TW201525004A - 結合前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶加工酶９型之人類抗原結合蛋白 - Google Patents

結合前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶加工酶９型之人類抗原結合蛋白 Download PDF

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Abstract

本發明提供如下組合物及方法，其與能夠抑制PCSK9結合於LDLR且具有增加之pH值敏感性、改良之結合親和力及/或增加之活體內半衰期的抗原結合蛋白有關或來源於該等抗原結合蛋白。在實施例中，該等抗原結合蛋白特異性結合PCSK9且具有增加之pH值敏感性、改良之結合親和力及/或增加之活體內半衰期。在一些實施例中，抗原結合蛋白為特異性結合PCSK9之完全人類、人類化或嵌合抗體、該等抗體之結合片段及衍生物以及多肽。其他實施例提供編碼該等抗原結合蛋白之核酸、其片段及衍生物及多肽；包含該等聚核苷酸之細胞；產生該等抗原結合蛋白、其片段及衍生物及多肽之方法；及使用該等抗原結合蛋白、其片段及衍生物及多肽之方法，包括治療或診斷罹患高膽固醇血症及相關病症或病狀之個體的方法。

Description

結合前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶加工酶9型之人類抗原結合蛋白
本發明係關於編碼結合前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶加工酶9型(下文中稱為「PCSK9」)之抗原結合蛋白(APB)之核酸分子，以及包含結合PCSK9之抗原結合蛋白的醫藥組合物，包括抑制PCSK9與LDL受體之結合的抗原結合蛋白，及使用該等核酸、多肽或醫藥組合物治療代謝失調之方法。亦提供使用抗原結合蛋白之診斷方法。
蛋白質前體加工酶枯草桿菌蛋白酶加工酶9(PCSK9)為與調節低密度脂蛋白受體(LDLR)蛋白質之含量有關的絲胺酸蛋白酶(Horton等人，2007；Seidah及Prat,2007)。活體外實驗表明向HepG2細胞中添加PCSK9可降低細胞表面LDLR之含量(Benjannet等人，2004；Lagace等人，2006；Maxwell等人，2005；Park等人，2004)。用小鼠進行之實驗表明增加PCSK9蛋白含量可降低肝臟中之LDLR蛋白質含量(Benjannet 等人，2004；Lagace等人，2006；Maxwell等人，2005；Park等人，2004)，而PCSK9剔除小鼠在肝臟中具有增加之LDLR含量(Rashid等人，2005)。此外，已鑑別各種引起血漿LDL含量增加或降低之人類PCSK9突變(Kotowski等人，2006；Zhao等人，2006)。已證實PCSK9可降低肝臟中之LDL受體含量，引起血漿中之高LDL膽固醇含量及對冠 心病之敏感性增加(Peterson等人，J Lipid Res.49(7)：1595-9(2008))。因此，極有利的是製備PCSK9之治療性拮抗劑，其抑制PCSK9之活性及PCSK9在各種疾病病狀中所起之相應作用。
本發明係部分基於多種針對PCSK9之抗體。PCSK9呈現為重要的及有利的治療性目標，且本發明提供作為治療及診斷劑之抗體，其係用於靶向與PCSK9之表現及/或活性有關的病理學病狀。因此，本發明提供與PCSK9有關之方法、組合物、套組及製品。
在另一實施例中，提供包含免疫球蛋白重鏈可變域多肽或其功能性片段之經分離之抗PCSK9抗原結合蛋白，該免疫球蛋白重鏈可變域多肽或其功能性片段與SEQ ID NO：270至353中之任一者之胺基酸序列具有至少85%、90%、95%序列一致性或包含該胺基酸序列。在另一實施例中，提供前述技術方案中之任一項之經分離之抗PCSK9抗原結合蛋白，其包含免疫球蛋白輕鏈可變域多肽或其功能性片段，該免疫球蛋白輕鏈可變域多肽或其功能性片段與SEQ ID NO：186至269中之任一者之胺基酸序列具有至少85%、90%、95%序列一致性或包含該胺基酸序列。在另一實施例中，提供先前描述之ABP中之任一者之抗原結合蛋白，其中抗原結合蛋白包含以下中之一或多者：(a)包含於(d)中之抗體中之任一者中且包含抗體中之任一者中所包含之胺基酸序列的重鏈及輕鏈，(b)(d)中之抗體中之任一者中所包含之重鏈及輕鏈可變域，或(c)(d)中列出之抗體中之任一者中所包含之CDRH1、CDRH2及CDRH3以及CDRL1、CDRL2及CDRL3，其中(d)為抗體SS-13406(8A3HLE-51)、SS-13407(8A3HLE-112)、SS-14888(P2C6-HLE51)、13G9,19A12,20D12、25B5、30G7、SS-15057、SS-15058、SS-15059、SS-15065、SS-15079、SS-15080、SS-15087、SS-15101、SS-15103、SS-15104、SS-15105、SS-15106、SS-15108、 SS-15112、SS-15113、SS-15114、SS-15117、SS-15121、SS-15123、SS-15124、SS-15126、SS-15132、SS-15133、SS-15136、SS-15139、SS-15140、SS-15141、SS-13983(A01)、SS-13991(A02)、SS-13993(C02)、SS-12685(P1B1)、SS-12686(P2F5)、SS-12687(P2C6)、SS-14892(P2F5/P2C6)、SS-15509、SS-15510、SS-15511、SS-15512、SS-15513、SS-15514、SS-15497、SS-15515,SS-15516、SS-15517、SS-15518、SS-15519、SS-15520、SS-15522、SS-15524、SS-14835、SS-15194、SS-15195、SS-15196、SS-14894、SS-15504、SS-15494、SS-14892、SS-15495、SS-15496、SS-15497、SS-15503、SS-15505、SS-15506、SS-15507、SS-15502、SS-15508、SS-1550、SS-15500、SS-15003、SS-15005、SS-15757(P1F4)、SS-15758(P1B6)、SS-15759(P2F4)、SS-15761(P2G5)、SS-15763(P2H7)或SS-15764(P2H8)。
在另一實施例中，提供上述ABPS中之任一者之抗PCSK9抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白為單株抗體。在另一實施例中，提供上述ABP中之任一者之抗PCSK9抗原結合蛋白，其中抗體經人類化。在另一實施例中，提供上述抗體中之任一者之抗PCSK9抗體，其中該抗體為人類抗體。在另一實施例中，提供上述抗體中之任一者之抗PCSK9抗體，其中該抗體為選自Fab、Fab'-SH、Fv、scFv或(Fab')2片段之抗體片段。在另一實施例中，提供上述抗體中之任一者之抗PCSK9抗體，其中至少一部分構架序列為人類共同構架序列。
在另一實施例中，提供編碼上述ABP中之任一者之抗PCSK9抗原結合蛋白的經分離之核酸。在另一實施例中，提供包含編碼上述ABP之核酸的載體。在一個實施例中，本發明之載體為表現載體。在另一實施例中，提供包含本發明之載體的宿主細胞。在一個實施例中，本發明之宿主細胞為原核宿主細胞。在本發明之另一實施例中，宿主細 胞為真核宿主細胞。在另一實施例中，提供本發明之用於產生抗PCSK9抗原結合蛋白之方法，該方法包含在適於表現編碼抗PCSK9抗體之核酸的條件下培養宿主細胞，該宿主細胞包含載體，該載體包含編碼上述抗PCSK9抗原結合蛋白1之核酸。在另一實施例中，提供進一步包含自宿主細胞回收抗PCSK9抗原結合蛋白之本發明之方法。
在另一實施例中，提供包含上述抗PCSK9抗原結合蛋白及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。在另一實施例中，提供降低個體中之LDL-膽固醇含量之方法，該方法包含投與個體有效量之任一種上述抗PCSK9抗原結合蛋白。在另一實施例中，提供治療個體中之膽固醇相關病症的方法，該方法包含投與個體有效量之任一種上述抗PCSK9抗原結合蛋白。在另一實施例中，提供治療個體中之高膽固醇血症的方法，該方法包含投與個體有效量之任一種上述抗PCSK9抗原結合蛋白。在另一實施例中，提供進一步包含投與個體有效量之第二藥劑的上述治療方法，其中抗PCSK9抗原結合蛋白為第一藥劑。在一些實施例中，提供其中第二藥劑使LDLR含量升高的方法。在一些實施例中，提供其中第二藥劑使LDL-膽固醇含量降低的方法。在一些實施例中，提供其中第二藥劑包含士他汀(statin)的方法。在一些實施例中，提供其中士他汀係選自由以下組成之群的方法：阿伐他汀(atorvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、美伐他汀(mevastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、普伐他汀(pravastatin)、羅素他汀(rosuvastatin)、辛伐他汀(simvastatin)及其任何組合。在另一實施例中，提供抑制個體中PCSK9與LDLR之結合的方法，該方法包含投與個體有效量之任一種上述抗PCSK9抗原結合蛋白。
在另一實施例中，提供偵測樣品中之PCSK9蛋白質的方法，該方法包含(a)使樣品與任一種上述抗原結合蛋白接觸，及(b)偵測抗PCSK9抗原結合蛋白與PCSK9蛋白質之間複合物之形成。
圖1為8A3抗體變異體(具有所示單胺基酸取代)之表面電漿子共振篩檢之圖形，該等變異體具有垂直軸上之pH 7.4下之結合親和力及水平軸上之pH 5.5下之估算複合物半衰期。
圖2為8A3抗體變異體(具有所示重鏈及輕鏈組合胺基酸變化)之表面電漿子共振篩檢之圖形，該等變異體具有垂直軸上之pH 7.4下之結合親和力及水平軸上之pH 5.5下之估算複合物半衰期。
圖3為31H4抗體變異體(具有所示取代)之表面電漿子共振篩檢之圖形，該等變異體具有垂直軸上之pH 7.4下之結合親和力及水平軸上之pH 5.5下之估算複合物半衰期。
圖4A及4B為描繪人類HepG2細胞中LDL攝取之抗體變異體P2C6抑制之圖形。
圖5A-D為一系列描繪活體內抗體變異體對LDL-C、HDL-C、總膽固醇及三酸甘油酯含量之作用的圖形。
圖6為展示血液樣品獲取時間之時線。
圖7A為描繪活體內抗體變異體(包含恆定域變化)對血清LDL-C之作用的圖形。圖7B為描繪活體內隨時間推移之抗體變異體(包含恆定域變化)濃度的圖形。
本文中所使用之章節標題係僅用於組織目的且不應視為限制所描述之標的物。
除非本文另有定義，否則與本申請案結合使用之科學及技術術語將具有一般技術者通常理解之含義。此外，除非上下文另有需要，否則單數術語將包括複數且複數術語將包括單數。
通常，本文所述之關於細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學及蛋白質與核酸化學及雜交使用之命名法及該 等學科之技術為此項技術中所熟知及常用之命名法及技術。除非另有指示，否則通常根據此項技術中所熟知且如貫穿本說明書所引用及討論之多種一般及較特定參考文獻中所述之習知方法來執行本發明之方法及技術。參見例如Sambrook等人， Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)及後續版，Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992)，以及Harlow及Lane,Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1988)，其以引用的方式併入本文中。酶促反應及純化技術係根據製造商之說明書如此項技術中通常所實現或如本文中所述執行。本文所述之關於分析化學、合成有機化學以及醫藥及藥物化學使用之術語及該等學科之實驗室程序及技術為此項技術中熟知及常用的。標準技術可用於化學合成、化學分析、醫藥製備、調配及傳遞以及治療患者。
應理解，本發明不限於本文中所描述之特定方法、方案及試劑等且因此可變化。本文中使用之術語學係僅出於描述特定實施例之目的且不意欲限制本發明之範疇。
除在操作實例中或明確說明外，本文中使用之所有表示成分量之數字或反應條件應理解為在一切情況下均由術語「約」修飾。當關於百分比使用時，術語「約」可意謂±5%，例如1%、2%、3%或4%。
I.定義
如本文中所用，除非另有特定說明，否則術語「一」意謂「一或多個」。
如本文中所用，「抗原結合蛋白」為包含結合於抗原或目標之部分以及視情況選用之骨架或構架部分的蛋白質，該骨架或構架部分使抗原結合部分具有可促進抗原結合蛋白與抗原結合之構形。抗原結合 蛋白之實例包括人類抗體、人類化抗體；嵌合抗體；重組型抗體；單鏈抗體；雙功能抗體；三功能抗體；四功能抗體；Fab片段；F(ab')2片段；IgD抗體；IgE抗體；IgM抗體；IgG1抗體；IgG2抗體；IgG3抗體；或IgG4抗體，及其片段。抗原結合蛋白可包含例如替代性蛋白質骨架或人工骨架，該替代性蛋白質骨架或人工骨架具有移植CDR或CDR衍生物。該等骨架包括(但不限於)抗體衍生骨架，包含引入以例如穩定抗原結合蛋白之三維結構的突變；以及完全合成骨架，包含例如生物相容性聚合物。參見例如Korndorfer等人，(2003)Proteins：Structure,Function,and Bioinformatics,53(1)：121-129；Roque等人，(2004)Biotechnol.Prog. 20：639-654。此外，可使用肽抗體模擬劑(「PAM」)，以及基於抗體模擬劑之骨架(其利用纖維結合蛋白組分作為骨架)。
抗原結合蛋白可具有例如天然存在之免疫球蛋白之結構。「免疫球蛋白」為四聚體分子。在天然存在之免疫球蛋白中，各四聚體由兩個一致多肽鏈對組成，各配對具有一個「輕」鏈(約25kDa)及一個「重」鏈(約50-70kDa)。各鏈之胺基末端部分包括主要負責抗原識別之約100至110或更多胺基酸之可變區。各鏈之羧基端部分界定主要負責效應功能之恆定區。將人類輕鏈分類為κ及λ(lambda)輕鏈。將重鏈分類為μ(mu)、δ(delta)、γ(gamma)、α(alpha)或ε(epsilon)，且將抗體之同型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。在輕鏈及重鏈內，可變區及恆定區由具有約12個或更多個胺基酸之「J」區接合，其中重鏈亦包括具有約10個或更多個胺基酸之「D」區。通常參見Fundamental Immunology第2版第7章(Paul,W.編，Raven Press,N.Y.(1989))，其以全文引用的方式併入本文中以用於所有目的。各輕/重鏈對之可變區形成抗體結合位點，使得完整免疫球蛋白具有兩個結合位點。
天然存在之免疫球蛋白鏈呈現相同的相對保存構架區域(FR)之通式結構，該等相對保存構架區域由三個高變區(亦稱為互補決定區或CDR)接合。自N端至C端，輕鏈及重鏈包含結構域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。對各結構域之胺基酸分配可根據Kabat等人，(1991)「Sequences of Proteins of Immunological Interest」，第5版，美國衛生和公眾服務部(US Dept.of Health and Human Services),PHS,NIH,NIH出版號91-3242之定義進行。儘管本文中使用卡拜特命名系統呈現，但亦可視需要根據替代性命名流程重新定義本文中揭示之CDR，諸如科西亞(Chothia)命名系統(參見Chothia及Lesk,(1987)J.Mol.Biol. 196：901-917；Chothia等人，(1989)Nature 342：878-883或Honegger及Pluckthun,(2001)J.Mol.Biol：309：657-670)。
在本發明之情形中，當解離常數(KD)10-8M時，將抗原結合蛋白稱為「特異性結合」或「選擇性結合」其目標抗原。抗體在KD 5×10-9M時以「高親和力」且在KD 5×10-10M時以「極高親和力」特異性結合抗原。在一個實施例中，抗體將以介於約10-7M與10-12M之間的KD結合於PCSK9，且在另一實施例中，抗體將以KD 5×10-9結合。
除非另有說明，否則「抗體」係指完整免疫球蛋白或其中與完整抗體針對特異性結合進行競爭之抗原結合部分。抗原結合部分可由重組型DNA技術或完整抗體之酶促或化學裂解產生。抗原結合部分尤其包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、結構域抗體(dAb)、包括互補決定區(CDR)之片段、單鏈抗體(scFv)、嵌合抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體，及含有至少一部分足以賦予多肽特異性抗原結合之免疫球蛋白的多肽。
Fab片段為單價片段，其具有VL、VH、CL及CH1結構域； F(ab')2片段為二價片段，其具有由絞鏈區處之二硫鍵連接的兩個Fab片段；Fd片段具有VH及CH1結構域；Fv片段具有抗體之單臂之VL及VH結構域；且dAb片段具有VH結構域、VL結構域或VH或VL結構域之抗原結合片段(美國專利第6,846,634號及6,696,245號；及美國申請公開案第05/0202512號、第04/0202995號、第04/0038291號、第04/0009507號、第03/0039958號，Ward等人，Nature 341：544-546(1989))。
單鏈抗體(scFv)為其中VL域及VH域經由連接子(例如胺基酸殘基之合成序列)接合以形成連續蛋白質鏈之抗體，其中連接子足夠長以允許蛋白質鏈在自身上摺疊及形成單價抗原結合位點(參見例如Bird等人，(1988)Science 242：423-26及Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-83)。雙功能抗體為包含兩個多肽鏈之二價抗體，其中各多肽鏈包含由連接子接合之VH及VL域，該連接子過短從而無法實現同一鏈上兩個結構域之間的配對，因此使各結構域與另一多肽鏈上之互補結構域配對(參見例如Holliger等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-48及Poljak等人，(1994)Structure 2：1121-23)。若雙功能抗體之兩個多肽鏈相同，則由其配對產生之雙功能抗體將具有兩個相同的抗原結合位點。可使用具有不同序列之多肽鏈產生具有兩個不同抗原結合位點之雙功能抗體。類似地，三功能抗體及四功能抗體分別為包含三個及四個多肽鏈且分別形成三個及四個抗原結合位點(其可相同或不同)之抗體。
可使用由Kabat等人，(1991)「Sequences of Proteins of Immunological Interest」，第5版，US Dept.of Health and Human Services,PHS,NIH,NIH出版號91-3242描述之系統鑑別既定抗體之互補決定區(CDR)及構架區(FR)。儘管本文中使用卡拜特命名系統呈現，但亦可視需要根據替代性命名流程重新定義本文中揭示之CDR， 諸如科西亞命名系統(參見Chothia及Lesk,(1987)J.Mol.Biol. 196：901-917；Chothia等人，(1989)Nature 342：878-883或Honegger及Pluckthun,(2001)J.Mol.Biol. 309：657-670)。可將一或多個CDR以共價或非共價方式併入分子中以使其成為抗原結合蛋白。抗原結合蛋白可合併有CDR作為較大多肽鏈之一部分、可將CDR共價連接至另一多肽鏈或可以非共價方式合併有CDR。CDR使抗原結合蛋白能夠特異性結合於特定相關抗原。
抗原結合蛋白可(但無需)具有一或多個結合位點。若存在一個以上結合位點，則結合位點可彼此相同或可不同。舉例而言，天然存在之人免疫球蛋白典型地具有兩個相同結合位點，而「雙特異性」或「雙功能」抗體具有兩個不同結合位點。此雙特異性形式之抗原結合蛋白(例如包含本文中提供之各種重鏈及輕鏈CDR之抗原結合蛋白)包含本發明之態樣。
術語「人類抗體」包括所有具有一或多個來源於人免疫球蛋白序列之可變區及恆定區之抗體。在一個實施例中，所有可變域及恆定域均來源於人免疫球蛋白序列(完全人類抗體)。此等抗體可以多種方式製備，其實例描述於下文中，包括藉由經遺傳修飾以表現來源於編碼人類重鏈及/或輕鏈之基因之抗體的小鼠之相關抗原經由免疫製備，諸如來源於XENOMOUSE®、ULTIMABTM、HUMAB-MOUSE®、VELOCIMOUSE®、VELOCIMMUNE®、KYMOUSE或ALIVAMAB系統之小鼠，或來源於人類重鏈轉殖基因小鼠、轉殖基因大鼠人類抗體譜系、轉殖基因兔人類抗體譜系或牛人類抗體譜系或HUTARGTM技術。亦可使用基於噬菌體之方法。
人類化抗體具有與藉由一或多個胺基酸取代、缺失及/或添加而自非人類物種獲得之抗體之序列不同的序列，使得人類化抗體與非人類物種抗體相比在投與人類個體時不太可能誘導免疫反應及/或誘導 不太嚴重的免疫反應。在一個實施例中，非人類物種抗體之重鏈及/或輕鏈之構架及恆定域中的某些胺基酸經突變以產生人類化抗體。在另一實施例中，來自人類抗體之恆定域與非人類物種之可變域融合。在另一實施例中，改變非人類抗體中之一或多個CDR序列中的一或多個胺基酸殘基以降低非人類抗體在投與人類個體時可能存在的免疫原性，其中所改變之胺基酸殘基對抗體與其抗原之免疫特異性結合而言並不重要，或所進行之胺基酸序列變化為保守性變化，使得人類化抗體與抗原之結合不會明顯劣於非人類抗體與抗原之結合。如何製備人類化抗體之實例可見於美國專利第6,054,297號、第5,886,152號及第5,877,293號中。
術語「嵌合抗體」係指含有一或多個來自一種抗體之區域及一或多個來自一或多種其他抗體之區域的抗體。在一個實施例中，一或多種CDR係來源於與PCSK9結合之人類抗體。在另一實施例中，所有CDR均來源於與PCSK9結合之人類抗體。在另一實施例中，將來自一種以上與PCSK9結合之人類抗體之CDR在嵌合抗體中混合及匹配。舉例而言，嵌合抗體可包含來自與PCSK9結合之第一人類抗體之輕鏈的CDR1、來自與PCSK9結合之第二人類抗體之輕鏈的CDR2及CDR3以及來自與PCSK9結合之第三抗體之重鏈。此外，構架區域可來源於與PCSK9結合之相同抗體中之一種、來自一或多種不同抗體(諸如人類抗體)或來自人類化抗體。在嵌合抗體之一個實例中，重鏈及/或輕鏈中之一部分與來自特定物種或屬於特定抗體類別或子類之抗體相同、與其同源或係自其獲得，而該鏈之其餘部分與來自另一物種或屬於另一抗體類別或子類之抗體相同、與其同源或係自其獲得。亦包括該等抗體中呈現所需生物活性之片段(例如特異性結合PCSK9之能力)。
術語「輕鏈」包括全長輕鏈及其具有足以賦予結合特異性之可變區序列之片段。全長輕鏈包括可變區域VL及恆定區域CL。輕鏈可 變區域位於多肽之胺基端處。輕鏈包括κ(「κ」)鏈及λ(「λ」)鏈。
術語「重鏈」包括全長重鏈及其具有足以賦予結合特異性之可變區序列之片段。全長重鏈包括可變區結構域VH及三個恆定區結構域CH1、CH2及CH3。VH結構域位於多肽之胺基端，且CH結構域位於羧基端，其中CH3最靠近多肽之羧基端。重鏈可為任何同型，包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3及IgG4次型)、IgA(包括IgA1及IgA2次型)、IgM及IgE。
如本文中所用之術語抗原結合蛋白之「免疫功能性片段」(或簡稱為「片段」)，例如抗體或免疫球蛋白鏈(重鏈或輕鏈)，為包含抗體之一部分(無論該部分係如何獲得或合成)之抗原結合蛋白，其缺乏全長鏈中之至少一些胺基酸，但其能夠特異性結合於抗原。該等片段具有生物活性，亦即其特異性結合於目標抗原且可與其他抗原結合蛋白(包括完整抗體)競爭特異性結合於既定抗原決定基。在一個態樣中，該種片段將保留至少一個於全長輕鏈或重鏈中所存在之CDR，且在一些實施例中將包含單一重鏈及/或輕鏈或其部分。此等生物學活性片段可由重組型DNA技術製備，或可由抗原結合蛋白(包括完整抗體)之酶促或化學裂解製備。免疫功能性免疫球蛋白片段包括(但不限於)Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、結構域抗體及單鏈抗體，且可來源於任何哺乳動物，包括(但不限於)人類、小鼠、大鼠、駱駝或兔。進一步預期本文所揭示之抗原結合蛋白的功能性部分(例如一或多個CDR)可共價結合於第二蛋白質或小分子以形成針對體內特定目標且具有雙功能治療性質或具有延長之血清半衰期的治療劑。
「Fc」區域含有兩個重鏈片段，其包含抗體之CH2及CH3域。兩個重鏈片段由兩個或兩個以上二硫鍵及CH3域之疏水性相互作用保持在一起。
「Fab'片段」含有一個輕鏈、及一個重鏈之含有VH結構域及CH1 結構域以及CH1結構域與CH2結構域之間的區域的部分，以便在兩個Fab'片段之兩條重鏈之間可形成鏈間二硫鍵以形成F(ab')2分子。
「F(ab')2片段」含有兩個輕鏈、及兩個含有CH1域與CH2域之間的一部分恆定區的重鏈，使得在兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵。因此，F(ab')2片段由兩個重鏈之間的二硫鍵保持在一起的兩個Fab'片段構成。
「Fv區」包含來自重鏈與輕鏈兩者之可變區，但缺乏恆定區。
「結構域抗體」為僅含有重鏈可變區或輕鏈可變區之免疫功能性免疫球蛋白片段。在一些情況下，兩個或兩個以上VH區與肽連接子共價接合以產生二價結構域抗體。二價域抗體之兩個VH區可靶向相同或不同抗原。
「半抗體(hemibody)」為包含完整重鏈、完整輕鏈及與完整重鏈之Fc區配對之第二重鏈Fc區的免疫功能性免疫球蛋白構築體。可(但無需)使用連接子使重鏈Fc區與第二重鏈Fc區接合。在特定實施例中，半抗體為本文中揭示之抗原結合蛋白之單價形式。在其他實施例中，可使用帶電殘基對使一個Fc區與第二個Fc區締合。
「二價抗原結合蛋白」或「二價抗體」包含兩個抗原結合位點。在一些情況下，兩個結合位點具有相同抗原特異性。如本文中所描述，二價抗原結合蛋白及二價抗體可為雙特異性，及形成本發明之態樣。
「多特異性抗原結合蛋白」或「多特異性抗體」為靶向一個以上抗原或抗原決定基之抗原結合蛋白或抗體，且形成本發明之另一態樣。
「雙特異性」、「雙重特異性」或「雙功能性」抗原結合蛋白或抗體分別為具有兩個不同抗原結合位點之雜交抗原結合蛋白或抗體。雙特異性抗原結合蛋白及抗體為一種多特異性抗原結合蛋白或多特異 性抗體且可由多種方法製備，包括(但不限於)融合瘤之融合或Fab'片段之連接。參見例如Songsivilai及Lachmann,(1990)Clin.Exp.Immunol. 79：315-321；Kostelny等人，(1992)J.Immunol. 148：1547-1553。雙特異性抗原結合蛋白或抗體之兩個結合位點將結合於兩個不同抗原決定基，該兩個不同抗原決定基可駐留於相同(例如PCSK9)或不同蛋白質目標上，包括例如：卵磷脂膽固醇醯基轉移酶(LCAT)、類促血管生成素蛋白質-3(ANGPTL3)、ANGPTL4、內皮脂肪酶(EL)、脂蛋白元CIII(ApoCIII)、脂蛋白脂肪酶(LPL)、纖維母細胞生長因子21(FGF21)。
術語「聚核苷酸」或「核酸」包括單股核苷酸聚合物及雙股核苷酸聚合物。包含聚核苷酸之核苷酸可為核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸或任一類型之核苷酸之經修飾形式。該等修飾包括鹼基修飾，諸如溴尿苷及肌苷衍生物；核糖修飾，諸如2'3'-二去氧核糖；及核苷酸間鍵聯修飾，諸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯及磷醯胺酸酯。
術語「寡核苷酸」意謂包含200個或200個以下核苷酸之聚核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸長度為10至60個鹼基。在其他實施例中，寡核苷酸長度為12、13、14、15、16、17、18、19或20至40個核苷酸。寡核苷酸可為例如用於構築突變基因之單股或雙股寡核苷酸。寡核苷酸可為有義或反義寡核苷酸。寡核苷酸可包括標記，包括放射性標記、螢光標記、半抗原或抗原標記，以用於偵測分析。寡核苷酸可例如用作PCR引子、選殖引子或雜交探針。
「經分離核酸分子」意謂基因組、mRNA、cDNA或合成來源之DNA或RNA或其某種組合，其不與在自然界中發現經分離聚核苷酸之聚核苷酸之全部或一部分締合，或其連接於其在自然界中不連接之聚核苷酸。在本發明中，應理解，「包含特定核苷酸序列之核酸分子」 不涵蓋完整染色體。除指定序列之外，「包含」指定核酸序列之經分離核酸分子亦可包括多達10種或甚至多達20種其他蛋白質或其部分之編碼序列，或可包括控制所述核酸序列之編碼區之表現的可操作地連接之調節序列，及/或可包括載體序列。
除非另有規定，否則本文論述之任何單股聚核苷酸序列之左手端為5'端；雙股聚核苷酸序列之左手方向稱為5'方向。初生RNA轉錄物之5'至3'添加方向稱為轉錄方向；DNA股上具有與RNA轉錄物相同之序列且相對於RNA轉錄物5'端為5'之序列區域稱為「上游序列」；DNA股上具有與RNA轉錄物相同之序列且相對於RNA轉錄物3'端為3'之序列區域稱為「下游序列」。
