CN112180094A - Dkk1抑制剂在预防和/或治疗肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病中的应用 - Google Patents
Dkk1抑制剂在预防和/或治疗肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及DKK1抑制剂在预防和/或治疗肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病中的应用。具体地，本发明提供了一种DKK1基因或其编码蛋白抑制剂的用途，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于预防和/或治疗肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病。本发明通过抑制肿瘤细胞中的DKK1基因或其编码蛋白的表达或活性，可有效预防和/或治疗肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病。此外，本发明也提供了检测血中DKK1的蛋白表达水平方法，作为提供精准治疗与判断预后的指标。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域。更具体地，本发明涉及DKK1抑制剂在预防和/ 或治疗肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病中的应用。
背景技术
肿瘤恶病质伴随体重减轻，严重损害生存质量，限制癌症的治疗，同时缩短生存期，然而，目前没有有效的治疗方法。同样，糖尿病伴随全身各个脏器的损伤，严重危害患者的生命健康，同时限制很多伴随疾病或固有疾病的治疗。虽然各类降糖疗法可以有效阻止疾病发生发展，然而，胰岛素本身对一大类病人(比如糖尿病伴有心衰的患者)有很强的毒副作用，还有如何判断部分降糖效果不稳定的病人其脏器是否仍在继续遭受损伤，等等，目前临床仍然存在大量亟待解决的问题。
因此，本领域迫切需要开发一种能够有效预防和/或治疗这些临床难以解决的疾病的治疗方案。
发明内容
本发明的目的就是提供一种能够有效预防和/或治疗肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病的治疗方案。
在本发明第一方面，提供了一种DKK1基因或其编码蛋白抑制剂的用途，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于预防和/或治疗肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病。
在另一优选例中，所述抑制剂包括抑制DKK1与LRP5/LRP6结合的抑制剂。
在另一优选例中，所述抑制剂抑制DKK1的活性和/或表达量。
在另一优选例中，所述抑制剂抑制DKK1与LRP5/LRP6的复合物的形成。
在另一优选例中，所述抑制剂抑制LRP5/LRP6的活性和/或表达量。
在另一优选例中，所述抑制剂抑制Kremen1/Kremen2的活性和/或表达量。
在另一优选例中，所述抑制剂选自下组：抗体、游离DKK1受体结合域或其突变体、DKK1受体的其它游离配体或其突变体、小分子化合物、microRNA、siRNA、shRNA、CRISPR试剂、或其组合。
在另一优选例中，所述抑制剂选自下组：MDC、CDHC/STHC、IGFBP4蛋白、表达IGFBP4的载体、IGFBP4突变体、表达IGFBP4突变体的载体、LRP5/LRP6 中和抗体、游离LRP5/LRP6与DKK1的结合域或其突变体、Kremen1/Kremen2抑制剂(包括中和抗体)、游离Kremen1/Kremen2与DKK1的结合域或其突变体、或其组合
在另一优选例中，所述表达IGFBP4的载体或表达IGFBP4突变体的载体包括病毒载体。
在另一优选例中，所述病毒载体选自下组：腺相关病毒载体、慢病毒载体、或其组合。
在另一优选例中，所述的IGFBP4蛋白包括全长蛋白或蛋白片段。
在另一优选例中，所述IGFBP4蛋白还包括IGFBP4蛋白的衍生物。
在另一优选例中，所述IGFBP4蛋白的衍生物包括经修饰的IGFBP4蛋白、氨基酸序列与天然IGFBP4蛋白同源且具有天然IGFBP4蛋白活性的蛋白分子、IGFBP4 蛋白的二聚体或多聚体、含有IGFBP4蛋白氨基酸序列的融合蛋白。
在另一优选例中，所述“氨基酸序列与天然IGFBP4蛋白同源且具有天然 IGFBP4蛋白活性的蛋白分子”是指其氨基酸序列与IGFBP4蛋白相比具有≥85％的同源性，较佳地≥90％的同源性，更佳地≥95％的同源性，最佳地≥98％同源性；并且具有天然IGFBP4蛋白活性的蛋白分子。
在另一优选例中，所述IGFBP4突变体选自下组：IGFBP4/H95P、 IGFBPDF/H95A、IGFBPDF/H95E、IGFBPDF/H95D、或其组合。
在另一优选例中，所述Kremen1/2抑制剂是指能够在体内或体外拮抗 Kremen2基因或其蛋白的活性和/或含量的物质；所述物质可以为人工合成的或天然的化合物、蛋白(如抗体)、核苷酸等。
在另一优选例中，所述Kremen1/2抑制剂包括拮抗Kremen1/2表达的物质。
在另一优选例中，所述Kremen1/2抑制剂包括Kremen1/2蛋白拮抗剂和/或Kremen1/2基因拮抗剂。
在另一优选例中，所述抑制Kremen1/2表达或活性指将Kremen1/2基因或蛋白的表达或活性降低≥20％，较佳地，≥50％，更佳地，≥70％。
在另一优选例中，所述肿瘤恶病质包括Wnt正常或低表达的肿瘤恶病质。
在另一优选例中，所述肿瘤恶病质包括与Wnt通路无关的肿瘤恶病质。
在另一优选例中，所述组合物或制剂还用于选自下组的一种或多种用途：
(a)降低肿瘤细胞内β-arrestin2的含量；
(b)抑制哺乳动物中的IκB和NFκB的激活；
(c)抑制p53和Bax/Bcl-2的上调；
(d)抑制肌肉蛋白标志物的下调；
(e)抑制哺乳动物肌肉组织中的细胞因子的上调。
在另一优选例中，所述肿瘤细胞来自选自下组的一种或多种肿瘤：肠癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、头颈部恶性肿瘤、或其组合。
在另一优选例中，所述肌肉蛋白标志物包括肌红蛋白(myoglobin)。
在另一优选例中，所述肌肉组织中的细胞因子选自下组：TNFα、IL1β、 IL6、、或其组合。
在另一优选例中，所述哺乳动物包括患有肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病的哺乳动物。
在另一优选例中，所述哺乳动物包括人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物(如小鼠、大鼠、或兔)、灵长类动物(如猴)。
在另一优选例中，所述DKK1来源于哺乳动物；优选地，来源于人、小鼠、大鼠、或兔；更优选地，来源于人。
在另一优选例中，所述DKK1基因包括野生型DKK1基因和突变型DKK1基因。
在另一优选例中，所述的突变型包括突变后编码蛋白的功能未发生改变的突变形式(即功能与野生型编码蛋白相同或基本相同)。
在另一优选例中，所述的突变型DKK1基因编码的多肽与野生DKK1基因所编码的多肽相同或基本相同。
在另一优选例中，所述的突变型DKK1基因包括与野生DKK1基因相比，同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％，更佳地，≥98％或99％)的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的突变型DKK1基因包括在野生型DKK1基因的5＇端和/或3＇端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的DKK1基因包括cDNA序列、基因组序列、或其组合。
在另一优选例中，所述DKK1蛋白包括DKK1的活性片段或其衍生物。
在另一优选例中，所述活性片段或其衍生物与DKK1的同源性至少为90％，优选为95％，更优选为98％、99％。
在另一优选例中，所述活性片段或其衍生物至少具有80％、85％、90％、95％、100％的DKK1活性。
在另一优选例中，所述DKK1蛋白的氨基酸序列选自下组：
(i)具有SEQ ID NO.:1或3所示氨基酸序列的多肽；
(ii)将如SEQ ID NO.:1或3所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-10个) 氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述蛋白功能的、由(i)衍生的多肽；或
(iii)氨基酸序列与SEQ ID NO.:1或3所示氨基酸序列的同源性≥90％(较佳地≥95％，更佳地≥98％或99％)，具有所述蛋白功能的多肽。
在另一优选例中，所述DKK1基因的核苷酸序列选自下组：
(a)编码如SEQ ID NO.:1或3所示多肽的多核苷酸；
(b)序列如SEQ ID NO.:2或4所示的多核苷酸；
(c)核苷酸序列与SEQ ID NO.:2或4所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％，更佳地≥99％)的多核苷酸；
(d)在SEQ ID NO.:2或4所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60 个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；
(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
在另一优选例中，所述DKK1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1或3所示。
在另一优选例中，所述编码DKK1蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.:2或4所示。
在另一优选例中，所述DKK1基因或其编码蛋白的抑制剂的含量为 0.1mg/kg-100mg/kg，较佳地，1mg/kg-50mg/kg，更佳地，2mg/kg-20mg/kg。
在另一优选例中，所述组合物包括药物组合物。
在另一优选例中，所述药物组合物含有(a)DKK1基因或其编码蛋白抑制剂；和(b)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述药物组合物为液态、固体、或半固体。
在另一优选例中，所述药物组合物的剂型包括片剂、颗粒剂、胶囊、口服液、或注射剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物中，所述组分(a)占所述药物组合物总重量的1-99wt％，较佳地10-90wt％，更佳地30-70wt％。
在另一优选例中，所述组合物还包括其他的预防和/或治疗肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病的药物。
在另一优选例中，所述其他的预防和/或治疗肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病的药物选自下组：肿瘤药物、糖尿病治疗药物、或其组合。
在另一优选例中，所述糖尿病治疗药物选自下组：胰岛素类药物、二甲双胍类降糖药物、GLP类药物、胃饥饿素(Ghrelin)、或其组合。
在另一优选例中，所述肿瘤药物选自下组：化疗药物、靶向治疗药物、免疫治疗药物、细胞治疗药物、或其组合。
在另一优选例中，所述化疗药物选自下组：吉西他滨、顺铂、长春新碱、紫杉醇、多柔比星、5-FU、或其组合。
在另一优选例中，所述靶向治疗药物选自下组：拉帕替尼、厄洛替尼、阿帕替尼、利妥昔单抗、贝伐珠单抗、曲妥珠单抗、或其组合。
在另一优选例中，所述免疫治疗药物选自下组：PD-1单抗、PDL-1单抗、CD47 单抗、或其组合。
在另一优选例中，所述细胞治疗药物选自下组：NK细胞、CART细胞、TIL细胞、或其组合。
在另一优选例中，所述组合物或制剂在预防和/或治疗肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病的应用中，可单独使用，或联合使用。
在另一优选例中，所述的联合使用包括：与其它预防和/或治疗肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病的药物联合使用。
本发明第二方面提供了一种药物组合物，包括：
(a1)用于预防和/或治疗肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病的第一活性成分，所述第一活性成分包括：DKK1基因或其编码蛋白抑制剂；
(a2)预防和/或治疗肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病的第二活性成分，所述第二活性成分包括：其他的用于预防和/或治疗肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病的药物；和
(b)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物中，所述组分(a1)占所述药物组合物总重量的1-99wt％，较佳地10-90wt％，更佳地30-70wt％。
在另一优选例中，所述的药物组合物中，所述组分(a2)占所述药物组合物总重量的1-99wt％，较佳地10-90wt％，更佳地30-70wt％。
在另一优选例中，所述第一活性成分和第二活性成分的重量比为1:100至 100：1，较佳地为1:10至10：1。
在另一优选例中，所其他的预防和/或治疗肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病的药物选自下组：肿瘤药物、糖尿病治疗药物、或其组合。
在另一优选例中，所述糖尿病治疗药物选自下组：胰岛素类药物、二甲双胍类降糖药物、GLP类药物、胃饥饿素(Ghrelin)、或其组合。
在另一优选例中，所述肿瘤药物选自下组：化疗药物、靶向治疗药物、免疫治疗药物、细胞治疗药物、或其组合。
在另一优选例中，所述化疗药物选自下组：吉西他滨、顺铂、长春新碱、紫杉醇、多柔比星、5-FU、或其组合。
在另一优选例中，所述靶向治疗药物选自下组：拉帕替尼、厄洛替尼、阿帕替尼、利妥昔单抗、贝伐珠单抗、曲妥珠单抗、或其组合。
在另一优选例中，所述免疫治疗药物选自下组：PD-1单抗、PDL-1单抗、CD47 单抗、或其组合。
在另一优选例中，所述细胞治疗药物选自下组：NK细胞、CART细胞、TIL细胞、或其组合。
在另一优选例中，所述药物组合物中可以是单一化合物，也可以是多个化合物的混合物。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备治疗或预防肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病的药物或制剂。
在另一优选例中，所述的药物剂型为口服给药或非口服给药剂型。
在另一优选例中，所述的口服给药剂型是片剂、散剂、颗粒剂或胶囊剂，或乳剂或糖浆剂。
在另一优选例中，所述的非口服给药剂型是注射剂或针剂。
在另一优选例中，所述的活性成分(a1)和活性成分(a2)的总含量为组合物总重的1～99wt％，更佳地为5～90wt％。
本发明第三方面提供了一种药盒，包括：
(i)第一容器，以及位于该第一容器中的活性成分(a1)DKK1基因或其编码蛋白抑制剂，或含有活性成分(a)的药物；和
(ii)第二容器，以及位于该第二容器中的活性成分(a2)其他的用于预防和/ 或治疗肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病的药物,或含有活性成分(a2)的药物。
在另一优选例中，所述的第一容器和第二容器是相同或不同的容器。
在另一优选例中，所述的第一容器的药物是含DKK1基因或其编码蛋白抑制剂的单方制剂。
在另一优选例中，所述的第二容器的药物是含其他的用于预防和/或治疗肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病的药物的单方制剂。
在另一优选例中，所述药物的剂型为口服剂型或注射剂型。
在另一优选例中，所述试剂盒还含有说明书，所述说明书中记载了联合给予活性成分(a1)和活性成分(a2)从而预防和/或治疗肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病的说明。
在另一优选例中，所述含有活性成分(a1)DKK1基因或其编码蛋白抑制剂的制剂或含有其他的用于预防和/或治疗肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病的药物的制剂的剂型分别包括胶囊、片剂、栓剂、或静脉注射剂。
在另一优选例中，所述含有活性成分(a1)DKK1基因或其编码蛋白抑制剂的制剂中，所述DKK1基因或其编码蛋白抑制剂的浓度为0.1mg/kg-100mg/kg，较佳地，1mg/kg-50mg/kg，更佳地，2mg/kg-20mg/kg。
本发明第四方面提供了一种体外降低肿瘤细胞内β-arrestin2的含量的方法，包括步骤：
在DKK1基因或其编码蛋白抑制剂存在的条件下，培养肿瘤细胞，从而降低肿瘤细胞内β-arrestin2的含量。
在另一优选例中，所述肿瘤细胞来自于选自下组的一种或多种肿瘤：肠癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、头颈部恶性肿瘤、或其组合。
在另一优选例中，所述肿瘤细胞为体外培养的细胞。
在另一优选例中，所述方法为非诊断性和非治疗性的。
在另一优选例中，所述DKK1基因或其编码蛋白抑制剂的作用浓度为 0.1mg/kg-100mg/kg，较佳地，1mg/kg-50mg/kg，更佳地，2mg/kg-20mg/kg。
本发明第五方面提供了一种本发明第二方面所述的药物组合物或本发明第三方面所述药盒的用途，用于制备用于预防和/或治疗肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病的药物。
在另一优选例中，所述药物组合物中，DKK1基因或其编码蛋白抑制剂的作用浓度为0.1mg/kg-100mg/kg，较佳地，1mg/kg-50mg/kg，更佳地，2mg/kg-20mg/kg。
本发明第六方面提供了一种筛选肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病的潜在治疗剂的方法，包括：
(a)在测试组中，在培养体系中，在测试化合物的存在下，培养表达DKK1 基因或其蛋白的细胞一段时间T1，检测测试组所述培养体系中的DKk1基因或其蛋白的表达量E1和/或活性A1；
并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组所述培养体系中DKK1基因或其蛋白的表达量E2和/或活性A2；和
(b)对E1和E2进行比较，如果E1显著低于E2，则表示所述测试化合物是肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病的潜在治疗剂；或
对A1和A2进行比较，如果A1显著低于A2，则表示所述测试化合物是肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病的潜在治疗剂。。
在另一优选例中，所述“显著高于”指E1/E2≤1/2，较佳地，≤1/3，更佳地，≤1/4。
在另一优选例中，所述细胞包括肿瘤细胞。
在另一优选例中，所述肿瘤细胞来自于选自下组的一种或多种肿瘤：肠癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、头颈部恶性肿瘤、或其组合。
在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗性的。
在另一优选例中，所述的方法包括步骤(c)：将步骤(a)中所确定的潜在治疗剂施用于哺乳动物，从而测定其对哺乳动物的肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病的影响。
在另一优选例中，所述哺乳动物包括人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物、灵长目动物，较佳地，包括小鼠、大鼠、兔、猴。
本发明第七方面提供了一种筛选肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病的潜在治疗剂的方法，包括：
(a)在测试组中，在培养体系中，在测试化合物的存在下，培养肿瘤细胞一段时间T1，检测测试组所述培养体系中所述DKK1与LRP6复合物的形成情况；
并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组所述培养体系中所述DKK1与LRP6复合物的形成情况；
