CN104027803A - 治疗眼科疾病的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及治疗眼科疾病的方法。本发明描述了使用针对类淀粉-β肽的抑制剂(包括单克隆抗体)用于治疗眼科疾病(例如年龄相关的黄斑退化)的方法。

Description

治疗眼科疾病的方法
本发明是申请日为2008年3月6日、申请号为200880007669.6、题为“治疗眼科疾病的方法”的中请的分案申请。
本申请要求2008年3月3提交的美国申请No.12/041,581的权益，美国申请No.12/041,581要求2007年3月9日提交的美国临时申请No.60/894,181的权益，美国申请No.12/041,581和美国临时申请No.60/894,181都通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及使用针对类淀粉-β肽的抗体的方法，用于治疗和/或预防眼科疾病，例如年龄相关黄斑退化，以及用于其它眼病理学中，例如青光眼、糖尿病性视网膜病变(包括糖尿病性黄斑水肿)、脉络膜新生血管膜(CNV)、葡萄膜炎、近视退化、眼肿瘤、视网膜中央静脉阻塞(centralretinal vein occlusion)、虹膜红变、眼新血管生成、中心浆液性视网膜病变(central serous retinopathy)、眼表面问题(ocular surface discus)(例如干眼)、视网膜中央动脉阻塞、囊样黄斑部水肿及任何其它视网膜退化性疾病。
发明背景
在美国，65岁以上个体中减小的最佳矫正视力的最常见起因为被称为年龄相关的黄斑退化(AMD)的视网膜病症。随着AMD进展，该疾病特征在于敏锐、中心视力的损失。受AMD影响的眼睛区域为黄斑-视网膜中心的小区域，其主要由感光细胞组成。占AMD患者的约85％-90％的所谓″干型″AMD(亦称为″地图状萎缩(geographic atrophy)″)涉及由细胞总体萎缩造成的眼睛色素分布改变、感光体损失及视网膜功能减少。所谓″湿型″AMD涉及引起视网膜下空间中凝血或伤痕的异常脉络膜血管增生。因此，湿型AMD的发作是由于在神经视网膜下形成异常脉络膜新生血管网络(脉络膜新血管生成，CNV)而发生。新形成的血管是过度渗漏的。这引起视网膜下流体及血液积累，引起视敏度损失。最终，随着涉及脉络膜及视网膜的大的盘状伤痕的形成，在所涉及区域中，功能性视网膜完全损失。尽管干型AMD患者可保持品质减小的视力，但湿型AMD经常导致失明。(Hamdi及Kenney，Age-related Macular degeneration-a new viewpoint，Frontiers inBioscience，e305-314，2003年5月)。CNV不仅在湿型AMD中还在其它眼病理学，例如青光眼、糖尿病性视网膜病变(包括糖尿病性黄斑水肿)、布鲁赫膜(Bruch′s membrane)破裂、近视退化、眼肿瘤及其它相关视网膜退化性疾病中发生。
AMD是发病机制为明显多因性的常见病症，其中遗传及环境因素在其发作及进展中起作用。各种所进行的研究已确定了AMD的若干风险因素，例如吸烟、衰老、家族史(Milton，Am J Ophthalmol88，269(1979)；Mitchell等人，Ophthalmology102，1450-1460(1995)；Smith等人，Ophthalmology108，697-704(2001))、性别(女性中7倍较高可能性：Klein等人，Ophthalmology99，933-943(1992))及种族(白种人最易受影响)。其它风险因素可包括眼睛特征，例如远视(farsightedness、hyperopia)及浅色眼睛，以及心血管疾病及高血压。疾病发作进展中的遗传参与的证据亦已有文献记录(参见上文Hamdi及Kenney)。
目前，不存在用于研究AMD的普遍接受的动物模型。Malek等人(PNAS102，11900-5(2005))的初始研究已产生了具有当组合时近似人类AMD的形态特征的三个风险因素的动物模型。值得注意的是该小鼠模型的发展已提供了测试针对AMD的治疗靶标和新颖分子机制的机会。仍存在对鉴定新颖靶标及能够治疗和/或预防以下眼科疾病的治疗剂的需要，所述眼科疾病例如年龄相关黄斑退化(湿型及干型)、青光眼、糖尿病性视网膜病变(包括糖尿病性黄斑水肿)、脉络膜新生血管膜(CNV)、葡萄膜炎、近视退化、眼肿瘤、视网膜中央静脉阻塞、虹膜红变、眼新血管生成、中心浆液性视网膜病变、眼表面问题(例如干眼)、视网膜中央动脉阻塞、囊样黄斑部水肿及其它视网膜退化性疾病。
发明内容
本发明公开了与眼科疾病的发病机制有关联的新颖治疗靶标。特别地，本发明公开了治疗眼科疾病的下述方法，其包含向个体施用有效量的抑制剂β-类淀粉(Aβ)肽。可将Aβ抑制剂施用至患有以下眼科疾病的个体：例如年龄相关黄斑退化(湿型及干型′AMD′)、青光眼、糖尿病性视网膜病变(包括糖尿病性黄斑水肿)、脉络膜新生血管膜(CNV)、葡萄膜炎、近视退化、眼肿瘤、视网膜中央静脉阻塞、虹膜红变、眼新血管生成、中心浆液性视网膜病变、眼表面问题(例如干眼)、视网膜中央动脉阻塞、囊样黄斑部水肿及其它视网膜退化性疾病。在一种实施方式中，抑制剂为抗体、反义分子、siRNA分子、核糖核酸酶或小分子化合物。
在一种实施方式中，本发明提供了治疗患有年龄相关的黄斑退化的个体的下述方法，其包含向个体施用包含治疗有效量的β-类淀粉(Aβ)肽的抑制剂的医药组合物。本发明的另一种实施方式涉及治疗患有年龄相关的黄斑退化(AMD)的个体的下述方法，其包含向个体施用包含治疗有效量的Aβ抑制剂的医药组合物。
本发明的另一种实施方式提供了治疗有效量的Aβ抑制剂的用途，所述用途用于制备供促进患有AMD的患者康复用的药物。在此实施方式的一方面中，抗体包含具有受损的效应器功能的Fc区。在此实施方式的另一方面中，疾病为AMD，包括湿型及干型AMD。
本发明还提供了治疗或预防与Aβ的类淀粉沉积相关的疾病的方法，其包含向个体施用有效剂量的医药组合物，该医药组合物包含与Aβ肽或Aβ肽的聚集形式特异性结合的抗体。在此实施方式的另一方面中，抗体包含与天然存在的Fc区具有变异的Fc区，其中该变异引起受损的效应器功能。在一些实施方式中，施用该抗体产生比施用无变异的抗体更少的脑微出血。
用于本发明的方法的抗体及多肽与Aβ肽或Aβ肽的聚集形式特异性结合。在一种实施方式中，抗体或多肽具有受损的效应器功能。在一些实施方式中，抗体或多肽不是F(ab′)2片段。在一些实施方式中，抗体或多肽不是Fab片段。在一些实施方式中，抗体或多肽不是单链抗体scFv。
与Aβ肽或Aβ肽的聚集形式特异性结合且包含具有受损的效应器功能的重链恒定区的多肽亦可用于本文所述的方法中的任一种。在一些实施方式中，多肽包含衍生自抗体9TL、6G或表3或表8中所示的其变异体的序列(例如一或多个CDR)。
在一些实施方式中，抗体或多肽包含具有受损的效应器功能的重链恒定区，其中重链恒定区包含Fc区。在一些实施方式中，Fc区中的N-糖基化被移除。在一些实施方式中，Fc区包含N-糖基化识别序列内的突变，由此使抗体或多肽的Fc区未经N-糖基化。在一些实施方式中，Fc区是经聚乙二醇化的。在一些实施方式中，抗体或多肽的重链恒定区为含有突变A330P331至S330S331(参考野生型IgG2a序列的氨基酸编号)的人类重链IgG2a恒定区。在一些实施方式中，抗体或多肽包含IgG4的、包含突变E233F234L235至P233V234A235的恒定区。
在一些实施方式中，抗体或多肽与Aβ肽的残基1-16内的表位特异性结合。在一些实施方式中，抗体或多肽与Aβ肽的N末端特异性结合。在一些实施方式中，抗体或多肽与Aβ肽的残基16-28内的表位特异性结合。在一些实施方式中，抗体与Aβ肽的C末端侧上的表位特异性结合，例如由氨基酸25或之后氨基酸开始的表位。抗体可与Aβ肽1-37、1-38、1-39、1-40、1-41、1-42、1-43中的任一种特异性结合。在一些实施方式中，抗体可与C末端截短Aβ肽的游离C末端氨基酸特异性结合，例如Aβ1-37、1-38、1-39、1-40、1-41、1-42、1-43。在一种实施方式中，抗体或多肽与Aβ1-40肽上的表位特异性结合。在此实施方式的另一方面中，抗体或多肽与Aβ1-42肽上的表位特异性结合。在此实施方式的再一方面中，抗体或多肽与Aβ1-43肽上的表位特异性结合。在一些实施方式中，抗体或多肽与Aβ1-40肽的残基28-40内的表位特异性结合。在一些实施方式中，抗体或多肽与Aβ1-42肽的残基28-42内的表位特异性结合。在一些实施方式中，抗体或多肽与Aβ1-43肽的残基28-43内的表位特异性结合。在一些实施方式中，抗体或多肽与Aβ肽特异性结合，而没有与全长类淀粉前驱蛋白质(APP)结合。在一些实施方式中，抗体或多肽与Aβ的聚集形式特异性结合，而没有与可溶形式结合。在一些实施方式中，抗体或多肽与Aβ的可溶形式特异性结合，而没有与聚集形式结合。在一些实施方式中，抗体或多肽与Aβ的聚集形式及可溶形式特异性结合。
在一些实施方式中，抗体或多肽与Aβ1-40的C末端肽33-40特异性结合。在一些实施方式中，抗体或多肽与包括氨基酸35-40的、Aβ1-40上的表位特异性结合。在一些实施方式中，抗体或多肽与包括氨基酸36-40的、Aβ1-40上的表位特异性结合。在一些实施方式中，抗体或多肽与包括氨基酸39和/或40的、Aβ1-40上的表位特异性结合。在一些实施方式中，抗体或多肽与Aβ1-40特异性结合，但并不与Aβ1-42和/或Aβ1-43特异性结合。在一些实施方式中，抗体包含本文所述的抗体9TL或衍生自9TL的抗体的可变区。在一些实施方式中，抗体或多肽竞争地抑制抗体9TL、6G和/或衍生自9TL或6G的抗体或多肽与各Aβ肽的结合。
在一些实施方式中，抗体或多肽以高于其与Aβ1-42及Aβ1-43结合的亲和性与Aβ1-40结合。在此实施方式的另一方面中，抗体不是抗体2294。在一些实施方式中，抗体与包括氨基酸25-34及40的、Aβ1-40上的表位结合。在一些实施方式中，抗体包含本文所述的抗体6G或衍生自6G的抗体的可变区。在一些实施方式中，抗体或多肽竞争地抑制抗体6G和/或衍生自6G的抗体或多肽与Aβ的结合。
在一些实施方式中，抗体或多肽以约100nM或以下、或20nM或以下，或2nM或以下的结合亲和性(KD)与Aβ肽结合。在此实施方式的一方面中，抗体或多肽以约100nM或以下、50nM或以下，或2nM或以下的KD与Aβ1-40肽结合。在此实施方式的另一方面中，抗体或多肽亦以约100nM或以下，50nM或以下，或2nM或以下的KD与Aβ1-42肽结合。
可以以本领域中已知的任何方法施用与Aβ肽特异性结合的抗体或多肽，包括：静脉内、皮下、经由吸入、动脉内、肌肉内、心内、心室内、非经肠、鞘内及腹膜内。施用可通过注射和/或可为全身性(例如静脉内)或局部施用。这通常也适用于本发明的多肽及多核苷酸。
本发明还提供了通过施用医药组合物来治疗眼科疾病的方法，所述医药组合物包含有效量的、与Aβ肽或Aβ肽的聚集形式特异性结合且具有受损的效应器功能的抗体或多肽中的任一种，或编码所述抗体或多肽的多核苷酸，及医药学上可接受的赋形剂。
本发明还提供了包含下述组合物中的任何一种或多种的试剂盒及组合物，所述组合物包含有效量的与Aβ肽或Aβ肽的聚集形式特异性结合的抗体或多肽中的任一种，或编码所述抗体或多肽的多核苷酸。一般在合适包装中且具备适当说明书的这些试剂盒可用于本文所述的方法中的任一种。
本发明还提供了一种制造治疗性人化抗体的方法，该治疗性人化抗体用于治疗与人类个体脑中的Aβ肽的类淀粉沉积相关的疾病，该方法包含：选择与Aβ肽特异性结合的第一人化抗体；及改变该抗体的Fc区，以提供相对于所述第一人化抗体具有受损的效应器功能的治疗性人化抗体。
本发明的另一种实施方式涉及保护或恢复个体视网膜功能的方法，其包含向所述个体施用包含治疗有效量的Aβ抑制剂的医药组合物。在一种实施方式中，抑制剂为抗体、反义分子、siRNA分子、核糖核酸酶或小分子化合物。
本发明的另一种实施方式涉及保持或复原个体视敏度的方法，其包含治疗有效量的Aβ抑制剂。
在上文实施方式的一方面中，上文方法用于并不正亦因阿兹海默氏症(Alzheimer′s disease)、唐氏综合征(Down′s syndrome)或脑类淀粉血管病变而受治疗的个体中。
本发明的上述方法包括作为抗体的Aβ抑制剂。在一方面中，本文中所公开的本发明涉及与Aβ1-40肽(表4中所示的SEQ ID NO：15)的C末端结合的抗体。因此在一方面中，该方法包含用抗体9TL(可互换称为″9TL″)进行的治疗，抗体9TL通过具有ATCC检录号PTA-6124及PTA-6125的表达载体来产生。图1中展示了9TL的重链及轻链可变区的氨基酸序列。图1中还展示了抗体9TL(包括Chothia及Kabat CDR)的互补决定区(CDR)部分。应当理解：提到对9TL区域的任何部分或整体涵盖由具有ATCC检录号PTA-6124及PTA-6125的表达载体产生的序列，和/或图1中所示出的序列。
在另一方面中，本发明包含施用具有表3中示出的氨基酸序列的9TL的抗体变异体。
在另一方面中，本发明包含施用包含抗体9TL或表3中所示的其变异体的片段或区域的抗体。在一种实施方式中，片段为抗体9TL的轻链。在另一种实施方式中，片段为抗体9TL的重链。在又一种实施方式中，片段含有来自抗体9TL的轻链和/或重链的一或多个可变区。在又一种实施方式中，片段含有来自图1中所示的轻链和/或重链的一或多个可变区。在又一种实施方式中，片段含有来自抗体9TL的轻链和/或重链的一或多个CDR。
在另一方面中，本发明包含施用多肽(其可为或可不为抗体)，其包含以下各物中的任何一种或多种：a)抗体9TL或表3中所示的其变异体的一或多个CDR；b)来自抗体9TL或表3中所示的其变异体的重链的CDR H3；c)来自抗体9TL或表3中所示的其变异体的轻链的CDR L3；d)来自抗体9TL或表3中所示的其变异体的轻链的三个CDR；e)来自抗体9TL或表3中所示的其变异体的重链的三个CDR；f)来自抗体9TL或表3中所示的其变异体的轻链的三个CDR及来自抗体9TL或表3中所示的其变异体的重链的三个CDR。本发明另外提供施用多肽(其可为或可不为抗体)，其包含以下各物中的任何一种或多种：a)衍生自抗体9TL或表3中所示的其变异体的一或多个(一、二、三、四、五或六个)CDR；b)衍生自来自抗体9TL的重链的CDR H3的CDR；和/或c)衍生自来自抗体9TL的轻链的CDR L3的CDR。在一些实施方式中，CDR为图1中所示的CDR。在一些实施方式中，衍生自抗体9TL或表3中所示的其变异体的一种或多种CDR与9TL或其变异体的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个CDR至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％一致。
在另一方面中，本发明包含施用抗体6G(可互换称为″6G″)。图8中展示6G的重链及轻链可变区的氨基酸序列。图8中亦展示抗体6G(包括Chothia及Kabat CDR)的互补决定区(CDR)部分。
在另一方面中，本发明包含施用具有表8中示出的氨基酸序列的6G的抗体变异体。
在另一方面中，本发明包含施用包含抗体6G或表8中所示的其变异体的片段或区域的抗体。在一种实施方式中，片段为抗体6G的轻链。在另一种实施方式中，片段为抗体6G的重链。在又一种实施方式中，片段含有来自抗体6G的轻链和/或重链的一或多个可变区。在又一种实施方式中，片段含有来自图8中所示的轻链和/或重链的一或多个可变区。在又一种实施方式中，片段含有来自抗体6G的轻链和/或重链的一或多个CDR。
在另一方面中，本发明包含施用下述多肽(其可为或可不为抗体)，所述多肽包含以下各物中的任何一种或多种：a)抗体6G或表8中所示的其变异体的一或多个CDR；b)来自抗体6G或表8中所示的其变异体的重链的CDRH3；c)来自抗体6G或表8中所示的其变异体的轻链的CDR L3；d)来自抗体6G或表8中所示的其变异体的轻链的三个CDR；e)来自抗体6G或表8中所示的其变异体的重链的三个CDR；f)来自抗体6G或表8中所示的其变异体的轻链的三个CDR及来自抗体6G或表8中所示的其变异体的重链的三个CDR。本发明另外包含施用多肽(其可为或可不为抗体)，其包含以下各物中的任何一种或多种：a)衍生自抗体6G或表8中所示的其变异体的一或多个(一、二、三、四、五或六个)CDR；b)衍生自来自抗体6G的重链的CDRH3的CDR；和/或c)衍生自来自抗体6G的轻链的CDR L3的CDR。在一些实施方式中，CDR为图8中所示的CDR。在一些实施方式中，衍生自抗体6G或表8中所示的其变异体的该或此类CDR至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％与6G或其变异体的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个CDR一致。
在另一方面中，本发明包含施用包含下述重链可变区及下述轻链可变区的抗体，所述重链可变区包含来自SEQ ID NO：26中所示的抗体6G重链可变区的三个CDR，所述轻链可变区包含来自SEQ ID NO：27中所示的抗体6G轻链可变区的三个CDR。在另一方面中，本发明包含施用包含下述重链可变区及下述轻链可变区的抗体，所述重链可变区包含SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：30中所示的三个CDR，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：33中所示的三个CDR。在再一方面中，本发明包含含有SEQ ID NO：26中所示的氨基酸序列的重链可变区及含有SEQ ID NO：27中所示的氨基酸序列的轻链可变区。在再一方面中，本发明包含SEQ ID NO：36中所示的重链氨基酸序列及SEQ ID NO：37中所示的轻链氨基酸序列。
在一些实施方式中，CDR为Kabat CDR。在其它一些实施方式中，CDR为Chothia CDR。在其它一些实施方式中，CDR为Kabat与ChothiaCDR的组合(亦称为″组合CDR″或″扩展CDR″)。换言之，对于含有一种以上CDR的任何给定实施方式而言，CDR可为Kabat、Chothia和/或组合CDR中的任一种。
在一些实施方式中，多肽(例如抗体)包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列，其中L1为L、V或I；其中Y2为Y或W；其中S3为S、T或G；其中L4为L、R、A、V、S、T、Q或E；其中V6为V、I、T、P、C、Q、S、N或F；且其中Y7为Y、H、F、W、S、I、V或A。在一些实施方式中，氨基酸序列为重链可变区中的CDR3。在本文中为方便起见，在本文上下文中或提到氨基酸时，“为/是(“is”)”指参照在SEQ ID中的位置来选择给定位置的氨基酸。举例而言，″L1为L、V或I″指在SEQ ID NO：5中位置1的氨基酸L可被V或I取代。
在一些实施方式中，多肽(例如抗体)包含SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列，其中Y8为Y、A或H；且其中A11为A或S；且其中K12为K或A。在一些实施方式中，氨基酸序列为轻链可变区中的CDR1。
在一些实施方式中，多肽(例如抗体)包含SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列，其中L1为L、M、N、C、F、V、K、S、Q、G、S；其中G3为G、S或T；其中T4为T或S；其中H5为H或L；其中Y6为Y、P、A、W、Q、M、S或E；其中V8为V、L、K、H、T、A、E、或M；且其中L9为L、I、T、S或V。在一些实施方式中，氨基酸序列为轻链可变区中的CDR3。
在一些实施方式中，多肽(例如抗体)包含重链可变区，该重链可变区包含：(a)SEQ ID NO：3中所示的CDR1区域；(b)SEQ ID NO：4中所示的CDR2区域；及(c)SEQ ID NO：5中所示的CDR3区域，其中L1为L、V或I；其中Y2为Y或W；其中S3为S、T或G；其中L4为L、R、A、V、S、T、Q或E；其中V6为V、I、T、P、C、Q、S、N或F；且其中Y7为Y、H、F、W、S、I、V或A。
在一些实施方式中，多肽(例如抗体)包含轻链可变区，该轻链可变区包含：(a)SEQ ID NO：6中所示的CDR1区域，其中Y8为Y、A或H；且其中A11为A或S；且其中K12为K或A；(b)SEQ ID NO：7中所示的CDR2区域；及(c)SEQ ID NO：8中所示的CDR3区域，其中L1为L、M、N、C、F、V、K、S、Q、G、S；其中G3为G、S或T；其中T4为T或S；其中H5为H或L；其中Y6为Y、P、A、W、Q、M、S或E；其中V8为V、L、K、H、T、A、E或M；且其中L9为L、I、T、S或V。
在一些实施方式中，本发明的抗体为人抗体。在其它实施方式中，本发明的抗体为人化抗体。在一些实施方式中，抗体为单克隆抗体。在一些实施方式中，抗体(或多肽)系经分离。在一些实施方式中，抗体(或多肽)为基本上纯的。
抗体的重链恒定区可来自任何类型的恒定区，例如IgG、IgM、IgD、IgA及IgE；及任何同型(isotype)，例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。
在一些实施方式中，抗体包含经修饰恒定区，例如免疫惰性(其包括部分免疫惰性，且可与术语″具有受损的效应器功能″互换使用)的恒定区，其例如并不触发补体介导溶胞、并不刺激抗体依赖细胞介导细胞毒性(ADCC)或并不活化微神经胶质细胞。在一些实施方式中，如Eur.J.Immunol.(1999)29：2613-2624；PCT申请案第PCT/GB99/01441号；和/或英国专利申请案第9809951.8号中所述来修饰恒定区。在其它实施方式中，抗体包含人类重链IgG2a恒定区，该恒定区包含以下突变：A330P331至S330S331(参考野生型IgG2a序列的氨基酸编号)。Eur.J.Immunol.(1999)29：2613-2624。在一些实施方式中，抗体包含IgG4的恒定区，该恒定区包含以下突变：E233F234L235至P233V234A235。在再其它一些实施方式中，针对N连接糖基化而对恒定区去糖基化(aglycosylated)。在一些实施方式中，通过使寡糖附接残基(例如Asn297)突变和/或侧接作为恒定区中N-糖基化识别序列的部分的残基，从而针对N连接糖基化而使恒定区去糖基化。在一些实施方式中，针对N连接糖基化而对恒定区去糖基化。以酶促方式或通过表达于糖基化缺乏宿主细胞中，从而可针对N连接糖基化而使恒定区去糖基化。
在另一方面中，本发明提供一种多核苷酸(其可经分离)，其包含编码抗体9TL或6G或表3及表8中所示的其变异体的片段或区域的多核苷酸。在一种实施方式中，片段为抗体9TL或6G的轻链。在另一种实施方式中，片段为抗体9TL或6G的重链。在又一种实施方式中，片段含有来自抗体9TL或6G的轻链和/或重链的一或多个可变区。在又一种实施方式中，片段含有来自抗体9TL或6G的轻链和/或重链的一或多个(亦即一、二、三、四、五、六个)互补决定区(CDR)。
附图简述
图1展示了9TL抗体的重链可变区(SEQ ID NO：1)及轻链可变区(SEQ IDNO：2)的氨基酸序列。Kabat CDR表示为粗体，Chothia CDR以下划线表示。对重链及轻链可变区的氨基酸残基依次编号。
图2展示了通过肽竞争进行的抗体9TL的表位定位。将Aβ1-40肽固定于SA芯片上。接着，使各与10μM各种肽(Aβ的氨基酸28-40、1-40、1-28、28-42、22-35、1-16、1-43、33-40、1-38或17-40)或无肽预培育1h的单克隆抗体2289及9TL Fab片段(各50nM)流到该芯片上。测量抗体Fab片段对固定Aβ1-40肽的结合。
图3是展示了通过肽竞争进行抗体2H6的表位定位的图。将Aβ1-40肽固定于SA芯片上。使各与16μM各种肽(Aβ的氨基酸1-16、1-28、1-38、1-40、1-42、1-43、17-40、17-42、22-35、25-35或33-40)或无肽预培育1h的单克隆抗体2289、2286或2H6(各100nM)流到该芯片上。测量抗体与固定Aβ1-40肽的结合。
图4是展示了抗体2H6、2286及2289与不同Aβ肽C末端变异体的结合的图。将GST-Aβ变异体(M35A、V36A、G37A、G38A、V39A或V40A)或GST-Aβ肽1-39、1-41、1-40、1-42固定于ELISA板上。将各固定的肽与单克隆抗体2286、2H6或2289(各mAb0.3nM)一起培育，且通过进一步依次以经生物素标记的抗小鼠IgG(H+L)及Sterptavidin-HRP培育来检测其结合。
图5为来自老化脂蛋白元同功异型物E4(APOE4)小鼠在正常膳食相对于高脂肪及胆固醇膳食下的a波及b波(A)及样品视网膜电图(B)的强度图。
图6为对比正常膳食动物的先前研究所绘的仅APOE4小鼠b波的强度图。R2迹线展示：当以抗Aβ抗体治疗AMD状小鼠(E4-HFC-R2)时的视网膜功能的保护或恢复。
图7展示AMD状(APOE4)小鼠脑部的全Aβ免疫组织化学。载片A(以抗Aβ抗体治疗的AMD状小鼠)展示阴性类淀粉检测。载片B、C及D(以介载体(vehicle)注射治疗的AMD状小鼠)展示阳性类淀粉检测。载片E系取自阳性对照且系取自血小板衍生APP小鼠模型(pdAPP，在血小板衍生生长因子启动子控制下的突变(V717F)人类APP(Games，D.等人，Nature373：523-527(1995))的脑。
图8展示6G抗体的重链可变区(SEQ ID NO：1)及轻链可变区(SEQ IDNO：27)的氨基酸序列。Kabat CDR系呈粗体文且Chothia CDR系经加下划线。对重链及轻链可变区的氨基酸残基依次编号。
图9展示通过ELISA进行的抗体6G的表位定位。将Aβ肽(1-16、1-28、17-40、17-42、22-35、28-40、28-42、1-38、1-40、1-42、1-43及33-40)固定于ELISA板上。将单克隆抗体6G(20nM)与各种固定肽培育1小时。使用山羊抗人类κHRP缀合二抗来测量与固定Aβ肽结合的抗体6G。
图10展示通过ELISA进行的抗体6G的表位定位。将各种Aβ肽固定于ELISA板上。将抗体6G与各种固定肽培育1h。使用山羊抗人类κHRP缀合二抗来测量与固定Aβ肽结合的抗体6G。″NB″指未检测到结合。
图11为展示Aβ上抗体6G结合的表位的示意图。其中展示了Aβ在类淀粉前驱蛋白质(APP)中及APP的部分在细胞膜中的相对位置。″CT99″指APP的C末端99个氨基酸。
图12为展示用针对Aβ1-16(m2324)及抗体6G的单克隆抗体对APP表达细胞进行免疫染色的照片。上方的图展示了细胞与m2324或6G(各5μg/ml)一起培育且通过二次Cy3缀合山羊抗小鼠或抗人抗体来检测结合之后在萤光显微镜下的细胞。下方的图展示了在显微镜下所观察的细胞。