術語「控制序列」係指可影響其所連接之編碼序列之表現及加工的聚核苷酸序列。此等控制序列之性質可視宿主生物體而定。在特定實施例中，原核生物之控制序列可包括啟動子、核糖體結合位點及轉錄終止序列。舉例而言，真核生物之控制序列可包括包含一個或複數個轉錄因子識別位點之啟動子、轉錄強化子序列及轉錄終止序列。「控制序列」可包括前導序列及/或融合搭配物序列。
術語「載體」意謂用於將蛋白質編碼資訊轉移至宿主細胞中之任何分子或實體(例如核酸、質體、噬菌體或病毒)。
術語「表現載體」或「表現構築體」係指適於轉型宿主細胞且含有引導及/或控制(連同宿主細胞一起)與其可操作地連接之一或多個異源編碼區之表現的核酸序列之載體。表現構築體可包括(但不限於)影響或控制與其可操作地連接之編碼區之轉錄、轉譯且若存在內含子，則影響該編碼區之RNA剪接的序列。
如本文所用，「可操作地連接」意謂該術語所應用之組分呈允許其在適合條件下執行其固有功能之關係。舉例而言，載體中「可操作地連接」於蛋白質編碼序列之控制序列與蛋白質編碼序列接合以便在 與控制序列之轉錄活性相容之條件下達成蛋白編碼序列之表現。
術語「宿主細胞」意謂已用或能夠用核酸序列轉型且藉此表現相關基因之細胞。該術語包括親本細胞之子代，而不管子代在形態或遺傳構成方面是否與原始親本細胞一致，只要存在相關基因即可。
術語「轉導」意謂基因自一個細菌轉移至另一個細菌，通常藉由噬菌體進行。「轉導」亦係指藉由複製缺陷反轉錄病毒獲取及轉移真核細胞序列。
術語「轉染」意謂細胞攝取外來或外源DNA，且當外源DNA已引入細胞膜內時，細胞經「轉染」。許多轉染技術已在此項技術中熟知且揭示於本文中。參見例如Graham等人，(1973)Virology 52：456；Sambrook等人，(2001)，見上文；Davis等人，(1986)Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier；Chu等人，(1981)Gene 13：197。該等技術可用於將一或多個外源DNA部分引入適合宿主細胞中。
術語「轉型」係指細胞遺傳特徵之變化，且當細胞已經修飾而含有新DNA或RNA時，細胞經轉型。舉例而言，當細胞藉由轉染、轉導或其他技術引入新遺傳物質而自其原生狀態經遺傳修飾時，細胞經轉型。在轉染或轉導之後，轉型DNA可藉由物理整合至細胞之染色體中而與細胞之DNA重組，或可以游離型元件形式短暫維持而不複製，或可以質體形式獨立複製。當轉型DNA隨細胞分裂一起複製時，細胞被視為已經「穩定轉型」。
術語「多肽」或「蛋白質」在本文中可互換使用以指胺基酸殘基之聚合物。該術語亦適用於其中一或多個胺基酸殘基為相應天然存在胺基酸之類似物或模擬物，以及天然存在之胺基酸聚合物。該等術語亦可涵蓋已經修飾(例如藉由添加碳水化合物殘基以形成醣蛋白，或磷酸化)之胺基酸聚合物。多肽及蛋白質可由天然存在及非重組型細胞製備，或多肽及蛋白質可由經遺傳工程改造或重組型細胞製備。 多肽及蛋白質可包含具有天然蛋白質之胺基酸序列的分子，或與原生序列相比具有一或多個胺基酸之缺失、添加及/或取代之分子。術語「多肽」及「蛋白質」涵蓋特異性或選擇性結合於PCSK9之抗原結合蛋白，或與特異性或選擇性結合於PCSK9之抗原結合蛋白相比具有一或多個胺基酸之缺失、添加及/或取代之序列。術語「多肽片段」係指與全長蛋白質相比具有胺基端缺失、羧基端缺失及/或內部缺失之多肽。該等片段與全長蛋白質相比亦可含有經修飾之胺基酸。在某些實施例中，片段長度為約5至500個胺基酸。舉例而言，片段長度可為至少5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400或450個胺基酸。有效多肽片段包括抗體之免疫功能性片段，包括結合域。在結合於PCSK9之抗原結合蛋白之情況下，有效片段包括(但不限於)CDR區域、重鏈或輕鏈之可變域、一部分抗體鏈或僅其包括兩個CDR之可變區及其類似物。
提及之術語「經分離蛋白質」意謂標的蛋白質(1)不含至少一些通常將與其一起存在之其他蛋白質，(2)基本上不含來自同一來源，例如來自同一物種之其他蛋白質，(3)由來自不同物種之細胞表現，(4)已與至少約50%之在自然界中與其締合之聚核苷酸、脂質、碳水化合物或其他物質分離，(5)可操作地與在自然界中不與其締合之多肽締合(藉由共價或非共價相互作用)，或(6)不存在於自然界中。通常，「經分離蛋白質」構成既定樣品之至少約5%、至少約10%、至少約25%或至少約50%。合成來源之基因組DNA、cDNA、mRNA或其他RNA或其任何組合可編碼該種經分離蛋白質。分離之蛋白質較佳實質上不含見於其天然環境中之蛋白質或多肽或其他污染物，此等物質將干擾其治療、診斷、預防、研究或其他用途。
多肽(例如抗原結合蛋白或抗體)之「變異體」包含以下胺基酸序列：其中相對於另一多肽序列，在該胺基酸序列中插入、缺失及/或 取代有一或多個胺基酸殘基。變異體包括融合蛋白。
多肽之「衍生物」為經一些與插入、缺失或取代變異體不同之方式化學修飾(例如經接合於另一化學部分)的多肽(例如抗原結合蛋白或抗體)。
如說明書通篇中與諸如多肽、核酸、宿主細胞及其類似物之生物物質結合使用之術語「天然存在」係指發現於自然界中之物質。
「抗原結合區」意謂特異性結合指定抗原(例如PCSK9)之蛋白質或一部分蛋白質。舉例而言，抗原結合蛋白之含有與抗原相互作用且賦予抗原結合蛋白對抗原之特異性及親和力之胺基酸殘基的部分稱為「抗原結合區」。抗原結合區通常包括一或多個「互補結合區」(「CDR」)。某些抗原結合區亦包括一或多個「構架」區。「CDR」為促成抗原結合特異性及親和力之胺基酸序列。「構架」區可有助於維持CDR之適當構形以促進抗原結合區與抗原之間的結合。
在某些態樣中，提供結合於PCSK9之重組型抗原結合蛋白。在此情形中，「重組蛋白」為使用重組技術(亦即經由表現如本文所述之重組核酸)製備之蛋白質。產生重組蛋白質之方法及技術在此項技術中為熟知的。
當在抗原結合蛋白(例如中和抗原結合蛋白、中和抗體、促效抗原結合蛋白、促效抗體及結合於PCSK9之結合蛋白質，其針對目標上之相同抗原決定基或結合位點進行競爭)之情形中使用時，術語「競爭」意謂抗原結合蛋白之間的競爭，如由分析法測定，其中所研究之抗原結合蛋白(例如抗體或其免疫功能性片段)防止參考分子(例如參考配體或參考抗原結合蛋白，諸如參考抗體)與共同抗原(例如PCSK9或其片段)之特異性結合。可使用多種競爭性結合分析法測定測試分子是否與參考分子競爭結合。可使用之分析法之實例包括固相直接或間接放射免疫分析法(RIA)、固相直接或間接酶免疫分析法(EIA)、夾心 競爭分析法(參見例如Stahli等人，(1983)Methods in Enzymology 9：242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(參見例如Kirkland等人，(1986)J.Immunol. 137：3614-3619)、固相直接標記分析法、固相直接標記夾心分析法(參見例如Harlow及Lane,(1988)見上文)；使用I-125標記之固相直接標記RIA(參見例如Morel等人，(1988)Molec.Immunol. 25：7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(參見例如Cheung，等人，(1990)Virology 176：546-552)；及直接標記RIA(Moldenhauer等人，(1990)Scand.J.Immunol. 32：77-82)。通常，該分析法涉及使用結合於固體表面之純化抗原或攜帶未經標記之測試抗原結合蛋白或經標記之參考抗原結合蛋白中之任一者的細胞。藉由測定在測試抗原結合蛋白存在下結合於固體表面或細胞之標記的量來量測競爭抑制。通常，存在過量之測試抗原結合蛋白。由競爭分析法識別之抗原結合蛋白(完全抗原結合蛋白)包括與參照抗原結合蛋白結合於同一抗原決定基的抗原結合蛋白及結合於與參照抗原結合蛋白所結合之抗原決定基足夠接近之相鄰抗原決定基而使得位阻存在的抗原結合蛋白。關於測定競爭結合之方法的其他細節提供於本文實例中。通常，當競爭抗原結合蛋白以過量存在時，其將抑制參考抗原結合蛋白與共同抗原之特異性結合達至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。在一些情況下，結合受抑制達至少80%、85%、90%、95%或97%或97%以上。
術語「抗原」係指能夠由選擇性結合劑(諸如抗原結合蛋白(包括例如抗體或其免疫功能性片段))結合且亦能夠在動物中用於產生能夠結合該抗原之抗體的分子。抗原可具有一或多個能夠與不同抗原結合蛋白(例如抗體)相互作用的抗原決定基。
術語「抗原決定基」意謂目標分子之胺基酸，其在抗原結合蛋白結合於目標分子時由抗原結合蛋白(例如抗體)接觸。該術語包括當 抗原結合蛋白(諸如抗體)結合於目標分子時所接觸之目標分子之胺基酸之完整列表之任何子集。抗原決定基可為相鄰或非相鄰(例如(i)在單鏈多肽中，在多肽序列中不彼此相鄰但在目標分子之情形中由抗原結合蛋白結合之胺基酸殘基，或(ii)在包含兩種或兩種以上個別組分之多聚受體中，在一或多種個別組分上呈現但仍由抗原結合蛋白結合之胺基酸殘基)。在某些實施例中，抗原決定基可為模擬劑，亦即其包含與用於產生抗原結合蛋白之抗原性抗原決定基類似的三維結構，且不包含或僅包含一些在該用於產生抗原結合蛋白之抗原決定基中發現的胺基酸殘基。最通常地，抗原決定基存在於蛋白質上，但在一些情況下可存在於其他種類之分子，諸如核酸上。抗原決定基決定子可包括分子之化學活性表面群組(諸如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基)，且可具有特定三維結構特徵及/或特定電荷特徵。通常，對特定目標分子具有特異性之抗原結合蛋白將優先識別蛋白質及/或巨分子之複雜混合物中之目標分子上的抗原決定基。
術語「一致性」係指兩個或兩個以上多肽分子或兩個或兩個以上核酸分子之序列之間的關係，如藉由對準及比較序列所測定。「一致性百分比」意謂所比較分子中胺基酸或核苷酸之間相同殘基之百分比，且基於所比較之最小分子之尺寸來計算。對於此等計算，必須利用特定數學模型或電腦程式(亦即「演算法」)來處理對準中之空隙(若存在)。可用於計算對準之核酸或多肽之一致性的方法包括以下文獻中描述之方法：Computational Molecular Biology,(Lesk,A.M.編)，(1988)New York：Oxford University Press；Biocomputing Informatics and Genome Projects,(Smith,D.W.編)，1993,New York：Academic Press；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,(Griffin,A.M.及Griffin,H.G.編)，1994,New Jersey：Humana Press；von Heinje,G.,(1987)Sequence Analysis in Molecular Biology,New York：Academic Press；Sequence Analysis Primer,(Gribskov,M.及Devereux,J.編)，1991,New York：M.Stockton Press；及Carillo等人，(1988)J.Applied Math. 48：1073。
在計算一致性百分比時，以在序列之間得到最大匹配之方式比對所比較之序列。用於測定一致性百分比之電腦程式為GCG程式包，其包括GAP(Devereux等人，(1984)Nucl.Acid Res. 12：387；Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,WI)。使用電腦演算法GAP來比對欲測定序列一致性百分比之兩個多肽或聚核苷酸。將序列對準以獲得其各別胺基酸或核苷酸之最佳匹配(「匹配跨度」，如演算法所確定)。結合演算法使用空隙開放罰分(gap opening penalty)(其計算為3×平均對角線，其中「平均對角線」為所用比較矩陣之對角線的平均值；「對角線」為特定比較矩陣分配給各完美胺基酸匹配之評分或數值)；及空隙擴展罰分(gap extension penalty)(通常為1/10×空隙開放罰分)以及比較矩陣(諸如PAM 250或BLOSUM 62)。在某些實施例中，演算法亦使用標準比較矩陣(對於PAM 250比較矩陣，參見Dayhoff等人，(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure 5：345-352；對於BLOSUM 62比較矩陣，參見Henikoff等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 89：10915-10919)。
使用GAP程式測定多肽或核苷酸序列之一致性百分比之推薦參數如下：演算法：Needleman等人，1970,J.Mol.Biol. 48：443-453；比較矩陣：BLOSUM 62，來自Henikoff等人，1992，見上文；空隙罰分：12(但無末端空隙罰分)
空隙長度罰分：4
相似性臨限值：0
用於對準兩個胺基酸序列之某些對準方案可使得兩個序列之僅 較短區域匹配，且此小對準區域可能具有極高序列一致性，即使兩個全長序列之間不存在顯著關係。因此，若需要產生涵蓋目標多肽之至少50個鄰接胺基酸的對準，則可調節所選對準方法(例如GAP程式)。
如本文所用，「實質上純」意謂所述分子物質種類為存在之主要物質種類，亦即以莫耳計，其含量大於同一混合物中之任何其他個別物質種類。在某些實施例中，實質上純之分子為目標物質占所存在之所有巨分子物質的至少50%(以莫耳計)之組合物。在其他實施例中，實質上純之組合物將占組合物中所存在之所有巨分子物質的至少80%、85%、90%、95%或99%。在其他實施例中，目標物質種類經純化以達成基本均質性，其中藉由習知偵測方法不可偵測出組合物中存在污染性物質種類且因此組合物由單一可偵測巨分子物質種類組成。
術語「治療」係指創傷、病理學或病狀之治療或改善中之任何成功標誌，包括任何客觀或主觀參數，諸如減輕；緩解；症狀減少或使創傷、病理學或病狀更可為患者忍受；降低退化或衰退之速率；使最終退化點之衰竭性較低；改善患者身體或精神安寧。症狀之治療或改善可基於客觀或主觀參數；包括身體檢查、神經精神病學測試及/或精神病學評估之結果。舉例而言，本文中呈現之某些方法可用於治療血脂異常(作為預防性或急性治療)、降低循環膽固醇含量及/或改善與原發性高脂質血症有關之症狀(家族性及非家族性異型接合)、混合血脂異常及同種接合子家族高膽固醇血症。
「有效量」通常為足以達成以下目的之量：降低症狀之嚴重性及/或頻率、消除症狀及/或潛在病因、預防症狀及/或其潛在病因發生及/或改良或緩解由糖尿病、肥胖症及血脂異常引起或與其相關之損害。在一些實施例中，有效量為治療有效量或預防有效量。「治療有效量」為足以按任何方式改善疾病病況(例如糖尿病、肥胖症或血脂異常)或症狀(尤其與疾病病況有關之病況或症狀)或以其他方式預防、 阻礙、延緩或逆轉疾病病況或任何其他與疾病有關之症狀之進程的量。「預防有效量」為在投與個體時將具有所欲預防性作用之量，例如預防或延緩糖尿病、肥胖症或血脂異常發作(或復發)，或降低糖尿病、肥胖症或血脂異常或相關症狀發作(或復發)之可能性。完全治療性或預防性作用未必由投與一次劑量發生，且可僅在投與一系列劑量後發生。因此，治療或預防有效量可以一或多次投藥投與。
「胺基酸」取其在此項技術中之正常含義。二十種天然存在胺基酸及其縮寫遵循習知用法。參見Immunology-A Synthesis，第2版，(E.S.Golub及D.R.Green編)，Sinauer Associates：Sunderland,Mass.(1991)，其以引用的方式併入本文中以用於目的。二十種習知胺基酸(非天然或非天然存在或經編碼之胺基酸，諸如α-,α-雙取代胺基酸、N-烷基胺基酸)及其他非習知胺基酸之立體異構體(例如D-胺基酸)亦可為多肽之適合組分且包括於片語「胺基酸」中。非天然及非天然編碼胺基酸(其可視需要經在本文中揭示之任何序列中發現之任何天然存在之胺基酸取代)之實例包括：4-羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸、ε-N,N,N-三甲基離胺酸、ε-N-乙醯基離胺酸、O-磷酸絲胺酸、N-乙醯基絲胺酸、N-甲醯基甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥基賴胺酸、σ-N-甲基精胺酸及其他類似胺基酸及亞胺基酸(例如4-羥基脯胺酸)。在本文中使用之多肽記號中，根據標準用法及慣例，左側方向為胺基端方向且右側方向為羧基端方向。可插入抗原結合蛋白序列中或取代抗原結合序列中之野生型殘基之非天然存在/編碼胺基酸之實例之非限制性列表包括β-胺基酸、高胺基酸、環狀胺基酸及具有衍生化側鏈之胺基酸。實例包括(以L-形式或D-形式；縮寫如括號中)：瓜胺酸(Cit)、高瓜胺酸(hCit)、Nα-甲基瓜胺酸(NMeCit)、Nα-甲基高瓜胺酸(Nα-MeHoCit)、鳥胺酸(Orn)、Nα-甲基鳥胺酸(Nα-MeOrn或NMeOrn)、肌胺酸(Sar)、高離胺酸(hLys或hK)、高精胺酸(hArg或hR)、高麩醯胺酸 (hQ)、Nα-甲基精胺酸(NMeR)、Nα-甲基白胺酸(Nα-MeL或NMeL)、N-甲基高離胺酸(NMeHoK)、Nα-甲基麩醯胺酸(NMeQ)、正白胺酸(Nle)、正纈胺酸(Nva)、1,2,3,4-四氫異喹啉(Tic)、八氫吲哚-2-甲酸(Oic)、3-(1-萘基)丙胺酸(1-Nal)、3-(2-萘基)丙胺酸(2-Nal)、1,2,3,4-四氫異喹啉(Tic)、2-二氫茚基甘胺酸(IgI)、對碘苯基丙胺酸(pI-Phe)、對胺基苯基丙胺酸(4AmP或4-胺基-Phe)、4-胍基苯丙胺酸(Guf)、甘胺醯基離胺酸(縮寫「K(Nε-甘胺醯基)」或「K(甘胺醯基)」或「K(gly)」)、硝基苯基丙胺酸(nitrophe)、胺基苯基丙胺酸(aminophe或胺基-Phe)、苯甲基苯基丙胺酸(benzylphe)、γ-羧基麩胺酸(γ-carboxyglu)、羥基脯胺酸(hydroxypro)、對羧基-苯丙胺酸(Cpa)、α-胺基己二酸(Aad)、Nα-甲基纈胺酸(NMeVal)、N-α-甲基白胺酸(NMeLeu)、Nα-甲基正白胺酸(NMeNle)、環戊基甘胺酸(Cpg)、環己基甘胺酸(Chg)、乙醯精胺酸(acetylarg)、α,β-二胺基丙酸(Dpr)、α,γ-二胺基丁酸(Dab)、二胺基丙酸(Dap)、環己基丙胺酸(Cha)、4-甲基-苯丙胺酸(MePhe)、β,β-二苯基-丙胺酸(BiPhA)、胺基丁酸(Abu)、4-苯基-苯丙胺酸(或聯苯丙胺酸；4Bip)、α-胺基-異丁酸(Aib)、β-丙胺酸、β-胺基丙酸、哌啶酸、胺基己酸、胺基庚酸、胺基庚二酸、鎖鏈素、二胺基庚二酸、N-乙基甘胺酸、N-乙基天門冬素、羥基賴胺酸、別-羥基賴胺酸、異鎖鏈素、別-異白胺酸、N-甲基甘胺酸、N-甲基異白胺酸、N-甲基纈胺酸、4-羥基脯胺酸(Hyp)、γ-羧基麩胺酸、ε-N,N,N-三甲基離胺酸、ε-N-乙醯基離胺酸、O-磷酸絲胺酸、N-乙醯基絲胺酸、N-甲醯基甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥基賴胺酸、ω-甲基精胺酸、4-胺基-O-鄰苯二甲酸(4APA)及其他類似胺基酸，及任一種該等特定列出之胺基酸之衍生化形式。
II.一般概述
本文中提供以延長之活體內半衰期結合於PCSK9之抗原結合蛋 白。在一些實施例中，本發明之具有延長之半衰期之抗原結合蛋白為pH值敏感性黏合劑。在一些實施例中，pH值敏感性黏合劑經工程改造以比初始抗體之pH值敏感性更高，例如藉由使一或多個殘基在重鏈或輕鏈或重鏈及輕鏈中之一或多個CDR中突變為組胺酸。在一些實施例中，本發明之具有延長之半衰期之抗原結合蛋白包含其恆定域中之突變。在一些實施例中，本發明之具有延長之半衰期之抗原結合蛋白為pH值敏感性黏合劑且包含其恆定域中之突變。
在本發明之一些實施例中，所提供之抗原結合蛋白可包含多肽，其中可嵌入及/或接合一或多個互補決定區(CDR)。在該等抗原結合蛋白中，可將CDR嵌入「構架」區域中，其定向CDR使得實現CDR之適合抗原結合性質。通常，該等所提供之抗原結合蛋白抑制PCSK9與LDLR之結合。因此，本文中提供之抗原結合蛋白在多種病狀中具有潛在治療效益，包括高膽固醇血症、原發性高脂質血症(家族性及非家族性異型接合)、混合血脂異常、同種接合子家族高膽固醇血症、心血管疾病及廣泛的任何需要活體內抑制PCSK9與LDLR之結合的疾病或病狀。
本文中所描述之某些抗原結合蛋白為抗體或來源於抗體。在某些實施例中，抗原抗原結合蛋白之多肽結構係基於抗體，包括(但不限於)單株抗體、雙特異性抗體、微型抗體、結構域抗體、合成抗體(本文中有時稱為「抗體模擬物」)、嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體、抗體融合物(本文中有時稱為「抗體結合物」)、半抗體及其片段。各種結構進一步描述於下文中。
已證明本文中提供之抗原結合蛋白可結合PCSK9(例如人類PCSK9)。本文中揭示之特異性結合PCSK9之抗原結合蛋白具有多種效用。舉例而言，一些抗原結合蛋白適用於特異性結合分析法、PCSK9(包括人類PCSK9)之親和力純化及用於鑑別PCSK9與LDLR之 結合之其他抑制劑的篩檢分析法。
如本文中說明，本文中揭示之特異性結合PCSK9之抗原結合蛋白可用於多種治療應用。舉例而言，某些抗原結合蛋白適用於治療患者中與膽固醇含量升高有關之病狀，諸如降低、緩解或治療血脂異常及心血管疾病。抗原結合蛋白之其他用途包括例如與PCSK9有關之疾病或病狀之診斷及用於測定是否存在PCSK9之篩檢分析法。本文中所描述之一些抗原結合蛋白可適用於治療與膽固醇含量升高有關之病狀、症狀及/或病理學。例示性病狀包括(但不限於)血脂異常及心血管疾病。
PCSK9
如本文中定義，本文中揭示之抗原結合蛋白抑制PCSK9與LDLR之結合。活體內，PCSK9之成熟形式為分子之活性形式。提供編碼全長人類PCSK9之核苷酸序列；編碼前結構域序列之核苷酸標有下劃線。
寄存編號NM_174936(SEQ ID NO：1)
提供編碼全長人類PCSK9之胺基酸序列；組成前結構域序列之胺基酸標有下劃線： 寄存編號NP_777596(SEQ ID NO：2)
提供編碼全長獼猴PCSK9之核苷酸序列；編碼前結構域序列之核苷酸標有下劃線。
(SEQ ID NO：3)
提供編碼全長獼猴PCSK9之胺基酸序列；組成前結構域序列之胺基酸標有下劃線： (SEQ ID NO：4)
如本文中所描述，PCSK9蛋白質亦可包括片段。術語PCSK9亦包括PCSK9胺基酸序列之轉譯後修飾，例如可能的N-連接糖基化作用位點。因此，抗原結合蛋白可結合於在一或多個位置經糖基化之蛋白質或自其產生。
特異性結合於PCSK9之抗原結合蛋白
提供多種適用於抑制PCSK9與LDLR結合之選擇性結合劑。此等試劑包括例如含有抗原結合域(例如具有抗原結合區域之單鏈抗體、結構域抗體、半抗體、免疫黏著劑及多肽)且特異性結合於PCSK9(尤其人類PCSK9)之抗原結合蛋白。
通常，所提供之抗原結合蛋白典型地包含如本文中所描述之一 或多個CDR(例如1、2、3、4、5或6個CDR)。在一些實施例中，抗原結合蛋白由純系天然表現，而在其他實施例中，抗原結合蛋白可包含(a)多肽構架結構及(b)一或多個插入多肽構架結構中及/或與其接合之CDR。在一些此等實施例中，CDR形成本文中所描述之由純系表現之重鏈或輕鏈之組分，在其他實施例中，可將CDR插入其中不天然表現CDR之構架中。多肽構架結構可具有多種不同形式。舉例而言，多肽構架結構可為或包含天然存在之抗體或其片段或變異體之構架，或其本質上可為完全合成。各種抗原結合蛋白結構之實例進一步描述於下文中。
在一些實施例中，其中抗原結合蛋白包含(a)多肽構架結構及(b)一或多個插入多肽構架結構中及/或與多肽構架結構接合之CDR，抗原結合蛋白之多肽構架結構為抗體或來源於抗體，分別包括(但不限於)單株抗體、雙特異性抗體、微型抗體、結構域抗體、合成抗體(本文中有時稱為「抗體模擬物」)、嵌合抗體、人類化抗體、抗體融合物(有時稱為「抗體結合物」)及以上各者之部分或片段。在一些情況下，抗原結合蛋白為抗體之免疫學片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2或scFv)。
本文中提供之某些抗原結合蛋白特異性結合於PCSK9，包括此蛋白質之人類形式。在一個實施例中，抗原結合蛋白特異性結合人類自身裂解、成熟、分泌型PCSK9(包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列中之胺基酸31至692)且抑制PCSK9與LDLR之結合。圖1為在一些實施例中，本發明之抗原結合蛋白如何結合於人類自身裂解、成熟、分泌型PCSK9之概念圖。
抗原結合蛋白結構
一些特異性結合PCSK9(包括本文中提供之人類形式)之抗原結合蛋白具有與天然存在之抗體典型相關之結構。此等抗體之結構單元通 常包含一或多個四聚體，各自由相同的兩對多肽鏈構成，但一些哺乳動物物種亦產生僅具有單一重鏈之抗體。在典型抗體中，各對包括一條全長「輕」鏈(在某些實施例中為約25kDa)及一條全長「重」鏈(在某些實施例中為約50-70kDa)。各個別免疫球蛋白鏈由若干個「免疫球蛋白域」構成，各域由約90至110個胺基酸組成且表現特徵性摺疊模式。該等域為構成抗體多肽之基本單元。各鏈之胺基端部分通常包括負責抗原識別之可變域。羧基端部分在演化上比鏈之另一端更保守且稱為「恆定區」或「C區」。人類輕鏈通常分類為kappa(「κ」)及lambda(「λ」)輕鏈，且此等輕鏈中之每一者均含有一個可變域及一個恆定域。重鏈通常分類為μ、δ、γ、α或ε鏈，且此等鏈分別將抗體之同型定義為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。IgG具有若干亞型，包括(但不限於)IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。IgM亞型包括IgM及IgM2。IgA亞型包括IgA1及IgA2。在人類中，IgA及IgD同型含有四條重鏈及四條輕鏈；IgG及IgE同型含有兩條重鏈及兩條輕鏈；且IgM同型含有五條重鏈及五條輕鏈。重鏈C區通常包含一或多個可負責效應功能之結構域。重鏈恆定區域之數目將視同型而定。舉例而言，IgG重鏈各含有三個C區域，稱為CH1、CH2及CH3。提供之抗體可具有任何此等同型及次型。在某些實施例中，抗原結合蛋白特異性結合於PCSK9。
在全長輕鏈及重鏈中，可變區及恆定區由具有約12個或更多個胺基酸之「J」區接合，其中重鏈亦包括具有約10個或更多個胺基酸之「D」區。參見例如Fundamental Immunology，第2版，第7章(Paul,W.編)1989,New York：Raven Press(其以全文引用的方式併入本文中以用於所有目的)。各輕鏈/重鏈對之可變區通常形成抗原結合位點。
特異性結合於PCSK9之例示性單株抗體之IgG2重鏈恆定域之一個實例具有胺基酸序列： (SEQ ID NO：5)。
結合於PCSK9之例示性單株抗體之κ輕鏈恆定域之一個實例具有胺基酸序列：RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：6)。
結合於PCSK9之例示性單株抗體之λ輕鏈恆定域之一個實例具有胺基酸序列：QPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(SEQ ID NO：7)。
免疫球蛋白鏈之可變區通常展示相同整體結構，其包含由3個更常稱為「互補決定區」或CDR之高變區接合之相對保守構架區(FR)。來自上述各重鏈/輕鏈對之兩個鏈之CDR通常由構架區對準以形成與目標蛋白質(例如PCSK9)上特異性抗原決定基特異性結合之結構。自N端至C端，天然存在之輕鏈與重鏈可變區兩者通常均與該等元件之下列順序相符：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。已設計出對佔據該等域每一者中之位置的胺基酸分配編號的編號系統。此編號系統定義於Kabat等人，(1991)「Sequences of Proteins of Immunological Interest」，第5版，US Dept.of Health and Human Services,PHS,NIH,NIH出版號91-3242中。儘管本文中使用卡拜特命名系統呈現，但亦可視需要根據替代性命名流程重新定義本文中揭示之CDR，諸如科西亞命名系統(參見Chothia及Lesk,(1987)J.Mol.Biol. 196：901-917；Chothia等人，(1989)Nature 342：878-883或Honegger及Pluckthun,(2001)J.Mol.Biol. 309：657-670)。
本文中提供之抗原結合蛋白之多種重鏈及輕鏈可變區描繪於圖2中。此等可變區中之每一者可分別連接至所揭示之重鏈及輕鏈恆定區以形成完全抗體重鏈及輕鏈。此外，由此產生之重鏈及輕鏈序列各自可經組合以形成完整抗體結構。應理解，本文提供之重鏈及輕鏈可變區亦可連接於序列不同於以上所列例示性序列的其他恆定域。
所提供之抗體之一些全長輕鏈及重鏈之特定實例及其相應胺基酸序列概述於表1A及1B中。表1A展示例示性輕鏈序列，且表1B展示例示性重鏈序列。
表1B中列出之例示性重鏈(SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94等)中之每一者(見下文)均可與圖1A中展示之例示性輕鏈中 之任一者(見下文)組合以形成抗體。
在本發明之另一態樣中，提供「半抗體」。半抗體為單價抗原結合蛋白，其包含(i)完整輕鏈，及(ii)視情況經由連接子與Fc區域(例如SEQ ID NO：5之IgG2 Fc區域)融合之重鏈。連接子可為連接子(SEQ ID NO：1771)，其中「x」為非零整數(分別例如(G4S)2、(G4S)3、(G4S)4、(G4S)5、(G4S)6、(G4S)7、(G4S)8、(G4S)9、(G4S)10；SEQ ID NO：1770-1778)。可使用所提供之重鏈及輕鏈組分構築半抗體。
