KR101259225B1

KR101259225B1 - 안 질환의 치료를 위한 약학 조성물

Info

Publication number: KR101259225B1
Application number: KR1020097021056A
Authority: KR
Inventors: 치아-양 린
Original assignee: 리나트 뉴로사이언스 코프.
Priority date: 2007-03-09
Filing date: 2008-03-06
Publication date: 2013-04-30
Also published as: CA2680222A1; CN101687922B; TWI449535B; JP2009062358A; MX2009009636A; CA2680222C; CN101687922A; NZ579273A; RU2009133789A; KR20090119990A; EP2134751A2; WO2008110885A3; IL200528A0; BRPI0808711A2; WO2008110885A2; AU2008224600B2; AU2008224600A1; TW200900079A; CN104027803A; US20090022728A1

Abstract

본 발명은 연령-관련 황반 변성(AMD)과 같은 안 질환의 치료를 위한, β-아밀로이드에 대해 유도된 억제제(단일클론 항체를 포함함)를 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

안 질환의 치료를 위한 약학 조성물{PHAMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR TREATING OPHTHALMIC DISEASES}

본 발명은 안 질환, 예컨대, 연령-관련 황반 변성(AMD)뿐만 아니라 다른 안구 병증, 예컨대, 녹내장, 당뇨성 망막병증(당뇨성 황반 부종을 포함함), 맥락막 신생혈관막(CNV), 포도막염, 근시 변성, 안구 종양, 중심 망막 정맥 폐쇄, 피부홍조, 안구 혈관신생, 중심 장액 망막병증, 안구 표면 원판, 예컨대, 안구 건조증, 중심 망막 동맥 폐쇄, 낭포 황반 부종 및 임의의 다른 망막 변성 질환의 치료 및/또는 예방에 있어서 β-아밀로이드(Aβ) 펩티드에 대한 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다.

본원은 2007년 3월 9일자로 출원된 미국 가출원 제60/894,181호를 우선권 주장하면서 2008년 3월 3일자로 출원된 미국 특허출원 제12/041,581호를 우선권 주장한다(상기 특허출원들의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 도입됨).

미국에서 65세 이상의 개체들에서 감소된 최적-교정 시력의 가장 공통적인 원인은 AMD로도 공지되어 있는 망막 장애이다. AMD는 진행됨에 따라 예리한 중추 시력이 상실됨을 특징으로 한다. AMD에 의해 영향을 받은 안구의 영역은 망막의 중심에 있으며 주로 광수용체 세포로 구성된 작은 영역인 황반이다. AMD 환자의 약 85 내지 90%를 차지하는 소위 "건성(dry)" AMD("지도형 위축"으로도 지칭됨)는 안구 색소 분포의 변화, 광수용체의 상실, 및 세포의 전체적인 위축으로 인해 감소된 망막 기능을 수반한다. 소위 "습성(wet)" AMD는 망막하(sub-retinal) 공간에서의 응괴 또는 반흔을 초래하는 비정상적인 맥락막 혈관의 증식을 수반한다. 따라서, 습성 AMD의 발병은 신경 망막하에서의 비정상적인 맥락막 혈관신생 네트워크의 형성(맥락막 혈관신생, CNV)으로 인해 일어난다. 새로이 형성된 혈관은 누출이 과도하게 일어난다. 이것은 시력의 상실을 초래하는 망막하 유체 및 혈액의 축적을 야기한다. 결과적으로, 맥락막 및 망막을 수반하는 큰 원반 형태의 반흔이 형성됨에 따라 관련된 영역에서의 기능적 망막이 완전히 상실된다. 건성 AMD 환자들은 감소한 시력을 보유할 수 있지만, 습성 AMD 환자들은 종종 실명한다. (문헌(Hamdi & Kenney, Age-related Macular degeneration - a new viewpoint, Frontiers in Bioscience, e305-314, May 2003) 참조). CNV는 습성 AMD에서뿐만 아니라, 다른 안구 병증, 예컨대, 녹내장, 당뇨성 망막병증(당뇨성 황반 부종을 포함함), 브루크 막 파열, 근시 변성, 안구 종양 및 다른 관련된 망막 변성 질환에서도 일어난다.

AMD는 유전적 인자 및 환경적 인자가 그의 발병 및 진행에 관여하므로 그의 발병기전이 명백히 다인성을 나타내는 일반적인 장애이다. 수행된 다양한 연구들은 AMD에 대한 여러 위험 인자들을 확인하였다: 예컨대, 흡연, 노화, 가족력(Milton, Am J Ophthalmol 88, 269 (1979); Mitchell et al., Ophthalmology 102, 1450-1460 (1995); Smith et al., Ophthalmology 108, 697-704 (2001)), 성 별(여성에서 발병률이 7배 더 높음: Klein et al., Ophthalmology 99, 933-943 (1992)) 및 인종(백인이 가장 민감함). 추가 위험 인자는 안구 특징, 예컨대, 원시 및 광-착색된 안구, 및 심혈관 질환 및 고혈압을 포함할 수 있다. 유전적 인자가 AMD의 발병 진행에 관여한다는 증거도 보고되어 있다(상기 함디(Hamdi) 및 켄네이(Kenney)의 문헌 참조).

현재, AMD를 연구하기 위한 일반적으로 허용되는 동물 모델은 없다. 말레크(Malek) 등에 의한 초기 연구(PNAS 102, 11900-5 (2005))는 조합된 경우 인간 AMD의 형태학적 특징에 근접하는 3가지 위험 인자들을 갖는 동물 모델을 생산하였다. 중요한 것은 이 마우스 모델의 개발이 AMD에 대한 새로운 분자 기작 및 치료 표적을 시험하는 기회를 제공하였다는 점이다. 안 질환, 예컨대, AMD(건성 AMD 및 습성 AMD 둘다), 녹내장, 당뇨성 망막병증(당뇨성 황반 부종을 포함함), CNV, 포도막염, 근시 변성, 안구 종양, 중심 망막 정맥 폐쇄, 피부홍조, 안구 혈관신생, 중심 장액 망막병증, 안구 표면 원반, 예컨대, 안구 건조증, 중심 망막 동맥 폐쇄, 낭포 황반 부종 및 다른 망막 변성 질환을 치료하고/하거나 예방할 수 있는 신규 표적 및 치료제를 찾을 필요가 있다.

도 1은 항체 9TL의 중쇄 가변 영역(서열번호 1) 및 경쇄 가변 영역(서열번호 2)의 아미노산 서열을 보여준다. 카바트(Kabat) CDR은 진하게 표시되어 있고, 초티아(Chothia) CDR은 밑줄로 표시되어 있다. 상기 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역에 대한 아미노산 잔기는 순차적으로 넘버링되어 있다.

도 2는 펩티드 경쟁에 의한 항체 9TL의 에피토프 맵핑을 보여준다. Aβ_1-40 펩티드를 스트렙타비딘-코팅된 칩(SA 칩) 상에 고정시켰다. 단일클론 항체 2289 및 9TL Fab 단편(각각 50 nM)을 10 μM의 다양한 펩티드(Aβ의 아미노산 28-40, 1 -40, 1-28, 28-42, 22-35, 1-16, 1-43, 33-40, 1-38 또는 17-40)와 1시간 동안 각각 예비항온처리하거나 펩티드와 예비항온처리하지 않은 다음, 상기 칩 상에 유동시켰다. 고정된 Aβ_1-40 펩티드와 항체 Fab 단편의 결합을 측정하였다.

도 3은 펩티드 경쟁에 의한 항체 2H6의 에피토프 맵핑을 보여주는 그래프이다. Aβ_1-40 펩티드를 SA 칩 상에 고정시켰다. 단일클론 항체 2289, 2286 또는 2H6(각각 100 nM)을 16 μM의 다양한 펩티드(Aβ의 아미노산 1-16, 1-28, 1-38, 1-40, 1-42, 1-43, 17-40, 17-42, 22-35, 25-35 또는 33-40)와 1시간 동안 각각 예비항온처리하거나 펩티드와 예비항온처리하지 않은 다음, 상기 칩 상에 유동시켰다. 고정된 Aβ_1-40 펩티드와 상기 항체의 결합을 측정하였다.

도 4는 항체 2H6, 2286 및 2289와 다양한 Aβ 펩티드 C-말단 변이체의 결합을 보여주는 그래프이다. GST-Aβ 변이체(M35A, V36A, G37A, G38A, V39A 또는 V40A), 또는 GST-Aβ 펩티드 1-39, 1-41, 1-40 또는 1-42를 ELISA 플레이트 상에 고정시켰다. 단일클론 항체 2286, 2H6 또는 2289(각각 0.3 nM mAB)를 고정된 펩티드 각각과 함께 항온처리하고, 이들의 결합은 바이오티닐화된 항-마우스 IgG(H+L)와 함께 추가로 항온처리하고 스트렙타비딘-HRP와 함께 추가로 항온처리함으로써 검출하였다.

도 5는 정상적인 음식 대 고지방 및 고콜레스테롤 음식("HFC")을 섭취한 고령의 아포지단백질 아이소폼(isoform) E4(APOE4) 마우스로부터 얻은 a- 및 b-파의 강도(A) 및 샘플 망막전위도(electroretinogram; ERG)(B)를 보여주는 그래프이다.

도 6은 정상적인 음식을 섭취한 동물의 선행 연구에 대해 작도된 APOE4 마우스의 b-파만의 강도를 보여주는 그래프이다. R2 추적은 AMD-유사 마우스(E4-HFC-R2)가 항-Aβ 항체로 처리된 경우 망막 기능이 보호 또는 회복됨을 보여준다.

도 7은 AMD-유사(APOE4) 마우스 뇌의 총 Aβ 면역조직화학을 보여준다. 슬라이드 A(항-Aβ 항체로 처리된 AMD-유사 마우스)는 음성 아밀로이드 검출을 보여준다. 슬라이드 B, C 및 D(비히클 주사로 처리된 AMD-유사 마우스)는 양성 아밀로이드 검출을 보여준다. 슬라이드 E는 양성 대조군으로부터 얻은 것이고, 혈소판-유래의 아밀로이드 전구체 단백질(APP) 마우스 모델의 뇌[pdAPP; 혈소판-유래의 성장 인자 프로모터의 조절 하에 있는 돌연변이된(V717F) 인간 APP(Games, D. et al, Nature 373: 523-527 (1995))]로부터 얻은 것이다.

도 8은 항체 6G의 중쇄 가변 영역(서열번호 1) 및 경쇄 가변 영역(서열번호 27)의 아미노산 서열을 보여준다. 카바트 CDR은 진하게 표시되어 있고, 초티아 CDR은 밑줄로 표시되어 있다. 상기 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역에 대한 아미노산 잔기는 순차적으로 넘버링되어 있다.

도 9는 ELISA에 의한 항체 6G의 에피토프 맵핑을 보여준다. Aβ 펩티드(1-16, 1-28, 17-40, 17-42, 22-35, 28-40, 28-42, 1-38, 1-40, 1-42, 1-43 및 33-40) 를 ELISA 플레이트 상에 고정시켰다. 단일클론 항체 6G(20 nM)를 다양한 고정된 펩티드와 함께 1시간 동안 항온처리하였다. 고정된 Aβ 펩티드에 결합된 항체 6G는 염소 항-인간 카파 HRP에 접합된 2차 항체를 사용하여 측정하였다.

도 10은 ELISA에 의한 항체 6G의 에피토프 맵핑을 보여준다. 다양한 Aβ 펩티드를 ELISA 플레이트 상에 고정시켰다. 항체 6G를 다양한 고정된 펩티드와 함께 1시간 동안 항온처리하였다. 고정된 Aβ 펩티드에 결합된 항체 6G는 염소 항-인간 카파 HRP에 접합된 2차 항체를 사용하여 측정하였다. "NB"는 검출된 결합이 없음을 의미한다.

도 11은 항체 6G가 Aβ 상에 결합하는 에피토프를 보여주는 개략적인 그래프이다. 세포막 내에 있는 APP 및 APP의 일부 내에서의 Aβ의 상대적인 위치가 표시되어 있다. "CT99"는 APP의 C-말단 99개 아미노산을 의미한다.

도 12는 Aβ_1-16(m2324) 및 항체 6G에 대한 단일클론 항체와 APP 발현 세포의 면역염색을 보여주는 사진이다. 상부 패널은 세포를 m2324 또는 6G(각각 5 ㎍/㎖)와 함께 항온처리하고 2차 Cy3-접합된 염소 항-마우스 또는 항-인간 항체로 결합을 검출한 후 형광 현미경 하에서 관찰한 세포를 보여준다. 하부 패널은 현미경 하에서 관찰한 세포를 보여준다.

도 13은 5가지 APOE4 마우스 연구 군, 즉 정상적인 음식을 섭취한 대조군 APOE4 마우스; HFC를 섭취한 대조군 APOE4 마우스(AMD-유사 모델); 항체 7G10으로 처리된 APOE4-HFC 마우스; 항체 2H6으로 처리된 APOE4-HFC 마우스; 및 항체 6G로 처리된 APOE4-HFC 마우스의 b-파만의 강도를 보여주는 그래프이다.

도 14는 3가지 APOE4 마우스 연구 군, 즉 정상적인 음식을 섭취한 대조군 APOE4 마우스; 대조군 APOE4-HFC 마우스; 및 항체 6G로 처리된 APOE4-HFC 마우스의 b-파만의 강도를 보여주는 그래프이다.

발명의 개요

본 발명은 안 질환의 발병기전에 관여하는 신규 치료 표적을 개시한다. 구체적으로, 본 발명은 유효량의 Aβ 펩티드 억제제를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 안 질환의 치료 방법을 개시한다. Aβ 펩티드 억제제는 안 질환, 예컨대, AMD(건성 AMD 및 습성 AMD 둘다), 녹내장, 당뇨성 망막병증(당뇨성 황반 부종을 포함함), CNV, 포도막염, 근시 변성, 안구 종양, 중심 망막 정맥 폐쇄, 피부홍조, 안구 혈관신생, 중심 장액 망막병증, 안구 표면 원반, 예컨대, 안구 건조증, 중심 망막 동맥 폐쇄, 낭포 황반 부종 및 다른 망막 변성 질환을 앓는 개체에게 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 억제제는 항체, 안티센스 분자, siRNA 분자, 라이보자임 또는 소분자 화합물이다.

한 실시양태에서, 본 발명은 치료 유효량의 Aβ 펩티드 억제제를 포함하는 약학 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, AMD를 앓는 개체의 치료 방법을 제공한다. 본 발명의 또 다른 실시양태는 치료 유효량의 Aβ 억제제를 포함하는 약학 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, AMD를 앓는 개체의 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 추가 실시양태는 AMD를 앓는 환자에서 회복을 촉진하기 위한 약제의 제조를 위한 치료 유효량의 Aβ 억제제의 용도를 제공한다. 이 실시양태의 한 측면에서, 항체는 손상된 이펙터(effector) 기능을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이 실시양태의 추가 측면에서, 질환은 건성 AMD 및 습성 AMD 둘다를 포함하는 AMD이다.

또한, 본 발명은 Aβ 펩티드 또는 이 펩티드의 응집된 형태에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 유효량의 약학 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, Aβ의 아밀로이드 축적과 관련된 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 이 실시양태의 추가 측면에서, 항체는 이펙터 기능을 손상시키는, 천연 발생 Fc 영역으로부터의 변이를 갖는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체의 투여는 변이가 없는 항체의 투여보다 덜한 뇌 미세출혈을 야기한다.

본 발명의 방법에서 사용되는 항체 및 폴리펩티드는 Aβ 펩티드 또는 이의 응집된 형태에 특이적으로 결합한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 손상된 이펙터 기능을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 F(ab')₂ 단편이 아니다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 Fab 단편이 아니다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 폴리펩티드는 단일쇄 항체 scFv가 아니다.

Aβ 펩티드 또는 이 펩티드의 응집된 형태에 특이적으로 결합하고 손상된 이펙터 기능을 갖는 중쇄 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드 또한 본 명세서에 기재된 임의의 방법에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 항체 9TL, 6G 또는 이들의 변이체(표 3 또는 8에 나타냄)로부터 유래된 서열(예를 들어, 1개 이상의 CDR)을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 손상된 이펙터 기능을 갖는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 불변 영역은 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 영역 내의 N-글리코실화는 제거되어 있다. 일부 실시양태에서, Fc 영역은 N-글리코실화 인식 서열 내에 하나의 돌연변이를 포함하고, 이에 따라 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드의 Fc 영역은 N-글리코실화되어 있지 않다. 일부 실시양태에서, Fc 영역은 PEG화되어 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 폴리펩티드의 중쇄 불변 영역은 A330P331로부터 S330S331로의 돌연변이(야생형 IgG2a 서열을 기준으로 하여 넘버링된 아미노산)를 포함하는 인간 중쇄 IgG2a 불변 영역이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 E233F234L235로부터 P233V234A235로의 돌연변이를 포함하는 IgG4의 불변 영역을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ 펩티드의 잔기 1-16에 위치한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ 펩티드의 N-말단에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ 펩티드의 잔기 16-28에 위치한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 Aβ 펩티드의 C-말단 상의 에피토프, 예컨대, 아미노산 25 또는 그 다음의 아미노산으로 시작되는 에피토프에 특이적으로 결합한다. 본 발명의 항체는 Aβ 펩티드 1-37, 1-38, 1-39, 1-40, 1-41, 1-42 및 1-43 중 임의의 펩티드에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 C-말단이 절단된(truncated) Aβ 펩티드, 예를 들어, Aβ_1-37 펩티드, Aβ_1-38 펩티드, Aβ_1-39 펩티드, Aβ_1-40 펩티드, Aβ_1-41 펩티드, Aβ_1-42 펩티드 또는 Aβ_1-43 펩티드의 자유 C-말단 아미노산에 특이적으로 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ_1-40 펩티드 상의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 이 실시양태의 추가 측면에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ_1-42 펩티드 상의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 이 실시양태의 또 다른 추가 측면에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ_1-43 펩티드 상의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ_1-40 펩티드의 잔기 28-40에 위치한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ_1-42 펩티드의 잔기 28-42에 위치한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ_1-43 펩티드의 잔기 28-43에 위치한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 전장 APP에 결합하지 않으면서 Aβ 펩티드에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ의 가용성 형태에 결합하지 않으면서 Aβ의 응집된 형태에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ의 응집된 형태에 결합하지 않으면서 Aβ의 가용성 형태에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ의 응집된 형태 및 Aβ의 가용성 형태 둘다에 특이적으로 결합한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ_1-40 펩티드의 C-말단 펩티드 33-40에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 아미노산 35-40을 포함하는 Aβ_1-40 펩티드 상의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 아미노산 36-40을 포함하는 Aβ_1-40 펩티드 상의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 아미노산 39 및/또는 40을 포함하는 Aβ_1-40 펩티드 상의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ_1-40 펩티드에 특이적으로 결합하지만 Aβ_1-42 펩티드 및/또는 Aβ_1-43 펩티드에는 특이적으로 결합하지 못한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 항체 9TL의 가변 영역 또는 본원에 기재된, 항체 9TL로부터 유래된 항체의 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 항체 9TL, 항체 6G, 및/또는 항체 9TL 또는 항체 6G로부터 유래된 항체 또는 폴리펩티드가 Aβ 펩티드 각각에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ_1-42 펩티드 및 Aβ_1-43 펩티드에 결합하는 것보다 더 높은 친화성으로 Aβ_1-40 펩티드에 결합한다. 이 실시양태의 추가 측면에서, 본 발명의 항체는 항체 2294가 아니다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 아미노산 25-34 및 40을 포함하는 Aβ_1-40 펩티드 상의 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 항체 6G의 가변 영역 또는 본원에 기재된, 항체 6G로부터 유래된 항체의 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 항체 6G, 및/또는 항체 6G로부터 유래된 항체 또는 폴리펩티드가 Aβ에 결합하는 것을 경쟁적으로 억제한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 약 100 nM 이하, 20 nM 이하 또는 2 nM 이하의 결합 친화성(K_D)으로 Aβ 펩티드에 결합한다. 이 실시양태의 한 측면에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 약 100 nM 이하, 50 nM 이하 또는 2 nM 이하의 K_D로 Aβ_1-40 펩티드에 결합한다. 이 실시양태의 추가 측면에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 약 100 nM 이하, 50 nM 이하 또는 2 nM 이하의 K_D로 Aβ_1-42 펩티드에도 결합한다.

Aβ 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 폴리펩티드는 정맥내, 피하, 흡입, 동맥내, 근육내, 심장내, 심실내, 비경구, 수막강내 및 복막내를 비롯한, 당업계에 공지된 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다. 투여는 주사 및/또는 전신, 예를 들어, 정맥내 또는 국소 경로에 의해 이루어질 수 있다. 이것은 본 발명의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드에도 일반적으로 적용된다.

또한, 본 발명은 Aβ 펩티드 또는 이 펩티드의 응집된 형태에 특이적으로 결합하고 손상된 이펙터 기능을 갖는 임의의 항체 또는 폴리펩티드 유효량, 또는 상기 항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 유효량, 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물을 투여함으로써 안 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 Aβ 펩티드 또는 이 펩티드의 응집된 형태에 특이적으로 결합하는 임의의 항체 또는 폴리펩티드 유효량, 또는 상기 항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 유효량을 포함하는 하나 이상의 임의의 조성물을 포함하는 키트 및 조성물도 제공한다. 일반적으로 적절한 설명서와 함께 적절하게 포장되어 있는 상기 키트는 본 명세서에 기재된 방법들 중 임의의 방법에서 유용하다.

또한, 본 발명은, 인간 개체의 뇌 내에서의 Aβ 펩티드의 아밀로이드 축적과 관련된 질환의 치료를 위한 인간화된 치료 항체를 제조하는 방법으로서, Aβ 펩티드에 특이적으로 결합하는 제1 인간화된 항체를 선별하는 단계; 및 상기 제1 인간화된 항체에 비해 손상된 이펙터 기능을 갖는 인간화된 치료 항체를 제공하도록 상기 제1 인간화된 항체의 Fc 영역을 변경시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 치료 유효량의 Aβ 억제제를 포함하는 약학 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 망막 기능을 보호하거나 회복시키는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 상기 억제제는 항체, 안티센스 분자, siRNA 분자, 라이보자임 또는 소분자 화합물이다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 치료 유효량의 Aβ 억제제를 포함하는, 개체에서 시력을 보존하거나 회복시키는 방법에 관한 것이다.

상기 실시양태들의 한 측면에서, 상기 방법들은 알쯔하이머병, 다운 증후군 또는 뇌 아밀로이드 혈관병증에 대해 치료를 받지 않은 개체에서 이용된다.

상기 본 발명의 방법들은 항체인 Aβ 억제제를 포함한다. 한 측면에서, 본 명세서에 개시된 본 발명은 Aβ_1-40 펩티드(표 4에서 나타낸 서열번호 15)의 C-말단에 결합하는 항체에 관한 것이다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 ATCC 기탁번호 PTA-6124 및 PTA-6125의 발현 벡터에 의해 생성된 항체 9TL("9TL"로도 지칭됨)를 사용한 치료를 포함한다. 항체 9TL의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 도 1에 표시되어 있다. 항체 9TL의 상보성 결정 영역(CDR)(초티아 CDR 및 카바트 CDR을 포함함) 또한 도 1에 표시되어 있다. 항체 9TL의 임의의 일부 또는 전체 영역을 언급하는 것은 ATCC 기탁번호 PTA-6124 및 PTA-6125의 발현 벡터에 의해 생성된 서열 및/또는 도 1에 표시된 서열을 포괄함을 이해해야 한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 표 3에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 항체 9TL의 항체 변이체의 투여를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 항체 9TL, 또는 표 3에 나타낸 항체 9TL의 변이체의 단편 또는 한 영역을 포함하는 항체의 투여를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 단편은 항체 9TL의 경쇄이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 단편은 항체 9TL의 중쇄이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 단편은 항체 9TL의 경쇄 및/또는 중쇄로부터 유래된 1개 이상의 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 단편은 도 1에 나타낸 경쇄 및/또는 중쇄로부터 유래된 1개 이상의 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 단편은 항체 9TL의 경쇄 및/또는 중쇄의 1개 이상의 CDR을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 a) 내지 f) 중 임의의 1개 이상을 포함하는 폴리펩티드(항체일 수 있거나 항체가 아닐 수 있음)의 투여를 포함한다: a) 항체 9TL 또는 표 3에 나타낸 항체 9TL의 변이체의 1개 이상의 CDR; b) 항체 9TL 또는 표 3에 나타낸 항체 9TL의 변이체의 중쇄로부터 유래된 CDR H3; c) 항체 9TL 또는 표 3에 나타낸 항체 9TL의 변이체의 경쇄로부터 유래된 CDR L3; d) 항체 9TL 또는 표 3에 나타낸 항체 9TL의 변이체의 경쇄로부터 유래된 3개의 CDR; e) 항체 9TL 또는 표 3에 나타낸 항체 9TL의 변이체의 중쇄로부터 유래된 3개의 CDR; 및 f) 항체 9TL 또는 표 3에 나타낸 항체 9TL의 변이체의 경쇄로부터 유래된 3개의 CDR 및 중쇄로부터 유래된 3개의 CDR. 또한, 본 발명은 하기 a) 내지 c) 중 임의의 1개 이상을 포함하는 폴리펩티드(항체일 수 있거나 항체가 아닐 수 있음)의 투여를 제공한다: a) 항체 9TL 또는 표 3에 나타낸 항체 9TL의 변이체로부터 유래된 1개 이상(1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개)의 CDR; b) 항체 9TL의 중쇄의 CDR H3으로부터 유래된 CDR; 및/또는 c) 항체 9TL의 경쇄의 CDR L3으로부터 유래된 CDR. 일부 실시양태에서, CDR은 도 1에 나타낸 CDR이다. 일부 실시양태에서, 항체 9TL 또는 표 3에 나타낸 항체 9TL의 변이체로부터 유래된 1개 이상의 CDR은 항체 9TL 또는 이의 변이체의 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 이상의 CDR과 약 85% 이상, 약 86% 이상, 약 87% 이상, 약 88% 이상, 약 89% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 약 99% 이상 동일하다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 항체 6G("6G"로도 지칭됨)의 투여를 포함한다. 항체 6G의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 도 8에 표시되어 있다. 항체 6G의 CDR(초티아 CDR 및 카바트 CDR을 포함함) 또한 도 8에 표시되어 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 표 8에 표시된 아미노산 서열을 갖는 항체 6G의 항체 변이체의 투여를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 항체 6G 또는 표 8에 나타낸 항체 6G의 변이체의 단편 또는 한 영역을 포함하는 항체의 투여를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 단편은 항체 6G의 경쇄이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 단편은 항체 6G의 중쇄이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 단편은 항체 6G의 경쇄 및/또는 중쇄로부터 유래된 1개 이상의 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 단편은 도 8에 나타낸 경쇄 및/또는 중쇄로부터 유래된 1개 이상의 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 단편은 항체 6G의 경쇄 및/또는 중쇄로부터 유래된 1개 이상의 CDR을 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 a) 내지 f) 중 임의의 1개 이상을 포함하는 폴리펩티드(항체일 수 있거나 항체가 아닐 수 있음)의 투여를 포함한다: a) 항체 6G 또는 표 8에 나타낸 항체 6G의 변이체의 1개 이상의 CDR; b) 항체 6G 또는 표 8에 나타낸 항체 6G의 변이체의 중쇄로부터 유래된 CDR H3; c) 항체 6G 또는 표 8에 나타낸 항체 6G의 변이체의 경쇄로부터 유래된 CDR L3; d) 항체 6G 또는 표 8에 나타낸 항체 6G의 변이체의 경쇄로부터 유래된 3개의 CDR; e) 항체 6G 또는 표 8에 나타낸 항체 6G의 변이체의 중쇄로부터 유래된 3개의 CDR; 및 f) 항체 6G 또는 표 8에 나타낸 항체 6G의 변이체의 경쇄로부터 유래된 3개의 CDR 및 중쇄로부터 유래된 3개의 CDR. 또한, 본 발명은 하기 a) 내지 c) 중 임의의 1개 이상을 포함하는 폴리펩티드(항체일 수 있거나 항체가 아닐 수 있음)의 투여를 제공한다: a) 항체 6G 또는 표 8에 나타낸 항체 6G의 변이체로부터 유래된 1개 이상(1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개)의 CDR; b) 항체 6G의 중쇄의 CDR H3으로부터 유래된 CDR; 및/또는 c) 항체 6G의 경쇄의 CDR L3으로부터 유래된 CDR. 일부 실시양태에서, CDR은 도 8에 나타낸 CDR이다. 일부 실시양태에서, 항체 6G 또는 표 8에 나타낸 항체 6G의 변이체로부터 유래된 1개 이상의 CDR은 항체 6G 또는 이의 변이체의 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 6개 이상의 CDR과 약 85% 이상, 약 86% 이상, 약 87% 이상, 약 88% 이상, 약 89% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 약 99% 이상 동일하다.

추가 실시양태에서, 본 발명은 서열번호 26에 나타낸 항체 6G의 중쇄 가변 영역으로부터 유래된 3개의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 27에 나타낸 항체 6G의 경쇄 가변 영역으로부터 유래된 3개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체의 투여를 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 28, 서열번호 29 및 서열번호 30에 나타낸 3개의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 31, 서열번호 32 및 서열번호 33에 나타낸 3개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체의 투여를 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 26에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 27에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 36에 나타낸 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 37에 나타낸 경쇄 아미노산 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, CDR은 카바트 CDR이다. 또 다른 실시양태에서, CDR은 초티아 CDR이다. 다른 실시양태에서, CDR은 카바트 CDR과 초티아 CDR의 조합물("조합된 CDR" 또는 "확장된 CDR"로도 지칭됨)이다. 즉, 하나 이상의 CDR을 포함하는 임의의 주어진 실시양태의 경우, CDR은 카바트 CDR, 초티아 CDR 및/또는 조합된 CDR 중 임의의 CDR일 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드(예컨대, 항체)는 L1이 L, V 또는 I이고, Y2가 Y 또는 W이며, S3이 S, T 또는 G이고, L4가 L, R, A, V, S, T, Q 또는 E이며, V6이 V, I, T, P, C, Q, S, N 또는 F이고, Y7이 Y, H, F, W, S, I, V 또는 A인 서열번호 5에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 아미노산 서열은 중쇄 가변 영역 내의 CDR3이다. 본원에서 편의상, 상기 문맥에서 또는 아미노산에 대한 언급에서 "이다"는 해당 서열번호에서 주어진 위치에 대한 언급과 함께 상기 위치에 대한 아미노산의 선택을 의미한다. 예를 들어, "L1은 L, V 또는 I이다"는 서열번호 5에서 위치 1에 있는 아미노산 L이 V 또는 I로 치환될 수 있음을 의미한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드(예컨대, 항체)는 Y8이 Y, A 또는 H이고, A11이 A 또는 S이며, K12가 K 또는 A인 서열번호 6에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 아미노산 서열은 경쇄 가변 영역 내의 CDR1이다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드(예컨대, 항체)는 L1이 L, M, N, C, F, V, K, S, Q, G 또는 S이고, G3이 G, S 또는 T이며, T4가 T 또는 S이고, H5가 H 또는 L이며, Y6이 Y, P, A, W, Q, M, S 또는 E이고, V8이 V, L, K, H, T, A, E 또는 M이고, L9가 L, I, T, S 또는 V인 서열번호 8에 나타낸 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 아미노산 서열은 경쇄 가변 영역 내의 CDR3이다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드(예컨대, 항체)는 (a) 서열번호 3에 나타낸 CDR1 영역; (b) 서열번호 4에 나타낸 CDR2 영역; 및 (c) 서열번호 5에 나타낸 CDR3 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 이때 L1은 L, V 또는 I이며, Y2는 Y 또는 W이고, S3은 S, T 또는 G이고, L4는 L, R, A, V, S, T, Q 또는 E이며, V6은 V, I, T, P, C, Q, S, N 또는 F이며, Y7은 Y, H, F, W, S, I, V 또는 A이다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드(예컨대, 항체)는 (a) Y8이 Y, A 또는 H이고, A11이 A 또는 S이며, K12가 K 또는 A인 서열번호 6에 나타낸 CDR1 영역; (b) 서열번호 7에 나타낸 CDR2 영역; 및 (c) L1이 L, M, N, C, F, V, K, S, Q, G 또는 S이고, G3이 G, S 또는 T이며, T4가 T 또는 S이고, H5가 H 또는 L이며, Y6이 Y, P, A, W, Q, M, S 또는 E이고, V8이 V, L, K, H, T, A, E 또는 M이고, L9가 L, I, T, S 또는 V인 서열번호 8에 나타낸 CDR3 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간 항체이다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 인간화된 항체이다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 단일클론 항체이다. 일부 실시양태에서, 상기 항체(또는 폴리펩티드)는 단리된 항체(또는 폴리펩티드)이다. 일부 실시양태에서, 상기 항체(또는 폴리펩티드)는 실질적으로 순수한 항체(또는 폴리펩티드)이다.

