 também foram expressos como proteínas de fusão de GST. Αβ-ι-40, Αβι_4ι, Αβι-42,, Αβ-ι-39, assim como as seis variantes diferentes (M35A(1-40), V36A(1-40), G37A(1-40), G38A(1-40), V39A(1-40), V40A(1-40) mostradas na Tabela 6) foram então imobilizados (100 μΙ de 0,025 μΙ μΙ de peptídeo-GST por poço) sobre placas de ensaio 25 ELISA e incubados com mAb 2286, 2289 e 2H6 em diluições seriadas de 0,3 nM para baixo (dados usando 0,3 nM de mAb são mostrados na Figura 4). Após 10 lavagens consecutivas, as placas de ensaio foram incubadas com 100 μΙ de 0,03 μΙ/ml por poço de anticorpo de cabra anticamundongo conjugado com biotina (H + L) (Vector Laboratories, vetor #BA-9200, Burllingame 30 CA, USA) seguido por 100 μΙ de 0,025 μg/ml por poço de Estreptavidina conjugada com HRP (Amersham Biosciences Corp., #RPN4401V, NJ, USA). A absorbância da placa foi lida em 450 nm. Tabela 6. Seqüências de aminoácidos de peptídeos beta-amiloide e varian

tes

1-40 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL (SEQ ID (WT) MVGGW NO:15) 1-42 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL (SEQ ID (WT) MVGGWIA NO: 16) 1-43 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL (SEQ ID (WT) MVGGWIAT NO:17) 1-41 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL (SEQ ID (WT) MVGGWI NO: 18) 1-39 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL (SEQ ID (WT) MVGGV NO:19) M35A DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL {SEQ ID (1-40) AVGGW N0:20) V36A DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL (SEQ ID (1-40) MAGGW NO:21) G37A DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL (SEQ ID (1-40) MVAGW NO:22) G 38 A DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL (SEQ ID (1-40) MVGAW NO:23) V39A DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL (SEQ ID (1-40) MVGGAV NO:24) V40A DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGL (SEQ ID (1-40) MVGGVA NO:25) Como mostrado na Figura 4, Mab 2289 que foi direcionado para

ao aminoácidos 16 a 28 de Αβ reconheceu todas as variantes com a mesma 5 intensidade e serviu como controle interno positivo da concentração da proteína e da integridade da proteína sobre a placa. O anticorpo 2H6 não reconheceu Αβι-4ΐ, Ap1-S9, ou Αβι-42 como mostrado na Figura 4. As variantes V40A, V39A, G38A, G37A, V36A, e M35A de Αβι.4ο mostraram ligação reduzida ao anticorpo 2H6, demonstrando que o epitopo do anticorpo 2H6 se 10 prolonga por pelo menos 6 aminoácidos na extremidade C-terminal de Αβι.40. As mutações de V e G para A são muito conservativas e provavelmente não produzem alterações conformacionais significativas nas proteínas, portanto, o maior efeito dessas mutações para a ligação do anticorpo 2H6 pode ser devido à habilidade do anticorpo de diferenciar entre os aminoácidos mencionados no contexto de Αβ e esses dados demonstram uma especificidade em um grau muito alto por esse anticorpo.

Para determinar se 2H6 e 9TL competem pela ligação a Αβι-4ο, experimentos de competição foram realizados usando um ensaio Biacore. Os anticorpos 2H6, 9TI e 2289 foram imobilizados sobre canais diferentes de um chip CM5. Os canais do chip CM5 foram ativados com cloridrato de Netil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodi-imida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. Os anticorpos 2H6, 9TI e 2289 foram diluídos em acetato de sódio 10 mM pH 4.0 e injetados sobre o chip ativado em uma concentração de 0,005 mg/ml. A densidade do anticorpo foi de 1625 unidades de resposta (RU) para 2H6; 4000 RU para 9TL e 2200 RU para 2289. Cada canal foi bloqueado com etanolamina. O peptídeo Ap-M0 (150 mM) foi derramado sobre o chip por 2 min. Então, o anticorpo 2H6 (a ser testado para competição por ligação) a 0,6 uM foi derramado sobre o chip por 1 min. O tampão HES-EP (tampão HEPES a 0,01 mM pH 7.4, NaCI a 0,15 M, EDTA a 3 mM, Tensoativo P20 a 0,005%) foi usado como tampão de corrida para todos os ensaios BIAcore. Após medir a ligação de Αβ-ι.4ο todos os canais do chip foram regenerados por lavagem duas vezes com um mistura de tampão de eluição de Pierce (Produto No. 21004, Pierce Biotechnology, Rockford, IL) e NaCI a 4 M (2:1) por 6 seg. A competição por ligação foi então realizada para o anticorpo 9TL e então para o anticorpo 2289. A competição entre 9TL e 2H6 pela ligação a Αβι.40 foi observada, mas nenhuma competição foi observada entre 9TL e 2289 ou entre 2H6 e 2289. As observações de competição entre o anticorpo imobilizado e o mesmo anticorpo fluindo sobre o chip serviram como controle positivo.

B. Anticorpo 2H6 não se liga a APP

Para determinar se 2H6 se liga as proteínas precursoras de amiIoide (APP)1 a ligação de 2H6 a células transfectadas com o tipo selvagem de APP foi determinada, Células 293 foram transfectadas com um cDNA que codifica a proteína precursora de amiloide humana de tipo selvagem. Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram incubadas sobre gelo por 45 minutos com anticorpos monoclonais θηίί-Αβ^-ιβ, anti-Api6-28, ou 2H6 (5 ug/ml em DMEM com 10% FCS). As células foram então lavadas três vezes em PBS por 5 minutos, fixadas com PFA 4%. As células foram novamente lavadas três vezes com PBS e a ligação do anticorpo foi detectada 5 com anticorpo secundário de cabra anticamundongo conjugado com Cy3 (diluição 1:500) de Jackson Immunoresearch sob microscópio de fluorescência.

Anticorpos anti-Αβι.ιβ e anti-Ap-i6-28 que reconhecem os epitopos N-terminal ou central em Αβ, mostraram, ambos, ligação significativa as proteínas precursoras APP expressas nas células. Em contraste, 2H6 não se ligou a células que expressam APP.

C. Geração de anticorpo 2H6 deglicosilado

Para gerar anticorpo 2H6 deglicosilado, a anticorpo 2H6 purificado foi incubado a 37°C por 7 dias com peptídeo-N-glicosidase F (Prozyme, 15 0,05 U por mg de anticorpo) em Tris-HCI a 20 mM pH 8.0. A integridade da deglicosilação foi verificada por MALDI-TOF-MS e eletroforese em gel de proteína. Anticorpos deglicosilados foram purificados por cromatografia com Proteína Aea endotoxina foi removida por Q-Sefarose. A afinidade de ligação a Αβι-40 do anticorpo deglicosilado 2H6 foi testada usando o ensaio Bia 20 core descrito acima e a afinidade de ligação do anticorpo deglicosilado 2H6 por Αβι-40 foi encontrada ser idêntica à do anticorpo 2H6 intacto.

