JP4840939B2 - Ｄｋｋ−１に対する抗体 - Google Patents

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Description

（関連出願への相互参照）
本願は、２００４年８月４日に出願された米国仮特許出願第６０／５９８，７９１号の利益を主張する。米国仮特許出願第６０／５９８，７９１号は、全ての目的のために、その全体が参考として本明細書中に援用される。
（発明の分野）
本発明は、ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１（Ｄｋｋ−１）タンパク質に対する選択的結合因子に関するものであり、より具体的には、Ｄｋｋ−１タンパク質のカルボキシル部分に位置するエピトープに対する選択的結合を媒介する抗体および抗原結合ドメインならびにＣＤＲ領域に関する。
（発明の背景）
生体骨組織は、骨の沈着と再吸収との間で動的平衡を示す。これらの過程は、主として以下の２つの細胞型により媒介される：骨の有機基質を含む分子を分泌する骨芽細胞、骨基質の溶解および骨塩類の可溶化を媒介する溶骨細胞。骨が成長している若齢個体においては、骨の沈着率が、骨の再吸収率を上回っているが、一方、老齢個体における再吸収率は、沈着率を上回り、骨質量の正味損失に至り得る。後者の状況により、骨折のリスク増大および破骨修復の遅速または不完全性をもたらし得る。これらの過程の基礎をなす分子機構を理解することは、骨疾患治療のための治療薬開発にとって重要である。ヒト遺伝学は、これらの機構の解明に主要な役割を演じており、異化作用および同化作用の骨活性双方に関与する複数因子の同定を可能にしている（非特許文献１；非特許文献２）。
ディックコップ（ｄｉｃｋｋｏｐｆ）−１（Ｄｋｋ−１）は、骨発生および骨形成における中心的な役割を有するカノニカルＷｎｔシグナル伝達経路の負の調節因子であることが分かっているタンパク質であるディックコップファミリーのメンバーである（例えば、非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；および非特許文献６を参照）。Ｄｋｋ−１は、Ｗｎｔ共受容体ＬＲＰ５またはＬＰＲ６およびクレメン（ｋｒｅｍｅｎ）タンパク質との相互作用を介してＷｎｔシグナル伝達を阻害する（例えば、非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；および非特許文献１０を参照）。ＬＲＰ５（ＬＲＰ６）およびクレメンタンパク質に結合することにより、Ｄｋｋ−１は、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６がＷｎｔ経路のメンバーと結合することを防いで、Ｗｎｔ媒介シグナル伝達を防ぎ、次いで骨形成阻害に至る。
ＬＲＰ５は、骨質量を調節する上で重要なタンパク質である（例えば、非特許文献１１；非特許文献１２を参照）。低骨質量を特徴とする常染色体性劣性障害（骨粗しょう症−偽性膠腫症候群、または「ＯＰＰＧ」）は、ＬＲＰ５における機能喪失変異が原因であるものとして確認されている（Ｇｏｎｇら、２００１年）。さらに、ＬＲＰ５における機能獲得変異により、ヒトにおいて常染色体優性の高骨質量を生じさせることが示されている（非特許文献１３）。高骨質量を生じさせるＬＲＰ５における同じ変異は、Ｄｋｋ−１の能力を妨害してＬＲＰ５シグナル伝達を阻害できる（例えば、非特許文献１４を参照）。したがって、Ｄｋｋ−１は、骨沈着の負の調節因子であるとして特徴付けられるのが相応である。
骨形成の調節におけるＤｋｋ−１の関与および骨喪失に関連する種々の他の疾患（例えば、癌および糖尿病）におけるその役割を鑑みて、治療的使用および他の目的のために抗Ｄｋｋ−１抗体の改善が必要である。
ＪａｎｓｓｅｎｓおよびＶａｎ Ｈｕｌ、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎ、２００２年、１１（２０）：２３８５−９３頁 Ｒａｌｓｔｏｎ、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎ Ｍｅｔａｂ．２００２年、８７（６）：２４６０−６６頁 Ｇｌｉｎｋａら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９８）３９１：３５７−６２頁 Ｆｅｄｉら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９９９）２７４（２７）：１９４６５−７２頁 Ｚｏｍ、Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ（２００１）１１：Ｒ５９２−９５頁 Ｋｒｕｐｎｉｋら、Ｇｅｎｅ（１９９９）２３８：３０１−１３頁 Ｂａｆｉｃｏら、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ（２００１）３：６８３頁 Ｍａｏら、Ｎａｔｕｒｅ（２００１）４１１（１７）：３２１頁 Ｍａｏら、Ｎａｔｕｒｅ（２００２）４１７（１７）：６６４頁 Ｓｅｍeｎｏｖら、Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ（２００１）１１：９５１−６１頁 Ｇｏｎｇら、Ｃｅｌｌ １０７：５１３−２３頁 Ｐａｔｅｌ、Ｎ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ（２００２）３４６（２０）：１５７２頁 Ｌｉｔｔｌｅら、Ａｍ Ｊ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２００２年、７０（１）：１９頁 Ｂｏｙｄｅｎら、Ｎ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ（２００２）３４６（２０）：１５１３−１５２１頁
（発明の概要）
Ｄｋｋ−１に選択的に結合する種々の結合剤を提供する。該試剤はまた、Ｄｋｋ−１とＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６との間の結合を阻止するか、または減少させることができ、それによってＷｎｔシグナル伝達と関連する少なくとも１つの活性を刺激できる。該試剤は、抗体またはその免疫機能性フラグメントであり得、したがって天然構造、ならびに抗原結合ドメイン（例えば、ドメイン抗体）を持つポリペプチド類を有する抗体を含む。これらの抗体およびフラグメントは、骨質量の喪失に関連する病態の予防または治療を含む種々の異なる疾患を治療するために、または新骨の産生を刺激するために、ならびに種々の非骨関連疾患に使用できる。抗体の生産に有用である核酸分子、ベクター、および宿主細胞ならびに選択的結合剤もまた提供する。
提供される幾つかの抗体および免疫機能性フラグメントとしては、
（ａ）（ｉ）配列番号７０と少なくとも８０％の配列同一性を有するＬＣ ＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号７２と少なくとも８０％の配列同一性を有するＬＣ ＣＤＲ２；および
（ｉｉｉ）配列番号７４と少なくとも８０％の配列同一性を有するＬＣＣＤＲ３
よりなる群から選択される１つまたは複数の軽鎖（ＬＣ）相補性決定領域（ＣＤＲ）；
（ｂ）（ｉ）配列番号７６と少なくとも８０％の配列同一性を有するＨＣＣＤＲ１；
（ｉｉ）配列番号７８と少なくとも８０％の配列同一性を有するＨＣ ＣＤＲ２；および
（ｉｉｉ）配列番号８０と少なくとも８０％の配列同一性を有するＨＣ ＣＤＲ３、
よりなる群から選択される１つまたは複数の重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ；
または
（ｃ）（ａ）の１つまたは複数のＬＣ ＣＤＲおよび（ｂ）の１つまたは複数のＨＣ ＣＤＲが挙げられる。
このような抗体またはフラグメントは、Ｄｋｋ−１ポリペプチドに特異的に結合できる。一定の抗体またはフラグメントには、前述のＣＧＲのうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つ全てを含む。
他の抗体またはフラグメントの軽鎖および重鎖は、上記に記載されたとおりであるが、前述の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する。さらに他の複数抗体またはそれらのフラグメントは、ＣＤＲ１が、配列番号７０に記載されたアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が、配列番号７２に記載されたアミノ酸配列を有し、および／またはＣＤＲ３が、配列番号７４に記載されたアミノ酸配列を有する軽鎖を有するものである。幾つかの抗体およびフラグメントはまた、ＣＤＲ１が、配列番号７６に記載されたアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ２が、配列番号７８に記載されたアミノ酸配列を有し、および／またはＣＤＲ３が、配列番号８０に記載されたアミノ酸配列を有する重鎖も有することができる。一定の抗体またはフラグメントは、配列番号７４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３および／または配列番号８０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む。
提供される一定の他の抗体および免疫機能性フラグメントとしては、（ａ）配列番号８４、２８または３２と少なくとも８０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）；（ｂ）配列番号９１、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４または６８と少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；または（ｃ）（ａ）のＶＬおよび（ｂ）のＶＨが挙げられる。
他の抗体またはフラグメントは、構造が類似しているが、ＶＬは、配列番号８４、２８または３２と少なくとも９０％の配列同一性を有し；ＶＨは、配列番号９１、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４または６８と少なくとも９０％の配列同一性を有する。一定の抗体またはフラグメントにおいて、ＶＬは、配列番号８４、２８または３２と少なくとも９５％の配列同一性を有し；ＶＨは、配列番号９１、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４または６８と少なくとも９５％の配列同一性を有する。さらに他の抗体またはフラグメントは、配列番号８４、２８または３２のアミノ酸配列を有するＶＬ、および／または配列番号９１、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４または６８のアミノ酸配列を有するＶＨを含むものである。
幾つかの抗体またはフラグメントは、配列番号８２、２６、または３０のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる軽鎖および／または配列番号８９、３４、３８、４２、４６、５０、５４、５８、６２、または６６のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる重鎖を含む。
配列番号２のアミノ酸３２〜２６６からなる成熟ヒトＤｋｋ−１タンパク質に特異的に結合する単離抗体またはその免疫機能性フラグメントであって、前記抗体が、２つのループを含むエピトープに結合し、前記ループは、配列番号２の２２０と２３７との間および配列番号２のシステイン残基２４５と２６３との間のジスルフィド結合によって形成されているものも含まれる。
開示されている他の抗体またはフラグメントは、Ｄｋｋ−１ポリペプチドに対する特異的結合に関して上記のものなどの抗体と競合する。例えば、幾つかの抗体およびフラグメントは、２本の同一重鎖および２本の同一軽鎖からなる抗体と競合し、該重鎖は、配列番号１２のアミノ酸２０〜４６５からなり、前記軽鎖は、配列番号１０のアミノ酸２１〜２３４からなる。
提供される種々の抗体およびフラグメントとしては、軽単鎖および／または重単鎖あるいは単一の可変軽ドメインおよび／または単一の可変重ドメインを挙げることができる。他の抗体およびフラグメントとしては、２本の軽鎖および／または２本の重鎖が挙げられる。該抗体またはフラグメントが、２本の軽鎖および／または２本の重鎖を含む場合、幾つかの場合において２本の軽鎖は、互いに同一であり；同様に幾つかの場合において、２本の重鎖は、同一である。提供される抗体としては、例えば、モノクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、またはヒト化抗体を挙げることができる。免疫機能性フラグメントとしては、限定はしないが、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２またはドメイン抗体を挙げることができる。幾つかの場合において、抗体またはフラグメントは、５×１０−４ｓ−１以下のｋｄ（ｋｅｆｆ）でＤｋｋ−１ポリペプチドから解離する。
任意の前述の抗体および免疫機能性フラグメントのいずれかを含む薬学的組成物もまた提供される。このような組成物はまた、典型的に緩衝剤、薬学的に受容可能な希釈剤、キャリア、可溶化剤、乳化剤および保存剤も含む。薬学的組成物または医薬品の製剤における前述の抗体および免疫活性フラグメントの使用法もまた記載される。
前述の抗体をコードする種々の核酸もまた提供される。幾つかの核酸は、例えば、（ａ）配列番号７０、７２および／または７４に記載されたアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ；および／または（ｂ）配列番号７６、７８および／または８０に記載されたアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲをコードし、その結果、コード化ＣＤＲは、Ｄｋｋ−１ポリペプチドに特異的に結合できる抗体またはその免疫機能性フラグメントをコードする。一定の他の核酸は、抗体および免疫活性フラグメントの可変軽鎖領域（ＶＬ）および／または可変重鎖（ＶＨ）をコードする配列を含むか、またはそれからなり、該ＶＬは、配列番号８４、２８または３２と少なくとも８０％、９０％または９５％の配列同一性を有し、該ＶＨは、配列番号９１、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４または６８と少なくとも８０％、９０％または９５％の配列同一性を有する。幾つかの核酸は、配列番号８４、２８または３２を含むか、またはそれらからなるＶＬをコードする配列および／または配列番号９１、３６、４０、４４、４８、５２、５６、６０、６４または６８を含むか、またはそれらからなるＶＨをコードする配列を含む。さらに他の核酸は、前述の配列特性を有するＶＬまたはＶＨの双方をコードする配列を含む。前述の核酸を含む発現ベクター、またこのような発現ベクターを含む細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）もまた、本明細書に開示されている。このような発現ベクターを含有する細胞を培養することによる抗体またはその免疫活性フラグメントを生産する方法もまた記載されている。
別の態様において、種々の疾患の治療における前述の抗体または免疫機能性フラグメントのある使用法を開示している。一定の方法は、例えば、関節炎、幹細胞再生に応答性の疾患、炎症性疾患、神経系疾患、眼疾患、腎疾患、肺疾患、および皮膚疾患を治療するために、投与を必要とする患者に本明細書に記載された抗体または免疫活性フラグメントの有効量を投与することを含む。幾つかの治療方法は、リウマチ様関節炎、乾癬性関節炎、および骨関節炎を治療することを含む。一定の抗体およびフラグメントは：（ａ）幹細胞再生に応答性であり、糖尿病、慢性心不全および筋肉疾患よりなる群から選択されるか；（ｂ）クローン病、大腸炎および炎症性腸疾患よりなる群から選択される炎症性疾患であるか；（ｃ）アルツハイマー病、パーキンソン病、およびハンチントン病よりなる群から選択される神経性疾患であるか；（ｄ）黄斑変性症および網膜症よりなる群から選択される眼疾患であるか；（ｅ）末期腎疾患、慢性腎疾患、腎炎、尿細管間質性腎炎およびＩｇＡ腎障害よりなる群から選択される腎疾患であるか；（ｆ）慢性閉塞性肺疾患、特発性肺線維症、および嚢胞性線維症よりなる群から選択される肺疾患であるか；または（ｇ）腸管上皮に対する化学療法誘導性損傷から生じる皮膚疾患である、疾患を治療するために使用される。
さらに、本明細書に記載された抗体またはその免疫機能性フラグメント（例えば、配列番号１０のアミノ酸４４〜５４、配列番号１０のアミノ酸７０〜７６および配列番号１０のアミノ酸１０９〜１１７よりなる群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ、および／または配列番号１２のアミノ酸５０〜５４、配列番号１２のアミノ酸６９〜８５および配列番号１２のアミノ酸１１８〜１２８よりなる群から選択される少なくとも１つの重鎖ＣＤＲを含む抗体または免疫機能性フラグメント）の治療的有効量を、骨質量喪失の治療または予防を必要とする患者に投与することを含む骨質量の喪失を治療または予防する方法を本明細書に提供する。本実施形態の一態様において、患者は骨に転移する癌を患っている患者であり、別の態様において、患者は多発性骨髄腫を患っている患者である。さらに別の態様において、患者は、骨粗しょう症、骨減少症、ページェット病、歯周病、リウマチ様関節炎、および固定化による骨喪失を患っている患者から選択される。
骨質量の増加を誘導する方法もまた開示する。このような方法は、本明細書に開示された抗体またはその免疫機能性フラグメント（例えば、配列番号１０のアミノ酸４４〜５４、配列番号１０のアミノ酸７０〜７６および配列番号１０のアミノ酸１０９〜１１７よりなる群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ、および／または配列番号１２のアミノ酸５０〜５４、配列番号１２のアミノ酸６９〜８５および配列番号１２のアミノ酸１１８〜１２８よりなる群から選択される少なくとも１つの重鎖ＣＤＲを含む抗体または免疫機能性フラグメント）の治療的有効量を、投与を必要とする患者に投与することを含む。一態様において、患者は骨に転移する癌を患っており、別の態様において、患者は多発性骨髄腫を患っている。さらに別の態様において、患者は、骨粗しょう症、骨減少症、ページェット病、歯周病、リウマチ様関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎および固定化による骨喪失を患っている患者から選択される。本法のさらなる態様において、患者は、骨移植レシピエントまたは骨折を患っている患者である。
本明細書記載された抗体またはその免疫機能性フラグメント（例えば、配列番号１０のアミノ酸４４〜５４、配列番号１０のアミノ酸７０〜７６および配列番号１０のアミノ酸１０９〜１１７よりなる群から選択される少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲ、および／または配列番号１２のアミノ酸５０〜５４、配列番号１２のアミノ酸６９〜８５および配列番号１２のアミノ酸１１８〜１２８よりなる群から選択される少なくとも１つの重鎖ＣＤＲ）の治療的有効量を、患者に投与することを含む、Ｗｎｔ活性の誘導を必要とする患者におけるＷｎｔ活性を誘導する方法もまた提供される。
（発明の詳細な説明）
Ｉ． 定義
本明細書において、別に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語および専門用語は、通常の当業者により一般に理解される意味を有する。さらに、文脈により別に必要とされない限り、単数用語は複数を含み、複数用語は単数を含む。一般に、本明細書に記載されている細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学およびタンパク質と核酸化学ならびにハイブリダイゼーションの技術に関連して用いられる命名法は、当業界で周知であり、かつ一般に使用されているものである。本発明の方法と技術は、他に指定されない限り、本明細書を通して引用され、検討されている種々の一般的かつより具体的な引用文献に記載されている当業者に周知の従来の方法に従って一般に実施される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２）、およびＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州（１９９０）を参照されたい。これらは参照として本明細書に組み込まれている。酵素反応および精製法は、当業界で一般に達成されているか、または本明細書に記載されているとおり、製造元の仕様書に従って実施される。本明細書に記載されている分析化学、合成有機化学、および薬品化学ならびに薬学的化学に関連して用いられる用語および、それらの実験室手順および技法は、当業者に周知であり、かつ一般に使用されている。化学合成、化学分析、薬学的調製、製剤化、および送達ならびに患者の処置に関しては標準的な技法が使用できる。
本開示に利用される以下の用語は、別に指定されない限り、当然のことながら以下の意味を有する：
本明細書に用いられる「Ｄｋｋ−１」は、例えば、Ｄｋｋ−１のラット、マウスおよびヒトの天然形態を含む。ヒトおよびマウスのＤｋｋ−１タンパク質をコードする代表的なヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１および３に示され：対応するアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２および４に示される。ヒトＤｋｋ−１タンパク質（配列番号２）は、配列番号２のアミノ酸１〜３１からなるリーダー配列を有する。代表的なラットＤｋｋ−１タンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録ＸＰ ２１９８０４に記載されている。この用語はまた、これらの天然タンパク質と免疫的に交差反応するこのような天然配列の変異体を含む。これらのタンパク質は、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６とＷｎｔとの間の相互作用を阻害できる。ヒトＬＲＰ５をコードする代表的なヌクレオチド配列は、配列番号５で与えられ、対応するアミノ酸配列は、配列番号６で示される。ヒトＬＲＰ６をコードする代表的なヌクレオチド配列は、配列番号７で示され、対応するアミノ酸配列は、配列番号８で示される。この用語はまた、抗体が特異的に結合するエピトープを含有するＤｋｋ−１の天然形体または変異体のフラグメントを称することもできる。
用語の「ポリヌクレオチド」または「核酸」とは、一本鎖または二本鎖ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドを含むヌクレオチド類は、リボヌクレオチド類もしくはデオキシリボヌクレオチド類またはヌクレオチドのいずれかのタイプの修飾形体であり得る。前記修飾としては、ブロモウリジンおよびイノシン誘導体などの塩基修飾、２’、３’−ジデオキシリボースなどのリボース修飾、およびホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニラデートおよびホスホロアミデートなどのヌクレオチド間結合修飾が挙げられる。この用語は、一本鎖および二本鎖形体の双方を含む。
用語の「オリゴヌクレオチド」とは、２００以下のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを意味する。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１０から６０塩基長である。他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０から４０までのオリゴヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは、例えば、変異遺伝子の構築における使用を目的として一本鎖であっても、二本鎖であってもよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、検出アッセイのために放射性標識、蛍光標識、ハプテンまたは抗原標識などの標識を含むことができる。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲプライマー、クローニングプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして使用できる。
「単離核酸分子」とは、ゲノムのＤＮＡまたはＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、または単離ポリヌクレオチドが天然に見られるそのポリヌクレオチドの全てまたは一部に関連していないか、または天然で結合しないポリヌクレオチドに結合している合成起源またはその幾つかの組合せを意味する。本開示の目的のために、特定のヌクレオチド配列を「含む核酸分子」は、当然のことながら無処置の染色体を包含しない。特定の核酸配列を「含む」単離核酸分子は、特定の配列に加えて、１０まであるいはさらに２０までの他のタンパク質またはその一部に関するコード配列を含み得るか、または挙げられた核酸配列のコード領域の発現を制御する作動可能に結合された調節配列を含み得、および／またはベクター配列を含み得る。
別に特定されない限り、本明細書で考察された任意の一本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向の末端は５’末端であり；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向は５’方向と称される。新生ＲＮＡ転写体の５’から３’方向の付加は、転写方向と称され；ＲＮＡ転写体の５’に対して５’末端である、ＲＮＡ転写体と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上流配列」と称され；ＲＮＡ転写体の３’に対して３’末端である、ＲＮＡ転写体と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下流配列」と称される。
用語の「制御配列」とは、結合するコード配列の発現およびプロセシングに影響を及ぼすことができるポリヌクレオチド配列を称す。このような制御配列の性質は、宿主生物に依存し得る。特定の実施形態において、原核生物に関する制御配列としては、プロモータ、リボソーム結合部位、および転写末端配列を挙げることができる。例えば、真核生物に関する制御配列としては、転写因子に対する１つまたは複数の認識部位を含むプロモータ類、転写エンハンサー配列、および転写末端配列を挙げることができる。本発明による「制御配列」は、リーダー配列および／または融合パートナー配列を含むことができる。
用語の「ベクター」とは、タンパク質コード情報を宿主細胞に移すために使用される任意の分子または物質（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージまたはウィルス）を意味する。
用語の「発現ベクター」または「発現構築体」とは、宿主細胞の形質転換に好適であり、作動可能にそれに結合した１つ以上の異種コード領域の発現を方向付けおよび／または制御する核酸配列を含有するベクターを称す。発現構築体としては、限定はしないが、転写、翻訳に影響を及ぼすか、または制御し、イントロンが存在する場合は、作動可能にそれに結合したコード領域のＲＮＡスプライシングに影響を及ぼす配列を挙げることができる。
本明細書に用いられる「作動可能に連結した」とは、該用語が適用される成分が、好適な条件下でそれらの固有の機能を実施できる関係にあることを意味する。例えば、タンパク質コード配列の発現が、制御配列の転写活性と適合した条件下で達成されるように、タンパク質コード配列に「作動可能に連結した」ベクター中の制御配列はタンパク質コード配列に結合している。
用語の「宿主細胞」とは、核酸配列により変換されているか、または変換されることが可能であり、それによって対象となっている遺伝子を発現する細胞を意味する。該用語は、対象となっている遺伝子が存在する限り、後代が、形態において、または遺伝子組立てにおいて元の親細胞と同一であっても同一でなくても、親細胞の後代を含む。
用語の「形質導入」とは、通常はバクテリオファージにより一細菌から別の細菌への遺伝子の移行を意味する。「形質導入」はまた、レトロウィルスによる真核細胞配列の獲得および移行を称す。
用語の「トランスフェクション」とは、細胞による外来または外因性ＤＮＡの取込みを意味し、外因性ＤＮＡが細胞膜内に導入された場合に細胞は「トランスフェクト」されている。多数のトランスフェクション技法が当業界に周知であり、本明細書に開示されている。例えば、Ｇｒａｈａｍら、１９７３年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２：４５６頁；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、同文献；Ｄａｖｉｓら、１９８６年、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；およびＣｈｕら、１９８１年、Ｇｅｎｅ１３：１９７頁を参照されたい。このような技法は、１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を好適な宿主細胞を導入するために使用できる。
用語の「形質転換」とは、細胞の遺伝子特性の変化を称し、細胞が改変されて、新規なＤＮＡまたはＲＮＡを含有した場合に細胞は形質転換されている。例えば、トランスフェクション、形質導入、または他の技法を介して新規な遺伝子材料を導入することにより、その天然状態から遺伝子的に改変されている場合、細胞は形質転換されている。トランスフェクションまたは形質導入後、形質転換ＤＮＡは、細胞の染色体に物理的に組み込むことによりその細胞のＤＮＡと組換えできるか、または複製されることなくエピソーム構成要素として一時的に維持され得るか、またはプラスミドとして独立して複製できる。形質転換ＤＮＡが、細胞分裂により複製される場合に、細胞は「安定に形質転換」されたと考えられる。
用語の「ポリペプチド」または「タンパク質」とは、天然タンパク質のアミノ酸配列を有する高分子、すなわち、天然細胞および非組換え細胞により産生されるか、または遺伝子工学的にまたは組換え細胞により産生されて、天然タンパク質のアミノ酸配列を有する分子、または天然配列の１つまたは複数のアミノ酸の欠失、添加、および／または置換を有する分子を含むタンパク質を意味する。用語の「ポリペプチド」および「タンパク質」は、特に抗Ｄｋｋ−１抗体、または抗Ｄｋｋ−１抗体の１つまたは複数のアミノ酸の欠失、添加、および／または置換を有する配列を包含する。用語の「ポリペプチドフラグメント」とは、完全長天然タンパク質と比較して、アミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失、および／または内部欠失のあるポリペプチドを称す。このようなフラグメントはまた、天然タンパク質と比較して、修飾アミノ酸を含有できる。一定の実施形態において、フラグメントは、約５から５００のアミノ酸長である。例えば、フラグメントは、少なくとも５、６、８、１０、１４、２０、５０、７０、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、または４５０のアミノ酸長であり得る。本発明に有用なポリペプチドフラグメントは、結合ドメインを含む抗体の免疫機能性フラグメントを含む。抗Ｄｋｋ−１抗体の場合、有用なフラグメントとしては、限定はしないが、ＣＤＲ領域、重鎖または軽鎖の可変ドメイン、２つのＣＤＲを含む抗体鎖の一部またはその可変領域のみが挙げられる。
本明細書に称される用語の「単離タンパク質」とは、対象タンパク質が、（１）通常見られると考えられる少なくとも幾つかの他のタンパク質がないか、（２）同じ起源、例えば、同じ種からの他のタンパク質が本質的にないか、（３）いろいろな種の細胞により発現されるか、（４）少なくとも約５０パーセントのポリヌクレオチド類、脂質類、炭水化物類、または天然関連の他の材料から分離されているか、（５）天然とは関連していないポリペプチドと作動可能（共有または非共有相互作用により）で結合しているか、または（６）天然に生じない、ことを意味する。合成起源のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ、またはそれらの任意の組合せは、このような単離タンパク質をコードできる。単離タンパク質には、その治療的、診断的、予防的研究または他の使用を妨害すると考えられる、その天然環境に見られるタンパク質もしくはポリペプチド類または他の混入物が実質的に無いことが好ましい。
ポリペプチド（例えば、抗体）の「変異体」は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、別のポリペプチド配列に比してアミノ酸配列に挿入され、アミノ酸配列から欠失され、および／またはアミノ酸配列が置換されるアミノ酸配列を含む。
ポリペプチドの「誘導体」は、例えば、別の化学部分との結合を経て、挿入、欠失、または置換変異体とはいくらか異なる様式で化学的に修飾されているポリペプチド（例えば、抗体）である。
用語の「抗体」とは、標的抗原との特異的結合に関して無処置抗体と競合でき、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、および二重特異性抗体を含む任意のイソタイプの無処置免疫グロブリン、またはそのフラグメントを称す。無処置抗体は、一般的に少なくとも２本の完全長重鎖および２本の完全長軽鎖を含むが、重鎖のみを含み得るラクダ科の天然抗体などの幾つかの場合においては、より少数の鎖を含み得る。本発明による抗体は、単独源のみに由来するか、あるいは「キメラ」であってもよい。すなわち、抗体の種々の部分が、２つの異なる抗体に由来し得る。例えば、ＣＤＲ領域は、ラット源またはマウス源に由来し、一方、Ｖ領域のフレームワーク領域は、ヒトなどの異なる動物源に由来し得る。本発明の抗体または結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技法、または無処置抗体の酵素的または化学的開裂によりハイブリドーマにおいて作製できる。別に指定されない限り、用語の「抗体」は、２本の完全長重鎖および２本の完全長軽鎖に加えて、それらの誘導体、変異体、フラグメント、および突然変異タンパク質を含み、その例は、以下に記載されている。
用語の「軽鎖」は、完全長軽鎖および結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有するそのフラグメントを含む。完全長軽鎖は、可変領域ドメイン、ＶＬ、および定常領域ドメイン、ＣＬを含む。軽鎖の可変領域ドメインは、ポリペプチドの網の末端にある。本発明による軽鎖は、カッパ鎖およびラムダ鎖を含む。
用語の「重鎖」は、完全長重鎖および結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有するそのフラグメントを含む。完全長重鎖は、可変領域ドメイン、ＶＨ、および３つの定常領域ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。ＶＨドメインはポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＨドメインはカルボキシル末端にあり、ＣＨ３は−ＣＯＯＨ末端に最も近接している。本発明による重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のサブタイプを含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２のサブタイプを含む）、ＩｇＭおよびＩｇＥなど、任意のイソタイプのものであり得る。