其他所提供之抗原結合蛋白為由表1A及1B中展示之重鏈及輕鏈之組合形成之抗體之變異體(見下文)，且包含各與此等鏈之胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的輕鏈及/或重鏈。在一些情況下，該等抗體包括至少一個重鏈及一個輕鏈，而在其他情況下，該等變異形式含有兩個相同輕鏈及兩個相同重鏈。
抗原結合蛋白之可變域
亦提供抗原結合蛋白，其含有選自由如表2B中所示組成之群的抗體重鏈可變區及/或選自由如圖2A中所示組成之群的抗體輕鏈可變區，及此等輕鏈及重鏈可變區之免疫功能性片段、衍生物、突變蛋白質及變異體。
表2B中列出之重鏈可變區中之每一者均可與表2A中展示之輕鏈可變區中之任一者組合以形成抗原結合蛋白。
在一些情況下，抗原結合蛋白包括至少一個表2A及2B中列出之重鏈可變區及/或一個輕鏈可變區。在一些情況下，抗原結合蛋白包括至少兩個表2A及2B中列出之不同重鏈可變區及/或輕鏈可變區。
重鏈可變區之不同組合可與輕鏈可變區之不同組合中之任一者 組合。
在其他實施例中，抗原結合蛋白包含兩個相同輕鏈可變區及/或兩個相同重鏈可變區。舉例而言，抗原結合蛋白可為抗體或其免疫功能性片段，其包括表2A及2B中列出之輕鏈可變區對及重鏈可變區對之組合中的兩個輕鏈可變區及兩個重鏈可變區。
在一些情況下，上述配對中之抗原結合蛋白可包含與表2A及2B中描述之指定可變域具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。
其他抗原結合蛋白(例如抗體或免疫功能性片段)包括如上文描述之變異型重鏈及變異型輕鏈之變異形式。
抗原結合蛋白CDR
在多種實施例中，本文中揭示之抗原結合蛋白可包含多肽，其中可移植、插入及/或接合一或多個CDR。抗原結合蛋白可具有1、2、3、4、5或6個CDR。抗原結合蛋白因此可具有例如一個重鏈CDR1(「CDRH1」)，及/或一個重鏈CDR2(「CDRH2」)，及/或一個重鏈CDR3(「CDRH3」)，及/或一個輕鏈CDR1(「CDRL1」)，及/或一個輕鏈CDR2(「CDRL2」)，及/或一個輕鏈CDR3(「CDRL3」)。一些抗原結合蛋白包括CDRH3與CDRL3兩者。特異性重鏈及輕鏈CDR在下文中分別鑑別於表3A及3B中。
本文中使用由Kabat等人，(1991)「Sequences of Proteins of Immunological Interest」，第5版，US Dept.of Health and Human Services,PHS,NIH,NIH出版號91-3242描述之系統鑑別既定抗體之互補決定區(CDR)及構架區(FR)。本文中揭示之某些抗體包含一或多個胺基酸序列，其與表3A(CDRH)及表3B(CDRL)中呈現之CDR中之一或多者之胺基酸序列相同或具有顯著序列一致性，見下文。
天然存在之抗體中之CDR之結構及性質已經描述，同上。簡言之，在傳統抗體中，CDR嵌埋在重鏈及輕鏈可變區中之構架中，其中其構成負責抗原結合及識別之區域。可變區在構架區域(由Kabat等人，(1991)指定之構架區域1-4，FR1、FR2、FR3及FR4；亦參見Chothia及Lesk,(1987)同上)包含至少三個重鏈或輕鏈CDR，參見例如Kabat等人，(1991)「Sequences of Proteins of Immunological Interest」，第5版，US Dept.of Health and Human Services,PHS,NIH,NIH出版號91-3242；亦參見Chothia及Lesk,(1987)J.Mol.Biol. 196：901-917； Chothia等人，(1989)Nature 342：877-883。然而，本文中提供之CDR無法僅用於定義傳統抗體結構之抗原結合域，但可嵌入多種其他多肽結構中，如本文中所描述。
在另一態樣中，抗原結合蛋白包含表3A及3B中列出之CDR之1、2、3、4、5或6種變異形式(見下文)，其各與表3A及3B中列出之CDR序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性(見下文)。一些抗原結合蛋白包含1、2、3、4、5或6個表3A及3B中列出之CDR(見下文)，其各與此等表中列出之CDR相差不超過1、2、3、4或5個胺基酸。
例示性抗原結合蛋白
在一個態樣中，亦提供特異性結合於包含一或多個來自PCSK9(尤其裂解、成熟、人類PCSK9)之胺基酸殘基的直鏈或三維抗原決定基之抗原結合蛋白。
在另一實施例中，經分離之抗原結合蛋白之第一胺基酸序列包含表3A中展示之各純系之CDRH3、CDRH2及CDRH1配對，及/或經分離之抗原結合蛋白之第二胺基酸序列包含表3B中展示之各純系之CDRL3、CDRL2及CDRL1配對。
在另一實施例中，抗原結合蛋白包含至少一個、至少兩個或至少3個表1B中展示之重鏈序列之CDRH序列。
在另一實施例中，抗原結合蛋白包含至少一個、兩個或三個表1A中輕鏈序列之CDRL序列。
在另一實施例中，抗原結合蛋白包含至少一個、兩個或三個表3B中重鏈可變序列之CDRH序列及至少一個、兩個或三個表1A中展示之輕鏈序列之CDRL。
在另一實施例中，抗原結合蛋白包含表1B中展示之重鏈序列中之任一者之CDRH1、CDRH2及CDRH3序列。
在另一實施例中，抗原結合蛋白包含表1A中展示之輕鏈序列中之任一者之CDRL1、CDRL2及CDRL3序列。
在一個態樣中，本文中提供之特異性結合於PCSK9之經分離之抗原結合蛋白可為單株抗體、多株抗體、重組型抗體、人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體、多特異性抗體或其抗體片段。
在另一實施例中，本文中提供之經分離之抗原結合蛋白之抗體片段可為Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、雙功能抗體或單鏈抗體分子。
在另一實施例中，本文中提供之特異性結合於PCSK9之經分離之抗原結合蛋白為人類抗體且可具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4類型。
在另一實施例中，特異性結合於PCSK9之經分離之抗原結合蛋白包含如表1A-1B中闡述之輕鏈或重鏈多肽。在一些實施例中，特異性結合於PCSK9之抗原結合蛋白包含諸如表2A-2B中列出之可變輕鏈或可變重鏈結構域。在其他實施例中，特異性結合於PCSK9之抗原結合蛋白包含如表3A-3B、4A-4B中闡述之一個、兩個或三個CDRH或一個、兩個或三個CDRL，見下文。該等抗原結合蛋白且甚至本文中揭示之任一種抗原結合蛋白可經一或多個PEG分子聚乙二醇化，例如具有選自由5K、10K、20K、40K、50K、60K、80K、100K或大於100K組成之群之分子量的PEG分子。
在另一態樣中，本文中提供之特異性結合於PCSK9之任何抗原結合蛋白可與標記基團偶合且可與本文中提供之經分離之抗原結合蛋白中之一者之抗原結合蛋白競爭結合PCSK9。在一個實施例中，本文中提供之經分離之抗原結合蛋白在投與患者時可降低血脂及膽固醇含量或改良其他心血管風險因素，諸如降低血液總膽固醇、LDL-C、VLDL-C、脂蛋白元B、non-HDL-C、脂蛋白(a)及增加HDL-C。
如將瞭解，對於任何包含一個以上表3A-3B中提供之CDR的抗原 結合蛋白，獨立地選自所描繪序列之CDR之任何組合均可有效。因此，可產生具有一個、兩個、三個、四個、五個或六個獨立選擇之CDR的抗原結合蛋白。然而，如熟習此項技術者瞭解，特定實施例通常利用非重複CDR之組合，例如通常不使用兩個CDRH2區域產生抗原結合蛋白等。
一些本文中提供之特異性結合於PCSK9之抗原結合蛋白更詳細地論述於下文中。
抗原結合蛋白及結合抗原決定基及結合域
當抗原結合蛋白稱為結合PCSK9上之抗原決定基時，其意謂抗原結合蛋白特異性結合於PCSK9之指定部分。在一些實施例中，抗原結合蛋白可特異性結合於由指定殘基(例如PCSK9之指定區段)組成之多肽。
在任一個上述實施例中，該抗原結合蛋白無需接觸PCSK9之每一個殘基。PCSK9內之每一個單一胺基酸取代或缺失亦無需顯著影響結合親和力。
抗原結合蛋白之抗原決定基特異性及結合域可由多種方法測定。舉例而言，一些方法可使用抗原之截短部分。其他方法利用在一或多個特異性殘基處突變之抗原，諸如藉由使用丙胺酸掃描或精胺酸掃描型方法或藉由產生及研究其中多種結構域、區域或胺基酸在兩個蛋白質(例如抗原或目標蛋白質中之一或多者之小鼠及人類形式)之間調換的嵌合蛋白質，或藉由蛋白酶保護分析法。
其他實施例
在另一實施例中，提供經分離之抗原結合蛋白，諸如人類抗體，其以與參考抗體實質上相同的Kd結合於PCSK9；在人類HepG2細胞分析法(或培養物中之其他適合細胞株或原生細胞)中以與參考抗體相同的程度降低PCSK9活體外阻斷LDL攝取之能力；降低血糖；降低 血清膽固醇含量；及/或與該參考抗體競爭結合PCSK9，其中參考抗體係選自由以下組成之群：SS-13406(8A3HLE-51)、SS-13407(8A3HLE-112)、SS-14888(P2C6-HLE51)、13G9、19A12、20D12、25B5、30G7、SS-15057、SS-15058、SS-15059、SS-15065、SS-15079、SS-15080、SS-15087、SS-15101、SS-15103、SS-15104、SS-15105、SS-15106、SS-15108、SS-15112、SS-15113、SS-15114、SS-15117、SS-15121、SS-15123、SS-15124、SS-15126、SS-15132、SS-15133、SS-15136、SS-15139、SS-15140、SS-15141、SS-13983(A01)、SS-13991(A02)、SS-13993(C02)、SS-12685(P1B1)、SS-12686(P2F5)、SS-12687(P2C6)、SS-14892(P2F5/P2C6)、SS-15509、SS-15510、SS-15511、SS-15512、SS-15513、SS-15514、SS-15497、SS-15515、SS-15516、SS-15517、SS-15518、SS-15519、SS-15520、SS-15522、SS-15524、SS-14835、SS-15194、SS-15195、SS-15196、SS-14894、SS-15504、SS-15494、SS-14892、SS-15495、SS-15496、SS-15497、SS-15503、SS-15505、SS-15506、SS-15507、SS-15502、SS-15508、SS-1550、SS-15500、SS-15003、SS-15005、SS-15757(P1F4)、SS-15758(P1B6)、SS-15759(P2F4)、SS-15761(P2G5)、SS-15763(P2H7)及SS-15764(P2H8)。
與抗體競爭之能力可使用任何適合分析法測定，諸如本文中所描述之分析法，其中抗原結合蛋白SS-13406(8A3HLE-51)、SS-13407(8A3HLE-112)、SS-14888(P2C6-HLE51)、13G9、19A12、20D12、25B5、30G7、SS-15057、SS-15058、SS-15059、SS-15065、SS-15079、SS-15080、SS-15087、SS-15101、SS-15103、SS-15104、SS-15105、SS-15106、SS-15108、SS-15112、SS-15113、SS-15114、SS-15117、SS-15121、SS-15123、SS-15124、SS-15126、SS-15132、SS-15133、SS-15136、SS-15139、SS-15140、SS-15141、SS- 13983(A01)、SS-13991(A02)、SS-13993(C02)、SS-12685(P1B1)、SS-12686(P2F5)、SS-12687(P2C6)、SS-14892(P2F5/P2C6)、SS-15509、SS-15510、SS-15511、SS-15512、SS-15513、SS-15514、SS-15497、SS-15515、SS-15516、SS-15517、SS-15518、SS-15519、SS-15520、SS-15522、SS-15524、SS-14835、SS-15194、SS-15195、SS-15196、SS-14894、SS-15504、SS-15494、SS-14892、SS-15495、SS-15496、SS-15497、SS-15503、SS-15505、SS-15506、SS-15507、SS-15502、SS-15508、SS-1550、SS-15500、SS-15003、SS-15005、SS-15757(P1F4)、SS-15758(P1B6)、SS-15759(P2F4)、SS-15761(P2G5)、SS-15763(P2H7)或SS-15764(P2H8)可用作參考抗體。
單株抗體
所提供之抗原結合蛋白包括單株抗體，其結合於PCSK9且以各種程度抑制PCSK9與LDLR結合。可使用此項技術中已知的任何技術產生單株抗體，例如藉由在完成免疫程式後使自轉殖基因動物獲得之脾細胞永生化。可使用此項技術中已知的任何技術使脾細胞永生化，例如藉由使其與骨髓瘤細胞融合以產生融合瘤。用於產生融合瘤之融合程序之骨髓瘤細胞較佳不產生抗體，具有高融合效率且酶不足，使得其不能在僅支持所需融合細胞(融合瘤)生長之某些選擇性培養基中生長。小鼠融合中所用之適合細胞株之實例包括Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 4 1、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7及S194/5XXO Bul；大鼠融合中所用之細胞株之實例包括R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F及4B210。其他適用於細胞融合之細胞株為U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2及UC729-6。
在一些情況下，藉由以下步驟產生融合瘤細胞株：用免疫原使動物(例如具有人免疫球蛋白序列之轉殖基因動物)免疫，該免疫原包 含(1)自身裂解、成熟、分泌型PCSK9，其包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之胺基酸31至692(如實例1中所示)；自經免疫之動物收集脾細胞；使脾細胞與骨髓瘤細胞株融合，藉此產生融合瘤細胞；自融合瘤細胞產生融合瘤細胞株(如實例2中所示)，及鑑別產生抗體之融合瘤細胞株，該抗體結合於PCSK9且阻斷PCSK9與LDLR結合(例如實例3中所描述)。該等融合瘤細胞株及由其產生之單株抗體形成本發明之態樣。
由融合瘤細胞株分泌之單株抗體可使用此項技術中已知的任何技術純化。可進一步篩檢融合瘤或mAb以鑑別具有特定性質之mAb，諸如阻斷PCSK9與LDLR結合之能力。該等篩檢之實例提供於本文中。
嵌合及人類化抗體
可容易地產生基於上述序列之嵌合及人類化抗體。一個實例為嵌合抗體，其為由來自不同抗體之蛋白質區段構成之抗體，該等區段共價接合產生功能性免疫球蛋白輕鏈或重鏈或其免疫功能部分。通常，重鏈及/或輕鏈之一部分與來源於特定物種或屬於特定抗體類別或子類之抗體中的相應序列一致或同源，而該(等)鏈之其餘部分與來源於另一物種或屬於另一抗體類別或子類之抗體中的相應序列一致或同源。關於與嵌合抗體有關之方法，參見例如美國專利第4,816,567號；及Morrison等人，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855，其以引用的方式併入本文中。CDR移植描述於例如美國專利第6,180,370號、第5,693,762號、第5,693,761號、第5,585,089號及第5,530,101號中。
通常，製備嵌合抗體之目標為產生其中來自所欲患者/受體物種之胺基酸數目最大化之嵌合體。一個實例為「CDR移植」抗體，其中抗體包含一或多個來自特定物種或屬於特定抗體類別或子類之互補決 定區(CDR)，而抗體鏈之其餘部分與來源於另一物種或屬於另一抗體類別或子類之抗體中之相應序列一致或同源。用於人類時，通常將來自嚙齒動物抗體之可變區或所選CDR移植於人類抗體中，替換人類抗體之天然存在之可變區或CDR。
一種適用類型之嵌合抗體為「人類化」抗體。人類化抗體通常自最初在非人類動物中產生之單株抗體製造。該單株抗體中之某些胺基酸殘基(通常來自抗體之非抗原識別部分)通常經修飾成與相應同型之人類抗體中的相應殘基同源。可例如使用多種方法藉由用人類抗體之相應區域取代嚙齒動物可變區之至少一部分來進行人類化(參見例如美國專利第5,585,089號及第5,693,762號；Jones等人，(1986)Nature 321：522-525；Riechmann等人，(1988)Nature 332：323-27；Verhoeyen等人，(1988)Science 239：1534-1536)。
在一個態樣中，可將本文中提供之抗體之輕鏈及重鏈可變區之CDR(例如表3-4及21-23中)移植至來自相同或不同譜系物種之抗體之構架區域(FR)。舉例而言，可將以下重鏈及輕鏈可變區之CDR移植至共同人類FR：VH1、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6、VH7、VH8、VH9、VH10、VH11、VH12、VH13、VH14、VH15、VH16、VH17、VH18、VH19、VH20、VH21VH22、VH23、VH24、VH25、VH26、VH27、VH28、VH29、VH30、VH31、VH32、VH33、VH34、VH35、VH36、VH37、VH38、VH39、VH40、VH41、VH42、VH43、VH44、VH45、VH46、VH47、VH48、VH49、VH50、VH51、VH52、VH53、VH54、VH55、VH56、VH57、VH58、VH59、VH60、VH61、VH62、VH63、VH64、VH65、VH66、VH67、VH68、VH69、VH70、VH71、VH72、VH73、VH74、VH75、VH76、VH77、VH78、VH79、VH80、81、VH82、VH83、VH84、VH85、VH86、VH87、VH88、VH89、VH90、VH91、VH92、VH93以及VH94及/或VL1、VL2、VL3、VL4、 VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11、VL12、VL13、VL14、VL15、VL16、VL17、VL18、VL19、VL20、VL21、VL22、VL23、VL24、VL25、VL26、VL27、VL28、VL29、VL30、VL31、VL32、VL33、VL34、VL35、VL36、VL37、VL38、VL39、VL40、VL41、VL42、VL43、VL44、VL45、VL46、VL47、VL48、VL49、VL50、VL51、VL52、VL53、VL54、VL55、VL56、VL57、VL58、VL59、VL60、VL61、VL62、VL63、VL64、VL65、VL66、VL67、VL68、VL69、VL70、VL71、VL72、VL73、VL74、VL75、VL76、VL77、VL78、VL79、VL80、VL81、VL82、VL83、VL84、VL85、VL86、VL87、VL88、VL89、VL90、VL91、VL92、VL93、VL94、VL95、VL96、VL97、VL98、VL99及VL100。為產生共同人類FR，可將來自若干人類重鏈或輕鏈胺基酸序列之FR對準以鑑別共同胺基酸序列。在其他實施例中，用來自不同重鏈或輕鏈之FR置換本文中揭示之重鏈或輕鏈之FR。在一個態樣中，不置換特異性結合於PCSK9之抗原結合蛋白(例如抗體)之重鏈及輕鏈之FR中的稀有胺基酸，而置換其餘的其餘FR胺基酸。「稀有胺基酸」為位於某一位置中之特定胺基酸，在FR之該位置中通常未發現此特定胺基酸。或者，一個重鏈或輕鏈之移植可變區可與不同於如本文揭示之特定重鏈或輕鏈之恆定區的恆定區一起使用。在其他實施例中，移植可變區為單鏈Fv抗體之一部分。
在某些實施例中，來自除人類外之物種的恆定區可與人類可變區一起用於產生雜合抗體。
完全人類抗體
本發明提供完全人類抗體。可獲得製備對於既定抗原具有特異性而無需使人類接觸抗原之完全人類抗體(「完全人類抗體」)的方法。提供用於實施完全人類抗體製造之一種特定方法為小鼠體液免疫 系統之「人類化」。將人類免疫球蛋白(Ig)基因座引入內源性Ig基因已去活之小鼠體內為一種在小鼠(一種可用任何所需抗原進行免疫之動物)體內產生完全人類單株抗體(mAb)之方法。使用完全人類抗體可使有時可因向人類投與小鼠或小鼠衍生之mAb作為治療劑所引起之免疫原性及過敏性反應減至最少。
可藉由使能夠在不產生內源免疫球蛋白情況下產生人類抗體之譜系的轉殖基因動物(典型地為小鼠)免疫來製備完全人類抗體。為此目的，抗原通常具有6個或6個以上相鄰胺基酸，且視情況結合於載體(諸如半抗原)。參見例如Jakobovits等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551-2555；Jakobovits等人，(1993)Nature 362：255-258；及Bruggermann等人，(1993)Year in Immunol. 7：33。在該方法之一個實例中，如下產生轉殖基因動物：使其中編碼小鼠免疫球蛋白重鏈及輕鏈之內源性小鼠免疫球蛋白基因座失能，及向小鼠基因組中插入含有編碼人類重鏈及輕鏈蛋白質之基因座之人類基因組DNA的大片段。接著對具有少於一整套人類免疫球蛋白基因座之經部分修飾之動物進行雜交育種以獲得具有所有所需免疫系統修飾之動物。當投與免疫原時，該等轉殖基因動物產生對免疫原具有免疫特異性、但具有人類而非鼠類胺基酸序列(包括可變區)之抗體。關於該等方法之其他細節，參見例如WO96/33735及WO94/02602。有關用於製備人類抗體之轉殖基因小鼠之其他方法描述於美國專利第5,545,807號；第6,713,610號；第6,673,986號；第6,162,963號；第5,545,807號；第6,300,129號；第6,255,458號；第5,877,397號；第5,874,299號及第5,545,806號；PCT公開案WO91/10741、WO90/04036，以及EP 546073及EP 546073中。
根據某些實施例，本發明之抗體可經由利用轉殖基因小鼠製備，該轉殖基因小鼠具有所插入之產生人類抗體之基因組的基本部 分，但不足以產生內源、鼠類抗體。接著，該等小鼠能夠產生人類免疫球蛋白分子及抗體，且不足以產生鼠免疫球蛋白分子及抗體。用於達成此結果之技術揭示於本文說明書中揭示之專利、申請案及參考文獻中。在某些實施例中，可使用諸如PCT公開申請案第WO 98/24893號或Mendez等人，(1997)Nature Genetics,15：146-156中揭示之方法，其以引用的方式併入本文中以用於任何目的。
通常，對PCSK9具有特異性之完全人類單株抗體可產生如下。用相關抗原(例如本文中所描述之抗原)使含有人免疫球蛋白基因之轉殖基因小鼠免疫，獲得來自表現抗體之小鼠之淋巴細胞(諸如B細胞)。此等回收細胞與骨髓型細胞株融合以製備永生融合瘤細胞株，且篩選並選擇此等融合瘤細胞株以鑑別產生對相關抗原具有特異性之抗體之融合瘤細胞株。在某些實施例中，提供產生對PCSK9具有特異性之抗體之融合瘤細胞株的產生。
在某些實施例中，完全人類抗體可藉由使人類脾細胞(B或T細胞)活體外暴露於抗原，且接著在免疫功能降低之小鼠(例如SCID或nod/SCID)中復原所暴露之細胞來產生。參見例如Brams等人，J.Immunol.160：2051-2058(1998)；Carballido等人，Nat.Med.,6：103-106(2000)。在某些該等方法中，將人類胎兒組織移植入SCID小鼠(SCID-hu)中會引起長期血細胞生成及人類T細胞發育。參見例如McCune等人，Science,241：1532-1639(1988)；Ifversen等人，Sem.Immunol.,8：243-248(1996)。在某些情況下，此等嵌合小鼠中之體液免疫反應依賴於動物中人類T細胞之共發育。參見例如Martensson等人，Immunol.,83：1271-179(1994)。在某些方法中，將人類周邊血液淋巴細胞移植入SCID小鼠中。參見例如Mosier等人，Nature,335：256-259(1988)。在某些該等實施例中，當該等移植細胞用激活劑(priming agent)(諸如葡萄球菌腸毒素A(Staphylococcal Enterotoxin A，SEA))或 抗人類CD40單株抗體處理時，偵測到較高B細胞產量。參見例如Martensson等人，Immunol.,84：224-230(1995)；Murphy等人，Blood,86：1946-1953(1995)。
因此，在某些實施例中，完全人類抗體可藉由在宿主細胞中表現重組DNA或藉由在融合瘤細胞中表現來產生。在其他實施例中，可使用本文所述之噬菌體呈現技術產生抗體。
經由利用如本文所述之XENOMOUSE®技術製備本文所述之抗體。接著，該等小鼠能夠產生人類免疫球蛋白分子及抗體，且不足以產生鼠免疫球蛋白分子及抗體。用於實現上述目的的技術揭示於本文中之發明背景部分中所揭示的專利、申請案及參考文獻中。然而，詳言之，小鼠之轉殖基因產生及得自其之抗體之較佳實施例揭示於1996年12月3日申請之美國專利申請案第08/759,620號及1998年6月11日公開之國際專利申請案第WO 98/24893號及2000年12月21日公開之WO 00/76310中，其揭示內容以引用的方式併入本文中。亦參見Mendez等人，Nature Genetics,15：146-156(1997)，其揭示內容以引用的方式併入本文中。
經由使用該技術可製備針對各種抗原的完全人類單株抗體。本質上，用相關抗原(例如本文中提供之抗原)使小鼠之XENOMOUSE®菌株免疫，自超免疫小鼠回收淋巴細胞(諸如B細胞)，及使回收之淋巴細胞與骨髓型細胞株融合以製備永生化融合瘤細胞株。篩檢並選擇此等雜交瘤細胞株以鑑別可產生特異於所感興趣之抗原之抗體的雜交瘤細胞株。本文中提供製備多個可產生對PCSK9具有特異性之抗體之雜交瘤細胞株的方法。此外，本文中提供了對該等細胞株所產生之抗體的特徵鑑定法，包括該等抗體之重鏈及輕鏈之核苷酸及胺基酸序列分析。
小鼠之XENOMOUSE®品系的產生進一步論述及描繪於以下文獻 中：1990年1月12日申請之美國專利申請案第07/466,008號、1990年11月8日申請之第07/610,515號、1992年7月24日申請之第07/919,297號、1992年7月30日申請之第07/922,649號、1993年3月15日申請之第08/031,801號、1993年8月27日申請之第08/112,848號、1994年4月28日申請之第08/234,145號、1995年1月20日申請之第08/376,279號、1995年4月27日申請之第08/430,938號、1995年6月5日申請之第08/464,584號、1995年6月5日申請之第08/464,582號、1995年6月5日申請之第08/463,191號、1995年6月5日申請之第08/462,837號、1995年6月5日申請之第08/486,853號、1995年6月5日申請之第08/486,857號、1995年6月5日申請之第08/486,859號、1995年6月5日申請之第08/462,513號、1996年10月2日申請之第08/724,752號、1996年12月3日申請之第08/759,620號、2001年11月30日申請之美國公開案2003/0093820及美國專利第6,162,963號、第6,150,584號、第6,114,598號、第6,075,181號及第5,939,598號以及日本專利第3 068 180 B2號、第3 068 506 B2號及第3 068 507 B2號。亦參見1996年6月12日授予公開之歐洲專利第EP 0 463 151 B1號、1994年2月3日公開之國際專利申請案第WO 94/02602號、1996年10月31日公開之國際專利申請案第WO 96/34096號、1998年6月11日公開之WO 98/24893、2000年12月21日公開之WO 00/76310。以上所引用之專利、申請案及參考文獻中之每一者之揭示內容均以全文引用的方式併入本文中。
使用融合瘤技術，可自轉殖基因小鼠(諸如本文中所描述之轉殖基因小鼠)產生及選擇具有所需特異性之抗原特異性人類mAb。該等抗體可使用適合載體及宿主細胞選殖及表現，或抗體可自培養之融合瘤細胞收集。
完全人類抗體亦可來源於噬菌體呈現文庫(如Hoogenboom等人，(1991)J.Mol.Biol. 227：381；及Marks等人，(1991)J.Mol.Biol. 222：581中所描述)。噬菌體呈現技術經由在絲狀噬菌體之表面上呈現抗體譜系並隨後藉由其結合於所選抗原對噬菌體進行選擇來模擬免疫選擇。一種該類技術描述於PCT公開案第WO 99/10494號(其以引用的方式併入本文中)中，其描述使用該方法分離MPL受體及msk受體之高親和力及功能性激動性抗體。
雙特異性或雙功能性抗原結合蛋白
