JP2015038109A - 眼科疾患を治療する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の実施は、他に指示がない限り、当技術分野の技能の範囲内にある分子生物学(組み換え技法を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技法を用いるであろう。そのような技法は、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版(Sambrook他、1989)Cold Spring Harbor Press;Oligonucleotides Synthesis(M.J.Gatt編、1984);Methods in Molecular Biology、Humana Press;Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis編、1998)Academic Press;Animal Cell Culture(R.I.Freshney編、1987);Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.MatherおよびP.E.Roberts、1998)Plenum Press;Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle、J.B.Griffiths、およびD.G.Newell編、1993〜1998)J.Wiley and Sons;Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.);Handbook of Experimental Immunology(D.M.WeirおよびC.C.Blackwell編);Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.MillerおよびM.P.Calos編、1987);Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel他編、1987);PCR:The Polymerase Chain Reaction、(Mullis他編、1994);Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan他編、1991);Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons、1999);Immunology(C.A.JanewayおよびP.Travers、1997);Antibodies(P.Finch、1997);Antibodies:a practical approach(D.Catty.編、IRL Press、1988〜1989);Monoclonal antibodies:a practical approach(P.ShepherdおよびC.Dean編、Oxford University Press、2000);Using antibodies:a laboratory manual(E.HarlowおよびD.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press、1999);The Antibodies(M.ZanettiおよびJ.D.Capra編、Harwood Academic Publishers、1995)などの文献中に十分に説明されている。
「Aβペプチドの阻害薬」は、Aβペプチドの産生および/または沈着を減少させることができる任意の薬剤である。Aβペプチドの阻害薬には、抗体、アンチセンス分子、siRNA分子、リボザイム、または小分子化合物が含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに、Aβペプチドの阻害薬は、アミロイド前駆体タンパク質の生成物Aβペプチドへのタンパク質分解的切断を中断することができる任意の薬剤を含む、Aβペプチドと結合しAβプラーク沈着を減少させることができる任意の薬剤である。Aβペプチドの産生および沈着を阻害するための追加の標的には、例えば、β−セクレターゼ(BACE1またはメマプシン−2−とも呼ばれる)または最低限4つの個々のタンパク質、すなわち、プレセニリン、ニカストリン、前咽頭欠損(anterior pharynx−defective)1(APH−1)およびプレセニリンエンハンサー2(PEN−2)からなるγセクレターゼ複合体を阻害またはサイレンシングさせることができる小分子治療薬またはsiRNAが含まれるが、これらに限定されるものではない。
抗Aβ抗体およびポリペプチド:
I.抗体9TLならびに9TL由来の抗体およびポリペプチド