(b)如果所述测试组中的所述述DKK1与LRP6复合物的形成数量Q1显著低于所述对照组中的所述述DKK1与LRP6复合物的形成数量Q2，则表示所述测试化合物是候选化合物。
在另一优选例中，所述的方法包括步骤(b)：将步骤(a)中所确定的候选化合物施用于哺乳动物，从而测定其对哺乳动物的肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病的影响。
在另一优选例中，所述哺乳动物包括人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物、灵长目动物，较佳地，包括小鼠、大鼠、兔、猴。
在另一优选例中，所述“显著低于”指Q1/Q2≤1/2,较佳地，≤1/3，更佳地≤1/4。
在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗性的。
在另一优选例中，所述肿瘤细胞来源于选自下组的一种或多种肿瘤：肠癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、头颈部恶性肿瘤。
本发明第八方面提供了一种预防和/或治疗肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病的方法，包括步骤：
给需要的对象，施DKK1基因或其编码蛋白抑制剂、权利要求2所述的药物组合物、或权利要求3所述的药盒。
在另一优选例中，所述的施用包括口服。
在另一优选例中，所述的对象包括人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物和灵长目动物，优选小鼠、大鼠、兔、猴。
在另一优选例中，所述DKK1基因或其编码蛋白抑制剂的施用剂量为 0.1mg/kg-100mg/kg，较佳地，1mg/kg-50mg/kg，更佳地，2mg/kg-20mg/kg。
在另一优选例中，所述DKK1基因或其编码蛋白抑制剂的施用频率为每周 1-7次，较佳地，每周2-5次，更佳地，每周2-3次。
在另一优选例中，所述DKK1基因或其编码蛋白抑制剂的施用时间为1-20 周，较佳地，2-12周，更佳地，4-8周。
本发明第九方面提供了一种确定肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病的治疗方案的方法，包括：
a)提供来自受试者的测试样品；
b)检测测试样品中DKK1蛋白的水平；和
c)基于所述样品中的DKK1蛋白水平来确定肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病的治疗方案。
在另一优选例中，所述的受试者为人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述样品来源于血液、肿瘤组织、腹水或尿液。
在另一优选例中，所述样品来源于外周血。
在另一优选例中，用以下方法进行检测：免疫学检测方法、酶学方法、或质谱方法。
在另一优选例中，所述免疫检测方法选自下组：ELISA、Western blotting、免疫荧光、化学发光、或其组合。
在另一优选例中，所述治疗方案还包括其他的预防和/或治疗肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病的疗法。
在另一优选例中，所述其他的预防和/或治疗肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病的疗法选自下组：
(a)肿瘤药物疗法；和/或
(b)糖尿病治疗药物疗法。
在另一优选例中，所述糖尿病治疗药物选自下组：胰岛素类药物、二甲双胍类降糖药物、GLP类药物、胃饥饿素(Ghrelin)、或其组合。
在另一优选例中，所述肿瘤药物选自下组：化疗药物、靶向治疗药物、免疫治疗药物、细胞治疗药物、或其组合。
在另一优选例中，所述化疗药物选自下组：吉西他滨、顺铂、长春新碱、紫杉醇、多柔比星、5-FU、或其组合。
在另一优选例中，所述靶向治疗药物选自下组：拉帕替尼、厄洛替尼、阿帕替尼、利妥昔单抗、贝伐珠单抗、曲妥珠单抗、或其组合。
在另一优选例中，所述免疫治疗药物选自下组：PD-1单抗、PDL-1单抗、CD47 单抗、或其组合。
在另一优选例中，所述细胞治疗药物选自下组：NK细胞、CART细胞、TIL细胞、或其组合。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了Dkk1上调可能与恶病质相关的肿瘤死亡有关。
其中，图1a显示了TCGA数据库分析临床上不同的肿瘤类型(包括了头颈癌、胰腺癌、胃腺癌和肺腺癌)患者，血液中Dkk1的表达量域生存期的关系。
图1b显示ELISA法检测荷瘤小鼠(肠癌细胞种植瘤和肺腺癌细胞种植瘤) 血液中Dkk1的表达。图1c显示了RT-qPCR法检测不同器官中Dkk1的表达量。
图1d显示了RT-qPCR法检测种植肿瘤对肌肉和肾脏中Dkk1表达量的影响。
图1e显示了Kaplan-Meier分析Dkk1对荷瘤小鼠生存期的影响。
图1f显示了Kaplan-Meier分析Dkk1综合抗体延长荷瘤小鼠生存期作用。
图1g显示了肿瘤晚期引起小鼠去瘤体重和肌肉重量的改变。
图1h显示了HE染色观察恶病质小鼠肌肉病理状态。
图1i显示了肿瘤种植晚期观察肾脏的重量、HE染色观察肾脏病理状态及自动生化仪检测肾功能的表达。
图2显示了下调膜蛋白LRP6和Kremen2能引起肿瘤恶病质。
图2a显示了Western blot法检测恶病质晚期肌肉中膜/总蛋白LRP6、LRP5、Kremen1、Kremen2的表达。
图2b显示了Western blot法检测恶病质晚期肾脏中膜/总蛋白LRP6、LRP5、Kremen1、Kremen2的表达。
图2c显示了Western blot法检测恶病质晚期肾脏中总/核蛋白β-catenin 的表达。
图3显示了逆转膜上LRP6和Kremen2下调可以阻止肿瘤恶病质。
图3a显示了Western blot法检测Dkk1肌肉注射引起的膜/浆蛋白LRP6、 Kremen2的改变，以及MDC对其逆转作用。
图3b显示了Kaplan-Meier分析MDC和Dkk1联用延长Dkk1引起的荷瘤小鼠生存期缩短作用。
图3c显示了腹腔注射MDC和IGFBP4可以逆转肿瘤引起的去瘤体重下降以及肌肉萎缩。
图3d和3e显示了Kaplan-Meier分析Clathin-TG2抑制剂(MDC、Cystamine 和Spermidine)对荷瘤小鼠生存期的影响。
图3f显示了Western blot分析MDC逆转肿瘤引起的膜蛋白LRP6和Kremen2 的表达，以及总蛋白Myoglobin的表达。
图3g显示了Kaplan-Meier分析IGFBP4对荷瘤小鼠生存期的影响。
图3h显示了Western blot分析IGFBP4影响Dkk1引起的膜/浆蛋白LRP6 和Kremen2的表达。
图4显示了RNA-Seq分析：敲低LRP5/6基因广泛改变GPCR的表达。
(A)HepG2细胞中LRP5/6(红色)或CTNNB1(β-catenin，蓝色)被siRNA敲低后， RNA-Seq分析用文氏图揭示了表达倍数变化>0.2的GPCR的数量分布。(B和C)HepG2 细胞中LRP5/6或CTNNB1(β-catenin)被siRNA敲低后，RNA-Seq分析用柱状图显示了 GPCR表达倍数的变化(B)；用热图显示了表达上调(红色)或下调(绿色)的GPCR倍数变化 (log2值)(C)。
图5显示了外源性LRP6N逆转敲低LRP5/6诱导的细胞DNA损伤。
(A)LRP5，LRP6或β-catenin被梯度稀释的siRNA敲低48h后，HUVEC细胞中LRP5/6，β-catenin和γH2AX的表达。n＝3。(B)LRP5/6或β-catenin敲低 48h后，LRP6N蛋白预处理和H2O2刺激诱导HUVEC细胞的γH2AX反应。n＝3。(C)H2O2按指定时间(左图)和浓度(右图)刺激HUVEC细胞后，γH2AX，细胞膜或总体 LRP5/6(m/tLRP5/6)，细胞核或总体β-catenin(n/tβ-catenin)的表达。n＝3。
图6显示了敲低MESD导致膜上LRP5/6下调和氧化应激抵抗的减弱。
(A)MESD敲低48h后，HUVEC细胞中MESD，细胞膜或总体LRP5/6(m/tLRP5/6) 和总体β-catenin(tβ-catenin)的表达。n＝3。(B)MESD被siRNA#1敲低48 h后，LRP6N蛋白预处理和H2O2刺激诱导HUVEC细胞的γH2AX反应。n＝3。
图7显示了Dkk1诱导细胞膜上LRP5/6内吞和DNA损伤反应。
(A)Dkk1蛋白按指定时间(左图)和浓度(右图)刺激HUVEC细胞后，细胞膜或总体LRP5/6(m/tLRP5/6)，细胞核或总体β-catenin(n/tβ-catenin)和γH2AX的表达。n＝3。(B)MDC或LRP6N蛋白预处理合并Dkk1蛋白和H2O2单独或先后刺激HUVEC 细胞诱导的γH2AX反应。n＝3。
图8显示了Dkk1通过下调膜上LRP5/6激活β-arrestin1/2信号的传导。
(A和B)MDC预处理合并指定时间(A)和浓度(B)的Dkk1蛋白刺激HUVEC细胞后，细胞膜或细胞浆β-arrestin1/2(m/cβ-arrestin1/2)和 LRP5/6(m/cLRP5/6)的表达。n＝3。(C)BIM-46187预处理合并Dkk1蛋白刺激 HUVEC细胞后，细胞膜或细胞浆β-arrestin1/2(m/cβ-arrestin1/2)的表达。n＝3。(D)LRP5/6或β-catenin敲低48h后，HUVEC细胞中β-arrestin1/2， LRP5/6和β-catenin的表达。n＝3。
图9显示了β-arrestin1/2介导了膜上LRP5/6下调引起的细胞DNA损伤。
(A)β-arrestin1/2敲低48h后，HUVEC细胞中β-arrestin1/2的表达。n＝ 3。(B)β-arrestin1/2敲低48h后，Dkk1蛋白和H2O2单独或先后刺激HUVEC细胞诱导的γH2AX反应。n＝3。(C)BIM-46187预处理合并Dkk1蛋白刺激HUVEC细胞后，γH2AX的表达。n＝3。(D)β-arrestin1/2合并LRP5/6或β-catenin敲低 48h后，H2O2刺激诱导HUVEC细胞的γH2AX反应。n＝3。
图10显示了G蛋白激动剂能够诱导DNA损伤反应。
(A和B)CTX(A)或PTX(B)按指定时间和浓度刺激诱导HUVEC细胞的γH2AX 反应。n＝3。
图11显示了LRP5/6基因敲除引起小鼠心脏损伤。
(A)他莫昔芬诱导1周的对照，LRP5/6-/-和β-catenin-/-小鼠，心脏中 LRP5/6，β-catenin，γH2AX，p53，p21，Bcl-2，Bax和Cleaved Caspase-3 的表达。n＝9。(B)他莫昔芬诱导35周的对照，LRP5/6-/-和β-catenin-/-小鼠的体重变化(左图)及多器官(心脏，肺脏，肾脏，脾脏，骨骼肌和脂肪)的相对重量比(右图)。n＝6。(C)对照，LRP5/6-/-和β-catenin-/-小鼠左心室射血分数(EF％)和左心室短轴缩短率(FS％)在他莫昔芬诱导后指定时间的变化(左图)；他莫昔芬诱导35周的对照，LRP5/6-/-和β-catenin-/-小鼠的代表性二维超声心动图，显示左心室收缩末期和舒张末期的波型模式。LRP5/6-/-小鼠的平波模式表明左心室壁肌肉运动受损(右图)。n＝6。(D)实时定量PCR分析。他莫昔芬诱导35周的对照，LRP5/6-/-和β-catenin-/-小鼠，心脏中ANP和BNP的表达。数据通过GAPDH内参标准化。n＝6。(E)对照，LRP5/6-/-和β-catenin-/-小鼠在他莫昔芬诱导后指定时间测量的二维心脏超声各指标的数值。n＝6。
图12显示了LRP5/6基因敲除激活小鼠心脏β-arrestin1/2信号的传导。
(A)他莫昔芬诱导1周的对照，LRP5/6-/-和β-catenin-/-小鼠，心脏中细胞膜，细胞浆和细胞核β-arrestin1/2(m/c/nβ-arrestin1/2)的表达。n＝6。 (B)实时定量PCR分析。他莫昔芬诱导8周的对照，LRP5/6-/-和β-catenin-/-小鼠，心脏中一些GPCR的表达。数据通过GAPDH内参标准化。n＝6。
图13显示了高血糖诱导糖尿病小鼠血液Dkk1的上调。
(A)正常小鼠，STZ造模7天或合并胰岛素治疗7天的糖尿病小鼠，血液Dkk1的ELISA分析。n＝8。(B)STZ造模(左图)或合并胰岛素治疗(右图)的糖尿病小鼠，指定时间的血糖浓度。n＝10。
图14显示了糖尿病小鼠膜上LRP5/6下调与心脏损伤的密切关系。
(A和B)STZ造模(A)或合并胰岛素治疗(B)的糖尿病小鼠，指定时间的心脏中细胞核或总体β-catenin(n/tβ-catenin)，细胞膜或总体 LRP5/6(m/tLRP5/6)和γH2AX的表达。n＝9。(C)正常小鼠，STZ造模7天或合并胰岛素治疗7天的糖尿病小鼠，血液8-OHdG的ELISA分析。n＝5。(D和 E)STZ造模7天(D)或合并胰岛素治疗7天(E)的糖尿病小鼠，心脏中p53，p21， Bcl-2，Bax和Cleaved Caspase-3的表达。n＝9。(F)STZ造模(左图)或合并胰岛素治疗(右图)的糖尿病小鼠，指定时间的体重变化。n＝10。
图15显示了Dkk1通过诱导LRP5/6膜内吞引起糖尿病心脏损伤。
(A)STZ造模7天或合并MDC干预4天的糖尿病小鼠，心脏中m/tLRP5/6和 n/tβ-catenin的表达。n＝9。(B)正常小鼠，STZ造模以及分别合并胰岛素和MDC的糖尿病小鼠，心脏中γH2AX(红色)和DAPI(蓝色)的免疫荧光染色，比例尺为50μm。n＝5。(C)STZ造模7天或合并MDC干预4天的糖尿病小鼠，心脏中γH2AX，p53，p21，Bcl-2，Bax和Cleaved Caspase-3的表达。n＝9。 (D)正常小鼠，STZ造模或合并MDC干预的糖尿病小鼠，血液8-OHdG的ELISA分析。n＝5。(E)STZ造模或合并MDC干预的糖尿病小鼠，指定时间的体重变化。n＝10。(F)正常小鼠，STZ造模以及分别合并胰岛素和MDC的糖尿病小鼠心脏HE染色，比例尺为70μm。n＝5。(G)STZ造模7天或合并MDC干预4 天的糖尿病小鼠血糖浓度。n＝10。(H)野生型小鼠Dkk1蛋白心脏内注射或合并MDC干预2天，心脏中m/tLRP5/6，n/tβ-catenin，γH2AX，p53和p21的表达。n＝6。(I)野生型小鼠Dkk1蛋白合并BIM-46187心脏内注射2天，心脏中γH2AX，p53和p21的表达。n＝6。
图16显示了Leptin-/-小鼠膜上LRP5/6下调导致糖尿病心脏损伤。
(A和B)WT(雄性n＝17；雌性n＝9)和Leptin-/-(雄性n＝12；雌性n＝ 9)小鼠的6周龄外形图，基因型鉴定及不同周龄的体重和血糖浓度。(C)6周龄 WT，Leptin+/-和Leptin-/-小鼠的心脏中m/tLRP5/6，n/tβ-catenin，γH2AX， p53，p21，Bcl-2，Bax和CleavedCaspase-3的表达。n＝6。(D)4周龄WT， Leptin+/-和Leptin-/-小鼠的心脏中m/tLRP5/6和tβ-catenin的表达。n＝6。 (E)6周龄WT，Leptin+/-和Leptin-/-小鼠血液Dkk1的ELISA分析。n＝10。(F)6 周龄WT和Leptin-/-小鼠的糖耐量测试(GTT)。n＝6。(G和I)D-葡萄糖(每2h 腹腔注射一次，持续24h)或合并MDC干预的6周龄Leptin-/-小鼠，血液Dkk1(G， n＝7)和8-OHdG(I，n＝5)的ELISA分析。(H)D-葡萄糖(每2h腹腔注射一次，持续24h)或合并MDC干预的6周龄Leptin-/-小鼠，心脏中m/tLRP5/6， n/tβ-catenin和γH2AX的表达。n＝10。(J和K)D-葡萄糖(每2h腹腔注射一次，持续24h)或合并MDC干预的6周龄Leptin-/-小鼠，心脏中γH2AX，p53，p21，Bcl-2，Bax和Cleaved Caspase-3的表达。n＝10。
图17显示了LRP5/6基因敲除加重了糖尿病心脏损伤。
(A)他莫昔芬诱导4周或合并STZ造模7天的对照，LRP6-/-和β-catenin-/-小鼠，心脏中γH2AX，p53，p21，Bcl-2，Bax，Cleaved Caspase-3，LRP5/6和β-catenin 的表达。n＝9。(B)他莫昔芬诱导4周或合并STZ造模14天的对照，LRP5/6-/-和β-catenin-/-小鼠左心室射血分数(EF％)和左心室短轴缩短率(FS％)在STZ造模前后的变化(左图)；STZ造模14天的对照，LRP5/6-/-和β-catenin-/-小鼠的代表性二维超声心动图，显示左心室收缩末期和舒张末期的波型模式。LRP5/6-/-小鼠的平波模式表明左心室壁肌肉运动受损(右图)。n＝6。(C和D)他莫昔芬诱导4周或合并 STZ造模7天的对照，LRP6-/-和β-catenin-/-小鼠的体重变化(C)和血糖浓度(D)。n ＝6。(E)他莫昔芬诱导4周或合并STZ造模14天的对照，LRP5/6-/-和β-catenin-/-小鼠在STZ造模前后测量的二维心脏超声各指标的数值。n＝6。
图18显示了外源性LRP6N阻止了糖尿病心脏损伤。
(A)基于Cre-loxP重组酶系统的LRP6N/Tg小鼠品系构建的示意图(上图) 和UBC-Cre阳性的LRP6N/Tg小鼠的基因型鉴定(下图)。他莫昔芬诱导使loxP 序列被Cre重组酶删除，CAG启动子从而启动了带myc标签的LRP6N基因的转录。(B)他莫昔芬诱导4周的对照和LRP6N/Tg小鼠，心脏中带myc标签的LRP6N， m/tLRP5/6，tβ-catenin和γH2AX的表达。n＝6。(C)STZ造模7天的对照和LRP6N/Tg小鼠，心脏中γH2AX，p53，p21，Bcl-2，Bax，CleavedCaspase-3， m/tLRP5/6和n/tβ-catenin的表达。n＝9。(D)正常小鼠，STZ造模或合并LRP6N/Tg过表达的糖尿病小鼠，血液8-OHdG的ELISA分析。n＝5。(E)尾静脉注射Vector和LRP6N质粒的野生型小鼠，指定时间的肺脏中带myc标签的 LRP6N表达。n＝3。(F)STZ造模7天合并尾静脉注射Vector和LRP6N质粒的糖尿病小鼠，心脏中γH2AX，p53，p21，Bcl-2，Bax和Cleaved Caspase-3 的表达。n＝8。(G)对照，LRP5/6-/-和β-catenin-/-小鼠(左图，n＝12)在他莫昔芬诱导35周后，以及对照和LRP6N/Tg小鼠(中图，n＝16)，Vector和LRP6N 质粒注射的小鼠(右图，n＝16)在STZ造模7天后的血糖浓度。(H)对照和 LRP6N/Tg小鼠(左图，n＝15)，Vector和LRP6N质粒注射的小鼠(右图，n＝15) 在STZ造模7天后的体重变化。
图19显示了糖尿病小鼠膜上LRP5/6下调特异激活心脏β-arrestin1/2信号的传导。
(A)STZ造模7天的糖尿病小鼠，心脏中细胞膜，细胞浆和细胞核β-arrestin1/2及细胞膜和细胞浆insulin receptor-β(m/c/nβ-arrestin1/2 和m/cIR-β)的表达。n＝6。(B)STZ造模14天合并胰岛素给药7天的糖尿病小鼠，心脏中m/c/nβ-arrestin1/2和m/cIR-β的表达。n＝6。(C)STZ造模7天合并 MDC给药4天的糖尿病小鼠，心脏中m/c/nβ-arrestin1/2和m/cIR-β的表达。 n＝6。(D)STZ造模7天的对照或LRP6N/Tg小鼠，心脏中m/c/nβ-arrestin1/2 和m/cIR-β的表达。n＝6。(E)野生型小鼠Dkk1蛋白心脏内注射合并MDC给药2 天，心脏中m/c/nβ-arrestin1/2和m/cIR-β的表达。n＝6。(F)野生型小鼠Dkk1 蛋白合并BIM-46187心脏内注射2天，心脏中m/c/nβ-arrestin1/2的表达。n＝6。 (G)对照，胰岛素单独给药7天，MDC单独给药4天，LRP6N/Tg小鼠的心脏中 m/c/nβ-arrestin1/2和m/cIR-β的表达。n＝6。
图20显示了可诱导全身LRP5和LRP6共敲除或β-catenin单敲除的转基因小鼠配种示意图。将交配得到的LRP5/6floxp/floxp或β -cateninfloxp/floxp纯合型小鼠与UBC-Cre阳性小鼠交配，可繁殖出诱导性全身LRP5/6共敲除或β-catenin单敲除的转基因小鼠(UBC-Cre-LRP5/6floxp/floxp或UBC-Cre-β-cateninfloxp/floxp)。经他莫昔芬腹腔注射诱导后的小鼠体内会实现全身LRP5/6的共敲除或β-catenin的单敲除(Ctr为阴性对照)，这样的小鼠可分别表示为LRP5/6-/-和β -catenin-/-。