Exemplo 4: Efeito do anticorpo deglicosilado 2H6 (2H6-D) na proteção e recuperação da função retiniana em um modelo animal de Degeneracão Macular Relacionada à Idade Estudos iniciais (Malek, G. e outros, PNAS 102: 11900-5 (2005))

demonstraram que a combinação de três fatores de risco: (1) genótipo da isoforma E4 de apolipoproteína (APOE4), (2) idade avançada (acima de 65 semanas) e (3) dieta rica em gordura e colesterol (HF-C) produziam um modelo animal que se aproximava intimamente dos achados clínicos de AMD. Camundongos idosos APOE4 desenvolveram alterações patológicas similares aos sinais morfológicos característicos observados na AMD humana atrófica e exsudativa, incluindo alterações pigmentares do pigmento do epitéIio retiniano (RPE), depósitos difusos espessos sub-RPE, depósitos ricos em lipídeos similares a drusas, espessamento da membrana de Bruch1 regiões desiguais de atrofia de RPE sobrejacentes a degeneração de fotorreceptor e neovascularização coroidal (CNV). Essas alterações não foram detectadas 5 em nenhum controle humano de camundongos que expressam APOE3 sem levar em consideração o regime dietético nem foram patologias detectadas em animais APOE4 jovens. Os déficits funcionais foram identificados a partir de eletrorretinogramas escotópicos de campo total. Animais afetados tiveram uma redução significativa nas amplitudes da onda a e b comparados com 10 controles. Significativamente, essas alterações histopatológicas e funcionais requerem a presença de todos três fatores de risco. Esse modelo animal de CNV ocorrendo espontaneamente é o primeiro a incorporar fatores de risco fisiologicamente relevantes de doença humana.

A. Protocolo Experimental Administração de anticorpos. Camundongos idosos (acima de 65

semanas) que expressam ApoE4 humana foram usados nos experimentos. O fenótipo similar a AMD presente nesses camundongos foi previamente descrito (Malek, G. e outros, PNAS 102: 11900-5 (2005)). Para oito semanas de estudo do tratamento, camundongos transgênicos ApoE4, com 65 sema20 nas de idade ou mais, foram designados para um de quatro grupos. O primeiro grupo (E4-ND) foi mantido continuamente com dieta normal (n=2). O segundo grupo (E4-HFC-R1) foi alimentado com uma dieta de 8 semanas enriquecida com gordura e colesterol (HF-C) (n=2). O terceiro grupo (E4- HFC-R1) foi alimentado com uma dieta HF-C por 8 semanas e recebeu se25 manalmente injeções intraperitoneais de Rinat 1 (3 mg/kg) (n=5). O quarto grupo (E4-HFC-R2) foi alimentado com uma dieta HF-C por 8 semanas e recebeu semanalmente injeções intraperitoneais de Rinat 2 (3 mg/kg) (n=5). Após o término do estudo, os grupos foram revelados: Rinat 1 era veículo com PBS e Rinat 2 era anticorpo 2H6 deglicosilado anti-Αβ (lgG2b monoclo30 nal de camundongo anti-Ap28-40 humana, '2H6-D' como descrito no Exemplo 3).

Avaliações in vivo. O exame de fundoscopia foi realizado na semana 0, enquanto que a fundoscopia e os angiogramas fluorescentes foram realizados na semana 8. Foram tiradas fotografias, usando uma câmera de fundoscopia (TRC-50EX Retina Camera). As imagens foram capturadas usando um sistema TOPCON IMAGEnet™. O corante fluoresceína (fluoresce5 ína sódica 10%, aproximadamente 0,1 ml/kg) foi injetado através de portas de acesso vasculares. As fotografias foram tiradas em vários momentos após a injeção do corante, para incluir a fase arterial, a fase arterio-venosa precoce e várias fases arterio-venosas tardias a fim de avaliar a neovascularização e monitorizar vazamentos de fluoresceína associados com lesões de 10 CNV. A interpretação e a análise dos angiogramas com fluoresceína foram conduzidas independentemente por um oftalmologista.

Os níveis de colesterol plasmátíco total no sangue total foram coletados dos camundongos (jejum de 5 horas) antes e depois da administração da dieta HF-C de 8 semanas.

Anqioqrafia com Fluoresceína (FA). Um animal, um E4-HFC-R2,

mostrou possíveis vazamentos nas fotos mais tardias do angiograma. O animal morreu após FA mas antes dos eletrorretinogramas e nenhum tecido foi recuperado.

Registros dos Eletrorretinogramas. Durante a nona semana, registros de eletrorretinograma (ERG) foram obtidos dos animais, adaptados ao escuro por pelo menos 12 horas. Cada animal foi anestesiado com um coquetel de quetamina/xilazina, as pupilas foram dilatadas e após o animal ser estabilizados sobre uma almofada térmica a 37°C, os traçados de ERG foram registrados usando um eletrodo de teste de prata colocado em contato com o olho junto com uma gota de hidroxipropil metilcelulose 2,5%. Os camundongos foram colocados em uma câmera estimuladora fotótica onde cada animal foi exposto a flashes de Iuz (intensidade max de 1000 cd-s/m2 atenuada em etapas de Iog de 1, começando com 0,0005). A amplitude da onda a foi medida a partir da linha de base até a depressão da onda a e a amplitude da onda b foi medida a partir da onda a até o pico da onda b.

Análise Histolóqica. No dia do sacrifício, os camundongos foram pesados, superdosados com Avertin (0,2 μΙ/10 g de peso corporal) e então perfundidos intracardiacamente com 20 ml de solução salina. Os cérebros foram removidos rapidamente e a metade esquerda do cérebro foi fixada por imersão por 16 h em formalina 10% preparada recentemente para histopatologia. Seções de trinta mícrons cortadas com vibratome foram pré-tratadas 5 com MeOH 10%, 1 x PBS e H202 2%, lavadas com PBS1 incubadas com ácido fórmico 88% por 1 minuto para recuperação do antígeno e bloqueadas como soro de cabra normal 5% (NGS) e PBS. As seções foram incubadas durante a noite com uma diluição 1:1000 de anticorpo primário 4G8 biotinilado (Signet 4G8 lgG2b monoclonal humana contra os resíduos 17-24 de β10 amiloide de camundongo) em NGS 1%/PBS e visualizadas usando o Kit ABC Vectastain (Vector Labs) como descrito pelo fabricante.

B. Resultados

Recuperação/proteção da função retiniana pela administração de anticorpo deglicosilado.

Como mostrado na Figura 5, há uma redução estatisticamente

significativa nas amplitudes das ondas a e b em camundongos ApoE4 alimentados com dieta rica em gordura e colesterol (E4-HFC) versus camundongos em dieta normal (E4-ND) (onda a = 0,0106, onda b = 0,008). ERGs obtidos dos animais injetados foram comparados com o grupo de ERGs ba

20 sais. Não há diferença significativa nas amplitudes da onda a tanto no grupo injetado (E4-HFC-R1 e E4-HFC-R2) comparada com E4-HFC (nãomostrado). Em contraste, as amplitudes da onda b mostram uma recuperação e/ou proteção evidente da função retiniana no grupo E4-HFC-R2 (Figura 6).

Redução dos depósitos de Αβ em camundongos APOE4 com

dieta HF-C injetados com anticorpo 2H6-D anti- Αβ. Como ilustrado na Figura 7, a imunocoloração de Αβ total em camundongos E4-HFC foi reduzida após 8 semanas de imunoterapia com anticorpo 2H6-D quando comparada ao grupo de controle com veículo.

C. Conclusão

Os dados acima demonstram 1) recuperação/proteção da função retiniana como demonstrado por ERGs de camundongos injetados com Anticorpo 2H6-D Anti-Αβ e 2) redução da deposição de amiloide quando tratado com anticorpo 2H6-D no cérebro de camundongo quando comparado com o grupo de camundongos com AMD não tratada.

Exemplo 5. Determinação da afinidade de ligação do anticorpo 6G e suas 5 variantes

A. Métodos gerais

Os seguintes métodos gerais foram usados nesse exemplo e em outros exemplos.