亦提供雙特異性及雙功能性抗體，其包括如上文所描述之一或多個CDR或一或多個可變區。在一些情況下，雙特異性或雙功能性抗體可為具有兩個不同重鏈/輕鏈對及兩個不同結合位點之人造雜合抗體。雙特異性抗體可藉由多種方法產生，包括(但不限於)融合融合瘤或連接Fab'片段。參見例如Songsivilai及Lachmann,(1990)Clin.Exp.Immunol. 79：315-321；Kostelny等人，(1992)J.Immunol. 148：1547-1553。如實例3中所描述，當本發明之抗原結合蛋白結合於PCSK9時，該結合可引起抑制PCSK9與LDLR結合。
各種其他形式
本發明中所提供之一些特異性結合於PCSK9之抗原結合蛋白包括本文中揭示之抗原結合蛋白之變異形式(例如具有表1-4中列出之序列的形式)。
在多種實施例中，本文中揭示之抗原結合蛋白可包含一或多種非天然存在/編碼之胺基酸。舉例而言，一些抗原結合蛋白在一或多個表3中列出之重鏈或輕鏈、可變區或CDR中具有一或多種非天然存在/編碼之胺基酸取代。非天然存在/編碼之胺基酸(其可視需要經本文中揭示之任何序列中發現之任何天然存在之胺基酸取代)之實例包括：4-羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸、ε-N,N,N-三甲基離胺酸、ε-N-乙醯基離胺酸、O-磷酸絲胺酸、N-乙醯基絲胺酸、N-甲醯基甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥基賴胺酸、σ-N-甲基精胺酸以及其他類似胺 基酸及亞胺基酸(例如4-羥基脯胺酸)。在本文中使用之多肽記號中，根據標準用法及慣例，左側方向為胺基端方向且右側方向為羧基端方向。可插入抗原結合蛋白序列中或經抗原結合序列中之野生型殘基取代之非天然存在/編碼之胺基酸之實例之非限制性列表包括β-胺基酸、高胺基酸、環狀胺基酸及具有衍生化側鏈之胺基酸。實例包括(呈L-形式或D-形式；縮寫如括號中)：瓜胺酸(Cit)、高瓜胺酸(hCit)、Nα-甲基瓜胺酸(NMeCit)、Nα-甲基高瓜胺酸(Nα-MeHoCit)、鳥胺酸(Orn)、Nα-甲基鳥胺酸(Nα-MeOrn或NMeOrn)、肌胺酸(Sar)、高離胺酸(hLys或hK)、高精胺酸(hArg或hR)、高麩醯胺酸(hQ)、Nα-甲基精胺酸(NMeR)、Nα-甲基白胺酸(Nα-MeL或NMeL)、N-甲基高離胺酸(NMeHoK)、Nα-甲基麩醯胺酸(NMeQ)、正白胺酸(Nle)、正纈胺酸(Nva)、1,2,3,4-四氫異喹啉(Tic)、八氫吲哚-2-甲酸(Oic)、3-(1-萘基)丙胺酸(1-Nal)、3-(2-萘基)丙胺酸(2-Nal)、1,2,3,4-四氫異喹啉(Tic)、2-二氫茚基甘胺酸(IgI)、對碘苯基丙胺酸(pI-Phe)、對胺基苯基丙胺酸(4AmP或4-胺基-Phe)、4-胍基苯丙胺酸(Guf)、甘胺醯基離胺酸(縮寫「K(Nε-甘胺醯基)」或「K(甘胺醯基)」或「K(gly)」)、硝基苯基丙胺酸(nitrophe)、胺基苯基丙胺酸(aminophe或胺基-Phe)、苯甲基苯基丙胺酸(benzylphe)、γ-羧基麩胺酸(γ-carboxyglu)、羥基脯胺酸(hydroxypro)、對羧基-苯丙胺酸(Cpa)、α-胺基己二酸(Aad)、Nα-甲基纈胺酸(NMeVal)、N-α-甲基白胺酸(NMeLeu)、Nα-甲基正白胺酸(NMeNle)、環戊基甘胺酸(Cpg)、環己基甘胺酸(Chg)、乙醯精胺酸(acetylarg)、α,β-二胺基丙酸(Dpr)、α,γ-二胺基丁酸(Dab)、二胺基丙酸(Dap)、環己基丙胺酸(Cha)、4-甲基-苯丙胺酸(MePhe)、β,β-二苯基-丙胺酸(BiPhA)、胺基丁酸(Abu)、4-苯基-苯丙胺酸(或聯苯丙胺酸；4Bip)、α-胺基-異丁酸(Aib)、β-丙胺酸、β-胺基丙酸、哌啶酸、胺基己酸、胺基庚酸、胺基庚二酸、鎖鏈素、二胺基庚二酸、N-乙基 甘胺酸、N-乙基天門冬素、羥基賴胺酸、別-羥基賴胺酸、異鎖鏈素、別-異白胺酸、N-甲基甘胺酸、N-甲基異白胺酸、N-甲基纈胺酸、4-羥基脯胺酸(Hyp)、γ-羧基麩胺酸、ε-N,N,N-三甲基離胺酸、ε-N-乙醯基離胺酸、O-磷酸絲胺酸、N-乙醯基絲胺酸、N-甲醯基甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥基賴胺酸、ω-甲基精胺酸、4-胺基-O-鄰苯二甲酸(4APA)及其他類似胺基酸，及任一種該等特定列出之胺基酸之衍生化形式。
此外，抗原結合蛋白可在一或多個表1-4中列出之重鏈或輕鏈、可變區或CDR中具有一或多個保守性胺基酸取代。天然存在胺基酸可基於常見側鏈性質分類：1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；3)酸性：Asp、Glu；4)鹼性：His、Lys、Arg；5)影響鏈取向的殘基：Gly、Pro；及6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
保守性胺基酸取代可涉及該等類別中之一者之成員與同一類別中之另一成員之交換。保守性胺基酸取代可涵蓋非天然存在/編碼之胺基酸殘基，其通常藉由化學肽合成而非生物系統中之合成併入。表8，同上。其包括肽模擬物及胺基酸部分之其他逆轉或反轉形式。
非保守性取代可涉及將一個上述種類中之一者之成員換成另一種類中之一成員。可將該等經取代之殘基引入與人類抗體同源之抗體區域或分子之非同源區域中。
在產生該等變化時，根據某些實施例，可考慮胺基酸之親水性指數。蛋白質之親水概況係藉由賦予各胺基酸以數值(「親水指數」)且接著沿肽鏈重複計算此等值之平均值來計算。已基於疏水性及電荷 特徵賦予各胺基酸以親水指數。其為：異白胺酸(+4.5)；纈胺酸(+4.2)；白胺酸(+3.8)；苯丙胺酸(+2.8)；半胱胺酸/胱胺酸(+2.5)；甲硫胺酸(+1.9)；丙胺酸(+1.8)；甘胺酸(-0.4)；蘇胺酸(-0.7)；絲胺酸(-0.8)；色胺酸(-0.9)；酪胺酸(-1.3)；脯胺酸(-1.6)；組胺酸(-3.2)；麩胺酸(-3.5)；麩醯胺酸(-3.5)；天冬胺酸(-3.5)；天冬醯胺(-3.5)；離胺酸(-3.9)；及精胺酸(-4.5)。
此項技術中瞭解親水概況對賦予蛋白質相互作用生物功能之重要性(參見例如Kyte等人，1982,J.Mol.Biol. 157：105-131)。已知某些胺基酸可經取代成具有類似親水指數或分值之其他胺基酸且仍然保留類似生物活性。在基於親水指數進行改變時，在某些實施例中，包括親水指數在±2以內之胺基酸的取代。在一些態樣中，包括在±1內之胺基酸，且在其他態樣中，包括在±0.5內之彼等胺基酸。
此項技術中亦應理解，類似胺基酸之取代可基於親水性有效地進行，尤其當由此產生之生物學功能性蛋白質或肽意欲用於免疫學實施例中時，如在本發明之情況下。在某些實施例中，蛋白質之最大局部平均親水性(取決於其相鄰胺基酸之親水性)與其免疫原性及抗原結合或免疫原性(亦即該蛋白質之生物性質)有關。
已賦予此等胺基酸殘基以下親水性值：精胺酸(+3.0)；離胺酸(+3.0)；天冬胺酸(+3.0±1)；麩胺酸(+3.0±1)；絲胺酸(+0.3)；天冬醯胺(+0.2)；麩醯胺酸(+0.2)；甘胺酸(0)；蘇胺酸(-0.4)；脯胺酸(-0.5±1)；丙胺酸(-0.5)；組胺酸(-0.5)；半胱胺酸(-1.0)；甲硫胺酸(-1.3)；纈胺酸(-1.5)；白胺酸(-1.8)；異白胺酸(-1.8)；酪胺酸(-2.3)；苯丙胺酸(-2.5)及色胺酸(-3.4)。在基於類似親水性值作出變化時，在某些實施例中，包括親水性值在±2內之胺基酸的取代，在其他實施例中，包括在±1內之胺基酸，且在其他實施例中，包括在±0.5內之胺基酸。在一些情況下，亦可基於親水性鑑別來自一級胺基酸序列之抗原 決定基。此等區域亦稱為「抗原決定基核心區」。
例示性保守性胺基酸取代闡述於表8中。
熟習此項技術者將能夠結合本文中提供之資訊，使用熟知技術測定如本文中闡述之多肽之適合變異體。熟習此項技術者可鑑別可由咸信對活性不重要之目標區域在不損害活性情況下改變之適合分子區域。熟習此項技術者亦將能夠鑑別分子中在類似多肽中具有保守性之殘基及部分。在其他實施例中，甚至可對生物活性或結構重要之區域亦可經保守性胺基酸取代而不破壞生物活性或不會不利影響多肽結 構。
此外，熟習此項技術者可回顧鑑別類似多肽中對於活性或結構重要之殘基的結構-功能研究。鑒於該種比較，可預測蛋白質中對應於類似蛋白質中對於活性或結構重要之胺基酸殘基之胺基酸殘基的重要性。熟習此項技術者可選擇化學上類似之胺基酸取代此等預測為重要之胺基酸殘基。
熟習此項技術者亦可分析類似多肽中之三維結構及與該三維結構相關之胺基酸序列。鑒於此資訊，熟習此項技術者可預測抗體之胺基酸殘基相對於該抗體之三維結構之對準。熟習此項技術者可選擇對預計位於蛋白質表面上之胺基酸殘基不造成根本變化，因為該等殘基可能涉及與其他分子之重要的相互作用。此外，熟習此項技術者可產生在各所要胺基酸殘基處含有單一胺基酸取代之測試變異體。接著可使用分析法針對抑制PCSK9與LDLR結合來篩檢此等變異體(包括本文中提供之實例中描述之變異體)，因此產生關於哪些胺基酸可變化且哪些胺基酸不可變化之資訊。換言之，基於自該等常規實驗收集之資訊，熟習此項技術者可輕易確定應避免單獨或與其他突變組合之其他取代的胺基酸位置。
許多科學出版物已致力於預測二級結構。參見Moult,(1996)Curr.Op.in Biotech. 7：422-427；Chou等人，(1974)Biochem. 13：222-245；Chou等人，(1974)Biochemistry 113：211-222；Chou等人，(1978)Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol. 47：45-148；Chou等人，(1979)Ann.Rev.Biochem. 47：251-276；及Chou等人，(1979)Biophys.J. 26：367-384。此外，現可使用電腦程式幫助預測二級結構。一種預測二級結構之方法係基於同源模型化。舉例而言，序列一致性大於30%或相似性大於40%之兩個多肽或蛋白質可具有類似結構拓撲。蛋白質結構資料庫(PDB)之發展使二級結構(包括多肽或蛋白質結構內之可能 摺疊數)之可預測性增強。參見Holm等人，(1999)Nucl.Acid.Res. 27：244-247。已提出(Brenner等人，1997,Curr.Op.Struct.Biol.7：369-376)在既定多肽或蛋白質中存在有限數目之摺疊且一旦已解析臨界數目之結構，結構預測即變得顯著更加精確。
其他預測二級結構之方法包括「穿刺法(threading)」(Jones,(1997)Curr.Opin.Struct.Biol. 7：377-387；Sippl等人，(1996)Structure 4：15-19)，「概況分析」(Bowie等人，(1991)Science 253：164-170；Gribskov等人，(1990)Meth.Enzym. 183：146-159；Gribskov等人，(1987)Proc.Nat.Acad.Sci. 84：4355-4358)，「演化鍵聯」(參見Holm,(1999)同上；及Brenner,(1997)同上)。
在一些實施例中，進行胺基酸取代使得：(1)降低對蛋白質水解之敏感性，(2)降低對氧化之敏感性，(3)改變用於形成蛋白質複合物之結合親和力，(4)改變配體或抗原結合親和力，及/或(5)賦予該等多肽其他物理化學或功能性質或對其進行修飾。舉例而言，可在天然存在之序列中進行單一或多個胺基酸取代(在一些實施例中，保守性胺基酸取代)。可在抗體中位於形成分子間接觸之結構域以外的部分中進行取代。在該等實施例中，可使用不會實質上改變親本序列之結構特徵的保守性胺基酸取代(例如不會破壞為親本或原生抗原結合蛋白之特徵的二級結構之一或多個置換胺基酸)。技術上認可之多肽二級及三級結構之實例描述於Creighton,Proteins：Structures and Molecular Properties第2版，1992,W.H.Freeman及Company；Creighton,Proteins：Structures and Molecular Principles,1984,W.H.Freeman及Company；Introduction to Protein Structure(Branden及Tooze編)，第2版，1999,Garland Publishing；Petsko及Ringe,Protein Structure and Function,2004,New Science Press Ltd；及Thornton等人，(1991)Nature 354：105中，其各以引用的方式併入本文中。
其他較佳抗體變異體包括半胱胺酸變異體，其中親本或原生胺基酸序列中之一或多個半胱胺酸殘基缺失或經另一胺基酸(例如絲胺酸)取代。尤其當抗體必須再摺疊為生物學活性構形時，半胱胺酸變異體為適用的。與原生抗體相比，半胱胺酸變異體可具有較少半胱胺酸殘基且通常為偶數個以最小化由非配對半胱胺酸引起之相互作用。
所揭示之重鏈及輕鏈、可變區域及CDR可用於製備含有特異性結合於PCSK9及抑制PCSK9與LDLR結合之抗原結合區的多肽。舉例而言，表3中所列之一或多個CDR可共價或非共價併入分子(例如多肽)中以產生免疫黏附。免疫黏著劑可合併有CDR作為較大多肽鏈之一部分、可將CDR共價連接至另一多肽鏈或可以非共價方式合併有CDR。CDR使免疫黏著劑能夠特異性結合於相關特定抗原(例如結合於PCSK9，包括其上抗原決定基)。
所揭示之重鏈及輕鏈、可變區域及CDR可用於製備含有特異性結合於PCSK9及抑制PCSK9與LDLR結合之抗原結合區的多肽。舉例而言，表3中列出之CDR中之一或多者可併入在結構上與「半」抗體類似的分子(例如多肽)中，該半抗體包含與Fc片段配對之抗原結合蛋白之重鏈、輕鏈，使得抗原結合區為單價(例如Fab片段)，但具有二聚Fc部分。
亦提供基於本文中所描述之可變區域及CDR之模擬物(例如「肽模擬物(peptide mimetics/peptidomimetics)」)。此等類似物可為肽、非肽或肽與非肽區之組合。Fauchere,(1986)Adv.Drug Res. 15：29；Veber及Freidinger,(1985)TINS第392頁；及Evans等人，(1987)J.Med.Chem. 30：1229，其以引用的方式併入本文中以用於任何目的。在結構上類似於治療上適用之肽之肽模擬物可用於產生類似治療或防治效應。該等化合物通常藉助於電腦化分子模型來研發。通常，肽模擬物為結構上與顯示所需生物活性(諸如特異性結合於PCSK9之能力) 之抗體類似的蛋白質，但肽模擬物具有一或多個視情況藉由此項技術中熟知的方法由選自以下之鍵置換的肽鍵：-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH-CH-(順式及反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-及-CH2SO-。某些實施例中可使用相同類型D-胺基酸進行共同序列之一或多個胺基酸之系統取代(例如D-離胺酸代替L-離胺酸)以產生更穩定的蛋白質。此外，可藉由此項技術中已知的方法產生包含共同序列或實質上一致的共同序列變化之限制性肽(Rizo及Gierasch,(1992)Ann.Rev.Biochem. 61：387，其以引用的方式併入本文中)，例如藉由添加能夠形成分子內二硫鍵(其使肽環化)之內部半胱胺酸殘基。
亦提供本文中所描述之特異性結合於PCSK9之抗原結合蛋白之衍生物。衍生化抗體可包含任何賦予抗體或片段所需性質(諸如在特定用途中半衰期延長)的分子或物質。衍生化抗原結合蛋白可包含例如可偵測(或標記)部分(例如放射性、比色、抗原性或酶促分子、可偵測珠粒(諸如磁性或電子緻密(例如金)珠粒)或結合於另一分子之分子(例如生物素或抗生蛋白鏈菌素))、治療或診斷部分(例如放射性、細胞毒性或醫藥活性部分)、或增加抗原結合蛋白對於特定用途(例如向諸如人類個體之個體投藥，或其他活體內或活體外用途)之適用性的分子。可用於對抗原結合蛋白進行衍生化之分子的實例包括白蛋白(例如人類血清白蛋白)及聚乙二醇(PEG)。可使用此項技術中熟知的技術製備抗原結合蛋白之白蛋白連接及聚乙二醇化衍生物。某些抗原結合蛋白包括如本文中所描述之聚乙二醇化單鏈多肽。在一個實施例中，抗原結合蛋白結合或以其他方式連接於甲狀腺素轉運蛋白(「TTR」)或TTR變異體。TTR或TTR變異體可用例如選自由以下組成之群的化學物質進行化學修飾：聚葡萄糖、聚(n-乙烯基吡咯啶酮)、聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇及聚乙烯醇。
其他衍生物包括本文中揭示之特異性結合於PCSK9之抗原結合蛋白與其他蛋白質或多肽之共價或聚集結合物，諸如藉由重組型融合蛋白質之表現，該重組型融合蛋白質包含與抗原結合蛋白之N端或C端融合之異源多肽，該抗原結合蛋白抑制PCSK9與LDLR結合。舉例而言，結合之肽可為異源信號(或前導)多肽(例如酵母α-因子前導序列)，或肽(諸如抗原決定基標籤)。本發明之含有抗原結合蛋白之融合蛋白質可包含經添加以促進抗原結合蛋白之純化或鑑別的肽，該抗原結合蛋白特異性結合於PCSK9(例如聚His標籤)且抑制PSCK9與LDLR結合。特異性結合於PCSK9之抗原結合蛋白亦可連接至FLAG肽，如Hopp等人，(1988)Bio/Technology 6：1204；及美國專利第5,011,912號中所描述。FLAG肽為高抗原性且提供由特異性單株抗體(mAb)可逆結合之抗原決定基，從而使得可快速分析及易於純化所表現之重組型蛋白質。適用於製備FLAG肽融合於指定多肽之融合蛋白的試劑可購得(Sigma,St.Louis,MO)。
包含一或多個特異性結合於PCSK9之抗原結合蛋白的多聚體形成本發明之另一態樣。多聚體可呈共價連接或非共價連接二聚體、三聚體或更高級多聚體形式。預期包含兩個或多於兩個結合於PCSK9且抑制PCSK9與LDLR結合之抗原結合蛋白的多聚體用作治療劑、診斷劑及亦用於其他用途，該多聚體之一個實例為同質二聚體。其他例示性多聚體包括雜二聚體、同質三聚體、異三聚體、同質四聚體、雜四聚體等。
一個實施例係關於包含多個特異性結合於PCSK9之抗原結合蛋白的多聚體，該多個抗原結合蛋白經由與特異性結合於PCSK9之抗原結合蛋白融合之肽部分之間的共價或非共價相互作用接合。該等肽可為肽連接子(間隔基)，或具有促多聚化作用性質之肽。白胺酸拉鏈及某些來源於抗體之多肽為可促進其所連接之抗原結合蛋白之多聚化作用 的肽，如本文中更詳細描述。
在特定實施例中，多聚體包含兩個至四個結合於PCSK9之抗原結合蛋白。多聚體之抗原結合蛋白部分可呈上述形式中之任一種，例如變異體或片段。多聚體較佳包含具有特異性結合於PCSK9之能力的抗原結合蛋白。
在一實施例中，使用來源於免疫球蛋白之多肽製備寡聚物。包含某些與抗體衍生之多肽之各種部分(包括Fc結構域)融合之異源多肽的融合蛋白質之製備方法已例如由Ashkenazi等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10535；Byrn等人，(1990)Nature 344：677；及Hollenbaugh等人，(1992)Current Protocols in Immunology，增刊4，第10.19.1-10.19.11頁描述。
一個實施例包含二聚體，其包含兩個藉由使特異性結合於PCSK9之抗原抗原結合蛋白與抗體之Fc區域融合而產生的融合蛋白質。該二聚體可如下製得：例如將編碼融合蛋白質之基因融合物插入適當表現載體中，在經重組表現載體轉型之宿主細胞中表現基因融合物，及使所表現之融合蛋白質極像抗體分子般組裝，隨後在Fc部分之間形成鏈間二硫鍵以得到二聚體。
如本文所用，術語「Fc多肽」包括衍生自抗體Fc區之多肽的原生及突變形成之蛋白質形式。亦包括含有促進二聚合之鉸鏈區的該等多肽之截短形式。包含Fc部分之融合蛋白質(及由其形成之寡聚物)提供藉由蛋白質A或蛋白質G管柱親和層析進行輕易純化之優勢。
一種適合Fc多肽(描述於PCT申請案WO 93/10151及美國專利第5,426,048號及第5,262,522號中)為自人類IgG1抗體之Fc區域之N端絞鏈區延伸至原生C端之單鏈多肽。另一種有效Fc多肽為美國專利第5,457,035號及Baum等人，(1994)EMBO J. 13：3992-4001中所描述之Fc突變蛋白質。除胺基酸19由Leu變為Ala、胺基酸20由Leu變為Glu且胺 基酸22由Gly變為Ala外，此突變蛋白質之胺基酸序列與WO 93/10151中呈現之原生Fc序列之胺基酸序列相同。突變蛋白質對Fc受體之親和力降低。
在其他實施例中，諸如本文中所揭示之抗原結合蛋白之重鏈及/或輕鏈之可變部分可由抗體重鏈及/或輕鏈之可變部分取代。
或者，寡聚物為包含多個特異性結合於PCSK9之抗原結合蛋白(具有或不具有肽連接子(間隔肽))之融合蛋白質。適合肽連接子包括美國專利第4,751,180號及第4,935,233號中所描述之肽連接子。
另一種製備包含特異性結合於PCSK9之抗原結合蛋白之寡聚衍生物的方法涉及使用白胺酸拉鏈。白胺酸拉鏈域為促進可見該等白胺酸拉鏈域之蛋白質之寡聚的肽。白胺酸拉鏈最初在若干種DNA結合蛋白質(Landschultz等人，(1988)Science 240：1759-64)中發現，且隨後在多種不同蛋白質中發現。已知白胺酸拉鏈包括可二聚或三聚之天然存在之肽及其衍生物。適用於產生可溶性寡聚蛋白質之白胺酸拉鏈域之實例描述於PCT申請案WO 94/10308中，且來源於肺界面活性蛋白D(lung surfactant protein D；SPD)之白胺酸拉鏈描述於Hoppe等人，1994,FEBS Letters 344：191(以引用的方式併入本文中)中。可實現所融合之異源蛋白質之穩定三聚作用之經修飾之白胺酸拉鏈之用途描述於Fanslow等人，(1994)Semin.Immunol. 6：267-278中。在一種方法中，包含與白胺酸拉鏈肽融合之抗原結合蛋白片段或衍生物(其特異性結合於PCSK9)之重組型融合蛋白質表現於適合宿主細胞中，且自培養物上清液回收所形成之可溶性寡聚抗原結合蛋白片段或衍生物。
在某些實施例中，抗原結合蛋白之KD(平衡結合親和力)小於1pM、10pM、100pM、1nM、2nM、5nM、10nM、25nM或50nM。
在另一態樣中，本發明提供活體外或活體內半衰期為至少一天 (例如當投與人類個體時)之抗原結合蛋白。在一個實施例中，抗原結合蛋白之半衰期為至少三天。在另一實施例中，抗體或其部分之半衰期為四天或四天以上。在另一實施例中，抗體或其部分之半衰期為八天或八天以上。在另一實施例中，抗體或其部分之半衰期為十天或十天以上。在另一實施例中，抗體或其部分之半衰期為十一天或十一天以上。在另一實施例中，抗體或其部分之半衰期為十五天或十五天以上。在另一實施例中，抗體或其抗原結合部分經衍生或修飾以使其半衰期比未經衍生或未經修飾之抗體長。在另一實施例中，特異性結合於PCSK9之抗原結合蛋白含有點突變以增加血清半衰期，諸如2000年2月24日公開之WO 00/09560中所描述，其以引用的方式併入本文中。
糖基化作用
特異性結合於PCSK9之抗原結合蛋白可具有與在原生物種中發現不同或由其改變之糖基化作用模式。如此項技術中所已知，糖基化模式可視蛋白質之序列(例如存在或不存在以下所論述之特定糖基化胺基酸殘基)或產生蛋白質之宿主細胞或生物體而定。以下論述特定表現系統。
多肽之糖基化通常為N連接或O連接。N連接型係指碳水化合物部分與天冬醯胺殘基之側鏈連接。三肽序列天冬醯胺酸-X-絲胺酸及天冬醯胺酸-X-蘇胺酸(其中X為除脯胺酸之外的任何胺基酸)為碳水化合物部分酶促結合至天冬醯胺酸側鏈之識別序列。因此，此等三肽序列中之任一者在抗體中的存在產生潛在性糖基化位點。O-連接型糖基化係指糖N-乙醯基半乳胺糖、半乳糖或木糖中之一者連接至羥基胺基酸，最常見為絲胺酸或蘇胺酸，但亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。
向抗原結合蛋白中添加糖基化位點宜藉由改變胺基酸序列以使 得其含有一或多個上述三肽序列來實現(用於N-連接型糖基化位點)。亦可藉由向原始拮抗劑序列加入一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基或經一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基取代原始拮抗劑序列來進行改變(對於O連接糖基化部位)。出於便利性，抗原結合蛋白胺基酸序列可經由在DNA層面上進行改變來改變，尤其藉由使編碼目標多肽之DNA在預選鹼基處突變以使得產生將轉譯為所需胺基酸之密碼子。
另一種增加抗原結合蛋白上碳水化合物部分之數目的方法為使糖苷化學或酶促偶合於蛋白質。此等程序為有利的，因為其不需要在具有糖基化能力之宿主細胞中產生蛋白質來進行N-連接型及O-連接型糖基化。視所用偶合模式而定，可將該(等)糖連接至(a)精胺酸及組胺酸、(b)游離羧基、(c)游離巰基諸如半胱胺酸之統基、(d)游離羥基，諸如絲胺酸、蘇胺酸、或羥基脯胺酸之羥基、(e)芳族殘基，諸如苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸之芳族殘基、或(f)谷醯胺酸之醯胺基。該等方法描述於WO 87/05330以及Aplin及Wriston,(1981)CRC Crit.Rev.Biochem. 10：259-306中。
可由化學或酶促方式實現移除起始抗原結合蛋白上之碳水化合物部分。化學去糖基化作用需要將該抗體暴露於化合物三氟甲磺酸、或等效化合物。此處理導致除連接糖(N-乙醯葡糖胺或N-乙醯半乳糖胺)之外的絕大多數或所有糖之裂解，而使抗體完整。化學去糖基化作用由Hakimuddin等人，(1987)Arch.Biochem.Biophys. 259：52-57及Edge等人，(1981)Anal.Biochem. 118：131-37描述。多肽上之碳水化合物部分之酶促裂解可使用多種內醣苷酶及外醣苷酶實現，如由Thotakura等人，(1987)Meth.Enzymol. 138：350-59描述。可藉由使用化合物衣黴素來防止潛在糖基化作用位點處之糖基化作用，如由Duskin等人，(1982)J.Biol.Chem. 257：3105-09描述。衣黴素阻斷蛋白質-N-醣苷鍵聯形成。
因此，本發明之態樣包括特異性結合於PCSK9之抗原結合蛋白之糖基化作用變異體，其中與親本多肽之胺基酸序列相比，糖基化作用位點之數目及/或類型已改變。在某些實施例中，與原生抗體相比，抗體蛋白質變異體包含更大數目或更小數目之N-連接糖基化位點。N-連接糖基化位點由Asn-X-Ser或Asn-X-Thr序列表徵，其中指定為X之胺基酸殘基可為除脯胺酸之外之任何胺基酸殘基。用於創造此序列之胺基酸殘基之取代提供潛在的新位點以用於N-連接醣鏈之添加。或者，消除或改變該序列之取代將阻止添加存在於原生多肽中之N-連接碳水化合物鏈。舉例而言，可藉由缺失Asn或藉由用不同胺基酸取代Asn來減少糖基化。在其他實施例中，產生一或多個新的N-連接位點。抗體通常在Fc區中具有N-連接糖基化位點。
標記及效應子基團
在一些實施例中，特異性結合於PCSK9之抗原結合蛋白包含一或多個標記。術語「標記」或「標記基團」意謂任何可偵測標記。適合標記基團的實例包括(但不限於)以下：放射性同位素或放射性核種(例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、螢光基團(例如FITC、若丹明(rhodamine)、鑭系元素磷光體)、酶促基團(例如辣根過氧化酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)、化學發光基團、生物素基團或由二次報導體識別之預定多肽抗原決定基(例如白胺酸拉鏈對序列、二次抗體之結合位點、金屬結合域、抗原決定基標籤)。在一些實施例中，標記基團經由各種長度之間隔臂偶合於抗原結合蛋白以降低潛在位阻。此項技術中已知多種用於標記蛋白質之方法且可視情況使用。
術語「效應子基團」意謂任何與特異性結合PCSK9且充當細胞毒性劑之抗原結合蛋白偶合之基團。適合效應基團的實例為放射性同位素或放射性核種(例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、 131I)。其他適合基團包括毒素、治療基團或化學治療基團。適合基團之實例包括加里刹黴素(calicheamicin)、奧瑞斯達汀(auristatins)、格爾德黴素(geldanamycin)及美登素(cantansine)。在一些實施例中，效應基團經由各種長度之間隔臂偶合於抗原結合蛋白以降低潛在位阻。
一般而言，標記分成多種類別，此視對其進行偵測之分析法而定：a)同位素標記，其可為放射性或重同位素；b)磁性標記(例如磁性粒子)；c)氧化還原活性部分；d)光學染料；酶促基團(例如辣根過氧化酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)；e)生物素標記基團；及f)由二次報導體識別之預定多肽抗原決定基(例如白胺酸拉鏈對序列、二次抗體之結合位點、金屬結合域、抗原決定基標籤等)。在一些實施例中，標記基團經由各種長度之間隔臂偶合於抗原結合蛋白以降低潛在位阻。此項技術中已知多種用於標記蛋白質之方法。
特定標記包括光學染料，包括(但不限於)發色團、磷光體及螢光團，其中螢光團在許多實例中具有特異性。螢光團可為「小分子」氟或蛋白質氟。