图13为仅五个研究组的APOE4小鼠的b波强度图：正常膳食的对照APOE4小鼠；高脂肪及胆固醇膳食(′HFC′)的对照APOE4小鼠(AMD状模型)；以7G10治疗的APOE4-HFC小鼠；以2H6治疗的APOE4-HFC小鼠；及以6G治疗的APOE4-HFC小鼠。
图14为仅三个研究组的APOE4小鼠的b波强度图：正常膳食的对照APOE4小鼠；对照APOE4HFC小鼠；及以6G治疗的APOE4-HFC小鼠。
发明详述
AMD的小鼠模型已有助于测试如下假设：不受理论限制，脂质输送调节异常及类淀粉沉积可促进见于年龄相关黄斑退化、青光眼、糖尿病性视网膜病变(包括黄斑水肿)及其它相关视网膜退化性疾病中所观察到视网膜变化的发病机制。已在阿兹海默氏症中广泛研究了Aβ沉积，且先前研究已表明Aβ在年龄相关黄斑退化(Yoshida，T.等人，J.of Clin.Invest.，115(10)：2793-2800(2005)；Anderson，D.等人，Experimental Eye Research78：243-256(2004)；Johnson，L等人，PNAS，99(18)：11820-11835(2002))及青光眼(McKinnon SJ，Front Biosci8：1140-56(2003)；Tatton等人，SurvOphthalmol.48：S25-37(2003))中的潜在作用。然而，迄今尚未存在关于Aβ抑制剂是否可通过实现视网膜保护和/或恢复而在治疗黄斑退化中提供治疗性益处的讨论。此外，尚未有关于Aβ同功异型物中的任一种是否可有差异地促进AMD发病机制的讨论。
如上文所讨论，Aβ为见于阿兹海默氏症中的神经炎斑的主要成份。Aβ为β类淀粉前驱蛋白质(βAPP或APP)的分裂产物。APP为一种含有大异位N末端域、跨膜域及小细胞质C末端尾部的I型跨膜糖蛋白。染色体21上单一APP基因转录的替代性拼接产生氨基酸数目不同的若干同功异型物。阿兹海默氏症中的先前研究已确定Aβ1-42同功异型物对类淀粉沉积必不可少，且与Aβ1-40相反，Aβ1-42可以是阿兹海默氏症的发病机制中的引发分子(McGowan，E.等人，Neuron47：191-199(2005))。阿兹海默氏症中的其它研究而且表明Aβ1-40同功异型物实际上可抑制类淀粉沉积，且Aβ1-40抑制剂可使得阿兹海默氏症进程恶化(Kim，J.等人，Neurobiology of Disease，27(3)：627-633(2007))。
本文中所公开的本发明提供通过施用治疗有效量的抗体9TL或6G或由其衍生的抗体或多肽来预防和/或治疗个体中眼科疾病的方法，此类眼科疾病例如年龄相关黄斑退化(湿型及干型)、青光眼、糖尿病性视网膜病变(包括糖尿病性黄斑水肿)、布鲁赫膜破裂、近视退化、眼肿瘤及其它相关视网膜退化性疾病。抗体9TL及其衍生物已被描述于WO2006036291中，其公开内容通过引用全部并入本文中。用于所公开方法中的抗体及多肽与Aβ1- 40的C末端结合。抗体6G及其衍生物已被描述于WO2006036291及WO2006118959中，其公开内容通过引用全部并入本文中。本发明的方法意欲包括Aβ的所有抑制剂，其包括但不限于：小分子化合物及生物制剂，例如抗体、反义分子、siRNA分子及核糖核酸酶。
通用技术
除非另作说明，否则本发明的实施将采用本领域内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学及免疫学的公知技术。这些技术已被充分解释于例如以下的文献中：Molecular Cloning：A LaboratoryManual，second edition(Sambrook等人，1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编，1984)；Methods in MolecularBiology，Humana Press；Cell Biology：A Laboratory Notebook(J.E.Cellis编，1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编，1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather及P.E.Roberts，1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures(A.Doyle，J.B.Griffiths及D.G.Newell编，1993-1998)J.Wiley and Sons；Methods inEnzymology(Academic Press，Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir及C.C.Blackwell编)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller及M.P.Calos编，1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编，1987)；PCR：The Polymerase Chain Reaction，(Mullis等人编，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人编，1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons，1999)；Immunobiology(C.A.Janeway及P.Travers，1997)；Antibodies(P.Finch，1997)；Antibodies：a practical approach(D.Catty.编，IRL Press，l988-1989)；Monoclonal antibodies：a practical approach(P.Shepherd及C.Dean编，Oxford University Press，2000)；Using antibodies：a laboratory manual(E.Harlow及D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999)；TheAntibodies(M.Zanetti及J.D.Capra编，Harwood Academic Publishers，1995)。
定义
″Aβ肽抑制剂″是能够减少Aβ肽产生和/或沉积的任何药剂。Aβ肽抑制剂包括但不限于：抗体、反义分子、siRNA分子、核糖核酸酶或小分子化合物。此外，Aβ肽抑制剂是能够结合Aβ肽且减少Aβ斑沉积的任何药剂，其包括能够中断类淀粉前驱蛋白质蛋白质裂解为产物Aβ肽的任何药剂。抑制Aβ肽产生及沉积的其它目标包括但不限于：例如能够抑制或压制β分泌酶(亦称为BACE1或memapsin-2)或γ分泌酶复合物(其最低限度由四种个别蛋白质组成：早老素(presenilin)、尼卡斯群(nicastrin)、前咽缺陷1(APH-1)及早老素增强子2(PEN-2))的小分子治疗剂或siRNA。
″抗体″为免疫球蛋白分子，其能够经由至少一个位于免疫球蛋白分子的可变区的抗原识别位点来与例如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等的靶标特异性结合。如本文中所用地，该术语不仅涵盖完整多克隆或单克隆抗体，而且涵盖其片段(例如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv)、单链(ScFv)、其突变体、包含抗体部分的融合蛋白，及包含抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它修饰构型。抗体包括任何类别的抗体，例如IgG、IgA或IgM(或其亚类)，且抗体不需属于任何特定类别。视其重链的恒定结构域的抗体氨基酸序列而定，免疫球蛋白可被归于不同类别。存在五个主要类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此类者中的若干者可进一步分成亚类(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。将对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称作α、δ、ε、γ及μ。不同类别免疫球蛋白的次单位结构及三维构型是公知的。
如本文中所用地，″单克隆抗体″指由基本上同类的抗体群体获得的抗体，即：包含该群体的个别抗体除可微量存在的可能天然存在的突变外均相同。单克隆抗体为高度特异性的，它们针对单一抗原位点。而且，与通常包括针对不同决定子(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，各单克隆抗体针对抗原上的单一抗原性位点。修饰语″单克隆″表明抗体的特征在于由抗体的基本上同类群体获得，且不应理解为需要通过任何特定方法来产生抗体。举例而言，根据本发明欲使用的单克隆抗体可通过先由Kohler及Milstein，1975，Nature，256：495所述的融合瘤方法来制得，或可通过例如美国专利第4,816,567号中所述的重组DNA方法制得。亦可自使用(例如)McCafferty等人，1990，Nature，348：552-554中所述技术产生的噬菌体文库来分离单克隆抗体。
如本文中所用地，″人化″抗体指非人(例如鼠类)抗体的下述形式，其是含有衍生自非人类免疫球蛋白的最小序列的特异性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其它抗原结合子序列)。在极大程度上，人化抗体是人类免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自接受者的互补决定区(CDR)的残基被经来自非人类物种(供体抗体)的CDR的残基置换，所述非人物种例如是具有所需特异性、亲和性及能力的小鼠、大鼠或兔。在一些情况下，人类免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应非人类残基置换。此外，人化抗体可包含既未在接受者抗体中也未在输入CDR或框架序列中发现的残基，但将其包括进来以进一步改善及优化抗体效能。一般而言，人化抗体将包含至少一个且通常二个可变结构域的基本上全部，其中CDR区域的全部或基本上全部均对应于非人类免疫球蛋白的那些，并且，FR区域的全部或基本上全部均为人类免疫球蛋白共有序列的那些。最优地，人化抗体还将包含至少一部分免疫球蛋白恒定区或域(Fc)，通常为人类免疫球蛋白的彼者。抗体可具有如WO99/58572中所述经修饰的Fc区。其它形式的人化抗体具有一或多个相对于原始抗体而言经改变的CDR(一、二、三、四、五、六个)，其还被称为一或多个″衍生自″一或多个来自原始抗体的CDR的CDR。
如本文中所用，″人抗体″表示具有相应于由人类产生的抗体的氨基酸序列的氨基酸序和/或已使用本领域中已知或本文中所公开的制造人抗体的技术中的任一种制得的抗体。人抗体的此定义包括包含至少一个人类重链多肽或至少一个人类轻链多肽的抗体。一个这样的实例为包含鼠类轻链及人类重链多肽的抗体。可使用各种本领域中已知的技术来制造人抗体。在一种实施方式中，人抗体选自噬菌体文库，其中该噬菌体文库表达人抗体(Vaughan等人，1996，Nature Biotechnology，14：309-314；Sheets等人，1998，PNAS，(USA)95：6157-6162；Hoogenboom及Winter，1991，J.Mol.Biol.，227：381；Marks等人，1991，J.Mol.Biol.，222：581)。还可通过将人类免疫球蛋白基因座引入内源免疫球蛋白基因已部分或完全失活的转殖基因动物(例如小鼠)中来制造人抗体。在美国专利第5,545,807号；第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；及第5,661,016号中描述此方法。或者，可通过永生化产生针对靶标抗原的抗体的人类B淋巴细胞来制备人抗体(此B淋巴细胞可自个体中回收或可经体外免疫)。例如参见Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，第77页(1985)；Boemer等人，1991，J.Immunol.，147(1)：86-95；及美国专利第5,750,373号。
如本文中所用，术语″9TL″及″抗体9TL″可互换使用，以指通过保藏号为ATCC PTA-6124及ATCC PTA-6125的表达载体产生的抗体。图1中展示了重链及轻链可变区的氨基酸序列。图1中图解性地示出了抗体9TL(包括Chothia及Kabat CDR)的CDR部分。编码重链及轻链可变区的多核苷酸展示于SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10中。在实例中描述了对9TL的分析。
如本文中所用地，术语″6G″及″抗体6G″可互换使用，以指具有SEQ IDNO：36中所示的重链氨基酸序列及SEQ ID NO：37中所示的轻链氨基酸序列的抗体。图8中展示了重链及轻链可变区的氨基酸序列。图8中图解性地示出了抗体6G(包括Chothia及Kabat CDR)的CDR部分。编码重链及轻链的多核苷酸展示于SEQ ID NO：38及SEQ ID NO：39中。在实例中描述了对6G的分析。
术语″多肽″、″寡肽″、″肽″及″蛋白质″本文中可互换使用，以指任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可为线性或带支链的，其可包含修饰氨基酸且其可杂有非氨基酸。所述术语也涵盖已经天然修饰或通过干预(intervention)来修饰的氨基酸聚合物；例如双硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，例如与标记组份缀合。该定义内还包括例如含有一或多个氨基酸类似物(例如包括非天然氨基酸等)的多肽以及本领域中已知的其它修饰。应了解：因为本发明的多肽基于抗体，所以多肽可作为单链或相关链的形式出现。
如本文中可互换使用的″多核苷酸″或″核酸″指任何长度的核苷酸的聚合物，其包括DNA及RNA。核苷酸可为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰核苷酸或碱基和/或其类似物，或可通过DNA或RNA聚合酶来并入聚合物中的任何受体。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸及其类似物。如果存在的话，对核苷酸结构的修饰可在聚合物组装之前或之后进行。核苷酸的序列可杂有非核苷酸组份。在聚合之后可对多核苷酸进一步修饰，例如通过与标记组份缀合来修饰。其它类型的修饰包括(例如)″盖子(cap)″、以类似物取代天然存在的核苷酸中的一种或多种、核苷酸间修饰，例如具有不带电的连接的修饰(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酸酯、胺基甲酸酯等)及具有带电的连接的修饰(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、含有侧位部分的修饰(例如蛋白质，例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-L-离胺酸等)、具有嵌入剂的修饰(例如吖啶、补骨脂素等)、含有螯合剂的修饰(例如金属、放射性金属、硼、氧化金属等)、含有烷化剂的修饰、具有经修饰的连接的修饰(例如α-变旋异构核酸等)，以及多核苷酸的未经修饰形式。另外，通常存在于糖中的任何羟基可(例如)经膦酸酯基、磷酸酯基置换，经标准保护基保护，或经活化以制备与其它核苷酸的其它键，或可与固体支撑物缀合。5′及3′末端OH可经磷酸化或经胺或具有1至20个碳原子的有机封端基团部分取代。其它羟基也可衍生至标准保护基。多核苷酸亦可含有本领域中一般已知的核糖或脱氧核糖类似物，包括(例如)2′-O-甲基-、′-O-烯丙基、2′-氟-或2′-叠氮基-核糖、碳环糖类似物、α-变旋异构糖、差向异构糖(例如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖(sedoheptulose))、非环状类似物及脱碱基核苷类似物，例如甲基核糖苷。一或多个磷酸二酯连接可被备选的连接基团置换。这些备选的连接基团基团包括但不限于：其中磷酸盐/酯被P(O)S(″硫代酯″)、P(S)S(″二硫代酯″)、(O)NR2(″酰胺酸酯″)、P(O)R、P(O)OR′、CO或CH2(′″甲缩醛″)置换的实施方式，其中R或R′各自独立地为H或经取代或未经取代的烷基，它们任选地含有醚(-O-)键的烷基(1-20个C)、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基。多核苷酸中并非所有键均需相同。先前的描述也适用于本文中所提及的所有多核苷酸，包括RNA及DNA。
抗体的″可变区″指单独或呈组合形式的抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区。重链及轻链的可变区各由四个通过三个亦称为高变区的互补决定区(CDR)连接的框架区(FR)组成。各链中的CDR由FR紧密保持在一起，且与来自其它链的CDR一起促成抗体的抗原结合位点的形成。存在至少两种测定CDR的技术：(1)基于交叉物种序列可变性的方法(亦即，Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，(第五版，1991，National Institutes of Health，Bethesda MD))；及(2)基于抗原抗体复合物的结晶学研究的方法(Al-lazikani等人(1997)J.Molec.Biol.273：927-948))。如本文中所用地，CDR可指由任一种方法或由两方法的组合界定的CDR。
抗体的″恒定区″指单独或呈组合形式的抗体轻链的恒定区或抗体重链的恒定区。
与抗体或多肽″优先结合″或″特异性结合″(本文中可互换使用)的表位是本领域中充分了解的术语，且在本领域中，测定此特异性或优先结合的方法也是公知的。与分子与替代性细胞或物质的反应或缔合相比，若分子更频繁、更迅速、以更大持续时间和/或更大亲和性与特定细胞或物质反应或缔合，则将该分子称为展现″特异性结合″或″优先结合″。与抗体与其它物质的结合相比，若抗体以更大亲和性、亲和力、更容易和/或以更大持续时间与靶标结合，则抗体与靶标″特异性结合″或″优先结合″。举例而言，与Aβ1-40表位特异性或优先结合的抗体与其与其它Aβ1-40表位或非Aβ1-40表位的结合相比，能以更大亲和性、亲和力、更容易和/或更大持续时间与此表位结合。通过阅读此定义还应了解：例如，与第一靶标特异性或优先结合的抗体(或部分或表位)可与或可不与第二靶标特异性或优先结合。因此，″特异性结合″或″优先结合″未必需要(尽管其可包括)独占结合。大体而言，但并非一定，提到结合指优先结合。
如本文中所用地，″基本上纯″指至少50％纯(亦即无污染物)、更优选至少90％纯、更优选至少95％纯、更优选至少98％纯、更优选至少99％纯的物质。
″宿主细胞″包括可以是或已是用于并入多核苷酸插入物的载体接受者的个别细胞或细胞培养物。宿主细胞包括单一宿主细胞的子代，且由于天然、偶然或故意突变，子代可不必完全与原始亲本细胞相同(在形态学或染色体组DNA补体方面)。宿主细胞包括用本发明的多核苷酸体内转染的细胞。
术语″Fc区″用于定义免疫球蛋白重链的C末端区域。″Fc区″可为天然序列Fc区或变异Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可改变，但人类IgG重链Fc区通常被定义为自位置Cys226的氨基酸残基或自Pro230至其羧基末端的伸展。Fc区中的残基编号为如在Kabat中EU指数的编号。Kabat等人，Sequences of Proteins of Imunological Interest，第5版，Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，Md.，1991。免疫球蛋白的Fc区一般包含两个恒定结构域：CH2及CH3。
如本文中所用地，″Fc受体″及″FcR″描述与抗体的Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列人类FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，其包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII亚类受体，包括这类受体的等位基因变异体及备选剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(″活化受体″)及FcγRIIB(″抑制受体″)，其具有主要在其细胞质域中存在不同的类似氨基酸序列。FcR系综述于Ravetch及Kinet，1991，Ann.Rev.Immunol.，9：457-92；Capel等人，1994，Immunomethods，4：25-34；及de Haas等人，1995，J.Lab.Clin.Med.，126：330-41中。″FcR″亦包括新生儿受体FcRn，其负责将母体IgG转移至胎儿(Guyer等人，1976，J.Immunol.，117：587；及Kim等人，1994，J.Immunol.，24：249)。
″补体依赖细胞毒性″及″CDC″指在补体存在下将靶标溶胞。通过将补体系统的第一组份(C1q)结合于与同源抗原复合的分子(例如抗体)来引发补体活化路径。为评定补体活化，可进行CDC检验，例如，如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods，202：163(1996)中所述进行。
″功能性Fc区″具有天然序列Fc区的至少一种效应器功能。示例性的″效应器功能″包括：C1q结合；补体依赖细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖细胞介导细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的调降等。此类效应器功能一般需要Fc区与结合域(例如抗体可变结构域)组合，可使用各种本领域中已知用以评估此类抗体效应器功能的检验来对其加以评定。
″天然序列Fc区″包含与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列一致的氨基酸序列。″变异Fc区″包含由于至少一个氨基酸修饰而不同于天然序列Fc区的氨基酸序列、然而保持天然序列Fc区的至少一种效应器功能的氨基酸序列。与天然序列Fc区相比或与亲本多肽的Fc区相比，变异Fc区在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中优选具有至少一个氨基酸取代，例如约一至约十个氨基酸取代，且优选约一至约五个氨基酸取代。本文中变异Fc区将与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区优选具有至少约80％序列一致性，且最优选与其具有至少约90％序列一致性，更优选与其具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％序列一致性。
如本文中所用地，″抗体依赖性细胞介导的细胞毒性″及″ADCC″指细胞介导反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如自然杀手(NK)细胞、嗜中性白血球及巨噬细胞)识别靶标细胞上的结合抗体，随后引起靶标细胞的溶胞。可使用体外ADCC检验来评定所关注分子的ADCC活性，例如美国专利第5,500,362号或第5,821,337号中所述的检验。用于此类检验的适用效应器细胞包括周围血液单核细胞(PBMC)及NK细胞。或者或另外，例如在动物模型中可体内评定所关注分子的ADCC活性，例如Clynes等人，1998，PNAS(USA)，95：652-656中所公开的动物模型。
如本文中所用地，″有效剂量″或″有效量″的药物、化合物或医药组合物为足以实现有利或所需结果的量。对于预防性用途而言，有利或所需结果包括例如消除或减小风险、减轻严重程度或延迟疾病发作的结果，该发作包括疾病的生物化学、组织和/或行为症状，在疾病发展期间呈现的其并发症及中间病理学表型。对于治疗性用途而言，有利或所需结果包括但不限于例如保护或恢复视网膜功能或保持或复原视敏度的临床结果。有效剂量可以一或多次施用来施用。为达成本发明的目的，有效剂量的药物、化合物或医药组合物为足以直接或间接地实现预防性或治疗性治疗的量。如在临床情形中了解，有效剂量的药物、化合物或医药组合物可与或可不与另一药物、化合物或医药组合物联合来达成。因此，在施用一或多种治疗剂的情形下可考虑″有效剂量″，并且，单一药剂若与一或多种其它药剂联合，所需结果可达成或已达成，单一药剂则可视为是以有效量给出的。
如本文中所用，″治疗″为获得有利或所需结果(包括临床结果)的方法。为达成本发明的目的，有利或所需临床结果包括但不限于：复原、预防或保护视网膜功能。
″Aβ肽的生物作用″或″Aβ生物活性″意谓Aβ在眼科疾病中的作用，其可为直接或间接作用，且不受理论限制地包括Aβ在脂质输送调节异常中的涉入。间接作用包括但不限于Aβ对视网膜功能及视敏度起作用。
如本文中所用，″延迟″眼科疾病的发展意谓推迟、阻碍、减缓、推延、稳定和/或延期疾病的发展。视疾病史和/或所治疗的个体而定，此延迟可具有变化的时间长度。对本领域技术人员而言显而易见：足够或显著延迟可实际上涵盖预防，因为个体并不发展该疾病。″延迟″眼科疾病发展的方法为当与不使用该方法相比时，在给定时间框架内减小疾病发展机率和/或在给定时间框架内减小疾病程度的方法。此类比较通常系基于临床研究，使用统计上显著数目的个体。
眼科疾病的″发展″意谓个体中眼科疾病的发作和/或进展。使用如本文所述的标准临床技术可检测眼科疾病的发展。然而，发展还表示最初可能不可检测的疾病进展。为达成本发明的目的，在此情况下，进展指如由标准眼科检查(ophthalmogical examination)或通过较专业化测试来测定的疾病病况的生物学过程。多种诊断性测试包括但不限于视野、视敏度、萤光血管摄影术(fluorescein angiography)、视网膜电图、光学同步断层摄影法(OCT)、视觉诱发电位(VEP)、靛氰绿、色彩视觉、阿姆斯勒方格表(Amsler grid)、眼内压及本领域技术人员已知的其它诊断工具。AMD的诊断性测试尤其包括但不限于：视敏度、眼底检查(fundoscopicexamination)、萤光血管摄影术、靛氰绿及眼同步断层摄影法(OCT)。″发展″包括出现、复发及发作。如本文中所用，眼科疾病的″发作″或″出现″包括初始发作和/或复发。