본 발명의 항체의 중쇄 불변 영역은 임의의 종류의 불변 영역, 예컨대, IgG, IgM, IgD, IgA 및 IgE; 및 임의의 아이소타입, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로부터 유래될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 변경된 불변 영역, 예컨대, 면역학적 불활성을 나타내는(부분적으로 면역학적 불활성을 나타내는 것을 포함하며 "손상된 이펙터 기능을 갖는"과 상호교환적으로 사용됨) 불변 영역, 예를 들어, 보체 매개 용해를 유발하지 못하거나, 항체-의존적 세포 매개 세포독성(ADCC)을 자극하지 못하거나, 또는 미세아교세포(microglia)를 활성화시키지 못하는 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 문헌(Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624); 국제특허출원 제PCT/GB99/01441호; 및/또는 영국 특허출원 제9809951.8호에 기재된 바와 같이 변경된다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 A330P331로부터 S330S331로의 돌연변이(야생형 IgG2a 서열을 기준으로 넘버링된 아미노산)를 포함하는 인간 중쇄 IgG2a 불변 영역을 포함한다(Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624). 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 E233F234L235로부터 P233V234A235로의 돌연변이를 포함하는 IgG4의 불변 영역을 포함한다. 다른 실시양태에서, 불변 영역은 N-결합 글리코실화가 결여되어 있다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 이 불변 영역의 N-글리코실화 인식 서열의 일부인 올리고사카라이드 부착 잔기(예컨대, Asn297) 및/또는 플랭킹 잔기를 돌연변이시킴에 의해 N-결합 글리코실화가 결여되어 있다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 N-결합 글리코실화가 결여되어 있다. 상기 불변 영역은 효소적 방법, 또는 글리코실화 결여 숙주 세포 내에서의 발현에 의해 N-결합 글리코실화가 결여될 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 항체 9TL, 항체 6G, 또는 표 3 및 8에 나타낸 이들의 변이체의 단편 또는 한 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 (단리될 수 있는) 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 단편은 항체 9TL 또는 항체 6G의 경쇄이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 단편은 항체 9TL 또는 항체 6G의 중쇄이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 단편은 항체 9TL 또는 항체 6G의 경쇄 및/또는 중쇄로부터 유래된 1개 이상의 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 단편은 항체 9TL 또는 항체 6G의 경쇄 및/또는 중쇄로부터 유래된 1개 이상(즉, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개)의 CDR을 포함한다.

발명의 상세한 설명

마우스 AMD 모델은, 이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만 지질 수송 이상조절 및 아밀로이드 축적이 AMD, 녹내장, 당뇨성 망막병증(황반 부종을 포함함) 및 다른 관련된 망막 변성 질환에서 관찰되는 망막 변화의 발병기전에 기여할 수 있다는 가설을 시험하는 데 있어서 수단이 되어 왔다. Aβ 축적은 알쯔하이머병에서 광범위하게 연구되어 왔고, 선행 연구들은 AMD(Yoshida, T., et al, J. of Clin. Invest., 115(10): 2793-2800 (2005); Anderson, D. et al, Experimental Eye Research 78: 243-256 (2004); Johnson, L. et al, PNAS, 99(18): 11820-11835(2002)) 및 녹내장(McKinnon SJ, Front Biosci 8: 1140-56 (2003); Tatton et al, Surv Ophthalmol. 48: S25-37 (2003))에서 Aβ의 잠재적인 역할을 암시하였다. 그러나, Aβ 억제제가 망막을 보호하고/하거나 회복시킴으로써 황반 변성의 치료에 있어서 치료적 이점을 제공할 수 있는 지에 대해서는 지금까지 논의된 바가 없다. 뿐만 아니라, Aβ의 아이소폼들 중 임의의 아이소폼이 AMD의 발병기전에 구별가능하게 기여할 수 있는 지에 대해서도 논의된 바가 없다.

전술된 바와 같이, Aβ는 알쯔하이머병에서 발견되는 신경 플라크의 주성분이다. Aβ는 β 아밀로이드 전구체 단백질(βAPP 또는 APP)의 분해 생성물이다. APP는 큰 이소(ectopic) N-말단 도메인, 경막 도메인 및 작은 세포질 C-말단 꼬리(tail)를 갖는 I형 경막 당단백질이다. 21번 염색체에 존재하는 단일 APP 유전자의 전사체의 택일적 스플라이싱(alternative splicing)은 아미노산 수에서 상이한 여러 아이소폼을 발생시킨다. 알쯔하이머병에 대한 선행 연구들은 Aβ_1-42 아이소폼이 아밀로이드 축적에 필요하고 Aβ_1-40 아이소폼과 대조적으로 Aβ_1-42 아이소폼이 알쯔하이머병의 발병기전에 있어서 개시 분자일 수 있음을 확립하였다(McGowan, E. et al, Neuron 47: 191-199 (2005)). 나아가, 알쯔하이머병에 대한 추가 연구들은 Aβ_1-40 아이소폼이 아밀로이드 축적을 실제로 억제할 수 있고 Aβ_1-40 아이소폼의 억제제가 알쯔하이머병 경과를 악화시킬 수 있음을 암시하였다(Kim, J. et al, Neurobiology of Disease, 27(3): 627-633 (2007)).

본 명세서에 개시된 본 발명은 치료 유효량의 항체 9TL, 항체 6G, 또는 이들로부터 유래된 항체 또는 폴리펩티드를 개체에게 투여하여 상기 개체에서 안 질환, 예컨대, AMD(건성 AMD 및 습성 AMD 둘다), 녹내장, 당뇨성 망막병증(당뇨성 망막 부종을 포함함), 브루크 막 파열, 근시 변성, 안구 종양 및 다른 관련된 망막 변성 질환을 예방하고/하거나 치료하는 방법을 제공한다. 항체 9TL 및 이의 유도체들은 개시내용 전체가 참고로 본원에 도입되는 국제특허출원 공개 제WO 06/036291호에 기재되어 있다. 개시된 방법에서 사용된 항체 및 폴리펩티드는 Aβ_1-40 펩티드의 C-말단에 결합한다. 항체 6G 및 이의 유도체들은 개시내용 전체가 참고로 본원에 도입되는 국제특허출원 공개 제WO 06/036291호 및 제WO 06/118959호에 기재되어 있다. 본 발명의 방법은 항체, 안티센스 분자, siRNA 분자 및 라이보자임과 같은 생물학적 물질 및 소분자 화합물을 포함하나 이들로 한정되지 않는 모든 Aβ 억제제를 포함한다.

일반적인 기법

본 발명의 실시는 달리 명시하지 않은 한 분자생물학의 통상적인 기법(재조합 기법을 포함함), 미생물학의 통상적인 기법, 세포생물학의 통상적인 기법, 생화학의 통상적인 기법 및 면역학의 통상적인 기법을 이용할 것이고, 상기 통상적인 기법들은 당업계의 기술에 포함된다. 상기 기법들은 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (MJ. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and CC. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); lmmunobiology (CA. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)]과 같은 문헌에 상세히 설명되어 있다.

정의

"Aβ 펩티드 억제제"는 Aβ 펩티드 생성 및/또는 축적을 감소시킬 수 있는 임의의 물질이다. Aβ 펩티드 억제제는 항체, 안티센스 분자, siRNA 분자, 라이보자임 및 소분자 화합물을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 나아가, Aβ 펩티드 억제제는 APP가 단백질분해효소에 의해 생성물 Aβ 펩티드로 절단되는 것을 방해할 수 있는 임의의 물질을 비롯한, Aβ 펩티드에 결합하여 Aβ 플라크 축적을 감소시킬 수 있는 임의의 물질이다. Aβ 펩티드 생성 및 축적의 억제를 위한 추가 표적은 예를 들어, β-세크레타제(secretase)(BACE1 또는 메맙신(memapsin)-2로도 지칭됨) 또는 γ-세크레타제 결합체(최소한 4가지 종류의 개별 단백질, 즉 프레세닐린(presenilin), 니카스트린(nicastrin), 전방 인두-결여 1(APH-1) 및 프레세닐린 인핸서(enhancer) 2(PEN-2)로 구성됨)를 억제하거나 침묵시킬 수 있는 소분자 치료제 및 siRNA를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

"항체"는 면역글로불린 분자의 가변 영역에 위치한 하나 이상의 항원 인식 부위를 통해 표적, 예컨대, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 본 명세서에서 사용된 상기 용어는 온전한(intact) 다클론(polyclonal) 또는 단일클론 항체뿐만 아니라, 그의 단편(예컨대, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv), 단일쇄(scFv) 및 돌연변이체, 항체 일부를 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는, 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변경된 구조체도 포함한다. 항체는 임의의 클래스의 항체, 예컨대, IgG, IgA 또는 IgM(또는 이들의 서브클래스)을 포함하고, 상기 항체는 임의의 특정한 클래스일 필요는 없다. 면역글로불린은 그의 중쇄의 불변 도메인의 항체 아미노산 서열에 따라 다양한 클래스로 분류될 수 있다. 5가지 주요 클래스의 면역글로불린, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있고, 이들 중 여러 클래스가 서브클래스(아이소타입), 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 분류될 수 있다. 면역글로불린의 다양한 클래스에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지칭된다. 면역글로불린의 다양한 클래스의 서브유니트 구조 및 3차원적 형태는 잘 공지되어 있다.

본원에서 사용된 "단일클론 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 의미한다. 즉, 상기 집단을 구성하는 개개의 항체들은 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연-발생 돌연변이를 제외하고 동일하다. 단일클론 항체는 단일 항원성 부위에 대해 유도된 고도로 특이적인 항체이다. 나아가, 전형적으로 다양한 결정인자(에피토프)에 대해 유도된 다양한 항체들을 포함하는 다클론 항체 제제와 대조적으로, 단일클론 항체 각각은 항원 상의 단일 결정인자에 대해 유도된다. 수식어 "단일클론"은 항체의 특성을 표시하고 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 것으로서, 임의의 특정한 방법에 의한 항체 집단의 획득으로서 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단일클론 항체는 문헌(Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256:495)에 최초로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다. 단일클론 항체는 예를 들어, 문헌(McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554)에 기재된 기법을 이용하여 발생시킨 파지 라이브러리로부터 단리될 수도 있다.

본 명세서에서 사용된 "인간화된" 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 포함하는 특이적인 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 이들의 단편(예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)인 비-인간(예를 들어, 뮤린(murine)) 항체 형태를 지칭한다. 대부분의 경우, 인간화된 항체는 인간 면역글로불린(수용자(recipient) 항체)의 CDR 내에 있는 잔기가 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 비-인간 종 면역글로불린(공여자 항체), 예컨대, 마우스, 래트 또는 토끼 면역글로불린의 CDR 내에 있는 잔기로 치환되어 있는 인간 면역글로불린이다. 일부 경우, 인간 면역글로불린의 Fv 골격 영역(FR)은 상응하는 비-인간 잔기로 치환된다. 나아가, 인간화된 항체는 수용자 항체에서뿐만 아니라 이식된 CDR 또는 골격 서열에서도 발견되지 않지만 항체 성능을 더 개선시키고 최적화시키기 위해 포함되는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역이 비-인간 면역글로불린의 CDR에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역이 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 FR 영역인 1개 이상, 전형적으로 2개의 가변 도메인 중 실질적으로 모든 가변 도메인을 포함할 것이다. 또한, 인간화된 항체는 최적으로 면역글로불린 불면 영역 또는 도메인(Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린의 Fc의 적어도 일부를 포함할 것이다. 항체는 국제특허출원 공개 제WO 99/58572호에 기재된 바와 같이 변경된 Fc 영역을 가질 수 있다. 인간화된 항체의 다른 형태는 모항체에 비해 변경된 1개 이상(1, 2, 3, 4, 5 또는 6개)의 CDR(모항체의 1개 이상의 CDR"로부터" 유래된 1개 이상의 CDR로도 지칭됨)을 갖는다.

본 명세서에서 사용된 "인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖고/갖거나 당업계에 공지되어 있거나 본 명세서에 개시되어 있는 인간 항체의 제조 기법들 중 임의의 기법을 이용하여 제조한 항체를 의미한다. 인간 항체의 상기 정의는 1개 이상의 인간 중쇄 폴리펩티드 또는 1개 이상의 인간 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체를 포함한다. 이의 일례로는 뮤린 경쇄 및 인간 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체이다. 인간 항체는 당업계에 공지되어 있는 다양한 기법을 이용하여 제조할 수 있다. 한 실시양태에서, 인간 항체는 인간 항체를 발현하는 파지 라이브러리로부터 선택된다(Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets et al., 1998, PNAS, (USA) 95:6157-6162; Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). 인간 항체는 내재 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화되어 있는 형질전환 동물, 예컨대, 마우스 내로 인간 면역글로불린 좌위를 도입함으로써 제조할 수도 있다. 이 방법은 미국 특허 제5,545,807호, 제5,545,806호, 제5,569,825호, 제5,625,126호, 제5,633,425호 및 제5,661,016호에 기재되어 있다. 별법으로, 인간 항체는 표적 항원에 대해 유도된 항체를 생성하는 인간 B 림프구를 불멸화시킴으로써 제조할 수 있다(상기 B 림프구는 개체로부터 회수될 수 있거나 시험관 내에서 면역화될 수 있음). 예를 들어, 문헌(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95) 및 미국 특허 제5,750,373호를 참조한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "9TL" 및 "항체 9TL"은 기탁번호가 ATCC PTA-6124인 발현 벡터 및 기탁 번호가 ATCC PTA-6125인 발현 벡터에 의해 제조된 항체를 지칭하는 데 있어서 상호교환적으로 사용된다. 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 도 1에 표시되어 있다. 항체 9TL의 CDR 부분(초티아 CDR 및 카바트 CDR을 포함함)은 도 1에 도식적으로 표시되어 있다. 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 각각 서열번호 9 및 10으로 표시되어 있다. 항체 9TL의 특징규명은 실시예에 기재되어 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "6G" 및 "항체 6G"는 서열번호 36으로 표시된 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 37로 표시된 경쇄 아미노산 서열을 가진 항체를 지칭하는 데 있어서 상호교환적으로 사용된다. 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 도 8에 표시되어 있다. 항체 6G의 CDR 부분(초티아 CDR 및 카바트 CDR을 포함함)은 도 8에 도시적으로 표시되어 있다. 중쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 각각 서열번호 38 및 39로 표시되어 있다. 항체 6G의 특징규명은 실시예에 기재되어 있다.

용어 "폴리펩티드", "올리고펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 본 명세서에서 임의의 길이의 아미노산 중합체를 지칭하는 데 있어서 상호교환적으로 사용된다. 상기 중합체는 직쇄 또는 분지쇄일 수 있고, 변경된 아미노산을 포함할 수 있고, 비-아미노산이 개재될 수 있다. 상기 용어들은 천연적으로 또는 개재에 의해, 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 개조 또는 변경, 예컨대, 표지화(labeling) 성분과의 접합에 의해 변경된 아미노산 중합체도 포함한다. 또한, 상기 정의는 예를 들어, 1개 이상이 아미노산 유사체(예컨대, 비천연 아미노산 등을 포함함) 및 당업계에 공지되어 있는 다른 변경을 포함하는 폴리펩티드도 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드는 항체를 기초로 한 것이기 때문에 단일쇄 또는 연결된 쇄로서 생성될 수 있음을 이해해야 한다.

본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드 중합체를 지칭하고 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변경된 뉴클레오티드 또는 염기 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합효소에 의해 중합체 내로 도입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변경된 뉴클레오티드, 예컨대, 메틸화된 뉴클레오티드 및 이의 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 구조에 대한 변경은 이 변경이 존재하는 경우 중합체의 조립 전 또는 후에 부가될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열에는 비-뉴클레오티드 성분들이 개재될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 중합 후 예컨대, 표지화 성분과의 접합에 의해 더 변경될 수 있다. 다른 종류의 변경은 예를 들어, "캡(cap)", 유사체에 의한 1개 이상의 천연 발생 뉴클레오티드의 치환, 뉴클레오티드간 변경, 예컨대, 비하전된 결합을 갖는 변경(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트라이에스터, 포스포아미데이트, 카바메이트 등), 하전된 결합을 갖는 변경(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트 등), 펜던트(pendant) 부분, 예컨대, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-라이신 등)을 갖는 변경, 인터칼레이터(intercalator)(아크리딘, 소랄렌(psoralen) 등)를 갖는 변경, 킬레이터(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화성 금속 등)를 갖는 변경, 알킬레이터(alkylator)를 갖는 변경, 변경된 결합(예를 들어, α-아노머 핵산 등)을 갖는 변경 및 폴리뉴클레오티드의 비변경된 형태를 포함한다. 또한, 통상적으로 당에 존재하는 하이드록실 기들 중 임의의 하이드록실 기는 예를 들어, 포스포네이트 기 또는 포스페이트 기에 의해 치환될 수 있거나, 표준 보호 기에 의해 보호될 수 있거나, 추가 뉴클레오티드와의 추가 결합을 형성하도록 활성화될 수 있거나, 또는 고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 말단 OH 및 3' 말단 OH는 인산화될 수 있거나, 또는 아민, 또는 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 유기 캡핑 기로 치환될 수 있다. 다른 OH도 표준 보호 기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 당업계에 일반적으로 공지되어 있는 라이보스 또는 데옥시라이보스 당의 유사체 형태(예를 들어, 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-라이보스, 카복실산 당 유사체, α-아노머 당, 에피머 당, 예컨대, 아라비노스, 크실로스 또는 라이소스(lyxose), 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 아크릴 유사체 및 염기소실(abasic) 뉴클레오시드 유사체, 예컨대, 메틸 리보사이드를 포함함)도 포함할 수 있다. 이 대안적 결합 기들은 포스페이트가 P(O)S("티오에이트"), P(S)S("다이티오에이트"), (O)NR₂("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH₂("포름아세탈")로 치환되어 있는 실시양태들(이때, R 또는 R'는 각각 독립적으로 H이거나, 또는 에테르(-O-) 결합, 아릴, 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐 또는 아르알딜을 포함하거나 포함하지 않는 치환된 또는 비치환된 알킬(탄소 원자수 1 내지 20)임)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 폴리뉴클레오티드 내의 모든 결합이 동일할 필요는 없다. 상기 설명은 본 명세서에 기재된 모든 폴리뉴클레오티드(RNA 및 DNA를 포함함)에 적용된다.

항체의 "가변 영역"은 단독으로 또는 조합 형태로 존재하는 항체 경쇄의 가변 영역 또는 항체 중쇄의 가변 영역을 지칭한다. 중쇄의 가변 영역 및 경쇄의 가변 영역은 초가변 영역으로도 공지되어 있는 3개의 CDR에 의해 연결된 4개의 FR로 각각 구성되어 있다. 각 쇄의 CDR들은 FR에 의해 서로 인접하여 위치하고, 다른 쇄의 CDR들과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다. CDR을 확인하는 2가지 이상의 기법이 존재한다: (1) 교차-종 서열 가변성을 기초로 한 방법(즉, 문헌(Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)의 방법); 및 (2) 항원-항체 결합체의 결정학적 연구를 기초로 한 방법(Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948). 본 명세서에서 사용된 바와 같이, CDR은 상기 2가지 방법들 중 어느 한 방법 또는 상기 2가지 방법의 조합에 의해 정의된 CDR을 지칭할 수 있다.

항체의 "불변 영역"은 단독으로 또는 조합 형태로 사용되는, 항체 경쇄의 불변 영역 또는 항체 중쇄의 불변 영역을 지칭한다.

항체 또는 폴리펩티드에 "우선적으로 결합하는" 또는 "특이적으로 결합하는"(이들 표현은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용됨) 에피토프는 당업계에서 잘 이해되는 용어이고, 이러한 특이적 또는 우선적 결합을 측정하는 방법도 당업계에 잘 공지되어 있다. 분자는 이것이 다른 세포 또는 물질과 반응하거나 결합하는 것보다 특정 세포 또는 물질과 더 빈번히, 더 빠르게, 더 오랫동안 및/또는 더 높은 친화성으로 반응하거나 결합하는 경우 "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"을 나타낸다고 표현된다. 항체는 다른 물질에 결합하는 것보다 더 높은 친화성 및 결합도로 더 용이하게 및/또는 더 오랫동안 표적에 결합하는 경우 상기 표적에 "특이적으로 결합"하거나 "우선적으로 결합"한다. 예를 들어, Aβ_1-40 에피토프에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체는 다른 Aβ_1-40 에피토프 또는 비-Aβ_1-40 에피토프에 결합하는 것보다 더 높은 친화성 및 결합도로 더 용이하게 및/또는 더 오랫동안 Aβ_1-40 에피토프에 결합하는 항체이다. 이 정의를 통해, 예를 들어, 제1 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체(또는 부분 또는 에피토프)가 제2 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수 있거나 결합할 수 없다는 것도 이해해야 한다. 따라서, "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"은 반드시 배타적 결합(을 포함할 수 있지만)을 요구하지는 않는다. 필연적으로는 아니지만 일반적으로 결합이라 함은 우선적 결합을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 "실질적으로 순수한"은 50% 이상 순수한(즉, 오염물질이 존재하지 않는), 더 바람직하게는 90% 이상 순수한, 더 바람직하게는 95% 이상 순수한, 더 바람직하게는 98% 이상 순수한, 가장 바람직하게는 99% 이상 순수한 물질을 의미한다.

"숙주 세포"는 폴리뉴클레오티드 삽입물 도입용 벡터를 위한 수용자일 수 있거나 수용자인 개개의 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손세포를 포함하고, 상기 자손세포는 천연적, 우연적 또는 의도적 돌연변이로 인해 원래의 모세포와 (형태 또는 게놈 DNA 상보체 면에서) 반드시 완전히 동일하지 않을 수 있다. 숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드로 생체 내 형질감염된 세포를 포함한다.

용어 "Fc 영역"은 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는 데 사용된다. "Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계가 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상적으로 위치 Cys226에 있는 아미노산 잔기 또는 위치 Pro230에 있는 아미노산 잔기로부터 그의 카복실-말단까지 걸쳐 있는 스트레치(stretch)로 정의된다. Fc 영역 내의 잔기들의 넘버링은 문헌(Kabat et al., Sequences of Proteins of lmunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991)에 기재된 EU 지수의 넘버링이다. 면역글로불린의 Fc 영역은 일반적으로 2개의 불변 도메인, CH2 및 CH3을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 "Fc 수용체" 및 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 지칭한다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 나아가, 바람직한 FcR은 IgG 항체(γ 수용체)에 결합하는 FcR이고 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체들(이 수용체들의 대립유전자 변이체 및 택일적으로 스플라이싱된 형태를 포함함)를 포함한다. FcγRII 수용체는 주로 그의 세포질 도메인에서 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는 FcγRIIA("활성화 수용체") 및 FcyRIIB("억제 수용체")를 포함한다. FcR은 문헌(Ravetch and Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92; Capel et al., 1994, Immunomethods, 4:25-34; and de Haas et al., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41)에 기재되어 있다. "FCR"은 모계 IgG를 태아에게 전달하는 신생아 수용체인 FcRn도 포함한다(Guyer et al., 1976, J. Immunol., 117:587; and Kim et al., 1994, J. Immunol., 24:249).

"보체 의존적 세포독성" 및 "CDC"는 보체의 존재 하에서의 표적의 용해를 의미한다. 보체 활성화 경로는 보체 시스템의 제1 성분(C1q)이 동족(cognate) 항원과 결합된 분자(예컨대, 항체)에 결합함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어, 문헌(Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996))에 기재된 CDC 분석법을 수행할 수 있다.

"기능적 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 1가지 이상의 이펙터 기능을 보유한다. 예시적 "이펙터 기능"은 C1q 결합; 보체 의존적 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체 의존적 세포 매개 세포독성(ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향-조절 등을 포함한다. 이러한 이펙터 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인(예를 들어, 항체 가변 도메인)과 조합될 것을 요구하고 당업계에 공지되어 있는 다양한 항체 이펙터 기능 평가 분석법을 이용하여 평가할 수 있다.

"천연 서열 Fc 영역"은 천연 상태에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. "변이체 Fc 영역"은 1가지 이상의 아미노산 변경에 의해 천연 서열 Fc 영역의 아미노산 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함하지만 천연 서열 Fc 영역의 1가지 이상의 이펙터 기능을 여전히 보유한다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모(parent) 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교할 때 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역에서 1개 이상의 아미노산 치환, 예를 들어, 약 1 내지 약 10개 아미노산 치환, 바람직하게는 약 1 내지 약 5개 아미노산 치환을 갖는다. 본 명세서에서 변이체 Fc 영역은 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역에 대해 약 80% 이상의 서열 동일성, 가장 바람직하게는 약 90% 이상의 서열 동일성, 더 바람직하게는 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 약 99% 이상의 서열 동일성을 보유할 것이다.

본 명세서에서 사용된 "항체 의존적 세포 매개 세포독성" 및 "ADCC"는 Fc 수용체(FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포(예를 들어, 천연 살해(NK) 세포, 호중구 및 대식세포)가 표적 세포에 결합된 항체를 인식하여 표적 세포의 용해를 야기하는 세포 매개 반응을 의미한다. 원하는 분자의 ADCC 활성은 시험관내 ADCC 분석법, 예컨대, 미국 특허 제5,500,362호 또는 제5,821,337호에 기재된 분석법을 이용하여 평가할 수 있다. 이러한 분석법에 유용한 이펙터 세포는 말초혈 단핵 세포(PBMC) 및 NK 세포를 포함한다. 택일적으로 또는 추가로, 원하는 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들어, 문헌(Clynes et al., 1998, PNAS (USA), 95:652-656)에 개시된 동물 모델과 같은 동물 모델 내에서 평가될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "유효 투여량" 또는 "유효량"의 약물, 화합물 또는 약학 조성물은 유리한 또는 원하는 결과를 얻기에 충분한 양이다. 예방 용도의 경우, 유리한 또는 원하는 결과는 위험의 제거 또는 감소, 심각도의 경감 또는 질환의 발병 시기의 지연(질환의 생화학적, 조직학적 및/또는 거동적 증상, 이의 합병증, 및 질환의 발달 동안 나타나는 중간 병리학적 표현형을 포함함)과 같은 결과를 포함한다. 치료 용도의 경우, 유리한 또는 원하는 결과는 제한된 임상 결과, 예컨대, 망막 기능의 보호 또는 회복, 또는 시력의 보존 또는 회복을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 유효 투여량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 본 발명의 목적상, 유효 투여량의 약물, 화합물 또는 약학 조성물은 예방 또는 치료적 처치를 직접적으로 또는 간접적으로 달성하기에 충분한 양이다. 임상 면에서 이해되는 바와 같이, 유효 투여량의 약물, 화합물 또는 약학 조성물은 또 다른 약물, 화합물 또는 약학 조성물과 함께 달성될 수 있거나 달성될 수 없다. 따라서, "유효 투여량"은 1가지 이상의 치료제를 투여한다는 면에서 고려될 수 있고, 단일 치료제는 1가지 이상의 다른 치료제와 함께 원하는 결과가 달성될 수 있거나 달성되는 경우 유효량으로 제공되는 것으로서 간주될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "치료" 또는 "치료하는"은 임상 결과를 비롯한 유리한 또는 원하는 결과를 얻는 방법이다. 본 발명의 목적상, 유리한 또는 원하는 임상 결과는 망막 기능의 회복, 예방 또는 보호를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

"Aβ 펩티드의 생물학적 효과" 또는 "Aβ 생물학적 활성"은 직접적 또는 간접적일 수 있는, 안 질환에 있어서의 Aβ의 효과를 의미하고, 이론에 구속받고자 하는 것은 아니지만, 지질 수송 이상조절에 있어서 Aβ의 관여를 포함한다. 간접적 효과는 망막 기능 및 시력에 대해 효과를 나타내는 Aβ를 포함하나 이로 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용된, 안 질환의 발달의 "지연"은 안 질환의 발달의 연기, 방해, 늦춤, 지연, 안정화 및/또는 유예를 의미한다. 상기 지연 기간은 치료될 질환 및/또는 개체의 이력에 따라 다를 수 있다. 당업자에게 자명한 바와 같이, 충분한 또는 유의한 지연은 사실상 개체가 상기 질환을 발달시키지 않는다는 점에서 예방을 포함할 수 있다. 안 질환의 발달을 "지연"시키는 방법은 이 방법을 이용하지 않은 경우와 비교할 때 소정의 시간 동안 질환 발달의 가능성을 감소시키고/시키거나 소정의 시간 동안 질환의 정도를 감소시키는 방법이다. 상기 비교는 전형적으로 통계학적으로 유의한 수의 피실험자를 이용한 임상 연구를 기초로 한다.

안 질환의 "발달"은 한 개체에서 안 질환의 발병 시기 및/또는 진행을 의미한다. 안 질환의 발달은 본 명세서에 기재된 표준 임상 기법을 이용하여 검출할 수 있다. 그러나, 발달은 초기에 검출될 수 없는 질환 진행을 의미하기도 한다. 본 발명의 목적상, 이러한 경우 진행은 표준 안과 조사 또는 보다 전문적인 시험에 의해 측정된, 질환 상태의 생물학적 경과를 의미한다. 다양한 진단 시험은 시야, 시력, 플루오레세인 혈관촬영, 망막전위도, 광 간섭 단층촬영(optical coherence tomography; OCT), 시유발전위(VEP), 인도시아나인 그린(indocyanine green), 색각, 암슬러 격자(Amsler grid), 안내압, 및 당업자에게 공지된 다른 진단 수단을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. AMD에 대한 진단 시험은 특히, 시력, 안저 검사, 플루오레세인 혈관촬영, 인도시아나인 그린 및 OCT를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. "발달"은 발생, 재발 및 발병을 포함한다. 본 명세서에서 사용된, 안 질환의 "발병" 또는 "발생"은 초기 발병 및/또는 재발을 포함한다.

본 명세서에서 사용된, 망막 기능을 "보호하는" 또는 망막 기능의 "보호"는 망막 기능의 안정화 또는 보존을 지칭한다. 본 명세서에서 사용된, 망막 기능의 "회복"은 앞선 손상 후 망막 기능의 회복을 의미한다. 망막 기능의 보호 또는 회복은 전술한 안과 진단 수단들 중 임의의 수단, 예컨대, 시력, 망막전위도, 시야, 안저 검사, 플루오레세인 혈관촬영, 인도시아나인 그린 및 OCT에 의해 측정되는 통계학적으로 유의한 결과(즉, p<0.05)를 측정함으로써 확인할 수 있다. 예를 들어, 하기 실시예 4에서 보여지는 바와 같이, 망막 기능의 통계학적으로 유의한 보호 또는 회복은 망막전위도에서의 b-파 진폭의 회복(p=0.008)에 의해 입증된다.