Vetor de expressão usado na caracterização do clone A expressão do fragmento Fab dos anticorpos estava sob o con

trole de um promotor IacZ induzível por ITPG similar àquele descrito em Barbas (2001) Phage display: a Iaboratory manual, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press pg 2.10. Vector pComb3X), entretanto, as modificações incluíram a adição e a expressão dos seguintes domínios 15 adicionais: domínio constante da cadeia leve Kappa humana e o domínio constante CHI de imunoglobulina lgG2 humana, região C da cadeia 2-gama de Ig1 número de acesso de proteína P01859; cadeia leve kappa de imunoglobulina (Homo sapiens), número de acesso de proteína CAA09181. Preparação de Fab em pequena escala 20 A expressão em pequena escala de Fabs em placas de 96 po

ços foi realizada como se segue. Começando a partir de E. coli transformada com uma biblioteca de Fab, as colônias foram removidas para inocular uma placa de controle (ágar LB + Ampicilina (50 pg/ml) + Glicose 2%) e uma placa de trabalho (2 ml/poço, placa de 96 poços contendo 1,5 ml de LB + Ampi25 cilina (50 pg/ml) + Glicose 2%). Ambas as placas foram incubadas a 30°C pó 8 a 12 horas. A placa de controle foi armazenada a 4°C e as células da placa de trabalho foram peletizadas a 5000 rpm e ressuspensas com 1 ml de LB + Ampicilina (50 pg/ml) + ITPG 1 mM para induzir a expressão de Fabs. As células foram coletadas por centrifugação após 5 h de tempo de expressão a 30 30°C, então ressuspensa em 500 μΙ de Tampão HBS-P (tampão HEPES a 10 mM pH 7.4, NaCI a 150 mM, P20 a 0,005%). A Iise das células ressuspensas em HBS-P foi realizada por um ciclo de congelamento (-80°C) e então descongelamento a 37°C. Os Iisados celulares foram centrifugados a 5000 rpm por 30 min para separar os restos celulares dos sobrenadantes contendo Fabs. Os sobrenadantes foram então injetados em um equipamento de ressonância de plasma de superfície BIAcore para se obter a informa5 ção sobre a afinidade para cada Fab. Os clones que expressavam Fabs foram resgatados da placa de controle para sequênciar o DNA e para a produção de Fab em grande escala e caracterização detalhada como descrito abaixo.

Preparação de Fab em grande escala Para se obter parâmetros cinéticos detalhados, Fabs foram ex

pressos e purificados a partir de grandes culturas. Frascos de Erlenmeyer contendo 200 ml de LB + Ampicilina (50 pg/ml) + Glicose 2% foram inoculados com 5 ml de uma cultura feita durante a noite de um clone de E coli que expressa Fab selecionado. Os clones foram incubados até que uma ODs5Onm fosse atingida e então induzidos pela substituição dos meios por 200 ml de LB + Ampicilina (50 pg/ml) + ITPG 1 mM. Após 5 h de tempo de expressão a 30°C, as células foram peletizadas por centrifugação, então ressuspensas em 10 ml de PBS (pH 8). A Iise das células foi obtida com dois ciclos de congelamento/descongelamento (-80°C e 37°C, respectivamente). O sobrenadante dos Iisados celulares foram carregados sobre colunas de superfluxo Ni-NTA sefarose (Qiagen, Valencia, CA) equilibradas com PBS, pH 8, então lavadas com 5 volumes de coluna de PBS, pH 8. Os Fabs individuais foram eluídos em diferentes frações com PBS (pH 8) + imidazol 300 mM. As frações contendo Fabs foram agrupadas e dialisadas em PBS, e então quantificadas por ELISA antes da caracterização da afinidade.

Preparação de anticorpo completo

Para a expressão de anticorpos completos, as regiões variáveis das cadeias leve e pesada foram clonadas em vetores de expressão de mamíferos e transfectadas usando Iipofectamina em células HEK 293 para expressão transitória. Os anticorpos foram purificados usando métodos padronizados com proteína A.

O vetor pDb.6G.hFc2a é um vetor de expressão que compreende a cadeia pesada do anticorpo 6G e é adequado para a expressão transitória ou estável da cadeia pesada. O vetor pDb.6G.hFc2a tem as seqüências de nucleotídeos que correspondem às seguintes regiões: a região promotora de citomegalovírus humano (nucleotídeos 1-612); um íntron sintético (nucle

5 otídeos 619-1507); a região codificadora de DHFR (nucleotídeos 707-1267); peptídeo de sinal do hormônio do crescimento humano (nucleotídeos 1525- 1602); região variável de cadeia pesada de 6G (nucleotídeos 1603-1951); região constante da cadeia pesada de lgG2 humana contendo as seguintes mutações: A330P331 to S330S331 (numeração de aminoácidos referente a 10 seqüência de lgG2a de tipo selvagem; veja Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613- 2624); sinal de poliadenilação tardia de SV40; região intensificadora de SV40; região f1 de fago e região codificadora de beta Iactamase (AmpR).

Vetor pDb.6G.hFc2a foi depositado na ATCC em 20 de Julho de 2004, e foi designado como ATCC No de Acesso PTA-6124.

O vetor pEb.6G.hK é um vetor de expressão que compreende a

cadeia leve do anticorpo 6G e é adequado para a expressão transitória da cadeia leve. O vetor pEb.6G.hK tem as seqüências de nucleotídeos que correspondem às seguintes regiões: a região promotora de citomegalovírus humano (nucleotídeos 1-612); um íntron EF-1 humano (nucleotídeos 619- 20 1142); peptídeo de sinal do hormônio do crescimento humano (nucleotídeos 1173-1150); região variável de cadeia leve de 6G; região constante da cadeia kappa humana; sinal de poliadenilação tardia de SV40; região intensificadora de SV40; região f1 de fago e região codificadora de beta Iactamase (AmpR).

Ensaio Biacore

As afinidades do anticorpo monoclonal 6G foram determinadas usando o sistema de ressonância de plasma de superfície (SPR) BIAcore3000™ (BIAcore, INC, Piseataway NJ) usando os métodos descritos no Exemplo 1 acima.

Ensaio ELISA

ELISA foi usado para medir a ligação do anticorpo 6G e variantes a peptídeos Αβ não-biotinilados. Placas NUNC maxísorp foram revestidas com 2,5 ug/ml de pepíídeos Αβ em PBS pH 7,4 por mais de 1 hora a 4°C. As placas foram bloqueadas com BSA a 1% em tampão PBS pH 7,4. O anticorpo primário (dos sobrenadantes celulares, soro contendo anticorpo anti-Αβ ou anticorpo total purificado ou Fabs na diluição desejada) foi incu5 bado com os peptídeos Αβ imobilizados por 1 h em temperatura ambiente. Após a lavagem, as placas foram incubadas com anticorpo secundário, um anticorpo de cabra anti- cadeia kappa humana conjugado com HRP (MP Biomedicals, 55233) na diluição 1:5000. Após a lavagem, o anticorpo secundário ligado foi medido pela adição de substrato TMB (KPL, 50-76-02, 50-65- 10 02). A reação HRP foi paralisada pela adição de ácido fosfórico a 1M e a absorbância a 450 nm foi medida.

ELISA foi usado para medir a ligação do anticorpo 6G e variantes a peptídeos Αβ biotinilados. Placas NUNC maxisorb foram cobertas com

6 ug/ml de estreptavidina (Pierce, 21122) em PBS pH 7.4 por mais de 1 h a 4°C. As placas foram bloqueadas com BSA a 1% em tampão PBS pH 7,4. Após a lavagem, os peptídeos Αβ biotinilados em PBS pH 7.4 foram incubados por 1 hora em temperatura ambiente. O anticorpo primário (dos sobrenadantes celulares, soro contendo anticorpo anti-Αβ ou anticorpo total purificado ou Fabs na diluição desejada) foi incubado com os peptídeos Αβ imobiIizados por 1 h em temperatura ambiente. Após a lavagem, as placas foram incubadas com anticorpo secundário, um anticorpo de cabra anti- cadeia kappa humana conjugado com HRP (MP Biomedicls, 55233) na diluição 1:5000. Após a lavagem, o anticorpo secundário ligado foi medido pela adição de substrato TMB (KPL, 50-76-02, 50-65-02). A reação HRP foi paralisada pela adição de ácido fosfórico a 1M e a absorbância a 450 nm foi medida.