本発明は、抗体9TLおよび表3に示すその変異体または抗体9TLに由来するポリペプチドおよび表3に示すその変異体、ならびに9TL抗体およびその変異体またはポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む医薬組成物を含む組成物を包含する。本明細書で使用する組成物は、Aβ1〜40のC末端と結合する1個または複数の抗体またはポリペプチド(抗体であっても抗体でなくてもよい)および/またはAβ1〜40のC末端と結合する1個または複数の抗体またはポリペプチドをコードする配列を含む1個または複数のポリヌクレオチドを含む。これらの組成物は、当技術分野でよく知られている、緩衝液を含む薬学的に許容できる賦形剤などの適当な賦形剤をさらに含むことができる。
本発明は、Aβ1〜40、Aβ1〜42、およびAβ1〜43と結合する抗体またはポリペプチドを投与することを含む眼科疾患を治療する方法をさらに提供する。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、Aβ1〜42、およびAβ1〜43との結合よりも高い親和性でAβ1〜40と結合する。一部の実施形態において、抗体は、Aβ1〜36、Aβ1〜37、Aβ1〜38、およびAβ1〜39と結合する。一部の実施形態において、抗体は、Aβ22〜35と結合する。一部の実施形態において、抗体は、Aβ28〜40と結合する。一部の実施形態において、抗体またはポリペプチドは、アミノ酸25〜34および40が含まれるAβ1〜40上のエピトープと結合する。
(1)非極性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile、
(2)電荷のない極性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln、
(3)酸性(負の電荷を帯びた):Asp、Glu、
(4)塩基性(正の電荷を帯びた);Lys、Arg、
(5)鎖配向に影響する残基:Gly、Pro、および
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe、His。
本発明の方法は、β−アミロイド(Aβ)ペプチドと特異的に結合し、エフェクター機能障害を有する抗体またはポリペプチド(抗体またはポリペプチドを含む医薬組成物を含む)を使用する。抗体およびポリペプチドは、以下の特徴、すなわち、(a)対象におけるアミロイドプラークの形成を抑制する、(b)対象の眼におけるアミロイドプラークを低減する、(c)加齢性黄斑変性症(萎縮型と滲出型の双方)、緑内障、糖尿病性網膜症(黄斑浮腫を含む)および他の関連する網膜変性疾患を含むがこれらに限定されない眼科疾患の1個または複数の症状を治療、予防、軽減する、(d)網膜機能の有意な保護または回復を引き起こす、および(e)視力の有意な保存または回復を引き起こすうちのいずれか(1個または複数)をさらに特徴とする。
本発明は、本発明の抗体およびポリペプチド(図1および8に示す軽鎖および重鎖可変領域のポリペプチド配列を含む抗体を含む)をコードする単離ポリヌクレオチド、ならびにポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞も提供する。
1個または複数のAβペプチドのC末端と結合する抗体9TLまたは6Gを用い、眼における標的Aβの有無を同定または検出することができる。話を簡単にするために、一般的に、これらの方法が、本明細書に記載されているAβ結合性実施形態(ポリペプチドなど)のうちのいずれかに当てはまるという理解の下で9TLまたは6G抗体に言及する。一般的に、検出は、生物試料をAβ1〜40と結合する本明細書に記載されている抗体と接触させ、Aβ1〜40とAβ1〜40と特異的に結合する抗体(例えば、9TL)の間で複合体を形成させるものである。そのような複合体の形成は、in vitroまたはin vivoであってよい。本明細書で使用する用語「検出」には、対照を参照する、または対照を参照しない定性的および/または定量的検出(レベルを測定すること)が含まれる。
本明細書に記載されている抗体(ポリペプチドを含む)、ポリヌクレオチド、および医薬組成物は、網膜関連変性を特徴とする眼科疾患の発生を治療、予防および阻止するための方法において使用することができる。方法は、対象に有効量の、タンパク質もしくはタンパク質沈着物と特異的に結合する抗体または抗体をコードするポリヌクレオチドを投与することを含み、抗体は、エフェクター機能障害を有する。