시력의 "보존" 또는 "회복"은 표준 시력검사표 및 당업계에 공지되어 있는 다양한 안과 진단 수단에 의해 측정될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "함께" 투여는 동시적인 투여 및/또는 상이한 시점에서의 투여를 포함한다. 함께 투여는 공동-제제로서의 투여 또는 별개의 조성물로서의 투여 또한 포함한다. 본 명세서에서 사용된 함께 투여는 항-Aβ 항체 및 또 다른 물질을 동시적으로 및/또는 별도로 개체에게 투여하는 임의의 환경을 포괄한다. 본 명세서에서 추가로 논의되어 있는 바와 같이, 항-Aβ 항체 및 상기 다른 물질은 상이한 투약 빈도 또는 간격으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 항-Aβ 항체는 1주 간격으로 투여될 수 있지만, 상기 다른 물질은 이보다 더 낮은 빈도로 투여될 수 있다. 항-Aβ 항체 및 상기 다른 물질은 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로로 투여될 수 있음을 이해해야 한다.

"생물학적 샘플"은 한 개체로부터 수득된 다양한 샘플 조직을 포괄하고 진단 또는 모니터링 분석에서 사용될 수 있다. 이 정의는 혈액 및 생물학적 유래의 다른 액체 샘플, 고체 조직 샘플, 예컨대, 생검 표본, 조직 배양물 또는 이들로부터 유래된 세포, 및 이들의 자손세포를 포괄한다. 또한, 상기 정의는 획득 후에 임의의 방법, 예컨대, 시약을 사용한 처리, 가용화, 특정 성분들, 예컨대, 단백질 또는 폴리뉴클레오티드의 농축, 또는 절편 목적을 위한 반-고체 또는 고체 매트릭스 내로의 포매(embedding)에 의해 처리된 샘플을 포함한다. 용어 "생물학적 샘플"은 임상 샘플을 포괄하고 배양물 중의 세포, 세포 상청액, 세포 용해물, 혈청, 혈장, 체액 및 조직 샘플도 포함한다.

"개체"("객체"로도 지칭됨)는 포유동물, 더 바람직하게는 인간이다. 포유동물은 농장 동물(예컨대, 소), 스포츠 동물, 애완동물(예컨대, 고양이, 개, 말), 영장류, 마우스 및 래트를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 "벡터"는 숙주 세포에서 1가지 이상의 원하는 유전자 서열을 전달할 수 있고 바람직하게는 발현할 수 있는 구축물(construct)을 의미한다. 벡터의 예는 바이러스 벡터, 네이키드(naked) DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제와 연결된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포좀에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 일부 진핵 세포, 예컨대, 생산자(producer) 세포를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 "발현 조절 서열"은 핵산의 전사를 지시하는 핵산 서열을 의미한다. 발현 조절 서열은 프로모터, 예컨대, 구성적 프로모터 또는 유도적 프로모터, 또는 인핸서일 수 있다. 발현 조절 서열은 전사될 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다.

본 명세서에서 사용된 "약학적으로 허용가능한 담체"는 활성 성분과 조합된 경우 상기 활성 성분이 생물학적 활성을 보유하도록 하며 개체의 면역 시스템과 반응하지 않는 임의의 물질을 포함한다. 그 예는 임의의 표준 약학적 담체, 예컨대, 포스페이트 완충 생리식염수, 물, 에멀젼, 예컨대, 오일/물 에멀젼, 및 다양한 종류의 습윤화제를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 에어로졸 또는 비경구 투여에 바람직한 희석제는 포스페이트 완충 생리식염수 또는 일반(0.9%) 생리식염수이다. 상기 담체를 포함하는 조성물은 잘 공지되어 있는 통상적인 방법에 의해 제제화된다(예를 들어, 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990) 및 문헌(Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000) 참조).

본 명세서에서 사용된 용어 "k_on"은 항체와 항원의 결합에 대한 속도 상수를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "k_off"는 항체/항원 결합체로부터의 항체의 해리에 대한 속도 상수를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "K_D"는 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 의미한다.

조성물 및 이 조성물의 제조 방법

항-Aβ 항체 및 폴리펩티드:

I. 항체 9TL, 및 항체 9TL로부터 유도된 항체 및 폴리펩티드

본 발명은 항체 9TL 및 표 3에 나타낸 이의 변이체, 또는 항체 9TL 및 표 3에 나타낸 이의 변이체로부터 유도된 폴리펩티드; 및 항체 9TL 및 이의 변이체 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학 조성물을 비롯한 조성물을 포괄한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 조성물은 Aβ_1-40 펩티드의 C-말단에 결합하는 1가지 이상의 항체 또는 폴리펩티드(항체일 수 있거나 항체가 아닐 수 있음), 및/또는 Aβ_1-40 펩티드의 C-말단에 결합하는 1가지 이상의 항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 1가지 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 조성물은 당업계에 잘 공지되어 있는 적절한 부형제, 예컨대, 완충제를 포함하는 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 항체 및 폴리펩티드는 하기 (a) 내지 (g) 중 임의의 (1가지 이상의) 특성을 특징으로 한다: (a) Aβ_1-40 펩티드의 C-말단 펩티드 28-40에 결합하나 Aβ_1-42 펩티드 또는 Aβ_1-43 펩티드에는 유의하게 결합하지 않는 특성; (b) Aβ_1-40 펩티드의 C-말단 펩티드 33-40에 결합하는 특성; (c) 개체에서의 아밀로이드 플라크 형성을 억제하는 특성; (d) 개체의 눈에서의 아밀로이드 플라크를 감소시키는 특성; (e) AMD(건성 AMD 및 습성 AMD 둘다), 녹내장, 당뇨성 망막병증(황반 부종을 포함함) 및 다른 관련된 망막 변성 질환을 포함하나 이들로 한정되지 않은 안 질환의 1가지 이상의 증상을 치료하거나, 예방하거나 완화시키는 특성; (f) 망막 기능을 유의하게 보호하거나 회복시키는 특성; 및 (g) 시력을 유의하게 보존하거나 회복시키는 특성.

본 발명의 항체 및 폴리펩티드는 다른 보고된 항-Aβ 항체와 대조적으로 바람직한 안전성 프로파일 또한 나타낼 수 있다.

따라서, 본 발명은 하기 (a) 내지 (l) 중 어느 하나, 또는 하기 (a) 내지 (l) 중 어느 하나를 포함하는 조성물(약학 조성물을 포함함)을 제공한다: (a) 항체 9TL 또는 표 3에 나타낸 이의 변이체; (b) 항체 9TL 또는 표 3에 나타낸 이의 변이체의 단편 또는 한 영역; (c) 항체 9TL 또는 표 3에 나타낸 이의 변이체의 경쇄; (d) 항체 9TL 또는 표 3에 나타낸 이의 변이체의 중쇄; (e) 항체 9TL 또는 표 3에 나타낸 이의 변이체의 경쇄 및/또는 중쇄로부터의 1개 이상의 가변 영역; (f) 항체 9TL 또는 표 3에 나타낸 이의 변이체의 1개 이상의 CDR(1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 CDR); (g) 항체 9TL의 중쇄로부터의 CDR H3; (h) 항체 9TL 또는 표 3에 나타낸 이의 변이체의 경쇄로부터의 CDR L3; (i) 항체 9TL 또는 표 3에 나타낸 이의 변이체의 경쇄로부터의 3개의 CDR; (j) 항체 9TL 또는 표 3에 나타낸 이의 변이체의 중쇄로부터의 3개의 CDR; (k) 항체 9TL 또는 표 3에 나타낸 이의 변이체의 경쇄로부터의 3개의 CDR 및 중쇄로부터의 3개의 CDR; 및 (l) 상기 (b) 내지 (k) 중 임의의 하나를 포함하는 항체. 본 발명은 상기 (a) 내지 (l) 중 임의의 하나 이상을 포함하는 폴리펩티드도 제공한다.

항체 9TL의 CDR 부분(초티아 CDR 및 카바트 CDR을 포함함)은 도 1에 도식적으로 표시되어 있다. CDR 영역의 확인은 당업계의 기술 내에 있다. 일부 실시양태에서, CDR은 카바트 CDR과 초티아 CDR의 조합물("조합된 CDR" 또는 "확장된 CDR"로도 지칭됨)일 수 있음을 이해해야 한다. 일부 실시양태에서, CDR은 카바트 CDR이다. 다른 실시양태에서, CDR은 초티아 CDR이다. 다시 말해, CDR이 하나 이상인 실시양태에서, CDR은 카바트 CDR, 초티아 CDR, 조합된 CDR 및 이들의 조합물 중 임의의 CDR일 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 항체 9TL 또는 표 3에 나타낸 이의 변이체의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 이상의 CDR과 실질적으로 동일한 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 이상의 CDR을 포함하는 폴리펩티드(항체일 수 있거나 항체가 아닐 수 있음)를 제공한다. 다른 실시양태는 항체 9TL 또는 항체 9TL로부터 유도된 항체의 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 이상의 CDR과 실질적으로 동일한 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 이상의 CDR을 갖는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 이상의 CDR은 항체 9TL 또는 표 3에 나타낸 이의 변이체의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 이상의 CDR과 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일하다. 본 발명의 목적상, 활성 정도는 항체 9TL 또는 표 3에 나타낸 이의 변이체에 비해 다양할 수 있지만(더 높거나 더 낮을 수 있음) 결합 특이성 및/또는 총 활성은 일반적으로 보유됨을 이해해야 한다.

또한, 본 발명은 항체 9TL 또는 표 3에 나타낸 이의 변이체의 서열의 5개 이상의 인접 아미노산, 8개 이상의 인접 아미노산, 약 10개 이상의 인접 아미노산, 약 15개 이상의 인접 아미노산, 약 20개 이상의 인접 아미노산, 약 25개 이상의 인접 아미노산, 및 약 30개 이상의 인접 아미노산 중 임의의 인접 아미노산을 갖는, 항체 9TL 또는 표 3에 나타낸 이의 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드(항체일 수 있거나 항체가 아닐 수 있음)를 제공하는데, 이때 상기 아미노산들 중 3개 이상의 아미노산은 항체 9TL(도 1) 또는 표 3에 나타낸 이의 변이체의 가변 영역으로부터 유래된다. 한 실시양태에서, 상기 가변 영역은 항체 9TL의 경쇄로부터 유래된다. 또 다른 실시양태에서, 상기 가변 영역은 항체 9TL의 중쇄로부터 유래된다. 예시적 폴리펩티드는 항체 9TL의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 둘다로부터 유래된 인접 아미노산(길이는 전술한 바와 같음)을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 5개 (또는 5개 이상의) 인접 아미노산은 도 1에 나타낸 항체 9TL의 CDR로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 상기 인접 아미노산은 항체 9TL의 가변 영역으로부터 유래된다.

II. 항체 6G, 및 항체 6G로부터 유도된 항체 및 폴리펩티드

본 발명은 Aβ_1-40 펩티드, Aβ_1-42 펩티드 및 Aβ_1-43 펩티드에 결합하는 항체 또는 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하는, 안 질환의 치료 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 항체 또는 상기 폴리펩티드는 Aβ_1-42 펩티드 및 Aβ_1-43 펩티드에 결합하는 것보다 더 높은 친화성으로 Aβ_1-40 펩티드에 결합한다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 Aβ_1-36 펩티드, Aβ_1-37 펩티드, Aβ_1-38 펩티드 및 Aβ_1-39 펩티드에 결합한다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 Aβ_22-35 펩티드에 결합한다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 Aβ_28-40 펩티드에 결합한다. 일부 실시양태에서, 상기 항체 또는 상기 폴리펩티드는 아미노산 25-34 및 40을 포함하는 Aβ_1-40 펩티드 상의 에피토프에 결합한다.

또한, 본 발명은 본 명세서에 기재된 항체 또는 폴리펩티드 중 임의의 항체 또는 폴리펩티드(예컨대, 항체 6G 및 표 8에 나타낸 이의 변이체, 또는 항체 6G 및 표 8에 나타낸 이의 변이체로부터 유도된 폴리펩티드); 또는 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오티드 중 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 안 질환의 치료 방법을 제공한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 조성물은 Aβ_1-40 펩티드의 C-말단에 결합하는 1가지 이상의 항체 또는 폴리펩티드(항체일 수 있거나 항체가 아닐 수 있음), 및/또는 Aβ_1-40 펩티드의 C-말단에 결합하는 1가지 이상의 항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 1가지 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 조성물은 당업계에 잘 공지되어 있는 적절한 부형제, 예컨대, 완충제를 포함하는 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 하기 (a) 내지 (g) 중 임의의 (1가지 이상의) 특성을 특징으로 한다: (a) Aβ_1-40 펩티드, Aβ_1-42 펩티드 및 Aβ_1-43 펩티드에 결합하는 특성; (b) Aβ_1-42 펩티드 및 Aβ_1-43 펩티드에 대한 결합 친화성보다 더 높은 결합 친화성으로 Aβ_1-40 펩티드에 결합하면서 Aβ_1-40 펩티드, Aβ_1-42 펩티드 및 Aβ_1-43 펩티드에 결합하는 특성; (c) 아미노산 25-34 및 40을 포함하는 Aβ_1-40 펩티드 상의 에피토프에 결합하는 특성; (d) Aβ_1-40 펩티드에의 결합에 비해 더 낮은 친화성으로 Aβ_1-36 펩티드, Aβ_1-37 펩티드, Aβ_1-38 펩티드 및 Aβ_1-39 펩티드에 결합하는 특성; (e) 약 1 μM 미만의 K_D로 Aβ_22-37 펩티드에 결합하는 특성; (f) Aβ_22-35 펩티드에 결합하는 특성; (g) Aβ_28-40 펩티드에 결합하는 특성; (h) 세포 내에서 발현된 APP에 결합하지 못하는 특성; (i) 객체의 눈에서의 아밀로이드 플라크를 감소시키는 특성; (j) AMD(건성 AMD 및 습성 AMD 둘다), 녹내장, 당뇨성 망막병증(황반 부종을 포함함) 및 다른 관련된 망막 변성 질환을 포함하나 이들로 한정되지 않은 안 질환의 1가지 이상의 증상을 치료하거나, 예방하거나 완화시키는 특성; (k) 망막 기능을 유의하게 보호하거나 회복시키는 특성; 및 (l) 시력을 유의하게 보존하거나 회복시키는 특성. 또한, 본 발명의 항체 및 폴리펩티드는 본 명세서에 기재된 손상된 이펙터 기능을 가질 수 있다. 손상된 이펙터 기능을 갖는 항체 및 폴리펩티드는 다른 보고된 항-Aβ 항체와 대조적으로 바람직한 안전성 프로파일을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 뇌 혈관 내의 출혈(뇌출혈); 수막뇌염(자기 공명 스캔의 변화를 포함함); 뇌 척수액 중의 상승된 백혈구 수; 및 중추신경계 염증 중 1가지 이상의 증상의 유의한 또는 허용불가능한 수준을 야기하지 않을 수 있다.

따라서, 본 발명은 하기 (a) 내지 (l) 중 어느 하나, 또는 하기 (a) 내지 (l) 중 어느 하나를 포함하는 조성물(약학 조성물을 포함함)을 제공한다: (a) 항체 6G 또는 표 8에 나타낸 이의 변이체; (b) 항체 6G 또는 표 8에 나타낸 이의 변이체의 단편 또는 한 영역; (c) 항체 6G 또는 표 8에 나타낸 이의 변이체의 경쇄; (d) 항체 6G 또는 표 8에 나타낸 이의 변이체의 중쇄; (e) 항체 6G 또는 표 8에 나타낸 이의 변이체의 경쇄 및/또는 중쇄로부터의 1개 이상의 가변 영역; (f) 항체 6G 또는 표 8에 나타낸 이의 변이체의 1개 이상의 CDR(1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 CDR); (g) 항체 6G의 중쇄로부터 CDR H3; (h) 항체 6G 또는 표 8에 나타낸 이의 변이체의 경쇄로부터의 CDR L3; (i) 항체 6G 또는 표 8에 나타낸 이의 변이체의 경쇄로부터의 3개의 CDR; (j) 항체 6G 또는 표 8에 나타낸 이의 변이체의 중쇄로부터의 3개의 CDR; (k) 항체 6G 또는 표 8에 나타낸 이의 변이체의 경쇄로부터의 3개의 CDR 및 중쇄로부터의 3개의 CDR; 및 (l) 상기 (b) 내지 (k) 중 임의의 하나를 포함하는 항체. 본 발명은 상기 (a) 내지 (l) 중 임의의 하나 이상을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.

항체 6G의 CDR 부분(초티아 CDR 및 카바트 CDR을 포함함)은 도 8에 도식적으로 표시되어 있다. CDR 영역의 확인은 당업계의 기술 내에 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 항체 6G 또는 표 8에 나타낸 이의 변이체의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 이상의 CDR과 실질적으로 동일한 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 이상의 CDR을 포함하는 폴리펩티드(항체일 수 있거나 항체가 아닐 수 있음)를 제공한다. 다른 실시양태는 항체 6G 또는 항체 6G로부터 유도된 항체의 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 이상의 CDR과 실질적으로 동일한 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 이상의 CDR을 갖는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 이상의 CDR은 항체 6G 또는 표 8에 나타낸 이의 변이체의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 이상의 CDR과 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일하다. 본 발명의 목적상, 활성 정도는 항체 6G 또는 표 8에 나타낸 이의 변이체에 비해 다양할 수 있지만(더 높거나 더 낮을 수 있음) 결합 특이성 및/또는 총 활성은 일반적으로 보유됨을 이해해야 한다.

또한, 본 발명은 항체 6G 또는 표 8에 나타낸 이의 변이체의 서열의 5개 이상의 인접 아미노산, 8개 이상의 인접 아미노산, 약 10개 이상의 인접 아미노산, 약 15개 이상의 인접 아미노산, 약 20개 이상의 인접 아미노산, 약 25개 이상의 인접 아미노산, 및 약 30개 이상의 인접 아미노산 중 임의의 인접 아미노산을 갖는 항체 6G 또는 표 8에 나타낸 이의 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드(항체일 수 있거나 항체가 아닐 수 있음)를 제공하는데, 이때 상기 아미노산들 중 3개 이상의 아미노산은 항체 6G(도 8) 또는 표 8에 나타낸 이의 변이체의 가변 영역으로부터 유래된다. 한 실시양태에서, 상기 가변 영역은 항체 6G의 경쇄로부터 유래된다. 또 다른 실시양태에서, 상기 가변 영역은 항체 6G의 중쇄로부터 유래된다. 예시적 폴리펩티드는 항체 6G의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 둘다로부터 유래된 인접 아미노산(길이는 전술한 바와 같음)을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 5개 (또는 5개 이상의) 인접 아미노산은 도 8에 나타낸 항체 6G의 CDR로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 상기 인접 아미노산은 항체 6G의 가변 영역으로부터 유래된다.

본 발명의 항체 및 폴리펩티드의 결합 친화성은 하기 예시적 실시양태와 같이 다를 수 있고 특정 값 또는 범위일 필요는 없다(그러나, 특정 값 또는 범위일 수 있음). Aβ 펩티드(Aβ_1-40 펩티드, Aβ_1-42 펩티드 또는 Aβ_1-43 펩티드를 포함함)에 대한 본 발명의 항체 및 폴리펩티드의 결합 친화성(K_D)은 약 0.10 내지 약 0.80 nM, 약 0.15 내지 약 0.75 nM, 또는 약 0.18 내지 약 0.72 nM일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 결합 친화성은 약 2 pM, 약 5 pM, 약 10 pM, 약 15 pM, 약 20 pM 또는 약 40 pM이거나 약 40 pM보다 크다. 한 실시양태에서, 상기 결합 친화성은 약 2 pM 내지 22 pM이다. 다른 실시양태에서, 결합 친화성은 약 10 nM, 약 5 nM, 약 1 nM, 약 900 pM, 약 800 pM, 약 700 pM, 약 600 pM, 약 500 pM, 약 400 pM, 약 300 pM, 약 200 pM, 약 150 pM, 약 100 pM, 약 90 pM, 약 80 pM, 약 70 pM, 약 60 pM, 약 50 pM, 약 40 pM, 약 30 pM 또는 약 10 pM 미만이다. 일부 실시양태에서, 상기 결합 친화성은 약 10 nM이다. 다른 실시양태에서, 상기 결합 친화성은 약 10 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 100 nM 미만, 약 150 nM 미만, 약 200 nM 미만, 약 250 nM 미만, 약 500 nM 미만 또는 약 1000 nM 미만이다. 다른 실시양태에서, 상기 결합 친화성은 약 5 nM 미만이다. 다른 실시양태에서, 상기 결합 친화성은 약 1 nM 미만이다. 다른 실시양태에서, 상기 결합 친화성은 약 0.1 nM 또는 약 0.07 nM이다. 다른 실시양태에서, 상기 결합 친화성은 약 0.1 nM 미만 또는 약 0.07 nM 미만이다. 다른 실시양태에서, 상기 결합 친화성은 약 10 nM, 약 5 nM, 약 1 nM, 약 900 pM, 약 800 pM, 약 700 pM, 약 600 pM, 약 500 pM, 약 400 pM, 약 300 pM, 약 200 pM, 약 150 pM, 약 100 pM, 약 90 pM, 약 80 pM, 약 70 pM, 약 60 pM, 약 50 pM, 약 40 pM, 약 30 pM 및 약 10 pM 중 임의의 값 내지 약 2 pM, 약 5 pM, 약 10 pM, 약 15 pM, 약 20 pM 및 약 40 pM 중 임의의 값이다. 일부 실시양태에서, 상기 결합 친화성은 약 10 nM, 약 5 nM, 약 1 nM, 약 900 pM, 약 800 pM, 약 700 pM, 약 600 pM, 약 500 pM, 약 400 pM, 약 300 pM, 약 200 pM, 약 150 pM, 약 100 pM, 약 90 pM, 약 80 pM, 약 70 pM, 약 60 pM, 약 50 pM, 약 40 pM, 약 30 pM 및 약 10 pM 중 임의의 값이다. 다른 실시양태에서, 상기 결합 친화성은 약 2 pM, 약 5 pM, 약 10 pM, 약 15 pM, 약 20 pM 또는 약 40 pM이거나 약 40 pM보다 크다. 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ_1-40 펩티드, Aβ_1-42 펩티드 및/또는 Aβ_1-43 펩티드의 조합물에 결합할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 항체 또는 상기 폴리펩티드는 적어도 Aβ_1-40 펩티드 및 Aβ_1-42 펩티드에 결합한다.

본 발명의 항체 및 폴리펩티드는 Aβ_1-36 펩티드, Aβ_1-37 펩티드, Aβ_1-38 펩티드, Aβ_1-39 펩티드, Aβ_1-42 펩티드 및 Aβ_1-43 펩티드 중 임의의 1가지 이상의 펩티드에 결합할 수도 있지만, 일부 실시양태에서, 상기 펩티드들 중 임의의 1가지 이상의 펩티드에 대한 결합 친화성은 Aβ_1-40 펩티드에 대한 상기 펩티드들의 결합 친화성보다 낮다. 일부 실시양태에서, Aβ_1-36 펩티드, Aβ_1-37 펩티드, Aβ_1-38 펩티드, Aβ_1-39 펩티드, Aβ_1-42 펩티드 및 Aβ_1-43 펩티드 중 임의의 1가지 이상의 펩티드에 대한 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드의 K_D는 Aβ_1-40 펩티드에 대한 K_D의 약 5배 이상, 약 10배 이상, 약 20배 이상, 약 30배 이상, 약 40배 이상, 약 50배 이상, 약 80배 이상, 약 100배 이상, 약 150배 이상, 약 200배 이상 또는 약 250배 이상이다.

또한, 본 발명은 상기 항체 또는 폴리펩티드 중 임의의 항체 또는 폴리펩티드의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 항체는 당업계에 공지되어 있는 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 항체의 단백질분해 또는 다른 분해, 전술된 재조합 방법(즉, 단일 또는 융합 폴리펩티드) 또는 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 항체의 폴리펩티드, 특히 약 50개 이하의 아미노산으로 구성된 짧은 폴리펩티드는 화학적 합성에 의해 편리하게 제조될 수 있다. 화학적 합성 방법은 당업계에 공지되어 있고 상업적으로 입수가능하다. 예를 들어, 항체는 고체 상(phase) 방법을 이용한 자동화된 폴리펩티드 합성기에 의해 제조될 수 있다. 미국 특허 제5,807,715호, 제4,816,567호 및 제6,331,415호도 참조한다.

별법으로, 상기 항체는 당업계에 잘 공지되어 있는 방법을 이용하여 재조합적으로 제조할 수 있다. 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 1가지 이상의 발현 벡터 또는 증폭 벡터 내로 클로닝된다. 원하는 항체를 코딩하는 서열은 숙주 세포 내에서 벡터 형태로 유지될 수 있고, 상기 숙주 세포는 장래 사용을 위해 증식되고 동결될 수 있다. 벡터(발현 벡터를 포함함) 및 숙주 세포는 본 명세서에 더 기재되어 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 항체, 예컨대, 항체 9TL 및 항체 6G의 단일쇄 가변 영역 단편("scFv")을 포괄한다. scFv는 짧은 연결 펩티드를 사용하여 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 연결함으로써 제조한다(Bird et al., (1988) Science 242:423-426). 연결 펩티드의 일례는 한 가변 영역의 카복시 말단과 다른 가변 영역의 아미노 말단 사이에 약 3.5 nm의 가교를 형성하는 (GGGGS)₃이다. 다른 서열의 링커도 디자인되어 사용되고 있다(Bird et al. (1988)). 링커는 추가 기능, 예컨대, 약물의 부착 또는 고체 지지체에의 부착을 위해 변경될 수 있다. 단일쇄 변이체는 재조합적으로 또는 합성적으로 제조될 수 있다. scFv의 합성 제조를 위해, 자동화된 합성기를 이용할 수 있다. scFv의 재조합 제조를 위해, scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 적절한 플라스미드를 적절한 숙주 세포, 예컨대, 효모, 식물, 곤충 또는 포유동물 세포와 같은 진핵세포, 또는 이. 콜라이와 같은 원핵세포 내로 도입할 수 있다. 원하는 scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 관용적인 기법, 예컨대, 폴리뉴클레오티드의 라이게이션에 의해 제조될 수 있다. 생성된 scFv는 당업계에 공지되어 있는 표준 단백질 정제 기법을 이용하여 단리할 수 있다.

다른 형태의 단일쇄 항체, 예컨대, 디아바디(diabody)도 포함된다. 디아바디는, VH 도메인 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 쇄 상에서 발현되어 있지만 동일한 쇄 상의 상기 두 도메인 사이의 페어링을 허용하기에는 너무 짧아 상기 도메인이 또 다른 쇄의 상보적인 도메인과 페이링을 형성하게 하여 2개의 항원 결합 부위를 형성하는 링커를 사용하는 2가 이중특이적 항체이다(예를 들어, 문헌(Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448) 및 문헌(Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123) 참조).

예를 들어, 2가지 이상의 상이한 항원, 즉 Aβ_1-40 펩티드 및 Aβ_1-42 펩티드에 대한 결합 특이성을 나타내는 단일클론 항체인 이중특이적 항체는 본 명세서에 개시된 항체를 사용하여 제조할 수 있다. 이중특이적 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌(Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology 121:210) 참조). 종래, 이중특이적 항체의 재조합 제조는 상이한 특이성을 나타내는 2개의 중쇄를 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 동시발현을 기초로 한 것이었다(Millstein and Cuello, 1983, Nature 305, 537-539).

이중특이적 항체를 제조하는 한 방법에 따르면, 원하는 결합 특이성(항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체 가변 도메인은 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 상기 융합은 바람직하게는 힌지의 적어도 일부, CH2 영역 및 CH3 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 사용하여 달성한다. 상기 융합은 1가지 이상의 융합물에 존재하는, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역(C_H1)을 갖지는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합물을 코딩하는 DNA 및, 필요한 경우, 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터 내에 삽입하고 적절한 숙주 유기체 내로 동시형질감염시킨다. 이것은 구축에서 사용되는 3가지 폴리펩티드 쇄의 불균등한 비가 최적 수율을 제공하는 실시양태에서 상기 3가지 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조절하는 데 있어서 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 균등한 비의 2가지 이상의 폴리펩티드 쇄의 발현이 높은 수율을 야기하거나 상기 비가 특별한 의미를 갖지 않는 경우 2가지 폴리펩티드 쇄 또는 3가지 폴리펩티드 쇄 모두에 대한 코딩 서열을 한 발현 벡터 내에 삽입할 수 있다.

한 방법에서, 이중특이적 항체는 한 아암(arm)에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 및 다른 아암에 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍(제2 결합 특이성을 제공함)으로 구성되어 있다. 이중특이적 분자의 반쪽에서만 면역글로불린 경쇄를 갖는 상기 비대칭적 구조는 원치 않은 면역글로불린 쇄 조합물로부터 원하는 이중특이적 화합물이 용이하게 분리될 수 있게 한다. 이 방법은 1994년 3월 3일 공개된 국제특허출원 공개 제WO 94/04690호에 기재되어 있다.

2개의 공유결합된 항체를 포함하는 이종접합체 항체도 본 발명의 범위 내에 있다. 상기 항체는 면역 시스템 세포를 원치 않은 세포에 표적화하고(미국 특허 제4,676,980호) HIV 감염을 치료하는(국제특허출원 공개 제WO 91/00360호 및 제WO 92/200373호; 및 유럽 특허 제03089호) 데 사용된다. 이종접합체 항체는 임의의 편리한 가교결합 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 적절한 가교결합제 및 가교결합 기법은 당업계에 잘 공지되어 있고 미국 특허 제4,676,980호에 기재되어 있다.

키메라 또는 하이브리드 항체도 가교결합제를 이용하는 방법을 비롯한 합성 단백질 화학 분야의 공지된 방법을 이용하여 시험관 내에서 제조할 수 있다. 예를 들어, 면역독소는 이황화 교환 반응을 이용하거나 티오에테르 결합을 형성함으로써 제작할 수 있다. 이 목적에 적합한 물질의 예로는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캡토부티르이미데이트를 들 수 있다.

항체 9TL의 1개 이상의 CDR 또는 항체 9TL로부터 유래된 1개 이상의 CDR을 포함하는 인간화된 항체는 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 단일클론 항체를 인간화하기 위해서는 4개의 일반적인 단계가 이용될 수 있다. 상기 단계는 다음과 같다: (1) 출발 항체 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인의 뉴클레오티드 서열 및 예측된 아미노산 서열을 확인하는 단계; (2) 인간화된 항체를 디자인하는 단계, 즉 인간화 과정 동안 어떤 항체 골격 영역을 사용할 지를 결정하는 단계; (3) 실제 인간화 방법/기법; 및 (4) 인간화된 항체의 형질감염 및 발현. 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호, 제5,807,715호, 제5,866,692호, 제6,331,415호, 제5,530,101호, 제5,693,761호, 제5,693,762호, 제5,585,089호, 제6,180,370호, 제5,225,539호 및 제6,548,640호를 참조한다.

재조합 인간화된 항체에 있어서, Fc 부분은 Fcγ 수용체 및 보체 면역 시스템과의 상호작용을 피하도록 변경될 수 있다. 이러한 종류의 변경은 케임브리지 대학의 병리학 교실 마이크 클락(Mike Clark) 박사에 의해 디자인되었고, 상기 항체의 제조 방법은 1999년 11월 18일 공개된 국제특허출원 공개 제WO 99/58572호에 기재되어 있다.