如本文中所用，″保护″视网膜功能指稳定或保持视网膜功能。如本文中所用，″恢复″视网膜功能系指在先前损害之后复原视网膜功能。视网膜功能的保护或恢复可通过测量统计上显著结果(亦即p＜0.05)来测定，如通过上述眼科诊断工具中的任一种来测量，尤其例如视敏度、视网膜电图、视野、眼底检查、萤光血管摄影术、靛氰绿及眼同步断层摄影法(OCT)。举例而言，如下文实例4中所示，统计上显著的视网膜功能保护或恢复系由视网膜电图中b波振幅恢复来展示(p＝0.008)。
视敏度的″保持″或″复原″可通过标准视力表以及本领域中公知的多种眼科诊断工具来测量。
如本文中所用地，″联合″施用包括同时施用和/或在不同时间施用。联合施用亦涵盖以共制剂来施用或以独立组合物来施用。如本文中所用，联合施用意谓涵盖向个体施用抗Aβ抗体与另一药剂的任何状况，其可同时和/或独立发生。如本文中进一步讨论地，应了解：可以以不同给药频率或间隔来施用抗Aβ抗体及其它药剂。举例而言，抗Aβ抗体可每周施用，而其它药剂可较不频繁地施用。应了解：可使用同一施用途径或不同施用途径来施用抗Aβ抗体及其它药剂。
″生物样品″涵盖多种自个体获得的样品类型且可用于诊断或监测检验。该定义涵盖生物源的血液及其它液体样品、固体组织样品，例如活组织检查样品或组织培养物或由此衍生的细胞及其子代。该定义亦包括在取得其之后以任何方式操作的样品，例如通过以试剂处理、溶解或某些组份(例如蛋白质或多核苷酸)的富集或包埋于半固体或固体基质中以达成切片目的。术语″生物样品″涵盖临床样品，且亦包括培养物中的细胞、细胞上清液、细胞溶胞物、血清、血浆、生物流体及组织样品。
″个体″(或者称为″受检者″)为哺乳动物，更优选为人类。哺乳动物亦包括但不限于农畜(例如牛)、体育动物、宠物(例如猫、狗、马)、灵长类动物、小鼠及大鼠。
如本文中所用，″载体″指能够在宿主细胞中递送且优选能够表达一或多种所关注基因或序列的构建体。载体的实例包括但不限于：病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂相关的DNA或RNA表达载体、囊封于脂质粒中的DNA或RNA表达载体，及某些真核细胞，例如生产细胞。
如本文中所用地，″表达控制序列″意指指导核酸转录的核酸序列。表达控制序列可以是，例如，组成性或诱导性启动子的启动子，或增强子。表达控制序列与待转录的核酸序列可操作地连接。
如本文中所用，″医药学上可接受的载剂″包括：当与活性成份组合时使该成份保持生物活性且对个体的免疫系统为非反应性的任何物质。实例包括但不限于标准医药载剂中的任一种，例如磷酸盐缓冲生理食盐水溶液、水、例如油/水乳液的乳液及多种类型的湿润剂。用于喷雾剂或非经肠施用的优选稀释剂为磷酸盐缓冲生理食盐水或生理(0.9％)食盐水。通过公知公知方法来调配包含此类载剂的组合物(例如参见Remington′sPharmaceutical Sciences，第18版，A.Gennaro编，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990；及Remington，The Science and Practice of Pharmacy第20版，Mack Publishing，2000)。
如本文中所用的术语″kon″意指抗体与抗原缔合的缔合速率常数(on rateconstant)。
如本文中所用的术语″koff″意指抗体自抗体/抗原复合物解离的解离速率常数(off rate constant)。
如本文中所用的术语″KD″意指抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。
组合物及组合物的制造方法
抗Aβ抗体及多肽：
I.抗体9TL及9TL衍生抗体及多肽
本发明涵盖组合物，包括医药组合物，其包含抗体9TL及表3中所示的其变异体或衍生自抗体9TL及表3中所示的其变异体的多肽；及包含编码9TL抗体及其变异体或多肽的序列的多核苷酸。如本文中所用，组合物包含一或多种与Aβ1-40的C末端结合的抗体或多肽(其可为或可不为抗体)和/或一或多种包含编码一或多种与Aβ1-40的C末端结合的抗体或多肽的序列的多核苷酸。此类组合物可另外包含合适赋形剂，例如医药学上可接受的赋形剂，包括缓冲剂，其在本领域中是公知的。
本发明的抗体及多肽特征在于以下特征中的任一种(一种或多种)：(a)与Aβ1-40的C末端肽28-40结合，但并不显著与Aβ1-42或Aβ1-43结合；(b)与Aβ1- 40的C末端肽33-40结合；(c)抑制在个体中形成类淀粉斑；(d)减少个体眼睛中的类淀粉斑；(e)治疗、预防、改善一或多种眼科疾病症状，该眼科疾病包括但不限于年龄相关黄斑退化(干型及湿型)、青光眼、糖尿病性视网膜病变(包括黄斑水肿)及其它相关视网膜退化性疾病；(f)产生视网膜功能的显著保护或恢复；及(g)产生视敏度的显著保持或复原。
与其它所报导的抗Aβ抗体相反，本发明的抗体及多肽还可展现想要的安全性。
因此，本发明提供以下各物中的任一种，或包含以下各物中的任一种的组合物(包括医药组合物)：(a)抗体9TL或表3中所示的其变异体；(b)抗体9TL或表3中所示的其变异体的片段或区域；(c)抗体9TL或表3中所示的其变异体的轻链；(d)抗体9TL或表3中所示的其变异体的重链；(e)来自抗体9TL或表3中所示的其变异体的轻链和/或重链的一或多个可变区；(f)抗体9TL或表3中所示的其变异体的一或多个CDR(一、二、三、四、五或六个CDR)；(g)来自抗体9TL的重链的CDR H3；(h)来自抗体9TL或表3中所示的其变异体的轻链的CDR L3；(i)来自抗体9TL或表3中所示的其变异体的轻链的三个CDR；(i)来自抗体9TL或表3中所示的其变异体的重链的三个CDR；(k)来自抗体9TL或表3中所示的其变异体的轻链的三个CDR及来自抗体9TL或表3中所示的其变异体的重链的三个CDR；及(l)包含(b)至(k)中的任一种的抗体。本发明还提供了包含以上各物中的任何一种或多种的多肽。
图1中图解性地示出了抗体9TL(包括Chothia及Kabat CDR)的CDR部分。CDR区域的测定系是本领域内公知的。应当了解：在一些实施方式中，CDR可以是Kabat与Chothia CDR的组合(亦称为″组合CDR″或″扩展CDR″)。在一些实施方式中，CDR为Kabat CDR。在其它实施方式中，CDR为Chothia CDR。换言之，在具有一种以上CDR的实施方式中，CDR可为Kabat、Chothia、组合CDR或其组合中的任一种。
在一些实施方式中，本发明提供了下述多肽(其可为或可不为抗体)，其包含基本上与9TL或表3中所示的其变异体的至少一个CDR、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或所有六个CDR一致的至少一个CDR、至少两个、至少三个或至少四个、至少五个或所有六个CDR。其它实施方式包括具有基本上与9TL的至少两个、三个、四个、五个或六个CDR一致或衍生自9TL的至少两个、三个、四个、五个或六个CDR的抗体。在一些实施方式中，该至少一个、二个、三个、四个、五个或六个CDR与9TL或表3中所示的其变异体的至少一个、二个、三个、四个、五个或六个CDR至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致。应了解，为达成本发明的目的，尽管活性程度与9TL或表3中所示的其变异体相比可改变(可更大或更小)，但结合特异性和/或总体活性一般得以保持。
本发明还提供了下述多肽(其可为或可不为抗体)，其包含9TL或表3中所示的其变异体的氨基酸序列，该氨基酸序列具有以下各物中的任一种：9TL或表3中所示的其变异体的序列的至少5个邻接氨基酸、至少8个邻接氨基酸、至少约10个邻接氨基酸、至少约15个邻接氨基酸、至少约20个邻接氨基酸、至少约25个邻接氨基酸、至少约30个邻接氨基酸，其中此类氨基酸中的至少3者来自9TL(图1)或表3中所示的其变异体的可变区。在一种实施方式中，可变区是来自9TL的轻链。在另一种实施方式中，可变区来自9TL的重链。示例性多肽具有来自9TL的重链及轻链可变区的邻接氨基酸(上述长度)。在另一种实施方式中，5个(或5个以上)邻接氨基酸来自图1中所示的9TL的互补决定区(CDR)。在一些实施方式中，邻接氨基酸来自9TL的可变区。
II.抗体6G及6G衍生抗体及多肽
本发明另外还提供了治疗眼科疾病的方法，其包含施用与Aβ1-40、Aβ1- 42及Aβ1-43结合的抗体或多肽。在一些实施方式中，抗体或多肽以比其与Aβ1-42及Aβ1-43结合更高的亲和性与Aβ1-40结合。在一些实施方式中，抗体与Aβ1-36、Aβ1-37、Aβ1-38及Aβ1-39结合。在一些实施方式中，抗体与Aβ22-35结合。在一些实施方式中，抗体与Aβ28-40结合。在一些实施方式中，抗体或多肽与包括氨基酸25-34及40的Aβ1-40上的表位结合。
本发明还提供了治疗眼科疾病的方法，其包含施用下述医药组合物，此类医药组合物包含本文所述的抗体或多肽中的任一种(例如抗体6G及表8中所示的其变异体或衍生自抗体6G及表8中所示的其变异体的多肽)；或本文所述的多核苷酸。如本文中所用，组合物包含一或多种与Aβ1-40的C末端结合的抗体或多肽(其可为或可不为抗体)和/或一或多种包含编码一或多种与Aβ1-40的C末端结合的抗体或多肽的序列的多核苷酸。此类组合物可另外包含合适赋形剂，例如医药学上可接受的赋形剂，包括缓冲剂，其在本领域中是公知的。
本发明的抗体及多肽特征在于以下特征中的任一种(一种或多种)：(a)与Aβ1-40、Aβ1-42及Aβ1-43结合；(b)与Aβ1-40、Aβ1-42及Aβ1-43结合，其中与Aβ1- 40结合的亲和性高于与Aβ1-42及Aβ1-43结合的亲和性；(c)与包括氨基酸25-34及40的Aβ1-4()上的表位结合；(d)与Aβ1-36、Aβ1-37、Aβ1-38及Aβ1-39结合，但与其与Aβ1-40的结合相比具有较低亲和性；(e)以小于约1μM的KD与Aβ22-37结合；(f)与Aβ22-35结合；(g)与Aβ28-40结合；(h)并不与表达于细胞中的APP结合；(i)减少个体眼睛中的类淀粉斑；(j)治疗、预防、改善一或多种下述眼科疾病症状，所述眼科疾病包括但不限于年龄相关黄斑退化(干型及湿型)、青光眼、糖尿病性视网膜病变(包括黄斑水肿)及其它相关视网膜退化性疾病；(k)产生视网膜功能的显著保护或恢复；及(l)产生视敏度的显著保持或复原。本发明的抗体及多肽还可具有本文所述的受损的效应器功能。与其它报导过的抗Aβ抗体相比，具有受损的效应器功能的抗体及多肽可展现出想要的安全性。举例而言，本发明的组合物可能不引起显著或不可接受水准的以下各项中的任何一种或多种：脑维管结构中出血(脑出血)；脑膜脑炎(包括变换磁共振扫描)；脑脊髓液中白血球计数升高；中枢神经系统炎症。
因此，本发明提供以下各物中的任一种，或包含以下各物中的任一种的组合物(包括医药组合物)：(a)抗体6G或表8中所示的其变异体；(b)抗体6G或表8中所示的其变异体的片段或区域；(c)抗体6G或表8中所示的其变异体的轻链；(d)抗体6G或表8中所示的其变异体的重链；(e)来自抗体6G或表8中所示的其变异体的轻链和/或重链的一或多个可变区；(f)抗体6G或表8中所示的其变异体的一或多个CDR(一、二、三、四、五或六个CDR)；(g)来自抗体6G的重链的CDR H3；(h)来自抗体6G或表8中所示的其变异体的轻链的CDR L3；(i)来自抗体6G或表8中所示的其变异体的轻链的三个CDR；(j)来自抗体6G或表8中所示的其变异体的重链的三个CDR；(k)来自抗体6G或表8中所示的其变异体的轻链的三个CDR及来自抗体6G或表8中所示的其变异体的重链的三个CDR；及(l)包含(b)至(k)中的任一种的抗体。本发明亦提供包含以上各物中的任何一种或多种的多肽。
图8中图解性地示出了抗体6G(包括Chothia及Kabat CDR)的CDR部分。CDR区域的测定系是本领域公知的。
在一些实施方式中，本发明提供了一种下述多肽(其可为或可不为抗体)，其包含基本上与6G或表8中所示的其变异体的至少一个CDR、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或所有六个CDR一致的至少一个CDR、至少两个、至少三个或至少四个、至少五个或所有六个CDR。其它一些实施方式包括具有基本上与6G的至少两个、三个、四个、五个或六个CDR一致或衍生自6G的至少两个、三个、四个、五个或六个CDR的抗体。在一些实施方式中，该至少一个、二个、三个、四个、五个或六个CDR与6G或表8中所示的其变异体的至少一个、二个、三个、四个、五个或六个CDR至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致。应了解，为达成本发明的目的，尽管活性程度与6G或表8中所示的其变异体相比可改变(可更大或更小)，但结合特异性和/或总体活性一般得以保持。
本发明还提供了下述多肽(其可为或可不为抗体)，其包含6G或表8中所示的其变异体的氨基酸序列，该氨基酸序列具有以下各物中的任一种：6G或表8中所示的其变异体的序列的至少5个邻接氨基酸、至少8个邻接氨基酸、至少约10个邻接氨基酸、至少约15个邻接氨基酸、至少约20个邻接氨基酸、至少约25个邻接氨基酸、至少约30个邻接氨基酸，其中此类氨基酸中的至少3者来自6G(图8)或表8中所示的其变异体的可变区。在一种实施方式中，可变区来自6G的轻链。在另一种实施方式中，可变区来自6G的重链。示例性多肽具有来自6G的重链及轻链可变区的邻接氨基酸(上述长度)。在另一种实施方式中，5个(或5个以上)邻接氨基酸来自图8中所示的6G的互补决定区(CDR)。在一些实施方式中，邻接氨基酸来自6G的可变区。
如下文所述的示例性实施方式，本发明的抗体及多肽的结合亲和性可变化，其不需为(但可为)一个特定值或范围。本发明的抗体及多肽对Aβ肽(包括或Aβ1-40、Aβ1-42或Aβ1-43肽)的结合亲和性(KD)可为约0.10nM至约0.80nM，约0.15nM至约0.75nM及约0.18nM至约0.72nM。在一些实施方式中，结合亲和性为约2pM、约5pM、约10pM、约15pM、约20pM、约40pM或大于约40pM。在一个实施方式中，结合亲和性在约2pM与22pM的间。在其它实施方式中，结合亲和性小于约10nM、约5nM、约1nM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约400pM、约300pM、约200pM、约150pM、约100pM、约90pM、约80pM、约70pM、约60pM、约50pM、约40pM、约30pM、约10pM。在一些实施方式中，结合亲和性为约10nM。在其它实施方式中，结合亲和性小于约10nM、小于约50nM、小于约100nM、小于约150nM、小于约200nM、小于约250nM、小于约500nM或小于约1000nM。在其它实施方式中，结合亲和性小于约5nM。在其它实施方式中，结合亲和性小于约1nM。在其它实施方式中，结合亲和性为约0.1nM或约0.07nM。在其它实施方式中，结合亲和性小于约0.1nM或小于约0.07nM。在其它实施方式中，结合亲和性为约10nM、约5nM、约1nM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约400pM、约300pM、约200pM、约150pM、约100pM、约90pM、约80pM、约70pM、约60pM、约50pM、约40pM、约30pM、约10pM中的任一种至约2pM、约5pM、约10pM、约15pM、约20pM或约40pM中的任一种。在一些实施方式中，结合亲和性为约10nM、约5nM、约1nM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约400pM、约300pM、约200pM、约150pM、约100pM、约90pM、约80pM、约70pM、约60pM、约50pM、约40pM、约30pM、约10pM中的任一种。在其它实施方式中，结合亲和性为约2pM、约5pM、约10pM、约15pM、约20pM、约40pM或大于约40pM。本发明的抗体或多肽可与Aβ1- 40、Aβ1-42和/或Aβ1-42肽的组合结合。在一个实施方式中，抗体或多肽与至少Aβ1-40及Aβ1-42肽结合。
本发明的抗体及多肽还可与Aβ1-36、Aβ1-37、Aβ1-38、Aβ1-39、Aβ1-42及Aβ1-43中的任何一种或多种结合，但在一些实施方式中，对此类肽中的任何一种或多种的结合亲和性小于其对Aβ31-40的结合亲和性。在一些实施方式中，抗体或多肽与Aβ1-36、Aβ1-37、Aβ1-38、Aβ1-39、Aβ1-42及Aβ1-43中的任何一种或多种的KD为与Aβ1-40的KD的至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约80倍、至少约100倍、至少约150倍、至少约200倍或至少约250倍。
本发明还提供了制造此类抗体或多肽中的任一种的方法。可通过本领域中已知的程序来制造本发明的抗体。可通过抗体的蛋白水解或其它降解、通过如上所述的重组方法(即单一或融合多肽)或通过化学合成来制造多肽。通过化学合成便利地制得抗体的多肽，尤其至多约50个氨基酸的较短多肽。化学合成方法是本领域已知的，并且可商业获得。举例而言，通过采用固相方法的自动化多肽合成仪可制造抗体。还参见美国专利第5,807,715号；第4,816,567号；及第6,331,415号。
在另一替代方法中，可使用本领域中公知的程序以重组方式制得抗体。在一种实施方式中，多核苷酸包含编码抗体的重链和/或轻链可变区的序列。在另一种实施方式中，将包含核苷酸序列的多核苷酸克隆进一或多个用于表达或繁殖的载体中。可将编码所关注抗体的序列保持于宿主细胞中的载体中，接着将宿主细胞扩展且冷冻，以备后用。本文进一步描述了载体(包括表达载体)及宿主细胞。
本发明还涵盖本发明的抗体(例如9TL及6G)的单链可变区片段(″scFv″)。通过使用短连接肽来连接轻链和/或重链可变区，从而制得单链可变区片段。Bird等人(1988)Science242：423-426。连接肽的实例为(GGGGS)3，其桥接一可变区的羧基末端与另一可变区的胺基末端的间约3.5nm。已设计且使用其它序列的连接子。Bird等人(1988)。连接子可又经修饰以获其它功能，例如药物附接或附接于固体支撑物。可以重组或合成方式制造单链变异体。为合成制造scFv，可使用自动合成仪。为重组制造scFv，可将含有编码scFv的多核苷酸的合适质粒引入合适宿主细胞中，该宿主细胞可为真核的，例如酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞；或为原核的，例如大肠杆菌(E.coli)。可通过例如多核苷酸连接反应的常规操作来制得编码所关注的scFv的多核苷酸。可使用本领域中已知的标准蛋白质纯化技术来分离得到的scFv。
本发明还涵盖其它形式的单链抗体，例如双功能抗体。双功能抗体是二价、双特异性抗体，其中，VH及VL域表达于单一多肽链上，但使用过短而无法使同一链上的两个结构域之间成对的连接子，由此使得所述结构域与另一链的互补结构域成对，且产生两个抗原结合位点(例如参见Holliger，P.等人(1993)Proc.Natl.Acad Sci.USA90：6444-6448；Poljak，R.J.等人(1994)Structure2：1121-1123)。
举例而言，可使用本文中所公开的抗体来制备双特异性抗体(对至少两种不同抗原(即Aβ1-40及Aβ1-42)具有结合特异性的单克隆抗体)。本领域中已知制造双特异性抗体的方法(例如参加Suresh等人，1986，Methods inEnzymology121：210)。传统上，重组制造双特异性抗体系基于两个免疫球蛋白重链-轻链对(其中两个重链具有不同特异性)的共表达(Millstein及Cuello，1983，Nature305，537-539)。
根据一种制造双特异性抗体的方法，将具有所需结合特异性(抗体-抗原组合位点)的抗体可变结构域与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。优选与包含铰链区、CH2及CH3区中的至少部分的免疫球蛋白重链恒定结构域融合。其优选具有含有轻链缀合所必需的位点(存在于融合中的至少一种中)的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合及(若需要)免疫球蛋白轻链的DNA插入独立表达载体中且共转染于合适宿主生物体中。在该构建中所使用的三个多肽链的不等比率提供最适产率的实施方式中，此举提供调节三个多肽片段的相互比例的高灵活性。然而，当等比率的至少两个多肽链的表达产生高产率时或当比率不具有特定重要性时，可能在一表达载体中插入两个或所有三个多肽链的编码序列。
在一种方法中，双特异性抗体包含在一条臂中具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，及在另一条臂中的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)。在仅一半双特异性分子中具有免疫球蛋白轻链的此不对称结构促进所需双特异性化合物与非所需免疫球蛋白链组合的分离。在1994年3月3日公开的PCT公开文本第WO94/04690号中描述了此方法。
包含两个共价连接抗体的异源缀合抗体也在本发明的范畴内。此类抗体已用于使免疫系统细胞靶向非所需细胞(美国专利第4,676,980号)，且用于治疗HIV感染(PCT申请公开文本第WO9I/00360号及第WO92/200373号；EP03089)。可使用任何便利的交联方法来制造异源缀合抗体。合适的交联剂及技术在本领域中是公知的，其被描述于美国专利第4,676,980号中。
还可使用合成蛋白质化学的已知方法(包括涉及交联剂的方法)来体外制备嵌合或杂合抗体。举例而言，可使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键构建免疫毒素。用于此目的的合适试剂的实例包括亚胺基硫醇盐及甲基-4-巯基丁酸酰亚胺酯。
可使用本领域中已知的任何方法来制造包含抗体9TL的一或多个CDR或衍生自抗体9TL的一或多个CDR的人化抗体。举例而言，可用四个通用步骤，将单克隆抗体人化。这些步骤为：(1)测定起始抗体轻链及重链可变结构域的核苷酸及预测氨基酸序列，(2)设计人化抗体，即决定在人化过程期间使用何种抗体框架区，(3)实际的人化方法/技术，及(4)人化抗体的转染及表达。例如参见美国专利第4,816,567号；第5,807,715号；第5,866,692号；第6,331,415号；第5,530,101号；第5,693,761号；第5,693,762号；第5,585,089号；第6,180,370号；第5,225,539号；第6,548,640号。
在重组人化抗体中，可修饰Fc部分，以避免与Fcγ受体及补体免疫系统相互作用。此类型的修饰由Cambridge University的Department of Pathology的Mike Clark博士设计，且在1999年11月18日公开的WO99/58572中描述过制备此类抗体的技术。
举例而言，若将抗体用于人类的临床试验及治疗，则可将恒定区设计为更类似于人类恒定区以避免免疫应答。例如参见美国专利第5,997,867号及第5,866,692号。
本发明涵盖对抗体9TL及6G的修饰，包括并不显著影响其特性的功能等同抗体及具有增强或减小活性和/或亲和性的变异体。举例而言，抗体9TL或6G的氨基酸序列可经突变，以获得对靶标Aβ肽具有所需结合亲和性的抗体。多肽修饰为本领域中的常规实践，无需在本文中详细描述。将多肽修饰示例于实例中。经修饰多肽的实例包括具有氨基酸残基保守性取代的多肽、并不显著不利地改变功能活性的一或多个缺失或添加氨基酸或使用化学类似物。
氨基酸序列插入包括长度范围介于一个残基至含有一百个或更多残基的多肽之间的氨基末端和/或羧基末端融合以及单一或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫胺酰基残基的抗体或与表位标签融合的抗体。抗体分子的其它插入变异体包括抗体的N末端或C末端与酶或多肽的融合，其增大抗体的血清半衰期。
取代变异体具有至少一个在所移除抗体分子中的氨基酸残基及插入其位置中的不同残基。虽然最关注的用于取代性诱变的位点包括高变区，但也涵盖FR改变。表1中在标题″保守性取代″下展示保守性取代。如果此类取代引起生物活性改变，则可引入在表1中被称为″示例性取代″或如下文参考氨基酸分类进一步描述的更实质性变化，并且对产物加以筛选。
表1：氨基酸取代
通过选择对维持以下各者的作用显著不同的取代来实现抗体的生物特性的实质性修饰：(a)取代区域内的多肽主链结构，例如呈片状或螺旋构型，(b)靶标位点处的分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的堆积。基于常见侧链特性，将天然存在的残基分组：
(1)非极性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)不带电的极性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性(带负电荷)：Asp、Glu；
(4)碱性(带正电荷)：Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；及
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe、His。
通过将此类类别中一种的成员交换为另一类别来达成非保守性取代。
任何不涉及保持抗体的适当构型的半胱氨酸残基通常还可被丝氨酸取代，以改良分子的氧化稳定性且防止异常交联。相反地，可将半胱氨酸键添加至抗体中以改良其稳定性，尤其当抗体为例如Fv片段的抗体片段时。
氨基酸修饰可介于改变或修饰一或多种氨基酸至完全重设计例如可变区的区域之间。对可变区的改变可改变结合亲和性和/或特异性。在一些实施方式中，在CDR域内达成不多于一至五个保守性氨基酸取代。在其它实施方式中，在CDR域内达成不多于一至三个保守性氨基酸取代。在再其它实施方式中，CDR域为CDR H3和/或CDR L3。
修饰还包括糖基化及非糖基化多肽以及具有其它翻译后修饰的多肽，此类翻译后修饰例如用不同糖的糖基化、乙酰化及磷酸化。抗体系在其恒定区中的保守位置处糖基化(Jefferis及Lund，1997，Chem.Immunol.65：111-128；Wright及Morrison，1997，TibTECH15：26-32)。免疫球蛋白的寡糖侧链影响蛋白质的功能(Boyd等人，1996，Mol.Immunol.32：1311-1318；Wittwe及Howard，1990，Biochem.29：4175-4180)及在糖蛋白部分的间的分子内相互作用(其可影响糖蛋白的构型及所呈现的三维表面)(Hefferis及Lund，同上；Wyss及Wagner，1996，Current Opin.Biotech.7：409-416)。寡糖亦可用以使给定糖蛋白基于特异性识别结构靶向某些分子。亦已报导抗体的糖基化影响抗体依赖细胞毒性(ADCC)。详言的，已报导具有β(1，4)-N-乙酰基葡糖胺基转移酶III(GnTIII)(催化对分GlcNAc的形成的糖基转移酶)的四环素调节表达的CHO细胞改良ADCC活性(Umana等人，1999，Mature Biotech.17：176-180)。