抗体は、担体、好ましくは薬学的に許容できる担体中で哺乳類に投与されることが好ましい。適当な担体およびそれらの製剤は、Remington’s Pharmaceutical Sciences、第18版、A.Gennaro編、Mack Publishing Co.、Easton、PA、1990;およびRemington、The Science and Practice of Pharmacy第20版、Mack Publishing、2000に記載されている。通常、製剤化には、適切な量の薬学的に許容できる塩を使用し、製剤を等張性にする。担体の例には、食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液が含まれる。溶液のpHは、約5〜約8であることが好ましく、約7〜約7.5であることがより好ましい。他の担体には、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスなどの持続放出調製物が含まれ、マトリクスは、成型品、例えば、フィルム剤、リポソーム剤または微粒子剤の形態である。当業者には明らかであるが、例えば、投与経路および投与されている抗体の濃度に応じて、特定の担体がより好ましいことがある。
本発明は、加齢性黄斑変性症(滲出型と萎縮型の双方)、緑内障、糖尿病性網膜症(糖尿病性黄斑浮腫を含む)、ブルッフ膜における裂傷、近視性変性、眼腫瘍および他の関連する網膜変性疾患などの、本明細書に記載されている眼科疾患を治療するのに有用な材料を含有する製品およびキットも提供する。製品は、ラベル付きの容器を含む。適当な容器には、例えば、瓶、バイアル、および試験管が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から製作することができる。容器は、病的な眼の状態を治療するのに、またはAβもしくはβAPPを検出または精製するのに有効である活性剤を有する組成物を保持する。組成物中の活性剤は、抗体であり、AβまたはβAPPに特異的なモノクローナル抗体を含むことが好ましい。一部の実施形態において、活性剤は、抗体9TLもしくは6Gおよびそれらに由来する抗体またはポリペプチドを含む。一部の実施形態において、活性剤は、エフェクター機能障害を有する抗Aβ抗体またはポリペプチドを含む。一部の実施形態において、抗Aβ抗体またはポリペプチドは、重鎖定常領域を含み、定常領域は、エフェクター機能障害を有する。容器上のラベルは、組成物が、AMDなどの病的な眼の状態を治療するのに使用されることを示し、上記に記載されている使用などのin vivo使用またはin vitro使用のどちらかについての使用法を示すこともある。
(実施例)
A.一般法
以下の一般法を、本実施例で使用した。
抗体のFabフラグメントの発現は、Barbas(2001)Phage display:a laboratory manual、Cold Spring Harbor、NY、Cold Spring Harbor Laboratory Press pg2.10.Vector pComb3Xに記載されているプロモーターに類似しているIPTG誘導性lacZプロモーターの制御下としたが、改変には、以下の追加ドメイン、すなわち、ヒトκ軽鎖定常ドメインおよびIgG2aヒト免疫グロブリンのCHI定常ドメイン、Igγ−2鎖C領域、タンパク質アクセッション番号P01859;免疫グロブリンκ軽鎖(ヒト)、タンパク質アクセッション番号CAA09181の付加および発現が含まれていた。
96ウェルプレートにおけるFabの小規模な発現を以下の通り行った。Fabライブラリーを形質移入した大腸菌(E.coli)から出発し、コロニーを採取し、マスタープレート(寒天LB+アンピシリン(50μg/ml)+2%グルコース)と作業プレート(2ml/ウェル、LB+アンピシリン(50μg/ml)+2%グルコース1.5mLを含有する96ウェル/プレート)の双方に接種した。両プレートを、30℃にて8〜12時間培養した。マスタープレートを4℃にて保存し、作業プレートからの細胞を、5000rpmでペレット化し、LB+アンピシリン(50μg/ml)+1mM IPTG 1mLで再懸濁し、Fabの発現を誘導した。細胞を、30℃にて5時間の発現後に遠心分離により採集し、次いで、緩衝液HBS−P(10mM HEPES緩衝液pH7.4、150mM NaCl、0.005% P20)500μLに再懸濁した。HBS−Pに再懸濁した細胞の溶解は、1サイクルの凍結(−80℃)次いで37℃における解凍によって行った。細胞ライセートを、5000rpmにて30分間遠心分離し、Fabを含有する上清から細胞残屑を分離した。次いで、上清を、BIAcoreプラズモン共鳴装置に注入し、各Fabについての親和性の情報を得た。Fabを発現するクローンを、マスタープレートから取り出し、以下に記載されるような大規模なFabの産生および詳細な特徴付けのためにDNAを配列決定した。