B. Afinidade de ligação de anticorpo 6G e suas variantes por A3i.an AB-U4? e outros peptídeos A3

As seqüências de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo 6G estão mostradas na Figura 8. A afinidade de ligação do anticorpo 6G por Ap^40, Αβ-ι-42 e Αβ22.37 determinada usando BIAcore descrito acima está mostrada na Tabela 7 abaixo. Tabela 7. Afinidade de ligação do fragmento Fab do anticorpo 6G

kon (1/Ms) koff (1/s) Kd (nM) Αβ 1 -40 Biotinilado imobilizado 3,0 x 105 7,0 x 10’4 2 sobre chip de estreptavidina, Fab de 6G fluindo sobre ele Αβ-ι-42 Biotinilado imobilizado 1,8 x 104 1,6 x 10'3 80 sobre chip de estreptavidina, Fab de 6G fluindo sobre ele Αβ22-37 Biotinilado imobilizado 3,6 x 105 3,9 x 10'3 11 sobre chip de estreptavidina, Fab de 6G fluindo sobre ele A seqüência de aminoácidos das variantes de 6G é mostrada na

Tabela 8 abaixo. Todas as substituições de aminoácidos das variantes mostradas na Tabela 8 estão descritas em relação a seqüência de 6G. A ligação relativa de variantes de 6G também é mostrada na Tabela 8. A ligação foi determinada por ELISA descrito acima com Αβι-40 ou Ap^42 imobilizados sobre a superfície de uma placa ELISA. Tabela 8. Seqüências de aminoácidos e dados de ligação para variantes do anticorpo 6G Dados de ligação de variantes mutantes de cadeia pesada de 6G por ELISA 450 ELISA número do clone mutações Αβι-40 Αβΐ-42 6G F99 D100 N101 Y102 D103 R104 2,55 0,95 1A Y 1,60 0,26 1B M 0,37 0,22 1G L 0,51 0,21 2G P 0,30 0,50 3E C 0,26 0,40 4G S 1,41 0,30 5D N 1,52 0,39 6A T 0,86 0,31 7B S 0,44 0,27 7D C 0,23 0,31 8H H 0,21 0,19 9E R 0,22 0,26 10A F 1,85 0,34 10E L 0,41 0,24 10G I 0,63 0,22 11D M 0,29 0,24 2F P 1,89 0,38 Continuação Dados de ligação de variantes mutantes de cadeia pesada de 6G por ELISA 450 ELISA número do clone mutações > Αβΐ-42 3P O 3A A 1,16 0,28 3B R 1,43 0,43 3C G 2,30 0,76 4A G 2,17 0,40 4B F 2,48 0,71 4D Q 2,45 1,00 6F S 2,28 0,62 Dados de ligação de variantes mutantes de cadeia pesada de 6G por ELISA A450 ELISA número do clone mutações Αβ 1-40 Αβΐ-42 6G Q93 Q94 S95 K96 E97 F98 P99 W100 S101 2,49 0,61 2H K 0,07 0,13 3A P 0,08 0,13 4F S 2,00 0,30 5B G 0,09 0,14 7E R 0,09 0,18 7F K 0,12 0,19 10E L 0,08 0,12 1A N 2,02 0,32 1C F 0,05 0,05 4A A 2,09 0,28 4G F 1,07 0,28 5H R 2,60 0,85 6C G 0,05 0,05 6D T 2,41 1,34 6E P 0,12 0,20 8G V 2,60 0,90 112 Exemplo 6: Caracterização de epitopo sobre o peptídeo AB que se liga ao anticorpo 6G

Para determinar o epitopo sobre o peptídeo Αβ que é reconhecido pelo anticorpo 6G, a análise de ligação por ELISA foi usada. Vários pep5 tídeos Αβ (Global Peptide Services, CO) foram imobilizados sobre uma placa de ELISA. A ligação de anticorpo 6G completo (a 20 mM) ao Αβ imobilizado foi determinada por ELISA como descrito acima. As seqüências de aminoácidos de Αβ-ι-40, Αβι_42 e Αβι-43 são mostradas abaixo na Tabela 9. Como mostrado na Figura 9, 0 anticorpo 6G se liga aos peptídeos Αβ 17-40, 17-42, 10 22-35, 28-40, 1-38, 1-40, 1-42, 1-43 e 28-42; mas a ligação a 28-42 é muito mais fraca do que a outros peptídeos Αβ. O anticorpo 6G não se liga aos peptídeos Αβ 1-16, 1-28 e 33-40. Assim, o anticorpo 6G se liga a terminação C de vários peptídeos Αβ truncados por exemplo, 22-35, 1-38, 1-40, 1-42 e 1-43.

A Tabela 9 abaixo mostra a comparação da afinidade de ligação

de 6G por Ap1^0 com outros peptídeos Αβ como medido por koff (1/s) usando o ensaio Biacore. O anticorpo 6G se liga a Αβ-|.40 com uma afinidade maior quando comparada com outros peptídeos, com afinidade significativamente menor com Αβι-40 truncado (tal como 1-37, 1-38 e 1-39), Αβι.42 e Ap1-^. Isso 20 indica que a cadeia lateral ou 0 arcabouço do aminoácido 40 (VaIina) de Αβ está envolvido na ligação de 6G a Ap-M0; e a ligação é significativamente reduzida (por exemplo, entre cerca de 10 a cerca de 50-259 vezes menos afinidade) na ausência desse aminoácido. A ligação com menor afinidade a Αβι.40 amidado da cadeia lateral indica que a ligação de 6G a Αβι-4ο envolve 25 mas não é dependente da terminação C livre de Αβι-40. A menor afinidade de ligação a Ap1.^ e Αβ-1^3 pode ser devida a diferenças conformacionais entre a forma monomérica de Αβι-40 e Ap-1.42 ou Ap^43. Foi mostrado que o monômero de Ap^42 tem uma conformação diferente do monômero de Ap-M0 em solução. Veja, a estrutura monomérica coordenada para AP1-42 mostrada no 30 Protein Data Bank (arquivos em pdb) com n° de acesso 11YT; e a estrutura monomérica coordenada para Αβι_4ο mostrada no Protein Data Bank (arquivos pdb) com n° de acesso 1BA6 e 1BA4. Tabela 9

Fragmento de k0ff (1/s) Koffde peptídeo Αβ/koff Αβι.4ο peptídeo Αβ (vezes de perda de afinidade) 1-28 1-43 Ligação muito baixa 22-35 0,0285 215,9 1-36 0,0205 155,3 1-37 0,0149 112,8 1-38 9,3x10'3 70,4 1-39 7,92x10'3 60,0 17-42 0,0465 352,2 1-42 1,9x10‘3 14,4 28-42 3,37x10‘3 25,5 28-40-NH2# 3,62x10‘3 27,4 28-40 6,4x10’4 4,8 17-40 2,15x10'4 1,6 1-40 1,32x104 1 Peptídeo fluido como analito sobre chip CM5 com anticorpo mo

noclonal 6G (Iigante) imobilizado por química de amina #peptídeo com terminação carboxi amidada 5 O mapeamento de epitopo do anticorpo 6G foi realizado por en

saio ELISA. 15-meros ou 10-meros biotinilados de vários peptídeos Αβ (esses peptídeos têm glicina adicionada na extremidade C-terminal) foram imobilizados sobre placas cobertas com estreptavidina. O anticorpo 6G (de 2,5 ug/ml a 10 ug/ml) foi incubado com os peptídeos imobilizados e a ligação foi 10 medida como descrito acima. Como mostrado na Figura 10, o anticorpo 6G se liga a peptídeos Αβ com os aminoácidos 20-34, 21-35, 22-36, 23-37, 24- 38, 25-39 e 25-34 com glicina na terminação C; mas não se liga a peptídeos Αβ com os aminoácidos 19-33, 26-40, 27-41, 24-33, e 26-35 que têm uma glicina na terminação C desses peptídeos. Isso sugere que o epitopo do an15 ticorpo 6G inclui aminoácidos entre 25 e 34.