抗体的糖基化通常为N连接型或O连接型。N连接型指将碳水化合物部分附接于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸、天冬酰胺-X-苏氨酸及天冬酰胺-X-半胱氨酸(其中X为除脯氨酸外的任何氨基酸)为用于碳水化合物部分酶促附接于天冬酰胺侧链的识别序列。因此，在多肽中存在此类三肽序列中的任一种，产生潜在糖基化位点。O-连接型糖基化系指糖N-乙酰基半乳胺糖、半乳糖或木糖中的一种附接于羟基氨基酸，最常见为丝氨酸或苏氨酸，尽管也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基离氨酸。
通过改变氨基酸序列使得其含有上述三肽序列中的一种或多种，来便利地实现添加糖基化位点至抗体(针对N连接型糖基化位点)。该改变亦可通过向原始抗体的序列添加一或多个丝氨酸或苏氨酸残基或用一或多个丝氨酸或苏氨酸残基取代来达成(针对O连接型糖基化位点)。
还可在不改变根本核苷酸序列的情况下改变抗体的糖基化模式。糖基化很大程度上视用以表达抗体的宿主细胞而定。因为用于表达重组糖蛋白(例如抗体)作为潜在的治疗剂的细胞类型很少为天然细胞，所以可预计抗体的糖基化模式变化(例如参见Hse等人，1997，J.Biol.Chem.272：9062-9070)。
除宿主细胞选择之外，在抗体重组制造期间影响糖基化的因素包括生长模式、培养基制剂、培养物密度、氧合作用、pH值、纯化方案及其类似因素。已提出各种方法来改变在特定宿主生物体中达成的糖基化模式，其包括引入或过量表达涉入寡糖产生的某些酶(美国专利第5,047,335号；第5,510,261号及第5,278,299号)。可以酶促方式自糖蛋白中移除糖基化或某些类型的糖基化，例如使用内切糖苷酶H(Endo H)、如实例3中所述的N-糖苷酶F、内切糖苷酶F1、内切糖苷酶F2、内切糖苷酶F3来移除。另外，重组宿主细胞可经遗传设计以在加工某些类型的多糖中为有缺陷的。本领域中公知此类及类似技术。
其它修饰方法包括使用本领域中已知的偶合技术，其包括但不限于酶促方式、氧化取代及螯合。例如，为附接标记用于免疫检验，可使用修饰。经修饰9TL的多肽是使用本领域中的已建立程序制得的，且可使用本领域中已知的标准检验来筛选，其中一些在下文及实例中描述。
在本发明的一些实施方式中，抗体包含经经修饰的恒定区，例如免疫上惰性或部分惰性的恒定区，例如并不触发补体介导溶胞、并不刺激抗体依赖细胞介导细胞毒性(ADCC)或并不活化微神经胶质细胞；或在以下各项中的任何一种或多种中具有减小的活性(与未修饰抗体相比)：触发补体介导溶胞、刺激抗体依赖细胞介导细胞毒性(ADCC)或活化微神经胶质细胞。对恒定区的不同修饰可用于达成效应器功能的最佳水准和/或组合。例如参见Morgan等人，Immunology86：319-324(1995)；Lund等人，J.Immunology157：4963-9157：4963-4969(1996)；Idusogie等人，J.Immunology164：4178-4184(2000)；Tao等人，J. Immunology143：2595-2601(1989)；及Jefferis等人，Immunological Reviews163：59-76(1998)。在一些实施方式中，如Eur.J.Immunol.(1999)29：2613-2624；PCT申请案第PCT/GB99/01441号；和/或英国专利申请案第9809951.8号中所述来修饰恒定区。在其它实施方式中，抗体包含人类重链IgG2a恒定区，该恒定区包含以下突变：A330P331至S330S331(参考野生型IgG2a序列的氨基酸编号)。Eur.J.Immunol.(1999)29：2613-2624。在再其它实施方式中，针对N连接糖基化而使恒定区去糖基化。在一些实施方式中，通过使糖基化氨基酸残基突变或侧接作为恒定区中N-糖基化识别序列的部分的残基，从而针对N连接糖基化而使恒定区去糖基化。举例而言，N-糖基化位点N297可突变至A、Q、K或H。参见Tao等人，J. Immunology143：2595-2601(1989)；及Jefferis等人，Immunological Reviews163：59-76(1998)。在一些实施方式中，针对N连接糖基化而使恒定区去糖基化。以酶促方式(例如通过酶PNGase来移除碳水化合物)或通过表达于糖基化缺乏宿主细胞中，从而可针对N连接糖基化而使恒定区去糖基化。
其它抗体修饰包括已如1999年11月18日公开的PCT公开文本第WO99/58572号中所述来修饰的抗体。除针对靶标分子的结合域外，此类抗体包含具有基本上与人类免疫球蛋白重链的恒定结构域的全部或部分同源的氨基酸序列的效应器结构域。此类抗体能够结合靶标分子，而不触发显著补体依赖溶胞，或靶标的细胞介导破坏。在一些实施方式中，效应器结构域能够特异性结合FcRn和/或FcγRIIb。此类者通常系基于衍生自两个或两个以上人类免疫球蛋白重链CH2域的嵌合结构域。以此方式修饰的抗体尤其适用于慢性抗体疗法，以避免对公知抗体疗法的发炎性及其它不利反应。
本发明包括亲和成熟实施方式。举例而言，可通过本领域中已知的程序来制造亲和成熟抗体(Marks等人，1992，Bio/Technology，10：779-783；Barbas等人，1994，Proc Nat.Acad.Sci，USA91：3809-3813；Schier等人，1995，Gene，169：147-155；Yelton等人，1995，J.Immunol.，155：1994-2004；Jackson等人，1995，J.Immunol.，154(7)：3310-9；Hawkins等人，1992，J.Mol.Biol.，226：889-896；及WO2004/058184)。
以下方法可用于调节抗体的亲和性且用于分析CDR。用于分析抗体的CDR和/或改变(例如改良)例如抗体的多肽的结合亲和性的一种方法被称为″文库扫描诱变(library scanning mutagenesis)″。大体而言，文库扫描诱变如下工作。使用本领域认可的方法，将CDR中的一或多个氨基酸位置经两个或两个以上(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)氨基酸置换。由此产生小型克隆文库(在一些实施方式中，对于每个经分析的氨基酸位置为一个)，其各具有两个或两个以上成员的复杂性(complexity)(若两个或两个以上氨基酸在每个位置经取代)。大体而言，该文库还包括包含天然(未经取代)氨基酸的克隆。针对对靶标多肽(或其它结合靶标)的结合亲和性，筛选来自各文库的少量克隆(例如约20-80个克隆(视文库的复杂性而定))，且鉴定具有增大、相同、减小或无结合的候选物。在本领域中公知测定结合亲和性的方法。可使用BIAcore表面等离子体共振分析来测定结合亲和性，该分析检测约2倍或更大的结合亲和性差异。当起始抗体已以相对较高亲和性结合时，例如约10nM或10nM以下的KD，BIAcore尤其适用。在本文实例中描述使用BIAcore表面等离子体共振的筛选。
可使用Kinexa Biocensor、闪烁邻近检验(scintillation proximity assay)、ELISA、ORIGEN免疫检验(IGEN)、萤光猝减、萤光转移和/或酵母展示来测定结合亲和性。还可使用合适生物检验来筛选结合亲和性。
在一些实施方式中，使用本领域认可的诱变方法(其中一些在本文中描述)，用所有20种天然氨基酸置换CDR中的每个氨基酸位置(在一些实施方式中一次一种)。这产生了小型克隆文库(在一些实施方式中，对于每个经分析的氨基酸位置为一个)，其各具有20个成员的复杂性(若所有20个氨基酸均在每个位置经取代)。
在一些实施方式中，待筛选的文库包含在两个或两个以上位置的取代，其可在同一CDR中或在两个或两个以上CDR中。因此，文库可包含在一个CDR中的两个或两个以上位置的取代。文库可包含在两个或两个以上CDR中的两个或两个以上位置的取代。文库可包含在3、4、5个或5个以上位置的取代，此类位置见于二、三、四、五或六个CDR中。可使用低冗余密码子来制备取代。例如参见Balint等人，(1993)Gene137(1)：109-18)的表2。
CDR可为CDRH3和/或CDRL3。CDR可为CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2和/或CDRH3中一种或多种。CDR可为Kabat CDR、Chothia CDR或扩展CDR。
可对具有改良结合的候选物测序，由此鉴定引起改良亲和性(亦称为″改良″取代)的CDR取代突变体。还可对结合的候选物测序，由此鉴定保持结合的CDR取代。
可进行多轮筛选。举例而言，具有改良结合的候选物(各包含在一或多个CDR的一或多个位置的氨基酸取代)也可用于设计在各改良CDR位置(亦即，CDR中的氨基酸位置，于此处取代突变体展示改良的结合)含有至少原始及经取代氨基酸的第二文库。下文进一步讨论对此文库的制备及筛选或选择。
文库扫描诱变也提供了分析CDR的方式，至于具有改良结合、相同结合、减小结合或无结合的克隆的频率还提供了与各氨基酸位置对抗体-抗原复合物稳定性的重要性有关的信息。举例而言，若CDR的位置在改变为所有20个氨基酸时保持结合，则将该位置鉴定为不太可能为抗原结合所需的位置。相反地，若CDR的位置在仅小百分比的取代中保持结合，则将该位置鉴定为对CDR功能重要的位置。因此，文库扫描诱变方法产生了CDR中可改变为多种不同氨基酸(包括所有20种氨基酸)的位置及CDR中不能改变或仅能改变为少数氨基酸的位置的信息。
具有改良亲和性的候选物可在第二文库中组合，这视所需文库的复杂性而定，其包括在该位置的改良氨基酸、原始氨基酸，且可另外包括在该位置的其它取代，或允许使用所需筛选或选择方法。另外，若需要，则相邻氨基酸位置可对至少两种或两种以上氨基酸随机化。相邻氨基酸的随机化可允许突变CDR中的额外构型灵活性，其可又允许或促进引入较大数目的改良突变。文库还可包含在第一轮筛选中并不展示改良亲和性的位置的取代。
使用本领域中已知的任何方法，包括使用BIAcore表面等离子体共振分析的筛选及使用在选择技术中已知的任何方法(包括噬菌体展示、酵母展示及核糖体展示)的选择，针对具有改良和/或改变结合亲和性的文库成员，对第二文库加以筛选或选择。
本发明还涵盖包含来自本发明的抗体(例如9TL及6G)或多肽的一或多个片段或区域的融合蛋白。在一种实施方式中，提供了下述融合多肽，其包含可变轻链区的至少10个邻接氨基酸和/或所示可变重链区的至少10个氨基酸。在其它实施方式中，提供了下述融合多肽，其包含可变轻链区的至少约10个、至少约15个、至少约20个、至少约25个或至少约30个邻接氨基酸；和/或可变重链区的至少约10个、至少约15个、至少约20个、至少约25个或至少约30个邻接氨基酸。在另一种实施方式中，融合多肽包含9TL或6G的轻链可变区和/或重链可变区。在另一种实施方式中，融合多肽包含9TL或6G的一或多个CDR。在再其它实施方式中，融合多肽包含抗体9TL或6G的CDR H3和/或CDR L3。为达成本发明的目的，9TL或6G融合蛋白分别含有一或多个9TL或6G抗体，及在天然分子中不附接于其的另一氨基酸序列，例如来自另一区域的异源序列或同源序列。示例性异源序列包括但不限于″标签″，例如FLAG标签或6His标签。标签在本领域中是公知的。
可通过本领域中已知的方法，例如以合成或重组方式来产生融合多肽。尽管本发明的融合蛋白也可通过本领域中已知的其它方式来制备，例如包括化学合成，但通常使用本文所述的重组方法，通过制备表达编码其的多核苷酸来制造本发明的融合蛋白。
本发明还提供了包含与促进与固体支撑物偶合的药剂(例如生物素或抗生物素蛋白)缀合(例如连接)的抗体或多肽的组合物。为简单起见，通常针对抗体提及，但应了解：此类方法适用于本文所述的Aβ结合实施方式中的任一种。缀合通常指如本文中所述连接此类组份。可在任何多种方法中达成连接(其一般为以邻近缔合方式将此类组份固定至少以便施用)。举例而言，当每种具有能够与另一种反应的取代基时，在药剂与抗体的间的直接反应为可能的。举例而言，例如氨基或巯基的亲核基团一方面可能够与例如酐或酰基卤的含羰基基团反应或另一方面可能够与含有良好离去基团(例如卤基)的烷基反应。
本发明的抗体或多肽可与标记剂(或者称为″标记″)连接，此类标记例如萤光分子、放射性分子的或本领域中已知的任何其它标记。标记在本领域中是已知的，其一般(直接或间接)提供信号。
本发明还提供了组合物(包括医药组合物)及试剂盒，其包含抗体9TL或6G，及如本公开文本所阐明的本文所述的任何或所有抗体和/或多肽。
具有受损的效应器功能的抗Aβ肽抗体及多肽
本发明的方法使用与β-类淀粉(Aβ)肽特异性结合且具有受损的效应器功能的抗体或多肽(包括包含此类抗体或多肽的医药组合物)。此类抗体及多肽的其它特征在于以下特征中的任一种(一种或多种)：(a)抑制在个体中形成类淀粉斑；(b)减少个体眼睛中的类淀粉斑；(c)治疗、预防、改善一或多种眼科疾病症状，该眼科疾病包括但不限于年龄相关黄斑退化(干型及湿型)、青光眼、糖尿病性视网膜病变(包括黄斑水肿)及其它相关视网膜退化性疾病；(d)产生视网膜功能的显著保护或恢复；及(e)产生视敏度的显著保持或复原。
本文所述的抗体及多肽可展现想要的安全性，举例而言，本发明的组合物并不引起显著或不可接受水准或具有减小水准的以下各项中的任何一种或多种：脑维管结构中出血(脑出血)；脑膜脑炎(包括变换磁共振扫描)；脑脊髓液中白血球计数升高；中枢神经系统炎症。
如本文中所用，具有″受损的效应器功能″(与″免疫上惰性″或″部分免疫上惰性″可互换使用)的抗体或多肽指并不具有任何效应器功能或具有减小效应器功能活性(与具有未修饰或天然存在恒定区的抗体或多肽相比)的抗体或多肽，例如其在以下各项的任何一种或多种中不具有活性或具有减小的活性：a)触发补体介导溶胞；b)刺激抗体依赖细胞介导细胞毒性(ADCC)；及c)活化微神经胶质细胞。效应器功能活性可减少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％及100％中的任一种。在一些实施方式中，抗体与β-类淀粉肽结合，而不触发显著补体依赖溶胞，或靶标的细胞介导破坏。举例而言，恒定区上的Fc受体结合位点可经修饰或突变以移除或减小对某些Fc受体(例如cγRI、FcγRII和/或FcγRIII)的结合亲和性。为简单起见，针对抗体而提及，但是应了解该实施方式也适用于多肽。用EU编号系统(Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest；第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealthy，Bethesda，Md.，1991)来指示(例如IgG抗体的)恒定区的哪个氨基酸残基是经改变或突变的。该编号可用于特定类型的抗体(例如IgG1)或物种(例如人类)，但应了解，可横跨各类型的抗体及物种达成类似改变。
在一些实施方式中，与Aβ肽特异性结合的抗体包含具有受损的效应器功能的重链恒定区。重链恒定区可具有天然存在的序列或为变异体。在一些实施方式中，天然存在的重链恒定区的氨基酸序列是经突变的，例如通过氨基酸取代、插入和/或缺失来突变，由此削弱恒定区的效应器功能。在一些实施方式中，重链恒定区的Fc区的N-糖基化也可改变，例如可完全或部分移除，由此削弱恒定区的效应器功能。
在一些实施方式中，通过移除抗Aβ肽的Fc区(例如在IgG的CH2域中)的N-糖基化来受损的效应器功能。在一些实施方式中，通过使糖基化氨基酸残基突变或侧接作为恒定区中糖基化识别序列的部分的残基来移除Fc区的N-糖基化。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸(N-X-S)、天冬酰胺-X-苏氨酸(N-X-T)及天冬酰胺-X-半胱氨酸(N-X-C)(其中X为除脯氨酸外的任何氨基酸)为用于碳水化合物部分酶促附接于天冬酰胺侧链以达成N-糖基化的识别序列。恒定区中三肽序列中氨基酸中的任一种的突变产生糖基化IgG。举例而言，人类IgG1及IgG3的N-糖基化位点N297可突变为A、D、Q、K或H。参见Tao等人，J. Immunology143：2595-2601(1989)；及Jefferis等人，Immunological Reviews163：59-76(1998)。已报导具有以Gln、His或Lys取代Asn-297的人类IgG1及IgG3并不与人类FcγRI结合且并不活化补体，其中C1q结合能力对IgG1而言完全丧失且对于IgG3而言显著减小。在一些实施方式中，三肽序列中氨基酸N突变为以下氨基酸中的任一种：A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、Y。在一些实施方式中，三肽序列中氨基酸N突变为保守性取代。在一些实施方式中，三肽序列中氨基酸X突变为脯氨酸。在一些实施方式中，三肽序列中氨基酸S突变为A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、V、W、Y。在一些实施方式中，三肽序列中氨基酸T突变为A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、V、W、Y。在一些实施方式中，三肽序列中氨基酸C突变为A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、V、W、Y。在一些实施方式中，三肽后的氨基酸突变为P。在一些实施方式中，以酶促方式(例如，如实例3中所述的N-糖苷酶F、内切糖苷酶F1、内切糖苷酶F2、内切糖苷酶F3及内切糖苷酶H)移除恒定区中的N-糖基化。亦可通过在具有N-糖基化缺乏的细胞株中产生抗体来达成N-糖基化的移除。Wright等人，J Immunol.160(7)：3393-402(1998)。
在一些实施方式中，与附接于恒定区的N-糖基化位点的寡糖相互作用的氨基酸残基经突变，以减小对FcγRI的结合亲和性。举例而言，可将人类IgG3的F241、V264、D265突变。参见Lund等人，J. Immunology157：4963-4969(1996)。
在一些实施方式中，通过如PCT WO99/58572及Armour等人，Molecular Immunology40：585-593(2003)；Reddy等人，J. Immunology164：1925-1933(2000)中所述修饰区域(例如人类IgG的233-236、297和/或327-331)，来使得效应器功能受损。除针对靶标分子的结合域外，PCTWO99/58572及Armour等人所述的抗体包含具有基本上与人类免疫球蛋白重链的恒定区的全部或部分同源的氨基酸序列的效应器结构域。此类抗体能够结合靶标分子，而不触发显著补体依赖溶胞，或靶标的细胞介导破坏。在一些实施方式中，效应器结构域对FcγRI、FcγRIIa及FcγRIII具有减小的亲和性。在一些实施方式中，效应器结构域能够特异性结合FcRn和/或FcγRIIb。此类者通常系基于衍生自两个或两个以上人类免疫球蛋白重链CH2域的嵌合域。以此方式修饰的抗体尤其适用于慢性抗体疗法以避免对公知抗体疗法的发炎性及其它不利反应。在一些实施方式中，抗体的重链恒定区为具有以下突变中的任一种的人类重链IgG1：1)A327A330P331至G327S330S331；2)E233L234L235G236至P233V234A235，其中G236缺失；3)E233L234L235至P233V234A235；4)E233L234L235G236A327A330P331至P233V234A235G327S330S331，其中G236缺失；5)E233L234L235A327A330P331至P233V234A235G327S330S331；及6)N297至A297或除N外的任何其它氨基酸。在一些实施方式中，抗体的重链恒定区为具有以下突变的人类重链IgG2：A330P331至S330S331。在一些实施方式中，抗体的重链恒定区为具有以下突变中的任一种的人类重链IgG4：E233F234L235G236至P233V234A235，其中G236缺失；E233F234L235至P233V234A235；及S228L235至P228E235。
抗体的恒定区亦可经修饰以使得补体活化受损。举例而言，通过使C1结合基元(例如，C1q结合基元)中恒定区中的氨基酸残基突变，在补体的C1组份的结合之后，IgG抗体的补体活化可减少。已报导人类IgG1的D270、K322、P329、P331中的每一种的Ala突变显著减小抗体与C1q结合及活化补体的能力。对于鼠类IgG2b而言，C1q结合基元构成残基E318、K320及K322。Idusogie等人，J. Immunology164：4178-4184(2000)；Duncan等人，Nature322：738-740(1988)。
人们认为，针对鼠类IgG2b而鉴定的C1q结合基元E318、K320及K322对于其它抗体同型而言为常见的。Duncan等人，Nature322：738-740(1988)。通过以在其侧链上具有不适当官能基的残基置换三个指定残基中的任一种，可消除对IgG2b的C1q结合活性。不一定只能用Ala置换离子残基来消除C1q结合。还可能使用其它经烷基取代的非离子残基(例如Gly、Ile、Leu或Val)或例如Phe、Tyr、Trp及Pro的芳族非极性残基来代替三个残基中的任一种以消除C1q结合。另外，还可能使用例如Ser、Thr、Cys及Met的极性非离子残基来代替残基320及322(但不代替318)以消除C1q结合活性。
本发明还提供了具有受损的效应器功能的抗体，其中该抗体具有经修饰铰链区。可通过修饰铰链区，来调节人类IgG对其Fc受体的结合亲和性。Canfield等人，J. Exp.Med.173：1483-1491(1991)；Hezareh等人，J.Virol.75：12161-12168(2001)；Redpath等人，Human Immunology59：720-727(1998)。特异性氨基酸残基可被突变或缺失。经修饰铰链区可包含衍生自与CH1域的类别或亚类不同的抗体类别或亚类的抗体的完整铰链区。举例而言，IgG抗体类别的恒定结构域(CH1)可附接于IgG4抗体类别的铰链区。或者，新铰链区可包含部分天然铰链或重复单元，其中重复的各单元系衍生自天然铰链区。在一些实施方式中，通过将一或多个半胱氨酸残基转化为例如丙氨酸的中性残基或通过将适当置放的残基转化为半胱氨酸残基来改变天然铰链区。美国专利第5,677,425号。使用本领域认可的蛋白质化学且优选使用遗传工程技术及如本文中所述来进行此类改变。
与Aβ肽特异性结合且与具有受损的效应器功能的重链恒定区融合的多肽也可用于本文所述的方法。在一些实施方式中，多肽包含衍生自抗体9TL或表3中所示的其变异体的序列。在一些实施方式中，多肽衍生自与Aβ肽结合的单结构域抗体。可使用本领域中已知的方法产生单结构域抗体。Omidfar等人，Tumour Biol.25：296-305(2004)；Herring等人，Trendsin Biotechnology21：484-489(2003)。
在一些实施方式中，抗体或多肽不是F(ab′)2片段。在一些实施方式中，抗体或多肽不是Fab片段。在一些实施方式中，抗体或多肽不是单链抗体scFv。在一些实施方式中，抗体或多肽是聚乙二醇化F(ab′)2片段。在一些实施方式中，抗体或多肽是聚乙二醇化Fab片段。在一些实施方式中，抗体或多肽是聚乙二醇化单链抗体scFv。
还可使用本领域中已知的制造具有受损的效应器功能的抗体的其它方法。
可在一或多个检验中测试具有经修饰恒定区的抗体及多肽，以评估与起始抗体相比生物活性的效应器功能减小的水平。举例而言，可使用本文中所公开的检验以及任何本领域认可的检验来评定具有经改变Fc区的抗体或多肽结合补体或Fc受体(例如微神经胶质细胞上的Fc受体)或经改变铰链区的能力。PCT WO99/58572；Armour等人，Molecular Immunology40：585-593(2003)；Reddy等人，J.Immunology164：1925-1933(2000)；Song等人，Infection and Immunity70：5177-5184(2002)。
在一些实施方式中，与β类淀粉特异性结合的抗体为多克隆抗体。在一些实施方式中，抗体为单克隆抗体。在一些实施方式中，抗体为人抗体。在一些实施方式中，抗体为嵌合抗体。在一些实施方式中，抗体为人化抗体。在一些实施方式中，抗体为灵长化抗体。例如参见Yocum等人，J.Rheumatol.25：1257-62(1998)；Bugelski等人，Human&ExperimentalToxicoloy19：230-243(2000)。在一些实施方式中，通过突变将抗体去免疫化以使抗体并不活化人类免疫系统。例如参见Nanus等人，J. Urology170：S84-S89(2003)。
如本文中所用地，Aβ肽包括类淀粉前驱蛋白质的酶促分裂产物的任何片段。举例而言，Aβ肽包括Aβ1-40、Aβ1-42或Aβ1-43的任何片段；及经各种数目的氨基酸在Aβ1-40、Aβ1-42或Aβ1-43的N末端或C末端截短的肽。本文中所用的氨基酸编号基于对Aβ1-43(SEQ ID NO：17)的编号。
在一些实施方式中，抗体或多肽与Aβ肽的1-16位残基内的表位特异性结合。在一些实施方式中，抗体或多肽与Aβ肽的16-28位残基内的表位特异性结合。在一些实施方式中，抗体或多肽与Aβ1-40肽的28-40位残基内的表位特异性结合。在一些实施方式中，抗体或多肽与Aβ1-42肽的28-42位残基内的表位特异性结合。在一些实施方式中，抗体或多肽与Aβ1-43肽的28-43位残基内的表位特异性结合。在一些实施方式中，抗体或多肽与Aβ肽特异性结合，而不与全长类淀粉前驱蛋白质(APP)结合。在一些实施方式中，抗体或多肽与Aβ的聚集形式特异性结合，而不与可溶形式结合。在一些实施方式中，抗体或多肽与Aβ的可溶形式特异性结合，而不与聚集形式结合。在一些实施方式中，抗体或多肽与Aβ的聚集形式及可溶形式特异性结合。在本领域中已知与Aβ的各种聚集形式结合的抗体，例如，与类淀粉β衍生可扩散配位体(ADDL)结合的抗体；与类淀粉原纤维和/或沉积物结合的抗体。WO03/104437；美国公开文本第2003/0147887号；美国公开文本第2004/0219146号。
