JP2023521090A

JP2023521090A - ＡＡＶ遺伝子治療のためのＣｐＧフリーＩＴＲ

Info

Publication number: JP2023521090A
Application number: JP2022561124A
Authority: JP
Inventors: ドゥアン，ドンシェン; パン，シウファン; ユエ，ヨンピン
Original assignee: University of Missouri System
Current assignee: University of Missouri System
Priority date: 2020-04-07
Filing date: 2021-04-07
Publication date: 2023-05-23
Also published as: CN115461465A; CO2022014515A2; AU2021251175A1; CA3169945A1; KR20220164708A; MX2022011777A; WO2021207415A1; EP4133092A1; EP4133092A4; US20230250422A1; BR112022019729A2

Abstract

開示されるものは、５’－シトシン－リン酸－グアニン－３’（ＣｐＧ）モチーフを含まない末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）核酸ベクターである。同様に開示されるものは、該ｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子、ならびに核酸の送達のためのおよび／または遺伝子治療のための組成物および方法である。さらに開示されるものは該ｒＡＡＶベクターを使用したＡＡＶ遺伝子治療によって疾患を処置するための組成物および方法である。

Description

連邦政府資金による研究開発の記載
本発明は、国立衛生研究所（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ）により授与された助成金番号ＮＳ０９０６３４およびＡＲ０７０５１７、ならびに陸軍医学研究開発部隊（ＡｒｍｙＭｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＭａｔｅｒｉａｌＣｏｍｍａｎｄ）により授与された助成金番号Ｗ８１ＸＷＨ－１４－１－０３０２の政府支援を得てなされたものである。政府は本発明に対して一定の権利を有する。

関連出願の相互参照
本願は、２０２０年４月７日に出願された米国仮出願番号第６３／００６，１４８号の利益を主張するものであり、ここに本明細書の一部として参照によりその全体を援用する。

配列表の組み込み
配列表の紙媒体のコピー、およびサイズが５，６４５バイト（ＭＩＣＲＯＳＯＦＴＷＩＮＤＯＷＳ^{（登録商標）}ＥＸＰＬＯＲＥＲで測定）であり、ファイル名が「２０ＵＭＣ０３７＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」であるファイルを含む、コンピューター可読形式の配列表をここに提供し、ここに本明細書の一部として参照により援用する。本配列表は配列番号１～１９からなる。

本開示の背景
本開示は一般に５’－シトシン－リン酸－グアニン－３’（ＣｐＧ）モチーフフリーな末端逆位反復配列（ＩＴＲ）（すなわち、ＣｐＧモチーフを全く含まないＩＴＲ）を含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）核酸ベクターに関する。より具体的には、本開示はｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子、核酸送達のための組成物および方法、ならびに遺伝子治療のための組成物および方法に関する。本開示はさらに、ｒＡＡＶベクターを使用したＡＡＶ遺伝子治療による疾患を処置するための組成物および方法に関する。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、アデノウイルス株中の異物粒子として最初に発見されたヘルパー依存性パブロウイルスである。ＡＡＶは～４．７ｋｂの一本鎖ＤＮＡゲノムを含む。ＡＡＶは８０年代後半から９０年代前半に遺伝子送達／遺伝子治療ベクターとして開発された。３つのＡＡＶベクターが遺伝性疾患の処置用として規制当局から承認されている。これらにはリポタンパク質リパーゼ欠損症の処置のためのＧｌｙｂｅｒａ、レーバー先天性黒内障の治療のためのＬｕｘｔｕｒｎａ（Ｖｏｒｅｔｉｇｅｎｅｎｅｐａｒｖｏｖｅｃ－ｒｚｙｌ）および脊髄性筋萎縮症の治療のためのＺｅｎｇｅｎｓｍａ（Ｏｎａｓｅｍｎｏｇｅｎｅａｂｅｐａｒｖｏｖｅｃ－ｘｉｏｉ）が含まれる。ＡＡＶ遺伝子治療は、血友病Ａ、血友病Ｂ、Ｘ連鎖性筋管ミオパチー、巨大軸索神経障害などの多くのその他の遺伝子疾患においても顕著な臨床的成功をもたらした。

ｒＡＡＶベクターは、野生型ＡＡＶ複製（Ｒｅｐ）および構造／カプシド（Ｃａｐ）オープンリーディングフレームを導入遺伝子発現カセットと置き換える事で生成される。２つの末端逆位反復配列（ＩＴＲ）は、ｒＡＡＶベクターにおける唯一の野生型ウイルス配列である（図１Ａ）。各ＩＴＲはフリップまたはフロップの何れかの構造で、Ｔ字のヘアピン構造を形成するヌクレオチドからなる。

ＩＴＲは、野生型ＡＡＶとｒＡＡＶの両方のゲノム複製、子孫ゲノムの生成およびカプシド形成、および一本鎖ベクターゲノムから持続的な導入遺伝子発現のための転写能力のある潜在型への変換に不可欠である。ＡＡＶベクターの産生は、二本鎖プロウイルスプラスミド（シス－プラスミド（ｃｉｓ－ｐｌａｓｍｉｄ））からベクターゲノムを首尾よく救出すること、続く自己プライミング機構を介したベクターゲノムの複製、ならびに一本鎖ゲノムの置換および組み立て済みのカプシドへのカプシド形成に依存する。ＩＴＲはこれらの過程の全てについて不可欠である。具体的には、大きなＲｅｐタンパク質はＲＢＥおよびＲＢＥ’エレメントに結合する。これらの相互作用により、大きなＲｅｐタンパク質は、配列および鎖特異的に末端分解部位（ｔｒｓ）でニックを作るよう位置づけられる。この切断によって生じた遊離の３’ＯＨ基が第二のＩＴＲ合成のための複製プライマーとして機能する。さらなる複製によって新たな相補鎖が産生され、元の相補鎖は置換される。置換鎖（ベクターゲノム）は、小さなＲｅｐタンパク質によって、５重チャネル（５－ｆｏｌｄｃｈａｎｎｅｌ）を介して、あらかじめ形成された空のカプシドに３’から５’の方向に送り込まれる。ベクター産生において果たす重要な役割に加えて、ＩＴＲはＡＡＶのトランスダクションにおいても重要である。ＩＴＲからプライミングされるベクターゲノムの一本鎖から二本鎖への変換は、導入遺伝子の転写に必須の条件である。持続的なＡＡＶトランスダクション（持続的な導入遺伝子の発現）もＩＴＲ間の組み換えおよび続くエピソーム性環状ＡＡＶゲノムの形成に依存する。

ＡＡＶ遺伝子治療を基礎研究から臨床研究へと移行する顕著な進歩にも関わらず、依然として重要な障害が存在している。これらのうちには免疫応答がある。ＡＡＶは当初は弱い免疫原性ベクターであると考えられていた。しかし、細菌の動物実験の結果および臨床試験のデータは、ＡＡＶベクターが自然免疫および適応免疫機構の両者を介して顕著な免疫応答を誘導し得る事を示唆する。

これらの欠点は、新たな増強されたＡＡＶ遺伝子治療技術を開発する必要性を強調する。したがって、改善された免疫原性特性を有するＡＡＶ遺伝子治療ベクターを開発する必要が存在する。

ＩＴＲの遺伝子改変は、ＡＡＶベクターの免疫原性を低下させるアプローチであり得る。残念なことに、ＩＴＲの変異誘発は機能的な欠損を伴う事が知られている。

ＩＴＲの構造と機能の関係は変異誘発によって広範に調べられてきた。ほとんどのＩＴＲの変異は有害である。それらはＡＡＶの複製および／またはカプシド形成に悪影響を及ぼす（Ｒｙａｎｅｔａｌ．，１９９６；Ｗａｎｇｅｔａｌ．，１９９８；ＢｒｉｓｔｅｒａｎｄＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９９；２０００；ＭｃＣａｒｔｙｅｔａｌ．，２００３；Ｚｈｏｎｇｅｔａｌ．，２００８；Ｚｈｏｕｅｔａｌ．，２００８；Ｌｉｎｇｅｔａｌ．，２０１５；Ｚｈｏｕｅｔａｌ．，２０１７）。ＲＢＥの２つのヌクレオチドのトランスバージョン変異はＲｅｐの結合を２倍から１０倍低下させる（Ｒｙａｎｅｔａｌ．，１９９６）。ＲＢＥのコア配列における１ヌクレオチドのトランスバージョン変異は最大で５倍までＲｅｐの結合を低下させる（Ｒｙａｎｅｔａｌ．，１９９６）。ｔｒｓの１ヌクレオチドのトランスバージョン変異は大きなＲｅｐタンパク質によるニック形成（ｎｉｃｋｉｎｇ）をほとんど停止させる（ＢｒｉｓｔｅｒおよびＭｕｚｙｃｚｋａ１９９９）。ＢおよびＣ腕の短縮（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）はＡＡＶの複製の８倍の減少をもたらす（Ｚｈｏｕｅｔａｌ．，２０１７）。１つのＩＴＲにおけるｔｒｓの欠失は、変異ＩＴＲからのＡＡＶゲノムの複製を完全に防ぐ（ＭｃＣａｒｔｙｅｔａｌ．，２００３；ＭｃＣａｒｔｙ，２００８）。Ｄ配列の欠失および／または置換によって、ＡＡＶは、両方の代わりに、プラス鎖またはマイナス鎖のゲノムのみをパッケージするようにする（Ｚｈｏｎｇｅｔａｌ．，２００８；Ｚｈｏｕｅｔａｌ．，２００８；Ｌｉｎｇｅｔａｌ．，２０１５）。ＩＴＲの欠陥は非ベクター配列のパッケージとも関連する（Ｗａｎｇｅｔａｌ．，１９９６；Ｗａｎｇｅｔａｌ．，１９９８；Ｓａｖｙｅｔａｌ．，２０１７；Ｔａｉｅｔａｌ．，２０１８）。まとめると、これらの研究はＡＡＶ遺伝子治療において無傷のＩＴＲを維持する事の重要性を明らかにする。

本開示の簡単な説明
本開示は、一般的に、５’－シトシン－リン酸－グアニン－３’（ＣｐＧ）モチーフを含まない末端逆位反復配列（ＩＴＲ）（すなわち、ＣｐＧモチーフを全く含まないＩＴＲ）に関する。より具体的には、本開示はＣｐＧモチーフを含まないＩＴＲ（すなわちＣｐＧモチーフを全く含まないＩＴＲ）を含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）核酸ベクターに関する。本開示はまた、ｒＡＡＶベクターを含むｒＡＡＶ粒子および医薬組成物に関する。本開示はまた、核酸送達のための方法およびＡＡＶ遺伝子治療のための方法に関する。本開示はさらにｒＡＡＶベクターを使用したＡＡＶ遺伝子治療による疾患を処置するための組成物および方法に関し、ここでｒＡＡＶベクターのＩＴＲはＣｐＧモチーフを含まない（すなわち、ＩＴＲがＣｐＧモチーフを全く含まない）。

１つの態様では、本開示は５’－シトシン－リン酸－グアニン－３’（ＣｐＧ）モチーフを含まない末端逆位反復配列（ＩＴＲ）（すなわち、ＩＴＲはＣｐＧモチーフを全く含まない）に関する。

１つの態様では、本開示は、５’－シトシン－リン酸－グアニン－３’（ＣｐＧ）モチーフを含まない末端逆位反復配列（ＩＴＲ）（すなわち、ＩＴＲはＣｐＧモチーフを全く含まない）を含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）核酸ベクターに関する。

別の態様では、本開示は、５’－シトシン－リン酸－グアニン－３’（ＣｐＧ）モチーフを含まないＩＴＲ（すなわち、ＩＴＲはＣｐＧモチーフを全く含まない）を含むｒＡＡＶ核酸ベクターおよびウイルスカプシドを含むｒＡＡＶ粒子に関する。

別の態様では、本開示は、ＣｐＧモチーフフリーのＩＴＲを含むｒＡＡＶ核酸ベクターおよび薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物に関する。好ましくは、ＩＴＲはＣｐＧを含まないＩＴＲである（すなわち、ＩＴＲはＣｐＧモチーフを全く含まない）。

別の態様では、本開示は、５’－シトシン－リン酸－グアニン－３’（ＣｐＧ）モチーフを含まないＩＴＲを含むｒＡＡＶベクターを細胞に投与する事を含む、細胞に核酸を送達する方法に関する。

別の態様では、本開示は、５’－シトシン－リン酸－グアニン－３’（ＣｐＧ）モチーフを含まないＩＴＲを含む治療有効量のｒＡＡＶベクターを対象に投与する事を含む、必要とする対象における疾患の処置方法に関する。好ましくは、ＩＴＲはＣｐＧフリーＩＴＲである（すなわち、ＩＴＲはＣｐＧモチーフを全く含まない）。

図面の簡単な説明
以下の詳細な説明を考慮することで、本開示はよりよく理解され、且つこれまで記載した事以外の特徴、態様および利点も明らかになるだろう。かかる詳細な説明は以下の図面を参照するものである。

図１Ａは、ＡＡＶベクターの模式的な概要を示す。

図１Ｂは、ＡＡＶ１（配列番号１）、２（配列番号２）、３（配列番号３）、４（配列番号４）、６（配列番号５）、７（配列番号６）およびＣｐＧフリーＡＡＶのバージョン１（ＡＡＶＣｐＧフリー１；配列番号７）に由来する３’－ＩＴＲのアライメントを示す。