詳細な速度論的パラメーターを得るため、Fabを、大きい培養液から発現および精製した。200mLのLB+アンピシリン(50μg/ml)+2%グルコースを含有する三角フラスコに、選択されたFab発現大腸菌(E.coli)クローンからの一夜培養液5mLを接種した。クローンを、1.0のOD550nmが得られるまで30℃にてインキュベートし、次いで、200mLのLB+アンピシリン(50μg/ml)+1mM IPTGに培地を置き換えた。30℃にて5時間の発現後、細胞を遠心分離によりペレット化し、次いで、10mLのPBS(pH8)に再懸濁した。細胞の溶解は、2サイクルの凍結/解凍(それぞれ、−80℃および37℃)によって得られた。細胞ライセートの上清を、PBSで平衡化したNi−NTAスーパーフローセファロース(Qiagen、Valencia.CA)カラム上にロードし、次いで、5カラム体積のPBS、pH8で洗浄した。個々のFabは、PBS(pH8)+300mMイミダゾールで様々な画分に溶出した。Fabを含有する画分をプールし、PBS中で透析し、次いで、親和性の特徴付けに先立ってELISAにより定量化した。
完全抗体の発現のため、重および軽鎖可変領域を哺乳類の発現ベクターにクローン化し、一過性発現のためにHEK293細胞中にリポフェクタミンを用いて形質移入した。抗体を、標準的な方法を用いてタンパク質Aを用いて精製した。
9TLモノクローナル抗体の親和性は、BIAcore3000(商標)表面プラズモン共鳴(SPR)システム(BIAcore,Inc、Piscaway NJ)を用いて決定した。親和性を決定する一方法は、CM5チップ上に9TLを固定化し、抗体に対するAβ1〜40ペプチドの結合反応速度(binding kinetics)を測定することである。CM5チップを、供給業者の説明書に従ってN−エチル−N’−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド塩酸(EDC)およびN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)で活性化した。抗体9TLまたはその変異体を、10mM酢酸ナトリウムpH4.0または5.0中に希釈し、0.005mg/mLの濃度で活性化したチップ上に注入した。個々のチップチャネルにわたる可変フロータイムを用い、一連の抗体密度、すなわち1000〜2000または2000〜3000反応単位(RU)を得た。チップをエタノールアミンでブロックした。再生研究は、2倍量のPIERCE溶出緩衝液および1倍量の4M NaClを含有する溶液が、200回を超える注入についてチップ上の9TLの活性を保ちながら、結合したAβ1〜40ペプチドを効率的に除去することを示した。HBS−EP緩衝液(0.01M HEPES、pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005%界面活性剤P20)を、すべてのBIAcoreアッセイのランニングバッファーとして使用した。精製したAβ1〜40合成ペプチド試料の段階希釈液(0.1〜10×推定KD)を100μL/minで1分間注入し、10分間の解離時間を置いた。速度論的な会合速度(kon)および解離速度(k0ff)は、BIAevaluationプログラムを用い、1:1ラングミュア結合モデル(Karlsson,R.Roos、H.Fagerstam、L.Petersson,B.(1994).Methods Enzymology 6.99〜110)にデータを当てはめることにより同時に得られた。平衡解離定数(KD)値は、k0ff/konとして算出した。
抗体9TLの重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を図1に示す。上記に記載されているBiacoreの両方法を用いて決定された抗体9TLのAβ1〜40に対する結合親和性を以下の表2に示す。
抗体9TLによって認識されるAβペプチド上のエピトープを決定するため、表面プラズモン共鳴(SPR、Biacore3000)結合分析を使用した。ビオチン(Global Peptide Services,CO)とカップリングさせたAβ1〜40ポリペプチドを、ストレプトアビジンでコーティングしたチップ(SAチップ)上に固定化した。Aβペプチドの様々な可溶性フラグメント(10μMにて、American Peptide Company Inc.、CA製)の存在下または非存在下での、固定化されたAβ1〜40とのAβ抗体Fabフラグメント(50nMにて)の結合。Aβ1〜40、Aβ1〜42、およびAβ1〜43のアミノ酸配列を表4で以下に示す。抗体9TL FabフラグメントのAβ1〜40との結合に置き換わったAβペプチドは、それぞれAβ28〜40、Aβ1〜40、Aβ33〜40、およびAβ17〜40であった(図2)。したがって、抗体9TLは、Aβ1〜40のC末端ペプチド(33〜40)と結合する。図2に示すように、Aβ1〜28、Aβ28〜42、Aβ22〜35、Aβ1〜16、Aβ1〜43、およびAβ1〜38ペプチドは、抗体9TL Fabフラグメントの結合を阻害せず、抗体9TLは、Aβ1〜40ペプチドのC末端と結合することを示唆した。