图21显示了可诱导全身过表达LRP6N的转基因小鼠配种示意图。将携带 LRP6N基因的小鼠(STOPfloxp/floxpLRP6N)与UBC-Cre阳性小鼠交配，可繁殖出诱导性全身过表达LRP6N的转基因小鼠(UBC-Cre-STOPfloxp/floxpLRP6N)。经他莫昔芬腹腔注射诱导后的小鼠体内会有LRP6N的过表达(Ctr为阴性对照)，这样的小鼠可表示为LRP6N/Tg。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，抑制肿瘤恶病质与糖尿病模型动物血中的DKK1蛋白的表达或活性，可有效预防和/或治疗肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病，并且发现DKK1这一活性与传统的作为Wnt信号通路抑制剂无关，而是通过诱导其受体LRP5/6内吞，从而诱导器官损伤。并且，申请人还意外的发现，抑制DKK1和LRP5/6的结合(即抑制DKK1与LRP5和LRP6 复合物的形成)，也可有效预防和/或治疗肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病。在此基础上，本发明人完成了本发明。
具体地，实验表明，DKK1蛋白通过诱导LRP5和LRP6的内吞作用，导致了器官损伤，加速了肿瘤恶病质导致的动物死亡和糖尿病伴随急性心肌梗死动物的死亡，同时不影响Wnt信号通路效应蛋白β-catenin。而小分子药物或者蛋白药物阻止了Dkk1引起的膜LRP5和LRP6下调可以完全阻止肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病，并且很好的延长了这些疾病小鼠生存期。通过全基因组的转录分析得到，在骨骼肌中，小分子药物阻止Dkk1引起的膜LRP5和LRP6下调阻止了多个GPCR信号通路的改变以及所有主要的恶病质相关的通路。而且，将Dkk1蛋白直接肌肉注射进小鼠下肢，马上就引起GPCR信号通路以及恶病质相关通路的激活。这些发现，建立了一个重要的途径，就是肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病的发展是通过不依赖于Wnt信号通路，而是以Dkk1-LRP5/LRP6为主轴，影响GPCR信号通路的(图1)。并为预防和/或治疗肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病提出了一个非常有前景的治疗方案。这样，虽然肿瘤恶病质与糖尿病有着本身特异的发病原因，DKK1-LRP5/6这条通路的改变在两种疾病上都扮演了同样的器官损伤作用。
肿瘤恶病质
恶病质亦称恶液质。表现为极度消瘦，皮包骨头，形如骷髅，贫血，无力，完全卧床，生活不能自理，极度痛苦，全身衰竭等综合征。多由癌症和其他严重慢性病引起。可看作是由于全身许多脏器发生障碍所致的一种中毒状态。肿瘤恶病质伴随体重减轻，严重损害生存质量，限制癌症的治疗，同时缩短生存期，然而，目前没有有效的治疗方法。肌肉萎缩是肿瘤恶病质的一个关键特征，是一个多因素疾病，对患者预后和生活质量有负面影响。无论体重指数(BMI) 如何，骨骼肌损耗被认为是癌症发展过程中一个有意义的预后因素，并且与增加化疗毒性的发生率、缩短肿瘤进展时间、手术结果差、身体损害和缩短生存期有关。
糖尿病
糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一组由多病因引起的胰岛素分泌或者作用缺陷，并以慢性高血糖为特征的全身代谢性疾病。长期的糖、脂肪及蛋白质代谢紊乱可引起多器官损害和稳态失衡，会导致心、肾、眼、神经、血管等组织器官慢性病变，功能减退，甚至衰竭等并发症。1型糖尿病(diabetes mellitus type 1，T1DM)和2型糖尿病(diabetesmellitus type 2，T2DM)是糖尿病的两个重要分型，两者的发病机制有所不同。血糖持续升高是糖尿病所致多器官DNA损伤的关键因素，因此利用胰岛素降低血糖进行治疗的同时如何降低血糖导致的细胞损伤作用是一个重要意义的科学问题。
DKK1蛋白和多核苷酸
在本发明中，术语“本发明蛋白”、“DKK1蛋白”、“DKK1多肽”可互换使用，都指具有DKK1氨基酸序列的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的DKK1蛋白。此外，该术语还包括全长的DKK1及其片段。本发明所指的 DKK1蛋白包括其完整的氨基酸序列、其分泌蛋白、其突变体以及其功能上活性的片段。
DKK1分泌蛋白是经典Wnt/β-catenin抑制剂，通过直接结合LRP5/6受体和Kremen受体介导LRP5/6内吞而抑制经典Wnt/β-catenin的激活状态。Mouse Dkk1(NP_034181.2)，由272个氨基酸组成，，序列如SEQ ID NO.:3所示；human Dkk1(NP_036374.1)，由266个氨基酸组成，序列如SEQ ID NO.:1所示。
在本发明中，术语“DKK1基因”、“DKK1多核苷酸”可互换使用，都指具有DKK1核苷酸序列的核酸序列。
人DKK1基因的基因组全长：
human DKK1 DNA序列(801nt)，NCBI登录号：NM_012242.4
ATGATGGCTCTGGGCGCAGCGGGAGCTACCCGGGTCTTTGTCGCGATGGTAGCGGCGGCTCTC GGCGGCCACCCTCTGCTGGGAGTGAGCGCCACCTTGAACTCGGTTCTCAATTCCAACGCTATCAAGA ACCTGCCCCCACCGCTGGGCGGCGCTGCGGGGCACCCAGGCTCTGCAGTCAGCGCCGCGCCGGGAAT CCTGTACCCGGGCGGGAATAAGTACCAGACCATTGACAACTACCAGCCGTACCCGTGCGCAGAGGAC GAGGAGTGCGGCACTGATGAGTACTGCGCTAGTCCCACCCGCGGAGGGGACGCAGGCGTGCAAATCT GTCTCGCCTGCAGGAAGCGCCGAAAACGCTGCATGCGTCACGCTATGTGCTGCCCCGGGAATTACTG CAAAAATGGAATATGTGTGTCTTCTGATCAAAATCATTTCCGAGGAGAAATTGAGGAAACCATCACT GAAAGCTTTGGTAATGATCATAGCACCTTGGATGGGTATTCCAGAAGAACCACCTTGTCTTCAAAAA TGTATCACACCAAAGGACAAGAAGGTTCTGTTTGTCTCCGGTCATCAGACTGTGCCTCAGGATTGTG TTGTGCTAGACACTTCTGGTCCAAGATCTGTAAACCTGTCCTGAAAGAAGGTCAAGTGTGTACCAAGCATAGGAGAAAAGGCTCTCATGGACTAGAAATATTCCAGCGTTGTTACTGTGGAGAAGGTCTGTCTT GCCGGATACAGAAAGATCACCATCAAGCCAGTAATTCTTCTAGGCTTCACACTTGTCAGAGACACTA A(SEQ ID NO.:2)
鼠DKK1基因的基因组全长：
Mouse Dkk1 DNA序列(819nt)，NCBI登录号：NM_010051.3
ATGATGGTTGTGTGTGCAGCGGCAGCTGTCCGGTTCTTGGCCGTGTTTACAATGATGGCTCTC TGCAGCCTCCCTCTGCTAGGAGCCAGTGCCACCTTGAACTCAGTTCTCATCAATTCCAACGCGATCA AGAACCTGCCCCCACCGCTGGGTGGTGCTGGGGGGCAGCCGGGCTCTGCTGTCAGTGTGGCGCCGGG AGTTCTCTATGAGGGCGGGAACAAGTACCAGACTCTTGACAACTACCAGCCCTACCCTTGCGCTGAA GATGAGGAGTGCGGCTCTGACGAGTACTGCTCCAGCCCCAGCCGCGGGGCAGCCGGCGTCGGAGGTG TACAGATCTGTCTGGCTTGCCGAAAGCGCAGGAAGCGCTGCATGAGGCACGCTATGTGCTGCCCCGG GAACTACTGCAAAAATGGAATATGCATGCCCTCTGACCACAGCCATTTTCCTCGAGGGGAAATTGAG GAAAGCATCATTGAAAACCTTGGTAATGACCACAACGCCGCCGCGGGGGATGGATATCCCAGAAGAA CCACACTGACTTCAAAAATATATCACACCAAAGGACAAGAAGGCTCCGTCTGCCTCCGATCATCAGA CTGTGCCGCAGGGCTGTGTTGTGCAAGACACTTCTGGTCCAAGATCTGTAAACCTGTCCTTAAAGAAGGTCAGGTGTGCACCAAGCACAAACGGAAAGGCTCCCACGGGCTGGAGATATTCCAGCGCTGTTACT GCGGGGAAGGCCTGGCTTGCAGGATACAGAAAGATCACCATCAAGCCAGCAATTCTTCTAGGCTCCACACCTGCCAGAGACACTAA(SEQ ID NO.:4)
人和鼠DKK1，在DNA水平的相似性为83％，蛋白序列相似性为81％。需理解的是，当编码相同的氨基酸时，密码子中核苷酸的取代是可接受的。另外需理解的是，由核苷酸取代而产生保守的氨基酸取代时，核苷酸的变换也是可被接受的。
在得到了DKK1的氨基酸片段的情况下，可根据其构建出编码它的核酸序列，并且根据核苷酸序列来设计特异性探针。核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的DKK1核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA 分子(如载体)和细胞中。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的DKK1多肽。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明的编码人DKK1多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，DKK1多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含DKK1编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞；动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA 转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
腺相关病毒
因腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)较其他病毒载体小，无致病性，可转染正在分裂和未分裂的细胞等特性，基于AAV载体的针对遗传性疾病的基因治疗方法受到了广泛的关注。
腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV),也称腺伴随病毒,属于微小病毒科依赖病毒属,是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。它编码两个末端的反向重复序列(ITR)中的cap和rep 基因。ITRs对于病毒的复制和包装具有决定性作用。cap基因编码病毒衣壳蛋白， rep基因参与病毒的复制和整合。AAV能感染多种细胞。
重组腺相关病毒载体(rAAV)源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。经过10余年的研究，重组腺相关病毒的生物学特性己被深入了解，尤其是其在各种细胞、组织和体内实验中的应用效果方面已经积累了许多资料。在医学研究中，rAAV被用于多种疾病的基因治疗的研究(包括体内、体外实验)；同时作为一种有特点的基因转移载体，还广泛用于基因功能研究、构建疾病模型、制备基因敲除鼠等方面。
在本发明一个优选的实施例中，载体为重组AAV载体。AAV是相对较小的DNA 病毒，其可以稳定和位点特异性方式整合到它们所感染的细胞的基因组中。它们能够感染一大系列的细胞而不对细胞生长、形态或分化产生任何影响，并且它们似乎并不涉及人体病理学。AAV基因组己被克隆、测序及表征。AAV在每个末端包含约 145个碱基的反向末端重复序列(ITR)区域，其作为病毒的复制起点。该基因组的其余被分成两个带有衣壳化功能的重要区域：包含涉及病毒复制和病毒基因表达的 rep基因的基因组左边部分；以及包含编码病毒衣壳蛋白的cap基因的基因组右边部分。
AAV载体可采用本领域的标准方法制备。任何血清型的腺相关病毒均是合适的。用于纯化载体的方法可见于例如美国专利No.6566118、6989264和6995006，它们的公开内容整体以引用方式并入本文。杂合载体的制备在例如PCT申请 No.PCT/US2005/027091中有所描述，该申请的公开内容整体以引用方式并入本文。用于体外和体内转运基因的衍生自AAV的载体的使用己有描述(参见例如国际专利申请公布No.WO91/18088和WO93/09239；美国专利No.4,797,368、6,596,535和 5,139,941，以及欧洲专利No.0488528，它们均整体以引用方式并入本文)。这些专利公布描述了其中rep和/或cap基因缺失并被所关注的基因替换的各种来源于 AAV的构建体，以及这些构建体在体外(进入培养的细胞中)或体内(直接进入生物体)转运所关注的基因的用途。复制缺陷重组AAV可通过将以下质粒共转染进被人类辅助病毒(例如腺病毒)感染的细胞系而制备：所含的所关注核酸序列的侧翼为两个AAV反向末端重复序列(ITR)区域的质粒，和携带AAV衣壳化基因(rep和cap基因)的质粒。然后通过标准技术纯化所产生的AAV重组体。
在一些实施方案中，重组载体被衣壳化到病毒粒子(例如包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、 AAV14、AAV15和AAV16的AAV病毒粒子)中。因此，本公开包括含有本文所述的任何载体的重组病毒粒子(因其包含重组多核苷酸而为重组的)。产生这样的粒子的方法是本领域己知的，并在美国专利No.6,596,535中有所描述。
DKK1抑制剂和药物组合物
利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与DKK1基因或蛋白发生相互作用的物质，尤其是抑制剂等。
可用于本发明的DKK1抑制剂(或拮抗剂)包括任何可以抑制DKK1基因或其编码蛋白的表达和/或活性的物质。
在本发明中，DKK1抑制剂还包括抑制DKK1与LRP5和LRP6结合的抑制剂(包括抑制DKK1与LRP5和LRP6复合物形成的抑制剂)。
在本发明中，DKK1抑制剂还包括抑制LRP5和LRP6的活性和/或表达量的物质。
例如，所述DKK1的抑制剂包括小分子化合物、DKK1的抗体、DKK1核酸的反义RNA、siRNA、shRNA、miRNA、或DKK1的活性抑制剂。
在一种优选的实施方式中，抑制DKK1的方法和步骤包括利用DKK1的抗体中和其蛋白，利用病毒(如腺相关病毒)携带的shRNA或siRNA或CRISPR试剂进行DKK1基因的沉默。
对DKK1的抑制率一般为达到至少50％以上的抑制，优选为60％、70％、80％、90％、95％的抑制，可以基于常规技术，例如流式细胞术、荧光定量PCR或Western blot等方法对DKK1的抑制率进行控制和检测。
本发明DKK1蛋白的抑制剂(包括抗体、小分子化合物、反义核酸、CRISPR 试剂以及其他抑制剂)，当在治疗上进行施用(给药)时，可抑制DKK1蛋白的表达和/或活性、或抑制LRP5和LRP6的表达和/或活性、或抑制DKK1与LRP5和 LRP6复合物的形成，从而预防和/或治疗肿瘤恶病质。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：局部、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、局部给药、自体细胞提取培养后回输等。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明抑制剂(如抗体、化合物、CRISPR试剂、反义序列(如siRNA)、或抑制剂)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克-10毫克/千克体重。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明首次发现，或抑制LRP5和LRP6的表达或活性、或抑制DKK1 与LRP5和LRP6复合物的形成，可预防和/或治疗肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病。
(2)本发明首次发现，本发明所预防和/或治疗的肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病为与Wnt通路无关的肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病、或Wnt正常或低表达的肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病。
(3)本发明首次发现，Dkk1蛋白通过诱导LRP5和LRP6的内吞作用，加速了肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病导致的动物死亡，同时不影响β-catenin。而小分子药物阻止了Dkk1引起的膜LRP5和LRP6下调可以完全阻止肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病，并且很好的延长了小鼠生存期。
(4)本发明首次发现，小分子药物阻止Dkk1引起的膜LRP5和LRP6下调阻止了多个GPCR信号通路的改变以及所有主要的恶病质和糖尿病伴随疾病相关的通路。
(5)本发明首次发现，肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病的发展是通过 Dkk1-LRP5和LRP6为主轴，影响GPCR信号通路并伴随炎症反应的发生。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
除非特别说明，否则本发明实施例中所用材料和试剂均为市售产品。
实验方法
恶病质研究相关实验方法:
1、细胞培养及试剂
CT26结肠癌细胞株在RPMI-1640培养基中培养，培养基中添加L-谷氨酰胺(Biosera,USA)和1％青霉素/链霉素(Corning,USA)和10％胎牛血清(Biosera, USA)。37摄氏度培养箱培养，重组小鼠Dkk1和IGFBP-4/H95P蛋白购自 Genscript.小鼠对人Dkk1单克隆抗体(mAb)是由上海三友生物制药有限公司生产。从Sigma公司购买MDC，用DMSO溶解，PBS稀释后使用。
2、癌症患者生存期分析
根据指示基因的中位数表达，将某一肿瘤类型的患者分为Dkk1高表达和低表达组。基于TCGA数据库、Oncolinc软件分析在线生成总体生存曲线，采用Kaplan-Meier生存期分析结合Log-rank显著性检验进行生存期分析。
3、肿瘤种植造模
雄性BALB/c六周龄小鼠，购自上海斯莱克实验动物有限公司，在特殊无菌环境下饲养。所有动物研究均经过福建中医药大学动物伦理委员会批准并按照美国国立卫生研究院伦理学指南进行。小鼠随机分为两组，荷瘤小鼠右侧皮下注射1*106CT26肿瘤细胞，对照组同部位注等体积PBS。每3天记录小鼠体重、食物摄入量和肿瘤体积。分别于肿瘤植入后的第15、20、25、30、40、50 天处死各组8只小鼠，检测恶病质病程的早期、中期和晚期。从CT26细胞植入后第20天气，每三天皮下注射含有12％DMSO的MDC(10mg/kg)或PBS作为对照。生存期实验从CT26细胞植入后第40天气，每三天腹腔注射PBS、 Dkk1(0.25mg/kg)、Dkk1综合抗体(0.2gm/kg)、MDC(10mg/kg)或 IGFBP-4/H95P(1.7mg/kg)，观察荷瘤小鼠生存期。在药物治疗前，随机对小鼠进行分析，以确保各组肿瘤平均体积相等。每4天用游标卡尺测量肿瘤大小、肿瘤体积的计算公式为V＝(L*W2)/2。用肿瘤密度乘以肿瘤体积估算肿瘤重量，肿瘤密度通过比较小鼠处死时肿瘤的试剂重量和肿瘤体积来确定。然后用小鼠体重减去肿瘤重量得到去瘤体重。实验终点牺牲小鼠，取材部位：股四头肌、肾脏和其他器官，同时称重。血液标本经过心脏穿刺放置于含edta的离心管中，2000rpm 4℃获得血浆样本，-80℃保存，待测。采用专为小鼠Dkk1涉及的ELISA试剂盒(R&D，USA)根据说明书测定血浆Dkk1水平。
4、肌肉注射Dkk1
野生型小鼠和β-arrestin2+/-KO小鼠左股四头肌注射(0.25mg/kg)、右腿注射等体积的PBS作为对照。与Dkk1联合注射MDC(10mg/kg)、 IGFBP-4/H95P(1.7mg/kg)或PBS作为对照，观察药物对Dkk1诱导的信号转到的影响。48小时后牺牲小鼠，取左右股四头肌，测定血浆细胞因子水平。
5、蛋白印记分析
膜蛋白是根据膜蛋白提取试剂盒(Sangon Biotech,China)说明书提取。 Westernblot分析略。用于WB分析的抗体购于Cell Signaling Technology 和Proteintech.