図１Ｃは、野生型ＩＴＲ（配列番号８）およびバージョン１ＣｐＧフリーＩＴＲ（配列番号９）において、フロップ構造におけるベクターゲノムの５’末端（５’－ＩＴＲ）でのＣｐＧモチーフを排除するためになされる変異の二次元図を示す。

図１Ｄは野生型３’－ＩＴＲ（１３０ヌクレオチド）配列（配列番号１０）およびＣｐＧフリー３’－ＩＴＲ（配列番号７）をもたらす塩基の変更を示す、フロップ構造における３’－ＩＴＲの二次元図を示す。

図１Ｅは、ＡＡＶ１（配列番号１）、２（配列番号２）、３（配列番号３）、４（配列番号４）、６（配列番号５）、７（配列番号６）およびＣｐＧフリーＡＡＶのバージョン－２（ＡＡＶＣｐＧフリー２；配列番号１１）に由来する３’－ＩＴＲのアライメントを示す。

図２Ａは各ベクターについて、３回の独立した生産ラウンドからのベクターの収量の定量を示す。

図２Ｂは、野生型ＩＴＲベクターおよびＣｐＧフリーＩＴＲベクターの代表的な透過型電子顕微鏡の画像を示す。

図２Ｃは、空の粒子の定量を示す。

図３Ａは、ＡＡＶマイクロ－ジストロフィン注射を受けなかった（未注射、右側パネル）、ＣｐＧフリーＡＡＶマイクロ－ジストロフィンベクターを注射された（ＣｐＧフリーＩＴＲ、左側パネル）、および野生型ＡＡＶマイクロ－ジストロフィンベクターを注射された（野生型ＩＴＲ、中央のパネル）、ジストロフィン－ヌルｍｄｘマウスの前脛骨筋からの、代表的なジストロフィンの免疫蛍光染色およびＨＥ染色の顕微鏡画像を示す。

図３Ｂは、ＣｐＧフリーＡＡＶマイクロ－ジストロフィンベクター（ＣｐＧフリーＩＴＲ）、または野生型ＡＡＶマイクロ－ジストロフィンベクター（野生型ＩＴＲ）のどちらかを受けたジストロフィン－ヌルｍｄｘマウスの前脛骨筋におけるジストロフィン陽性筋線維の定量を示す。

図３Ｃは、ＡＡＶマイクロ－ジストロフィン注射を受けなかった（未注射）、ＣｐＧフリーＡＡＶマイクロ－ジストロフィンベクターを注射された（ＣｐＧフリーＩＴＲ）、および野生型ＡＡＶマイクロ－ジストロフィンベクターを注射された（野生型ＩＴＲ）、ジストロフィン－ヌルｍｄｘマウスの前脛骨筋におけるマイクロ－ジストロフィン発現のウェスタンブロット評価を示す。

図３Ｄは、ＣｐＧフリーＡＡＶマイクロ－ジストロフィンベクター（ＣｐＧフリーＩＴＲ）、または野生型ＡＡＶマイクロ－ジストロフィンベクター（野生型ＩＴＲ）のどちらかを受けたジストロフィン－ヌルｍｄｘマウスの前脛骨筋における、ウェスタンブロットによるジストロフィンの発現レベルの定量を示す。

図３Ｅは、ＣｐＧフリーＡＡＶマイクロ－ジストロフィンベクター（ＣｐＧフリーＩＴＲ）、または野生型ＡＡＶマイクロ－ジストロフィンベクター（野生型ＩＴＲ）のどちらかを受けたジストロフィン－ヌルｍｄｘマウスの前脛骨筋における、定量ＰＣＲによる、ＡＡＶベクターゲノムのコピー数の定量を示す。

図４Ａ－４Ｆは、前脛骨筋の代表的な全景ジストロフィン免疫染色およびヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色の顕微鏡画像を示す。同上。同上。

図５Ａおよび５Ｂは、中心核形成および筋線維の大きさ分布の評価を示す。

図６Ａ－６Ｈは、筋肉収縮の定量的評価を示す。同上。同上。同上。

本開示は様々な改変および代替的な形態をとり得るが、その特定の実施形態を図面において例示し、本明細書において以下に詳細に記載する。しかし、特定の実施形態の記載は、全ての改変、等価物および代替物が添付の特許請求の範囲によって規定されるような本開示の精神および範囲に入るように補完するために本開示を限定する事を意図するものではない事を理解されたい。

本開示の詳細な説明
別段の規定がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野における当業者が通常理解する意味と同じ意味を有する。本開示の実施または試験において、本明細書に記載される方法および材料と類似するかまたは等価である任意の方法および材料を使用する事ができるが、以下に好ましい方法および材料を記載する。

本開示のアプローチは、野生型ＩＴＲに比して１つ以上のＣｐＧモチーフを欠いたＩＴＲを生産する事である。好ましくは、ＩＴＲはＣｐＧフリーＩＴＲである。いくつかの態様では、ＩＴＲはｒＡＡＶベクターにおいて使用される。驚くべきことに、この変異にも関わらず、ＩＴＲは遺伝子送達のための機能を維持する。このアプローチの重要な利点は、ｒＡＡＶベクターがＣｐＧモチーフを全く含まない事である（すなわち、何れのＣｐＧモチーフも欠いている；また本明細書では「ＣｐＧフリー」と称する）。

１つの態様では、本開示は、少なくとも１つの５’－シトシン－リン酸－グアニン－３’（ＣｐＧ）モチーフを欠いた末端逆位反復配列（ＩＴＲ）に関する。好ましくは、ＩＴＲは何れのＣｐＧモチーフも含まない（すなわち、「ＣｐＧフリー」である）。好ましくは、ＩＴＲは配列番号７、配列番号９、配列番号１１、および配列番号１２の内の１つである。

１つの態様では、本開示は１つ以上の５’－シトシン－リン酸－グアニン－３’（ＣｐＧ）モチーフを欠いた末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）核酸ベクターに関する。好ましくは、ＩＴＲは何れのＣｐＧモチーフも含まない（すなわち、「ＣｐＧフリー」である）。好ましくは、ＩＴＲは配列番号７、配列番号９、配列番号１１、および配列番号１２の内の１つである。

本明細書で使用する場合、５’－シトシン－リン酸－グアニン－３’（ＣｐＧ）モチーフは、一本鎖の直鎖配列における、１つのリン酸基で分離されたシトシン（Ｃ）およびグアニン（Ｇ）を指す。ＣｐＧの表記は、この一本鎖の直鎖配列を、二本鎖配列のシトシンとグアニンのＣＧ塩基対と区別するために使用される。特定の理論に拘束されることなく、ＩＴＲのＣｐＧモチーフの数を減らすと、Ｔ細胞応答が減弱し、導入遺伝子の発現が延長されると考えられている。メチル化されていないＣｐＧモチーフは、取り込まれた後、形質細胞様樹状細胞のエンドソームにおいてＴｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）によって感知され（Ｚｈｕｅｔａｌ．，２００９；Ｍａｒｔｉｎｏｅｔａｌ．，２０１１；Ｔｏｔｈｅｔａｌ．，２０１９）、およびこれはＩ型インターフェロンの産生および細胞障害性Ｔリンパ球細胞の活性化をもたらすと考えられている（Ｚｈｕｅｔａｌ．，２００９；Ｒｏｇｅｒｓｅｔａｌ．，２０１５；Ｒｏｇｅｒｓｅｔａｌ．，２０１７；Ａｓｈｌｅｙｅｔａｌ．，２０１９）。

本明細書で使用する場合、組み換えアデノ随伴ウイルス核酸ベクター、またはｒＡＡＶベクターは、ゲノム５’末端に５’－ＩＴＲを、およびゲノムの３’末端に３’－ＩＴＲを持つ一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）鎖を指す。５’－ＩＴＲおよび３’－ＩＴＲ間のＤＮＡは、異種細胞に遺伝物質を運搬するために使用され得る発現カセットであり得る。ｒＡＡＶベクターという用語は、核酸鎖における塩基の配列（一次構造）または３次元的に折りたたまれたｓｓＤＮＡ分子（三次構造）を表し得る。

いくつかの実施形態では、組み換えアデノ随伴ウイルス核酸ベクター、またはｒＡＡＶベクターはまた、ゲノムの真ん中に末端分解部位が変異したＩＴＲを有し、５’末端および３’末端に２つのオープンエンドの通常のＩＴＲを有する自己相補型ベクターを指す。ゲノムの５’側と、ゲノムの３’側の折り返しによって、相補的な二本鎖デオキシリボ核酸（ｄｓＤＮＡ）が形成され、これは異種細胞への遺伝物質の送達に使用される。

本明細書で使用する場合、「野生型ＡＡＶＩＴＲ」とは、天然に存在するアデノ随伴ウイルスおよび組み換えＡＡＶベクターにおける末端ｓｓＤＮＡセグメントである５’－ＩＴＲおよび３’－ＩＴＲの一方またはその両方を指す。天然に存在するアデノ随伴ウイルスの例には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３を含む。本開示のＣｐＧフリーＩＴＲの調製という点で、参照として使用するために特に好適な野生型ＡＡＶＩＴＲはアデノ随伴ウイルスセロタイプ２（ＡＡＶ２）に由来するものである。野生型ＡＡＶＩＴＲという用語は、核酸鎖における塩基配列（一次構造）、または三次元的に折りたたまれたｓｓＤＮＡＡＡＶベクター分子中のＩＴＲセグメント（三次構造）を指す。典型的なｒＡＡＶベクターはＩＴＲの配列を除くすべての天然のウイルス配列を欠いている。よって、遺伝子療法またはその他のｒＡＡＶ適用に使用される多くのベクターは野生型ＡＡＶＩＴＲを含むベクターが用いられる。したがって、本明細書で使用される場合、野生型ＡＡＶＩＴＲという用語は多くのｒＡＡＶベクターにおいて使用される野生型ＡＡＶＩＴＲを包含する事が理解されよう。野生型ＡＡＶＩＴＲ配列の例には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６を含む。

野生型ＡＡＶＩＴＲは約１４５個の核酸を含む。本開示のＩＴＲは約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約１００から約１５０、約１１０から約１５０、約１１０から約１４０、約１２０から約１４０、約１２０から約１５０、約１３０から約１５０、または約１３０から約１４０個の核酸を含む。野生型ＩＴＲの末端の１５－１７ヌクレオチド（すなわち、５’－ＩＴＲの５’末端の１５－１７ヌクレオチドおよび／または３’－ＩＴＲの３’末端の１５－１７ヌクレオチド）の欠失はＩＴＲの機能を変化させないことが観察されており（Ｓａｍｕｌｓｋｉｅｔａｌ．，１９８７；Ｓａｖｙｅｔａｌ．，２０１７）、したがって本開示の特に好適なＩＴＲは約１３０個の核酸を含む。

いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、および配列番号１２の１つ以上に対して、約７０％から約９９％、約７０％から約９５％、約７０％から約９０％、約７０％から約８０％、約８０％から約９９％、約８０％から約９５％、または約８０％から約９０％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、および配列番号１２の１つ以上に対して約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を含む。

いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、野生型ＡＡＶＩＴＲに含まれる１つ以上のＣｐＧモチーフを欠く。野生型ＡＡＶベクター中の２つの野生型ＡＡＶＩＴＲは全部で３２個のＣｐＧモチーフを含む（各１６個）。いくつかの実施形態では、１つのＩＴＲは、野生型ＡＡＶＩＴＲにおける１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６個のＣｐＧモチーフを欠く。いくつかの実施形態では、２つのＩＴＲは、野生型ＡＡＶＩＴＲにおける１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、または３２個のＣｐＧモチーフを欠く。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、１つ以上の野生型ＡＡＶＩＴＲに対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、または９９％の配列同一性を含み、およびＩＴＲは、野生型ＡＡＶＩＴＲにおける１６個のＣｐＧモチーフの内の１つ以上を欠く。特に好適なＩＴＲは、１つ以上のセロタイプ－２の野生型ＡＡＶＩＴＲ（ＡＡＶ２ＩＴＲ）に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、または９９％の配列同一性を有し、およびＩＴＲは野生型ＡＡＶ２ＩＴＲにおける１６個のＣｐＧモチーフの内の１つ以上を欠く。好ましい実施形態では、配列同一性の計算は、野生型ＩＴＲの末端の１５ヌクレオチド（すなわち、５’－ＩＴＲの５’末端の１５ヌクレオチドおよび／または３’－ＩＴＲの３’末端の１５ヌクレオチド）を無視する。