「螢光標記」意謂任何可經由其固有的螢光性質而被偵測的分子。適合螢光標記包括(但不限於)螢光素、若丹明、四甲基若丹明、曙紅(eosin)、藻紅(erythrosin)、香豆素(coumarin)、甲基-香豆素、芘、孔雀綠(Malacite green)、芪、螢光黃(Lucifer Yellow)、Cascade藍(Cascade Blue)、德克薩斯紅(Texas Red)、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC Red 640、Cy 5、Cy 5.5、LC Red 705、俄勒岡綠(Oregon green)、Alexa-Fluor染料(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680)、Cascade藍、Cascade黃(Cascade Yellow)及R-藻紅素(PE)(Molecular Probes,Eugene,OR)、FITC、若丹明及德克薩斯紅(Pierce, Rockford,IL)、Cy5、Cy5.5、Cy7(Amersham Life Science,Pittsburgh,PA)。適合光學染料(包括螢光團)描述於Molecular Probes Handbook,Richard P.Haugland及後續版中，包括Molecular Probes Handbook,A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies，第11版，Johnson及Spence(編)，其以引用的方式明確併入本文中。
適合蛋白質螢光標記亦包括(但不限於)綠色螢光蛋白質，包括GFP之海腎(Renilla)、海筆(Ptilosarcus)或水母(Aequorea)物質(Chalfie等人，(1994)Science 263：802-805)、eGFP(Clontech Labs.,Inc.,Genbank寄存編號U55762)、藍色螢光蛋白質(BFP,Quantum Biotechnologies,Inc.,Quebec,Canada；Stauber,(1998)Biotechniques 24：462-71；Heim等人，(1996)Curr.Biol. 6：178-82)、增強型黃色螢光蛋白質(EYFP,Clontech Labs.,Inc.)、螢光素酶(Ichiki等人，(1993)J.Immunol. 150：5408-17)、β-半乳糖苷酶(Nolan等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 85：2603-07)及海腎(WO92/15673、WO95/07463、WO98/14605、WO98/26277、WO99/49019、美國專利第5292658號、第5418155號、第5683888號、第5741668號、第5777079號、第5804387號、第5874304號、第5876995號及第5925558號)。
製備抗原結合蛋白
所提供之非人類抗體可例如來源於任何抗體產生動物，諸如小鼠、大鼠、兔、山羊、驢或非人類靈長類動物(諸如猴子(例如獼猴(cynomolgus)或恆河猴(rhesus monkey))或猿(例如黑猩猩(chimpanzee)))。非人類抗體可用於例如活體外細胞培養物及基於細胞培養物之應用中，或其中對抗體之免疫反應不出現或無意義、可得到阻止、不受關注，或被需要之任何其他應用中。在某些實施例中，可藉由用以下物質或此項技術中已知的其他方法(例如本文中呈現之實例中所描述的方法)進行免疫來產生抗體：包含SEQ ID NO：2之胺基 酸序列之胺基酸31至692之重組型自身裂解、成熟、分泌型PCSK9；或全長PCSK9；或表現PCSK9之完全細胞；或由表現PCSK9之細胞製備之細胞膜；或融合蛋白質，例如包含與Fc融合之PCSK9(或其細胞外結構域)之Fc融合物。或者，可藉由用胺基酸進行免疫來產生某些非人類抗體，該等胺基酸為區段PCSK9，其形成由本文中提供之某些抗體結合之抗原決定基的一部分。抗體可為多株抗體、單株抗體或可於宿主細胞中藉由表現重組型DNA合成。
可如上文所描述藉由對含有人免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物進行免疫或藉由選擇表現人類抗體譜系之噬菌體呈現文庫來製備完全人類抗體。
單株抗體(mAb)可由多種技術產生，包括習知單株抗體方法，例如Kohler及Milstein,(1975)Nature 256：495-97中之標準體細胞雜交技術。或者，可使用其他用於產生單株抗體之技術，例如B-淋巴細胞之病毒或致癌轉型。一種適用於製備融合瘤之動物系統為鼠類系統，其為一種極公認程序。此項技術中已知用於融合之經免疫之脾細胞之分離的免疫方案及技術。對於該等程序，使來自經免疫小鼠之B細胞與適合之永生化融合搭配物(諸如鼠類骨髓瘤細胞株)融合。必要時，可替代小鼠對大鼠或此外其他哺乳動物進行免疫且可使該等動物之B細胞與鼠類骨髓瘤細胞株融合以形成融合瘤。或者，可使用來自除小鼠以外之來源的骨髓瘤細胞株。亦熟知製造融合瘤之融合程序。亦可使用SLAM技術產生抗體。
所提供之單鏈抗體可藉由經胺基酸橋(短肽連接子)連接重鏈及輕鏈可變域(Fv區域)片段從而產生單一多肽鏈來形成。該等單鏈Fv(scFv)可藉由使編碼DNA(該等DNA編碼兩個可變域多肽(VL及VH))之間的肽連接子之DNA融合來製備。視兩個可變域之間的可撓性連接子之長度而定，所得多肽可在自身摺疊以形成抗原結合單體或其可形 成多聚物(例如二聚體、三聚體或四聚體)(Kortt等人，1997,Prot.Eng.10：423；Kortt等人，2001,Biomol.Eng.18：95-108)。藉由組合不同的包含VL及VH之多肽，可形成結合於不同抗原決定基之多聚scFv(Kriangkum等人，2001,Biomol.Eng.18：31-40)。所研發之用於產生單鏈抗體之技術包括美國專利第4,946,778號；Bird等人，(1988)Science 242：423-26；Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 85：5879-83；Ward等人，(1989)Nature 334：544-46；de Graaf等人，(2002)Methods Mol Biol. 178：379-387中描述之技術。來源於本文中提供之抗體之單鏈抗體包括(但不限於)scFv，其包含表2中描繪之重鏈及輕鏈可變區之可變域組合，或包括表3-4及6-23中描繪之CDR之輕鏈及重鏈可變域之組合。
可使用子類轉換方法將本文中提供之一種子類抗體換為不同子類之抗體。因此，IgG抗體可來源於例如IgM抗體且反之亦然。該等技術允許製備具有既定抗體(親本抗體)之抗原結合性質且亦顯示與親本抗體不同之抗體同型或子類相關之生物性質的新穎抗體。可使用重組型DNA技術。該等程序中可使用編碼特定抗體多肽之經選殖之DNA，例如編碼所需同型之抗體之恆定域之DNA。參見例如Lantto等人，(2002)Methods Mol.Biol. 178：303-16。
因此，所提供之抗體包括包含例如上文描述之具有所需同型(例如IgA、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE及IgD)及其Fab或F(ab')2片段之可變域組合的抗體。此外，若需要IgG4，亦可能需要引入點突變(例如絞鏈區中自CPSCP至CPPCP(分別為SEQ ID NO：1828及1829，按出現順序)之突變，如Bloom等人，(1997)Protein Science 6：407-15中所描述，其以引用的方式併入本文中)以緩解形成可引起IgG4抗體中之多相性之內H鏈雙硫鍵的傾向。
此外，亦已知用於產生具有不同性質(亦即對其所結合之抗原呈 現不同親和力)之抗體之技術。一種該類技術(稱為鏈改組)涉及在絲狀噬菌體表面上呈現免疫球蛋白可變域基因譜，通常稱為噬菌體呈現。鏈改組已用於製備針對半抗原2-苯基噁唑-5-酮之高親和力抗體，如由Marks等人，(1992)Nature Biotechnology 10：779-83描述。
可對表2中描述之重鏈及輕鏈可變區或表3A及3B、4A及4B中描述之CDR進行保守性修飾(及對編碼核酸進行相應修飾)以產生具有功能性及生物化學特性之抗原結合蛋白。用於實現該等修飾之方法描述於本文中。
特異性結合於PCSK9之抗原結合蛋白可以多種方式進一步修飾。舉例而言，若其將用於治療目的，則其可與聚乙二醇結合(聚乙二醇化)以延長血清半衰期或增強蛋白質傳遞。PEG可直接連接至抗原結合蛋白或其可經由連接子(諸如醣苷鍵)連接。
或者，個體抗體或其片段之V區域可與不同抗體分子之Fc區域融合。可修飾用於此目的之Fc區以使其不結合補體，從而降低在融合蛋白質用作治療劑時誘導患者中細胞溶解之可能性。此外，個體抗體或其功能性片段可與人類血清白蛋白結合以增強抗體或其片段之血清半衰期。另一種適用於抗原結合蛋白或其片段之融合搭配物為運甲狀腺素蛋白(TTR)。TTR具有形成四聚體之能力，因此抗體-TTR融合蛋白質可形成增加其結合親合力之多價抗體。
或者，本文所述之抗原結合蛋白的功能性及/或生物化學特徵之實質性修飾可藉由在重鏈及輕鏈之胺基酸序列中形成取代來達成，該等取代在其對維持以下之作用方面顯著不同：(a)取代區域中分子骨架的結構，例如呈片狀或螺旋構形；(b)分子之目標位點處之電荷或疏水性；或(c)側鏈之體積。「保守性胺基酸取代」」可涉及以非原生殘基進行之原生胺基酸殘基之取代，其對該位置處胺基酸殘基之極性或電荷影響極小或無影響。參見表8，同上。此外，多肽中之任何天 然殘基亦可經丙胺酸取代，如先前對於丙胺酸掃描突變誘發所述。
可由熟習此項技術者藉由應用常規技術來實施標的抗體之胺基酸取代(無論保守性或非保守性)。胺基酸取代可用於識別本文中提供之抗體之重要殘基，或增加或降低此等抗體對PCSK9之親和力或用於改良本文中所描述之其他抗原結合蛋白之結合親和力。
表現抗原結合蛋白之方法
本文亦提供包含至少一種如上文所述之聚核苷酸的呈質體、表現載體、轉錄或表現卡匣形式之表現系統及構築體，以及包含該等表現系統或構築體之宿主細胞。
本文中提供之抗原結合蛋白可由多種習知技術中之任一種製備。舉例而言，可使用此項技術中已知的任何技術藉由重組表現系統產生特異性結合於PCSK9之抗原結合蛋白。參見例如Monoclonal Antibodies,Hybridomas：A New Dimension in Biological Analyses,(Kennet等人編)Plenum Press(1980)及後續版；以及Harlow及Lane,(1988)同上。
抗原結合蛋白可於融合瘤細胞株中(例如尤其抗體可於融合瘤中表現)或除融合瘤以外的細胞株中表現。編碼抗體之表現構築體可用於轉型哺乳動物、昆蟲或微生物宿主細胞。可使用任何已知的用於將聚核苷酸引入宿主細胞中之方法進行轉型，包括例如將聚核苷酸封裝於病毒或噬菌體中且用構築體藉由此項技術中已知的轉染程序對宿主細胞進行轉導，如由美國專利第4,399,216號；第4,912,040號；第4,740,461號；及第4,959,455號所例示。所用最佳化轉型程序將視所轉型之宿主細胞之類型而定。將異源聚核苷酸引入哺乳動物細胞中之方法為此項技術所熟知，且包括(但不限於)葡聚糖介導之轉染、磷酸鈣沈澱、凝聚胺(polybrene)介導之轉染、原生質體融合、電穿孔、聚核苷酸囊封於脂質體中、將核酸與帶正電之脂質混合、及將DNA直接 顯微注射至細胞核中。
重組型表現構築體典型地包含編碼多肽之核酸分子，該多肽包含以下中之一或多者：一或多個本文中提供之CDR；輕鏈恆定區；輕鏈可變區；重鏈恆定區(例如CH1、CH2及/或CH3)；及/或抗原結合蛋白之另一骨架部分。使用標準接合技術將該等核酸序列插入適合表現載體中。在一實施例中，重鏈或輕鏈恆定區連接至抗PCSK9特異性重鏈或輕鏈可變區之C端且連接入表現載體中。通常選擇在所用特定宿主細胞中有功能之載體(亦即載體與宿主細胞機構相容，從而允許進行基因之擴增及/或表現)。在一些實施例中，使用可使用蛋白質報導體進行蛋白質-片段互補分析法之載體，諸如二氫葉酸還原酶(參見例如美國專利第6,270,964號，其以引用的方式併入本文中)。可自例如Invitrogen Life Technologies或BD Biosciences購買適合表現載體。其他適用於選殖及表現本發明之抗體及片段之載體包括Bianchi及McGrew,(2003)Biotech.Biotechnol.Bioeng. 84：439-44中描述之載體，其以引用的方式併入本文中。其他適合表現載體論述於例如「Gene Expression Technology」,Methods Enzymol.，第185卷，(Goeddel等人編)，(1990),Academic Press中。
通常，用於任何宿主細胞中之表現載體將含有用於質體維持及用於選殖及表現外源性核苷酸序列之序列。在某些實施例中，總稱為「側接序列」之該等序列通常將包括一或多個以下核苷酸序列：啟動子、一或多個強化子序列、複製起點、轉錄終止序列、含有供者及受者剪接位點之完整內含子序列、編碼用於多肽分泌之前導序列的序列、核糖體結合位點、聚腺苷酸化序列、用於插入編碼待表現多肽之聚核苷酸的多酶切點接頭區域及可選擇標記元件。
表現載體可視情況含有「標籤」編碼序列，亦即位於抗原結合蛋白編碼序列之5'或3'端之寡核苷酸分子；寡核苷酸序列編碼polyHis (諸如hexaHis、HHHHHH(SEQ ID NO：1830))，或另一「標籤」，諸如FLAG、HA(血球凝集素流感病毒)或myc，其存在可商購抗體。此標籤通常在多肽表現後與多肽融合，且可充當用於自宿主細胞親和性純化或偵測抗原結合蛋白之工具。親和力純化可例如使用針對標籤之抗體作為親和基質藉由管柱層析來實現。接著可視情況藉由多種方法(諸如使用某些用於裂解之肽酶)自純化之抗原結合蛋白移除標籤。
側接序列可為同源(亦即來自與宿主細胞相同之物種及/或菌株)、異源(亦即來自不同於宿主細胞物種或品系之物種)、雜交(亦即來自一個以上來源之側接序列的組合)、合成或原生序列。因此，側接序列之來源可為任何原核或真核生物體、任何脊椎動物或無脊椎動物生物體或任何植物，限制條件為側接序列在宿主細胞機器中發揮功能且可由宿主細胞機器活化。
適用於載體中之側接序列可由此項技術中熟知的若干種方法中之任一種獲得。通常，本文中之有效側接序列已藉由定位及/或限制酶消化預先鑑別且因此可使用適合的限制核酸內切酶自適合組織來源分離。在一些情況下，側接序列之完全核苷酸序列可為已知。此處，可使用本文中所描述用於核酸合成或選殖之方法合成側接序列。
無論已知側接序列之全部抑或僅一部分，其均可使用聚合酶鏈反應(PCR)及/或藉由用適合探針(諸如來自相同或不同物種之寡核苷酸及/或側接序列片段)篩選基因組文庫來獲得。當側接序列為未知時，可自較大片的可能含有例如編碼序列或甚至另一基因或其他基因之DNA分離含有側接序列之DNA之片段。可藉由進行限制酶消化以產生適當DNA片段，接著使用瓊脂糖凝膠純化、管柱層析或熟習此項技術者已知的其他方法進行分離來實現分離。選擇適合酶來實現此目的對於一般技術者將顯而易知。
複製起點通常為在市面上購得之彼等原核表現載體的一部分， 且該起點幫助載體在宿主細胞中擴增。若所選載體不含複製位點之起點，則可基於已知序列化學合成且接合至載體中。舉例而言，來自質體pBR322(GenBank寄存編號J01749，New England Biolabs,Beverly,MA)之複製起點適用於大部分革蘭氏陰性細菌(gram-negative bacteria)且多種病毒起源(例如SV40、多瘤、腺病毒、水泡性口膜炎病毒(VSV)或乳突狀瘤病毒(諸如HPV或BPV))適用於選殖哺乳動物細胞中之載體。通常，哺乳動物表現載體無需複製起點組分(例如通常僅使用SV40起點，因為其亦含有病毒早期啟動子)。
轉錄終止序列通常位於多肽編碼區末端之3'方向且用以終止轉錄。通常，原核細胞中之轉錄終止序列為富含G-C之片段，其後為聚T序列。儘管序列易於自文庫選殖或甚至以載體之部分形式自市售，但其亦可使用核酸合成方法(諸如本文所述之核酸合成方法)輕易合成。
可選擇標記基因編碼在選擇性培養基中生長之宿主細胞之存活及生長所必需之蛋白質。典型選擇標記基因編碼如下蛋白質：(a)賦予對抗生素或其他毒素(例如用於原核宿主細胞之安比西林(ampicillin)、四環素(tetracycline)或康黴素(kanamycin))之抗性；(b)補充細胞之營養缺陷；或(c)供應無法自複合培養基或限定培養基獲得之關鍵營養物。特定可選擇標記為康黴素抗性基因、安比西林抗性基因及四環素抗性基因。有利的是，新黴素(neomycin)抗性基因亦可用於原核宿主細胞及真核宿主細胞中之選擇。
其他可選擇基因可用於擴增待表現基因。擴增為使產生對於生長或細胞存活關鍵之蛋白質所需之基因在連續數代重組細胞之染色體中串聯重複的過程。適合於哺乳動物細胞之可選擇標記的實例包括二氫葉酸還原酶(DHFR)及無啟動子胸苷激酶基因。將哺乳動物細胞轉型體置於選擇壓力下，其中由於載體中存在可選擇基因而使僅轉型體 唯一適應得以存活。藉由在培養基中之選擇試劑之濃度連續增加(藉此引起可選擇基因及編碼另一基因(諸如結合於PCSK9之抗原結合蛋白)之DNA之擴增)條件下培養轉型之細胞來施加選擇壓力。因此，由擴增之DNA合成數量增加之多肽(諸如抗原結合蛋白)。
核糖體結合位點通常為mRNA之轉譯起始所必需且特徵在於夏因-達爾加諾(Shine-Dalgarno)序列(原核生物)或克紮克(Kozak)序列(真核生物)。該元件通常位於啟動子之3'及待表現多肽之編碼序列之5'。
在一些情況下，諸如當真核宿主細胞表現系統中需要糖基化時，可操作各種前序列或原序列來改良糖基化或產量。舉例而言，可改變特定信號肽之肽酶裂解位點，或添加亦可影響糖基化作用之原序列。最終蛋白質產物可能在-1位置(相對於成熟蛋白質之第一胺基酸)具有一或多個附帶表現之額外胺基酸，其可能尚未完全移除。舉例而言，最終蛋白質產物可具有一個或兩個在肽酶裂解位點中發現之胺基酸殘基，其連接至胺基端。或者，使用一些酶裂解位點可產生所需多肽之輕微截短形式(若酶在成熟多肽內該區域處切割)。
表現及選殖將通常含有啟動子，其由宿主有機物識別且與編碼特異性結合於PCSK9之抗原結合蛋白之分子可操作地連接。啟動子為位於結構基因之起始密碼子上游(亦即5')的未轉錄序列(通常在約100 bp至1000 bp內)，其控制結構基因之轉錄。啟動子習知地分為兩類之一：誘導性啟動子及組成性啟動子。誘導性啟動子回應於培養條件之一些變化(諸如存在或不存在營養物或溫度變化)引發在其控制下自DNA之轉錄量增加。另一方面，組成性啟動子均一地轉錄其可操作地連接之基因，亦即對基因表現之控制極小或無控制。大量可由多種潛在宿主細胞所別之啟動子已為吾人所熟知。藉由限制酶消化自來源DNA移除啟動子且將所需啟動子序列插入載體中來使適合啟動子與編碼包含抗原結合蛋白之重鏈或輕鏈的DNA可操作地連接。
此項技術中亦熟知適用於酵母宿主之啟動子。酵母強化子宜與酵母啟動子一起使用。適於與哺乳動物宿主細胞一起使用之啟動子已為吾人所熟知且包括(但不限於)自病毒(諸如多形瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒、鳥類肉瘤病毒、細胞巨大病毒、反轉錄病毒、B型肝炎病毒及猿猴病毒40(SV40))之基因組獲得之啟動子。其他適合之哺乳動物啟動子包括異源哺乳動物啟動子，例如熱休克啟動子及肌動蛋白啟動子。
其他相關啟動子包括(但不限於)：SV40早期啟動子(Benoist及Chambon,(1981)Nature 290：304-310)；CMV啟動子(Thornsen等人，(1984)Proc.Natl.Acad.U.S.A. 81：659-663)；勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)之3'長末端重複中所含啟動子(Yamamoto等人，(1980)Cell 22：787-97)；疱疹胸苷激酶啟動子(Wagner等人，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 78：1444-45)；來自金屬硫蛋白基因之啟動子及調節序列(Prinster等人，(1982)Nature 296：39-42)；及原核啟動子，諸如β-內醯胺酶啟動子(Villa-Kamaroff等人，(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 75：3727-31)；或tac啟動子(DeBoer等人，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 80：21-25)。亦關注以下動物轉錄控制區域，其呈現組織專一性且已用於轉殖基因動物中：彈性蛋白酶I基因控制區域，其在胰臟腺泡細胞中具有活性(Swift等人，(1984)Cell 38：639-46；Ornitz等人，(1986)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol. 50：399-409；MacDonald,(1987)Hepatology 7：425-515)；胰島素基因控制區域，其在胰臟β-細胞中具有活性(Hanahan,(1985)Nature 315：115-22)；免疫球蛋白基因控制區域，其在淋巴樣細胞中具有活性(Grosschedl等人，(1984)Cell 38：647-58；Adames等人，(1985)Nature 318：533-38；Alexander等人，(1987)Mol.Cell.Biol. 7：1436-44)；小鼠乳腺瘤病毒控制區域，其在睾丸、乳房、淋巴及肥大細胞中具有活性 (Leder等人，(1986)Cell 45：485-95)；白蛋白基因控制區域，其在肝臟中具有活性(Pinkert等人，(1987)Genes and Devel. 1：268-76)；α-胎蛋白基因控制區域，其在肝臟中具有活性(Krumlauf等人，(1985)Mol.Cell.Biol. 5：1639-48；Hammer等人，(1987)Science 253：53-58)；α1-抗胰蛋白酶基因控制區域，其在肝臟中具有活性(Kelsey等人，(1987)Genes and Devel. 1：161-71)；β-球蛋白基因控制區域，其在骨髓細胞中具有活性(Mogram等人，(1985)Nature 315：338-40；Kollias等人，(1986)Cell 46：89-94)；髓磷脂鹼性蛋白基因控制區域，其在腦中之少樹突神經膠細胞中具有活性(Readhead等人，(1987)Cell 48：703-12)；肌球蛋白輕鏈-2基因控制區域，其在骨骼肌中具有活性(Sani,(1985)Nature 314：283-86)；及促性腺釋放激素基因控制區域，其在丘腦下部具有活性(Mason等人，(1986)Science 234：1372-78)。
可藉由更高級真核生物將強化子序列插入載體中以增加編碼輕鏈或重鏈之DNA之轉錄，該輕鏈或重鏈包含特異性結合於PCSK9之抗原結合蛋白，例如特異性結合於PCSK9之人類抗原結合蛋白。強化子為DNA之順式作用元件，通常長度為約10-300 bp，其作用於啟動子以增加轉錄。強化子相對不依賴於取向及位置，已發現其位於轉錄單元之5'與3'方向的位置。可自哺乳動物基因獲得之若干個強化子序列為已知的(例如血球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白及胰島素)。然而，通常使用來自病毒之強化子。此項技術中已知之SV40強化子、細胞巨大病毒早期啟動子強化子、多瘤病毒強化子及腺病毒強化子為用於活化真核啟動子之例示性強化元件。儘管強化子可位於載體中以編碼序列計之5'或3'位處，但其通常位於以啟動子計之5'位處。編碼適當原生或異源信號序列(前導序列或信號肽)之序列可併入表現載體中以促進抗體之細胞外分泌。信號肽或前導序列之選擇視待產生抗體之宿主細胞的類型而定，且異源信號序列可置換原生信號序 列。在哺乳動物宿主細胞中具有功能性之信號肽之實例包括以下：美國專利第4,965,195號中描述之介白素-7(IL-7)之信號序列；Cosman等人，(1984)Nature 312：768-71中描述之介白素-2之信號序列；EP專利第0367 566號中描述之介白素-4受體信號肽；美國專利第4,968,607號中描述之I型介白素-1受體信號肽；EP專利第0 460 846號中描述之II型介白素-1受體信號肽。
可由起始載體(諸如市售載體)構築表現載體。該等載體可(但無需)含有所有所需側接序列。當載體中不存在一或多個側接序列時，可個別地獲得該一或多個側接序列且將其接合至載體中。用於獲得各側接序列之方法為熟習此項技術者所熟知。
在構築載體且將編碼包含特異性結合於PCSK9之抗原結合蛋白之輕鏈、重鏈或輕鏈及重鏈插入載體中之適當位點後，可將完整載體插入適合宿主細胞中以用於擴增及/或多肽表現。將抗原結合蛋白之表現載體轉型至所選宿主細胞中可藉由熟知方法完成，包括轉染、感染、磷酸鈣共沈澱、電穿孔、顯微注射、脂質轉染法、DEAE-葡聚糖介導之轉染或其他已知技術。所選方法將部分地隨所用宿主細胞之類型而變。此等方法及其他適合方法已為熟練技師所熟知且闡述於例如Sambrook等人，(2001)，同上中。
當在適當條件下培養時，宿主細胞合成抗原結合蛋白，接著可自培養基收集(若宿主細胞將其分泌入培養基中)或直接自產生其之宿主細胞收集(若未分泌)。適當宿主細胞之選擇將視多種因素而定，諸如所需表現量、活性所需或必需之多肽修飾(諸如糖基化或磷酸化)及摺疊成生物活性分子之容易性。
可用作用於表現之宿主之哺乳動物細胞株在此項技術中已為吾人所熟知且包括(但不限於)可自美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection；ATCC)獲得之永生化細胞株，包括(但不限於)海 拉細胞(HeLa cell)、人類胎腎293細胞(HEK293細胞)、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、海拉細胞、仔倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人類肝細胞癌細胞(例如Hep G2)及多種其他細胞株。在某些實施例中，可經由確定哪些細胞株具有高表現量及組成性產生具有所需結合性質(例如結合PCSK9之能力)之抗原結合蛋白來選擇細胞株。在另一實施例中，選擇來自B細胞譜系之細胞株，其不產生其自有抗體但具有產生及分泌異源抗體之能力。抑制PCSK9與LDLR結合之能力亦可形成選擇準則。
抗原結合蛋白用於診斷性及治療性目的之用途
在某些情況下，PCSK9活性與多種人類疾病病況相關。舉例而言，在某些情況下，PCSK9活性過高與某些病狀(諸如高膽固醇血症)相關。因此，在某些情況下，調節PCSK9活性可在治療上有效。在某些實施例中，使用針對PCSK9之中和抗原結合蛋白調節至少一種PCSK9活性(例如與LDLR之結合)。該等方法可治療及/或預防病症及/或降低病症之風險，該等病症與血清膽固醇含量升高或膽固醇含量升高有關。
如熟習此項技術者將瞭解，根據本發明，與膽固醇、LDL或LDLR含量變化有關、涉及膽固醇、LDL或LDLR含量變化或可受膽固醇、LDL或LDLR含量變化影響之病症可由抗原結合蛋白之多種實施例解決。在一些實施例中，「膽固醇相關病症」(其包括「血清膽固醇相關病症」)包括以下中之任一或多者：高膽固醇血症、心臟病、代謝症候群、糖尿病、冠心病、中風、心血管疾病、阿茲海默症(Alzheimer's disease)及常見血脂異常，其可為顯性，例如由總血清膽固醇升高、LDL升高、三酸甘油酯升高、VLDL升高及/或HDL降低表示。可使用單獨或與一或多種其他藥劑組合之ABP治療之原發性及繼發性血脂異常的一些非限制性實例包括代謝症候群、糖尿病、家族性 混合型高脂質血症、家族性高三酸甘油酯血症、家族性高膽固醇血症(包括異型接合高膽固醇血症、同型接合高膽固醇血症)、家族性載脂蛋白B-100缺陷症、多基因性高膽固醇血症、殘粒移除疾病(remnant removal disease)、肝脂肪酶缺乏症；繼發於以下任一者之血脂異常：膳食不慎重、甲狀腺功能低下(hypothyroidism)、藥物(包括雌激素(estrogen)及助孕素(progestin)療法、β-阻斷劑及噻嗪利尿劑)、腎病症候群、慢性腎衰竭、庫欣氏症候群(Cushing's syndrome)、原發性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis)、肝醣儲存疾病、肝癌、膽汁鬱滯(cholestasis)、肢端肥大症(acromegaly)、胰島素瘤(insulinoma)、單純性生長激素缺乏症(isolated growth hormone deficiency)及酒精誘發之高三酸甘油酯血症。ABP亦可適用於預防或治療動脈粥樣硬化疾病，諸如冠心病、冠狀動脈病、周邊動脈疾病、中風(缺血性及出血性)、心絞痛或腦血管疾病及急性冠狀動脈症候群、心肌梗塞。在一些實施例中，ABP適用於降低以下之風險：非致死性心臟病發作、致死性及非致死性中風、某些類型之心臟手術、心臟衰竭之住院治療、心臟病患者之胸痛及/或由確定心臟病(諸如先前心臟病發作、先前心臟手術及/或具有動脈阻塞證明之胸痛)引起之心血管事件。在一些實施例中，ABP及方法可用於降低復發性心血管事件之風險。
如熟習此項技術者所應瞭解，通常可經由使用士他汀處理(可治療或可預防)之病症或疾病亦可受益於應用本發明抗原結合蛋白。此外，在一些實施例中，可受益於阻止膽固醇合成或LDLR表現增加之疾病或病症亦可用抗原結合蛋白之各種實施例治療。此外，如熟習此項技術者所應瞭解，使用抗PCSK9抗體可尤其適用於治療糖尿病。不僅糖尿病為冠心病之風險因素，而且胰島素會使PCSK9之表現增加。亦即糖尿病人具有升高之血漿脂質含量(其可與高PCSK9含量相關)且可受益於降低該等含量。此大體上更詳細地論述於Costet等人 (「Hepatic PCSK9 Expression is Regulated by Nutritional Status via Insulin and Sterol Regulatory Element-binding Protein 1C」,J.Biol.Chem.,281：6211-6218,2006)中，其以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，向患有糖尿病、腹部主動脈瘤(abdominal aortic aneurysm)、動脈粥樣硬化及/或周邊血管疾病者投與抗原結合蛋白以使其血清膽固醇含量降低至較安全範圍。在一些實施例中，向處於顯現本文所述之任何疾病之風險中的患者投與抗原結合蛋白。在一些實施例中，向吸菸、患有高血壓或早期心臟病發作之家族性病史之個體投與ABP。