6、Real-time PCR分析
总RNA按说明书提取分离(Takara,Japan).比较CT法计算相对mRNA水平，归一化至对照组。
检测引物如下:
7、RNA-seq分析
总RNA采用Trizol试剂盒(Lige technology)提取，RNA测序文库采用 IIIumina文库准备协议从提取的RNA中构建，RNA-seq在lllumina HiSeq4000 平台上进行，采用两端协议，都区长度为150bp。测序读取使用hisat2(v2.1.0) 与带注释的小鼠转录本(mm10)对齐。使用GFOLD(v1.1.4)计算基因表达水平，发现差异表达基因，参数如下：GFOLD值≠0，并且两个样本的变化值≥1.35. RNA-seq数据采集仪GSE121873号上传到基因表达综合数据库中。对定义基因进行KEGG通路分析。将CT26肿瘤小鼠造模50天的股四头肌中的上调的DEGs 或注射Dkk1蛋白24小时与对照组小鼠股四头肌中DEGs分别上调和下调，经过MDC治疗的小鼠肌肉有改善。
8、统计分析
采用Graphpad Prism软件进行统计分析。结果均已±标准差表示，使用Kolmogorov-Smirnov检验分析为转换数据的正态性，采用T检验比较两组之间的差异；采用单因素方差分析比较三个火三个以上组件的差异，然后进行LSD-t 事后分析。P＜0.05为有统计学差异。
糖尿病研究相关实验方法：
1、细胞的冻存，复苏，传代及分盘
当贴壁培养的细胞汇合度达到80％，即可进行冻存、传代或者分盘。一个 10cm培养皿细胞可以冻存3管或传代3个10cm盘。细胞的冻存和复苏遵循“缓冻速溶”的原则，冻存时要梯度降温，复苏时要快速解冻。
A、细胞冻存：
(1)吸去10cm培养皿中的培养液，加入3ml PBS，轻轻摇晃培养皿。
(2)吸去PBS，加入1ml胰酶，轻轻摇晃培养皿，使胰酶完全覆盖贴壁细胞，将培养皿置于细胞培养箱中5min。
(3)取出培养皿，观察细胞是否完全变成球形或从壁上脱离，若已变圆，加入1ml完全培养基，终止胰酶消化，轻轻吹打细胞使其悬浮，收集细胞悬液到15ml离心管。
(4)室温，1000rpm，离心5min。
(5)配制冻存液(90％完全培养基+10％DMSO)，混匀后，静置冷却至室温。
(6)吸去离心后的细胞上清，先用1ml冻存液打匀细胞沉淀，再加入剩余冻存液，继续吹打混匀。
(7)将细胞悬液分装到冻存管中，1ml/管，迅速将其放入冻存盒，再放入 -80℃冰箱，48h后冻存管转移到液氮罐中永久保存。
B、细胞复苏：
(1)从液氮罐中取出细胞，在37℃水浴锅中迅速解冻。
(2)室温，1000rpm，离心5min。
(3)吸去上清，加入1ml完全培养基，打匀细胞沉淀，再转移到10cm培养皿(含有7ml完全培养基)，在培养箱中前后左右摇晃混匀，静置培养。
C、细胞传代：
(1)先按照冻存的前4步进行操作。
(2)吸去离心后的细胞上清，先用1ml完全培养基打匀细胞沉淀，再加入适量培养基，继续吹打混匀。
(3)每个10cm培养皿(含有7ml完全培养基)加入1ml细胞悬液，在培养箱中前后左右摇晃混匀，静置培养。
D、细胞分盘：
(1)先按照冻存的前4步进行操作。
(2)吸去上清，加入5ml完全培养基，吹打混匀。
(3)取100μl细胞悬液稀释10倍，再取20μl稀释液到血球计数板进行计数，数出四个大方格中的细胞数，计算平均值乘以105，得出原细胞悬液中每毫升的细胞数。
(4)每个3.5cm培养皿(含有2ml完全培养基)加入含有一定数量细胞的细胞悬液，在培养箱中混匀后，静置培养。
2、细胞的基因敲低
基因敲低(gene knockdown)是一种RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术，不同于基因敲除(gene knockout)使目标基因永久性的表达沉默，它是通过双链小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)高效特异地降解细胞内具有同源序列的mRNA，从而阻断靶基因的表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。
(1)先对3.5cm培养皿中已培养24h的HUVEC细胞换液，将完全培养基换成不含双抗、含10％FBS的培养基。
(2)一个3.5cm培养皿的转染体系配制如下：1μl siRNA Oligo/Red(原液浓度为20μM)加入含250μl纯Opti-MEM的EP管中并混匀，1.5μl RNAiMAX(转染试剂)加入含250μl纯Opti-MEM的流式管中并混匀，再将EP 管中的液体全部加入流式管中并混匀，室温静置15min。
(3)将配好的转染体系加入3.5cm培养皿中，细胞继续培养24～48h，即可收样并抽提细胞总蛋白，通过蛋白免疫印迹(Western Blotting)鉴定基因的敲低效果。
3、RNA-Seq分析
使用标准Illumina文库制备方案从提取的RNA样本构建得到转录组测序文库。在Illumina HiSeq 2000测序平台上使用阅读长度为100bp的Pair-End 方案对文库进行RNA-Seq分析。使用两个不匹配的Tophat-2.0.9将读取序列与已有的人转录组数据(hg19)进行比对。唯一的读取映射会保留在基因表达谱中。差异表达的基因通过工具Cuffdiff确定。对于每个转录本，通过计算每百万读取中来自于某基因每千个碱基长度的读取数(Reads PerKilo bases per Million reads，RPKM)来评估基因的表达水平。
4、质粒的转化、扩增大抽和细胞转染
A、质粒的转化：
(1)从-80℃冰箱中取出感受态细菌在冰上融化。
(2)打开细菌专用超净操作台的紫外灯灭菌10min，打开水浴锅加热至42 ℃。
(3)标记若干灭菌EP管，每个EP管依次加入50μl感受态菌液和2.5μl 质粒后轻轻打匀。
(4)将EP管放在冰上孵育25min，然后放入42℃水浴锅热激60s，再将其插入冰块90s。
(5)每个EP管加入1ml细菌培养基后放入37℃摇床，225rpm，摇45min。
(6)将制备好的细菌培养板(已灭菌，含Amp 1:1000)放入37℃培养箱预热。
(7)将灭菌枪头折弯，吸入菌液后均匀涂在细菌培养板上(每盘100μl)。
(8)待液体稍干后将细菌培养板倒置放入37℃培养箱中培养12～16h。
B、质粒的扩增与大抽：
(1)从细菌培养板中挑取中等大小，饱满，且没有和其他克隆接触的单克隆，接种到含3ml 2.5％LB细菌培养基(已灭菌，含Amp 1:1000)的15ml离心管中，盖子轻旋，放入37℃摇床，225rpm，摇14h。
(2)从小摇LB培养液中取1ml用作质粒小量抽提，并对小量抽提产物测序鉴定，选取阳性克隆的培养液，1:1000接种到含100～200ml 2.5％LB培养基(已灭菌，含Amp 1:1000)的大摇瓶中，放入37℃摇床，225rpm，摇14h。
(3)从大摇LB培养液中取500μl菌液和500μl 50％灭菌甘油混合，加入冻存管，记录好菌种信息，放入-20℃冰箱长期保存。
(4)将其余大摇LB培养液(菌液OD600一般在2.0～3.0之间)室温5000g，离心10min，收集菌体沉淀至灭菌50ml离心管中，并尽可能吸去上清。
(5)质粒大抽按照无内毒素质粒大提试剂盒(北京TIANGEN)的说明书在室温下进行操作。
(6)使用NanoDrop测定质粒DNA的浓度(μg/ml)和纯度(OD260/OD280)，纯度通常在1.7～1.9为佳。
C、质粒的细胞转染：
(1)先对3.5cm培养皿中已培养24h的AD293细胞换液，将完全培养基换成不含双抗、含10％FBS的培养基。
(2)一个3.5cm培养皿的转染体系配制如下：3μg质粒和9μl L-PEI(转染试剂，1μg/μl)依次加入到250μl纯Opti-MEM中并混匀，室温静置15min，然后加入到3.5cm培养皿中。
(3)转染4h后，进行换液(不含双抗、含10％FBS的培养基)，细胞继续培养24～48h，即可收样并抽提细胞总蛋白。对于表达分泌型蛋白的质粒，可以收取培养液上清，通过Western Blotting鉴定质粒的转染效果。
5、报告基因检测
报告基因检测(TOPFLASH Reporter Gene Assay)，是分析经典Wnt信号通路是否被激活及激活强度的常用方法，检测系统采用Promega公司的双萤光素酶报告基因检测系统(Dual-
Reporter(DLRTM)Assay System)。具体步骤如下：
(1)试剂准备：1×PBS；1×PLB(用ddH2O将5×Passive Lysis Buffer(PLB) 稀释后使用，母液-20℃储存，稀释后4℃储存)；LAR II Reagent(室温解冻 10ml LuciferaseAssay BufferⅡ，随后全部倒入底物冻干粉(Luciferase Substrate)中，混匀后尽快使用，避免反复冻融，96孔板每孔需100μl)； 1×Stop&
Reagent(用Stop&
Buffer将50×Stop&
Substrate 溶解于棕色Stop&
Reagent瓶中，混匀后尽快使用，避免反复冻融，96 孔板每孔需100μl)。
(2)样品准备：使用两代以内的AD293细胞在48孔板中铺盘，做3个复孔，细胞数量为30000个/孔，培养基为300μl/孔，过夜贴壁后，我们以考察LRP6 或β-catenin敲低是否会抑制Wnt3a激活的经典Wnt通路为例，进行如下操作。
先进行基因敲低，每孔的转染体系配制如下：0.4μl LRP6或β-catenin 的siRNAOligo(使用Annealing Buffer将0.4μl Oligo按1:1至1:32倍比稀释为6个浓度梯度)/Red(Red为对照)加入20μl纯Opti-MEM中并混匀，0.6 μl RNAiMAX(转染试剂)加入20μl纯Opti-MEM中并混匀，将两者进一步混匀，室温静置15min，全部加入培养基中。
24h后进行质粒转染，每孔共转染质粒160ng，Fugene(转染试剂)0.48 μl/孔，Opti-MEM 8μl/孔。160ng的质粒包含40ng SP-TOP(Tcf/Lef-luc) 报告基因表达载体和1ngRenilla海肾萤光素酶表达载体，以及1ng Wnt3a 质粒或GFP质粒(检测转染效率)，最后用Vector补齐至160ng，全部加入培养基中，细胞继续培养24h后，进行细胞裂解：先去除48孔板中的培养基；用1×PBS清洗AD293细胞，去除清洗液；将1×PLB加入48孔板，65μl/孔，将细胞充分裂解混匀。
(3)上机操作和数据处理：检测用96孔板每孔内加入上述细胞裂解液20 μl。通过Promega公司的
96Microplate Luminometer和Dual-
Luciferase AssaySystem依次得到萤火虫荧光素酶(Photinus Pyralis Luciferase)和海肾萤光素酶(Renilla Reniformis Luciferase)的表达情况。先将萤光素酶检测试剂II(LuciferaseAssay Reagent II，LAR II)加入样品中，100μl/孔，萤火虫萤光素酶产生的光信号持续至少1min。定量萤火虫萤光强度后，再加入Stop&
Reagent，100μl/孔，终止萤火虫萤光的同时启动海肾萤光素酶反应，在完成两种萤光素酶的检测后，根据海肾萤光素酶数据对萤火虫荧光素酶数据做归一化处理。
6、特定基因型的转基因小鼠
A、含UBC-Cre的转基因小鼠
通过将Cre重组酶基因与两个雌激素受体(estrogen receptor，ER)的配体结合区(ligand-binding domain，LBD)进行融合，产生一种嵌合重组酶 (mER-Cre-mER)，该嵌合重组酶的表达受特异的泛素C(ubiquitin C，UBC)启动子的控制。泛素蛋白存在于所有真核细胞之中，因此，Cre重组酶能在全身的组织和器官表达。Cre重组酶能与loxP位点结合，有效切除两个loxP位点间的序列，实现基因敲除。但是嵌合的Cre不能自发地进入细胞核内发挥其活性，只有结合雌激素后才能入核。为避免内源性雌激素引起的非特异性基因敲除，对雌激素LBD的关键氨基酸进行突变，使其不能与体内的生理性雌激素结合，而只能与外源性的雌激素类似物他莫昔芬(Tamoxifen)结合，从而实现了Cre 重组酶时间和空间的双重表达。以上就是UBC-Cre小鼠的转基因特点。
B、可诱导LRP5/6或β-catenin全身敲除的转基因小鼠
LRP5floxp/floxp，LRP6floxp/floxp和β-cateninfloxp/floxp这三种纯合型小鼠的构建方法类似，例如，LRP5floxp/floxp或LRP6floxp/floxp纯合型小鼠，首先是通过基因打靶(genetargeting)和同源重组(homologous recombination)在基因组中LRP5或LRP6基因区域的两侧各插入1个loxP位点，筛选得到含有floxp-LRP5-floxp或floxp-LRP6-floxp位点的转基因小鼠，然后将其分别与野生型(wild-type，WT)小鼠交配及回交繁殖，最终得到LRP5floxp/floxp或LRP6floxp/floxp纯合型小鼠[131]。同理，可以获得β-cateninfloxp/floxp纯合型小鼠[134]。本研究中用到的LRP5floxp/floxpLRP6floxp/floxp转基因小鼠是将LRP5floxp/floxp和LRP6floxp/floxp小鼠继续进行交配繁殖而得。
接下来，如图20所示，我们通过LRP5floxp/floxpLRP6floxp/floxp纯合型小鼠与上述UBC-Cre小鼠进行配种繁殖产生可诱导LRP5和LRP6全身共敲除的转基因小鼠，利用Cre重组酶的特性，经他莫昔芬诱导后的小鼠基因型表示为LRP5/6-/-(LRP5/6 double knockout)。同理，也可以获得条件性β-catenin全身敲除的转基因小鼠，其敲除后的基因型表示为β-catenin-/-(β-catenin knockout)。本研究中，我们分别对UBC-Cre-LRP5/6floxp/floxp纯合型小鼠、UBC-Cre-β-cateninfloxp/floxp纯合型小鼠和Ubc-Cre阳性小鼠(对照组)腹腔注射1％他莫昔芬(30mg/kg/day)，连续注射5 天，继续等待1周或4周后，Western Blotting检测小鼠心脏的LRP5/6或β-catenin的敲除效果，发现相较于对照组小鼠，LRP5/6-/-小鼠的心脏LRP5/6和β-catenin-/-小鼠的心脏β-catenin的蛋白表达水平均显著降低(如图17(A)和图20所示)，表明他莫昔芬诱导作用是成功的，可以对LRP5/6-/-和β-catenin-/-小鼠用做进一步的研究，如1型糖尿病造模。
C、可诱导LRP6N全身过表达的转基因小鼠
转座子系统是一种高整合效率、高目的基因表达概率、适合较大目的片段插入的转基因模式动物制作系统。转座子特有的“剪切和粘贴”机制，使DNA片段在载体和基因组之间能“自由”的转移，从而有效介导外源DNA片段对基因组的整合。转座时，转座酶有效地识别载体中目的片段两端的特异转座子序列(ITRs)，与转座子末端结合形成短暂的发夹结构，“剪切”后脱离载体，“粘贴”至基因组的特异性位点。具体地，将构建好的含有转座子系统和CAG promoter-floxp-stop codon-floxp-LRP6N-myc cDNA片段的基因载体和CMVpromoter-transposase的表达载体通过显微注射技术，进行小鼠受精卵细胞核DNA显微注射，注射后的受精卵移植到假孕小鼠生殖系统中，使其怀孕并获得新生小鼠，采集尾尖，提取DNA，利用PCR进行鉴定，筛选制备出转座子介导的携带LRP6N基因片段的转基因小鼠(CAG-floxp-stop codon-floxp-LRP6N)。
CAG是一种高效的合成启动子，常用于哺乳动物的表达载体中驱动基因的高水平表达。CAG中含有CMV的早期增强子，β-actin的启动子及β-珠蛋白的剪接受体[138]。上述转基因小鼠的LRP6N在正常情况下并不表达，只有与相应的组织特异性Cre表达阳性的小鼠杂交后，因Stop终止密码子(stop codon)在特定组织中被Cre删除，从而CAG的β-actin启动子能够让LRP6N基因片段在特定组织中实现表达。因此，如图21所示，我们将含有LRP6N基因的小鼠(CAG-floxp-stop codon-floxp-LRP6N)与上述UBC-Cre小鼠[133]交配，繁殖出他莫昔芬可诱导的全身过表达LRP6N的转基因小鼠，诱导后的小鼠表示为LRP6N/Tg。本研究中，我们对UBC-Cre-STOPfloxp/floxpLRP6N小鼠腹腔注射1％他莫昔芬(30mg/kg/day)，连续注射5天，继续等待4周后，Western Blotting检测发现，相较于UBC-Cre阳性小鼠(对照组)，LRP6N/Tg小鼠在心脏中有LRP6N蛋白的过表达(如图18(A，B) 和图21所示)，表明他莫昔芬诱导作用是成功的，可以对LRP6N/Tg小鼠用做进一步的研究，如1型糖尿病造模。
D、Leptin基因敲除小鼠
Leptin基因敲除小鼠(Leptin knockout mice，Leptin-/-mice，ob/ob mice) 是一种自发产生肥胖表型的纯合子小鼠，常作为研究2型糖尿病的动物模型，4周时可以看到肥胖表型，6周时出现显著高血糖(浓度高于13.8mM)和糖耐量受损症状。Leptin(瘦素)是由脂肪组织分泌的蛋白质类激素，参与调节体内的糖、脂肪及能量代谢，促使机体减少摄食，增加能量释放，抑制脂肪细胞的合成，进而使体重减轻[139]。Leptin-/-小鼠由于缺乏瘦素配体，食欲旺盛，体重会迅速增加，导致脂肪沉积和病态肥胖，体重可达WT小鼠的三倍，且不受饮食限制的影响。除上述表现外，Leptin-/-小鼠还具有胰岛素抵抗，生殖力降低，代谢减退，创伤愈合能力受损及垂体和肾上腺激素水平升高等特点。由于Leptin-/-小鼠不育，故Leptin-/-小鼠均由Leptin+/-小鼠交配产生。
7、小鼠基因型鉴定
A、组织基因组DNA抽提：
(1)剪脚趾给小鼠标记序号，并将剪下的脚趾放入EP管，用于基因组DNA提取，每次剪完脚趾的剪刀要用酒精棉球擦拭干净，避免基因组的交叉污染。
(2)加入裂解液，50mM NaOH 200μl/管，完全覆盖样品，在金属浴锅100 ℃煮1h，30min时拿出来小心弹打，将组织和裂解液充分混合，使组织尽可能被煮烂并释放出基因组DNA，注意盖紧EP管盖子，防止裂解液蒸发。最后，检查脚趾是否被NaOH完全裂解，对于未充分裂解的组织，需适当延长裂解时间。
(3)溶解完全后，1000g，离心1min，加入Tris-HCl(pH 8.0)20μl/管以中和裂解液，Vortex震荡混匀后，进行基因型鉴定。
B、普通PCR反应：
(1)普通PCR反应体系配制如下：
(2)将加好反应体系的8联管瞬时离心，放入PCR仪，按如下所示的不同转基因小鼠的PCR反应条件设置好反应程序，进行PCR扩增。
(2.1)UBC-Cre小鼠：
(2.2)LRP5floxp/floxp、LRP6floxp/floxp或β-cateninfloxp/floxp小鼠：
(2.3)STOPfloxp/floxpLRP6N小鼠：
(2.4)Leptin-/-小鼠：
C、PCR反应产物琼脂糖核酸电泳，鉴定小鼠基因型：
(1)根据欲分离DNA片段大小用1×TAE缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖溶液。在微波炉内加热熔化，冷却片刻，加入一滴荧光染料(Gel-Red)，旋转混匀后，倒入制胶平板中，室温下，待溶液凝固。
(2)完全凝固，小心拔出梳子，上样孔一侧靠近负极，放入电泳槽内。使电泳槽中的1×TAE缓冲液完全没过胶面，避免孔内产生气泡。向孔内点样，10μl/ 孔，根据被鉴定的DNA条带大小选择对应分子量范围的DNA Marker。
(3)打开电源，开始电泳。一般电压为60～100V，电泳20～40min即可。
(4)电泳完毕，关闭电源。在核酸成像仪上使电泳条带成像，根据DNA Marker 判断条带大小，确定小鼠基因型。特定基因型小鼠的条带大小参见下表：
8、二维超声心动图