A.モノクローナル抗体2H6の作製および特徴付け
マウスを、Geerligs HJ他、1989、J.Immunol.Methods 124:95〜102;Kenney JS他、1989、J.Immunol.Methods 121:157〜166;およびWicher K他、1989、Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.89:128〜135に記載されているように連続約16週間間隔でアジュバント(1足蹠につき50μl、1匹のマウスにつき計100μl)中のKLHにコンジュゲートしたペプチド(Aβ1〜40のアミノ酸28〜40)25〜100μgで免疫化した。まず、マウスを、CFA(完全フロインドアジュバント)中のペプチド50μgで免疫化した。次に、21日後、マウスを、IFA(不完全フロインドアジュバント)中のペプチド25μgで免疫化した。2回目の免疫化から23日後、3回目の免疫化を、IFA中のペプチド25μgで行った。10日後、ELISAを用いて抗体価をテストした。3回目の免疫化の34日後、4回目の免疫化を、IFA中のペプチド25μgで行った。4回目の免疫化の32日後、最後の追加免疫を100μgの可溶性ペプチドで行った。
2H6がアミロイド前駆体タンパク質(APP)と結合するか否かを決定するため、野生型APPを形質移入した細胞に対する2H6の結合を決定した。293細胞を、野生型ヒトアミロイド前駆体タンパク質をコードするcDNAで形質移入した。形質移入の48時間後、細胞を、モノクローナル抗体抗Aβ1〜16、抗Aβ16〜28または2H6(10%FCSを添加したDMEM中5ug/ml)と共に氷上で45分間インキュベートした。次いで、細胞をPBS中で5分間、3回洗浄し、4%PFAで固定した。細胞を、PBS中で再び3回洗浄し、抗体結合を、蛍光顕微鏡下でJackson Immunoresearch製の二次Cy3結合ヤギ抗マウス抗体(1:500の希釈)で検出した。
脱グリコシル化抗体2H6を作製するため、精製抗体2H6を、20mM Tris−HCl pH8.0中のペプチド−N−グリコシダーゼF(Prozyme、抗体1mg当たり0.05U)と共に37℃にて7日間インキュベートした。脱グリコシル化の完全性は、MALDI−TOF−MSおよびタンパク質ゲル電気泳動により検証した。脱グリコシル化抗体を、タンパク質Aクロマトグラフィーにより精製し、内毒素を、Q−セファロースにより除去した。脱グリコシル化2H6のAβ1〜40との結合親和性を、上記に記載されているBiacoreアッセイを用いてテストし、脱グリコシル化2H6のAβ1〜40との結合親和性は、インタクトな抗体2H6と一致することが判明した。
初期の研究(Malek,G.他、PNAS 102:11900〜5(2005))は、3つの危険因子、すなわち(1)アポリポタンパク質アイソフォームE4(APOE4)遺伝子型、(2)高齢(65週超)および(3)高脂肪およびコレステロールの多い(HF−C)食事の組合せが、ヒトAMDの臨床的特徴に極めて近似した動物モデルを生み出すことを立証した。老齢のAPOE4マウスは、網膜色素上皮(RPE)−色素変化、厚いびまん性のRPE下沈着、脂質の多いドルーゼン様沈着、ブルッフ膜の肥厚、光受容体変性に重なるRPE萎縮の斑状領域および脈絡膜血管新生(CNV)を含む萎縮型と滲出型双方のヒトAMDにおいて観察される形態学的特徴に類似した病理学的変化を発生した。これらの変化は、食事計画とは無関係に対照のヒトAPOE3発現マウスのいずれにおいても検出されないばかりか、幼若APOE4マウスでもいかなる病変も検出されなかった。機能障害は、全視野暗順応網膜電図から識別した。罹患動物は、対照と比較して、aおよびb波振幅の顕著な低下を有していた。重要なことに、これらの組織病理学的および機能的変化は、3つすべての危険因子の存在を必要とした。自然に発生するCNVのこの動物モデルは、ヒト疾患の生理学的に関連する危険因子を初めて組み込むモデルである。
抗体の投与。高齢の(65週を超える)ヒトApoE4を発現する標的置換(targeted−replacement)マウスを実験に使用した。これらのマウスに存在するAMD様表現型は、以前に開示されている(Malek,G.他、PNAS 102:11900〜5(2005))。8週間の治療試験の場合、65週齢以上のApoE4−トランスジェニックマウスは、4群のうちの1群に割り付けた。第1群(E4−ND)は、普通食で継続的に維持された(n=2)。第2群(E4−HFC−R1)は、高脂肪、コレステロール富化(HF−C)食を8週間給餌された(n=2)。第3群(E4−HFC−R1)は、HF−C食を8週間給餌され、Rinat1(3mg/kg)の腹腔内注射を週に一度受けた(n=5)。第4群(E4−HFC−R2)は、HF−C食を8週間給餌され、Rinat2(3mg/kg)の腹腔内注射を週に一度受けた(n=5)。試験の終了後、群を非盲検化した。Rinat1は、PBSビヒクルであり、Rinat2は、脱グリコシル化抗Aβ抗体2H6(実施例3に記載されているようなマウスモノクローナル抗ヒトAβ28〜40IgG2b「2H6−D」)であった。