好ましくは、ＩＴＲはＣｐＧモチーフを含まない（すなわち、何れのＣｐＧモチーフも含まないＣｐＧフリーＩＴＲである）。本明細書で使用する場合、ＣｐＧフリーＩＴＲは、何れのＣｐＧモチーフも含まないＩＴＲを意味する。野生型ＡＡＶベクター中の２つのＩＴＲは全部で３２個のＣｐＧモチーフを含む（各１６個）。いくつかの実施形態では、１つのＩＴＲは、野生型ＡＡＶＩＴＲにおける１６個のＣｐＧモチーフを欠く。いくつかの実施形態では、２つのＩＴＲは野生型ＡＡＶＩＴＲにおける３２個のＣｐＧモチーフを欠く。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、１つ以上の野生型ＡＡＶＩＴＲに対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも８５％の配列同一性を含み、およびＩＴＲは、野生型ＡＡＶＩＴＲにおける１６個のＣｐＧモチーフを欠く。特に好適なＩＴＲは、１つ以上のセロタイプ－２の野生型ＡＡＶＩＴＲ（ＡＡＶ２ＩＴＲ）に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％の配列同一性を有し、ならびに、１つのＩＴＲは野生型ＡＡＶ２ＩＴＲにおける１６個のＣｐＧモチーフを欠く、および／または２つＩＴＲは野生型ＡＡＶ２ＩＴＲにおける３２個のＣｐＧモチーフを欠く。好ましい実施形態では、配列同一性の計算は、野生型ＩＴＲの末端の１５ヌクレオチド（すなわち、５’－ＩＴＲの５’末端の１５ヌクレオチドおよび／または３’－ＩＴＲの３’末端の１５ヌクレオチド）を無視する。

２つの配列の同一性パーセントは、最適比較のための配列のアライメントによって決定され得る。例えば、第２の核酸配列との最適アライメントのために、第１の核酸配列の配列中にギャップが導入され得る。そして、対応する位置にあるヌクレオチドを比較する。第１の配列中のある位置が、第２の配列において対応する位置のヌクレオチドと同じヌクレオチドによって占められる場合、核酸はその位置において同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、配列が共有する同一のヌクレオチドの数の関数である。したがって、同一性パーセント＝［同一のヌクレオチドの数／重なる位置の総数］×１００。配列同一性のパーセンテージはこの式に従って計算することができ、比較される最適にアライメントされた配列を比較し、両方の配列において同一の核酸が生じる位置の数を決定して一致する位置の数（上記の式の「同一の位置の数」）を求め、一致する位置の数を比較された位置の総数（上記の式の「重なる位置の総数」）で除算し、およびその結果に１００を掛けることで配列同一性パーセントが求まる。この比較において配列は同じ長さであってよく、または異なる長さであってもよい。比較ウィンドウを決定するための配列の最適アライメントは、ＳｍｉｔｈａｎｄＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｈ（１９７２）（ＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ，１９７０）の相同性アライメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎａｎｄＬｉｐｍａｎ（１９８８）（ＰｅａｒｓｏｎａｎｄＬｉｐｍａｎ，１９８８）の手法による類似性の検索、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実装（ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡａｎｄＴＦＡＳＴＡｉｎａＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓＳｏｆｔｗａｒｅＰａｃｋａｇｅＲｅｌｅａｓｅ７．０，ＧｅｎｅｔｉｃＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ，５７５，ＳｃｉｅｎｃｅＤｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）または検査によって行われ得る。

好ましくは、ＩＴＲは、ＣｐＧモチーフにおけるＣまたはＧ残基の点変異によって、野生型ＡＡＶＩＴＲにおける１６個のＣｐＧモチーフの１つ以上を欠く。特定の実施形態では、ＣｐＧモチーフにおけるＣまたはＧ残基の点変異のいくつかのまたは全てはトランジション変異である。例えば、本開示のＩＴＲは野生型ＩＴＲに対して約８５％の配列同一性を含み（配列同一性の計算において削除された野生型ＩＴＲの末端の１５ヌクレオチドは無視する）、および全て野生型ＩＴＲのシトシン［Ｃ］および／またはグアニン［Ｇ］をアデニン［Ａ］、またはチミン［Ｔ］、またはグアニン［Ｇ］、またはシトシン［Ｃ］に置き換える点変異であるＩＴＲの変異によって、野生型ＩＴＲにおける１６個のＣｐＧモチーフすべてを欠き得る。

「トランジション変異」は、当業者に理解される通りのその元の意味に従って使用され、ピリミジン塩基（すなわち、チミン［Ｔ］またはシトシン［Ｃ］）が別のピリミジン塩基に置換されるか、またはプリン塩基（すなわち、アデニン［Ａ］またはグアニン［Ｇ］）が別のプリン塩基に置換される際に起こる。

野生型ＩＴＲは、例としてＡＡＶ２の５’－ＩＴＲ（図１Ｃ、配列番号８）に示すように、Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’およびＤ配列を含む７つのセグメントに分けられる。配列Ａ、ＢおよびＣは、それぞれ配列Ａ’、Ｂ’およびＣ’と逆向きに相補的である。配列Ｂ／Ｂ’およびＣ／Ｃ’の塩基対はＩＴＲのＴ字ヘアピン構造の２つの腕を構成する。配列ＡおよびＡ’の対はＴ字のＩＴＲの軸を形成する。２０ヌクレオチド長のＤ配列はＡＡＶベクター中で一本鎖ＤＮＡとして維持される（図１Ｃおよび１Ｄ）。

野生型ＩＴＲは機能を持つために不可欠な３つの配列エレメントを含む。これらには、Ｒｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）、第２のＲｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ’）および末端分解部位（ｔｒｓ）を含む。ＲＢＥはＡ／Ａ’軸中に位置し、２２ｂｐの配列からなる（図１Ｃおよび１Ｄ）ＲＢＥ内には、１０ｂｐのコア配列が存在する（図１Ｃおよび１Ｄ）。コア配列における２ヌクレオチドのトランスバージョン変異はＲｅｐ結合親和性を少なくとも１０倍低下させる（Ｒｙａｎｅｔａｌ．，１９９６）。３つのＧＡＧＹの４ヌクレオチドの反復（相補鎖におけるＲＣＴＣ）は、ＲＢＥにおけるコンセンサスＲｅｐ－結合モチーフであると考えられている（Ａｍｉｓｓｅｔａｌ．，２００３；Ｗｉｌｍｏｔｔｅｔａｌ．，２０１９）。ＹはＣまたはＴを指し、およびＲはＡまたはＧを指す。このコンセンサスＲｅｐ－結合モチーフおよびその周辺の配列はＲｅｐ結合に重要である（Ｗｉｌｍｏｔｔｅｔａｌ．，２０１９）。いくつかの実施形態では、４つのＧＭＧＹの４ヌクレオチドの反復（相補鎖におけるＲＣＫＣ）およびそれに隣接する配列はＲｅｐ結合に重要であると考えられている。ＭはＡまたはＣを指し、ＫはＧまたはＴを指す。ＡＡＶ２ＩＴＲの文脈では、４つのＧＭＧＣの４ヌクレオチドの反復（相補鎖におけるＧＣＫＣ）およびそれに隣接する配列（５’末端のＣＡＧＴおよび３’末端のＡＧ）がＲｅｐ結合に必要である（Ｒｙａｎｅｔａｌ．，１９９６）。ＲＢＥ’はＢまたはＣ腕のどちらかの先端に位置する。それは５ヌクレオチド配列からなる（図１Ｃおよび１Ｄ）（ＢｒｉｓｔｅｒａｎｄＭｕｚｙｃｚｋａ，２０００）。ｔｒｓは、Ａ／Ａ’軸およびＤ配列の連結部に位置する７ヌクレオチド配列である（ＢｒｉｓｔｅｒａｎｄＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９９）。

野生型ＩＴＲには１６個のＣｐＧモチーフが存在する（図１Ｂおよび１Ｃ）。これらの領域における変異はＩＴＲの機能に影響する事が知られている（Ｒｙａｎｅｔａｌ．，１９９６；ＢｒｉｓｔｅｒａｎｄＭｕｚｙｃｚｋａ，１９９９；２０００；Ｚｈｏｕｅｔａｌ．，２０１７）。これらのＣｐＧモチーフはＡ／Ａ’軸（配列Ａに４つ、配列Ａ’に４つ）、Ｂ／Ｂ’腕（配列Ｂに２つ、配列Ｂ’に２つ）およびＣ／Ｃ’腕（配列Ｃに２つ、配列Ｃ’に２つ）に位置する。３つのＩＴＲに不可欠なエレメントの内、ＲＢＥのみがＣｐＧモチーフを含む（コア配列に６つ、および全部で８つ）。ＲＢＥ’およびｔｒｓにはＣｐＧモチーフはない。

いくつかの実施形態では、本開示のＩＴＲは、トランジション変異を含むＲｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）を含む。好ましくは、ＲＢＥにおける全ての変異はトランジション変異である。いくつかの実施形態では、ＩＴＲはトランジション変異、トランスバージョン変異およびその組み合わせを含み得る。

ＡＡＶベクター（野生型および改変型）はベクターの両端にある２つのＩＴＲ、５’末端ＩＴＲおよび３’末端ＩＴＲを含む（図１Ａ）。したがって、本開示のｒＡＡＶベクターもまた２つのＩＴＲ、５’末端ＩＴＲおよび３’末端ＩＴＲを含み、ならびに少なくとも１つ、好ましくは両者のＩＴＲは１つ以上のＣｐＧモチーフを欠く。より好ましくは、少なくとも１つ、好ましくは両者のＩＴＲはＣｐＧフリーである。様々な実施形態では、ｒＡＡＶベクターはＣｐＧフリーの５’末端ＩＴＲ、ＣｐＧフリーの３’末端－ＩＴＲおよびその組み合わせを含む。

いくつかの実施形態では、５’末端ＩＴＲは、５’末端－ＩＴＲのＡセグメントにおける最初のＣｐＧモチーフにおいてグアニンからチミンへの置換を含む。いくつかの実施形態では、５’末端ＩＴＲはＡセグメントにおける３つの残ったＣｐＧモチーフにおいてグアニンからアデニンへの置換を含む。

いくつかの実施形態では、５’末端ＩＴＲは、５’末端ＩＴＲのＣセグメントにおける最初のＣｐＧモチーフにおいてグアニンからアデニンへの置換を含み、およびＣセグメントにおけるすぐ下流のシトシンにおいてシトシンからグアニンへの置換を含む。いくつかの実施形態では、５’末端ＩＴＲは、５’末端ＩＴＲのＣセグメントの第２のＣｐＧモチーフにおいてグアニンからシトシンへの置換を含み、およびＣセグメントにおけるすぐ下流のグアニンにおいてグアニンからチミンへの置換を含む。

いくつかの実施形態では、５’末端ＩＴＲは５’末端ＩＴＲのＣセグメントにおける最初のＣｐＧモチーフにおいてグアニンからチミンへの置換を含み、およびＣセグメントにおけるすぐ下流のシトシンにおいてシトシンからグアニンへの置換を含む。いくつかの実施形態では、５’末端ＩＴＲは、５’末端ＩＴＲのＣセグメントの第２のＣｐＧモチーフにおいてシトシンからアデニンへの置換を含み、およびＣセグメントにおけるすぐ下流のグアニンにおいてグアニンからアデニンへの置換を含む。

いくつかの実施形態では、５’末端ＩＴＲは、５’末端ＩＴＲのＢセグメントにおける最初のＣｐＧモチーフにおいてグアニンからアデニンへの置換を含む。いくつかの実施形態では、５’末端ＩＴＲは、５’末端ＩＴＲのＢセグメントにおける第２のＣｐＧモチーフにおいてグアニンからシトシンへの置換を含む。

いくつかの実施形態では、５’末端ＩＴＲは、５’末端ＩＴＲのＢセグメントにおける最初のＣｐＧモチーフにおいてグアニンからチミンへの置換を含む。いくつかの実施形態では、５’末端ＩＴＲは、５’末端ＩＴＲのＢセグメントにおける第２のＣｐＧモチーフにおいてシトシンからグアニンへの置換を含む。

いくつかの実施形態では、５’末端ＩＴＲのＡ’、Ｂ’およびＣ’セグメントにおける対応する塩基は相補的な塩基で置換される。

いくつかの実施形態では、３’末端ＩＴＲは、３’末端－ＩＴＲのＡセグメントにおける最初のＣｐＧモチーフにおいてグアニンからチミンへの置換を含む。いくつかの実施形態では、３’末端ＩＴＲは３’末端－ＩＴＲのＡセグメントにおける３つの残ったＣｐＧモチーフにおいてグアニンからアデニンへの置換を含む。

いくつかの実施形態では、３’末端ＩＴＲは、３’末端ＩＴＲのＢセグメントにおける最初のＣｐＧモチーフにおいてグアニンからアデニンへの置換を含む。いくつかの実施形態では、３’末端ＩＴＲは、３’末端ＩＴＲのＢセグメントにおける第２のＣｐＧモチーフにおいてシトシンからグアニンへの置換およびグアニンからシトシンへの置換を含む。

いくつかの実施形態では、３’末端ＩＴＲは、３’末端ＩＴＲのＢセグメントにおける最初のＣｐＧモチーフにおいてグアニンからチミンへの置換を含む。いくつかの実施形態では、３’末端ＩＴＲは、３’末端ＩＴＲのＢセグメントにおける第２のＣｐＧモチーフにおいてシトシンからグアニンへの置換を含む。