本研究使用VisualSonics Vevo 2100成像系统进行二维超声心动图检测。提前对小鼠的左胸部进行脱毛，用1％异氟烷通过汽化器将小鼠麻醉，同时补给氧气。需检测的反映左心室功能的物理指标包括舒张末期左心室内径(left ventricular internaldimension in end-diastole，LVIDd)、舒张末期左心室后壁厚度(left ventricularposterior wall in end-diastole，LVPWd)、舒张末期室间隔厚度 (interventricularseptum in end-diastole，IVSd)(即在左心室体积最大期间测量)，收缩末期左心室内径(left ventricular internal dimension in end-systole，LVIDs)(即在左心室后壁收缩程度最大期间测量)。左心室容量的计算方法为Teichholtz校正公式：V＝[7.0/(2.4+D)]×D3，计算舒张末期左心室容积(left ventricular end-diastolic volume，LVEDV)的D代表LVIDd，计算收缩末期左心室容积(left ventricular end-systolic volume，LVESV)的D代表LVIDs。左心室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)的计算公式为：EF ＝(LVEDV-LVESV)/LVEDV×100％，左心室短轴缩短率(left ventricular fractionalshortening，LVFS)的计算公式为：FS＝(LVIDd-LVIDs)/LVIDd×100％。
9、1型糖尿病小鼠造模
STZ诱导糖尿病发病是一种化学性糖尿病造模的方法，其全称为链脲佐菌素(Streptozotocin)，是一种从无色链霉素分离出来的广谱抗生素，它能够在短时间内选择性损伤胰岛β细胞，引起β细胞坏死，导致血胰岛素不同程度下降伴血糖升高，形成胰岛素依赖型的1型糖尿病。和其他化学性糖尿病造模方法如四氧嘧啶 (Alloxan，ALX)造模相比，STZ引起的糖尿病高血糖反应及酮症均较缓和，所致糖尿病模型也较稳定。本研究中，我们对小鼠腹腔注射STZ诱导建立1型糖尿病模型，使用电子秤测量小鼠体重，使用便携式血糖仪从小鼠尾端采血，测量其血糖浓度。成模标准是非空腹血糖值高于13.8mM(250mg/dl)。造模步骤如下：
(1)将8周龄野生型雄性小鼠按照随机化原则分组，进行脚趾标记，测量体重和随机血糖。
(2)造模前，对小鼠禁食12h，但不禁水。
(3)配制2％STZ-柠檬酸溶液，即2g STZ粉末溶解于100ml柠檬酸缓冲液(0.05 M，pH 4.5)，混匀成为淡黄色透明液体。STZ在室温下极不稳定，易升华，操作应在冰上进行，所配溶液需注意避光，并及时使用。
(4)按照所称体重，造模组小鼠一次性腹腔注射2％STZ-柠檬酸溶液(160 mg/kg)，对照组小鼠一次性腹腔注射相应体积的柠檬酸缓冲液，注射完成2h后，恢复小鼠进食。
(5)在注射后的不同时间点测量体重和随机血糖，并将小鼠麻醉，取材。
10、葡萄糖耐量测试
葡萄糖耐量测试(glucose tolerance test，GTT)是显示机体对外源葡萄糖从血液中清除效率的一个标准测试，用以评估体内糖代谢平衡的维持情况。细胞从血液中吸收葡萄糖受到胰岛素的调节，胰岛素抵抗会导致糖耐量异常，即相比正常机体，需要更长时间来清除葡萄糖含量。本研究中，Leptin-/-和WT小鼠从4周龄开始，连续每周同一时间测量其体重和空腹6h血糖。根据Leptin-/-小鼠的体重和血糖变化，我们选取6周龄Leptin-/-小鼠(实验组)和WT小鼠(对照组)进行葡萄糖耐量测试。具体步骤如下：
(1)对小鼠禁食12h(不禁水)，称量体重，尾端采血测定基础血糖水平。
(2)用灭菌PBS配成20％和30％D-葡萄糖溶液，并用0.45μm滤器过滤。
(3)按照所称体重，用20％D-葡萄糖溶液对WT小鼠进行腹腔注射，用30％D- 葡萄糖溶液对Leptin-/-小鼠进行腹腔注射，剂量均为2g/kg。
(4)在注射后的不同时间点(15、30、60、90、120、240min)，尾端采血测量小鼠血糖浓度。
11、胰岛素体内拯救
胰岛素体内拯救实验是对STZ诱导1周的糖尿病小鼠皮下注射长效甘精胰岛素(Insulin Glargine)或相应体积的生理盐水(对照组)。具体步骤如下：
(1)取出胰岛素注射笔，室温放置3h，恢复胰岛素生物活性。连接好注射笔专用针头，小心挤出10μl胰岛素液体(最小单位剂量体积)。用移液枪小心吸出，分装在EP管，2μl/管。使用前，每个EP管加入998μl灭菌生理盐水，将胰岛素浓度稀释为0.0002U/μl(原液浓度为0.1U/μl)，配好后应及时使用。
(2)将STZ造模1周的小鼠按照随机化原则分组，测量体重和随机血糖。
(3)按照所称体重，胰岛素拯救组皮下注射稀释好的胰岛素(1U/kg/day)，每天同一时间注射一次，连续注射7天，对照组为相应体积的生理盐水。
(4)在胰岛素干预的不同时间点测量体重和随机血糖，并将小鼠麻醉，取材。
12、MDC体内拯救
STZ糖尿病小鼠的MDC体内拯救实验是对STZ诱导3天的糖尿病小鼠腹腔注射 MDC(灭菌PBS稀释，10mg/kg/day)，每天同一时间注射一次，注射相应体积DMSO(灭菌PBS稀释)的糖尿病小鼠作为对照组。在注射后的不同时间点测量体重和随机血糖，待MDC连续干预4天后，将小鼠麻醉，取材。
Leptin-/-小鼠的MDC体内拯救实验是预先对6周龄Leptin-/-小鼠腹腔注射 MDC(灭菌PBS稀释，10mg/kg)或者相应体积的DMSO(灭菌PBS稀释)，Leptin-/-小鼠MDC的注射剂量应根据6周龄同窝出生的WT小鼠的体重计算而得。MDC干预1h 后，腹腔注射50％D-葡萄糖或者相应体积的PBS。Leptin-/-小鼠注射D-葡萄糖的程序是，24h期间每隔2h注射一次，共计12次，每次D-葡萄糖的注射剂量固定为首次使用剂量(2g/kg)。注射结束，将小鼠麻醉，取材。
Dkk1纯化蛋白局部注射心脏合并MDC干预的实验，选取10周龄野生型雄性小鼠，对其左胸部进行脱毛，并腹腔注射MDC(灭菌PBS稀释，10mg/kg)或者相应体积的DMSO(灭菌PBS稀释)，以后每天同一时间注射一次。MDC干预1h后，进行心脏Dkk1蛋白注射。先使用1％异氟烷给小鼠持续吸入麻醉，并使用呼吸机供氧，然后打开小鼠近胸骨端第四肋间隙，暴露出心脏。使用200μl微量注射器，在心脏的三个位点局部注射Dkk1(每颗心脏Dkk1用量为10μg，溶解于30μl PBS)或者等体积PBS。其中，两个位点在左心室周围的边界，一个位点进入左心室的心肌。注射结束，缝合伤口，撤去麻醉，等待小鼠苏醒。待MDC连续干预2天后，将小鼠麻醉，取材。
除了给心脏单独注射Dkk1蛋白外，我们还需要进行Dkk1联合BIM-46187局部注射小鼠心脏的实验。根据实验分组，分为四种不同溶液的心脏注射，包括PBS， Dkk1，BIM-46187以及Dkk1与BIM-46187的混合液。每颗心脏Dkk1用量为10μg， BIM-46187用量为2.4μg，使用30μl PBS稀释后进行心脏注射，具体操作步骤同上。注射结束，缝合伤口，撤去麻醉，等待小鼠苏醒。待注射2天后，将小鼠麻醉，取材。
13、LRP6N质粒尾静脉注射
本研究中使用的LRP6N质粒(带myc标签)需要事先进行鉴定，即通过体外转染AD293细胞，随后收取细胞的上清培养液，使用Western Blotting检测证明LRP6N 质粒能够表达出分泌型LRP6N蛋白之后，再进行以下质粒尾静脉注射的操作。试剂准备：①Hepes溶液(50mM，pH 7.4，0.22μm过滤)；②D-葡萄糖溶液(50％，0.22 μm过滤)；③L-PEI溶液(1mg/ml，pH 5.0，0.22μm过滤)。具体方法：先将50 μg LRP6N或Vector质粒溶于100μl含有5％D-葡萄糖的Hepes溶液中，室温静置10min。再缓慢加入65μl L-PEI到上述溶液中，迅速混匀。室温孵育10min，将混合物通过尾静脉注射到小鼠体内。前期我们发现，小鼠尾静脉注射荧光素酶 (luciferase)质粒1天后，再经尾静脉给予荧光素底物(luciferin)，通过小动物活体成像仪观察全身的荧光素酶活性，其在肺脏、肝脏及脾脏处均有表达，且肺部表达水平最高。因此，我们选取肺脏来观察LRP6N质粒在尾静脉注射后不同时间的表达情况。WesternBlotting证明LRP6N质粒表达的分泌型LRP6N蛋白能在体内持续表达至少6天。LRP6N质粒尾静脉注射应在STZ诱导1天后进行，在STZ造模 7天后，测量体重和随机血糖，并将小鼠麻醉，取材。
14、小鼠取材
(1)2％戊巴比妥钠腹腔注射将小鼠麻醉(45mg/kg)。
(2)腹部朝上四肢固定在操作台，剑突下横向剪开上腹部，暴露肝脏，用止血钳提起剑突，剪开膈肌进入胸腔，沿剑突两侧剪断肋骨，向头侧掀开，暴露心脏。
(3)使用1ml注射器快速穿刺右心耳抽取适量血液放入EDTA抗凝管中。
(4)找到心尖部并用镊子提起，将灌流针刺入心尖部，用止血钳固定针尖，剪开右心耳，开始心脏灌流。
(5)生理盐水灌注：迅速将灌注泵的导管放入生理盐水中，开始灌流，直到从右心耳流出的液体为无色，同时小鼠肝脏色淡，四肢发白，肠管肿胀为止。
(6)多聚甲醛灌注：接着将灌注泵的导管小心移至4％多聚甲醛中，开始灌流。如看到小鼠四肢突然紧张，尾部卷曲，组织器官逐渐变硬，即达到固定效果。
(7)取材并进行器官称重。进一步处理：对于蛋白或RNA抽提的组织样本，生理盐水灌注完毕后，液氮迅速冷冻，-80℃保存；对于制作冰冻切片的组织样本，生理盐水灌注完毕后，吸干附着在样本上的液体，直接用OCT包埋好，再用液氮迅速冷冻，-80℃保存；对于制作石蜡切片的组织样本，4％多聚甲醛灌注完毕后，再取下标本放入4％多聚甲醛中，4℃摇床上继续固定24h，用于后续的石蜡包埋和切片染色。
15、细胞和组织的蛋白抽提
细胞和组织的总蛋白抽提
(1)按下表配制总蛋白抽提的裂解液，配好混匀后放在冰上：
| 成分 | 用量(1000μl体系) |
| RIPA(2×) | 500μl |
| 蛋白酶抑制剂(100×) | 10μl |
| NaF(0.5M) | 100μl |
| β-Glycerophosphate(0.5M) | 40μl |
| Na<sub>3</sub>VO<sub>4</sub>(0.2M) | 5μl |
| ddH<sub>2</sub>O | 345μl |
(2)3.5cm培养皿中的贴壁细胞汇合度达到90％可用于总蛋白抽提。先用吸管吸掉培养液，再用PBS洗两遍，吸干PBS残液后，置于冰上。
(3)每个细胞样品加入150μl总蛋白裂解液，使裂解液和细胞充分接触，用刮子刮下细胞裂解液收集到预冷EP管中，冰浴15min。
(4)每100mg组织加入500μl预冷灭菌PBS(含终浓度为1mM的蛋白酶和磷酸化酶抑制剂)，在PBS中尽可能将组织块剪碎。4℃，12000rpm，5min，弃PBS 上清，保留沉淀。再向每个样品加入150μl总蛋白裂解液，使用匀浆器在冰上将组织沉淀充分匀浆，冰浴15min。
(5)4℃，14000g，10min，小心收集总蛋白上清液到新的EP管，-80℃保存备用。
细胞和组织的膜蛋白抽提
(1)分别向膜蛋白抽提A液和B液加入PMSF(终浓度为1mM)。
(2)3.5cm培养皿中的贴壁细胞汇合度达到90％可用于膜蛋白抽提。先用吸管吸掉培养液，再用PBS洗两遍，吸干PBS残液后，置于冰上。
(3)每个样品加入500μl预冷灭菌PBS(含终浓度为1mM的PMSF)，用刮子刮下细胞收集到预冷EP管中。在PBS中尽可能将组织块剪碎。
(4)4℃，12000rpm，5min，弃PBS上清，保留沉淀。
(5)每个样品加入100μl(细胞)或200μl(组织)A液，用移液枪将细胞沉淀重悬，使沉淀完全散开。组织沉淀需用匀浆器在冰上将其充分匀浆，冰浴15min。
(6)先用液氮将样品迅速冻结，然后放入37℃水浴锅，当样品融化到几乎没有冰晶时取出，反复冻融3～5次，勿使样品融化过度，结束后放回冰上。
(7)最高速Vortex 5s，4℃，700g，10min，小心收集上清液到新的EP管，勿触及沉淀。
(8)步骤“7”的上清液继续离心，4℃，14000g，30min，小心收集上清液到新的EP管，勿触及沉淀，抽提得到浆蛋白，-80℃保存备用。
(9)4℃，14000g，1min，尽可能吸尽上清，保证膜蛋白不被混入浆蛋白成分。
(10)每个样品加入50μl(细胞)或100μl(组织)B液，最高速Vortex 10s 重悬沉淀，冰浴10min，重复2次，以充分抽提膜蛋白。
(11)4℃，14000g，5min，小心收集上清液到新的EP管，抽提得到膜蛋白， -80℃保存备用。
细胞和组织的核蛋白抽提
(1)分别向浆蛋白抽提A液和核蛋白抽提液加入PMSF(终浓度为1mM)。
(2)3.5cm培养皿中的贴壁细胞汇合度达到90％可用于核蛋白抽提。先用吸管吸掉培养液，再用PBS洗两遍，吸干PBS残液后，置于冰上。
(3)每个样品加入500μl预冷灭菌PBS(含终浓度为1mM的PMSF)，用刮子刮下细胞收集到预冷EP管中。在PBS中尽可能将组织块剪碎。
(4)4℃，12000rpm，5min，弃PBS上清，保留沉淀。
(5)每个细胞样品：加入200μl A液。每个组织样品：A液和B液按体积比 20:1混匀(含终浓度为1mM的PMSF)配成200μl组织匀浆液加入组织中。
(6)最高速Vortex 5s，使沉淀完全散开。组织沉淀需用匀浆器在冰上将其充分匀浆，冰浴15min。
(7)组织：4℃，1500g，5min。吸上清到预冷EP管，抽提得到部分浆蛋白。组织沉淀接着从步骤“5”开始按照细胞的处理方法进行浆、核蛋白的抽提。
(8)每个样品加入10μl B液。最高速Vortex 5s，冰浴1min。
(9)最高速Vortex 5s，4℃，14000g，5min。
(10)吸上清到预冷EP管，勿触及沉淀，抽提得到浆蛋白，-80℃保存备用。组织抽提得到的浆蛋白可以和步骤“7”中的浆蛋白合并。
(11)完全吸尽残余上清，每个样品加入50μl核蛋白抽提液。
(12)最高速Vortex 30s，使沉淀完全散开，放回冰上，每隔2min再高速 Vortex30s，共持续30min。
(13)4℃，14000g，10min。
(14)吸上清到预冷EP管，抽提得到核蛋白，-80℃保存备用。
蛋白浓度的测定与校准
A、蛋白浓度的测定采用BCA法，具体步骤如下：
(1)冰上溶解混匀待测蛋白样品，96孔板每孔先加入18μl ddH2O，再加入2 μl样品，空白孔只加入20μl ddH2O。每个样品做2个复孔。
(2)蛋白浓度测定A液和B液按体积比50:1配制蛋白浓度测定液，200μl/ 孔，将96孔板轻轻摇动混匀，放入37℃恒温箱孵育30min。
(3)取出96孔板，以空白孔调零，在562nm波长读取各孔的OD值。
B、蛋白浓度的校准采用相对定量法，具体步骤如下：
(1)OD值最小的样品体积(aμl)作为校准体积，其他样品的配平体积为[最小 OD值×aμl]/其他样品OD值，再用ddH2O补齐其他样品体积至校准体积(aμl)，从而将每个样品的OD值都调至最小OD值样品的水平。
(2)每个样品中加入0.25倍蛋白液体积的5×上样缓冲液并混匀，100℃金属浴锅中煮5min，短暂离心后，-80℃保存备用。
16、蛋白免疫印迹
A、配制SDS-PAGE凝胶：
蛋白电泳凝胶为双层胶，包括上层的浓缩胶和下层的分离胶。浓缩胶浓度为 5％，分离胶浓度根据目的蛋白分子量的大小确定。本研究中大分子量蛋白(LRP5/6，β-catenin，β-arrestin1/2)使用8％-5％双层胶，小分子量蛋白(γH2AX，p53， p21，Bcl-2，Bax，Cleaved Caspase-3)使用12％-5％双层胶。另外，根据蛋白样品的上样数量和体积选择配制凝胶的孔数(10孔或15孔)和厚度(1mm或1.5mm)。凝胶配方见实验材料部分，配制步骤如下：
(1)用自来水将玻璃板冲洗干净，烘箱烘干后，放入配胶架，防止底部漏液。
(2)先配制分离胶，依次加入ddH2O、30％Acrylamide、Tris-HCl、10％SDS、 10％APS、TEMED，混匀后进行注胶，每块胶用量7.5ml，避免产生气泡，最后再加正丁醇压平液面，让其凝固30min。
(3)再配制浓缩胶(方法同分离胶)，每块胶用量2ml，避免产生气泡，迅速插入干净的成孔梳子，让其凝固30min。
B、蛋白电泳：
通过蛋白分子量及电荷量的差异，导致不同的蛋白分子在电泳凝胶内的移动速度不同，从而使各种蛋白分子在凝胶中区分开来。具体步骤如下：
(1)将配制好的凝胶夹入夹子，放入电泳槽中，倒入1×电泳缓冲液，完全浸没凝胶的上样孔，轻轻取下成孔梳子，避免胶孔变形。
(2)冰上溶解混匀蛋白样品，100℃金属浴锅中煮5min，短暂离心后放回冰上，准备上样。
(3)上样：将所有蛋白样品按记录好的上样顺序排好，移液枪吸取等量样品加入胶孔中。上样时，枪头贴着较高侧玻璃，沿孔道所在位置尽量放低，遇到阻力时即可滴加，由于样品含上样缓冲液，故样品液可以自行沉入孔底；每完成一次上样，为避免交叉污染，需更换新枪头进行下一次上样；上样量要适中，10孔胶每孔最多40μl，15孔胶每孔最多20μl。上样结束后，在上样两侧的孔内各加入适量预染蛋白Marker(左侧8μl，右侧4μl)，通过Marker颜色的深浅方便分辨上样的左右顺序。
(4)电泳：盖上电泳槽盖子，接通电源，室温下开始电泳，设置电泳条件：先 80V，30min，待样品跑下浓缩胶并压成一条水平直线后(通过溴酚蓝来判断)，再 120V，90min，使Marker中不同分子量的染料在凝胶中分离开，根据Marker的分子量大小，判断不同大小的蛋白分子在凝胶中是否充分分离开，适时终止电泳，准备电转。
C、凝胶电转：
大于20kDa的目的蛋白转膜选用0.45μm的PVDF膜，小于20kDa则选用 0.2μm的PVDF膜。PVDF膜需用甲醇处理，以活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电的蛋白结合。具体步骤如下：
(1)预冷的1×电转缓冲液倒入电转槽中，转膜夹板及其内容物浸泡在1×电转缓冲液中备用。
(2)按照凝胶大小(5.5×8.5cm2)准备好PVDF膜，剪角做好标记，以区分膜的正反面，在甲醇中活化1min后，放入1×电转缓冲液中备用。
(3)电泳结束后，胶板用水冲洗干净，并用刮板撬开，取下凝胶，打开转膜夹板，按照海绵衬垫→滤纸→凝胶→PVDF膜→滤纸→海绵衬垫的排列顺序，将内容物放入转膜夹板黑面的正中位置上，并轻轻压平，合上转膜夹板的白面。插入电转槽(黑面对黑面，白面对红面)，补满电转缓冲液。转膜过程中，应避免PVDF膜和凝胶之间产生气泡，可用刮板轻轻赶走间隙中的微小气泡。
(4)电转：电转槽放入冰块中，盖上电转槽盖子，接通电源开始电转，设置电转条件：100V，120min。电转过程中，如发现电流过大或电转缓冲液过热，应及时更换新预冷的电转缓冲液，防止因过热导致转膜失败。
D、封闭：
封闭液(5％脱脂牛奶)能够和PVDF膜上的非特异性结合位点结合，降低PVDF 膜的背景，确保一抗与目的蛋白的特异性结合。具体步骤如下：
(1)电转结束后，打开转膜夹板，用镊子取出PVDF膜，迅速放入封闭液中，室温下，摇床缓慢摇动1h。
(2)洗膜。倒掉封闭液，PVDF膜放在摇床上，用TBST洗三次，每次5min，洗好后准备一抗孵育。
E、抗体(一抗和二抗)孵育：
通过孵育一抗，PVDF膜上的蛋白质或多肽与对应的一抗起特异性免疫反应，然后通过孵育二抗(辣根过氧化物酶(HRP)标记)，使一抗与二抗相结合，经过曝光液底物与二抗连接的HRP发生级联放大反应，显示出能被检测到的化学发光的蛋白条带，从而能够判断特异性目的蛋白的表达水平。具体步骤如下：
(1)一抗的稀释：一抗使用前先要短暂离心，用一抗稀释液按抗体说明书推荐的倍数稀释一抗原液。
(2)一抗的孵育：根据Marker的大小，将PVDF膜剪出包含所孵育目的蛋白分布的相应部位，不同的目的蛋白要使用其对应的特异性一抗进行孵育。孵育时间取决于抗体与蛋白的亲和性及蛋白的含量丰度。将稀释好的一抗和PVDF膜(有蛋白分布的一面朝上)一起放在孵育盒内，使膜均匀覆没，让一抗与膜能够均匀结合。4 ℃，缓慢摇动摇床，进行过夜孵育。亲和性或者浓度较低的蛋白样品，建议使用较高的抗体稀释浓度和较长的孵育时间(一般不超过18h)来保证其特异性结合。
(3)洗膜：回收孵育后的一抗到离心管(一般重复利用三次)，4℃保存。PVDF 膜放在摇床上，用TBST洗三次，每次5min，洗好后准备二抗孵育。
(4)二抗的稀释：二抗使用前先要短暂离心，用TBST按抗体说明书推荐的倍数稀释二抗原液。