本明細書に用いられる用語、免疫グロブリン鎖の「免疫機能性フラグメント」（または単に「フラグメント」）とは、完全長鎖に存在するアミノ酸のうち少なくとも幾つかを欠くが、抗原に特異的に結合できる抗体軽鎖または重鎖を称す。このようなフラグメントは、標的抗原に特異的に結合し、所与のエピトープに対する特異的な結合に関して無処置抗体と競合できる点で生物学的に活性である。本発明の一態様において、このようなフラグメントは、完全長軽鎖または重鎖に存在する少なくとも１つのＣＤＲを保持し、幾つかの実施形態において、重単鎖および／または軽単鎖またはそれらの一部を含む。これらの生物学的に活性なフラグメントは、組換えＤＮＡ技法により作製でき、あるいは無処置抗体の酵素的または化学的開裂により作製できる。本発明の免疫機能性免疫グロブリンフラグメントとしては、限定はしないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ドメイン抗体および単鎖抗体が挙げられ、限定はしないが、ヒト、マウス、ラット、ラクダまたはウサギなどの任意の哺乳動物源に由来し得る。本発明の抗体の機能性部分、例えば、１つまたは複数のＣＤＲを、第２のタンパク質または小型の分子に共有結合させて、二機能性治療特性を有するか、または血清中半減期の延長性を有する、体内における特定の標的に特異的な治療剤創製の可能性がさらに考慮されている。
「Ｆａｂフラグメント」は、１本の軽鎖およびＣ１Ｈならびに１本の重鎖の可変領域からなる。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成できない。
「Ｆｃ」領域は、抗体のＣＨ１およびＣＨ２ドメインを含む２本の重鎖フラグメントを含有する。２本の重鎖フラグメントは、２つ以上のジスルフィド結合およびＣＨ３ドメインの疎水性相互作用により一緒に保持される。
「Ｆａｂ’フラグメント」は、１本の軽鎖ならびにＶＨドメインとＣＨ１ドメイン、およびＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の領域を含む１本の重鎖の一部を含有する結果、２つのＦａｂ’フラグメントの２つの重鎖間で鎖間ジスルフィド結合が形成でき、Ｆ（ａｂ’）２分子が形成される。
「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」は、２本の軽鎖ならびに、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の定常領域の一部を含有する結果、２本の重鎖間に鎖間ジスルフィド結合が形成される。したがって、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、２本の重鎖間のジスルフィド結合により一緒に保持される２つのＦａｂ’フラグメントを含む。
「Ｆｖ領域」は、重鎖および軽鎖双方の可変領域を含むが、定常領域を欠く。
「単鎖抗体」は、重鎖および軽鎖可変領域が屈曲性リンカーにより結合して、単ポリペプチド鎖を形成し、これが抗原結合領域を形成しているＦｖ分子である。単鎖抗体は、国際特許出願公開第８８／０１６４９号、米国特許第４，９４６，７７８号および米国特許第５，２６０，２０３号に詳細に考察されており、それらの開示は、参照として組み込まれている。
「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含有する免疫機能性免疫グロブリンフラグメントである。幾つかの場合において、二価ドメイン抗体を創製するために、２つ以上のＶＨ領域をペプチドリンカーによって共有結合させる。二価ドメイン抗体の２つのＶＨ領域は、同じ抗原でも異なる抗原でも標的にできる。
「二価抗体」は、２つの抗原結合部位を含む。幾つかの場合において、２つの結合部位は、同じ抗原特異性を有する。しかしながら、二価抗体は、二重特異性であり得る（下記参照）。
「多重特異性」は、１つ超の抗原またはエピトープを標的にするものである。
「二重特異性」、「デュアル二相特異性」または「二機能性」抗体は、２つの異なる抗原結合部位を有するハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、多重特異性抗体の一種であり、限定はしないが、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの結合などの種々の方法により生産できる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ＆ Ｌａｃｈｍａｎｎ（１９９０）、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１頁；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら（１９９２）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３頁を参照されたい。二重特異性抗体の２つの結合部位は、同一かまたは異なるタンパク質標的上に存在し得る２つの異なるエピトープに結合する。
用語の「中和抗体」とは、リガンドに結合し、その結合パートナーに対するリガンドの結合を妨げ、そうでない場合には、その結合パートナーに対するリガンド結合から生じるであろう生物学的応答を妨害する抗体を称する。抗体またはその免疫機能性フラグメントの結合性および特異性の評価において、過剰の抗体が、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％またはそれ以上（インビトロでの競合的結合アッセイにて測定された）、リガンドに結合した結合パートナーの量を減少させる場合、抗体またはフラグメントは、その結合パートナーへのリガンド結合を実質的に阻害することになる。Ｄｋｋ−１に対する抗体類の場合、中和抗体は、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６に結合するＤｋｋ−１の能力を減少させることによって、Ｗｎｔ活性の測定可能な増加を誘導する。
同一のエピトープに対して競合する抗体の文脈で用いられる用語の「競合する」とは、抗体間での競合を意味し、試験下での抗体または免疫機能性フラグメントが、共通の抗原（例えば、Ｄｋｋ−１またはそのフラグメント）への参照抗体の特異的結合を防止するか、または阻止するアッセイによって判定される。以下の多数のタイプの競合的結合アッセイが使用できる。例えば：固相の直接的または間接的放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、固相の直接的または間接的酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（例えば、Ｓｔａｈｌｉら（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ９：２４２−２５３頁を参照）；固相の直接的ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えば、Ｋｉｒｋｌａｎｄら、（１９８６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４−３６１９頁を参照）；固相の直接的標識アッセイ、固相の直接的標識サンドイッチアッセイ（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｐｒｅｓｓを参照）；Ｉ−１２５を用いた固相の直接的標識ＲＩＡ；固相の直接的ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えば、Ｃｈｅｕｎｇｒａ（１９９０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７６：５４６−５５２頁を参照）；固相の直接的標識アッセイＲＩＡ（例えば、Ｍｏｄｅｎｈａｕｅｒら、（１９９０）Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７−８２頁を参照）。典型的に、このようなアッセイは、固相表面に結合させた精製抗原またはこれらのいずれかを有する細胞、未標識試験免疫グロブリンおよび標識参照免疫グロブリンの使用を含む。競合的阻害は、試験免疫グロブリンの存在下、固相表面に結合させた標識または細胞の量を判定することにより測定される。通常、試験免疫グロブリンは、過剰に存在する。競合アッセイによって確認された抗体（競合抗体）は、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体、および立体障害を発生する上で、参照抗体により結合したエピトープに十分近位の隣接エピトープに結合する抗体を含む。競合結合性を判定する方法に関するさらなる詳細は、本明細書の実施例に提供されている。通常、競合抗体が過剰に存在する場合、それは、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％または７５％、共通抗原への参照抗体の特異的結合を阻害する。幾つかの場合、結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％またはそれ以上阻害される。
用語の「抗原」とは抗体などの選択的結合剤により結合することができ、さらにその抗原に結合できる抗体を産生するために、動物に使用できる分子または分子の一部を称す。抗原は、異なる抗体と相互作用できる１つまたは複数のエピトープを有することができる。
用語の「エピトープ」は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合できる任意の決定因子を含む。エピトープは、その抗原を特異的に標的とする抗体が結合する抗原の領域であり、抗原がタンパク質である場合、抗体に直接接触する特定のアミノ酸を含む。多くの場合、エピトープは、タンパク質上に存在するが、幾つかの場合、核酸など他の種類の分子上に存在し得る。エピトープ決定因子としては、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基またはスルホニル基などの分子の化学的に活性な表面基を挙げることができ、特定の三次元構造特性、および／または特定の荷電特性を有することができる。一般に、特定の標的抗原に特異的な抗体は、タンパク質および／または高分子の複合体混合物における標的抗原上のエピトープを優先的に認識する。
本発明の抗体は、解離定数（ｋｄ）が≦１０−８Ｍである場合、その標的抗原に「特異的に結合する」と言われる。該抗体は、ｋｄが≦１０−９Ｍである場合、「高親和性」で、ｋｄが≦１０−１０Ｍである場合、「超高親和性」で抗原に特異的に結合する。本発明の一実施形態において、抗体は、１０−９Ｍのｋｄおよび約１×１０−４／秒のオフレートを有する。本発明の一実施形態において、該オフレートは＜１×１０−５である。本発明の他の実施形態において、抗体は、１０−８Ｍと１０−１０Ｍとの間のｋｄでヒトＤｋｋ−１に結合し、さらに他の実施形態において、ｋｄ≦２×１０−１０Ｍで結合する。
用語の「同一性」とは、配列のアラインメントおよび比較によって判定された２つ以上のポリペプチド分子間の関係、あるいは２つ以上の核酸分子間の関係を称す。「同一性パーセント」とは、比較された分子におけるアミノ酸間またはヌクレオチド間で同一残基のパーセントを意味し、比較されている最小の分子のサイズに基づいて算出される。これらの算出のために、アラインメントおけるギャップ（もしあれば）は、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）により処理しなければならない。アラインメントされた核酸またはポリペプチドの同一性を算出するために用いることのできる方法としては、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編集）、１９８８年、ニューヨーク：オックスフォード大学プレス；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編集）、１９９３年、ニューヨーク：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ、（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編集）、１９９４年、ニュージャージー州：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、１９８７年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ニューヨーク：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｋｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ、（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ編集）、１９９１年、ニューヨーク：Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ；およびＣａｒｉｌｌｏら、１９８８年、ＳＬＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８：１０７３頁に記載されたものが挙げられる。
同一性パーセントの算出において、比較されている配列は、配列間で最大のマッチが得られる方法でアラインメントされる。同一性パーセントを判定するために用いられるコンピュータプログラムは、ＧＡＰを含むＧＣＧプログラムのパッケージである（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４年、Ｎｕｖｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １２：３８７頁；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、ウィスコンシン大学、マジソン、ウィスコンシン州）。配列同一性パーセントを判定する予定の２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドをアラインメントするためにコンピュータアルゴリズムＧＡＰが用いられる。配列は、それら個々のアミノ酸またはヌクレオチドの最適マッチング（アルゴリズムにより判定される「マッチドスパン」）のためにアラインメントする。ギャップオープニング・ペナルティ（３Ｘ平均対角線として算出され、「平均ダイアゴナル」とは、使用される比較マトリックスのダイアゴナルの平均であり；「ダイアゴナル」とは、特定の比較マトリックスにより各々の完全アミノ酸マッチに割り当てられたスコアまたは数である）およびギャップ延長ペナルティ（通常ギャップオープニング・ペナルティの１／１０倍である）、ならびにＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳＵＭ６２などの比較マトリックスが、該アルゴリズムに関連して用いられる。一定の実施形態において、標準比較マトリックス（ＰＡＭ２５０の比較マトリックスに関しては、Ｄａｙｈｏｆｆら、１９７８年、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５：３４５−３５２頁；ＢＬＯＳＵＭ６２の比較マトリックスに関しては、Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、１９９２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９頁を参照）もまた、該アルゴリズムにより用いられる。
ＧＡＰプログラムを用いてポリヌクレオチドまたはヌクレオチド配列に関する同一パーセントを判定するための推奨されるパラメータは以下のものである：
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、１９７０年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３頁；
比較マトリックス：ＨｅｍｉｋｏｆｆらのＢＬＯＳＵＭ６２、１９９２年、上記文献；
ギャップペナルティ：１２（しかし、エンドギャップに関してペナルティはない）
ギャップ長ペナルティ：４
類似性の閾値：０。
２つのアミノ酸配列をアラインメントするための一定のアラインメント方式では、２つの配列の短い領域だけのマッチングが生じ得、この小さなアラインメントされた領域は、たとえ２つの完全長配列間に有意な関係がなくても、極めて高い配列同一性を有し得る。したがって、選択されたアラインメント法（ＧＡＰプログラム）は、それが望ましいならば、標的ポリペプチドの少なくとも５０の連続アミノ酸に及ぶアラインメントが生じるように調整できる。
本明細書に用いられる「実質的に純粋」とは、記載された分子種が存在している優占種であること、すなわち、同じ混合物において、それが他の個々の種よりもモル基準で豊富であることを意味する。一定の実施形態において、実質的に純粋な分子は、対象種が、存在する全ての高分子種の少なくとも５０％（モル基準で）を含む組成物である。他の実施形態において、実質的に純粋な組成物は、組成物に存在する全ての高分子種のうち少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％を含む。他の実施形態において、対象種は本質的に均一に精製され、従来の検出法により混入種を組成物中に検出できず、したがって該組成物が、検出可能な単一の高分子種からなる。
用語の「骨減少症」とは、正常な骨塩量（ＢＭＤ）を有すると考えられる標準的患者と比較して少なくとも１つの標準偏差の骨喪失患者を称す。当目的のために、該測定は、二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＥＸＡ）により判定され、患者のＢＭＤを、年齢と性別対応基準（Ｚスコア）と比較する。骨減少症を判定する上で、ＢＭＤ測定は、１つまたは複数の骨からとることができる。
用語の「治療的有効量」とは、哺乳動物において治療応答を生じさせると判定された抗Ｄｋｋ−１抗体量を称す。このような治療的有効量は、通常の当業者により容易に確認される。
「アミノ酸」は、当業界におけるその通常の意味を含む。２０種の天然アミノ酸およびそれらの略語は、従来の使用法に従う。任意の目的のために参照として本明細書に組み込まれている、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−−Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、（編集者Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ ａｎｄ Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｎ）、Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅ：サンダーランド、マサチューセッツ州（１９９１）を参照されたい。２０種の従来のアミノ酸、α−，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、および他の非慣例的アミノ酸などの非天然アミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）もまた、本発明のポリペプチドに好適な成分であり得る。非慣例的アミノ酸の例としては：４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、および他の同様なアミノ酸ならびにイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が挙げられる。本明細書に用いられるポリペプチド表記法において、標準的使用法および慣例に従って左手方向は、アミノ末端方向であり、右手方向は、カルボキシ末端方向である。
ＩＩ． 概要
本発明は、Ｄｋｋ−１に特異的な免疫グロブリンの抗体および抗原結合部位を含む新規な組成物（例えば、配列番号２のアミノ酸３２から２６６までからなるポリペプチドまたは配列番号４のアミノ酸３２から２７２までからなるポリペプチド）を提供する。これらの抗体および抗体フラグメントの幾つかは、ラット、マウスおよびヒトのＤｋｋ−１など、幾つかの哺乳動物源と交差反応し得る。これらの抗体および抗体フラグメントの幾つかは、ある種のＤｋｋ−１に対して他の種Ｄｋｋ−１に対するよりも高い親和性を有する（例えば、抗体および抗体フラグメントの幾つかは、ラットまたはマウスＤｋｋ−１と比較してヒトＤｋｋ−１に、より高い親和性を有し；他の抗体は、ヒトＤｋｋ−１と比較してラットまたはマウスＤｋｋ−１に、より高い親和性を有する）。本発明はまた、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体などの新規な中性抗体、ならびにヒトＤｋｋ−１における立体配座エピトープに結合する抗体およびその免疫機能性フラグメントを提供する。抗体およびフラグメントをコードする核酸も開示し、ならびにこれらの核酸を用いて抗体を発現する方法も開示する。別の態様において、本発明は、抗体抗原結合部位の免疫結合特性を示すことができる分子（例えば、免疫機能性フラグメントおよびポリペプチド類）に関する。
本明細書に開示される抗体および免疫機能性フラグメントは、種々の有用性を有する。抗体およびフラグメントの幾つかは、例えば、特異的な結合アッセイ、Ｄｋｋ−１またはそのリガンドのアフィニティー精製、およびＤｋｋ−１活性の他のアンタゴニストを確認するためのスクリーニングアッセイに有用である。抗体のうちの幾つかは、Ｄｋｋ−１の活性に関連する種々の疾患を治療するために使用できる。したがって幾つかの抗体およびフラグメントは、骨塩密度の増加、新規骨の合成、全身骨喪失（例えば、骨侵食）の治療、骨修復、および種々の形態の関節炎などの骨に関する種々の治療に使用できる。幾つかの抗体はまた、溶骨細胞活性を増加させ、骨吸収を誘導させるために使用できる。しかしながら、開示される抗体およびフラグメントのうちの幾つかは、骨疾患に無関係である種々の疾患を治療するために使用できる。下記でより詳細に記載されるように、このような疾患の例としては、幹細胞の再生促進が望ましいもの（例えば、糖尿病および筋肉疾患）、炎症性疾患（例えば、クローン病および炎症性腸疾患）、神経系疾患、眼疾患、腎疾患、および種々の皮膚疾患が挙げられる。
ＩＩＩ． 抗体および免疫機能性フラグメント
Ｄｋｋ−１活性を調節するのに有用な種々の選択的結合剤を提供する。これらの薬剤としては、例えば、抗原結合ドメイン（例えば、単鎖抗体類、ドメイン抗体類、免疫接着剤、および抗原結合領域を有するポリペプチド類）を含有し、特にＤｋｋ−１ポリペプチド（例えば、ヒト、ラットおよび／またはマウスＤｋｋ−１ポリペプチド）に結合する抗体および免疫機能性フラグメントが挙げられる。該薬剤の幾つかは、例えば、Ｄｋｋ−１のＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６への結合を阻害するのに有用であり、したがってＷｎｔシグナル伝達に関連する１つまたは複数の活性を刺激するために使用できる。
Ａ．天然抗体の構造
提供される結合剤の幾つかは、典型的に天然抗体に関連した構造を有する。これら抗体の構造単位は、典型的に１つまたは複数の四量体を含んでなり、その各々は、２つの同一対のポリペプチド鎖から構成されているが、哺乳動物の幾つかの種は、重単鎖のみを有する抗体も産生する。典型的な抗体において、各々の組または対は、１つの完全長「軽」鎖（一定の実施形態において約２５ｋＤａ）および１つの完全長「重」鎖（一定の実施形態において約５０〜７０ｋＤａ）を含む。それぞれ個々の免疫グロブリン鎖は、幾つかの「免疫グロブリンドメイン」から構成され、その各々は凡そ９０から１１０のアミノ酸からなり、特徴的な折たたみパターンを発現する。これらのドメインは、抗体ポリペプチドを構成している塩基単位である。各鎖のアミノ末端部は、典型的に抗原認識を担う可変ドメインを含む。カルボキシ末端部は、その鎖の他の末端よりも進化的に保存され、「定常領域」または「Ｃ領域」と称される。ヒトの軽鎖は、一般的にカッパ軽鎖およびラムダ軽鎖として分類され、これらの各々が、１つの可変ドメインおよび１つの定常ドメインを含有する。重鎖は、典型的にミュー鎖、デルタ鎖、ガンマ鎖、アルファ鎖、またはイプシロン鎖として分類され、これらは、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして抗体のイソタイプを定義する。ＩｇＧは、限定はしないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４など、幾つかのサブタイプを有する。ＩｇＭサブタイプとしては、ＩｇＭ１およびＩｇＭ２が挙げられる。ＩｇＡサブタイプとしては、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２が挙げられる。ヒトにおけるＩｇＡおよびＩｇＤイソタイプは、４本の重鎖および４本の軽鎖を含有し；ＩｇＧおよびＩｇＥイソタイプは、２本の重鎖および２本の軽鎖を含有し；ＩｇＭイソタイプは、５本の重鎖および５本の軽鎖を含有する。重鎖Ｃ領域は、典型的にエフェクター機能を担い得る１つまたは複数のドメインを含む。重鎖定常領域のドメイン数は、イソタイプに依存する。ＩｇＧ重鎖において、各々は、例えば、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３として知られている３つのＣ領域ドメインを含有する。提供される抗体は、これらのイソタイプおよびサブタイプのいずれかを有し得る。本発明の一定の実施形態において、抗Ｄｋｋ−１抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４サブタイプのものである。
完全長の軽鎖および重鎖において、可変領域および定常領域は約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により結合しており、重鎖はまた約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域を含む。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第２版、７章（Ｐａｕｌ，Ｗ．編集）１９８９年、ニューヨーク：Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ（全ての目的のために参照としてその全体が本明細書に組み込まれている）を参照されたい。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、典型的に抗原結合部位を形成する。
免疫グロブリン鎖の可変領域は、しばしば「相補性決定領域」またはＣＤＲと呼ばれる、３つの高度可変領域により結合されている比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）を含む一般に同じ全体構造を示す。上記の各重鎖／軽鎖対の２本鎖ＣＤＲは、標的タンパク質上の特定のエピトープ（例えば、Ｄｋｋ−１）と特異的に結合する構造を形成するためにフレームワーク領域により典型的にアラインメントされる。Ｎ末端からＣ末端にかけて、天然軽鎖および重鎖可変領域の双方は、典型的に以下の順序のこれら要素：ＦＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４と一致する。これらドメインの各々における位置を占有するアミノ酸に対して番号を割り当てるためにナンバリングシステムが考案されている。このナンバリングシステムは、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８７年および１９９１年、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、ベセスダ、メリーランド州）、またはＣｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ、１９８７年、Ｊ．Ｍｏｌ。Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７頁；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８−８８３頁に定められている。
提供される幾つかの抗体の完全長の軽鎖および重鎖ならびに対応するヌクレオチド配列およびアミノ酸配列の具体例は、表１に要約されている。
Figure 0004840939
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 表１に挙げられた各々の軽鎖を、表１に示された任意の重鎖と組合せて抗体を形成できる。このような組合せの例としては、Ｈ１〜Ｈ１０と結合したＬ１、またはＨ１〜Ｈ１０と結合したＬ２およびＨ１〜Ｈ１０と結合したＬ３（すなわち、Ｌ１Ｈ１、Ｌ１Ｈ２、Ｌ１Ｈ３、Ｌ１Ｈ４、Ｌ１Ｈ５、Ｌ１Ｈ６、Ｌ１Ｈ７、Ｌ１Ｈ８、Ｌ１Ｈ９、Ｌ１Ｈ１０、Ｌ２Ｈ１、Ｌ２Ｈ２、Ｌ２Ｈ３、Ｌ２Ｈ４、Ｌ２Ｈ５、Ｌ２Ｈ６、Ｌ２Ｈ７、Ｌ２Ｈ８、Ｌ２Ｈ９、Ｌ２Ｈ１０、Ｌ３Ｈ１、Ｌ３Ｈ２、Ｌ３Ｈ３、Ｌ３Ｈ４、Ｌ３Ｈ５、Ｌ３Ｈ６、Ｌ３Ｈ７、Ｌ３Ｈ８、Ｌ３Ｈ９、およびＬ３Ｈ１０）が挙げられる。幾つかの場合において、抗体には、表１に挙げられたものからの、少なくとも１本の重鎖および１本の軽鎖を含む。他の場合において、抗体は、２本の重鎖および２本の軽鎖を含む。例として、抗体または免疫機能性フラグメントとしては、２本のＬ１軽鎖および２本のＨ１重鎖、または２本のＬ２軽鎖および２本のＨ３重鎖、または２本のＬ軽鎖および２本のＨ４重鎖または２本のＬ２および２本のＨ５重鎖、および表１に掲げられた軽鎖対および重鎖対の他の同様の組合せを挙げることができる。
このような抗体の具体例として、一実施形態において、抗Ｄｋｋ−１抗体は、ラットに由来するモノクローナル抗体である。前述の立体配座エピトープに結合できる代表的な抗体は、モノクローナル抗体１１Ｈ１０および１Ｆ１１（下記の例を参照）であり、その各々が軽鎖および重鎖を含む。１１Ｈ１０の完全軽鎖は、配列番号９に示されるヌクレオチド配列によりコードされ、また１１Ｈ１０の完全重鎖は、配列番号１１に示されるヌクレオチド配列によりコードされる。１１Ｈ１０の対応する軽鎖および重鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１０と１２に示される。配列番号１０の残基１〜２０および配列番号１２の残基１〜１９は、それぞれ１１Ｈ１０の軽鎖および重鎖これらのシグナル配列に対応する。シグナル配列のない軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号８２に示され；シグナル配列を欠いている重鎖のアミノ酸配列は、配列番号８９に示される。
このように、前述の実施形態の一態様において、重鎖は、配列番号１２のアミノ酸２０〜４６５（すなわち、配列番号８９に相当するＨ１）からなり得、また本実施形態の別の態様において、軽鎖は、配列番号１０のアミノ酸２１〜２３４（すなわち、配列番号８２に相当するＬ１）からなり得る。本実施形態の別の態様において、抗体は、配列番号１２のアミノ酸２０〜４６５からなる重鎖および配列番号１０のアミノ酸２１〜２３４からなる軽鎖の双方を含む。幾つかの場合において、抗体は、各々が配列番号１２のアミノ酸２０〜４６５からなる２本の同一重鎖、および各々が配列番号１０のアミノ酸２１〜２３４からなる２本の同一軽鎖からなる。別の具体的な例は、軽鎖Ｌ２（配列番号２６）および重鎖（配列番号３４）を含む抗体である。これらの軽鎖およぼ重鎖のコード配列は、それぞれ配列番号２５と３３に表される。これらの抗体は、２本の同一重鎖および軽鎖を含むことができる。表１に掲げた他の重鎖および軽鎖は、同様の様式で組合わせることができる。
提供される他の抗体は、表１に示された重鎖および軽鎖の組合わせにより形成された抗体の変異体であり、これら鎖のアミノ酸配列に対して各々が、少なくとも、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一性を有する軽鎖および／または重鎖を含む。幾つかの場合において、このような抗体は、少なくとも１本の重鎖および１本の軽鎖を含むが、一方、他の場合において、このような変異体は、２本の同一軽鎖および２本の同一重鎖を含有する。
Ｂ．抗体の可変ドメイン
表２に示されるＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３よりなる群から選択される軽鎖可変領域および／またはＶＨ１〜ＶＨ１０よりなる群から選択される重鎖可変領域を含む抗体、これら軽鎖および重鎖可変領域の免疫機能性フラグメント、誘導体、突然変異タンパク質および変異体も提供される。
このタイプの抗体は、一般に式「ＶＬｘＶＨｙ」により表示でき、表１に掲げたように式中「ｘ」は、軽鎖可変領域の数であり、「ｙ」は、重鎖可変領域の数に相当する。一般にｘおよびｙは、それぞれ１または２である。
Figure 0004840939
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 したがって、ＶＬ２ＶＨ１は、ＶＬ２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ドメインおよびＶＨ１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有する抗体を称す。したがって提供される抗体としては、限定はしないが、以下の形態を有するものが挙げられる：ＶＬ１ＶＨ１、ＶＬ１ＶＨ２、ＶＬ１ＶＨ３、ＶＬ１ＶＨ４、ＶＬ１ＶＨ５、ＶＬ１ＶＨ６、ＶＬ１ＶＨ７、ＶＬ１ＶＨ８、ＶＬ１ＶＨ９、ＶＬ１ＶＨ１０、ＶＬ２ＶＨ１、ＶＬ２ＶＨ２、ＶＬ２ＶＨ３、ＶＬ２ＶＨ４、ＶＬ２ＶＨ５、ＶＬ２ＶＨ６、ＶＬ２ＶＨ７、ＶＬ２ＶＨ８、ＶＬ２ＶＨ９、ＶＬ２ＶＨ１０、ＶＬ３ＶＨ１、ＶＬ３ＶＨ２、ＶＬ３ＶＨ３、ＶＬ３ＶＨ４、ＶＬ３ＶＨ５、ＶＬ３ＶＨ６、ＶＬ３ＶＨ７、ＶＬ３ＶＨ８、ＶＬ３ＶＨ９、およびＶＬ３ＶＨ１０。幾つかの場合において、前述の抗体は、２つの軽鎖可変領域ドメインおよび２つの重鎖可変領域ドメイン（例えば、ＶＬ１２ＶＨ１２など）を含む。
このような抗体の具体例として、ある一定の抗体またはその免疫機能性フラグメントは、１１Ｈ１０の軽鎖可変領域または重鎖可変領域を含んでなり、該軽鎖可変領域は、配列番号１０のアミノ酸２１〜１２７（すなわち、配列番号８４に相当するＶＬ１）からなり、該重鎖可変領域は、配列番号１２のアミノ酸２０〜１３９（すなわち、配列番号９１に相当するＶＨ１）からなる。本実施形態の一態様において、抗体は、２本の同一重鎖および２本の同一軽鎖からなる。
例えば、配列番号１０のアミノ酸２１〜１２７からなる軽鎖可変領域を含む抗体または抗原結合抗体もしくはその免疫機能性フラグメントを含んでなり、さらに配列番号１２のアミノ酸２０〜１３９からなる重鎖可変領域を含む抗体も提供される。
ある一定の抗体は、Ｌ１、Ｌ２またはＬ３から選択される軽鎖可変ドメインの配列とは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５のアミノ酸残基だけが異なるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含んでなり、このような配列各々の相違は、独立して１つのアミノ酸の欠失、挿入または置換のいずれかである。幾つかの抗体における軽鎖可変領域は、ＶＬ１、ＶＬ２またはＶＬ３の軽鎖可変領域のアミノ酸配列に対して少なくとも、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む。