いくつかの実施形態では、３’末端ＩＴＲは、３’末端ＩＴＲのＣセグメントにおける最初のＣｐＧモチーフにおいてグアニンからアデニンへの置換を含み、およびＣセグメントにおけるすぐ下流のシトシンにおいてシトシンからグアニンへの置換を含む。いくつかの実施形態では、３’末端ＩＴＲは、３’末端ＩＴＲのＣセグメントの第２のＣｐＧモチーフにおいてグアニンからシトシンへの置換を含み、およびＣセグメントにおけるすぐ下流のグアニンにおいてグアニンからチミンへの置換を含む。

いくつかの実施形態では、３’末端ＩＴＲは、３’末端ＩＴＲのＣセグメントにおける最初のＣｐＧモチーフにおいてグアニンからチミンへの置換を含み、およびＣセグメントにおけるすぐ下流のシトシンにおいてシトシンからグアニンへの置換を含む。いくつかの実施形態では、３’末端ＩＴＲは、３’末端ＩＴＲのＣセグメントの第２のＣｐＧモチーフにおいてシトシンからアデニンへの置換を含み、およびＣセグメントにおける第２のＣｐＧモチーフのすぐ下流のグアニンにおいてグアニンからアデニンへの置換を含む。

いくつかの実施形態では、３’末端ＩＴＲのＡ’、Ｂ’およびＣ’セグメントにおける対応する塩基は相補的な塩基で置換される。

ＧＣ含量は、ＣｐＧフリーＩＴＲの設計における別の重要な考慮事項である。野生型ＡＡＶ１、２、３、４、６、および７の３’－ＩＴＲのＧＣ含量は、それぞれ６８．５３％、６９．６６％、６５．０７％、６４．３８％、６７．１３％、および６８．９７％である。ヒトゲノムのＧＣ含量は平均で４０．９％である。特に好適なＣｐＧフリーＩＴＲは、７０％以下、６５％以下、６０％以下のＧＣ含量、約７０％、約６５％、約６０％のＧＣ含量、約４０％から約７０％、約４０％から約６５％、または約４０％から約６０％の範囲のＧＣ含量を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＩＴＲは約６０％のＧＣ含量を含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは６０．１６％（バージョン－１ＣｐＧフリーＩＴＲの５’－ＩＴＲ）、６０．００％（バージョン－１ＣｐＧフリーＩＴＲの３’－ＩＴＲ）、５８．５９％（バージョン－２ＣｐＧフリーＩＴＲの５’－ＩＴＲ）、および５８．０２％（バージョン－２ＣｐＧフリーＩＴＲの３’－ＩＴＲ）のＧＣ含量を含む。

ＧＣ含量は、オンラインのＧＣ含量計算機を用いて算出される。具体的には、ＧＣ含量のパーセンテージは、以下の式を用いて計算される：総数（Ｇ＋Ｃ）／総数（Ａ＋Ｔ＋Ｇ＋Ｃ）ｘ１００％。

特に好適なＩＴＲの配列を表１に提示する。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、および配列番号１２の１つ以上に対して、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または約１００％配列同一性を含む。好ましくは、ＩＴＲは、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、および配列番号１２、およびその組み合わせ、からなる群より選択される配列を含む。例えば、１つの実施形態では、５’末端ＩＴＲは配列番号９を含み、および３’末端ＩＴＲは配列番号７を含む。別の実施形態では、５’末端ＩＴＲは配列番号９を含み、および３’末端ＩＴＲは配列番号１１を含む。別の実施形態では、５’末端ＩＴＲは配列番号１２を含み、および３’末端ＩＴＲは配列番号１１を含む。別の実施形態では、５’末端ＩＴＲは配列番号１２を含み、および３’末端ＩＴＲは配列番号７を含む。

本開示のｒＡＡＶベクターは発現カセットをさらに含む。発現カセットはＡＡＶ遺伝子治療技術による送達のために関心のある核酸配列をコードする。様々な実施形態では、発現カセットは１つ以上の診断剤、治療剤および／または予防剤をコードする。例えば、１つの実施形態では、発現カセットはマイクロ－ジストロフィンをコードする。

発現カセットはさらに真核生物プロモーターをコードし得る。特に好適な真核生物プロモーターには組織特異的プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、発現カセットはさらに組織特異的プロモーターをコードする。

発現カセットはさらに誘導性プロモーターをコードし得る。好適な誘導性プロモーターには、例えば、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）誘導性プロモーター、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）誘導性プロモーター、およびタモキシフェン（ｔａｍ）誘導性プロモーターを含む。誘導性プロモーターを含むことで、誘導化合物の投与によって遺伝子発現の一時的な制御が可能になる。例えば、Ｔｅｔ－（およびＤｏｘ－）誘導性システムの２つの成分はＴｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）およびｔｅｔオペレーター（ｔｅｔＯ）である。Ｔｅｔおよびその類縁体であるドキシサイクリン（Ｄｏｘ）の両者はＴｅｔＲと相互作用し、哺乳類の系において十分に忍容性があり、広く使用されている。Ｔｅｔ－ＯＮアプローチは遺伝子発現を制御するために使用し得る。リバースｔｅｔ調節性トランス活性化因子またはＴｅｔ－ＯＦＦシステムでは、ＴｅｔまたはＤｏｘはＴｅｔ応答性プロモーターに結合し、誘導する。

送達システム
好適なｒＡＡＶベクター送達方法は、裸のＤＮＡの送達である。

好ましくは、ｒＡＡＶベクターは好適なＤＮＡ送達システムに含まれる。好適なＤＮＡ送達システムは非ウイルス送達システムを含む。特に好適な非ウイルス送達システムは、例えば、リポソームベクター、カチオン性ポリマー、ナノ粒子およびＤＮＡ結合ポリマーを含む。１種類以上のｒＡＡＶベクターが投与される実施形態では、ｒＡＡＶベクターは任意選択で異なる送達システムに含まれ得る。あるいは、いくつかの実施形態では、複数のｒＡＡＶベクターは単一の送達システムに含まれ得る。

別の特に好適なＤＮＡ送達システムにはウイルスカプシドを含む。特に好適なウイルスベクターは、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ハイランズＪウイルス（ＨＪＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を含む。１種類以上のｒＡＡＶベクターが投与される実施形態では、ｒＡＡＶベクターは任意選択で異なるウイルスカプシドに含まれ得る。あるいは、いくつかの実施形態では、複数のｒＡＡＶベクターは単一のウイルスカプシドに含まれ得る。

本開示の１つの態様は、５’－シトシン－リン酸－グアニン－３’（ＣｐＧ）モチーフを含まない末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含むｒＡＡＶ核酸ベクターおよびウイルスカプシドを含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子に関する。

特に好適なウイルスカプシドは、ＡＡＶまたはｒＡＡＶウイルスカプシドである。ウイルスカプシドのいくつかの実施形態は、ＡＡＶ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、ｒｈ１０、ｒｈ７４、およびＡＡＶ－Ａｎｃ８０、ＡＡＶ－Ｂ１、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＫＰ１、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ－Ｍｙｏ、ＡＡＶ－ＮＰ２２、ＡＡＶ－ＮＰ４０、ＡＡＶ－ＮＰ６６、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ａ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶチロシン変異体、またはその他の天然に存在するかまたは実験室で生成されたカプシドである。

ＡＡＶウイルスカプシドは、野生型ＡＡＶゲノムによってコードされる野生型ウイルスカプシドを指す。野生型ＡＡＶゲノムは、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３のための重複するヌクレオチド配列を含むｃａｐオープンリーディングフレームを含み、これらは相互作用して正二十面体対称を持つカプシドを形成する。これらのタンパク質の分子量はそれぞれ８７、７２および６２キロダルトンである。野生型ＡＡＶカプシドはＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の合計６０個の単量体が１：１：１０の比率で、正二十面体対称となるように配置された混合物からなり、推定サイズは３．９メガダルトンである。ｒＡＡＶ核酸ベクターは野生型ＡＡＶカプシドにカプセル化され得る。いくつかの実施形態では、ウイルスカプシドは野生型ＡＡＶカプシドの改変バージョンであり得る。例えば、ｒＡＡＶ核酸ベクターは変異型ＡＡＶカプシドまたは組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）カプシドにカプセル化され得る。

ｒＡＡＶベクターは、知られた方法によって、事前に組み立てられたウイルスカプシドにカプセル化され得る。

医薬組成物
本開示のさらなる態様は、本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶ粒子を含む医薬組成物に関する。

本開示の１つの態様は、５’－シトシン－リン酸－グアニン－３’（ＣｐＧ）モチーフを含まない末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含むｒＡＡＶ核酸ベクターおよび薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物に関する。

本開示の別の態様は、５’－シトシン－リン酸－グアニン－３’（ＣｐＧ）モチーフを含まない末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含むｒＡＡＶ核酸ベクターおよびウイルスカプシドを含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子、ならびに薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物に関する。

本明細書に記載される化合物は、例えば、ここに本明細書の一部として参照によりその全体を援用する、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．），２１ｓｔｅｄｉｔｉｏｎ，ＩＳＢＮ：０７８１７４６７３６（２００５）において記載される、１つ以上の薬学的に許容できる担体または賦形剤を使用する、任意の従来の方法によって医薬組成物中に配合され得る。係る組成物は、精製された形態であり得る治療有効量の（例えば、治療有効量の）本明細書に記載の１つ以上の化合物を、対象への適切な投与のための形態を提供するための好適な量の担体と共に含み得る。

「組成物」という用語は、ヒトなどの対象への投与に好適な形態で薬剤を調製する事を指す。よって、「組成物」には、希釈剤または担体を含む薬学的に許容できる賦形剤を含み得る。

本明細書で使用する場合、「薬学的に許容できる」という用語は、薬理活性の許容できない損失または許容できない有害な副作用を引き起こさない物質または成分を記載し得る。薬学的に許容される成分の例としては、ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＰｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ（ＵＳＰ２９）ａｎｄＮａｔｉｏｎａｌＦｏｒｍｕｌａｒｙ（ＮＦ２４），ＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓＰｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌＣｏｎｖｅｎｔｉｏｎ，Ｉｎｃ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，２００５（「ＵＳＰ／ＮＦ」）またはより最近の版にモノグラフを有するもの、およびＦＤＡの継続的に更新されるＩｎａｃｔｉｖｅＩｎｇｒｅｄｉｅｎｔＳｅａｒｃｈオンラインデータベースに記載されている成分があり得る。また、ＵＳＰ／ＮＦ等に記載されていない他の有用な成分も使用することができる。

本明細書で使用する場合、「薬学的に許容できる担体」という用語は、任意の種類の、非毒性、不活性な固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料または製剤補助剤を意味する。薬学的に活性な物質に対しての係る媒体および剤の使用は、当分野でよく知られている（一般に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．），２１ｓｔｅｄｉｔｉｏｎ（２００５）を参照）。例えば、経口投与のための医薬組成物は、経口投与に好適な投与量で、当分野で知られた薬学的に許容できる担体を使用して製剤化され得る。係る担体は、対象による摂取のために、医薬組成物を錠剤、丸薬（ｐｉｌｌ）、糖衣錠（ｄｒａｇｅｅ）、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー（ｓｌｕｒｒｙ）、懸濁液などに製剤化する事を可能にする。

活性化合物を薬学的に使用し得る調製物へと処理する事を容易にする賦形剤および助剤を含む薬学的に許容できる担体。薬学的に許容できる担体として機能しうる物質のいくつかの例は、ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖類；コーンスターチおよびポテトスターチなどのスターチ；セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロース；粉末トラガカント（ｔｒａｇａｃａｎｔｈ）；モルト；ゼラチン；タルク（ｔａｌｃ）；ココアバターおよび坐剤ワックスなどの賦形剤；ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、大豆油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール類；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル類；アガー；Ｔｗｅｅｎ８０などの洗浄剤；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；パイロゲンフリー水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；人工脳脊髄液（ＣＳＦ）およびリン酸緩衝液、ならびに他の無毒性適合潤滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味料、香料、保存剤および抗酸化剤であり、所望の投与経路に基づく処方者の判断に従って、組成物中に存在しうる。

薬学的に許容できるものにはポリマーを含む。特に好適なポリマーはポロキサマーである。

医薬組成物は、プロテアーゼをさらに含み得る。特に好適なプロテアーゼはトリプシン、コラゲナーゼおよびその組み合わせであり得る。

医薬組成物はさらに低分子を含み得る。

何れかの従来の培地または剤が化合物と不適合である場合を除いて、医薬組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性成分もまた組成物中に組み込まれ得る。

「安定な」製剤または組成物は、例えば少なくとも約１日、少なくとも約１週間、少なくとも約１か月、少なくとも約３か月、少なくとも約６か月、少なくとも約１年、または少なくとも約２年間などの商業用に妥当な期間、約０°Ｃから約６０°Ｃなどの便利な温度で保存する事が可能なように十分な安定性を有する組成物を指し得る。

組成物は、投与様式に適するべきである。本開示で使用する組成物は、非経口、経口、局所、皮内、鼻腔、筋肉、腹腔、静脈内、動脈内、皮下、硬膜外、経皮、頬、および直腸を含むがそれに限らないいくつかの経路を使用した、対象への投与のための周知の方法によって製剤化され得る。化合物は、１つ以上の追加の剤と組み合わせて、または生物学的に活性のある剤もしくは生物学的に不活性な剤と共に投与され得る。係る生物学的に活性もしくは不活性な剤は、薬剤と流体的または機械的に連通していてもよく、またはイオン性、共有結合、ファンデルワールス力、疎水性、親水性もしくはその他の物理的な力によって薬剤と結合していてもよい。