(5)二抗的孵育：将稀释好的二抗和PVDF膜(有蛋白分布的一面朝上)一起放在孵育盒内，室温下，缓慢摇动摇床，孵育1～2h。
(6)洗膜。倒掉二抗(不回收)，PVDF膜放在摇床上，用TBST洗三次，每次5min，洗好后准备曝光显影。
F、曝光显影：
蛋白条带的显影采用化学发光法。二抗连接的HRP是一种高灵敏度酶，可以催化ECL曝光液底物产生一种发光物质，曝光机能将发光信号转化为图片上的条带灰度信号，条带灰度能够反映目的蛋白的表达水平。具体步骤如下：
(1)配制曝光液：将ECL曝光A液和B液等体积混匀，并用锡箔纸避光。
(2)将PVDF膜上的TBST用纸吸干，平放在一层透明薄膜上(有蛋白分布的一面朝上)，将曝光液均匀敷在膜上，反应1min左右，吸走曝光液，将薄膜放置在曝光机的镜头正下方，调整好视野，使用Quantity One 4.4软件对PVDF膜进行曝光，目的蛋白的曝光条件会因抗体效价不同而各异，需要自行摸索最佳的参数。最后将曝光数据导出TIFF图片格式保存，必要时可使用Image-Pro Plus 6.0软件进行蛋白条带的灰度值定量分析。
17、总RNA抽提和实时定量PCR
A、总RNA抽提：
样品收集之后，最好立刻进行总RNA制备。若不能及时抽提，应使用液氮将其冷冻后，-80℃保存。在组织RNA抽提时，应以液氮研磨的方式迅速破碎样品，勿先行解冻，以免内源性RNA酶引起RNA降解。此外，为防止RNA在提取过程中被外源性RNA酶降解，注意使用去RNA酶的枪头和EP管；研磨工具需要高温高压灭菌后使用；戴好一次性口罩和手套；操作时避免讲话等。
(1)每50～100mg组织加入1ml Trizol对液氮研磨后的样品进行裂解，用移液枪反复吹打以裂解组织样品。
(2)将Trizol裂解液转入EP管，室温放置5min。
(3)每1ml Trizol加入0.2ml三氯甲烷，盖上EP管盖子，在手中用力震荡 15s，室温放置3min后，12000g，4℃，15min。
(4)取上层水相置于新的EP管中，每1ml Trizol加入0.5ml异丙醇，上下颠倒混匀，室温放置10min，12000g，4℃，10min，弃上清，保留沉淀。
(5)每1ml Trizol加入1ml用DEPC水配制的75％乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g，4℃，5min，弃上清，保留沉淀。同样操作再洗一次，共两次。
(6)让沉淀的RNA在室温下自然干燥。
(7)加入50μl DEPC水，冰上放置5～10min，使沉淀溶解，抽提得到RNA。
(8)使用NanoDrop测定RNA样品的浓度(μg/ml)和纯度(OD260/OD280)，纯度通常在1.8～2.0为佳。
B、实时定量PCR：
(1)去除RNA样品中的基因组DNA(gDNA)。按下表冰上配制反应液，按反应数 +2的量配制Master Mix，再分装到每个反应管中，最后加入RNA样品。反应液在 42℃，反应2min，结束后，冰上保存，得到的去gDNA的RNA用于反转录。
(2)反转录反应。按下表冰上配制反应液，按反应数+2的量配制Master Mix，再分装到每个反应管中，轻柔混匀。反应液在37℃，反应15min；85℃，反应5s，结束后，冰上保存，得到的cDNA模板用于SYBR Green qPCR反应。
(3)制备PCR反应体系。按下表冰上配制反应液，建议20μl反应液中cDNA 模板用量所相当于的RNA样品不要超过100ng。
(4)上机检测和结果分析
检测某一基因的样品需要做3个复孔，以排除加样误差。加好的96/384孔板用透明贴膜密封，并简短离心，离下管壁的残液。放入PCR仪，设置反应条件：Step 1：预变性(95℃30s)；Step 2：PCR反应(95℃5s，60℃34s)40×循环。在 60℃时，设定荧光检测点，进行扩增。必要时，反应结束后可加做溶解曲线，以检测扩增产物的特异性。最终得到的CT值，通过2-ΔΔCT法计算出某一基因在不同样本中的表达情况。
18、组织冰冻切片和免疫荧光染色
(1)从-80℃冰箱取出OCT包埋块，用安全刀片将标本底部修平后迅速粘附于圆形支撑器上，置入-24℃冰冻切片机的冷冻台。待包埋块完全粘附于支撑器后，固定在标本台上，先快速切掉不要的OCT，直到暴露出待切组织块部位。
(2)调整切片厚度6μm，切好后室温放置30min以防脱片，-20℃保存备用。
(3)从-20℃冰箱取出冰冻切片，先室温放置30min，再用预冷的4％多聚甲醛室温固定20min，PBS洗3×10min，用纸吸干样本周围液体。
(4)0.2％Triton X-100(PBS稀释)通透细胞膜10min，PBS洗3×10min。
(5)免疫组化笔画圈，5％BSA室温封闭1h。
(6)滴加一抗(1％BSA稀释)，封口膜均匀覆盖，放在湿盒中防止表面干燥，4 ℃孵育过夜。
(7)PBST洗3×10min，用纸吸干样本周围液体。
(8)滴加Cy3荧光二抗(1％BSA稀释)，封口膜均匀覆盖，室温避光孵育1h。
(9)PBST洗3×10min，注意避光，用纸吸干样本周围液体。
(10)DAPI染色(2μg/ml，PBS稀释)10min，注意避光。
(11)PBST洗3×10min，注意避光，用纸吸干样本周围液体。
(12)滴加防荧光淬灭剂，封片。
(13)激光扫描共聚焦显微镜拍照成像(63×油镜)，能够看到Cy3标记的红色荧光(目的蛋白)和DAPI标记的蓝色荧光(细胞核)。
19、组织石蜡切片和HE染色
A、组织石蜡切片的制作：
(1)取出4％多聚甲醛固定24h后的组织标本，用大头针将标签和组织连接起来，流水过夜冲洗去除固定液后，用ddH2O配制的梯度乙醇进行脱水处理。
(2)脱水：70％乙醇1h→80％乙醇1h→90％乙醇1h→95％乙醇1h(×2)→100％乙醇1h(×2)。
(3)二甲苯透明30min(×2)。
(4)浸蜡：65℃融化好的石蜡浸3～4h。
(5)包埋：将组织放在自制包埋盒中，加入融化的石蜡，用大头针调整好组织的位置，小心将包埋盒放在-20℃冷却台上，待大部分石蜡凝固后，将标签贴在石蜡块上面，标记好组织标本，10min后撬蜡。
(6)切片：用安全刀片修剪石蜡块，固定在石蜡切片机上，调整切片厚度6μm，用毛笔将组织片摊平，转移到40℃水浴锅，再用防脱载玻片将组织片从水浴锅中捞出。
(7)将载玻片放到37℃烤片机上烤过夜，室温保存。
B、HE染色：
(1)将上述载玻片65℃烤片5min，开始脱蜡：二甲苯10min→二甲苯5min。
(2)水化：100％乙醇5min(×2)→95％乙醇5min(×2)→85％乙醇3min→75％乙醇2min→ddH2O 1min。
(3)苏木素染5min。水洗15min。
(4)1％盐酸酒精分化30s。水洗15min。
(5)ddH2O 2min→75％乙醇2min→85％乙醇2min。
(6)伊红染15s。
(7)脱水：95％乙醇5min(×2)→100％乙醇5min(×2)。
(8)二甲苯透明5min(×2)。
(9)封片：在载玻片中间滴一滴中性树胶，将盖玻片放在中性树胶上，缓慢按压使中性树胶充满盖玻片覆盖的整个空间，避免产生气泡。24h后用二甲苯擦去表面的中性树胶。通风橱中放置24h，使二甲苯充分挥发。
(10)光学显微镜下分别使用低倍(12.5×)和高倍(400×)观察拍照。
20、血浆Dkk1的测定(ELISA法)
(1)样品准备：将新鲜取得的小鼠血液存放在EDTA抗凝管中，室温静置10min 后，1000g，离心15min，收集上清液，即血浆。如果不能立即检测，应分装后， -80℃保存，避免反复冷冻。保存过程中如出现沉淀，使用时应在室温下充分解冻，并再次离心。
(2)所有试剂室温恢复30min并充分混匀。链霉亲和素-HRP(1:200)，生物素标记的山羊抗小鼠Dkk1检测抗体(1:180)，重组小鼠Dkk1标准品(1:100)，血浆样品(1:4)先使用试剂稀释液(reagent diluent)稀释到指定浓度；山羊抗小鼠Dkk1 包被抗体(1:180)先使用包被缓冲液(coating buffer)稀释到指定浓度。稀释好的试剂用于以下各步骤。
(3)标准品：使用试剂稀释液将标准品倍比稀释为1350、675、337.5、168.8、 84.4、42.2、21.1pg/ml等7个浓度梯度。
(4)上样板包被：立即将Dkk1包被抗体按每孔100μl加入96孔上样板中进行抗体包被，用封板膜密封好，室温下孵育过夜。
(5)洗板：小心揭掉封板膜，弃去液体并甩干，用稀释后的洗涤液注满每孔，静置30s弃去，用纸彻底拍干，充分清洗上样板3次。
(6)封闭：每孔加入300μl试剂稀释液(reagent diluent),室温下孵育1h。
(7)重复步骤“4”。
(8)上样：每孔加入100μl ddH2O(空白孔)、Dkk1标准品或血浆样品，盖好上样板，室温下孵育2h。
(9)重复步骤“4”。
(10)检测：每孔加入100μl Dkk1检测抗体，盖好上样板，室温下孵育2h。
(11)重复步骤“4”。
(12)每孔加入100μl链霉亲和素-HRP，盖好上样板，室温下避光孵育20min。
(13)重复步骤“4”。
(14)每孔加入100μl显色液(底物A和底物B 1:1混匀，15min内使用)，盖好上样板，室温下避光孵育20min。
(15)每孔加入50μl终止液，轻轻摇晃上样板使液体混匀。
(16)读板：以空白孔调零，在450nm波长读取各孔的OD值。
(17)统计：根据标准品的浓度(横坐标)及其OD平均值(纵坐标)，生成标准曲线和线性回归方程，由公式计算出上样微孔中的Dkk1浓度(pg/ml)，再乘以稀释倍数得到Dkk1在血浆中的实际浓度(pg/ml)。
21、血浆8-OHdG的测定(ELISA法)
(1)样品准备同血浆Dkk1的测定(ELISA法)。
(2)分组：试剂盒室温放置30min。取出酶标板，根据标准品和血浆样品的数量确定所需板条数。分别设置空白孔(Blank)、非特异结合检测孔(Non-Specific Binding，NSB)、标准品/血浆样品组。为减少实验误差，设置2个复孔。
(3)标准品：使用标准品稀释液将标准品倍比稀释为20、10、5、2.5、1.25、 0.625、0.313、0.157ng/ml等8个浓度梯度。
(4)加样：按下表在不同设置的微孔中加入所需试剂：
(5)孵育：酶标板用封板膜密封后，4℃孵育18h。
(6)洗板：小心揭掉封板膜，弃去液体并甩干，用稀释后的洗涤液注满每孔，静置30s弃去，用纸彻底拍干，充分清洗酶标板5次。
(7)显色：向每孔加入显色液(含有AChE的反应底物)200μl。将酶标板重新密封一张封板膜，放在摇床上，室温避光反应90～120min。
(8)终止：显色反应结束后，轻轻揭掉封板膜，防止液体溅出孔外，立即读板。
(9)读板：以空白孔调零，在412nm波长读取各孔的OD值。
(10)统计：标准品和血浆样品的OD值须先减去NSB孔OD平均值进行校正。根据标准品的浓度(横坐标)及其校正的OD平均值(纵坐标)，生成标准曲线和线性回归方程，由公式计算出上样微孔中的8-OHdG浓度(ng/ml)，再乘以稀释倍数得到 8-OHdG在血浆中的实际浓度(ng/ml)。
22、统计学分析
本研究中，数据的统计学分析由GraphPad Prism 5软件完成，所有数据表示为平均值±标准差。两组样本间的不配对双尾t检验(Student’s t-test) 和多组样本间的单因素方差分析(one-way analysis of variance with Bonferroni’s post hoc test，one-way ANOVA含Bonferroni法验后比较) 用于评估两组数据的统计学差异。对于所有实验，当P值小于0.05时，组间差异具有显著统计学意义。图例中所示*号含义为P值的显著程度：*P<0.05， **P<0.01，***P<0.001。
实施例1 Dkk1上调可能与恶病质相关的肿瘤死亡有关。
通过TCGA分析，Dkk1在多种肿瘤的临床患者中表达量升高，同时高表达的 Dkk1会显著减少患者生存期(图1a)通过ELISA分析得到，在小鼠皮下种植CT26 和LLC肿瘤细胞后，也能观察到血液中的Dkk1上调(图1b)。Real-time PCR分析显示，相比肌肉、肾脏、心脏和肝脏等器官相比，CT26肿瘤细胞中的Dkk1表达量最高(图1c)，说明植入肿瘤可能会释放Dkk1和提高局部升值循环Dkk1.甚至，CT26 肿瘤的种植引起了肌肉和肾脏中Dkk1表达量的升高(图1d)。值得注意的是，即使在CT26肿瘤种植之后，肾脏表达的Dkk1几乎可以忽略不计(图1c,d)。所有的CT26 荷瘤小鼠在种植肿瘤后的大约80天全部死亡，而注射Dkk1可以明显缩短荷瘤小鼠生存期，(从40天开始间隔2天一次注射Dkk1)(图1e)，表明DKK1可以直接影响癌症死亡。然而Dkk1的中和抗体可以延长CT26荷瘤小鼠寿命(图1f)。由于CT26 肿瘤细胞不转移，所以这个模型的癌症死亡不是转移引起的。值得注意的是，CT26 荷瘤小鼠出现了严重的恶病质，伴随着持续的体重下降和肌肉重量下降(图1g)。显瘦的肌肉纤维和空白区域被HE染色显示出来，提示肌肉萎缩和一些肌肉水解(图 1h)。非常有趣的是，肾脏重量始终保持不变，且HE染色和血液中的肌酐、尿素氮 (图1i)这两个肾功能指标也没有改变，表明种植CT26细胞对肾脏没有影响。这些结果表明，CT26肿瘤种植通常会影响除了肾脏以外的器官。虽然，在LLC细胞荷瘤小鼠中也观察到了Dkk1的升高(图1b)，但是LLC细胞有较强的迁移能力。所以，为了阐明Dkk1在与转移无关肿瘤死亡中有害作用的潜在机制，我们在接下来的试验中重点研究了CT26荷瘤小鼠。
实施例2下调膜蛋白LRP6和Kremen2能引起肿瘤恶病质
肌肉萎缩是肿瘤恶病质的一个关键特征，是一个多因素疾病，对患者预后和生活质量有负面影响。无论体重指数(BMI)如何，骨骼肌损耗被认为是癌症发展过程中一个有意义的预后因素，并且与增加化疗毒性的发生率、缩短肿瘤进展时间、手术结果差、身体损害和缩短生存期有关。此外，Kremen1/2是Dkk1介导的LRP5/6 下膜所必须的受体。因此，为了探究Dkk1在癌症死亡中有害作用的潜在机制，我们首先检测了CT26荷瘤小鼠中Dkk1结合蛋白LRP5/6和Kremen1/2的表达。在种植肿瘤第50天的时候，体循环的Dkk1显著升高(图1b)，同时肌肉萎缩也明显发生(图1g和图1h)，肌肉上的膜蛋白和总蛋白的LRP6以及Kremen2均显著下调，而LRP5和Kremen1下调不明显(图2a)。相比较起来，即使到了恶病质的最终阶段，肾中的LRP6表达没有改变，而Kremen2的表达反而显著的升高了(图2b)。基于肿瘤植入对肾脏无影响这些结果(实施例1i)，提示膜上的LRP6和Kremen2的调节可能是Dkk1诱导器官损伤的原因。此外，活化的β-catenin和核内的β-catenin 的表达没有改变(图2c)，提示，恶病质发展引起LRP6改变机制与β-catenin无关。
实施例3逆转膜上LRP6和Kremen2下调可以阻止肿瘤恶病质
为了验证膜上LRP6的下调参与肿瘤恶病质发生发展，我们用了一个小分子化学药物MDC，来阻止Dkk1引起的膜LRP5/6的下调。往正常小鼠下肢肌肉注射Dkk1，引起膜上LRP6和Kremen2的内吞(图3a)，而同时注射MDC可以阻止这一现象(图 3a)。更重要的是，MDC可以抑制Dkk1注射引起的荷瘤小鼠快速死亡(图3b)。令人惊讶的是，在种植肿瘤的同时注射MDC，可以逆转膜上的LRP6和Kremen2下调从而完全的阻止体重和肌肉重量的下降(图3c)。即使是种植肿瘤40天以后，MDC干预也可以延长CT26小鼠的生存期(图3d)。进一步用clathrin-TG2相关的内吞抑制剂Cystamine和Spermindine看到了与MDC相似的延长肿瘤小鼠生存期的结果 (图3e)。结合肌肉蛋白水平检测结果(图3f)表明，阻止Dkk1引起的膜上LRP6和 Kremen2的下调可以防止肿瘤恶病质，并且延长生存期。有趣的是，失去IGF结合能力的重组突变体IGFBP4/H95P蛋白，可以结合膜上的LRP6而阻止Dkk1信号传导，同样也能延长荷瘤小鼠的生存期(图3g)。与MDC一样，同时注射IGFBP-4/H95P可以完全阻止体重和肌肉重量的下降(图3c)，其机制也是通过抑制Dkk1引起的膜 LRP6表达的下调(图3h)。
实施例4 LRP5/6缺失后GPCR表达谱改变(转录组测序)
Wnt共受体LRP5/6参与激活Wnt/β-catenin通路。鉴于LRP5/6会激活β-catenin入核，所以为了探索LRP5/6自身对GPCR的密切影响是否普遍存在，则需要排除LRP5/6下游β-catenin信号的干扰，即要有相应β-catenin的实验作为LRP5/6的实验对照。首先，我们使用RNAi技术在若干细胞(HepG2、Hela、U2OS、 HUVEC)中分别进行LRP5/6和β-catenin的基因敲低实验，显微镜下观察到敲低LRP5/6基因引起以上细胞状态变差和生长停滞，尤其在HepG2细胞中表现最为明显，接着通过WB检测发现LRP5/6敲低后γH2AX信号被上调，暗示敲低LRP5/6 基因的细胞均发生了不同程度的DNA损伤，而对照组和敲低β-catenin基因都没有发现这一现象，这说明LRP5/6能够不依赖β-catenin特异保护细胞稳态的平衡。考虑到在单个细胞中，存在大量GPCR可以与LRP5/6相互作用的可能性，所以我们猜测，敲低LRP5/6基因会同时影响到这些和LRP5/6相互作用的GPCR，进而会通过正负反馈回路的调控导致这些GPCR在转录水平的表达发生变化，最终改变了 GPCR信号，打破了细胞稳态，引起诸如细胞生长停滞和DNA损伤等改变。为了验证这一假设，又考虑到HepG2细胞受LRP5/6基因敲低的影响较为显著，因此，我们利用高通量RNA-Seq，分析了HepG2细胞在敲低LRP5/6或者β-catenin之后全基因组转录水平的改变，尝试考察敲低LRP5/6基因本身对GPCR表达水平造成的影响。
HepG2细胞的RNA-Seq分析结果显示，相较于敲低β-catenin基因，敲低 LRP5/6基因后导致表达水平发生改变的GPCR在数量和程度上均占有显著优势(图 4，A-C)，这暗示敲低LRP5/6基因能够经由反馈回路特异地引起与之相互作用的 GPCR在转录水平上的变化。这些结果表明了LRP5/6和GPCR之间具有广泛的密切关系，这种关系与Wnt/β-catenin通路无关，同时也为我们研究LRP5/6调控细胞及糖尿病心脏损伤的分子机制提供了依据。
实施例5 LRP6胞外段(LRP6N)可逆转LRP5/6缺失诱导的DNA损伤
最初我们发现，通过在HUVEC细胞中敲低LRP5/6或者β-catenin，观察到敲低LRP5/6使细胞出现了DNA损伤(γH2AX信号上调)，而对照组和敲低β-catenin 都没有发生这一现象(图5B)。除了同时敲低LRP5/6以外，WB结果显示，与敲低β-catenin相比，使用不同浓度梯度的siRNA对HUVEC细胞单独敲低LRP5或LRP6 也能导致DNA损伤发生(γH2AX信号上调)(图5A)。这些结果表明敲低LRP5/6基因能引起HUVEC细胞的稳态紊乱，并且LRP5/6的这种功能不依赖于β-catenin。有趣的是，通过向HUVEC细胞培养基中预先加入LRP6胞外段的可溶性蛋白质(LRP6 ectodomain，LRP6N)，发现敲低LRP5/6诱导的γH2AX信号上调能够被LRP6N显著减弱(图5B)。由于分泌型LRP6N蛋白是在细胞膜表面起作用，因而LRP6N蛋白在敲低LRP5/6诱导的细胞DNA损伤中的拯救作用表明了LRP5/6在细胞膜上的缺失是导致细胞发生DNA损伤的根本原因。
H2O2可以在体外模拟一种疾病状态下的异常培养环境。H2O2的过氧基团可以直接攻击细胞的DNA双链单纯导致氧化性DNA损伤而不会引起LRP5/6和β-catenin 的表达变化，并且，H2O2诱导的DNA损伤程度呈现浓度和时间的依赖性(图5C)。为了进一步考察LRP5/6维持细胞稳态的生物学作用，我们使用模拟疾病状态的一种不良刺激(H2O2)在上述实验基础上对HUVEC细胞做进一步处理。当我们使用低浓度 H2O2(50μM)刺激HUVEC细胞后发现，与对照组和敲低β-catenin相比，敲低LRP5/6 上调的γH2AX信号被H2O2进一步激活，并且也能够通过外源性LRP6N蛋白的预处理让这种改变显著减弱(图5B)。相比之下，LRP6N蛋白对于对照组和敲低β-catenin的HUVEC细胞中H2O2激活的γH2AX信号则没有影响(图5B)。这些结果表明细胞膜上LRP5/6的缺失会减弱HUVEC细胞对氧化应激的抵抗能力，并且这一现象不依赖于β-catenin。