提供される幾つかの抗体は、Ｈ１〜Ｈ１０から選択される重鎖可変ドメインの配列とは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５のアミノ酸残基だけが異なるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含んでなり、このような配列各々の相違は、独立して１つのアミノ酸の欠失、挿入または置換のいずれかである。幾つかの抗体における重鎖可変領域は、ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６、ＶＨ７、ＶＨ８、ＶＨ９、ＶＨ１０の重鎖可変領域のアミノ酸配列と少なくとも、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらに他の抗体または免疫機能性フラグメントは、いま記載した変異体軽鎖および変異体重鎖の変異体形態を含む。
Ｃ．抗体のＣＤＲ
所与の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびフレームワーク領域（ＦＲ）は、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、米国厚生省、ＰＨＳ、ＮＩＨ、ＮＩＨ刊行番号９１−３２４２、１９９１年に記載されたシステムを用いて同定できる。本明細書に開示される一定の抗体は、表３にまとめた１つまたは複数のＣＤＲのアミノ酸配列と同一か、または実質的に配列同一性を有する１つまたは複数のアミノ酸を含む。
Figure 0004840939
 提供される抗体および免疫機能性フラグメントは、上記に掲げた複数ＣＤＲのうち１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つ全てを含むことができる。幾つかの抗体またはフラグメントは、軽鎖ＣＤＲ３および重鎖ＣＤＲ３の双方を含む。ある一定の抗体は、ＣＤＲの表３に掲げたＣＤＲの変異体を有し、１つまたは複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つ）の各々は、表３に掲げたＣＤＲと少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の配列同一性を有する。例えば、抗体またはフラグメントは、各々が、表３に掲げた、軽鎖ＣＤＲ３および重鎖ＣＤＲ３それぞれと少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％の配列同一性を有する軽鎖ＣＤＲ３および重鎖ＣＤＲ３の双方を含むことができる。任意の所与のＣＤＲに関するアミノ酸配列が、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのアミノ酸残基のみ表３に掲げた配列と異なるように、提供される幾つかの抗体のＣＤＲ配列は、表３に掲げたＣＤＲ配列と異なり得る。掲げた配列との相違は、通常は保存的置換である（下記参照）。
具体例として、提供される抗体および免疫機能性フラグメントは、１１Ｈ１０軽鎖から以下のＣＤＲ配列の１つまたは複数を含むことができる：
ＣＤＲ１：配列番号１０のアミノ酸４４〜５４、これはまた配列番号７０（配列番号９のヌクレオチド１３０〜１６２（配列番号８５）または配列番号６９によりコード化された）にも相当する；
ＣＤＲ２：配列番号１０のアミノ酸７０〜７６、これはまた配列番号７２（配列番号９のヌクレオチド２０８〜２２８（配列番号８６）または配列番号７１によりコード化された）にも相当する；
ＣＤＲ３：配列番号１０のアミノ酸１０９〜１１７、これはまた配列番号７４（配列番号９のヌクレオチド３２５〜３５１（配列番号８７）または配列番号７３によりコード化された）にも相当する；
本発明のさらなる抗体および免疫機能性フラグメントは、１１Ｈ１０重鎖から以下のＣＤＲ配列の１つまたは複数を含むことができる：
ＣＤＲ１：配列番号１２のアミノ酸５０〜５４、これはまた配列番号７６（配列番号１１のヌクレオチド１４８〜１６２（配列番号９２）または配列番号７５によりコード化された）にも相当する；
ＣＤＲ２：配列番号１２のアミノ酸６９〜８５、これはまた配列番号７８（配列番号１１のヌクレオチド２０５〜２５５（配列番号９３）または配列番号７７によりコード化された）にも相当する；
ＣＤＲ３：配列番号１２のアミノ酸１１８〜１２８、これはまた配列番号８０（配列番号１１のヌクレオチド３５２〜３８４（配列番号９４）または配列番号７９によりコード化された）にも相当する。
１つまたは複数の軽鎖または重鎖ＣＤＲを含むポリペプチド類は、さらに詳細に下記に記載される好適な宿主細胞においてポリペプチドを発現するために好適なベクターを用いることにより生産できる。
表２および表３に開示されている重鎖および軽鎖可変領域および複数ＣＤＲは、限定はしないが、ドメイン抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、単鎖抗体およびｓｃＦｖｓなど、当業界に公知である任意の種々のタイプの免疫機能性フラグメントのいずれかを調製するために使用できる。
Ｄ．抗体および結合エピトープ
抗体が、Ｄｋｋ−１などの特定の残基内のエピトープに結合される場合、例えば、該抗体は、特定の残基からなるポリペプチドに特異的に結合することを意味する。このような抗体は、必ずしもＤｋｋ−１内の全ての残基と接触するとは限らない。また、Ｄｋｋ−１内の単一のアミノ酸の置換または削除の全てが、必ずしも結合親和性に有意な影響を及ぼすとは限らない。抗体のエピトープ特異性は、種々の方法で測定できる。例えば、１つのアプローチは、Ｄｋｋ−１配列の範囲にある約１５のアミノ酸の重なりペプチドの集合、および少数のアミノ酸（例えば、３つのアミノ酸）の増分の相違を試験することを含む。該ペプチドを、マイクロタイター皿のウェル内に固定化する。固定は、該ペプチドの１つの末端をビオチン化することにより達成することができる。任意に同じペプチドの異なるサンプルを、Ｎ末端およびＣ末端でビオチン化し、比較目的のために別々のウェル内で固定化できる。これは、末端特異的抗体を確認するために有用である。任意にさらなるペプチドを含めて、対象の特定アミノ酸で終結させることができる。このアプローチは、Ｄｋｋ−１の内部フラグメントに対する末端特異的抗体を確認するために有用である。抗体または免疫機能性フラグメントは、種々のペプチドの各々に対する特異的結合に関してスクリーニングされる。エピトープは、抗体が特異的結合を示す全てのペプチドに共通であるアミノ酸のセグメントによって生じるものとして確定される。エピトープを確定する具体的なアプローチに関する詳細は、実施例６に記載されている。
Ｄｋｋ−１のカルボキシ末端部に位置する立体配座エピトープに結合する抗体およびその免疫機能性フラグメント（図１を参照）もまた提供される。Ｄｋｋ−１のカルボキシ末端は、幾つかのループを創製するジスルフィド結合のクラスターを形成する幾つかのシステイン残基を含有する。本発明は、これらのループのうちの２つに結合することによって、Ｄｋｋ−１の能力を中和し、Ｗｎｔ活性を抑制する抗体を提供する。前述の立体配座エピトープに結合できる代表的な抗体は、モノクローナル抗体１１Ｈ１０および１Ｆ１１であり、それらは各々、軽鎖および重鎖を含む。１１Ｈ１０の完全軽鎖は、配列番号９に示されたヌクレオチド配列によりコード化され、１１Ｈ１０の完全重鎖は、配列番号１１に示されたヌクレオチド配列によりコード化される。１１Ｈ１０の対応する軽鎖および重鎖アミノ酸配列（シグナル配列を含む）は、それぞれ配列番号１０と１２に示される。シグナル配列のない成熟形態は、配列番号８２と８９に相当する。
これら２つのループを含むエピトープは、配列番号２のシステイン残基２２０と２３７との間、また配列番号２のシステイン残基２４５と２６３との間のジスルフィド結合により形成される。したがって、エピトープを形成する２つのループの本体は、配列番号２のアミノ酸２２１〜２３６および２４６〜２６２を含む。結合に関与するこのループ内のセグメントは、配列番号２のアミノ酸２２１〜２２９および配列番号２のアミノ酸２４６〜２５３を含む。このように本明細書に提供される一定の抗体およびフラグメントは、前述の領域に特異的に結合する。抗体およびフラグメントの幾つかは、例えば、配列番号２のアミノ酸２２１から２６２を含むか、またはそれらからなるペプチドに結合する。
本発明の一態様において、配列番号２のアミノ酸２２１〜２２９および／または２４６〜２５３を含むか、またはそれらからなるペプチドが提供される。他のペプチドは、配列番号２のアミノ酸２２１〜２３６および／または２４６〜２６２を含むか、またはそれらからなる。さらに提供される他のペプチドは、配列番号２のアミノ酸２２１〜２６２の領域および／または配列番号２のアミノ酸２２１〜２５３の領域を含むか、またはそれらからなる。このようなペプチドは、天然のＤｋｋ−１の完全長タンパク質配列よりも短い（例えば、ペプチドは、１つまたは複数の前述の領域を含み得、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、または２００のアミノ酸長であり得る）。これらのペプチド類は、免疫原性を増加させるために別のペプチドに融合させることができ、したがって融合タンパク質の形態であり得る。
Ｅ．競合抗体
Ｄｋｋ−１に対する特異的結合に関して例示の抗体または機能性フラグメントの１つと競合する抗体およびそれらの免疫機能性フラグメントもまた提供される。このような抗体およびフラグメントはまた、例示の抗体のエピトープと同じエピトープに結合し得る。例示の抗体またはフラグメントと同じエピトープと競合するか、または結合する抗体およびフラグメントは、同様な機能的特性を示すと考えられる。例示の抗体およびフラグメントとしては、表１〜３に挙げられた重鎖および軽鎖、可変領域ドメインおよびＣＤＲを有するものを含め、上記のものが挙げられる。競合抗体または免疫機能性フラグメントとしては、上記の抗体およびエピトープの節に記載されたエピトープに結合するものを挙げることができる。
具体的一例として、いくつかの競合抗体またはフラグメントとしては、配列番号２のアミノ酸３６から２６６、または配列番号４のアミノ酸３２から２７２からなるＤｋｋ−１タンパク質に特異的に結合し、配列番号１２のアミノ酸２０から４６５からなる２本の同一重鎖、および配列番号１０のアミノ酸２１から２３４からなる２本の同一軽鎖からなる抗体の、ヒトＤｋｋ−１に対する結合を防止または減少させることができるものが挙げられる。他の競合抗体は、表１に挙げられたものなどの、２本の同一重鎖および２本の同一軽鎖からなる抗体の、ヒトＤｋｋ−１に対する結合を防止または減少させる。
Ｆ．モノクローナル抗体
提供される抗体には、Ｄｋｋ−１に結合するモノクローナル抗体が含まれる。モノクローナル抗体は、当業界に公知の任意の方法を用いて、例えば、免疫化スケジュール完了後、形質転換動物から採取した脾臓細胞の固定化により、製造できる。脾臓細胞は、当業界に公知の任意の方法を用いて、例えば、それらを骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマを製造することによって固定化できる。ハイブリドーマ製造融合法に用いられる骨髄腫細胞は、非抗体産生性であり、融合効率が高く、酵素が欠失しているために一定の媒体中で増殖する能力がなく、所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を支持することが好ましい。マウスの融合に用いられる好適な細胞系の例としては、Ｓｐ−２０、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ４１、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ１．７およびＳ１９４／５ＸＸ０ Ｂｕｌが挙げられ；ラットの融合に用いられる好適な細胞系の例としては、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ１．２．３、ＩＲ９８３Ｆおよび４Ｂ２１０が挙げられる。細胞融合に有用な他の細胞系は、Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２およびＵＣ７２９−６である。
いくつかの場合、ハイブリドーマ細胞系は、Ｄｋｋ−１免疫原によって動物（例えば、ヒト免疫グロブリン配列を有する形質転換動物）を免疫化し；免疫化した動物から脾臓細胞を採取し；採取した脾臓細胞を骨髄腫細胞に融合することによって、ハイブリドーマ細胞を作製し；ハイブリドーマ細胞からハイブリドーマ細胞系を確立し、Ｄｋｋ−１ポリペプチドに結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を同定することによって生産される。このようなハイブリドーマ細胞系、およびそれらによって作製された抗Ｄｋｋ−１モノクローナル抗体は、本発明に包含される。
ハイブリドーマ細胞系によって分泌されたモノクローナル抗体は、当業界に公知の任意の方法を用いて精製することができる。ハイブリドーマまたはｍＡｂ類は、Ｗｎｔ誘導活性を阻止する能力などの特性を有するｍＡｂを同定するために、さらにスクリーニングできる。そのようなスクリーニングの例は、下記の実施例に提供されている。
Ｇ．キメラ抗体およびヒト化抗体
前述の配列に基づいたキメラ抗体およびヒト化抗体もまた提供される。治療薬に用いられるモノクローナル抗体は、使用前に、種々の方法において修飾できる。一例は、機能的な免疫グロブリンの軽鎖または重鎖、またはその免疫機能的部分を作製するために共有結合させた異なる抗体のタンパク質セグメントからなる抗体である「キメラ」抗体である。一般に、重鎖および／または軽鎖の一部は特定種に由来する抗体における対応する配列と同一または相同であるか、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属しており、一方、その鎖の残部は、他の種に由来する抗体における対応する配列と同一または相同であるか、または他の抗体クラスまたはサブクラスに属している。キメラ抗体に関する方法については、例えば、参照として本明細書に組み込まれている米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５頁（１９８５）を参照されたい。ＣＤＲグラフティングは、例えば、全ての目的のために、参照として本明細書に組み込まれている米国特許第６，１８０，３７０号、第５，６９３，７６２号、第５，６９３，７６１号、第５，５８５，０８９号および５，５３０，１０１号に記載されている。
一般に、キメラ抗体を作製する目的は、意図された親種のアミノ酸数が最大化されているキメラを創製することである。一例は、抗体が、特定種の１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むか、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属しており、一方、その抗体鎖の残部が、他の種に由来する抗体における対応する配列と同一または相同であるか、または他の抗体クラスまたはサブクラスに属している「ＣＤＲグラフト」抗体である。ヒトにおける使用では、齧歯類抗体のＶ領域または選択されたＣＤＲがヒト抗体にグラフトされて、ヒト抗体の天然Ｖ領域またはＣＤＲと置き換わることが多い。
キメラ抗体の１つの有用なタイプは、「ヒト化」抗体である。一般に、ヒト化抗体は、最初、非ヒト動物において増加させたモノクローナル抗体から製造される。このモノクローナル抗体の非抗原認識部分に典型的に由来する該抗体における一定のアミノ酸残基は、対応するイソタイプのヒト抗体における対応する残基と相同であるように修飾される。ヒト化は、例えば、齧歯類の可変領域の少なくとも一部を、ヒト抗体の対応する領域と置換することにより、種々の方法を用いて実施できる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号および台，６９３，７６２号；Ｊｏｎｅｓら、１９８６年、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−２５号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８年、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−２７頁；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−３６頁を参照）。
本発明の一態様において、本明細書に提供された抗体の軽鎖および重鎖（表３を参照）の可変領域のＣＤＲを、同じかまたは異なる系統種の抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）にグラフトする。例えば、１１Ｈ１０抗体の軽鎖および重鎖の可変領域のＣＤＲを、コンセンサスヒトＦＲにグラフトできる。コンセンサスヒトＦＲを作製するために、いくつかのヒト重鎖または軽鎖のアミノ酸配列のＦＲをアラインメントして、コンセンサスアミノ酸配列を同定することができる。他の実施形態においては、１１Ｈ１０抗体の重鎖または軽鎖のＦＲを、異なる重鎖または軽鎖のＦＲによって置換する。本発明の一態様において、抗Ｄｋｋ−１抗体の重鎖および軽鎖のＦＲにおける希少アミノ酸は置換せず、残りのＦＲアミノ酸は置換する。「希少アミノ酸」は、この特定アミノ酸が通常はＦＲに見られない位置にある特定のアミノ酸である。あるいは、１１Ｈ１０抗体のグラフト可変領域を、１１Ｈ１０の定常領域とは異なる定常領域と共に使用できる。本発明の他の実施形態において、グラフト可変領域は、一本鎖Ｆｖ抗体の一部である。
一定の実施形態において、ヒト以外の種の定常領域をヒト可変領域と共に使用して、ハイブリッド抗体を製造できる。
Ｈ．完全ヒト抗体
完全ヒト抗体もまた提供される。ヒトを抗原に曝露させることなく、所与の抗原に特異的な完全ヒト抗体（「完全ヒト抗体」）を作製する方法が利用できる。完全ヒト抗体の作製を実施する１つの手段は、マウスの体液性免疫系の「ヒト化」である。内因性Ｉｇ遺伝子を不活化したマウスにヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）座を導入することは、任意の所望の抗原によって免疫化できる動物であるマウスにおいて完全ヒトモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を作製する１つの手段である。完全ヒト抗体の使用により、マウスのまたはマウス誘導Ｍａｂ類を治療薬としてヒトに投与することによって時折生じ得る免疫原性およびアレルギー性応答を最少化することができる。
完全ヒト抗体は、内因性免疫グロブリン産生の不在下で、ヒト抗体のレパートリーを作製することができる形質転換動物（通常はマウス）の免疫化によって作製できる。この目的のための抗原は、典型的に、６つ以上の連続アミノ酸を有し、任意に、ハプテンなどのキャリアに結合させる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２５５１−２５５５頁；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９３年、Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−２５８頁およびＢｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、１９９３年、Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３頁を参照されたい。このような方法の一例において、形質転換動物は、その中のマウスの重および軽免疫グロブリン鎖をコードする内因性マウス免疫グロブリン座を不能化し、ヒト重鎖および軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座を含有するヒトゲノムＤＮＡの大型フラグメントを、マウスゲノムに挿入することによって作製される。次いで、ヒト免疫グロブリン座の完全相補体未満を有する部分的修飾動物を交雑育種し、所望の免疫系修飾を全て有する動物を得る。免疫原を投与すると、これらの形質転換動物は、その免疫原に免疫特異的ではあるが、可変領域を含めて、マウスのアミノ酸配列ではなく、ヒトのアミノ酸配列を有する抗体を産生する。このような方法のさらなる詳細に関しては、例えば、参照として、本明細書に組み込まれている国際公開第９６／３３７３５号および第９４／０２６０２号を参照されたい。ヒト抗体作製用の形質転換マウスに関するさらなる方法は、米国特許第５，５４５，８０７号；第６，７１３，６１０号；６，６７３，９８６号；６，１６２，９６３号；５，５４５，８０７号；第６，３００，１２９号；第６，２５５，４５８号；第５，８７７，３９７号；第５，８７４，２９９号および代，５４５，８０６号に；ＰＣＴ国際公開第９１／１０７４１号、国際公開第９０／０４０３６号に、欧州特許第５４６０７３Ｂ１号および欧州特許第５４６０７３Ａ１号に記載されており、これらは全て、全ての目的のために、参照としてそれらの全体が本明細書に組み込まれている。
本明細書において、「ＨｕＭａｂ」マウスと称される上記の形質転換マウスは、内因性のμおよびκ鎖座を不活化する標的変異と共に、再配列していないヒト重鎖（μおよびγ）およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子の小型遺伝子座を含有する（Ｌｏｎｂｅｒｇら、１９９４年、Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−８５９頁）。したがって、このマウスは、マウスＩｇＭまたはκの発現減少を示し、免疫化に応答し、導入されたヒトの重鎖および軽鎖導入遺伝子は、クラス転換および体細胞変異を受けて、高親和性ヒトＩｇＧ κモノクローナル抗体を作出する。（Ｌｏｎｂｅｒｇら、上記；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、１９９５年、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｕｎｏｌ．、１３：６５−９３頁；ＨａｒｄｉｎｇおよびＬｏｎｂｅｒｇ、１９９５年、Ａｎｎ．Ｎ，Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６頁）。ＨｕＭａｂマウスの調製は、Ｔａｙｌｏｒら、１９９２年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０：６２８７−６２９５頁；Ｃｈｅｎら、１９９３年、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５：６４７−６５６頁；Ｔｕａｉｌｌｏｎら、１９９４年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２−２９２０頁；Ｌｏｎｂｅｒｇら、１９９４年、Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−８５９頁；Ｌｏｎｂｅｒｇ、１９９４年、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １１３：４９−１０１頁；Ｔａｉｌｏｒら、１９９４年、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６：５７９−５９１頁；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、１９９５年、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３頁；ＨａｒｄｉｎｇおよびＬｏｎｂｅｒｇ、１９９５年、Ａｎｎ．Ｎ，Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６頁；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、１９９６年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：８４５−８５１頁に詳細に記載されており、前述の文献は、全ての目的のために、参照としてそれらの全体が本明細書に組み込まれている。さらに、米国特許第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，７８９，６５０号；第５，８７７，３９７号；第５，６６１，０１６号；第５，８１４，３１８号；第５，８７４，２９９号；および第５，７７０，４２９号；ならびに米国特許第５，５４５，８０７号；国際公開第９３／１２２７号；第９２／２２６４６号；および第９２／０３９１８号を参照されたい。これら全ての開示は、全ての目的のために、参照としてそれらの全体が本明細書に組み込まれている。これらの形質転換マウスにおいてヒト抗体を作製するために利用される技法は、参照として本明細書に組み込まれている国際公開第９８／２４８９３号、およびＭｅｎｄｅｚら、１９９７年、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５６頁にも開示されている。例えば、ヒト抗Ｄｋｋ−１抗体を作出するために、ＨＣｏ７およびＨＣｏ１２形質転換マウス株を使用できる。
ハイブリドーマ技法を用いて、所望の特異性を有する抗原特異的ヒトＭＡｂ類を作製し、上記のものなどの形質転換マウスから選択することができる。このような抗体をクローン化し、好適なベクターおよび宿主細胞を用いて発現させることができるか、または培養ハイブリドーマ細胞から抗体を採集することができる。
完全ヒト抗体はまた、ファージ表示ライブラリー（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９１年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１頁；およびＭａｒｋｓら、１９９１年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１頁に開示されている）に由来し得る。ファージ表示法は、糸状バクテリオファージの表面上の抗体レパートリーの表示による免疫選択、および引き続いて、選択抗原に対するそれらの結合によるファージの選択を模倣している。このような方法の１つが、ＰＣＴ国際公開第９９／１０４９４号（参照として本明細書に組み込まれている）に記載されており、ここには、そのような方法を用いた、ＭＰＬおよびｍｓｋ受容体に対する高親和性で機能的なアゴニスト抗体の単離が記載されている。
Ｉ．二特異的または二機能的抗体
提供される抗体はまた、上記の１つまたは複数のＣＤＲもしくは１つまたは複数の可変領域を含む二特異的抗体および二機能的抗体も含む。いくつかの例において、二特異的抗体または二機能的抗体は、２つの異なる重／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である。二特異的抗体は、限定はしないが、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの結合などの種々の方法によって作製できる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ＆ Ｌａｃｈｍａｎｎ、１９９０年、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１頁；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、１９９２年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３頁を参照されたい。
Ｊ．種々の他の形態
提供されるくつかの抗体または免疫機能性フラグメントは、上記に開示された抗体およびフラグメントの変異体である（例えば、表１〜３に挙げられた配列を有するもの）。例えば、抗体またはフラグメントのいくつかは、表１〜３に挙げられた１つまたは複数の重鎖または軽鎖、可変領域またはＣＤＲにおける１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を有するものである。
天然のアミノ酸は、共通の側鎖特性に基づいたクラスに分けられる：
１） 疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２） 中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
３） 酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４） 塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５） 鎖の方向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
６） 芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
保存的アミノ酸置換は、これらのクラスの１つのメンバーを、同じクラスの他のメンバーと交換することを含み得る。保存的アミノ酸置換は、典型的には、生物系における合成ではなく、化学的ペプチド合成によって組み込まれる非天然アミノ酸残基を包含し得る。これらには、ペプチド模倣物およびアミノ酸部分の他の逆転または反転形態が含まれる。
非保存的置換は、上記クラスの１つのメンバーを、他のクラスのメンバーと交換することを含み得る。このような置換残基は、ヒト抗体に相同的な抗体領域、または該分子の非相同領域内に導入できる。
このような変更を行う場合、一定の実施形態によると、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮できる。タンパク質の疎水性親水性プロフィルは、各アミノ酸に数値（「疎水性親水性指標」）を指定し、次いで、ペプチド鎖に沿って、これらの値を繰り返し平均化することによって算出される。各アミノ酸は、その疎水性および電荷特性に基づいて疎水性親水性指標が指定されている。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）：トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタメート（−３．５）：グルタミン（−３．５）；アスパルテート（−３．５）：アスパラギン（−３．５）：リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。
タンパク質における相互作用的な生物学的機能の検討における疎水性親水性プロフィルの重要性は、当業界に認識されている（例えば、Ｋｙｔｅら、１９８２年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３１頁を参照）。一定のアミノ酸は、類似の疎水性親水性の指標またはスコアを有し、かつ類似の生物学的活性を保持している他のアミノ酸と置換できることが知られている。疎水性親水性指標に基づいて交換を行う場合、一定の実施形態において、疎水性親水性指標が±２以内のアミノ酸の置換が含まれる。本発明のいくつかの態様において、±１以内のものが含まれ、本発明の他の態様においては、±０．５以内のものが含まれる。
このようなアミノ酸置換は、特にそのことによって作出される生物学的に機能的なタンパク質またはペプチドが、当該の場合のように免疫学的実施形態における使用が意図されている場合、親水性に基づいて効率的に行うことができる。一定の実施形態において、隣接アミノ酸の親水性に制御されるタンパク質の最大局所平均親和性は、その免疫原性と抗原結合性または免疫原性に関連しており、すなわち、そのタンパク質の生物学的特性に関連している。
これらのアミノ酸残基に、以下の親水性値が指定されている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパルテート（＋３．０±１）；グルタメート（＋３．０±）；セリン（＋０．３）：アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。類似の親水性値に基づいて交換を行う場合、一定の実施形態において、親和性値が±２以内のアミノ酸の置換が含まれ、他の実施形態においては、±１以内のものが含まれ、さらに他の実施形態においては、±０．５以内のものが含まれる。いくつかの例においては、親和性に基づいて一次アミノ酸配列のエピトープを同定することもできる。これらの領域はまた、「エピトープコア領域」とも称される。
代表的な保存的アミノ酸置換を表４に記載する。
Figure 0004840939
 当業者は、周知の方法を用いて、本明細書に記載されたポリペプチドの好適な変異体を判定できるであろう。当業者は、活性に重要ではないと考えられる標的領域により、活性を消失させることなく交換し得る分子の好適な領域を確認できる。当業者はまた、類似のポリペプチドの中で保存される分子の残基および部分を確認することもできるであろう。さらなる実施形態において、生物学的活性にとって、または構造にとって重要と考えられる領域も、生物学的活性を消失させることなく、あるいは、該ポリペプチド構造に有害な影響を及ぼすことなく、保存的アミノ酸置換に供することができる。
また、当業者は、活性または構造にとって需要である類似のポリペプチドにおける残基を同定して、構造−機能試験を再検討することができる。当業者は、このような予測された重要なアミノ酸残基による、化学的に類似したアミノ酸の置換を選択することができる。
また当業者は、類似ポリペプチドにおける構造に関連した三次元構造およびアミノ酸配列を分析することもできる。このような知見を鑑み、当業者は、抗体のアミノ酸残基のアラインメントを、その三次元構造に関して予測することができる。当業者は、タンパク質の表面にあると予想されたアミノ酸残基に根本的な変化を生じさせることがないように、選択を行うことができる。このような残基は、他の分子との重要な相互作用に関係していることがあり得るからである。さらに当業者は、所望の各アミノ酸残基における単一のアミノ酸置換を含有する試験変異体を創製できる。次いでこれらの変異体を、Ｄｋｋ−１中和化活性に関するアッセイ（下記実施例を参照）を用いてスクリーニングでき、このようにして、どのアミノ酸が交換でき、どのアミノ酸を交換してはいけないかということに関する知見が得られる。言い換えると、このようなルーチン実験から収集された知見に基づいて、当業者は、単独での、または他の変異と組み合わせたさらなる置換を避けるべきアミノ酸位置を容易に判定することができる。