脱グリコシル化抗体の投与による網膜機能の回復/保護
図5に示すように、高脂肪およびコレステロールの多い食事(E4−HFC)を給餌されたApoE4マウスでは、普通食(E4−ND)を与えられたマウスに比べて、aおよびb波振幅に統計的に有意な低下がある(a波 p=0.0106、b波 p=0.008)。注射された動物から得られたERGを、我々のERGのベースラインセットと比較した。E4−HFCと比較して、注射された群のどちら(E4−HFC−R1およびE4−HFC−R2)にもa波振幅に有意差はなかった(図示せず)。対照的に、b波振幅は、E4−HFC−R2群における網膜機能の顕著な回復および/または保護を示している(図6)。
上記のデータは、1)抗Aβ抗体2H6−Dを注射したマウスのERGによって証明されるような網膜機能の回復/保護および2)未治療AMDマウス群と比較して、マウス脳における抗体2H6−Dで治療した場合のアミロイド沈着の減少を証明している。
A.一般法
以下の一般法を、本実施例および他の実施例で使用した。
抗体のFabフラグメントの発現は、Barbas(2001)Phage display:a laboratory manual、Cold Spring Harbor、NY、Cold Spring Harbor Laboratory Press pg2.10.Vector pComb3Xに記載されているプロモーターに類似しているIPTG誘導性lacZプロモーターの制御下としたが、改変には、以下の追加ドメイン、すなわち、ヒトκ軽鎖定常ドメインおよびIgG2aヒト免疫グロブリンのCHI定常ドメイン、Igγ−2鎖C領域、タンパク質アクセッション番号P01859;免疫グロブリンκ軽鎖(ヒト)、タンパク質アクセッション番号CAA09181の付加および発現が含まれていた。
96ウェルプレートにおけるFabの小規模な発現を以下の通り行った。Fabライブラリーを形質移入した大腸菌(E.coli)から出発し、コロニーを採取し、マスタープレート(寒天LB+アンピシリン(50μg/ml)+2%グルコース)と作業プレート(2ml/ウェル、LB+アンピシリン(50μg/ml)+2%グルコース1.5mLを含有する96ウェル/プレート)の双方に接種した。両プレートを、30℃にて8〜12時間培養した。マスタープレートを4℃にて保存し、作業プレートからの細胞を、5000rpmでペレット化し、LB+アンピシリン(50μg/ml)+1mM IPTG 1mLで再懸濁し、Fabの発現を誘導した。細胞を、30℃にて5時間の発現後に遠心分離により採集し、次いで、緩衝液HBS−EP(100mM HEPES緩衝液pH7.4、150mM NaCl、0.005% P20)500μLに再懸濁した。HBS−Pに再懸濁した細胞の溶解は、1サイクルの凍結(−80℃)次いで37℃における解凍によって行った。細胞ライセートを、5000rpmにて30分間遠心分離し、Fabを含有する上清から細胞残屑を分離した。次いで、上清を、BIAcoreプラズモン共鳴装置に注入し、各Fabについての親和性の情報を得た。Fabを発現するクローンを、マスタープレートから取り出し、以下に記載するような大規模なFabの産生および詳細な特徴付けのためにDNAを配列決定した。
詳細な速度論的パラメーターを得るため、Fabを、大きい培養液から発現および精製した。200mLのLB+アンピシリン(50μg/ml)+2%グルコースを含有する三角フラスコに、選択されたFab発現大腸菌(E.coli)クローンからの一夜培養液5mLを接種した。クローンを、1.0のOD550nmが得られるまで30℃にてインキュベートし、次いで、200mlのLB+アンピシリン(50μg/ml)+1mM IPTGに培地を置き換えた。30℃にて5時間の発現後、細胞を遠心分離によりペレット化し、次いで、10mLのPBS(pH8)に再懸濁した。細胞の溶解は、2サイクルの凍結/解凍(それぞれ、−80℃および37℃)によって得られた。細胞ライセートの上清を、PBS、pH8で平衡化したNi−NTAスーパーフローセファロース(Qiagen、Valencia.CA)カラム上にロードし、次いで、5カラム体積のPBS、pH8で洗浄した。個々のFabは、PBS(pH8)+300mMイミダゾールで様々な画分に溶出した。Fabを含有する画分をプールし、PBS中で透析し、次いで、親和性の特徴付けに先立ってELISAにより定量化した。
完全抗体の発現のため、重および軽鎖可変領域を哺乳類の発現ベクターにクローン化し、一過性発現のためにHEK293細胞中にリポフェクタミンを用いて形質移入した。抗体を、標準的な方法を用いてタンパク質Aを用いて精製した。