实施例6 MESD缺失可增强氧化应激效应
MESD蛋白作为LRP5/6的伴侣蛋白，能够帮助其从细胞浆转移到细胞膜上，成为成熟的LRP5/6发挥生物学功能。WB结果显示HUVEC细胞中敲低MESD基因，能够促使细胞膜上的LRP5/6降低(图6A)，但没有发生明显的细胞损伤(图6B)。进一步研究表明，经过低浓度H2O2(50μM)处理极大地增强了敲低MESD细胞中的γH2AX信号，而且外源性LRP6N蛋白的预处理能够显著减弱这种改变(图 6B)。这些结果充分表明完整的膜上LRP5/6对于增强细胞抵抗氧化应激的能力是至关重要的。
实施例7 Dkk1可诱导DNA损伤效应
分泌蛋白Dkk1诱导细胞膜上LRP5/6内吞而抑制Wnt/β-catenin信号通路。由于成年时期许多慢性疾病(如糖尿病、慢性心肌缺血、恶性肿瘤等)患者的血液 Dkk1水平均明显上调且伴有不良预后，但其中机制还不清楚。为了深入探讨该机制，在HUVEC细胞中加入了不同时间和浓度梯度的纯化Dkk1蛋白，发现Dkk1能够快速诱导细胞膜上LRP5(100ng/ml从15min)和LRP6(100ng/ml从5min)的内吞 (总蛋白表达水平不变，而膜蛋白表达水平下调)(图7A)。值得注意的是，Dkk1(100 ng/ml)在5min内显著激活γH2AX，并在15min时达到峰值(图7A)。这表明Dkk1 能够在内吞LRP5/6的同时导致细胞DNA损伤发生的可能性。其次，我们还发现 Dkk1(100ng/ml)是在60min后下调核内β-catenin的表达水平(总蛋白表达水平不变，而核蛋白表达水平下调)，但是较高剂量的Dkk1在30min内并没有下调核内β-catenin的表达，这提示Dkk1不是通过抑制β-catenin信号来诱导细胞DNA 损伤反应(图7A)。另外，像在图6B显示的,通过单纯使用siRNA来更大程度引起β-catenin减低同样没有改变γH2AX信号，也更加支持这一观点。为了进一步证明LRP5/6膜内吞与γH2AX激活之间的内在关系，我们使用Dkk1内吞LRP5/6的抑制剂MDC预处理HUVEC细胞，结果如图7B，发现Dkk1诱导的γH2AX激活被MDC 减弱。而且与直接敲低LRP5/6类似的是，通过外源性LRP6N蛋白的预处理也可以抑制Dkk1诱导的γH2AX激活(图7B)。这些结果暗示分泌型LRP6N蛋白可以替代细胞膜上的内源性LRP5/6发挥保护细胞稳态的作用。综合以上数据可知，由Dkk1 诱导的膜上LRP5/6的下调是细胞DNA损伤发生的起始原因，也即Dkk1导致的细胞损伤是通过下调膜上LRP5/6而不是通过阻止β-catenin的核移位来实现的。
此外，为了考察膜上LRP5/6对处于不良环境中的细胞是否也具有上述保护作用，我们使用低浓度H2O2(50μM)在上述实验基础上对HUVEC细胞做进一步刺激。实验表明，H2O2本身能够在不影响细胞膜上LRP5/6表达的同时，激活γH2AX信号，而且当Dkk1诱导膜上LRP5/6下调以后，H2O2能够强烈地上调γH2AX信号(图7B)。值得注意的是，MDC或LRP6N本身不引起γH2AX反应，并且也不能阻止H2O2诱导的γH2AX激活，但是它们显著减弱了在Dkk1存在下被H2O2诱导增强的γH2AX信号(图7B)。这些结果进一步表明完整的膜上LRP5/6对于抵抗氧化应激和维持细胞稳态是至关重要的。
实施例8 Dkk1通过内吞LRP5/6激活β-arrestin1/2信号的传导
上述RNA-Seq分析证明了LRP5/6和大多数GPCR之间存在密切关系，因而不难推测，膜上LRP5/6的下调可能会导致GPCR膜上稳态的失衡，进一步引起下游信号通路发生复杂的改变。如前所述，β-arrestin1/2和各种G蛋白一样，都是GPCR一般的直接下游靶标，但不同于GPCR和G蛋白的是，β-arrestin1/2 可以快速地移位到细胞膜并直接结合到活化GPCR的C端，并通过自身的细胞膜和细胞浆/细胞核之间的转运，特异地参与调节一般GPCR信号的传导，因此， GPCR信号改变的一个普遍结果是细胞内β-arrestin1/2发生了移位改变。为了验证广泛的GPCR信号紊乱与LRP5/6下调是否存在相关性，我们考察了Dkk1 诱导膜上LRP5/6内吞对β-arrestin1/2信号改变的具体影响，即用胞内β-arrestin1/2的信号传导进一步阐述膜上LRP5/6与GPCR之间的关系。
我们首先分析了Dkk1刺激HUVEC细胞后β-arrestin1/2的移位改变。结果显示，Dkk1可以在内吞LRP5/6的同时快速上调HUVEC细胞浆中的β-arrestin1/2，而下调细胞膜上的β-arrestin1/2(图8A)，并且经过Dkk1 内吞LRP5/6的抑制剂MDC的预处理可以阻止以上β-arrestin1/2的移位变化 (图8B)。在短时间(15min)内Dkk1刺激诱导LRP5/6和β-arrestin1/2发生相似的快速变化，提示Dkk1首先结合并快速诱导细胞膜上LRP5/6发生内吞，然后导致β-arrestin1/2的移位改变，这表明膜上LRP5/6和GPCR之间具有直接而密切的关系(图8A)。一般而言，当GPCR激活时，首先发生的是质膜内侧G蛋白相对于这些GPCR的移位，然后才出现胞内β-arrestin1/2相对于这些GPCR的移位。为此，我们使用小分子BIM-46187(1μM 30min)预处理HUVEC 细胞，它是G蛋白一般抑制剂，能够直接结合G蛋白α亚基，进而阻止配体活化的GPCR和G蛋白复合物的形成及后续G蛋白的构象改变，由于这样的结合阻止了受体与G蛋白异三聚体间正常的相互作用，从而抑制了G蛋白α亚基的GDP/GTP交换，导致G蛋白及GPCR信号受到了广泛抑制。事实上，我们发现BIM-46187能够阻止HUVEC细胞中Dkk1诱导的β-arrestin1/2移位(图 8C)，表明Dkk1诱导的膜上LRP5/6下调影响了GPCR信号，进而导致GPCR一般下游靶标β-arrestin1/2的移位改变。值得注意的是，通过RNAi技术引起的LRP5/6下调是一个长期过程，可能会继发难以预料的二次效应。因此，在 HUVEC细胞中敲低LRP5/6而不是β-catenin会上调β-arrestin1/2的表达水平(图8D)，可能是由于LRP5/6和GPCR之间的密切关系导致反馈系统在转录水平间接启动了以上变化。总之，这些结果暗示Dkk1可以通过诱导LRP5/6内吞影响GPCR信号，并且进一步证明LRP5/6确实与GPCR密切相关。
实施例9β-arrestin1/2介导了膜上LRP5/6下调引起的细胞DNA损伤
目前已知，GPCR直接下游靶标β-arrestin1/2通过细胞膜和细胞浆/细胞核之间的转运不仅可以参与GPCR信号传递，还能介导DNA损伤应答，所以，一方面，HUVEC细胞膜上LRP5/6被Dkk1内吞的同时，快速诱导了β-arrestin1/2从细胞膜到细胞浆的转移，继而导致细胞γH2AX激活；另一方面，通过MDC抑制Dkk1内吞LRP5/6的同时，也能阻止β-arrestin1/2在细胞内的移位和γH2AX的激活。与之类似的还有，HUVEC细胞敲低β-arrestin1/2后(图9A)，不仅阻断了GPCR-β-arrestin1/2信号传导，还抑制了由Dkk1刺激诱导的γH2AX激活(图9B)。值得注意的是，对于Dkk1和低浓度H2O2(50μM)先后刺激诱导增强的γH2AX信号，敲低β-arrestin1/2 同样具有明显的拯救作用，但敲低β-arrestin1/2并没有保护H2O2本身引起的细胞DNA损伤(图9B)，表明β-arrestin1/2在促进Dkk1诱导的DNA损伤中的特异作用。此外，Dkk1刺激诱导的γH2AX激活也被G蛋白一般抑制剂 BIM-46187(1μM，30min)预处理所抑制(图9C)。综合以上实验结果可知， Dkk1-LRP5/6轴是通过激活GPCR-β-arrestin1/2信号传导(β-arrestin1/2 移位改变)介导了LRP5/6内吞引起的细胞DNA损伤和稳态失衡。
值得一提的是，与上述敲低β-arrestin1/2抑制Dkk1对细胞损害的结果相似，在HUVEC细胞中敲低β-arrestin1/2也能够抑制敲低LRP5/6所引起的 DNA损伤及抗氧化应激能力的削弱，并且这种保护作用不依赖于β-catenin(图 9D)。以上结果均证明，GPCR下游的直接分子靶标β-arrestin1/2是导致 LRP5/6缺失诱导的细胞DNA损伤和稳态失衡的直接调控因子。
实施例10 G蛋白激动剂能够诱导DNA损伤反应
上述实验结果揭示了Dkk1-LRP5/6-GPCR-β-arrestin1/2通路在Dkk1诱导的细胞DNA损伤中的重要功能。接下来，为了进一步验证GPCR信号紊乱与细胞DNA损伤的密切关系，我们通过使用G蛋白激动剂干扰GPCR下游的直接靶标G蛋白，观察是否同样可以诱导细胞DNA损伤。实验表明，CTX(霍乱毒素) 能持续激活Gs蛋白α亚基，其刺激HUVEC细胞能以剂量和时间依赖性方式显著上调γH2AX(图10A)。值得注意的是，PTX(百日咳毒素)可以快速抑制Gi蛋白α亚基，而长期刺激可以激活Gs蛋白α亚基，并且γH2AX在短期和长期刺激中都被不同剂量的PTX所激活(图10B)。以上结果表明，影响不同G蛋白的功能均能够诱导DNA损伤反应。因此，作为GPCR的一般下游靶标，G蛋白稳态的破坏会广泛改变GPCR信号，进而导致细胞稳态失衡。
实施例11 LRP5/6基因敲除引起小鼠心脏损伤
我们使用经腹腔注射他莫昔芬诱导后的8周龄LRP5/6或β-catenin全身敲除(LRP5/6-/-或β-catenin-/-)小鼠对LRP5/6在成体组织中的作用加以阐述。它们是通过LRP5/6floxp/floxp或β-cateninfloxp/floxp小鼠分别与含Cre重组酶的小鼠 (UBC-Cre/ESR1)交配获得，该重组酶表达受全身表达的UBC启动子的控制，能够实现基因的全身敲除。以心脏为例，Western Blotting从蛋白水平证实，他莫昔芬诱导1周的LRP5/6-/-或β-catenin-/-小鼠心脏中的特定基因被成功敲除(图11A)。
在实验过程中发现，与对照组小鼠相比，经他莫昔芬诱导35周的LRP5/6-/-小鼠显示出体重及多种器官(包括心脏，肺脏，肾脏，脾脏，骨骼肌和脂肪)重量的减轻(图11B)，而β-catenin-/-小鼠却没有出现这些变化，提示LRP5/6缺失特异地诱导了机体和多器官的严重损害。随后，我们选取感兴趣的心脏作为器官损伤的研究对象，进一步考察了LRP5/6敲除对心脏造成的影响。我们发现他莫昔芬诱导1 周的LRP5/6-/-而不是β-catenin-/-小鼠心脏中的γH2AX信号明显增加，p53和p21 表达水平也显著上调，但LRP5/6-/-小鼠心脏的DNA损伤并没有引起凋亡发生(图 11A)。此外，二维超声心动图显示经他莫昔芬诱导35周的LRP5/6-/-小鼠的心脏物理功能受损，包括左心室射血分数(EF％)和左心室短轴缩短率(FS％)的减少(图11C 和11E)；实时定量PCR分析也显示LRP5/6-/-小鼠心衰标志物ANP和BNP显著上调(图 11D)，这些结果进一步表明LRP5/6敲除可以导致心脏损伤。相比之下，β-catenin-/-小鼠和同窝出生且只表达Cre重组酶的对照组小鼠直到敲除35周仍无明显差异。综上可知，短期敲除LRP5/6能特异诱导成年小鼠心脏DNA损伤反应和细胞周期停滞，而长期LRP5/6的缺失引起DNA损伤的积累，进而造成心脏功能受损。总之，上述实验初步证明了LRP5/6能够保护成年小鼠心脏的正常功能和稳态平衡。
实施例12 LRP5/6基因敲除激活小鼠心脏β-arrestin1/2信号的传导
细胞实验表明，GPCR的一般下游靶标β-arrestin1/2通过细胞膜和细胞浆/ 细胞核之间的转运不仅可以参与GPCR信号传递，还能介导DNA损伤应答。类似地，为了论证LRP5/6-/-小鼠心脏的上述损伤变化是否与GPCR-β-arrestin1/2信号改变有关，我们考察了LRP5/6-/-小鼠心脏的β-arrestin1/2。如图12A所示，LRP5/6-/-而不是β-catenin-/-小鼠能够诱导心脏中β-arrestin1/2的移位改变(包括细胞膜上β-arrestin1/2的下调，细胞浆中β-arrestin1/2及细胞核中β-arrestin1 的上调)，这说明β-arrestin1/2能够介导LRP5/6敲除引起的心脏DNA损伤，同时也为LRP5/6与GPCR的密切关系提供了直接证据。此外，实时定量PCR也显示(图 12B)，LRP5/6-/-而不是β-catenin-/-小鼠诱导了心脏中多个重要GPCR基因水平的改变，进一步支持了LRP5/6与多种GPCR密切相关的观点。总之，上述结果初步表明了LRP5/6具有不依赖β-catenin维持成年小鼠GPCR-β-arrestin1/2信号稳定，进而阻止心脏DNA损伤和功能紊乱的生物学功能。
实施例13高血糖诱导糖尿病小鼠血液Dkk1的上调
我们的ELISA测定显示，STZ诱导的1型糖尿病小鼠血液Dkk1水平大幅增加(图13A)。有趣的是，通过每日给予胰岛素对糖尿病小鼠进行治疗，不仅降低了STZ 诱导的血糖升高(图13B),也使其高浓度的血液Dkk1降回到了基础水平(图13A)。这些结果表明，STZ诱导的糖尿病高血糖能够特异地上调血液Dkk1，而胰岛素可以借助其降血糖作用使升高的血液Dkk1水平恢复正常。由于STZ诱导的糖尿病小鼠类似于血液中含有高表达Dkk1的糖尿病患者，因而，我们使用该小鼠模型来考察 Dkk1对糖尿病有害作用的形成机制。
实施例14糖尿病小鼠膜上LRP5/6下调与心脏损伤的密切关系
如前所述，Dkk1具有抑制Wnt/β-catenin信号和内吞膜上LRP5/6的双重生物学功能，为了确定高水平的血液Dkk1在糖尿病中发挥何种作用，我们考察了STZ 诱导的1型糖尿病小鼠心脏β-catenin和LRP5/6的表达。如图14A所示，在STZ 造模的不同时间点，我们发现心脏细胞核和总体β-catenin均没有发生改变，提示Wnt/β-catenin信号通路不参与糖尿病的发病过程。值得注意的是，伴随着血糖浓度(STZ造模第5天显著上升)及血液Dkk1的上调，心脏膜上LRP5/6的表达水平在造模第5天显著下调，并在造模第7天变得更加明显，但总体LRP5/6表达水平始终不受影响，提示在STZ诱导的1型糖尿病小鼠中，心脏膜上LRP5/6的内吞可能与高血糖诱导的血液Dkk1上调有关(图14A)。此外，表明心脏DNA损伤的γH2AX信号也从STZ造模第5天显著增加，并在第7天达到峰值(图14A)。血液 8-OHdG在STZ造模第7天也明显上调(图14C)，进一步确认了糖尿病DNA损伤的发生。STZ糖尿病小鼠的这些改变在时间上的一致性意味着心脏膜上LRP5/6的下调及DNA损伤的发生与高血糖上调的Dkk1密切相关。同时，如图14D所示，在STZ 造模第7天的糖尿病小鼠中，也显示出其他损伤标志物水平的明显上调(包括心脏 p53和p21，Bax/Bcl-2和Cleaved Caspase-3)，这表明糖尿病导致了严重的心脏 DNA损伤，最终引起了凋亡。
值得注意的是，如图14B所示，每日给予STZ诱导的糖尿病小鼠胰岛素治疗后，血糖浓度从治疗第1天开始降低并在随后的时间始终保持在低水平，同时血液Dkk1 由于血糖浓度下降也处于基础水平。当胰岛素治疗第3天时，心脏的膜上LRP5/6 开始上调，伴随着γH2AX信号减弱，这些改变在治疗第7天变得更加明显。并且如图14C和14E所示，在胰岛素治疗第7天，糖尿病小鼠其他损伤标志物(包括血液8-OHdG；心脏p53和p21，Bax/Bcl-2和Cleaved Caspase-3)的表达也大大减弱。考虑到体重下降是1型糖尿病发生多器官损伤后的标志性体征，故在上述变化的基础上，我们还发现胰岛素的降血糖效应促进了糖尿病小鼠减轻的体重逐步得到恢复 (图14F)。以上结果表明，胰岛素治疗对于心脏膜上LRP5/6下调和糖尿病损伤实现的逆转在时间上的一致性进一步暗示，糖尿病心脏损伤与受到血糖严格调控的血液Dkk1和膜上LRP5/6的表达水平密切相关。
实施例15 Dkk1通过诱导LRP5/6膜内吞引起糖尿病心脏损伤
为了进一步论证糖尿病小鼠心脏LRP5/6膜内吞及DNA损伤与Dkk1水平上调的相关性，我们使用能阻止Dkk1内吞膜上LRP5/6的抑制剂MDC，观察膜上 Dkk1-LRP5/6轴在糖尿病心脏损伤中的作用。如图15A所示，我们发现STZ诱导的糖尿病心脏膜上LRP5/6下调能够被MDC抑制，而总体LRP5/6及细胞核或总体β-catenin表达水平保持不变，说明Dkk1特异地介导了糖尿病心脏LRP5/6的膜内吞，但不影响经典Wnt通路。同时，如图15B和15C所示，我们分别通过免疫荧光染色和Western Blotting检测显示，与胰岛素对DNA损伤的拯救类似，糖尿病心脏的γH2AX激活也能被MDC所抑制。此外，MDC还阻止了糖尿病小鼠血液中 8-OHdG的上升(图15D)。这些结果表明糖尿病小鼠的DNA损伤主要受到Dkk1诱导的膜上LRP5/6下调的调控。如图15C和15E所示，MDC还抑制了糖尿病心脏中p53， p21，Bax/Bcl-2和CleavedCaspase-3的上调，以及糖尿病小鼠体重的减轻。心脏HE染色表明，STZ造模引起糖尿病心肌结构显著的损伤，包括心肌纤维的排列混乱和断裂，及组织间隙空间的扩大，以上这些变化均可以被胰岛素(阳性对照) 和MDC阻止(图15F)。重要的是，MDC在阻止上述损伤的同时没有改变糖尿病小鼠的血糖浓度(图15G)，表明高血糖引起的糖尿病损伤本质上归因于膜上LRP5/6的下调。这些结果强烈提示Dkk1通过诱导膜上LRP5/6下调导致糖尿病心脏损伤的可能性。为了证明Dkk1与心脏损伤的直接关系，我们使用Dkk1纯化蛋白注射心肌，结果表明Dkk1可以不影响β-catenin信号而直接诱导心脏膜上LRP5/6的下调和γH2AX，p53和p21的上调，并且这些改变也可以被MDC预处理所逆转(图15H)，这说明Dkk1能够直接下调膜上LRP5/6来诱导心脏DNA损伤和细胞周期停滞。此外，如图15I，我们在Dkk1纯化蛋白联合BIM-46187局部注射小鼠心脏的实验中发现， BIM-46187(G蛋白一般抑制剂)同样能够有效抑制Dkk1通过LRP5/6膜内吞诱导的心脏损伤，包括γH2AX，p53和p21，该结果表明Dkk1-LRP5/6轴介导的心脏DNA 损伤和细胞周期停滞可能与膜上LRP5/6下调造成的GPCR信号激活有关。
总之，上述结果初步提出了一种LRP5/6不依赖β-catenin调控糖尿病心脏损伤的分子机制，即糖尿病的高血糖表型诱导血液Dkk1上调，后者导致膜上LRP5/6 的下调，即Dkk1-LRP5/6轴发生了改变，进而影响了GPCR信号的稳定，引起心脏 DNA损伤，细胞周期停滞，甚至凋亡等稳态失衡的表现，最终形成了糖尿病的心脏损伤。
实施例16 Leptin-/-小鼠膜上LRP5/6下调导致糖尿病心脏损伤
肥胖被认为是导致2型糖尿病发病的高危因素，近年来，随着肥胖人数急剧增加，2型糖尿病的患病率也呈上升趋势。如前所述，Leptin-/-小鼠显示出肥胖表型，并伴有严重的高血糖，因此，我们将其作为模拟2型糖尿病的小鼠模型来考察 LRP5/6在其中的相关作用。如图16A和16B所示，和同窝出生的Leptin+/-或WT小鼠相比，5周龄的Leptin-/-小鼠体重和血糖均显著增加。如图16C所示，6周龄的 Leptin-/-小鼠血糖浓度达到最高水平时，其心脏的膜上LRP5/6显著下调，并且γH2AX，p53和p21的表达也轻微上调，但没有发生β-catenin的核移位。值得注意的是，4周龄的Leptin-/-，Leptin+/-和WT同窝出生的小鼠之间心脏膜上LRP5/6 的表达水平相似(图16D)，同时，4周龄的Leptin-/-与WT小鼠的血糖水平也很相似，但Leptin-/-小鼠的体重水平已经显著增加(图16A和16B)，表明6周龄Leptin-/-小鼠膜上LRP5/6下调是由高血糖而不是高体重(肥胖因素)导致的。此外，如图16E 所示，ELISA检测显示出6周龄Leptin-/-小鼠血液Dkk1水平显著上调，表明Dkk1 可能参与诱导了2型糖尿病心脏膜上LRP5/6下调和DNA损伤。