多数の科学刊行物が、二次構造の予測に充てられてきた。Ｍｏｕｌｔ、１９９６年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：４２２−４２７頁；Ｃｈｏｕら、１９７４年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：２２２−２４５頁；Ｃｈｏｕら、１９７４年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １１３：２１１−２２２頁；Ｃｈｏｕら、１９７８年、Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４７：４５−１４８頁；Ｃｈｏｕら、１９７９年、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２５１−２７６頁；およびＣｈｏｕら、１９７９年、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２６：３６７−３８４頁を参照されたい。さらに、二次構造の予測を補助するために、現在、コンピュータプログラムが利用できる。二次構造を予測する１つの方法は、相同性モデリングに基づいている。例えば、３０％超の配列同一性、または４０％超の類似性を有する２つのポリペプチドまたはタンパク質は、類似の構造トポロジーを有することが多い。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の最近の増大により、ポリペプチド構造またはタンパク質構造内の可能な折りたたみ数を含めた二次構造の予測性が増強されている。Ｈｏｌｍら、１９９９年、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２７：２４４−２４７頁を参照されたい。所与のポリペプチドまたはタンパク質における折りたたみ数には制限があり、一旦、構造の限界数が決まれば構造式予測は飛躍的に正確になることが提案されている（Ｂｒｅｎｎｅｒら、１９９７年、Ｃｕｒｒ．Ｏ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３６９−３７６頁）。
二次構造予測のさらなる方法としては、「スレッディング」（Ｊｏｎｅｓ、１９９７年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ． ７：３７７−８７頁；Ｓｉｐｐｌら、１９９６年、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４：１５−１９頁）、「プロフィル分析」（Ｂｏｗｉｅら、１９９１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：１６４−１７０頁；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９９０年、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１８３：１４６−１５９頁；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９８７年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：４３５５−４３５８頁）、および「進化的連関」（Ｈｏｌｍ、１９９９年、上記；およびＢｒｅｎｎｅｒ、１９９７年上記を参照）が挙げられる。
本発明のいくつかの実施形態において、（１）タンパク質分解に対する脆弱性を減少させる、（２）酸化に対する脆弱性を減少させる、（３）タンパク質複合体形成に関する結合親和性を変化させる、（４）リガンドまたは抗原の結合親和性を変化させる、（４）このようなポリペプチドに関する他の物理化学的または機能的特性を与えるかまたは改変する、アミノ酸置換が行われる。例えば、天然配列において、単一のまたは複数のアミノ酸置換（一定の実施形態においては保存的アミノ酸置換）を行うことができる。ドメインの外側にあって、分子間接触を形成する抗体の一部に置換を行うことができる。このような実施形態において、親配列の構造式的特性を実質的に変化させない保存的アミノ酸置換（例えば、親抗体または天然抗体を特徴づけている二次構造を破壊しない１つまたは複数のアミノ酸置換）を用いることができる。当業界に認められているポリペプチドの二次および三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編集）、１９８４年、Ｗ．Ｈ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｆｒｅｅｍａｎ社；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｂｒａｎｄｅｎ ａｎｄ Ｔｏｏｚｅ編集）、１９９１年、ニューヨーク：Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ；およびＴｈｏｒｎｔｏｎら、１９９１年、Ｎａｔｕｒｅ ３５４：１０５頁に記載されており、これらは各々参照として、本明細書に組み込まれている。
本発明はまた、グリコシル化部位の数および／またはタイプが、親ポリペプチドのアミノ酸配列に比較して変化している、本発明の抗体のグリコシル化変異体も包含する。一定の実施形態において、抗体タンパク質変異体は、天然抗体よりも多いまたは少ない数のＮ結合グリコシル化部位を含む。Ｎ結合グリコシル化部位は、配列：Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒを特徴とし、式中、Ｘで示されるアミノ酸残基は、プロリン以外の任意のアミノ酸残基である。この配列を作り出すアミノ酸残基の置換によって、Ｎ結合炭水化物鎖付加にとって新たに可能性のある部位が提供される。あるいは、この配列を除去または変化させる置換によって、天然ポリペプチドに存在するＮ結合炭水化物鎖の付加が防がれる。例えば、Ａｓｎの欠失または異なるアミノ酸によるＡｓｎの置換によってグリコシル化を減少させることができる。他の実施形態において、１つまたは複数の新たなＮ結合部位が作出される。抗体は典型的に、Ｆｃ領域にＮ結合グリコシル化部位を有する。例えば、本明細書に記載される１１Ｈ１０抗体は、アミノ酸３１５（配列番号１２）にＮ結合グリコシル化部位を有する。
さらなる好ましい抗体変異体としては、親または天然アミノ酸配列における１つまたは複数のシステイン残基が、他のアミノ酸（例えばセリン）から欠失しているか、またはそれによって置換されているシステイン変異体が挙げられる。システイン変異体は、抗体が生物学的に活性なコンホメーションにリフォールドされなければならない場合、とりわけ有用である。システイン変異体は、天然抗体よりも少ないシステイン残基を有し得、典型的には、不対システインから生じる相互作用を最少化するために偶数を有する。
Ｄｋｋ−１ポリペプチドに特異的に結合できる抗原結合領域を含有するポリペプチドを調製するために、開示されている重鎖および軽鎖、可変領域ドメインおよびＣＤＲを使用することができる。例えば、表３に挙げられた１つまたは複数のＣＤＲを、共有的にまたは非共有的に分子（例えば、ポリペプチド）内に組み込んで、免疫アドヘシンを作製することができる。免疫アドヘシンは、ＣＤＲをより大きなポリペプチド鎖の一部として組み込むか、ＣＤＲを他のポリペプチド鎖に共有的に結合させるか、またはＣＤＲを非共有的に組み込むことができる。ＣＤＲは、免疫アドヘシンが、対象となっている特定の抗原（例えば、Ｄｋｋ−１ポリペプチドまたはそのエピトープ）に特異的に結合することを可能にする。
本明細書に記載されている可変領域ドメインおよびＣＤＲに基づいた模倣物（例えば、「ペプチド模倣物」または「ペプチド模擬物」）もまた提供される。これらの類縁体は、ペプチド類、非ペプチド類またはペプチド領域と非ペプチド領域の組み合わせであり得る。任意の目的のために、参照として本明細書に組み込まれている、Ｆａｕｃｈｅｒｅ、１９８６年、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．１５：２９頁；ＶｅｂｅｒおよびＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ、１９８５年、ＴＩＮＳ、３９２頁；およびＥｖａｎｓら、１９８７年、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９頁。治療に有用なペプチドに構造的に類似したペプチド模倣物を用いて、類似の治療的または予防的効果を生じさせることができる。このような化合物は、コンピュータ化分子モデリングの補助によって開発されることが多い。一般に、本発明のペプチド模倣物は、本明細書ではＤｋｋ−１に特異的に結合する能力などの所望の生物学的活性を示す抗体に構造的に類似しているが、当業界に周知の方法により、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＳＯ−から選択される結合によって任意に置換された１つまたは複数のペプチド結合を有するタンパク質である。本発明の一定の実施形態において、より安定なタンパク質を創製するために、コンセンサス配列の１つまたは複数のアミノ酸の、同じタイプのＤ−アミノ酸による系統的な置換が使用できる。さらに、当業界に公知の方法により、例えば、ペプチドを環化する分子内ジスルフィド架橋を形成することのできる内部システイン残基の付加により、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列変異を含む拘束ペプチドを創製できる（ＲｉｚｏおよびＧｉｅｒａｓｃｈ、１９９２年、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７頁）。
本明細書に記載されている抗体の誘導体および免疫機能性フラグメントもまた提供される。誘導体化した抗体またはフラグメントは、具体的使用において、該抗体またはフラグメントに半減期延長などの所望の性質を付与する任意の分子または物質を含んでなり得る。誘導体化した抗体は、例えば、検出可能（または標識）部分（例えば、放射性、比色、抗原分子または酵素分子、検出可能ビーズ（磁気または高電子密度（例えば金）ビーズ）、または他の分子（例えば、ビオチンまたはストレプトアビジン）に結合する分子）、治療的または診断的部分（例えば、放射性、細胞毒性、または薬剤活性部分）、または具体的使用（例えば、ヒト対象などの対象への投与、または他のインビボまたはインビトロ使用）に関して、抗体の好適性を増大させる分子を含んでなり得る。抗体を誘導体化するために使用できる分子の例としては、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。抗体のアルブミン結合誘導体およびＰＥＧ化誘導体は、当業界に周知の方法を用いて調製できる。一実施形態において、抗体を、トランスチレチン（ＴＴＲ）またはＴＴＲ変異体と複合化または結合させる。ＴＴＲまたはＴＴＲ変異体は、例えば、デキストラン、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）、ポリエチレングリコール類、プロピレングリコールホモポリマー類、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー類、ポリオキシエチル化ポリオール類およびポリビニルアルコール類よりなる群から選択される化学物質によって化学的に修飾できる。
他の誘導体としては、抗Ｄｋｋ−１抗体ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合させた異種ポリペプチドを含む組換え融合タンパク質の発現などによる、抗Ｄｋｋ−１抗体またはそれらのフラグメントと、他のタンパク質またはポリペプチドとの共有複合体または凝集複合体が挙げられる。例えば、複合ペプチドは、異種シグナル（またはリーダー）ポリペプチド、例えば、酵母アルファ因子リーダー、またはエピトープタグなどのペプチドであり得る。抗Ｄｋｋ−１抗体含有融合タンパク質は、（例えば、ポリ−Ｈｉｓ）の精製または同定を助けるために付加されたペプチドを含み得る。抗Ｄｋｋ−１抗体ポリペプチドはまた、Ｈｏｐｐら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４、１９８８年、および米国特許第５，０１１，９１２号に記載されたＦＬＡＧペプチドに結合させることもできる。ＦＬＡＧペプチドは、高抗原性であり、特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）と可逆的に結合したエピトープを提供し、発現組換えタンパク質の迅速なアッセイと容易な精製を可能にする。所与のポリペプチドにＦＬＡＧペプチドを融合させた融合タンパク質を調製するための有用な試薬が市販されている（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州、セントルイス）。
一種または複数種の抗Ｄｋｋ−１抗体ポリペプチドを含有するオリゴマーを、Ｄｋｋ−１アンタゴニストとして使用できる。オリゴマーは、共有結合または非共有結合した二量体、三量体、またはより多量体のオリゴマーの形態であり得る。２種以上の抗Ｄｋｋ−１抗体ポリペプチドを含むオリゴマーは、一例としては、ホモダイマーとしての使用が考慮されている。他のオリゴマーとしては、ヘテロダイマー、ホモトリマー、ヘテロトリマー、ホモテトラマー、ヘテロテトラマーなどが挙げられる。
一実施形態は、抗Ｄｋｋ−１抗体ポリペプチドに融合させたペプチド部分間の共有または非共有相互作用により結合した複数の抗Ｄｋｋ−１抗体ポリペプチドを含むオリゴマーに関するものである。このようなペプチドは、ペプチドリンカー（スペーサー）であり得るか、またはオリゴマー化を促進する性質を有するペプチドであり得る。該ペプチドの中でも、付加した抗Ｄｋｋ−１抗体ポリペプチドのオリゴマー化を促進できる、抗体由来のロイシンジッパー類および／または一定のポリペプチド類があり、下記により詳細に記載されている。
特定の実施形態において、該オリゴマーは、２つから４つの抗Ｄｋｋ−１抗体ポリペプチドを含む。該オリゴマーの抗Ｄｋｋ−１抗体部分は、上記の任意の形態、例えば、変異体またはフラグメントであり得る。該オリゴマーは、Ｄｋｋ−１結合活性を有する抗Ｄｋｋ−１抗体ポリペプチドを含むことが好ましい。 一実施形態において、オリゴマーは、免疫グロブリン由来のポリペプチドを用いて調節される。抗体由来ポリペプチドの種々の部分（Ｆｃドメインなど）に融合させた一定の異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製は、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、１９９１年、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：１０５３５頁；Ｂｙｒｎら、１９９０年、Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６７７頁；およびＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈら、１９９２年、「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｄ」、ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、補遺４、１０．１９．１＝１０．１９．１１頁によって記載されている。
本発明の一実施形態は、抗Ｄｋｋ−１抗体のＤｋｋ−１結合フラグメントを、ある抗体のＦｃ領域に融合させることによって創製された２種の融合タンパク質を含むダイマーに関するものである。該ダイマーは、例えば、融合タンパク質をコードする遺伝子融合を適切な発現ベクターに挿入し、組換え発現ベクターによって形質転換した宿主細胞において該遺伝子融合を発現させ、発現融合タンパク質を抗体分子様に集結させ、その際、Ｆｃ部分間に鎖内ジスルフィド結合が形成して、ダイマーを与えることによって、作製することができる。
本明細書に用いられる用語の「Ｆｃポリペプチド」には、抗体のＦｃ領域由来のポリペプチドの天然形態および変異タンパク質形態が含まれる。二量体化を促進するヒンジ領域を含有するこのようなポリペプチドの切断形態もまた含まれる。Ｆｃ部分を含む融合タンパク質（およびそれらから形成されたオリゴマー）は、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇカラムでのアフィニティークロマトグラフィーによる容易な精製という利点を提供する。
ＰＣＴ出願国際公開第９３／１０１５１号および米国特許第５，４２６，０４８号および５，２６２，５２２号（これらの各々は、参照として、本明細書に組み込まれている）に記載されている１つの好適なＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域のＮ末端ヒンジ領域から天然Ｃ末端まで延在している一本鎖ポリペプチドである。他の有用なＦｃポリペプチドは、米国特許第５，４５７，０３５号ｏｂｉ Ｂａｕｍｒａ，１９９４ｎｅｎ ，ＥＭＢＯ Ｊ．１３：３９９２−４００１頁に記載されているＦｃ変異タンパク質である。この変異タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａに変化しており、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕに変化しており、アミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａに変化している以外は、国際公開第９３／１０１５１号に提示されている天然Ｆｃ配列のアミノ酸配列と同一である。この変異タンパク質は、Ｆｃ受容体に対する親和性減少を示す。
他の実施形態において、本明細書に開示されているような抗Ｄｋｋ−１抗体の重鎖および／または軽鎖の可変部分を、ある抗体の重鎖および／または軽鎖の可変部分で置換できる。
あるいは、該オリゴマーは、ペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を有する、または有さない複数の抗Ｄｋｋ−１抗体ポリペプチドを含む融合タンパク質である。好適なペプチドリンカーの中でも、米国特許第４，７５１，１８０号および第４，９３５，２３３号に記載されているものがある。
オリゴマーの抗Ｄｋｋ−１抗体誘導体を調製するための他の方法は、ロイシンジッパーの使用を含む。ロイシンジッパードメインは、それらが見られるタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、もともといくつかのＤＮＡ結合タンパク質において確認され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１７５９頁）、以来、種々のタンパク質において見出されている。知られているロイシンジッパーの中でも、二量体化または三量体化する天然ペプチドおよびそれらの誘導体がある。好適なオリゴマータンパク質を作製するために好適なロイシンジッパードメインの例は、ＰＣＴ出願国際公開第９４／１０３０８号に記載されており、また、肺表面活性タンパク質Ｄ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーは、Ｈｏｐｐｅら、１９９４年、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３４４：１９１頁に記載されており、参照として、本明細書に組み込まれている。融合された異種タンパク質の安定な三量体化を可能にする修飾ロイシンジッパーの使用は、Ｆａｎｓｌｏｗら、１９９４年、Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２６７−７８頁に記載されている。一方法において、ロイシンジッパーペプチドに融合させた抗Ｄｋｋ−１抗体フラグメントまたは誘導体を含む組換え融合タンパク質を、好適な宿主細胞内に発現させ、可溶性のオリゴマー抗Ｄｋｋ−１抗体フラグメントまたはそれが形成する誘導体を、培養上澄み液から回収する。
提供されるいくつかの抗体は、例えば、下記の実施例に記載されたとおりに測定された、少なくとも１０４または１０５／Ｍｘ秒の、Ｄｋｋ−１に対する結合親和性（Ｋａ）を有する。他の抗体は、少なくとも１０６、１０７、１０８または１０９／Ｍｘ秒のｋａを有する。提供される一定の抗体は、低い解離速度を有する。例えばいくつかの抗体は、１×１０−４ｓ−１、１×１０−５ｓ−またはより低いＫｏｆｆを有する。他の実施形態において、Ｋｏｆｆは、以下の可変領域ドメイン：ＶＬ１ＶＨ１、ＶＬ１ＶＨ２、ＶＬ１ＶＨ３、ＶＬ１ＶＨ４、ＶＬ１ＶＨ５、ＶＬ１ＶＨ６、ＶＬ１ＶＨ７、ＶＬ１ＶＨ８、ＶＬ１ＶＨ９、ＶＬ１ＶＨ１０、ＶＬ２ＶＨ１、ＶＬ２ＶＨ２、ＶＬ２ＶＨ３、ＶＬ２ＶＨ４、ＶＬ２ＶＨ５、ＶＬ２ＶＨ６、ＶＬ２ＶＨ７、ＶＬ２ＶＨ８、ＶＬ２ＶＨ９、ＶＬ２ＶＨ１０、ＶＬ３ＶＨ１、ＶＬ３ＶＨ２、ＶＬ３ＶＨ３、ＶＬ３ＶＨ４、ＶＬ３ＶＨ５、ＶＬ３ＶＨ６、ＶＬ３ＶＨ７、ＶＬ３ＶＨ８、ＶＬ３ＶＨ９、ＶＬ３ＶＨ１０の組み合わせを有する抗体と同じである。
他の態様において、本発明は、インビトロまたはインビボで（例えば、ヒト対象に投与した場合）、少なくとも１日の半減期を有する抗Ｄｋｋ−１抗体を提供する。一実施形態において、該抗体は、少なくとも３日の半減期を有する。他の実施形態において、該抗体またはその部分は、４日以上の半減期を有する。他の実施形態において、該抗体またはその部分は、８日以上の半減期を有する。他の実施形態において、該抗体またはその抗原結合部分は、誘導体化されていない、または修飾されていない抗体に比較して、より長い半減期を有するように、誘導体化または修飾される。他の実施形態において、該抗体は、血清半減期を延長させるために、本明細書に組み込まれている、２０００年２月２４日に発行された国際公開第００／０９５６０号に記載されているような点変異を含有する。
ＩＶ．核酸
本発明の抗体の一方または双方の鎖またはそのフラグメント、誘導体、変異タンパク質または変異体をコードする核酸、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定、分析、変異生成または増幅のためのハイブリダイゼーションプローブ、ＰＣＲプライマーまたは配列決定プライマーとしての使用に十分なポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド発現を阻害するためのアンチセンス核酸、および前述の相補的配列もまた提供される。該核酸は、任意の長さであり得る。それらは、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３０、３５０、４００、４５０、５００、７５０、１０００、１５００、３０００、５０００またはそれ以上のヌクレオチド長であり得、および／またはより長い核酸、例えばベクターの一部であり得る。該核酸は、一本鎖または二本鎖であり得、また、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡヌクレオチド、およびそれらの変異体（例えばペプチド核酸）を含んでなり得る。
本明細書に提供される一定の抗体が結合するエピトープをコードする核酸もまた提供される。したがって、配列番号２のアミノ酸２２１〜２２９および／または２４６〜２５３をコードするいくつかの核酸が含まれ、また、配列番号２のアミノ酸２２１〜２３６および／または２４６〜２６２をコードする核酸、および配列番号２のアミノ酸２２１〜２６２または配列番号２のアミノ酸２２１〜２５３をコードする核酸が含まれる。これらのペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸もまた提供される。
抗体ポリペプチド（例えば、重鎖または軽鎖、可変ドメインのみ、または完全長）をコードするＤＮＡは、Ｄｋｋ−１またはその免疫原性フラグメントで免疫化されたマウスのＢ細胞から単離できる。該ＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの常法により単離できる。ファージ表示は、抗体の誘導体を調製できる公知の他の方法である。一方法において、対象となっている抗体の成分であるポリペプチドを、任意の好適な組換え発現系において発現させ、発現したポリペプチドを組み立てて抗体分子を形成する。
該抗体および免疫機能性フラグメントの軽鎖および重鎖、可変領域およびＣＤＲをコードする、提供された代表的核酸は、上記の表１〜３に挙げてある。遺伝コードの縮重により、表１〜３に挙げられたポリペプチド配列の各々は、表１〜３に挙げられたもの以外の多数の他の核酸配列によってもコードされる。本発明は、本発明の各抗体をコードする各縮重ヌクレオチド配列を提供する。
本発明はさらに、特定のハイブリダイゼーション条件下で、他の核酸（例えば、表１〜３に挙げられたヌクレオチド配列を含む核酸）とハイブリダイズする核酸を提供する。核酸をハイブリダイズする方法は当業界に十分に知られている。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ニューヨーク州（１９８９）、６．３．１−６．３．６を参照されたい。本明細書に定められているとおり、中等度ストリンジェントハイブリダイゼーション条件では、５×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、約５０％ホルムアルデヒドのハイブリダイゼーション緩衝液、６×ＳＳＣを含有する予備洗浄溶液、および５５℃ハイブリダイゼーション温度（または４２℃のハイブリダイゼーション温度を用いて、約５０％のホルムアミドを含有するものなどの他の同様なハイブリダイゼーション溶液）および０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６０℃の洗浄条件が用いられる。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件では、４５℃で、６×ＳＳＣ中、ハイブリダイズし、引き続き、６８℃で、０．１×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中で１回以上洗浄する。さらに当業者は、互いに少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一性のヌクレオチド配列を含む核酸が、典型的には互いにハイブリダイズしたままであるように、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを増加または減少させるために、ハイブリダイゼーション条件および／または洗浄条件を操作することができる。
ハイブリダイゼーション条件の選択に影響を及ぼす基本的パラメーターならびに好適な条件を考察するための指針は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ、ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、コールドスプリング・ハーバー、ニューヨーク州、９章および１１章；およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９５年、Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ社、２．１０節および６．３〜６．４節）に記載されており、例えば、該ＤＮＡの長さおよび／または塩基組成に基づいて、当業界で通常の技術を有する者によって容易に決定することができる。
変異によって核酸に変化を導入し、それによって、該核酸がコードするポリペプチド（例えば、本発明の抗体または抗体誘導体）のアミノ酸配列に変化をもたらすことができる。変異は、当業界に公知の任意の方法を用いて導入できる。一実施形態において、１つまたは複数のアミノ酸残基を、例えば、部位特異的変異誘発プロトコルを用いて変化させる。他の実施形態において、１つまたは複数のランダムに選択された残基を、例えば、ランダム変異誘発プロトコルを用いて変化させる。変異ポリペプチドは、どんな方法で作製されても、所望の性質に関して、発現させ、スクリーニングすることができる。
核酸がコードするポリペプチドの生物学的活性を有意に変化させることなく、該核酸に変異を導入することができる。例えば、ヌクレオチド置換を行って、非本質的なアミノ酸残基におけるアミノ酸置換をもたらすことができる。あるいは、核酸がコードするポリペプチドの生物学的活性を選択的に変化させる１つまたは複数の変異を該核酸に導入することができる。例えば、該変異は、生物学的活性を量的にまたは質的に変化させることができる。量的変化の例としては、該活性の増大、減少または除去が挙げられる。質的変化の例としては、該抗体の抗原特異性の変化が挙げられる。
他の態様において、本発明は、本発明の核酸配列を検出するためのプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとしての使用に好適な核酸分子を提供する。本発明の核酸分子は、本発明の完全長ポリペプチドをコードする核酸配列の一部のみ、例えば、プローブまたはプライマーとして使用できるフラグメント、または本発明のポリペプチドの活性部分（例えば、Ｄｋｋ−１結合部分）をコードするフラグメントのみを含んでなり得る。
本発明の核酸配列に基づいたプローブは、本発明のポリペプチドをコードする核酸または類似の核酸、例えば転写体の検出に使用できる。該プローブは、標識基、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子を含んでなり得る。このようなプローブは、該ポリペプチドを発現する細胞を同定するために使用できる。
他の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドまたはその一部（例えば、１つまたは複数のＣＤＲまたは１つまたは複数の可変領域ドメインを含有するフラグメント）をコードする核酸を含むベクターを提供する。ベクターの例としては、限定はしないが、プラスミド、ウィルスベクター、非エピソーム哺乳動物ベクターおよび発現ベクター、例えば組換え発現ベクターが挙げられる。本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に好適な形態の本発明の核酸を含み得る。該組換え発現ベクターは、発現に用いられる宿主細胞に基づいて選択された、発現させる核酸配列に作動可能に結合させた１つまたは複数の調節配列を含む。調節配列としては、多くのタイプの宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現に関するもの（例えば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー、ニワトリ肉腫ウィルスプロモーターおよびサイトメガロウィルスプロモーター）、一定の宿主細胞のみにおけるヌクレオチド配列の発現に関するもの（例えば、組織特異的調節配列、参照として、本明細書にそれらの全体が組み込まれているＶｏｓｓら、１９８６年、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１１：２８７頁、Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２３７頁を参照）、および特定の処理または条件に応答したヌクレオチド配列の誘導発現に関するもの（例えば、哺乳動物細胞におけるメタロチオニンプロモーターおよび原核系および真核系双方におけるｔｅｔ応答および／またはストレプトマイシン応答プロモーター（上記参照）が挙げられる。当業者にとって当然のことではあるが、発現ベクターのデザインは、形質転換させる宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子に依存し得る。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入することによって、本明細書に記載された核酸によってコードされた融合タンパク質またはペプチドなどのタンパク質またはペプチドを製造することができる。
他の態様において、本発明は、本発明の組換え発現ベクターを導入した宿主細胞を提供する。宿主細胞は、任意の原核細胞（例えば、大腸菌）または真核細胞（例えば、酵母、昆虫、または哺乳動物の細胞（例えばＣＨＯ細胞））であり得る。ベクターＤＮＡは、従来の形質転換法またはトランスフェクション法によって原核細胞または真核細胞に導入できる。哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションに関しては、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション法により、該ゲノムに外来ＤＮＡを組み込むのは、細胞の少フラクションのみでよいことが知られている。これらの組み込み体を同定および選択するために、一般的には、選択的マーカー（例えば、抗体に対する耐性に関する）をコードする遺伝子を、対象となっている遺伝子と共に宿主細胞に導入する。好ましい選択的マーカーとしては、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与するものが挙げられる。導入された核酸を安定にトランスフェクトされた細胞は、他にも方法はあるがその中でも、薬物選択によって同定できる（例えば、選択的マーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生き残り、他の細胞は死滅する）。
Ｖ．抗体の調製
提供される非ヒト抗体は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ロバ、または非ヒト霊長類（サル（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル）など）または類人猿（例えばチンパンジー））などの任意の抗体産生動物に由来し得る。非ヒト抗体は、例えば、インビトロ細胞培養および細胞培養に基づく適用、または該抗体に対する免疫応答が生じないか、有意ではないか、防止できるか、重要でないか、または所望されている任意の他の適用において使用できる。本発明の一定の実施形態において、該抗体は、完全長Ｄｋｋ−１またはＤｋｋ−１のカルボキシ末端側によって免疫化することによって製造できる。あるいは、本明細書に提供されている一定の抗体が結合するエピトープの一部（例えば、１１Ｈ１０、図１を参照）を形成するヒトＤｋｋ−１のセグメントである、配列番号２のアミノ酸２２１−２３６および／またはアミノ酸２４６−２６２によって免疫化することによって、一定の非ヒト抗体を増加させることができる。該抗体は、ポリクローナル、またはモノクローナルであり得るか、または組換えＤＮＡの発現によって宿主細胞内で合成できる。
完全ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン座を含有する形質転換動物を免疫化することによって、またはヒト抗体のレパートリーを発現しているファージ表示ライブラリーを選択するによって、上記のとおり調製できる。
本発明のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、従来のモノクローナル抗体方法論、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５年、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５頁の標準的体細胞ハイブリダイゼーション法などの種々の方法によって作製できる。あるいは、モノクローナル抗体を作製する他の方法、例えば、Ｂリンパ球のウィルス性または発癌性の形質転換を使用できる。ハイブリドーマを作製する好適な動物系の１つは、十分に確立された方法であるマウス系である。免疫化脾臓細胞を単離するための免疫化プロトコルおよび方法は、当業界に知られている。このような方法では、免疫化マウスのＢ細胞を、マウス骨髄腫細胞系などの好適な固定化された融合パートナーに融合させる。所望の場合、マウスの代わりにラットまたはそれ以外の他の動物を免疫化し、このような動物のＢ細胞をマウス骨髄腫細胞系に融合させて、ハイブリドーマを形成できる。あるいは、マウス以外の出所の骨髄腫細胞系を使用できる。ハイブリドーマを作製するための融合法もまた十分に知られている