Baseado nos dados mostrados acima, o epitopo que liga o anticorpo 6G parece incluir os aminoácidos 25-34 e 40. A Figura 11 é um gráfico esquemático que mostra o epitopo do anticorpo 6G.

B. Anticorpo 6G não se liga a APP

Para determinar se 6G se liga as proteínas precursoras de amiIoide (APP)1 a ligação de 6G a células transfectadas com o tipo selvagem de 5 APP foi determinada. Células HEK 293 foram transfectadas com um cDNA que codifica a proteína precursora de amiloide humana de tipo selvagem. Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram incubadas sobre gelo por 45 minutos com anticorpos monoclonais anti-APi-i6 (m2324) ou 6G (5 ug/ml em DMEM com 10% FCS). As células foram então lavadas três ve10 zes em PBS por 5 minutos, fixadas com PFA 4%. As células foram novamente lavadas três vezes com PBS e a ligação do anticorpo foi detectada com anticorpo secundário de cabra anticamundongo conjugado com Cy3 (diluição 1:500) de Jackson Immunoresearch sob microscópio de fluorescência.

Como mostrado na Figura 12, anticorpo anti-A3i.i6 que reconhe

ce os epitopos N-terminal em Αβ, mostraram ligação significativa as proteínas precursoras APP expressas nas células. Em contraste, 6G não se ligou a células que expressam APP.

Exemplo 7: Produção e Caracterização de anticorpo 7G10 de murino (antiA3i-4? /Α3ι-4λ).

Camundongos foram imunizados com ~ 100 ug de um peptídeo conjugado com KLH em adjuvante como descrito por in Konig1 G. et al, Annals New York Academy of Sciences. 777:344-55 (1996). Como as posições 29- 42 do peptídeo BA4 encontram-se inteiramente dentro da região transmembrana putativa de APP e são hidrofóbicas por natureza, o peptídeo KLH foi conjugado com um espaçador hidrofílico. KLH-HDGDGD-MVGGVVIA foi sintetizado em Anaspec o resíduo espaçador 5 foi suficiente para ultrapassar os problemas de insolubilidade e estender a terminação C para longe do transportador. No primeiro dia, os camundongos foram imunizados com 100 pg 35-42 / peptídeo KLH com CFA (adjuvante completo Freund) subcutaneamente. No dia 15, os camundongos foram imunizados com 100 pg de peptídeo/KLH Ribi/alum. No dia 55, os camundongos foram imunizados como no Dia 15. No Dia 95, os camundongos foram estimulados com 100 pg de peptídeo/KLH intravenosamente.

Esplenócitos foram obtidos dos camundongos imunizados e no Dia 99 foram fundidos com células de mieloma P3x63Ag8.653, ATCC CRL 5 1580, em uma proporção de 10:1 com polietileno glicol 1500. As células fundidas forma plaqueadas em placas de 96 poços em DMEM contendo soro de cavalo 20% e 2-oxaloacetato/piruvato/insulina (Sigma) e os sobrenadantes ensaiados, começando no Dia 10 após a fusão usando ensaio ELISA e revestindo com 2ug/ml de Αβ1-42 (Anaspec). Positivos foram selecionados e 10 expandidos e caracterizados posteriormente.

Título de soros de camundongo no dia da fusão era 1/9000 quando testados para o peptídeo livre Αβι-42. A afinidade de ligação de 7G10 a Αβ-Μο, 1-42 e 1-43 foi analisada por Biacore.

Ensaio Biacore

As afinidades do anticorpo monoclonal 7G10 foram determina

das usando BIAcore3000° como descrito previamente no Exemplo 1. Αβ1- 40, 1-42 e 1-43 N-biotinilados foram capturados sobre chip SA. Três séries de diluição de Fabs anti-Api-40, Fabs 3ηίϊ-Αβ1-42 e Fabs anti-Api-43, respectivamente, foram injetadas começando com uma diluição 1/6 de estoque 20 de 7G10 listado acima. O chip foi regenerado com um pulso de 18 seg de 6% EtOH+6mM NaOH.

Amostra IgG Vol. (mL) Fab Vol. (mL) KD (nM) (mg/mL (mg/mL) Peptídeo Ap^40 0,672 2,4 1,458 0,4 Não apli¬ cável Peptídeo APm2 0,672 2,4 1,458 0,4 37,6 Peptídeo Ap^43 0,672 2,4 1,458 0,4 41 Como indicado acima, 7G10 teve uma Kd de 37,6 nM para 0 peptídeo Api_42 e uma Kd de 41 nM para o peptídeo Αβ-ι-43. Nenhuma ligação mensurável foi detectada contra o peptídeo Αβι.40.

25 Exemplo 10: Efeitos comparativos de anticorpos 9TL, 6G e 7G10 na proteção e recuperação da função retiniana em um modelo animal de Degeneranão Macular Relacionada à Idade A. Protocolo Experimental

Administração de anticorpos. O protocolo como descrito no Exemplo 4 acima foi repetido. Camundongos transgênicos ApoE4, com 65 semanas de idade ou mais, foram designados para um de cinco grupos por oito semanas. O primeiro grupo (E4-ND) foi mantido continuamente com dieta normal (n=6). O segundo grupo (E4-HFC-R1) foi alimentado com uma dieta de 8 semanas enriquecida com gordura e colesterol (HF-C) (n=12). O terceiro grupo (E4-HFC-R1) foi alimentado com uma dieta HF-C por 8 semanas e recebeu semanalmente injeções intraperitoneais de Rinat 3 (3 mg/kg) (n=12). O quarto grupo (E4-HFC-R2) foi alimentado com uma dieta HF-C por 8 semanas e recebeu semanalmente injeções intraperitoneais de Rinat 4 (3 mg/kg) (n=12). O quinto grupo (E4-HFC-R) foi alimentado com uma dieta HF-C por 8 semanas e recebeu semanalmente injeções intraperitoneais de Rinat 5 (3 mg/kg) (n=12). Após o término do estudo, os grupos foram revelados: Rinat 3 era 7G10; Rinat 4 era anticorpo 2H6 deglicosilado anti-Αβ; e Rinat 5 era 6G.

O exame de fundoscopia e os angiogramas fluorescentes foram realizados como descrito previamente no Exemplo 4 acima. Os registros de ERG foram obtidos após a oitava semana como descrito previamente no Exemplo 4 acima.

Resultados

Recuperação/proteção da função retiniana pela administração de anticorpo deglicosilado

Como mostrado na Figura 13, as amplitudes da onda b confir25 mam a recuperação e/ou proteção significativas da função retiniana no grupo tratado com 2H6 (E4-HFC anti- Αβ -mo)· As amplitudes da onda b indicam pouco ou nenhuma recuperação no grupo tratado com 7G10 (E4-HFC antiΑβι-42/ Αβ M3). Surpreendentemente, as amplitudes da onda b indicam uma grande recuperação e/ou proteção da função retiniana no grupo tratado com 30 6G (E4-HFC anti-ΑβΜο/ Αβ m2). Como mostrado na figura 14, a amplitude da onda b no grupo tratado com 6G foi comparável ao grupo de controle de camundongos normais, indicando recuperação e/ou proteção completas da 10

15

20

25

função retiniana.

Conclusão

Os dados acima demonstram 1) o amiloide sub-RPE é patogênico e/ou tóxico na AMD; 2) a recuperação/proteção significativa da função retiniana como demonstrada por ERGs de camundongos injetados com Anticorpo 2H6-D anti-Αβ; e 3) recuperação/proteção completas da função retiniana como demonstrado por ERGs de camundongos injetados com anticorpo 6G biespecífico θηίι'-Αβ^^/Αβι^.