예를 들어, 불변 영역은 항체를 인간에서 임상 시험 및 치료에 사용하는 경우, 면역 반응을 피하기 위해 인간 불변 영역과 더 유사하도록 개조될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,997,867호 및 제5,866,692호를 참조한다.

본 발명은 그의 성질에 유의한 영향을 미치지 않는 기능적 등가물 항체, 및 증가된 또는 감소된 활성 및/또는 친화성을 나타내는 변이체를 포함하는 항체 9TL 및 6G에 대한 변경물을 포함한다. 예를 들어, 항체 9TL 또는 6G의 아미노산 서열은 표적 Aβ 펩티드에의 원하는 결합 특이성을 갖는 항체를 수득하도록 돌연변이될 수 있다. 폴리펩티드의 변경은 당업계에서 관용적인 기술이므로 본 명세서에 상세하게 기재될 필요가 없다. 폴리펩티드의 변경은 실시예에 예시되어 있다. 변경된 폴리펩티드의 예는 아미노산 잔기의 보존적 치환을 갖는 폴리펩티드, 기능적 활성을 유의하게 악화시키지 않는 아미노산의 하나 이상의 결실 또는 부가를 갖는 폴리펩티드, 또는 화학적 유사체가 사용된 폴리펩티드를 포함한다.

아미노산 서열 삽입체는 그 길이가 1개의 잔기부터 100개 이상의 잔기를 포함하는 폴리펩티드까지 이르는 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합체뿐만 아니라, 1개 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열내 삽입체를 포함한다. 말단 삽입체의 예로는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 에피토프 태그에 융합된 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 또는 폴리펩티드와 항체의 N- 또는 C-말단의 융합체를 포함한다.

치환 변이체는 항체 분자 내의 1개 이상의 아미노산 잔기가 제거되고 그 자리에 상이한 잔기가 삽입되어 있는 항체이다. 치환 돌연변이유발에 대한 가장 흥미로운 부위는 초가변 영역을 포함하지만, FR 변경도 고려된다. 보존적 치환은 "보존적 치환"이라는 표제 하에 하기 표 1에 기재되어 있다. 상기 치환이 생물학적 활성의 변화를 초래하는 경우, 하기 표 1에 "예시적 치환"으로 명명된, 또는 아미노산 클래스와 관련하여 이하에 더 상세히 기재된 보다 실질적인 변화가 도입될 수 있고 생성물도 스크리닝될 수 있다.

항체의 생물학적 성질의 실질적인 변경은 (a) 치환 영역 내의 폴리펩티드 골격의 구조를 예를 들어 시트 또는 나선 구조로 유지하는 것에 대한 상기 변경의 효과, (b) 표적 부위에서의 분자의 전하 또는 소수성을 유지하는 것에 대한 상기 변경의 효과, 또는 (c) 측쇄의 용적을 유지하는 것에 대한 상기 변경의 효과에 있어서 유의하게 상이한 치환을 선택함으로써 달성한다. 천연 발생 잔기는 공통된 측쇄 성질을 기초로 하여 하기 군으로 분류된다:

(1) 비-극성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) 전하 없는 극성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) 산성(음으로 하전됨) Asp, Glu;

(4) 염기성(양으로 하전됨): Lys, Arg;

(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및

(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe, His.

비-보존적 치환은 상기 클래스 중 한 클래스의 구성원을 또 다른 클래스의 구성원으로 교체함으로써 달성한다.

항체의 적절한 구조를 유지하는 데 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기는 분자의 산화적 안정성을 개선하고 비정상적인 가교결합을 방지하기 위해 일반적으로 세린으로 치환시킬 수도 있다. 대조적으로, 시스테인 결합은 특히 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우 항체의 안정성을 개선시키기 위해 항체에 부가될 수 있다.

아미노산 변경은 1개 이상의 아미노산을 변화시키거나 변경하는 것부터 한 영역, 예컨대, 가변 영역을 완벽하게 재디자인하는 것까지 다양할 수 있다. 가변 영역의 변화는 결합 친화성 및/또는 특이성을 바꿀 수 있다. 일부 실시양태에서, 1개 내지 5개 이상의 보존적 아미노산 치환이 CDR 도메인 내에 만들어진다. 다른 실시양태에서, 1개 내지 3개 이상의 보존적 아미노산 치환이 한 CDR 도메인 내에서 만들어진다. 다른 실시양태에서, 상기 CDR 도메인은 CDR H3 및/또는 CDR L3이다.

또한, 변경은 글리코실화된 폴리펩티드 및 비-글리코실화된 폴리펩티드뿐만 아니라, 다른 번역 후 변경, 예컨대, 상이한 당을 사용한 글리코실화, 아세틸화 및 인산화로 변경된 폴리펩티드도 포함한다. 항체는 그의 불변 영역 내의 보존된 위치에서 글리코실화된다(Jefferis and Lund, 1997, Chem. Immunol. 65:111-128; Wright and Morrison, 1997, TibTECH 15:26-32). 면역글로불린의 올리고사카라이드 측쇄는 단백질의 기능에 영향을 미치고(Boyd et al., 1996, Mol. Immunol. 32:1311-1318; Wittwe and Howard, 1990, Biochem. 29:4175-4180) 당단백질의 구조 및 제시된 3차원적 표면에 영향을 미칠 수 있는, 당단백질의 부분 사이의 분자내 상호작용에 영향을 미친다(Hefferis and Lund, supra; Wyss and Wagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7:409-416). 올리고사카라이드는 특이적 인식 구조를 기초로 하여 소정의 당단백질을 특정 분자에 표적화하는 데 기여할 수도 있다. 또한, 항체의 글리코실화는 ADCC에 영향을 미친다고 보고되어 있다. 특히, 이등분 GlcNAc의 형성을 촉진하는 글리코실트랜스퍼라제인 β(1,4)-N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 III(GnTIII)의 테트라사이클린-조절된 발현을 나타내는 CHO 세포는 개선된 ADCC 활성을 나타내는 것으로 보고되었다(Umana et al., 1999, Mature Biotech. 17:176-180).

항체의 라이코실화는 전형적으로 N-결합되어 있거나 O-결합되어 있다. "N-결합된"은 탄수화물 부분이 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착되어 있는 상태를 의미한다. X가 프롤린을 제외한 임의의 아미노산인 경우 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린, 아스파라긴-X-쓰레오닌 및 아스파라긴-X-시스테인은 효소에 의해 탄수화물 부분이 아스파라긴 측쇄에 부착되는 데 필요한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드 내의 상기 3개의 트리펩티드 서열 중 어느 하나의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 생성한다. O-결합된 글리코실화는 당인 N-아세틸갈락토사민, 갈라토스 및 자일로스 중 하나가 하이드록시아미노산, 예컨대, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시라이신이 사용될 수 있지만 가장 일반적으로는 세린 또는 쓰레오닌에 부착되는 것을 의미한다.

항체에의 글리코실화 부위의 부가는 상기 항체가 (N-결합된 글리코실화 부위의 경우) 상기 트리펩티드 서열들 중 하나 이상을 포함하도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성한다. 상기 변경은 (O-결합된 글리코실화 부위의 경우) 1개 이상의 세린 또는 쓰레오닌 잔기를 모 항체의 서열에 부가하거나 치환시킴으로써 달성할 수도 있다.

항체의 글리코실화 패턴은 기초가 되는 뉴클레오티드 서열을 변경하지 않으면서 변경할 수도 있다. 글리코실화는 항체를 발현하는 데 사용되는 숙주 세포에 주로 달려 있다. 잠재적 치료제로서 재조합 당단백질, 예컨대, 항체의 발현에 사용되는 세포 종류가 천연 세포인 경우는 거의 없기 때문에, 항체의 글리코실화 패턴의 변경이 예측될 수 있다(예를 들어, 문헌(Hse et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:9062-9070) 참조).

숙주 세포의 선택 이외에, 항체의 재조합 제조 동안에 글리코실화에 영향을 미치는 인자는 생장 방식, 배지 제제화, 배양 밀도, 산소첨가, pH, 정제 방식 등을 포함한다. 특정 숙주 유기체 내에서 글리코실화 패턴을 변경하기 위한 다양한 방법들, 예컨대 올리고사카라이드 제조에 관여하는 특정 효소의 도입 또는 과다발현이 제안되었다(미국 특허 제5,047,335호, 제5,510,261호 및 제5,278,299호). 글리코실화 또는 특정 종류의 글리코실화는 예를 들어, 엔도글리코시다제 H(Endo H), 실시예 3에 기재된 N-글리코시다제 F, 엔도글리코시다제 F1, 엔도글리코시다제 F2 또는 엔도글리코시다제 F3을 사용한 효소적 방법을 통해 당단백질로부터 제거될 수 있다. 또한, 재조합 숙주 세포는 특정 종류의 폴리사카라이드를 프로세싱하는 데 있어서 결함을 갖도록 유전적으로 개조될 수 있다. 이 기법들 및 이와 유사한 기법들이 당업계에 잘 공지되어 있다.

다른 변경 방법은 효소적 수단, 산화적 치환 및 킬레이션(chelation)을 포함하나 이들로 한정되지 않는 당업계에 공지되어 있는 커플링 기법을 이용한 변경을 포함한다. 변경은 예를 들어, 면역분석용 표지를 부착시키는 데 이용될 수 있다. 변경된 9TL 폴리펩티드는 당업계에 확립된 방법을 이용하여 제조하고 당업계에 공지된 표준 분석법(이 분석법들 중 일부는 하기 실시예에 기재되어 있음)을 이용하여 스크리닝할 수 있다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 항체는 변경된 불변 영역, 예컨대, 면역학적 불활성 또는 부분적 불활성을 나타내는 불변 영역, 예를 들어, 보체 매개 용해를 유발하지 않거나, ADCC를 자극하지 않거나, 미세아교세포를 활성화시키지 않거나; 또는 보체 매개 용해의 유발, ADCC의 자극 및 미세아교세포의 활성화 중 임의의 1가지 이상의 활성에 있어서 감소한 활성을 나타내는 불변 영역을 포함한다. 불변 영역의 상이한 변경이 이펙터 기능의 최적 수준 및/또는 조합을 달성하는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, 문헌(Morgan et al., Immunology 86:319-324 (1995); Lund et al., J. Immunology 157:4963-9 157:4963-4969 (1996); Idusogie et al., J. Immunology 164:4178-4184 (2000); Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601 (1989); and Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76 (1998))을 참조한다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 문헌(Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624), 국제특허출원 제PCT/GB99/01441호 및/또는 영국 특허출원 제9809951.8호에 기재된 바와 같이 변경된다. 다른 실시양태에서, 항체는 A330P331로부터 S330S331(야생형 IgG2a 서열을 기준으로 넘버링한 아미노산)로의 돌연변이를 포함하는 인간 중쇄 IgG2a를 포함한다(Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624). 다른 실시양태에서, 불변 영역은 N-결합된 글리코실화에 대해 글리코실화되어 있지 않다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 불변 영역 내의 N-글리코실화 인식 서열의 일부인 글리코실화된 아미노산 잔기 또는 플랭킹 잔기를 돌연변이시켜 N-결합된 글리코실화에 대해 글리코실화되어 있지 않다. 예를 들어, N-글리코실화 부위 N297은 A, Q, K 또는 H로 돌연변이될 수 있다. 문헌(Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601 (1989); and Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76 (1998))을 참조한다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 N-결합된 글리코실화에 대해 글리코실화되어 있지 않다. 불변 영역은 효소적 방법(예컨대, 효소 PNGase에 의한 탄수화물의 제거) 또는 글리코실화 결여 숙주 세포 내에서의 발현에 의해 N-결합된 글리코실화에 대해 글리코실화되지 않을 수 있다.

다른 항체 변경은 1999년 11월 18일 공개된 국제특허출원 공개 제WO 99/58572호에 기재된 바와 같이 변경된 항체를 포함한다. 상기 항체는 표적 분자에 대한 결합 도메인 이외에 인간 면역글로불린 중쇄의 불변 도메인의 전부 또는 일부와 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 갖는 이펙터 도메인을 포함한다. 상기 항체는 표적 분자의 유의한 보체 의존적 용해 또는 세포-매개 파괴를 유발하지 않으면서 표적 분자에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이펙터 도메인은 FcRn 및/또는 FcγRIIb에 특이적으로 결합할 수 있다. 이들은 전형적으로 2개 이상의 인간 면역글로불린 중쇄 C_H2 도메인으로부터 유래된 키메라 도메인을 기초로 한 것이다. 이 방식으로 변경된 항체는 통상적인 항체 요법에 대한 염증 반응 및 다른 불리한 반응을 피하기 위해 만성 항체 요법에서 사용하기에 특히 적합하다.

본 발명은 친화성 성숙(matured) 실시양태를 포함한다. 예를 들어, 친화성 성숙 항체는 당업계에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다(문헌(Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10:779-783); 문헌(Barbas et al., 1994, Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813); 문헌(Schier et al., 1995, Gene, 169:147-155); 문헌(Yelton et al., 1995, J. Immunol., 155:1994-2004); 문헌(Jackson et al., 1995, J. Immunol., 154(7):3310-9); 문헌(Hawkins et al, 1992, J. Mol. Biol., 226:889-896); 및 국제특허출원 공개 제WO 04/058184호).

하기 방법들은 항체의 친화성의 조절 및 CDR의 특징규명에 사용될 수 있다. 항체의 CDR을 특징규명하고/하거나 폴리펩티드, 예컨대, 항체의 결합 친화성을 변화시키는(예컨대, 개선하는) 한 방법은 "라이브러리 스캐닝 돌연변이유발"로 지칭된다. 일반적으로, 라이브러리 스캐닝 돌연변이유발은 다음과 같이 수행된다. CDR 내의 1개 이상의 아미노산 위치를, 당업계에 인식된 방법을 이용하여 2개 이상(예컨대, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개)의 아미노산으로 치환시킨다. 이것은 작은 클론 라이브러리를 발생시키는데(일부 실시양태에서, 분석된 아미노산 위치마다 하나씩), 각 라이브러리는 (2가지 이상의 아미노산이 위치마다 치환된 경우) 2가지 이상의 구성원으로 이루어져 있다. 일반적으로, 라이브러리는 천연 (비치환된) 아미노산을 포함하는 클론도 포함한다. 소수의 클론, 예컨대, (라이브러리의 복잡성에 따라) 약 20 내지 80개의 클론을 표적 폴리펩티드(또는 다른 결합 표적)의 결합 친화성에 대해 스크리닝하고, 결합이 증가된, 동일한, 감소한 또는 없는 후보물질을 확인한다. 결합 친화성의 측정 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 결합 친화성은 결합 친화성에 있어서 약 2배 이상의 차이를 검출하는 BIAcore 표면 플라즈몬 공명 분석(SPR)을 이용하여 측정할 수 있다. BIAcore는 출발 항체가 이미 비교적 높은 친화성, 예를 들어, 약 10 nM 이하의 K_D로 결합하는 경우 특히 유용하다. BIAcore SPR을 이용한 스크리닝은 본원의 실시예에 기재되어 있다.

결합 친화성은 키넥사 바이오센서(Kinexa Biocensor), 신틸레이션 인접성(proximity) 분석법, ELISA, ORIGEN 면역분석법(IGEN), 형광 켄칭, 형광 전이, 및/또는 효모 디스플레이를 이용하여 측정할 수 있다. 결합 친화성은 적절한 생체분석법을 이용하여 스크리닝할 수도 있다.

일부 실시양태에서, CDR 내의 모든 아미노산 위치는 당업계에 인식된 돌연변이유발법들(이 방법들 중 일부는 본 명세서에 기재되어 있음)을 이용하여 모든 20가지 천연 아미노산으로 (일부 실시양태에서는 한 번에 하나씩) 치환시킨다. 이것은 작은 클론 라이브러리를 발생시키는데(일부 실시양태에서, 분석된 아미노산 위치마다 하나씩), 각 라이브러리는 (모든 20가지 아미노산이 위치마다 치환된 경우) 20가지 구성원으로 이루어져 있다.

일부 실시양태에서, 스크리닝될 라이브러리는 동일한 CDR 또는 2개 이상의 CDR 내에 있을 수 있는 2개 이상의 위치에서 치환을 포함한다. 따라서, 라이브러리는 1개의 CDR 내의 2개 이상의 위치에서 치환을 포함할 수 있다. 라이브러리는 2개 이상의 CDR 내의 2개 이상의 위치에서 치환을 포함할 수 있다. 라이브러리는 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 CDR 내에서 발견되는 3, 4 또는 5개 이상의 위치에서 치환을 포함할 수 있다. 상기 치환은 낮은 잉여(redundancy) 코돈을 사용하여 발생시킬 수 있다. 예를 들어, 문헌(Balint et al. , (1993) Gene 137(1):109-18)의 표 2를 참조한다.

CDR은 CDR H3 및/또는 CDR L3일 수 있다. CDR은 CDR L1, CDR L2, CDR L3, CDR H1, CDR H2 및/또는 CDR H3 중 하나 이상일 수 있다. CDR은 카바트 CDR, 초티아 CDR 또는 연장된 CDR일 수 있다.

개선된 결합을 나타내는 후보물질을 스크리닝하여, 친화성을 개선시키는 CDR 치환 ("개선된" 치환으로도 지칭됨) 돌연변이체를 찾을 수 있다. 결합하는 후보물질도 시퀀싱하여, 결합을 보유하는 CDR 치환을 찾을 수 있다.

스크리닝은 다수회 실시할 수 있다. 예를 들어, 개선된 결합을 나타내는 후보물질(후보물질은 1개 이상의 CDR의 1개 이상의 위치에서 아미노산 치환을 각각 포함함)은 개선된 CDR 위치(즉, 치환된 돌연변이체가 개선된 결합을 보이는 CDR 내의 아미노산 위치) 각각에서 적어도 원래의 아미노산 및 치환된 아미노산을 포함하는 제2 라이브러리의 디자인에도 유용하다. 상기 라이브러리의 제조 및 선별 또는 선택은 이하에 더 논의되어 있다.

또한, 라이브러리 스캐닝 돌연변이유발법은 개선된 결합, 동일한 결합 또는 감소한 결합을 나타내거나 결합을 나타내지 않는 클론의 빈도가 항체-항원 결합체의 안정성을 위한 각 아미노산 위치의 중요성에 대한 정보를 제공하는 한 CDR을 특징규명하기 위한 수단을 제공한다. 예를 들어, CDR의 한 위치가 모든 20가지 아미노산으로 변경된 경우 결합을 보유한다면, 상기 위치는 항원 결합에 필요하지 않을 가능성이 큰 위치로서 확인된다. 반대로, CDR의 한 위치가 작은 비율의 치환에서만 결합을 보유한다면, 상기 위치는 CDR 기능에 중요한 위치로서 확인된다. 따라서, 라이브러리 스캐닝 돌연변이유발법은 많은 상이한 아미노산(모든 20가지 아미노산을 포함함)으로 변경될 수 있는 CDR 내의 위치들, 및 변경될 수 없거나 소수의 아미노산으로 변경될 수만 있는 CDR 내의 위치들에 대한 정보를 제공한다.

개선된 친화성을 나타내는 후보물질은 그 위치에서 개선된 아미노산 또는 원래의 아미노산을 포함하는 제2 라이브러리 내에서 조합될 수 있고, 원하는 라이브러리의 복잡성, 또는 원하는 스크리닝 또는 선별 방법을 이용할 때 허용되는 라이브러리의 복잡성에 따라 상기 위치에서 추가 치환을 추가로 포함할 수 있다. 추가로, 원하는 경우, 인접하는 아미노산 위치는 2개 이상의 아미노산까지 무작위화될 수 있다. 인접하는 아미노산의 무작위화는 돌연변이체 CDR에서 추가의 구조적 유연성을 허용할 수 있고, 상기 추가의 구조적 유연성은 더 많은 수의 개선 돌연변이의 도입을 허용하거나 용이하게 할 수 있다. 라이브러리는 제1회 스크리닝에서 개선된 친화성을 나타내지 않는 위치에서 치환을 포함할 수도 있다.

제2 라이브러리는 BIAcore SPR을 이용한 스크리닝, 및 파지 디스플레이, 효모 디스플레이 및 라이보좀 디스플레이를 비롯한 당업계에 공지된 임의의 선별 방법을 이용한 선별을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 방법의 이용을 통해, 개선된 결합 친화성 및 변경된 결합 친화성을 나타내는 라이브러리 구성원에 대해 스크리닝되거나 선별된다.

또한, 본 발명은 본 발명의 항체(예컨대, 9TL 및 6G) 또는 폴리펩티드로부터 유래된 1개 이상의 단편 또는 영역을 포함하는 융합 단백질도 포함한다. 한 실시양태에서, 가변 경쇄 영역의 10개 이상의 인접 아미노산 및/또는 보이는 가변 중쇄 영역의 10개 이상의 아미노산을 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다. 다른 실시양태에서, 가변 경쇄 영역의 약 10개 이상, 약 15개 이상, 약 20개 이상, 약 25개 이상 또는 약 30개 이상의 인접 아미노산; 및/또는 가변 중쇄 영역의 약 10개 이상, 약 15개 이상, 약 20개 이상, 약 25개 이상 또는 약 30개 이상의 인접 아미노산을 포함하는 융합 폴리펩티드를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 융합 폴리펩티드는 항체 9TL 또는 6G의 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 융합 폴리펩티드는 항체 9TL 또는 6G의 1개 이상의 CDR을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 융합 폴리펩티드는 항체 9TL 또는 6G의 CDR H3 및/또는 CDR L3을 포함한다. 본 발명의 목적상, 9TL 또는 6G 융합 단백질은 1개 이상의 9TL 또는 항체 6G, 및 천연 분자에서 부착되어 있지 않은 또 다른 아미노산 서열, 예를 들어, 또 다른 영역으로부터 유래된 이종 서열 또는 동종 서열을 각각 포함한다. 예시적 이종 서열은 "태그", 예컨대, FLAG 태그 또는 6His 태그를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 태그는 당업계에 잘 공지되어 있다.

융합 폴리펩티드는 당업계에 공지되어 있는 방법, 예를 들어, 합성 방법 또는 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 융합 단백질은 이 융합 단백질이 예컨대, 화학적 합성법을 포함하는, 당업계에 공지되어 있는 다른 방법에 의해 제조될 수 있다 하더라도 본 명세서에 기재된 재조합 방법을 이용하여 상기 융합 단백질을 코딩하는 발현 폴리뉴클레오티드를 제조함으로써 제조할 수 있다.

본 발명은 고체 지지체에의 커플링을 용이하게 하는 물질(예컨대, 바이오틴 또는 아비딘)에 접합된 (예를 들어, 결합된) 항체 또는 폴리펩티드를 포함하는 조성물도 제공한다. 간결함을 위해, 일반적으로 항체를 언급할 것이지만, 상기 방법들은 본 명세서에 기재된 Aβ 결합 실시양태들 중 임의의 실시양태에 적용됨을 이해해야 한다. 접합은 일반적으로 상기 성분들을 본 명세서에 기재된 바와 같이 연결함을 의미한다. 연결(일반적으로 적어도 투여를 위해 상기 성분들을 근접한 연결 상태로 고착시키는 것)은 많은 임의의 방식으로 달성될 수 있다. 물질과 항체 사이의 직접적 반응은 각각이 서로 반응할 수 있는 치환기를 보유하는 경우 가능하다. 예를 들어, 상기 물질 및 항체 중 어느 하나의 친핵성 기, 예컨대, 아미노 또는 설프하이드릴 기는 나머지 하나의 카보닐-보유 기, 예컨대, 무수물 또는 산 할로겐화물, 또는 우수한 이탈 기(예컨대, 할로겐화물)를 보유하는 알킬 기와 반응할 수 있다.

본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 표지화제("표지"로도 지칭됨), 예컨대, 형광 물질, 방사성 분자, 또는 당업계에 공지되어 있는 임의의 다른 표지에 연결될 수 있다. 일반적으로 신호를 (직접적으로 또는 간접적으로) 제공하는 표지는 당업계에 공지되어 있다.

또한, 본 발명은 항체 9TL 또는 6G, 및 본 개시내용에 비추어 자명한 바와 같이 본 명세서에 기재된 임의의 또는 모든 항체 및/또는 폴리펩티드를 포함하는 조성물(약학 조성물을 포함함) 및 키트를 제공한다.

손상된 이펙터 기능을 갖는 항-Aβ 펩티드 항체 및 폴리펩티드

본 발명의 방법은 Aβ 펩티드에 특이적으로 결합하고 손상된 이펙터 기능을 갖는 항체 또는 폴리펩티드(항체 또는 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물을 포함함)를 사용한다. 또한, 상기 항체 및 폴리펩티드는 하기 특성들 중 임의의 (1가지 이상의) 특성을 특징으로 한다: (a) 개체에서 아밀로이드 플라크의 형성을 억제하는 특성; (b) 개체의 눈에서 아밀로이드 플라크를 감소시키는 특성; (c) AMD(건성 AMD 및 습성 AMD 둘다), 녹내장, 당뇨성 망막병증(황반 부종을 포함함) 및 다른 관련된 망막 변성 질환을 포함하나 이들로 한정되지 않는 안 질환의 1가지 이상의 증상을 치료하거나, 예방하거나 개선시키는 특성; (d) 망막 기능의 유의한 보호 또는 회복을 유도하는 특성; 및 (e) 시력의 유의한 보존 또는 회복을 유도하는 특성.

본 명세서에 기재된 항체 및 폴리펩티드는 바람직한 안전성 프로파일을 나타낼 수 있는데, 예를 들어, 본 발명의 조성물은 하기 증상 중 임의의 1가지 이상의 증상의 유의한 또는 허용불가능한 수준을 초래하지 않거나 하기 증상 중 임의의 1가지 이상의 증상의 수준을 감소시킨다: 뇌혈관 내에서의 출혈(뇌출혈); 수막뇌염(자기 공명 스캔의 변화를 포함함); 뇌 척수액 중의 증가한 백혈구 수; 및 중추신경계 염증.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "손상된 이펙터 기능"("면역학적 불활성" 또는 "부분적 면역학적 불활성"과 상호교환적으로 사용됨)을 갖는 항체 또는 폴리펩티드는 임의의 이펙터 기능을 갖지 않거나 (비변경된 또는 천연 발생 불변 영역을 갖는 항체 또는 폴리펩티드에 비해) 이펙터 기능의 감소된 활성을 나타내는, 예를 들어, 하기 기능 중 임의의 1가지 이상의 기능에 있어서 무활성 또는 감소된 활성을 나타내는 항체 또는 폴리펩티드를 의미한다: a) 보체 매개 용해의 유발; b) ADCC의 자극; 및 c) 미세아교세포의 활성화. 이펙터 기능 활성은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 정도 감소될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 표적의 유의한 보체 의존적 용해 또는 세포-매개 파괴를 유발하지 않으면서 Aβ 펩티드에 결합한다. 예를 들어, 불변 영역 상의 Fc 수용체 결합 부위는 특정 Fc 수용체, 예컨대, FcγRI, FcγRII 및/또는 FcγRIII에의 결합 친화성을 제거하거나 감소시키도록 변경되거나 돌연변이될 수 있다. 간결함을 위해, 항체를 언급할 것이지만, 본 발명의 실시양태들은 폴리펩티드에도 적용됨을 이해해야 한다. EU 넘버링 시스템(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest; 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Healthy, Bethesda, Md., 1991)은 (예를 들어, IgG 항체의) 불변 영역의 어떤 아미노산 잔기가 변경되거나 돌연변이되는 지를 표시하는 데 이용된다. 상기 넘버링은 특정한 종류의 항체(예컨대, IgG1) 또는 종(예컨대, 인간)에 대해 이용될 수 있지만, 유사한 변화가 항체 및 종의 종류와 무관하게 만들어질 수 있음을 이해해야 한다.

일부 실시양태에서, Aβ 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체는 손상된 이펙터 기능을 갖는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 천연 발생 서열을 가질 수 있거나 변이체이다. 일부 실시양태에서, 천연 발생 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열은 예를 들어, 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실에 의해 돌연변이되어, 상기 불변 영역의 이펙터 기능이 손상된다. 일부 실시양태에서, 중쇄 불변 영역의 Fc 영역의 N-글리코실화도 변화될 수 있는데, 예를 들어, 상기 N-글리코실화가 완전히 또는 부분적으로 제거되어 상기 불변 영역의 이펙터 기능이 손상될 수 있다.

일부 실시양태에서, 이펙터 기능은 항-Aβ 펩티드의 (예컨대, IgG의 C_H2 도메인 내의) Fc 영역의 N-글리코실화를 제거함으로써 손상시킨다. 일부 실시양태에서, Fc 영역의 N-글리코실화는 불변 영역 내의 글리코실화 인식 서열의 일부인 글리코실화된 아미노산 잔기 또는 플랭킹 잔기를 돌연변이시켜 제거한다. X가 프롤린을 제외한 임의의 아미노산인 경우 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린(N-X-S), 아스파라긴-X-쓰레오닌(N-X-T) 및 아스파라긴-X-시스테인(N-X-C)은 N-글리코실화를 위해 탄수화물 부분이 효소적 방법에 의해 아스파라긴 측쇄에 부착되는 데 필요한 인식 서열이다. 불변 영역 내의 트리펩티드 서열 내의 아미노산 중 임의의 아미노산을 돌연변이시켜 글리코실화되지 않은 IgG를 생성한다. 예를 들어, 인간 IgG1 및 IgG3의 N-글리코실화 부위 N297은 A, D, Q, K 또는 H로 돌연변이될 수 있다. 문헌(Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601 (1989); and Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76 (1998))을 참조한다. Asn-297이 Gln, His 또는 Lys로 치환된 인간 IgG1 및 IgG3은 인간 FcγRI에 결합하지 않고, IgG1의 경우 완전히 상실되어 있고 IgG3의 경우 급격히 감소되어 있는 C1q 결합능을 갖는 보체를 활성화시키지 못한다고 보고되어 있다. 일부 실시양태에서, 상기 트리펩티드 서열 내의 아미노산 N은 아미노산 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W 및 Y 중 임의의 하나로 돌연변이된다. 일부 실시양태에서, 상기 트리펩티드 서열 내의 아미노산 N은 보존적 치환으로 돌연변이된다. 일부 실시양태에서, 상기 트리펩티드 서열 내의 아미노산 X는 프롤린으로 돌연변이된다. 일부 실시양태에서, 상기 트리펩티드 서열 내의 아미노산 S는 A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, V, W 또는 Y로 돌연변이된다. 일부 실시양태에서, 상기 트리펩티드 서열 내의 아미노산 T는 A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, V, W 또는 Y로 돌연변이된다. 일부 실시양태에서, 상기 트리펩티드 서열 내의 아미노산 C는 A, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, V, W 또는 Y로 돌연변이된다. 일부 실시양태에서, 상기 트리펩티드 다음의 아미노산은 P로 돌연변이된다. 일부 실시양태에서, 불변 영역 내의 N-글리코실화는 효소적 방법(예컨대, 실시예 3에 기재된 N-글리코시다제 F, 엔도글리코시다제 F1, 엔도글리코시다제 F2, 엔도글리코시다제 F3 및 엔도글리코시다제 H)에 의해 제거된다. N-글리코실화의 제거는 N-글리코실화가 결여되어 있는 세포주 내에서 항체를 생성함으로써 달성할 수도 있다(Wright et al., J Immunol. 160(7):3393-402 (1998)).

일부 실시양태에서, 불변 영역의 N-글리코실화 부위에 부착된 올리고사카라이드와 상호작용하는 아미노산 잔기는 FcγRI에의 결합 친화성을 감소시키도록 돌연변이된다. 예를 들어, 인간 IgG3의 F241, V264 및 D265가 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, 문헌(Lund et al., J. Immunology 157:4963-4969 (1996))을 참조한다.