提供される一本鎖抗体は、アミノ酸架橋（短ペプチドリンカー）を介して重鎖および軽鎖の可変ドメイン（Ｆｖ領域）を結合させ、単一のポリペプチド鎖を生じさせることによって形成できる。このような一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、２種の可変ドメインポリペプチド（ＶＬおよびＶＨ）をコードするＤＮＡ間のペプチドリンカーをコードする融合ＤＮＡによって調製できる。生じるポリペプチドは、それら自体で折り返されて、２つの可変ドメイン間の屈曲性リンカーの長さに依って、抗原結合単量体を形成できるか、または多量体（例えば、二量体、三量体または四量体）を形成できる（Ｋｏｒｔｔら、１９９７年、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：４２３頁；Ｋｏｒｔｔら、２００１年、Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：９５−１０８頁）。種々のＶＬおよびＶＨを含むポリペプチドを組み合わせることによって、種々のエピトープに結合する多量体ｓｃＦｖ類を形成することができる。（Ｋｒｉａｎｇｋｕｍら、２００１年、Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．１８：３１−４０頁）。一本鎖抗体作製のために開発された方法としては、米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３頁；Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９頁；Ｗａｒｄら、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４頁、ｄｅ Ｇｒａａｆら、２００２年、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１７８：３７９−８７頁に記載されたものが挙げられる。本明細書に提供された抗体に由来する一本鎖抗体としては、限定はしないが、可変ドメインの以下の組み合わせ：ＶＬ１ＶＨ１、ＶＬ１ＶＨ２、ＶＬ１ＶＨ３、ＶＬ１ＶＨ４、ＶＬ１ＶＨ５、ＶＬ１ＶＨ６、ＶＬ１ＶＨ７、ＶＬ１ＶＨ８、ＶＬ１ＶＨ９、ＶＬ１ＶＨ１０、ＶＬ２ＶＨ１、ＶＬ２ＶＨ２、ＶＬ２ＶＨ３、ＶＬ２ＶＨ４、ＶＬ２ＶＨ５、ＶＬ２ＶＨ６、ＶＬ２ＶＨ７、ＶＬ２ＶＨ８、ＶＬ２ＶＨ９、ＶＬ２ＶＨ１０、ＶＬ３ＶＨ１、ＶＬ３ＶＨ２、ＶＬ３ＶＨ３、ＶＬ３ＶＨ４、ＶＬ３ＶＨ５、ＶＬ３ＶＨ６、ＶＬ３ＶＨ７、ＶＬ３ＶＨ８、ＶＬ３ＶＨ９、ＶＬ３ＶＨ１０を含むｓｃＦｖ類が挙げられる。
本明細書に提供されたあるサブクラスの抗体を、サブクラス転換法を用いて異なるサブクラスの抗体へ変化させることができる。したがって、ＩｇＧ抗体は、例えばＩｇＭ抗体から誘導でき、また逆もあり得る。このような方法によって、所与の抗体（親抗体）の抗原結合性を有し、かつ親抗体のイソタイプまたはサブクラスとは異なる抗体イソタイプまたはサブクラスに関連した生物学的性質も示す新規抗体の調製が可能となる。組換えＤＮＡ法が使用できる。このような方法には、特定の抗体ポリペプチドをコードするクローン化ＤＮＡ、例えば、所望のイソタイプの抗体の定常ドメインをコードするＤＮＡが使用できる。例えば、Ｌａｎｔｔｏら、２００２年、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：３０３−１６頁を参照されたい。
したがって、提供される抗体としては、例えば、以下の可変ドメインの組み合わせを含むものが挙げられる：所望のイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＥ、およびＩｇＤ）を有するＶＬ１ＶＨ１、ＶＬ１ＶＨ２、ＶＬ１ＶＨ３、ＶＬ１ＶＨ４、ＶＬ１ＶＨ５、ＶＬ１ＶＨ６、ＶＬ１ＶＨ７、ＶＬ１ＶＨ８、ＶＬ１ＶＨ９、ＶＬ１ＶＨ１０、ＶＬ２ＶＨ１、ＶＬ２ＶＨ２、ＶＬ２ＶＨ３、ＶＬ２ＶＨ４、ＶＬ２ＶＨ５、ＶＬ２ＶＨ６、ＶＬ２ＶＨ７、ＶＬ２ＶＨ８、ＶＬ２ＶＨ９、ＶＬ２ＶＨ１０、ＶＬ３ＶＨ１、ＶＬ３ＶＨ２、ＶＬ３ＶＨ３、ＶＬ３ＶＨ４、ＶＬ３ＶＨ５、ＶＬ３ＶＨ６、ＶＬ３ＶＨ７、ＶＬ３ＶＨ８、ＶＬ３ＶＨ９、ＶＬ３ＶＨ１０ならびにそれらのＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグメント。さらに、ＩｇＧ４が所望される場合、ＩｇＧ４抗体における異種性をもたらし得るＨ鎖内ジスルフィド結合形成の傾向性を減少させるために、参照として本明細書に組み込まれているＢｌｏｏｍら、１９９７年、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６：４０７頁に記載されているヒンジ領域における点変異（ＣＰＳＣＰ＞ＣＰＰＣＰ）を導入することもまた望まれ得る。
さらに、種々の性質（すなわち、結合する抗原に対する種々の親和性）を有する抗体を誘導する方法も知られている。チェーンシャッフリングと称されるこのような方法の１つは、しばしばファージ表示とも称される、線維状バクテリオファージ表面上での免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子のレパートリー表示を含む。チェーンシャッフリングは、Ｍａｒｋｓら、１９９２年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９頁に記載されているとおり、ハプテン２−フェニルオキサゾール−５−オンに対する高親和性抗体を調製するために使用されている。
機能的および生化学的特徴を有する抗Ｄｋｋ−１抗体を作製するために、表１に記載された重鎖および軽鎖に対する保存的改変（ならびにコード核酸の対応する修飾）を行うことができる。このような改変を達成するための方法は、上記にある。
本発明による抗体およびそれらの機能性フラグメントは、種々の方法においてさらに修飾できる。例えば、それらが治療目的に使用される場合、血清半減期を延長させるため、またはタンパク質送達を増加させるために、それらをポリエチレングリコールに結合させること（ペギル化）ができる。あるいは、対象抗体またはそれらのフラグメントのＶ領域を、異なる抗体分子のＦｃ領域に融合させることができる。この目的で使用されるＦｃ領域は、該融合タンパク質が治療薬として用いられる場合、相補体に結合しないことで、親における細胞溶解の傾向性を減少させるように修飾できる。また、対象抗体またはそれらの機能性フラグメントは、該抗体またはそのフラグメントの血清半減期を延長させるために、ヒト血清アルブミンに結合させることができる。本発明の抗体またはそれらのフラグメントにとって他の有用な融合パートナーは、トランスチレチン（ＴＴＲ）である。ＴＴＲは、四量体を形成する能力を有し、したがって、抗体−ＴＴＲ融合タンパク質は、結合活性を増加させ得る多価抗体を形成することができる。
あるいは、本明細書に記載された抗体およびフラグメントの機能的および／または生化学的特徴における実質的な修飾は、（ａ）置換領域における分子主鎖の、例えばシート状またはらせん状コンホメーションとしての構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩高性、の維持に及ぼすそれらの影響が有意に異なる重鎖および軽鎖のアミノ酸配列における置換を生じさせることによって達成できる。「保存的アミノ酸置換」には、天然のアミノ酸残基を、その位置におけるアミノ酸残基の極性または電荷に及ぼす影響がほとんどないか、または全くない非天然残基によって置換することが含まれる。さらに、ポリペプチドにおける任意の天然残基を、アラニンスキャン変異誘発に関して先に記載したとおり、アラニンによって置換することもできる。
対象抗体のアミノ酸置換（保存的であろうと非保存的であろうと）は、ルーチン法を適用して当業者により実施できる。本明細書に提供された抗体の重要な残基を同定するために、またはヒトＤｋｋ−１に対するこれらの抗体の親和性を増加または減少させるために、または本明細書に記載された他のＤｋｋ−１抗体の結合親和性を改変するために、アミノ酸置換を用いることができる。
ＶＩ．抗Ｄｋｋ−１抗体の発現
抗Ｄｋｋ−１抗体および免疫機能性フラグメントは、任意の多数の常法により調製できる。例えば、抗Ｄｋｋ−１抗体は、当業界に公知の任意の方法を用いて組替え発現系により生産できる。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ、Ｋｅｎｎｅｔら（編集）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（１９８０）：およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（編集）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州（１９８８）を参照されたい。
本発明の抗体は、ハイブリドーマ細胞系またはハイブリドーマ以外の細胞系に発現できる。抗体をコードする発現構築物は、例えば、哺乳動物、昆虫または微生物宿主細胞を形質転換させるために使用できる。形質転換は、ウィルスまたはバクテリオファージにおけるポリヌクレオチドのパッケージングや、米国特許第４，３９９，２１６号、米国特許第４，９１２，０４０号、米国特許第４，７４０，４６１号、および米国特許第４，９５９，４５５号（これらの特許は、任意の目的のために参照として本明細書に組み込まれている）により例示される当業界に公知のトランスフェクション法により、宿主細胞を該構築物によって形質導入することなど、ポリヌクレオチド類を宿主細胞に導入する任意の公知の方法を用いて実施できる。使用される最適の形質転換法は、形質転換される宿主細胞型に依存する。異種ポリヌクレオチド類の哺乳動物細胞への導入方法は、当業界に周知であり、限定はしないが、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔、ポリヌクレオチド類のリポソームへのカプセル化、核酸と陽電荷脂質との混合、および核へのＤＮＡの直接的ミクロ注入が挙げられる。
本発明の組換え発現構築物は、典型的に１つまたは複数の以下のものを含むポリペプチドをコードする核酸分子を含む：重鎖定常領域（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３）；重鎖可変領域；軽鎖定常領域；軽鎖可変領域；抗Ｄｋｋ−１抗体の軽鎖または重鎖の１つまたは複数のＣＤＲ。これらの核酸配列を、標準的連結法を用いて適切な発現ベクター内に挿入する。一実施形態において、１１Ｈ１０の重鎖または軽鎖定常領域を、Ｄｋｋ−１に特異的な重鎖または軽鎖可変領域のＣ末端に付加させて、発現ベクターに連結する。ベクターは典型的に、使用される特定の宿主細胞において機能的であるように選択される（すなわち、ベクターは、宿主細胞の仕組みと適合し、遺伝子の増幅および／または発現を生じさせ得る）。幾つかの実施形態において、ジヒドロ葉酸還元酵素などのタンパク質レポーターを用いてタンパク質フラグメント相補性アッセイを使用するベクターが用いられる（例えば、参照として本明細書に組み込まれている米国特許第６，２７０，９６４号を参照）。好適な発現ベクターは、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓまたはＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（旧名「Ｃｌｏｎｔｅｃｈ」）から購入できる。本発明の抗体およびフラグメントをクローニングおよび発現するのに他の有用なベクターとしては、参照として本明細書に組み込まれているＢｉａｎｃｈｉ ａｎｄ ＭｃＧｒｅｗ、Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８４（４）：４３９−４４頁（２００３）に記載されているものが挙げられる。さらなる好適な発現ベクターは、例えば、参照として本明細書に組み込まれているＭｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、１８５巻（Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編集）、１９９０年、ニューヨーク：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓに考察されている。
典型的に任意の宿主細胞に用いられる発現ベクターは、プラスミドまたはウィルス維持のための配列、および異種ヌクレオチド配列発現のための配列を含有する。「フランキング配列」と総称されるこのような配列は、以下の作動可能に結合されるヌクレオチド配列の１つまたは複数を典型的に含む：プロモーター、１つまたは複数のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナーおよびアクセプタースプライス部位を含有する完全イントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現させるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、および選択マーカー要素。
任意に、ベクターは、「タグ」コード配列、すなわち、コード配列の５’または３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子、ポリＨｉｓをコードするオリゴヌクレオチド配列（ヘキサＨｉｓなど）、または別の「タグ」（それに関してＦＬＡＧ（登録商標）、ＨＡ（インフルエンザウィルスのヘマグルチニン）、またはｍｙｃなど、市販の抗体が存在している）を含有する。タグは、典型的に発現の際に抗体タンパク質に融合させ、宿主細胞の抗体のアフィニティー精製のための手段として役立ち得る。アフィニティー精製は、例えば、アフィニティーマトリックスとしてタグに対する抗体を用いるカラムクロマトグラフィにより達成できる。任意にタグは、引き続き開裂用の一定のペプチダーゼ類を用いることなど、種々の手段により精製された抗体ポリペプチドから除去できる。
発現ベクターにおけるフランキング配列は、同種（すなわち、宿主細胞と同じ種および／または株に由来）でも、異種（すなわち、宿主細胞種または株以外の種に由来）でも、ハイブリッド（すなわち、１種以上の起源のフランキング配列の組合わせ）でも、合成でも、または天然でもよい。フランキング配列が、宿主細胞の仕組みにおいて機能的であり、それによって活性化できるならば、このようにフランキング配列の起源は、任意の原核生物でも真核生物でも、任意の脊椎生物でも無脊椎生物でも、また植物であってもよい。
本発明のベクターに有用なフランキング配列は、当業界に周知の任意の幾つかの方法によって得ることができる。典型的に、本明細書に有用なフランキング配列を、マッピングおよび／または制限エンドヌクレアーゼ消化によって前もって確認しておくことによって、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて適切な組織源から単離できる。幾つかの場合、フランキング配列の完全ヌクレオチド配列は公知であり得る。この場合、フランキング配列は、核酸合成またはクローニングのために本明細書に記載された方法を用いて合成できる。
フランキング配列の全てまたは一部だけが知られている場合、それは、ＰＣＲを用い、および／または同一種または別の種からの好適なオリゴヌクレオチドおよび／またはフランキング配列フラグメントによるゲノムライブラリをスクリーニングすることにより得ることができる。フランキング配列が知られていない場合、フランキング配列を含有するＤＮＡフラグメントを、例えば、コード配列またはさらに別の遺伝子を含有し得るＤＮＡのより大きな部分から単離できる。単離は、適切なＤＮＡフラグメントを作製するための制限エンドヌクレアーゼ消化、次いでアガロースゲル精製、Ｑｕｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィ（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、カリフォルニア州）を用いた単離、または当業技術者に公知の他の方法により達成できる。この目的を達成するのに好適な酵素の選択は、当業者にとって容易に明らかとなろう。
複製起点は、典型的に原核動物発現ベクターの一部であって、特に商品として購入されるものであり、この起点は宿主細胞におけるベクターの増幅を補助する。選択されたベクターが、増幅部位の起点を含有しない場合、公知の配列に基づいて化学的に合成でき、ベクターに結合できる。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２の複製起点（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ビバリー、マサチューセッツ州）は、たいていのグラム陰性細菌に好適であり、種々の起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウィルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、あるいはＨＰＶまたはＢＰＶなどのパピローマウィルス）は、哺乳動物細胞におけるベクターをクローニングするために有用である。一般に、哺乳動物発現ベクターにとって哺乳動物の複製起点は必要ではない（例えば、ＳＶ４０源は、初期プロモーターを含有するという理由だけで使用されることが多い）。
本発明の発現およびクローニングベクターは、典型的に宿主生物によって認識されるプロモーターを含有し、抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫機能性フラグメントをコードする核酸に作動可能に結合している。プロモーターは、構造遺伝子の転写を制御する構造遺伝子の開始コドン（一般に約１００から１０００ｂｐの範囲）の上流に位置する未転写配列である。プロモーターは、従来から２つのクラスのプロモーターおよび構成的プロモーターのうちの１つに分類される。誘導性プロモーターは、栄養物の有無または温度変化などの培養条件における何らかの変化に応答してそれらの制御下でＤＮＡからの転写レベルの増加を開始する。一方、構成的プロモーターは、連続的な遺伝子産物の産生を開始する：すなわち、遺伝子発現上の実験的制御が殆どないか、または全くない。種々の宿主細胞となる可能性のあるものにより認識される多数のプロモーターはよく知られている。制限酵素消化によりＤＮＡ源からプロモーターを除去することにより、またはポリメラーゼ連鎖反応によりプロモーターを増幅させ、所望のプロモーター配列をベクターに挿入させることにより、好適なプロモーターを抗Ｄｋｋ−１抗体をコードするＤＮＡに作動可能に結合させる。
酵母宿主との使用に好適なプロモータもまた、当業界に周知である。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターとの使用に有利である。哺乳動物の宿主細胞との使用に好適なプロモーターは周知であり、限定はしないが、ポリオーマウィルス、鶏痘ウィルス、アデノウィルス（アデノウィルス２など）、ウシパピロウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、最も好ましくはサルウィルス４０（ＳＶ４０）などのウィルスのゲノムから得られるものが挙げられる。他の好適な哺乳動物プロモーターとしては、異種哺乳動物プロモーター、例えば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーターが挙げられる。
本発明の組換え発現ベクター類の実施に好適な特定のプロモーターとしては、限定はしないが：ＳＶ４０の初期プロモーター領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ、１９８１年、Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−１０頁）；ＣＭＶプロモーター；ラウス肉腫ウィルスの３’長末端反復に含有されるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８０年、Ｃｅｌｌ ２２：７８７−９７頁）；メタロチオニン遺伝子の制御配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２年、Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２頁）；ベータ−ラクタマーゼプロモーターなどの原核生物発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、１９７８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、７５：３７２７−３１頁）；またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、１９８３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８０：２１−２５頁）が挙げられる。組織特異性を示し、遺伝子導入動物に利用されている以下の動物の転写制御領域もまた使用できる：膵腺房細胞において活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら、１９８４年、Ｃｅｌｌ ３８：６３９−４６頁；Ｏｒｎｉｔｚら、１９８６年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９頁；ＭａｃＤｏｎａｌｄ、１９８７年、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５−５１５頁）；膵ベータ細胞において活性であるインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｌａｎ、１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５−２２頁）；精巣細胞、乳房細胞、リンパ系細胞および肥満細胞において活性であるマウス乳癌ウィルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら、１９８６年、Ｃｅｌｌ ４５：４８５−９５頁）；肝臓において活性であるアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７年、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ １：２６８−７６頁）；肝臓において活性であるアルファ−胎児性タンパク質遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら、１９８５年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９−４８頁；Ｈａｍｍｅｒら、１９８７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：５３−５８頁）；肝臓において活性であるアルファ１−抗トリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−７１頁）；骨髄性細胞において活性であるベータ−グロブリン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら、１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８−４０頁；Ｋｏｌｌｉａｓら、１９８６年、Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４頁）；脳内の乏突起神経膠芽細胞において活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｈｅａｄら、１９８７年、Ｃｅｌｌ ４８：７０３−１２頁）；骨格筋において活性であるミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ、１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３−８６年）；視床下部において活性である性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら、１９８６年、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２−７８頁）；および特にたいていのリンパ系細胞において活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、１９８４年、Ｃｅｌｌ ３８：６４７−５８頁；Ａｄａｍｅｓら、１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３５−３８頁；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９８７年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：１４３６−４４頁）。
エンハンサー配列をベクターに挿入して、本発明の抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫機能性フラグメントをコードする高等真核生物の核酸における転写を増加させることができる。エンハンサーは通常約１０〜３００ｂｐ長であり、プロモーターに作用して転写を増加させるＤＮＡのシス作用性因子である。エンハンサーは、比較的、方向および位置から独立している。それらは、転写単位の５’および３’に見られる。哺乳動物の遺伝子から利用できる幾つかのエンハンサー配列が知られている（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルファ−胎児性タンパク質およびインスリン）。ウィルスからのエンハンサー配列もまた使用できる。ＳＶ４０エンハンサーサイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、およびアデノウィルスエンハンサーは、真核生物プロモーターを活性化する代表的な促進因子である。エンハンサーは、核酸分子に対して５’または３’位でベクター内にスプライスできるが、典型的にはプロモーターに対して５’部位に置かれる。
発現ベクターにおいて、転写終結配列は、典型的にポリペプチドコード領域の３’末端に位置する。原核生物細胞の発現に用いられる転写終結配列は、典型的にポリ−Ｔ配列へと続くＧ−Ｃ豊富なフラグメントである。該配列は、ライブラリから容易にクローン化されるか、またはさらにベクターの一部として商品として購入されるが、本明細書に記載されたものなどの核酸合成のための方法を用いて容易に合成することもできる。
選択マーカー遺伝子要素は、選択的培養培地中で増殖される宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコードする。発現ベクターに用いられる典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核生物宿主細胞に対する抗体または他の毒素、例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシンに対する耐性を付与し；（ｂ）細胞の栄養要求欠乏性を補足し；または（ｃ）複合培地から利用できない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。選択マーカーの例としては、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子およびテトラサイクリン耐性遺伝子が挙げられる。細菌ネオマイシン耐性遺伝子もまた、原核生物および真核生物宿主細胞の双方における選択のために使用できる。
他の選択遺伝子は、発現される遺伝子を増幅させるために使用できる。増幅は、単一コピーでは、ある一定の選択条件下で細胞の生存および増殖させるのに十分な高レベルで発現できない遺伝子を、組換え細胞の連続世代の染色体内でタンデムに反復させる過程である。哺乳動物細胞に好適な増幅可能な選択マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）およびプロモーターのないチミジンキナーゼが挙げられる。これらマーカーの使用において、哺乳動物細胞の形質転換体は、ベクターに存在する選択遺伝子のために該形質転換体のみが独自に順応して生存する選択圧下に置かれる。培地中の選択剤の濃度が連続的に増加することによって、選択遺伝子が増幅された哺乳動物細胞のみを生存させる条件下で形質転換された細胞を培養することにより、選択圧が課される。これらの状況下で、本発明の抗体をコードするＤＮＡなどの選択遺伝子に隣接したＤＮＡを、選択遺伝子と共に同時増幅させる。その結果、増幅ＤＮＡから抗Ｄｋｋ−１ポリペプチド量が増加して合成される。
リボソーム結合部位は、通常ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、シャイン・ダルガーノ配列（原核生物）またはコザーク（Ｋｏｚａｋ）配列（真核生物）を特徴とする。この因子は、典型的にプロモーターに対して３’に、また発現されるポリペプチドのコード化配列に対して５’に位置する。
幾つかの場合において、例えば、真核生物宿主細胞発現系においてグリコシル化が望まれる場合、グリコシル化または収量を改善するために種々のシグナルペプチドを操作できる。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ開裂部位を変えるか、またはやはりグリコシル化に影響を及ぼし得るシグナルペプチドを付加できる。最終タンパク質産物は、発現し易い１つまたは複数の付加アミノ酸を１位（成熟タンパク質の第１のアミノ酸に関して）に有することがあり、これらは完全に除去されていないと考えられる。例えば、最終タンパク質産物は、ペプチダーゼ開裂部位に見られるアミノ末端に結合した１つまたは２つのアミノ酸残基を有することができる。あるいは、幾つかの酵素開裂部位の使用により、該酵素が成熟ポリペプチド内のような領域で切断する場合は、僅かに切断されてはいるが、依然として活性な形態の所望のポリペプチドが生じ得る。
市販の発現ベクターが、上記の所望のフランキング配列の幾つかを欠いている場合、これらの配列をベクター内に個々に結合させることによって該ベクターを修飾できる。ベクターが選択され、所望のとおり修飾された後、抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫機能性フラグメントをコードする核酸分子を、ベクターの適切な部位に挿入する。
本発明の抗体またはその免疫機能性フラグメントをコードする配列を含有する完全ベクターを、増幅および／またはポリペプチド発現に好適な宿主細胞に挿入する。抗体、その免疫機能性フラグメントに関する発現ベクターの選択された宿主細胞への形質転換は、トタンスフェクション法、感染法、塩化カルシウム法、電気穿孔法、ミクロ注入法、リポフェクション法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などの方法を含む周知の方法または他の公知の技法により達成できる。選択された方法は、一部使用される宿主細胞型の機能である。これらの方法および他の好適な方法は、当業者に周知である。
適切な条件下で培養される場合、形質転換宿主細胞は、抗体またはその免疫機能性フラグメントを合成し、これを引き続き培養培地から（宿主細胞がそれを培地中に分泌する場合）、またはそれを産生する宿主細胞（それが分泌されない場合）から直接採取できる。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性にとって望ましいか、または必要なポリペプチド修飾（グリコシル化またはリン酸化など）および生物活性分子へのフォールディングの容易さなどの種々の因子に依存する。
発現のための宿主として利用できる哺乳動物細胞系は当業界に周知であり、限定はしないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｈｅｌａ細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、および多数の他の細胞系など、Ａｎｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手できる多くの固定化細胞系が挙げられる。一定の実施形態において、特定のＤＮＡ構築体を発現する最良の細胞系は、種々の細胞系を試験してどの細胞系が最高レベルの発現レベルを有し、構成的Ｄｋｋ−１結合性を有する抗体を生産するかを判定することにより選択できる。
ＶＩ．薬学的組成物
Ａ．代表的な製剤
一定の実施形態において、本発明はまた、以下の１つまたは複数：薬学的に受容可能な希釈剤；キャリア；可溶化剤；乳化剤；保存剤；および／またはアジュバント、と共に対象の抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫機能性フラグメントを含む組成物を提供する。このような組成物は、抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫機能性フラグメントの有効量を含有できる。したがって、本明細書に提供される抗Ｄｋｋ−１抗体およびその免疫活性フラグメントの、薬学的組成物または医薬品の調製における使用もまた含まれる。このような組成物は、下記の代表的な有用性の節に挙げられたような種々の疾患の治療に使用できる。
薬学的調製のための受容可能な製剤成分は、使用される投与量および濃度において、レシピエントに対して非毒性である。提供される抗体および免疫機能性フラグメントに加えて、本発明による組成物は、例えば、組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、透明性、色、等張性、臭い、無菌性、安定性、解離または放出の速度、吸着または透過性、を改変、維持または保存するための成分を含有できる。薬学的組成物を製剤化するための好適な材料としては、限定はしないが、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなど）；抗菌剤；抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウムなど）；緩衝剤（酢酸塩、ホウ酸塩、重炭酸塩、トリス−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩または他の有機酸類など）；増量剤（マンニトールまたはグリシンなど）；キレート化剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリンなど）；充填剤；単糖類、二糖類；および他の炭水化物（グルコース、マンノースまたはデキストリン類など）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなど）；着色剤、風味剤および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー類（ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド類；塩形成対イオン類（ナトリウムなど）；保存剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素など）；溶媒類（グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなど）；糖アルコール類（マンニトールまたはソルビトールなど）；懸濁剤；界面活性剤または湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル類、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０などのポリソルベート類、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパール）；安定性増強剤（ショ糖またはソルビトールなど）；等張性増強剤（ハロゲン化アルカリ金属、好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトール、ソルビトールなど）；送達媒体；希釈剤；賦形剤および／または薬学的用アジュバント類が挙げられる。（参照として本明細書に組み込まれているＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編集）、１９９０年、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社を参照）。