É compreendido que os exemplos e modalidades descritos aqui são para propósitos ilustrativos apenas e que várias modificações ou alterações à Iuz desses serão sugeridas por pessoas versadas na técnica e são para serem incluídas dentro do espírito e do escopo desse pedido. Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes citados aqui estão incorporados por referência em suas totalidades para todos os propósitos, na mesma extensão como se cada publicação, patente ou pedido de patente individuais fossem especificamente e individualmente indicado para ser assim incorporado por referência.

Depósito de Material Biológico

Os seguintes materiais foram depositados com a American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-

2209, USA (ATCC): Material

pDb.9TL.hFc2a pEb.9TL.hK pDb.6G.hFc2a pEb.6G.hK

AnticorpoNo.

cadeia pesada 9TL cadeia leve 9TL cadeia pesada 6G cadeia leve 6G

ATCC Ac- Data de Deposito cesso N0

PTA-6124

PTA-6125

PTA-6786

PTA-6787

de Julho de 2004 de Julho de 2004 de Junho de 2005 de Junho de 2005

Vetor pEb.9TL.hK é um polinucleotídeo que codifica a região variável de cadeia leve e a região constante kappa de 9TL; e o vetor pDb.9TL.hFc2a é um polinucleotídeo que codifica a região variável de cadeia pesada de 9TL e a região constante de cadeia pesada lgG2a contendo as seguintes mutações: A330P331 para S330S331 (numeração de aminoácidos com referência a seqüência de lgG2a de tipo selvagem); vide Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624).

Vetor pEb.6G.hK é um polinucleotídeo que codifica a região variável de cadeia leve e a região constante kappa de G6; e o vetor pDb.6G.hFc2a é um polinucleotídeo que codifica a região variável de cadeia 5 pesada de 9TL e a região constante de cadeia pesada lgG2a contendo as seguintes mutações: A330P331 para S330S331 (numeração de aminoácidos com referência a seqüência de lgG2a de tipo selvagem): vide Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624).

Esses depósitos foram feitos sob as especificações do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para o Propósito de Procedimento de Patente e as Regulamentações de acordo com o mesmo (Tratado de Budapeste). Isso assegura a manutenção de uma cultura viável do depósito por 30 anos a partir da data de depósito. O depósito será disponibilizado pela ATCC sob os termos do Tratado de Budapeste e sujeito a um contrato entre Rinat Neuroscience Corp. e ATCC1 que assegura a disponibilidade permanente e irrestrita da progênie da cultura do depósito para o público após a emissão da patente U.S. pertinente ou após ser aberta para o público de qualquer pedido de patente U.S. ou estrangeiro, o que vier primeiro, e assegura a disponibilidade da progênie para aquele determinado pelo U.S. Commissioner of Patents and Trademarks para ser designado para isso de acordo com 35 USC Section 122 e as regras do Commissioner de acordo com isso (incluindo 37 CFR Section 1.14 com referência particular a 886 OG 638).

O cessionário do presente pedido concordou que se uma cultura 25 dos materiais em depósito morrer ou se perder ou for destruída, quando cultivada sob condições adequadas, os materiais serão rapidamente substituídos após a notificação por outros iguais. A disponibilidade do material depositado não deve ser considerada como uma licença para praticar a invenção em contravenção aos direitos assegurados sob qualquer governo com suas 30 leis de patente.

Seqüências de Anticorpos

Sequência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 9TL (SEQ ID NO: 1)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYYTEAYYIHWVRQAPGQGLEWMG RIDPATGNTKYAPRLQDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCASLY SLPVYWGQGTTVSS Seqüência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de 9TL (SEQ ID NO:2)

DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDAKTYLNWFQQRPGQSPR RLIYQISRLDPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGTHYPVL FGQGTRLEIKRT CDR H1 de 9TL (CDR estendida) (SEQ ID NO: 3)

G YYTE A YYIH

CDR H2 de 9TL (CDR estendida) (SEQ ID NO: 4)

RIDPATGNTKYAPRLQD

CDR H3 de 9TL (CDR estendida) (SEQ ID NO: 5)

LYSLPVY

CDR L1 de 9TL (CDR estendida) (SEQ ID NO: 6)

KSSQSLLYS DAKTYLN

CDR L2 de 9TL (CDR estendida) (SEQ ID NO: 7)

QISRLDP

CDR L3 de 9TL (CDR estendida) (SEQ ID NO: 8)

LQGTHYPVL

Seqüência de nucleotídeos da região variável de cadeia pesada de 9TL (SEQ ID NO:9)

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGTGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCT 25 T CCGT G AAGGTTT CCTGCAAAGCAT CT GGTT ACT AT ACGG AGGCTT ACT ATATCCACTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGTCAAGGCCTGGAGTGGATGG GCAGGATTGATCCTGCGACTGGTAATACTAAATATGCCCCGAGGTTACA G G ACCGGGTGACCAT GACT CG CGATACCT CCACCAGCACT GT CT ACAT GGAACT GAGCT CTCTG CG CT CT G AGG AC ACTGCT GT GT ATT ACT GT GCC 30 T CCCTTT AT AGT CT CCCT GT CT ACT GGGGCCAGGGT ACCACT GTT ACCG TGTCCTCT

Seqüência de nucleotídeos da região variável de cadeia leve de 9TL (SEQ ID NO: 10)

GAT GTTGT GAT GACCCAGT CCCCACT GT CTTTGCCAGTT ACCCTGGGAC AACCAG CCT CCAT AT CTT GCAAGT CAAGT CAGAG CCT CTT AT AT AGT GAT GCCAAGACAT ATTT GAATT GGTT CCAACAGAGGCCTGGCCAGT CT CCAC 5 GCCGCCTAATCTATCAGATTTCCCGGCTGGACCCTGGCGTGCCTGACA G G TT CAG TG G C AGTG G ATC AG GC A CAG ATTTT ACACTTAAAAT CAG CAG AGTGGAGGCTGAAGATGTGG GAGTTTATT ACTG CTT ACAAG GTACACAT TATCCGGTGCTCTTCGGTCAAGGGACCCGCCTGGAGATCAAACGCACT Seqüência de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo 9TL completo 10 (incluindo lqG2a modificada como aqui descrito) (SEQ ID NO:11)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYYTEAYYIHWVRQAPGQGLEWMG RIDPATGNTKYAPRLQDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCASLY SLPVYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNV 15 DHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLT VVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 20 Seqüência de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo 9TL completo (SEQ ID NO: 12)

DWMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDAKTYLNWFQQRPGQSPR RLIYQISRLDPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGTHYPVL FGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGEC

Seqüência de nucleotídeos da cadeia pesada do anticorpo 9TL completo (incluindo lqG2a modificada como aqui descrito) (SEQ ID NQ:13) CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGTGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCT TCCGTGAAGGTTTCCTGCAAAGCATCTGGTTACTATACGGAGGCTTACT ATATCCACTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGTCAAGGCCTGGAGTGGATGG GCAGGATTGATCCTGCGACTGGTAATACTAAATATGCCCCGAGGTTACA GG ACCGGGT GACCAT GACT CGCGAT ACCT CCACCAGCACT GT CT ACAT GGAACT GAGCT CTCTGCGCT CT G AGGACACT GCT GT GT ATTACT GTGCC TCCCTTTATAGTCTCCCTGTCTACTGGGGCCAGGGTACCACTGTTACCG TGTCCT CTGCCT CCACCAAGGGCCCAT CT GT CTT CCCACTGGCCCCAT G 5 CTCCCGCAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCA AGGACTACTTCCCAGAACCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCTCT GACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCCTCAGGTCT CT ACT CCCT CAGCAGCGT GGTG ACCGT GCCAT CCAG CAACTT CG GCAC CCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCAAGCAACACCAAGGT 10 CG ACAAGACCGT GGAGAG AAAGT GTT GT GT GGAGT GTCCACCTT GT CC AGCCCCTCCAGTGGCCGGACCATCCGTGTTCCTGTTCCCTCCAAAGCC AAAGGACACCCT GAT GAT CT CCAG AACCCCAGAGGT GACCT GT GT GGT GGT GGACGT GT CCCACG AGG ACCCAG AGGT GCAGTTCAACT GGT AT GT GGACGGAGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCAAGAGAGGAGC 15 AGTTCAACTCCACCTTCAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGGTGCACC AGGACTGGCTGAACGGAAAGGAGTATAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGG GACTGCCATCCAGCATCGAGAAGACCATCTCCAAGACCAAGGGACAGC CAAGAGAGCCACAGGTGTATACCCTGCCCCCATCCAGAGAGGAGATGA CCAAG AACCAGGT GT CCCT GACCT GTCT GGT G AAGGGATT CT AT CCATC 20 CGACAT CGCCGTGGAGT GGGAGT CCAACGGACAGCCAGAGAACAACT A TAAGACCACCCCTCCAATGCTGGACTCCGACGGATCCTTCTTCCTGTAT T CCAAGCT GACCGTGGACAAGT CCAGAT GGCAGCAGGGAAACGT GTT C T CTT GTT CCGT GAT GCACGAGGCCCT G CACAACCACTAT ACCCAG AAGA GCCTGTCCCTGTCTCCAGGAAAGTAATTCTAGA 25 Seqüência de nucleotídeos da cadeia leve do anticorpo 9TL completo (SEQ ID NO: 14)