일부 실시양태에서, 이펙터 기능은 국제특허출원 공개 제99/58572호 및 문헌(Armour et al., Molecular Immunology 40: 585-593 (2003); Reddy et al., J. Immunology 164:1925-1933 (2000))에 기재된 인간 IgG의 233-236, 297 및/또는 327-331과 같은 영역들을 변경시킴으로써 손상시킨다. 국제특허출원 공개 제WO 99/58572호 및 상기 아모르(Armour)의 문헌에 기재된 항체는 표적 분자에 대한 결합 도메인 이외에 인간 면역글로불린 중쇄의 불변 영역의 전부 또는 일부와 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 갖는 이펙터 도메인을 포함한다. 상기 항체는 표적 분자의 유의한 보제 의존적 용해 또는 세포-매개 파괴를 유발하지 않으면서 표적 분자에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 이펙터 도메인은 FcγRI, FcγRIIa 및 FcγRIII에 대한 감소한 친화성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 상기 이펙터 도메인은 FcRn 및/또는 FcγRIIb에 특이적으로 결합할 수 있다. 이들은 전형적으로 2개 이상의 인간 면역글로불린 중쇄 C_H2 도메인으로부터 유래된 키메라 도메인을 기초로 한 것이다. 이 방식으로 변경된 항체는 통상적인 항체 요법에 대한 염증 반응 및 다른 불리한 반응을 피하기 위해 만성 항체 요법에서 사용하기에 특히 적합하다. 일부 실시양태에서, 항체의 중쇄 불변 영역은 하기 돌연변이들 중 임의의 돌연변이를 갖는 인간 중쇄 IgG1이다: 1) A327A330P331로부터 G327S330S331로의 돌연변이; 2) E233L234L235G236으로부터 G236이 결실된 P233V234A235로의 돌연변이; 3) E233L234L235로부터 P233V234A235로의 돌연변이; 4) E233L234L235G236A327A330P331로부터 G236이 결실된 P233V234A235G327S330S331로의 돌연변이; 5) E233L234L235A327A330P331로부터 P233V234A235G327S330S331로의 돌연변이; 및 6) N297로부터 A297 또는 N을 제외한 임의의 다른 아미노산으로의 돌연변이. 일부 실시양태에서, 항체의 중쇄 불변 영역은 A330P331로부터 S330S331로의 돌연변이를 갖는 인간 중쇄 IgG2이다. 일부 실시양태에서, 항체의 중쇄 불변 영역은 E233F234L235G236으로부터 G236이 결실된 P233V234A235로의 돌연변이, E233F234L235로부터 P233V234A235로의 돌연변이, 및 S228L235로부터 P228E235로의 돌연변이 중 임의의 돌연변이를 갖는 인간 중쇄 IgG4이다.

항체의 불변 영역은 보체 활성화를 손상시키도록 변경될 수도 있다. 예를 들어, 보체의 C1 성분의 결합 후 IgG 항체의 보체 활성화는 C1 결합 모티프(예를 들어, C1q 결합 모티프) 내의 불변 영역 내의 아미노산 잔기를 돌연변이시켜 감소시킬 수 있다. 인간 IgG1의 D270, K322, P329 및 P331 각각에 대한 Ala 돌연변이는 C1q에 결합하여 보체를 활성화시키는 항체의 능력을 유의하게 감소시킨다고 보고되어 있다. 뮤린 IgG2b의 경우, C1q 결합 모티프는 잔기 E318, K320 및 K322를 구성한다(Idusogie et al., J. Immunology 164:4178-4184 (2000); Duncan et al., Nature 322: 738-740 (1988)).

뮤린 IgG2b의 경우 확인된 C1q 결합 모티프 E318, K320 및 K322는 다른 항체 아이소타입의 경우에도 공통적으로 존재하는 것으로 생각된다(Duncan et al., Nature 322: 738-740 (1988)). IgG2b에 대한 C1q 결합 활성은 3개의 특정된 잔기들 중 임의의 한 잔기를 그의 측쇄 상에 부적절한 작용기를 갖는 잔기로 치환시켜 제거할 수 있다. C1q 결합을 제거하기 위해 이온성 잔기를 Ala으로만 치환시킬 필요는 없다. C1q 결합을 제거하기 위해 상기 3개의 잔기들 중 임의의 한 잔기 대신에 다른 알킬-치환된 비-이온성 잔기, 예컨대, Gly, Ile, Leu 또는 Val, 또는 방향족 비-극성 잔기, 예컨대, Phe, Tyr, Trp 및 Pro를 사용할 수도 있다. 또한, C1q 결합 활성을 제거하기 위해 잔기 320 및 322 대신에(그러나, 잔기 318은 아님) 극성 비-이온성 잔기, 예컨대, Ser, Thr, Cys 및 Met을 사용할 수도 있다.

본 발명은 손상된 이펙터 기능을 갖는 항체로서 변경된 힌지 영역을 갖는 항체 또한 제공한다. Fc 수용체에 대한 인간 IgG의 결합 친화성은 상기 힌지 영역을 변경시켜 조절할 수 있다(Canfield et al., J. Exp. Med. 173:1483-1491 (1991); Hezareh et al., J. Virol. 75:12161-12168 (2001); Redpath et al., Human Immunology 59:720-727 (1998)). 특정 아미노산 잔기는 돌연변이되거나 결실될 수 있다. 변경된 힌지 영역은 C_H1 도메인의 항체 클래스 또는 서브클래스와는 상이한 항체 클래스 또는 서브클래스의 항체로부터 유래된 완전한 힌지 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 클래스 IgG 항체의 불변 도메인(C_H1)은 클래스 IgG4 항체의 힌지 영역에 부착될 수 있다. 별법으로, 새로운 힌지 영역은 반복부 내의 각 유니트가 천연 힌지 영역으로부터 유래된 반복 유니트 또는 천연 힌지의 일부를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 천연 힌지 영역은 1개 이상의 시스테인 잔기를 중성 잔기, 예컨대, 알라닌으로 전환시키거나 적절하게 배치된 잔기를 시스테인 잔기로 전환시킴으로써 변경시킨다(미국 특허 제5,677,425호). 이러한 변경은 당업계에 공지되어 있는 단백질 화학 기법, 바람직하게는 유전적 개조 기법을 이용하여 본 명세서에 기재된 바와 같이 수행한다.

Aβ 펩티드에 특이적으로 결합하고 손상된 이펙터 기능을 갖는 중쇄 불변 영역에 융합되어 있는 폴리펩티드도 본 명세서에 기재된 방법에서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 항체 9TL 또는 표 3에 기재된 상기 항체의 변이체로부터 유래된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 Aβ 펩티드에 결합하는 단일 도메인 항체로부터 유래된다. 단일 도메인 항체는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제조할 수 있다(Omidfar et al., Tumour Biol. 25:296-305 (2004); Herring et al., Trends in Biotechnology 21 :484-489 (2003)).

일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 F(ab')₂ 단편이 아니다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 Fab 단편이 아니다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 단일쇄 항체 scFv가 아니다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 PEG화된 F(ab')₂ 단편이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 PEG화된 Fab 단편이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 PEG화된 단일쇄 항체 scFv이다.

당업계에 공지되어 있는, 손상된 이펙터 기능을 갖는 항체를 제조하는 다른 방법도 이용될 수 있다.

변경된 불변 영역을 갖는 항체 및 폴리펩티드는 출발 항체에 비해 생물학적 활성에 있어서 이펙터 기능 감소의 수준을 평가하기 위한 1가지 이상의 분석법으로 시험할 수 있다. 예를 들어, 보체 또는 Fc 수용체(예컨대, 미세아교세포 상의 Fc 수용체)에 결합하는 변경된 Fc 영역을 갖거나 변경된 힌지 영역을 갖는 항체 또는 폴리펩티드의 능력은 본 명세서에 기재된 분석법 및 당업계에 공지되어 있는 임의의 분석법을 이용하여 평가할 수 있다(국제특허출원 공개 제WO 99/58572호; 문헌(Armour et al., Molecular Immunology 40: 585-593 (2003)); 문헌(Reddy et al., J. Immunology 164:1925-1933 (2000)); 및 문헌(Song et al., Infection and Immunity 70:5177-5184 (2002)).

일부 실시양태에서, Aβ 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체는 다클론 항체이다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 단일클론 항체이다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 인간 항체이다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 키메라 항체이다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 인간화된 항체이다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 영장류화된(primatized) 항체이다. 예를 들어, 문헌(Yocum et al., J. Rheumatol. 25:1257-62 (1998); Bugelski et al., Human & Experimental Toxicoloy 19:230-243 (2000))을 참조한다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 항체가 인간 면역 시스템을 활성화시키지 않도록 돌연변이에 의해 탈면역화된다. 예를 들어, 문헌(Nanus, et al., J. Urology 170:S84-S89 (2003))을 참조한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, Aβ 펩티드는 APP의 효소적 절단 생성물의 임의의 단편을 포함한다. 예를 들어, Aβ 펩티드는 Aβ_1-40 펩티드, Aβ_1-42 펩티드 또는 Aβ_1-43 펩티드의 임의의 단편; 및 Aβ_1-40 펩티드, Aβ_1-42 펩티드 또는 Aβ_1-43 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에서 다양한 수의 아미노산이 절단되어 있는 펩티드를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 아미노산 넘버링은 Aβ_1-43의 넘버링(서열번호 17)을 기초로 한 것이다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ 펩티드의 잔기 1-16 내의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ 펩티드의 잔기 16-28 내의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ_1-40 펩티드의 잔기 28-40 내의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ_1-42 펩티드의 잔기 28-42 내의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ_1-43 펩티드의 잔기 28-43 내의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 전장 APP에 결합하지 않으면서 Aβ 펩티드에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ의 가용성 형태에 결합하지 않으면서 Aβ의 응집된 형태에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ의 응집된 형태에 결합하지 않으면서 Aβ의 가용성 형태에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ의 응집된 형태 및 가용성 형태 둘다에 특이적으로 결합한다. Aβ의 다양한 응집된 형태에 결합하는 항체는 당업계에 공지되어 있는데, 그 예로는 Aβ-유래의 분산성 리간드(ADDL)에 결합하는 항체; 및 아밀로이드 원섬유 및/또는 침착물에 결합하는 항체를 들 수 있다(국제특허출원 공개 제WO 03/104437호; 미국 특허출원 공개 제2003/0147887호; 및 미국 특허출원 공개 제2004/0219146호).

일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 3D6 면역글로불린 경쇄(미국 특허출원 공개 제2003/0165496호 또는 제2004/0087777호에서 서열번호 2)로부터 유래된 1개, 2개 또는 3개의 CDR, 및/또는 3D6 면역글로불린 중쇄(미국 특허출원 공개 제2003/0165496호 및 제2004/0087777호에서 서열번호 4)로부터 유래된 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 미국 특허출원 공개 제2003/0165496호에서 서열번호 8에 기재된 가변 중쇄 영역, 및 미국 특허출원 공개 제2003/0165496호에서 서열번호 5에 기재된 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 미국 특허출원 공개 제2003/0165496호에서 서열번호 12에 기재된 가변 중쇄 영역, 및 미국 특허출원 공개 제2003/0165496호에서 서열번호 11에 기재된 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 10D5 면역글로불린 경쇄(미국 특허출원 공개 제2003/0165496호 및 제2004/0087777호에서 서열번호 14)로부터 유래된 1개, 2개 또는 3개의 CDR, 및/또는 10D5 면역글로불린 중쇄(미국 특허출원 공개 제2003/0165496호 및 제2004/0087777호에서 서열번호 16)로부터 유래된 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ_1-40 펩티드의 잔기 33-40 내의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 아미노산 35-40을 포함하는 Aβ_1-40 펩티드 상의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 아미노산 36-40을 포함하는 Aβ_1-40 펩티드 상의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 아미노산 39 및/또는 40을 포함하는 Aβ_1-40 펩티드 상의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 Aβ_1-40 펩티드에 특이적으로 결합하지만 Aβ_1-42 펩티드 및/또는 Aβ_1-43 펩티드에는 특이적으로 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 항체 9TL, 또는 본 명세서에 기재된, 항체 9TL로부터 유래된 항체 또는 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 항체 9TL, 및/또는 항체 9TL로부터 유래된 항체 또는 폴리펩티드와 Aβ_1-40 펩티드의 결합을 경쟁적으로 억제한다. 일부 실시양태에서, 항체는 국제특허출원 공개 제WO 04/032868호에 기재된 항체 2286이 아니다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 항체 6G, 또는 본 명세서에 기재된, 항체 6G로부터 유래된 항체 또는 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 항체 6G, 및/또는 항체 6G로부터 유래된 항체 또는 폴리펩티드와 Aβ_1-40 펩티드 및 Aβ_1-42 펩티드의 결합을 경쟁적으로 억제한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 미국 특허출원 공개 제2004/0146512호 및 국제특허출원 공개 제WO 04/032868호에 기재된 항체 2294가 아니다. 국제특허출원 공개 제WO 06/118959호에 기재된 바와 같이, 항체 2294는 항체 6G가 결합하는 에피토프와 매우 유사한 에피토프에 결합한다.

항체 및 폴리펩티드의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있고 본 명세서에 기재되어 있다.

경쟁 분석을 이용하여, 2가지 항체가 동일하거나 입체적으로 중첩되는 에피토프를 인식함으로써 동일한 에피토프에 결합하는 지 아니면 한 항체가 또 다른 항체와 항원의 결합을 경쟁적으로 억제하는 지를 확인할 수 있다. 상기 분석은 당업계에 공지되어 있다. 전형적으로, 항원은 멀티-웰 플레이트 상에 고정되고, 표지된 항체의 결합을 차단하는 비표지된 항체의 능력을 측정한다. 상기 경쟁 분석에 대한 통상적인 표지는 방사성 표지 또는 효소 표지이다.

폴리뉴클레오티드, 벡터 및 숙주 세포

본 발명은 본 발명의 항체 및 폴리펩티드(도 1 및 8에 나타낸 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역의 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함함)를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포도 제공한다.

따라서, 본 발명은 (a) 항체 9TL 또는 6G, 또는 표 3 및 8에 나타낸 상기 항체의 변이체; (b) 항체 9TL 또는 6G, 또는 표 3 및 8에 나타낸 상기 항체의 변이체의 단편 또는 한 영역; (c) 항체 9TL 또는 6G, 또는 표 3 및 8에 나타낸 상기 항체의 변이체 경쇄; (d) 항체 9TL 또는 6G, 또는 표 3 및 8에 나타낸 상기 항체의 변이체의 중쇄; (e) 항체 9TL 또는 6G, 또는 표 3 및 8에 나타낸 상기 항체의 변이체의 경쇄 및/또는 중쇄로부터 유래된 1개 이상의 가변 영역; (f) 항체 9TL 또는 6G, 또는 표 3 및 8에 나타낸 상기 항체의 변이체의 1개 이상의 CDR(1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 CDR); (g) 항체 9TL 또는 6G의 중쇄로부터 유래된 CDR H3; (h) 항체 9TL 또는 6G, 또는 표 3 및 8에 나타낸 상기 항체의 변이체의 경쇄로부터 유래된 CDR L3; (i) 항체 9TL 또는 6G, 또는 표 3 및 8에 나타낸 상기 항체의 변이체의 경쇄로부터 유래된 3개의 CDR; (j) 항체 9TL 또는 6G, 또는 표 3 및 8에 나타낸 상기 항체의 변이체의 중쇄로부터 유래된 3개의 CDR; (k) 항체 6G, 또는 표 3 및 8에 나타낸 상기 항체의 변이체의 경쇄로부터 유래된 3개의 CDR 및 중쇄로부터 유래된 3개의 CDR; 및 (l) 상기 (b) 내지 (k) 중 어느 하나를 포함하는 항체 중 임의의 하나를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드(또는 약학 조성물을 포함하는 조성물)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 9, 10 및 34에 나타낸 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 35에 나타낸 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 이들 둘다를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 항체(항체 단편을 포함함) 및 폴리펩티드, 예컨대, 손상된 이펙터 기능을 갖는 항체 및 폴리펩티드 중 임의의 항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 당업계에 공지된 방법으로 제조할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중 임의의 폴리뉴클레오티를 포함하는 조성물(예컨대, 약학 조성물)을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 본 명세서에 기재된 항체 9TL을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 본 명세서에 기재된 항체 또는 폴리펩티드 중 임의의 항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 서열번호 9에 나타낸 폴리뉴클레오티드 및 서열번호 10에 나타낸 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 이들 둘다를 포함한다. 발현 벡터, 및 폴리뉴클레오티드 조성물의 투여는 본 명세서에 더 기재되어 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오티드들 중 임의의 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법을 제공한다.

상기 임의의 폴리뉴클레오티드의 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드도 본 발명에 포함된다. 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥(코딩 또는 안티센스) 또는 이중-가닥일 수 있고, DNA(게놈, cDNA 또는 합성 DNA) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는 인트론을 포함하며 일-대-일 방식으로 DNA 분자에 상응하는 HnRNA 분자, 및 인트론을 포함하지 않는 mRNA 분자를 포함한다. 추가 코딩 또는 비-코딩 서열은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 내에 존재할 수 있지만 반드시 그러한 것은 아니고, 폴리뉴클레오티드는 다른 분자에 연결되고/되거나 물질을 지지할 수 있지만 반드시 그러한 것은 아니다.

폴리뉴클레오티드는 천연 서열(즉, 항체 또는 이의 일부를 코딩하는 내재 서열)을 포함할 수 있거나 상기 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 코딩된 폴리펩티드의 면역반응성이 천연 면역반응성 분자에 비해 감소되지 않도록 1개 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 포함한다. 코딩된 폴리펩티드의 면역반응성에 대한 효과는 일반적으로 본 명세서에 기재된 바와 같이 평가될 수 있다. 변이체는 천연 항체 또는 이의 일부를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 바람직하게는 약 70% 이상의 동일성, 더 바람직하게는 약 80% 이상의 동일성, 가장 바람직하게는 약 90% 이상의 동일성을 나타낸다.

2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열은 상기 2개의 서열 내의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열이 이하에 기재된 바와 같이 최대 상응도에 대해 정렬될 때 동일한 경우 "동일"하다고 기재된다. 2개의 서열 사이의 비교는 전형적으로 상기 서열들을 비교 창에 걸쳐 비교하여 서열 유사성이 있는 국소 영역을 찾고 비교함으로써 수행한다. 본 명세서에 기재된 "비교 창"은 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후 동일한 수의 인접 위치를 갖는 기준 서열과 비교될 수 있는 약 20개 이상의 인접 위치, 통상 30 내지 약 75개, 40 내지 약 50개의 인접 위치를 갖는 서열 분절을 의미한다.

비교를 위한 서열의 최적 정렬은 디폴트 파라미터를 사용하는, 바이오인포매틱스(bioinformatics) 소프트웨어의 레이저진 스위트(Lasergene suite) 내의 메갈라인(Megalign) 프로그램(DNASTAR, 인코포레이티드; 미국 위스콘신주 매디슨 소재)을 이용하여 수행할 수 있다. 이 프로그램은 하기 문헌에 기재된 여러 정렬 개요를 구체화한다: 문헌(Dayhoff, M. O. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M. O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358); 문헌(Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA); 문헌(Higgins, D. G. and Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153); 문헌(Myers, E.W. and Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17); 문헌(Robinson, E. D., 1971 , Comb. Theor. 11:105); 문헌(Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425); 문헌(Sneath, P.H.A. and Sokal, R. R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA); 및 문헌(Wilbur, W.J. and Lipman, D. J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730).

바람직하게는, "서열 동일성(%)"은 2개의 최적으로 정렬된 서열을 20개 이상의 인접 위치를 갖는 비교 창에 걸쳐 비교함으로써 측정하고, 이때 상기 비교 창 내의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 일부는 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 기준 서열(부가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교할 때 20% 이하, 통상 5 내지 15%, 또는 10 내지 12%의 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 상기 %는 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 서열 둘다에 존재하는 위치의 수를 측정하여 매칭된 위치의 수를 확인하고 상기 매칭된 위치의 수를 기준 서열 내의 위치의 총수(즉, 창 크기)로 나누고 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성(%)을 산출함으로써 계산한다.

별법으로, 변이체는 천연 유전자, 또는 이의 일부 또는 상보체와 실질적으로 유사할 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드 변이체는 중등도의 엄격한 조건 하에서 천연 항체를 코딩하는 천연 발생 DNA 서열(또는 상보적 서열)에 혼성화할 수 있다.

적절한 "중등도의 엄격한 조건"은 5X SSC, 0.5% SDS 및 1.0 mM EDTA(pH 8.0)로 구성된 용액 중에서의 예비세척; 50 내지 65℃에서 5X SSC 중에서의 밤샘 혼성화; 및 이어서 0.1% SDS를 함유하는 2X SSC, 0.5X SSC 및 0.2X SSC 각각으로 20분 동안 65℃에서 2회 세척함을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 "고등도의 엄격한 조건" 또는 "고엄격도 조건"은 (1) 세척을 위해 낮은 이온 강도 및 높은 온도를 이용하고, 예를 들어, 50℃에서 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산나트륨/0.1% 소듐 도데실 설페이트를 사용하고; (2) 42℃에서 혼성화 과정 동안 변성제, 예컨대, 포름아마이드, 예를 들어, 750 mM 염화나트륨 및 75 mM 시트르산나트륨과 함께 0.1% 소혈청 알부민/0.1% 피콜(Ficoll)/0.1% 폴리비닐피롤리돈/50 mM 인산나트륨 완충제(pH 6.5)를 함유하는 50%(부피/부피) 포름아마이드를 사용하고; (3) 42℃에서 0.2X SSC(염화나트륨/시트르산나트륨)로 세척하고 55℃에서 50% 포름아마이드로 세척한 후, 55℃에서 EDTA를 함유하는 0.1X SSC로 구성된 고엄격도 세척을 수행하면서 42℃에서 50% 포름아마이드, 5X SSC(0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨(pH 6.8), 0.1% 피로인산나트륨, 5X 덴하르츠(Denhardt) 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA(50 ㎍/㎖), 0.1% SDS 및 10% 덱스트란 설페이트를 사용하는 조건이다. 당업자라면 프로브 길이 등과 같은 인자를 고려하기 위해 필요에 따라 온도, 이온 강도 등을 조절하는 방법을 인식할 것이다.

당업자라면 유전 코드의 축퇴성으로 인해 본 명세서에 기재된 폴리펩티드를 코딩하는 많은 뉴클레오티드 서열들이 있음을 인식할 것이다. 이 폴리뉴클레오티드들 중 일부는 임의의 천연 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대해 최소한의 유사성을 보유한다. 그럼에도 불구하고, 코돈 용법의 차이로 인해 다양한 폴리뉴클레오티드가 본 발명에서 구체적으로 고려된다. 본 명세서에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자들의 대립유전자도 본 발명의 범위 내에 있다. 대립유전자는 1가지 이상의 돌연변이, 예컨대, 뉴클레오티드의 결실, 부가 및/또는 치환의 결과로서 변경된 내재 유전자이다. 생성된 mRNA 및 단백질은 변경된 구조 또는 기능을 가질 수 있으나 반드시 그러한 것은 아니다. 대립유전자는 표준 기법(예컨대, 혼성화, 증폭 및/또는 데이터베이스 서열 비교)을 이용하여 확인할 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 화학적 합성, 재조합 방법 또는 PCR을 이용하여 수득할 수 있다. 화학적 폴리뉴클레오티드 합성 방법은 당업계에 잘 공지되어 있으므로 본 명세서에서 상세히 기재될 필요는 없다. 당업자라면 원하는 DNA 서열을 생성하기 위해 본 명세서에 제시된 서열 및 시판되는 DNA 합성기를 이용할 수 있다.

RNA는 적절한 벡터 내의 단리된 DNA를 적절한 숙주 세포 내로 삽입하여 수득할 수 있다. 상기 세포가 복제되고 DNA가 RNA로 전사되는 경우, RNA는 예컨대, 샘브룩의 문헌(189)에 기재된, 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 단리할 수 있다.

적절한 클로닝 벡터는 표준 기법에 따라 제작할 수 있거나 당업계에서 입수가능한 다수의 클로닝 벡터로부터 선택될 수 있다.

발현 벡터는 일반적으로 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 함유하는 복제가능한 폴리뉴클레오티드 구축물이다. 발현 벡터는 에피좀으로서 또는 염색체 DNA의 삽입된 일부로서 숙주 세포 내에서 복제가능해야 함이 내포되어 있다. 적절한 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터(아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 레트로바이러스 등을 포함함), 코스미드, 및 국제특허출원 공개 제WO 87/04462호에 개시된 발현 벡터를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

흥미로운 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 전기천공, 염화칼슘, 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스트란 또는 다른 물질을 사용한 형질감염, 미세사출 포격(microprojectile bombardment), 리포펙션 및 감염(예컨대, 벡터가 백시니아 바이러스와 같은 감염성 물질인 경우)을 포함하는 다수의 적절한 수단 중 임의의 수단에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오티드들 중 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 이종 DNA를 과다발현할 수 있는 임의의 숙주 세포는 원하는 항체, 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자를 단리하기 위한 목적으로 사용될 수 있다. 포유동물 숙주 세포의 비-제한적 예는 COS, HeLa 및 CHO 세포를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 국제특허출원 공개 제WO 87/04462호 또한 참조한다. 적절한 비-포유동물 숙주 세포는 원핵생물(예컨대, 이. 콜라이(E. coli) 또는 비. 서브틸리스(B. subtillis)) 및 효모(예컨대, 에스. 세레비지애(S. cerevisae), 에스. 폼베(S. pombe), 또는 케이. 락티스(K. lactis))를 포함한다. 바람직하게는, 숙주 세포는 숙주 세포 내의 원하는 상응하는 내재 항체 또는 단백질(존재하는 경우)의 발현 수준보다 약 5배, 더 바람직하게는 10배, 훨씬 더 바람직하게는 20배 이상 더 높은 수준으로 cDNA를 발현한다. Aβ_1-40 펩티드에의 특이적 결합에 대한 숙주 세포의 스크리닝은 면역분석법 또는 FACS에 의해 수행된다. 원하는 항체 또는 단백질을 과다발현하는 세포를 찾을 수 있다.

항체 9TL 또는 6G로부터 유래된 항체, 및 손상된 이펙터 기능을 갖는 항-Aβ 항체의 진단 용도

1개 이상의 Aβ 펩티드의 C-말단에 결합하는 항체 9TL 또는 6G는 눈 내의 표적화된 Aβ의 존재 또는 부재를 확인하거나 검출하는 데 이용될 수 있다. 간결함을 위해, 일반적으로 항체 9TL 또는 6G를 언급할 것이지만, 이 방법들은 본 명세서에 기재된 Aβ 결합 실시양태들(예컨대, 폴리펩티드) 중 임의의 실시양태에도 적용됨을 이해해야 한다. 검출은 일반적으로 Aβ_1-40 펩티드에 결합하는 본 명세서에 기재된 항체와 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계, 및 Aβ_1-40 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체(예컨대, 9TL)와 Aβ_1-40 펩티드 사이의 결합체를 형성하는 단계를 수반한다. 상기 결합체의 형성은 시험관 내 또는 생체 내에서 일어날 수 있다. 본 명세서에 기재된 용어 "검출"은 대조군을 기준으로 하거나 기준으로 하지 않은 정성적 및/또는 정량적 검출(수준 측정)을 포함한다.

폴리펩티드에 결합하는 항체를 사용하는 면역분석법, 예컨대, 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA), 방사선면역분석법(RIA) 등; 및 코딩된 폴리펩티드에 대한 기능적 분석법, 예를 들어, 결합 활성 또는 효소 활성 분석법을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 공지된 방법들 중 임의의 방법을 검출에 이용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 검출가능하게 표지된다. 다른 실시양태들도 당업계에 공지되어 있고 본 명세서에 기재되어 있다.

본 발명의 항체 및 폴리펩티드는 변경된 또는 비정상적인 Aβ 펩티드 또는 βAPP 발현을 나타내는 안 질환, 안구 병증 또는 안구 장애의 검출, 진단 및 모니터링에 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명은 안 내의 Aβ 펩티드 발현이 변경되어 있거나 비정상적인 상태인 것으로 의심되는 개체의 표본(샘플)을 본 발명의 항체 또는 폴리펩티드와 접촉시키는 단계, 및 Aβ 펩티드의 수준이 대조군 또는 비교 표본의 Aβ 펩티드의 수준과 상이한 지를 확인하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 개체의 표본(샘플)을 접촉시키는 단계 및 Aβ 펩티드의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함한다.

진단 목적을 위해, 항체는 방사성동위원소, 형광 표지 및 다양한 효소-기질 표지를 포함하나 이들로 한정되지 않는 검출가능한 부분으로 표지될 수 있다. 표지를 항체에 접합시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는 표지될 필요가 없고, 이의 존재는 본 발명의 항체에 결합하는 표지된 항체를 사용하여 검출할 수 있다.

본 발명의 항체는 임의의 공지된 분석법, 예컨대, 경쟁 결합 분석법, 직접 및 간접 샌드위치 분석법 및 면역침전 분석법에서 사용될 수 있다(Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc. 1987)).

또한, 본 발명의 항체는 생체 내 진단 분석법, 예컨대, 생체 내 이미징에서 사용될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 항체는 원하는 세포 또는 조직의 위치를 면역신티오그래피(immunoscintiography)를 이용하여 확인할 수 있도록 방사성핵종(예컨대, ¹¹¹In, ⁹⁹Tc, ¹⁴C, ¹³¹I, ¹²⁵I, 또는 ³H)으로 표지된다.

본 발명의 항체는 당업계에 잘 공지되어 있는 기법에 따라 병리학에서 염색제로서 사용될 수도 있다.

손상된 이펙터 기능을 갖는 항-Aβ 항체는 망막-관련 변성 안 질환의 위험에 있거나 상기 안 질환을 앓는 것으로 진단받은 개체의 진단을 위한 망막 기능의 측정, 및 임의의 치료 및 질환 단계의 진행 평가에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 손상된 이펙터 기능을 갖는 항-Aβ 항체를 개체에게 투여하고, 혈장 중의 Aβ의 수준을 측정하는데, 이때 혈장 Aβ 수준의 증가는 개체 내의 뇌 아밀로이드 축적의 존재 및/또는 수준을 표시한다. 이 방법들은 치료 효능 및 질환 단계를 모니터링하고 장래 투약 및 빈도를 결정하는 데 이용될 수 있다. 손상된 이펙터 기능을 갖는 항체는 보다 우수한 안전성 프로파일을 가질 수 있고 상기 진단 용도에 있어서 이점을 제공할 수 있다.

치료 목적을 위한 항-Aβ 항체의 사용 방법

본 명세서에 기재된 항체(폴리펩티드를 포함함), 폴리뉴클레오티드 및 약학 조성물은 망막-관련된 변성을 특징으로 하는 안 질환의 치료, 예방 및 진행 억제 방법에서 사용될 수 있다. 상기 방법은 단백질 또는 단백질 침착물에 특이적으로 결합하는 유효량의 항체, 또는 상기 항체를 코딩하는 유효량의 폴리뉴클레오티드를 개체에게 투여하는 단계를 포함하고, 이때 상기 항체는 손상된 이펙터 기능을 갖는다.