在一些实施方式中，抗体或多肽包含一、二或三个来自3D6免疫球蛋白轻链(美国公开文本第2003/0165496号或第2004/0087777号中的SEQ IDNO：2)的CDR和/或一、二或三个来自3D6免疫球蛋白重链(美国公开文本第2003/0165496号或第2004/0087777号中的SEQ ID NO：4)的CDR。在一些实施方式中，抗体或多肽包含如美国公开文本第2003/0165496号中SEQ IDNO：8中示出的可变重链区及如美国公开文本第2003/0165496号中SEQ IDNO：5中示出的可变轻链区。在一些实施方式中，抗体或多肽包含如美国公开文本第2003/0165496号中SEQ ID NO：12中示出的可变重链区及如美国公开文本第2003/0165496号中SEQ ID NO：11中示出的可变轻链区。在一些实施方式中，抗体或多肽包含一、二或三个来自10D5免疫球蛋白轻链(在美国公开文本第2003/0165496号或第2004/0087777号中的SEQ ID NO：14)的CDR和/或一、二或三个来自10DS免疫球蛋白重链(在美国公开文本第2003/0165496号或第2004/0087777号中的SEQ ID NO：16)的CDR。
在一些实施方式中，抗体或多肽与Aβ1-40的33-40位残基内的表位特异性结合。在一些实施方式中，抗体或多肽与Aβ1-40上包括35-40位氨基酸的表位特异性结合。在一些实施方式中，抗体或多肽与Aβ1-40上包括36-40位氨基酸的表位特异性结合。在一些实施方式中，抗体或多肽与Aβ1-40上包括第39和/或40位氨基酸的表位特异性结合。在一些实施方式中，抗体或多肽与Aβ1-40特异性结合，但并不与Aβ1-42和/或Aβ1-43特异性结合。在一些实施方式中，抗体或多肽为本文所述的抗体9TL或衍生自9TL的抗体或多肽。在一些实施方式中，抗体或多肽竞争地抑制抗体9TL和/或衍生自9TL的抗体或多肽与Aβ1-40的结合。在一些实施方式中，抗体不是PCT WO2004/032868中所述的抗体2286。在其它实施方式中，抗体或多肽是本文所述的抗体6G或衍生自6G的抗体或多肽。在一些实施方式中，抗体或多肽竞争地抑制抗体6G和/或衍生自6G的抗体或多肽与Aβ1-40及Aβ1-42的结合。在一些实施方式中，抗体不是US2004/0146512及WO04/032868中所述的抗体2294。如WO2006118959中所述，抗体2294与极类似于抗体6G的表位结合。
制造抗体及多肽的方法是本领域中已知的，并且在本文中有所描述。
通过识别相同或空间上叠盖的表位，可将竞争检验用以测定两个抗体是否结合同一表位，或一抗体竞争地抑制另一抗体与抗原的结合。此类检验在本领域中是已知的。通常将抗原固定于多孔板上且测量未经标记的抗体阻断经标记的抗体结合的能力。此类竞争检验的常见标记为放射性标记或酶标记。
多核苷酸、载体及宿主细胞
本发明还提供了编码本发明的抗体及多肽(包括包含图1及图8中所示的轻链及重链可变区的多肽序列的抗体)的分离多核苷酸，及包含该多核苷酸的载体及宿主细胞。
因此，本发明提供了下述多核苷酸(或组合物，包括医药组合物)，其包含编码以下各物中的任一种的多核苷酸：(a)抗体9TL或6G或表3及表8中所示的其变异体；(b)抗体9TL或6G或表3及表8中所示的其变异体的片段或区域；(c)抗体9TL或6G或表3及表8中所示的其变异体的轻链；(d)抗体9TL或6G或表3及表8中所示的其变异体的重链；(e)来自抗体9TL或6G或表3及表8中所示的其变异体的轻链和/或重链的一或多个可变区；(f)抗体9TL或6G或表3及表8中所示的其变异体的一或多个CDR(一、二、三、四、五或六个CDR)；(g)来自抗体9TL或6G的重链的CDR H3；(h)来自抗体9TL或6G或表3及表8中所示的其变异体的轻链CDR L3；(i)来自抗体9TL或6G或表3及表8中所示的其变异体的轻链的三个CDR；(j)来自抗体9TL或6G或表3及表8中所示的其变异体的重链的三个CDR；(k)来自抗体9TL或6G或表3及表8中所示的其变异体的轻链的三个CDR及来自抗体9TL或6G或表3及表8中所示的其变异体的重链的三个CDR；及(1)包含(b)至(k)中的任一种的抗体。在一些实施方式中，多核苷酸包含SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：34及SEQ ID NO：35中所示的多核苷酸中的任一种或两者。
在另一方面中，本发明提供了编码本文所述的抗体(包括抗体片断)及多肽(例如具有受损的效应器功能的抗体及多肽)中的任一种的多核苷酸。可通过本领域中已知的程序制造所述多核苷酸。
在另一方面中，本发明提供了下述组合物(例如医药组合物)，其包含本发明的多核苷酸中的任一种。在一些实施方式中，组合物包含表达载体，所述表达载体包含编码如本文中所述的9TL抗体的多核苷酸。在其它实施方式中，组合物包含下述表达载体，所述表达载体包含编码本文所述的抗体或多肽中的任一种的多核苷酸。在再其它一些实施方式中，组合物包含SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10中所示的多核苷酸中的任一种或两者。本文进一步描述了表达载体及多核苷酸组合物的施用。
在另一方面中，本发明提供了制造本文所述的多核苷酸中的任一种的方法。
本发明还涵盖与任何此类序列互补的多核苷酸。多核苷酸可为单链(编码或反义)或双链且可为DNA(染色体组DNA、cDNA或合成DNA)或RNA分子。RNA分子包括含有内含子且以一对一方式对应于DNA分子的HnRNA分子及不含有内含子的mRNA分子。其它编码或非编码序列可(但不必需)存在于本发明的多核苷酸内，且多核苷酸可(但不必需)与其它分子和/或支撑材料连接。
多核苷酸可包含天然序列(亦即编码抗体或其部分的内源序列)或可包含此序列的变异体。多核苷酸变异体含有一或多个取代、添加、缺失和/或插入，使得经编码多肽的免疫应答性相对于天然免疫应答性分子而言并不减小。一般可如本文中所述来评定对经编码多肽的免疫应答性的影响。变异体优选展现与编码天然抗体或其部分的多核苷酸序列至少约70％一致性，更优选至少约80％一致性且最佳至少约90％一致性。
若在如下所述针对最大对应性对齐时，在两条序列中的核苷酸或氨基酸的序列是相同的，则将两挑多核苷酸或多肽序列称为″一致″。通常通过在比较窗口上比较序列，以鉴定和比较序列相似性的局部区域，从而进行两条序列之间的比较。如本文中所用的″比较窗口″指至少约20个邻接位置的区段(通常30至约75个，40至约50个)，其中两个序列经最佳对准之后，序列可与具有相同数目的邻接位置的参考序列相比。
用于比较的序列的最佳对齐可使用生物信息学软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)的Lasergene软件包中的Megalign程序，使用默认参数来进行。此程序体现了以下参考文献中所述的若干对准方案：Dayhoff，M.O.(1978)A model of evolutionary change in proteins-Matrices for detectingdistant relationships。在Dayhoff，M.O.(编)Atlas of Protein Sequence andStructure，National Biomedical Research Foundation，Washington DC第5卷，Suppl.3，第345-358页；Hein J.，1990，Unified Approach to Alignment andPhylogenes，第626-645页；Methods in Enzymology，第183卷，AcademicPress，Inc.，San Diego，CA；Higgins，D.G.及Sharp，P.M.，1989，CABIOS5：151-153；Myers，E.W.及Muller W.，1988，CABIOS4：11-17；Robinson，E.D.，1971，Comb.Theor.11：105；Santou，N.，Nes，M.，1987，Mol.Biol.Evol.4：406-425；Sneath，P.H.A.及Sokal，R.R.，1973，Numerical Taxonomy thePrinciples and Practice of Numerical Taxonomy，Freeman Press，San Francisco，CA；Wilbur，W.J.及Lipman，D.J.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80：726-730中。
优选地，通过在具有至少20个位置的比较窗口上比较两个经最佳对准的序列来测定″序列一致性百分比″，其中在两个序列最佳对准下与参考序列(其并不包含添加或缺失)相比，比较窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分可包含20％或以下、通常5％至15％或10％至12％的添加或缺失(亦即缺口)。该百分比系如下计算：测定相同核酸碱或氨基酸残基在两个序列中均存在的位置数目以产生匹配位置的数目，用匹配位置的数目除以参考序列中位置总数(亦即窗口尺寸)且将结果乘以100以产生序列一致性百分比。
变异体亦可(或者)基本上与天然基因或其部分或补体同源。此类多核苷酸变异体能够在适度严格条件下与编码天然抗体(或互补序列)的天然存在DNA序列杂交。
合适的″适度严格条件″包括在5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)的溶液中预洗；在50℃-65℃、5×SSC下杂交过夜；接着在65℃下洗涤两次历时20分钟，每次2×、0.5×及0.2×SSC(含有0.1％SDS)。
如本文中所用，″高度严格条件″或″高严格性条件″为如下条件：(1)采用低离子强度及高温进行洗涤，例如在50℃下用0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠；(2)杂交期间采用变性剂，例如甲酰胺，例如在42℃下用50％(v/v)甲酰胺与0.1％牛血清白蛋白/0.1％聚蔗糖(Ficoll)/0.1％聚乙烯吡咯啶酮/50mM磷酸钠缓冲剂(pH6.5)，以及750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠；或(3)在42℃下采用50％甲酰胺、5×SSC(0.75MNaCl、0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH6.8)、0.1％焦磷酸钠、5×丹哈德溶液(Denhardt′s solution)、经超声波处理的鲑鱼精DNA(50μg/ml)、0.1％SDS及10％硫酸葡聚糖，在42℃下以0.2×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)洗涤及在55℃下以50％甲酰胺洗涤，接着进行由在55℃下含有EDTA的0.1×SSC组成的高严格性洗涤。本领域技术人员将知道如何调节适应例如探针长度及其类似因素的因素所必需的温度、离子强度等。
普通技术人员应了解由于遗传密码子的简幷，因此存在多种编码如本文中所述的多肽的核苷酸序列。一些此类多核苷酸带有与任何天然基因的核苷酸序列的最小同源性。然而，本发明特别地涵盖由密码子用途差异造成变化的多核苷酸。另外，包含本文中所提供的多核苷酸序列的基因的等位基因也在本发明的范畴内。等位基因为内源基因，其由于一或多种突变(例如核苷酸的缺失、添加和/或取代)而改变。所得mRNA及蛋白质可(但不必需)具有改变的结构或功能。可使用标准技术(例如杂交、扩增和/或数据库序列比较)来鉴定等位基因。
可使用化学合成、重组方法或PCR获得本发明的多核苷酸。在本领域中公知化学多核苷酸合成的方法，这无需在本文中详细描述。本领域技术人员可使用本文中所提供的序列及商业DNA合成仪以制造所需DNA序列。
通过使用在适当载体中的分离DNA且将其插入合适宿主细胞中来获得RNA。当将细胞复制物及DNA转录于RNA中时，可接着使用本领域技术人员所公知的方法分离RNA，例如，如Sambrook等人，(1989)所阐明。
合适的克隆载体可根据标准技术来构建或可选自大量本领域中可得的克隆载体。
表达载体一般为含有根据本发明的多核苷酸的可复制多核苷酸构建体。这表明表达载体必须在宿主细胞中可复制为离合染色小体或染色体DNA的整合部分。合适的表达载体包括但不限于质粒，病毒载体，包括腺病毒、腺相关病毒、反转录病毒，粘粒及PCT公开文本第WO87/04462号中公开的表达载体。
通过大量适当方式中的任一种，包括电穿孔，采用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其它物质的转染；微弹轰击；脂质转染(lipofection)；及感染(例如，其中载体为例如牛痘病毒的感染剂)，可将含有所关注的多核苷酸的载体引入宿主细胞中。
本发明还提供了包含本文所述的多核苷酸中的任一种的宿主细胞。为达成分离编码所关注抗体、多肽或蛋白质的基因的目的，任何能够过度表达异源DNA的宿主细胞均可使用。哺乳动物宿主细胞的非限制性实例包括但不限于COS、HeLa及CHO细胞。还参见PCT公开文本第WO87/04462号。合适的非哺乳动物宿主细胞包括原核生物(例如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌(B.subtilli))及酵母(例如酿酒酵母(S.cerevisae)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)；或乳酸克鲁维酵母(K.lactis))。宿主细胞优选以比宿主细胞中相应所关注内源抗体或蛋白质(若存在)的水准高约5倍、更优选高10倍、甚至更优选高20倍的水准来表达cDNA。通过免疫检验或FACS实现与Aβ1-40特异性结合的宿主细胞的筛选。可鉴定过量表达所关注抗体或蛋白质的细胞。
具有受损的效应器功能的9TL或6G衍生抗体及抗Aβ抗体的诊断用途
与一或多个Aβ肽的C末端结合的抗体9TL或6G可用于鉴定或检测眼睛中靶标Aβ的存在或不存在。为简单起见，通常将针对9TL或6G抗体来描述，但是应了解：此类方法适用于本文所述的Aβ结合实施方式(例如多肽)中的任一种。检测一般包括使生物样品与结合于Aβ1-40的本文所述的抗体接触，及在Aβ1-40与特异性结合于Aβ1-40的抗体(例如9TL)的间形成复合物。此复合物的形成可为体外或体内的。如本文中所用的术语″检测″包括在有或无参考对照的情况下的定性和/或定量检测(测量水准)。
多种已知方法中的任一种均可用于检测，这包括但不限于免疫检验，其使用结合多肽的抗体，例如通过酶联结免疫吸附剂分析法(ELISA)、放射免疫检验(RIA)及其类似方法；及用于被编码多肽的功能性检验，例如结合活性或酶促检验。在一些实施方式中，抗体被可检测标记。其它实施方式是本领域中已知的，并且在本文中描述过。
本发明的抗体及多肽可用于检测、诊断及监测具有改变或异常Aβ或βAPP表达的眼科疾病、病状或病症。因此在一些实施方式中，本发明提供方法，其包括：使疑似在眼睛中具有改变或异常Aβ表达的个体的样品(样品)与本发明的抗体或多肽接触，及测定Aβ肽的水准是否不同于对照或比较样品的Aβ肽水准。在其它实施方式中，本发明提供方法，其包括：接触个体的样品(样品)及测定Aβ表达水准。
对于诊断应用而言，抗体可以可检测部分标记，所述可检测部分包括但不限于放射性同位素、萤光标记及各种酶-受体标记。在本领域中已知使标记与抗体缀合的方法。在本发明的其它实施方式中，本发明的抗体无需被标记，可使用与本发明的抗体结合的经标记抗体来检测其存在。
本发明的抗体可用于任何已知检验法中，例如竞争性结合检验、直接及间接夹心式检验及免疫沉淀检验。Zola，Monoclonal Antibodies：A Manualof Techniques，第147-158页(CRC Press，Inc.1987)。
抗体还可用于体内诊断检验，例如体内成像。一般以放射核素(例如111In、99Tc、14C、131I、125I或3H)标记抗体以便所关注细胞或组织可使用免疫闪烁扫描法来局部化。遵照本领域中公知的技术，抗体亦可用作病理学中的染色剂。
具有受损的效应器功能的抗Aβ抗体可用于测量视网膜功能以诊断处于视网膜相关退化性眼科疾病风险中或经诊断患有视网膜相关退化性眼科疾病的个体，及评定任何治疗及疾病阶段的进展。在一些实施方式中，向个体施用具有受损的效应器功能的抗Aβ抗体，且测量血浆中的Aβ水准，由此而得的血浆Aβ的增加表明个体中的脑部类淀粉负荷的存在和/或水准。此类方法可用于监测治疗的有效性及疾病阶段，且可用于确定未来给药及频率。具有受损的效应器功能的抗体可具有更好的安全性，并且提供针对此类诊断用途的优势。
为治疗目的使用抗Aβ抗体的方法
本文所述的抗体(包括多肽)、多核苷酸及医药组合物可用于治疗、预防及抑制特征在于视网膜相关退化的眼科疾病发展的方法中。此类方法包含向个体施用有效量的与蛋白质或蛋白质沉积物特异性结合的抗体或编码该抗体的多核苷酸，其中该抗体具有受损的效应器功能。
本文所述的抗体(包括多肽)、多核苷酸及医药组合物可用于治疗、预防及抑制年龄相关黄斑退化及其它眼科疾病的发展的方法中，此类其它眼科疾病例如年龄相关黄斑退化(湿型及干型)、青光眼、糖尿病性视网膜病变(包括糖尿病性黄斑水肿)、布鲁赫膜破裂、近视退化、眼肿瘤及其它相关视网膜退化性疾病。此类方法包含向个体施用抗体、多肽或多核苷酸或医药组合物。在预防性应用中，以足以消除或减小风险、减轻严重程度或延迟疾病发作的量向易患眼科疾病或另外处于眼科疾病风险中的患者施用医药组合物或药物，所述发作包括疾病的生物化学、组织和/或行为症状，在疾病发展期间呈现的其并发症及中间病理学表型。在治疗性应用中，以足以治愈或至少部分停滞疾病症状(生物化学、组织和/或行为症状)的量向疑似患有或已患有此疾病的患者施用组合物或药物，此类症状包括疾病发展中的其并发症及中间病理学表型。
年龄相关黄斑退化的并发症及中间病理学表型包括厚扩散视网膜下色素上皮细胞(RPE)沉积、唇富脉络膜小疣状沉积(lip-rich drusen-likedeposit)、布鲁赫膜增厚、RPE萎缩的斑点区域及脉络膜新血管生成。
本发明还提供了延迟个体的视网膜退化和/或其症状的发展的方法，其包含向个体施用有效剂量的包含本文所述的抗体、多肽或多核苷酸的医药组合物。
本发明还提供了恢复或保护个体视网膜功能的方法，其包含向个体施用有效剂量的包含本文所述的抗体、多肽或多核苷酸的医药组合物。
本发明还提供了在个体视网膜中减少类淀粉斑和/或减少或减缓Aβ积累的方法，其包含向个体施用有效剂量的包含本文所述的抗体、多肽或多核苷酸的医药组合物。
本发明还提供了在个体视网膜中移除或清除类淀粉斑和/或Aβ积累的方法，其包含向个体施用有效剂量的包含本文所述的抗体、多肽或多核苷酸的医药组合物。在一些实施方式中，类淀粉斑系在个体的脑中。
本发明还提供了减少视网膜组织中的Aβ肽、抑制和/或减少视网膜组织中的Aβ肽积累的方法，其包含向个体施用有效剂量的包含本文所述的抗体、多肽或多核苷酸的医药组合物。Aβ多肽可呈可溶、寡聚或沉积形式。寡聚形式的Aβ可由2-50个Aβ多肽构成，其可为全长1-40及1-42的肽和/或此类肽的任何截短型式的混合物。
本发明还提供了改良或逆转眼科疾病中视网膜退化的方法，其包含向个体施用有效剂量的包含本文所述的抗体、多肽或多核苷酸的医药组合物。
本发明还提供了治疗或预防与视网膜退化相关的疾病的方法，其包含向个体施用有效剂量的医药组合物，该医药组合物包含与β类淀粉肽或β类淀粉肽的聚集形式特异性结合的抗体，其中该抗体包含与天然存在的Fc区具有变异的Fc区，其中该变异引起受损的效应器功能，由此使施用该抗体产生比施用无变异抗体更小的脑微出血。
通过在单一时间点或多个时间点单一直接注射至单一或多个部位，可实现本文所述的方法(包括预防方法或疗法)。还可几乎同时施用至多个部位。施用频率可在疗法过程期间被确定及调节，且施用频率基于实现所需结果。在一些情况下，持续连续释放抗体(包括多肽)、多核苷酸的制剂及本发明的医药组合物可能是适当的。用于达成持续释放的各种制剂及设备是本领域中已知的。
患者、个体或个体包括哺乳动物，例如人类、牛、马、犬、猫、猪及绵羊动物。个体优选为人类，其可罹患或可未罹患疾病或本文所示症状。本发明的方法可预防地施用于一般人群，而不需对个体患者进行任何风险评定。本发明的方法适用于确实具有年龄相关黄斑退化的已知遗传风险的个体。此类个体包括具有已经历该疾病的亲戚的个体及通过分析遗传或生物化学标记物确定风险的个体。
可用于上文方法的医药组合物包括本文所述的抗体、多肽和/或多核苷酸中的任一种。在一些实施方式中，抗体为抗体9TL或6G或表3及8中所示的其变异体。在一些实施方式中，抗体为与Aβ肽特异性结合且包含具有受损的效应器功能的恒定区的抗体。
施用及剂量
抗体优选在载剂、优选医药学上可接受的载剂中向哺乳动物施用。合适载剂及其制剂被描述于：Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，A.Gennaro编，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990；及Remington，TheScience and Practice of Pharmacy，第20版，Mack Publishing，2000。通常将适当量的医药学上可接受的盐用于制剂中以使制剂等张。载剂的实例包括盐水、林葛尔氏溶液(Ringer′s solution)及右旋糖溶液。溶液的pH值优选为约5至约8，且更优选约7至约7.5。其它载剂包括持续释放制剂，例如含有抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，此类基质系呈成形对象的形式，例如膜、脂质粒或微粒。本领域技术人员应了解，视例如施用途径及施用抗体的浓度而定，某些载剂可为更优选的。
通过注射(例如全身性、静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、门静脉内(intraportal)、脑内、脑心室内(intracerebralventricular)及鼻内)或通过其它方法(例如输注，其确保其以有效形式递送至血流)，可向哺乳动物施用抗体。亦可通过隔离灌注(isolated perfusion)技术，例如隔离组织灌注来施用抗体以发挥局部治疗作用。另外，本发明的抗体可局部地或以例如玻璃体内注射、视网膜下注射或双面注射的注射形式向眼睛施用。关于将化合物向眼睛施用的其它信息可见于Tolentino等人，Retina24(2004)132-138；Reich等人，Molecularvision9(2003)210-216中。
可凭经验决定施用抗体的有效剂量及进度，且进行此类决定在本领域的技术范围内。本领域技术人员应了解：必须施用的抗体的剂量将视(例如)将接受抗体的哺乳动物、施用途径、特定类型的所用抗体及其它向哺乳动物施用的药物而改变。为抗体选择适当剂量的指导见于关于抗体治疗性用途的文献中，例如Handbook ofMonoclonal Antibodies，Ferrone等人编，Noges Publications，Park Ridge，N.J.，1985，第22章及第303-357页；Smith等人，Antibodies in Human Diagnosis and Therapy，Haber等人编，Raven Press，New York，1977，第365-389页。视上文提及的因素而定，单独使用的抗体的典型每日剂量范围可介于每天1μg/kg至至多100mg/kg体重或更多。大体而言，可使用以下剂量中的任一种：施用至少约50mg/kg体重；至少约10mg/kg体重；至少约3mg/kg体重；至少约1mg/kg体重；至少约750μg/kg体重；至少约500μg/kg体重；至少约250μg/kg体重；至少约100μg/kg体重；至少约50μg/kg体重；至少约10μg/kg体重；至少约1μg/kg体重或更多的剂量。在治疗开始时，可以较低剂量或较小频率施用抗体以避免潜在副作用，例如暂时性脑类淀粉血管病变(CAA)。
在一些实施方式中，可存在一个以上抗体。此类组合物可含有至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个本发明的不同抗体(包括多肽)。
抗体还可与有效量的一或多种其它治疗剂组合向哺乳动物施用。抗体可与该或此类其它治疗剂依次或同时施用。抗体及治疗剂的量视(例如)使用何类型药物、所治疗的病理学病状及施用进度及途径而定，但若个别地使用每一种，则该量通常将较小。
向哺乳动物施用抗体之后，可以本领域技术人员所公知的多种方式监测哺乳动物的生理条件。
可使以上施用原理及剂量适合于本文所述的多肽。
编码本文所述的抗体或多肽的多核苷酸还可用于在所需细胞中递送及表达抗体或多肽。显然，表达载体可用以直接表达抗体。可全身地、腹膜内、静脉内、肌肉内、皮下、鞘内、心室内、经口、经肠、非经肠、经鼻内、经皮或通过吸入来施用表达载体。举例而言，表达载体施用包括局部(local)或全身性施用，包括注射、口服、颗粒枪或插入导管施用及局部(topical)施用。本领域技术人员熟悉表达载体的施用来获得外源蛋白质体内表达。例如参见美国专利第6,436,908号；第6,413,942号；及第6,376,471号。
还可使用包含编码本发明的抗体的多核苷酸的治疗组合物的靶向递送。受体介导的DNA递送技术被描述于(例如)Findeis等人，TrendsBiotechnol.(1993)11：202；Chiou等人，Gene Therapeutics：Methods AndApplications of Direct Gene Transfer(J.A.Wolff编)(1994)；Wu等人，J.Biol.Chem.(1988)263：621；Wu等人，J.Biol.Chem.(1994)269：542；Zenke等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1990)87：3655；Wu等人，J. Biol.Chem.(1991)266：338中。在基因疗法方案中，以约100ng至约200mg DNA的范围施用含有多核苷酸的治疗组合物以局部施用。在基因疗法方案期间还可使用约500ng至约50mg、约1μg至约2mg、约5μg至约500μg及约20μg至约100μgDNA的浓度范围。可使用基因递送介载体，递送本发明的治疗性多核苷酸及多肽。基因递送介载体可具有病毒或非病毒来源(一般参见Jolly，Cancer Gene Therapy(1994)1：51；Kimura,Human Gene Therapy(1994)5：845；Connelly，Human Gene Therapy(1995)1：185；及Kaplitt，NatureGenetics(1994)6：148)。使用内源哺乳动物启动子或异源启动子可诱导此类编码序列的表达。编码序列的表达可为组成性的或受调控的。