放出制御（または徐放性）組成物は、組成物の活性を延長し、投与頻度を減らすために製剤化され得る。放出制御組成物は、作用開始時間またはその他の特徴、例えば化合物の血中レベルなどに影響を与え、結果として副作用の発生に影響を与えるために使用され得る。放出制御組成物は、所望の治療効果をもたらす量の化合物を最初に放出し、その他の量の化合物を徐々に且つ継続的に放出し、長時間にわたって治療効果のレベルを維持するように設計され得る。体内でほぼ一定の化合物の量を保つために、化合物は、体内から代謝または排出される化合物の量に代わる速度で剤形から放出され得る。化合物の放出制御は、例えばｐＨの変化、温度変化、酵素、水またはその他の生理学的条件または分子、などの様々な誘導因子によって刺激され得る。

本明細書に記載する組成物、ｒＡＡＶベクター、またはｒＡＡＶ粒子はまた、その他の治療モダリティと組み合わせて使用され得る。よって、本明細書に記載の治療に加えて、疾患、障害または状態の処置に有効であることが知られているその他の治療を対象に提供し得る。

方法
本開示のさらなる態様は、本明細書に記載のｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶ粒子、および医薬組成物を細胞に送達する方法に関する。

特定の態様は、５’－シトシン－リン酸－グアニン－３’（ＣｐＧ）モチーフを含まない末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）核酸ベクターを細胞に投与する事を含む、核酸を細胞に送達する方法に関する。

別の特定の態様は、５’－シトシン－リン酸－グアニン－３’（ＣｐＧ）モチーフを含まない末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含むｒＡＡＶ核酸ベクターおよびウイルスカプシドを含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を細胞に投与する事を含む、核酸を細胞に送達する方法に関する。

別の特定の態様は、５’－シトシン－リン酸－グアニン－３’（ＣｐＧ）モチーフを含まない末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含むＡＡＶ核酸ベクターおよびウイルスカプシドを含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子、ならびに薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物を細胞に投与する事を含む、核酸を細胞に送達する方法に関する。

投与されるウイルス構築物の用量は、ＡＡＶウイルスの分野でよく確立された測定単位であるベクターゲノム（ｖｇ）コピー数に基づく。約１ｘ１０^２ｖｇ／注射部位から約１ｘｌ０^１５ｖｇ／ｋｇ（約１マイクロリットルから約５０ミリリットルの範囲の容積）の好適な用量範囲が使用される。例えば投与経路、疾患の種類や重症度、または個体の年齢、性別、体重および状態に応じて、より高いまたはより低い用量が使用される。特定の投与量および送達方法の指針は、当分野において文献において提供されており、当業者が一般に入手可能である。一般に、非経口経路を用いる場合、より低い用量を投与し得る。よって、例えば、静脈投与のためには、例えば約１ｘｌ０^９ｖｇ／ｋｇから１ｘｌ０^１５ｖｇ／ｋｇの用量範囲が使用され得る。

特に好適な細胞は哺乳類細胞であり、齧歯類（例えばマウスおよびラット）、ブタ、霊長類、ウサギ、ウシ、ウマ、イヌなどの実験動物由来の細胞を含む。また、細胞は実験動物、畜産動物、ペットなどの生きた動物の細胞であり得る。

特に好適な細胞はヒト細胞である。細胞はヒト由来の実験細胞であり得、疾患細胞または疾患でない細胞を含む。また、細胞は生きたヒト患者の細胞であり得る。また、細胞は胚性幹細胞または人工多能性幹細胞であり得る。

本開示のさらなる態様は、治療有効量の本明細書に記載のｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶ粒子、または医薬組成物を対象に投与する事を含む、それを必要とする対象における遺伝子治療方法または疾患の処置方法に関する。

特定の態様は、５’－シトシン－リン酸－グアニン－３’（ＣｐＧ）モチーフを含まない末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含む、治療有効量の組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）核酸ベクターを対象に投与する事を含む、それ必要とする対象における遺伝子治療方法に関する。

別の態様は、５’－シトシン－リン酸－グアニン－３’（ＣｐＧ）モチーフを含まない末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含むｒＡＡＶ核酸ベクターおよびウイルスカプシドを含む、治療有効量の組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を対象に投与する事を含む、それ必要とする対象における遺伝子治療方法に関する。

別の態様は、５’－シトシン－リン酸－グアニン－３’（ＣｐＧ）モチーフを含まない末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含むｒＡＡＶ核酸ベクターおよびウイルスカプシドを含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子、ならびに薬学的に許容できる担体を含む治療有効量の医薬組成物を対象に投与する事を含む、それを必要とする対象における遺伝子治療方法に関する。

特定の態様は、５’－シトシン－リン酸－グアニン－３’（ＣｐＧ）モチーフを含まない末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含む治療有効量のｒＡＡＶ核酸ベクターを対象に投与する事を含む、それを必要とする対象における疾患の処置方法に関する。

別の態様は、５’－シトシン－リン酸－グアニン－３’（ＣｐＧ）モチーフを含まない末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含むｒＡＡＶ核酸ベクターおよびウイルスカプシドを含む、治療有効量の組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を対象に投与する事を含む、それを必要とする対象における疾患の処置方法に関する。

別の態様は５’－シトシン－リン酸－グアニン－３’（ＣｐＧ）モチーフを含まない末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含むｒＡＡＶ核酸ベクターおよびウイルスカプシドを含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子、ならびに薬学的に許容できる担体を含む治療有効量の医薬組成物を対象に投与する事を含む、それを必要とする対象における疾患の処置方法に関する。

医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、髄腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、非経口、局所、舌下、または直腸手段を含むがそれに限らない経路によって投与され得る。例えば、投与は、経口、鼻腔内、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内、腫瘍内、直腸、局所、および経皮からなる群より選択され得る。

本明細書に記載する任意の１つ以上の化合物の治療有効量の決定は、当業者の能力の範囲内である。治療有効量とは、所望の結果をもたらす活性成分（化合物）の量を指す。正確な用量は、処置を必要とする患者に関連する因子に照らして、当業者によって決定される。用量および用法は、十分なレベルの活性成分を提供するために、または所望の効果を維持するために調節される。考慮され得る因子には、疾患状態の重症度、対象の一般的な健康状態、対象の年齢、体重および性別、食事、投与時間および頻度、薬剤の組合せ、反応感受性および治療への忍容性／応答性を含む。長時間作用型医薬組成物は、特定の製剤の半減期およびクリアランス速度に応じて、３日から４日ごと、１週間ごとまたは２週間に１回投与され得る。

本明細書に記載する各症状、疾患、障害および状態ならびにその他は、本明細書に記載する組成物および方法から利益を得る事ができる。一般に、症状、疾患、障害および状態の処置には、症状、疾患、障害および状態を患う、またはその素因があるが、その臨床症状または不顕性症状（ｓｕｂｃｌｉｎｉｃａｌｓｙｍｐｔｏｍ）を経験していないか示していない哺乳動物における、臨床症状の出現を予防または遅延させる事を含む。処置にはまた、症状、疾患、障害および状態を阻害する事、例えば疾患またはその少なくとも１つの臨床症状または不顕性症状の発生を阻止または低減することを含む。さらに、処置には疾患を緩和する事、例えば、症状、疾患、障害もしくは状態、またはその臨床症状もしくは不顕性症状の少なくとも１つを退行させる事を含む。処置される対象への利益は、統計的に有意であるか、対象または医師にとって少なくとも知覚可能であるかのいずれかであり得る。

本明細書で使用する場合、「それを必要とする個体」および「それを必要とする対象」は、特定される疾患、障害または状況にかかりやすい、またはそのリスクがある、またはそれを患う個体を指す。個体は、家族歴、年齢、環境および／または生活習慣によってこれらの疾患、障害または状況にかかりやすいか、またはそのリスクが高くなっている可能性がある。それを必要とする個体は、成人個体、子供および小児個体であり得る。特に好適な個体はヒトである。その他の特に好適な個体は、齧歯類（例えば、マウスおよびラット）、ブタ、霊長類、ウサギ、ウシ、ウマ、イヌ等の実験動物であり得る。

いくつかの実施形態では、それを必要とする個体は成人個体、子供、および小児個体からなる群より選択される。

いくつかの実施形態では、疾患は、肝臓疾患、心臓疾患、肺疾患、腎臓疾患、血液疾患、中枢神経系疾患、神経筋疾患を指し得る。

特に好適な投与方法は、組織または臓器へのｉｎｓｉｔｕ適用である。例えば、疾患は神経筋疾患であってよく、発現カセットはマイクロ－ジストロフィンをコードしてよく、および投与は筋組織への投与または静脈注射であってよい。

別の特に好適な投与方法は、眼球またはその近傍へのｉｎｓｉｔｕ適用であり得る。例えば、疾患は網膜疾患であってよく投与は眼球またはその近傍への投与であってよい。

別の特に好適な投与方法は耳またはその内部へのｉｎｓｉｔｕ適用であってよい。例えば、疾患は聴覚障害または難聴であってよく、および投与は耳またはその内部への投与であってよい。

実施例
実施例１～４は、例示的なＣｐＧフリーＩＴＲを持つｒＡＡＶベクターの設計および生成に関する。実施は５～９は例示的なｒＡＡＶベクターを用いたｉｎｖｉｖｏマウスモデル実験に関する。

実施例１

本実施例は例示的なｒＡＡＶベクターのための例示的なＣｐＧフリーＩＴＲの設計を示す。

ＣｐＧの減少がｒＡＡＶの産生に影響するかを決定するために、同一の発現カセットを運搬するが、ＩＴＲが異なる、２種類のｒＡＡＶマイクロ－ジストロフィンベクターを作成した。１種類は野生型ＩＴＲを有し、もう１種類はＣｐＧフリーＩＴＲを有する。

ＣｐＧフリーＩＴＲの生成。１つの実施例では、ＣｐＧフリーＩＴＲを、ＡＡＶ２の野生型ＩＴＲに基づいて設計した。５’末端ＣｐＧフリーＩＴＲを、ＩＴＲのＡ配列における最初のＣｐＧモチーフのグアニンをチミンで置き換え、ＩＴＲのＡ配列において残った３つのＣｐＧモチーフのグアニンをアデニンで置き換え、ＩＴＲのＣ配列における最初のＣｐＧモチーフのグアニンおよびそのすぐ下流のシトシンをアデニンおよびグアニンで置き換え、ＩＴＲのＣ配列における第２のＣｐＧモチーフのグアニンおよびそのすぐ下流のグアニンをシトシンおよびチミンで置き換え、ＩＴＲのＢ配列における最初のＣｐＧモチーフのグアニンをアデニンで置き換え、ＩＴＲのＢ配列における第２のＣｐＧモチーフのグアニンをシトシンで置き換える事によって設計した。５’末端ＩＴＲのＡ’、Ｂ’およびＣ’配列における対応する塩基は相補的な塩基で置換される（図１Ｃ）。

別の実施例では、５’末端ＣｐＧフリーＩＴＲを、ＩＴＲのＡ配列における最初のＣｐＧモチーフのグアニンをチミンで置き換え、ＩＴＲのＡ配列において残った３つのＣｐＧモチーフのグアニンをアデニンで置き換え、ＩＴＲのＣ配列における第１のＣｐＧモチーフのグアニンおよびそのすぐ下流のシトシンをチミンおよびグアニンで置き換え、ＩＴＲのＣ配列における第２のＣｐＧモチーフのシトシンおよびそのすぐ下流のグアニンをアデニンおよびアデニンで置き換え、ＩＴＲのＢ配列における最初のＣｐＧモチーフのグアニンをチミンで置き換え、およびＩＴＲのＢ配列における第２のＣｐＧモチーフのシトシンをグアニンで置き換える事によって設計した。５’末端ＩＴＲのＡ’、Ｂ’およびＣ’配列における対応する塩基は相補的な塩基で置換される。

１つの実施例では、３’末端ＣｐＧフリーＩＴＲを、ＩＴＲのＡ配列における最初のＣｐＧモチーフのグアニンをチミンで置き換え、ＩＴＲのＡ配列において残った３つのＣｐＧモチーフのグアニンをアデニンで置き換え、ＩＴＲのＢ配列における最初のＣｐＧモチーフのグアニンをアデニンで置き換え、Ｂ腕の第２のＣｐＧモチーフのシトシンおよびグアニンをグアニンおよびシトシンでそれぞれ置き換え、ＩＴＲのＣ配列における第１のＣｐＧモチーフのグアニンおよびそのすぐ下流のシトシンをアデニンおよびグアニンで置き換え、およびＩＴＲのＣ配列における第２のＣｐＧモチーフのグアニンおよびそのすぐ下流のグアニンをシトシンおよびチミンで置き換えることによって設計した。５’末端ＩＴＲのＡ’、Ｂ’およびＣ’配列における対応する塩基は相補的な塩基で置換される（図１Ｄ）。