본 명세서에 기재된 항체(폴리펩티드를 포함함), 폴리뉴클레오티드 및 약학 조성물은 AMD, 및 다른 안 질환, 예컨대, AMD(건성 AMD 및 습성 AMD 둘다), 녹내장, 당뇨성 망막병증(당뇨성 황반 부종을 포함함), 브루크 막 파열, 근시 변성, 안구 종양 및 다른 관련된 망막 변성 질환의 치료, 예방 및 진행 억제 방법에서 사용될 수 있다. 상기 방법은 상기 항체, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드, 또는 약학 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 예방 용도에 있어서, 약학 조성물 또는 약제는 안 질환에 대한 감수성을 나타내는 환자 또는 안 질환의 위험에 있는 환자에서 상기 위험을 제거하거나 감소시키거나, 또는 상기 질환(이 질환의 생화학적, 조직학적 및/또는 거동적 증상, 상기 질환의 합병증, 및 상기 질환의 진행 과정 동안에 나타나는 중간 병리학적 표현형을 포함함)의 심각도를 완화시키거나 발병시기를 늦추기에 충분한 양으로 상기 환자에게 투여된다. 치료 용도에 있어서, 조성물 또는 약제는 안 질환의 합병증, 및 상기 질환의 진행 과정 동안 나타나는 중간 병리학적 표현형을 포함하는 안 질환의 증상(생화학적, 조직학적 및/또는 거동적 증상)을 치유하거나 적어도 부분적으로 진행을 막기에 충분한 양으로 상기 질환을 앓는 것으로 의심되거나 이미 안 질환을 앓는 환자에게 투여된다.

AMD의 합병증 및 중간 병리학적 표현형은 두꺼운 분산성 망막하 색소 상피(sub-RPE) 침착, 입술-풍부 드루젠-유사(lip-rich drusen-like) 침착, 브루크 막의 비후화, RPE 비대증의 패치(patchy) 영역 및 맥락막 혈관신생을 포함한다.

또한, 본 발명은 본 명세서에 기재된 항체, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학 조성물 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 망막 변성 및/또는 이의 증상의 진행을 늦추는 방법도 제공한다.

또한, 본 발명은 본 명세서에 기재된 항체, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학 조성물 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 망막 기능을 회복하거나 보호하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 명세서에 기재된 항체, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학 조성물 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체의 망막 내에서 아밀로이드 플라크를 감소시키고/시키거나 Aβ 축적을 감소시키거나 늦추는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 명세서에 기재된 항체, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학 조성물 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체의 망막 내에서 아밀로이드 플라크 및/또는 Aβ 축적을 제거하거나 없애는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 아밀로이드 플라크는 개체의 뇌에 존재한다.

또한, 본 발명은 본 명세서에 기재된 항체, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학 조성물 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 망막 조직에서 Aβ 펩티드를 감소시키거나 망막 조직에서 Aβ 펩티드의 축적을 억제하고/하거나 감소시키는 방법을 제공한다. Aβ 폴리펩티드는 가용성 형태, 올리고머 형태 또는 침착된 형태일 수 있다. Aβ 폴리펩티드의 올리고머 형태는 전장 1-40 및 1-42 펩티드 및/또는 상기 펩티드의 임의의 절두된(truncated) 버전의 혼합물일 수 있는 2 내지 50개 Aβ 폴리펩티드들로 구성될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 명세서에 기재된 항체, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 약학 조성물 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 안 질환에서 망막 변성을 개선시키거나 반전시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 Aβ 펩티드 또는 Aβ 펩티드의 응집된 형태에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 약학 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 망막 변성과 관련된 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공하는데, 이때 상기 항체는 천연 발생 Fc 영역으로부터의 변경을 갖는 Fc 영역을 포함하고, 상기 변경은 손상된 이펙터 기능을 초래하고, 상기 항체의 투여는 상기 변경을 갖지 않은 항체의 투여보다 뇌 미세출혈을 덜 야기한다.

본 명세서에 기재된 방법(예방 또는 치료를 포함함)은 단일 부위 또는 다수의 부위에 단일 시점 또는 다수의 시점에서 단일 방향으로 주사하여 달성할 수 있다. 투여는 다수의 부위에서 거의 동시적으로 일어날 수도 있다. 투여 빈도는 결정될 수 있고 치료 과정에 걸쳐 조절될 수 있으며 원하는 결과의 달성을 기초로 한다. 일부 경우, 본 발명의 항체(폴리펩티드를 포함함), 폴리뉴클레오티드 및 약학 조성물의 연속적 서방출 제제가 적합할 수 있다. 서방출을 달성하기 위한 다양한 제제 및 장치가 당업계에 공지되어 있다.

환자, 객체 또는 개체는 포유동물, 예컨대, 인간, 소, 말, 개, 고양이, 돼지 및 양을 포함한다. 상기 개체는 바람직하게는 인간이고 질환을 앓거나 앓지 않을 수 있거나 증상을 보일 수 있다. 본 발명의 방법은 개체 환자의 위험에 대한 임의의 평가의 필요성 없이 예방 차원에서 일반적인 집단에 대해 실시될 수 있다. 본 발명의 방법은 AMD의 공지된 유전적 위험을 갖는 개체에게 유용하다. 이러한 개체는 상기 질환을 앓은 경험이 있는 친척이 있는 개체, 및 유전적 또는 생화학적 마커의 분석에 의해 상기 질환에 대한 위험이 확인된 개체를 포함한다.

상기 방법들에서 사용될 수 있는 약학 조성물은 본 명세서에 기재된 항체, 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 9TL 또는 6G, 또는 표 3 및 8에 나타낸 상기 항체의 변이체이다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 Aβ 펩티드에 특이적으로 결합하고 손상된 이펙터 기능을 갖는 불변 영역을 포함하는 항체이다.

투여 및 투여량

바람직하게는, 본 발명의 항체는 담체, 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 포유동물에게 투여된다. 적절한 담체 및 이의 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; and Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000)에 기재되어 있다. 전형적으로, 적정량의 약학적으로 허용가능한 염을 제제 중에 사용하여 상기 제제를 등장성 제제로 만든다. 상기 담체의 예로는 생리식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 들 수 있다. 상기 용액의 pH는 바람직하게는 약 5 내지 약 8이고, 더 바람직하게는 약 7 내지 약 7.5이다. 추가 담체는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체로 구성된 반투과성 매트릭스와 같은 서방출 제제를 포함하고, 상기 매트릭스는 성형 제품, 예를 들어, 필름, 리포좀 또는 미세입자의 형태이다. 예를 들어, 투여 경로 및 투여될 항체의 농도에 따라 특정 담체가 더 바람직할 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다.

본 발명의 항체는 주사(예컨대, 전신, 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 문맥내, 뇌내, 뇌혈관내 및 비강내), 또는 항체가 유효한 형태로 혈류로 전달될 수 있게 하는 다른 방법, 예컨대, 관주에 의해 포유동물에게 투여될 수 있다. 상기 항체는 단리된 관류 기법, 예컨대, 단리된 조직 관류에 의해 국소적 치료 효과를 발휘하도록 투여될 수도 있다. 또한, 본 발명의 항체는 눈에 국소 투여될 수 있거나 주사제, 예컨대, 유리체내 주사제, 망막하 주사제 또는 양측 주사제의 형태로 투여될 수 있다. 화합물을 눈에 투여하는 것에 대한 추가 정보는 문헌(Tolentino et al., Retina 24 (2004) 132-138) 및 문헌(Reich et al., Molecular vision 9 (2003) 210-216)에서 찾을 수 있다.

항체의 투여를 위한 유효 투여량 및 스케쥴은 실험적으로 결정될 수 있고, 이러한 결정은 당업계의 기술에 포함된다. 당업자라면 투여되어야 할 항체의 투여량이 예를 들어, 항체를 제공받을 포유동물, 투여 경로, 특히 사용되는 항체의 종류 및 포유동물에게 투여되는 다른 약물에 따라 다를 것임을 이해할 것이다. 항체에 대한 적정 투여량을 선택하는 데 있어서 지침은 항체의 치료 용도에 관한 문헌, 예를 들어, 문헌(Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., 1985, ch. 22 and pp. 303-357) 및 문헌(Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds., Raven Press, New York, 1977, pp. 365-389)에서 찾을 수 있다. 단독으로 사용되는 항체의 전형적인 1일 투여량은 상기 인자들에 따라 1일 당 약 1 ㎍/kg(체중) 내지 100 mg/kg(체중) 이하일 것이다. 일반적으로, 하기 투여량 중 임의의 투여량이 사용될 수 있다: 약 50 mg/kg(체중) 이상의 투여량; 약 10 mg/kg(체중) 이상의 투여량; 약 3 mg/kg(체중) 이상의 투여량; 약 1 mg/kg(체중) 이상의 투여량; 약 750 ㎍/kg(체중) 이상의 투여량; 약 500 ㎍/kg(체중) 이상의 투여량; 약 250 ㎍/kg(체중) 이상의 투여량; 약 100 ㎍/kg(체중) 이상의 투여량; 약 50 ㎍/kg(체중) 이상의 투여량; 약 10 ㎍/kg(체중) 이상의 투여량; 약 1 ㎍/kg(체중) 이상의 투여량 및 그 이상의 투여량. 항체는 잠재적인 부작용, 예컨대, 일시적인 뇌 아밀로이드 혈관병증(CAA)을 피하기 위해 치료의 초기에 더 낮은 투여량 또는 더 낮은 빈도로 투여될 수 있다.

일부 실시양태에서, 1가지 이상의 항체가 존재할 수 있다. 이러한 조성물은 1가지 이상, 2가지 이상, 3가지 이상, 4가지 이상 또는 5가지 이상의 상이한 본 발명의 항체들(폴리펩티드를 포함함)을 함유할 수 있다.

본 발명의 항체는 유효량의 1가지 이상의 다른 치료제와 함께 포유동물에게 투여될 수도 있다. 상기 항체는 1가지 이상의 다른 치료제와 함께 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 항체 및 치료제의 양은 예를 들어, 사용되는 약물의 종류, 치료될 병리학적 상태, 투여 스케쥴 및 투여 경로에 달려 있지만 일반적으로 각각 개별적으로 사용되는 경우보다 더 낮을 것이다.

항체를 포유동물에게 투여한 후, 포유동물의 생리학적 상태를 당업자에게 잘 공지되어 있는 다양한 방법으로 모니터링할 수 있다.

상기 투여 원칙 및 투여량은 본 명세서에 기재된 폴리펩티드에도 적용될 수 있다.

본 명세서에 기재된 항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 원하는 세포 내에서 상기 항체 또는 폴리펩티드를 발현하고 전달하는 데에도 사용될 수 있다. 발현 벡터가 항체의 발현을 지시하는 데 사용될 수 있음은 자명하다. 상기 발현 벡터는 전신, 복강내, 정맥내, 근육내, 피하, 수막강내, 뇌실내, 경구, 장내, 비경구, 비강내, 피내 또는 흡입 투여될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터의 투여는 주사, 경구 투여, 입자 총 또는 카테터 사용 투여 및 국소 투여를 포함하는 국부 또는 전신 투여를 포함한다. 당업자는 생체 내에서 내재 단백질을 발현시키기 위한 발현 벡터의 투여를 잘 이해하고 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,436,908호, 제6,413,942호 및 제6,376,471호를 참조한다.

본 발명의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 치료 조성물의 표적화된 전달도 이용될 수 있다. 수용체-매개 DNA 전달 기법은 예를 들어, 문헌(Findeis et al., Trends Biotechnol. (1993) 11:202), 문헌(Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer (JA. Wolff, ed.) (1994)), 문헌(Wu et al., J. Biol. Chem. (1988) 263:621), 문헌(Wu et al., J. Biol. Chem. (1994) 269:542), 문헌(Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1990) 87:3655) 및 문헌(Wu et al., J. Biol. Chem. (1991) 266:338)에 기재되어 있다. 폴리뉴클레오티드를 함유하는 치료 조성물은 유전자 요법 프로토콜에서 국부 투여의 경우 DNA의 양이 약 100 ng 내지 약 200 mg이 되도록 투여된다. 약 500 ng 내지 약 50 mg, 약 1 ㎍ 내지 약 2 mg, 약 5 내지 약 500 ㎍, 약 20 내지 약 100 ㎍ 농도의 DNA가 유전자 요법 프로토콜에서 사용될 수 있다. 본 발명의 치료 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 유전자 전달 비히클을 이용하여 전달할 수 있다. 유전자 전달 비히클은 바이러스 또는 비-바이러스로부터 유래될 수 있다(일반적으로, 문헌(Jolly, Cancer Gene Therapy (1994) 1:51); 문헌(Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5:845); 문헌(Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1:185); 및 문헌(Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6:148) 참조). 이러한 코딩 서열의 발현은 내재 포유동물 프로모터 또는 이종 프로모터를 사용하여 유도할 수 있다. 상기 코딩 서열의 발현은 구성적 발현 또는 조절된 발현일 수 있다.

원하는 세포 내에서의 원하는 폴리뉴클레오티드의 전달 및 발현을 위한 바이러스-기재 벡터는 당업계에 잘 공지되어 있다. 예시적 바이러스-기재 비히클은 재조합 레트로바이러스 벡터(예를 들어, 국제특허출원 공개 제WO 90/07936호, 제WO 94/03622호, 제WO 93/25698호, 제WO 93/25234호, 제WO 93/11230호, 제WO 93/10218 및 제WO 91/02805호; 미국 특허 제5,219,740호 및 제4,777,127호; 영국 특허 제2,200,651호; 및 유럽 특허 제0 345 242호), 알파바이러스-기재 벡터(예를 들어, 신드비스 바이러스 벡터, 셈리키 포레스트 바이러스(ATCC VR-67; ATCC VR-1247)), 로스 리버 바이러스 벡터(ATCC VR-373; ATCC VR-1246), 베네주엘란 말 뇌염 바이러스 벡터(ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532), 및 아데노-관련된 바이러스(AAV) 벡터(예를 들어, 국제특허출원 공개 제WO 94/12649호, 제WO 93/03769호, 제WO 93/19191호, 제WO 94/28938호, 제WO 95/11984호 및 제WO 95/00655호 참조)를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 문헌(Curiel, Hum. Gene Then (1992) 3:147)에 기재된 바와 같은, 사멸된 아데노바이러스에 연결된 DNA의 투여도 이용될 수 있다.

사멸된 아데노바이러스에만 연결된 또는 연결되지 않은 다가양이온성 축합 DNA(예를 들어, 문헌(Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147) 참조); 리간드-결합된 DNA(예를 들어, 문헌(Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264:16985) 참조); 진핵세포 전달 비히클 세포(예를 들어, 미국 특허 제5,814,482호; 및 국제특허출원 공개 제WO 95/07994호, 제WO 96/17072호, 제WO 95/30763호 및 제WO 97/42338호 참조); 및 핵산 전하 중성화 또는 세포막과의 융합을 포함하나 이들로 한정되지 않는 비-바이러스 전달 비히클 및 방법도 이용될 수 있다. 네이키드(naked) DNA도 사용될 수 있다. 예시적 네이키드 DNA 도입 방법은 국제특허출원 공개 제WO 90/11092호 및 미국 특허 제5,580,859호에 기재되어 있다. 유전자 전달 비히클로서 작용할 수 있는 리포좀은 미국 특허 제5,422,120호; 국제특허출원 공개 제WO 95/13796호, 제WO 94/23697호 및 제WO 91/14445호; 및 유럽 특허 제0 524 968호에 기재되어 있다. 추가 방법은 문헌(Philip, Mol. Cell Biol. (1994) 14:2411) 및 문헌(Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91:1581)에 기재되어 있다.

키트

본 발명은 본 명세서에 기재된 안 질환, 예컨대, AMD(습성 AMD 및 건성 AMD 둘다), 녹내장, 당뇨성 망막병증(당뇨성 황반 부종을 포함함), 브루크 막 파열, 근시 변성, 안구 종양 및 다른 관련된 망막 변성 질환의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제품 및 키트도 제공한다. 상기 제품은 표지가 있는 용기를 포함한다. 적절한 용기는 예를 들어, 병, 바이알 및 시험 튜브를 포함한다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 상기 용기는 병리학적 안구 병증의 치료 또는 Aβ 또는 βAPP의 검출 또는 정제에 효과적인 활성 물질을 갖는 조성물을 보유한다. 상기 조성물 중의 활성 물질은 항체이고 바람직하게는 Aβ 또는 βAPP에 대해 특이적인 단일클론 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 활성 물질은 항체 9TL 또는 6G, 또는 이들로부터 유래된 임의의 항체 또는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 활성 물질은 손상된 이펙터 기능을 갖는 항-Aβ 항체 또는 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-Aβ 항체 또는 폴리펩티드는 손상된 이펙터 기능을 갖는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 용기 상의 표지는 조성물이 AMD와 같은 병리학적 안구 병증을 치료하는 데 사용됨을 표시하고, 생체 내 또는 시험관 내 사용, 예컨대, 전술한 바와 같은 사용을 위한 설명을 표시할 수도 있다.

또한, 본 발명은 본 명세서에 기재된 항체(예컨대, 항체 9TL 또는 6G), 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 포함하는 키트도 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 키트는 상기 용기를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 키트는 상기 용기 및 완충제를 포함하는 제2 용기를 포함한다. 또한, 본 발명의 키트는 상업적 관점 및 사용자의 관점에 비추어 바람직한 다른 물질, 예컨대, 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 시린지, 및 본 명세서에 기재된 임의의 방법(예컨대, AMD의 치료 방법, 및 뇌에서 Aβ 펩티드의 축적을 억제하거나 감소시키는 방법)을 수행하기 위한 설명이 있는 팩키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. Aβ 또는 βAPP의 검출 또는 정제에서 사용되는 키트에 있어서, 항체는 전형적으로 검출가능한 표지, 예컨대, 방사성동위원소, 형광 화합물, 생체발광 화합물, 화학발광 화합물, 금속 킬레이터 또는 효소로 표지된다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 약제로서의 사용 및/또는 약제의 제조를 위한 사용이든 관계없이 본 명세에 기재된 방법들 중 임의의 방법에서 사용하기 위한 (본 명세서에 기재된) 조성물을 제공한다.

하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 제공된 것이지 본 발명을 한정하기 위해 제공된 것이 아니다.

실시예 1: 항체 9TL 및 이의 변이체의 결합 친화성 측정

A. 일반적인 방법

하기 일반적인 방법들을 본 실시예에서 사용하였다.

클론 특징규명에서 사용된 발현 벡터

항체의 Fab 단편의 발현은 문헌(Barbas (2001) Phage display: a laboratory manual, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press pg 2.10. Vector pComb3X)에 기재된 것과 유사한 IPTG 유도적 lacZ 프로모터의 조절 하에 있었으나, 변경은 하기 추가 도메인의 부가 및 발현을 포함한다: 인간 카파 경쇄 불변 도메인 및 IgG2a 인간 면역글로불린의 C_H1 불변 도메인, Ig 감마-2 쇄 C 영역, 단백질 등록 번호 P01859; 면역글로불린 카파 경쇄(호모사피엔스), 단백질 등록 번호 CAA09181.

소규모 Fab 제조

96 웰 플레이트 내에서의 Fab의 소규모 발현을 다음과 같이 수행하였다: Fab 라이브러리로 형질전환된 이. 콜라이로부터 출발하여, 콜로니를 픽킹하여 마스터 플레이트(아가 LB + 앰피실린(50 ㎍/㎖) + 2% 글루코스) 및 작업 플레이트(2 ㎖/웰, 1.5 ㎖의 LB + 앰피실린(50 ㎍/㎖) + 2% 글루코스를 함유하는 96 웰/플레이트) 둘다를 접종하였다. 상기 플레이트 둘다를 30℃에서 8 내지 12시간 동안 생장시켰다. 상기 마스터 플레이트를 4℃에 저장하고, 상기 작업 플레이트로부터의 세포를 5000 rpm에서 원심분리하고, 펠렛을 1 ㎖의 LB + 앰피실린(50 ㎍/㎖) + 1 mM IPTG로 재현탁하여 Fab의 발현을 유도하였다. 30℃에서 5시간 동안 발현시킨 후 원심분리하여 세포를 모은 다음 500 ㎕의 완충제 HBS-P(10 mM HEPES 완충제(pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.005% P20)에 재현탁시켰다. HBS-P에 재현탁된 세포를 -80℃에서 동결시킨 후 37℃에서 해동시킴으로써 용해시켰다. 세포 용해물을 5000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 Fab가 함유된 상청액으로부터 세포 데브리스를 분리하였다. 이어서, 상청액을 BIAcore 플라즈몬 공명 장치 내로 주입하여 각 Fab에 대한 친화성 정보를 수득하였다. DNA의 시퀀싱, 및 이하에 기재된 대규모 Fab 제조 및 상세한 특징규명을 위해 Fab를 발현하는 클론을 마스터 플레이트로부터 구조하였다.

대규모 Fab 제조

상세한 동적 파라미터를 얻기 위해, Fab를 발현시키고 대규모 배양물로부터 정제하였다. LB + 앰피실린(50 ㎍/㎖) + 2% 글루코스가 함유된 삼각 플라스크를 선별된 Fab-발현 이. 콜라이 클론으로부터의 밤새 배양물 5 ㎖로 접종하였다. OD₅₅₀ _nm가 1.0에 도달할 때까지 클론을 30℃에서 항온처리한 후 배지를 LB + 앰피실린(50 ㎍/㎖) + 1 mM IPTG 200 ㎖로 교체하여 발현을 유도하였다. 30℃에서 5시간 동안 발현시킨 후, 세포를 원심분리하여 펠렛 상태로 모은 다음 10 ㎖의 PBS(pH 8)에 재현탁시켰다. 동결(-80℃에서)/해동(37℃에서)을 2회 수행하여 세포 용해물을 수득하였다. 세포 용해물의 상청액을 PBS(pH 8)로 평형화된 Ni-NTA 수퍼플로우 세파로스(퀴아젠; 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재) 컬럼 상에 로딩한 후, 5배 컬럼 부피의 PBS(pH 8)로 세척하였다. 개개의 Fab를 PBS(pH 8) + 300 mM 이미다졸을 사용하여 여러 분획으로 용출하였다. Fab를 함유하는 분획을 모아 PBS 중에서 투석한 후 친화성 특징규명 전에 ELISA로 정량하였다.

전장 항체 제조

전장 항체의 발현을 위해, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포유동물 발현 벡터 내에 클로닝하고 일시적 발현을 위해 리포펙타민을 사용하여 HEK 293 세포 내로 형질감염시켰다. 표준 방법을 이용하여 항체를 단백질 A로 정제하였다. 벡터 pDb.9TL.hFc2a는 항체 9TL의 중쇄를 포함하는 발현 벡터이고 상기 중쇄의 일시적 또는 안정한 발현에 적합하다. 벡터 pDb.9TL.hFc2a는 하기 영역에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다: 뮤린 사이토메갈로바이러스 프로모터 영역(뉴클레오티 드 1-612); 합성 인트론(뉴클레오티드 619-1507); DHFR 코딩 영역(뉴클레오티드 707-1267); 인간 성장 호르몬 신호 펩티드(뉴클레오티드 1525-1602); 항체 9TL의 중쇄 가변 영역(뉴클레오티드 1603-1951); A330P331로부터 S330S331로의 돌연변이(야생형 IgG2a 서열을 기준으로 한 아미노산 넘버링; 문헌(Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624) 참조)를 포함하는 인간 중쇄 IgG2a 불변 영역: SV40 후기 폴리아데닐화 신호(뉴클레오티드 2960-3203); SV40 인핸서 영역(뉴클레오티드 3204-3449); 파지 f1 영역(뉴클레오티드 3537-4992); 및 베타 락타마제(AmpR) 코딩 영역(뉴클레오티드 4429-5286). 벡터 pDb.9TL.hFc2a는 2004년 7월 20일자로 ATCC에 기탁되었고 ATCC 기탁번호 PTA-6124를 배정받았다.

벡터 pEb.9TL.hK는 항체 9TL의 경쇄를 포함하는 발현 벡터이고 상기 경쇄의 일시적인 발현에 적합하다. 벡터 pEb.9TL.hK는 하기 영역에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다: 뮤린 사이토메갈로바이러스 프로모터 영역(뉴클레오티드 1-612); 인간 EF-1 인트론(뉴클레오티드 619-1142); 인간 성장 호르몬 신호 펩티드(뉴클레오티드 1173-1150); 항체 9TL 경쇄 가변 영역(뉴클레오티드 1251-1593); 인간 카파 쇄 불변 영역(뉴클레오티드 1594-1914); SV40 후기 폴리아데닐화 신호(뉴클레오티드 1932-2175); SV40 인핸서 영역(뉴클레오티드 2176-2421); 파지 f1 영역(뉴클레오티드 2509-2964); 및 베타 락타마제(AmpR) 코딩 영역(뉴클레오티드 3401-4258). 벡터 pEb.9TL.hK는 2004년 7월 20일자로 ATCC에 기탁되었고 ATCC 기탁번호 PTA-6125를 배정받았다.

BIAcore 분석

BIAcore 3000™ SPR 시스템(BIAcore, 인코포레이티드; 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)을 이용하여 9TL 단일클론 항체의 친화성을 측정하였다. 상기 친화성을 측정하는 한 방법은 CM5 칩 상에 항체 9TL을 고정시키고 Aβ_1-40 펩티드와 상기 항체의 결합 속도를 측정하는 것이다. CM5 칩은 공급자의 설명에 따라 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS)로 활성화시켰다. 항체 9TL 또는 이의 변이체를 10 mM 아세트산나트륨(pH 4.0 또는 5.0)으로 희석하고 0.005 mg/㎖의 농도로 상기 활성화된 칩 상에 주입하였다. 개개의 칩 채널을 가로지르는 가변 유동 시간을 이용하여 1000-2000 또는 2000-3000 반응 유니트(RU)의 항체 밀도를 달성하였다. 상기 칩을 에탄올아민으로 블로킹하였다. 재생 연구는 2배 부피의 PIERCE 용출 완충제 및 1배 부피의 4 M NaCl을 함유하는 용액이 200회 이상의 주입 과정 동안 상기 칩 상의 항체 9TL의 활성을 유지하면서 결합된 Aβ_1-40 펩티드를 효과적으로 제거함을 보여주었다. HBS-EP 완충제(0.01 M HEPES, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20)를 모든 BIAcore 분석을 위한 런닝 완충제로서 사용하였다. 정제된 Aβ_1-40 합성 펩티드 샘플의 연속 희석물(0.1-10x 추정된 K_D)을 100 ㎕/분의 속도로 1분 동안 주입하고 10분 동안의 해리 시간을 허용하였다. BIAevalution 프로그램을 이용하여 데이터를 1:1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델(Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110)에 피팅함으로써 동역학 적 결합 속도(k_on) 및 해리 속도(k_off)를 동시에 수득하였다. 평형 해리 상수(K_D) 값은 k_off/k_on으로서 계산하였다.

별법으로, 친화성은 SA 칩 상에 Aβ_1-40 펩티드를 고정시키고 고정된 Aβ_1-40 펩티드와 9TL Fab 및 9TL 변이체의 Fab의 결합 속도를 측정함으로써 측정하였다. 9TL Fab 단편 및 이의 변이체 Fab 단편의 친화성은 SPR 시스템(BIAcore 3000™, BIAcore, 인코포레이티드; 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)으로 측정하였다. SA 칩(스트렙타비딘)은 공급자의 설명에 따라 사용하였다. 바이오티닐화된 Aβ_1-40 펩티드를 HBS-EP(10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% P20)로 희석하고 0.005 mg/㎖의 농도로 상기 칩 상에 주입하였다. 개개의 칩 채널을 가로지른 가변 유동 시간을 이용하여 2가지 항원 밀도 범위를 달성하였다: 상세한 동역학적 연구를 위해 10-200 RU 및 농도 연구 및 스크리닝을 위해 500-600 RU. 재생 연구는 100 mM 인산(인산 사용 후 2배 부피의 50 mM NaOH 및 1배 부피의 70% 에탄올을 함유하는 용액이 사용될 수도 있음)이 200회 이상의 주입 동안 상기 칩 상에서 Aβ 펩티드의 활성을 유지하면서 결합된 Fab를 효과적으로 제거함을 보여주었다. HBS-EP 완충제를 모든 BIAcore 분석을 위한 런닝 완충제로서 사용하였다. 정제된 Fab 샘플의 연속 희석물(0.1-10x 추정된 K_D)을 100 ㎕/분의 속도로 2분 동안 주입하였고 10분 동안의 해리 시간을 허용하였다. Fab 단백질의 농도는 공지된 농도(아미노산 분석에 의해 측정됨)의 표준 Fab를 사용하여 ELISA 및/또는 SDS-PAGE로 측정하였 다. BIAevalution 프로그램을 이용하여 데이터를 1:1 랭뮤어 결합 모델(Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110)에 피팅함으로써 동역학적 결합 속도(k_on) 및 해리 속도(k_off)를 동시에 수득하였다. 평형 해리 상수(K_D) 값은 k_off/k_on으로서 계산하였다.

B. 항체 9TL 및 이의 변이체와 Aβ _1-40 펩티드의 결합 친화성

항체 9TL의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 도 1에 나타나 있다. 상기 BIAcore 방법 둘다를 이용하여 측정한 항체 9TL과 Aβ_1-40 펩티드의 결합 친화성은 하기 표 2에 기재되어 있다.

항체 9TL 및 Fab 단편의 결합 친화성

	k_on(1/Ms)	k_off(1/s)	K_D(nM)
CM5 칩 상의 9TL mAb, 상기 칩 상으로 유동된 Aβ_1-40 펩티드	4.25 x 10⁵	3.89 x 10^-4	0.9
SA 칩 상의 Aβ_1-40 펩티드, 상기 칩 상으로 유동된 9TL Fab	3.18 x 10⁵	3.59 x 10^-4	1.13

항체 9TL의 변이체의 아미노산 서열은 하기 표 3에 나타나 있다. 표 3에 나타낸 변이체의 모든 아미노산 치환은 항체 9TL의 서열을 기준으로 표시되어 있다. 9TL 변이체의 Fab 단편의 결합 친화성도 표 3에 기재되어 있다. K_D 및 다른 동역학적 파라미터는 SA 칩 상에 고정된 Aβ_1-40 펩티드를 사용하여 상기 BIAcore 분석으로 측정하였다.

실시예 2: 항체 9 TL 이 결합하는 Aβ _1-40 펩티드 상의 에피토프의 특징규명

항체 9TL에 의해 인식되는 Aβ 폴리펩티드 상의 에피토프를 확인하기 위해, SPR(BIAcore 3000™) 결합 분석을 이용하였다. 바이오틴(글로발 펩티드 서비시즈, 미국 콜로라도주 소재)에 커플링된 Aβ_1-40 폴리펩티드를 SA 칩 상에 고정시켰다. 고정된 Aβ_1-40 펩티드와 Aβ 항체 Fab 단편(50 nM)을 Aβ 펩티드의 다양한 가용성 단편(10 μM, 어메리칸 펩티드 캄파니 인코포레이티드(미국 캘리포니아주 소재)로부터 입수함)의 부재 또는 존재 하에서 결합시켰다. Aβ_1-40 펩티드, Aβ_1-42 펩티드 및 Aβ_1-43 펩티드의 아미노산 서열은 하기 표 4에 나타나 있다. 항체 9TL Fab 단편과 Aβ_1-40 펩티드의 결합을 억제하는 Aβ 펩티드는 Aβ_28-40, Aβ_1-40, Aβ_33-40 및 Aβ_17-40이었다(도 2). 따라서, 항체 9TL은 Aβ_1-40 펩티드의 C-말단 펩티드(33-40)에 결합한다. 도 2에서 보여지는 바와 같이, Aβ_1-28, Aβ_28-42, Aβ_22-35, Aβ_1-16, Aβ_1-43 및 Aβ_1-38 펩티드는 항체 9TL Fab 단편의 결합을 억제하지 못하였는데, 이는 항체 9TL이 Aβ_1-40 펩티드의 C-말단에 결합함을 암시한다.