在本领域中公知用于递送所需多核苷酸及在所需细胞中表达的病毒基载体。示例性病毒基介载体包括但不限于：重组反转录病毒(例如参见PCT公开文本第WO90/07936号；第WO94/03622号；第WO93/25698号；第WO93/25234号；第WO93/11230号；第WO93/10218号；第WO9I/02805号；美国专利第5,219,740号；第4,777,127号；英国专利第2,200,651号；及EP0345242)、α病毒基载体(例如辛德毕斯病毒(Sindbis virus)载体、胜利基森林病毒(Semliki forest virus)(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)、罗斯河病毒(Ross River virus)(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)及委内端拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)(ATCC VR-923；ATCC VR-1250；ATCC VR1249；ATCC VR-532))，及腺相关病毒(AAV)载体(例如参见PCT公开文本第WO94/12649号；第WO93/03769号；第WO93/19191号；第WO94/28938号；第WO95/11984号及第WO95/00655号)。还可采用如Curiel，Hum.Gene Ther.(1992)3：147中所述的与杀死腺病毒连接的DNA施用。
亦可采用非病毒递送介载体及方法，其包括但不限于与单独杀死腺病毒连接或不连接的多价阳离子缩合DNA(例如参见Curiel，Hum.Gene Ther.(1992)3：147)；配位体连接DNA(例如参见Wu，J. Biol. Chem.(1989)264：16985)；真核细胞递送介载体细胞(例如参见美国专利第5,814,482号；PCT公开文本第WO95/07994号；第WO96/17072号；第WO95/30763号及第WO97/42338号)及核电荷中和或与细胞膜融合。亦可采用裸DNA。在PCT公开文本第WO90/11092号及美国专利第5,580,859号中描述示例性裸DNA引入法。在美国专利第5,422,120号；PCT公开文本第WO95/13796号；第WO94/23697号；第WO91/14445号；及EP0524968中描述可充当基因递送介载体的脂质粒。在Philip，Mol.Cell Biol.(1994)14：2411中且在Woffendin，Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)91：1581中描述其它方法。
试剂盒
本发明还提供了含有本文所述的适用于治疗眼科疾病的物质的制品及试剂盒，此类眼科疾病例如年龄相关黄斑退化(湿型及干型)、青光眼、糖尿病性视网膜病变(包括糖尿病性黄斑水肿)、布鲁赫膜破裂、近视退化、眼肿瘤及其它相关视网膜退化性疾病。该制品包含具有标记的容器。合适的容器包括(例如)瓶、小瓶及试管。容器可由例如玻璃或塑料的多种材料形成。容器装有具有活性剂的组合物，所述活性剂对于治疗病理学眼科病状或对于检测或纯化Aβ或βAPP为有效的。组合物中的活性剂为抗体，且优选包含对Aβ或βAPP具特异性的单克隆抗体。在一些实施方式中，活性剂包含抗体9TL或6G或由此衍生的任何抗体或多肽。在一些实施方式中，活性剂包含具有受损的效应器功能的抗Aβ抗体或多肽。在一些实施方式中，抗Aβ抗体或多肽包含重链恒定区，其中该恒定区具有受损的效应器功能。容器上的标记指示组合物用于治疗例如AMD的病理学眼科病状且亦可指示对体内或体外用途的指导，例如上述那些。
本发明还提供了包含本文所述的抗体(例如9TL或6G)、多肽、多核苷酸中任一种的试剂盒。在一些实施方式中，本发明的试剂盒包含上述容器。在其它实施方式中，本发明的试剂盒包含上述容器及包含缓冲剂的第二容器。其可另外包括其它自商业及使用者观点来看所需的物质，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器及包装插页，此类包装插页具有进行本文所述的任何方法(例如用于治疗AMD的方法及用于抑制或减小脑中Aβ肽堆积的方法)的说明书。在欲用于检测或纯化Aβ或βAPP的试剂盒中，抗体通常以一种可检测标记物例如放射性同位素、萤光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂或酶标记。
在一些实施方式中，本发明提供用于本文所述的方法中任一种的组合物(本文所述)，无论是用作药物和/或用于药物的制造。
提供以下实施例以说明本发明，但非限制本发明。
实施例
实施例1.抗体9TL及其变异体的结合亲和性测定
A.通用方法
以下通用方法用于此实例中。
用于分析克隆的表达载体
抗体的Fab片段的表达在类似于Barbas(2001)Phage display：alaboratory manual，Cold Spring Harbor，NY，Cold Spring Harbor LaboratoryPress pg2.10.Vector pComb3X)中所述启动子的IPTG诱导性lacZ启动子控制下，然而修饰包括添加及表达以下其它结构域：IgG2a人类免疫球蛋白的人类κ轻链恒定结构域及CHI恒定结构域、Igγ-2链C区、蛋白质检录号P01859；免疫球蛋白κ轻链(智人(homosapiens))、蛋白质检录号CAA09181。
小规模Fab制备
如下进行96孔板中的Fab小规模表达。自以Fab文库转型的大肠杆菌起始，挑选菌落以接种母板(琼脂LB+胺苄青霉素(Ampicillin)(50μg/ml)+2％葡萄糖)及工作板(2毫升/孔，96孔/板，含有1.5mL LB+胺苄青霉素(50μg/ml)+2％葡萄糖)。两板均在30℃下生长8-12小时。将母板储存在4℃下且使来自工作板的细胞在5000rpm下粒化且以1mL LB+胺苄青霉素(50μg/ml)+1mM IPTG将其再悬浮以诱导Fab表达。在30℃下5h的表达时间后通过离心来收集细胞，接着将细胞再悬浮于500μL缓冲液HBS-P(10mM HEPES缓冲液(pH7.4)，150mM NaCl，0.005％P20)中。通过冷冻(-80℃)接着在37℃下融化的一个循环来达成HBS-P再悬浮细胞的溶胞。以5000rpm将细胞溶胞物离心30min以自含有Fab的上清液分离细胞碎片。接着将上清液注入BIAcore等离子体共振装置中以获得各Fab的亲和性信息。自母板取出表达Fab的克隆以将DNA测序且用于如下所述的大规模Fab制造及详细分析。
大规模Fab制备
为获得详细动力学参数，表达Fab且将其自大规模培养物纯化。以来自所选Fab表达大肠杆菌克隆的5mL过夜培养物接种含有200mL LB+胺苄青霉素(50μg/ml)+2％葡萄糖的锥形瓶。在30℃下培育克隆直至达成1.0的OD550nm，且接着通过将培养基置换为200ml LB+胺苄青霉素(50μg/ml)+1mM IPTG来对其加以诱导。在30℃下5h的表达时间后，通过离心使细胞粒化，接着将其再悬浮于10mL PBS(pH8)中。通过冷冻/融化(分别在-80℃及37℃下)的两个循环获得细胞的溶胞。将细胞溶胞物的上清液负载于以PBS(pH8)平衡的Ni-NTA超流琼脂糖(Qiagen，Valencia.CA)管柱上，接着以5管柱体积的PBS(pH8)洗涤。以PBS(pH8)+300mM咪唑使个别Fab洗脱于不同级分中。将含有Fab的级分汇集且于PBS中渗析(dialized)，接着通过ELISA定量，随后进行亲和性分析。
全抗体制备
为表达全抗体，将重链及轻链可变区克隆于哺乳动物表达载体中，且使用脂质转染胺(lipofectamine)将其转染于HEK293细胞中以瞬间表达。使用标准方法，使用蛋白质A来纯化抗体。载体pDb.9TL.hFc2a是包含9TL抗体的重链的表达载体，其适用于重链的瞬间或稳定表达。载体pDb.9TL.hFc2a具有对应于以下区域的核苷酸序列：鼠类细胞巨大病毒启动子区(核苷酸1-612)；合成的内含子(核苷酸619-1507)；DHFR编码区(核苷酸707-1267)；人类生长激素信号肽(核苷酸1525-1602)；9TL的重链可变区(核苷酸1603-1951)；含有以下突变的人类重链IgG2a恒定区：A330P331至S330S331(参考野生型IgG2a序列的氨基酸编号；参见Eur.J.Immunol.(1999)29：2613-2624)；SV40晚期多聚腺嘌呤信号(核苷酸2960-3203)；SV40增强子区(核苷酸3204-3449)；噬菌体f1区(核苷酸3537-4992)及β内酰胺酶(AmpR)编码区(核苷酸4429-5286)。2004年7月20日将载体pDb.9TL.hFc2a保藏于ATCC且指定为ATCC检录号PTA-6124。
载体pEb.9TL.hK为包含9TL抗体的轻链的表达载体且适用于轻链的瞬间表达。载体pEb.9TL.hK具有对应于以下区域的核苷酸序列：鼠类细胞巨大病毒启动子区(核苷酸1-612)；人类EF-1内含子(核苷酸619-1142)；人类生长激素信号肽(核苷酸1173-1150)；抗体9TL轻链可变区(核苷酸1251-1593)；人类κ链恒定区(核苷酸1594-1914)；SV40晚期多聚腺嘌呤信号(核苷酸1932-2175)；SV40增强子区(核苷酸2176-2421)；噬菌体f1区(核苷酸2509-2964)及β内酰胺酶(AmpR)编码区(核苷酸3401-4258)。2004年7月20日将载体pEb.9TL.hK保藏于ATCC且指定为ATCC检录号PTA-6125。
Biacore检验
使用BlAcore3000TM表面等离子体共振(SPR)系统(BIAcore，INC，Piscaway NJ)，来测定9TL单克隆抗体的亲和性。测定亲和性的一种方法为将9TL固定于CM5芯片上且测量Aβ1-40肽对抗体的结合动力学。根据供货商的说明书以N-乙基-N′-(3-二甲胺基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化CM5芯片。将抗体9TL或其变异体稀释于10mM乙酸钠(pH4.0或5.0)中且以0.005mg/mL的浓度注射于活化芯片上。使用穿过个别芯片信道的可变流动时间，达成如下范围的抗体密度：1000-2000个反应单位(RU)或2000-3000个反应单位(RU)。以乙醇胺阻断芯片。再生研究展示含有2倍体积PIERCE洗脱缓冲液及1倍体积4M NaCl的溶液有效移除所结合的Aβ1-40肽同时保持芯片上9TL的活性历时200次以上的注射。将HBS-EP缓冲液(0.01M HEPES(pH7.4)，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005％界面活性剂P20)用作所有BIAcore检验的电泳缓冲液。将经纯化Aβ1-40合成肽样品的连续稀释物(0.1-10×估计KD)以100μL/min注射1min且允许10min的解离时间。通过将资料拟合为1∶1朗缪尔(Langmuir)结合模型(Karlsson，R.Roos，H.Fagerstam，L. Petersson，B.(1994).Methods Enzymology6.99-110)使用BIAevaluation程序来同时获得动力学缔合速率(kon)及解离速率(koff)。平衡解离常数(KD)值系计算为koff/kon。
或者，通过将Aβ1-40肽固定于SA芯片上且测量9TL Fab及9TL变异体的Fab对固定Aβ1-40肽的结合动力学来测定亲和性。通过表面等离子体共振(SPR)系统(BIAcore3000TM，BIAcore，Inc.，Piscaway，NJ)来测定9TL Fab片段及其变异体Fab片段的亲和性。根据供货商的说明书来使用SA芯片(链亲和素(streptavidin))。将经生物素标记的Aβ肽1-40稀释于HBS-EP(10mMHEPES(pH7.4)，150mM NaCl，3mM EDTA，0.005％P20)中，并以0.005mg/mL的浓度注射于芯片上。使用穿过个别芯片信道的可变流动时间，达成两个范围的抗原密度：对于详细动力学研究而言为10-200反应单位(RU)，且对于浓度研究及筛选而言为500-600RU。再生研究展示100mM磷酸(亦可接着用含有2体积50mM NaOH及1体积70％乙醇的溶液)有效移除所结合的Fab同时保持芯片上Aβ肽的活性历时200次以上的注射。将HBS-EP缓冲液用作所有BIAcore检验的电泳缓冲液。将经纯化Fab样品的连续稀释物(0.1-10×估计KD)以100μL/min注射2min且允许10min的解离时间。通过ELISA和/或SDS-PAGE电泳使用已知浓度(通过氨基酸分析测定)的标准Fab来测定Fab蛋白质的浓度。通过将资料拟合为1∶1朗缪尔结合模型(Karlsson，R.Roos，H.Fagerstam，L.Petersson，B.(1994).MethodsEnzymology6.99-110)使用BIAevaluation程序来同时获得动力学缔合速率(kon)及解离速率(koff)。平衡解离常数(KD)值系计算为koff/kon。
B.抗体9TL及其变异体对Aβ1-40的结合亲和性
图1中展示了抗体9TL的重链及轻链可变区的氨基酸序列。下表2中展示了使用上述两种Biacore方法测定的9TL抗体对Aβ1-40的结合亲和性。
表2.抗体9TL及Fab片段的结合亲和性
下表3中展示了9TL的变异体的氨基酸序列。表3中所示的变异体的所有氨基酸取代均系相对于9TL序列来描述。表3中亦展示9TL变异体的Fab片段的结合亲和性。通过上述BIAcore分析以固定于SA芯片上的Aβ1-40来测定KD及其它动力学参数。
表3.抗体9TL变异体的氨基酸序列及动力学资料。
1＝所有CDR均为扩展CDR，其包括Kabat及Chothia CDR两者。依次编号氨基酸残基。
2＝以实验测定加下划线的kon。其它者估计为与9TL相同。
3＝KD值系计算为KD＝koff/kon。
实施例2：抗体9TL所结合的Aβ1-40肽上的表位的分析
为测定由抗体9TL识别的Aβ多肽上的表位，使用表面等离子体共振(SPR，Biacore3000)结合分析。将与生物素(Global Peptide Services，CO)偶合的Aβ1-40多肽固定于链亲和素涂布芯片(SA芯片)上。在不存在或存在Aβ肽的不同可溶片段(10mM，来自American Peptide Company Inc.，CA)的情况下使Aβ抗体Fab片段(50nM)与固定Aβ1-40结合。下表4中展示了Aβ1-40、Aβ1-42及Aβ1-43的氨基酸序列。替换了抗体9TL Fab片段与Aβ1-40的结合的Aβ肽分别为Aβ28-40、Aβ1-40、Aβ33-40及Aβ17-40(图2)。因此，抗体9TL与Aβ1-40的C末端肽(33-40)结合。如图2中所示，Aβ1-28、Aβ28-42、Aβ22-35、Aβ1-16、Aβ1- 43及Aβ1-38肽并不抑制抗体9TL Fab片段的结合，这表明抗体9TL与Aβ1-40肽的C末端结合。
另外，Aβ28-42及Aβ1-43肽并不抑制抗体9TL与Aβ1-40的结合，尽管其可易于抑制Aβ1-40与对照抗体(抗体2289，在美国申请公开文本第2004/0146512号及第WO04/032868号中描述此抗体)结合，该对照抗体与Aβ1-40的16-28结合。此类结果展示抗体9TL与Aβ1-40优先结合，但不与Aβ1-42及Aβ1-43结合。
表4.β类淀粉肽的氨基酸序列
实例3.单克隆抗体2H6及去糖基化2H6的产生
A.单克隆抗体2H6的产生及分析
以约16个连续周间隔，以25-100μg在佐剂(每脚垫(footpad)50μl，每小鼠总共100μl)中与KLH缀合的肽(Aβ1-40的氨基酸28-40)使小鼠免疫，如以下文献中所述：Geerligs HJ等人，1989，J.Immunol.Methods124：95-102；Kenney JS等人，1989，J.Immunol.Methods121：157-166；及Wicher K等人，1989，Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.89：128-135。首先以CFA(傅氏完全佐剂(complete Freud′s adjuvant))中的50μg肽使小鼠免疫。21天之后，以IFA(傅氏不完全佐剂)中的25μg肽使小鼠第二次免疫。第二次免疫二十三天之后，以IFA中的25μg肽进行第三次免疫。十天之后，使用ELISA来测试抗体力价。第三次免疫34天之后，以IFA中的25μg肽进行第四次免疫。在第四次免疫32天之后，以100μg可溶肽进行最终加强免疫。
自经免疫小鼠获得脾细胞，用聚乙二醇1500使其以10∶1的比率与NSO骨髓瘤细胞融合。析出(plated out)杂合物于DMEM中的96孔板中，该DMEM含有20％马血清及2-草酰乙酸盐/丙酮酸盐/胰岛素(Sigma)，且开始进行次黄嘌呤/胺基蝶呤/胸苷选择。在第8天，添加含有20％马血清的100μl DMEM至所有孔中。通过使用抗体捕获免疫检验来筛选杂合物的上清液。以类别特异性第二抗体执行抗体类别的测定。选择一系列单克隆抗体产生细胞株以用于分析。一种所选细胞株产生如被称为2H6的抗体。此抗体经测定具有IgG2b重链。
测定抗体2H6与Aβ1-40的亲和性。使用蛋白质A亲和性层析法自融合瘤培养物的上清液纯化单克隆抗体2H6。使上清液平衡为pH8。接着将上清液负载于以PBS平衡至pH8的蛋白质A管柱MabSelect(AmershamBiosciences#17-5199-02)。以5管柱体积的PBS(pH8)洗涤管柱。以50mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH3)洗脱抗体。以1M磷酸盐缓冲液(pH8)中和经洗脱抗体。以PBS渗析经纯化抗体。通过SDS-PAGE，使用鼠类mAb标准曲线来测定抗体浓度。
2H6Fab是通过使用Immunopure Fab试剂盒(pierce#44885)的2H6全抗体的木瓜酶蛋白质分解来制备的，且通过遵照制造商的说明书流经蛋白质A层析法来对其加以纯化。通过SDS-PAGE及A280使用1OD＝0.6mg/ml来测定浓度。
使用BlAcore3000TM表面等离子体共振(SPR)系统(BIAcore，INC，Piscaway NJ)来测定2H6单克隆抗体的亲和性。测定亲和性的一种方法为将2H6抗体固定于CM5芯片上且测量Aβ1-40肽对抗体的结合动力学。根据供货商的说明书，以N-乙基-N′-(3-二甲胺基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)来活化CM5芯片。将2H6单克隆抗体稀释于10mM乙酸钠(pH4.0或5.0)中且以0.005mg/mL的浓度注射于活化芯片上。使用穿过个别芯片信道的可变流动时间，达成如下范围的抗体密度：1000-2000反应单位(RU)或2000-3000反应单位(RU)。以乙醇胺阻断芯片。再生研究展示：Pierce洗脱缓冲液(产品号21004，Pierce Biotechnology，Rockford，IL)与4M NACL(2∶1)的混合物有效地移除了所结合的Aβ1-40肽，同时保持芯片上的2H6抗体活性历时200次以上的注射。将HBS-EP缓冲液(0.01MHEPES(pH7.4)，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005％界面活性剂P20)用作所有BIAcore检验的电泳缓冲液。将经纯化Aβ1-40合成肽样品的连续稀释物(0.1-10×估计KD)以100μL/分钟注射1分钟且允许10分钟的解离时间。通过将资料拟合为1∶1朗缪尔结合模型(Karlsson，R.Roos，H.Fagerstam，L.Petersson，B.(1994).Methods Enzymology6.99-110)，使用BIAevaluation程序，来同时获得动力学缔合速率(kon)及解离速率(koff)。平衡解离常数(KD)值系计算为koff/kon。
或者，亲和性系通过将Aβ1-40肽固定于SA芯片上且测量2H6Fab对固定Aβ1-40肽的结合动力学来测定。通过表面等离子体共振(SPR)系统(BIAcore3000TM，BIAcore，Inc.，Piscaway，NJ)来测定2H6Fab片段的亲和性。根据供货商的说明书来使用SA芯片(链亲和素)。将经生物素标记的Aβ肽1-40(SEQID NO：15)稀释于HBS-EP(10mM HEPES(pH7.4)，150mM NaCl，3mMEDTA，0.005％P20)中且以0.005mg/mL的浓度注射于芯片上。使用穿过个别芯片信道的可变流动时间，达成两个范围的抗原密度：对于详细动力学研究而言为10-200个反应单位(RU)，且对于浓度研究而言为500-600RU。再生研究展示Pierce洗脱缓冲液与4M NaCl(2∶1)的混合物有效移除所结合的Fab同时保持芯片上的Aβ肽活性历时200次以上的注射。将HBS-EP缓冲液用作所有BIAcore检验的电泳缓冲液。将经纯化Fab样品的连续稀释物(0.1-10×估计KD)以100μL/min注射2min，且允许10min的解离时间。通过ELISA和/或SDS-PAGE电泳，使用已知浓度(通过氨基酸分析测定)的标准Fab来测定Fab蛋白质的浓度。通过将资料拟合为1∶1朗缪尔结合模型(Karlsson，R.Roos，H.Fagerstam，L. Petersson，B.(1994).MethodsEnzymology6.99-110)，使用BIAevaluation程序，来同时获得动力学缔合速率(kon)及解离速率(koff)。平衡解离常数(KD)值系计算为koff/kon。下表5中展示了使用上述两种方法测定的2H6抗体的亲和性。
如上所述来测试与Aβ1-40的氨基酸28-40的肽结合的鼠类抗体2286的亲和性。在美国申请案第10/683,815号及PCT/US03/32080中描述抗体2286。
表5.抗体2H6及2286的结合亲和性
为测定由抗体2H6识别的Aβ多肽上的表位，使用表面等离子体共振(SPR，Biacore3000)结合分析。将与生物素(Global Peptide Services，CO)偶合的Aβ1-40多肽(SEQ ID NO：15)固定于链亲和素涂布芯片(SA芯片)上。在不存在或存在Aβ肽的不同可溶片段(16μM，来自American Peptide CompanyInc.，CA)的情况下使Aβ抗体(100nM)与固定Aβ1-40结合。替换抗体2H6与Aβ1-40的结合的Aβ肽分别为Aβ17-40、Aβ33-40及Aβ1-40(图3)。因此，抗体2H6与Aβ1-40的C末端肽(33-40)结合。然而，Aβ1-40的此C末端肽(33-40)在测试浓度下并不替换抗体2286与Aβ1-40的结合。如图3中所示，Aβ1-38肽并不抑制抗体2H6或抗体2286与Aβ1-40的结合，表明类似于抗体2286，抗体2H6所结合的表位包括Aβ1-40肽的氨基酸39和/或40(图3)。
另外，Aβ1-42及Aβ1-43肽并不抑制抗体2H6与Aβ1-40的结合，尽管其可易于抑制Aβ1-40与对照抗体(抗体2289，在美国申请案第10/683,815号及PCT/US03/32080中描述此抗体)结合，该对照抗体与Aβ1-40的16-28结合(图3)。此类结果展示抗体2H6与Aβ1-40优先结合，但不与Aβ1-42及Aβ1-43结合。
为进一步评定抗体2H6所结合的β-类淀粉肽的离散氨基酸残基的涉入，通过定点诱变产生不同的Aβ1-40变异体，其中最后6个氨基酸(Aβ1-40氨基酸残基35-40)中的每一种个别地经丙氨酸置换(丙氨酸扫描诱变)。将此类Aβ1- 40变异体(表6中所示的序列)在大肠杆菌中表达为麸胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ USA)，接着在谷胱甘肽-琼脂糖珠粒(Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO，USA)上进行亲和性纯化。作为对照，野生型(WT)Aβ1-40以及Aβ1-41、Aβ1-42及Aβ1-39也表达为GST融合蛋白。接着将Aβ1-40、Aβ1-41、Aβ1-42，、Aβ1-39以及六个不同变异体(表6中所不的M35A(1-40)、V36A(1-40)、G37A(1-40)、G38A(1-40)、V39A(1-40)、V40A(1-40))固定(100μl0.025μg/ml的GST肽/孔)于ELISA检验板上，且与在自0.3nM向下(使用0.3nM mAb的资料展示于图4中)的连续稀释物中的mAb2286、2289及2H6中的任一种一起培育。10次连续洗涤之后，检验板系依次经每孔100μl0.03μg/ml的生物素缀合山羊抗小鼠(H+L)抗体(Vector Laboratories，载体#BA-9200，Burllingame CA，USA)、每孔100μl0.025μg/ml的HRP缀合链亲和素(Amersham Biosciences Corp.，#RPN4401V，NJ，USA)培育。在450nm处读取板的吸光度。
表6.β类淀粉肽及变异体的氨基酸序列
如图4中所示，针对Aβ的氨基酸16至28的Mab2289以相同强度识别所有变异体，且充当板上蛋白质浓度及蛋白质完整性的内部正对照。如图4中所示，抗体2H6并不识别Aβ1-41、Aβ1-39或Aβ1-42。Aβ1-40变异体V40A、V39A、G38A、G37A、V36A及M35A展示与抗体2h6减小的结合，证明抗体2H6表位在Aβ1-40的C末端处扩展至少6个氨基酸。V及G至A的突变为极保守突变且不太可能在蛋白质中产生重要构型变化，因此，此类突变对抗体2H6结合的较大作用可归因于抗体在Aβ范围内区分所提及氨基酸的能力，且此类资料证明此抗体的极高程度的特异性。
为测定2H6及9TL是否为与Aβ1-40结合而竞争，使用Biacore检验来进行竞争实验。将抗体2H6、9TL及2289固定于CM5芯片的不同信道上。根据供货商的说明书，以N-乙基-N′-(3-二甲胺基丙基)-碳化二亚胺盐酸盐(EDC)及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化CM5芯片信道。将抗体2H6、9TL及2289各稀释于10mM乙酸钠(pH4.0)中且以0.005mg/mL的浓度注射于活化芯片上。抗体密度对于2H6而言为1625个反应单位(RU)；对于9TL而言为4000RU；且对于2289而言为2200RU。以乙醇胺阻断各信道。使Aβ1-40肽(150μM)流动于芯片上历时2分钟。接着使0.6μM的抗体2H6(待针对结合竞争进行测试)流动于芯片上历时1分钟。将HBS-EP缓冲液(0.01M HEPES(pH7.4)，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005％界面活性剂P20)用作所有BIAcore检验的电泳缓冲液。测量Aβ1-40的结合后，通过以Pierce洗脱缓冲液(产品号21004，Pierce Biotechnology，Rockford，IL)与4M NaCl(2∶1)的混合物洗涤两次历时6sec来再生芯片的所有信道。接着对抗体9TL且接着对抗体2289进行竞争结合。观察到9TL与2H6的间对与Aβ1-40结合的竞争，但在9TL与2289的间或在2H6与2289的间未观察到竞争。对在固定抗体与流动于芯片上的相同抗体的间竞争的观察结果充当正对照。