考虑到糖尿病患者的糖耐量普遍受损，所以我们对6周龄Leptin-/-小鼠做了葡萄糖耐量测试。结果如图16F所示，注射葡萄糖后Leptin-/-小鼠的血糖维持较高水平长达2h，但WT小鼠的血糖在15min内立即降低，这表明Leptin-/-小鼠体内血糖的清除存在延迟。有趣的是，如图16H，16I和16J所示，体内注射葡萄糖(每2 h一次，持续24h)能明显诱导Leptin-/-小鼠心脏膜上LRP5/6的下调，γH2AX激活和血液8-OHdG的上调，及心脏p53，p21和Bax/Bcl-2的上调，而核内β-catenin 没有明显变化。为了验证这些变化是否与Dkk1有关，首先，我们通过ELISA检测发现注射葡萄糖比注射PBS的Leptin-/-小鼠血液Dkk1水平明显升高(图16G)；其次，MDC显著逆转了由注射葡萄糖引起的心脏膜上LRP5/6的下调及上述损伤分子指标的上调(图16H，16I和16K)。这些结果表明高血糖直接上调的血液Dkk1在促进膜上LRP5/6内吞和糖尿病心脏损伤中的有害作用，同时还提供了一种新的机制，可以很好地解释限制代谢综合征患者的葡萄糖摄入对于改善糖尿病损伤的重要性。
总之，上述1型和2型糖尿病小鼠模型的体内结果共同表明，高血糖可诱导血液Dkk1的上调和细胞膜上LRP5/6的下调，进而导致糖尿病小鼠心脏的DNA损伤应答，细胞周期停滞，甚至凋亡。因此，LRP5/6在细胞膜上的完整性对于维持组织器官稳态是至关重要的。此外，MDC借助其稳固膜上LRP5/6表达的作用可能有望成为1型和2型糖尿病患者器官损伤的临床治疗药物。
实施例17 LRP5/6基因敲除加重了糖尿病心脏损伤
细胞实验表明，敲低LRP5/6基因能够促使不良培养环境(H2O2)中的HUVEC细胞 DNA损伤显著加重，可见LRP5/6的存在的确有助于维持细胞稳态。类似地，为了进一步探讨LRP5/6不依赖β-catenin维持成年机体稳态的功能，我们对他莫昔芬诱导4周后的全身LRP5/6-/-或β-catenin-/-小鼠进行STZ诱导的糖尿病造模，以考察体内LRP5/6的缺失能否加重糖尿病引起的心脏损伤。如图17A所示，STZ诱导1 周的全身LRP5/6-/-的糖尿病小鼠心脏分子损伤的程度比全身非敲除的糖尿病小鼠要更加严重，包括显著上调的γH2AX，p53，p21，Bax/Bcl-2以及Cleaved Caspase-3(图17A)；并且，全身LRP5/6-/-的糖尿病小鼠在STZ诱导2周时发生了明显的心脏物理功能受损(包括EF％和FS％的减少，图17B和17E)。值得一提的是，相较于全身非敲除的糖尿病小鼠，在全身β-catenin-/-的糖尿病小鼠中上述心脏损伤分子指标和心脏物理功能并没有出现显著变化(图17B和17E)。此外，与全身非敲除的糖尿病小鼠相比，全身LRP5/6-/-的糖尿病小鼠在STZ诱导1周时还出现了较为明显的体重下降(图17C)，但两者的血糖水平并没有差异(图17D)。上述结果共同表明，完全缺失LRP5/6能够明显加重糖尿病心脏和机体的损伤，并且这一现象不受β-catenin信号和血糖水平的影响；也进一步证明LRP5/6自身具有不依赖β-catenin维持成年机体稳态的一般生物学功能。
实施例18 LRP6胞外段(LRP6N)阻止了糖尿病心脏损伤
鉴于外源性LRP6N蛋白能够在体外阻止LRP5/6敲低诱导的细胞DNA损伤这一事实，我们进一步考察了LRP6N是否也可以预防体内的糖尿病心脏损伤。首先，如图18A所示，我们使用转座子技术构建了携带LRP6N基因片段的转基因小鼠，并通过条件性Cre-loxP重组酶系统诱导小鼠全身过表达LRP6N蛋白(带myc标签)。在他莫昔芬诱导4周后的LRP6N/Tg小鼠心脏中，除了LRP6N过表达外，没有观察到其他分子的改变(图18B)。然而，如图18C和18D所示，LRP6N/Tg小鼠阻止了STZ 造模引起的糖尿病心脏γH2AX，p53，p21，Bax/Bcl-2和Cleaved Caspase-3以及血液8-OHdG的上调(图18C和18D)。同时，LRP6N/Tg小鼠也抑制了STZ造模诱导的内源性膜上LRP5/6下调(图18C)。类似地，如图18E和18F所示，通过小鼠尾静脉注射LRP6N质粒(带myc标签)，也减弱了糖尿病心脏γH2AX，p53，p21， Bax/Bcl-2和Cleaved Caspase-3的增加(图18E和18F)。此外，如图18G所示，和各自的对照组相比，小鼠内源性LRP5/6或β-catenin的敲除以及外源性LRP6N 的过表达(如转基因或体内转染质粒)均不会改变机体的血糖浓度，表明体内 LRP5/6或β-catenin表达的变化对血糖代谢不会产生任何影响(图18G)。值得强调的是，由于分泌型LRP6N蛋白是在细胞膜表面发挥保护作用，所以，这些体内结果进一步表明糖尿病心脏损伤直接归因于膜上LRP5/6的下调，而不依赖β-catenin信号和血糖水平的调控；同时也表明LRP6N能够取代内源性LRP5/6阻止糖尿病心脏损伤的发生。
如图18H所示，通过LRP6N/Tg小鼠和LRP6N质粒尾静脉注射的小鼠体内过表达LRP6N，能够有效阻止STZ造模诱导的糖尿病体重减轻(图18H)，这些结果提示 LRP6N具有普遍预防糖尿病损伤的能力。如前所述，1型糖尿病小鼠多器官受损所导致的消瘦表型同样能够被胰岛素和MDC所抑制。由于LRP6N过表达和MDC干预不会改变血糖水平，因此，可溶性LRP6N蛋白和MDC可以作为潜在的针对糖尿病损伤的治疗方案，即使在高血糖条件下对机体和器官仍然能够起到很好地保护作用。
实施例19糖尿病小鼠膜上LRP5/6下调特异激活心脏β-arrestin1/2信号的传导
由于高血糖影响了糖尿病心脏膜上LRP5/6的表达，因此，我们也想知道高血糖是否也影响了GPCR-β-arrestin1/2信号。首先，如图19A和19B所示，我们发现了β-arrestin1/2在STZ诱导的1型糖尿病心脏中的移位(包括膜上β-arrestin1/2的下调，浆内β-arrestin1/2及核内β-arrestin1的上调)(图 19A)，并且胰岛素治疗能够逆转这种移位(图19B)，表明高血糖可以影响β-arrestin1/2信号。其次，如图19C和19D所示，高血糖引起的β-arrestin1/2 移位改变也能通过MDC干预或LRP6N/Tg小鼠的LRP6N过表达得到阻止(图19C和19D)，表明高血糖是通过影响Dkk1-LRP5/6轴(上调Dkk1和下调膜上LRP5/6)诱导了心脏β-arrestin1/2的移位。支持这一观点的是，Dkk1直接注射心脏诱导的膜上β-arrestin1/2下调，浆内β-arrestin1/2及核内β-arrestin1上调，能够被MDC(图19E)或BIM-46187(图19F)所抑制，提示Dkk1通过下调心脏膜上 LRP5/6(Dkk1-LRP5/6轴)直接影响了GPCR-β-arrestin1/2信号的传导。如图19G 所示，因为单独使用胰岛素，MDC或者体内过表达LRP6N都没能诱导心脏β-arrestin1/2的移位，这些结果进一步支持高血糖通过上调Dkk1和下调膜上 LRP5/6特异地影响GPCR-β-arrestin1/2信号的观点。
如前所述，LRP5/6-/-而不是β-catenin-/-小鼠也能诱导心脏β-arrestin1/2 的移位改变(图12A)，这为LRP5/6调控β-arrestin1/2提供了直接证据。由于G 蛋白一般抑制剂BIM-46187能够通过抑制GPCR信号紊乱显著阻止Dkk1直接内吞膜上LRP5/6诱导的心脏β-arrestin1/2移位改变(图19F)及DNA损伤(图15I)，因此，LRP5/6的缺失可以破坏众多GPCR的稳态，引起下游β-arrestin1/2的信号传导，后者促进了DNA损伤反应，严重的DNA损伤甚至会发生凋亡，最终导致器官功能受损。
值得注意的是，LRP5/6和胰岛素受体(insulin receptor，IR)都是单次跨膜蛋白，并且胰岛素受体被认为在糖尿病的发展中起到关键作用，它属于受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTKs)家族，由两个α亚基(IR-α)和两个β亚基(IR-β)通过二硫键连接而成。两个α亚基位于细胞膜外侧，其上有胰岛素的结合位点；两个β亚基是受体的跨膜部分，起信号转导作用。为了探究LRP5/6 在糖尿病心脏损伤中的保护作用是否与胰岛素受体有关，我们考察了糖尿病及其各种干预条件下胰岛素受体的表达情况。如图19A-E所示，糖尿病小鼠或Dkk1蛋白直接注射的心脏细胞膜上和细胞浆内的胰岛素受体并没有发生类似LRP5/6及β-arrestin1/2的移位改变。此外，单独使用胰岛素，MDC或者体内过表达LRP6N 也没有诱导心脏膜上或浆内胰岛素受体的移位(图19G)。因此，这些结果强烈暗示膜上LRP5/6下调是通过特异地调控GPCR-β-arrestin1/2信号来参与糖尿病心脏损伤，而不受胰岛素受体的影响。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海东慈生物科技有限公司
<120> DKK1抑制剂在预防和/或治疗肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病中的应用
<130> P2019-0652
<160> 38
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 266
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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Gly Ile Leu Tyr Pro Gly Gly Asn Lys Tyr Gln Thr Ile Asp Asn Tyr
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Ser Asp Cys Ala Ser Gly Leu Cys Cys Ala Arg His Phe Trp Ser Lys
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<213> 智人(Homo sapiens)
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acccgcggag gggacgcagg cgtgcaaatc tgtctcgcct gcaggaagcg ccgaaaacgc 360
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tgtgctagac acttctggtc caagatctgt aaacctgtcc tgaaagaagg tcaagtgtgt 660
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<213> 小鼠(Mus musculus)
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<400> 38
tcgtagtcat acggtgtggt g 21
Claims (11)
1.一种DKK1基因或其编码蛋白抑制剂的用途，其特征在于，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于预防和/或治疗肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物或制剂还用于选自下组的一种或多种用途：
(a)降低肿瘤细胞内β-arrestin2的含量；
(b)抑制哺乳动物中的IκB和NFκB的激活；
(c)抑制p53和Bax/Bcl-2的上调；
(d)抑制肌肉蛋白标志物的下调；
(e)抑制哺乳动物肌肉组织中的细胞因子的上调。
3.一种药物组合物，其特征在于，包括：
(a1)用于预防和/或治疗(a)肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病的第一活性成分，所述第一活性成分包括：DKK1基因或其编码蛋白抑制剂；
(a2)预防和/或治疗(a)肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病的第二活性成分，所述第二活性成分包括：其他的用于预防和/或治疗肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病的药物；和
(b)药学上可接受的载体。
4.一种药盒，其特征在于，包括：
(i)第一容器，以及位于该第一容器中的活性成分(a1)DKK1基因或其编码蛋白抑制剂，或含有活性成分(a)的药物；和
(ii)第二容器，以及位于该第二容器中的活性成分(a2)其他的用于预防和/或治疗肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病的药物,或含有活性成分(a2)的药物。
5.一种体外降低肿瘤细胞内β-arrestin2的含量的方法，其特征在于，包括步骤：
在DKK1基因或其编码蛋白抑制剂存在的条件下，培养肿瘤细胞，从而降低肿瘤细胞内β-arrestin2的含量。
6.一种权利要求3所述的药物组合物或权利要求4所述药盒的用途，其特征在于，用于制备用于预防和/或治疗肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病的药物。
7.一种筛选肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病的潜在治疗剂的方法，其特征在于，包括：
(a)在测试组中，在培养体系中，在测试化合物的存在下，培养表达DKK1基因或其蛋白的细胞一段时间T1，检测测试组所述培养体系中的DKk1基因或其蛋白的表达量E1和/或活性A1；
并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组所述培养体系中DKK1基因或其蛋白的表达量E2和/或活性A2；和
(b)对E1和E2进行比较，如果E1显著低于E2，则表示所述测试化合物是肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病的潜在治疗剂；或
对A1和A2进行比较，如果A1显著低于A2，则表示所述测试化合物是肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病的潜在治疗剂。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤(c)：将步骤(a)中所确定的潜在治疗剂施用于哺乳动物，从而测定其对哺乳动物的肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病的影响。
9.一种筛选肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病的潜在治疗剂的方法，其特征在于，包括：
(a)在测试组中，在培养体系中，在测试化合物的存在下，培养肿瘤细胞一段时间T1，检测测试组所述培养体系中所述DKK1与LRP6复合物的形成情况；
并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组所述培养体系中所述DKK1与LRP6复合物的形成情况；
(b)如果所述测试组中的所述述DKK1与LRP6复合物的形成数量Q1显著低于所述对照组中的所述述DKK1与LRP6复合物的形成数量Q2，则表示所述测试化合物是候选化合物。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤(b)：将步骤(a)中所确定的候选化合物施用于哺乳动物，从而测定其对哺乳动物的肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病的影响。
11.一种确定肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病的治疗方案的方法，其特征在于，包括：
a)提供来自受试者的测试样品；
b)检测测试样品中DKK1蛋白的水平；和
c)基于所述样品中的DKK1蛋白水平来确定(a)肿瘤恶病质与糖尿病伴随疾病的治疗方案。
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| US4797368A (en) | 1985-03-15 | 1989-01-10 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector |
| US5139941A (en) | 1985-10-31 | 1992-08-18 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | AAV transduction vectors |
| WO1991018088A1 (en) | 1990-05-23 | 1991-11-28 | The United States Of America, Represented By The Secretary, United States Department Of Commerce | Adeno-associated virus (aav)-based eucaryotic vectors |
| US5173414A (en) | 1990-10-30 | 1992-12-22 | Applied Immune Sciences, Inc. | Production of recombinant adeno-associated virus vectors |
| US5252479A (en) | 1991-11-08 | 1993-10-12 | Research Corporation Technologies, Inc. | Safe vector for gene therapy |
| US6566118B1 (en) | 1997-09-05 | 2003-05-20 | Targeted Genetics Corporation | Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors |
| US6989264B2 (en) | 1997-09-05 | 2006-01-24 | Targeted Genetics Corporation | Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors |
| EP2369002A1 (en) | 1999-08-09 | 2011-09-28 | Targeted Genetics Corporation | Enhancement of expression of a single-stranded, heterologous nucleotide sequence from recombinant viral vectors by designing the sequence such that it forms intrastrand base pairs |
| MXPA03007327A (es) * | 2001-02-16 | 2005-02-14 | Genentech Inc | Tratamiento que involucra la proteina dickkopf-1 o antagonistas de la misma. |
| US7709611B2 (en) * | 2004-08-04 | 2010-05-04 | Amgen Inc. | Antibodies to Dkk-1 |
| EP2121755A1 (en) * | 2007-02-08 | 2009-11-25 | Merck & Co., Inc. | Antibodies specific for dkk-1 |
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| CN103608037B (zh) * | 2011-02-01 | 2016-04-13 | 香港大学 | 抗dkk1单克隆抗体用于治疗肝癌的用途 |
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