또한, Aβ_28-42 펩티드 및 Aβ_1-43 펩티드는 이 펩티드들이 Aβ_1-40 펩티드의 16-28에 결합하는 대조군 항체(항체 2289, 이 항체는 미국 특허출원 공개 제2004/0146512호 및 국제특허출원 공개 제WO 04/032868호에 기재되어 있음)와 Aβ_1-40 펩티드의 결합을 용이하게 억제할 수 있다 하더라도 항체 9TL과 Aβ_1-40 펩티드의 결합을 억제하지 못하였다. 이 결과는 항체 9TL이 Aβ_1-40 펩티드에는 우선적으로 결합하지만 Aβ_1-42 펩티드 및 Aβ_1-43 펩티드에는 결합하지 못함을 보여준다.

실시예 3: 단일클론 항체 2 H6 및 탈글리코실화된 2 H6 의 발생

A. 단일클론 항체 2H6의 발생 및 특징규명

마우스를, 문헌(Geerligs HJ et al., 1989, J. Immunol. Methods 124:95-102; Kenney JS et al., 1989, J. Immunol. Methods 121 :157-166; and Wiener K et al., 1989, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 89:128-135)에 기재된 바와 같이 약 16주 간격으로 연속적으로 면역보강제 중의 KLH에 접합된 펩티드(Aβ_1-40 펩티드의 아미노산 28-40) 25 내지 100 ㎍(발바닥 당 50 ㎕, 마우스 당 총 100 ㎕)으로 면역화시켰다. 마우스를 CFA(완전 프로인트 면역보강제) 중의 상기 펩티드 50 ㎍으로 1차 면역화시켰다. 21일 후, 마우스를 IFA(불완전 프로인트 면역보강제) 중의 상기 펩티드 25 ㎍으로 2차 면역화시켰다. 2차 면역화로부터 23일 후, IFA 중의 상기 펩티드 25 ㎍으로 3차 면역화를 실시하였다. 10일 후, ELISA를 이용하여 항체 역가를 시험하였다. 3차 면역화로부터 34일 후, IFA 중의 상기 펩티드 25 ㎍으로 4차 면역화를 실시하였다. 4차 면역화로부터 32일 후, 100 ㎍의 가용성 펩티드로 최종 부스터를 실시하였다.

면역화된 마우스로부터 비장세포를 수득하고, 상기 비장세포를 폴리에틸렌 글리콜 1500을 사용하여 10:1의 비로 NSO 골수종 세포와 융합시켰다. 수득된 하이브리드를 20% 말 혈청 및 2-옥살로아세테이트/피루베이트/인슐린(시그마)이 함유된 DMEM이 들어있는 96-웰 플레이트 내로 플레이팅하고, 하이포잔틴/아미노프테린/타이미딘 선별을 시작하였다. 8일째 날, 20% 말 혈청이 함유된 DMEM 100 ㎕를 상기 모든 웰에 첨가하였다. 상기 하이브리드의 상청액을, 항체 포획 면역분석법을 이용하여 스크리닝하였다. 항체 클래스의 확인은 클래스-특이적 제2 항체를 사용하여 수행하였다. 단일클론 항체 생산 세포주의 패널을 특징규명을 위해 선별하였다. 선별된 한 세포주는 2H6으로 명명된 항체를 생산하였다. 상기 항체는 IgG2b 중쇄를 가진 것으로 확인되었다.

Aβ_1-40 펩티드에 대한 항체 2H6의 친화성을 측정하였다. 단백질 A 친화 크로마토그래피를 이용하여 하이브리도마 배양물의 상청액으로부터 단일클론 항체 2H6을 정제하였다. 상기 상청액을 pH 8로 평형화시켰다. 이어서, 상기 상청액을, PBS에 의해 pH 8로 평형화된 단백질 A 컬럼 MabSelect(아머샴 바이오사이언시즈 #17-5199-02)에 로딩하였다. 상기 컬럼을 5배 컬럼 부피의 PBS(pH 8)로 세척하였다. 상기 항체를 50 mM 시트레이트-포스페이트 완충제(pH 3)로 용출하였다. 용출된 항체를 1 M 포스페이트 완충제(pH 8)로 중화시켰다. 정제된 항체를 PBS로 투석하였다. 항체 농도를 뮤린 mAB 표준 곡선을 이용하여 SDS-PAGE로 측정하였다.

이뮤노퓨어 Fab 키트(PIERCE #44885)를 사용한 2H6 전장 항체의 파파인 단백질분해를 통해 2H6 Fab를 제조하고, 제조된 2H6 Fab를 제조자의 설명에 따라 단백질 A 크로마토그래피를 통한 유동을 이용하여 정제하였다. 농도를 SDS-PAGE 및 10D=0.6 mg/㎖를 사용한 A280으로 측정하였다.

2H6 단일클론 항체의 친화성은 BIAcore 3000™ SPR 시스템(BIAcore, 인코포레이티드; 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)을 이용하여 측정하였다. 상기 친화성을 측정하는 한 방법은 2H6 항체를 CM5 칩 상에 고정시키고 상기 항체에 대한 Aβ_1-40 펩티드의 결합 속도를 측정하는 것이다. CM5 칩을 공급자의 설명에 따라 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC)) 및 N-하이드록석신이미드(NHS)로 활성화시켰다. 2H6 단일클론 항체를 10 mM 아세트산나트륨(pH 4.0 또는 5.0)으로 희석하고 0.005 mg/㎖의 농도로 상기 활성화된 칩 상에 주입하였다. 개개의 칩 채널을 가로지르는 가변 유동 시간을 이용하여 1000-2000 또는 2000-3000 RU의 항체 밀도를 달성하였다. 상기 칩을 에탄올아민으로 블로킹하였다. 재생 연구는 PIERCE 용출 완충제(제품 번호 21004, PIERCE 바이오테크놀로지; 미국 일리노이스주 룩포드 소재)와 4 M NaCl의 혼합물(2:1)이 200회 이상의 주입 과정 동안 상기 칩 상의 2H6 항체의 활성을 유지하면서 결합된 Aβ_1-40 펩티드를 효과적으로 제거함을 보여주었다. HBS-EP 완충제(0.01 M HEPES, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20)를 모든 BIAcore 분석을 위한 런닝 완충제로서 사용하였다. 정제된 Aβ_1-40 합성 펩티드 샘플의 연속 희석물(0.1-10x 추정된 K_D)을 100 ㎕/분의 속도로 1분 동안 주입하고 10분 동안의 해리 시간을 허용하였다. BIAevalution 프로그램을 이용하여 데이터를 1:1 랭뮤어 결합 모델(Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110)에 피팅함으로써 동역학적 결합 속도(k_on) 및 해리 속도(k_off)를 동시에 수득하였다. 평형 해리 상수(K_D) 값은 k_off/k_on으로서 계산하였다.

별법으로, 친화성은 SA 칩 상에 Aβ_1-40 펩티드를 고정시키고 고정된 Aβ_1-40 펩티드와 2H6 Fab의 결합 속도를 측정함으로써 측정하였다. 2H6 Fab 단편의 친화성은 SPR 시스템(BIAcore 3000™, BIAcore, 인코포레이티드; 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)으로 측정하였다. SA 칩(스트렙타비딘)은 공급자의 설명에 따라 사용하였다. 바이오티닐화된 Aβ_1-40 펩티드(서열번호 15)를 HBS-EP(10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% P20)로 희석하고 0.005 mg/㎖의 농도로 상기 칩 상에 주입하였다. 개개의 칩 채널을 가로지른 가변 유동 시간을 이용하여 2가지 항원 밀도 범위를 달성하였다: 상세한 동역학적 연구를 위해 10-200 RU 및 농도 연구를 위해 500-600 RU. 재생 연구는 PIERCE 용출 완충제와 4 M NaCl의 혼합물(2:1)이 200회 이상의 주입 과정 동안 상기 칩 상의 Aβ 펩티드의 활성을 유지하면서 결합된 Fab를 효과적으로 제거함을 보여주었다. HBS-EP 완충제를 모든 BIAcore 분석을 위한 런닝 완충제로서 사용하였다. 정제된 Fab 샘플의 연속 희석물(0.1-10x 추정된 K_D)을 100 ㎕/분의 속도로 2분 동안 주입하였고 10분 동안의 해리 시간을 허용하였다. Fab 단백질의 농도는 공지된 농도(아미노산 분석에 의해 측정됨)의 표준 Fab를 사용하여 ELISA 및/또는 SDS-PAGE로 측정하였다. BIAevalution 프로그램을 이용하여 데이터를 1:1 랭뮤어 결합 모델(Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110)에 피팅함으로써 동역학적 결합 속도(k_on) 및 해리 속도(k_off)를 동시에 수득하였다. 평형 해리 상수(K_D) 값은 k_off/k_on으로서 계산하였다. 상기 방법 둘다를 이용하여 측정한 2H6 항체의 친화성은 하기 표 5에 나타나 있다.

Aβ_1-40 펩티드의 아미노산 28-40으로 구성된 펩티드에 결합하는 뮤린 항체 2286에 대한 친화성은 전술한 바와 같이 시험하였다. 항체 2286은 미국 특허출원 제10/683,815호 및 국제특허출원 제PCT/US03/32080호에 기재되어 있다.

항체 2H6 및 2286의 결합 친화성

	k_on(1/Ms)	k_off(1/s)	K_D(nM)
CM5 칩 상의 2H6 mAb, 상기 칩 상에 유동된 Aβ_1-40 펩티드	4.67 x 10⁵	3.9 x 10^-3	9
SA 칩 상의 Aβ_1-40 펩티드, 상기 칩 상에 유동된 2H6 Fab	6.3 x 10⁵	3.0 x 10^-3	4.7
CM5 칩 상의 2286 mAb, 상기 칩 상에 유동된 Aβ_1-40 펩티드	1.56 x 10⁵	0.0419	269
SA 칩 상의 Aβ_1-40 펩티드, 상기 칩 상에 유동된 2286 Fab	1.8 x 10⁵	0.044	245

항체 2H6에 의해 인식되는 Aβ 폴리펩티드 상의 에피토프를 확인하기 위해, SPR(BIAcore 3000™) 결합 분석을 이용하였다. 바이오틴(글로발 펩티드 서비시즈, 미국 콜로라도주 소재)에 커플링된 Aβ_1-40 폴리펩티드(서열번호 15)를 SA 칩 상에 고정시켰다. 고정된 Aβ_1-40 폴리펩티드와 Aβ 항체(100 nM)를 Aβ 펩티드의 다양한 가용성 단편(16 μM, 어메리칸 펩티드 캄파니 인코포레이티드(미국 캘리포니아주 소재)로부터 입수함)의 부재 또는 존재 하에서 결합시켰다. 항체 2H6과 Aβ_1-40 폴리펩티드의 결합을 억제하는 Aβ 펩티드는 Aβ_17-40 펩티드, Aβ_33-40 펩티드 및 Aβ_1-40 펩티드이었다(도 3). 따라서, 항체 2H6은 Aβ_1-40 펩티드의 C-말단 펩티드(33-40)에 결합한다. 그러나, Aβ_1-40 펩티드의 이 C-말단 펩티드(33-40)는 시험된 농도에서 항체 2286과 Aβ_1-40 폴리펩티드의 결합을 억제하지 못하였다. 도 3에서 보여지는 바와 같이, Aβ_1-38 펩티드는 항체 2H6 또는 항체 2286과 Aβ_1-40 폴리펩티드의 결합을 억제하지 못하였는데, 이는 항체 2286과 유사하게 항체 2H6이 결합하는 에피토프가 Aβ_1-40 펩티드의 아미노산 39 및/또는 40을 포함함을 암시한다(도 3).

또한, Aβ_1-42 펩티드 및 Aβ_1-43 펩티드는 이 펩티드들이 Aβ_1-40 펩티드의 16-28에 결합하는 대조군 항체(항체 2289, 이 항체는 미국 특허출원 공개 제2004/0146512호 및 국제특허출원 공개 제WO 04/032868호에 기재되어 있음)와 Aβ_1-40 펩티드의 결합을 용이하게 억제할 수 있다 하더라도 항체 2H6과 Aβ_1-40 펩티드의 결합을 억제하지 못하였다. 이 결과는 항체 2H6이 Aβ_1-40 펩티드에는 우선적으로 결합하지만 Aβ_1-42 및 Aβ_1-43 펩티드에는 결합하지 못함을 보여준다.

항체 2H6이 결합하는 Aβ 펩티드의 분산된 아미노산 잔기의 관여 여부를 더 확인하기 위해, 마지막 6개의 아미노산(Aβ_1-40 아미노산 잔기 35-40)이 알라닌(알라닌 스캐닝 돌연변이유발)으로 개별적으로 치환되어 있는 다양한 Aβ_1-40 변이체를 부위 지정 돌연변이유발을 이용하여 발생시켰다. 상기 Aβ_1-40 변이체들(표 6에 표시된 서열을 가짐)을 글루타싸이온-S-트랜스퍼라제(GST) 융합 단백질(아머샴 파마샤 바이오테크; 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)로서 이. 콜라이에서 발현시킨 후, 글루타싸이온-아가로스 비드(시그마-알드리치 코포레이션; 미국 미조리주 세인트 루이스 소재) 상에서의 친화 정제를 이용하여 정제하였다. 대조군으로서 야생형(WT) Aβ_1-40뿐만 아니라 Aβ_1-41, Aβ_1-42 및 Aβ_1-39도 GST 융합 단백질로서 발현시켰다. Aβ_1-40, Aβ_1-41, Aβ_1-42 및 Aβ_1-39뿐만 아니라 6가지 다양한 변이체(표 6에 기재된 M35A(1-40), V36A(1-40), G37A(1-40), G38A(1-40), V39A(1-40) 및 V40A(1-40))를 ELISA 분석 플레이트 상에 고정시키고(웰 당 0.025 ㎍/㎕의 GST-펩티드 100 ㎕), 농도가 0.3 nM씩 감소된 연속 희석물 형태의 mAb 2286, 2289 및 2H6 중 어느 하나와 함께 항온처리하였다(0.3 nM mAb를 사용한 데이터는 도 4에 나타냄). 10회의 연속 세척 후, 분석 플레이트를 웰 당 0.03 ㎍/㎖의 바이오틴-접합된 염소-항-마우스(H+L) 항체(벡터 레이보레이토리스, 벡터 #BA-9200; 미국 캘리포니아주 버링감 소재) 100 ㎕에 이어서 웰 당 0.025 ㎍/㎖의 HRP-접합된 스트렙타비딘(아머샴 바이오사이언시즈 코포레이션, #RPN4401V; 미국 뉴저지주 소재) 100 ㎕와 함께 항온처리하였다. 플레이트의 흡광도를 450 nm에서 판독하였다.

도 4에서 보여지는 바와 같이, Aβ의 아미노산 16-28에 대해 유도된 Mab 2289는 동일한 강도로 모든 변이체를 인식하였고 플레이트 상의 단백질 농도 및 단백질 통합성의 내부 양성 대조군으로서의 기능을 수행하였다. 항체 2H6은 도 4에서 보여지는 바와 같이 Aβ_1-41, Aβ_1-39 또는 Aβ_1-42를 인식하지 못하였다. Aβ_1-40변이체 V40A, V39A, G38A, G37A, V36A 및 M35A는 항체 2H6에 대한 감소된 결합을 보였는데, 이는 항체 2H6 에피토프가 Aβ_1-40의 C-말단에서 6개 이상의 아미노산만큼 연장되어 있음을 의미한다. V 및 G로부터 A로의 돌연변이는 매우 보존적이고 단백질에서 중요한 구조적 변화를 야기하지 않을 것이므로, 항체 2H6 결합에 대한 상기 돌연변이의 주된 효과는 Aβ와 관련하여 언급한 아미노산들을 구별하는 항체의 능력에 기인할 것이고, 이 데이터는 이 항체에 대한 고도의 특이성을 입증한다.

항체 2H6 및 9TL이 Aβ_1-40에의 결합에 대해 경쟁하는 지를 확인하기 위해, BIAcore 분석법을 이용하여 경쟁 실험을 수행하였다. 항체 2H6, 9TL 및 2289를 CM5 칩의 여러 패널 상에 고정시켰다. CM5 칩 채널은 공급자의 설명에 따라 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS)로 활성화시켰다. 항체 2H6, 9TL 및 2289를 10 mM 아세트산나트륨(pH 4.0)으로 각각 희석하고 0.005 mg/㎖의 농도로 상기 활성화된 칩 상에 주입하였다. 항체 2H6의 경우 항체 밀도는 1625 RU이었고, 항체 2289의 경우 항체 밀도는 2200 RU이었다. 각 채널은 에탄올아민으로 블로킹하였다. Aβ_1-40 펩티드(150 μM)를 상기 칩 상에 2분 동안 유동시켰다. 이어서, (결합의 경쟁에 대해 시험될) 항체 2H6을 0.6 μM의 농도로 상기 칩 상에 1분 동안 유동시켰다. HBS-EP 완충제(0.01 M HEPES, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20)를 모든 BIAcore 분석을 위한 런닝 완충제로서 사용하였다. Aβ_1-40의 결합을 측정한 후, 칩의 모든 채널을, PIERCE 용출 완충제(제품 번호 21004, PIERCE 바이오테크놀로지; 미국 일리노이스주 룩포드 소재)와 4 M NaCl의 혼합물(2:1)로 6초 동안 2회 세척하여 재생시켰다. 이어서, 항체 9TL에 대해 경쟁 결합을 수행한 후 항체 2289에 대해 경쟁 결합을 수행하였다. Aβ_1-40에의 결합에 대한 항체 9TL과 항체 2H6 사이의 경쟁이 관찰되었지만, 항체 9TL과 항체 2289 사이의 경쟁 또는 항체 2H6과 항체 2289 사이의 경쟁은 관찰되지 않았다. 고정된 항체와 칩 상에 유동된 동일한 항체 사이의 경쟁 관찰은 양성 대조군으로서 사용되었다.

B. 항체 2 H6 은 APP 에 결합하지 못한다.

항체 2H6이 APP에 결합하는 지를 확인하기 위해, 야생형 APP로 형질감염된 세포와 항체 2H6의 결합을 측정하였다. 293 세포를 야생형 인간 APP를 코딩하는 cDNA로 형질감염시켰다. 형질감염으로부터 48시간 후, 세포를 단일클론 항체 항-Aβ_1-16, 항-Aβ_16-28 또는 2H6(10% FCS가 함유된 DMEM 중의 5 ㎍/㎖)과 함께 얼음 상에서 45분 동안 항온처리하였다. 이어서, 상기 세포를 PBS로 5분 동안 3회 세척하고, 4% PFA로 고정시켰다. 상기 세포를 PBS로 3회 재세척하고, 2차 Cy3-접합된 염소 항-마우스 항체(1:500의 희석물)(잭슨 이뮤노리서치)를 사용하여 현광 현미경 하에서 항체 결합을 검출하였다.

Aβ에서 N-말단 에피토프 또는 중심 에피토프를 인식하는 항-Aβ_1-16 및 항-Aβ_16-28 항체 둘다 세포 상에 발현된 APP 전구체 단백질에의 유의한 결합을 보였다. 대조적으로, 항체 2H6은 APP 발현 세포에 결합하지 못하였다.

C. 탈글리코실화된 항체 2H6의 발생

탈글리코실화된 항체 2H6을 발생시키기 위해, 정제된 항체 2H6을 20 mM Tris-HCl(pH 8.0) 중의 펩티드-N-글리코시다제 F(프로자임, 항체 1 mg 당 0.05 U)와 함께 37℃에서 7일 동안 항온처리하였다. 탈글리코실화의 완결을 MALDI-TOF-MS 및 단백질 겔 전기영동으로 검증하였다. 탈글리코실화된 항체를 단백질 A 크로마토그래피로 정제하고 내독소를 Q-세파로스로 제거하였다. Aβ_1-40 펩티드에 대한 탈글리코실화된 2H6의 결합 친화성을 상기 BIAcore 분석법을 이용하여 시험하고, Aβ_1-40 펩티드에 대한 탈글리코실화된 2H6의 결합 친화성은 온전한 항체 2H6의 결합 친화성과 동일한 것으로 밝혀졌다.

실시예 4: AMD 동물 모델에서 망막 기능의 보호 및 회복에 있어서 탈글리코실화된 항체 2H6(2H6-D)의 효과

초기 연구(Malek, G. et al., PNAS 102: 11900-5 (2005))는 하기 3가지 위험 인자의 조합이 인간 AMD의 임상 특징과 밀접하게 관련된 것으로 추정되는 동물 모델을 제공함을 입증하였다: (1) 아포지단백질 아이소폼 E4(APOE4) 유전자형, (2) 고령(65주 이상) 및 (3) 고지방 및 고콜레스테롤 풍부(HF-C) 음식섭취. 고령 APOE4 마우스는 RPE-색소 변화, 두꺼운 분산성 서브-RPE 침착, 입술-풍부 드루젠-유사 침착, 브루크 막의 비후화, 광수용체 변성과 중첩되는 RPE 비대증의 패치 영역 및 맥락막 혈관신생(CNV)을 포함하는, 인간 건성 AMD 및 습성 AMD 둘다에서 관찰된 형태학적 특징과 유사한 병리학적 변화를 발달시켰다. 이 변화는 식이 요법과 관계없이 대조군 인간 APOE3 발현 마우스 중 임의의 마우스에서 검출되지 않았고, 어린 APOE4 동물에서도 임의의 병리학적 변화가 검출되지 않았다. 기능적 결함을 전장 암순응 망막전위도로부터 확인하였다. 영향받은 동물들은 대조군에 비해 a-파 및 b-파 증폭에 있어서 유의한 감소를 보였다. 중요하게는, 이 조직병리학적 및 기능적 변화는 상기 3가지 위험 인자 모두의 존재를 필요로 하였다. 자연 발생 CNV의 동물 모델은 인간 질환의 생리학적-관련 위험 인자를 도입한 제1 동물 모델이다.

A. 실험 프로토콜

항체의 투여

인간 ApoE4를 발현하는 고령의(65주 이상의) 표적화된-치환 마우스를 본 실험에 사용하였다. 상기 마우스에 존재하는 AMD-유사 표현형은 이미 개시되어 있다(Malek, G. et al., PNAS 102: 11900-5 (2005)). 8주 동안의 처리 연구를 위해, 65주 이상의 고령 ApoE4-형질전환 마우스를 4개의 군 중 한 군으로 배정하였다. 제1 군(E4-ND)에게는 정상적인 음식을 꾸준히 공급하였다(n=2). 제2 군(E4-HFC-R1)에는 고지방 및 고콜레스테롤 풍부(HF-C) 음식을 8주 동안 공급하였다(n=2). 제3 군(E4-HFC-R1)에는 HF-C 음식을 8주 동안 공급하고 리나트(Rinat) 1(3 mg/kg)을 매주 복강내 주사하였다(n=5). 제4 군(E4-HFC-R2)에게는 HF-C 음식을 8주 동안 공급하고 리나트 2(3 mg/kg)를 매주 복강내 주사하였다(n=5). 연구의 완결 후, 상기 군들에게 공급한 물질을 확인하였다: 리나트 1은 PBS 비히클이었고 리나트 2는 탈글리코실화된 항-Aβ 항체 2H6(실시예 3에 기재된, 마우스 단일클론 항-인간 Aβ_28-40 IgG2b "2H6-D")이었다.

생체 내 평가

기저부(fundus) 검사를 0주째 시점에 수행하고, 기저부 및 플루오레세인 혈관촬영을 8주째에 수행하였다. 기저부 카메라(TRC-50EX 레티나 카메라)를 이용하여 사진을 촬영하였다. TOPCON IMAGEnet™ 시스템을 이용하여 이미지를 포획하였다. 플루오레세인 염료(10% 플루오레세인 나트륨, 약 0.1 ㎖/kg)를 혈관 접근 포트를 통해 주입하였다. 혈관신생을 평가하고 CNV 병소와 관련된 플루오레세인의 누출을 모니터링하기 위해, 염료 주입 후 여러 시점에서 동맥 상(phase), 초기 동맥정맥 상 및 여러 후기 동맥정맥 상을 포함하는 사진을 촬영하였다. 플루오레세인 혈관촬영의 해석 및 분석은 안과의사에 의해 독립적으로 수행되었다.

전혈 중의 총 혈장 콜레스테롤 수준을 HF-C 음식의 8주간 공급 전 및 후에 상기 마우스(5시간 동안 금식함)로부터 수집하였다.

플루오레세인 혈관촬영(FA)

1마리 동물, 즉 E4-HFC-R2는 혈관촬영의 후기 프레임에서 가능한 누출을 보였다. 상기 동물은 FA 후 및 망막전위도 판독 전에 사망하였고 조직은 회수될 수 없었다.

망막전위도 판독

9주째가 되는 시점에서, 12시간 이상의 기간 동안 암순응된 동물로부터 망막전위도(ERG) 판독치를 수득하였다. 동물을 케타민/크실라진 칵테일로 각각 마취시키고, 동공을 확장시키고, 37℃ 가온 패드 상에서 상기 동물을 안정화시킨 후, 2.5% 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 한 방울과 함께 눈과 접촉되도록 배치된 은 와이어 시험 전극을 사용하여 ERG 추적치를 기록하였다. 마우스를 광 자극제 챔버 내에 넣었는데, 이 챔버 내에서 동물은 광의 플래시에 노출되었다(0.0005로부터 시작하여, 1 로그 단계에서 1000 cd-s/m²의 최대 강도가 약화됨). a-파 진폭을 기준선부터 a-파 골(trough)까지 측정하고, b-파 진폭을 a-파 골부터 b-파 봉우리까지 측정하였다.

조직학적 분석

희생 당일 마우스의 체중을 측정하고 마우스에게 아버틴(체중 10 gm 당 0.2 ㎕)을 과다투여한 다음, 20 ㎖의 생리식염수를 심장내로 관주하였다. 뇌를 신속히 제거하고, 뇌의 좌측 절반을 조직병리학적 분석을 위해 즉석 제조된 10% 포르말린 중에서 16시간 동안 함침하여 고정시켰다. 30 마이크론 진동절단 절편을 10% MeOH, 1x PBS 및 2% H₂O₂로 전처리하고, PBS로 세척하고, 항원 복구를 위해 88% 포름산 중에서 1분 동안 항온처리하고, 5% 정상 염소 혈청(NGS) 및 PBS로 블로킹하였다. 절편을 1% NGS/PBS 중의 바이오티닐화된 4G8 1차 항체(Aβ의 아미노산 잔기 17-24에 대한 Signet 4G8 단일클론 마우스 인간 IgG2b)의 1:1000 희석물과 함께 밤새 항온처리하고 ABC 벡타스테인 키트(Vectastain Kit)(벡타 랩스)를 제조자의 설명에 따라 사용하여 상기 절편을 가시화하였다.

B. 결과

탈글리코실화된 항체의 투여에 의한 망막 기능의 회복/보호

도 5에서 보여지는 바와 같이, 고지방 및 고콜레스테롤 풍부 음식을 공급받은 ApoE4 마우스(E4-HFC) 대 정상 음식을 공급받은 마우스(E4-ND)의 a-파 및 b-파 진폭에 있어서 통계학적으로 유의한 감소가 있다(a-파 p=0.0106, b-파 p=0.008). 처리된 동물들로부터 얻은 ERG를 본 발명자들의 ERG 기준 세트와 비교하였다. E4-HFC와 비교하여 처리군(E4-HFC-R1 및 E4-HFC-R2)의 a-파 진폭에 있어서 유의한 차이가 없었다. 대조적으로, b-파 진폭은 E4-HFC-R2 군에서의 망막 기능의 놀라운 회복 및/또는 보호를 보여준다(도 6).

항-Aβ 항체 2H6-D가 주입된 HF-C 음식을 공급받은 APOE4 마우스에서의 Aβ 침착물의 감소

도 7에서 보여지는 바와 같이, E4-HFC 마우스에서의 총 Aβ 면역염색은 대조 비히클 군과 비교할 때 항체 2H6-D를 사용한 8주간의 면역요법 후 감소되었다.

C. 결론

상기 데이터는 1) 항-Aβ 항체 2H6-D를 공급받은 마우스의 ERG에 의해 입증된 망막 기능의 회복/보호, 및 2) 비처리된 AMD 마우스 군과 비교할 때 마우스 뇌에서 항체 2H6-D로 처리된 경우 아밀로이드 축적의 감소를 보여준다.

실시예 5: 항체 6G 및 이의 변이체의 결합 친화성 측정

A. 일반적인 방법

하기 일반적인 방법들을 본 실시예 및 다른 실시예에서 사용하였다.

클론 특징규명에 사용된 발현 벡터

소규모 Fab 제조

대규모 Fab 제조

상세한 동적 파라미터를 얻기 위해, Fab를 발현시키고 대규모 배양물로부터 정제하였다. LB + 앰피실린(50 ㎍/㎖) + 2% 글루코스가 함유된 삼각 플라스크를 선별된 Fab-발현 이. 콜라이 클론으로부터의 밤새 배양물 5 ㎖로 접종하였다. OD₅₅₀ _nm가 1.0에 도달할 때까지 클론을 30℃에서 항온처리한 후 배지를 LB + 앰피실린(50 ㎍/㎖) + 1 mM IPTG 200 ㎖로 교체하여 발현을 유도하였다. 30℃에서 5시간 동안 발현시킨 후, 세포를 원심분리하여 펠렛 상태로 모든 다음 10 ㎖의 PBS(pH 8)에 재현탁시켰다. 동결(-80℃에서)/해동(37℃에서)을 2회 수행하여 세포 용해물을 수득하였다. 세포 용해물의 상청액을 PBS(pH 8)로 평형화된 Ni-NTA 수퍼플로우 세파로스(퀴아젠; 미국 캘리포니아주 발렌시아 소재) 컬럼 상에 로딩한 후, 5배 컬럼 부피의 PBS(pH 8)로 세척하였다. 개개의 Fab를 PBS(pH 8) + 300 mM 이미다졸을 사용하여 여러 분획으로 용출하였다. Fab를 함유하는 분획을 모아 PBS 중에서 투석한 후 친화성 특징규명 전에 ELISA로 정량하였다.

전장 항체 제조

전장 항체의 발현을 위해, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포유동물 발현 벡터 내에 클로닝하고 일시적 발현을 위해 리포펙타민을 사용하여 HEK 293 세포 내로 형질감염시켰다. 표준 방법을 사용하여 항체를 단백질 A로 정제하였다.

벡터 pDb.6G.hFc2a는 항체 6G의 중쇄를 포함하는 발현 벡터이고 중쇄의 일시적 또는 안정한 발현에 적합하다. 벡터 pDb.6G.hFc2a는 하기 영역에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다: 뮤린 사이토메갈로바이러스 프로모터 영역(뉴클레오티드 1-612); 합성 인트론(뉴클레오티드 619-1507); DHFR 코딩 영역(뉴클레오티드 707-1267); 인간 성장 호르몬 신호 펩티드(뉴클레오티드 1525-1602); 항체 6G의 중쇄 가변 영역; A330P331로부터 S330S331로의 돌연변이(야생형 IgG2a 서열을 기준으로 한 아미노산 넘버링; 문헌(Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624) 참조)를 포함하는 인간 중쇄 IgG2a 불변 영역: SV40 후기 폴리아데닐화 신호; SV40 인핸서 영역; 파지 f1 영역; 및 베타 락타마제(AmpR) 코딩 영역.