GAT GTT GT GAT GACCCAGT CCCCACT GT CTTT GCCAGTT ACCCT GGGAC AACCAG CCT CCAT AT CTT G CAAGT CAAGT CAG AG CCT CTTAT AT AGTGAT GCCAAGACATATTT GAATTGGTT CCAACAGAGGCCTGGCCAGT CT CCAC 30 GCCGCCTAATCTATCAGATTTCCCGGCTGGACCCTGGCGTGCCTGACA G G TT CAGT G G C AGTG G AT CAG G CAC AG ATTTT ACACTT AAAAT CAG CAG AGTGG AGGCT GAAGAT GTGGG AGTTT ATT ACT GCTT ACAAGGT ACACAT TATCCGGTGCT CTT CG GTCAAG G G ACCCGCCT G G AG AT CAAACG CACT GTGGCT GCACCAT CT GT CTT CAT CTT CCCT CCAT CT GAT G AGCAGTT GA AATCCGG AACT GCCT CT GTT GT GTGCCTGCT GAAT AACTT CT AT CCACG CGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCGGTAA 5 CTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAG CCTCAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAA AGT CT ACGCCT GCGAAGTCACCCAT CAGGGCCT GAGTT CT CCAGT CAC AAAGAGCTTCAACCGCGGTGAGTGCTAATTCTAG Seqüência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 6G (SEQ 10 ID NO:26)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYAIHWVRQ

APGQGLEWMGFTSPYSGVSNYNQKFKGRVTMTRDTSTST

VYMELSSLRSEDTAVYYCARFDNYDRGYVRDYWGQGTLV

TVS

Seqüência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de 6G (SEQ ID NQ:27)

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNDRISFLNW YQQKPGQPPKLLIYAATKQGTGVPDRFSGSGSGTDFTLT ISSLQAEDVAVYYCQQSKEFPWSFGGGTKVEIKRTV CDR H1 de 6G (CDR estendida) (SEQ ID NO:28)

GYTFTTYAIH

CDR H2 de 6G (CDR estendida) (SEQ ID NO:29)

FTSPYSGVSNYNQKFKG

CDR H3 de 6G (CDR estendida) (SEQ ID NQ:30)

FDNYDRGYVRDY

CDR L1 de 6G (CDR estendida) (SEQ ID NO:31)

RASESVDNDRISFLN

CDR L2 de 6G (CDR estendida) (SEQ ID NO:32)

AATKQGT

CDR L3 de 6G (CDR estendida) (SEQ ID NO:33)

QQSKEFPWS

Seqüência de nucleotídeos da cadeia pesada de 6G (SEQ ID NO:34) CAGGTGCAACTGGTGCAATCCGGTGCCGAGGTGAAAAAGCCAGGCGC CTCCGT GAAAGT GT CCT G CAAAG CCT CCGGTT ACACCTTT ACCACCT AT GCCATCCATTGGGTGCGCCAGGCCCCAGGCCAGGGTCTGGAGTGGAT GGGCTTTACTTCCCCCTACTCCGGGGTGTCGAATTACAATCAGAAGTTC 5 AAAGGCCGCGTCACCATGACCCGCGACACCTCCACCTCCACAGTGTAT ATGG AGCT GT CCT CT CT GCGCT CCGAAGACACCGCCGT GT ATT ACT GT G CCCGCTTCGACAATTACGATCGCGGCTATGTGCGTGACTATTGGGGCC AGGGCACCCTGGTCACCGTCTCC

Seqüência de nucleotídeos da cadeia leve de 6G (SEQ ID NO:35)

GACAT CGT GAT GACCCAGTCCCCAG ACT CCCTGGCCGT GT CCCT GGGC GAGCGCGCCACCATCAACTGCCGCGCCAGCGAATCCGTGGATAACGAT CGTATTTCCTTTCTGAACTGGTACCAGCAGAAACCAGGCCAGCCTCCTA AGCTGCT CATTT ACGCCGCCACCAAACAGGGT ACCGGCGT GCCT GACC GCTT CT CCGGCAGCGGTT CCGGCACCGATTT CACT CT GACCAT CT CCT C 15 CCTGCAGGCCGAAGAT GTGGCAGT GT ATT ACT GT CAGCAGT CCAAAGA GTTT CCCT GGT CCTTTGGCGGT GGCACCAAGGT GGAGAT CAAACGCAC TGTG

Seqüência de aminoácidos da cadeia pesada do anticorpo 6G completo (incluindo lqG2a modificada como aqui descrito) (SEQ ID NO:36)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYAIHWVRQAPGQGLEWMG FTSPYSGVSNYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTA VYYCARF DNYDRGYVRDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGT QTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKD 25 TLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNST FRVVSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYT LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Seqüência de aminoácidos da cadeia leve do anticorpo 6G completo (SEQ 30 ID NO:37)

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNDRISFLNWYQQKPGQPPKLLI

YAATKQGTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEFPWSF GGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTHQ GLSSPVTKSFNRGEC

Seqüência de nucleotídeos da cadeia pesada do anticorpo 6G completo (in5 cluindo lgG2a modificada como aqui descrito (SEQ ID NO:38)

CAGGTGCAACTGGTGCAATCCGGTGCCGAGGTGAAAAAGCCAGGCGC CT CCGT GAAAGT GT CCT GCAAAGCCT CCG GTTACACCTTT ACCACCT AT GCCATCCATTGGGTGCGCCAGGCCCCAGGCCAGGGTCTGGAGTGGAT GGG CTTTACTT CCCCCT ACT CCGGGGTGT CGAATT ACAAT C AG AAGTT C 10 AAAGGCCGCGTCACCATGACCCGCGACACCTCCACCTCCACAGTGTAT ATGGAGCTGTCCTCTCTGCGCTCCGAAGACACCGCCGTGTATTACTGTG CCCGCTTCGACAATTACGATCGCGGCTATGTGCGTGACTATTGGGGCC AGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCTG T CTT CCCACTGGCCCCATGCT CCCGCAGCACCT CCGAGAGCACAGCCG 15 CCCT GGGCT GCCTGGT CAAGG ACT ACTT CCCAG AACCT GT GACCGT GT CCTGGAACT CT GGCGCT CT GACCAGCGGCGT GCACACCTTCCCAGCT G TCCTGCAGTCCTCAGGTCTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGC CAT CCAGCAACTTCGGCACCCAG ACCT ACACCT GCAACGT AGAT CACAA GCCAAGCAACACCAAGGTCGACAAGACCGTGGAGAGAAAGTGTTGTGT 20 GGAGTGTCCACCTTGTCCAGCCCCTCCAGTGGCCGGACCATCCGTGTT CCT GTT CCCT CCAAAGCCAAAGGACACCCT GAT GAT CT CCAGAACCCCA GAGGT GACCT GT GTGGT GGT GGACGT GT CCCACGAGGACCCAGAGGT GCAGTTCAACTGGTATGTGGACGGAGTGGAGGTGCACAACGCCAAGAC CAAGCCAAGAGAGGAGCAGTTCAACTCCACCTTCAGAGTGGTGAGCGT 25 GCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGAAAGGAGTATAAGTG T AAGGT GT CCAACAAGGG ACTGCCAT CCAGCAT CGAG AAG ACCAT CT C CAAGACCAAGGGACAGCCAAGAGAGCCACAGGTGTATACCCTGCCCCC AT CCAGAGAGGAGAT G ACCAAGAACCAGGT GT CCCT GACCT GT CT GGT G AAGGG ATT CT AT CCAT CCG ACAT CGCCGT GGAGT GGGAGT CCAACGG 30 ACAGCCAGAGAACAACTATAAGACCACCCCTCCAATGCTGGACTCCGAC GGATCCTTCTTCCTGTATTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGATGGC AGCAGGGAAACGTGTTCTCTTGTTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACA ACCACT AT ACCCAGAAG AGCCT GT CCCT GT CT CCAGGAAAG Seqüência de nucleotídeos da cadeia leve do anticorpo 6G completo 6G (SEQ ID N0.39)