在一些實施例中，根據2004 NCEP治療目標，若個體處於中度或較高風險中，則向個體投與ABP。在一些實施例中，若個體之LDL膽固醇含量大於160mg/dl，則向個體投與ABP。在一些實施例中，若個體LDL膽固醇含量大於130(且根據2004 NCEP治療目標，其具有中度或中等高風險)，則投與ABP。在一些實施例中，若個體LDL膽固醇含量大於100(且根據2004 NCEP治療目標，其具有較高或極高風險)，則投與ABP。
醫師將能夠視特定患者之個別概況來選擇適當治療指標及目標脂質含量。用於指導高脂質血症之治療之一種良好認可之標準為Third Report of the National Cholesterol Education Program(NCEP)Expert Panel on Detection,Evaluation,and Treatment of the High Blood Cholesterol in Adults(Adult Treatment Panel III)Final Report,National Institutes of Health,NIH出版號02-5215(2002)，其印刷公開案以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，使用針對PCSK9之抗原結合蛋白使PCSK9活性量自異常高位準或甚至正常位準降低。在一些實施例中，使用針對PCSK9之抗原結合蛋白治療或預防高膽固醇血症及/或用其製備藥劑 及/或用於其他膽固醇相關病症(諸如本文中提及之病症)。在某些實施例中，使用針對PCSK9之抗原結合蛋白治療或預防PCSK9活性正常之病狀，諸如高膽固醇血症。在該等病狀中，例如PCSK9活性降低至正常活性以下可提供治療效應。
在一些實施例中，使用一種以上針對PCSK9之抗原結合蛋白以調節PCSK9活性。
在某些實施例中，提供治療膽固醇相關病症(諸如高膽固醇血症)之方法，其包含投與治療有效量之一或多種針對PCSK9之抗原結合蛋白及另一種治療劑。
在某些實施例中，僅投與針對PCSK9之抗原結合蛋白。在某些實施例中，在投與至少一種其他治療劑之前投與針對PCSK9之抗原結合蛋白。在某些實施例中，與投與至少一種其他治療劑同時投與針對PCSK9之抗原結合蛋白。在某些實施例中，在投與至少一種其他治療劑之後投與針對PCSK9之抗原結合蛋白。在其他實施例中，在投藥至少一種其他治療劑之前投與針對PCSK9之抗原結合蛋白。治療劑(除抗原結合蛋白外)包括(但不限於)至少一種其他降膽固醇(血清及/或總體膽固醇)劑或試劑。在一些實施例中，藥劑增加LDLR之表現、已觀測到增加血清HDL含量、降低LDL含量或降低三酸甘油酯含量。例示性治療劑包括(但不限於)士他汀(阿伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、羅素他汀、辛伐他汀)、菸鹼酸(菸酸)(NIACOR、Niaspan(緩慢釋放菸酸)、Slo-菸酸(緩慢釋放菸酸))、纖維酸(Lopid(吉非羅齊(Gemfibrozil))、Tricor(非諾貝特(fenofibrate))、膽汁酸錯隔劑(降膽敏(Questran)(消膽胺(cholestyramine))、考來維侖(colesevelam)(Welchol)、Colestid(考來替潑(colestipol)))、膽固醇吸收抑制劑(澤替亞(Zetia)(依澤替米貝(ezetimibe)))、菸鹼酸與士他汀之組合(Advicor(洛伐他汀及尼亞斯潘 (niaspan)))、士他汀與吸收抑制劑之組合(Vytorin(珠克爾(Zocor)及澤替亞))及/或脂質改良劑。在一些實施例中，ABP與以下試劑組合：PPAR γ促效劑、PPAR α/γ促效劑、角鯊烯合成酶抑制劑、CETP抑制劑、抗高血壓劑、抗糖尿病劑(諸如磺醯基脲、胰島素、GLP-1類似物、DDPIV抑制劑)、ApoB調節劑、MTP抑制劑及/或閉塞性動脈硬化治療劑。在一些實施例中，ABP與增加個體之LDLR蛋白含量之藥劑，諸如士他汀、某些細胞激素樣抑瘤素(oncostatin)M、雌激素及/或某些草本成分(諸如小檗鹼(berberine))組合。在一些實施例中，ABP與增加個體之血清膽固醇含量之藥劑(諸如某些抗精神病藥劑、某些HIV蛋白酶抑制劑、膳食要素(諸如高果糖、蔗糖、膽固醇或某些脂肪酸)及RXR、RAR、LXR、FXR之某些核受體促效劑及拮抗劑)組合。在一些實施例中，ABP與增加個體之PCSK9含量之藥劑，諸如士他汀及/或胰島素組合。兩者之組合可使其他藥劑之不合需要之副作用由ABP緩解。如熟習此項技術者將瞭解，在一些實施例中，ABP與其他藥劑/化合物組合。在一些實施例中，同時投與ABP及其他藥劑。在一些實施例中，ABP及其他藥劑不同時投與，其中ABP係在投與藥劑之前或之後投與。在一些實施例中，個體在病症之相同預防、發作期及/或療程期間接受ABP及另一種藥劑(其增加LDLR含量)。
本發明之醫藥組合物可以組合治療形式(意即與其他藥劑組合)來投藥。在某些實施例中，組合療法包含能夠結合PCSK9之抗原結合蛋白與至少一種抗膽固醇藥劑組合。藥劑包括(但不限於)活體外以合成方式製備之化學組合物、抗體、抗原結合區域以及其組合及結合物。在某些實施例中，藥劑可充當促效劑、拮抗劑、立體異位調節劑或毒素。在某些實施例中，藥劑可起抑制或刺激其目標之作用(例如受體或酶活化或抑制)，且藉此促進LDLR之表現增加或降低血清膽固醇含量。
在某些實施例中，針對PCSK9之抗原結合蛋白可在用降膽固醇(血清及/或總膽固醇)劑治療之前、同時及之後投與。在某些實施例中，針對PCSK9之抗原結合蛋白可防治性投與以防止或減緩高膽固醇血症、心臟病、糖尿病及/或任何膽固醇相關疾病之發作。在某些實施例中，可投與針對PCSK9之抗原結合蛋白以治療現有高膽固醇血症病狀。在一些實施例中，ABP延遲疾病及/或與疾病相關之症狀之發作。在一些實施例中，向不存在任一種膽固醇相關疾病或其子組之任何症狀的個體提供ABP。
在某些實施例中，針對PCSK9之抗原結合蛋白與特定治療劑一起用於治療各種膽固醇相關疾病，諸如高膽固醇血症。在某些實施例中，鑒於病狀及所要治療程度，可投與兩種、三種或三種以上藥劑。在某些實施例中，此等藥劑可藉由包括在同一調配物中一起提供。在某些實施例中，此(等)藥劑及針對PCSK9之抗原結合蛋白可藉由包括在同一調配物中一起提供。在某些實施例中，此等藥劑可單獨調配且藉由包括在治療套組中一起提供。在某些實施例中，此等藥劑及針對PCSK9之抗原結合蛋白可單獨調配且藉由包括在治療套組中一起提供。在某些實施例中，此等藥劑可單獨提供。在某些實施例中，當由基因療法投與時，相同載體中可包括基因編碼蛋白質試劑及/或針對PCSK9之抗原結合蛋白。在某些實施例中，基因編碼蛋白質試劑及/或針對PCSK9之抗原結合蛋白可受相同啟動子區域控制。在某些實施例中，基因編碼蛋白質試劑及/或針對PCSK9之抗原結合蛋白可在獨立載體中。
在某些實施例中，本發明提供醫藥組合物，其包含針對PCSK9之抗原結合蛋白以及醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑、增溶劑、乳化劑、防腐劑及/或佐劑。
在某些實施例中，本發明提供醫藥組合物，其包含針對PCSK9之 抗原結合蛋白及治療有效量之至少一其他治療劑以及醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑、增溶劑、乳化劑、防腐劑及/或佐劑。
在某些實施例中，針對PCSK9之抗原結合蛋白可與至少一種用於炎症之治療劑一起使用。在某些實施例中，針對PCSK9之抗原結合蛋白可與至少一種用於免疫疾病之治療劑一起使用。用於炎症及免疫病症之例示性治療劑包括(但不限於)1型環加氧酶(cyclooxygenase)(COX-1)及2型環加氧酶(COX-2)抑制劑；38kDa有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase)(p38-MAPK)之小分子調節劑；炎症路徑中涉及之細胞內分子之小分子調節劑，其中此等細胞內分子包括(但不限於)jnk、IKK、NF-κB、ZAP70及lck。用於炎症之某些例示性治療劑描述於例如C.A.Dinarello及L.L.Moldawer Proinflammatory and Anti-Inflammatory Cytokines in Rheumatoid Arthritis：A Primer for Clinicians第三版(2001)Amgen Inc.Thousand Oaks,CA中。
在某些實施例中，醫藥組合物將包括一種以上針對PCSK9之不同抗原結合蛋白。在某些實施例中，醫藥組合物將包括一種以上針對PCSK9之抗原結合蛋白，其中針對PCSK9之抗原結合蛋白結合一個以上抗原決定基。在一些實施例中，各種抗原結合蛋白將不彼此競爭結合PCSK9。在一些實施例中，表2及圖2及/或圖3中描繪之任一種抗原結合蛋白均可在醫藥組合物中組合在一起。
在某些實施例中，可接受之調配物質較佳在所採用之劑量及濃度下對接受者無毒。在一些實施例中，調配物質係用於皮下(s.c.)及/或靜脈內(I.V.)投藥。本發明之醫藥組合物可包含調配物質供修飾、維持或保存(例如)該組合物之pH值、容積滲透濃度、黏度、澄清度、顏色、等張性、氣味、無菌度、穩定性、溶解或釋放速率、吸附或穿透。在某些實施例中，適合之調配材料包括(但不限於)胺基酸(諸如甘 胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、精胺酸或離胺酸)；抗菌劑；抗氧化劑(諸如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉)；緩衝劑(諸如硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽、其他有機酸)；膨化劑(諸如甘露醇或甘胺酸)、螯合劑(諸如乙二胺四乙酸(EDTA))；錯合劑(諸如咖啡鹼、聚乙烯吡咯啶酮、β-環糊精或羥丙基-β-環糊精)；填充劑；單醣，雙醣及其他碳水化合物(諸如葡萄糖、甘露糖及糊精)；蛋白質(諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)；著色劑；調味劑及稀釋劑；乳化劑；親水性聚合物(諸如聚乙烯吡咯啶酮)；低分子量多肽；成鹽平衡離子(諸如鈉)；防腐劑(諸如氯化苯甲烴銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、沙威隆(chlorhexidine)、山梨酸或過氧化氫)；溶劑(諸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(諸如甘露醇或山梨糖醇)；懸浮劑；界面活性劑或濕潤劑(諸如普流尼克(pluronic)類、PEG、脫水山梨糖醇酯、諸如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80之聚山梨醇酯、氚核、緩血酸胺(tromethamine)、卵磷酯、膽固醇、替洛沙哌(tyloxapal))；穩定性增強劑(蔗糖或山梨糖醇)；張力增強劑(諸如鹼金屬鹵化物(較佳為氯化鈉或氯化鉀、甘露醇、山梨糖醇))；傳遞媒劑；稀釋劑；賦形劑及/或醫藥佐劑(Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，A.R.Gennaro編，Mack Publishing Company(1995))。在一些實施例中，調配物包含PBS；20mM NaOAC，pH 5.2；50mM NaCl及/或10mM NAOAC，pH 5.2；9%蔗糖。
在某些實施例中，針對PCSK9之抗原結合蛋白及/或治療性分子連接至此項技術中已知的半衰期延長媒劑。該等媒劑包括(但不限於)聚乙二醇、肝糖(例如ABP之糖基化作用)及聚葡萄糖。該等媒劑例如描述於美國申請案第09/428,082號(現為美國專利第6,660,843號)及公開PCT申請案第WO 99/25044號中，其以引用的方式併入本文中以用 於任何目的。
在某些實施例中，最佳的醫藥組合物將由熟習此項技術者視例如預期投與途徑、傳遞型式及所需劑量確定。參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences，同上。在某些實施例中，該等組合物可影響本發明之抗體之物理狀態、穩定性、活體內釋放速率及活體內清除速率。
在某些實施例中，醫藥組合物中之主要媒劑或載劑可本質上為水性或非水性。舉例而言，在某些實施例中，適合媒劑或載劑可為注射用水、生理食鹽水溶液或人工腦脊髓液，其可補充有用於非經腸投藥之組合物中常用的其他物質。在一些實施例中，生理食鹽水包含等張磷酸鹽緩衝鹽水。在某些實施例中，中性緩衝鹽水或生理食鹽水與血清白蛋白之混合物亦為例示性媒劑。在某些實施例中，可藉由將具有所需純度之所選組合物與視情況選用之調配劑(Remington's Pharmaceutical Sciences，同上)以凍乾塊狀物或水溶液形式混合來製備用於儲存器之包含針對PCSK9之抗原結合蛋白的組合物(具有或不具有至少一種其他治療劑)。此外，在某些實施例中，可使用適當賦形劑(諸如蔗糖)將包含針對PCSK9之抗原結合蛋白的組合物(具有或不具有至少一種其他治療劑)調配為凍乾產物。
在某些實施例中，可選擇醫藥組合物用於非經腸傳遞。在某些實施例中，可選擇組合物用於吸入或用於經消化道(諸如經口)傳遞。該等醫藥學上可接受之組合物之製備方法屬於熟習此項技術者之能力範疇內。
在某些實施例中，調配物組分以投藥位點可接受之濃度存在。在某些實施例中，緩衝劑係用以將組合物維持於生理pH值或略微較低之pH值，通常在約5至約8之pH值範圍內。
在某些實施例中，當預期非經腸投藥時，治療調配物可呈無熱 原質、非經腸可接受之水溶液形式，其包含針對PCSK9之所需抗原結合蛋白連同或不連同其他治療劑一起於醫藥學上可接受之媒劑中。在某些實施例中，用於非經腸注射之媒劑為針對PCSK9之抗原結合蛋白連同或不連同至少一種其他治療劑一起於其中調配成經適當防腐之無菌等張溶液之無菌蒸餾水。在某些實施例中，製備可涉及所要分子與可使產品控制或持續釋放因而該產品可經由儲槽式注射傳遞的試劑，諸如可注射微球體、生物可侵蝕粒子、聚合化合物(諸如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂質體一起調配。在某些實施例中，亦可使用玻尿酸(hyaluronic acid)，且其可具有促進在循環中之持續時間的作用。在某些實施例中，可植入藥物傳遞裝置可用於引入所需分子。
在某些實施例中，可調配用於吸入之醫藥組合物。在某些實施例中，針對PCSK9之抗原結合蛋白可連同或不連同至少一種其他治療劑一起調配成用於吸入之乾燥粉末。在某些實施例中，包含針對PCSK9之抗原結合蛋白連同或不連同至少一種其他治療劑之吸入溶液可與推進劑一起調配以用於氣霧劑傳遞。在某些實施例中，溶液可經噴霧。經肺投藥進一步描述於PCT申請案第PCT/US94/001875號中，該案描述經肺傳遞經化學修飾之蛋白質。
在某些實施例中，預期某些調配物可經口投與。在某些實施例中，可在存在或不存在製備固體劑型(諸如錠劑及膠囊)時常用載劑的情況下調配以此方式投藥之針對PCSK9之抗原結合蛋白(具有或不具有至少一種其他治療劑)。在某些實施例中，可設計膠囊以於胃腸道中生物可用性最大且體循環前降解最小時之時刻釋放調配物之活性部分。在某些實施例中，可包括至少一種其他試劑以促進針對PCSK9之抗原結合蛋白及/或任何其他治療劑之吸收。在某些實施例中，亦可使用稀釋劑、調味劑、低熔點蠟、植物油、潤滑劑、懸浮劑、錠劑崩解劑及黏合劑。
在某些實施例中，醫藥調配物可涉及有效量之針對PCSK9之抗原結合蛋白連同或不連同至少一種其他治療劑一起與適於製造錠劑之無毒賦形劑混合。在某些實施例中，藉由將錠劑溶解於無菌水或另一種適當媒劑中，可製備呈單位劑量形式之溶液。在某些實施例中，適合賦形劑包括(但不限於)惰性稀釋劑，諸如碳酸鈣、碳酸鈉或碳酸氫鈉、乳糖或磷酸鈣；或黏合劑，諸如澱粉、明膠或阿拉伯膠(acacia)；或潤滑劑，諸如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。
熟習此項技術者將顯而易知其他醫藥調配物，包括呈持續或控制傳遞調配物形式之涉及針對PCSK9之抗原結合蛋白連同或不連同至少一種其他治療劑的調配物。在某些實施例中，熟習此項技術者亦已知用於調配多種其他持續或控制傳遞工具(諸如脂質體載劑、生物易侵蝕微粒或多孔珠粒及積存注射劑)之技術。參見例如PCT申請案第PCT/US93/00829號，其描述用於傳遞醫藥組合物之多孔聚合微粒之控制釋放。在某些實施例中，持續釋放製劑可包括呈特型製品形式之半滲透性聚合物基質，例如薄膜或微膠囊。持續釋放基質可包括聚酯、水凝膠、聚丙交酯(U.S.3,773,919及EP 058,481)、L-麩胺酸與γ乙基-L-麩胺酸酯之共聚物(Sidman等人，Biopolymers,22：547-556(1983))、聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.,15：167-277(1981)及Langer,Chem.Tech.,12：98-105(1982))、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，同上)或聚-D(-)-3-羥基丁酸(EP 133,988)。在某些實施例中，持續釋放組合物亦可包括脂質體，其可藉由此項技術中已知的若干種方法中之任一種製備。參見例如Eppstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82：3688-3692(1985)；EP 036,676；EP 088,046及EP 143,949。
用於活體內投藥之醫藥組合物通常為無菌的。在某些實施例中，此可藉由經無菌濾膜過濾來達成。在某些實施例中，當將組合物 凍乾時，使用此方法之滅菌可在凍乾及復原之前或之後進行。在某些實施例中，用於非經腸投藥之組合物可以凍乾形式或溶液形式儲存。在某些實施例中，一般將非經腸組合物置於具有無菌取用口之容器中，例如具有可由皮下注射針穿透之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶中。
在某些實施例中，一旦醫藥調配物已經調配，其即可以溶液、懸浮液、凝膠劑、乳液、固體形式或以脫水或凍乾粉末形式儲存於無菌小瓶中。在某些實施例中，此等調配物可以即用形式或以在投藥之前復原之形式(例如凍乾形式)儲存。
在某些實施例中，提供用於產生單一劑量投藥單元之套組。在某些實施例中，套組可含有具有乾燥蛋白質之第一容器與具有水性調配物之第二容器兩者。在某些實施例中，包括含有單腔室及多腔室預填充注射器(例如液體注射器及溶解注射器(lyosyringe))之套組。
在某些實施例中，欲在治療上採用的包含針對PCSK9之抗原結合蛋白連同或不連同至少一種其他治療劑之醫藥調配物的有效量將例如視治療情形及對象而定。熟習此項技術者應瞭解根據某些實施例之適當治療劑量因此將部分地視所傳遞之分子、針對PCSK9之抗原結合蛋白所針對之適應症、使用或不使用至少一種其他治療劑、投藥途徑、及患者之尺寸(體重、體表或器官尺寸)及/或狀況(年齡及總體健康狀況)而變化。在某些實施例中，臨床醫師可滴定劑量並修改投藥途徑以獲得最佳治療效應。在某些實施例中，視以上所提及之因素而定，典型劑量可在約0.1μg/kg至約100mg/kg或100mg/kg以上範圍內。
在某些實施例中，給藥頻率將考慮針對PCSK9之抗原結合蛋白及/或所用調配物中任何其他治療劑之藥物動力學參數。在某些實施例中，臨床醫師將投與組合物直至達到獲得所需作用之劑量。在某些實施例中，組合物可由此以單次劑量投與，或隨時間以兩次或兩次以上劑量投與(其可或可不含有相同量之所需分子)，或經由植入裝置或導 管以連續輸注形式投與。適當劑量之進一步改進由一般熟習此項技術者按常規進行且在其常規進行之工作範圍內。在某些實施例中，可經由使用適當劑量-反應資料確定適當劑量。在一些實施例中，投藥之量及頻率可慮及欲獲得之所要膽固醇含量(血清及/或總體)及個體之當前膽固醇含量、LDL含量及/或LDLR含量，其皆可藉由熟習此項技術者熟知之方法獲得。
在某些實施例中，醫藥組合物之投藥途徑與已知方法一致，例如經口；經靜脈內、腹膜內、腦內(實質內)、腦室內、肌肉內、皮下地、眼內、動脈內、門靜脈內或病灶內注射途徑；藉由持續釋放系統或藉由植入裝置。在某些實施例中，可藉由快速注射或藉由連續輸液或藉由植入設備投與該等組合物。
在某些實施例中，可經植入上面已吸收或封裝有所需分子之薄膜、海綿或另一適合物質來局部投與組合物。在某些實施例中，當使用植入裝置時，該裝置可植入任何適合組織或器官中，且所要分子之傳遞可經由擴散、定時釋放推注或連續投藥來達成。
在某些實施例中，需要以離體方式使用包含針對PCSK9之抗原結合蛋白的醫藥組合物(具有或不具有至少一種其他治療劑)。在該等實例中，將自患者移出之細胞、組織及/或器官暴露於包含針對PCSK9之抗原結合蛋白的醫藥組合物(具有或不具有至少一種其他治療劑)，隨後將該等細胞、組織及/或器官植入回患者中。
在某些實施例中，可使用諸如本文中所描述之方法，藉由植入某些經遺傳工程改造以表現及分泌多肽之細胞來傳遞針對PCSK9之抗原結合蛋白及/或任何其他治療劑。在某些實施例中，該等細胞可動物或人類細胞，且可為自體、異源或異種細胞。在某些實施例中，細胞可經永生化。在某些實施例中，為降低免疫學反應之機率，可將細胞封裝以避免周圍組織之浸潤。封裝物質通常為生物相容、半滲透之 聚合殼或膜，其容許該(等)蛋白質產物之釋放但防止病人免疫系統或其他來自周圍組織之有害因子破壞該等細胞。
基於ABP顯著中和PCSK9活性之能力(如以下實例中證明)，此等ABP將在治療及預防由PCSK9介導之活性引起的症狀及病狀(諸如高膽固醇血症)中具有治療性作用。
診斷應用
在一些實施例中，ABP用作診斷工具。ABP可用於分析樣品及/或個體中存在之PCSK9之量。如熟習此項技術者所應瞭解，此等ABP無需為中和性ABP。在一些實施例中，診斷用ABP不為中和性ABP。在一些實施例中，診斷用ABP結合的抗原決定基不同於中和性ABP所結合之抗原決定基。在一些實施例中，兩種ABP不彼此競爭。
在一些實施例中，本文揭示之ABP用於或提供於用於偵測哺乳動物組織或細胞中之PCSK9之分析套組及/或方法中以篩選/診斷與PCSK9之含量變化相關之病症或疾病。套組包含結合PCSK9之ABP及指示ABP與PCSK9結合(若存在)及視情況PCSK9蛋白含量之工具。可使用指示ABP之存在之各種工具。舉例而言，螢光團、其他分子探針或酶可連接於ABP且可以多種方式觀測ABP之存在。篩選此等疾病之方法可涉及使用套組，或僅使用一種揭示之ABP並確定ABP是否結合樣品中之PCSK9。如熟習此項技術者所應瞭解，較高或升高之PCSK9含量將導致較大量之ABP與樣品中之PCSK9結合。因此，ABP結合程度可用於確定樣品中存在多少PCSK9。PCSK9之量大於預定量(例如未患有PCSK9相關疾病之人士將具有之量或範圍)之個體或樣品可表徵為患有PCSK9介導之疾病。在一些實施例中，向服用士他汀之個體投與ABP以確定士他汀是否已使個體之PCSK9之量增加。
在一些實施例中，ABP為非中和性ABP且用於測定接受ABP及/或士他汀治療之個體之PCSK9的量。
實例
以下實例(包括進行之實驗及所獲得之結果)係僅出於說明性目的提供且不應視為限制。
實例1 產生抗PCSK9抗體及融合瘤
在XenoMouse®小鼠(Abgenix,Fremont,CA)中產生包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之胺基酸31至692的針對自身裂解、成熟、分泌型PCSK9之抗體，XenoMouse®小鼠為含有人免疫球蛋白基因之小鼠。將包括以下之XenoMouse®品系用於免疫：XMG2KL、XMG4KL、XMG2/K及XMG4/K。使用GenBank序列作為參考(NM_174936)，使用標準重組型技術製備PCSK9。
向各小鼠注射總共10μg抗原，其腹膜內傳遞至腹部中。後續增強免疫為5μg劑量且注射法在腹膜內注射至腹部與在尾巴根部皮下注射之間切換。對於腹膜內注射，用TiterMax® Gold(Sigma，目錄號T2684)將抗原製備為乳液且對於皮下注射，將抗原與明礬(磷酸鋁)及CpG寡糖混合。向每隻小鼠最終注射5μg抗原，其係在磷酸緩衝鹽水(「PBS」)中傳遞且傳遞至2個位點，50%腹膜內傳遞至腹部中且50%在尾巴根部皮下傳遞。向小鼠注射抗原八至十一次。
接著使用如下效價方案監測小鼠之抗PCSK-9特異性免疫反應：用中性鏈親和素(neutravadin)以8μg/ml(50微升/孔)塗佈Costar 3368培養基結合板且在4℃下在1X PBS/0.05%疊氮化合物中培育隔夜。使用TiterTek洗滌(用逆滲透純化(「RO」)水3次循環洗滌)。板用250μl 1X PBS/1%牛乳阻斷且在室溫(「RT」)下培育至少30分鐘。使用TiterTek洗去阻斷物(用RO水3次循環洗滌)。在1X PBS/1%牛乳/10mM Ca2+(分析稀釋劑)(50微升/孔)中以2μg/ml捕捉生物素化(b)-人類PCSK9且在室溫下培育1小時。使用TiterTek洗去未結合之b-PCSK9(用RO水3 次循環洗滌)。對於初級抗體，一式兩份地自1：100以1：3滴定血清。此係在分析稀釋劑(50微升/孔)中進行且在室溫下培育1小時，且接著使用TiterTek洗滌(用RO水3次循環洗滌)。二級抗體為山羊抗人類IgG Fc HRP，每毫升分析稀釋劑中400奈克，50微升/孔。在室溫下培育1小時。接著使用TiterTek洗滌(用RO水3次循環洗滌)且在紙巾上輕拍乾燥。對於受質，使用單步驟型TMB溶液(Neogen,Lexington,Kentucky)(50微升/孔)且其在室溫下培育30分鐘。用於偵測板結合之PCSK9的陽性對照物為可溶性LDL受體(R&D Systems，目錄號2148LD/CF)及多株兔抗PCSK9抗體(Caymen Chemical #10007185)，其在分析稀釋劑中一式兩份地自3μg/ml以1：3滴定。用山羊抗LDLR(R&D Systems，目錄號AF2148)及兔抗山羊IgGFc HRP在400ng/ml之濃度下偵測LDLR；用山羊抗兔IgG Fc在分析稀釋劑中於400ng/ml之濃度下偵測兔多株抗體。陰性對照物為未經處理之XMG2-KL及XMG4-KL血清，其在分析稀釋劑中一式兩份地自1：100以1：3滴定。
對於如所描述用可溶性抗原免疫之小鼠，藉由ELISA分析法測試針對人類PCSK9之抗體之效價。收集經鑑別具有升高之針對PCSK9之特異性免疫反應的動物且用於抗體產生。進行多輪抗體產生以產生用於選擇本文中所描述之抗體的面板。
實例2 回收淋巴細胞、B細胞分離物、融合物及產生融合瘤
此實例概述如何回收免疫細胞及產生融合瘤。藉由頸椎脫位處死經免疫之小鼠，且自各群組獲取及收集引流淋巴結。藉由在DMEM中研磨以使細胞自組織釋放來使B細胞自淋巴組織分離，且細胞懸浮於DMEM中。對細胞進行計數，且向細胞小球中添加每1億個淋巴細胞0.9ml DMEM以使細胞逐漸但完全再懸浮。
將淋巴細胞與自ATCC購買之非分泌型骨髓瘤P3X63Ag8.653細胞 (目錄號CRL 1580)(Kearney等人，(1979)J.Immunol.123,1548-1550)以1：4之比率混合。藉由在400 x g下離心4分鐘將細胞混合物溫和造粒。在傾析上清液後，細胞使用1ml吸管溫和混合。經1分鐘緩慢添加經預先加熱之來自Sigma之PEG/DMSO溶液(目錄號P7306)(每1百萬個B細胞1ml)同時溫和攪拌，接著進行1分鐘混合。接著經2分鐘添加經預先加熱之IDMEM(每1百萬個B細胞2ml)(不含麩醯胺酸、L-麩醯胺酸、pen/鏈球菌、MEM非必需胺基酸)(均來自Invitrogen)同時溫和攪拌。最終經3分鐘添加經預先加熱之IDMEM(每106個B細胞8ml)。
融合細胞在400 x g下減速旋轉6分鐘且以每1百萬個B細胞再懸浮於20ml選擇培養基DMEM(Invitrogen)、15% FBS(Hyclone)(補充有L-麩醯胺酸、pen/鏈球菌、MEM非必需胺基酸、丙酮酸鈉、2-巰基乙醇(均來自Invitrogen)、HA-偶氮絲胺酸次黃嘌呤及OPI(丁酮二酸酯、丙酮酸酯、牛胰島素)(均來自Sigma)及IL-6(Boehringer Mannheim))中。細胞在37℃下培育20-30分鐘且接著再懸浮於200ml選擇培養基中且在T175燒瓶中培養3-4天，隨後進行96孔塗佈。因此，產生融合瘤，其產生針對PCSK9之抗原結合蛋白。
實例3 選擇PCSK9抗體
本實例概述如何表徵及選擇各種PCSK9抗原結合蛋白。評估所分泌之針對PCSK9之抗體(由實例1及2中產生之融合瘤產生)之結合。基於以下特徵中之一或多者選擇抗體；結合資料、對PCSK9與LDLR結合之抑制、pH值敏感性結合、結構域特異性結合及親和力。
首次篩檢