薬学的組成物における主要媒体またはキャリアは、水性でも非水性でもよい。このような組成物に好適な媒体またはキャリアとしては、注射用水、生理的食塩水または人工脳脊髄液が挙げられ、場合によっては、非経口投与用組成物に一般的な他の材料が添加される。中性緩衝生理食塩水または血清アルブミンを混合した生理食塩水は、さらなる代表的媒体である。抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫機能性フラグメントを含む組成物は、所望の純度を有する選択された組成物を、凍結乾燥ケークまたは水溶液形態の任意の製剤化剤と混合することにより、保存用に調製できる。さらに、抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫機能性フラグメントは、ショ糖などの適切な賦形剤を用いて凍結乾燥物として製剤化できる。
製剤成分は、受容できる濃度で投与部位に存在する。緩衝剤は、生理的ｐＨあるいは僅かにより低いｐＨで、典型的には約４．０から約８．５あるいは約５．０から８．０の間でのｐＨ範囲内に該組成物を維持するために使用することが有利である。薬学的組成物は、約ｐＨ６．５〜８．５のトリス緩衝液、または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝液を含むことができ、さらにソルビトールまたはその好適な代替物を含むことができる。
薬学的組成物は、錠剤製造に好適である非毒性賦形剤と混合した抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫機能性フラグメントの有効量を含むことができる。錠剤を滅菌水または別の適切な媒体に溶解することにより、液剤を単位用量形態で調製できる。好適な賦形剤としては、限定はしないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムまたは重炭酸ナトリウム、乳糖、またはリン酸カルシウムなどの不活性材料；または澱粉、ゼラチン、またはアラビアゴムなどの結合剤；またはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクなどの潤滑剤が挙げられる。
さらなる薬学的組成物は、持続型または制御送達製剤の形態である。リポソームキャリア、生体侵食性ミクロ粒子または多孔性ビーズおよび蓄積注射などの種々の他の持続型または制御送達手段を製剤化する方法を用いることができる（例えば、薬学的組成物の送達用多孔性ポリマーミクロ粒子の制御放出を記載している、国際出願ＰＣＴ／米国第９３／００８２９号を参照）。持続型放出製剤としては、形状化製品の形態での半透過性マトリックス、例えば、薄膜、またはミクロカプセル、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリアクチド（米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許第０５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、１９８３年、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５５６号）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら、１９８１年、Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ １５：１６７−２７７頁およびＬａｎｇｅｒ、１９８２頁、Ｃｈｅｍ Ｔｅｃｈ １２：９８−１０５頁）、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら、同書）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号）を挙げることができる。持続型放出組成物としてはまた、当業界に公知の任意の幾つかの方法により調製できるリポソーム類を挙げることができる。例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎら、１９８５年年Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８−３６９２頁；欧州特許第０３６，６７６号；欧州特許第０８８，０４６号および欧州特許第１４３，９４９号を参照されたい。
インビボ投与に用いられる薬学的組成物は、一般的に滅菌である。滅菌は、滅菌ろ過膜を通すろ過により達成できる。組成物が凍結乾燥される場合、滅菌は、凍結乾燥および再構成の前か後に実施できる。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥形態または溶液において保存できる。一定の実施形態において、非経口用組成物は、滅菌アクセス口を有する容器、例えば、皮下注射針により貫通可能な密栓を有する静脈溶液用バッグまたはバイアル、または注入用に即時使用できる前充填滅菌シリンジに入れる。
本発明の薬学的組成物を製剤化したら、それを、溶液、懸濁液、ゲル、乳濁液、固体として、または乾燥または凍結乾燥粉末として滅菌バイアル中に保存できる。このような製剤は、即時使用できる形態または投与前に再構成される形態（例えば、凍結乾燥された）で保存できる。
薬学的組成物を製剤化するために使用される成分は、高純度であることが好ましく、有害となる可能性のある不純物が実質的にないことが好ましい（例えば、少なくとも米国食品（ＮＦ）グレード、一般に少なくとも分析グレード、またより典型的には少なくとも薬学的グレード）。さらに、インビボ使用に意図された組成物は、通常は滅菌されている。所与の化合物を使用前に合成する必要がある場合、生じた製造物は典型的に、合成または精製工程時に存在し得る毒性となる可能性のある薬剤、特にエンドトキシン類のいずれもが実質的に無い。非経口用組成物はまた、滅菌で、実質的に等張性であり、ＧＭＰ条件下で製造される。
本発明は、複数回用量または単回用量投与単位を作製するためのキットを提供する。例えば、本発明によるキットは各々、例えば、単一および複数チャンバの前充填されたシリンジ（例えば、液体シリンジ、リオシリンジまたは針なしシリンジ）などの、乾燥タンパク質を有する第１の容器および水性希釈剤を有する第２の容器の双方を含むことができる。
本発明の薬学的組成物は、典型的には注射により非経口的に送達できる。注射は、眼内、腹腔内、門脈内、筋肉内、静脈内、くも膜下腔内、病巣内、病巣周囲または皮下であり得る。点眼剤は、眼内投与のために使用できる。幾つかの場合において、注射は、処置が標的とする特定の１本の骨または複数本の骨の近傍に局在化させることができる。非経口投与のために、抗体は、薬学的に受容可能な媒体中、所望の抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫機能性フラグメントを含む、発熱物質のない非経口的に受容可能な水溶液中で投与できる。特に非経口注射に好適な媒体は、抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫機能性フラグメントが、適切に保存された滅菌等張性液として製剤化されている滅菌蒸留水である。
対象の抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫機能性フラグメントを含む薬学的組成物は、放出持続を達成するために、輸液による大量瞬時投与または連続投与、移植デバイス、持続型放出システムまたは他の手段により投与できる。薬学的組成物はまた、所望の分子が吸収されているか、またはカプセル化されている膜、スポンジまたは別の適切な材料を介して局所的に投与できる。移植デバイスが用いられる場合、該デバイスは、任意の好適な組織または臓器に移植でき、所望の分子の送達は、拡散、定時放出大量瞬時投与、または連続放出であり得る。この製剤は、製品の制御放出または持続放出を提供できる注射可能なミクロスフェア、生体侵食性粒子、ポリマー化合物（ポリ乳酸；ポリグリコール酸；またはコポリ（乳／グリコール）酸（ＰＬＧＡ）など）、ビーズまたはリポソームなどの物質によって製剤化でき、次いで蓄積注射により送達できる。ヒアルロン酸による製剤化は、循環時間の持続を助長する効果を有する。
抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫機能性フラグメントを含む対象組成物は、吸入用に製剤化できる。これらの実施形態において、抗Ｄｋｋ−１抗体は、吸入用の乾燥粉末として製剤化されるか、または抗Ｄｋｋ−１抗体の吸入溶液もまた、噴霧化などにより、エーロゾル送達用噴射剤と共に製剤化できる。肺送達は、化学的修飾タンパク質の肺送達が記載され、参照として本明細書に組み込まれている国際出願ＰＣＴ／米国第９４／００１８７５号にさらに記載されている。
本発明のある一定の薬学的組成物は、経口など、消化管を介して送達できる。この様式で投与される対象の抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫機能性フラグメントは、錠剤およびカプセル剤などの固形剤形の配合に慣例的に使用されるキャリアと共に、またはキャリアなしで製剤化できる。カプセル剤は、生物学的利用能が最大であり、全身前分解が最少である時に胃腸管内の箇所で製剤の活性部分を放出させるようにデザインできる。抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫機能性フラグメントの吸収を促進させるために、追加の試剤を含ませることができる。経口投与では、消化酵素に対する耐性を付与するために、修飾アミノ酸を使用できる。希釈剤、風味剤、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤、および結合剤もまた使用できる。
抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫機能性フラグメントを含む対象組成物はまたエキソビボでも使用できる。このような場合において、患者から取り出された細胞、組織または臓器を、抗Ｄｋｋ−１抗体に暴露するか、それと共に培養する。次いで培養細胞を、その患者または異なる患者に戻して移植できるか、または他の目的のために使用できる。
一定の実施形態において、抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫機能性フラグメントは、ポリペプチドを発現し、分泌させるために、本明細書に記載されたものなどの方法を用いて、遺伝子操作された一定の細胞を移植することによって送達できる。このような細胞は、動物細胞でもヒト細胞でもよく、また、自己種でも、異種でも、異種間でもよく、また不死化のものであってもよい。免疫応答の機会を減少させるために、細胞はカプセル化して周囲組織の侵入を避けることができる。カプセル化材料は、典型的には生体適合性であって、タンパク質製品は放出させるが、患者の免疫系または周囲組織からの他の有害な因子による細胞破壊を防ぐような半透過性封入体または膜である。
Ｂ．投与量
提供される薬学的組成物を、予防処置および／または治療処置のために投与できる。「有効量」とは、一般に症状の重症度および／または頻度の軽減または除去および／または損傷の改善または治療である所望の効果を達成するために、活性成分（すなわち、抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫機能性フラグメント）の十分ではあるが、非毒性である量を称す。「治療的有効量」とは、疾患状態または症状を治療するために十分な量、あるいは、疾患または任意の他の望ましくない症状の進行を防ぐか、妨げるか、遅らせるかまたは反転させる上で十分な量を称す。「予防的有効量」とは、疾患状態または症状の発生を防ぐか、妨げるかまたは遅らせる上で有効な量を称す。
一般に、該抗体またはフラグメントの毒性および治療的有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％が致死する量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的有効な用量）の測定など、細胞培養および／または実験動物における標準的薬学手法に従って判定できる。毒性作用と治療作用との間の用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。大きな治療指数を示す組成物が好ましい。
細胞培養および／または動物試験から得られたデータは、ヒトへの投与量範囲を製剤化するのに使用できる。活性成分の投与量は、典型的に、毒性が殆ど無いか、全く無いＥＤ５０を含む濃度を循環させる範囲内にある。投与量は、使用される剤形および利用される投与経路に依ってこの範囲内で変わり得る。
治療的または予防的に使用される、抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫機能性フラグメントを含む薬学的組成物の有効量は、例えば、治療の背景および目的に依る。したがって、一定の実施形態による治療のための適切な投与量レベルは、部分的に、送達される分子、抗Ｄｋｋ−１抗体が用いられる適応症、投与経路、および患者のサイズ（体重、体表面または臓器サイズ）に依って変わり得ることを当業者は認識するであろう。臨床医は、投与量の力価を測ることができ、最適の治療効果を得るために投与経路を変更できる。典型的な投与量は、上記の因子に依って、約０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまで、またはそれ以上の範囲である。一定の実施形態において、投与量は、０．１μｇ／ｋｇから約１５０ｍｇ／ｋｇまで；または１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまで；または５μｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇまでの範囲であり得る。
投与回数は、製剤中の抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫機能性フラグメントの薬物動態パラメータに依存する。例えば、ある投与量が、所望の効果達成に到達するまで、臨床医は、該組成物を投与するであろう。したがって、該組成物は、単回用量、または経時的に２回以上の用量（所望の分子の同一量を含有しても、しなくてもよい）、または移植デバイスまたはカテーテルを介した連続輸液として投与できる。治療は、経時的に連続的であっても、または断続的であってもよい。適切な投与量のさらなる改善は、通常の当業者によりルーチンに成され、彼らによりルーチンに実施される業務の範囲内である。適切な投与量は、適切な用量応答データの使用により確認することができる。
Ｄｋｋ−１の異常発現または過剰発現を特徴とする医学的障害を治療するために、対象の抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫機能性フラグメントを含む組成物は、障害の重症度を反映する少なくとも１つの指標において持続された改善を誘導する上で十分な量および時間で患者に投与できる。患者が、少なくとも１日から７日、または幾つかの場合においては１週間から６週間離れた少なくとも２つの機会に改善を示す場合に、改善が「持続されている」と考えられる。適切な間隔は、ある程度、治療されている病態に依存し；改善が持続されているかどうかを判定するための適切な間隔を決定するのは、当業医師の権限内にある。改善の程度は、徴候または症状に基づいて判定され、また生活の質のアンケートなど、患者に渡されるアンケートも使用できる。
患者の病気の程度を反映する種々の指標を、治療の量および時間が十分であるかどうかを判定するために評価できる。選択された１つまたは複数の指標に関するベースライン値は、抗体の最初の用量投与前の患者の検査により確立される。ベースライン検査は、最初の用量投与の約６０日以内に行われることが好ましい。例えば、骨折の治療など急性症状を治療するために抗体を投与する場合、傷害が生じたら実際にはできるだけ早く最初の用量が投与される。
患者が、選択された１つまたは複数の指標に関するベースラインを超えた改善が明示されるまで抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫機能性フラグメントを投与することにより改善が誘導される。慢性病態の治療において、この改善度は、少なくとも１ヵ月以上の期間、例えば、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月以上、または無期限に亘ってこの医薬品を反復投与することにより得られる。１週間から６週間の期間、または単回用量でも、急性病態の治療に十分であることが多い。傷害または急性病態に関して、単回用量でも十分であり得る。
治療後の患者の病気の程度が、１つまたは複数の指標に従って改善されたように見えても、治療を、同じレベルでまたは用量または回数を減じて無期限に継続できる。いったん治療を減少、または中止しても、後で症状が再び現れたら、元のレベルで再開できる。
ＶＩＩ．抗Ｄｋｋ−１抗体に関する代表的な有用性
Ａ．検出およびスクリーニング
対象の抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫機能性フラグメントは、生体サンプルにおけるＤｋｋ−１を検出するために使用できる。このような使用は、該タンパク質を産生する細胞または組織の確認を可能にするか、あるいはＤｋｋ−１が過剰産生、または過少産生される病態を検出するための診断として役立つ。
提供される抗体およびフラグメントは、Ｄｋｋ−１に結合する分子をスクリーニングする方法にも使用できる。例えば、種々の競合的スクリーニング法が使用できる。幾つかの方法において、Ｄｋｋ−１抗体が結合するＤｋｋ−１分子またはそのフラグメントを、別の分子（すなわち、候補分子）と共に、本明細書に開示された抗体またはフラグメントに接触させる。該抗体またはフラグメントとＤｋｋ−１との間の結合減少は、該分子がＤｋｋ−１に結合する指標である。該抗体またはフラグメントの結合は、種々の方法、例えばＥＬＩＳＡを用いて検出できる。Ｄｋｋ−１抗体またはフラグメントとＤｋｋ−１との間の結合の検出は、抗体を検出可能に標識することによって簡便化できる。幾つかの方法において、最初のスクリーニングで結合を示す分子を、それがＤｋｋ−１活性を示すかどうか（例えば、該分子がＷｎｔシグナル伝達を活性化するかどうか）を判定するためにさらに分析する。
Ｂ．骨関連障害の治療
他の態様において、提供される抗体および免疫機能性フラグメントの幾つかは、例えば、Ｄｋｋ−１活性の阻害に応答する疾患など、種々の異なる疾患を有する患者を治療するために使用できる。これらの抗体およびフラグメントはまた、Ｗｎｔシグナル伝達の誘導に応答する疾患を治療するためにも使用できる。本明細書に用いられる用語の「患者」は、他に記載されない限りヒトおよび動物対象を含む。このような疾患の例としては、限定はしないが、骨質量低下状態、全身骨減少、骨形成抑制および骨侵食などの骨障害に関与する種々の疾患が挙げられる。該抗体およびフラグメントの幾つかは、骨修復にも使用できる。
抗体および免疫機能性フラグメントの幾つかは、骨芽細胞活性を刺激し、骨塩密度または骨質量を増加させる治療的使用を有する。したがってこれらの抗体およびフラグメントは、過度の骨減少に関係する種々の医学的障害を患っている患者または過度の骨芽細胞活性が必ずしもないと思われる場合でも新骨形成を必要とする患者を治療するために有用である。Ｄｋｋ−１活性の遮断により、Ｗｎｔタンパク質によって伝達されるシグナル伝達を介して骨芽細胞活性化がもたらされる。過度の破骨細胞活性化は、骨減少症、骨粗しょう症、歯周病、ページェット病、固定化による骨減少、溶解性骨転移およびリウマチ様関節炎、乾癬性関節炎などの関節炎、強直性脊椎炎および骨侵食に関係する他の病態など、提供される抗体および免疫機能性フラグメントにより治療できる多くの骨減少症障害に関連する。
限定はしないが、グルココルチコイド誘導骨粗しょう症、移植後誘導骨粗しょう症、化学療法に伴う骨粗しょう症（すなわち、化学療法誘導骨粗しょう症）、固定化誘導骨粗しょう症、機械的荷重除去による骨粗しょう症、および抗痙攣薬使用に伴う骨粗しょう症などの種々の形態の骨粗しょう症など、種々の他の骨質量低下状態もまた治療できる。幾つかの抗体またはフラグメントにより治療できるさらなる骨疾患としては、腎不全に伴う骨疾患、ならびに栄養、胃腸および／または肝臓関連の骨疾患が挙げられる。
骨関節炎およびリウマチ様関節炎などの例が挙げられる種々の形態の関節炎もまた治療できる。該抗体およびフラグメントはまた、関節炎（例えば、リウマチ様関節炎）に伴う全身性骨減少を治療するために使用できる。関節炎の治療において、患者は、病巣周囲または病巣内へ、対象抗体またはそのフラグメントを注入することにより利益を得ることができる。例えば、抗体またはそのフラグメントを、炎症性関節に隣接して、または直接に注入することにより、その部位の損傷骨の修復を刺激することができる。
乳癌および前立腺癌などの幾つかの癌は、破骨細胞活性を増加させ、骨再吸収を誘導させることが知られている。骨髄に生じる多発性骨髄腫もまた、おそらく部分的には、血漿細胞によるＤｋｋ−１の発現増加による骨減少を伴い、次いで近傍での骨芽細胞の骨構築活性を抑制する。対象の抗体およびその免疫機能性フラグメントの投与によりＤｋｋ−１活性を減少させることによって、過度の破骨細胞活性に反作用することに役立つ骨芽細胞活性の増加をもたらすことができ、それによって患者における前述の重症度の障害を軽減し、骨侵食を軽減し、新骨形成を誘導する。幾つかの抗Ｄｋｋ−１抗体または免疫機能性フラグメントによる治療により、骨減少性障害を患っている患者における骨塩密度の有意な増加を誘導することができる。
本明細書に記載された抗体または免疫機能性フラグメントによるＤｋｋ−１の阻害はまた、種々の骨修復適用にも使用できる。例えば、ある一定の抗体およびフラグメントは、人工関節に伴う摩耗デブリの骨破壊の遅延化、骨折修復の促進、および移植された骨移植片の周囲の生骨への取込み増強に有用となり得る。
抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫機能性フラグメントは、単独でまたは他の治療剤と併用して、例えば、癌治療剤、破骨細胞活性を阻害する薬剤、または骨芽細胞活性を増強させる他の薬剤と併用して投与することができる。例えば、本発明の抗体は、放射線療法または化学療法を受けている癌患者に投与できる。本発明の抗体と併用して用いられる化学療法剤としては、アントラサイクリン類、タキソール、タモキシフェン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、オキサロプラチン、Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標）（［（１Ｒ）−３−メチル−１−［［（２Ｓ）−１−オキソ−３−フェニル−２−［（ピラジニルカルボニル）アミノ］プロピル］アミノ］ブチル］ボロン酸）および／または癌治療に使用される他の小型分子薬物を挙げることができる。乳癌患者は、化学療法剤と抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫機能性フラグメントとを含む併用治療と同時にアロマターゼ阻害剤の投与から利益を得るであろう。
抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫機能性フラグメントは、骨質量の減少をもたらす上記に挙げた病態の治療のために単独で、または、限定はしないが、ＢＮＰ−１からＢＭＰ−１２と称される骨形態形成因子；形質転換成長因子−βおよびＴＧＦ−ベータファミリーメンバー；線維芽細胞成長因子ＦＧＦ−１からＦＧＦ−１０；インターロイキン−１阻害剤（ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１に対する抗体およびＩＬ−１受容体に対する抗体など）；ＴＮＦα阻害剤（エタナーセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）、アダリブマブ（ａｄａｌｉｂｕｍａｂ）およびインフリキシマブ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）など）；ＲＡＮＫリガンド阻害剤（溶解性ＲＡＮＫ、オステオプロテゲリン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）およびＲＡＮＫまたはＲＡＮＫリガンドに特異的に結合するアンタゴニスト抗体など）、副甲状腺ホルモン、Ｅシリーズプロスタグランジン類、ビスホスホネート類およびフッ化物ならびにカルシウムなどの骨増強無機塩類、などの骨成長促進（アナボリック）剤または骨抗再吸収剤と併用して使用できる。本発明の抗体およびその機能性フラグメントと併用して使用できるアナボリック薬剤としては、副甲状腺ホルモンおよびインスリン様成長因子（ＩＧＦ）が挙げられ、後者の薬剤は、ＩＧＦ結合タンパク質と複合化されていることが好ましい。このような併用治療に好適なＩＬ−１受容体アンタゴニストは、国際公開第８９／１１５４０号に記載されており、好適な溶解性ＴＮＦ受容体−１は、国際公開第９８／０１５５５号に記載されている。代表的なＲＡＮＫリガンドアンタゴニストは、例えば、国際公開第０３／０８６２８９号、国際公開第０３／００２７１３号、米国特許第６，７４０，５１１号および米国特許第６，４７９，６３５号に開示されている。前述の特許および特許出願は全て、参照として本明細書に組み込まれている。
さらに、抗Ｄｋｋ−１抗体は、腫瘍細胞に結合し、腫瘍成長に対して細胞毒性効果および／または細胞増殖抑制効果を誘導する抗体と併用して患者に投与できる。このような抗体の例としては、細胞表面のタンパク質Ｈｅｒ２、ＣＤＣ２０、ＣＤＣ３３、ムチン様糖タンパク質および腫瘍細胞に存在する上皮細胞成長因子（ＥＧＦＲ）に結合し、これらのタンパク質を示す腫瘍細胞に対する細胞増殖抑制効果および／または細胞毒性効果を誘導するものが挙げられる。このような抗体の例としては、乳癌の治療のためのＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）および非ホジキンリンパ腫の治療のためのＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）が挙げられ。また、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）およびＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）などの抗体ベース薬物が挙げられる。また、併用療法としては、ＴＮＦ関連ポリペプチドＴＲＡＩＬなどの腫瘍細胞において選択的にアポトーシスを誘導する、癌治療剤としてのポリペプチド類を挙げることができる。
対象の抗体またはその免疫機能性フラグメントを、同じ条件で投与される他の処置および治療剤と共に同時に投与できる。本明細書に用いられる「同時投与」は、同時または連続的に投与される処置を包含する。抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫機能性フラグメントは、初期（病期ＩまたはＩＩ）の癌による骨質量の減少発生を防ぐか、あるいは緩和させるために予防的に投与できるか、または骨に対する転移による既存の骨質量減少病態を寛解させるために投与できる。
本発明の抗Ｄｋｋ−１抗体は、骨内の腫瘍細胞の増殖を防ぎ、および／または処置するために使用できる。腫瘍細胞は破骨細胞を刺激して、内部骨マトリックスを再吸収させるために、骨に転移する癌を容易に拡がり得る。抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫機能性フラグメントによる処置は、骨芽細胞活性増大を刺激することにより、このような転移部位での骨塩密度の維持を助ける。骨へ転移する可能性のある癌は、転移が生じる前後に投与された抗Ｄｋｋ−１抗体により予防または処置できる。
多発性骨髄腫は、抗Ｄｋｋ−１抗体またはその抗原結合フラグメントによって予防および／または治療できる癌タイプの一例である。罹患患者は、骨の局在化領域における破骨細胞の活性化増大のため骨質量の減少を典型的に示す。骨髄細胞は、破骨細胞を活性化して、骨髄空間に埋め込まれている骨髄腫細胞の周囲の骨を溶解するタンパク質であるＲＡＮＫリガンドを直接的または間接的に産生する。次いで骨髄腫細胞に隣接する正常な破骨細胞がＩＬ−６を産生し、骨髄腫細胞の成長および増殖をもたらす。さらに多発性骨髄腫細胞は、Ｄｋｋ−１を産生することによって骨芽細胞の活性を阻害し、さらにこの疾患における骨再吸収活性を促進させる。抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫機能性フラグメントによる動物の治療により、骨芽細胞活性が刺激され、それによって腫瘍部位での骨質量が増加する。このような治療は、骨痛の軽減をもたらし、腫瘍細胞により利用される骨栄養素を放出する再吸収活性を防ぐことにより、骨へのさらなる転移を遮断できる。この疾患の治療において、抗Ｄｋｋ−１抗体またはその免疫機能性フラグメントは、ＲＡＮＫリガンドまたはＩＬ−６に対する抗体に対して特異的であるアンタゴニスト抗体と同時に投与できる。
Ｃ．他の障害の治療
骨障害に関連する前述の使用に加えて、提供される抗体または免疫機能性フラグメントの幾つかは、他の疾患を治療するために使用できる。これら種々の疾患におけるＤｋｋ−１の役割は、種々の異なる組織におけるその発現により部分的に支持される。例えば、該抗体およびフラグメントは、幹細胞再生を促進することが望ましい疾患を治療するために使用できる。このような疾患としては、限定はしないが、糖尿病、慢性心不全および種々の筋疾患［例えば、固定化またはベッド安静から生じる不使用萎縮症；加齢による脆弱（高齢者の肉腫）；筋ジストロフィ；癌、ＡＩＤＳまたは感染症に関連する悪液質；腎不全／尿毒症におけるタンパク質エネルギー失調症、および肥満症における筋萎縮］が挙げられる。種々の感染性疾患、例えば、クローン病、大腸炎、および感染性腸疾患もまた治療できる。該抗体およびフラグメントは、種々の神経系疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびハンチントン病）の治療にも使用できる。眼疾患（例えば、黄斑変性症および種々の網膜症）もまた、該抗体およびフラグメントの幾つかにより治療できる。種々の腎疾患（例えば、末期腎疾患、慢性腎疾患、糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎およびＩｇＡ腎症）もまた、幾つかの抗体により使用できる。さらに、皮膚疾患および上皮疾患などの種々の肺疾患（例えば、慢性閉塞性肺疾患、特発性後腹膜繊維化症および嚢胞性線維症）および種々の皮膚障害もまた治療できる。治療できる皮膚障害の例としては、損傷腸管上皮（例えば、化学療法誘導損傷）、および腸管上皮の成長および生存を刺激することが望ましい他の疾患が挙げられる。
ＶＩＩＩ．キット
本明細書に記載された抗体または免疫機能性フラグメントまたは薬学的組成物を含むキットもまた提供される。幾つかのキットには、容器（例えば、バイアルまたはサンプル）中に抗体、フラグメントまたは組成物などを含み、上記の種々の検出、スクリーニングおよび治療適用における該抗体またはフラグメント使用のための取扱い説明書もまた含むことができる。抗体、フラグメントまたは組成物は、例えば、溶液の一部として、または固体（例えば、凍結乾燥粉末）としてなど、種々の形態であり得る。この取扱い説明書には、適切な液体中に該抗体またはフラグメントを調製する方法（例えば、溶解または再構成）および／または上記疾患（例えば、骨低質量、全身骨減少症、骨形成抑制および骨侵食などの骨障害；幹細胞再生；感染性疾患；神経系疾患；眼疾患；腎疾患および皮膚障害）の治療のために該抗体またはフラグメントを投与する方法に関する説明書を含むことができる。
キットはまた、緩衝剤、塩類、錯化金属イオン類および上記の薬学的組成物の節で記載された他の薬剤などの種々の他の成分を含むことができる。これらの成分は、該抗体またはフラグメントと一緒に含んでもよく、または別々の容器に入れてもよい。キットはまた、該抗体またはフラグメントと一緒に投与するための他の治療剤を含むことができる。このような薬剤の例としては、限定はしないが、癌を治療する薬剤、腫瘍細胞に結合する骨促進剤および抗体、ならびに上記の他の薬剤が挙げられる。
以下の実施例は、本明細書に提供される抗体、フラグメントまたは組成物のある一定の態様を単に説明するために提供されており、したがって請求された本発明の範囲を限定するものとして解釈してはならない。
（実施例１ マウスおよびラットにおけるマウスＤｋｋ−１に対するモノクローナル抗体の産生）
Ａ．免疫化
抗原として使用された組換えマウスＤｋｋ−１は、公的に入手可能な配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０３０４３３．１）を用いてマウス胎盤ｃＤＮＡからクローン化された。抗マウスＤｋｋ−１抗体の交差反応性を試験するために用いられたヒトＤｋｋ−１のクローニングは、米国特許第６，３４４，５４１号に記載されたとおりに行った。抗原として使用するマウスＤｋｋ−１を調製するために、８５０ｃｍ２ローラーボトルで、５％ＦＢＳ、１×非必須アミノ酸、１×ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ／ｇｌｕｔおよび１×ピルビン酸ナトリウムを有するＤＭＥＭ（完全ＤＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ、グランドアイランド、ニューヨーク州）中の４〜５×１０７接着２９３Ｔ細胞（Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手したヒト胎性腎細胞）を接種し一晩置いた。
翌日、細胞を形質移入した。６７５μｌのＦｕＧｅｎｅ６トランスフェクション剤を、６．７５ｍｌの無血清ＤＭＥＭ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）および１１２．５μｇのｐｃＤＮＡ３．１ ＤＮＡ（このプラスミドはＦＬＡＧに結合されたマウスＤｋｋ−１を発現する）中に希釈した。室温で３０分間インキュベーション後、ＤＮＡ混合物を各ローラーボトル（全部で約３０本のボトル）に加え、５％ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。２４時間後、１×非必須アミノ酸、１×ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ／ｇｌｕｔ、１×ピルビン酸ナトリウム、１×インスリン−トランスフェリン−セレン補足剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および０．５％ＤＭＳＯを含有する１００ｍｌの無血清ＤＭＥＭを、各ボトルに加えた。この培地を採取し、１４日間４８時間毎に新鮮な培地と取替えた。プールされた澄明な培養培地から、マウスＤｋｋ−１を精製した。