B.抗体2H6并不与APP结合
为测定2H6是否与类淀粉前驱蛋白质(APP)结合，测定2H6与以野生型APP转染的细胞的结合。以编码野生型人类类淀粉前驱蛋白质的cDNA转染293细胞。转染四十八小时之后，在冰上以单克隆抗体抗Aβ1-16、抗Aβ16- 28或2H6(5μg/ml，在具有10％FCS的DMEM中)将细胞培育45分钟。接着在PBS中将细胞洗涤三次历时5分钟，以4％PFA固定。在PBS中将细胞再洗涤三次，且在萤光显微镜下以来自Jackson Immunoresearch的二次Cy3缀合山羊抗小鼠抗体(1∶500的稀释物)检测抗体结合。
识别Aβ中N末端或中心表位的抗Aβ1-16及抗Aβ16-28抗体两者均展示与表达于细胞上的APP前驱蛋白质的显著结合。相反，2H6并不与APP表达细胞结合。
C.去糖基化抗体2H6的产生
为产生去糖基化抗体2H6，在37℃下以在20mM Tris-HCl(pH8.0)中的肽-N-糖苷酶F(Prozyme，0.05U/mg抗体)将经纯化抗体2H6培育7天。通过MALDI-TOF-MS及蛋白质凝胶电泳来检验去糖基化的完整性。通过蛋白质A层析法纯化去糖基化抗体且通过Q-琼脂糖移除内毒素。使用上述Biacore检验来测试去糖基化2H6对Aβ1-40的结合亲和性，且发现去糖基化2H6对Aβ1-40的结合亲和性与完整抗体2H6一致。
实施例4：去糖基化抗体2H6(2H6-D)在年龄相关黄斑退化的动物模型中保护及恢复视网膜功能中的作用
初始研究(Malek，G.等人，PNAS102：11900-5(2005))证明以下三个风险因素的组合产生极近似人类AMD的临床特征的动物模型：(1)脂蛋白元同功异型物E4(APOE4)基因型、(2)老年(65周龄以上)及(3)高脂肪及胆固醇富含(HF-C)膳食。年老APOE4小鼠发展类似于在干型及湿型人类AMD中所观察的形态学特点的病变，包括视网膜色素上皮(RPE)色素改变、厚扩散RPE下沉积、脂质富含脉络膜小疣状沉积、布鲁赫膜增厚、上覆感光体退化的RPE萎缩的斑点区域及脉络膜新血管生成(CNV)。与膳食方案无关，在对照人类APOE3表达小鼠中的任一种中均未检测到此类改变，亦未在年轻APOE4动物中检测到任何病理学。自全视野暗视视网膜电图(full fieldscotopic electroretinogram)鉴定功能性不足。与对照相比，受影响的动物在a波振幅及b波振幅中具有显著减小。重要的是此类组织病理学及功能性改变需要存在所有三个风险因素。自发出现CNV的此动物模型首先并有人类疾病的生理上相关风险因素。
A.实验方案
抗体的施用。
将表达人类ApoE4的年老(65周龄以上)靶标置换小鼠用于实验。先前已公开(Malek，G.等人，PNAS102：11900-5(2005))存在于此类小鼠中的AMD状表型。对于八周治疗研究而言，将65周龄或65周龄以上的ApoE4转殖基因小鼠分配至四组中的一种。连续保持第一组(E4-ND)处于正常膳食(n＝2)。对第二组(E4-HFC-R1)喂食高脂肪、胆固醇富集(HF-C)膳食历时8周(n＝2)。对第三组(E4-HFC-R1)喂食HF-C膳食历时8周且使其每周接受Rinat1(3mg/kg)的腹膜内注射(n＝5)。对第四组(E4-HFC-R2)喂食HF-C膳食历时8周且使其每周接受Rinat2(3mg/kg)的腹膜内注射(n＝5)。研究完成之后，为各组去遮蔽(unmasked)：Rinat1为PBS介载体且Rinat2为去糖基化抗Aβ抗体2H6(如实例3中所述的小鼠单克隆抗人类Aβ28-40IgG2b′2H6-D′)。
体内评定。
在第0周进行眼底检查，而在第8周进行眼底及萤光素血管造影术。使用眼底相机(TRC-50EX视网膜相机)来拍摄照片。使用TOPCONIMAGEnetTM系统来捕获影像。经由血管出入孔(vascular access port)注射萤光素染料(10％萤光素钠，约0.1mL/kg)。染料注射之后，在若干时点拍摄照片以包括动脉相、早期动静脉相及若干晚期动静脉相，以便评估新血管生成且监测与CNV病变相关的萤光素渗漏。由眼科医师独立地进行萤光素血管造影术的解译及分析。
在施用8周HF-C膳食前后，自小鼠(禁食5小时)收集全血中的总血浆胆固醇含量。
萤光血管摄影术(FA)。
一动物(E4-HFC-R2)在血管造影术的晚期框架中展示可能的渗漏。在FA之后但在视网膜电图之前动物死亡且无组织可恢复。
视网膜电图记录。
在第九周期间，由暗适应至少12小时的动物获得视网膜电图(ERG)记录。用氯胺酮/甲苯噻嗪混合物麻醉各动物，其瞳孔放大且在动物稳定于37℃温暖垫上之后，使用置于与眼睛接触的银线测试电极连同一滴2.5％羟丙基甲基纤维素来记录ERG示踪。将小鼠置于适光刺激室中，在该室中将动物曝露于光闪(nashes of light)(最大强度1000cd-s/m2，自0.0005起始，以1个对数步长衰减)。自基线至a波波谷测量a波振幅，且自a波波谷至b波波峰测量b波振幅。
组织分析。
在杀死之日，将小鼠称重，以Avertin过度给药(0.2μl/10gm体重)，且接着以20mL盐水心内灌注。迅速移除脑部，且在新鲜制备的用于组织病理学的10％福尔马林(formalin)中将脑的左半边浸渍固定16h。以10％MeOH、1×PBS及2％H2O2预处理三十微米振动切片机切片(vibratomesection)，将其以PBS洗涤，在88％甲酸中培育1分钟以用于抗原恢复且以5％正常山羊血清(NGS)及PBS将其阻断。以1％NGS/PBS中的经生物素标记的4G8一抗(针对β-类淀粉的氨基酸残基17-24的Signet4G8单克隆小鼠人类IgG2b)的1∶1000稀释物培育切片过夜，且如制造商所述使用ABCVectastain试剂盒(Vector Labs)进行目测。
B.结果
通过施用去糖基化抗体来恢复/保护视网膜功能。
如图5中所示，相对于处于正常膳食的小鼠(E4-ND)，在喂食高脂肪及胆固醇富含膳食的ApoE4小鼠(E4-HFC)中，存在统计上显著的a波振幅及b波振幅的减小(a波p＝0.0106，b波p＝0.008)。将由经注射动物获得的ERG与ERG的基线组(baseline set)进行相比。与E4-HFC(未图标)相比，在任一经注射组(E4-HFC-R1及E4-HFC-R2)的a波振幅中不存在显著差异。相反地，在E4-HFC-R2组中，b波振幅展示视网膜功能的惊人恢复和/或保护(图6)。
在处于HF-C膳食的经注射抗Aβ抗体体2H6-D的APOE4小鼠中Aβ沉积的减少。如图7中所说明，8周用抗体2H6-D的免疫疗法后，与对照介载体组相比，E4-HFC小鼠中的总Aβ免疫染色减小。
C.结论
以上资料证明：1)视网膜功能的恢复/保护，如由经注射抗Aβ抗体2H6-D的小鼠的ERG证明，及2)与未经治疗的AMD小鼠组相比，当以抗体2H6-D在小鼠脑中治疗时，类淀粉沉积减少。
实施例5.抗体6G及其变异体的结合亲和性测定
A.通用方法
将以下通用方法用于此实例及其它实例中。
用于克隆分析的表达载体
抗体的Fab片段表达处于类似于Barbas(2001)Phage display：alaboratory manual，Cold Spring Harbor，NY，Cold Spring Harbor LaboratoryPress pg2.10.Vector pComb3X)中所述启动子的IPTG诱导性1acZ启动子控制下，然而修饰包括添加及表达以下额外域：IgG2a人类免疫球蛋白的人类κ轻链恒定结构域及CHI恒定结构域、Igγ-2链C区、蛋白质检录号P01859；免疫球蛋白κ轻链(智人)、蛋白质检录号CAA09181。
小规模Fab制备
如下进行96孔板中的Fab小规模表达。自以Fab库转型的大肠杆菌起始，挑选菌落以接种母板(琼脂LB+胺苄青霉素(50μg/ml)+2％葡萄糖)及工作板(2毫升/孔，96孔/板，含有1.5mL LB+胺苄青霉素(50μg/ml)+2％葡萄糖)。两板均在30℃下生长8-12小时。将母板储存在4℃下，使来自工作板的细胞在5000rpm下粒化且以1mL LB+胺苄青霉素(50μg/ml)+1mM IPTG将其再悬浮以诱导Fab表达。在30℃下5h的表达时间后通过离心来收集细胞，接着将细胞再悬浮于500μL缓冲液HBS-P(10mM HEPES缓冲液(pH7.4)，150mM NaCl，0.005％P20)中。通过冷冻(-80℃)接着在37℃下融化的一个循环来达成HBS-EP再悬浮细胞的溶胞。以5000rpm将细胞溶胞物离心30min以自含有Fab的上清液分离细胞碎片。接着将上清液注入BIAcore等离子体共振装置中以获得各Fab的亲和性信息。自母板取出表达Fab的克隆以将DNA测序且用于如下所述的大规模Fab制造及详细分析。
大规模Fab制备
为获得详细动力学参数，表达Fab且将其自大规模培养物纯化。以来自所选Fab表达大肠杆菌克隆的5mL过夜培养物接种含有200mL LB+胺苄青霉素(50μg/ml)+2％葡萄糖的锥形瓶。在30℃下培育克隆直至达成1.0的OD550nm，且接着通过将培养基置换为200ml LB+胺苄青霉素(50μg/ml)+1mM IPTG来将其诱导。在30℃下5h的表达时间后，通过离心使细胞粒化，接着将其再悬浮于10mL PBS(pH8)中。通过冷冻/融化(分别在-80℃及37℃下)的两个循环获得细胞的溶胞。将细胞溶胞物的上清液负载于以PBS(pH8)平衡的Ni-NTA超流琼脂糖(Qiagen，Valencia.CA)管柱上，接着以5管柱体积的PBS(pH8)洗涤。以PBS(pH8)+300mM咪唑来洗脱处于不同级份中的各Fab。将含有Fab的级分汇集且于PBS中渗析，接着通过ELISA定量，随后进行亲和性分析。
全抗体制备
为表达全抗体，将重链及轻链可变区克隆于哺乳动物表达载体中且使用脂质转染胺将其转染于HEK293细胞中以瞬间表达。使用标准方法，使用蛋白质A来纯化抗体。
载体pDb.6G.hFc2a为包含6G抗体的重链的表达载体且适用于重链的瞬间或稳定表达。载体pDb.6G.hFc2a具有对应于以下区域的核苷酸序列：鼠类细胞巨大病毒启动子区(核苷酸1-612)；合成内含子(核苷酸619-1507)；DHFR编码区(核苷酸707-1267)；人类生长激素信号肽(核苷酸1525-1602)；6G的重链可变区；含有以下突变的人类重链IgG2a恒定区：A330P331至S330S331(参考野生型IgG2a序列的氨基酸编号；参见Eur.J.Immunol.(1999)29：2613-2624)；SV40晚期多聚腺嘌呤信号；SV40增强子区；噬菌体f1区及β内酰胺酶(AmpR)编码区。
载体pEb.6G.hK为包含6G抗体的轻链的表达载体且适用于轻链的瞬间表达。载体pEb.6G.hK具有对应于以下区域的核苷酸序列：鼠类细胞巨大病毒启动子区(核苷酸1-612)；人类EF-1内含子(核苷酸619-1142)；人类生长激素信号肽(核苷酸1173-1150)；抗体6G轻链可变区；人类κ链恒定区；SV40晚期多聚腺嘌呤信号；SV40增强子区；噬菌体f1区及β内酰胺酶(AmpR)编码区。
Biacore检验
使用BlAcore3000TM表面等离子体共振(SPR)系统(BIAcore，INC，Piscaway NJ)使用上文实例1中所述的方法来测定6G单克隆抗体的亲和性。
ELISA检验
将ELISA用于测量抗体6G及变异体与非经生物素标记的Aβ肽的结合。在4℃下以在PBS(pH7.4)中的2.5μg/ml Aβ肽涂布NUNC maxisorp板历时多于1小时。以PBS缓冲液(pH7.4)中的1％BSA来阻断板。在室温下使一抗(来自细胞上清液、含抗Aβ抗体的血清或处于所需稀释度的经纯化全抗体或Fab)与固定Aβ肽培育1h。洗涤之后，用二抗(以1∶5000稀释的HRP缀合山羊抗人类κ链抗体(MP Biomedicals，55233))培育板。洗涤之后，通过添加TMB受体(KPL，50-76-02，50-65-02)来测量所结合的二抗。通过添加1M磷酸来终止HRP反应且测量在450nm处的吸光度。
将ELISA用于测量抗体6G及变异体与经生物素标记的Aβ肽的结合。在4℃下以在PBS(pH7.4)中的6μg/ml链亲和素(Pierce，21122)涂布NUNCmaxisorp板历时多于1小时。以PBS缓冲液(pH7.4)中的1％BSA来阻断板。洗涤之后，在室温下将PBS(pH7.4)中的经生物素标记的Aβ肽培育1小时。在室温下使一抗(来自细胞上清液、含抗Aβ抗体的血清或处于所需稀释度的经纯化全抗体或Fab)与固定Aβ肽培育1h。洗涤之后，用二抗(以1∶5000稀释的HRP缀合山羊抗人类κ链抗体(MP Biomedicals，55233))培育板。洗涤之后，通过添加TMB受体(KPL，50-76-02，50-65-02)来测量所结合的二抗。通过添加1M磷酸来终止HRP反应且测量在450nm处的吸光度。
B.抗体6G及变异体对Aβ1-40、Aβ1-42及其它Aβ肽的结合亲和性
图8中展示抗体6G的重链及轻链可变区的氨基酸序列。下表7中展示使用上述Biacore测定的6G抗体对Aβ1-40、Aβ1-42及Aβ22-37的结合亲和性。
表7.抗体6G Fab片段的结合亲和性
下表8中展示了6G的变异体的氨基酸序列。表8中所示的变异体的所有氨基酸取代均是相对于6G的序列来描述的。6G变异体的相对结合也展示于表8中。通过上述ELISA以固定于ELISA板表面上的非经生物素标记的Aβ1-40或Aβ1-42来测定结合。
表8.抗体6G变异体的氨基酸序列及结合资料。
实施例6：抗体6G所结合的Aβ肽上的表位的分析
为测定由抗体6G识别的Aβ肽上的表位，使用ELISA结合分析。将各种Aβ肽(Global Peptide Services，CO)固定于ELISA板上。通过如上所述的ELISA来测定6G全抗体(20nM)与固定Aβ的结合。下表9中展示Aβ1-40、Aβ1- 42及Aβ1-43的氨基酸序列。如图9中所示，抗体6G与Aβ肽17-40、17-42、22-35、28-40、1-38、1-40、1-42、1-43及28-42结合；但与28-42的结合较比与其它Aβ肽的结合弱得多。抗体6G并不与Aβ肽1-16、1-28及33-40结合。因此，抗体6G与例如22-35、1-38、1-40、1-42及1-43的各种截短Aβ肽的C末端结合。
下表9展示了如使用Biacore检验通过koff(1/s)测量的6G对Aβ1-40与对其他Aβ肽的结合亲和性比较。抗体6G以与其它肽相比最高的亲和性与Aβ1-40结合，其中对截短Aβ1-40(例如1-36、1-37、1-38及1-39)、Aβ1-42及Aβ1-43具有显著较低亲和性。此表明Aβ的氨基酸40(缬氨酸)的侧链或主链系与6G与Aβ1- 40的结合有关；且当不存在此氨基酸时结合显著减小(例如约10至约50-250倍的亲和性损失)。以较低亲和性与羧基末端酰胺化Aβ1-40的结合表明6G与Aβ1-40的结合涉及(但不取决于)Aβ1-40的游离C末端。与Aβ1-42及Aβ1-43的较低亲和性结合可归因于在Aβ1-40与Aβ1-42或Aβ1-43的单体形式间的构型差异。已展示Aβ1-42的单体具有不同于溶液中Aβ1-40单体的构型。参见蛋白质数据库(Protein Data Bank)(pdb档案)中所示具有检录号1IYT的Aβ1-42的单体结构同等物；及蛋白质数据库(βdb档案)中所示具有检录号1BA6及1BA4的Aβ1-40的单体结构同等物。
表9
作为分析物，肽流动于具有通过胺化学固定的6G单克隆抗体(配位体)的CM5芯片上
#羧基端酰胺化的肽
通过ELISA检验进行抗体6G的表位定位。将各种Aβ肽(此类肽具有添加至C末端的甘氨酸)的经生物素标记的15聚体(15-mer)或10聚体(10-mer)固定于链亲和素涂布板上。以固定肽培育抗体6G(2.5Hg/ml至10μg/ml)且如上所述测量结合。如图10中所示，抗体6G与具有氨基酸20-34、21-35、22-36、23-37、24-38、25-39及25-34的Aβ肽(在C末端具有甘氨酸)结合；但并不与具有氨基酸19-33、26-40、27-41、24-33及26-35的Aβ肽(在此类肽的C末端具有甘氨酸)结合。此表明抗体6G所结合的表位包括氨基酸25至34。
基于上文所示资料，抗体所6G结合的表位似乎包括氨基酸25-34及40。图11为展示抗体6G的表位的示意图。
B.抗体6G并不与APP结合
为测定6G是否与类淀粉前驱蛋白质(APP)结合，测定6G与以野生型APP转染的细胞的结合。以编码野生型人类类淀粉前驱蛋白质的cDNA转染HEK293细胞。转染四十八小时之后，在冰上以单克隆抗体抗Aβ1-16、(m2324)或6G(5μg/ml，在具有10％FCS的DMEM中)将细胞培育45分钟。接着在PBS中将细胞洗涤三次历时5分钟，以4％PFA固定。在PBS中将细胞再洗涤三次，且在萤光显微镜下以来自Jackson Immunoresearch的Cy3缀合山羊抗小鼠二抗(1∶500的稀释物)检测抗体结合。
如图12中所示，识别Aβ中N末端表位的抗Aβ1-16抗体展示与表达于细胞上的APP前驱蛋白质的显著结合。相反，6G并不与APP表达细胞结合。
实施例7：鼠类抗体7G10(抗Aβ1-42/Aβ1-43)的制造及分析。
以～100μg在佐剂中与KLH缀合的肽使小鼠免疫，如Konig，G.等人，Annals New York Academy of Sciences.777：344-55(1996)中所述。因为BA4肽的位置29-42完全处于APP推定跨膜区域内且本质上为疏水性的，所以KLH肽与亲水性间隔基缀合。KLH-HDGDGD-MVGGVVIA系在Anaspec下合成，且5个残基间隔基足以克服不溶性问题且将C末端扩展远离载剂。在第一天，以具有CFA(傅氏完全佐剂)的100μg35-42/KLH肽以皮下方式使小鼠免疫。在第15天，以100μg肽/KLH Ribi/矾使小鼠免疫。在第55天，如第15天般使小鼠免疫。在第95天，以100μg肽/KLH以静脉内方式对小鼠进行加强免疫。
自经免疫小鼠获得脾细胞，且在第99天用聚乙二醇1500融合使其以10∶1的比率与P3x63Ag8.653骨髓瘤细胞(ATCC CRL1580)融合。将融合细胞接种于(plated into)DMEM中的96孔板中，该DMEM含有20％马血清及2-草酰乙酸盐/丙酮酸盐/胰岛素(Sigma)，且上清液在融合之后第10天使用Elisa检验开始检验，且以2μg/ml Aβ1-42(Anaspec)涂布。选择及扩增阳性物及进一步对其加以分析。
当测试Aβ1-42游离肽时，融合的日的小鼠血清力价为1/9000。由Biacore分析7G10与Aβ1-40、1-42及1-43的亲和性结合。
Biacore检验
如实例1中先前所述使用来测定7G10抗体的亲和性。将N-生物素标记的Aβ1-40、1-42及1-43捕获于SA芯片上。以上列7G10备料的1/6稀释物起始，分别注射抗Aβ1-40Fab、抗Aβ1-42Fab及抗Aβ1-43Fab的三倍稀释物系列。以6％EtOH+6mM NaOH的18sec脉冲使芯片再生。
如上所指出，7G10对Aβ1-42肽具有37.6nM的KD且对Aβ1-43肽具有41nM的KD。对Aβ1-40肽未检测到可测量的结合。
实施例10：抗体9TL、6G及7G10在年龄相关黄斑退化动物模型中保护及恢复视网膜功能中的比较作用
A.实验方案
抗体的施用。
重复如上文实例4中所述的方案。将65周龄或65周龄以上的ApoE4转殖基因小鼠分配至5组中的一种历时八周。连续保持第一组(E4-ND)处于正常膳食(n＝6)。对第二组(E4-HFC-R1)喂食高脂肪、胆固醇富集(HF-C)膳食历时8周(n＝12)。对第三组(E4-HFC-R1)喂食FHF-C膳食历时8周且使其每周接受Rinat3(3mg/kg)的腹膜内注射(n＝12)。对第四组(E4-HFC-R2)喂食HF-C膳食历时8周且使其每周接受Rinat4(3mg/kg)的腹膜内注射(n＝12)。对第五组(E4-HFC-R)喂食HF-C膳食历时8周且使其每周接受Rinat5(3mg/kg)的腹膜内注射(n＝12)。研究完成之后，为各组去遮蔽：Rinat3为7G10；Rinat4为去糖基化抗Aβ抗体2H6；且Rinat5为6G。
如上文实例4中先前所述来进行眼底检查及萤光素血管造影术。第八周之后，如上文实例4中先前所述来获得ERG记录。
结果
通过施用去糖基化抗体来恢复/保护视网膜功能。
如图13中所示，b波振幅证实在以2H6(E4-HFC抗Aβ1-40)治疗的组中显著恢复和/或保护视网膜功能。b波振幅表明以7G10(E4-HFC抗Aβ1-42/Aβ1-43)治疗的组几乎无恢复。令人惊讶地，b波振幅表明在6G(E4-HFC抗Aβ1-40/Aβ1- 42)治疗的组中甚至更大地恢复和/或保护视网膜功能。如图14中所示，以6G治疗的组的b波振幅可与正常小鼠的对照组相当，表明视网膜功能的完全恢复和/或保护。
结论
以上资料证明：1)RPE下类淀粉在AMD中为病原性和/或毒性的；2)显著恢复/保护视网膜功能，如由经抗Aβ抗体2H6-D注射的小鼠的ERG证明；及3)完全恢复/保护视网膜功能，如由经双特异性抗Aβ1-40/Aβ1-426G注射的小鼠的ERG证明。
应了解：本文所述的实施例及实施方式系仅出于说明性目的，在本文教导下，本领域技术人员能够提出各种修改或改变，它们将被包括于本申请的宗旨及范围内。本文中所引用的所有公开文本、专利及专利申请都出于所有目的而以通过引用全部并入本文中，引用的程度就如同已特定地及个别地表明将各个别公开文本、专利或专利申请以引用的方式并入一样。
生物材料的保藏
已由American Type Culture Collection，10801University Boulevard，Manassas，Virginia20110-2209，USA(ATCC)保藏以下物质。
载体pEb.9TL.hK为编码9TL轻链可变区及轻链κ恒定区的多核苷酸；且载体pDb.9TL.hFc2a为编码9TL重链可变区及重链IgG2a恒定区的多核苷酸，该重链IgG2a恒定区含有以下突变：A330P331至S330S331(参考野生型IgG2a序列的氨基酸编号；参见Eur.J. Immunol.(1999)29：2613-2624)。
载体pEb.6G.hK为编码6G轻链可变区及轻链κ恒定区的多核苷酸；且载体pDb.6G.hFc2a为编码6G重链可变区及重链IgG2a恒定区的多核苷酸，该重链IgG2a恒定区含有以下突变：A330P331至S330S331(参考野生型IgG2a序列的氨基酸编号；参见Eur.J. Immunol.(1999)29：2613-2624)。
在国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约(Budapest Treatyon the Intemational Recognition of the Deposit of Microorganisms for thePurpose of Patent Procedure)及其(布达佩斯条约)条例的条款下执行此类保藏。此举确保自保藏的日起保持保藏物的可存活行培养物历时30年。该保藏物将通过ATCC在布达佩斯条约款项下而可获得，且服从在RinatNeuroscience Corp.与ATCC之间的协议，其确保一旦相关美国专利公布或一旦使任何美国或国外专利申请案(无论何者首先出现)变得公诸于众，公众即可获得保藏物的培养物的子代永久及无限制利用性，且确保对根据35USC Section122及依照其的委员细则(包括37CFR Section1.14，其特定参考886OG638)，由美国专利与商标委员对其授权所确定者可获得子代的利用性。
本申请案的受让人已同意若保藏中材料的培养物在合适条件下培养时死亡或损失或破坏，则将通知立即以另一相同物替换此类材料。不应将保藏材料的利用性理解为在违背任何政府当局根据其专利法授予的权利的情况下实践本发明的许可。
抗体序列
9TL重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：1)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYYTEAYYIHWVRQAPGQGLE
WMGRIDPATGNTKYAPRLQDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAV
YYCASLYSLPVYWGQGTTVTVSS
9TL轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：2)
DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDAKTYLNWFQQRPGQ
SPRRLIYQISRLDPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQ
GTHYPVLFGQGTRLEIKRT
9TL CDR H1(扩展CDR)(SEQ ID NO：3)
GYYTEAYYIH
9TL CDR H2(扩展CDR)(SEQ ID NO：4)
RIDPATGNTKYAPRLQD
9TL CDR H3(扩展CDR)(SEQ ID NO：5)
LYSLPVY
9TL CDR L1(扩展CDR)(SEQ ID NO：6)
KSSQSLLYSDAKTYLN
9TL CDR L2(扩展CDR)(SEQ ID NO：7)
QISRLDP
9TL CDR L3(扩展CDR)(SEQ ID NO：8)
LQGTHYPVL
9TL重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO：9)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGTGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCTTCCGTGA
AGGTTTCCTGCAAAGCATCTGGTTACTATACGGAGGCTTACTATATCCACTGGGTGC
GCCAAGCCCCTGGTCAAGGCCTGGAGTGGATGGGCAGGATTGATCCTGCGACTGG
TAATACTAAATATGCCCCGAGGTTACAGGACCGGGTGACCATGACTCGCGATACCT
CCACCAGCACTGTCTACATGGAACTGAGCTCTCTGCGCTCTGAGGACACTGCTGTG
TATTACTGTGCCTCCCTTTATAGTCTCCCTGTCTACTGGGGCCAGGGTACCACTGTT
ACCGTGTCCTCT