進行結合於野生型PCSK9之抗體之首次篩檢。對兩批收集物進行首次篩檢。首次篩檢包含ELISA分析法且使用以下方案進行：使用Costar 3702培養基結合384孔板(Corning Life Sciences)。用 1X PBS/0.05%疊氮化合物中4μg/ml濃度之中性鏈親和素塗佈板，體積為40微升/孔。板在4℃下培育隔夜。接著板使用Titertek板洗滌器(Titertek,Huntsville,AL)洗滌。進行3次循環洗滌。板用90μl 1X PBS/1%牛乳阻斷且在室溫下培育約30分鐘。接著洗滌板。再進行3次循環洗滌。捕捉樣品經PCSK9生物素化且以40微升/孔之體積在1X PBS/1%牛乳/10mM Ca2+中以0.9μg/ml添加。接著板在室溫下培育1小時。接著，板使用Titertek板洗滌器洗滌，使用3次循環洗滌操作。將10μl上清液轉移至40μl 1X PBS/1%牛乳/10mM Ca2+中且在室溫下培育1.5小時。板再使用Titertek板洗滌器洗滌，使用3次循環洗滌操作。於1X PBS/1%牛乳/10mM Ca2+中100ng/ml(1：4000)之濃度之山羊抗人類IgG Fc POD以40微升/孔添加至板中且在室溫下培育1小時。使用3次循環洗滌再一次洗滌板。最終，單步驟型TMB(Neogen,Lexington,Kentucky)以40微升/孔添加至板中且在室溫下30分鐘後，每孔用40微升1N鹽酸進行淬滅。使用Titertek板讀取器在450nm下立即讀取OD。將具有比陰性對照上清液之平均信號大三倍之信號的上清液測定為陽性黏合劑。陰性對照之平均信號為0.092。五種所選抗體之此實驗之結果提供於以下表30A中。
多輪免疫、融合瘤產生及首次篩檢引起發現8306種抗原特異性融合瘤之鑑別。接著對面板進行阻斷LDLR結合相互作用之能力的篩檢。
大規模受體配體阻斷篩檢
為篩檢阻斷結合於LDLR之PCSK9的抗體，使用D374Y PCSK9突變體進行分析法。用突變體進行此分析法係因為其對LDLR較高具有結合親和力，從而允許進行敏感性更高的受體配體阻斷分析法。在受體配體阻斷篩檢中使用以下方案：在篩檢中使用Costar 3702培養基結合384孔板(Corning Life Sciences)。用於1X PBS/0.05%疊氮化合物中2μg/ml之山羊抗LDLR(R&D目錄號AF2148)以40微升/孔之體積塗佈板。板在4℃下培育隔夜。接著板使用Titertek板洗滌器(Titertek,Huntsville,AL)洗滌。進行3次循環洗滌。板用90μl 1X PBS/1%牛乳阻斷且在室溫下培育約30分鐘。接著板使用Titertek板洗滌器洗滌。進行3次循環洗滌。捕捉樣品為LDLR(R&D，目錄號2148LD/CF)，且於1X PBS/1%牛乳/10mM Ca2+中之0.4μg/ml以40微升/孔之體積添加。接著板在室溫下培育1小時10分鐘。同時，20ng/ml生物素化人類D374Y PCSK9與15微升融合瘤耗盡上清液一起於Nunc聚丙烯板中培育且耗盡上清液濃度以1：5稀釋。接著板在室溫下預先培育約1小時30分鐘。接著，板使用Titertek板洗滌器洗滌，使用3次循環洗滌操作。將每孔50微升預先培育之混合物轉移至經LDLR塗佈之ELISA板上且在室溫下培育1小時。為偵測LDLR結合之b-PCSK9，每孔40微升抗生蛋白鏈菌素HRP以於分析稀釋劑中500ng/ml添加至板中。板在室溫下培育1小時。板再使用Titertek板洗滌器洗滌。進行3次循環洗滌。最終，將每孔40微升單步驟型TMB(Neogen,Lexington,Kentucky)添加至板中且在室溫下30分鐘後，用每孔40微升1N鹽酸淬滅。使用Titertek板讀取器在450nm下立即讀取OD。b-PCSK9之最大結合由陰性對照融合瘤上清液之平均信號定義。抑制%計算為；抑制%=1-(Ab上清液+b-PCSK9之OD/陰性對照上清液+b-PCSK9之OD)。篩檢鑑別出384種阻斷PCSK9與LDLR孔之間的相互作用的抗體，100種抗體強烈阻斷相互作用(OD<0.3)。此等抗體抑制PCSK9與LDLR之結合相互作用超過75%(超過75%抑制)。
所選抗體群之結果提供於以下表3B中。
實例4 pH值敏感性結合
亦篩檢8306融合瘤之板中pH值敏感性結合於PCSK9之抗體。為篩檢pH值敏感性，使用野生型PCSK9蛋白質進行ELISA結合分析法且使用以下方案進行：用於具有0.01%疊氮化鈉之1X PBS中10μg/ml之中性鏈親和素(Thermo 31000B)以40微升/孔塗佈未經處理之來自Corning Costar之384孔微量滴定板(目錄號3702)。板包埋於塑膠中，在4℃下儲存隔夜。第二天，所有步驟在環境室溫下進行，使用Titertek Atlas微板洗滌器，用逆滲透性純水洗滌板3次循環。在所有後續步驟中使用相同洗滌方案。各孔用每孔90微升1X PBS/1%牛乳阻斷至少30分鐘。洗滌後，以40微升/孔於具有10mM氯化鈣(CaCl2)之1X PBS/1%非脂肪脫脂乳中以100ng/ml捕捉生物素化人類野生型PCSK9。培育1小時，接著洗滌。人類抗人類PCSK9耗盡融合瘤培養物廢培養基在1：25、1：125及1：625最終稀釋下之結合在具有10mM CaCl2之1X PBS/1%牛乳中於pH 7.4或pH 6.0下進行。培育1小時，接著洗滌。用於具有10mM CaCl2之1X PBS/1%牛乳中100ng/ml之山羊抗人類IgG Fc HRP(Thermo P31413)進行結合之人類抗體之偵測。培育1小時，接著添加發色受質TMB(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺)，40微升/孔且培育30分鐘，接著用一莫耳鹽酸停止。用Multiskan Ascent讀取器在450nm下讀取光密度。
所選抗體之結果提供於以下表40中。
實例5 抗體重鏈及輕鏈之序列分析
接著藉由Sanger(雙脫氧法)核苷酸定序測定上述抗體之輕鏈及重鏈之核酸及胺基酸序列。接著推導核酸序列之胺基酸序列。所得13G9、19A12、20D12、25B5及30D12之胺基及核酸序列呈現於本說明書之表1-4中。
實例6 產生抗PCSK9 8A3抗體變異體 熱點/協變突變體
利用8A3：PCSK9共晶體結構，使用EGAD系統(Pokala,N.及Handel,T.M.(2005)Energy functions for protein design：adjustment with protein-protein complex affinities,models for the unfolded state,and negative design of solubility and specificity.,Journal of molecular biology 347,203-27)之Interface Mutation用戶端產生8A3中之突變且計算所得△△G以指示可能降低結合能量狀態之突變。由於EGAD不會使甘胺酸殘基突變，輕鏈CDR1中之甘胺酸首先突變成丙胺酸以產生用於EGAD突變誘發掃描之結構複合物。藉由選擇所有位於PCSK9之6Å 內的8A3 CDR殘基來指示適用於突變誘發之8A3殘基。此產生用於突變誘發之19個輕鏈及15個重鏈CDR殘基，總共34個殘基。允許各殘基突變成除半胱胺酸、甘胺酸、脯胺酸及色胺酸外的所有天然殘基(以所有單一及雙重突變體組合形式)，產生144,160 8A3變異體。在EGAD計算期間，允許任何突變位點之4.5Å內之所有殘基經旋轉異構體最佳化。選擇最低△△G變異體之面板進行選殖、表現及篩檢。P2C6(SS-12687)、P2F5(SS-12686)及P1B1(SS-12685)之結合動力學描述於以下實例11中且活體內資料提供於以下實例15中。
抗PCSK9抗體8A3(參見表60B中之SS-8086)經歷額外輪次的工程改造以進一步改良其親和力及pH值敏感性。藉由標準突變誘發方法將8A3之CDR區域中之特定選擇之殘基系統地變換為其他殘基。在HEK293細胞中產生各變異體且分別分析其在pH 7.4及pH 5.5下結合人類PCSK9之能力。8A3之各CDR中引起pH 7.4下改良之結合或pH 5.5下降低之結合的個別變化在下一輪工程改造中組合。
其他8A3變異體
檢驗PCSK9/8A3複合物之晶體結構以知曉8A3變異體P2C6為何對PCSK9具有較高結合親和力。P2C6在兩個CDR胺基酸處與8A3母體分子不同，LC Ser68(57)Leu及HC Ile129(107)Met。在結構中，位置68(57)位於與PCSK9中頻繁紊亂迴路(約212-222個胺基酸)緊密相鄰之區域中。Ser68(57)Leu突變藉由允許與此迴路之特異性相互作用而可給予較高的對PCSK9之親和力。為在具有異化特性之類P2C6骨架(僅8A3變異體LC Ser68(57))上產生抗體，與胺基酸68(57)緊密相鄰之選擇胺基酸突變成組胺酸。選擇用於突變之胺基酸為：LC Tyr38(35)
LC Tyr57(54)
LC Asn69(58)
LC Ser72(61)
LC Ser79(68)
LC Ser83(72)
在8A3 LC Ser68(57)Leu母體分子上產生所有單一及雙重突變組合。發現8A3變異體A01、A02及C02在pH 7.4下保持所需較高親和力之結合動力學且在pH 5.5下具有較低親和力。A01、A02及C02之結合動力學提供於表60D中。
實例7
作為實例，如表70A中所示，當8A3(SS-8086)之LC CDR2中之絲胺酸57位置變換為所有其他殘基且與HC I107M配對時，若干變異體在pH 7.4下顯示改良之結合。然而，所有變異體在pH 5.5下仍緊密結合，一些變異體之估計解離半衰期大於800秒且一些變異體之估計解離半衰期為約450秒，其比親本P2C6(SS-12687)快。
意外的是，當S57位置處之一些變化與LC CDR1處之N33F組合時，幾乎所有的變異體在pH 5.5下均顯示快速解離速率，但在pH 7.4下仍保持高親和力，如表70B中所示。
此外，產生且藉由SPR分析8A3變異體之其他組合突變體。如圖70C中所示，四種不同重鏈變異體與11種不同輕鏈變異體組合以產生大型新穎黏合劑之板。藉由SPR分析所有此等純系在pH 7.4及pH 5.5 下與huPCSK9之結合親和力。選擇8A3變異體之小板用於大規模生產及其他表徵。
所選8A3變異體之產生及表徵。
將編碼抗PCSK9 8A3(SS-8086)變異體之重鏈及輕鏈的DNA載體(pTT5)共轉染至HEK293-6E細胞中，且在6天後收集培養基，且藉由在TBS結合緩衝液中及用100mM乙酸鈉(PH=3.5)溶離而在Mabselect Sure管柱中純化。用1M Tris(pH 8.0)將pH值調節至5.5。濃縮溶離之樣品且將緩衝液變換為A52Su(10mM冰乙酸/9%蔗糖，pH 5.2)。
產生及純化所選8A3變異體之板且藉由如下基於溶液之平衡分析法量測其對人類PCSK9之結合親和力：在BIAcore上藉由溶液平衡結合分析法量測抗PCSK9抗體與人類及獼猴PCSK9之結合。使用胺偶合 (由GE Healthcare,Piscataway,NJ提供之試劑)在7000 RU之近似密度下將抗體固定於CM5晶片之第二流動細胞上。使用第一流動細胞作為背景對照。對於pH 7.4下之分析法，將1.0nM PCSK9與抗體於PBS加0.1mg/mL BSA、0.005% P20中之連續稀釋物(在0.02nM至150nM範圍內)混合且在室溫下培育4小時。對於pH 5.5下之分析法，將1.0nM PCSK9與抗體於10mM檸檬酸鈉(pH 5.5)加150mM NaCl、0.1mg/mL BSA、0.005% P20中之連續稀釋物(在0.07nM至450nM範圍內)混合且在室溫下培育4小時。藉由注射於經抗體塗佈之晶片表面上來量測混合溶液中游離PCSK9之結合。在溶液中不存在抗體情況下測定抗體表面上100% PCSK9結合信號。隨溶液中抗體濃度增加而降低之PCSK9結合反應表明PCSK9結合於抗體，阻止PCSK9結合於固定抗體表面。標繪PCSK9結合信號與抗體濃度之關係曲線，使用KinExA Pro軟體中提供之n曲線單一位點均質結合模型自競爭曲線之非線性回歸獲得KD。結果呈現於以下表70D中。
實例8 產生31H4變異體
為在具有異化特性之31H4(SS-4201)骨架上產生抗體，使選擇CDR胺基酸突變成組胺酸。在PCSK9/31H4複合結構之分析後，基於胺基酸與PCSK9之接近性選擇胺基酸。第一輪變異體產生為31H4 W113(103)H骨架上之單突變。選擇用於突變之(SS-14573)胺基酸為：LC Tyr39(33)
LC Tyr109(93)
LC Ser135(98)
HC Phe29(27)
HC Phe31(29)
HC Tyr39(32)
HC Ser61(54)
HC Ser66(56)
HC Tyr67(57)
HC Ile68(58)
HC Tyr70(60)
HC Asp72(62)
HC Ser73(63)
HC Asp109(99)
HC Tyr110(100)
HC Asp111(101)
HC Phe112(102)
HC Tyr132(106)
HC Tyr133(107)
使用基於結構之編號系統(ResidueAHo(Linear).Honegger,a及a Plückthun.「Yet Another Numbering Scheme for Immunoglobulin Variable Domains：An Automatic Modeling and Analysis Tool.」Journal of Molecular Biology 309，第3號(2001)：657-70)以及線性編號進行骨架編號。線性編號以成熟序列作為第一殘基開始，使得殘基 描繪為ResidueAHo(Linear)。使用來自第一輪變異體之結合資料指導選擇保留用於第二輪之突變。若突變在pH 7.4下保持高親和力結合，或在pH 5.5下展示較弱結合跡象但保持pH 7.4親和力，則保留該等突變。在第二輪中，在31H4 W113(103)H(SS-14573)骨架上產生所有可能雙重組合。保留用於第二輪之胺基酸係如以下表80A中列出：
實例9 抗PCSK9恆定區抗體變異體
藉由將8A3之重鏈可變域分別融合於經工程改造以延長血清半衰期之人類IgG2恆定域IgG2HLE-51及IgG2HLE112中來構築兩種8A3變異體8A3HLE51(mAb ID SS-13406)、P2C6-HLE51(mAb ID SS-14888)及8A3HLE112(mAb ID SS-13407)，如PCT/US2012/070146中所描述，其以全文引用的方式併入本文中。將編碼各8A3變異體之重鏈及輕鏈之DNA載體共轉染至人類HEK293-6E細胞中。在培養6天後收集調節培養基且藉由滲濾濃縮，且藉由MabSelect SuRe(GE Healthcare Bio-Sciences,L.L.C.,Uppsala,Sweden)管柱及用0.5%乙酸(pH 3.5)溶離來捕捉。收集之部分藉由添加1M HEPES(pH 7.9)中和且用25mM乙酸鈉(pH 5.2)稀釋。經中和之收集物用含0%-40% B之20CV(B=25 mM乙酸(pH 5.2)、1M NaCl)之線性梯度溶離，藉由SP Sepharose HP(75ml)純化。將收集之部分透析至A5Su調配緩衝液(10mM冰乙酸/9%蔗糖，pH 5.2)中。兩種變異體8A3HLE51(mAb ID SS-13406)及8A3HLE112(mAb ID SS-13407)如以下實例16中所描述進行活體內測試。
實例10 抗PCSK9 8A3變異體之結合動力學
以如下方式分析本文中實例6中描述之抗PCSK9 8A3變異體之結合動力學。為測定中性pH值下之結合動力學，使用配備有GLC感測器晶片(Bio-Rad,Hercules,CA)之ProteOn XPR36光學生物感測器(Bio-Rad,Hercules,CA)在HBS-P緩衝液系統(10mM HEPES pH 7.4、150mM NaCl及0.05%界面活性劑P20)中於25℃下進行生物感測器分析。使用山羊抗人類IgG捕捉抗體(Jackson Laboratories；109-005-098)製備晶片表面，該捕捉抗體使用標準胺偶合化學法在感測器晶片之水平方向上固定至所有通道以達到5,000-6,000 RU之水準。此表面類型提供在各再生步驟後可再現地捕捉新鮮分析抗體(配體)之格式。將抗PCSK9 8A3變異體及對照抗PCSK9 8A3在垂直方向上捕捉至通道1-6(約100-150 RU)。將於操作緩衝液中在100至1.23nM濃度範圍內之五種rhu PCSK9(3倍稀釋物)在水平方向上同時注射於晶片表面上。在五種分析物濃度下同時進行空白(緩衝液)注射且用於評估及減去系統假影。在50微升/分鐘之流速下監測締合相300秒，而在50微升/分鐘之流速下監測解離相1800秒。表面用10mM甘胺酸(pH 1.5)在50微升/分鐘之流速下再生30秒。使用ProteOn Manager 3.1.0版3.1.06©軟體(Bio-Rad,Hercules,CA)對資料進行對準、雙重參考且擬合簡易1：1結合模型。
為測定酸性pH值下之估計複合物半衰期，使用類似方法，其使 用HBS-P緩衝液系統(10mM HEPES pH 5.5、150mM NaCl、0.05%界面活性劑P20及1mg/ml BSA)。使用ProteOn Manager 3.1.0版3.1.06©軟體(Bio-Rad,Hercules,CA)對資料進行對準及雙重參考，且變異體使用已知複合物半衰期之對照抗體8A3親本(SS-8086)、P1B1(SS-12685)、P2F5(SS-12686)及P2C6(SS-12687)定性歸類。
除pH 5.5、25℃下之估計複合物半衰期外，亦測定pH 7.4、25℃下，huPCSK9與抗PCSK9 8A3變異體之結合的締合及解離動力學結合常數(ka、kd)以及解離平衡結合常數(Kd)。抗PCSK9 8A3變異體在pH 7.4下之親和力(Kd)及估計複合物半衰期展示於圖1及2中。完全動力學資料展示於表10A及10B中。
實例11 抗PCSK9 8A3熱點變異體之結合動力學 首次篩檢
為測定huPCSK9與如本文中實例7中所描述產生之8A3 EGAD變異體結合之結合動力學，使用配備有GLC感測器晶片(Bio-Rad,Hercules,CA)之ProteOn XPR36光學生物感測器在HBS-EP緩衝液系統(10mM HEPES pH 7.4、150mM NaCl、3.0mM EDTA及0.05%界面活性劑P20)中於25℃下進行初始SPR篩檢。使用山羊抗人類IgG捕捉抗體(Jackson Laboratories；109-005-098)製備晶片表面，該捕捉抗體使用標準胺偶合化學法在感測器晶片之水平方向上固定至所有通道以達到5,000-6,000 RU之水準。此表面類型提供在各再生步驟後可再現地捕捉新鮮分析抗體(配體)之格式。將8A3變異體及對照抗PCSK9 8A3在垂直方向上捕捉至通道1-6(約100-150 RU)。將於操作緩衝液中在100至1.23nM濃度範圍內之五種重組型hu PCSK9(3倍稀釋物)在水平 方向上同時注射於晶片表面上。在五種分析物濃度下同時進行空白(緩衝液)注射且用於評估及減去系統假影。在50微升/分鐘之流速下監測締合相300秒，而在50微升/分鐘之流速下監測解離相1800秒。表面用10mM甘胺酸(pH 1.5)在50微升/分鐘之流速下再生30秒。使用ProteOn Manager 3.1.0版3.1.06©軟體(Bio-Rad,Hercules,CA)對資料進行對準、雙重參考且擬合簡易1：1結合模型。
由192種抗PCSK9 8A3 EGAD變異體之初始SPR篩檢，與親本8A3相比，8種變異體顯示緊密結合，較低K d ，如表11A中所示。此外，與親本8A3相比，8種變異體顯示相當的結合。
二次篩檢
在SPR篩檢中測定huPCSK9與首次篩檢中鑑別之八種8A3 EGAD變異體(實例XXX)結合之結合動力學，該SPR篩檢係使用配備有GLC感測器晶片(Bio-Rad,Hercules,CA)之ProteOn XPR36光學生物感測器在HBS-EP緩衝液系統(10mM HEPES pH 7.4、150mM NaCl、3.0mM EDTA及0.05%界面活性劑P20)中於25℃下進行。使用山羊抗人類IgG捕捉抗體(Jackson Laboratories；109-005-098)製備晶片表面，該捕捉抗體使用標準胺偶合化學法在感測器晶片之水平方向上固定至所有通 道以達到5,000-6,000 RU之水準。此表面類型提供在各再生步驟後可再現地捕捉新鮮分析抗體(配體)之格式。將8A3變異體及對照抗PCSK9 8A3在垂直方向上捕捉至通道1-6(約100-150 RU)。將於操作緩衝液中在33至0.411nM濃度範圍內之五種rhu PCSK9或重組型獼猴PCSK9(3倍稀釋物)在水平方向上一式三份地注射於晶片表面上。在五種分析物濃度下同時進行空白(緩衝液)注射且用於評估及減去系統假影。在50微升/分鐘之流速下監測締合相300秒，而在50微升/分鐘之流速下監測解離相7200秒。表面用10mM甘胺酸(pH 1.5)在50微升/分鐘之流速下再生30秒。使用ProteOn Manager 3.1.0版3.1.06©軟體(Bio-Rad,Hercules,CA)對資料進行對準、雙重參考且擬合簡易1：1結合模型。
如表11B中說明比較huPCSK9與cynoPCSK9之間的結合動力學。
在KinExA或BIAcore上藉由溶液平衡結合分析法量測抗PCSK9抗體與人類PCSK9之結合，由表11C提供。
在KinExA上，在4℃下用每毫升含50微克人類PCSK9之50mM Na2CO3(pH 9.6)預先塗佈Reacti-Gel 6X(Pierce Biotechnology,Inc.Rockford,IL)隔夜。接著經PCSK9塗佈之珠粒用含1mg/mL BSA(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)之1M Tris-HCl(pH 7.5)在4℃下阻斷2小時。在分析之前，將10pM及100pM抗體與遞增濃度(0.1pM至10nM)之人類PCSK9混合且在含有0.1mg/mL BSA及0.005% P20之PBS中在室溫下平衡8小時。接著混合物通過經PCSK9塗佈之珠粒。因為僅游離抗體分子可結合於經PCSK9塗佈之珠粒，因此在既定PCSK9濃度下，結合信號與處於平衡之游離抗體之濃度成正比。珠粒結合之抗體之量使用螢光Cy5標記之山羊抗人類IgG抗體(Jackson Immuno Research,West Grove,PA)在2微克/毫升下於Super-Block(Pierce Biotechnology,Inc.Rockford,IL)中定量。使用KinExA Pro軟體(Sapidyne Instruments Inc.,Boise,ID)中提供之n曲線單一位點均質結合模型自競爭曲線之非線性回歸獲得解離平衡常數(KD)。
在BIAcore上，使用胺偶合(由GE Healthcare,Piscataway,NJ提供之試劑)在約5000-7000 RU之密度下將抗體固定於CM5晶片之第二、第三或第四流動細胞上。使用第一流動細胞作為背景對照。對於pH 7.4下之分析法，將0.3、1.0或10之nM PCSK9與抗體於PBS加0.1mg/mL BSA、0.005% P20中之連續稀釋物(在0.0004nM至390nM範圍內)混合且在室溫下培育4小時。對於pH 5.5下之分析法，將0.3、1.0或10nM PCSK9與抗體於10mM檸檬酸鈉(pH 5.5)加150mM NaCl、0.1mg/mL BSA、0.005% P20中之連續稀釋物(在0.001nM至977nM範圍內)混合且在室溫下培育4小時。藉由注射於經抗體塗佈之晶片表面上來量測混合溶液中游離PCSK9之結合。在溶液中不存在抗體情況下 測定抗體表面上100% PCSK9結合信號。隨溶液中抗體濃度增加而降低之PCSK9結合反應表明PCSK9結合於溶液中之抗體，阻止PCSK9結合於固定抗體表面。標繪PCSK9結合信號與抗體濃度之關係曲線，使用KinExA Pro軟體(Sapidyne Instruments Inc.,Boise,ID)中提供之單一位點均質結合模型自競爭曲線之非線性回歸獲得KD。
實例12 抗PCSK9 31H4變異體之結合動力學
為測定以上實例8中描述之31H4變異體在中性pH值下之結合動力學，使用配備有GLC感測器晶片(Bio-Rad,Hercules,CA)之ProteOn XPR36光學生物感測器在HBS-P緩衝液系統(10mM HEPES pH 7.4、150mM NaCl及0.05%界面活性劑P20)中於25℃下進行生物感測器分析。使用山羊抗人類IgG捕捉抗體(Jackson Laboratories；109-005-098)製備晶片表面，該捕捉抗體使用標準胺偶合化學法在感測器晶片之水平方向上固定至所有通道以達到5,000-6,000 RU之水準。此表面類型提供在各再生步驟後可再現地捕捉新鮮分析抗體(配體)之格式。將31H4變異體及對照抗PCSK9 8A3在垂直方向上捕捉至通道1-6(約100- 150 RU)。將於操作緩衝液中在100至1.23nM濃度範圍內之五種rhu PCSK9(3倍稀釋物)在水平方向上同時注射於晶片表面上。在五種分析物濃度下同時進行空白(緩衝液)注射且用於評估及減去系統假影。在50微升/分鐘之流速下監測締合相300秒，而在50微升/分鐘之流速下監測解離相1800秒。表面用10mM甘胺酸(pH 1.5)在50微升/分鐘之流速下再生30秒。使用ProteOn Manager 3.1.0版3.1.06©軟體(Bio-Rad,Hercules,CA)對資料進行對準、雙重參考且擬合簡易1：1結合模型。
為測定酸性pH值下之估計複合物半衰期，使用類似方法，其使用HBS-P緩衝液系統(10mM HEPES pH 5.5、150mM NaCl、0.05%界面活性劑P20及1mg/ml BSA)。使用ProteOn Manager3.1.0版3.1.06©軟體(Bio-Rad,Hercules,CA)對資料進行對準及雙重參考，且變異體使用已知複合物半衰期之對照抗體8A3親本(SS-8086)、P1B1(SS-12685)、P2F5(SS-12686)及P2C6(SS-12687)基於其動力學概況定性歸類。
除pH 5.5、25℃下之估計複合物半衰期外，亦測定pH 7.4、25℃下，huPCSK9與92種抗PCSK9 31H4 His變異體之結合的締合及解離動力學結合常數(ka、kd)以及解離平衡結合常數(Kd)。抗PCSK9 31H4變異體在pH 7.4下之親和力(Kd)及估計複合物半衰期展示於圖3中。
抗PCSK9 31H4 His動力學速率常數之子集展示於表12中，其在pH 7.4下之解離平衡結合常數(Kd)<400pM且在pH 5.5下之估計複合物半衰期<100秒。將此等變異體用於確認性基於溶液之SPR分析法中。
實例13 抗PCSK9 8A3恆定區變異體之結合動力學
在BIAcore上藉由溶液平衡結合分析法量測抗PCSK9抗體8A3(SS-8086)、8A3HLE51(mAb ID SS-13406)及8A3HLE112(mAb ID SS-13407)與人類及獼猴PCSK9之結合。使用胺偶合(由GE Healthcare,Piscataway,NJ提供之試劑)在5000 RU之近似密度下將抗體固定於CM5晶片之第二流動細胞上。使用第一流動細胞作為背景對照。對於pH 7.4下之分析法，將1.0nM PCSK9與抗體於PBS加0.1mg/mL BSA、0.005% P20中之連續稀釋物(在0.07nM至150nM範圍內)混合且在室溫下培育4小時。對於pH 5.5下之分析法，將1.0nM PCSK9與抗體於10mM檸檬酸鈉(pH 5.5)加150mM NaCl、0.1mg/mL BSA、0.005% P20中之連續稀釋物(在0.07nM至450nM範圍內)混合且在室溫下培育4小時。藉由注射於經抗體塗佈之晶片表面上來量測混合溶液中游離PCSK9之結合。在溶液中不存在抗體情況下測定抗體表面上100% PCSK9結合信號。隨溶液中抗體濃度增加而降低之PCSK9結合反應表明PCSK9結合於抗體，阻止PCSK9結合於固定抗體表面。標繪PCSK9結合信號與抗體濃度之關係曲線，使用KinExA Pro軟體(Sapidyne Instruments Inc.,Boise,ID)中提供之單一位點均質結合模型自競爭曲線之非線性回歸獲得KD。結果呈現於於以下表13A中。
恆定區抗體變異體與FcRn之結合動力學
在BIAcore T200上在pH 5.5下測試抗PCSK9抗體與人類及犬FcRn之結合。簡言之，使用胺偶合在約5000 RU之密度下將CHO huFc固定於CM5晶片之流動細胞2上。使用流動細胞1作為背景對照。將10nM人類或犬FcRn與抗體之連續稀釋物(在0.1-2,000nM範圍內)混合且在室溫下於10mM乙酸鈉(pH 5.5)、150mM NaCl、0.005% P20、0.1mg/ml BSA中培育1小時。藉由將混合物注射於表面來量測游離FcRn與固定CHO huFc之結合。在溶液中不存在抗體情況下測定100% FcRn結合信號。隨溶液中抗體濃度增加而降低之FcRn結合反應表明FcRn結合於溶液中之抗體，其阻斷FcRn與固定Fc表面結合。標繪FcRn結合信號與抗體濃度之關係曲線，在GraphPad Prism 5TM軟體中使用單位點競爭之非線性回歸計算EC50。結果呈現於以下表13B中。
實例14 抗體變異體對PCSK9阻斷人類HepG2細胞中LDL攝取之作用
此實例證明本發明之抗原結合蛋白降低細胞之LDL攝取之能力。人類HepG2細胞在黑色、透明底部96孔板(Costar)中以2.5×105個細胞/孔之濃度在補充有10% FBS之DMEM培養基(Mediatech,Inc)中接種，且在37℃(5% CO2)下培育隔夜。為形成PCSK9及抗體複合物，2μg/ml D374Y人類PCSK9與在攝取緩衝液(具有1% FBS之DMEM)中稀釋之各種濃度之P2C6 IgG2抗體(SS-12687)或單獨攝取緩衝液(對照)一起在室溫下培育1小時。在用PBS洗滌細胞後，將D374Y PCSK9/抗體混合物轉移至細胞中，接著添加於攝取緩衝液中稀釋之LDL-BODIPY(Life Technologies)達到6μg/ml之最終濃度。在37℃(5% CO2)下培育3小時後，細胞用PBS充分洗滌且藉由SafireTM(TECAN)在480-520nm(激發)及520-600nm(發射)下偵測細胞螢光信號。