GACAT CGT GAT GACCCAGT CCCCAGACT CCCT GGCCGT GT CCCT GGGC G AGCGCGCCACCAT CAACT GCCGCGCCAGCGAAT CCGT GGAT AACGAT CGT ATTT CCTTT CT GAACT GGT ACCAGCAG AAACCAGGCCAGCCT CCT A AGCTGCT CATTT ACGCCGCCACCAAACAGGGT ACCGGCGTGCCT GACC GCTT CT CCGGCAGCGGTT CCGGCACCG ATTTCACT CT GACCAT CTCCT C CCT GC AGGCCG AAG AT GT GGCAGT GT ATT ACT GT CAGCAGT CCAAAG A GTTTCCCT GGT CCTTT GGCGGT GGCACCAAGGT GGAGAT CAAACGCAC TGTG G CT GCACCAT CTGT CTT CAT CTT CCCT CCAT CT GAT G AGCAGTT G AAATCCGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCAC GCGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCGGTA ACT CCCAGGAGAGT GT C ACAG AGCAGGACAGCAAGGACAGCACCT ACA GCCTCAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACA AAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGTTCTCCAGTCA CAAAGAGCTTCAACCGCGGTGAGTGC

Seqüência de aminoácidos da cadeia pesada de m7G10 (SEQ ID NQ:40) EVKLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSTYAMSWIRQTPEKRLEWVASI G

NSSRTYYPDSVKGRFTISRDNAGSILYLQMSSLRSEDTAIYYCARGEDGNY

AWFT

YWGQGTQVTVS

Seqüência de aminoácidos da cadeia pesada de m7G10 (SEQ ID NO:41)

DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSVKNNLHWYQQKSHESPRLLIKYT FQS

MSGIPSRFSGSGSGTDFTLIINSVETEDFGMYFCQQSNRWPLTFGAGTKLE

L

Seqüência de aminoácidos da CDR H1 de m7G10 (SEQ ID NO:42)

TYAMS

Seqüência de aminoácidos da CDR H2 de m7G10 (SEQ ID NQ:43)

SIGNSSRTYYPDSVKG Seqüência de aminoácidos da CDR H3 de m7G10 (SEQ ID NO:44) GEDGNYAWFTY

Seqüência de aminoácidos de L1 (SEQ ID NO:45)

RASQSVKNNLH 5 Seqüência de aminoácidos de L2 de m7G10 (SEQ ID NO:46)

YTFQSMS

Seqüência de aminoácidos de L3 de m7G10 L3 (SEQ ID NO:47) QQSNRWPLT

Seqüência de nucleotídeos da cadeia pesada de m7G10HC (SEQ ID NO:48) 10 GAAGT GAAGCT GGTGGAGTCTGGGGGAGACTTAGT GAAGCCT GGAGG GTCCCT GAAACT CTCCTGTGCAG CCTCTG GATT CACTTT CAGTACCT AT GCCAT GT CTT GGATT CGCCAGACT CCAGAGAAGAGGCTGGAGT GGGTC G CCT CCATT GGT AAT AGT AGT AGG ACTTACTAT CCAG ACAGTGT GAAGG GCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCCGGGAGCATCCTGTACCTCCA 15 AAT GAG CAGT CT GAGGT CT G AGG ACACGGCC ATTT ATT ATT GT GCAAGA GGGGAAGATGGTAACTACGCCTGGTTTACTTACTGGGGCCAAGGGACT CAGGTCACCGTCTCC

Seqüência de nucleotídeos da cadeia leve de m7G10HC (SEQ ID NQ:49) GAT ATT GT GCT AACTCAGT CT CCAGCCACCCT GT CT GT GACT CCAGG AG 20 ATAGCGTCAGTCTTTCCTGCAGGGCCAGCCAAAGTGTTAAGAACAACCT ACACTGGTAT CAACAAAAGT CACAT GAGT CT CCAAGGCTT CT CAT CAAG T AT ACTTT CCAGT CCAT GTCTG G GAT CCCCT CCAG GTT CAGTG G CAGTG GCT CAGGG ACAG ATTT CACT CT CATT AT CAACAGT GT G GAGACT GAAGA TTTTGG AAT GTATTT CTGT CAACAGAGT AACCGTTGGCCGCT CACGTT C 25 GGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTG

Claims (15)

1. Método para tratar um indivíduo que sofre de uma doença oftálmica, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um inibidor de peptídeo β-amiloide (Αβ).

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o anticorpo se liga especificamente ao peptídeo Αβ selecionado do grupo que consiste em Αβι_36ι Αβ-ι-37, Αβι-38, Αβ-ι-39, Αβ-Μο, Αβι-42, e Αβι-43.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o anticorpo se liga especificamente a um epitopo sobre Αβ^ο.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o anticorpo também se liga especificamente a um epitopo sobre Αβ-ι-42.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a doença é uma degeneração macular relacionada a idade.

6. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o anticorpo se liga ao peptídeo Αβ com uma K0 de cerca de 100 nM ou menos.

7. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o anticorpo se liga ao peptídeo Αβι.40 com uma Kd de cerca de 100 nM ou menos.

8. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o anticorpo se liga ao peptídeo Αβι.42 com uma Kd de cerca de 100 nM ou menos.

9. Método de acordo com a reivindicação 2, em que 0 anticorpo se liga a terminação C do peptídeo Αβ.

10. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o anticorpo se liga a um epitopo sobre Αβ^ο que inclui os aminoácidos de 25 a 34 e 40.

11. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o anticorpo se liga a Αβ-ι-40 com uma afinidade maior do que sua ligação a Αβ^ e Αβι.43 e em que o anticorpo não é o anticorpo 2294.

12. Método de acordo com a reivindicação 2, em que a região Fc do anticorpo não é N-glicosilada ou tem uma padrão de N-glicosilação que está alterado em relação à região Fc nativa.

13. Anticorpo de acordo com a reivindicação 2, em que 0 anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende três CDRs da região variável de cadeia pesada do anticorpo 6G mostradas na SEQ ID N0 26 e uma região variável de cadeia leve que compreende três CDRs da região variável leve de 6G mostradas na SEQ ID N0 27.

14. Anticorpo como definido na reivindicação 2, em que o anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada que compreende a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N0 26 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N0 27.

15. Método para tratar um indivíduo que sofre de degeneração macular relacionada à idade, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo, em que o anticorpo se liga especificamente a um epitopo sobre Αβι.40 e Αβι-42.