別の実施例では、３’末端ＣｐＧフリーＩＴＲを、ＩＴＲのＡ配列における最初のＣｐＧモチーフのグアニンをチミンで置き換え、ＩＴＲのＡ配列において残った３つのＣｐＧモチーフのグアニンをアデニンで置き換え、ＩＴＲのＢ配列における最初のＣｐＧモチーフのグアニンをチミンで置き換え、Ｂ腕の第２のＣｐＧモチーフのシトシンをグアニンで置き換え、ＩＴＲのＣ配列における第１のＣｐＧモチーフのグアニンおよびそのすぐ下流のシトシンをチミンおよびグアニンで置き換え、およびＩＴＲのＣ配列における第２のＣｐＧモチーフのシトシンおよびそのすぐ下流のグアニンをアデニンおよびアデニンで置き換えることによって設計した。５’末端ＩＴＲのＡ’、Ｂ’およびＣ’配列における対応する塩基は相補的な塩基で置換される。

設計したＣｐＧフリーＩＴＲを、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）によって合成した。設計したＣｐＧフリーＩＴＲはまた、ＤＮＡ合成サービスを提供している任意の他の商業的な提供元によって合成され得る。

図１．ＣｐＧフリーＩＴＲのエンジニアリング。図１Ａ、ＡＡＶベクターの模式的な概要。発現カセットはプロモーター、導入遺伝子およびポリアデニル化（ｐＡ）シグナル、およびその他の示されていない調節エレメント（例えばイントロン、エンハンサー、マイクロＲＮＡ結合標的など）で構成された。本研究の文脈では、導入遺伝子はマイクロ－ジストロフィン遺伝子（μＤｙｓ）であった。ＡＡＶベクターでは、発現カセットは２つのＩＴＲに挟まれていた。５’および３’ＩＴＲを点線の枠で強調する。図１Ｂ、バージョン－１ＣｐＧフリーベクターおよびＡＡＶ１、２、３、４、６、および７由来の３’－ＩＴＲのアライメント。ＡＡＶＩＴＲはＤ、Ａ、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’およびＡ’セクションに分割された。黒色の太字は、バージョン１ＣｐＧフリーＩＴＲにおけるヌクレオチドと異なるＡＡＶ２ＩＴＲにおけるヌクレオチドを示す。セクションＤとセクションＡの間の下線を引いた斜体のヌクレオチドＧＴＴＧＧＣＣはＡＡＶ２末端分解部位（ｔｒｓ）である。セクションＣとセクションＣ’の間の下線を引いた斜体のヌクレオチドＣＴＴＴＧはＡＡＶ２の第２のＲｅｐ－結合エレメント（ＲＢＥ’）である。セクションＡおよびＡ’における下線を引いたヌクレオチドＡＡＶ２Ｒｅｐ－結合エレメント（ＲＢＥ）である。枠線はＲｅｐ－結合エレメントにおけるＧＡＧＹ（相補鎖におけるＲＣＴＣ）４ヌクレオチド反復モチーフを示す。アスタリスクは、全てのＩＴＲで保存されているヌクレオチドを示す。黒丸はＡＡＶ１、２、３、４、６、および７のＩＴＲにおいて保存されているが、バージョン－１ＣｐＧフリーＩＴＲでは保存されていないヌクレオチドを示す。ダッシュはバージョン－１ＣｐＧフリーＩＴＲに存在しないヌクレオチドを示す。図１Ｃ、フロップ構造における５’－ＩＴＲの二次元図。ＡＡＶＩＴＲは、Ａ／Ａ’軸（配列Ａおよびその相補的な配列Ａ’）、Ｂ／Ｂ’腕（配列Ｂ、その相補的な配列Ｂ’および配列ＢとＢ’の間に介在する３つのアデニンヌクレオチド）、Ｃ／Ｃ’腕（配列Ｃ、その相補的な配列Ｃ’および配列ＣとＣ’の間に介在する３つのチミジンヌクレオチド）、およびＤ－配列（下線部）を含む、４つの領域に分割された。加えて、Ｂ／Ｂ’腕とＣ／Ｃ’腕の間には非対合のチミジンが存在する。灰色の文字、ＡＡＶベクターにおいて欠失したヌクレオチド。ＲＢＥ、Ｒｅｐ－結合エレメント、２２ｂｐ配列。コアＲＢＥ配列（枠線）は１０ｂｐ配列からなる。ＲＢＥ’、第２のＲｅｐ－結合エレメント、５塩基配列。矢頭、末端分解部位（ｔｒｓ）。挿入、用語の説明。ＣｐＧフリーＩＴＲにおいて改変されたヌクレオチドを表示した。図１Ｄ、フロップ構造における３’－ＩＴＲの二次元図。３’－ＩＴＲは、Ａ／Ａ’軸（配列Ａおよびその相補的な配列Ａ’）、Ｂ／Ｂ’腕（配列Ｂ、その相補的な配列Ｂ’および配列ＢとＢ’の間に介在する３つのアデニンヌクレオチド）、Ｃ／Ｃ’腕（配列Ｃ、その相補的な配列Ｃ’および配列ＣとＣ’の間に介在する３つのチミジンヌクレオチド）、およびＤ－配列（下線部）を含む、４つの領域に分割された。加えて、Ｂ／Ｂ’腕とＣ／Ｃ’腕の間には非対合のチミジンが存在する。灰色の文字、ＡＡＶベクターにおいて欠失したヌクレオチド。ＲＢＥ、Ｒｅｐ－結合エレメント、２２ｂｐ配列。コアＲＢＥ配列（枠線）は１０ｂｐ配列からなる。ＲＢＥ’、第２のＲｅｐ－結合エレメント、５塩基配列。矢頭、末端分解部位（ｔｒｓ）。挿入、用語の説明。ＣｐＧフリーＩＴＲにおいて改変されたヌクレオチドを表示した。図１Ｅ、バージョン－２ＣｐＧフリーベクターおよびＡＡＶ１、２、３、４、６、および７由来の３’－ＩＴＲのアライメント。ＡＡＶＩＴＲはＤ、Ａ、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’およびＡ’セクションに分割された。黒色の太字は、バージョン２ＣｐＧフリーＩＴＲにおけるヌクレオチドと異なるＡＡＶ２ＩＴＲにおけるヌクレオチドを示す。網掛け文字は、バージョン１とバージョン２のＣｐＧフリーＩＴＲの間で異なるヌクレオチドを示す。セクションＤとセクションＡの間の下線を引いた斜体のヌクレオチドＧＴＴＧＧＣＣはＡＡＶ２末端分解部位（ｔｒｓ）である。セクションＣとセクションＣ’の間の下線を引いた斜体のヌクレオチドＣＴＴＴＧはＡＡＶ２の第２のＲｅｐ－結合エレメント（ＲＢＥ’）である。セクションＡおよびＡ’における下線を引いたヌクレオチドはＡＡＶ２Ｒｅｐ－結合エレメント（ＲＢＥ）である。枠線はＲｅｐ－結合エレメントにおけるＧＡＧＹ（相補鎖におけるＲＣＴＣ）４ヌクレオチド反復モチーフを示す。アスタリスクは、全てのＩＴＲで保存されているヌクレオチドを示す。黒丸はＡＡＶ１、２、３、４、６、および７のＩＴＲにおいて保存されているが、バージョン－１ＣｐＧフリーＩＴＲでは保存されていないヌクレオチドを示す。ダッシュはバージョン－１ＣｐＧフリーＩＴＲに存在しないヌクレオチドを示す。

実施例２

この実施例は、ＣｐＧフリーＩＴＲを持ち、マイクロ－ジストロフィンをコードする例示的な発現カセットを持つ例示的なｒＡＡＶベクターの産生を示す。

マイクロ－ジストロフィン発現カセット。コドン最適化したヒトマイクロ－ジストロフィン遺伝子は、ヒトジストロフィンのＮ末端ドメイン、ヒンジ１、スペクトリン用反復配列１、１６、１７および２４、ヒンジ４、システインリッチドメイン、ならびにシントロフィン／ジストロブレビン結合部位を含む。マイクロ－ジストロフィンの発現は、ｐＣｐＧｆｒｅｅ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ，ＵＳＡ）からのヒト伸長因子１－α（Ｅ１Ｆ－α）プロモーターおよびマウスサイトメガロウイルスエンハンサー、ならびにｐＧＬ３－Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）からの合成ポリアデニル化部位により制御された。

組み換えＡＡＶの産生、精製および力価測定。ｒＡＡＶストックの産生のために２つのシス－プラスミドを使用した。それらは上述のような全く同じマイクロ－ジストロフィン発現カセットを運ぶ。一方のシス－プラスミドは、バージョン１ＣｐＧフリーＩＴＲを含む。もう一方のシス－プラスミドは野生型ＩＴＲを含む。ｒＡＡＶベクターはＹ７３１Ｆチロシン変異体ＡＡＶ９にパッケージされ、および公開されたプロトコルに従って一過性トランスフェクション法を使用してベクターストックを産生した（Ｓｈｉｎｅｔａｌ．，２０１２；Ｓｈｉｎｅｔａｌ．，２０１３）。ｒＡＡＶベクターを、４°Ｃで４８時間の、３回のＨＥＰＥＳ緩衝液の交換が続く２ラウンドの等密度塩化セシウム超遠心分離によって精製した。ウイルス力価を、ＡＢＩ７９００ＨＴｑＰＣＲｍａｃｈｉｎｅで、ＦａｓｔＳＹＢＲＧｒｅｅｎＭａｓｔｅｒＭｉｘｋｉｔ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）を使用した定量ＰＣＲによって決定した。プライマーのペアは、マウスサイトメガロウイルスエンハンサー領域に対して設計した。フォワードプライマーは、５’－ＡＣＡＴＡＡＧＧＴＣＡＡＴＧＧＧＡＧＧＴＡＡＧＣ（配列番号１３）であり、およびリバースプライマーは、５’－ＣＡＡＴＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＴＴＣ（配列番号１４）である。

ＩＴＲシーケンシング。複雑な二次構造および高いＧＣ含量のため、ＤＮＡを最初にＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅｉｌｌｕｓｔｒａＴｅｍｐｌｉＰｈｉＳｅｑｕｅｎｃｅＲｅｓｏｌｖｅｒＫｉｔ（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｄｅ＃２８－９０３５－２９）を用いて増幅した。そして増幅産物を、５’末端ＩＴＲに対するプライマー５’－ＧＡＴＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＡＴＴＡ（配列番号１５）および３’末端ＩＴＲに対するプライマー５’－ＴＴＡＴＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧ（配列番号１６）を使用したサンガーシーケンシングの対象とした。

ＡＡＶウイルスＩＴＲシーケンシング。ベクターゲノムを、Ｔｒａｎｅｔａｌ（Ｔｒａｎｅｔａｌ．，２０２０）に記載のように、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）抽出およびＥｔＯＨ沈殿によって単離した。略述すると、ｉｎｄｅｘｅｄＳＭＲＴＢｅｌｌａｄａｐｔｅｒｓを用いた、ＥｘｐｒｅｓｓＴｅｍｐｌａｔｅＰｒｅｐＫｉｔ２．０（Ｅｎｄ－Ｒｅｐａｉｒ／Ａ－ｔａｉｌｉｎｇ）（ＰＮ１００－９３８－９００）を使用して、ＳＭＲＴシーケンシングライブラリーを構築した。ライブラリーはＳｅｑｕｅｌＩＩで１５時間にわたり回収された。得られたサブリードをリコールアダプターで処理し、ｃｃｓを－－ｍｉｎ－ｓｎｒ＝２．００および－－ｍｉｎ－ｐａｓｓｅｓ＝０．５の最小閾値で実行した。Ｒｏｂｉｎｓｏｎｅｔａｌ（Ｒｏｂｉｎｓｏｎｅｔａｌ．，２０１１）に記載のように、リードの多量体化を外し（ｄｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ）、参照ベクターゲノムにマッピングし、およびＩＧＶ上に表示した。ＡＡＶウイルスＩＴＲシーケンシングによって、精製されたＡＡＶベクターにおけるＣｐＧモチーフの完全な排除が確かめられた。

実施例３

本実施例は、ＣｐＧフリーＩＴＲを含む例示的なｒＡＡＶベクターの収量についての研究を示す。

一過性トランスフェクションはｒＡＡＶの産生のために最も一般的に使用される方法であり、野生型およびＣｐＧフリーベクターの産生のために使用した。粗溶解液を、等密度塩化セシウム超遠心分離法を使用して、並行して精製した。ベクター力価を、同じ設定を使用した定量ＰＣＲによって決定した。

ベクターの産生効率を試験するために、各ベクターについて、３つのバッチを作成した。野生型およびＣｐＧフリーベクターの収量はそれぞれ１．１８±０．０８ｘ１０^５ｖｇ／細胞および３．０３±０．３２ｘ１０^４ｖｇ／細胞であった（図２Ａ）。

図２Ａ－２Ｃ．ｒＡＡＶ産生の定量的評価。図２Ａ、各ベクターについての３つの独立した生産ラウンドからのベクターの収量。＊＊、ｐ＜０．０１。図２Ｂ、野生型ＩＴＲベクターおよびＣｐＧフリーＩＴＲベクターの代表的な透過型電子顕微鏡画像。矢印、完全にパッケージされたＡＡＶ粒子。矢頭、空のＡＡＶ粒子。図２Ｃ、空の粒子の定量。各データ点は、２５，０００倍の倍率で１つの視野から得られた定量結果を示す。野生型ＩＴＲベクターについては、合計で４８個の視野を定量した。ＣｐＧフリーＩＴＲベクターについては、合計で２５個の視野を定量した。