9TL轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO：10)
GATGTTGTGATGACCCAGTCCCCACTGTCTTTGCCAGTTACCCTGGGACAACCAG
CCTCCATATCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTATATAGTGATGCCAAGACATATT
TGAATTGGTTCCAACAGAGGCCTGGCCAGTCTCCACGCCGCCTAATCTATCAGATT
TCCCGGCTGGACCCTGGCGTGCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACA
GATTTTACACTTAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATGTGGGAGTTTATTACTG
CTTACAAGGTACACATTATCCGGTGCTCTTCGGTCAAGGGACCCGCCTGGAGATC
AAACGCACT
9TL重链全抗体氨基酸序列(包括如本文所述的经修饰IgG2a)(SEQ ID NO：11)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYYTEAYYIHWVRQAPGQGLEWMGRIDPATG
NTKYAPRLQDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCASLYSLPVYWGQGTTVTV
SSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV
LQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPV
AGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE
EQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLP
PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKL
TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
9TL轻链全抗体氨基酸序列(SEQ ID NO：12)
DWMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQSLLYSDAKTYLNWFQQRPGQSPRRLIYQISR
LDPGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGTHYPVLFGQGTRLEIKRTVA
APSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS
KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
9TL重链全抗体核苷酸序列(包括如本文所述的经修饰IgG2a)(SEQ ID NO：13)
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGTGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCTTCCGTGA
AGGTTTCCTGCAAAGCATCTGGTTACTATACGGAGGCTTACTATATCCACTGGGTG
CGCCAAGCCCCTGGTCAAGGCCTGGAGTGGATGGGCAGGATTGATCCTGCGACTG
GTAATACTAAATATGCCCCGAGGTTACAGGACCGGGTGACCATGACTCGCGATACC
TCCACCAGCACTGTCTACATGGAACTGAGCTCTCTGCGCTCTGAGGACACTGCTGT
GTATTACTGTGCCTCCCTTTATAGTCTCCCTGTCTACTGGGGCCAGGGTACCACTG
TTACCGTGTCCTCTGCCTCCACCAAGGGCCCATCTGTCTTCCCACTGGCCCCATGC
TCCCGCAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACT
TCCCAGAACCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCA
CACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCCTCAGGTCTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGA
CCGTGCCATCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAA
GCCAAGCAACACCAAGGTCGACAAGACCGTGGAGAGAAAGTGTTGTGTGGAGTGT
CCACCTTGTCCAGCCCCTCCAGTGGCCGGACCATCCGTGTTCCTGTTCCCTCCAAA
GCCAAAGGACACCCTGATGATCTCCAGAACCCCAGAGGTGACCTGTGTGGTGGTG
GACGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGCAGTTCAACTGGTATGTGGACGGAGTGG
AGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCAAGAGAGGAGCAGTTCAACTCCACCTTCAG
AGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGAAAGGAGTAT
AAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGACTGCCATCCAGCATCGAGAAGACCATCTCCAA
GACCAAGGGACAGCCAAGAGAGCCACAGGTGTATACCCTGCCCCCATCCAGAGAG
GAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGATTCTATCCATC
CGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGACAGCCAGAGAACAACTATAAGACC
ACCCCTCCAATGCTGGACTCCGACGGATCCTTCTTCCTGTATTCCAAGCTGACCGT
GGACAAGTCCAGATGGCAGCAGGGAAACGTGTTCTCTTGTTCCGTGATGCACGAG
GCCCTGCACAACCACTATACCCAGAAGAGCCTGTCCCTGTCTCCAGGAAAGTAATT
CTAGA
9TL轻链全抗体核苷酸序列(SEQ ID NO：14)
GATGTTGTGATGACCCAGTCCCCACTGTCTTTGCCAGTTACCCTGGGACAACCAGC
CTCCATATCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTATATAGTGATGCCAAGACATATTT
GAATTGGTTCCAACAGAGGCCTGGCCAGTCTCCACGCCGCCTAATCTATCAGATTT
CCCGGCTGGACCCTGGCGTGCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAG
ATTTTACACTTAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATGTGGGAGTTTATTACTGCT
TACAAGGTACACATTATCCGGTGCTCTTCGGTCAAGGGACCCGCCTGGAGATCAAA
CGCACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCTCCATCTGATGAGCAGTTGAA
ATCCGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCACGCGAGGCCA
AAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCGGTAACTCCCAGGAGAGTGT
CACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACCCTG
AGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGG
GCCTGAGTTCTCCAGTCACAAAGAGCTTCAACCGCGGTGAGTGCTAATTCTAG
6G重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：26)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYAIHWVRQ
APGQGLEWMGFTSPYSGVSNYNQKFKGRVTMTRDTSTST
VYMELSSLRSEDTAVYYCARFDNYDRGYVRDYWGQGTLV
TVS
6G轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：27)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNDRISFLNW
YQQKPGQPPKLLIYAATKQGTGVPDRFSGSGSGTDFTLT
ISSLQAEDVAVYYCQQSKEFPWSFGGGTKVEIKRTV
6G CDR H1(扩展CDR)(SEQ ID NO：28)
GYTFTTYAIH
6G CDR H2(扩展CDR)(SEQ ID NO：29)
FTSPYSGVSNYNQKFKG
6G CDR H3(扩展CDR)(SEQ ID NO：30)
FDNYDRGYVRDY
6G CDR L1(扩展CDR)(SEQ ID NO：31)
RASESVDNDRISFLN
6G CDR L2(扩展CDR)(SEQ ID NO：32)
AATKQGT
6G CDR L3(扩展CDR)(SEQ ID NO：33)
QQSKEFPWS
6G重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO：34)
CAGGTGCAACTGGTGCAATCCGGTGCCGAGGTGAAAAAGCCAGGCGCCTCCGTGA
AAGTGTCCTGCAAAGCCTCCGGTTACACCTTTACCACCTATGCCATCCATTGGGTG
CGCCAGGCCCCAGGCCAGGGTCTGGAGTGGATGGGCTTTACTTCCCCCTACTCCG
GGGTGTCGAATTACAATCAGAAGTTCAAAGGCCGCGTCACCATGACCCGCGACACC
TCCACCTCCACAGTGTATATGGAGCTGTCCTCTCTGCGCTCCGAAGACACCGCCGT
GTATTACTGTGCCCGCTTCGACAATTACGATCGCGGCTATGTGCGTGACTATTGGG
GCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCC
6G轻链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO：35)
GACATCGTGATGACCCAGTCCCCAGACTCCCTGGCCGTGTCCCTGGGCGAGCGC
GCCACCATCAACTGCCGCGCCAGCGAATCCGTGGATAACGATCGTATTTCCTTTCT
GAACTGGTACCAGCAGAAACCAGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACGCCGCC
ACCAAACAGGGTACCGGCGTGCCTGACCGCTTCTCCGGCAGCGGTTCCGGCACC
GATTTCACTCTGACCATCTCCTCCCTGCAGGCCGAAGATGTGGCAGTGTATTACTG
TCAGCAGTCCAAAGAGTTTCCCTGGTCCTTTGGCGGTGGCACCAAGGTGGAGATC
AAACGCACTGTG
6G重链全抗体氨基酸序列(包括如本文所述的经修饰IgG2a)(SEQ ID NO：36)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYAIHWVRQAPGQGLEWMGFTSPYSG
VSNYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARFDNYDRGYVRDYWG
QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECP
PCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHN
AKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPR
EPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSD
GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
6G轻链全抗体氨基酸序列(SEQ ID NO：37)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNDRISFLNWYQQKPGQPPKLLIYAATKQ
GTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEFPWSFGGGTKVEIKRTVA
APSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS
KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
6G重链全抗体核苷酸序列(包括如本文所述的经修饰IgG2a)(SEQ ID NO：38)
CAGGTGCAACTGGTGCAATCCGGTGCCGAGGTGAAAAAGCCAGGCGCCTCCGTGA
AAGTGTCCTGCAAAGCCTCCGGTTACACCTTTACCACCTATGCCATCCATTGGGTG
CGCCAGGCCCCAGGCCAGGGTCTGGAGTGGATGGGCTTTACTTCCCCCTACTCCG
GGGTGTCGAATTACAATCAGAAGTTCAAAGGCCGCGTCACCATGACCCGCGACAC
CTCCACCTCCACAGTGTATATGGAGCTGTCCTCTCTGCGCTCCGAAGACACCGCC
GTGTATTACTGTGCCCGCTTCGACAATTACGATCGCGGCTATGTGCGTGACTATTG
GGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCTGTC
TTCCCACTGGCCCCATGCTCCCGCAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCT
GCCTGGTCAAGGACTACTTCCCAGAACCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGC
TCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCCTCAGGTCTCTACT
CCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCATCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACAC
CTGCAACGTAGATCACAAGCCAAGCAACACCAAGGTCGACAAGACCGTGGAGAGA
AAGTGTTGTGTGGAGTGTCCACCTTGTCCAGCCCCTCCAGTGGCCGGACCATCCG
TGTTCCTGTTCCCTCCAAAGCCAAAGGACACCCTGATGATCTCCAGAACCCCAGAG
GTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGCAGTTCAACT
GGTATGTGGACGGAGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCAAGAGAGGAGC
AGTTCAACTCCACCTTCAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTG
GCTGAACGGAAAGGAGTATAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGACTGCCATCCAGC
ATCGAGAAGACCATCTCCAAGACCAAGGGACAGCCAAGAGAGCCACAGGTGTATA
CCCTGCCCCCATCCAGAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCT
GGTGAAGGGATTCTATCCATCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGACAG
CCAGAGAACAACTATAAGACCACCCCTCCAATGCTGGACTCCGACGGATCCTTCTT
CCTGTATTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAGCAGGGAAACGTGTTC
TCTTGTTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTATACCCAGAAGAGCCTGTC
CCTGTCTCCAGGAAAG
6G轻链全抗体核苷酸序列(SEQ ID NO：39)
GACATCGTGATGACCCAGTCCCCAGACTCCCTGGCCGTGTCCCTGGGCGAGCGC
GCCACCATCAACTGCCGCGCCAGCGAATCCGTGGATAACGATCGTATTTCCTTTCT
GAACTGGTACCAGCAGAAACCAGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACGCCGCC
ACCAAACAGGGTACCGGCGTGCCTGACCGCTTCTCCGGCAGCGGTTCCGGCACC
GATTTCACTCTGACCATCTCCTCCCTGCAGGCCGAAGATGTGGCAGTGTATTACTG
TCAGCAGTCCAAAGAGTTTCCCTGGTCCTTTGGCGGTGGCACCAAGGTGGAGATC
AAACGCACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCTCCATCTGATGAGCAGTT
GAAATCCGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCACGCGAGG
CCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCGGTAACTCCCAGGAGAG
TGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACC
CTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCA
GGGCCTGAGTTCTCCAGTCACAAAGAGCTTCAACCGCGGTGAGTGC
m7G10重链氨基酸序列(SEQ ID NO：40)
EVKLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSTYAMSWIRQTPEKRLEVWASIG
NSSRTYYPDSVKGRFTISRDNAGSILYLQMSSLRSEDTAIYYCARGEDGNYAWFT
YWGQGTQVTVS
m7G10轻链氨基酸序列(SEQ ID NO：41)
DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSVKNNLHWYQQKSHESPRLLIKYTFQS
MSGIPSRFSGSGSGTDFTLIINSVETEDFGMYFCQQSNRWPLTFGAGTKLEL
m7G10H1CDR氨基酸序列(SEQ ID NO：42)
TYAMS
m7G10H2CDR氨基酸序列(SEQ ID NO：43)
SIGNSSRTYYPDSVKG
m7G10H3CDR氨基酸序列(SEQ ID NO：44)
GEDGNYAWFTY
m7G10L1氨基酸序列(SEQ ID NO：45)
RASQSVKNNLH
m7G10L2氨基酸序列(SEQ ID NO：46)
YTFQSMS
m7G10L3氨基酸序列(SEQ ID NO：47)
QQSN RWPLT
m7G10HC重链核苷酸序列(SEQ ID NO：48)
GAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTG
AAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTACCTATGCCATGTCTTGGATT
CGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCCTCCATTGGTAATAGTAGTA
GGACTTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCC
GGGAGCATCCTGTACCTCCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATTT
ATTATTGTGCAAGAGGGGAAGATGGTAACTACGCCTGGTTTACTTACTGGGGCCAA
GGGACTCAGGTCACCGTCTCC
M7G10HC轻链核苷酸序列(SEQ ID NO：49)
GATATTGTGCTAACTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGACTCCAGGAGATAGCGT
CAGTCTTTCCTGCAGGGCCAGCCAAAGTGTTAAGAACAACCTACACTGGTATCAAC
AAAAGTCACATGAGTCTCCAAGGCTTCTCATCAAGTATACTTTCCAGTCCATGTCTG
GGATCCCCTCCAGGTTCAGTGGCAGTGGCTCAGGGACAGATTTCACTCTCATTATC
AACAGTGTGGAGACTGAAGATTTTGGAATGTATTTCTGTCAACAGAGTAACCGTTG
GCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTG

Claims (15)

1.治疗患有眼科疾病的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的β类淀粉(Aβ)肽。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体与选自由Aβ1-36、Aβ1-37、Aβ1-38、Aβ1-39、Aβ1-40、Aβ1-42及Aβ1-43组成的组的Aβ肽特异性结合。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体与Aβ1-40上的表位特异性结合。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述抗体还与Aβ1-42上的表位特异性结合。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述疾病为年龄相关的黄斑退化。
6.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体以约100nM或更小的KD与所述Aβ肽结合。
7.如权利要求3所述的方法，其中该抗体以约100nM或更小的KD与所述Aβ1-40肽结合。
8.如权利要求8所述的方法，其中该抗体还以约100nM或更小的KD与所述Aβ1-42肽结合。
9.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体与所述Aβ肽的C端结合。
10.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体与Aβ1-40上包括氨基酸25-34及40的表位结合。
11.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体以高于其与Aβ1-42及Aβ1-43结合的亲和性与Aβ1-40结合，且其中所述抗体不是抗体2294。
12.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体的Fc区未经N-糖基化或具有相对于天然Fc区而言经改变的N-糖基化模式。
13.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体包含下述重链可变区和下述轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：26中所示的抗体6G重链可变区的三个CDRs，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：27中所示的抗体6G轻链可变区的三个CDRs。
14.如权利要求2所述的方法，其中所述抗体包含下述重链可变区和下述轻链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO：26中所示的氨基酸序列，所述轻链可变区包含SEQ ID NO：27中所示的氨基酸序列。
15.治疗患有年龄相关的黄斑退化的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的抗体，其中，所述抗体与Aβ1-40及Aβ1-42上的表位特异性结合。
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