벡터 pEb.6G.hK는 항체 6G의 경쇄를 포함하는 발현 벡터이고 상기 경쇄의 일시적인 발현에 적합하다. 벡터 pEb.6G.hK는 하기 영역에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다: 뮤린 사이토메갈로바이러스 프로모터 영역(뉴클레오티드 1-612); 인간 EF-1 인트론(뉴클레오티드 619-1142); 인간 성장 호르몬 신호 펩티드(뉴클레오티드 1173-1150); 항체 6G 경쇄 가변 영역; 인간 카파 쇄 불변 영역; SV40 후기 폴리아데닐화 신호; SV40 인핸서 영역; 파지 f1 영역; 및 베타 락타마제(AmpR) 코딩 영역.

BIAcore 분석

상기 실시예 1에 기재된 방법을 이용하여 BIAcore 3000™ SPR 시스템(BIAcore, 인코포레이티드; 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)으로 6G 마우스 항체의 친화성을 측정하였다.

ELISA 분석

항체 6G 및 이의 변이체와 비-바이오티닐화된 Aβ 펩티드의 결합을 측정하기 위해 ELISA를 이용하였다. NUNC 맥시소프 플레이트를 4℃에서 PBS(pH 7.4) 중의 Aβ 펩티드 2.5 ㎍/㎖로 1시간 이상 동안 코팅하였다. 플레이트를 PBS 완충제(pH 7.4) 중의 1% BSA로 블로킹하였다. 1차 항체(세포 상청액으로부터 얻음, 항-Aβ 항체를 함유하는 혈청, 또는 원하는 희석비로 희석된 정제된 전장 항체 또는 Fab)를 실온에서 고정된 Aβ 펩티드와 함께 1시간 동안 항온처리하였다. 세척 후, 플레이트를 2차 항체, 즉 1:5000 희석비로 희석된 HRP-접합된 염소 항-인간 카파 쇄 항체(MP 바이오메디칼스, 55233)와 함께 항온처리하였다. 세척 후, 결합된 2차 항체를, TMB 기질(KPL, 50-76-02, 50-65-02)을 첨가하여 측정하였다. 1 M 인산을 첨가하여 HRP 반응을 정지시키고, 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

항체 6G 및 이의 변이체와 바이오티닐화된 Aβ 펩티드의 결합을 측정하기 위해 ELISA를 이용하였다. NUNC 맥시소프 플레이트를 4℃에서 PBS(pH 7.4) 중의 스트렙타비딘(PIERCE, 21122) 6 ㎍/㎖로 1시간 이상 동안 코팅하였다. 플레이트를 PBS 완충제(pH 7.4) 중의 1% BSA로 블로킹하였다. 세척 후, PBS(pH 7.4) 중의 바이오티닐화된 Aβ 펩티드를 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 1차 항체(세포 상청액으로부터 얻음, 항-Aβ 항체를 함유하는 혈청, 또는 원하는 희석비로 희석된 정제된 전장 항체 또는 Fab)를 실온에서 고정된 Aβ 펩티드와 함께 1시간 동안 항온처리하였다. 세척 후, 플레이트를 2차 항체, 즉 1:5000 희석비로 희석된 HRP-접합된 염소 항-인간 카파 쇄 항체(MP 바이오메디칼스, 55233)와 함께 항온처리하였다. 세척 후, 결합된 2차 항체를, TMB 기질(KPL, 50-76-02, 50-65-02)을 첨가하여 측정하였다. 1 M 인산을 첨가하여 HRP 반응을 정지시키고, 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

B. Aβ _1-40 펩티드, Aβ _1-42 펩티드 및 다른 Aβ 펩티드에 대한 항체 6G 및 이의 변이 체의 결합 친화성

항체 6G의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 도 8에 표시되어 있다. 상기 BIAcore 시스템을 이용하여 측정한, Aβ_1-40 펩티드, Aβ_1-42 펩티드 및 Aβ_22-37 펩티드에 대한 항체 6G의 결합 친화성은 하기 표 7에 표시되어 있다.

항체 6G Fab 단편의 결합 친화성

	k_on(1/Ms)	k_off(1/s)	K_D(nM)
스트렙타비딘 칩 상에 고정된 바이오티닐화된 Aβ_1-40 펩티드, 상기 칩 상으로 유동된 항체 6G Fab	3.0 x 10⁵	7.0 x 10^-4	2
스트렙타비딘 칩 상에 고정된 바이오티닐화된 Aβ_1-42 펩티드, 상기 칩 상으로 유동된 항체 6G Fab	1.8 x 10⁴	1.6 x 10^-3	80
스트렙타비딘 칩 상에 고정된 바이오티닐화된 Aβ_22-37 펩티드, 상기 칩 상으로 유동된 항체 6G Fab	3.6 x 10⁵	3.9 x 10^-3	11

항체 6G의 변이체의 아미노산 서열은 하기 표 8에 나타나 있다. 표 8에 나타낸 변이체의 모든 아미노산 치환은 항체 6G의 아미노산 서열을 기준으로 기재된 것이다. 항체 6G의 변이체의 상대적 결합도 표 8에 기재되어 있다. 결합은 ELISA 플레이트의 표면 상에 고정된 비-바이오티닐화된 Aβ_1-40 펩티드 또는 Aβ_1-42 펩티드를 사용하여 상기 ELISA로 측정하였다.

실시예 6: 항체 6G가 결합하는 Aβ 펩티드 상의 에피토프의 특징규명

항체 6G에 의해 인식되는 Aβ 펩티드 상의 에피토프를 확인하기 위해, ELISA 결합 분석을 이용하였다. 다양한 Aβ 펩티드(글로발 펩티드 서비시즈; 미국 콜로라도주 소재)를 ELISA 플레이트 상에 고정시켰다. 고정된 Aβ 펩티드와 6G 전장 항체(20 nM)의 결합을 전술한 바와 같이 ELISA로 측정하였다. Aβ_1-40 펩티드, Aβ_1-42 펩티드 및 Aβ_1-43 펩티드의 아미노산 서열은 하기 표 9에 나타나 있다. 표 9에서 보여지는 바와 같이, 항체 6G는 Aβ_17-40 펩티드 , Aβ_17-42 펩티드, Aβ_22-35 펩티드, Aβ_28-40 펩티드, Aβ_1-38 펩티드, Aβ_1-40 펩티드, Aβ_1-42 펩티드, Aβ_1-43 펩티드 및 Aβ_28-42 펩티드에 결합하지만, Aβ_28-42 펩티드에의 결합은 다른 Aβ 펩티드보다 훨씬 더 약하다. 항체 6G는 Aβ_1-16 펩티드, Aβ_1-28 펩티드 및 Aβ_33-40 펩티드에 결합하지 못하였다. 따라서, 항체 6G는 다양한 절두된 Aβ 펩티드, 예를 들어, Aβ_22-35 펩티드, Aβ_1-38 펩티드, Aβ_1-40 펩티드, Aβ_1-42 펩티드 및 Aβ_1-43 펩티드의 C-말단에 결합한다.

하기 표 9는 BIAcore 분석법을 이용하여 k_off(1/s)로 측정한, Aβ_1-40 펩티드에 대한 항체 6G의 결합 친화성과 다른 Aβ 펩티드에 대한 항체 6G의 결합 친화성의 비교를 보여준다. 항체 6G는 다른 펩티드에 비해 최대 친화성으로 Aβ_1-40 펩티드에 결합하고 절두된 Aβ_1-40 펩티드(예컨대, 1-36, 1-37, 1-38 및 1-39), Aβ_1-42 펩티드 및 Aβ_1-43 펩티드에 상당히 낮은 친화성으로 결합한다. 이것은 Aβ의 아미노산 40(발린)의 측쇄 또는 골격이 항체 6G와 Aβ_1-40의 결합에 관여하고, 결합이 상기 아미노산의 부재 하에서는 유의하게 감소함(예를 들어, 약 10 내지 약 50-250배의 친화성 상실)을 시사한다. 카복시-말단 아미데이트화된 Aβ_1-40 펩티드에 대한 낮은 친화성 결합은 항체 6G와 Aβ_1-40 펩티드의 결합이 Aβ_1-40 펩티드의 자유 C-말단을 이용하지만 상기 자유 C-말단에 의존하지 않음을 시사한다. Aβ_1-42 펩티드 및 Aβ_1-43 펩티드에 대한 보다 낮은 결합 친화성은 Aβ_1-40 펩티드의 단량체 형태와 Aβ_1-42 펩티드 또는 Aβ_1-43 펩티드의 단량체 형태 사이의 구조적 차이에 기인할 수 있다. Aβ_1-42 펩티드 단량체는 용액 중의 Aβ_1-40 펩티드 단량체와 상이한 구조를 가짐이 밝혀졌다. 검색 번호 1IYT로 단백질 데이터 뱅크(pdb 파일)에서 확인되는 Aβ_1-42 펩티드에 대한 단량체 구조 배위; 및 검색 번호 1BA6 및 1BA4로 단백질 데이터 뱅크(pdb 파일)에서 확인되는 Aβ_1-40 펩티드에 대한 단량체 구조 배위를 참조한다.

항체 6G의 에피토프 맵핑은 ELISA 분석으로 수행하였다. 다양한 Aβ 펩티드들(이 펩티드들은 C-말단에 부가된 글리신을 가짐)의 바이오티닐화된 15-머 또는 10-머를 스트렙타비딘-코팅된 플레이트 상에 고정시켰다. 항체 6G(2.5 내지 10 ㎍/㎖)를 상기 고정된 펩티드와 함께 항온처리하고, 결합을 전술한 바와 같이 측정하였다. 도 10에서 보여지는 바와 같이, 항체 6G는 C-말단에서 글리신을 갖는 아미노산 20-34, 21-35, 22-36, 23-37, 24-38, 25-39 및 25-34를 갖는 Aβ 펩티드에 결합하지만, 상기 펩티드의 C-말단에서 글리신을 갖는 아미노산 19-33, 26-40, 27-41, 24-33 및 26-35를 갖는 Aβ 펩티드에는 결합하지 못한다. 이것은 항체 6G가 결합하는 에피토프가 아미노산 25-34를 포함함을 시사한다.

상기 보여진 데이터를 기초로 할 때, 항체 6G가 결합하는 에피토프는 아미노산 25-34 및 40을 포함하는 듯하다. 도 11은 항체 6G의 에피토프를 보여주는 개략도이다.

B. 항체 6G는 APP 에 결합하지 못한다.

항체 6G가 APP에 결합하는 지를 확인하기 위해, 야생형 APP로 형질감염된 세포와 항체 6G의 결합을 측정하였다. HEK293 세포를 야생형 인간 APP를 코딩하는 cDNA로 형질감염시켰다. 형질감염으로부터 48시간 후, 세포를 단일클론 항체 항-Aβ_1-16, (m2324) 또는 6G(10% FCS가 함유된 DMEM 중의 5 ㎍/㎖)와 함께 얼음 상에서 45분 동안 항온처리하였다. 이어서, 상기 세포를 PBS로 5분 동안 3회 세척하고, 4% PFA로 고정시켰다. 상기 세포를 PBS로 3회 재세척하고, 2차 Cy3-접합된 염소 항-마우스 항체(1:500의 희석물)(잭슨 이뮤노리서치)를 사용하여 현광 현미경 하에서 항체 결합을 검출하였다.

도 12에서 보여지는 바와 같이, Aβ에서 N-말단 에피토프를 인식하는 항-Aβ_1-16 항체는 세포 상에 발현된 APP 전구체 단백질에의 유의한 결합을 보였다. 대조적으로, 항체 6G는 APP 발현 세포에 결합하지 못하였다.

실시예 7: 뮤린 항체 7G10(항-Aβ _1-42 /Aβ _1-43 )의 제조 및 특징규명

마우스를 문헌(Konig, G. et al, Annals New York Academy of Sciences. 777:344-55 (1996))에 기재된 바와 같이 면역보강제 중의 KLH에 접합된 펩티드 약 100 ㎍으로 면역화시켰다. BA4 펩티드의 위치 29-42가 APP의 잠정적 경막 영역 내에 전체적으로 놓여 있고 성질 면에서 소수성을 띠기 때문에, KLH 펩티드를 친수성 스페이서에 접합시켰다. KLH-HDGDGD-MVGGVVIA는 Anaspec에서 합성하고, 5개 잔기로 구성된 스페이서는 불용성 문제를 극복하고 C-말단이 담체로부터 떨어져 있게 하기에 충분하였다. 첫째 날, 마우스를 CFA(완전 프로인트 면역보강제)와 함께 100 ㎍의 35-42/KLH 펩티드로 피하로 면역화시켰다. 15일째 날, 마우스를 100 ㎍의 펩티드/KLH Ribi/명반으로 면역화시켰다. 55일째 날, 마우스를 15일째 날과 동일하게 면역화시켰다. 95일째 날, 마우스를 100 ㎍의 펩티드/KLH로 정맥내로 부스팅하였다.

면역화된 마우스로부터 비장세포를 수득하고, 99일째 날에 폴리에틸렌 글리콜 1500을 사용하여 10:1의 비율로 상기 비장세포와 P3x63Ag8.653 골수종 세포인 ATCC CRL 1580을 융합시켰다. 융합된 세포를 20% 말 혈청 및 2-옥살로아세테이트/피루베이트/인슐린(시그마)이 함유된 DMEM이 들어 있는 96-웰 플레이트 내에 플레이팅하고, 융합 후 10일째 날부터 시작하여 ELISA 분석 및 2 ㎍/㎖ Aβ_1-42(Anaspec)로의 코팅을 이용하여 상청액을 분석하였다. 양성 세포를 선별하여 증폭시키고 특징규명을 추가로 수행하였다.

융합 당일 마우스 혈청 역가는 Aβ_1-42 자유 펩티드에 대해 시험된 경우 1/9000이었다. Aβ_1-40 펩티드, Aβ_1-42 펩티드 및 Aβ_1-43 펩티드와 항체 7G10의 친화성 결합은 BIAcore로 분석하였다.

BIAcore 분석

항체 7G10의 친화성을 실시예 1에서 전술한 바와 같이 BIAcore 3000™을 이용하여 측정하였다. N-바이오티닐화된 Aβ_1-40 펩티드, Aβ_1-42 펩티드 및 Aβ_1-43 펩티드를 SA 칩 상에 포획시켰다. 상기 항체 7G10 원액의 1/6 희석물부터 시작하여, 항-Aβ_1-40 Fab, 항-Aβ_1-42 Fab 및 항-Aβ_1-43 Fab의 3배 연속 희석물을 주입하였다. 상기 칩을, 6% EtOH + 6 mM NaOH의 18초 펄스를 이용하여 재생시켰다.

샘플	IgG (mg/㎖)	부피(㎖)	Fab(mg/㎖)	부피(㎖)	K _D (nM)
Aβ_1-40 펩티드	0.672	2.4	1.458	0.4	적용불가
Aβ_1-42 펩티드	0.672	2.4	1.458	0.4	37.6
Aβ_1-43 펩티드	0.672	2.4	1.458	0.4	41

상기 표시된 바와 같이, 항체 7G10은 Aβ_1-42 펩티드에 대해 37.6 nM의 K_D를 나타내고, Aβ_1-43 펩티드에 대해 41 nM의 K_D를 나타내었다. Aβ_1-40 펩티드에 대한 측정가능한 결합은 검출되지 않았다.

실시예 10: 동물 AMD 모델에서 망막 기능의 보호 및 회복에 있어서 항체 2H6-D, 6G 및 7G10의 효과 비교

A. 실험 프로토콜

항체의 투여

실시예 4에 기재된 프로토콜을 반복하였다. 65주 이상의 고령 ApoE4-형질전환 마우스를 8주 동안 5개의 군 중 1개의 군으로 배정하였다. 제1 군(E4-ND)에게는 정상적인 음식을 꾸준히 공급하였다(n=6). 제2 군(E4-HFC-R1)에게는 고지방 및 고콜레스테롤 풍부(HF-C) 음식을 8주 동안 공급하였다(n=12). 제3 군(E4-HFC-R1)에게는 HF-C 음식을 8주 동안 공급하고 리나트 3(3 mg/kg)을 매주 복강내 주사하였다(n=12). 제4 군(E4-HFC-R2)에게는 HF-C 음식을 8주 동안 공급하고 리나트 4(3 mg/kg)를 매주 복강내 주사하였다(n=12). 제5 군(E4-HFC-R)에게는 HF-C 음식을 8주 동안 공급하고 리나트 5(3 mg/kg)를 매주 복강내 주사하였다(n=12). 연구의 완결 후, 상기 군들에게 공급한 물질을 확인하였다: 리나트 3은 항체 7G10이었고, 리나트 4는 탈글리코실화된 항-Aβ 항체 2H6이었고, 리나트 5는 항체 6G이었다.

기저부 검사 및 플루오레세인 혈관촬영은 상기 실시예 4에서 전술한 바와 같이 수행하였다. ERG 판독치는 상기 실시예 4에서 전술한 바와 같이 8주 후에 수득하였다.

결과

탈글리코실화된 항체의 투여에 의한 망막 기능의 회복/보호

도 13에서 보여지는 바와 같이, b-파 진폭은 항체 2H6-D로 처리된 군(E4-HFC 항-Aβ_1-40)에서 망막 기능의 유의한 회복 및/또는 보호를 확인시켜준다. b-파 진폭은 항체 7G10으로 처리된 군(E4-HFC 항-Aβ_1-42/Aβ_1-43)의 회복이 거의 없거나 전혀 없음을 보여준다. 놀랍게도, b-파 진폭은 항체 6G로 처리된 군(E4 HFC 항-Aβ_1-40/Aβ_1-42)에서 망막 기능의 훨씬 더 높은 회복 및/또는 보호를 보여준다. 도 14에서 보여지는 바와 같이, 항체 6G로 처리된 군의 b-파 진폭은 정상적인 마우스의 대조군에 필적하였는데, 이는 망막 기능의 완전한 회복 및/또는 보호를 의미한다.

결론

상기 데이터는 1) 서브-RPE 아밀로이드가 AMD에서 병원성 및/또는 독성을 나타낸다는 점; 2) 항-Aβ 항체 2H6-D로 처리된 마우스의 ERG에 의해 입증된, 망막 기능의 유의한 회복/보호; 및 3) 이중특이적 항-Aβ_1-40/Aβ_1-42 6G로 처리된 마우스의 ERG에 의해 입증된, 망막 기능의 완전한 회복/보호를 확인시켜준다.

본 명세서에 기재된 실시예 및 실시양태는 예시를 위한 목적으로만 제공된 것이므로 이들의 다양한 변경 또는 변화가 당업자에게 시사될 것이고 본원의 기술적 사상 및 범위 내에 포함될 것임을 이해할 것이다. 본 명세서에서 인용된 모든 공개문헌, 특허 및 특허출원은 개개의 공개문헌, 특허 또는 특허출원이 참고로 도입되기 위해 구체적으로 및 개별적으로 기재된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 본원에 도입된다.

생물학적 물질의 기탁

하기 물질들은 미국 버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 불레바드 10801에 소재하는 미국 세포주은행에 기탁되었다:

물질	항체 번호	ATCC 기탁번호	기탁일
pDb.9TL.hFc2a 9TL	9TL 중쇄	PTA-6124	2004년 7월 20일
pEb.9TL.hK	9TL 경쇄	PTA-6125	2004년 7월 20일
pDb.6G.hFc2a	6G 중쇄	PTA-6786	2005년 6월 15일
pEb.6G.hK	6G 경쇄	PTA-6787	2005년 6월 15일

벡터 pEb.9TL.hK는 항체 9TL 경쇄 가변 영역 및 경쇄 카파 불변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이고, 벡터 pDb.9TL.hFc2a는 9TL 중쇄 가변 영역, 및 A330P331로부터 S330S331로의 돌연변이(야생형 IgG2a 서열을 기준으로 넘버링한 아미노산; 문헌(Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624) 참조)를 포함하는 중쇄 IgG2a 불변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.

벡터 pEb.6G.hK는 항체 6G 경쇄 가변 영역 및 경쇄 카파 불변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이고, 벡터 pDb.6G.hFc2a는 항체 6G 중쇄 가변 영역, 및 A330P331로부터 S330S331로의 돌연변이(야생형 IgG2a 서열을 기준으로 넘버링한 아미노산; 문헌(Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624) 참조)를 포함하는 중쇄 IgG2a 불변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.

상기 기탁은 특허 절차상 미생물기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 규정 및 그 하부 조례(부다페스트 조약) 하에 이루어진 것이다. 부다페스트 조약은 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 생존가능한 배양의 유지를 보증한다. 상기 기탁물은 관련 미국 특허의 공고 시 또는 임의의 미국 또는 외국 특허출원의 공개 시 기탁물의 배양물의 자손세포의 영구적 및 비제한적 입수가능성을 보장하고, 미국 특허상표법 제35조 제122항 및 이에 따른 시행규칙(특히, 886 0G 638과 관련된 연방규정 제37조 제1.14항을 포함함)에 따라 미국 특허상표청의 특허상표청장이 자격을 가진 것으로 판단한 자에게 상기 자손세포의 입수가능성을 보장하는 부다페스트 조약의 약정 및 리나트 뉴로사이언스 코퍼레이션과 ATCC 사이의 협정에 따라 ATCC로부터 입수가능할 것이다.

본원의 출원인은 기탁된 물질의 배양물이 적절한 조건 하에 배양될 때 사멸되거나 소실 또는 파괴되는 경우, 통지를 받은 즉시 상기 물질을 또 다른 동일 물질로 교체할 것에 동의한다. 기탁된 물질의 입수가능성은 특허법에 따라 임의의 정부의 권한 하에 인정된 권리에 위반하여 본 발명을 실시하기 위한 허가로서 해석되어서는 안 된다.

SEQUENCE LISTING <110> Rinat Neuroscience Corporation <120> Methods of Treating Ophthalmic Diseases <130> PC33563A <140> PCT/IB2008/000486 <141> 2008-03-06 <150> US 60/894,181 <151> 2007-03-09 <150> US 12/041,581 <151> 2008-03-03 <160> 49 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Tyr Thr Glu Ala Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Thr Gly Asn Thr Lys Tyr Ala Pro Arg Leu 50 55 60 Gln Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Leu Tyr Ser Leu Pro Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 2 Asp Val 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Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly 325 330 335 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 340 345 350 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 355 360 365 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 370 375 380 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 385 390 395 400 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 405 410 415 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 420 425 430 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 12 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 12 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Asp Ala Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Gln Ile Ser Arg Leu Asp Pro Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 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tactaaatat 180 gccccgaggt tacaggaccg ggtgaccatg actcgcgata cctccaccag cactgtctac 240 atggaactga gctctctgcg ctctgaggac actgctgtgt attactgtgc ctccctttat 300 agtctccctg tctactgggg ccagggtacc actgttaccg tgtcctctgc ctccaccaag 360 ggcccatctg tcttcccact ggccccatgc tcccgcagca cctccgagag cacagccgcc 420 ctgggctgcc tggtcaagga ctacttccca gaacctgtga ccgtgtcctg gaactctggc 480 gctctgacca gcggcgtgca caccttccca gctgtcctgc agtcctcagg tctctactcc 540 ctcagcagcg tggtgaccgt gccatccagc aacttcggca cccagaccta cacctgcaac 600 gtagatcaca agccaagcaa caccaaggtc gacaagaccg tggagagaaa gtgttgtgtg 660 gagtgtccac cttgtccagc ccctccagtg gccggaccat ccgtgttcct gttccctcca 720 aagccaaagg acaccctgat gatctccaga accccagagg tgacctgtgt ggtggtggac 780 gtgtcccacg aggacccaga ggtgcagttc aactggtatg tggacggagt ggaggtgcac 840 aacgccaaga ccaagccaag agaggagcag ttcaactcca ccttcagagt ggtgagcgtg 900 ctgaccgtgg tgcaccagga ctggctgaac ggaaaggagt ataagtgtaa ggtgtccaac 960 aagggactgc catccagcat cgagaagacc atctccaaga ccaagggaca gccaagagag 1020 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Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Asp 20 25 30 Arg Ile Ser Phe Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Thr Lys Gln Gly Thr Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys 85 90 95 Glu Phe Pro Trp Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Ala Ile His 1 5 10 <210> 29 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 29 Phe Thr Ser Pro Tyr Ser Gly Val Ser Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 30 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 30 Phe Asp Asn Tyr Asp Arg Gly Tyr Val Arg Asp Tyr 1 5 10 <210> 31 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 31 Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Asp Arg Ile Ser 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aacgatcgta tttcctttct gaactggtac 120 cagcagaaac caggccagcc tcctaagctg ctcatttacg ccgccaccaa acagggtacc 180 ggcgtgcctg accgcttctc cggcagcggt tccggcaccg atttcactct gaccatctcc 240 tccctgcagg ccgaagatgt ggcagtgtat tactgtcagc agtccaaaga gtttccctgg 300 tcctttggcg gtggcaccaa ggtggagatc aaacgcactg tg 342 <210> 36 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 36 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Ala Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Phe Thr Ser Pro Tyr Ser Gly Val Ser Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Asp Asn Tyr Asp Arg Gly Tyr Val Arg Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys 210 215 220 Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 37 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 37 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Asp 20 25 30 Arg Ile Ser Phe Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Thr Lys Gln Gly Thr Gly Val Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys 85 90 95 Glu Phe Pro Trp Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 38 <211> 1341 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 38 caggtgcaac tggtgcaatc cggtgccgag gtgaaaaagc caggcgcctc cgtgaaagtg 60 tcctgcaaag cctccggtta cacctttacc acctatgcca tccattgggt gcgccaggcc 120 ccaggccagg gtctggagtg gatgggcttt acttccccct actccggggt gtcgaattac 180 aatcagaagt tcaaaggccg cgtcaccatg acccgcgaca cctccacctc cacagtgtat 240 atggagctgt cctctctgcg ctccgaagac accgccgtgt attactgtgc ccgcttcgac 300 aattacgatc gcggctatgt gcgtgactat tggggccagg gcaccctggt caccgtctcc 360 tcagcctcca ccaagggccc atctgtcttc ccactggccc catgctcccg cagcacctcc 420 gagagcacag ccgccctggg ctgcctggtc aaggactact tcccagaacc tgtgaccgtg 480 tcctggaact ctggcgctct gaccagcggc gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtcc 540 tcaggtctct actccctcag cagcgtggtg accgtgccat ccagcaactt cggcacccag 600 acctacacct gcaacgtaga tcacaagcca agcaacacca aggtcgacaa gaccgtggag 660 agaaagtgtt gtgtggagtg tccaccttgt ccagcccctc cagtggccgg accatccgtg 720 ttcctgttcc ctccaaagcc aaaggacacc ctgatgatct ccagaacccc agaggtgacc 780 tgtgtggtgg tggacgtgtc ccacgaggac ccagaggtgc agttcaactg gtatgtggac 840 ggagtggagg tgcacaacgc caagaccaag ccaagagagg agcagttcaa ctccaccttc 900 agagtggtga gcgtgctgac cgtggtgcac caggactggc tgaacggaaa ggagtataag 960 tgtaaggtgt ccaacaaggg actgccatcc agcatcgaga agaccatctc caagaccaag 1020 ggacagccaa gagagccaca ggtgtatacc ctgcccccat ccagagagga gatgaccaag 1080 aaccaggtgt ccctgacctg tctggtgaag ggattctatc catccgacat cgccgtggag 1140 tgggagtcca acggacagcc agagaacaac tataagacca cccctccaat gctggactcc 1200 gacggatcct tcttcctgta ttccaagctg accgtggaca agtccagatg gcagcaggga 1260 aacgtgttct cttgttccgt gatgcacgag gccctgcaca accactatac ccagaagagc 1320 ctgtccctgt ctccaggaaa g 1341 <210> 39 <211> 654 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 39 gacatcgtga tgacccagtc cccagactcc ctggccgtgt ccctgggcga gcgcgccacc 60 atcaactgcc gcgccagcga atccgtggat aacgatcgta tttcctttct gaactggtac 120 cagcagaaac caggccagcc tcctaagctg ctcatttacg ccgccaccaa acagggtacc 180 ggcgtgcctg accgcttctc cggcagcggt tccggcaccg atttcactct gaccatctcc 240 tccctgcagg ccgaagatgt ggcagtgtat tactgtcagc agtccaaaga gtttccctgg 300 tcctttggcg gtggcaccaa ggtggagatc aaacgcactg tggctgcacc atctgtcttc 360 atcttccctc catctgatga gcagttgaaa tccggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420 aataacttct atccacgcga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcc 480 ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540 agcaccctga ccctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600 acccatcagg gcctgagttc tccagtcaca aagagcttca accgcggtga gtgc 654 <210> 40 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 40 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Gly Asn Ser Ser Arg Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Gly Ser Ile Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Glu Asp Gly Asn Tyr Ala Trp Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Gln Val Thr Val Ser 115 <210> 41 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 41 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 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120 catgagtctc caaggcttct catcaagtat actttccagt ccatgtctgg gatcccctcc 180 aggttcagtg gcagtggctc agggacagat ttcactctca ttatcaacag tgtggagact 240 gaagattttg gaatgtattt ctgtcaacag agtaaccgtt ggccgctcac gttcggtgct 300 gggaccaagc tggagctg 318

Claims

아미노산 25 내지 34 및 40을 포함하는 β-아밀로이드(Aβ)_1-40 펩티드의 C-말단 상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는, 연령-관련 황반 변성(AMD), 녹내장, 당뇨성 망막병증, 맥락막 신생혈관막(CNV), 포도막염, 근시 변성, 안구 종양, 중심 망막 정맥 폐쇄, 피부홍조, 안구 혈관신생, 중심 장액 망막병증, 안구 건조증, 중심 망막 동맥 폐쇄 및 낭포 황반 부종으로 구성된 군으로부터 선택된 안 질환의 치료를 위한 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,

항체가 서열번호 36에 표시된 중쇄 아미노산 서열 및 서열번호 37에 표시된 경쇄 아미노산 서열을 포함하는, 약학 조성물.
삭제
제 1 항에 있어서,

항체가 Aβ_1-42 펩티드 상의 에피토프에도 특이적으로 결합하는, 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,

질환이 연령-관련 황반 변성(AMD)인, 약학 조성물.
삭제
제 1 항에 있어서,

항체가 100 nM 이하의 K_D로 Aβ_1-40 펩티드에 결합하는, 약학 조성물.
제 7 항에 있어서,

항체가 100 nM 이하의 K_D로 Aβ_1-42 펩티드에도 결합하는, 약학 조성물.
삭제
삭제
제 1 항에 있어서,

항체가 Aβ_1-42 펩티드 및 Aβ_1-43 펩티드보다 더 높은 친화성으로 Aβ_1-40 펩티드에 결합하고 항체 2294가 아닌, 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,

항체의 Fc 영역이 N-글리코실화되어 있지 않은, 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,

항체가 서열번호 28, 서열번호 29 및 서열번호 30에 표시된 3개의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 31, 서열번호 32 및 서열번호 33에 표시된 3개의 CDR을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 약학 조성물.
제 1 항에 있어서,

항체가 서열번호 26에 표시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 27에 표시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 약학 조성물.
Aβ_1-40 펩티드의 C-말단 상의 에피토프 및 Aβ_1-42 펩티드의 C-말단 상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 연령-관련 황반 변성(AMD)의 치료를 위한 약학 조성물로서, 상기 Aβ_1-40 펩티드 상의 에피토프는 아미노산 25 내지 34 및 40을 포함하는 약학 조성물.
Aβ_1-40 펩티드의 C-말단 상의 에피토프 및 Aβ_1-42 펩티드의 C-말단 상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는, 연령-관련 황반 변성(AMD)과 관련된 시력을 보존하거나 회복시키기 위한 약학 조성물로서, 상기 Aβ_1-40 펩티드 상의 에피토프는 아미노산 25 내지 34 및 40을 포함하는 약학 조성물.
제 16 항에 있어서,

항체가 망막 기능을 유의하게 보호하거나 회복시키는, 약학 조성물.