下記のとおりマウスおよびラットを、完全長組換えマウスＤｋｋ−１の注入により免疫化した。幾つかの実験では、マウス（ラットではなく）に、ＰＡＤＲＥペプチド（Ｅｐｉｍｍｕｎｅ）への注入前に結合した組換えマウスＤｋｋ−１を注入した。結合は、マウスＤｋｋ−１と２５倍モル過剰のＮ−スクシンイミジル６−マレイミデオカプロエート（ＭＩＣＡ）（Ｆｌｕｋａ ＃６３１７７）とを室温で３時間反応させることによって実施した。マレイミド活性化マウスＤｋｋ−１を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５で充填した８ｍｍ×１２５ｍｍカラムにより未処理ＭＩＣＡから分離した。１ｍｇのマレイミド活性化マウスＤｋｋ−１を、０．５ｍｇのＰＡＤＲＥペプチド（ＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡＣ；配列番号１３）および０．５ｍｇのＰＡＤＲＥペプチド（ＣＡＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（Ｘ＝シクロヘキシル−アラニン）；配列番号１４）と共に室温で１時間インキュベートし、次いでＰＢＳに対して透析した。
Ｂａｌｂ／ｃマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）ならびに遺伝子導入ＡＧＰ３マウス（Ｋｈａｒｅら、ＰＮＡＳ ９７：３３７０−３３７５頁、２０００年）を、下記のとおり末梢排出リンパ節または脾臓を標的として免疫化した。ルイスラットは、脾臓のみを標的にして免疫化した。
リンパ節を標的にするために、１：１比のＤｋｋ−１：アジュバントを用いて１０〜１３日に亘って１２箇所（背部６箇所、腹部６箇所）に５回皮下注入した。使用されたアジュバントは、完全／不完全フロイントアジュバント混合物（Ｐｉｅｒｃｅ）またはＲＩＢＩ（Ｃｏｒｉｘａ）のいずれかとした。最終注入から１日から３日後に、各注入マウスからの末梢リンパ節を採取し、下記のとおり誘電電気泳動細胞融合を用いてマウスＳＰ２／０．Ａｇ１４骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ １５８１）に融合した。注入ラットに対して、最後の抗原注入から１３日後にリンパ節を取り出し、リンパ球を、ラットに由来するＹ３ Ａｇ １．２．３融合パートナー細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ １６３１）に融合した。
脾臓を標的にするために、マウスに対して１：１比のｍｕＤｋｋ−１：完全フロイントアジュバントまたはｍｕＤｋｋ−１−ＰＡＤＲＥ：完全フロイントアジュバントのいずれかを用いて２〜４箇所の部位に皮下注入した。２週間後に、１：１比のｍｕＤｋｋ−１：ＲＩＢＩアジュバントまたはｍｕＤｋｋ−ＰＡＤＲＥ：ＲＩＢＩアジュバントを用いて２箇所の皮下部位および１箇所の腹腔内部位に第２の免疫化を実施した。抗Ｄｋｋ−１抗体応答に関して分析するために、血液サンプルを１０日後に採取した。最も良く応答したものには、ＰＢＳ中ｍＤｋｋ−１の腹腔内注入をして増強した。５日後、マウスＳＰ２／０．Ａｇ１４骨髄腫細胞に融合させるリンパ球調製のために脾臓を取り出した。
Ｂ．リンパ球融合プロトコル
免疫化動物のリンパ節または脾臓から単離したリンパ球を、以下の最適プロトコルを用いてマウスＳＰ２／０．Ａｇ１４またはＹ３ Ａｇ １．２．３ラット細胞に融合した。
単一細胞懸濁液を、脾臓細胞または末梢リンパ節（ＰＬＮ）細胞から調製し、３０〜４０ｍｌの無血清培地を用い、１００μｍの細胞ろ過器を通して５０ｍｌチューブにろ過した。２０００ｒｐｍで５分間チューブを遠心分離し細胞を採取した。赤血球（存在する場合）を溶解させるために、細胞を、１０ｍｌのＲＢＣ溶解緩衝液（０．０１Ｍ ＴＲＩＳ／ＨＣｌ中、８．３ｇ／Ｌ塩化アンモニウム、ｐＨ７．２）に再懸濁し、さらに溶解緩衝液を全部で３０ｍｌ加えた。細胞を２〜５分間放置してから、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。赤色がペレット中に残存している場合は、この溶解法を繰り返した。溶解ステップ後、細胞をＳＦ媒体に再懸濁し、計数のために一定分割量を取り出し、次いで細胞を全部で５０ｍｌのＳＦ媒体中で洗浄した。
融合に使用される前に、これらの細胞を以下の「選別」法に２回供した。この選別は、これらの処置に抵抗した細胞を選別する目的のために実施するもので、以下のとおり２回繰り返した。選別は、幾つかのステップの融合プロトコル、すなわち、遠心分離、ＥＣＦ融合緩衝液中のインキュベーション（Ｃｙｔｏｐｕｌｓｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｙｔｏｆｕｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ Ｃ、カタログ番号ＣＰＳ−ＬＣＭ）および融合過程の電流による整列工程の実施から成った。この選別を受けたＳＰ２／０．Ａｇ１４骨髄腫細胞は、「ＳＰ２／０−ＥＣＦ−Ｆ」細胞と称され、選別を受けたＹ３．ＡＧ １．２．３細胞は、「Ｙ３−ＥＣＦ−Ｆ」細胞と称される。
Ｂ細胞濃縮ステップは、マウスにのみ実施された。なお、ＡＧＰ３マウスを用いる場合、このステップは行われない。手短に言えば、このステップは、ＳＦ中、１０７個の脾臓細胞またはリンパ節細胞を懸濁し、ＳＦ媒体で予め洗浄した１０μｌのＣＤ９０＋磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ Ｂｉｏｔｅｃカタログ番号１３０−０４９−１０１）を加え、緩やかに攪拌しながら４〜１２℃で１５分間インキュベートすることからなる。次に細胞を、媒体により１：３に希釈し、４０μｍろ過器を通してろ過した。全部で２×１０８個の細胞（１０８個の陽性細胞）まで、ＬＳ＋カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ Ｂｉｏｔｅｃカタログ番号１３０−０４２−４０１）上に装填し、溶出物をＣＤ９０−フラクションとして採取した。
融合を実施する前に、融合用チャンバを７０％エタノールで滅菌し、次いで無菌フード内で風乾した。Ｂ細胞濃縮が実施される場合、骨髄腫およびＣＤ９０−を１：１で組合わせ、５０ｍｌチューブ内で十分に混合した。Ｂ細胞濃縮が実施されたら、骨髄腫および脾細胞またはＰＭＮｓを１：２．５比で組合わせた。無血清培地を４０ｍｌ加え、細胞を２０００ＲＰＭで５分間遠心分離した。細胞ペレットを、２５ｍｌの等浸透圧融合緩衝液（ＥＣＦ）で２回洗浄した。細胞をある容量のＥＣＦに再懸濁し１ｍｌ当り２×１０６から１×１０７までの最終濃度を得た。２ｍｌの懸濁細胞を、２ｍｌの融合用チャンバに移し、ケーブルに接続した。６０ボルトのＡＣを、３０秒間印加し、次いで３０マイクロ秒間１５００ボルトのＤＣの３連続パルスを１秒間隔で、次いで６０ボルトのＡＣを３秒間印加した。この処理中、洗浄液も含め等浸透圧融合緩衝液への細胞の暴露は３時間以内とした。融合後、細胞を室温で１５〜４５分間融合用チャンバ内で静置し、その後で、続きの処置を実施した。
融合細胞を、融合用チャンバから取り出し、１５％低ＩｇＧ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１×ＰＳＧ（Ｇｉｂｃｏ）、５５μｍβ−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、１×ＯＰＩ（Ｓｉｇｍａ）および５％Ｏｒｉｇｅｎクローニング因子（Ｉｇｅｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を含有するＢＤ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｙｉｅｌｄ培地（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中、１〜５×１０５個の細胞／ｍｌに再懸濁した。Ｙ３Ａｇ１．２．３融合パートナーを含む実験において、１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６を、Ｏｒｉｇｅｎクローニング因子の代わりに用いた。９６ウェル培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ）の個々のウェルに、１００μｌの細胞を接種し、３７℃、６．５％ＣＯ２中でインキュベートした。翌日１×ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ）を含有する１００μｌの同じ培地を各ウェルに加え、このプレートをさらに７日間インキュベートし、その後培地を除去し、２００μｌの同じ培地に置き換えた。総日数１０〜１４日のインキュベーションの後にＥＬＩＳＡスクリーニングを実施した。
融合は全て、Ｃｙｔｏｐｕｌｓｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｙｔｏｆｕｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ Ｃ Ｃｅｌｌ（カタログ番号ＣＰＳ−ＬＣＭ）中で実施した。骨髄腫細胞に対する細胞融合は、ＥＣＭ２００１およびエンハンサー４００パルスモニターを用いて以下のとおり達成した。用いられた条件を、下表５に示しす。
Figure 0004840939
 一般に、融合リンパ球は、後の分析のために融合直後に凍結させた。凍結のために、ｔ−１５０フラスコに、融合培地中、１〜３×１０５／ｍｌの間の骨髄腫細胞密度で新鮮に融合したハイブリッドを接種した。翌日、細胞を採取し、１０％ＤＭＳＯを含有する９０％ＦＢＳ中で凍結した。
（実施例２ Ｄｋｋ−１に対する中性抗体を産生するハイブリドーマの単離）
実施例１に記載されたハイブリドーマを、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて最初にスクリーニングした。ＥＬＩＳＡのために、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：ＧＩＢＣＯ）中、５０μｌの１〜５μｇ／ｍｌ組換えｍｕＤｋｋ−１を高結合ＥＬＩＳＡプレート（ＣＯＳＴＡＲ（登録商標））の各ウェルに加えてプレートを１時間調製した。次いで、ハイブリドーマ上澄液の非特異的結合を阻止するために、ウェルを、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および１％ヤギ血清（ＧＩＢＣＯ）を含有する２００μｌのＰＢＳと共に１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで洗浄し、４０μｌのハイブリドーマ上澄液を各ウェルに加えてから、プレートを１時間インキュベートした。もう一度ＰＢＳで洗浄後、ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）に結合したヤギ抗ｍｕＩｇＧ（Ｆｅ特異的）またはＨＲＰに結合したヤギ抗ラットＩｇＧ．Ｈ＋Ｌの１：１０，０００希釈液の５０μｌを各ウェルに加え、プレートを室温で１時間インキュベートした、プレートをＰＢＳで再度洗浄し、その後１ウェル当り、５０μｌのＡＢＴＳ基質（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸；ＫＰＬ）を加えた。この基質は、ＨＲＰとの反応の際に水溶性緑色産物を産生する。光学密度を、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて読取り、データは、Ｓｏｆｔｍａｘプロソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて解釈した。下表６は、免疫化された動物の各カテゴリから得られたＥＬＩＳＡ陽性クローン数を示している。抗原反応性の全てのハイブリドーマを、抗体の産生およびさらなる試験のために細胞培養において増加させた。
Figure 0004840939
 Ａ．ＴＣＦ／ｌｅｆ−ルシフェラーゼアッセイ
実施例１に記載されたとおり得られた数百のハイブリドーマを、ルシフェラーゼ発現がＷｎｔの制御下にあるＴＣＦ／ｌｅｆ−ルシフェラーゼレポーター構築体を利用して試験した。この構築体により形質移入された細胞が、生物学的に活性なＷｎｔに暴露された場合、ルシフェラーゼ活性が誘導される。Ｗｎｔ誘導ルシフェラーゼ活性は、組換えＤｋｋ−１タンパク質をこの構築体を含有する細胞に加えることによって抑制できる。本実験に関して、Ｗｎｔ３ａおよびＤｋｋ−１の双方を最初に、Ｗｎｔ依存ルシフェラーゼ発現の凡そ８０％を抑制する最適化量で細胞に加えた。抗Ｄｋｋ−１抗体のこれら同じ細胞へのさらなる添加は、Ｗｎｔ活性を再生させ、したがってルシフェラーゼ発現を増加させることが予想される。したがって、Ｗｎｔ／ルシフェラーゼ構築体を形質移入された細胞においてルシフェラーゼ発現を再生できるかどうかを判定するために、ハイブリドーマの上澄液を試験した。ルシフェラーゼ活性は、下記のとおり定量化した。
０日目に、新鮮にトリプシン化した２９３Ｔ細胞を、フィブロネクチン被覆９６ウェルプレート内に２．５×１０４／ウェルで平板培養した。次いで細胞に、ホタルルシフェラーゼをコードするＤＮＡおよびウミシイタケルシフェラーゼをコードするＤＮＡを同時トランスフェクトした。１日目の各ウェルで、３０μｌのＤＭＥＭ（マイナス抗体）中１０ｎｇのＴＣＦ／ｌｅｆ−ルシフェラーゼＤＮＡ（ＵｐｓｔａｔｅのＴＯＰｆｌａｓｈ、番号２１−１７０）および１ｎｇのウミシイタケルシフェラーゼＤＮＡ（ｐＲＬ−ＴＫ；Ｐｒｏｍｅｇａ番号Ｅ２２４１）を、１：１０Ｐｏｌｙｆｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｂｔ（登録商標）（Ｑｕｉａｇｅｎ ３０１１０７）の２０μｌと混合し、ＰｏｌｙＦｅｃｔ−ＤＮＡ複合体を形成させるために室温で１０分間インキュベートした。このインキュベーション後、１００μｌの増殖培地を該複合体に加えた。次に培養培地を各ウェルから取り出し、増殖培地中の複合体をウェルに加えた。ウェル中の増殖培地を３時間後に取り出し、馴化培地と置き換えた。
３日後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、デュアルルシフェラーゼキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、番号ＰＡＥ１９６０）中に含まれた４０μｌの新鮮に作製された受動溶解用緩衝液を各ウェルに加えた。受動溶解用緩衝液はまた、Ｐｒｏｍｅｇａ（番号Ｅ１９４１）から別に入手できる。プレートを室温で２０分間振とうして細胞溶解を生じさせる。１アッセイ当り１０μｌの溶解液を、製造元のプロトコルに従ってＰｒｏｍｅｇａ、番号ＰＡＥ１９６０を用いて９６ウェル白色プレート（ＶＷＲ ６２４０２−９８０）中、デュアルルシフェラーゼアッセイを実施するために使用した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＤｅｖｉｃｅｓからのＬｍａｘ（デュアル注入器を有するルミノメータ）を用いて、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼからの発光シグナルを双方とも記録し、これらのシグナルの比率を用いて、ＥＣ５０を決定し、用量応答曲線をプロットした。最初に、ホタルルシフェラーゼの基質を細胞溶解液に注入し、発光シグナルを記録した。次いでウミシイタケルシフェラーゼの基質を、同じウェルに注入し、生じた第２の発光シグナルを記録した。上記の表２は、このアッセイにおける陽性結果を誘導したハイブリドーマ数を報告しているが、このように、それらが産生したモノクローナルはＷｎｔを中和できたことを示している。
ＳＴ２細胞アッセイを用いるハイブリドーマスクリーニング
ルシフェラーゼアッセイにおいて陽性と試験されたこれらのハイブリドーマのさらなるスクリーニングのために、マウス骨髄に由来する間質細胞系（ＲＩＫＥＮ、細胞番号ＲＣＢ０２４４）を使用した。Ｗｎｔ３ａシグナル伝達に応答して、ＳＴ２は、骨芽細胞マーカータンパク質アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を発現する骨芽細胞に分化する。これらの細胞におけるＷｎｔ３ａによるＡＬＰの誘導は、Ｗｎｔ阻害剤Ｄｋｋ−１を培養培地に加えることによって阻止でき、ＡＬＰ発現は、中和抗Ｄｋｋ−１抗体など、Ｄｋｋ−１活性を中和できる試剤に細胞を暴露することによってこれらの条件下で再生できる。したがって、、ハイブリドーマは、Ｗｎｔ３ａの存在下でＳＴ２に対するＡＬＰ活性を再生する能力に関してスクリーニングされた。
アッセイに関する調製において、ＳＴ２細胞を、１０％ウシ胎児血清、１×ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミンおよび１×ピルビン酸ナトリウム（全てこれらの試剤は、ＧＩＢＣＯから入手した）を含有するＭＥＭ−α中で培養した。細胞を、１ウェル当り２２μｌの培養培地を有する９６ウェルプレート内で１×１０４個の細胞／ウェルで平板培養した。細胞を、５％ＣＯ２を有する加湿インキュベーター中、３７℃で２４時間まで一晩インキュベートした。
アッセイ０日目に、各ウェルに、２０μｌの緩衝液プラスマウスＬ−Ｗｎｔ３ａ安定細胞系に由来する２０μｌのＷｎｔ３ａ馴化培地中、２００ｎｇの組換えマウスまたはヒトＤｋｋ−１を加えた。馴化培地は、Ｗｎｔ３ａ源を提供した。これら２つの試剤（すなわち、Ｄｋｋ−１およびＷｎｔ３ａ）量は、これらの細胞におけるＡＬＰの約１０％の完全動態範囲を可能にするために互いに相対的調整を行った。次に試験される各抗体を１：２間隔でＤＭＥＭに滴定してＡＬＰ活性を再生する能力を測定した。試験範囲の高端で、各ウェルは１ｍｌ当り１００μｇの抗体を受けた。ヤギ抗ヒトＤｋｋ−１ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号：ＡＦ１０９６）は、陽性コントロールとして役立った。偽形質移入馴化培地または上記のＳＴ２培養培地のいずれかを陰性コントロールとして用いた。抗体またはコントロール培地を添加後、該プレートを３７°で７２時間インキュベートした。
３日目に培地を除去し、細胞を０．１Ｍ ＴＲＩＳ（ｐＨ７．４）でリンスした。次に、１ウェル当り、グリシン緩衝液中、１５０μｌの０．１％ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｉ−３０２１）を加え、その後プレートを−８０℃に凍結してから解凍した。解凍したら、ＡＬＰをアッセイするために、１００μｌの各ウェルの細胞溶解液を、新鮮な９６ウェルプレートに移した。基質としてグリシン緩衝液（０．１Ｍグリシン、１ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ１０．５）中、１００μｌの４ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェノールリン酸二ナトリウム（Ｓｉｇｍａ：カタログ番号１０４−４０）を、１ウェル当り２ｍｇ／ｍｌの最終基質濃度に加えた。ＡＬＰによる加水分解時に、この基質は黄色を有するｐ−ニトロフェノールを生じる。次いでプレートを３７℃で３０分間インキュベートしてＡＬＰによって基質を加水分解させた。このインキュベーション後、１ウェル当り５０μｌの０．５Ｎ ＮａＯＨを添加することにより反応を中止させた。プレートを４０５〜４１０ｎＭで読み取った。ＡＬＰアッセイは、ＢＣＡタンパク質アッセイを用いて正規化し、製造元（Ｐｉｅｒｃｅカタログ番号２３２２３、２３２２４）の取扱い説明書に従って実施した。正規化（ＰＮＰ ｎｍｏｌ／タンパク質１ｍｇ）は、真のアルカリホスファターゼ誘導測定を妨げ得る各ウェルが経験する細胞数の変化を相殺させるために実施した。
ＡＬＰアッセイの結果を陽性および陰性コントロールと比較し、その結果は表７に報告した。表７のデータは、試験された多数のクローンのものを示しているが、最も強力な中和活性を発現する２つは、ラットに由来する１Ｆ１１−２および１１Ｈ１２の両者であった。
Figure 0004840939
 要約すると、全部で１９，２５０のハイブリドーマを、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてスクリーニングした。これらのうち、ＥＬＩＳＡアッセイにおける７２８の結合Ｄｋｋ−１、および中和化アッセイ（ＴＣＲ／ｌｅｆレポーターアッセイまたはＳＴ２細胞アッセイ）の１つまたは双方において１０が、陽性であった。表７におけるデータは、陽性クローンのものを示し、１１Ｈ１０クローンは、最良の活性を有した。例えば、１１Ｈ１０クローンは、８ｎｍのヒトＤｋｋ−１に対して３．５ｎＭのＥＣ５０および８ｎｍのマウスＤｋｋ−１に対して６．１ｎＭのＥＣ５０を有した。
（実施例３ Ｄｋｋ−１に対するモノクローナルの親和性結合）
上記のとおり、細胞ベースのアッセイにおいて最良のＤｋｋ−１中和アッセイを示すハイブリドーマは、ラット由来の１１Ｈ１０および１Ｆ１１であった（実施例２を参照）。１１Ｈ１０抗体は、ＩｇＧＩイソタイプのものである。本実施例は、これら２つの抗体が双方ともマウス、ラットおよびヒトＤｋｋ−１に対して高親和性で結合することを例証している。そのより良好な中和活性と一致して、１１Ｈ１０クローンもまた、これらのアッセイにおいてＤｋｋ−１に対して１Ｆ１１よりも高い親和性を有した。
動態学的分析は、ＢｉａＣｏｒｅ ２０００（ＢＩＡＣＯＲＥ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン国）を用いてＤｋｋ−１に対する１１Ｈ１０抗体および１Ｆ１１抗体の結合を試験するために実施した。ラットＤｋｋ−１（２６０μｇ／ｍｌ）、マウスＤｋｋ−１（６９０μｇ／ｍｌ）およびヒトＤｋｋ−１（９００μｇ／ｍｌ）を、ＣＭ５チップ表面に免疫化し、種々の濃度（０．７８ｎＭから約１００ｎＭ）の抗体を、免疫化Ｄｋｋ−１表面上に注入した。結合センサーグラムを、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ３．２を用いて分析した。データを、下表８および９に要約する。
Figure 0004840939
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 １１Ｈ１０が、Ｄｋｋ−１に対してより高い親和性を有し、標的に対するその親和性がＢｉａＣｏｒｅアッセイの感度限界を超えたことが、ＢｉａＣｏｒｅ結果から明らかであった。したがって、Ｄｋｋ−１に対する１１Ｈ１０の結合親和性を、より高感度のＫｉｎＥｘＡ（登録商標）３０００（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、Ｂｏｉｓｅ、アイダホ州）を用いて平衡結合分析によりさらに評価した。これらの測定では、Ｒｅａｃｔｉ−Ｇｅｌ ６×ビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州）を、マウス、ラットまたはヒトＤｋｋ−１で予め被覆し、ＢＳＡにより遮断した。１００ｐＭ、３００ｐＭ、または１０００ｐＭの１１Ｈ１０抗体を、ヒト、マウスまたはラットＤｋｋ−１の１ｐＭから５０ｎＭまでの濃度範囲の種々の濃度で混合し、室温で８時間平衡化した。次にこの混合物を、Ｄｋｋ−１被覆ビーズ上に通過させた。ビーズ結合抗Ｄｋｋ−１抗体量を、蛍光タグで標識されたヤギ抗ラットＩｇＧ抗体（Ｃｙ５；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ウェストグローブ、ペンシルバニア州）を用いて定量化した。測定された蛍光シグナル量は、平衡での各反応混合物中の遊離抗Ｄｋｋ−１抗体の濃度に比例した。解離平衡定数（Ｋｄ）は、ＫｉｎＥｘＡソフトウェアを使用したデュアル曲線ワンサイト相同モデルを用いて競合曲線の非線形回帰式から得られた。１１Ｈ１０に関するＫｉｎＥｘＡアッセイの結果により、ヒトＤｋｋ−１に対するＫｄは、１．３×１０−１０Ｍであり、マウスＤｋｋ−１およびラットＤｋｋ−１に対しては、それぞれ１．６５×１０−１０Ｍおよび５．４×１０−１０Ｍであったことを示した。
結合動態試験は、上表１に記載された軽鎖および重鎖（各鎖の同一対）の幾つかの異なる組合わせにより実施した。一般にこれらの抗体は、１０４／Ｍｘ秒と１０６／Ｍｘ秒との間のＫａ値、および１０−４ｓ−１と１０−５ｓ−１との間のＫｏｆｆ（Ｋｄ）を有する。
（実施例４ ハイブリドーマ１１Ｈ１０のインビボ試験）
若齢マウス動物モデルにおけるＤｋｋ−１の中和化により、骨塩密度（ＢＭＤ）および骨形成のためのマーカーである血清中オステオカルシンの増加を生じるかどうかを判定するために実験を実施した。
これらの実験に関して、１１Ｈ１０抗体は、培養された１１Ｈ１０ハイブリドーマ細胞培地から精製した。採取された培養培地を、５０ ｋＤ ＭＷＣＯスクリーニングチャネルカセット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を装着したＰｅｌｌｉｃｏｎ限外ろ過デバイス（Ａｍｉｃｏｎ）を用いて１２倍に濃縮した。濃縮した培地を０．２μｍポアフィルタを通してろ過してから、タンパク質Ｇセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に結合させた。少なくとも４容量のＰＢＳでタンパク質Ｇセファロースを洗浄後、抗体をＩｇＧ溶出緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）で溶出してから、５％ ｖ／ｖ １Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを加えることにより中性ｐＨに緩衝処理した。次に抗体をＰＢＳに対して透析した。透析液を、０．２μｍフィルタを通してろ過し、０．０６ＥＵ／ｍｌ Ｐｙｒｏｔｅｌｌ ＬＡＬバイアル（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ｏｆ Ｃａｐｅ Ｃｏｄ）によりエンドトキシンを試験した。精製抗体におけるタンパク質濃度は、１．３５の吸光係数を用いて２８０ｎｍでの吸光度により測定した。
４週齢オスＢＤＦ−１マウス（ＡＰＲ ２３３７５７、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）に、表１０に示されたとおり、精製１１Ｈ１０モノクローナル抗体の３用量（５、１０、２０ｍｇ／ｋｇ）のうちの１用量を用いて３週間に亘り皮下注入した。１群当り５匹のマウスを用いた。陰性コントロールマウスは、媒体（ＰＢＳ）を注入し、陽性コントロールマウスは、これらのマウスにおける骨密度の増加を刺激することが知られている（Ｄｅｍｐｓｔｅｒら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ １４（６）：６９０−７０９頁（１９９３））副甲状腺ホルモン（アミノ酸１〜３４）を注入した。１注入当り、０．００１Ｎ ＨＣｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２％ ＢＳＡ、ｐＨ８．０中の１００μｇ／ｋｇのＰＴＨ（１〜３４）を用いた。この実験を、表１０に示されたとおり、丁度２回反復したが、２０ｍｇのラットＩｇＧを受けた陰性コントロールマウスの群が追加された。さらに、これらの実験を、組換え発現１１Ｈ１０により反復させた。
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 オステオカルシンアッセイおよび臨床化学パネルのために、血液をベースライン（０日目）、３日目、５日目、７日目、１４日目（眼窩後部）、２１日目（終末心穿刺）に採血した。
血清中オステオカルシン濃度は、マウスオステオカルシンに特異的な免疫放射線アッセイ（ＩＲＭＡ）キット（Ｉｍｍｕｎｏｔｏｐｉｃｓ社、サンクレメンテ、カリフォルニア州）を用いて測定した。アッセイ前に血清サンプルを室温に平衡化させ、全てのアッセイを２重反復で実施した。このアッセイでは、マウスオステオカルシンに対して２種の抗体を使用した。第１の抗体は、オステオカルシン分子のＣ末端の中央領域を認識するアフィニティー精製ポリクローナルヤギ抗体であり；この抗体を、捕捉剤として用いられるプラスチック上に固定化した。他の抗体は、オステオカルシン分子のアミノ末端を認識するアフィニティー精製ポリクローナル抗体であり；この抗体は、オステオカルシンの検出に使用するために放射標識された。マウス血清サンプルを、抗体被覆ビーズおよび１２５Ｉ標識抗体と共に室温で１８時間から２４時間インキュベートして、固定化抗体および放射標識抗体にオステオカルシンを結合させ、標識ビーズ結合「サンドイッチ」を形成した。インキュベーション後、未結合標識抗体を除去するためにビーズを２回洗浄し、ガンマカウンターでカウントし、カウントをバックグラウンドに関して修正した。これらのアッセイにおいて、抗体複合体の反応性は、血清中のマウスオステオカルシン量に直接比例した。サンプル中のマウスオステオカルシンの濃度は、キット中のこの目的のために提供されたコントロールオステオカルシンから作成した標準曲線から直接決定した。
３日目およびその後、１１Ｈ１０の全ての用量が、媒体処置マウスと比較してオステオカルシンの増加を誘導した。増加度は、用量依存であった。１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇ用量では、７日の時点で統計的に依然として有意のままであった。投与された全ての用量で、オステオカルシン誘導が、１１Ｈ１０処置開始３日後の早期に見られ、観察された総増加度は、ＰＴＨ処置動物に見られたものと同様か、またはそれらより大きかった。
ＢＭＤをアッセイするために、第１週末、第２週末および第３週末にマウス全体のＸ線写真を、Ｆａｘｉｔｒｏｎ番号４３８５５Ａ Ｘ線システム（バッファローグローブ、イリノイ州）およびＫｏｄａｋ Ｘ−ＯＭＡＴ ＴＬフィルム（ロチェスター、ニューヨーク州）を用いて５６ｋｖｐで４９秒間撮影した。生じたｘ線フィルムを、１０種の骨における骨密度の増加に関して、肉視検査した。媒体またはＰＴＨ緩衝液で処置された群では増加が認められなかった。しかしながら、ＰＴＨ（１〜３４）または１１Ｈ１０で処置された群は、１週目までに５種以上の骨において、また３週目末までに１０種の骨の大部分に密度増加を示した。
３週目末の注入期間において、ｐＱＣＴ ＢＭＤ分析を、脛骨幹端近位で実施し、全体密度、小柱密度および皮質密度を測定した。ｐＱＴＣにより測定された全ＢＭＤは、１１Ｈ１０の最高用量において、主に小柱ＢＭＤ増加による陽性応答を示した。表１１は、実施した２つの実験のうちの１つで得られたＢＭＤ測定値を示している。双方の実験で同様の結果が得られた。表１１の数字は、媒体コントロールと比較した変化パーセントを表している。表１１中の星印は、１１Ｈ１０群とコントロール群との間に統計的有意差があることを示している（ＡＮＯＶＡ ｐ＜０．０５）。全体的に、１１Ｈ１０によって誘導されたＢＭＤ増加量は、ＰＴＨ（１〜３４）陽性コントロールによって誘導された増加量と同等であった。
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 （実施例５ 種々の抗体のインビボ試験）
骨密度を増加させる中和Ｄｋｋ１の能力にさらにアクセスするために、若齢（６週齢）および老齢（８．５ヵ月齢）マウスの双方を、上記実施例４のとおりラット１１Ｈ１０で処置した。マウスを、ｐＱＣＴおよびミクロＣＴ（μＣＴ）によるＢＭＤ変化について分析した。μＣＴに関しては、ｅＸｐｌｏｒｅ Ｌｏｃｕｓ ＳＰ Ｍｉｃｒｏ−ＣＴ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ウォークシャ、ウィスコンシン州、米国）を用いてマウス大腿骨における小柱構造および皮質幾何学的形状を調べた。ＰＢＳで満たし、ガーゼで固定された骨密度ファントムを有する２ｃｍクライオチューブに大腿骨を入れた。大腿骨全体を、密度ファントムで検量した２００°（８０ｋＶｐ、８０ｕＡ）に関して０．５°回転でスキャンし、再構成して１８×１８×１８μｍのボクセルサイズを有する画像を生じさせた。
対象領域を、皮質および小柱形態計測パラメータならびに密度パラメータ（ＧＥＨＣ ＭｉｃｒｏＶｉｅｗソフトウェア）に関して分析した。大腿骨幹の中央１０％（長さで）を、平均骨内膜周長および骨膜周長、ならびに皮質面積および容積ＢＭＤ（閾値＝６４０ｍｇ／ｃｃ）に関して分析した。大腿骨遠位から小柱骨の領域を単離し、骨容量フラクション（ＢＶ／ＴＶ）、小柱厚（Ｔｂ．Ｔｈ）、小柱数（Ｔｂ．Ｎ）、および容積ＢＭＤ（閾値＝３２０ｍｇ／ｃｃ）などのＢＭＤおよび立体的解析パラメータに関して分析した。これらの領域を、大腿骨長（１０％の長さ）に基づいて選択し、成長プレート海綿状近位に配置した。
ｐＱＣＴおよびμＣＴの双方が、１１Ｈ１０処置の若齢および老齢マウスのｒにおいてＢＭＤの有意な変化を示した。さらに許容されたμＣＴは、ラット１１Ｈ１０による中和Ｄｋｋ１活性により、若齢および老齢マウスの双方において小柱数の有意な増加をもたらすことを示した（図２）。老齢マウスにおけるラット１１Ｈ１０の最高用量は、骨内膜周長の減少をもたらし、ラット１１Ｈ１０はまた、海綿骨に加えて皮質骨成長にも積極的に影響を及ぼすことを示した。
Ｄｋｋ１中和化が、エストロゲン欠乏のための骨減少の回復を補助できるかどうかを判定するために、卵巣摘出（ＯＶＸ）マウスを、ラット１１Ｈ１０（３、１０，３０ｍｇ／ｋｇ、皮下注入により１週２回）により処置した。この実験において、７ヵ月齢ＣＤＦ−１マウス、５ヵ月齢ＯＶＸ後マウスを、ラット１１Ｈ１０ｍＰＴＨ（１００μｇ／ｋｇ）または媒体で処置した。ＢＭＤを、ベースライン、７日目、１４日目、２１日目および２８日目のｐＱＣＴにより分析した。２８日目のデータを、脛骨および腰椎に関するベースラインからの変化パーセントとして下記に示す（図３）。
別の実験において、ｈ１１Ｈ１０ ＲＴ ＩｇＧ１イソタイプおよびｈ１１Ｈ１０ ＲＴ ＩｇＧ２イソタイプ（軽鎖および重鎖ならびに可変領域に関する配列は表１および２を参照）の有効性は、上記と同様のプロトコルを修飾して用いて若齢マウスにおいて判定し、ｈ１１Ｈ１０ ＲＴ ＩｇＧ１イソタイプおよびｈ１１Ｈ１０ ＲＴ ＩｇＧ２イソタイプをラット１１Ｈ１０およびＰＴＨと比較した（図４）。これら２種の抗体もまた、マウスにおいてＤＥＸＡ分析により測定されたようにＢＭＤを増加させたことを、このデータは示している。
上記の実験結果は、本明細書に記載された抗体の幾つかによるＤｋｋ−１活性の中和化が、骨形成に対してアナボリック効果を有することを示している。
（実施例６ １１Ｈ１０抗体に結合するヒトＤｋｋ−１エピトープの特性化）
ヒトＤｋｋ−１は、Ｎ−末端近傍およびＣ−末端近傍に位置する２つのジスルフィドドメインを含有し、本明細書ではＮ−およびＣ−末端ジスルフィドドメインと称される。Ｎ−末端ジスルフィドドメイン（以後、「ジスルフィドドメイン１」）は、５５のアミノ酸残基（配列番号２のアミノ酸８５〜１３９）を含有し、１０個のシステインを有して５つの分子内ジスルフィド結合を形成する。Ｃ−末端ジスルフィドドメイン（以後、「ジスルフィドドメイン２」）は、約７５のアミノ酸残基（配列番号２のアミノ酸１８９〜２６３）を含有し、１０個のシステインを含有して５つの分子内ジスルフィド架橋を形成し、その結果、完全折りたたみタンパク質中に７つのループが形成される（図１参照）。Ｄｋｋ−１のジスルフィドドメイン２は、カノニカル補リパーゼ折りたたみ体と同様の分子構造を有することが提案されており、その結晶構造は、ブタ補リパーゼを用いて決定されている（Ａｒａｖｉｎｄ，Ａ．ａｎｄ Ｋｏｏｎｉｎ，Ｅ．Ｖ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８：Ｒ４７７−４７９頁（１９９８））。ヒトＤｋｋ−１のジスルフィドドメイン２の７つのループは、配列番号２のアミノ酸１９０〜１９４、１９６〜１９９、２０２〜２０９、２１１〜２１９、２２１〜２３６、２４０〜２４４および２４６〜２６２からなる。