実施例４

本実施例は、ＣｐＧフリーＩＴＲを含む例示的なｒＡＡＶベクターのゲノムのカプシド形成に関する研究を示す。

ｒＡＡＶゲノムのカプシド形成を試験するために、空の粒子の割合を、透過型電子顕微鏡を使用して定量した（図２Ｂおよび２Ｃ）。パッケージされたｒＡＡＶビリオンは均一な電子密度を示す一方で、空の粒子は暗い中心部を有する（図２Ｂ）。平均して、野生型およびＣｐＧフリーベクターストックにおいて、それぞれ１１．９±１．２％および１１．８±１．５％の空の粒子が存在していた。野生型およびＣｐＧフリーベクターにおいて同程度の量の空の粒子が検出されたため（～１２％）、ＩＴＲからのＣｐＧモチーフの排除は、一本鎖ゲノムの事前に組み立てられたカプシドへのパッケージには影響しない事が明らかになった（図２Ｂおよび２Ｃ）。

電子顕微鏡。ｒＡＡＶ粒子を透過型電子顕微鏡で調べた。具体的には、精製および透析したＡＡＶウイルスを、超純水で１～３ｘ１０^９ｖｇ／μｌに希釈し、そして２００－ｍｅｓｈｇｌｏｗ－ｄｉｓｃｈａｒｇｅｃａｒｂｏｎ－ｃｏａｔｅｄｃｏｐｐｅｒｇｒｉｄ上に５分間置いた。超純水で優しく４、５回洗浄した後、ウイルスを２％ＮＡＮＯ－Ｗ^（商標）（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ，Ｙａｐｈａｎｋ，ＮＹ，ＵＳＡ）で５分間染色した。ウイルス粒子を、ＪＥＯＬＪＥＭ－１４００透過型電子顕微鏡を使用して可視化した。

実施例５～９は、ＣｐＧフリーＩＴＲを含む例示的なｒＡＡＶベクターを使用したｉｎｖｉｖｏマウスモデル実験に関する。

実施例５

この実施例は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｄｕｃｈｅｎｎｅｍｕｓｃｕｌａｒｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）（ＤＭＤ）のマウスモデルにおける、ＣｐＧフリーＩＴＲを持つ例示的なｒＡＡＶベクターの投与を示す。

ＣｐＧの欠失がｒＡＡＶベクターのｉｎｖｉｖｏトランスダクションに影響するかを決定するために、ＤＭＤのｍｄｘモデルにおけるペア研究を行った。具体的には、野生型およびＣｐＧフリーベクターを、同じｍｄｘマウスの前脛骨（ＴＡ）筋の異なる側に注射した。ｒＡＡＶ注入の４か月後に、ＴＡ筋におけるマイクロ－ジストロフィンの発現、ＡＡＶゲノムのコピー数、ならびに筋疾患の組織学的および生理学的レスキューを定量した（図３～６）。

実験マウス。全ての動物実験は、ミズーリ大学の動物実験委員会（ＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅ）の承認を受けており、且つＮＩＨのガイドラインに準拠した。全ての動物実験はミズーリ大学において行われた。ジストロフィン欠損ｍｄｘマウス（Ｓｔｏｃｋｎｕｍｂｅｒ００１８０１）はもともとＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＢａｒＨａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入した。実験マウスは、ＴｈｅＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙの創設者（ｆｏｕｎｄｅｒ）を用いて、ミズーリ大学の特定病原体フリーのバリア施設内で自家作製した。マウスの遺伝子型を公開されたプロトコルを使用して確認した（Ｓｈｉｎｅｔａｌ．，２０１１）。すべてのマウスは、特定病原体フリーの動物飼育施設において、１２時間明期（２５ルクス）：１２時間暗期のサイクルで維持し、ＰｉｃｏＬａｂｒｏｄｅｎｔｄｉｅｔ２０＃５０５３およびオートクレーブ処理した水道水を自由摂取させた。室温と相対湿度はそれぞれ６８±２°Ｆと５０±２０％に維持した。すべての動物について、一般的な状態および健康状態を毎日観察した。すべてのマウスは、離乳時に無作為に割り当てられた固有の識別番号（イヤータグ）を有していた。

ｒＡＡＶ投与。２．８ｘ１０^１０ｖｇ粒子／筋肉（５０μｌのＨＥＰＥＳ緩衝液中）のｒＡＡＶベクターを、ハミルトンシリンジを用いて６匹の１０ｍ齢雌ｍｄｘマウスのＴＡ筋に注射した。ＴＡ筋の片側には野生型ベクターが、同じマウスの反対側のＴＡ筋にはＣｐＧフリーベクターが投与された。

形態学的解析。ｒＡＡＶ注入から４か月後に、末端ＴＡ筋機能アッセイを行った。機能アッセイ後に、ミズーリ大学の動物実験委員会によって承認されたプロトコルに従ってマウスを安楽死させた。ＴＡ筋を注意深く解剖し、二片に切り分けた。一片は液体窒素で瞬間凍結した。もう一片は、ｏｐｔｉｍａｌｃｕｔｔｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｃｏｍｐｏｕｎｄ（ＳａｋｕｒａＦｉｎｅｔｅｋＩｎｃ．，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）中の液体窒素で冷却したイソペンタン中に包埋した。１０ミクロンの凍結切片を染色に使用した。一般的な筋肉の病理組織学はヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色で明らかにされた。ジストロフィンの発現は、ヒトジストロフィンのヒンジ１領域を認識するが、マウスジストロフィンと交差反応しない、種特異的なジストロフィンモノクローナル抗体であるＤｙｓ－３（１：２０，ＶｅｃｔｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐｅｔｅｒｂｏｒｏｕｇｈ，ＵＫ）を使用した免疫蛍光染色によって評価した。スライドをＮｉｋｏｎＥ８００蛍光顕微鏡を使用した同じ露出設定で観察した。画像はＱＩｍａｇｅＲｅｔｉｇａ１３００カメラを用いて撮影した。中心核を有する筋線維をＦｉｊｉｉｍａｇｉｎｇｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓｃｈｉｎｄｅｌｉｎｅｔａｌ．，２０１２）を使用して、デジタル化したＨ＆Ｅ染色画像から決定した。ジストロフィン陽性細胞の割合を、Ｆｉｊｉｉｍａｇｉｎｇｓｏｆｔｗａｒｅを使用して、デジタル化したジストロフィン免疫染色画像から定量した。

ウェスタンブロット。前脛骨筋を、１０％ＳＤＳ、５ｍＭエチレンジアミン四酢酸、６２．５ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、および２％プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）を含むホモジナイズ緩衝液で、組織ホモジナイザー（ＢｕｌｌｅｔＢｌｅｎｄｅｒＳｔｏｒｍ２４，ＮｅｘｔＡｄｖａｎｃｅ，ＮＹ）を使用して、機械の速度設定１２で、４°Ｃで１０分間ホモジナイズした。ホモジネートをエッペンドルフ遠心分離機（ｍｏｄｅｌ５４１７Ｃ；ＢｒｉｎｋｍａｎｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＩｎｃ．，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）で、１４，０００ＲＰＭで３分間遠心分離した。上清中の全タンパク質濃度をＤＣａｓｓａｙｋｉｔ（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して測定した。５０μｇのタンパク質を９５°Ｃで５分間変性させ、氷上で２分間冷却し、そして３％濃縮（ｓｔａｃｋｉｎｇ）／６％分離（ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ）ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルで、１００Ｖで分離した。１０％メタノールを含むＴｏｗｂｉｎ緩衝液中で、４°Ｃで１０時間、６０Ｖでタンパク質を０．４５μｍＰＶＤＦメンブレンに転写した。このメンブレンを蒸留水で５分間洗浄し、その後１０ｍｌの１×ｉＢｉｎｄＦｌｅｘｓｏｌｕｔｉｏｎに少なくとも２分間浸漬した（５００μｌの１００ＸＡｄｄｉｔｉｖｅおよび１０ｍｌのｉＢｉｎｄＦｌｅｘ５Ｘｂｕｆｆｅｒを３９．５ｍｌの蒸留水中で混合したもの）。このメンブレンを、マイクロ－ジストロフィンおよびα－チューブリンをそれぞれ含む２つの断片に切断した。次に、メンブレンを、ｉＢｉｎｄＦｌｅｘＷｅｓｔｅｒｎＳｙｓｔｅｍ（ＣａｔａｌｏｇｎｕｍｂｅｒＳＬＦ２０００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に置いたあらかじめ濡らしたｉＢｉｎｄＦｌｅｘＣａｒｄ上のプール液の上部に、タンパク質側を下にして置いた。サンプルを、以下の順序でウェル挿入部の列に添加した：列１、一次抗体マウス抗ヒトジストロフィン反復配列１６（１：２００ｉｎ１ＸｉＢｉｎｄＦｌｅｘｓｏｌｕｔｉｏｎ，ＭＡＮＤＹＳ１０２ｃｌｏｎｅ７Ｄ２ＴｙｐｅＧ２ａ，ｅｘ４３，２０４７－２１０５）（Ｍｏｒｒｉｓｅｔａｌ．，２０１１）またはマウス抗α－チューブリン（１：１０００ｉｎ１ＸｉＢｉｎｄＦｌｅｘｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｔ５１６８，Ｓｉｇｍａ）；列２、１ＸｉＢｉｎｄＦｌｅｘＦＤｓｏｌｕｔｉｏｎ；列３、二次抗体ヤギ抗－マウスＩｇＧ（１：１０００ｉｎ１ＸｉＢｉｎｄＦｌｅｘｓｏｌｕｔｉｏｎ，ＳａｎｔａＣｒｕｚ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）；列４、１ＸｉＢｉｎｄＦｌｅｘＦＤｓｏｌｕｔｉｏｎ。ウェルのカバーを閉じて、サンプルを３時間インキュベートした。シグナルをＣｌａｒｉｔｙＷｅｓｔｅｒｎＥＣＬｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して検出し、およびＬｉ－ＣＯＲＯｄｙｓｓｅｙｉｍａｇｉｎｇｓｙｓｔｅｍを使用して可視化した。バンド強度のデンシトメトリー定量を、Ｌｉ－ＣＯＲＩｍａｇｅＳｔｕｄｉｏＶｅｒｓｉｏｎ５．０．２１ソフトウェアを使用して行った。マイクロ－ジストロフィンタンパク質バンドの相対強度は、同じブロット中の対応するα－チューブリンバンド（ローディングコントロール）で標準化した。

ＴＡ筋中のベクターゲノムのコピー数の定量。ＯＣＴに包埋された冷凍組織サンプルからゲノムＤＮＡを抽出した。ＤＮＡの濃度をＮａｎｏＤｒｏｐＯｎｅ^ＣＳｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で測定した。定量ＴａｑＭａｎＰＣＲアッセイを、ＰｒｉｍｅＴｉｍｅＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩＤＴ，ＩＡ）を使用して、ＡＢＩ７９００ＨＴｑＰＣＲｍａｃｈｉｎｅ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）で行った。ｑＰＣＲプライマーおよびプローブは、ヒトＥＦ－１αプロモーター領域から設計した。フォワードプライマー５’－ＧＧＣＴＴＧＧＧＴＡＡＡＣＴＧＧＧＡＡＡ－３’（配列番号１７）であり、リバースプライマーは５’－ＧＴＴＣＡＣＡＧＡＧＡＣＴＡＣＴＧＣＡＣＴＴＡＴ－３’（配列番号１８）であり、およびプローブは５’－ＡＴＧＴＧＧＴＧＴＡＣＴＧＧＣＴＣＣＡＣＣＴＴＴ－３’（配列番号１９）であった。ｑＰＣＲ反応は以下の条件下で行った：９５°Ｃで１０分、続いて以下を４０サイクル：９５°Ｃで１５秒および６０°Ｃで１分。各反応のサイクル閾値（Ｃｔ）の値は、バージョン１ＣｐＧフリーＩＴＲを含む既知の量のシス－プラスミドのコピー数の標準曲線に対して測定することで、ベクターゲノムのコピー数に変換した。データは２倍体ゲノムあたりのベクターゲノムのコピー数として報告する。