細胞攝取分析法之結果展示於圖5A-B中。概括說來，測定抗體變異體之EC50值且發現對P2C6 IgG2之EC50為11.1nM(圖4)。此等結果表明所施用之抗原結合蛋白可降低PCSK9阻斷細胞之LDL攝取之作用。
實例15 在51天研究中，抗體P1B1、P2C6及P2F5之血清膽固醇降低作用及藥物動力學
為評估在51天研究中，獼猴中經由針對PCSK9蛋白質之抗體療法實現之總血清膽固醇(TC)降低，進行以下程序。
在整個實驗期間用正常飲食餵食雄性獼猴(4-6kg)。在T=0時經由皮下注射向動物投與0.5mg/kg劑量之抗PCSK9抗體P1B1(SS-12685)、P2C6(SS-12687)、P2F5(SS-12685)、8A3(SS-8086)(陽性對照)、31H4(SS-4201)(陽性對照)或陰性對照抗體抗KLH。
給藥組展示於表15A中。在圖6中指示之時間點時收集血清。
以0.5mg/kg給藥之動物在處理後一天開始顯示LDL膽固醇降低。31H4抗體組中之LDL膽固醇(LDL-C)在第6天開始恢復至給藥前含量且在第9天完全恢復至基線含量。P2C6呈現第二位最短的LDL-C降低持續時間。P2C6在第15天開始恢復至給藥前含量且在第21天完全恢復至基線含量。其他所測試之抗PCSK9抗體(8A3、P1B1及P2F5)呈現更平緩地恢復至給藥前含量。各抗體之LDL膽固醇降低持續時間與其藥物動力學性質一致，如圖7A-B中所示。對於31H4，與其他抗PCSK9抗體及抗KLH對照物相比，較短作用持續時間對應於較低AUC暴露及較短表觀終末半衰期(表15B)。P2C6與31H4相比增加之藥理學作用持續時間與AUC暴露及表觀終末半衰期增加3倍相關聯。P1B1及P2F5之藥物動力學彼此極類似，且與31H4及P2C6相比延長之藥理學作用一致。8A3之AUC暴露無法與抗KLH對照物區分，但抗PCSK9 8A3抗體呈現延長之LDL膽固醇降低，而對照抗KLH對LDL-膽固醇無效。
實例16 在84天研究中，抗體8A3、8A3 5-51及8A3 5-112之血清膽固醇降低作用及藥物動力學
為評估在84天研究中，獼猴中經由針對PCSK9蛋白質之抗體療法實現之總血清膽固醇降低，進行以下程序。
在整個實驗期間用正常飲食餵食雄性獼猴(約3kg)。在T=0時經 由靜脈內注射以1mg/kg之劑量向動物投與抗PCSK9抗體8A3(SS-8086)、8A3 5-51(mAb ID SS-13406)、8A3 5-112(mAb ID SS-13407)或陰性對照抗體抗KLH。
給藥組展示於表16A中。在給藥後之時間點0.25、1、4、24、72、168、240、336、408、504、576、672、744、840、1008、1176、1344、1512及1680小時時收集血清。
以1mg/kg給藥之動物在處理後24小時(1天)開始顯示LDL-C膽固醇降低。8A3抗體組中之LDL-C在第504小時(21天)開始恢復至給藥前含量且在第744小時(31天)完全恢復至基線含量。相對於8A3，8A3 5-51及5-112給藥組均展示延長之藥理學作用。8A3 5-51及5-112抗體給藥組中之LDL-C分別在第672小時(28天)及第1008小時(42天)開始恢復至給藥前含量。對於8A3 5-51及5-112，分別在第1008小時(42天)及第1848小時(77天)觀測到恢復至基線。各抗體之LDL-C降低持續時間與其藥物動力學性質一致，如圖8中所示。8A3抗體呈現與抗KLH對照物類似之藥物動力學；AUC暴露相等且8A3之表觀終末半衰期為抗KLH之67%(表16B)。與經改良之藥理學作用持續時間一致，8A3 5-51抗體與8A3相比顯示增加之AUC暴露(2.0x)、較低的清除率(53%)及延長之終末半衰期(1.9x)。8A3 5-112之藥物動力學性質與8A3 5-51類似。
本文中引用之所有參考文獻均以全文引用的方式併入本文中以獲得其所有教示且用於所有目的。
本發明之範疇不限於本文中所描述之特定實施例，該等特定實施例僅意欲作為本發明之個別態樣之說明，且功能上等效方法及組分形成本發明之態樣。當然，除本文中所展示及描述外，對熟習此項技術者而言，本發明之各種修改自先前描述及隨附圖式而變得顯而易見。該等修改欲在隨附申請專利範圍之範疇內。
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<220>
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<223> 例示性抗體可變輕(VL)鏈
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變輕(VL)鏈
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變輕(VL)鏈
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<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變輕(VL)鏈
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<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變輕(VL)鏈
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<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變輕(VL)鏈
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<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變輕(VL)鏈
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<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變輕(VL)鏈
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<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變輕(VL)鏈
<400> 209
<210> 210
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變輕(VL)鏈
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<210> 211
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變輕(VL)鏈
<400> 211
<210> 212
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變輕(VL)鏈
<400> 212
<210> 213
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變輕(VL)鏈
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<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變輕(VL)鏈
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<211> 112
<212> PRT
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<220>
<223> 例示性抗體可變輕(VL)鏈
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<212> PRT
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<220>
<223> 例示性抗體可變輕(VL)鏈
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<212> PRT
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<220>
<223> 例示性抗體可變輕(VL)鏈
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<212> PRT
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<220>
<223> 例示性抗體可變輕(VL)鏈
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<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變輕(VL)鏈
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<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變輕(VL)鏈
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<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變輕(VL)鏈
<400> 221
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<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變輕(VL)鏈
<400> 222
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<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變輕(VL)鏈
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變輕(VL)鏈
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<212> PRT
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<223> 例示性抗體可變輕(VL)鏈
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<220>
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<220>
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<220>
<223> 例示性抗體可變重(VH)鏈
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<220>
<223> 例示性抗體可變重(VH)鏈
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<223> 例示性抗體可變重(VH)鏈
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<220>
<223> 例示性抗體可變重(VH)鏈
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<220>
<223> 例示性抗體可變重(VH)鏈
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<220>
<223> 例示性抗體可變重(VH)鏈
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<220>
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<220>
<223> 例示性抗體可變重(VH)鏈
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<211> 123
<212> PRT
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<220>
<223> 例示性抗體可變重(VH)鏈
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變重(VH)鏈
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<220>
<223> 例示性抗體可變重(VH)鏈
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<211> 123
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<220>
<223> 例示性抗體可變重(VH)鏈
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<220>
<223> 例示性抗體可變重(VH)鏈
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<220>
<223> 例示性抗體可變重(VH)鏈
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<220>
<223> 例示性抗體可變重(VH)鏈
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<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變重(VH)鏈
<400> 308
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<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變重(VH)鏈
<400> 309
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<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變重(VH)鏈
<400> 310
<210> 311
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變重(VH)鏈
<400> 311
<210> 312
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變重(VH)鏈
<400> 312
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<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變重(VH)鏈
<400> 313
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<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變重(VH)鏈
<400> 314
<210> 315
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變重(VH)鏈
<400> 315
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<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變重(VH)鏈
<400> 316
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<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變重(VH)鏈
<400> 317
<210> 318
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變重(VH)鏈
<400> 318
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<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變重(VH)鏈
<400> 319
<210> 320
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變重(VH)鏈
<400> 320
<210> 321
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變重(VH)鏈
<400> 321
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<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變重(VH)鏈
<400> 322
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<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變重(VH)鏈
<400> 323
<210> 324
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變重(VH)鏈
<400> 324
<210> 325
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變重(VH)鏈
<400> 325
<210> 326
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變重(VH)鏈
<400> 326
<210> 327
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變重(VH)鏈
<400> 327
<210> 328
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變重(VH)鏈
<400> 328
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<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變重(VH)鏈
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<210> 330
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變重(VH)鏈
<400> 330
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<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變重(VH)鏈
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<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變重(VH)鏈
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性抗體可變重(VH)鏈
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<223> 例示性抗體可變重(VH)鏈
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<223> 例示性抗體可變重(VH)鏈
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<223> 例示性CDRH序列-CDRH1
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<223> 例示性CDRH序列-CDRH1
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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<220>
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 例示性CDRL序列-CDRL1
<400> 984
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<223> 例示性CDRL序列-CDRL1
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<223> 例示性CDRL序列-CDRL1
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<223> 例示性CDRL序列-CDRL3
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<223> 例示性CDRL序列-CDRL2
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<212> PRT
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<212> PRT
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<211> 7
<212> PRT
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<400> 1012
<210> 1013
<211> 9
<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<223> 例示性CDRL序列-CDRL1
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性CDRL序列-CDRL2
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 例示性CDRL序列-CDRL3
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<223> 例示性CDRL序列-CDRL1
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<211> 7
<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<213> 人工序列
<220>
<223> 例示性CDRL序列-CDRL3
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<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重鏈
<400> 1026
<210> 1027
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 輕鏈
<400> 1027
<210> 1028
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重鏈
<400> 1028
<210> 1029
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 輕鏈
<400> 1029

Claims (19)

  1. 一種經分離之抗原結合蛋白，其在pH 5.5下以1nM至約100nM之親和力且在pH 7.4下以0.01nM至約10nM之親和力結合於人類PSCK9。
  2. 如請求項1之抗原結合蛋白，其包含168小時至約1008小時之半衰期。
  3. 如請求項1或2之抗原結合蛋白，其包含pH 5.5下之複合物解離速率，其中pH 5.5下之T1/2可為1秒至約100秒。
  4. 如請求項1之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含以下中之一或多者：(a)輕鏈，其包含SEQ ID NO：8-91中之一者之胺基酸序列；(b)重鏈，其包含SEQ ID NO：92-17中之一者之胺基酸序列；(c)包含(a)之輕鏈及(b)之重鏈之組合。
  5. 如請求項1、2及4中任一項之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含以下中之一或多者：(a)重鏈可變域，其包含SEQ ID NO：270-353中之一者之胺基酸序列；(b)輕鏈可變域，其包含SEQ ID NO：186-269中之一者之胺基酸序列；(c)包含(a)之重鏈可變域及(b)之輕鏈可變域之組合。
  6. 如請求項1、2及4中任一項之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含以下中之一或多者：(a)重鏈及輕鏈，其包含於選自(d)中之抗體中之任一者之抗體中且包含該等抗體中之任一者中所包含之胺基酸序列；(b)重鏈及輕鏈可變域，其包含於選自(d)中之該等抗體中之任 一者之抗體中；或(c)(d)中列出之該等抗體中之任一者中所包含的CDRH1、CDRH2及CDRH3以及CDRL1、CDRL2及CDRL3；(d)SS-13406(8A3HLE-51)、SS-13407(8A3HLE-112)、SS-14888(P2C6-HLE51)、13G9、19A12、20D12、25B5、30G7、SS-15057、SS-15058、SS-15059、SS-15065、SS-15079、SS-15080、SS-15087、SS-15101、SS-15103、SS-15104、SS-15105、SS-15106、SS-15108、SS-15112、SS-15113、SS-15114、SS-15117、SS-15121、SS-15123、SS-15124、SS-15126、SS-15132、SS-15133、SS-15136、SS-15139、SS-15140、SS-15141、SS-13983(A01)、SS-13991(A02)、SS-13993(C02)、SS-12685(P1B1)、SS-12686(P2F5)、SS-12687(P2C6)、SS-14892(P2F5/P2C6)、SS-15509、SS-15510、SS-15511、SS-15512、SS-15513、SS-15514、SS-15497、SS-15515、SS-15516、SS-15517、SS-15518、SS-15519、SS-15520、SS-15522、SS-15524、SS-14835、SS-15194、SS-15195、SS-15196、SS-14894、SS-15504、SS-15494、SS-14892、SS-15495、SS-15496、SS-15497、SS-15503、SS-15505、SS-15506、SS-15507、SS-15502、SS-15508、SS-1550、SS-15500、SS-15003、SS-15005、SS-15757(P1F4)、SS-15758(P1B6)、SS-15759(P2F4)、SS-15761(P2G5)、SS-15763(P2H7)及SS-15764(P2H8)。
  7. 如請求項1、2及4中任一項之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白為單株抗體。
  8. 如請求項7之抗原結合蛋白，其中該抗體為人類化抗體。
  9. 如請求項7之抗原結合蛋白，其中該抗體為人類抗體。
  10. 如請求項7之抗原結合蛋白，其中該抗體為選自Fab、Fab'-SH、Fv、scFv或(Fab')2片段之抗體片段。
  11. 如請求項7之抗原結合蛋白，其中構架序列之至少一部分為人類共同構架序列。
  12. 一種醫藥組合物，其包含一或多種如請求項1至11中任一項之抗原結合蛋白與其醫藥學上可接受之載劑的混雜物。
  13. 一種經分離之核酸，其包含編碼如請求項1至11中任一項之抗原結合蛋白的輕鏈可變域胺基酸序列、重鏈可變域胺基酸序列或該兩種胺基酸序列之聚核苷酸序列。
  14. 一種表現載體，其包含如請求項13之核酸。
  15. 一種經分離之宿主細胞，其包含如請求項13之核酸。
  16. 一種經分離之宿主細胞，其包含如請求項14之表現載體。
  17. 一種產生抗原結合蛋白之方法，其包含在允許表現該抗原結合蛋白之條件下培育如請求項15或16之宿主細胞。
  18. 一種如請求項12之組合物之用途，其係用於預防或治療可藉由降低血清LDL膽固醇含量而治療之病狀。
  19. 如請求項18之用途，其中該病狀為高膽固醇血症。
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