還元剤を用いた処理により、１１Ｈ１０に結合するＤｋｋ−１の能力が無効になり、この抗体により標的にされるエピトープが、立体配置的であり、このタンパク質における少なくとも幾つかのジスルフィド結合の維持を必要とすることが示された。この立体配置的エピトープを特性化するために、臭化シアン（ＣＮＢｒ）および数種のプロテアーゼによるヒトＤｋｋ−１の切断を含んだ方法が適用され、次いで生じたフラグメントが、１１Ｈ１０抗体に依然として結合できるかどうかを調べるために試験した。生じたデータは、判定されるエピトープの位置が決定されることを可能にした。手短に言うと、ペプチド消化物を、抗体と共に、または抗体なしでインキュベートし、１０Ｋカットオフ膜を通して抗体に結合したペプチド（約１５０，０００Ｄａ）を捕捉し、次にＨＰＬＣペプチドマッピングに供した。抗体に暴露させたサンプル中のＨＰＬＣピークの高さの減少により、そのピークのペプチドが抗体に結合しており、したがってエピトープの一部を形成したことを示した。個々のＨＰＬＣピークを採取し、ペプチドを同定し、Ｎ末端配列決定によりマップ化した。ペプチドが１１Ｈ１０に結合できるかどうかを判定するために、それらを、結合のためのバイオセンサーとしてタンパク質Ａ捕捉抗Ｄｋｋ−１抗体を用いて、ＢｉａＣｏｒｅワークステーションによるリアルタイムの生体特異的相互作用アッセイに供した。
これら試験用の全てのＨＰＬＣ分析は、逆相Ｃ５カラム（１ｍｍ ｉ．ｄ．×１０ｃｍ長）を用いて実施された。ＨＰＬＣペプチドマッピングは、０．０５％トリフルオロ酢酸（移動相Ａ）中から０．０５％トリフルオロ酢酸中の９０％アセトニトリルの線形勾配により実施した。カラムは、０．１５ｍｌ／分の流速で７０分に亘り展開された。
ＣＮＢｒ消化
ｈＤｋｋ−１のＣＮＢｒ開裂により、２種の大型フラグメント、ＣＮＢｒ１およびＣＮＢｒ２が生成した。これらは、それぞれジスルフィドドメイン２およびジスルフィドドメイン１を表した。ＣＮＢｒ１は、ジスルフィド結合により一緒に保持された２種のペプチド（配列番号２のアミノ酸１７９〜２０６および配列番号２のアミノ酸２０７〜２６６）からなった。ＣＮＢｒ２もまた、ジスルフィド結合により一緒に保持された２種のペプチド（配列番号２のアミノ酸３２〜１２２および配列番号２のアミノ酸１２７〜１７８）からなった。ＢｉａＣｏｒｅ分析の結果、１１Ｈ１０は、ＣＮＢｒ１には有意に結合できたが、ＣＮＢｒ２には全く結合しないことが示された。したがって、１１Ｈ１０は、Ｄｋｋ−１のジスルフィドドメイン２に位置したエピトープに結合することが結論付けられた。
トリプシン消化
次にヒトＤｋｋ−１を、ａｒｇおよびｌｙｓの後で開裂するトリプシンで消化した。０．５〜１．０ｍｇ／ｍｌでＤｋｋ−１の約２００μｇを、８μｇのこれらのプロテアーゼのうちの１種または他種と共に３７℃で２０時間ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中でインキュベートしてＤｋｋ−１の完全消化を達成した。
トリプシン消化物のＨＰＬＣクロマトグラフィにより、複数ピークが生じた。トリプシンフラグメントのどれが、抗体に結合する能力を保持しているかどうか（それが存在するならば）を判定するために、消化物を、１１Ｈ１０抗体と１：２のモル比において、０℃で２時間インキュベートした。抗体およびそれに結合したペプチドをＭｉｃｒｏｃｏｎ膜（３０，０００分子量をカットオフ）上で捕捉した。Ｍｉｃｒｏｃｏｎフィルタからの流液中ペプチドをＨＰＬＣ上で分析し、抗体に結合したためにどのピークが減少または除去されたかを判定した。抗体に暴露させたサンプルに関するＨＰＬＣの結果を、１１Ｈ１０なしの同じ方法に供されたコントロール消化物と比較した。下記に考察されるように、トリプシン消化により生成したフラグメントのいずれも１１Ｈ１０に結合する能力を保持していなかった。
配列分析は、トリプシン消化後のＨＰＬＣから回収されたピークにおけるペプチドを同定し、マッピングするために実施した。２本のピーク、Ｔｒｙｐ４０．５（保持時間４０．５分）（約６〜７ｋＤａ）およびＴｒｙｐ４５（約８ｋＤａ）は、それぞれジスルフィドドメイン２およびジスルフィドドメイン１にマッピングされた配列を含有することが確認された。Ｍｉｃｒｏｃｏｎ膜捕捉またはＢｉａＣｏｒｅ結合実験により試験された場合、Ｔｒｙｐ４０．５またはＴｒｙｐ４５のいずれも１１Ｈ１０に結合しなかった。Ｔｒｙｐ４０．５は、ジスルフィドドメイン２の５つのジスルフィド結合により一緒に保持された７種の小型ペプチド（６つから１２のアミノ酸長）からなった。ジスルフィドドメイン２の配列の３種の小型セグメントが、Ｔｒｙｐ４０．５から欠落していた。これらの欠落配列は、配列番号２のアミノ酸２０４〜２０８、２２３〜２２６および２４７〜２４９であった。Ｔｒｙｐ４０．５は、１１Ｈ１０に結合できないことから、これら３種の欠落ペプチドの１つまたは複数が、この抗体が結合するエピトームの必須部分を形成しているにちがいないことは明らかである。
エンドＬｙｓＣ消化
エンドＬｙｓＣ（ｌｙｓの後のみ開裂）によるヒトＤｋｋ−１の消化もまた、上記のとおりＨＰＬＣに供された場合、幾本かのピークを生成した。１つだけのＨＰＬＣフラクション、ＬｙｓＣ４８．７は、ＨＰＬＣ分析前に消化物を抗体とインキュベートした場合にピーク高の減少を示した。ＬｙｓＣ４８．７は、ジスルフィドドメイン２の５つ全てのジスルフィド結合により一緒に保持された３種のペプチドフラグメントからなった。配列分析により、これら３種のペプチドは、配列番号２のアミノ酸１８３〜２２２、２２７〜２４９、および２５０〜２６６からなることを示した。配列分析により、ＬｙｓＣ４８．７は、ジスルフィドドメイン２の１つのセグメント、すなわち、配列番号２のアミノ酸２２３〜２２６だけを欠落していることが明らかとなった。したがって、ＬｙｓＣ４８．７は、ジスルフィドドメイン２の３つのドメインを欠落したＴｒｙｐ４０．８よりも構造的により完全であった。
ＬｙｓＣフラクションに結合する１１Ｈ１０の能力を、ＢｉｓＣｏｒｅ結合アッセイを用いて測定した。ＬｙｓＣ４８．７フラクションのみが、何らかの結合活性を示した。ＬｙｓＣ４８．７フラクションは、強いオンレートの抗体結合を示した。しかしながら、オフレートは極めて速く、結合は速やかにバックグラウンドレベルまで減少した。これらのデータにより、配列番号２のアミノ酸２２３〜２２６が、ジスルフィドドメイン２から切り取られない場合は、１１Ｈ１０に対する標的エピトープは、抗体に対する結合を保持しないことを示している。したがって、１１Ｈ１０がＤｋｋ−１に結合する際に残基２２３〜２２６が１１Ｈ１０に直接接触することになり得るか、または折りたたみタンパク質のアミノ酸２２３〜２２６の即近傍内の他のアミノ酸残基に、抗体を有効に接触させる三次元構造を維持するために、これらの残基が必須であることが結論付けられる。
ＡｓｐＮ消化
１１Ｈ１０結合エピトープをさらに描写するために、ｈＤｋｋ−１をプロテアーゼＡｓｐＮで消化し、生じたフラグメントを上述のとおり分析した。消化物を１１Ｈ１０に予め暴露した場合、ＡｓｐＮ消化により生成した主要なＨＰＬＣピークのうち、３本の高さが減少し、これらのペプチドが抗体に結合したことを示した。抗体に結合したピークは、ＡｓｐＮ４８．７、ＡｓｐＮ４９．６およびＡｓｐＮ５２であった。配列分析により、これら３本の抗体反応性ピークは、ジスルフィドドメイン２に由来することが示された。ＡｓｐＮ４８．７とＡｓｐＮ４９．６とは、アミノ酸配列が同一であり、それらの各々は、ジスルフィドドメイン２における５つのジスルフィド結合により一緒に保持されるペプチドからなった。これら２本のピークのＨＰＬＣ移動の相違は、恐らくＡｓｎ２５６に結合した炭水化物の異質性によるものであった。これら２つのペプチドは、配列番号２のアミノ酸１６６〜２３１および２３２〜２６６であった。ＡｓｐＮ５２は、配列番号２のアミノ酸１６６〜２６６に相当する単一のペプチドのみを含有した。したがって、ＡｓｐＮ５２は、明らかに部分的消化産物であり、その配列は、ＡｓｐＮ４８．７とＡｓｐＮ４９．６に大部分は重なるが、後者の２つは、ＡｓｐＮ５２と比較して、Ｌｅｕ２３１とＧｌｕ２３２との間で余分な切取りを受けた。この切取りは、配列番号２のアミノ酸２２１と２３６との間にあるループ内で生じる。これらピークの３本全てが、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ捕捉実験およびＢｉａｃｏｒｅ結合分析において１１Ｈ１０に対して有意な結合を示した。これらのデータにより、ｈＤｋｋ−１（配列番号２）のアミノ酸２３１と２３２との間のペプチド結合の分裂は、１１Ｈ１０がその標識エピトープを認識する能力に影響を及ぼさないことが示されている。
消化結果の分析
上記の結果により、１１Ｈ１０は、タンパク質のジスルフィドドメイン２に位置しているヒトＤｋｋ−１の非線形エピトープに結合し、また該エピトープは、配列番号２のジスルフィド結合Ｃｙｓ２２０−Ｃｙｓ２４５、Ｃｙｓ２３９−Ｃｙｓ２６３およびＣｙｓ２００−Ｃｙｓ２３７により形成された２つの大型ループに存在することを示している（図１を参照）。図１に示されるように、エピトープを形成２つのループは、Ｃｙｓ２２０とＣｙｓ２３７との間およびＣｙｓ２４５とＣｙｓ２６３との間にあり、したがって２つのループの本体は、配列番号２のアミノ酸２２１〜２３６および２４６〜２６２を含む。Ｄｋｋ−１のトリプシン消化により、アミノ酸２２３〜２２６および２４７〜２４９が取り除かれることによりＣｙｓ２２０／Ｃｙｓ２３７ループおよびＣｙｓ２４５／Ｃｙｓ２６３ループが開いた。これら２種のペプチドが除去されたことにより、トリプシン消化産物は、１１Ｈ１０に結合できなかった。第３のペプチド（配列番号２のアミノ酸２０４〜２０８）もまた、トリプシン消化により除去されたが、他のプロテアーゼが、これらのアミノ酸類が存在するループを切り取ることなく抗体結合を減少できることから、これはエピトープ外にあると思われた。抗体結合を大幅に減少させたＬｙｓＣ消化はまた、配列番号２のアミノ酸２２３〜２２６を除去することによりＣｙｓ２２０／Ｃｙｓ２３７ループを開き、またＬｙｓ２４９（配列番号２）における単一ペプチド結合で開裂させることによりＣｙｓ２４５／Ｃｙｓ２６３ループを開いた。したがって、ＬｙｓＣ消化結果もまた、１１Ｈ１０結合に関するＣｙｓ２２０／Ｃｙｓ２３７ループおよびＣｙｓ２４５／Ｃｙｓ２６３ループに関係した。ＡｓｐＮ消化は、抗体結合を減ずることなくＣｙｓ２２０／Ｃｙｓ２３７ループ内のＧｌｕ２３２（配列番号２）で切り取り、したがって適切なエピトープコンフォメーションの保存にとって、このループが全く完全であることが必要でないことを示唆した。しかしながら、上記に示されたように、ＬｙｓＣによるこの同じループから配列番号２のアミノ酸２２３〜２２６の除去が、抗体結合を破壊したため、このループは明らかに重要である。
これらの分析によれば、１１Ｈ１０に結合するエピトープは、ジスルフィドドメイン２のＣｙｓ２２０／Ｃｙｓ２３７ループおよびＣｙｓ２４５／Ｃｙｓ２６３ループの近傍に位置しており、したがって、配列番号２のアミノ酸２２０〜２３７およびアミノ酸２４５〜２６３は、抗体結合にとって極めて重要である。このＣ末端ドメインジスルフィドクラスター内の他のジスルフィド結合により形成されたループは、この抗体による認識には関与していないようである。この結果はまた、このドメイン内のジスルフィド結合は、抗体結合を可能にする立体配置にエピトープを保持するために完全でなければならないことを示している。エピトープ内で、結合を保持するために必要であると思われる最小部分としては、配列番号２のアミノ酸２２１〜２２９（これは、Ｇｌｕ２３２における開裂が結合に影響を与えなかったという事実から導かれる）および構造的考察により、このループ内の他のアミノ酸が１１Ｈ１０に結合することを妨げることができる嵩高い炭水化物部分にＡｓｐ２５６が結合していることが示されることから配列番号２のアミノ酸２４６〜２５３が挙げられる。
（実施例７ １Ｆ１１抗体はＤｋｋ−１への結合に関して１１Ｈ１０と競合する）
１Ｆ１１モノクローナル抗体が、１１Ｈ１０と同じＤｋｋ−１上のエピトープに結合し得るかどうかを判定するために実験を実施した。この事柄は、これらのモノクローナル抗体の双方が、Ｄｋｋ−１の生物活性を中和することから興味深かった。下表１２に示されるとおり、１Ｆ１１は、ＴＣＦ−ｌｅｆアッセイにおいてマウス、ラットおよびヒトＤｋｋ−１活性を中和するが、１１Ｈ１０ほどではない。
Figure 0004840939
 １１Ｈ１０と１Ｆ１１との間の競合実験は、上記のとおり、ＢｉａＣｏｒｅ ２０００を用いて実施した。ヒトＤｋｋ−１を捕捉するために、１１Ｈ１０または１Ｆ１１を固定化したＢｉａＣｏｒｅチップを使用された。捕捉ステップ後、Ｄｋｋ−１へのさらなる結合が達成されるかどうかを調べるために、１Ｆ１１または１１Ｈ１０を、チップ表面上に注入した。これらの実験において、チップ上に注入された抗体はいずれも、捕捉されたヒトＤｋｋ−１に結合できなかった。すなわち、１１Ｈ１０は、１Ｆ１１により捕捉されたヒトＤｋｋ−１に結合できなかったし、また、１Ｆ１１は、１１Ｈ１０により捕捉されたヒトＤｋｋ−１に結合できなかった。これらのデータは、これら２つの抗体が、ヒトＤｋｋ−１上の同じエピトームに結合することを強く示しており、したがって、この特定のエピトームを標的にすることは、Ｄｋｋ−１活性を中和するために特に有効な手段であることを示唆している。
表１に掲げた重鎖および軽鎖を含む他の幾つかの抗体（重鎖および軽鎖の同一対）が、ラット１１Ｈ１０および１Ｆ１１により認識された同じエピトープに関して競合し得るかどうかを判定するために他の実験を実施し、そのようであることが分かった。
（実施例８ １１Ｈ１０はＬＲＰ６へのＤｋｋ−１の結合を妨害する）
Ｄｋｋ−１とＬＲＰ６および推定上ＬＲＰ５の相互作用を妨害することにより、１１Ｈ１０が、その生物学的影響を及ぼすかどうかを判定するために、我々は、フローサイトメトリーを利用するＫＲＰ６ Ｄｋｋ−１結合アッセイを確立した。このアッセイでは、入手した市販のＬＲＰ６−Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、番号１５０５−ＬＲ）およびアミノ末端ビオチンタグ化ヒトＤｋｋ−１を用いる。ビオチンタグ化Ｄｋｋ−１融合構築体は、哺乳動物発現構築体においてビオチンのＣ末端に融合発現されるようにｈＤｋｋ−１をコードするＤＮＡをクローニングすることにより作出された。この構築体は、一時的に２９３Ｔ細胞にトランスフェクトされ、トランスフェクション４８時間後に馴化培地を収集した。
１１Ｈ１０が、ＬＲＰ６に対するＤｋｋ−１結合を妨害できるかどうかを判定するために、ＬＲＰ６を、１１Ｈ１０の有り無なしのもとで馴化培地に加えた。次にストレプトアビジンビーズをこの調製物に加え、ビオチンＤｋｋ−１融合タンパク質をビーズに結合させた。Ｄｋｋ−１へのＬＲＰ６の結合を、ＬＲＰ６−Ｆｃ融合構築体のＦｃ部分に特異的なＦＩＴＣ結合抗体を用いることにより測定した。Ｄｋｋ−１へのＬＲＰ６結合は、フローサイトメトリー用いることにより検出した。６．４６の特異的結合シグナル（特異的結合は、観察された全シグナルマイナスＤｋｋ−１不在下で観察されたシグナルに等しい）が、ＬＲＰ６とＤｋｋ−１で検出された。ＬＲＰ６添加前のＤｋｋ−１と１１Ｈ１０とのインキュベーションによりこのシグナルが２．６６に減少したが、これは抗体無しで観察された特異的結合の５０％未満であり、このことから１１Ｈ１０が、ＬＰＲ６へのＤｋｋ−１の結合を妨害することが示された。
（実施例９ １１Ｈ１０重鎖および軽鎖ｃＤＮＡのクローニング）
総ＲＮＡを、製造元の取扱い説明書に従ってＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりラットハイブリドーマ１１Ｈ１０細胞から単離し、次いでＱｕｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ（登録商標）カラムを用いてさらに精製した。５’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）オリゴヌクレオチド（５’−ＣＧＡ ＣＵＧ ＧＡＧ ＣＡＣ ＧＡＧ ＧＡＣ ＡＣＵ ＧＡＣ ＡＵＧ ＧＡＣ ＵＧＡ ＡＧＧ ＡＧＵ ＡＧＡ ＡＡ−３’；配列番号１５）を、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）成分およびプロトコルを用いてＲＮＡに結合させた。このオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡ分子の５’末端に２つのユニークなプライミング部位を提供する。第１鎖のｃＤＮＡは、延長アダプター（５’−ＧＧＣ ＣＧＧ ＡＴＡ ＧＧＣ ＣＴＣ ＡＣＮ ＮＮＮ ＮＮＴ−３’；配列番号１６）を有するランダムプライマーを用いてこの修飾ＲＮＡから合成した。
ラット抗体遺伝子の保存配列を利用して、５’ＲＡＣＥ ＰＣＲ反応を実施し、て抗ｍｕＤｋｋ−１抗体をコードするこれらのｃＤＮＡ類を増幅させた。１１Ｈ１０の完全軽鎖をクローンするために、正方向プライマーとしてＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）プライマー（５’ＣＧＡ ＣＴＧ ＧＡＧ ＣＡＣ ＧＡＧ ＧＡＣ ＡＣＴ ＧＡ−３’；配列番号１７）を用い、逆方向プライマーとして５’−ＧＣＡ ＡＣＡ ＧＴＧ ＧＴＡ ＧＧＴ ＣＧＣ ＴＴＧ ＴＧＧ−３’（配列番号１８）を用いてＲＡＣＥ ＰＣＲを実施した。この逆方向プライマーは、ラットカッパ鎖３’未翻訳領域のヌクレオチド７４〜９８に相当する。次にこのＰＣＲ産物を、正方向プライマーとしてＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）入れ子プライマー（５’ＧＧＡ ＣＡＣ ＴＧＡ ＣＡＴ ＧＧＡ ＣＴＧ ＡＡＧ ＧＡＧ ＴＡ−３’（配列番号１９））および同じ逆方向プライマー（配列番号１８）を用いる入れ子ＰＣＲ用のテンプレートとして用いた。
重鎖の可変領域に対するＲＡＣＥ ＰＣＲでは、正方向プライマーとしてＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）プライマーを用い、逆方向プライマーとしてラットＩｇＧ定常領域におけるヌクレオチド１０から３９に相当する５’−ＡＧＧ ＡＧＣ ＣＡＧ ＴＧＧ ＡＴＡ ＧＡＣ ＡＧＡ−３’（配列番号２０）を用いた。次にこのＰＣＲ産物を、正方向プライマーとしてＧｅｎｅＲａｃｅｒ（商標）入れ子プライマーおよび同じ逆方向プライマー５’−ＡＧＧ ＡＧＣ ＣＡＧ ＴＧＧ ＡＴＡ ＧＡＣ ＡＧＡ−３’（配列番号２０）を用いて、入れ子ＰＣＲ用のテンプレートとして用いた。
次にＲＡＣＥ ＰＣＲ産物を、クローニングベクターｐＣＲ４−ＴＯＰＯ ＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化した。これらクローンのＤＮＡ配列は、クローニング部位をフランキングしているｐＣＲ４ベクタープライマー、色素標識ヌクレオチドおよびＡＢＩ ＤＮＡシーケンサーを用いて決定した。１１Ｈ１０軽鎖および重鎖可変領域に関するコンセンサス配列を構築し、コード配列のアミノ末端部に特異的な５’ＰＣＲプライマーをデザインするために用いた。これらのプライマーはまた、クローニングおよびＫｏｚａｋ配列に関するＳａＩＩ制限部位を含有した。軽鎖用にデザインされた５’ＰＣＲプライマーは、以下のヌクレオチド配列：５’−ＡＡＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＴＣ ＧＡＣ ＴＡＧ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＧＴ ＧＴＧ ＣＣＴ ＡＣＴ ＣＡＴ ＣＴＣ−３’（配列番号２１）；重鎖に関しては、５’−ＡＡＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＴＣ ＧＡＣ ＴＡＧ ＡＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＡＣ ＡＴＣ ＡＧＧ ＣＴＣ ＡＧＣ ＴＴＧ Ｇ−３’（配列番号２２）を有した。次にこれら５’プライマーを、コード配列のカルボキシ末端部に特異的で、クローニングのためのＮｏｔＩ制限部位を含有する３’プライマーと共に用いた。軽鎖に関する３’プライマーは、以下のヌクレオチド配列：５’−ＡＡＣ ＣＧＴ ＴＴＡ ＡＡＣ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＣ ＴＡＡ ＣＡＣ ＴＣＡ ＴＴＣ ＣＴＧ ＴＴＧ Ａ−３’（配列番号２３）を有し；および重鎖に関する３’プライマーは、５’−ＡＡＣ ＣＧＴ ＴＴＡ ＡＡＣ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＣＡＴ ＴＴＡ ＣＣＣ ＧＧＡ ＧＡＧ ＴＧＧ ＧＡＧ−３’（配列番号２４）を有した。これらのプライマーは、１１Ｈ１０抗体の軽鎖および重鎖遺伝子の完全コード領域を増幅させるためのＰＣＲ反応に用いた。クローン化配列は、ＢｉａｎｃｈｉおよびＭｃＧｒｅｗ、２００３年に記載されたＣＨＯ細胞に発現させた。
１１Ｈ１０完全軽鎖および重鎖をコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号９および１１に示され、配列番号１０および１２は、それらのアミノ酸配列を示す。１１Ｈ１０の軽鎖は、アミノ酸１〜２０（配列番号９のヌクレオチド１〜６０によりコードされた）からなるリーダー配列を有し；したがって成熟タンパク質は、配列番号１０のアミノ酸２１で開始する。１１Ｈ１０の軽鎖可変領域は、配列番号１０のアミノ酸２１〜１２７（配列番号８４も参照）に相当する配列番号９のヌクレオチド６１〜３８１（配列番号８３も参照）によりコードされる。１１Ｈ１０軽鎖ＣＤＲ１は、配列番号１０のアミノ酸４４〜５４（配列番号７０も参照）をコードする配列番号９のヌクレオチド１３０〜１６２（配列番号８５も参照）によりコードされ；１１Ｈ１０軽鎖ＣＤＲ２は、配列番号１０のアミノ酸７０〜７６（配列番号７２も参照）をコードする配列番号９の２０８〜２２８（配列番号８６も参照）によりコードされる残基であり；１１Ｈ１０軽鎖ＣＤＲ３は、配列番号１０のアミノ酸１０９〜１１７（配列番号７４も参照）をコードする配列番号９のヌクレオチド３２５〜３５１（配列番号８７も参照）によりコードされる。
１１Ｈ１０重鎖は、アミノ酸１〜１９（配列番号１１のヌクレオチド１〜５７によりコードされた）からなるリーダー配列を有し、したがって成熟タンパク質は、配列番号１２の残基２０で開始し、ヌクレオチド５８〜１３９５によりコードされる。重鎖可変領域は、配列番号１２のアミノ酸２０〜１３９（配列番号９１も参照）をコードする配列番号１１のヌクレオチド５８〜４１７（配列番号９０も参照）によりコードされる。重鎖ＣＤＲ１は、配列番号１２のアミノ酸５０〜５４（配列番号７６も参照）をコードする配列番号１１のヌクレオチド１４８〜１６２（配列番号９３も参照）によりコードされ；１１Ｈ１０重鎖ＣＤＲ２は、配列番号１１のアミノ酸６９〜８５（配列番号７８も参照）をコードする配列番号１１のヌクレオチド２０５〜２５５（配列番号９３も参照）によりコードされ；重鎖ＣＤＲ３は、配列番号１２のアミノ酸１１８〜１２８（配列番号８０も参照）をコードする配列番号１１のヌクレオチド３５２〜３８４（配列番号９４も参照）によりコードされる。
当然のことではあるが、本明細書に記載された実施例および実施形態は、単に説明を目的とするものであり、それを鑑みて種々の修飾または変更が当業者に示唆され、また、それらは本出願の精神および範囲内および添付の請求項の範囲内に含まれるべきである。個々の刊行物、特許および特許出願が、参照として組み込まれていることが具体的かつ個々に示されていても、本明細書に引用された全ての刊行物、特許または特許出願は、同じ程度に全ての目的のために、参照としてそれらの全体が本明細書に組み込まれている。
図１は、タンパク質のカルボキシ末端近くに位置しているヒトＦｋｋ−１のセグメントの三次元構造を描写するリボン図を示す。図中に示された全てのアミノ酸番号は、配列番号２のアミノ酸配列に相当する。図中に示された２つのペプチド配列は、１１Ｈ１０モノクローナル抗体が、このタンパク質に特異的に結合する上で重要な領域を表す。下線部のアミノ酸は、Ｄｋｋ−１タンパク質への抗体の結合にとって重要な役割を演じていると考えらている。エピトープを含むループは、影付けしてあり、２つのエピトープループのうちの１つを、他のループよりも僅かに暗く影付けしている。このリボン図の極めて明るい着色部分は、１１Ｈ１０とヒトＤｋｋ−１との間の結合相互作用において演じる役割がより小さいと考えられている。 図２Ａおよび２Ｂは、ラット１１Ｈ１０により処置された若齢マウスと老齢マウスに関するμＣＴ結果を示す。図２Ａは、老齢マウス（８．５月齢）および若齢マウス（６週齢）の双方対媒体（陰性コントロール）およびＰＴＨ（陽性コントロール）におけるラット１１Ｈ１０の異なる投与量（５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇ）での小柱数のプロットである。図２Ｂは、老齢マウス（８．５月齢）対媒体（陰性コントロール）およびＰＴＨ（陽性コントロール）におけるラット１１Ｈ１０の異なる投与量（５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは２０ｍｇ／ｋｇ）での骨内膜周囲長のプロットである。 図３Ａおよび３Ｂは、ラット１１Ｈ１０（３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇ）で処置されて２８日後の卵巣切除（ＯＶＸ）マウスにおけるＢＭＤのパーセント変化対媒体およびＰＴＨ（１００μｇ／ｋｇ）を示すプロットである。用いられたマウスは、ＯＶＸ５ヵ月後であった。図３Ａは、ベースラインに比して２８日目での脛骨におけるＢＮＤの変化を示す。図３Ｂは、ベースラインに比して２８日目での腰椎部におけるＢＭＤの変化を示す。 図４は、ラット１１Ｈ１０またはＰＴＨに比して１１Ｈ１０ＲＴ ＩｇＧ１または１１Ｈ１０ＲＴ ＩｇＧ２の投与３週後の若齢マウスにおけるＢＭＤのパーセント変化のプロットである。

Claims (36)

  1. 以下：
    （ａ）（ｉ）配列番号７０に記載されたアミノ酸配列を有するＬＣ ＣＤＲ１；および
    （ｉｉ）配列番号７２に記載されたアミノ酸配列を有するＬＣ ＣＤＲ２；および
    （ｉｉｉ）配列番号７４に記載されたアミノ酸配列を有するＬＣ ＣＤＲ３；ならびに
    （ｂ）（ｉ）配列番号７６に記載されたアミノ酸配列を有するＨＣ ＣＤＲ１；および
    （ｉｉ）配列番号７８に記載されたアミノ酸配列を有するＨＣ ＣＤＲ２；および
    （ｉｉｉ）配列番号８０に記載されたアミノ酸配列を有するＨＣ ＣＤＲ３、
    を含む、成熟ヒトＤｋｋ−１タンパク質に特異的に結合する単離抗体またはその免疫機能性フラグメントであって、該抗体は、２つのループを含むエピトープに結合し、該ループが、配列番号２の２２０と２３７との間および配列番号２のシステイン残基２４５と２６３との間のジスルフィド結合によって形成されている、単離抗体またはその免疫機能性フラグメント。
  2. 配列番号２のアミノ酸２２１〜２６２の間に位置する２つの別個の領域に結合する、請求項１に記載の単離抗体またはその免疫機能性フラグメント。
  3. 前記単離抗体または免疫機能性フラグメントが、２つの別個の領域に結合し、ここで、一つの領域が、配列番号２のアミノ酸２２１〜２３６であり、第二の領域が、配列番号２のアミノ酸２４６〜２６２である、請求項１に記載の単離抗体または免疫機能性フラグメント。
  4. 一つの領域が、配列番号２のアミノ酸２２１〜２２９であり、第二の領域が、配列番号２のアミノ酸２４６〜２５３である、請求項２に記載の単離抗体または免疫機能性フラグメント。
  5. ２つの同一のＶＨおよび２つの同一のＶＬからなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離抗体または免疫機能性フラグメント。
  6. ２つの同一のＶＨおよび２つの同一のＶＬからなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離抗体または免疫機能性フラグメントであって、該ＶＬは、配列番号８４のアミノ酸配列を有し；該ＶＨは、配列番号９１のアミノ酸配列を有する、単離抗体または免疫機能性フラグメント。
  7. 配列番号８２のアミノ酸配列を含む軽鎖と配列番号８９のアミノ酸配列を含む重鎖とを含む、請求項６に記載の単離抗体または免疫機能性フラグメント。
  8. Ｄｋｋ−１ポリペプチドへの特異的結合に関して請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体と競合する、Ｄｋｋ−１中和活性を有する抗体または免疫機能性フラグメント。
  9. ２つの同一の重鎖および２つの同一の軽鎖からなる抗体と競合する、請求項８に記載の単離抗体または免疫機能性フラグメントであって、該重鎖は、配列番号１２のアミノ酸２０〜４６５からなり、該軽鎖は、配列番号１０のアミノ酸２１〜２３４からなる、単離抗体または免疫機能性フラグメント。
  10. ５×１０−４ｓ−ｌ以下のｋｄでＤｋｋ−１ポリペプチドから解離する、請求項９に記載の単離抗体または免疫機能性フラグメント。
  11. モノクローナル抗体である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離抗体または免疫機能性フラグメント。
  12. ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離抗体または免疫機能性フラグメント。
  13. ヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離抗体または免疫機能性フラグメント。
  14. （ａ）配列番号７０、７２および７４に記載されたアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ；ならびに
    （ｂ）配列番号７６、７８および８０に記載されたアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ
    をコードする核酸であって、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体をコードする、核酸。
  15. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体または免疫機能性フラグメントの前記ＶＨおよび前記ＶＬの双方をコードする配列を含む、核酸。
  16. 請求項６に記載の抗体または免疫機能性フラグメントの前記ＶＨおよび前記ＶＬの双方をコードする核酸セグメントを含む、核酸。
  17. 請求項１５に記載の核酸を含む、発現ベクター。
  18. 請求項１７に記載の発現ベクターを含む、単離細胞。
  19. 請求項１８に記載の細胞を培養する工程を包含する、抗体またはその免疫機能性フラグメントを産生する方法。
  20. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体またはその免疫機能性フラグメントと、緩衝剤、薬学的に受容可能な希釈剤、キャリア、可溶化剤、乳化剤および保存剤よりなる群から選択される成分とを含む、薬学的組成物。
  21. 骨修復において使用するため、または疾患を処置するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体またはその免疫機能性フラグメントを含む薬学的組成物であって、該疾患は、骨障害および破骨細胞活性を増加させ、骨再吸収を誘導させる癌よりなる群から選択される、薬学的組成物。
  22. 前記疾患が、骨減少症、骨粗しょう症、ページェット病、強直性脊椎炎、歯周病、骨修復、固定化による骨減少、または溶解性骨転移よりなる群から選択される、請求項２１に記載の薬学的組成物。
  23. 前記骨修復が、骨折の処置である、請求項２１に記載の薬学的組成物。
  24. 前記抗体が、骨芽細胞活性を刺激し、骨塩密度または骨質量を増加させる、請求項２１に記載の薬学的組成物。
  25. 前記処置が、骨成長促進剤または骨抗再吸収剤と併用した前記抗体またはその免疫機能性フラグメントの投与を含む併用治療である、請求項２１に記載の薬学的組成物。
  26. 前記骨成長促進剤または骨抗再吸収剤が、骨形態形成因子ＢＭＰ−１からＢＭＰ−１２、形質転換成長因子−β、線維芽細胞成長因子ＦＧＦ−１からＦＧＦ−１０、インターロイキン−１阻害剤、ＴＮＦα阻害剤、ＲＡＮＫリガンド阻害剤、副甲状腺ホルモン、Ｅシリーズプロスタグランジン、ビスホスホネート、骨増強無機塩およびアナボリック剤よりなる群から選択される、請求項２５に記載の薬学的組成物。
  27. （ａ）前記インターロイキン−１阻害剤が、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１に対する抗体またはＩＬ−１受容体に対する抗体であり、
    （ｂ）前記ＴＮＦα阻害剤が、エタナーセプト、アダリブマブまたはインフリキシマブであり、
    （ｃ）前記ＲＡＮＫリガンド阻害剤が、溶解性ＲＡＮＫ、オステオプロテゲリンまたはＲＡＮＫもしくはＲＡＮＫリガンドに特異的に結合するアンタゴニスト抗体であり、
    （ｄ）前記骨増強無機塩が、フッ化物またはカルシウムである、
    請求項２６に記載の薬学的組成物。
  28. 放射線療法または化学療法を受けている癌患者を処置するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体またはその免疫機能性フラグメントを含む薬学的組成物。
  29. 前記抗体またはその免疫機能性フラグメントが、アントラサイクリン、タキソール、タモキシフェン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、オキサロプラチン、または［（１Ｒ）−３−メチル−１−［［（２Ｓ）−１−オキソ−３−フェニル−２−［（ピラジニルカルボニル）アミノ］プロピル］アミノ］ブチル］ボロン酸と併用して投与されることを特徴とする、請求項２８に記載の薬学的組成物。
  30. 前記抗体またはその免疫機能性フラグメントが、乳癌患者に、アロマターゼ阻害剤および化学療法剤と併用して投与されることを特徴とする、請求項２８または２９に記載の薬学的組成物。
  31. 前記抗体またはその免疫機能性フラグメントが、腫瘍細胞に結合し、腫瘍成長に対して細胞毒性効果および／または細胞増殖抑制効果を誘導する抗体と併用して投与されることを特徴とする、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  32. 腫瘍成長に対して細胞毒性効果および／または細胞増殖抑制効果を誘導する前記抗体が、細胞表面のタンパク質Ｈｅｒ２、ＣＤＣ２０、ＣＤＣ３３、ムチン様糖タンパク質または上皮細胞成長因子受容体に結合する抗体である、請求項３１に記載の薬学的組成物。
  33. 前記抗体またはその免疫機能性フラグメントが、腫瘍細胞において選択的にアポトーシスを誘導するポリペプチドと併用して投与されることを特徴とする、請求項２８に記載の薬学的組成物。
  34. 前記ポリペプチドがＴＲＡＩＬである、請求項３３に記載の薬学的組成物。
  35. 前記併用治療が、同時または連続的に投与される処置を包含する、請求項２５〜２７および２９〜３４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  36. 多発性骨髄腫を処置するための薬学的組成物の調製のための、有効量の請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体またはその免疫機能性フラグメントの薬学的組成物。
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