骨格筋機能アッセイ。ＴＡ筋の機能を公開されたプロトコル（Ｈａｋｉｍｅｔａｌ．，２０１１；Ｈａｋｉｍｅｔａｌ．，２０１３）に従ってｉｎｓｉｔｕで評価した。具体的には、単収縮力（ｔｗｉｔｃｈｆｏｒｃｅ）、強縮力（ｔｅｔａｎｉｃｆｏｒｃｅ）および伸張性収縮（ｅｃｃｅｎｔｒｉｃｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ）のプロファイルを測定した。実験マウスを、２５ｍｇ／ｍｌのケタミン、２．５ｍｇ／ｍｌのキシラジンおよび０．５ｍｇ／ｍｌのアセプロマジンを含むカクテルを２．５μｌ／ｇ体重で腹腔内注射する事で麻酔した。ＴＡ筋および坐骨神経を慎重に露出させた。そしてマウスを特注の温度制御されたフットプレート台（ｃｕｓｔｏｍ－ｄｅｓｉｇｎｅｄｔｈｅｒｍｏ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｆｏｏｔｐｌａｔｅｐｌａｔｆｏｒｍ）（Ｈａｋｉｍｅｔａｌ．，２０１３）に移した。続いて、公開されたプロトコル（Ｈａｋｉｍｅｔａｌ．，２０１１；Ｈａｋｉｍｅｔａｌ．，２０１３）に従って、力をｉｎｓｉｔｕで、３０５Ｃ－ＬＲｄｕａｌ－ｍｏｄｅｓｅｒｖｏｍｏｔｏｒｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ（ＡｕｒｏｒａＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ａｕｒｏｒａ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）を用いて測定した。絶対単収縮力（ａｂｓｏｌｕｔｅｔｗｉｔｃｈｆｏｒｃｅ）、最適最大等尺性強縮力（ｏｐｔｉｍａｌｍａｘｉｍａｌｉｓｏｍｅｔｒｉｃｔｅｔａｎｉｃｆｏｒｃｅ）および伸張性収縮の１０回の反復サイクルによる力の低下を決定した。データの取得および解析は、ＤｙｎａｍｉｃＭｕｓｃｌｅＣｏｎｔｒｏｌａｎｄＡｎａｌｙｓｉｓｓｏｆｔｗａｒｅ（ＡｕｒｏｒａＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｃ．）を用いて行った。比筋力（ｓｐｅｃｉｆｉｃｍｕｓｃｌｅｆｏｒｃｅ）を、絶対筋力を筋断面積（ＣＳＡ）で除算する事によって計算した。筋ＣＳＡは以下の式に従って算出した：ＣＳＡ＝（筋量ｇ）／［（筋密度ｇ／ｃｍ^３）ｘ（長さ比）ｘ（最適筋長ｃｍ）］。筋密度として、１．０６ｇ／ｃｍ^３を使用した（ＭｅｎｄｅｚａｎｄＫｅｙｓ，１９６０）。長さ比は、最適筋長に対する最適筋線維長の比を意味する。ＴＡ筋の長さ比は０．６であった（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｅｔａｌ．，１９９４）。

統計解析。データは平均±標準誤差（ＳＥＭ）で表す。統計的有意を、ＧｒａｐｈＰａｄＰＲＩＳＭｓｏｆｔｗａｒｅｖｅｒｓｉｏｎ７．０（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ，ＬａＪｏｌｌａＣａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して、スチューデントのｔ検定により決定した。ｐ＜０．０５のとき、その差は有意であるとみなされる。

実施例６

本実施例は、本研究におけるマウスの筋組織を免疫蛍光染色した結果を示す。

免疫蛍光染色では、野生型およびＣｐＧフリーベクターを注射されたＴＡ筋の両方で、筋全体にわたって堅牢な筋鞘マイクロ－ジストロフィンの発現が観察された（図３Ａ、図６）。マイクロ－ジストロフィン陽性筋線維の割合において顕著な差はなかった（図３Ｂ）。

図３Ａおよび３Ｂ．免疫蛍光染色によるマイクロ－ジストロフィン発現の評価。図３Ａ、ＣｐＧフリーベクター（左側パネル）および野生型ベクター（中央パネル）を注射されたジストロフィン－ヌルｍｄｘマウスの前脛骨筋からの、代表的なジストロフィン免疫蛍光染色およびＨＥ染色の顕微鏡画像。コントロールとして、年齢および性別を一致させた未注射のｍｄｘマウスからのＴＡ筋を含む（右側パネル）。スケールバーは全ての画像に適用される。図３Ｂ、ジストロフィン陽性筋線維の定量。

図３Ｃおよび３Ｄ．ウェスタンブロットによるマイクロ－ジストロフィン発現の評価。図３Ｃ、ＡＡＶマイクロ－ジストロフィンベクター注射を受けなかった（未注射）、ＣｐＧフリーＡＡＶマイクロ－ジストロフィンベクターを注射された（ＣｐＧフリーＩＴＲ）、および野生型ＡＡＶマイクロ－ジストロフィンベクターを注射された（野生型ＩＴＲ）ジストロフィン－ヌルｍｄｘマウスの前脛骨筋からの、代表的なジストロフィンのウェスタンブロット。図３Ｄ、Ｌｉ－ＣＯＲＩｍａｇｅＳｔｕｄｉｏＶｅｒｓｉｏｎ５．０．２１ｓｏｆｔｗａｒｅを使用したバンド強度のデンシトメトリー定量。マイクロ－ジストロフィンタンパク質バンドの相対強度を、同じブロットにおける対応するアルファ－チューブリンバンド（ローディングコントロール）で標準化した。

図３Ｅ．定量ＰＣＲによる、ＴＡ筋におけるＡＡＶベクターゲノムのコピー数の評価。ＡＡＶベクターゲノムのコピー数を、ＣｐＧフリーＡＡＶマイクロ－ジストロフィンベクター注射（ＣｐＧフリーＩＴＲ）または野生型ＡＡＶマイクロ－ジストロフィンベクター注射（野生型ＩＴＲ）のどちらかを受けたジストロフィン－ヌルｍｄｘマウスのＴＡ筋について定量した。

図４Ａ－４Ｆ．前脛骨筋の代表的な全景ジストロフィン免疫蛍光染色およびＨＥ染色の顕微鏡画像。図４Ａ、ＣｐＧフリーベクターを注射した筋におけるジストロフィン染色。図４Ｂ、ＣｐＧフリーベクターを注射した筋におけるＨＥ染色。図４Ｃ、野生型ＩＴＲベクターを注射した筋におけるジストロフィン染色。図４Ｄ、野生型ＩＴＲベクターを注射した筋におけるＨＥ染色。図４Ｅ、未注射の筋肉におけるジストロフィン染色。図４Ｆ、未注射の筋肉におけるＨＥ染色。

実施例７

本実施例は、本研究のマウスの筋組織における組織学的レスキューに関する実験結果を示す。

組織学的レスキューを決定するために、中心核形成および筋線維の大きさの分布を定量した（図５）。前者は変性／再生（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ／ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）を、および後者は筋肥大／萎縮（ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ／ａｔｒｏｐｈｙ）を明らかにした。野生型ベクターを注射した筋は５４．３±２．１％の中心核をもつ筋線維を含む。ＣｐＧフリーベクターを注射した筋肉は５９．１±３．１％の中心核をもつ筋線維を含む（図５Ａ）。筋繊維の大きさは、最小フェレ径によって測定した（図５Ｂ）。全範囲（１０～５６μｍ）において、野生型とＣｐＧフリーベクター注入筋の間に差はなかった。

図５Ａおよび５Ｂ．中心核形成および筋線維の大きさ分布の評価。図５Ａ、ＣｐＧフリーベクターおよび野生型ベクターで処置したｍｄｘマウスにおける、中心部に局在した核を含む筋線維の割合。図５Ｂ、ＣｐＧフリーベクターで処置した筋からの６１６本の筋線維（ｎ＝６筋肉、筋肉あたり８０から１３１本の筋線維）および野生型ベクターで処理した筋肉からの７１２本の筋線維（ｎ＝６筋肉、筋肉あたり８７～１３５筋線維）の、異なる最小フェレ径における筋線維の割合の分布。

実施例８

本実施例は、本研究のマウスの筋組織における生理学的レスキューに関する実験結果を示す。

生理学的レスキューを決定するために、筋重量、断面積、絶対単収縮力および比単収縮力、絶対強縮力および比強縮力、力－頻度の関係、および伸張性収縮負荷後の力の低下を定量した（図６）。検討した全てのパラメーターにおいて、統計的に有意な差はなかった。

図６Ａ－６Ｈ．筋肉の収縮性の定量的評価。図６Ａ、前脛骨（ＴＡ）筋の重量。図６Ｂ、筋肉の断面積（ＣＳＡ）。図６Ｃ、絶対単収縮力（Ｐｔ）。図６Ｄ、比単収縮力（ｓＰｔ）。図６Ｅ、絶対強縮力（Ｐｏ）。図６Ｆ、比強縮力（ｓＰｏ）。図６Ｇ、力－頻度の関係。図６Ｈ、伸張性収縮プロファイル。

実施例９

本実施例は、マウス研究におけるトランスダクション効率に関する実験結果を示す。

一本鎖から二本鎖への変換（複製に似た過程）においてＩＴＲが果たす役割および、ＣｐＧフリーベクターに関して収量が顕著に減少するという観察を考慮すると、最初ＣｐＧフリーベクターは減少したトランスダクション効率を示し得ると考えられていた。これを試験するために、同じ動物におけるペアの実験を行った。野生型ベクターを筋肉の片側に注射し、ＣｐＧフリーベクターをもう一方に注射した。驚くべきことに、導入遺伝子の発現において差は検出されなかった（図３）。重要なことには、両者のベクターは、疾患マウスにおける組織学的および生理学的欠損の緩和において同様に効果的であった（図５および６）。

要するに、ＣｐＧフリーＩＴＲは、ｒＡＡＶベクターの製造のために使用することができる。重要なことに、ＩＴＲにＣｐＧを持たないｒＡＡＶベクターの生物学的な有効性は野生型ＩＴＲを持つベクターのそれと同等であった。

本開示の要素またはその好ましい実施形態を紹介する場合、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」および「ｓａｉｄ」はその要素の１つ以上が存在する事を意味する事を意図する。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は、包括的であって、記載した要素以外の追加的な要素が存在し得る事を意味する事を意図する。

上記の観点から、本開示のいくつかの目的が達成され、およびその他の有利な結果が得られる事がわかるであろう。

本開示の範囲から逸脱する事なく、上述の方法、過程および組成物において様々な変更がなされ得るので、上記の説明に含まれる、および添付の図面において示される全ての事項は例示的なものとして解釈され、限定的な意味で解釈されないことが意図される。

Claims

５’－シトシン－リン酸－グアニン－３’（ＣｐＧ）モチーフを含まない末端逆位反復配列（ＩＴＲ）。
配列番号７、配列番号９、配列番号１１、および配列番号１２の内の少なくとも１つに対して約７０％～約９０％の配列同一性を含む、請求項１に記載のＩＴＲ。
約１００～約２００個の核酸を含む、請求項１に記載のＩＴＲ。
７０％以下のＧＣ含量を含む、請求項１に記載のＩＴＲ。
トランジション変異を含むＲｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）を含む、請求項１に記載のＩＴＲ。
ＩＴＲが５’末端ＩＴＲであるかまたは３’末端ＩＴＲである、請求項１に記載のＩＴＲ。
ＩＴＲが５’末端ＩＴＲであり、および５’末端ＩＴＲが、５’末端ＩＴＲにおけるＡセグメントの最初のＣｐＧモチーフにおいてにグアニンからチミンへの置換を含む、請求項１に記載のＩＴＲ。
ＩＴＲが５’末端ＩＴＲであり、および５’末端ＩＴＲが、Ａセグメントにおける３つの残ったＣｐＧモチーフにおいてグアニンからアデニンへの置換を含む、請求項７に記載のＩＴＲ。
５’末端ＩＴＲのＡ’、Ｂ’およびＣ’セグメントにおける対応する塩基が相補的な塩基と置換される、請求項８に記載のＩＴＲ。
ＩＴＲが３’末端ＩＴＲであり、および３’末端ＩＴＲが、３’末端ＩＴＲのＡセグメントにおける最初のＣｐＧモチーフにおいてグアニンからチミンへの置換を含む、請求項１に記載のＩＴＲ。
ＩＴＲが３’末端ＩＴＲであり、および３’末端ＩＴＲが、３’末端ＩＴＲのＡセグメントにおける３つの残ったＣｐＧモチーフにおいてグアニンからアデニンへの置換を含む、請求項１０に記載のＩＴＲ。
３’末端ＩＴＲのＡ’、Ｂ’およびＣ’セグメントにおける対応する塩基が相補的な塩基と置換される、請求項１１に記載のＩＴＲ。
配列番号７、配列番号９、配列番号１１、および配列番号１２の内の少なくとも１つに対して約８０％の配列同一性を含む、請求項１に記載のＩＴＲ。
配列番号７、配列番号９、配列番号１１、および配列番号１２の内の少なくとも１つからなる群より選択される、請求項１に記載のＩＴＲ。
５’－シトシン－リン酸－グアニン－３’（ＣｐＧ）モチーフを含まない末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）核酸ベクター。
５’－シトシン－リン酸－グアニン－３’（ＣｐＧ）モチーフを含まない末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含むｒＡＡＶ核酸ベクターおよびウイルスカプシドを含む、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子。
薬学的に許容できる担体および請求項１６に記載の組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む医薬組成物。
請求項１５に記載のｒＡＡＶベクターを細胞に投与する事を含む、核酸を細胞に送達する方法。
対象に治療有効量の請求項１５に記載のｒＡＡＶベクターを投与する事を含む、必要とする対象における疾患の予防または処置方法。
疾患が、神経筋疾患、網膜疾患、聴覚疾患、肝臓疾患、腎臓疾患、肺疾患、心臓疾患、血液疾患、中枢神経系疾患、およびその他の疾患、から選択される、請求項１９に記載の疾患の予防または処置方法。