6Gモノクローナル抗体の親和性は、上記の実施例1に記載されている方法を用い、BIAcore3000(商標)表面プラズモン共鳴(SPR)システム(BIAcore,INC、Piscaway NJ)を用いて決定した。
ELISAを、抗体6Gおよび変異体の非ビオチン化Aβペプチドとの結合を測定するために使用した。NUNCmaxisorpプレートを、4℃にて1時間超、PBSpH7.4中の2.5ug/mlのAβペプチドでコーティングした。プレートを、PBS緩衝液pH7.4中の1%BSAでブロックした。一次抗体(細胞上清、望ましい希釈で抗Aβ抗体、または精製完全抗体もしくはFabを含有する血清から)を、固定化したAβペプチドと共に室温にて1時間インキュベートした。洗浄した後、プレートを、1:5000希釈にて二次抗体、HRP結合ヤギ抗ヒトκ鎖抗体(MP Biomedicals、55233)と共にインキュベートした。洗浄した後、結合している二次抗体を、TMB基質(KPL、50−76−02、50−65−02)を加えることにより測定した。HRP反応を、1Mリン酸を加えることにより停止させ、450nmにおける吸光度を測定した。
抗体6Gの重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を図8に示す。上記に記載されているBiacoreを用いて決定された6G抗体のAβ1〜40、Aβ1〜42およびAβ22〜37に対する結合親和性を以下の表7に示す。
抗体6Gによって認識されるAβペプチド上のエピトープを決定するため、ELISA結合分析を使用した。様々なAβペプチド(Global Peptide Services,CO)をELISAプレート上に固定化した。6G完全抗体(20nMにて)の固定化されたAβとの結合を、上記に記載されているようなELISAにより決定した。Aβ1〜40、Aβ1〜42、およびAβ1〜43のアミノ酸配列を以下の表9に示す。図9に示すように、抗体6Gは、Aβペプチド17〜40、17〜42、22〜35、28〜40、1〜38、1〜40、1〜42、1〜43、および28〜42と結合するが、28〜42との結合は、他のAβペプチドよりもかなり弱い。抗体6Gは、Aβペプチド1〜16、1〜28および33〜40とは結合しなかった。したがって、抗体6Gは、様々な切断型Aβペプチド、例えば、22〜35、1〜38、1〜40、1〜42、および1〜43のC末端と結合する。
6Gがアミロイド前駆体タンパク質(APP)と結合するか否かを決定するため、野生型APPを形質移入した細胞に対する6Gの結合を決定した。HEK293細胞を、野生型ヒトアミロイド前駆体タンパク質をコードするcDNAで形質移入した。形質移入の48時間後、細胞を、モノクローナル抗体抗Aβ1〜16、(m2324)または6G(10%FCSを添加したDMEM中5ug/ml)と共に氷上で45分間インキュベートした。次いで、細胞をPBS中で5分間、3回洗浄し、4%PFAで固定した。細胞を、PBS中で再び3回洗浄し、抗体結合を、蛍光顕微鏡下でJackson Immunoresearch製の二次Cy3結合ヤギ抗マウス抗体(1:500の希釈)で検出した。
マウスを、Konig,G.他、Annals New York Academy of Sciences.777:344〜55(1996)に記載されているようにアジュバント中のKLHにコンジュゲートされたペプチド約100μgで免疫化した。BA4ペプチドの29〜42位は、APPの推定膜貫通領域内に完全にあり、性質が疎水性であるため、KLHペプチドを、親水性スペーサーとコンジュゲートさせた。KLH−HDGDGD−MVGGVVIAを、Anaspecにおいて合成した。5残基スペーサーは、不溶性の問題を克服し、担体から離れてC末端を延長するのに十分であった。1日目に、マウスを、皮下で、CFA(完全フロインドアジュバント)と共に35〜42/KLHペプチド100μgで免疫化した。15日目に、マウスを、100μgのペプチド/KLH Ribi/ミョウバンで免疫化した。55日目に、マウスを、15日目と同様に免疫化した。95日目に、マウスを、静脈内で100μgのペプチド/KLHで追加免疫した。
7G10抗体の親和性を、実施例1にすでに記載されているようなBIAcore3000(登録商標)を用いて決定した。N−ビオチン化Aβ1〜40、1〜42、および1〜43を、SAチップ上に捕捉した。抗Aβ1〜40Fab、抗Aβ1〜42Fab、および抗Aβ1〜43Fabの3倍希釈シリーズをそれぞれ、上記に列挙されている7G10ストックの1/6希釈から出発して注入した。チップは、6%EtOH+6mM NaOHの18秒パルスで再生した。
A.実験プロトコル
抗体の投与。上記の実施例4に記載されているようなプロトコルを繰り返した。65週齢以上のApoE4−トランスジェニックマウスは、8週間、5群のうちの1群に割り付けた。第1群(E4−ND)は、普通食で継続的に維持された(n=6)。第2群(E4−HFC−R1)は、高脂肪、コレステロール富化(HF−C)食を8週間給餌された(n=12)。第3群(E4−HFC−R1)は、HF−C食を8週間給餌され、Rinat3(3mg/kg)の腹腔内注射を週に一度受けた(n=12)。第4群(E4−HFC−R2)は、HF−C食を8週間給餌され、Rinat4(3mg/kg)の腹腔内注射を週に一度受けた(n=12)。第5群(E4−HFC−R)は、HF−C食を8週間給餌され、Rinat5(3mg/kg)の腹腔内注射を週に一度受けた(n=12)。試験の終了後、群を非盲検化した。Rinat3は、7G10であり、Rinat4は、脱グリコシル化抗Aβ抗体2H6であり、Rinat5は、6Gであった。
脱グリコシル化抗体の投与による網膜機能の回復/保護
図13に示すように、b波振幅は、2H6(E4−HFC抗Aβ1〜40).A.で治療した群における網膜機能の有意な回復および/または保護を裏付けた。b波振幅は、7G10(E4−HFC抗Aβ1〜42/Aβ1〜43)で治療した群に回復がほとんどないか、まったくないことを示している。驚いたことに、b波振幅は、6G(E4−HFC抗Aβ1〜40/Aβ1〜42)で治療した群における網膜機能のさらに大きな回復および/または保護を示している。図14に示すように、6Gで治療した群のb波振幅は、正常マウスの対照群に匹敵し、網膜機能の完全な回復および/または保護を示していた。
上記のデータは、1)RPE下アミロイドが、AMDにおいて病原性および/または毒性であること、2)抗Aβ抗体2H6−Dを注射したマウスのERGによって証明された網膜機能の有意な回復/保護、および3)二重特異性抗Aβ1〜40/Aβ1〜426Gを注射したマウスのERGによって証明された網膜機能の完全な回復および/または保護を示している。
以下の材料は、American Type Culture Collection、10801 University Boulevard、Manassas、Virginia20110―2209、USA(ATCC)に寄託された。
9TL重鎖可変領域アミノ酸配列(配列番号1)
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DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDAKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYQISRLDPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGTHYPVLFGQGTRLEIKRT
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Claims (12)
- Aβ1〜40のC末端領域に特異的に結合する抗体を含む、眼科疾患治療用医薬組成物。
- 抗体が、Aβ1〜42上のエピトープとも特異的に結合する請求項1に記載の医薬組成物。
- 疾患が、加齢性黄斑変性症である請求項1に記載の医薬組成物。
- 抗体が、100nM以下のKDでAβ1〜40ペプチドと結合する請求項1に記載の医薬組成物。
- 抗体が、100nM以下のKDでAβ1〜42ペプチドとも結合する請求項4に記載の医薬組成物。
- 抗体が、アミノ酸25〜34および40が含まれるAβ1〜40上のエピトープと結合する請求項1に記載の医薬組成物。
- 抗体が、そのAβ1〜42およびAβ1〜43との結合よりも高い親和性でAβ1〜40と結合し、抗体が、抗体2294ではない請求項1に記載の医薬組成物。
- 抗体のFc領域が、N−グリコシル化されていないか、または天然Fc領域に関して変更されているN−グリコシル化パターンを有する請求項1に記載の医薬組成物。
- 抗体が、配列番号26に示す抗体6G重鎖可変領域由来の3個のCDRを含む重鎖可変領域および配列番号27に示す抗体6G軽鎖可変領域由来の3個のCDRを含む軽鎖可変領域を含む請求項1に記載の医薬組成物。
- 抗体が、配列番号26に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号27に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む請求項1に記載の医薬組成物。
- Aβ1〜40およびAβ1〜42のC末端領域に特異的に結合する抗体を含む、加齢性黄斑変性症治療用医薬組成物。
- 抗体が、配列番号36に示す重鎖および配列番号37に示す軽鎖を含む請求項1に記載の医薬組成物。
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